PT100400B

PT100400B - Formulacoes de microemulsoes convertiveis

Info

Publication number: PT100400B
Application number: PT100400A
Authority: PT
Inventors: Albert J Owen; Seang H Yiv; Ani B Sarkahian
Original assignee: Affinity Biotech Inc
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-16
Publication date: 1999-08-31
Also published as: ATE183099T1; EP0580778B1; US5646109A; GR3031718T3; US5444041A; ES2136620T3; DK0580778T3; DE69229779D1; US5633226A; CA2108266C; JPH06507172A; EP0580778A4; MX9201816A; PT100400A; AU668509B2; DE69229779T2; CN1066183A; EP0580778A1; AU1896692A; WO1992018147A1

Description

Campo do invento

Esta é uma continuação em parte do pedido de Patente depositado em 14 de Fevereiro, 1992, entitulado CONVERTIBLE MICROEMULSION FORMULATIONS por Albert J. Owen; Seang H. Yiv e Ani B. Sarkahian, referência N^a AFBI-0200 o qual é, por sua vez, uma continuação em parte do pedido de Patente n^a de série 687691, depositado em 26 de Abril, 1991.

Este invento refere-se a microemulsões, e a processos para preparar e utilizar as mesmas. Mais particularmente, este refere-se a certas formulações de microemulsões únicas as quais são de fase reversível (i.e., convertíveis como se define em seguida), a processos para as preparar e armazenar, e à sua utilização em administração de drogas, proteínas, e materiais biologicamente activos similares, incluindo os terapeuticamente activos.

Como aqui utilizado, as microemulsões deste invento são dispersões estáveis de emulsão própria, de óleo-em-água, estabilizadas por películas interfaciais de moléculas tensioactivas. Estas microemulsões são também caracterizadas pelos seus pequenos tamanhos de partículas médios, geralmente inferiores a cerca de 0,1 micron, pela sua estabilidade numa larga gama de temperaturas, tipicamente de cerca de 5°C a 50°C, e por parecerem termodinamicamente estáveis, i.e., indefinidamente estáveis nesta gama. Elas são também relativamente insensíveis ao pH ou à força iónica da fase aquosa interna.

Estas microemulsões são ainda caracterizadas por se formarem espontaneamente sem necessidade de equipamento de tensão de corte elevada, o que é distinto das emulsões convencionais (macroemulsões) as quais têm que ser preparadas por fornecimento de quantidades significativas de energia, e as quais estão portanto sujeitas a temperaturas, pressões, e tensão de corte extremas, resultando danos nos conteúdos da emulsão.

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-3Para uma discussão adicional destes sistemas, ver Microemulsions, M.Kahlweit, Science, 240:617-621 (1988).

O termo convertível ou fase reversível, quando aqui utilizados para descrever as microemulsões deste invento, significa uma formulação de microemulsão capaz de ser convertida de um sistema de água-em-óleo (a/o) para um sistema de óleo-em-água (o/a) pela adição de água ao primeiro, como se descreve em maior detalhe abaixo.

Também, conversão, quando aqui utilizada, pretende definir em particular a reversão de uma emulsão a/o para formar uma emulsão o/a, como é distinto do termo inversão, quando utilizado na arte, o qual descreve principalmente a mudança de uma emulsão a/o numa formulação de água-em-óleo-em-água (a/o/a).

Antecedentes do invento

A preparação e a utilização de microemulsões na formulação de drogas, proteínas, e similares são conhecidas na arte. Ver, por exemplo, a Patente dos E.U. 3989843, a qual descreve a aplicação de microemulsões a formulações médicas. Também, em Eur. J. Biochem.. Samama et al.. 163(3):609-617 (16 de Março, 1987) descreve a alcool-desidrogenase do fígado em microemulsões de a/o iónicas, enquanto Lee et al.. descreve a extracção de epoxido-ciclase, utilizando várias microemulsões iónicas, em FEEBS Lett.. 244(2):347-50 (27 de Fev., 1989). No entanto, em cada caso, não se mostra nem sugere que estas microemulsões sejam de fase reversível.

As patentes dos E.U. 4931210, 4857506, 4714566 e 4590086, por outro lado, descrevem processos de preparação de emulsões de áqua-em-óleo as quais são depois invertidas para formar emulsões de fase de água-em-óleo-em-água (a/o/a) bem conhecidas. Estas preparações complexas são no entanto formulações de macroemulsões requerendo elevada enerqia de tensão de corte para as preparar, e o produto resultante é uma emulsão de a/o/a a qual compreende realmente um emulsão de a/o misturada com uma fase aquosa de tal maneira que a primeira fase aquosa interna

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-4não se mistura com a segunda fase aquosa contínua.

Os sistemas de emulsão para distribuição de agentes lipofílicos por via oral, parentérica, ou por administração cutânea local e para distribuição transdérmica do polipéptido hirudina, estão descritos na pat. dos E.U. N² 4719239 de Muller et al. Estão descritos sistemas de microemulsão contendo drogas possuindo um bom balanço hidrofílico/lipofílico para distribuição transdérmica no pedido de Patente da GB 2098865. Estas referências falham na descrição da utilização de uma microemulsão de água-em-óleo para distribuição mucosal de um agente activo solúvel em água, tal como as proteínas e os péptidos.

Têm-se também utilizado sistemas de emulsão como sistemas adjuvantes de vacinas, particularmente emulsões de água-em-óleo. A força da resposta imunitária e a velocidade com que esta é evocada podem ser modificadas pela natureza da matriz do líquido da vacina. Um exemplo amplamente utilizado deste tipo de sistemas é o adjuvante de Freund, o qual consiste em óleo de parafina e um tensioactivo, manido mono-oleato. Estas emulsões adjuvantes, devido à sua instabilidade termodinâmica, têm que ser emulsionadas com uma solução contendo o imunogénio imediatamente antes da injecção da vacina. Em adição, o óleo de parafina no adjuvante pode levar à inflamação do local da injecção e à formação de granulomas. Estes dois efeitos são grandemente aumentados se forem também empregues estimulantes imunológicos. No entanto, o óleo e os estimulantes imunológicos são úteis uma vez que estimulam a resposta imunológica aumentando a actividade dos macrofagos. Estes macrofagos engolfam as gotículas da emulsão e processam o imunogénio no local da injecção. Será portanto benéfico conseguir produzir um sistema adjuvante de vacinas que possua uma estabilidade prolongada e assim, uma prolongada vida em prateleira no seu estado de microemulsão preparada, e que possa ser formulado com um óleo biodegradável que não vá estimular a produção de granulomas.

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-5Continua a haver uma necessidade de novos e melhores sistemas de distribuição para materiais biologicamente activos. Muitos dos agentes terapêuticos que emergem da revolução biotecnológica, assim como algumas drogas antigas tais como a insulina e a calcitonina, consistem em grandes moléculas de proteínas. Estas drogas têm que ser injectadas no paciente porque são incapazes de sobreviver ao processo digestivo e não passam rapidamente através da mucosa que reveste o aparelho gastrintestinal para entrar na corrente sanguínea. Um novo sistema de distribuição de drogas que possa permitir que as proteínas entrem na corrente sanguínea através de, por exemplo, o revestimento do sistema digestivo, será de grande benefício.

Os sistemas de distribuição de drogas melhorados podem também proporcionar vantagens muito melhoradas para os pacientes. Por exemplo, a calcitonina é uma hormona peptídica genérica utilizada para o tratamento de osteoporose e outras doenças envolvendo lesões ósseas. A osteoporose afecta 24 milhões de americanos, incluindo 2/3 das mulheres após a menopausa. Correntemente, a maior parte da calcitonina é distribuída por injecção. 0 tratamento com calcitonina para a osteoporose requer uma administração a longo prazo com doses baixas mas frequentes da droga. Uma formulação oral ou de supositórios de calcitonina ofereceria grandes vantagens aos pacientes submetidos a estes tratamentos.

Sumário do Invento

De acordo com o presente invento, proporciona-se agora uma composição compreendendo uma microemulsão de água-em-óleo altamente estável contendo materiais solúveis em água, biologicamente, incluindo terapeuticamente activos, na sua fase aquosa interna, materiais solúveis em água que são controladamente libertados quando necessário imediatamente antes da administração pela rápida conversão da microemulsão numa emulsão de óleo-em-água por adição de água para formar uma fase aquosa contínua.

invento refere-se também à preparação destas microemulsões

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-6e à sua utilização na administração de materiais solúveis em água biologicamente e terapeuticamente activos.

Um aspecto do invento é a armazenagem ou manutenção dos materiais, tais como proteínas e péptidos, num estado solubilizado a temperaturas ou condições a que de outro modo seriam instáveis. Por exemplo, verificou-se que algumas proteínas podem ser armazenadas dissolvidas na fase aquosa das microemulsões de a/o a temperaturas às quais a proteína seria instável se armazenada meramente como uma solução aquosa. Estas proteínas podem ser armazenadas numa microemulsão a/o deste invento até serem utilizadas, altura em que se adiciona água até se formar uma emulsão de o/a, emulsão esta que então se administra oralmente ou por injecção. A microemulsão de a/o armazenada também pode ser administrada no corpo, no qual se converte numa emulsão de o/a por adição de fluidos corporais. Desta maneira, os problemas de armazenagem são minimizados ou eliminados.

Os tempos de armazenagem típicos para drogas, proteínas, e similares, que se podem conseguir com as composições deste invento são tempos normalmente de cerca de 1 a 48 horas, preferivelmente 16-24 horas até várias semanas ou meses, i.e.,

3-12, a temperaturas de entre cerca da temperatura ambiente ,

i.e., cerca de 20°c, até à temperatura em que a microemulsão quebra, geralmente na gama de cerca de 50-70°c, preferivelmente abaixo de cerca de 40°C. Certamente podem-se utilizar temperaturas abaixo da temperatura ambiente.

Ainda num outro aspecto deste invento, verificou-se que, inesperadamente, se uma microemulsão de a/o deste invento contendo, por exemplo, uma droga solúvel em água na fase aquosa interna, for administrada directamente ao corpo de animais, incluindo humanos, os próprios fluidos corporais são suficientes para converter a microemulsão de a/o numa emulsão de o/a, libertando assim lentamente a droga in situ. Isto é particularmente vantajoso sobre a pré-conversão com água porque se forem empregues os fluidos corporais, o volume total de

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-7líquido administrado é inferior. Este processo é particularmente útil na administração no cólon ou nos intestinos, de drogas tais como péptidos, proteínas, ou outras moléculas com ligações que são prontamente atacadas por enzimas, onde o óleo protege a droga nos intestinos até esta ser lentamente libertada à medida que os fluidos corporais convertem a emulsão. No caso da calcitonina, por exemplo, se esta for administrada no cólon, apenas na forma de uma solução aquosa, os enzimas do cólon destroem a droga antes de esta ser absorvida, enquanto que com as formulações de microemulsões deste invento, a calcitonina é protegida dos enzimas até ser lentamente libertada por hidratação dentro do corpo.

Numa concretização particular do presente invento, o sistema da microemulsão de a/o é formulado de modo que, com conversão com água adicional, se forma uma microemulsão de o/a. Este sistema é vantajoso pois o sistema convertido possui um menor tamanho de partículas. Noutra concretização do presente invento, o sistema de microemulsão é formulado na forma de um sólido à temperatura ambiente, o que se verificou, surpreendentemente, que aumentava a absorção e incorporação da droga e a actividade para distribuição gastrintestinal.

