PL192280B1

PL192280B1 - Inhibitory proteaz serynowych, a zwłaszcza proteazy wirusa NS3 zapalenia wątroby C, kompozycja farmaceutyczna i zastosowania

Info

Publication number: PL192280B1
Application number: PL332872A
Authority: PL
Inventors: Roger D. Tung; Scott L. Harbeson; David D. Deininger; Mark A. Murcko; Govinda Rao Bhisetti; Luc J. Farmer
Original assignee: Vertex Pharma
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2006-09-29
Also published as: ATE212037T1; IS5028A; BR9712544A; AU719984B2; PL194025B1; DE69709671T2; DK0932617T3; US8314141B2; EP2409985A2; CN1133649C; GEP20012471B; IL191905A0; US6265380B1; BR9712544B1; US20040266731A1; CA2268391A1; CZ298749B6; US7388017B2; SK286105B6; JP4080541B2

Abstract

1. Inhibitor proteazy serynowej, zwi azek o wzorze (II): w którym W oznacza: m oznacza 0 lub 1; ka zdy R 2 niezale znie oznacza wodór, alkil, alkenyl, aryl, aralkil, aralkenyl, cykloalkil, cykloalkiloalkil, cykloalkenyl, cy- kloalkenyloalkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heterocykliloalkenyl, heteroaryl lub heteroaralkil, albo dwie grupy ........ PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowa klasa związków, które są użyteczne jako inhibitory proteaz serynowych, a zwłaszcza jako inhibitory proteazy NS3 zapalenia wątroby C. Jako takie, działają one przez zakłócanie cyklu życiowego wirusa zapalenia wątroby C i są również przydatne jako środki przeciwwirusowe.

Wynalazek niniejszy dotyczy również kompozycji farmaceutycznych zawierających takie związki. Związki i kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są szczególnie przydatne do hamowania aktywności proteazy NS3 HCV i w konsekwencji mogą być dogodnie stosowane jako środki terapeutyczne przeciwko wirusowi zapalenia wątroby C i przeciwko innym wirusom, których proliferacja jest zależna od proteazy serynowej. Wynalazek dotyczy również zastosowania nowych związków do wytwarzania leku do hamowania aktywności proteaz, obejmujących proteazę NS3 wirusa zapalenia wątroby C i inne proteazy serynowe.

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby C („HCV) stanowi poważny problem medyczny. HCV uważa się za czynnik sprawczy większości zapaleń wątroby nie-A i nie-B, a seroprewalencję ludzi ocenia się łącznie na 1% [R.H. Purcell, „Hepatitis C virus: Historical perspective and current concepts”

FEMS_Mięrobiology_Reyiews 14, str. 181-192 (1994); C.L. Van der Poel, „Hepatitis C Virus. Epidemiology, Transmission and Prevention in Hepatitis C. Virus. Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, wyd. H.W. Reesink., (Bazylea: Karger), str. 137-163 (1994)]. W samych Stanach Zjednoczonych zakażonych może być cztery miliony osobników (M.J. Alter i E.E. Mast, „The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North. Am. 23, str. 437-455 (1994)].

Po pierwszej ekspozycji na HCV jedynie u około 20% zakażonych osobników rozwija się ostre kliniczne zapalenie wątroby, podczas gdy u pozostałych zakażenie wydaje się zanikać samoistnie. W większości przypadków jednakże wirus wywołuje przewlekłe zapalenie, które trwa przez długie lata [S. Iwarson, „The Natural Course of Chronic Hepatitis” FEMS Microbiology Ręyiews 14, str. 201-204 (1994)]. Powoduje to zazwyczaj nawracające i postępujące zapalenie wątroby, które często prowadzi do poważniejszych stanów chorobowych, takich jak marskość i rak wątroby [M.C. Kew, „Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma”, FEMS Microbiology Reyiews 14, str. 211-220 (1994); I. Saito i in., „Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, str. 6547-6549 (1990)]. Niestety, nie ma w pełni skutecznego leczenia w przypadku wyniszczającej progresji przewlekłego HCV.

Genom HCV koduje poliproteinę złożoną z 3010-3033 aminokwasów (Q.-L. Choo i in., „Genetic Organisation and Diversity of the Hepatitis C Virus”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, str. 2451-2455 (1991); N. Kato i in., Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, str. 9524-9528 (1990); A. Takamizawa i in., „Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers”, J. Virol., 65, str. 1105-1113 (1991)]. Uważa się, że białka niestrukturalne (NS) HCV dostarczają zasadniczego mechanizmu katalitycznego do replikacji wirusa. Białka NS tworzą się przez proteolityczne rozszczepienie poliprotein [R. Bartenschlager i in., „Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleayage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions”, J. Virol., 67, str. 3855-3844 (1993); A. Grakoui i in., „Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites”, J. Virol., 67, str. 2832-2843 (1993); A. Grakoui i in., „Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products”, J. Virol., 67, str. 1385-1395 (1993); L. Tomei i in., „NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein”, J. Virol., 67, str. 4017-4026 (1993)].

Białko 3 NS HCV (NS3) obejmuje aktywność proteazy serynowej, która wspomaga obróbkę większości enzymów wirusowych, przez co uważana jest za zasadniczą dla replikacji i zakaźności wirusa. Wiadomo, że mutacje proteazy NS3 wirusa żółtej gorączki zmniejszają zakaźność wirusową [T.J. Chambers i in., „Eyidence that the N-terminal Domain of Nonstructural Protein NS3 from Yellow Feyer Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleayeages in the Viral Polyprotein”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, str. 8898-8902 (1990)]. Stwierdzono, że pierwszych 181 aminokwasów białka N3S (reszty 1027-1207 poliproteiny wirusa) zawiera domenę proteazy serynowej NS3, która przetwarza wszystkie cztery miejsca poliproteiny HCV znajdujące się poniżej (C. Lin i in., „Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, str. 8147-8157 (1994)].

PL 192 280 B1

Proteaza serynowa NS3 HCV i związany z nią kofaktor, NS4A, wspomaga obróbkę wszystkich enzymów wirusowych, tak więc jest uważana za zasadniczą dla replikacji wirusa. Obróbka ta wydaje się być analogiczna do prowadzonej przez proteazę aspartylową ludzkiego wirusa niedoboru odporności, która jest również związana z obróbką enzymatyczną wirusa inhibitorów proteazy HIV, które hamują obróbkę białka wirusa i są silnymi środkami przeciwwirusowymi u ludzi, co wskazuje, że przerwanie tego etapu cyklu życiowego wirusa prowadzi do uzyskania terapeutycznie aktywnych środków. W konsekwencji stanowi to atrakcyjny cel przy opracowywaniu leków. Niestety, nie istnieją obecnie inhibitory proteazy serynowej, które byłyby środkami przeciwko HCV.

W europejskim zgłoszeniu patentowym O 195 212 opisano związki, które są inhibitorami peptydazy. Związki te są pochodnymi pewnych substratów peptydazy. Stwierdzono, że są one użyteczne jako inhibitory enzymów, proteaz serynowych, tiolowych, proteaz karboksylowych i proteaz metalo-zależnych. Nie stwierdzono jednakże, że związki te są użyteczne jako inhibitory proteazy HCV NS3.

Ponadto, obecna wiedza o HCV nie prowadzi do zadowalających środków przeciwko HCV lub do zadowalającego leczenia. Jedyną znaną terapią HCV jest leczenie interferonem. Jednakże interferony wykazują znaczne efekty uboczne (Janssen i in., 1994; Renault i Hoofnagle, 1989), [H.L.A. Janssen i in., „Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronić Viral Hepatitis” J. Hepatol., 21, str. 241-243 (1994A)]; P.F. Renault i J.H. Hoofnagle, „Side effects of alpha interferon, Seminars in Liver Disease 9, 273-277 (1989)] w niektórych przypadkach (około 25%) wywołują długotrwałą reemisję [O. Weiland, „Interferon Therapy in Chronić Hepatitis C Virus Infection”, FEMS Microbiology Reviews 14, str. 279-288 (1994)]. Jednakże perspektywy skutecznych szczepionek przeciwko HCV pozostają niepewne.

Tak więc, istnieje potrzeba bardziej skutecznego leczenia HCV. Inhibitory takie mogłyby mieć działanie terapeutyczne jako inhibitory proteazy, szczególnie inhibitory proteazy serynowej, a bardziej konkretnie jako inhibitory proteazy NS3 HCV. Szczególnie związki takie mogą być użyteczne jako środki przeciwwirusowe, a zwłaszcza jako środki przeciwko HCV.

Wynalazek niniejszy dostarcza związków i ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych, które są użyteczne jako inhibitory proteazy serynowej, a zwłaszcza jako inhibitory proteazy NS3 HCV. Związki te można stosować same lub w kombinacji z innymi środkami immunomodulacyjnymi, takimi jak α-, β- i γ-interferony; inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna i amantadyna; inne inhibitory proteazy wirusa zapalenia wątroby C; inhibitory skierowane na inne cele w cyklu życiowym HCV, obejmujące helikazę, polimerazę, metaloproteazę lub wewnętrzne miejsce włączenia rybosomu, lub ich kombinacje.

Wynalazek dostarcza także kompozycji farmaceutycznych zawierających związki według wynalazku, jak również kompozycji wieloskładnikowych obejmujących dodatkowe środki immunomodulacyjne, takie jak α-, β- i γ-interferony; inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna i amantadyna; inne inhibitory proteazy wirusa zapalenia wątroby C; inhibitory skierowane na inne cele w cyklu życiowym HCV, obejmujące helikazę, polimerazę, metaloproteazę lub wewnętrzne miejsce włączenia rybosomu, lub ich kombinacje. Wynalazek dostarcza również zastosowania związków według wynalazku do wytwarzania leku do hamowania aktywności proteaz, obejmujących proteazę NS3 wirusa zapalenia wątroby C i inne proteazy serynowe.

Dla pełniejszego zrozumienia niniejszego wynalazku zamieszczono poniżej następujący szczegółowy opis. W opisie stosuje się następujące skróty:

Oznaczenie	Reagent lub fragment
Abu	kwas aminomasłowy
Ac	acetyl
AcOH	kwas octowy
Bn	benzyl
Boc	tert-butyloksykarbonyl
Bz	benzoil
Cbz	karbobenzyloksyl
CDI	karbonyloimidazol
DCE	1,2-dichloroetan
DCM	dichlorometan
DIEA	diizopropyloetyloamina
DMA	dimetyloacetamid

PL 192 280 B1

DMAP

DMF

DPPA

DMSO

Et

EtOAc

FMOC

HbtU

HOBt

HPLC

Me

MS

NMP

ND

Pip

Prz

PyBrop

Pyr

THF

TFA

TFE

Tol dimetyloaminopirydyna dimetyloformamid azydek difenylofosforylu sulfotlenek dimetylu etyl octan etylu

9-fluorenylometoksykarbonyl heksafluorofosforan O-benzotriazolilo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy

N-hydroksybenzotriazol wysokosprawna chromatografia cieczowa metyl spektroskopia mas

N-metylopirolidynon nie oznaczono piperydyna piperazyna heksafluorofosforan bromo-tris-pirolidynofosfoniowy pirydyna tetrahydrofuran kwas trifluorooctowy trifluoroetanol toluen

W opisie stosuje się nastę pują ce okreś lenia:

Jeśli wyraźnie nie stwierdzono inaczej, stosowane tu określenia „-SO2-„ i „-S(O)2-„ odnoszą się do sulfonu lub pochodnych sulfonu (tj. obydwie grupy przyłączone są do S), a nie do sulfinianu - estru.

Określenie „podstawiony” odnosi się do zastąpienia jednego lub więcej atomów wodoru w danej strukturze rodnikiem wybranym spośród konkretnych grup. Gdy więcej niż jeden atom wodoru może być zastąpiony podstawnikiem wybranym z tej samej konkretnej grupy, wówczas podstawniki takie w każdej pozycji mogą być takie same lub różne.

Stosowane tu określenie „amino” odnosi się do trójwartościowego azotu, który może być pierwszorzędowy, lub który może być podstawiony 1-2 grupami alkilowymi.

Określenie „alkil” lub „alkan”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do prostołańcuchowego lub rozgałęzionego nasyconego alifatycznego rodnika węglowodorowego zawierającego określoną ilość atomów węgla, lub gdy ilość ta nie jest wskazana, korzystnie od 1 do 10, a bardziej korzystnie od 1-5 atomów węgla. Przykłady rodników alkilowych obejmują, ale nie wyłącznie, metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, izobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, izoamyl, n-heksyl itp.

Określenie „alkeny” lub „alken”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do prostołańcuchowego lub rozgałęzionego mono- lub poli-nienasyconego alifatycznego rodnika węglowodorowego zawierającego określoną ilość atomów węgla, albo gdy ilość ta nie jest wskazana, korzystnie od 2-10 atomów węgla, a bardziej korzystnie od 2-5 atomów węgla. Przykłady rodników alkenylowych obejmują, ale nie wyłącznie, etenyl, E- i Z-propenyl, E- i Z-izobutenyl, E- i Z-pentenyl, E- i Z-heksenyl, E,E-, E,Z-, Z,E- i Z,Z-heksadienyl itp.

Określenie „alkinyl” lub „alkin”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do prostołańcuchowego lub rozgałęzionego mono- lub poli-nienasyconego alifatycznego rodnika węglowodorowego zawierającego określoną ilość atomów węgla, albo gdy ilość ta nie jest wskazana, korzystnie od 2-10 atomów węgla, a bardziej korzystnie od 2-5 atomów węgla, przy czym co najmniej jeden z nienasyconych alifatycznych rodników węglowodorowych zawiera potrójne wiązanie. Przykłady rodników alkinylowych obejmują, ale nie wyłącznie, etynyl, propynyl, izobutynyl, pentynyl, heksynyl, heksenynyl, itp.

Określenie „aryl”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do karbocyklicznego rodnika aromatycznego zawierającego określoną liczbę atomów węgla, który ewentualnie może być skondensowany, na przykład benzo-skondensowany, z jednym do trzech pierścieniami cykloalkilowymi, aromatycznymi, heterocyklicznymi lub heteroaromatycznymi. Korzystne grupy arylowe zawierają od 6-14 atomów węgla, a bardziej korzystnie od 6-10 atomów węgla. Przykłady rodników arylowych obejmują, ale nie wyłącznie, fenyl, naftyl, antracenyl itp.

PL 192 280 B1

Określenie rodnik „karbocykliczny”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do trwałego niearomatycznego 3- do 8-członowego pierścieniowego rodnika węglowego, który może być nasycony, albo mono- lub poli-nienasycony, i który ewentualnie może być skondensowany, na przykład benzoskondensowany, z jednym do trzech pierścieniami cykloalkilowymi, aromatycznymi, heterocyklicznymi lub heteroaromatycznymi. Rodnik karbocykliczny może być związany z dowolnym endocyklicznym atomem węgla, co prowadzi do wytworzenia trwałej struktury.

Określenie „cykloalkil” lub „cykloalkan”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do stabilnego niearomatycznego 3- do 8-członowego pierścieniowego rodnika węglowego, który jest nasycony i ewentualnie może być skondensowany, na przykład benzoskondensowany, z jednym do trzech pierścieniami cykloalkilowymi, aromatycznymi, heterocyklicznymi lub heteroaromatycznymi. Cykloalkil może być związany z dowolnym endocyklicznym atomem węgla, co prowadzi do wytworzenia trwałej struktury. Korzystnie rodniki karbocykliczne zawierają 5 do 6 atomów węgla. Przykłady rodników karbocyklicznych obejmują, ale nie wyłącznie, cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cykloheptyl, cyklopentenyl, cykloheksenyl, indan, tetrahydronaftalen, itp.

Określenie „cykloalkenyl” lub „cykloalkan”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do trwałego cyklicznego pierścienia węglowodorowego zawierającego co najmniej jedno endocykliczne podwójne wiązanie węgiel-węgiel. Rodnik karbocykliczny może być związany z dowolnym cyklicznym atomem węgla, co prowadzi do powstania trwałej struktury. Jeżeli liczba atomów węgla nie jest wskazana, rodnik cykloalkenylowy korzystnie zawiera od 5-7 atomów węgla. Przykłady rodników cykloalkenylowych obejmują, ale nie wyłącznie, cyklopentenyl, cykloheksenyl, cyklopentadienyl, indenyl, itp.

Określenie „cykloalkilidenyl”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do trwałego cyklicznego pierścienia węglowodorowego zawierającego co najmniej jedno egzocykliczne wiązanie podwójne węgiel-węgiel, w którym cykliczny pierścień węglowodorowy ewentualnie może być skondensowany, na przykład benzoskondensowany, z jednym do trzech pierścieniami cykloalkilowymi, aromatycznymi, heterocyklicznymi lub heteroaromatycznymi. Rodnik karbocykliczny może być związany z dowolnym cyklicznym atomem węgla, co prowadzi do powstania trwałej struktury. Jeżeli liczba atomów węgla nie jest wskazana, rodnik cykloalkilidenylowy korzystnie zawiera od 5-7 atomów węgla. Przykłady rodników cykloalkilidenylowych obejmują, ale nie wyłącznie, cyklopentylidenyl, cykloheksylidenyl, cyklopentenylidenyl, itp.