Uma concretização particular do presente invento é a utilização de uma microemulsão de a/o como um sistema adjuvante de vacinas. O imunogénio é transportado na fase aquosa do sistema adjuvante de microemulsão, o qual, quando introduzido dentro do corpo e ao contactar com os fluidos corporais aquosos, sofre a conversão para formar uma emulsão de óleo-em-água.

Administração ao corpo, quando aqui utilizado para sistemas que se convertem em macroemulsões, inclui qualquer processo não intravenoso tal como os meios intramuscular, subcutâneo, oral, rectal, ou peritoneal. Mais especificamente, a microemulsão de a/o é administrada parentericamente, enteri-camente, ou por meio de qualquer outra membrana mucosa. Os sistemas que se convertem em microemulsões podem também ser administrados por via intravenosa ou intra-arterial.

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Em ainda outra concretização deste invento, determinou-se que estas microemulsões de a/o podem também ser utilizadas para formular pomadas tópicas as quais são altamente vantajosas pois permanecem húmidas sobre a pele durante longos períodos de tempo sem secar nem fragmentar.

Breve Descrição das Figuras

A fig.l é um diagrama de fases de uma concretização do presente invento representando a região da microemulsão de água-em-óleo onde o óleo é Captex 200, a fase aquosa é uma solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Myverol 18-92:Cremophor EL.

A fig.2 é um diagrama de fases de uma concretização do presente invento representando a região da microemulsão de água-em-óleo em que o óleo é Captex 200, a fase aquosa é solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é

Capmul MCM:Centrophase 31:Tween 80.

A fig,3 é um diagrama de fases de uma concretização do presente invento representando a região da microemulsão de água-em-óleo em que o óleo é Captex 200, a fase aquosa é solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é

Capmul MCM:Centrophase 31:Cremophor EL.

A fig.4 é um diagrama de fases de uma concretização do presente invento representando a região da microemulsão de água-em-óleo em que o óleo é Whitepsol H-15, a fase aquosa é solução aquosa de sorbitol a 20% em peso em NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Myverol 18-92:Tween 80.

A fig.5 é um diagrama de fases de uma concretização do presente invento representando a região da microemulsão de água-em-óleo em que o óleo é MYVACET 9-45K, a fase aquosa é solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Myverol 18-92:Cremophor EL.

Descrição do Invento

A composição de material biologicamente activo deste invento compreende, no mínimo, (1) uma fase aquosa; (2) um óleo farmaceuticamente aceitável, ou suas misturas; (3) um

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-9tensioactivo dispersável em óleo, ou suas misturas; e (4) um material ou combinação de materiais biologicamente activos solúveis em água. Em adição, podem estar opcionalmente incluídos outros adjuvantes tais como agentes estabilizantes, corantes, drogas solúveis em óleo e similares. Cada um destes componentes e adjuvantes deve ser adequado para utilização no paciente e será normalmente de grau alimentar e/ou um material farmaceuticamente aceitável. Quaisquer drogas estarão presentes nas quantidades terapeuticamente eficazes. As composições do presente invento são microemulsões de água-em-óleo (a/o) biologicamente compatíveis. Estas composições são biologicamente compatíveis no sentido em que não são tóxicas e contêm materiais biodegradáveis ou não absorvíveis. Por não tóxico entende-se não tóxico dependendo da via de administração a um paciente, pois a toxicidade de uma via pode não ser equivalente à de outra via.

As microemulsões do presente invento são criadas pela interacção entre o tensioactivo ou mistura de tensioactivos e as fases oleosa e aquosa. 0 tensioactivo ou mistura de tensioactivos possui, preferivelmente, um balanço hidrofílico-lipofílico (HBL) dentro de uma gama específica. Por balanço hidrofílico-lipofílico”, entende-se uma quantidade empírica, sobre uma escala arbitrária, que seja uma medida da polaridade de um tensioactivo ou mistura de tensioactivos. Ver P. Becher et al. , Nonionic Surfactant, Phvsical Chemistrv¹¹, Mareei Dekker, NY (1987), páginas 439-456. É uma termo amplamente conhecido e utilizado. As microemulsões de a/o podem ser sólidos, incluindo semi-sólidos, geles ou líquidos à temperatura ambiente.

Mais particularmente, a quantidade dos componentes deve ser tal que o material biologicamente activo compreenda entre 10”^ e 100 % peso/volume, com base no volume da fase aquosa. Geralmente, no sistema de microemulsão, a fase aquosa varia até cerca de 60 por cento em volume; o conteúdo em óleo varia entre cerca de 5 e cerca de 99, preferivelmente entre cerca de 10 e cerca de 99 por cento em volume; o conteúdo de tensioactivo varia entre cerca de 1 e cerca de 70 por cento em volume.

,4r*

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-10O conteúdo de água nas microemulsões de a/o é até cerca de 20 por cento em volume, preferivelmente até cerca de 3 0 por cento em volume, mais preferivelmente até cerca de 40 por cento em volume, e em alguns casos, tão elevada como 60 por cento em volume da microemulsão. Num sistema de microemulsão de a/o de elevado conteúdo de fase aquosa preferido, o conteúdo de fase aquosa varia entre cerca de 20 e cerca de 60 por cento em volume, preferivelmente entre cerca de 30 e cerca de 60, mais preferivelmente cerca de 40-55%; 0 conteúdo de óleo varia entre cerca de 5 e cerca de 50 por cento em volume, preferivelmente entre cerca de 5 e cerca de 40, mais preferivelmente cerca de 5-15%; o conteúdo de tensioactivo varia entre cerca de 5 e cerca de 75 por cento em volume, preferivelmente entre cerca de 20 e cerca de 65, mais preferivelmente cerca de 40-50%. Num sistema de microemulsão de a/o de baixo conteúdo de fase aquosa preferido, a fase aquosa deve compreender não mais do que cerca de 20%, preferivelmente o conteúdo de fase aquosa varia entre cerca de 0,1 e cerca de 20 por cento em volume, mais preferivelmente cerca de 0,1-15%; o conteúdo de óleo varia entre cerca de 30 e cerca de 99 por cento em volume, preferivelmente cerca de 50-90%; o conteúdo de tensioactivo varia entre cerca de 1 e cerca de 70 por cento em volume, preferivelmente cerca de 2-50%. Quando a fase aquosa da microemulsão de a/o é inferior a cerca de 20% em volume, prefere-se ter uma razão da fase oleosa para o tensioactivo de HLB baixo, HLB inferior a cerca de 8, preferivelmente inferior a cerca de 5, de pelo menos 6:1, e preferivelmente de pelo menos cerca de 10:1. o componente água da fase aquosa pode ser parcialmente ou completamente substituído pela incorporação de outro solvente polar, biologicamente compatível, tal como álcoois poli-hidrólicos possuindo pelo menos 2 grupos hidroxilo, glicerol, propilenoglicol, e suas misturas, no entanto prefere-se ter a fase aquosa constituída por pelo menos 30%, e mais preferivelmente 50% de água. Assim, o termo fase aquosa, quando aqui utilizado, pretende abranger uma fase compreendendo água, estes solventes polares, e suas misturas. A fase aquosa pode compreender, em adição à água (ou outro solvente polar) e ao material activo, outros adjuvantes tais como, mas não

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AFBI - 0288 limitados a, agentes estabilizantes, corantes, modificadores, e similares, ou sais (p.ex., quando se utiliza solução salina).

A formulação de uma microemulsão possuindo um elevado conteúdo de fase aquosa é preferido nas situações onde o material biologicamente activo possui uma solubilidade em água relativamente baixa ou onde se deseja uma quantidade relativamente elevada do material biologicamente activo no sistema de microemulsão.

Os adjuvantes, tais como agentes conservantes, colorantes, aromatizantes ou drogas solúveis em óleo, p.ex., esteroides, se estiverem presentes, devem ser incluídos apenas nas quantidades que não irão afectar adversamente as novas propriedades da microemulsão, geralmente em quantidades entre cerca de 0 e 20% em volume, com base no volume total da composição.

Na descrição seguinte será entendido que a natureza dos óleos e tensioactivos não é crítica para além das qualificações particulares apresentadas abaixo, e podem geralmente ser quaisquer dos materiais conhecidos convencionalmente empregues e que são aceites na indústria alimentar e farmacêutica.

O óleo, ou suas misturas, pode ser líquido à temperatura ambiente, embora em alguns casos, seja aceitável um aquecimento moderado de um óleo sólido para formar um líquido. Se a injecção for a via de administração preferida, o óleo deve ser líquido à temperatura ambiente. 0 aquecimento de um óleo que é sólido à temperatura ambiente é desejável para formulações de suposi-tórios, cremes, pomadas, e em alguns casos, de cápsulas orais. Os exemplos de óleos adequados para os propósitos deste invento incluem triésteres de glicerol possuindo entre cerca de 9 e 83, preferivelmente 20-60 átomos de carbono, e diésteres de propilenoglicol possuindo entre cerca de 7 e 55, preferivelmente 15-40 átomos de carbono, mais preferivelmente, ésteres de propilenoglicol dos ácidos cáprico e caprílico possuindo entre 19 e 23 átomos de carbono. Os triglicéridos são ainda definidos como triglicéridos de cadeia curta possuindo 9-15 átomos de

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‘La ' carbono, triglicéridos de cadeia média possuindo 21-45 átomos de carbono, e triglicéridos de cadeia longa possuindo mais do que 45 átomos de carbono. Os triglicéridos de cadeia curta e de cadeia média, e preferivelmente os de cadeia curta, são preferidos para sistemas de microemulsão de a/o líquidos. Os diésteres de propilenoglicois são ainda definidos como de cadeia curta possuindo entre 7-11 átomos de carbono, de cadeia média possuindo entre 15-31 átomos de carbono, e de cadeia longa possuindo mais do que 31 átomos de carbono. Os exemplos de triésteres de glicerol incluem óleos naturais comestíveis tais como os óleos de canola, de milho, de oliva, de girassol e de coco, triacetina, os ésteres do ácido decanóico, e óleos quimicamente sintetizados tais como o 1-oleil-2,3-diacetilglicerol. Os diésteres de propilenoglicois incluem os ésteres de propilenoglicol dos ácidos cáprico e caprílico, tais como o Captex 200® (Karlshamns Lipid Specialities, Columbus, OH) e outros grupos éster como se descreveu anteriormente para o glicerol.

Como se mostra nos dados seguintes, verificou-se noutra concretização que, surpreendentemente, quando se utilizam conjuntamente, uma mistura de um óleo e tensioactivos mono ou diglicéridos, particularmente Captex 200® e Capmul MCM®, manufacturados por Karlshamns Lipid Specialities of Columbus, OH, como se define em seguida, há um aumento significativo na actividade do ingrediente activo. Portanto, dependendo da natureza da droga, podem ser preferidas misturas de óleos e mono e diglicéridos.