Dla specjalisty w tej dziedzinie wiedzy oczywiste będzie, że niektóre grupy można zaklasyfikować zarówno do cykloalkanów, jak i do grup arylowych. Przykłady takich grup obejmują indanyl i tetrahydronaftyl.

Jeżeli nie stwierdzono inaczej, określenie „monocykl lub „monocykliczny”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do 5-7-członowego układu pierścieniowego.

Jeżeli nie stwierdzono inaczej, określenie „bicykl” lub „bicykliczny”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do 6-11-członowego układu pierścieniowego.

Jeżeli nie stwierdzono inaczej, określenie „tricykl” lub „tricykliczny”, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do 11-15-członowego układu pierścieniowego.

Określenie „heterocyklil” lub „rodnik heterocykliczny”, samo lub w kombinacji z innym terminem, jeśli nie stwierdzono inaczej, odnosi się do 5- do 15-członowego mono-, bi- lub tricyklicznego pierścienia heterocyklicznego, który jest nasycony lub częściowo nienasycony, ale jest niearomatyczny, i ewentualnie moż e być skondensowany, na przykład benzoskondensowany, z jednym do trzech pierścieniami cykloalkilowymi, aromatycznymi, heterocyklicznymi lub heteroaromatycznymi. Każdy rodnik heterocykliczny zawiera jeden lub więcej atomów węgla i od jednego do czterech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę. Stosowane tu określenie „heteroatomy azotu i siarki obejmuje utlenione formy azotu i siarki oraz czwartorzędowaną postać każdego zasadowego azotu. Rodnik heterocykliczny może być związany z dowolnym endocyklicznych węglem lub heteroatomem, co prowadzi do wytworzenia trwałej struktury.

Korzystne rodniki heterocykliczne obejmują, na przykład, imidazolidynyl, indazolinolil, perhydropirydazyl, pirolinyl, pirolidynyl, piperydynyl, pirazolinyl, piperazynyl, morfolinyl, tiamorfolinyl, β-karbolinyl, tiazolidynyl, tiamorfolinylosulfon, oksopiperydynyl, oksopirolidynyl, oksoazepinyl, azepinyl, furazanyl, tetrahydropiranyl, tetrahydrofuranyl, oksatiolil, ditiolil, tetrahydrotiofenyl, dioksanyl, dioksolanyl, tetrahydrofurotetrahydrofuranyl, tetrahydropiranotetrahydrofuranyl, tetrahydrofurodihydrofuranyl, tetrahydropiranodihydrofuranyl, dihydropiranyl, dihydrofuranyl, dihydrofurotetrahydrofuranyl, dihydropiranotetrahydrofuranyl, sulfolanyl, itp.

PL 192 280 B1

Określenie „heteroaryl” i „heteroaromatyczny”, samo lub w kombinacji z innym terminem, jeśli nie stwierdzono inaczej, odnosi się do trwałego 3- do 7-członowego monocyklicznego pierścienia heterocyklicznego, który jest aromatyczny, i ewentualnie może być skondensowany, na przykład benzoskondensowany z jednym do trzech pierścieniami cykloalkilowymi, aromatycznymi, heterocyklicznymi lub heteroaromatycznymi. Każdy pierścień heteroaromatyczny zawiera jeden lub więcej atomów węgla i od jednego do czterech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę . Stosowane tu określenie „heteroatomy azotu i siarki obejmuje utlenione formy azotu i siarki oraz czwartorzędowaną postać każdego zasadowego azotu. Rodnik heteroaromatyczny może być związany z dowolnym endocyklicznych węglem lub heteroatomem, co prowadzi do wytworzenia trwałej struktury.

Przykłady rodników heteroaromatycznych obejmują, na przykład, benzimidazolil, imidazolil, chinolil, izochinolil, indolil, indazolil, pirydazyl, pirydyl, pirolil, pirazolil, pirazynyl, chinoksolil, piranyl, pirymidynyl, pirydazynyl, furyl, tienyl, triazolil, tiazolil, tetrazolil, benzofuranyl, oksazolil, benzooksazolil, izoksazolil, izotiazolil, tiadiazolil, tiofenyl, itp.

Określenie „chlorowiec” odnosi się do atomu fluoru, chloru, bromu lub jodu. Korzystnymi chlorowcami są fluor i chlor.

We wzorach chemicznych stosuje się nawiasy w celu wskazania 1) obecności więcej niż jednego atomu lub grupy związanych z tym samym atomem lub z tą samą grupą; albo 2) punktu rozgałęzienia w łańcuchu (tzn. grupa lub atom tuż przed otwartym nawiasem jest bezpośrednio związana z grupą lub atomem tuż po zamkniętym nawiasie). Przykładem pierwszego zastosowania jest „N(R¹)2, co oznacza dwie grupy R¹ związane z atomem azotu. Przykładem drugiego zastosowanie jest „-C(O)R¹”, co oznacza, że atom tlenu i grupa R¹ są związane z atomem węgla, jak w następującym wzorze:

Stosowane tu symbol „B oznacza atom boru.

Wynalazek niniejszy dostarcza związków, które są użyteczne jako inhibitory proteazy, zwłaszcza inhibitory proteazy serynowej, a bardziej konkretnie inhibitory proteazy NS3 HCV. Jako takie, zakłócają one cykl życiowy wirusa HCV i innych wirusów, których proliferacja zależy od proteazy serynowej. Tak więc, związki te są użyteczne jako środki przeciwwirusowe.

Związki według wynalazku są przedstawione wzorem (II):

w którym:

W oznacza:

PL 192 280 B1

m oznacza 0 lub 1;

każdy R² niezależnie oznacza wodór, alkil, alkenyl, aryl, aralkil, aralkenyl, cykloalkil, cykloalkiloalkil, cykloalkenyl, cykloalkenyloalkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heterocykliloalkenyl, heteroaryl lub heteroaralkil, albo dwie grupy R², związane z tym samym atomem azotu, tworzą z nim razem 5-7-członowy monocykliczny heterocykliczny układ pierścieniowy; w którym dowolny atom węgla w grupie R²ewentualnie jest podstawiony grupą J.

J oznacza alkil, aryl, aralkil, alkoksyl, aryloksyl, aralkoksyl, cykloalkil, cykloalkoksyl, heterocyklil, heterocykliloksy, heterocykliloalkil, grupę keto, hydroksyl, grupę aminową, alkiloaminową, alkanoiloaminową, aroiloaminową, aralkanoiloaminową, karboksyl, karboksyalkil, karboksamidoalkil, chlorowiec, grupę cyjanową, grupę nitrową, formyl, acyl, sulfonyl lub grupę sulfonamidową, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J¹.

J¹ oznacza alkil, aryl, aralkil, alkoksyl, aryloksyl, heterocyklil, heterocyklilooksy, grupę keto, hydroksyl, grupę aminową, alkanoiloaminową, aroiloaminową, karboksyl, karboksyalkil, karboksamidoalkil, chlorowiec, grupę cyjanową, grupę nitrową, formyl, sulfonyl lub grupę sulfonamidową.

L oznacza alkil, alkenyl lub alkinyl, w których dowolny atom wodoru zwią zany z atomami wę gla ewentualnie jest podstawiony chlorowcem, zaś dowolny atom wodoru lub chlorowca związany z końcowym atomem węgla ewentualnie jest podstawiony sulfhydrylem lub hydroksylem.

A¹ oznacza

R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają wodór, alkil, alkenyl, aryl, aralkil, aralkenyl, cykloalkil, cykloalkiloalkil, cykloalkenyl, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil, i ewentualnie są podstawione 1-3 grupami J;

X oznacza wią zanie, -C(H)(R⁷)-, -O-, -S- lub -N(R⁸)-;

R⁷ oznacza wodór, alkil, alkenyl, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J;

R⁸ oznacza wodór, alkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, aralkanoil, heterocyklanoil, heteroaralkanoil, -C(O)R¹⁴, -SO2R¹⁴ lub grupę karboksamidową, i ewentualnie

PL 192 280 B1 ₈ jest podstawiony 1-3 grupami J; albo R⁸ i Z, razem z atomami, z którymi są związane, tworzą zawierający azot mono- lub bicykliczny układ pierścieniowy ewentualnie podstawiony 1-3 grupami J;

R¹⁴ oznacza alkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil;

Y oznacza wiązanie, -CH2-, -C(O)-, -C(O)C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- lub -S(O)(NR⁷)-, gdzie R⁷ ma wyżej podane znaczenie;

Z oznacza alkil, aryl, aralkil, cykloalkil, cykloalkiloalkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, -OR² lub -N(R²)2, w których dowolny atom węgla ewentualnie jest podstawiony grupą J, zaś R² ma wyżej podane znaczenie;

A² oznacza wiązanie lub

R⁹ oznacza alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, karboksyalkil lub karboksamidoalkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J;

M oznacza alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J, przy czym dowolny atom węgla w grupie alkilowej może być zastąpiony przez heteroatom;

V oznacza wiązanie, -CH2-, -C(H)(R¹¹)-, -O-, -S- lub -N(R¹¹)-;

R¹¹ oznacza wodór lub C1-3 alkil;

K oznacza wiązanie, -O-, -S-, -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2- lub -S(O)(NR¹¹)-, gdzie R¹¹ ma wyżej podane znaczenie;

T oznacza -R¹², -alkilo-R¹², -alkenylo-R¹², -alkinylo-R¹², -OR¹², -N(R¹²)₂, -C(O)R¹², -C(=NO-alkil)R¹² lub

każdy R¹² oznacza wodór, aryl, heteroaryl, cykloalkil, heterocyklil, cykloalkilidenyl lub heterocykloalkilidenyl, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J, albo pierwszy R¹² i drugi R¹², razem z atomem azotu, z którym są związane, tworzą mono- lub bicykliczny układ pierścieniowy ewentualnie podstawiony 1-3 grupami J;

R¹⁰ oznacza alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, karboksyalkil lub karboksamidoalkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J;

R¹⁵ oznacza alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, karboksyalkil lub karboksamidoalkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J;

R¹⁶ oznacza wodór, alkil, aryl, heteroaryl, cykloalkil lub heterocyklil;

pod warunkiem, że gdy V i K oznaczają tlen, wówczas T ma znaczenie inne niż OR¹².

Korzystnie, W oznacza

Najkorzystniej, W oznacza

PL 192 280 B1

Korzystnie J oznacza alkil, alkoksyol, aryloksyl, aryl, aralkil, aralkoksyl, chlorowiec, heteroaryl, grupę cyjanową, grupę aminową, grupę nitrową, heterocyklil, acyl, karboksyl, karboksyalkil, grupę alkiloaminową, hydroksyl, heterocykliloalkil, grupę aralkanoiloaminową, aroiloaminową, alkanoiloaminową, formyl lub grupę keto.

Bardziej korzystnie, J oznacza t-butyl, metyl, trifluorometyl, metoksyl, etoksyl, trifluorometoksyl, karboksyl, fenyl, benzyl, fenoksyl, benzyloksyl, fluor, chlor, brom, izoksazolil, pirydynyl, piperydynyl, karboksymetyl, karboksyetyl, grupę dialkiloaminową, morfolinylometyl, grupę fenyloacetyloaminową lub grupę acyloaminową.

Korzystnie, J¹ oznacza alkoksyl, alkil, chlorowiec lub aryl.

Bardziej korzystnie, J¹ oznacza C1-3 alkoksyl, chlor, C1-3 alkil lub fenyl.

Korzystnie, L oznacza alkil, alkenyl, allil lub propargil.

Bardziej korzystnie, L oznacza trichlorowcometyl, sulfhydryl lub alkil podstawiony trichlorowcometylem, sulfhydrylem lub hydroksylem.

Korzystnie, każdy R⁵ i R⁶ oznacza wodór.

Korzystnie, X oznacza -O- lub -N(R⁸)-.

Korzystnie, R⁸ oznacza wodór.

Korzystnie, Y oznacza -CH2-, -C(O)-, -C(O)C(O)- lub -S(O)2-.

Korzystnie, R² oznacza fluor, trifluorometyl, alkil, aryl, aralkil, heteroaryl, heterocyklil lub heterocykliloalkil.

Korzystnie, Z oznacza alkil, aryl, aralkil, heterocyklil, cykloalkil, heteroaryl, OR² lub N(R²)2, w których R² korzystnie oznacza aralkil lub alkenyl.

Bardziej korzystnie, Z oznacza fenyl, 1,4-benzodioksanyl, 1,3-benzodioksolil, benzotiazolil, naftyl, benzyl, oksadiazolil, izoksazolil, chinolil, benzotiofenyl, tiazolil, cykloheksyl, butyl, naftyl, dioksolanyl, benzyl, pirydynyl, morfolinyl, N-anilinyl, N-aminobenzotiazol, N-aminobenzodioksol, N-aminonaftylen, N-benzyloaminę, N-aminopirydynę, benzyloksyl, alliloksyl lub fenetyl, i ewentualnie jest podstawiony grupą J.

Bardziej korzystnie, Z oznacza naftyl, 3,4-dichlorofenyl, 2-karbometoksyfenyl.

9 9

Korzystnie, R⁹ oznacza alkil. Bardziej korzystnie, R⁹ oznacza propyl. Najkorzystniej, R⁹ oznacza izopropyl.

Korzystnie, M oznacza alkil, heteroaralkil, aryl, cykloalkiloalkil, aralkil lub aralkil, w którym jeden z atomów węgla w grupie alkilowej jest zastą piony przez O lub S.

Bardziej korzystnie, M oznacza propyl, metyl, pirydylometyl, benzyl, naftylometyl, fenyl, imidazolilometyl, tiofenylometyl, cykloheksylometyl, fenetyl, benzylotiometyl lub benzyloksyetyl.

Korzystnie, V oznacza -N(R¹¹)-.

Korzystnie, R¹¹ oznacza wodór.

Korzystnie, K oznacza -C(O)- lub -S(O)2-.

Korzystnie, T oznacza -R¹², -alkilo-R¹², -alkenylo-R¹², -OR¹², -N(R¹²)₂, -C(=NO-alkilo)R¹², albo

PL 192 280 B1

12

Bardziej korzystnie, T oznacza -R¹² lub -alkilo-R¹².

Korzystnie, R¹² oznacza aryl lub heteroaryl i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J. Bardziej korzystnie, R¹² oznacza 1-naftyl, izochinolil, indolil lub 2-alkoksy-1-naftyl.

Korzystnie, R¹⁰ oznacza alkil podstawiony karboksylem. Bardziej korzystnie, R¹⁰ oznacza C1-3 alkil podstawiony karboksylem.

Korzystnie, R¹⁵ oznacza alkil podstawiony karboksylem. Bardziej korzystnie, R¹⁵ oznacza C1-3 alkil podstawiony karboksylem.

₁

W korzystnym wykonaniu, we wzorze (II) A¹ oznacza:

₂ a A² oznacza wią zanie.

Korzystnie, w tym wykonaniu, X oznacza O.

Bardziej korzystnie, Y oznacza -CH2-.

Alternatywnie, Y oznacza -C(O)-.

₂

Alternatywnie, Y oznacza -C(O)-, a Z oznacza -N(R²)2-.

₈

Alternatywnie, w tym korzystnym wykonaniu, X oznacza -N(R⁸)-.

Bardziej korzystnie, Y oznacza -C(O)-.

Alternatywnie, Y oznacza -S(O)2-.

₂

Alternatywnie, Y oznacza -C(O)-, a Z oznacza -N(R²)2.

8 14

Alternatywnie, w tym korzystnym wykonaniu, X oznacza -N(R⁸)-, gdzie R⁸ oznacza -C(O)R¹⁴ lub -S(O)2R¹⁴.

14

Bardziej korzystnie, gdy R⁸ oznacza -C(O)R¹⁴, Y oznacza -C(O)-.

Alternatywnie, Y oznacza -S(O)2-.

₂

Alternatywnie, Y oznacza -C(O)-, a Z oznacza -N(R²)2.

14 2

Bardziej korzystnie, gdy R⁸ oznacza -S(O)2R¹⁴, wówczas Y oznacza -C(O)-, a Z oznacza -N(R²)2. Bardziej korzystne wykonanie niniejszego wynalazku stanowią związki o wzorze (II), w którym ₁

A¹ oznacza:

gdzie X oznacza -O-, a Y oznacza -CH2-; A² oznacza

PL 192 280 B1

V oznacza -(NR¹¹)-, a

K oznacza -C(O)-.

₁

Następnym korzystnym rozwiązaniem są związki o wzorze (II), w którym A¹ oznacza:

gdzie X oznacza O, a Y oznacza CH2, A² oznacza:

V oznacza -(NR¹¹)-, a

K oznacza -S(O)2-.

₁

Kolejnym korzystnym wykonaniem są związki o wzorze (II), w którym A¹ oznacza:

gdzie X oznacza O, a Y oznacza -CH2-,

A² oznacza wiązanie;

V oznacza -(NR¹¹)-, a

K oznacza -C(O)-.

₁

W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, w związkach o wzorze (II) A oznacza:

PL 192 280 B1

gdzie X oznacza O, a Y oznacza -CH2-, A² oznacza wiązanie;

V oznacza -(NR¹¹)-, a K oznacza -S(O)2-.

Korzystnie, W oznacza:

Najkorzystniej, W oznacza:

gdzie R² oznacza aralkil; lub ο

II

Ρ—Oaryl

I

Oaryl

Korzystnie, w takich korzystnych wykonaniach, L oznacza alkil, alkenyl, allil lub propargil. Bardziej korzystnie, L oznacza trichlorowcometyl, sulfhydryl lub alkil podstawiony trichlorowcometylem, sulfhydrylem lub hydroksylem.

W kolejnym korzystnym wykonaniu, w związkach o wzorze (II), A¹ oznacza:

PL 192 280 B1 ₂ a A² oznacza wiązanie. Korzystne grupy w tym korzystnym wykonaniu mają wyż ej podane znaczenia.

₁

W nastę pnym korzystnym wykonaniu we wzorze (II) A¹ oznacza:

₂ a A oznacza:

Korzystne, bardziej korzystne i najbardziej korzystne grupy w tym korzystnym wykonaniu mają wyżej podane znaczenia.

Jak przewidziano w niniejszym wynalazku, wiele inhibitorów proteazy NS3 ukierunkowanych na centrum aktywne może mieć charakter peptydomimetyków, tak więc mogą być zaprojektowane na podstawie naturalnych substratów. A zatem, korzystne podstawniki takich peptydomimetycznych inhibitorów według wynalazku obejmują takie, które odpowiadają łańcuchowi głównemu lub łańcuchom bocznym w naturalnie występujących substratach lub w substratach syntetycznych wykazujących wysokie powinowactwo wobec enzymu (niska wartość Km).

Dla specjalisty w tej dziedzinie oczywiste będzie, że niektóre grupy można zaklasyfikować jako heterocykliczne lub heteroaromatyczne, w zależności od punktu przyłączenia.

Związki według wynalazku mogą zawierać jeden lub więcej asymetrycznych atomów węgla, tak więc mogą występować w postaci racematów i mieszanin racemicznych, pojedynczych enancjomerów, mieszanin diastereomerów i pojedynczych diastereomerów. Wszystkie takie postaci izomeryczne związków są wyraźnie objęte zakresem wynalazku. Każdy stereogenny atom węgla może występować w konfiguracji R lub S. W zakres wynalazku wchodzą tylko takie kombinacje podstawników i zmiennych, które prowadzą do wytworzenia trwałych związków. Stosowane tu określenie „trwały odnosi się do związków, które wykazują trwałość wystarczającą, aby mogły zostać wytworzone i które zachowują integralność w czasie wystarczającym, aby mogły być stosowane do opisanych celów (tzn. do terapeutycznego lub profilaktycznego podawania ssakom lub do stosowania w chromatografii powinowactwa). Związki takie zazwyczaj są trwałe w temperaturze 40°C lub niższej, w nieobecności wilgoci lub w innych chemicznie reaktywnych warunkach przez co najmniej tydzień.

Związki według wynalazku można syntetyzować konwencjonalnymi sposobami. Korzystnie, związki takie syntetyzuje się dogodnie z łatwo dostępnych substancji wyjściowych.

W niniejszym opisie związki według wynalazku obejmują związki o wzorze (II), jak również ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne i proleki. Określenie „farmaceutycznie dopuszczalna pochodna lub prolek” oznacza dowolną farmaceutycznie dopuszczalną sól, ester, lub sól estru lub inną pochodną związku według wynalazku, która po podaniu pacjentowi, jest zdolna do dostarczenia mu (bezpośrednio lub pośrednio) związku według wynalazku.

Zgodnie z powyższym, wynalazek dostarcza również proleków związków według wynalazku, które są pochodnymi opracowanymi w celu poprawy własności biologicznych, takich jak dostępność przy podawaniu doustnym, klarowność, metabolizm lub dystrybucja w kompartmentach. Pochodne takie są dobrze znane w technice.

Jak wiadomo specjaliście w tej dziedzinie techniki, w celu poprawienia własności biologicznych związki według wynalazku można modyfikować przez wprowadzanie odpowiednich grup funkcyjnych. Modyfikacje takie są znane w technice i obejmują takie, modyfikacje, które zwiększają penetrację do

PL 192 280 B1 danego kompartmentu biologicznego (np. do krwi, układu limfatycznego, ośrodkowego układu nerwowego), poprawiają biodostępność przy podawaniu doustnym, poprawiają rozpuszczalność w celu umożliwienia podawania przez wstrzyknięcie, zmieniają metabolizm lub szybkość wydalania.

Określenie „chroniony” odnosi się do danej grupy funkcyjnej przyłączonej do odpowiedniej grupy chemicznej (grupy ochronnej). Przykłady odpowiednich grup ochronnych dla grupy aminowej i innych grup ochronnych są opisane w T.W. Greene i P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, wyd. 2, John Wiley and Sons (1991); L. Fieser i M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for

Organie Synthesis, John Wiley and Sons (1994); wyd. L. Paquette, Encyclopedia of Reagents for Organie Synthesis, John Wiley and Sons (1995) i podano je w odniesieniu do konkretnych związków stosowanych w niniejszym wynalazku.

Korzystnymi pochodnymi i prolekami są takie, które zwiększają biodostępność przy podawaniu doustnym związków według wynalazku, gdy są one podawane ssakowi (np. sprawiając, że podawane doustnie związki są łatwiej absorbowane we krwi), mają lepszy stopień klirensu lub lepszy profil metaboliczny, lub które wzmacniają dostarczenie związku macierzystego do przedziału biologicznego (np. do mózgu lub układu limfatycznego) w porównaniu do związku wyjściowego. Korzystne proleki obejmują pochodne, w których grupa zwiększająca rozpuszczalność w wodzie lub aktywny transport przez ściany jelita jest przyłączona do struktur związków o wzorze (II).

Farmaceutycznie dopuszczalne sole związków według wynalazku obejmują sole utworzone z farmaceutycznie dopuszczalnymi kwasami nieorganicznymi i organicznymi oraz z zasadami. Przykłady odpowiednich soli z kwasami obejmują octan, adypinian, alginian, asparaginian, benzoesan, benzenosulfonian, wodorosiarczan, maślan, cytrynian, kamforan, kamforosulfonian, cyklopentanopropionian, diglikonian, dodecylosiarczan, etanosulfonian, mrówczan, fumaran, glukoheptanian, glicerofosforan, glikolan, hemisiarczan, heptanian, heksanian, chlorowodorek, bromowodorek, jodowodorek, 2-hydroksyetanosulfonian, mleczan, maleinian, malonian, metanosulfonian, 2-naftalenosulfonian, nikotynian, azotan, szczawian, palmitynian, pektynian, nadsiarczan, 3-fenylopropionian, fosforan, pikrynian, piwalinian, propionian, salicylan, bursztynian, siarczan, winian, tiocyjanian, tosylan i undekanian. Inne kwasy, takie jak szczawiowy, aczkolwiek same nie są farmaceutycznie dopuszczalne, mogą być stosowane do wytwarzania soli użytecznych jako produkty przejściowe w wytwarzaniu związków według wynalazku oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami.

Sole utworzone z odpowiednimi zasadami obejmują sole z metalami alkalicznymi (np. z sodem i potasem), z metalami ziem alkalicznych (np. z magnezem), sole amonowe i sole N-(C1-C4alkil)⁴⁺. Wynalazek przewiduje również czwartorzędowanie dowolnych grup zawierających zasadowy atom azotu w związkach według wynalazku. W wyniku takiego czwartorzędowania wytworzyć można produkty rozpuszczalne lub dyspergowalne w wodzie lub w oleju.

Związki o wzorze (II) można wytworzyć zasadniczo sposobami zilustrowanymi w przykładach 1-8. Dla specjalisty w tej dziedzinie techniki zrozumiałe jednak będzie, że przedstawione schematy syntezy nie obejmują wyczerpującej listy sposobów i środków, za pomocą których można zsyntetyzować związki opisane i zastrzeżone w niniejszym zgłoszeniu. Inne sposoby będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie wiedzy. Ponadto, w celu otrzymania żądanych związków opisane powyżej różne etapy syntezy można prowadzić w zmienionej kolejności lub porządku.

Bez wiązania się z teorią, uważamy, że związki według wynalazku współdziałają kowalencyjnie lub niekowalencyjne z centrum aktywnym proteazy NS3 HCV lub innej proteazy serynowej, hamując zdolność takiego enzymu do rozszczepiania naturalnych lub syntetycznych substratów. Niekowalencyjne wiązania są korzystne, ponieważ zapewniają stosunkowo wyższą specyficzność hamowania, nie hamując innych niepożądanych celów, np. proteaz cysteinowych. A zatem, związki te będą wykazywały wyższy indeks terapeutyczny przy podawaniu ssakom niż kowalencyjne inhibitory proteazy, które oddziaływują z większą ilością proteazy i powodują niepożądane skutki toksyczne. Z drugiej strony, oddziaływania kowalencyjne są korzystne z uwagi na fakt, że zapewniają większą siłę hamowania, co pozwala na podawanie mniejszych dawek, zmniejszając tym samym problemy związane z ewentualnym brakiem specyficzności.

Nowe związki według niniejszego wynalazku są doskonałymi inhibitorami proteaz, zwłaszcza proteaz serynowych, a bardziej konkretnie inhibitorami proteaz NS3 HCV. Tak więc, związki te są zdolne do celowanego działania i hamowania proteaz, zwłaszcza proteaz serynowych, a bardziej konkretnie proteaz NS3 HCV. Jako takie, związki te zakłócają cykl życiowy wirusów, łącznie z HCV, i tym samym są przydatne jako środki przeciwwirusowe. Zahamowanie można zmierzyć różnymi sposobami, takimi jak opisane w przykładzie 10.

PL 192 280 B1

Określenie „środek przeciwwirusowy” odnosi się do związku lub leku, który wykazuje aktywność hamującą wobec wirusa. Środki takie obejmują inhibitory odwrotnej transkryptazy (łącznie z analogami nukleozydowymi i analogami nie-nukleozydowymi) oraz inhibitory proteazy. Korzystnie, inhibitorem proteazy jest inhibitor proteazy HCV.

Stosowane tu określenie „leczenie odnosi się do łagodzenia objawów konkretnego zaburzenia u pacjenta lub do poprawy moż liwego do oceny parametru związanego z konkretnym zaburzeniem. Stosowane tu określenie „pacjent odnosi się do ssaka, z człowiekiem włącznie.

Zgodnie z następnym wykonaniem, wynalazek niniejszy dostarcza kompozycji farmacueutycznych zawierających związek o wzorze (II) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól; dodatkowy środek wybrany z grupy obejmującej, ale nie wyłącznie, środek immunomodulacyjny, taki jak α-, β- i γ-interferon; inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna i amantadyna; inne ihibitory proteazy HCV;

inhibitory skierowane na inne cele w cyklu życiowym HCV, takie jak helikaza, polimeraza lub metaloproteaza; lub ich kombinację; oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, adiuwant lub rozcieńczalnik. W innym wykonaniu wynalazek dostarcza kompozycji zawierających związek o wzorze (I) lub (II) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól; oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, adiuwant lub rozcieńczalnik. Kompozycje takie mogą ewentualnie zawierać dodatkowy środek wybrany z grupy obejmującej środek immunomodulacyjny, taki jak α-, β- i γ-interferon; inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna i amantadyna; inne ihibitory proteazy HCV; inhibitory helikazy HCV; lub ich kombinacje.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub adiuwant” odnosi się do nośnika lub adiuwanta, który może być podawany pacjentowi razem ze związkiem według wynalazku, nie znosząc jego aktywności farmakologicznej i który jest nietoksyczny przy podawaniu w dawkach wystarczających do dostarczenia terapeutycznej ilości związku.

Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, adiuwanty i rozcieńczalniki, które można stosować w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, stearynian glinu, lecytynę, samoemulgujące układy dostarczania leku (SEDDS), takie jak da-tokoferol, bursztynian poliglikolu etylenowego 1000, środki powierzchniowo czynne stosowane w postaciach użytkowych środków farmaceutycznych, takie jak Tween lub inne podobne polimeryczne matryce do dostarczania leku, białka surowicze, takie jak albumina surowicy ludzkiej, substancje buforowe, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbinowy, sorbinian potasu, mieszaniny częściowych glicerydów nasyconych roślinnych kwasów tłuszczowych, wodę, sole i elektrolity, takie jak siarczan protaminy, wodorofosforan disodu, wodorofosforan potasu, chlorek sodu, sole cynku, krzemionka koloidalna, trikrzemian magnezu, poliwinylopirolidon, substancje oparte na celulozie, glikol polietylenowy, sól sodową karboksymetylocelulozy, poliakrylany, woski, polimery blokowe polietylenpolioksypropylen, glikol polietylenowy i lanolinę. W celu poprawy dostarczalności związków o wzorze (I) lub (II) dogodnie można również stosować cyklodekstryny, takie jak α-, β- i γ-cyklodekstryna, lub ich chemicznie modyfikowane pochodne, takie jak hydroksyalkilocyklodekstryny, obejmujące 2- i 3-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny lub inne solubilizowane pochodne.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo, przez wdmuchiwanie do nosa, miejscowo, doodbytniczo, donosowo, dopoliczkowo, dopochwowo lub z wszczepionego zbiornika. Korzystne jest podawanie doustne lub przez wstrzykiwanie. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać dowolne konwencjonalne, nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, adiuwanty lub rozcieńczalniki. W niektórych przypadkach, w celu zwiększenia trwałości formułowanego związku lub jego postaci użytkowej, pH kompozycji można regulować stosując farmaceutycznie dopuszczalne kwasy, zasady lub bufory. Stosowany tu termin „pozajelitowo obejmuje wstrzykiwanie podskórne, śródskórne, dożylne, domięśniowe, dostawowe, domaziówkowe, domostkowe, dokomorowe, do miejsca chorobowo zmienionego i doczaszkowe, oraz podawanie technikami wlewów.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci sterylnych nadających się do wstrzykiwania preparatów, na przykład, w postaci sterylnych nadających się do wstrzyknięć wodnych lub olejowych zawiesin. Zawiesinę taką wytwarza się znanymi w technice sposobami przy użyciu odpowiednich środków dyspergujących lub zwilżających (takie jak, na przykład, Tween 80) i środków zawieszających. Sterylne preparaty do wstrzyknięć mogą być również w postaci sterylnego nadającego się do wstrzyknięć roztworu lub zawiesiny w nietoksycznym dopuszczalnym do stosowania pozajelitowego rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, na przykład jako roztwór w 1,3-butanodiolu. Jako dopuszczalne rozcieńczalniki i rozpuszczalniki można stosować mannitol, wodę, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór

PL 192 280 B1 chlorku sodu. Ponadto, jako rozcieńczalnik lub środek zawieszający korzystnie stosuje się również sterylne, ciekłe oleje. Do tych celów stosować można dowolną mieszankę ciekłych olejów, łącznie z syntetycznymi mono- lub diglicerydami. Do wytwarzania preparatów do wstrzyknięć przydatne są także kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy, i ich glicerydowe pochodne, oraz naturalne farmaceutycznie dopuszczalne oleje, takie jak olej z oliwek lub olej rycynowy, szczególnie w ich polietoksylowanych wersjach. Takie olejowe roztwory lub zawiesiny mogą również zawierać jako rozcieńczalnik lub czynnik dyspergujący długołańcuchowy alkohol, taki jak opisane w Pharcopeia Helvetica (Ph. Helv.) lub podobny alkohol albo karboksymetylocelulozę lub podobne środki dyspergujące, które są zwyczajowo stosowane do wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych postaci użytkowych, takich jak emulsje i/lub zawiesiny. Do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych w postaci stałej, ciekłej lub w innej formie, można również stosować inne stosowane zwykle środki powierzchniowo czynne, takie jak Tween lub Span i/lub inne podobne środki emulgujące lub zwiększające biodostępność.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać doustnie w dowolnej postaci użytkowej odpowiedniej do takiego podawania, obejmującej, ale nie wyłącznie, kapsułki, tabletki, wodne zawiesiny i roztwory. W przypadku tabletek do podawania doustnego jako nośniki stosuje się zwykle laktozę i skrobię kukurydzianą. Zazwyczaj dodaje się również środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu. W kapsułkach do podawania doustnego użyteczne nośniki obejmują laktozę i suchą skrobię kukurydzianą. W wodnych zawiesinach do podawania doustnego składnik czynny łączy się ze środkami emulgującymi lub zawieszającymi. W razie potrzeby, można również dodawać substancje słodzące i/lub smakowo-zapachowe i/lub barwniki.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można również podawać w postaci czopków do podawania doodbytniczego. Preparaty takie wytwarza się przez zmieszanie związku według wynalazku z odpowiednim niedrażniącym nośnikiem, który jest stały w temperaturze pokojowej, ale ciekły w temperaturze odbytu, a zatem topi się w odbycie, uwalniając związki czynne. Substancje takie obejmują, ale nie wyłącznie, masło kakaowe, wosk pszczeli i glikole polietylenowe.