O tensioactivo, ou mais preferivelmente, a mistura de tensioactivos, deve ser escolhida de entre aquelas que possuem um valor resultante de HLB na gama de cerca de 7 a 14, mais preferivelmente de 8 a 13. Quando se emprega uma mistura de tensioactivos, embora alguns dos componentes possam possuir um valor fora da gama desejada, p.ex., inferior a cerca de 5, deve entender-se que por mistura de tensioactivos com HLB superiores a, p.ex., cerca de 9, o valor de HBL combinado resultante estará na gama de 7 a 14. Também, quando se emprega

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AFBI - 0288 uma mistura, é desejável que pelo menos um destes tensioactivos possua um peso molecular de pelo menos cerca de 500, embora este peso não seja crítico. Verificou-se que embora alguns sistemas de distribuição de proteínas e péptidos necessitem da presença de certos tensioactivos, tais como esteroides ou lecitina, os presentes sistemas de microemulsões de a/o não requerem qualquer tensioactivo ou mistura de tensioactivos particulares, e podem estar essencialmente isentos, isto é, contendo menos que cerca de 0,05% em peso na microemulsão de a/o, de qualquer dos tensioactivos indicados. No entanto, para promover a biodisponibilidade do agente activo, são preferidos certos tensio-activos.

É preferida uma mistura de tensioactivos guando a microemulsão de a/o possui um conteúdo de fase aquosa superior a cerca de 20% em volume. A mistura inclui um tensioactivo com um HLB elevado ou misturas de tensioactivos com HLB elevados, possuindo um valor de HLB superior a cerca de 9 e preferivelmente pelo menos um tensioactivo possuindo um valor de HLB superior a cerca de 12. Em algumas concretizações possuindo um conteúdo de fase aquosa relativamente elevado, superior a cerca de 40% em volume, é preferido ter pelo menos um tensioactivo com um HLB superior a cerca de 15, e um tensioactivo de HLB baixo possuindo um valor de HLB inferior a cerca de 5, os quais, conjuntamente, possuem um valor de HLB médio de cerca de 7 a 14. Adicionalmente, o tensioactivo deverá ser desejavelmente, altamente solúvel em óleo ou dispersável em óleo, e a rápida adição do tensioactivo ao óleo torna-o assim de fácil processamento.

Os tensioactivos que podem ser empregues nas nossas composições incluem tanto agentes iónicos, i.e., catiónicos, aniónicos ou zwiteriónicos, como agentes não iónicos, ou suas misturas. Exemplos de tensioactivos catiónicos incluem o brometo de cetildimetiletilamónio, o cloreto de cetilpiridínio e outros sais destes tensioactivos.

Exemplos de tensioactivos aniónicos incluem ácidos gordos ^c8-32 ^{e seus} sais; ácido eólico e seus derivados tais como o

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desoxicolato, e seus sais, ácido ursodesoxicólico, e ácido taurocólico; diésteres C₈_₅₆ de ácido tartárico; fosfolípidos tais como ácido fosfatídico e fosfatidilserina; monoésteres ^c5-29 áe ácido láctico; sulfonatos Cg_₂₀, incluindo derivados alquilo, olefino, e alquilarilo; ácidos tridecil- e dodecilbenzenossulfónico; e derivados C₅_₃₃ de sarcosina e betaina.

Os tensioactivos zwiteriónicos incluem fosfolípidos tais como lecitina, fosfatidiletanolamina, e esfingomielinas.

Entre os tensioactivos não iónicos que se podem empregar estão o óleo de ricínio etoxilado; monoglicéridos C₅_₂g e seus derivados etoxilados; diglicéridos C₁₅_₆₀ e seus derivados de polioxietileno possuindo 1 a 90 grupos POE; ésteres C₁₀_₄₀ (10 -40 átomos de carbono no álcool) de ácidos gordos de cadeia longa ( ácidos gordos possuindo 16 átomos de carbono e superiores); álcoois esterois tais como o colesterol, o ergoesterol, e seus ésteres C₂_₂₄; ésteres gordos etoxilados ^c8-96^; ésteres gordos de sacarose C₁₄_₁₃₀; e monoésteres, diésteres e triésteres de sorbitol e sorbitano C₂₀_₁₃₀, e seus derivados de polioxietileno (POE) possuindo 0 a 90 grupos POE, p.ex., mono-oleato de polioxietileno-sorbitano, hexaoleato de POE sorbitol (50). Destes, são preferidos os mono e diglicéridos, ou suas misturas, como tensioactivos de HLB baixo e os compostos de sorbitol e sorbitano como tensioactivos de HLB elevado. Mais especificamente, os tensioactivos de HLB baixo preferidos incluem monoglicéridos C_g a C₁₃ ( HLB de cerca de

4-7), diglicéridos C₁₉ a C₂₅ de ácidos gordos mono ou poli-insaturados ( HLB de cerca de 3-5), diglicéridos C₁₅-C₂₃ ( HLB de cerca de 4-6), e diglicéridos C₃₅ a C₄₇ de ácidos gordos mono e poli-insaturados (HLB de cerca de 2,5-4,5); Os tensioactivos de HLB elevado preferidos incluem o óleo de ricínio etoxilado ( HLB de cerca de 10-16) e os tensioactivos de sorbitano com HLB de cerca de 10-18. Os álcoois mono-hidroxilo de cadeia curta, tais como C-l a C₆ não são empregues como tensioactivos nestes sistemas devido aos seus factores de toxicidade.

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-15Como apresentado anteriormente, o peso molecular destes tensioactivos não é crítico, mas é desejável que pelo menos um deles possua um peso molecular de pelo menos cerca de 500, mais preferivelmente superior a cerca de 750.

material activo solúvel em água a incorporar na fase aquosa interna da microemulsão de a/o pode ser qualquer material biologicamente activo, particularmente, proteínas solúveis em água, péptidos e outros compostos farmaceuticamente activos,

i.e., drogas, e compostos que possam ter uso como agentes de diagnóstico. As vitaminas e outros suplementos alimentares que não são vulgarmente definidos como terapêuticos, não estão dentro da definição do agente activo. Os exemplos de proteínas que podem ser vantajosamente formuladas, particularmente para armazenagem prolongada, incluem enzimas, tais como a peroxidase de rábano, a fosfatase alcalina e seus derivados; e outras proteínas instáveis que tendem a sofrer desactivação durante a armazenagem a temperaturas elevadas, tais como citocinas, hemoglobina, interleucinas, e similares. Péptidos incluindo hormonas polipeptídicas tais como calcitoninas, insulinas e similares, são adequadas para incorporação.

Outros agentes activos que podem ser utilizados no sistema de microemulsão de a/o incluem péptidos que podem ser satisfactoriamente empregues que incluem drogas de péptidos farmaceuticamente activos tais como a desmopressina (l-desamino-8-D-argininavasopressina). As drogas que podem ser empregues neste sistema são drogas solúveis em água que são caracterizadas por possuírem baixa biodisponibilidade oral. Os exemplos de algumas das drogas que podem ser empregues incluem: anti-coagulantes, tais como heparina ou seus derivados; antimicrobianos, tais como penicilina G, carbenicilina, meziocilina e outros derivados da penicilina fracamente absorvidos; cefalos-porinas, tais como cefalotina, cefoxitina, cefotaxima e outras moléculas desta série, normalmente administradas por injecçao; drogas antineoplásticas, tais como fluoro-uracilo, citarabina, azauridina, tioguanina, vinblastina, vincristina, e bleomicina; anti-inflamatórios, tais como aurotioglucose e tiomalato de

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sódio e ouro; e drogas antiparasíticas, tais como suramina e mabendazolo.

Outros agentes activos incluem péptidos RGD, péptidos hemato-reguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, eritropoetinas, interleucinas (p.ex., IL-2, 3, 4 e similares), factores de coagulação (p.ex., factores VII, VIII, IX), factores estimulantes de colónias (p.ex., G-CSF, GM-CS, M-CSF), péptidos de libertação hipotalâmica (p.ex., péptidos de libertação da hormona do crescimento, factores de libertação de gonado-tropina), interferões, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral, anticorpos, fragmentos de anticorpos, factores de coagulação, dismutases, vacinas, imuno-reguladores, inibidores da protease do HIV, factores neurotróficos (p.ex., factores de crescimento nervoso), miméticas de péptidos e proteínas, e antagonistas da angiotensina II.

presente invento proporciona também formulações que incorporam pequenos péptidos, possuindo entre cerca de 2 e cerca de 10, mais preferivelmente entre cerca de 2 a cerca de 6 porções de aminoácido. Um grupo em particular, os antagonistas do receptor de fibrinogénio (péptidos contendo RGD) são tetrapéptidos com um peso molecular médio de cerca de 600. Estes péptidos antagonistas são inibidores da agregação de plaquetas altamente potentes aos níveis do plasma, tão baixo como 1 pmol/ml. Um antagonista de fibrinogénio preferido é o péptido ciclo(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ preparado pelo processo de Ali et al.. pedido de Patente publicado EP0341915, cuja descrição se incorpora aqui como referência na sua totalidade. É também preferido o péptido ciclo(S,S)- (2-mercapto) benzoil- (N^a-metil) Arg-Gly-Asp- (2-mercapto) f enilamida que pode ser preparado pelo processo descrito na patente publicada EPO 0423212, Pedido de Patente n^B 90311537.6 cuja descrição se incorpora aqui como referência na sua totalidade. 0s péptidos RGD podem geralmente estar incluídos na microemulsão numa quantidade até cerca de 50 mg/ml da fase aquosa.

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-17Outros antagonistas de fibrinogénio úteis no presente invento são os péptidos descritos em Pierschbacher et al., WO 89/05150 (US/88/04403); Marguerie, EP 0 275 748; Adams et al., Patente dos E.U. 4 857 508; Zimmerman et al., Patente dos E.U. 4683291; Nutt et al., EP 0 410 537; Nutt et al.. EP 0 410 539; Nutt et al., EP 0 410 540; Nutt et al., EP 0 410 541; Nutt et al., EP 0 410 767; Nutt et al.. EP 0 410 833; Nutt et al., EP 0 422 937; Nutt et al., EP 0 422 938; Alig et al., EP 0 372 486, Ohba et al., WO 90/02751 (PCT/JP89/00926); Klein et al.. Patente dos E.U. 4 952 562; Scarborough et al. . WO 90/15620 (PCT/US90/03417); Ali et al., PCT US 90/06514, depositado em 2 de Novembro, 1990; Compostos similares a péptidos como descrito em Alig et al., EP 0 381 033; e Alig et al., EP 0 384 362; e os péptidos RGD cíclicos:

Ac-Cys-(NMe)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂

Ac-Cys-Asn-Dtc-Amf-Gly-Asp-Cys-OH

Dtc = ácido 4,4'-dimetiltiazolidino-5-carboxílico

Amf = para-aminometilfenilalanina

Os péptidos/polipéptidos maiores também úteis no presente invento são os descritos em Pierschbacher et al. , Patente dos E.U. 4 589 881 (>30 resíduos); Bittle et al., E.U. 4 544 500 (20-30 resíduos); e Dimarchi et al., EP 0 204 480 (>34 resíduos).

São também preferidos os péptidos de libertação da hormona do crescimento, os quais são péptidos geralmente com doze aminoácidos ou inferiores e provocam a libertação da hormona do crescimento. Os péptidos de libertação da hormona do crescimento podem ser utilizados numa quantidade até cerca de 75 mg/ml da fase aquosa.