Miejscowe podawanie kompozycji farmaceutycznych według wynalazku jest szczególnie przydatne, gdy żądane leczenie obejmuje obszary lub narządy łatwo dostępne dla podawania miejscowego. Do zastosowania miejscowego na skórę kompozycje farmaceutyczne sporządza się w postaci odpowiedniej maści zawierającej składniki czynne zawieszone lub rozpuszczone w nośniku. Nośniki do podawania miejscowego związków według wynalazku obejmują, ale nie wyłącznie, olej mineralny, parafinę ciekłą, wazelinę białą, glikol propylenowy, polioksyetylen, polioksypropylen, wosk emulgujący i wodę. Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci lotionu lub kremu zawierającego składnik czynny zawieszony lub rozpuszczony w nośniku. Do odpowiednich nośników należą, ale nie wyłącznie, olej mineralny, monostearynian sorbitanu, polysorbate 60, woski z estrów cetylowych, alkohol cetearylowy, 2-oktylododekanol, alkohol benzylowy i woda. Kompozycje według wynalazku można również podawać do dolnego odcinka przewodu pokarmowego w postaci czopków lub wlewów doodbytniczych. W zakres wynalazku wchodzą również plastry do podawania przezskórnego.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można również podawać przez rozpylanie do nosa lub inhalację. Kompozycje takie wytwarza się technikami znanymi w farmacji i mogą być one sporządzone jako roztwory w soli fizjologicznej, z zastosowaniem alkoholu benzylowego lub innych odpowiednich środków konserwujących, promotorów absorpcji, fluorowęglowodorów i/lub innych znanych w technice środków solubilizujących lub dyspergujących.

W monoterapii do zapobiegania i leczenia chorób wirusowych, a zwłaszcza chorób związanych z HCV, odpowiednie są poziomy dawkowania inhibitorów proteazy według wynalazku w zakresie pomiędzy około 0,01 i około 100 mg/kg wagi ciała dziennie, a korzystnie od około 0,5 do około 75 mg/kg wagi ciała dziennie. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku podaje się zwykle od około 1 do około 5 razy dziennie, lub alternatywnie, w postaci ciągłego wlewu. Podawanie takie stosuje się w terapii chorób przewlekłych i ostrych. Ilość składnika czynnego, którą można łączyć z nośnikami, z uzyskaniem dawki jednostkowej, będzie zmieniać się w zależności od leczonego pacjenta i drogi podawania. Zazwyczaj kompozycja zawiera od około 5% do około 95% związku czynnego (wag./wag.). Korzystnie, kompozycje takie zawierają od około 20% do około 80% związku czynnego.

Gdy kompozycje według wynalazku zawierają kombinację związku o wzorze (II) z jednym lub więcej dodatkowymi środkami terapeutycznymi lub profilaktycznymi, wówczas zarówno związek, jak i dodatkowy środek, powinny być obecne w dawkach pomiędzy około 10 do 100%, a bardziej korzystnie pomiędzy około 10 do 80% dawki podawanej zwykle w monoterapii.

PL 192 280 B1

Zgodnie z jednym z wykonań, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają dodatkowy środek immunomodulacyjny. Przykłady takich dodatkowych środków obejmują, ale nie wyłącznie, α-, β- i γ-interferony.

Zgodnie z innym wykonaniem, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają dodatkowo inny środek przeciwwirusowy. Przykłady takich środków obejmują rybawirynę i amantadynę.

Zgodnie z kolejnym wykonaniem, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają dodatkowo inne inhibitory proteazy HCV.

Zgodnie z jeszcze innym wykonaniem, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają dodatkowo inhibitor skierowany na inne cele w cyklu życiowym HCV, takie jak helikaza, polimeraza lub metaloproteaza.

Po poprawie stanu zdrowia pacjenta, w razie potrzeby można dalej podawać dawkę podtrzymującą związku, kompozycji lub kombinacji według wynalazku. Następnie dawkę lub częstość jej podawania, albo i jedno i drugie, można zmniejszyć w zależności od objawów, do poziomu, przy którym utrzymuje się poprawa stanu zdrowia, a gdy objawy zostały złagodzone do żądanego poziomu leczenie można przerwać. Jednakże, po ponownym wystąpieniu objawów choroby pacjent może znowu wymagać długotrwałego leczenia.

Jak wiadomo specjaliście, mogą być wymagane dawki mniejsze lub większe od tu podanych. Konkretne dawkowanie i schemat leczenia dla danego pacjenta będzie zależeć od różnych czynników, obejmujących działanie konkretnego stosowanego związku, wiek, ciężar ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, dietę, częstość podawania, szybkość wydzielania, połączenie z innymi lekami, zaawansowanie i przebieg zakażenia, podatność pacjenta na zakażenie i od oceny lekarza prowadzącego.

Gdy związki według wynalazku lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole formułuje się razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, wytworzoną kompozycję można podawać in vivo ssakom, takim jak człowiek, w celu zahamowania proteaz serynowych, zwłaszcza proteazy NS3 HCV lub do leczenia albo zapobiegania zakażeniom wirusowym, a zwłaszcza zakażeniom wirusem HCV. Leczenie takie można również prowadzić stosując związki według wynalazku w kombinacji z innymi środkami, które obejmują, ale nie wyłącznie: środki immunomodulacyjne, takie jak α-, β- i γ-interferony; inne środki przeciwwirusowe, takie jak rybawiryna, amantadyna; inne inhibitory proteazy NS3 HCV; inhibitory skierowane na inne cele w cyklu życiowym HCV, takie jak helikaza, polimeraza, metaloproteaza, lub wewnętrzne miejsce włączenia rybosomu; oraz ich kombinacje. Takie dodatkowe środki można łączyć ze związkami według wynalazku, z wytworzeniem pojedynczej dawki jednostkowej. Alternatywnie, takie dodatkowe środki można podawać ssakom oddzielnie, w postaci dawek wielokrotnych.

Zgodnie z powyższym, związki o wzorze (II) według wynalazku, w których podstawniki mają wyżej podane znaczenia, poddaje się ssakom w celu hamowania aktywności proteazy serynowej. Korzystnie proteazą serynową jest proteaza NS3 HCV lub HCV.

Sposób zmniejszania aktywności proteazy serynowej u ssaków alternatywnie obejmuje etap podawania takiemu ssakowi opisanych powyżej kompozycji farmaceutycznych i kombinacji. Gdy kompozycja farmaceutyczna zawiera jako składnik czynny tylko związek według wynalazku, sposoby takie mogą dodatkowo obejmować etap podawania ssakowi środka wybranego spośród środków immunomodulacyjnych, środków przeciwwirusowych, inhibitorów proteazy HCV, lub inhibitorów skierowanych na inne etapy w cyklu życiowym HCV, takie jak helikaza, polimeraza lub metaloproteaza. Taki dodatkowy środek można podawać ssakowi przed, jednocześnie lub po podaniu kompozycji według wynalazku.

Związki i kompozycje według wynalazku są użyteczne do hamowania replikacji wirusa u ssaków, zatem nadają się do leczenia lub zapobiegania chorobom wirusowym, na przykład, takim jak HCV. Gdy kompozycja farmaceutyczna zawiera jako składnik czynny tylko związek według wynalazku, sposoby leczenia lub zapobiegania mogą dodatkowo obejmować etap podawania ssakowi środka wybranego spośród środków immunomodulacyjnych, środków przeciwwirusowych, inhibitorów proteazy HCV, lub inhibitorów skierowanych na inne etapy w cyklu życiowym HCV. Taki dodatkowy środek można podawać ssakowi przed, jednocześnie lub po podaniu kompozycji według wynalazku.

Opisane tu związki można również stosować jako odczynniki laboratoryjne. Związki według wynalazku mogą być również stosowane do leczenia i zapobiegania zanieczyszczeniom wirusami różnych materiałów, a tym samym do zmniejszania ryzyka zakażenia wirusami personelu laboratoryjnego lub medycznego lub pacjentów, którzy wchodzą w kontakt z takimi materiałami, Materiały te obejmują,

PL 192 280 B1 ale nie wyłącznie, materiały biologiczne, takie jak krew, tkanka, itd.; narzędzia chirurgiczne i przyrządy, narzędzia laboratoryjne i przyrządy; oraz aparatura i materiały do pobierania krwi.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej zamieszczono następujące przykłady. Przykłady te mają jedynie charakter ilustracyjny i w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku.

Ogólne materiały i metody

W przykładzie 1 opisano ogólny sposób syntezy związków według wynalazku. Bardziej konkretne sposoby wytwarzania związków według wynalazku, obejmujących związki 1-88 i 127-197, podano w przykładach 2-9.

Dane HPLC zamieszczone w Tabelach 1-5 wyrażono w odniesieniu do gradientu rozpuszczalnika; czasu retencji i % czystości. W każdym przypadku stosowano wodę dejonizowaną.

Prawidłowe jony molekularne (M + H)⁺ i/lub (M + Na)⁺ dla wszystkich związków otrzymano za pomocą spektrometrii mas metodą desorpcji z laserem w obecności matrycy (KRATOS MALDI I) lub metodą spektrometrii mas z elektrorozpylaniem (MICROMASS Quatro II).

P r z y k ł a d 1

Wiele aminokwasów nadających się do syntezy peptydylowych lub peptydomimetycznych związków według wynalazku można zakupić na rynku, na przykład z firmy Sigma Chemical Company lub Bachem Feinchemikalien AG (Szwajcaria). Aminokwasy, które nie są dostępne w handlu, można wytworzyć rutynowymi sposobami syntezy („Kinetic Resolution of Unnatural and Rarely Occuring Amino Acids: Enantioselectiye Hydrolysis of N-Acyl Amino Acids Catalyzed by Acylase I”, H.K. Chenault i in., J. Am. Chem. Soc., 111, 6354-6364 (1989) i cytowane tam publikacje; „Synthesis of β-γ-Unsaturated Amino Acids by the Strecker Reacion, W.J. Greenlee, J. Org. Chem., 49, 2632-2634 (1984); Recent Stereoselective Synthesis Approaches to Beta-amino Acids, D. Cole, Tetrahedron 50: 9517 (1994); „The Chemistry of Cyclic Alpha Imino Acids. A.B. Mauger, Vol. 4, „Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, wyd. Marcel Dekker (1977); „Recent Progress in the Synthesis and Reaction of Substituted Piperydynes”, Org. Prep. Procedure Int. 24, 585621 (1992), które to publikacje powołuje się tutaj jako stan techniki.

Niektóre związki o wzorze (II) można zsyntetyzować z aminokwasów, stosując procedury dobrze znane w dziedzinie syntezy peptydów i w chemii organicznej. Przykłady takich syntez przedstawiono ogólnie w publikacji Bodanszky i Bodanszky, „The Practice of Peptide Synthesis”, SpringerVerlag , Berlin, Niemcy (1984); „The Peptides, Gross i Meinhofer, wyd., Academic Press, 1979, Vol. I-III, oraz J.M. Stewart i J.D. Young, „Solid Phase Peptide Synthesis, wyd. drugie, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984); a także „Recent Adyances in the Generation of Molecular Diyersity”, W.H. Moss, G.D. Green i M.R. Payia, w „Annual Reportsd in Medicinal Chemistry, Vol. 28, str. 315-324; J.A. Bristol, wyd. Academic Press, San Diego, CA (1993), które to publikacje powołuje się tutaj jako stan techniki.

W syntezie peptydów w roztworze, α-aminową grupę aminokwasu, który ma być sprzęgany, stosuje się zwykle ochronę typu uretanowego, za pomocą takich grup jak Boc, Cbz, Fmoc lub Alloc, zaś wolną grupę karboksylową aktywuje się przez reakcję z karbodiimidem, takim jak DCC, EDC lub DIC, ewentualnie w obecności katalizatora, takiego jak HOBT, HOAt, HOSu lub DMAP. Odpowiednie są również inne sposoby, które prowadzi się z udziałem aktywnych estrów, halogenków kwasowych, aminokwasów i bezwodników aktywowanych enzymem, obejmujące reagenty fosfoniowe, takie jak BOP, Py-BOP, N-karboksybezwodniki, symetryczne bezwodniki, mieszane bezwodniki karbonowe, bezwodniki karbonowofosfinowe i karbonowo-fosforowe. Po wytworzeniu peptydu, grupy ochronne można usunąć sposobami wymienionymi powyżej, takimi jak uwodornienie w obecności katalizatora na bazie palladu, platyny lub rodu, działanie sodem w ciekłym amoniaku, działanie kwasem solnym, kwasem fluorowodorowym, bromowodorowym, mrówkowym, trifluorometanosulfonowym lub trifluorooctowym, drugorzędowymi aminami, jonem fluorkowym, halogenkami trimetylosililu, obejmującymi bromek i jodek, oraz substancjami alkalicznymi. Procesy syntezy opisanymi powyżej technikami można zautomatyzować stosując dostępną na rynku aparaturę, taką jak, ale nie wyłącznie, Adyanced Chemtech 357 FBS i 496 MOS; Tecan CombiTec, i Applied Biosystems 433A. Dla specjalisty w tej dziedzinie oczywisty będzie dobór odpowiednich metod i ich równoważników w zależności od konkretnego żądanego związku. Modyfikacje procesów chemicznych i dobór odpowiedniej aparatury leżą w zakresie wiedzy przeciętnego specjalisty.

P r z y k ł a d 2

Związki 1-26 (tabela 1) wytwarza się, jak przedstawiono na Schemacie 1.

PL 192 280 B1

SCHEMAT 1 “β

Żywica

HBtU

HO0t

DIEA

DMF

25%TFA/DCM lOlŁDIEACMF

300 iźywica

O-CHj-Z

H l‘NH ^rcb-@

1.Fmoc-Val, HBTU HOBI.DIEA.NMP

Z. 25% plp/DMF

3. Fmoe.V«l, HBTU HOBtDIEA.NMP

4. 25% plfrtJMF - - ίΗ,ηβ^-

5. Prz-ΟΗ,ΗΒΤυ

Żywica ' HOBt.DIEA.NMP

95%

TFAJ5·/.

HZO

VaFVal

P«

THF/H,CO/1NHCI

O-CHi-Z

Prz-Val-Vel301

1. 25%TFA?DCM

10%DtEA/DMF

Hau, HOffl

DIEA, DMF

PL 192 280 B1

Synteza 301-306

Etap A. Synteza 301. Żywicę 4-metylobenzhydryloaminową (1,05 mmola, 20,0 g), umieszczono w lejku ze spiekanego szkła i przemyto dimetyloformamidem (3 x 75 ml), 10% (obj./obj.) roztworem diizopropyloetyloaminy (DIEA) w dimetyloformamidzie (2 x 75 ml) i w końcu dimetyloformamidem (4 x 75 ml). Do żywicy dodano dimetyloformamidu w ilości wystarczającej do uzyskania zawiesiny, a następnie związku 300 (8,0 g, 20,8 mmola, wytworzonego z (2S) 2-(t-butyloksykarbonyloamino)butyroaldehydu sposobem według A.M. Murphy i in., J. Am. Chem. Soc., 114, 3156-3157 (1992), hydratu 1-hydroksybenzotriazolu (HOBTH₂O; 3,22 g, (21,0 mmola), heksafluorofosforanu O-benzotriazolo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego (HBTU; 8,0 g, 21,0 mmola) i DIEA (11 ml, 63 mmole). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, stosując wytrząsarkę typu „wrist arm”. Żywicę oddzielono na lejku ze spiekanego szkła przez sączenie próżniowe i przemycie dimetyloformamidem (3 x 75 ml). Nieprzereagowane grupy aminowe zablokowano przez reakcję żywicy z mieszaniną 20% (obj./obj.) bezwodnik octowy/dimetyloformamid (2 x 50 ml) bezpośrednio w lejku (10 min./przemycie). Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 75 ml) i dichlorometanem (3 x 75 ml), po czym wysuszono przez noc w piecu próżniowym i otrzymano związek 300a (26,3 g, 81% wydajności).

Grupę ochronną t-Boc usunięto z żywicy 300a, stosując syntezator Advanced Chemtech 396 Multiple Peptide, następującym sposobem. Żywicę 300a (0,05 mmola) spęczniono przez przemycie dichlorometanem (3x1 ml), a następnie odszczepiono grupę ochronną t-Boc, stosując mieszaninę 50% (obj./obj.) TFA/dichlorometan (1,0 ml) przez 10 minut (z wytrząsaniem), po czym świeży reagent (1 ml) przez 30 minut. Następnie żywicę przemyto dichlorometanem (3x1 ml), po czym DMF (3x1 ml), następnie układem 10% DIEA/dimetyloformamid (obj./obj.), a na końcu N-metylopirolidonem (3x1 ml). Otrzymano żywicę 301.

Etap B. Synteza 303. Związek ten wytworzono z żywicy 301 (0,05 mmola) stosując syntezator Advanced ChemTech 396 Multiple Peptide. Żywicę 301 acylowano roztworem 0,4M 302 i 0,4M HOBT w N-metylopirolidonie (0,5 ml), roztworem 0,4M HBTU w N-metylopirolidonie (0,5 ml) i roztworem 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję sprzęgania powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1 ml), a potem dichlorometanem (3x1 ml) i otrzymano żywicę 303.

Etap C. Synteza 305. Syntezę związku związanego z żywicą zakończono stosując syntezator Advanced ChemTech 396 Multiple Peptide. Żywicę 303 przemyto dichlorometanem (3x1 ml), a następnie odszczepiono grupę ochronną t-Boc, stosując układ 50% (obj./obj.) TFA/dichlorometan (1,0 ml) przez 10 minut (z wytrząsaniem), po czym świeży reagent (1 ml) przez 30 minut. Następnie żywicę przemyto dichlorometanem (3x1 ml), po czym DMF (3x1 ml), następnie układem 10% DIEA/dimetyloformamid (obj./obj.), a na końcu N-metylopirolidonem (3x1 ml) i otrzymano żywicę 304. Żywicę tę acylowano roztworem 0,4M Fmoc-walina i 0,4M HOBT w N-metylopirolidonie (0,5 ml), roztworem 0,4M HBTU w N-metylopirolidonie (0,5 ml) i roztworem 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję sprzęgania powtórzono. Cykle zautomatyzowane obejmowały: (1) przemywanie żywicy dimetyloformamidem (3x1 ml); (2) usunięcie grupy ochronnej przez działanie 25% (obj./obj.) roztworem piperydyny w dimetyloformamidzie (1 ml) przez 3 minuty, a następnie świeżym reagentem (1 ml) przez 10 minut; (3) przemycie żywicy dimetyloformamidem (3x1 ml) i N-metylopirolidonem (3x1 ml), przed sprzęganiem, jak opisano powyżej. W ten sposób sprzęgano Fmoc-walinę i kwas pirazyno-2-karboksylowy.

Etap D. Synteza 306. Przed odszczepieniem, żywicę przemyto mieszaniną 1:1 dichlorometan/metanol (3x1 ml), a następnie wysuszono pod próżnią. Od żywicy odszczepiono aldehyd albo przez działanie układem 95% TFA/5% H2O (obj./obj., 1,5 ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, albo przez działanie układem tetrahydrofuran/30% formalina/1N HCl, 9:1:1 (obj./obj./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu żywicy reagentem odszczepiającym (1 ml), połączone przesącze rozcieńczono wodą i liofilizowano, z wytworzeniem surowego związku 306 w postaci białego proszku. Związek ten oczyszczono metodą półpreparatywnej RP-HPLC na kolumnie Waters DeltaPak 300 A C18 (15 μ, 30 x 300 mm), eluując liniowym gradientem acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (obj./obj.) przez 45 minut przy przepływie 20 ml/min. Frakcje zawierające żądany produkt zebrano i liofilizowano, uzyskując związek 306.

PL 192 280 B1

P r z y k ł a d 3

Związki 27-29 (tabela 1) wytworzono, jak przedstawiono na schemacie 2.

PL 192 280 B1

Etap A. Synteza 301. Patrz Etap A, Sposób według schematu 1.

Etap B. Synteza 308. Żywicę 301 (6,0 g, 0,65 mmola/g, 3,9 mmola) spęczniono w lejku ze spiekanego szkła przez przemycie dichlorometanem (3 x 50 ml). Następnie odszczepiono grupę ochronną przez działanie układem 50% (obj./obj.) TFA/dichlorometan (50 ml) przez 10 minut (z przerywanym mieszaniem), a następnie przez 30 minut świeżym reagentem (50 ml). Żywicę następnie przemyto dichlorometanem (3 x 50 ml), dimetyloformamidem (2 x 50 ml), układem 10% DIEA/dimetyloformamid (obj./obj.) (2 x 50 ml), a na końcu N-metylopirolidonem (3 x 50 ml). Żywicę przeniesiono do 100 ml kolby i dodano N-metylopirolidonu, uzyskując zawiesinę, a następnie związku 307 (3,03 g, 8,0 mmola), HOBTH₂O (1,22 g, 8,0 mmola), HBTU (3,03 g, 8,0 mmola) i DIEA (4,2 ml, 24 mmole). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, stosując wytrząsarkę typu „wrist arm”. Obróbkę żywicy i zablokowanie 20% (obj./obj.) roztworem bezwodnika octowego w dimetyloformamidzie prowadzono, jak opisano dla żywicy 301 i otrzymano związek 308 (6,86 g, z wydajnością ilościową).

Etap C. Synteza 309. Związek ten wytworzono z żywicy 308 (0,15 mmola), stosując syntezator Tecan CombiTec. Żywicę 308 przemyto (0,076 mmola) dimetloformamidem (3x2 ml), odblokowano stosując 25% (obj./obj.) roztwór piperydyny w dimetyloformamidzie (2,5 ml) przez 5 minut, a następnie świeży reagent (2 ml) przez 20 minut. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 2,5 ml) i N-metylopirolidonem (3 x 2,5 ml), a następnie acylowano roztworem 0,4M Fmoc-walina i 0,4M HOBT w N-metylopirolidonie (0,8 ml), roztworem 0,4M HBTU w N-metylopirolidonie (0,8 ml) i roztworem 1,6 M DIEA w N-metylopirolidonie (0,6 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. Reakcję sprzęgania powtórzono. Procedury odblokowania i sprzęgania powtórzono w celu dodania drugiej reszty waliny i końcowej reszty kwasu pirazyno-2-karboksylowego. Następnie żywicę przemyto dichlorometanem (3 x 2,5 ml) i otrzymano związek 309.

Etap D. Synteza 310. Do żywicy 309 dodano mieszaniny 1:1 pirydyna/dichlorometan (obj./obj.) (1 ml), 0,8M roztworu dimetyloaminopirydyny w dimetyloformamidzie (0,2 ml) i 0,2M roztworu Z-COCl w dichlorometanie (1,5 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. Reakcję acylowania powtórzono. Żywicę przemyto dichlorometanem (3 x 2,5 ml), dimetyloformamidem (3 x 2,5 ml), dichlorometanem (3 x 2,5 ml) i na końcu układem 1:1 dichlorometan/metanol (3 x 2,5 ml) i otrzymano żywicę 310.

Etap E. Synteza 311. Przed odszczepieniem, żywicę przemyto układem 1:1 dichlorometan/metanol (3x1), a następnie wysuszono pod próżnią. Od żywicy odszczepiono aldehyd przez działanie układem tetrahydrofuran/formalina/kwas octowy/1N HCl, 5:1:1:0,1 (obj./obj./obj./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu żywicy reagentem odszczepiającym (1 ml), połączone przesącze rozcieńczono wodą i liofilizowano, z wytworzeniem surowego związku 311 w postaci białego proszku. Związek ten oczyszczono metodą półpreparatywnej RP-HPLC na kolumnie Waters DeltaPak 300 A C18 (15 μ, 30 x 300 mm), eluując liniowym gradientem acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (obj./obj.) przez 45 minut przy przepływie 20 ml/min. Frakcje zawierające żądany produkt zebrano i liofilizowano, uzyskując związek 311.

P r z y k ł a d 4

Związki 30-56 (tabela 1) wytworzono, jak opisano na schemacie 3.

PL 192 280 B1

Etap A. Synteza 301. Patrz etap A, sposób według schematu 1.

Etap B. Synteza 308. Patrz etap B, sposób według schematu 2

Etap C. Synteza 312. Związek ten wytworzono z żywicy 308 (0,15 mmola) stosując syntezator Tecan CombiTec. Żywicę 308 przemyto toluenem (3 x 2,5 ml), a następnie zawieszono w toluenie (1,0 ml). Do zawiesiny tej dodano albo 0,8M roztworu R₃ δ-izocyjanianu w toluenie (1,0 ml), a następnie 0,8M DIEA w toluenie (1,0 ml), albo roztworu 0,8M R₃ kwasu δ-karboksylowego i 0,8M DIEA w toluenie (1,0 ml), a następnie 0,8N azydku difenylofosforylu w toluenie (1,0 ml). Mieszaninę reakcyjną wytrząsano

PL 192 280 B1 przez 8 godzin w temperaturze 50°C. Następnie żywicę przemyto toluenem (3 x 2,5 ml) i dimetyloformamidem (4 x 2,5 ml) i otrzymano żywicę 312.

Etap D. Synteza 313. Patrz etap D, sposób według schematu 2.

Etap E. Synteza 314. Patrz etap E, sposób według schematu 2.

P r z y k ł a d 5

Związki 57-70 (tabela 1) wytworzono, jak opisano na schemacie 4.

PL 192 280 B1

Etap A. Synteza 301. Patrz etap A, sposób według schematu 1.

Etap B. Synteza 316. Związek ten wytworzono z żywicy 301 (0,05 mmola) stosując syntezator Advanced ChemTech 396 Multiple Peptide. Żywicę 301 acylowano roztworem 0,4M związku 315 i 0,4M HOBT w N-metylopirolidonie (0,5 ml), roztworem 0,4M HBTU w N-metylopirolidonie (0,5 ml) i roztworem 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję sprzęgania powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1 ml), a potem dichlorometanem (3 x 1 ml). Grupę ochronną Boc odszczepiono działając układem 50% (obj./obj.) TFA/dichlorometan (1,0 ml) przez 10 minut z szybkim mieszaniem, a następnie przez 30 minut świeżym reagentem (1,0 ml). Żywicę przemyto dichlorometanem (3 x 1,0 ml), dimetyloformamidem (2 x 1,0 ml), układem 10% DIEA/dimetyloformamid (obj./obj.) (2 x 1,0 ml), dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml), i w końcu dichlorometanem (3 x 1,0 ml). Otrzymano związek 316.

Etap C. Synteza 317a. Żywicę 316 acylowano roztworem 0,4M Z-CO2H i 0,4M HOBT w N-metylopirolidonie (0,5 ml), roztworem 0,4M HBTU w N-metylopirolidonie (0,5 ml) i 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję sprzęgania powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1 ml) i otrzymano żywicę 317a.

Etap C. Synteza 317b. Żywicę 316 acylowano 0,5M Z-COCl w dimetyloformamidzie (1 ml) i 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Etap acylowania powtórzono. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 2,5 ml) i otrzymano żywicę 317b.

Etap C. Synteza 317c. Żywicę 316 poddano reakcji z 1,0M Z-chlorku sulfonylu w dichlorometanie (0,5 ml) i 1M roztworem pirydyny w dichlorometanie (0,60 ml) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję powtórzono. Żywicę przemyto dichlorometanem (3 x 1,0 ml), a następnie dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml) i otrzymano żywicę 317c.

Etap C. Synteza 317d. Żywicę 316 poddawano reakcji z 0,5M Z-izocyjanianu w dimetyloformamidzie (1,2 ml) przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. Reakcję powtórzono. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml) i otrzymano żywicę 317d.

Etap C. Synteza 317e. Żywicę 316 poddawano reakcji z 0,5M Z-CHO w dimetyloformamidzie (1,2 ml) w obecności kwasu octowego (1,0 ml) i cyjanoborowodorku sodu (200 ml) 4 przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję powtórzono. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml) i otrzymano żywicę 317e.

Etap D. Synteza 318. Syntezę związku związanego z żywicą zakończono stosując syntezator Advanced Chemtech 396 Multiple Peptide. W celu dodania Fmoc-waliny, następnej Fmoc-waliny i w końcu kwasu pirazyno-2-karboksylowego prowadzono zautomatyzowane cykle opisane w etapie C, schemat 1.

Etap E. Synteza 319. Patrz etap E, sposób według schematu 2.

P r z y k ł a d 6

Związki 81-88 i 127-142 (tabele 3 i 4) wytworzono sposobem przedstawionym na Schemacie 5.

PL 192 280 B1

1. Fmoc-A’,HBTU

HOBt.DIEA.NMP

2.25%pip/DMF

3, Ftnoc-Val, HBTU

T-CąH/HBiU/HOSl

HO5t.DIEA.NMP < 25% pIp/DMF

T-COaDIEA/DMF νβΙ-Α-ΝΗ

COaH

S. FmocNH

T

T-SOjO/Pyr/DCM

HBTU. HOSt

DIEA.NMP

6.2S%piprt3MF

SCHEMAT 5

DIEA

DMF

25%TFA/DCM

EA/DMF

Λ

9S%TFA/5«

H20

X'NH

NH vaFA

THF/HjCOnNHC

321x1 ica '^•γ^νβΐ-Α’-ΝΗ^¹M O

PL 192 280 B1

Etap A. Synteza 301. Patrz etap A, sposób według schematu 1.

Etap B. Synteza 320. Syntezę związku związanego z żywicą prowadzono przy użyciu syntezatora Advanced Chemtech 396 Multiple Peptide, wychodząc z żywicy 165 (0,05 mola). W celu dodania Fmoc-aminokwasu, a następnie Fmoc-waliny i wreszcie końcowego Fmoc-aminokwasu prowadzono zautomatyzowane cykle opisane w etapie C, schemat 1. Grupę Fmoc usunięto, jak opisano uprzednio, stosując układ 25% piperydyna/dimetyloformamid (obj./obj.) i otrzymano żywicę 166.

Etap C. Synteza 321a. Żywicę 320 acylowano roztworem 0,4M T-CO2H i 0,4M HOBT w N-metylopirolidonie (0,5 ml), roztworem 0,4 M HBTU w N-metylopirolidonie i roztworem 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3x1 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3x1 ml) i otrzymano żywicę 321a.

Etap C. Synteza 321b. Żywicę acylowano 0,5M T-COCl w dimetyloformamidzie (1 ml) i 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Etap acylowania powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3x1 ml) i otrzymano żywicę 321b.

Etap C. Synteza 321c. Żywicę 320 poddano reakcji z 1,0M T-chlorku sulfonylu w dichlorometanie (0,5 ml) i 1M pirydyny w dichlorometanie (0,60 ml) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3 x 1,0 ml) i otrzymano żywicę 321c.

Etap C. Synteza 321d. Żywicę 320 poddano reakcji z 0, 5M T-izocyjanianu w dimetyloformamidzie (1,2 ml) przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. Reakcję powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3 x 1,0 ml) i otrzymano żywicę 321d.

Etap D. Synteza 322. Aldehyd odszczepiono od żywicy i całkowicie usunięto grupy ochronne przez działanie układem 95% TFA/5% H2O (obj./obj., 1,5 ml) przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po przemyciu żywicy świeżym reagentem odszczepiającym (1 ml) połączone przesącze dodano do zimnej mieszaniny 1:1 eter:pentan (12 ml) i wytworzony osad wyodrębniono przez odwirowanie i zdekantowanie. Otrzymany osad rozpuszczono w układzie 10% acetonitryl/90% H2O/0,1% TFA (15 ml) i liofilizowano, uzyskując surowy związek 322 w postaci białego proszku. Związek ten oczyszczono metodą półpreparatywnej RP-HPLC na kolumnie Waters DeltaPak 300 A C18 (15 μ, 30 x 300 mm), eluując liniowym gradientem acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (obj./obj.) przez 45 minut przy przepływie 20 ml/min. Frakcje zawierające żądany produkt zebrano i liofilizowano, uzyskując związek 322.

P r z y k ł a d 7

Związki 143-197 (tabela 5) wytworzono, jak przedstawiono na schemacie 6.

PL 192 280 B1

Etap A. Synteza 301. Patrz etap A, sposób według schematu 1.

Etap B. Synteza 326. Związek ten wytworzono z żywicy 301 (0,50 mmola), stosując syntezator Applied Biosystems Model 433A Peptide. Następnie, stosując standardowe cykle sprzęgania przy użyciu HBTU i HOBt w N-metylopirolidynonie jako reagentów sprzęgających, do żywicy dodano aminokwasy chronione grupami N^a-Fmoc i otrzymano żywicę 326.

Etap C. Synteza 327a. Syntezę zakończono, stosując syntezator Advanced Chemtech 396 Multiple Peptide. Żywicę 326 (0,05 mmola) oblokowano stosując roztwór 25% (obj./obj.) piperydyny w dimetyloformamidzie (1 ml) przez 3 minuty, a następnie świeży reagent (1 ml) przez 10 minut. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3x1 ml) i N-metylopirolidonem (3x1 ml). Żywicę acylowano roztworem 0,4M T-CO2H i 0,4M HOBT w N-metylopirolidonie (0,5), roztworem 0,4M HBTU w Nmetylopirolidonie (0,5 ml) i roztworem 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) i mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję sprzęgania powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3x1 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3 x 1 ml) i otrzymano żywicę 327a.