É exemplificativo da classe dos péptidos de libertação da hormona do crescimento o péptido His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2 .1

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AFBI - 0288 e outros péptidos que provocam a libertação da hormona do crescimento essencialmente pelo mesmo mecanismo que o His-D-TrpAla-Trp-D-Phe-Lys-NH₂. Outro péptido de libertação da hormona do crescimento preferido é o Ala-His-D-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂. Os péptidos de libertação da hormona do crescimento estão descritos, por exemplo, em Momany, Patente dos E.U. 4 411 890; Momany, Patente dos E.U. 4 410 513; Momany, Patente dos E.U. 4 410 512; Momany, Patente dos E.U. 4 228 158; Momany, Patente dos E.U. 4 228 157; Momany, Patente dos E.U. 4 228 156; Momany, Patente dos E.U. 4 228 155; Momany, Patente dos E.U. 4 226 857; Momany, Patente dos E.U. 4 224 316; Momany, Patente dos E.U. 4 223 021; Momany, Patente dos E.U. 4 223 020; Momany, Patente dos E.U. 4 223 019; Bowers et al., Patente dos E.U. 4 880 778; Bowers et al., Patente dos E.U. 4 880 777; Bowers et al.. Patente dos E.U. 4 839 344; Bowers et al., Patente dos E.U. WO 89/10933 (PCT/US89/01829); Bowers et al., EP-A 398 961, Bowers et al.. EP-A 400 051, todas elas completamente incorporadas aqui como referência.

Os compostos farmaceuticamente activos empregues no presente invento incluem também imunogénios os quais podem ser incorporados em sistemas adjuvantes de vacinas. Os imunogénios que são aceitáveis incluem proteínas purificadas e péptidos e seus derivados, e geralmente imunogénios que possuem uma medida média do tamanho das partículas na gama até cerca de 150 nm, as quais são portanto capazes de ser mantidas na fase aquosa da microemulsão .

Referiu-se que o material biologicamente activo era um material solúvel em água. Os peritos na arte perceberão rapidamente pela lista de materiais activos representativos que estes são solúveis numa extensão eficaz na fase aquosa e possuem uma solubilidade desprezável numa fase orgânica. A solubilidade dos materiais activos na fase aquosa a cerca de 20°C é de pelo menos cerca de 1 parte por 100 000 partes e preferivelmente de pelo menos cerca de 1 parte por 10 000 partes. Para conseguir este nível de solubilidade, o pH ou a força iónica de uma fase aquosa podem ser alterados. A solubilidade dos materiais activos em

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AFBI materiais orgânicos, tais como os apresentados para compreender a fase orgânica da microemulsão, a cerca de 20’C é inferior a cerca de 10 partes por 1 000 000 partes e preferivelmente inferior a cerca de 1 parte por 1 000 000 partes. O coeficiente de partição água:óleo é superior a 10:1, vantajosamente, pelo menos cerca de 50:1, preferivelmente pelo menos cerca de 100:1, e mais preferivelmente superior a cerca de 1000:1. O coeficiente de partição água:óleo é uma quantidade vulgarmente utilizada e refere-se à razão entre a solubilidade do material em água a cerca de 20°C e a solubilidade do material num óleo de referência, geralmente azeite, que é uma mistura de triglicéridos de ácidos gordos saturados e insaturados esterifiçados a glicerol, a cerca de 20°C. O coeficiente de partição é determinado por dissolução do agente activo num volume igual de água e azeite (tensioactivo ausente) e a determinação da solubilidade em cada fase. Quando aqui utilizado, o óleo de referência é um azeite de grau U.S.P./N.F. disponível em vários fornecedores químicos incluindo o Spectrum Chemicals Mfg. Corp., Gardena, CA.

A quantidade de ingrediente activo incluída na fase aquosa interna pode variar consideravelmente, dependendo da sua solubilidade e actividade, da utilização para a qual se destina, da quantidade de emulsão a ser empreque, e similares. Geralmente, como apresentado anteriormente, os ingredientes activos nas quantidades de IO⁹ a 100% em % peso/volume, com base no volume da fase aquosa interna, proporcionam uma formulação satisfactória para a maioria das aplicações. O material biologicamente activo será solúvel na microemulsão de a/o ou será solúvel após a conversão na microemulsão de o/a por adição de água ao sistema.

As microemulsões de a/o podem ser formuladas com agentes para aumentar a absorção nas mucosas de péptidos e proteínas. Estes incluem sais biliares tais como os sais biliares tri-hidroxi, i.e., colato, taurocolato, e glicolato, sais biliares di-hidroxi, i.e., desoxicolato, taurodesoxicolato, quenodesoxicolato, e ursodesoxicolato, sais biliares triceto tais como o desidro-colato. Podem ser utilizados tensioactivos

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não iónicos tais como éteres de polioxietileno com cadeias alquilo de comprimento entre 12-18 átomos de carbono e cadeias de polioxietileno (POE) de comprimentos entre 2-60, p-t-octilfenoxipolioxietilenos com 2-60 grupos POE, nonilfenoxipolioxietilenos com 2-60 grupos POE, ésteres de polioxietileno-sorbitano com comprimentos de cadeias alquilo de 8-24 e 4-80 grupos POE, e l-dodecil-hexa-hidro-2H-azepin-2-ona (azona, laurocapramo). Podem-se utilizar tensioactivos aniónicos tais como dodecil-sulfato de sódio e sulfossuccinato de dioctilsódio. Podem-se utilizar lisolecitinas contendo cadeias acilo gordas saturadas possuindo 8-24 átomos de carbono ou cadeias acilo gordas insaturadas possuindo 1 a 4 ligações duplas e 16-24 átomos de carbono. Podem-se utilizar mono/diésteres de glicerol, tais como mono/diésteres de um ácido gordo de cadeia média contendo ácidos gordos saturados com 8-12 átomos de carbono, e ésteres de mono/diglicerol de ácidos gordos insaturados possuindo 1 a 4 ligações duplas e 16-24 átomos de carbono. Podem-se utilizar acilcarnitinas, acilcolinas e acilaminoácidos, tais como acilcarnitinas possuindo grupos acilo de 12-20 carbonos e onde os grupos acilo possuem 0-4 ligações duplas, acilcolinas tais como ésteres de acilcolina de ácidos gordos possuindo 8-22 átomos de carbono e 0-4 ligações duplas, e acilaminoácidos tais como N-acilaminoácidos e dipéptidos possuindo grupos acilo com 8-24 átomos de carbono e 0-4 ligações duplas e possuindo os aminoácidos grupos amino na posição a ou β e um peso molecular inferior a 350. Adicionalmente, podem-se utilizar ácidos gordos mono e poli-insaturados e seus sais possuindo 14-24 átomos de carbono e 1-4 ligações duplas, e ácido salicíclico e o seu sal de sódio, 5-metoxi-salicilato de sódio.

As microemulsões de a/o deste invento podem ser rapidamente preparadas misturando simplesmente, com agitação moderada, os componentes seleccionados nas razões desejadas à temperatura ambiente ou a temperaturas ligeiramente elevadas. Como se mencionou anteriormente, não é necessária elevada energia de mistura ou aplicação de calor, embora se possa empregar o uso limitado de cada uma, se desejado, para aumentar a velocidade de formação da microemulsão. Além disto, os ingredientes não

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-21— precisam de ser adicionados por qualquer ordem particular para além de o material activo dever estar presente na fase aquosa quando se forma a emulsão. Preferivelmente, no entanto, o tensioactivo deve ser primeiro misturado com a fase oleosa, seguido por adição de água na razão adequada. È preferido dissolver primeiro o material activo em água, e depois adicionar esta fase aquosa ao óleo e aos componentes tensioactivos.

tamanho das gotícuias, i.e., o número do diâmetro médio, na microemulsão de a/o resultante é normalmente de 10-150 nanómetros (nm), normalmente inferior a 50-100 nm, com a maioria das gotículas inferiores a 100 nm, mais preferivelmente inferiores a 75. A medição do tamanho das partículas é normalmente determinada por técnicas de dispersão de luz laser. As microemulsões de água-em-óleo são também caracterizadas pela sua aparência estável, límpida e homogénea.

A quantidade de água ou fluído aquoso, p.ex., fluido corporal aquoso, necessário para converter a microemulsão de a/o numa emulsão de o/a quando utilizada, por exemplo, para armazenagem de proteínas, não é crítica e pode ser determinada rotineiramente por titulação da microemulsão com excesso de água. Geralmente, no entanto, verificou-se que a água num excesso de cerca de 1 a 33 vezes o volume da emulsão é

suficiente para este propósito.

Além do volume de água adicionado ou proporcionado pelo próprio corpo, os outros factores que controlam a velocidade da libertação de uma dada droga incluem o pH, a temperatura, e o grau de agitação. Os peritos na arte reconhecerão que variando estas condições de uma maneira geralmente conhecida, a libertação da droga pode ser diminuída ou aumentada conforme desej ado.

sistema de microemulsão do presente invento pode ser formulado com um óleo de ponto de fusão elevado, ou seja, um óleo com um ponto de fusão acima da temperatura ambiente (22-23°C), preferivelmente acima de cerca de 30°C, de modo a

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formular uma microemulsão que seja sólida à temperatura ambiente. Igualmente, podem-se utilizar tensioactivos de elevado ponto de fusão tais como um éster Ciq_4q de um ácido gordo de cadeia longa e álcoois possuindo pelo menos cerca de 12 átomos de carbono, em que estes tensioactivos possuem pontos de fusão acima da temperatura ambiente, preferivelmente acima de cerca de 30°C. Preferivelmente, a microemulsão derreterá às temperaturas do corpo, geralmente entre cerca de 35-40°C. A quantidade de óleo de elevado ponto de fusão e o ponto de fusão desse óleo podem variar, mas a composição final contendo a microemulsão é sólida à temperatura ambiente. O sistema de microemulsão sólida pode ser utilizado na forma de um veículo transportador ' supositório ou na forma de um veículo transportador oral. A formulação oral é preferivelmente na forma de comprimido ou cápsula. A microemulsão pode ser formulada directamente com o óleo de ponto de fusão elevado, ou pode ser formulada primeiro, ligando-se depois o óleo de elevado ponto de fusão com a microemulsão. Estes óleos de ponto de fusão elevado são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, óleos de coco parcialmente hidrogenados, óleos de palma, manteiga de coco, óleo de amendoim hidrogenado, e vários óleos vegetais hidrogenados, juntamente com suas combinações. Os óleos preferidos incluem os óleos de coco e de palma hidrogenados e suas misturas.