Etap C. Synteza 327b. Syntezę zakończono stosując syntezator Applied Biosystems Model 433A Peptide. Żywicę 326 (0,05 mmola) odblokowano przez działanie roztworem 25% (obj./obj.) pirydyny w dimetyloformamidzie (1 ml) przez 3 minuty, a następnie świeżym (1 ml) przez 10 minut. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3x1 ml) i N-metylopirolidonem (3x1 ml). Żywicę acylowano 0,5M T-COCl w dimetyloformamidzie (1 ml) i 1,6M DIEA w N-metylopirolidonie (0,35 ml) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Etap acylowania powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3x1 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3x1 ml) i otrzymano żywicę 327b.

Etap C. Synteza 327c. Syntezę zakończono stosując syntezator Applied Biosystems Model 433A Peptide. Żywicę 326 (0,05 mmola) odblokowano przez działanie roztworem 25% (obj./obj.) pirydyny w dimetyloformamidzie (1 ml) przez 3 minuty, a następnie świeżym (1 ml) przez 10 minut. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1 ml) i dichlorometanem (3 x 1 ml). Żywicę poddano reakcji z 1,0M T-chlorku sulfonylu w dichlorometanie (0,5 ml) i 1M pirydyny w dichlorometanie (0,60 ml) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3x1 ml) i otrzymano żywicę 327c.

Etap C. Synteza 327d. Syntezę zakończono stosując syntezator Applied Biosystems Model 433A Peptide. Żywicę 326 (0,05 mmola) odblokowano przez działanie roztworem 25% (obj./obj.) pirydyny w dimetyloformamidzie (1 ml) przez 3 minuty, a następnie świeżym (1 ml) przez 10 minut. Żywicę przemyto dimetyloformamidem (3x1 ml). Żywicę poddano reakcji z 0,5M T-izocyjanianu w dimetyloformamidzie (1,2 ml) przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. Reakcję powtórzono. Następnie żywicę przemyto dimetyloformamidem (3 x 1,0 ml), dichlorometanem (3 x 1,0 ml) i układem 1:1 dichlorometan/metanol (obj./obj.) (3x1 ml) i otrzymano żywicę 327d.

Etap D. Synteza 328. Patrz etap D, sposób według schematu 1.

P r z y k ł a d 8

Związki 79-80 (tabele 2 i 3) wytworzono, jak przedstawiono na schemacie 7.

PL 192 280 B1

SCHEMAT 7 □ΙΕΑ/

DCM

5hr o

T-CO-Val-Val-A -ΗΝ'Χ^'ΟΗ O

333

25% pip

DMF

Żywica

331

AcOH

TFE

DCM

T-CO-Val-Val-A-HN

2:2.6

PyBrop

DIEA

NHR²R^j

DMA/DCE

70C

T-COWal-Mal-ATHN

N(R²)₂

T-CO-val

HN ual

N[R

1. Fmoc-Α',ΗΒΤυ HOBt,DlEAj4MP

2. 25% pip/DMF

3. Fmoc-Val, HBTU HOBt,DIEA,NMP

4. 25% pip/DMF

5. Fmoc-Val, HBTU HOBt,DIEA,NMP

6. 25% pip/DMF

7. Cap wiłh T-CO₂H iO-A / ^•^-l-aAc-A i“QAc^/r)CM

2.) 50%TrA/DCM

Etap A. Synteza 330. Żywicę 2-chlorotritylową (2,2 mmola/g, 1,69 g) poddano reakcji ze związkiem 329 (0,385 g, 1,1 mmola) wytworzonym zgodnie ze sposobem S.L. Harbeson i in., J. Med. Chem., 37, 2918 (1994)) w dichlorometanie w obecności DIEA (0,47 ml, 2,7 mmola) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Reakcję przerwano dodatkiem metanolu i żywicę wyodrębniono na lejku ze spiekanego szkła przez sączenie próżniowe i przemyto dichlorometanem (3 x 25 ml). Żywicę wysuszono przez noc pod próżnią i otrzymano związek 330 (1,92 g, 0,49 mrówn./g).

PL 192 280 B1

Etap B. Synteza 332. Syntezę związku związanego z żywicą prowadzono stosując syntezator Applied Biosystems Model 433A Peptide, wychodząc z żywicy 330 (0,74 mmola). W celu dodania Fmoc-A¹, a następnie Fmoc-A² i Fmoc-A³ prowadzono zautomatyzowane cykle, jak opisano w etapie C, schemat 1. Grupę Fmoc usunięto, jak opisano uprzednio, przez działania mieszaniną 25% piperydyna/dimetyloformamid (obj./obj.) i otrzymano żywicę 332.

Etap C. Synteza 333. Przed odszczepieniem, żywicę przemyto układem 1:1 dichlorometan/metanol (3x1 ml), a następnie żywicę wysuszono pod próżnią. Od żywicy odszczepiono peptyd przez działanie układem kwas octowy:trifluoroetanol:dichlorometan (1:1:3) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu żywicy dichlorometanem, połączone przesącze zatężono pod próżnią i otrzymano surowy związek 333 w postaci białego proszku (0,48 g, 76%).

Etap D. Synteza 335. Związek 333 (0,05 g, 0,058 mmola) rozpuszczono w dimetyloacetamidzie (1 ml) i dodano DIEA (0,17 mola), odpowiedniej aminy (0,20 mmola) i pyBrop (0,12 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze 70°C, a następnie rozcieńczono H2O (8 ml) i odwirowano. 0trzymano osad, który wysuszono pod próżnią i uzyskano surowy związek 334. Związek ten rozpuszczono w N-metylopirolidonie (3 ml) i poddano reakcji z nadjodanem Dess-Martina (110 mg, 0,26 mmola) w temperaturze pokojowej przez noc. Do mieszaniny reakcyjnej dodano nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (5 ml) i 10% (wag./obj.) wodnego roztworu tiosiarczanu sodu (5 ml) i mieszano, a następnie dodano H2O (40 ml). Osad oddzielono przez odwirowanie, a substancję stałą wysuszono pod próżnią. W razie potrzeby usuwalne kwasem grupy ochronne usunięto przez działanie układem 1:1 kwas trifluorooctowy:dichlorometan w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią i surowy związek oczyszczono metodą półpreparatywnej RP-HPLC na kolumnie Waters DeltaPak 300 A C18 (15 μ, 30 x 300 mm), eluując liniowym gradientem acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (obj./obj.) przez 45 minut przy przepływie 20 ml/min. Frakcje zawierające żądany produkt zebrano i liofilizowano, uzyskując związek 335.

P r z y k ł a d 9

Związki 71-78 wytworzono z odpowiednich chronionych kwasów peptydowych. Kwasy takie wytworzono, jak opisano na schemacie 7, stosując żywicę 2-chloro-chlorotritylową. Następnie te kwasy peptydowe sprzęgano z jedną z następujących grup, stosując standardowe sposoby sprzęgania peptydów w fazie stałej. Podano również odniesienia do sposobów wytwarzania takich grup.

J. Oleksyszyn i in., Synthesis, 985-985 (1979)

S. Eigendy i in., Tetrahedron, 50, 3803-3812 (1994)

M.R. Angelestro i in., Tetrahedron Letters, 33, 3265-3268 (1992);

PL 192 280 B1

T.T. Curran, J. Organic Chemistry, 58, 6360-6363 (1993)

E. Edwards i in., J. Medicinal Chemistry, 38, 3972-3982 (1995).

W razie potrzeby, wytworzone produkty można utlenić do ketonów, stosując nadjodynian Dess-Martina, jak przedstawiono na schemacie 7. W razie potrzeby, usuwalne kwasem grupy ochronne można usunąć przez działanie układem 1:1 kwas trifluorooctowy:dichlorometan, w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią i surowy związek oczyszcza się metodą półpreparatywnej RP-HPLC na kolumnie Waters DeltaPak 300 A C18 (15 μ, 30 x 300 mm), eluując liniowym gradientem acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (obj./obj.) przez 45 minut przy przepływie 20 ml/min. Frakcje zawierające żądany produkt zbiera się i liofilizuje, z wytworzeniem końcowych produktów 71-78.

T a b e l a 1

Wzory i dane analityczne - związki 1-70

	Z	X	Y	Dane JS	HPLC
1	'σ°Ό	o	ch₂	ND	40-80%B; 5.484 min.; 6.580 min; 75:25 fastsiow
2		0	ch₂	(M+Na)= 693.2	40-80%B; 5.376 min; 95%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	Z	X	Y	Dane MS	HPL.C
3	w-o -'“AJ	0	CH2	(M+H}= 664.0 (M+Na)= 685.2	20-60%B; 8.527 min.; 100%
4	N-O •A),	0	ch₂	(M+Na)= 714.3	20*60%B; 8.885 min.; 100%
5	N-O I -^<Λ^	0	ch₂	(M+H)= 682.9. (M+Na> 704.0	2060%B; 7.541 min,; 95.6%
6	Λ^-	o	ch₂	(M+K)= 644.0, (M+Na)= 664.0	20-60% B; 7.822 min.; 100%
7	Cl IL Z F ^F	0	ch₂	<M+H)= 746.7. (M+Na)= 765.7	40-80%B; 4.228 min.; 92%
8	★ \_ ^0—Z F Q—/	o	ch₂	(M+H}= 671.5, (M+Na}= 694.0	20-60%B; 8.554 min.; 98%
9	W	o	ch₂	(M+Na)= 700.9	40-80%B; 4.688 min.; 100%
10	'a	o	ch₂	(M+Na)= 686.3	40-80% B; 4.630 min.; 94%
11	K λαΖα YjTĄJ	0	ch₂	671.1, (M+Na}= 693.2	40-80%B; 5.323 min.; 6.435 min.; B8;12, szybki: wolny
12	.o	0	ch₂	(M+H)= 613.7, (M+Na)= 636.2	20-60%B; 5.696 min.; 100%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	Z	X	Y	Dane MS	HPLC
13		0	ch₂	(M+Na)=695.3	20-60%8; 9.046 min.; 100%
14	-US	o	ch₂	(M+Na)=714.9	20-60%B; 7.729 min.; 100%
15	CU	o	ch₂	(M+Na}= 642.72	20-60%B; 7.133 min.; 100%
16	U	0	CH₂	(M+Na)- 685.6	20-60%B; 10.177 ‘ min.; 100%
17	Cu / p F ^r	o	ch₂	(M+Na)= 685.6	20-60%B; 10.265 min.; 100%
18	Ή'	0	CH₂	(M+Na)- 700.9	20-60%B; 10.696 min.; 100%
19	CO	o	ch₂	(M+Na)= 709.4	30-70%B; 9.216 min.; 100%
20	'CO	o	ch₂	(M+Ńa)= 667.3	20-60%B; 10.225 min; 100%
21	'O™	o	ch₂	(M+Na)-641.8	20-60%B; 7,15 min.; 100%
22	'a;	0	ch₂	(M+Na)= 653.1	20-60%B; 8.822 min.; 100%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	2	X	Υ	Dane MS	HPLĆ
23	* /°	0	ch₂	(M+Na)= 707.3	20-60%B; 11.362 min.; 100%
24	* ¢/-0^-°	Ο	ch₂	(M+Na)= 733.9	20-60%B; 10.964 min.; 100%
25		0	ch₂	(M+Na)= 828.2	40-80%B; 7.040 min.; 100%
26	♦	ο	ch₂	(M+Na)= 667.5	30-70%B; 8.907 min.; 96%
27	* φ CI	0	C(0)	(M+H) - 677.3	10-60%B; 10.83 min; 80%
28	b	ο	C(O)	(M+H) = 609.3	10-60%B; 9.65 min; 98%
29	'μ	0	C(0)	(M+H) = 589.6	10-60%B; 9.52 min; 98%
30	Ν''* ; CI	0	C(0)	(M+H) - 692.3	10-60% B; 11.52 min; 98% (wolny RT) 1060%B; 1U.Z3 min; 90% (szybki RT)

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	2	X	Y	Dane MS	HPLC
31	ά:	0	C(0)	(M+H) = 692.3	10-60%B; 11.21 min; 98% (slow RT); 1060%B; 10.23 min; 98%
32	« Ν'”* Ók	o	C(0)	(M+H)« 658.4	10-60% B; 10.72 min; 98%
33	N^‘ .A N	0	C(0)	(M+H) = 707.48	10-60%B; 9.9 min; 98%
34	O^s	0	C(O)	(M+H) ~ 752.6	10-60%B; 10.37 min; 98%
35	_fX \=N	0	C(0)	(M+H)» 681.5	10-60%B; 8.40 min; 98%
36	* s N ćk	o	C(O)	(M+H) = 666.6	10-6Q%8; 8.57 min; 86%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	Z	X	Y	Dane »3	HPLC
37	. ó	o	C(O)	(M+H) = 666.6	10-60%B; 8.70 min; 06%
38	ću	0	C(O)	(M+H) = 649.6	10-60%; 9.44 min; 98%
39	X Φ A	0	C(O)	(M+H) = 669.6	10-60%B; 10.06 min; 94%
40	« u' Ó^_N% 1 o	0	C(O)	(M+H) = 669.6	10-60%B; 11.0 min; 96% (slow RT); 10-60%B; 10.12 min; 98% (szybki RT)
41	X ¹ A”'	o	C<O)	(M+H) = 684.6	10-60%B; 9.81 min; 95%
42	G. i	0	C(O)	(M+H) = 654.6	10-60%B; 9.52 min; 98%
43		0	C(O)	(M+H) = 654.6	10-60%B; 9.73 min; 93%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	Z	X	Y	Dane MS	HPLC
44		0	c(O)	(M+H) = 668.56	10-60%B; 8,35 min; 92%
45	•	0	C(O)	(M+Na) - 716.5	10-60%B; 8.86 min; 80%
46		o	C(O)	(M+Na)« 716.1	10-60%B; 11.26/11.58 min (1:7); 98%; 10-60%S; 11.27/11.56 min (2:1); 98%
47	*	o	C(O)	(M+Na) s 676.1	10-60%B; 8,33 min; 96%
48		o	C(O)	(M+Na)« 697.8	10-60%B; 9.73 min; 90%
49	A ó	0	C(O)	(M+Na) = 647.2	10-60%B; 8.59 min; 90%
50	N^X σ¹	0	C{0)	(M+Na) = 660.6	10-60%8; 8.36 min; 94%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	Z	X	Υ	Dane MS	HPLC
51	* Λ αΑΑα	0	C(O}	(M+H) = 693.3	10-60%B; 9.42 mtn/10.37 min; 85%
52	•	0	C(O)	(M+H) = 700.4	10-60%B; 10.59 min; 98%
53		0	C(O)	(M+H) ·- 716.3	10-60%B; 11.24/12.18 min; 95%
54	ν< X	0	C(O)	(M+H) = 666.4	1Ó6Ó%B; 9.97 min; 98%
55	ł Ν Ο ĆA	0	C(O)	(M+H) = 682.3	10-60%B; 9.89 min; 98%
56	* 0γ°	ο	C(O)	(M+H) - 696.3	10-60%B; 10.34 min; 98%
57	• Cl Cf	ΝΗ	C(O)	(M+H) “ 676,31	20-60%B; 9.023 min.; 100%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	Z	X	Y	Dane MS	HPLC
58	’Ά	NH	C{O)	(M+H)= 637.5	20-80%B; 5.152 min.; 100%
59	ΛΛ — N O \_y	NH	C(O)	(M+H)= 617.5	20-80%B; 3.216 min.; 100%
60	'°X>	NH	C(0)	(M+H)= 638.5	20-80%B; 6.221 min.; 100%
61		NH	C(O)	(M+H)= 588.4	20-80%B; 4.503 min.; 100%
62	'0	NH	C(0)	(M+H)= 608.5	20-80%B; 5.055 min.; 100%
63	UO	NH	C(0)	(M+H)= 636.5	20-80%B; 5.697 min.; 100%
64	Ό	NH	C(0) C(O)	{M+H)= 636.5	20-80%B; 5.548 min.; 100%
65	Ό	NH	S(Ofe	(M+H)= 658.4	20-80%B; 5.632 min.; 100%
66	'W	NH	C(0)	(M+H)= 658.5	20-80%B; 6.690 min.; 100%
67	’Ό	NH	ch₂	(M+H}= 594.5	20-80%B; 5,114 min.; 100%
63	'Ό	NH	C(O)	(M+H)= 6Ϊ4.5	20-80%B; 5.5:‘i9 min.; 100%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 1

	Z	X	Y	Dane MS	HPLC
69	'0	0	ch₂	(M+H)=560.4	20-80%B; 8.062 min.; 100%
70	''a:	o	ch₂	(M+H)= 628.3	20-80%B; 9.990 min.; 100%

T a b e l a 2

Wzory i dane analityczne - związki 71-79

Z

	Z	W	Dane MS	HPLC
71	a	9 -90	(M+H)= 869.3	40-80%B; 8.812.8.920 min.; 2-1 miesz.wAbu 100%
72	''CO	ę -9O	(M+H}= 849.4	40-80%B; 8.3«π·η 539 min.; 2:1 .miesz. w Abu, 1CC9
73	’Ό	o-o b	(M+H)= 799.5	20-60%B; 12.519 min.; 95%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 2