)

O sistema de microemulsão de a/o que é sólido à temperatura ambiente (22-23°C) pode ser preparado utilizando directamente o óleo de elevado ponto de fusão com o outro componente durante a formulação. A solução de componentes é aquecida a uma temperatura ligeiramente elevada de cerca de 25-60°C, preferivelmente cerca de 30-50°c, durante a mistura e é arrefecida num sólido à temperatura ambiente. 0 sistema de microemulsão de a/o final possui gamas de componentes dentro das previamente apresentadas para os sistemas de microemulsão líquida. Os sistemas sólidos preferidos possuem entre cerca de 20-90%, preferivelmente 30-60% p/p de um óleo de elevado ponto de fusão possuindo um ponto de fusão entre cerca de 29,4-48,9° C; entre cerca de 1-50%, preferivelmente 3-30% p/p da fase aquosa, e 15-80%,

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-23preferivelmente 23-60% p/p de um tensioactivo ou mistura de tensioactivos possuindo uma gama de HLB como apresentado anteriormente neste invento. Preferivelmente, o tensioactivo é uma mistura de tensioactivos contendo 5-30%, preferivelmente 8-20% p/p (da microemulsão) de um tensioactivo possuindo um HLB superior a 8, e 10-50%, preferivelmente 15-40% p/p (da microemulsão ) de um tensioactivo possuindo um HLB inferior a 8.

sistema de microemulsão de a/o que é sólido à temperatura ambiente pode também ser preparado preparando primeiro a microemulsão de a/o sem o óleo de elevado ponto de fusão e dispersando esta microemulsão no óleo de elevado ponto de fusão. Primeiro, prepara-se a microemulsão de a/o de acordo com o presente invento. Depois, liga-se o óleo de elevado ponto de fusão com a microemulsão de a/o. Vulgarmente isto consegue-se a temperaturas ligeiramente elevadas entre cerca de 25-60°C, preferivelmente cerca de 30-50°C. Dispersa-se portanto a microemulsão dentro de uma matriz feita de um óleo de elevado

ponto de fusão. A quantidade de óleo de elevado ponto de fusão em relação à microemulsão varia de cerca de 0,5:1 a cerca de 2:1. Esta quantidade pode variar para além destas gamas desde que se produza um sistema de microemulsão dispersa final que seja um sólido à temperatura ambiente. O óleo de elevado ponto de fusão é tipicamente misturado com um tensioactivo de HLB baixo, geralmente possuindo um HLB inferior a cerca de 8, antes da adição à microemulsão de modo a reter e dispersar adequadamente a microemulsão no óleo de elevado ponto de fusão.

Verificou-se, surpreendentemente que, tomando um certo sistema de microemulsão de a/o do presente invento, e ajustando-o de modo a possuir um valor de HLB efectivo mais elevado, a microemulsão de a/o se converte, com adição de água, não apenas numa emulsão de o/a como acontece com todas a microemulsões de a/o reivindicadas, mas sim numa microemulsão de o/a. O elevado valor de HLB é obtido nos presentes sistemas pela adição de um modificador que permite que o nível de HLB da microemulsão de a/o seja aumentado para além do seu nível normal de estabilidade sem a quebra da microemulsão de a/o. 0 nível de

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-24HLB final do tensioactivo ou mistura de tensioactivos destas microemulsões de a/o é superior a cerca de 7, e é preferivelmente de cerca de 7 a cerca de 16, mais preferivelmente de cerca de 8-13. Os modificadores que se mostraram úteis são incorporados na fase aquosa da microemulsão e incluem sorbitol, polietilenoglicol (PEG), manitol, propilenoglicol, e mono e dissacáridos. Se forem incorporadas proteínas ou péptidos na fase aquosa, então os modificadores preferidos são o manitol, o sorbitol, e o PEG.

Quanto mais modificador for adicionado à microemulsão de a/o, mais pode ser aumentado o HLB no sistema com a retenção de uma microemulsão de a/o. Este elevado nível do HLB permite a conversão numa microemulsão de o/a. A quantidade precisa de modificador e a quantidade precisa do tensioactivo de elevado nível de HLB adicionados à microemulsão são funcionalmente determinados pela presença de dois resultados finais:

(1) a retenção da microemulsão de a/o e (2) a conversão numa microemulsão de o/a com adição de água.

A quantidade de modificador adicionado à fase aquosa da microemulsão de a/o depende do valor final de HLB desejado. Tipicamente, pode-se empregar uma solução de modificador aquosa a 10-50%, preferivelmente a 20-50%, mais preferivelmente a 20-30% em peso, preferivelmente uma solução de sorbitol, como fase aquosa modificada para a microemulsão de a/o. Esta solução de sorbitol pode conter tampões fisiológicos e solução salina ou outros sais.

tamanho das partículas da microemulsão de a/o que se converte numa microemulsão de o/a é o mesmo que se referiu anteriormente para as microemulsões de a/o. 0 número médio do tamanho das partículas da microemulsão de o/a convertida é tipicamente inferior a cerca de 100 nm, preferivelmente entre 10-100 nm, mais preferivelmente entre 20-60 nm, como determinado por técnicas de dispersão de luz laser. A quantidade de água necessária para converter o sistema de a/o na microemulsão de o/a pode variar dependendo da composição da microemulsão de a/o.

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-25Tipicamente, a quantidade de água necessária varia entre cerca de 1 a 10 vezes o volume do sistema de a/o. Podem-se utilizar maiores quantidades de água para converter os sistemas de a/o, e utilizam-se quantidades até cerca de 1000 vezes o volume do sistema de a/o, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 100 vezes o volume do sistema de a/o para os converter na microemulsão de o/a.

Estes sistemas de microemulsão de a/o que se convertem em microemulsões de o/a podem ser vantajosamente empregues como veículos transportadores para drogas solúveis em água que se degradam na fase oleosa, tais como certos péptidos e proteínas, e imunogénios utilizados para formulações orais ou de supositórios. Estas formulações são também preferidas para administração intravenosa e intra-arterial. O risco de formação de embolias é grandemente reduzido devido aos tamanhos extremamente pequenos das partículas produzidas após a conversão com excesso de fluido corporal.

Estas formulações de microemulsões de a/o que se convertem em microemulsões de o/a podem também ser utilizadas como emulsões de lípidos nutricionais, e especialmente como formulações de nutrição parentérica total, o sistema de a/o pode ser convertido utilizando uma fase aquosa contendo nutrientes solúveis em água para formar microemulsões de lípidos-em-água imediatamente antes da administração.

As microemulsões de a/o contendo o material biologicamente activo na fase aquosa do presente invento são preferivelmente administradas parentericamente, entericamente e por meio de outras membranas de mucosas tais como nasalmente, rectalmente, vaginalmente, ou por via do cólon. Após a administração, pode ser medido ou observado o efeito biológico sobre o animal, provocado pelo material activo. 0 sistema de microemulsão convertível aumenta tanto a activação de droga como a sua absorção e incorporação no local da conversão. 0 aspecto único da convertibilidade das presentes microemulsões proporciona que a droga seja mantida primeiramente na fase aquosa devido à

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-26insolubilidade na fase oleosa. Isto é vantajoso pois certos materiais activos podem-se tornar inactivos se dispersos dentro de uma fase oleosa ou se dissolvidos numa fase aquosa fora de uma emulsão. Geralmente, os materiais activos como as proteínas e os péptidos empregues no presente invento apresentam um nível de aetividade superior quando armazenados no sistema de microemulsão de a/o quando comparado com o que teriam se armazenados durante o mesmo período de tempo e sob as mesmas condições na mesma fase aquosa que não estivesse contida dentro de um sistema de microemulsão.

A administração oral de um material biologicamente activo, contido dentro do sistema de distribuição de drogas de microemulsão de a/o do presente invento pode ser na forma de cápsula ou comprimido. A cápsula é geralmente um material de amido ou gelatina. Certos materiais activos podem ser sus-ceptíveis ao baixo pH do meio no estômago e têm que ser portanto distribuídos ao meio de pH mais elevado no sistema intestinal. Embora estes materiais activos sejam beneficamente distribuídos na forma de supositórios, se for desejada a administração oral, a cápsula ou o comprimido podem ser fornecidos com um revestimento entérico. Estes revestimentos são bem conhecidos na arte como processos para revestir entericamente uma cápsula ou um comprimido. 0 processo de produção de uma cápsula entericamente revestida utilizando o sistema de microemulsão de a/o do presente invento é como se segue. Prepara-se a microemulsão de a/o contendo o agente activo e coloca-se então esta composição na cápsula. Reveste-se então a cápsula com uma solução de revestimento entérico. A solução de revestimento entérico contém a substância de revestimento entérico polimérica e solventes. A substância de revestimento entérico polimérica é geralmente um polímero farmaceuticamente aceitável que se irá dissolver em contacto com os fluidos intestinais, a pH de cerca de 5,5 a 7,0, mas não se dissolve ao pH inferior dos fluídos do estômago. Os revestimentos entéricos poliméricos estão prontamente disponíveis comercialmente, tais como os materiais de revestimento entérico Eastmar^ C-A-P™ (ftalato de acetato de celulose) e C-A-T ( trimelitato de

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acetato de celulose), disponíveis em Eastman Chemical Products, Inc. São conhecidas várias técnicas para aplicar o revestimento polimérico entérico tais como revestimento por vaporização ou revestimento por imersão e podem ser necessárias várias camadas da substância entérica.

Um sistema de microemulsão de a/o preferido para a distribuição de um material biologicamente activo, tal como a calcitonina, ao aparelho gastrintestinal é um que não só seja um sólido às condições ambientes mas também se converta numa microemulsão de o/a em contacto com um meio aquoso tal como fluidos corporais. Um exemplo de um destes sistemas preferidos é um sistema contendo cerca de 33-45% v/v, mais preferivelmente cerca de 36-42%, de uma composição contendo uma mistura de triésteres:diésteres de glicerol e ácido láurico possuindo um ponto de fusão de cerca de 33-36°C (sendo um exemplo o witepsol H-15 que é uma mistura de 90:10% em peso de triésteres: diésteres com uma pequena quantidade, inferior a 2% em peso, de monoglicéridos, produzida por Huls of Germany); cerca de 30-42% v/v, mais preferivelmente cerca de 32-40%, de mono-oleato de polioxietileno-sorbitano ( Tween 80, Sigma Corp.); cerca de

5-10% v/v, mais preferivelmente cerca de 6-9%, de mono/diglicéridos de ácidos gordos de cadeia média, cáprico e caprílico (Capmul MCM, de Karlshamns Lipid Specialties, Columbus, OH); cerca de 3,5-5,5% v/v, mais preferivelmente 4-5% de um monoglicérido de cadeia longa, tal como monoglicéridos de óleo de girassol (Myverol 18-92); e cerca de 3-25% v/v, mais preferivelmente cerca de 5-20%, de sorbitol aquoso a 20% p/v numa solução tampão contendo o material biologicamente activo. 0 conteúdo de droga, o pH, e a força iónica da solução aquosa variarão dependendo da composição que seja mais adequada para o material biologicamente activo hospedado. Se for utilizada a calcitonina, é preferido empregar até cerca de 1 mg de calcitonina de salmão (de Bachem Co.) por grama do sistema de microemulsão.

Um sistema de microemulsão de a/o preferido para a distribuição de um material biologicamente activo, tal como a

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AFBI - 0288 ____ calcitonina, na forma de um supositório é um que seja um sólido à temperatura ambiente. Um exemplo de um destes sistemas preferidos é um sistema contendo cerca de 23-27% p/p de ésteres de propilenoglicol dos ácidos cáprico/caprílico (Captex 200 de Karlshamns Lipid Specialties, Columbus, OH); cerca de 6-10% p/p de mono e diglicéridos dos ácidos caprídico/cáprico (Capmul 8210 MCM de Karlshamns Lipid Specialties); cerca de 1-2,5% p/p de lecitina líquida de Central Soya (Centrophase 31); cerca de 15-17% p/p de tri-ricinoleato de polioxietilenoglicerol (Cremophor EL de BASF); cerca de 40-45% p/p de óleos de semente de palma , de coco e de palma parcialmente hidrogenado (HB-108 de Karlshamns Lipid Specialties), e cerca de 5-7% p/p de tampão acetato 100 mM, pH = 4,2. Quando utilizado num supositório de calcitonina, prefere-se utilizar cerca de 980U de calcitonina de salmão (de Bachem Co.) em que o peso do supositório final seja de cerca de 1,7 g.