	Z	W	Dane MS	HPLC
74	'0		(M+H)= 716	15.62 min.; >95%
75	'0	O F /V ^F F F^F	(M+H)=7 13	13.47 min.
76	'Ό	O O F F	(M+H)=7 17	13.05 min.; >90%
77	'Ό	S; 11 0	(M+H)= 703	10-90%B; 8.5 min.; 8.6 min (2:1); >95%
78	Ό	0 ri^ji O	(M+H)= 727	8.7 min,; 10 min. (2:1); 95%
79	Ό	0	(M+H)= 743	10-80%B; 5.4 min.; 95%

T a b e l a 3

Wzory i dane analityczne - związki 80-88

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 3

	Τ	W	Dane MS	HPLC
80	A · V— Ν 0 0	0 ο	(M+H)» 947	20-70%B; 6.15 min.; 95%
81	• αζ	C(0)H	(M+Na)= 553.60	5-45%B; 11.699 min.; 100%
82	Ο'°\ •	C(0)H	(M+H)- 547.4	5-45%B; 11.083 min.; 100%
83	* Ο	C(0)H	(M+Na)= 625.3	5-45%8; 12.258 min.; 100%
84	°γ^^/'^χ· 0	C(0)H	(M+Na)= 626.5	5-45%B; 11.083 min.; 100%
85	Η// .	C(0)H	(M+Na)= 589.5	5-45%B; 11.606 min.; 100%
86	Λύ'· <Αθ	C(0)H	(M+Na)= 717.2	5-45%B; 7.942 min.; 100%
07	Ck,O U	C(0)H	(M+H)» 655.3	15-55%B; 10.735 min.; 100%
88	θχχ°χ ,	C(0)H	(M+Na)= 644.1	20-60%B; 11.360 min.; 98%

PL 192 280 B1

T a b e l a 4

Wzory i dane analityczne - związki 127-142

	M	Dane MS	HPLC
127	*	(M+H)= 644.30	15-55%B; 6.08 min; 100%
128	•	(M+H)= 681.3	2Q-60%B; 8.11 min; 100%
129		(M+H)= 750.6	30-70%B; 6.99 min; 100%
130	4	(M+H)= 720.2	30-70%B; 6.71 min; 100%
131	ζϊτ·	(M+Na)= 715.4	30-70%B; 5.64 min; 100%
132	<ρ~\	(M+Na)= 715.2	30-70%B; 5.58 min; 100%
133	0. 4	{M+H)= 630.9	30-70%B; 3.78 min; 100%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 4

	Μ	Dane MS	HPLC
134	Ca *	(Μ+Η}= 634.0	15-55%Β; 5.90 min; 100%
135		(Μ+Η)« 691.60	30-70% Β; 4.22 min; 100%
136	Ο~\ *	(Μ+Η)= 651.20	40-80%Β; 5.59 min; 100%
137	Ο	(Μ+Η)= 659.10	40-80%Β; 4.65 min; 100%
138		(Μ+Η)= 651.70	40-80%Β; 3.83 min; 100%
139	• CH₃	(Μ+Η)= 582.90	40-80% Β; 2.34 min; 100%,
140	O^s- #	(Μ+Η)= 690.70	40-80%Β; 5.15 min; 100%
141	Qr, *	(M+Na)= 664.80	40-8Q%8; 3.93 min; 100%
142	G“V/ *	(M+Na)- 708.80	40-80%B; 5.398 min; 100%

PL 192 280 B1

T a b e l a 5

Wzory i dane analityczne - związki 143-197

	Τ	U	Dane MS	HPLC
143	Ο. *	S(O2)	(M+Na)= 566.71	20-80%B; 10.186 min.; >95%
144	Ο'·	S(Oz)	{M+Na)= 552.26	20-80%B; 9.985 min.; 90%
145	σ“'·	C(O}	(M+Na)= 531.60	20-80%B; 9.978 min; 95%
146	CO	C(0)	(M+Na)= 542.37	20-80%B; 10.404 min; 95%
147	GO	C(O)	(M+Na)= 544.42	20-80%B; 10.246 min; 95%
148	H₃C^'^X .	c<0)	(M+Na)= 454.26	20-80%B; 7.109 min; 95%
149	σ'	C(0)	(M+Na)= 516.05	20-80%B; 9.668 min; 95%
150	CUXX'	C(0)	(M+Na)= 649.17	20-80%B; 9.880 min; 95%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 5

	Τ	υ	Dane MS	HPLC
151		C(O)	(M+Ńa)= 648.45	20-80%8; 10.030 min; 95%
152	ΑΧΟ'-	C(O}	(M+Na)= 587.08	20-80%B; 7.892 min; 95%
153	Ν * tr	C(O)	(M+Na)= 505.47	20-80%B; 8.583 min; 95%
154	€Ρ	c(6>	(M+Na)= 554.96	20-80%B; 10.411 min; 95%
155		C(O)	(M+Na)= 551,90	20-80%B; 6.737 min; 95%
156	Χ9	C(O)	(M+Na}= 566.11	20-80%B; 9.227 min; 95%
157	Χ/'·	C(O)	(M+Na)= 594.59	20-80% B; 7.567 min; 95%
158	ł *	C(O)	{M+Na)= 567.00	20-80% B; 10.409 min; 95%
159	α	c<0)	(M+Na)= 566.10	20-80%B; 10.716 min; 95%
160	χ.	C(O)	(M+Na)= 559.27	20-80%B; 10.597 min; 95%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 5

	Τ	υ	Dane-®	HPLC
161	γ	¢¢0)	(M+Na)= 574.66	20-80%B; 3.723 min; 95%
162	σ°ν	C(O)	(M+Na)- 607.43	20-80%B; 12.019 min; 95%
163		C(O)	(M+H)= 514.63	20-80%B; 6.170 min; 95%
164	X-	C(O)	(M+H)= 538.67	20-80%B; 7.094 min; 99%; 20-80%B; 6.712 min; 99%
165		C(O)	(M+Na)= 620.77	20-80%B; 8,390 min; 99%
166		C(O)	(M+H)- 536.44	20-80%B; 7.787 min; 99%
167	*	C(O)	(M+H)= 525,58	20-80%B; 7.023 min; 99%
168	•	C(O)	(M+Na)= 582.25	20-60%B; 7.220 min; 98%
169	CV (Αη	C(O)	(M+H)= 552,32	20-80%B; 6.410 min; 99%
170	γ	C(O)	(M+H)= 550.77	20-80% B; 6.663 min; 99%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 5

	Τ	υ	.. Dapi&aS	HPLC
171	σ°^	C(0)	(M+H)- 538.87	20-80%B; 7.101 min; 99%
172	X	C{0)	(M+Na)= 554.79	20-80%B; 7.011 min; 99%
173	αχ	C(0)	(M+H)= 551.59	20-80%B; 8.029 min; 96%
174	•	C<0)	(M+H)= 549.86	20-80%B; 7.320 min; 99%
175	α> *	C{0)	(M+Na)= 554.79	20-80%B; 6.413 min; 99%
176	0^ X	C{0)	(M+H)= 555.05	20-80%B; 7.065 min; 99%
177		C(O)	{M+Na)= 584.55	20-80%B; 9.099 min; 99%
178		C(0)	(M+H)= 535.23	20-80%B. 8.038 min; 99% -
179		C{0)	(M+Na)= 569.07	10-80%B; 5.885; 98%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 5

	Τ	u	Dana, as	HPLC
180	c9	C{O)	(M+H)= 548.03	10-80% B; 5.991; 99%
181	a.	C(0)	(M+Na)= 533.91	10-80%B; 7,237; 99%
182	*	C(O)	(M+Na)- 830.91	10-80%B; 9.382; 95%
183	*	C(0)	(M+H}= 599.4	10-80% B; 7.0 min; 99%
184	„Ϋ-.	Ć(O)	(M+Na)= 545.27	10-80%B; 6.89 min; 99%
185		C(O)	(M+Na)= 643,91	10-80%B; 10.43 min; 99%
186	ζ^-ΛΛ- ci ·	C(O)	(M+Na)= 664.69	10-80%B; 9.95 min; 99%
187	sr-^ Nb,	C(O5	(M+Na}= 595.53	16-80%B; 8.61 min; 99%
188	+	C(0)	(M+Na)= 596.45	10-80%B; 9.0 min; 92%

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 5

	Τ	υ	Dane ..MS	HPLC
189	0 \ 9	C(O)	(M+Na}= 533.73	10-30%B; 8.438; 99%
190	9	C(O)	(M+Na)= 554.20	10-80%B; 7.990; 99%
191	γ.	C{0)	(M+Na)= 557.74	10-8C%B; 9.06 min; 99%
192	γ.	C(O)	(M+Na)= 545.70	10-80%B; 10.11 min; 99%
193	γ	C(O)	(M+Na)= 544,06	10-80%B; 8.41 min; 99%
194	9-	C(O)	(M+Na> 545.49	10-80%B; 8.41 min; 96%
195	ζλ ΊΓ «	C(O)	(M+Na)= 594.05	10-80%B; 8.3 min; 99%
196	/χ__γ°ν__ *	C(O)	(M+H)= 574.3	10-80%B; 8.84 min; 98%
197	«	c<0)	(M+H}= 588.4	10-80%B; 9.37 min; 99%

W powyższych tabelach RT = temperatura pokojowa

PL 192 280 B1

P r z y k ł a d 10

O ile związki o wzorze (II) są zdolne do hamowania proteazy serynowej NS3, są one w oczywisty sposób klinicznie przydatne do leczenia chorób wirusowych, łącznie z HCV. Opisane badania potwierdzają zdolność związków do hamowania HCV in vivo.

Peptydy i testy

Peptydy EDVV abuCSMSY (Abu oznacza kwas aminomasłowy), DEMEECSQHLPYI, ECTTPCSGSWLRD i EDW AbuC-p-nitroanilid zakupiono z firmy AnaSpec Inc. (San Jose, CA).

Zawartość peptydu w oczyszczonych liofilizowanych peptydach i w peptydach „in-house” oznaczono metodą ilościowej analizy azotu i odpowiednich wartości użyto do wytwarzania roztworów peptydów do badań (Galbreath). pKa oznaczano metodą Robertson Microlit Laboratories, Inc. (Madison, NJ).

Testy na rozszczepianie z użyciem metodą HPLC prowadzono w temperaturze 30°C, stosując 25 nM do 3,0 μΜ enzymu w 100 μl objętości roztworu zawierającego 50 mM HEPES-KOH (pH 7,8), 100 mM NaCl, 20% gliceryny, 5 mM DTT i odpowiednie ilości substratu (w DMSO), z lub bez peptydu NS4A, tak aby końcowe stężenie DMSO nie przekraczało 4%. Osobne badania kontrolne potwierdziły, że takie stężenie DMSO nie wpływa na aktywność enzymu. Reakcję rozszczepienia przerywano dodatkiem równej objętości mieszaniny 10% TFA:acetonitryl (1:1), a aktywność badano metodą kolumnowej HPLC z odwróconymi fazami (kolumna Rainin C18 Microsorb-MV, 5 mm, 4,6 x 250 mm; 0-50% acetonitryl, 0,1% TFA przy 3,33% min.), stosując aparaturę Hewlett Packard 1050 z autowtryskiem i szeregowym układem diod detekcji przy 210 nm i 280 nm (w razie potrzeby). Eluowane fragmenty peptydów zbierano i identyfikowano metodą spektrometrii mas i przez analizę N-końcowej sekwencji. Tożsamość fragmentu i stężenie potwierdzono na podstawie autentycznych, zsyntetyzowanych produktów. Początkowe szybkości rozszczepiania oznaczano przy < 20% konwersji substratu, a parametry katalityczne określano na podstawie kinetyki Michaelisa-Mentena, stosując program MultiFit (Day Computing, Cambridge, MA).

Badania spektrofotometryczne prowadzono na płytce do mikromiareczkowania z 96-studzienkami w temperaturze 30°C, stosując czytnik SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ze zdolnością kinetyczną. Rozszczepienie substratu EDVV AbuC-p-nitroanilid (5A-pNA) prowadzono z lub bez NS4A, stosując taki sam bufor jak do badań HPLC, w temperaturze 30°C, a uwolnienie pNA monitorowano przy 405 nm. Współczynnik ekstynkcji dla p-nitroaniliny jest niezależny od pH przy wartościach 5,5 i wyższych (H. Tuppy, i in., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 329, str. 278-288 (1962); Raybuck and Luong, niepublikowane obserwacje). W badaniach tych procentowa zawartość DMSO nie przekraczała 4%.

Zależności V_max, K_m i V_max/K_m od pH oznaczano stosując serie buforów o stałej sile jonowej, zawierających 50 mM MES, 25 Nm Tris, 25 mM etanoloaminy i 0,1 M NaCl [J.F. Morrison i R.F. Stone, Biochemistry, 27, str. 5499-5506 (1988)]. Punkt przegięcia krzywej dla danych log V obliczano metodą nieliniowego dopasowania najmniejszych kwadratów danych do równania:

log v = log[V_max/(1 + H/Ka)]

[M. Dixon i E.C. Webb, Enzymes; Academic Press: Nowy Jork, Vol. str. 138-164 (1979)]. Punkty przegięcia dla log [V/K] obliczono metodą nieliniowego dopasowania najmniejszych kwadratów danych do równania:

log v = log[V_max/(1 + H/Ka + K/H)]

[M. Dixon i E.C. Webb, Enzymes; Academic Press: Nowy Jork, Vol. str. 138-164 (1979)]. W obydwu przypadkach stosowano program KineTic (BioKin Ltd.).

Stałe kinetyczne dla reakcji bisubstratowej o mechanizmie uporządkowanym z szybko uzyskaną równowagą oznaczano z krzywej szybkości w funkcji [4A], [EDVV AbuC-pNA] metodą dopasowania najmniejszych kwadratów do równania 1 (J.F. Morrison, Biochim. Biophys. Acta, 185, str. 269-286 (1969)], jak opisano powyżej. Wartości K_ii i K_is dla inhibitorów peptydylowych wyznaczano na podstawie szybkości w funkcji [inhibitor], [substrat] i dopasowania do równania dla mieszanego hamowania:

szybkość = V_max[S]/{K_m(1 + [I]/Kis] + [S] (1 + [I]/K_H]}

W obydwu procedurach stosowano dostępny na rynku program KinetAsyst (StateCollege, PA). Wartość K obliczano z wykresu szybkość w funkcji [inhibitor] przez nieliniowe dopasowanie najmniejszych

PL 192 280 B1 kwadratów do równania Morrisona dla kompetycyjnego hamowania silnego wiązania [J.F. Morrison, Biochim. Biophys. Acta, 185, str. 269-286 (1969)]. W badaniu tym stosowano program KineTic (BioKin Ltd.).

Wyniki przedstawiono w tabeli 6 Wartości K_I podano w μΜ. Kategoria „A” oznacza zahamowanie < 1 μΜ; kategoria „B” oznacza zahamowania 1-100 μΜ; kategoria „C” oznacza zahamowanie > 100 μΜ. Oznaczenie „ND” wskazuje, że związek nie był badany.

T a b e l a 6

Dane hamowania enzymu dla związków 1-88 i 127-197

Nr związku	Ki (μΜ)	Nr związku	Ki (μΜ)	Nr związku	Ki (μΜ)
1	2	3	4	5	6
1	B	42	B	83	B
2	B	43	B	84	B
3	B	44	B	85	B
4	B	45	B	86	B
5	B	46	B	87	B
6	B	47	B	88	B
7	B	48	B	127	C
8	B	49	B	128	B
9	B	50	B	129	B
10	B	51	B	130	C
11	B	52	B	131	B
12	B	53	B	132	B
13	B	54	B	133	B
14	B	55	B	134	C
15	B	56	C	135	B
16	B	57	B	136	B
17	B	58	B	137	B
18	B	59	B	138	B
19	B	60	C	139	C
20	B	61	C	140	B
21	B	62	B	141	B
22	B	63	B	142	B
23	B	64	B	143	C

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 6

1	2	3	4	5	6
24	B	65	B	144	C
25	B	66	B	145	B
26	B	67	C	146	B
27	B	68	C	147	C
28	B	69	B	148	C
29	B	70	B
30	B	71	A
31	B	72	B
32	B	73	B
33	C	74	B
34	B	75	B
35	B	76	C
36	C	77	C
37	B	78	B
38	B	79	B
39	B	80	A
40	B	81	B
41	B	82	B

T a b e l a 6 c.d.