Outro sistema preferido para a distribuição do material activo é uma composição contendo entre cerca de 5-80% v/v de uma mistura de triésteres:diésteres de glicerol e ácido láurico possuindo um ponto de fusão de cerca de 33-36°C ( sendo um exemplo o Witepsol H-15); cerca de 15-50% v/v de mono-oleato de polioxietileno-sorbitano (Tween 80); cerca de 3-11% v/v de mono/diglicéridos de ácidos gordos de cadeia média, cáprico e caprílico (Capmul MCM); cerca de 2-6% v/v de um monoglicérido de cadeia longa, tal como monoglicéridos de óleo de girassol (Myverol 18-92); e cerca de 6-42% v/v de sorbitol aquoso a 25% p/p e propilenoglicol a 25% p/p numa solução tampão contendo o material biologicamente activo. 0 conteúdo de droga, o pH, e a força iónica da solução aquosa variarão dependendo da composição que seja mais adequada para o material biologicamente activo hospedado. Esta composição é preferida para a administração de agentes activos tais como calcitoninas, insulinas, hormonas do crescimento humanas, antagonistas do receptor de fibrinogénio (péptidos contendo RGD, tais como o ciclo(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂, e péptidos de libertação da hormona do crescimento, tais como o His-D-Trp-Ala-Trp-D

-Phe-Lys-NH₂

872

AFBI - 0288

-29Como apresentado anteriormente, em ainda outra concretização, podem-se utilizar as nossas microemulsões para preparar pomadas e unguentos tópicos não secantes, em oposição a transdérmicos. Estes podem ser rapidamente preparados simplesmente por mistura de uma quantidade terapeuticamente activa da emulsão com bases de petróleo tópicas conhecidas ou similares, normalmente empregues para aplicação na pele, desde que estes materiais sejam compatíveis com a emulsão. A microemulsão de a/o é idealmente adequada para o tratamento de feridas onde a camada de pele epidérmica seca, o estrato córneo ou camada córnea é removida, expondo portanto a camada de pele dérmica basicamente aquosa, como por exemplo em feridas de queimaduras. A microemulsão de a/o pode também ser utilizada onde a camada de pele dérmica está também parcialmente removida. A microemulsão de a/o, quando em contacto com a camada dérmica ou a camada do corpo inferior converte-se numa emulsão de o/a com a adição dos fluidos corporais aquosos. Preferivelmente, utilizam-se proteases, tais como serina, metalo, cisteína, aspartilo, e similares as quais degradam as proteínas do tecido conectivo tais como o colagénio e a elastina e similares, conjuntamente com os factores de crescimento, como material activo para ajudarem na remoção e reparação dos tecidos da pele. Os exemplos de factores de crescimento incluem, por exemplo, o factor de crescimento derivado das plaquetas, PDGF, o factor de crescimento epidérmico, EGF, os factores de crescimento transformantes, TGFa e TGF/3, e os factores de crescimento semelhantes à insulina, IGF-I e IGF-II, e similares. Estes materiais activos possuem geralmente tamanhos médios de partículas superiores a 1 até cerca de 100, preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 30 nanometros. Tipicamente, o peso molecular destes materiais activos é de pelo menos cerca de 5 000 e até mais do que 40 000, preferivelmente de cerca de 5 000 a cerca de 35 000. O tamanho médio dos poros da epiderme humana é inferior a cerca de 1 nm, e portanto os materiais activos empregues nos sistemas tópicos não atravessam eficazmente a camada de pele da epiderme.

sistema de microemulsão tópica actua como um reservatório

872

AFBI - 0288 para proporcionar uma proteína estável ao local da ferida. A microemulsão tópica é preferivelmente apresentada na forma de um sólido, pomada ou gel, que possa ser facilmente removido do local da ferida por lavagem com um fluido aquoso. Mais preferivelmente, a microemulsão tópica é apresentada na forma de um sólido ou semi-sólido (que se deforma sob a aplicação de pressão) para manter a microemulsão de a/o no local da ferida para a conversão e libertação da droga.

Ainda uma concretização do presente invento abrange a utilização da microemulsão de a/o como um sistema transportador para ser utilizado num sistema adjuvante de vacinas. Neste sistema adjuvante de vacinas, o imunogéneo é misturado na fase aquosa. Esta fase aquosa é então misturada com a fase oleosa que contém o tensioactivo. Estes sistemas adjuvantes podem também ser formulado com um imunoestimulador, que são bem conhecidos na arte dos adjuvantes de vacinas. Estes imunoestimuladores incluem compostos como di ou tripéptidos de muramilo e seus derivados; interferões, e interleucinas. A fase aquosa pode também conter sais inorgânicos, agentes tampão, conservantes, e similares, em adição ao imunogéneo.

sistema de microemulsão adjuvante de vacinas do presente invento é caracterizado pela sua estabilidade e longa vida de prateleira, em comparação com os sistemas adjuvantes de emulsão da arte anterior. 0 uso de óleos do presente invento, que são referidos como óleos biodegradáveis, para formular o sistema de microemulsão proporciona benefícios sobre os sistemas de emulsão adjuvantes anteriores na medida em que se crê que diminui a produção de granulomas. Os adjuvantes de microemulsão de a/o podem ser prontamente convertidos em emulsões de óleo em água quando administrada no corpo o que permite a produção de gotículas de óleo estimulantes dos macrofagos in sito. Também se espera que o tamanho menor e mais uniforme das gotículas resultantes levem a uma resposta mais reprodutível a um dado imunogéneo.

invento será agora ilustrado pelos seguintes exemplos,

872

AFBI - 0288

não se pretendendo que seja por eles limitado.

-31EXEMPLOS

Formulação e convertibilidade

Prepararam-se várias formulações de microemulsões de água-em-óleo (a/o) deste invento nas quais, a título ilustrativo, os componentes, as suas razões, e as condições de operação seleccionadas para proporcionar uma microemulsão convertível, foram um pouco variadas como se mostra nos exemplos seguintes. Por conveniência, não se incluiu nenhuma droga em nenhum caso, mas entender-se-á que qualquer droga solúvel em água, como definido anteriormente e mostrado em alguns dos exemplos, se dissolveria na fase da água dispersa.

Determinou-se então o valor de HLB de cada sistema de tensioactivos e a estabilidade de cada emulsão, como se apresenta em seguida em cada exemplo.

Para os propósitos destes exemplos, os valores de HLB utilizados foram os especificados pelos fornecedores dos tensioactivos; 0 HLB resultante de uma mistura de tensioactivos foi calculado numa base volumétrica.

Na preparação de cada formulação empregou-se o seguinte procedimento geral:

Pipetou-se num pegueno frasco uma quantidade medida de óleo, seguida pela adição de um tensioactivo, ou mistura de tensioactivos, com um dado valor de HLB. Agitou-se então o frasco com um misturador de vortex durante um dado número de minutos até o tensioactivo e o óleo se misturarem completamente. Adicionou-se então uma solução salina à mistura de óleo/tensioactivo e agitou-se a mistura durante alguns minutos até se recuperar uma emulsão de a/o opticamente límpida. Mede-se a sua estabilidade por inspecção visual periódica quanto à presença de separação de fases macroscópica, como mostrado pela turbidez ou pela formação de duas camadas distintas. Estável significa que a emulsão está límpida e só tem uma fase.

ο

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AFBI - 0288

-32Podem-se testar as características físicas das microemulsões incluindo propriedades como a viscosidade, a condutância e o índice de refracção.

EXEMPLO 1

De acordo com o procedimento geral anterior, preparou-se uma

microemulsão de a/o empregando os seguintes componentes
quantidades e	razões, e valores de HLB dos tensioactivos:
Componente	Composição	Valor	de HLB	Quantidade (ul)
Óleo	Captex 200¹				870,0
Sistema	Hexaoleato de POE			11,4	50,0
tensioactivo	sorbitol 50²
	Cremophor EL			13,5	50,0
Água	Solução salina				30,0

(NaCl a 0,9% em peso)

TOTAL 12,5 1000,0

-*-Captex 200 - ésteres de propilenoglicol dos ácidos cáprico/ /caprílico (Karlshamns Lipid Specialties, Columbus, OH)

TABELA 1 ►

Características Físicas e Químicas do Captex 200

Descrição: Diéster manufacturado por re-esterificação de ácidos gordos de coco fraccionados (primariamente caprílico e capróico) com com propilenoglicol.

Nome CTFA: Dicaprilato/caprato de propilenoglicol

Ácido gordo livre (como oleico): 0,03

Número de hidroxilo: 0,05

Número de saponificação: 329,7

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AFBI - 0288 •y do ácido gordo:

capróico caprilico cáprico láurico e superiores

-33Composição

Ácido

4,1

68,2

27,4

0,2 ^Hexaoleato de POE sorbitol - hexaoleato de polioxietileno (50) sorbitol (ICI Américas, Inc. Wilmington, DE) ³Cremophor EL - Triricinoleato de polioxietilenoglicerol 35 DAC (BASF, Inc.)

Misturaram-se estes componentes num misturador de vortex a 25°C durante cerca de 3 minutos para proporcionar uma microemulsão de a/o límpida estável.

Adicionou-se então água à composição total na razão de 4:1 (v/v) para converter a microemulsão numa emulsão de o/a.

EXEMPLO 2

De acordo com os procedimentos do exemplo 1, empregaram-se os seguintes componentes para formar uma microemulsão de a/o:

Componente	Composição	Valor de HLB	Ouantidade (ul)
Óleo	Captex 200		870,0
Sistema	& Centrophase 31	4,0	10,5
tensioactivo	Cremophor EL	13,5	89,5
Água	Solução salina (NaCl a 0,9% em peso)		30,0
TOTAL		12,5	1000,0

Misturaram-se estes componentes num misturador de vortex a * Centrophase 31 - lecitina (peso molecular - 800) (Central Soya,

Fort Wayne, IN).

872

AFBI - 0288 —34— ° C durante cerca de 6 minutos para proporcionar uma microemulsão de a/o límpida que era estável tanto a 25°C como a 50°C.

EXEMPLO 3

De acordo com os procedimentos do exemplo 2, mas substituindo o Cremophor EL por 54,5 μΐ de Tween 80 (mono-oleato de polioxietileno-sorbitano, Sigma Corp.) (HLB = 15), e aumentando a quantidade de Centrophase 31 para 45,5 μΐ para proporcionar um valor médio de HLB de 10,0, formou-se uma microemulsão de a/o e converteu-se numa emulsão de o/a.

EXEMPLO 4

Componente	Composição	Valor de HLB	Ouantidade (ul)

Óleo	Captex 200		861,3
Sistema	Capmul MCM*	5,0	8,7
tensioactivo	Centrophase 31	4,0	10,5
	Cremophor EL	13,5	89,5
Água	Solução salina (NaCl a 0,9% em peso)		30,0
TOTAL		9,0	1000,0

* Capmul MCM - mono e diglicéridos de ácidos gordos de cadeia média (cáprico e caprílico) (Karlshamns Lipid Specialties, Columbus, OH).