Nr związku	Ki (μM)	Nr związku	Ki (μM)
1	2	3	4
149	B	174	B
150	B	175	B
151	C	176	C
152	C	177	C
153	B	178	B
154	B	179	B

PL 192 280 B1

c.d. tabeli 6

1	2	3	4
155	B	180	C
156	B	181	C
157	B	182	C
158	B	183	B
159	B	184	B
160	B	185	B
161	C	186	C
162	B	187	C
163	C	188	C
164	C	189	C
165	C	190	C
166	C	191	C
167	C	192	C
168	B	193	C
169	C	194	C
170	C	195	B
171	C	196	B
172	C	197	B
173	C

Aczkolwiek przedstawiono wiele wykonań niniejszego wynalazku, oczywiste jest, że ich podstawową konstrukcję można zmieniać, uzyskując inne wykonania z zastosowaniem sposobów według wynalazku. Tak więc, należy rozumieć, że zakres niniejszego wynalazku jest określony raczej załączonymi zastrzeżeniami, niż konkretnymi wykonaniami, które podano jedynie przykładowo.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Inhibitor proteazy serynowej, związek o wzorze (II):

PL 192 280 B1 w którym m oznacza 0 lub 1;

każdy R² niezależnie oznacza wodór, alkil, alkenyl, aryl, aralkil, aralkenyl, cykloalkil, cykloalkiloalkil, cykloalkenyl, cykloalkenyloalkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heterocykliloalkenyl, heteroaryl lub heteroaralkil, albo dwie grupy R², związane z tym samym atomem azotu, tworzą z nim razem 5-7-członowy monocykliczny heterocykliczny układ pierścieniowy; w którym dowolny atom węgla w grupie R²ewentualnie jest podstawiony grupą J;

J oznacza alkil, aryl, aralkil, alkoksyl, aryloksyl, aralkoksyl, cykloalkil, cykloalkoksyl, heterocyklil, heterocykliloksy, heterocykliloalkil, grupę keto, hydroksyl, grupę aminową, alkiloaminową, alkanoiloaminową, aroiloaminową, aralkanoiloaminową, karboksyl, karboksyalkil, karboksamidoalkil, chlorowiec, grupę cyjanową, grupę nitrową, formyl, acyl, sulfonyl lub grupę sulfonamidową, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J¹;

J¹ oznacza alkil, aryl, aralkil, alkoksyl, aryloksyl, heterocyklil, heterocyklilooksy, grupę keto, hydroksyl, grupę aminową, alkanoiloaminową, aroiloaminową, karboksyl, karboksyalkil, karboksamidoalkil, chlorowiec, grupę cyjanową, grupę nitrową, formyl, sulfonyl lub grupę sulfonamidową;

L oznacza alkil, alkenyl lub alkinyl, w których dowolny atom wodoru ewentualnie jest podstawiony chlorowcem, zaś dowolny atom wodoru lub chlorowca związany z końcowym atomem węgla ewentualnie jest zastąpiony przez sulfhydryl lub hydroksyl;

A¹ oznacza

R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają wodór, alkil, alkenyl, aryl, aralkil, aralkenyl, cykloalkil, cykloalkiloalkil, cykloalkenyl, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil, i ewentualnie są podstawione 1-3 grupami J;

X oznacza wiązanie, -C(H)(R⁷)-, -O-, -S- lub -N(R⁸)-;

R⁷ oznacza wodór, alkil, alkenyl, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J;

PL 192 280 B1 ₈

R oznacza wodor, alkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, aralkanoil, heterocyklanoil, heteroaralkanoil, -C(O)R¹⁴, -SO₂R¹⁴ lub grupę karboksamidową, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J; albo R⁸ i Z, razem z atomami, z którymi są związane, tworzą zawierający azot mono- lub bicykliczny układ pierścieniowy ewentualnie podstawiony 1-3 grupami J;

R oznacza alkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil;

Y oznacza wiązanie, -CH₂-, -C(O)-, -C(O)C(O)-, -S(O)-, -S(O)₂- lub -S(O) (NR⁷)-, gdzie R⁷ ma wyżej podane znaczenie;

Z oznacza alkil, aryl, aralkil, cykloalkil, cykloalkiloalkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, -OR² lub -N(R²)₂, w których dowolny atom węgla ewentualnie jest podstawiony grupą J, zaś R² ma wyżej podane znaczenie;

karboksyalkil lub karboksamidoalkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J;

M oznacza alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl lub heteroaralkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J, przy czym dowolny atom węgla w grupie alkilowej może być zastąpiony przez heteroatom;

V oznacza wiązanie, -CH₂-, -C(H)(R¹¹)-, -O-, -S- lub -N(R¹¹)-;

R¹¹ oznacza wodór lub C_1-3 alkil;

K oznacza wiązanie, -O-, -S-, -C(O)-, -S(O)-, -S(O)₂- lub -S(O) (NR¹¹)-, gdzie R¹¹ ma wyżej podane znaczenie;

T oznacza -R¹², -alkil-R¹², -alkenyl-R¹², -alkinyl-R¹², -OR¹², -N(R¹²)2, -C(O)R¹², -C(=NO-alkil)R¹² lub

R¹⁰ oznacza alkil, karboksyalkil lub karboksamidoalkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J;

R¹² oznacza wodór, aryl, heteroaryl, cykloalkil, heterocyklil, cykloalkilidenyl lub heterocykloalkilidenyl, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J, albo pierwszy R¹² i drugi R¹², razem z atomem azotu, z którym są związane, tworzą mono- lub bicykliczny układ pierścieniowy ewentualnie podstawiony 1-3 grupami J;

R¹⁵ oznacza alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, heterocyklil, heterocykliloalkil, heteroaryl, heteroaralkil, karboksyalkil lub karboksamidoalkil, i ewentualnie jest podstawiony 1-3 grupami J; a

R¹⁶ oznacza wodór, alkil, aryl, heteroaryl, cykloalkil lub heterocyklil;

przy czym określenie alkil, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do prostołańcuchowego lub rozgałęzionego nasyconego alifatycznego rodnika węglowodorowego zawierającego 1-10 atomów węgla; określenie alkenyl, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do prostołańcuchowego lub rozgałęzionego mono- lub poli-nienasyconego alifatycznego rodnika węglowodorowego zawierającego 2-10 atomów węgla; określenie alkinyl, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do prostołańcuchowego lub rozgałęzionego mono- lub poli-nienasyconego alifatycznego rodnika węglowodorowego zawierającego 2-10 atomów węgla; określenie aryl, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do karbocyklicznego rodnika aromatycznego zawierającego 6-14 atomów węgla, który ewentualnie może być skondensowany z jednym do trzech pierścieni cykloalkilowych, aromatycznych, heterocyklicznych lub heteroaromatycznych; określenie cykloalkil, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do stabilnego niearomatycznego 3- do 8-członowego

PL 192 280 B1 pierścienia węglowego, który jest nasycony i ewentualnie może być skondensowany z jednym do trzech pierścieni cykloalkilowych, aromatycznych, heterocyklicznych lub heteroaromatycznych; określenie cykloalkenyl, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do stabilnego cyklicznego 5- do 7-członowego pierścienia węglowodorowego zawierającego co najmniej jedno endocykliczne podwójne wiązanie węgiel-węgiel; określenie cykloalkilidenyl, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do stabilnego cyklicznego 5- do 7-członowego pierścieniowego rodnika węglowodorowego zawierającego co najmniej jedno egzocykliczne podwójne wiązanie węgiel-węgiel, przy czym cykliczny pierścień węglowodorowy ewentualnie może być skondensowany z jednym do trzech pierścieni cykloalkilowych, aromatycznych, heterocyklicznych lub heteroaromatycznych; określenie heterocyklil, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do stabilnego 5- do 15-członowego mono-, bi- lub tricyklicznego pierścienia heterocyklicznego, który jest nasycony lub częściowo nienasycony, ale nie jest aromatyczny, który ewentualnie może być skondensowany z jednym do trzech pierścieni cykloalkilowych, aromatycznych, heterocyklicznych lub heteroaromatycznych i który składa się z jednego lub więcej atomów węgla i od jednego do czterech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę; określenie heteroaryl, samo lub w kombinacji z innym terminem, odnosi się do stabilnego 3- do 7-członowego monocyklicznego pierścienia heterocyklicznego, który jest aromatyczny i ewentualnie może być skondensowany z jednym do trzech pierścieni cykloalkilowych, aromatycznych, heterocyklicznych lub heteroaromatycznych i który składa się z jednego lub więcej atomów węgla i od jednego do czterech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę;

pod warunkiem, że gdy V i K oznaczają tlen, wówczas T ma znaczenie inne niż OR¹².
2. Związek według zastrz. 1, w którym R⁵ i R⁶ oznaczają wodór.
3. Związek według zastrz. 1, w którym R⁵ i R⁶ oznaczają wodór, A² oznacza:

a R⁹ oznacza izopropyl;

L oznacza etyl;

X oznacza -O- lub -N (H)-;

Y oznacza -CH₂-, -C(O)- lub -S(O)₂-;

V oznacza -N(H)-; a K oznacza -C(O)-.
4. Związek według zastrz. 3, w którym M oznacza izopropyl.
5. Związek według zastrz. 4, w którym Z oznacza aryl lub heteroaryl.
6. Związek według zastrz. 5, w którym T oznacza aryl lub heteroaryl.
7. Związek według zastrz. 6, w którym T oznacza pirazynę.
8. Związek według zastrz. 3, w którym X oznacza -O-, a Y oznacza -CH₂-.
9. Związek według zastrz. 8, w którym Z oznacza aryl lub heteroaryl.
10. Związek według zastrz. 9, w którym Z oznacza aryl.
11. Związek według zastrz. 3, w którym T oznacza -R¹², -OR¹², -N(R¹²)₂ lub grupę o wzorze

10 15 16 w którym R , R i R mają znaczenie jak określone w zastrz. 1.
12. Związek według zastrz. 11, w którym M oznacza alkil, heteroalkil, aryl, cykloalkiloalkil, aralkil lub aralkil, w którym jeden z atomów węgla w grupie alkilowej jest zastąpiony przez O lub S.
13. Związek według zastrz. 12, w którym M oznacza propyl, metyl, pirydometyl, benzyl, naftylometyl, fenyl, imidazolilometyl, tiofenylometyl, cykloheksylometyl, fenetyl, benzylotiometyl lub benzyloksyetyl.
14. Związek według zastrz. 13, w którym T oznacza aryl lub heteroaryl.

PL 192 280 B1
15. Związek według zastrz. 14, w którym T oznacza pirazynę.
16. Związek według zastrz. 1, w którym
17. Związek według zastrz. 16, w którym M oznacza izopropyl, a K oznacza -C(O)-.

12 12 12 12
18. Związek według zastrz. 17, w którym T oznacza -R , -alkil-R , -alkenyl-R , -OR , -N(R¹²)₂, -C(=NO-alkilo)R¹² lub grupę o wzorze ή Π 1fi 1 fi w którym R , R i R mają znaczenia określone w zastrz. 1.
19. Związek według zastrz. 1, w którym Z oznacza fenyl, a dowolny atom węgla jest ewentualnie podstawiony przez J.
20. Związek według zastrz. 1, który jest wybrany spośród następujących związków:

w których podstawniki mają następujące znaczenia:

Z X Y 1 O CH2 2 O CH2 3 Ν-Ό O CH2

PL 192 280 B1 Z X Y 4 Ν-Ό O CH2 5 N-O I O CH2 6 AV O CH2 7 Cl '(Abb ΜγΛ/ F O CH2 8 \ <Υ O CH2 9 ού O CH2 10 '« O CH2 11 </—y__ζ~ O CH2 12 Jb 1 O CH2 13 xo O CH2

PL 192 280 B1 Z X Y 14 z O CH2 15 CX O CH2 16 'q4' O CH2 17 α_Λ O CH2 18 QoV O CH2 19 'CO O CH2 20 O CH2 21 'CC O CH2 22 'Ci O CH2 23 __Cl s O CH2

PL 192 280 B1 Z X Y 24 O CH2 25 χ/γΧν O CH2 26 O CH2 27 ο- CI O C(O) 28 \ ο O C(O) 29 O C(O) 30 >< ΗΝ <ϊ“ CI O C(O) 31 ΗΝ'* Az¹ UTc, O C(O)

PL 192 280 B1 Z X Y 32 HN Ćk O C(O) 33 HN nh₂ O C(O) 34 HN φν' o^s O C(O) 35 >r HN bP O C(O) 36 s HN Ćę 0 O C(O) 37 HN 0^^ O C(O)

PL 192 280 B1 Z X Y 38 HN ćk O C(O) 39 HN^X Φ o'^N*o O C(O) 40 HN a.„ _ / 0 O C(O) 41 HN O C(O) 42 HN άθ 1 O C(O) 43 HN CA O C(O) 44 HN o—/ O C(O)

PL 192 280 B1 Z X Y 45 HtX X O C(O) 46 HN Cl O C(O) 47 X HN 7 O C(O) 48 HN'* ΧιΧ XX O C(O) 49 ,* HN γΛι XJ O C(O) 50 «Τ HN o^J O C(O) 51 HfX A οΐ'Χ^'Χ:! O C(O)

PL 192 280 B1 Z X Y 52 O C(O) 53 ΗΝ* ός ό O C(O) 54 ΗΐΧ . Α O C(O) 55 ΗΝ 0 Α O C(O) 56 ,χ ΗΝ Οφ \Χ O C(O) 57 X « Cl CI NH C(O) 58 > Ά NH C(O) 59 /—\ V NH C(O)

PL 192 280 B1 Z X Y 60 ''Ό NH C(O) 61 NH C(O) 62 Ό NH C(O) 63 ''Ό NH C(O) 64 Ό NH 66 66 65 'Ό NH S(O)2 66 NH C(O) 67 Ό NH CH2 68 Ό NH C(O) 69 O CH2 70 α O CH2

PL 192 280 B1 Z W 71 CC ę ^\\ A o 72 ę θ /¾^ 1? 0 '—y 73 Ό A /=\ —-β -0 —\\ z) b 74 '0 Yf 75 '0 0 F Ά F F^r 76 '0 O 0 A- F F

PL 192 280 B1 Z W 77 '0 °p II O 78 '0 O 79 Ό Ύ-'ό w których podstawniki mają nastę pują ce znaczenia:

T w 80 °i^H / H / oJ-O-f /—N 0 0 ' H Yoj 81 ch₃ C(O)H

PL 192 280 B1 T W 82 xh₂ HO C(O)H 83 O—\ O C(O)H 84 0 C(O)H 85 h₃c h - C(O)H 86 O y O OH C(O)H 87 ObjOH i ^H C(O)H 88 Cu, C(O)H w których podstawniki maja nastę pujące znaczenia:

PL 192 280 B1 M 127 O.

128 ^h°XX\ 129 130 / ¹ ............\ 131 132 133 0.

134 HN-<^ 135 ₀Λ-Ο-χ 136 O, 137 A'

PL 192 280 B1 M 138 Cr- 139 ch₃ 140 Ολ- 141 142 0^-7 w których podstawniki mają następujące znaczenia:

T U 143 η-, S(O2) 144 0' S(O2)

PL 192 280 B1 T U 145 σ^:' C(O) 146 Cd. C(O) 147 (X* C(O) 148 h₃g^ C(O) 149 0 C(O) 150 cuca' N C(O) 151 θτΧ' C(O) 152 A-O' H C(O) 153 H O C(O) 154 H N C(O) 155 ΗζΝΧχ/', \J ' C(O)

PL 192 280 B1 T U 156 ΙΌ' C(O) 157 Ό Η,Ν-γ^ΝΌ\ s— C(O) 158 t T C(O) 159 C(O) 160 co C(O) 161 Οχ. xo ćr C(O) 162 C(O) 163 C(O) 164 c/ C(O) 165 OH C(O)

PL 192 280 B1 T U 166 C(O) 167 C(O) 168 cR C(O) 169 / \ o R C(O) 170 0 cR C(O) 171 O- C(O) 172 HO / / C(O) 173 RX C(O) 174 / \ C(O) 175 0Q C(O)

PL 192 280 B1 T U 176 „Jp. 1 J C(O) 177 A C(O) 178 Y C(O) 179 % H C(O) 180 c9 H C(O) 181 N=< v- C(O) 182 C(O) 183 dF C(O) 184 γ. C(O)

PL 192 280 B1 T U 185 C(O) 186 C(O) 187 Ογλ C(O) 188 C(O) 189 V# \ C(O) 190 H A. C(O) 191 C(O) 192 A- OH C(O) 193 ęK C(O) 194 ę. C(O)

PL 192 280 B1 T U 195 9- Br C(O) 196 C(O) 197 C(O)
21. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera związek określony w zastrz. 1 w ilości skutecznej do hamowania proteazy NS3 HCV.
22. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do hamowania aktywności proteazy serynowej.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że proteazą serynową jest proteaza NS3 HCV.
24. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zakażeniu wirusowym zapaleniem wątroby C u pacjenta.
25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że związek formułuje się razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
26. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera związek określony w zastrz. 20 w ilości skutecznej do hamowania proteazy NS3 HCV.
27. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 20 do wytwarzania leku do hamowania aktywności proteazy serynowej.
28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że proteazą serynową jest proteaza NS3 HCV.
29. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 20 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zakażeniu wirusowym zapaleniem wątroby C u pacjenta.
30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że związek formułuje się razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.