Misturaram-se estes componentes num misturador de vortex a

25°C durante cerca de 3 minutos para proporcionar uma microemulsão de a/o límpida possuindo um tamanho de partículas de 25 nm (número médio) e uma estabilidade de 5°C a 50^eC como medida por inspecção visual periódica.

872

AFBI - 0288

Adicionou-se então água à composição total na razão de 4:1 (v/v) para converter a microemulsão e produzir a emulsão de o/a.

EXEMPLO 5

De acordo com os procedimentos de exemplo 2, mas aumentando a quantidade de água (solução salina) de 30 para 150 μΐ para proporcionar 15% de água na formulação, e ajustando as quantidades dos outros componentes em conformidade (óleo - 350 μ1; Centrophase 31 - 52,6 μΐ; Cremophor EL - 447,4 μΐ) , converteu-se satisfactoriamente a microemulsão de a/o numa emulsão de o/a. Nesta formulação a razão de óleo para água foi de 2,3:1, e a do tensioactivo para água mais óleo foi 1:1.

EXEMPLO 6

De acordo com os procedimentos do exemplo 4, mas alterando a quantidade de tensioactivo Capmul, primeiro para 4,35 μΐ (HLB final = 10,2), e depois para 17,4 μΐ (HLB final = 7,7), obtiveram-se também microemulsões convertiveis.

EXEMPLO 7

De acordo com os procedimentos do exemplo 4, mas substituindo o tensioactivo Capmul MCM por 8,7 μΐ de 1-monocapriloí1-rac-glicerol, ou 8,7 μΐ de Dicaprin (uma mistura equimolar de 1,2- e 1,3-diglicérido de ácido cáprico), obtiveram-se também microemulsões satisfactoriamente convertíveis.

EXEMPLO 8

De acordo com os procedimentos do exemplo 2, mas substituindo o tensioactivo Centrophase 31 daquele sistema de tensioactivos por Myverol 18-92 (monolinoleato de glicerol; valor de HLB - 3,8-4,0), e misturando os componentes durante 3 minutos, obteve-se uma microemulsão de a/o a qual, quando se adicionou água (4:1 v/v), se converteu numa emulsão de o/a. O HLB da mistura de tensioactivos nesta formulação era de 9,0.

872

AFBI - 0288

-36EXEMPLO 9

De acordo com os procedimentos do exemplo 4, mas substituindo o Captex 200 como óleo por 861,3 μΐ de Myvacet (1oleil-2,3-diacetilglicerol); (Eastman Chemical Products, Inc., Kingsport, TN), obteve-se uma microemulsão de a/o satisfactória a qual, com adição de água à composição total (na razão de 4:1 v/v), se converteu numa emulsão de o/a. 0 HLB da mistura de tensioactivos nesta formulação era de 9,0.

Dados de estabilidade

De modo a demonstrar a estabilidade das composições deste invento a temperaturas elevadas para fins de armazenagem das mesmas durante longos períodos de tempo, preparou-se uma série de microemulsões de acordo com este invento, seguindo os procedimentos gerais do exemplo 2. No exemplo 10, armazenou-se a proteína peroxidase de rábano (HRP) durante certos tempos e a certas temperaturas e depois ensaiaram-se in vitro, como se mostra neste exemplo.

EXEMPLO 10

Este exemplo ilustra a incorporação de uma proteína, nomeadamente a enzima peroxidase de rábano (HRP), na microemulsão de a/o convertível deste invento, e a estabilidade desta emulsão resultante.

De acordo com os procedimentos gerais anteriores, preparouse uma microemulsão contendo a enzima a partir dos seguintes componentes;

Componente	Composição	Valor de HLB Quantidade i
Óleo	Captex 200		861,3
Sistema	Capmul MCM	5,0	8,7
tensioactivo	Centrophase 31	4,0	10,5
	Cremophor EL	13,5	89,5
Solução de peroxidase	(ver nota 1)		30,0
TOTAL		9,0	1000,0
1 Solução de	peroxidase - 100	μΐ de solução	de armazém de HRP

mg/ml) em 400 μΐ de solução salina a 0,9% em peso (NaCl).

872

AFBI - 0288

-37Misturaram-se estes componentes num misturador de vortex a 25⁰C durante cerca de 2 minutos para proporcionar uma microemulsão de a/o.

Após a armazenagem durante o tempo especificado a 50°C, converteu-se então a microemulsão numa emulsão de o/a por adição de água. Isto conseguiu-se pipetando 30 μΐ da microemulsão contendo a enzima peroxidase de rábano para 970 μΐ de solução salina a 0,9% em peso (NaCl).

Após a conversão, ensaiou-se então a emulsão em relação à actividade. Esta actividade foi comparada com a actividade das soluções de armazém de HRP que se mantiveram a 50°C durante o mesmo tempo e depois se pipetaram para solução salina (30 μΐ para 970 μΐ de solução salina) da mesma maneira que a microemulsão anterior. Diluiu-se primeiro a HRP de armazém para a mesma concentração da HRP na fase aquosa da microemulsão convertida.

A. Procedimento de ensaio

O ensaio realizou-se como se segue:

1. Coloca-se o espectrofotómetro a 492 nm e 25°C.

2. Pipeta-se para a cuvete 2,97 ml de solução tampão de ODP (o-fenilenodiamina) (1 tab.—> 26 ml).

3. Estabelece-se o branco a 492 nm.

4. Pipeta-se para a cuvete 25 μΐ de solução de HRP de controlo diluída... Mistura-se e regista-se o aumento de absorvância a 492 nm durante 5 minutos.

5. Segue-se o mesmo procedimento para a microemulsão de a/solução de HRP. OPD = o-fenilenodiamina

B. Resultados:

Determinou-se a percentagem de actividade utilizando a seguinte equação:

actividade no tempo t

Percentagem de actividade = ------------------------ x 100 actividade no tempo 0

872

AFBI - 0288

-38A tabela seguinte sumariza os resultados que se obtiveram do ensaio da HRP de controlo e da microemulsão contendo a HRP.

TABELA 2

PERCENTAGEM DE ACTIVIDADES DA HRP DE CONTROLO (SOLUÇÕES DE

ARMAZÉM) E DA MICROEMULSÃO CONTENDO A HRP

Tempo (horas)	% de actividade HRP de controlo	HRP em ME
0	100	100
3	76	77
6	73	83
24	20	68
27	20	68
48	11	53

Dos resultados anteriores, poder-se-á ver que após 48 horas, a microemulsão contendo a HRP foi muito mais activa do que a HRP de controlo, a qual tinha perdido a maioria da sua actividade em 48 horas. Assim, a microemulsão deste invento proporciona a vantagem distinta de permitir uma armazenagem a longo prazo de proteínas a temperaturas elevadas, enquanto até aqui elas tinham que ser mantidas a temperaturas muito mais baixas para preservar a sua estabilidade.

) EXEMPLO 11

Realizou-se uma série de experiências em ratazanas utilizando as microemulsões de a/o deste invento para as avaliar como veículos para a distribuição rectal do péptido calcitonina, (utilizado no tratamento de hipercalcémia baixando os níveis de Ca⁺⁺ no soro), onde os fluidos corporais da ratazana servirão para converter a microemulsão de a/o numa emulsão de o/a e assim libertar a calcitonina.

Produziram-se formulações que variaram de 3% a 15% (v/v) de fase aquosa e que variaram de líquidos a geles à temperatura ambiente. As formulações continham, em adição à fase aquosa, um a três óleos e uma liga de dois emulsionantes. A maioria das formulações mostrou estabilidade à temperatura numa gama de 5°C

872

AFBI - 0288

-39a 50°C. Escolheram-se três formulações com diferentes ligas de óleos para avaliação biológica em modelos de ratazanas macho jovens (ratazanas Sprague-Dawley; 140-170 gm).

Comparou-se a instilação rectal com as injecções directas de calcitonina no corpo. Como se mostra pelos dados seguintes, a instilação rectal de cada uma das três formulações de microemulsões de calcitonina testadas produziu uma diminuição, dependente da dose, do cálcio no soro na ratazana, demonstrando assim que a microemulsão de a/o se tinha convertido no cólon, com a libertação de quantidades eficazes de calcitonina activa. Por outro lado, as preparações de microemulsões de controlo que não continham calcitonina não produziram uma variação significativa nos níveis de cálcio no soro. Além disto, como se mostra abaixo, a incorporação de dois óleos mais o óleo de coco no supositório para formar uma microemulsão semi-sólida melhorou a resposta da calcitonina mais de dez vezes sobre a formulação líquida básica contendo um único óleo.

A. Formulações

Testaram-se três formulações de microemulsões de a/o que continham 3% v/v de volume de fase aquosa, e variando as quantidades de calcitonina/ml de emulsão. Formularam-se na forma de líquidos, duas formulações, A e B abaixo; a terceira microemulsão (Formulação C) foi formulada na forma semi-sólida (supositório) por adição de um óleo de coco de elevado ponto de fusão à microemulsão. Esta formulação era um sólido ceroso brando à temperatura ambiente que derreteu à temperatura do corpo para libertar a calcitonina da microemulsão.

Chave para as Formulações de Microemulsões de Calcitonina:

A. A microemulsão do exemplo 2, mais calcitonina.

B. A microemulsão do exemplo 4, mais calcitonina.

C. A microemulsão do exemplo 4, (1 volume); ao qual se adicionam dois volumes de uma mistura contendo volumes de óleo de coco e 0,2 volumes de Capmul MCM; mais calcitonina.

1,8

872

AFBI - 0288

-40Todas as concentrações de calcitonina são dadas em unidades de actividade biológica por volume da emulsão final.

B. Processos de teste

Administraram-se rectalmente microemulsões contendo calcitonina, ou apenas contendo solução salina (controlo) a cada um dos grupos de 3 a 7 ratazanas num volume de 250 μΐ. Tomaram-se amostras de sangue no tempo = 0, 1, e 2 horas após a dosagem. Mediu-se o cálcio do soro após 1 e 2 horas pois os estudos iniciais mostraram que é quando se obtém a resposta máxima da calcitonina. Anastesiaram-se as ratazanas pelo procedimento completo e sangraram-se pela cavidade orbital.

Preparou-se o soro de cada amostra de sangue e determinaram-se os níveis de Ca⁺² no soro (cálcio ionizado livre) utilizando um equipamento de ensaio clínico de cálcio Beckman.

C. Resultados

Os resultados deste estudo estão mostrados na tabela 2 a qual sumariza a actividade das microemulsões A, B e C.

(Segue Tabela 3)

872

0288

w.

DAS MICROEMULSÕES DE CALCITONINA INSTILADAS

RECTALMENTE

AFBI

-41TABELA 3

EFEITO

SOBRE OS

NÍVEIS DE

CÁLCIO NO SORO

Variação no

CA⁺² do soro lh

Conteúdo de calcitonina

MicroN² de após tratamento

emulsão	(unidade/ml)	animais	(mg/dl)	liSD¹	Após	2	h¹
A	0	4	0,23	+	2,55	1,92	+	1,01
	60	7	-1,81	+	2,50	-1,02	+	1,65
	120	5	-1,11	+	0,96	-1,60	+	1,25
	240	5	-1,89	±	1,27	-2,44	+	1,29
B	0	4	-0,38	±	1,58	0,73	+	0,91
	10	4	-1,78	+	0,78	-1,30	+	0,50
	20	5	-1,98	+	0,47	-2,36	+	0,44
	0	3	0,17	+	0,09	0,67	+	0,50
C	10	4	-1,71	+	0,51	-2,39	+	0,36
	20	4	-1,82	+	0,35	-2,23	+	0,11
B pré-	0	5	0,41	+	0,13	0,47	±	0,40
convertida	20	5	-1,27	+	1,07	-1,62	+	1,29
Solução	10	5	-0,13	+	0,45	0,15	+	0,33

salina ¹ cálcio ionizado no soro do sangue em unidades de miligramas de cálcio (mg) por decilitro (100 ml) de soro ± o desvio padrão.

Os resultados mostrados na tabela 2 mostram a eficácia das nossas microemulsões contendo calcitonina para baixar o cálcio do soro. Devido à elevada resposta da ME-B comparada com a ME-A, é necessário determinar que o nível da resposta da ME-A não foi devido a desactivação da calcitonina pela própria formulação. Para determinar isto, injectaram-se SQ 25 0 μΐ de ME-A (60 Unidades/ml) e ME-A (0 Unidades/ml) em dois pares de animais. 0

872

AFBI - 0288 cálcio do soro diminuiu uma média de 3,2 mg/dl (miligramas/decilitro) nos animais tratados com a microemulsão de calcitonina, e 0,3 mg/dl nos controlos. Isto demonstra a presença de calcitonina activa em ME-A.

Realizou-se outra série de testes para demonstrar a eficácia destas emulsões que foram convertidas após armazenagem mas antes da administração nas ratazanas. De acordo com estes testes, formulou-se a microemulsão B e armazenou-se a 5°c durante 2 dias, que seguidamente se converteu numa emulsão de o/a por adição de água em quantidade igual à do volume total da emulsão antes da introdução rectal nas ratazanas. Como mostrado na tabela 2, a calcitonina foi geralmente eficaz após a armazenagem quando pré-convertida e depois utilizada, mas não tão eficaz como com a conversão interna dentro do cólon.

A tabela mostra também que a incorporação dos mono e diglicéridos produziu, surpreendentemente, uma melhoria significativa na resposta à calcitonina. Uma dose de 20 U/ml de ME-B produziu uma resposta similar à que se obteve previamente com 240 U/ml de ME-A, um melhoramento superior a uma ordem de grandeza.

A administração rectal da microemulsão C de calcitonina sólida produziu respostas que foram iguais ou superiores às observadas com a formulação B.

A última linha da tabela 2 indica que a instilação de uma solução salina de calcitonina no recto não produziu resposta significativa.

EXEMPLO 12 exemplo seguinte demonstra que uma microemulsão não convertível em que o HLB do tensioactivo era de 4,0, não foi eficaz na distribuição rectal de calcitonina.

Formulou-se uma microemulsão como se segue, utilizando o procedimento geral do exemplo 1:

872

AFBI - 0288

-43COMPONENTE

COMPOSIÇÃO

VALOR DE HLB QUANTIDADE (ttL)

óleo	Captex 200	500
Tensioactivo	Centrophase 31¹	4,0	450
Água mais calcitonina	Solução tamponada²		50
Total		4,0	1000

¹Lecitina de soja líquida ²Quantidade de calcitonina =240 unidades/ml

Introduziu-se a microemulsão de a/o resultante contendo calcitonina no cólon das ratazanas de acordo com os procedimentos gerais do exemplo 11. Uma medição do cálcio ionizado no sangue não mostrou diminuição significativa para o sistema de microemulsão quando comparado com uma formulação de controlo sem calcitonina.

EXEMPLO 13 exemplo seguinte demonstra a produção de sistemas de microemulsão de a/o que possuem concentrações de água relativamente elevadas. De acordo com o procedimento geral mencionado anteriormente, prepararam-se as microemulsões de a/o empregando os componentes, quantidades e razões seguintes (os volumes abaixo estão em microlitros):

872

AFBI - 0288

	Tens ioactivo	Óleo	Fase aquosa
Exemplo	Myverol 18-92	Tween 20	Centroleno A	Captex 200	Triacetina	Solução NaCl 1%	Água
1	270	230	—	100	—	400	—
2	250	200	50	100	—	400	—
3	240	180	80	50	50	—	400
4	260	160	80	50	50	—	400
5	260	160	80	50	50	—	500
6	260	160	80	50	50	—	600
7	260	160	80	50	50	—	720

Tween 20 é um éster laurato de sorbitol possuindo um valor de HLB de cerca de 16,7 adquirido em Spectrum, New Brunswick, NJ. Centroleno A é uma lecitina hidroxilada possuindo um valor de HLB de cerca de 9,5 manufacturada por Central Soya, Fort Wayne, IN.

EXEMPLO 14

Realizou-se uma série de experiências utilizando ratazanas com microemulsões de a/o deste invento que são sólidas às condições ambiente para as avaliar como veículo para a distribuição oral do péptido calcitonina de salmão (utilizado no tratamento de hipercalcémia baixando os níveis de Ca⁺² e P04 no soro). Os fluidos corporais de ratazana serviram para converter a microemulsão numa emulsão de o/a que activou a droga e promoveu a absorção e incorporação da droga pelo animal. As variáveis controladas foram o Ca⁺² e o PO4.

Formulações

Prepararam-se as preparações de teste utilizando um óleo de elevado ponto de fusão, neste caso uma mistura de óleo de coco hidrogenado e óleo de palma. Os óleos utilizados foram obtidos de Karlshamns Lipid Specialties, USA, de Columbus, Ohio. Os óleos foram marcados HB-95, HB-108, e HB-118 que correspondem aos nomes comerciais de HYDROKOTE 95, 108 e 118. Os óleos tinham

872

AFBI - 0288 pontos de fusão aproximados de 95, 108 e 118°F (35, 42 e 48°C), respectivamente.

grupo A de microemulsões foi preparado formulando primeiro a microemulsão e depois misturando o óleo HB-108 com a microemulsão. Misturaram-se os componentes da microemulsão num contentor a uma temperatura elevada de cerca de 40°C aos quais se adicionou a calcitonina contida no tampão acetato. Uma vez formada a microemulsão, adicionou-se o componente HB-108 contendo 10% de Capmul.

Os grupos B e C de microemulsões foram preparadas formulando a microemulsão directamente com o óleo HB.

FORMULAÇÕES

	Grupo Al	Controlo (Al
Dose	40 U/ml	0 U/ml
Capmul MCM a 10% em Captex 200	570 μΐ	1,71 ml
Cremophor EL	298 μΐ	894 μΐ
Lecitina	35 μΐ	105 μΐ
Tampão acetato lOOmm	92 μΐ	300 μΐ
solução de armazém de calcitonina 10000 U/ml	8 μΐ	“ ·*·“
HE total	1,0 ml	3,0 ml
Capmul a 10% em HB-108	1,0 ml	3,0 ml

Volume total

2,0 ml

6,0 ml

872

AFBI - 0288

-46Grupo BI

Controlo (Bl')

Dose	40 U/ml	0 U/ml
Myverol 18-92	373 pl	746 pl
Tween 80	404 pl	808 pl
Capmul MCM	124 pl	249 pl
HB-95	725 pl	1,45 ml
Tampão acetato lOOmm	365 pl	746 pl
Solução de armazém de calcitonina 10000 U/ml	8 pl
Volume total	2,0 ml	4,0 ml

	Grupo ci	Controlo
Dose	40 U/ml	0 U/ml
Myverol 18-92	373 pl	746 pl
Tween 80	404 pl	808 pl
Capmul MCM	124 pl	249 pl
HB-118	725 pl	1,45
Tampão acetato 100 mm	365 pl	746 pl
Solução de armazém de calcitonina 10000 U/ml	8 pl

Volume total

2,0 ml

4,0 ml

872 AFBI - 0288 -47

Processo do teste

Cada grupo de teste continha cinco animais ( ratazanas macho jovens, ratazanas Spraque-Dawley aprox. 140-170 gm). Os grupos Al, BI e Cl receberam 250 μΐ da microemulsão respectiva, 40 U/ml de calcitonina; os controlos receberam 250 μΐ da microemulsão de controlo.

Os animais foram alimentados forçadamente por via oral com a microemulsão derretida e depois foram rapidamente anestesiados e recolheu-se uma amostra de sangue pela cavidade orbital para estabelecer uma linha de base (Τθ). Após 120 min., recolheu-se I uma segunda amostra de sangue. Analisaram-se os níveis de Ca⁺² e P04 em ambas as amostras e compararam-se para determinar a activação e a absorção e incorporação da droga. Os níveis de Ca⁺² no soro (cálcio ionizado livre) foram determinados utilizando um equipamento de ensaio clínico de cálcio Beckman 700 juntamente com os níveis de po4 no soro.

Resultados

Os resultados deste estudo estão mostrados na tabela seguinte a qual sumariza a actividade das microemulsões Al, BI e Cl e dos controlos Al^z, BI* e Cl*. Todas as formulações de microemulsões de calcitonina mostraram, estatisticamente, reduções significativas tanto nos níveis de Ca⁺² como nos de PO₄no soro, excepto o sistema de microemulsão Cl, que não mostrou esta actividade para a redução do Ca⁺². 0 valor ^ZP^Z é uma quantidade estatística que se refere à probabilidade de os valores do tratamento e do controlo serem iguais. Um valor ^ZP^Zde 0,05 representa uma probabilidade de um-em-vinte de os grupos serem iguais. Portanto, valores de ^ZP^Z inferiores a 0,05 são considerados estatisticamente significativos.

872

AFBI - 0288

-48& FF^ r_z- ,_s .

ύ

SUMÁRIO DAS VARIAÇÕES DE CÁLCIO E FOSFATO NO SORO INDUZIDAS POR ALIMENTAÇÃO FORÇADA POR VIA ORAL DE RATAZANAS COM MICROEMULSÕES

CONTENDO TRIGLICÉRIDOS DE PONTO DE FUSÃO ELEVADO COM OU SEM CALCITONINA
				Valor		Valor
		Cal-		^ZP^Z		^ZP^Z
		cito-	Dif.	calci-	Dif.	calci-
		nina	Ca⁺²	tonina	PO₄	tonina
Formu-	Trigli	MRC	mg/dl	vs	mg/dl	vs
lação	cérido	U/ml	vs 2h	controlo	vs 2h	controlo
Al	HB-108	40	-0,62	—	-2,8
Al^z	HB-108	0	-0,14	0,029	-0,8	0,010
BI	HB-95	40	-1,58	—	-2,6
Bl^z	HB-95	0	0,82	0,036	-0,2	0,003
Cl	HB-118	40	2,08	—	-2,6
Cl^z	HB-118	0	0,08	0,880	0,0	0,005

Valores ^ZP^Z < 0,05 são considerados significativos.

EXEMPLO 15

Realizou-se uma série de experiências utilizando ratazanas com a microemulsão de a/o deste invento para avaliar o comportamento entre formulações sólidas e formulações líquidas utilizando o péptido calcitonina de salmão (utilizado no tratamento de hipercalcémia baixando os níveis de Ca⁺² no soro) por via de administração oral. Os fluidos corporais da ratazana serviram para converter a microemulsão numa emulsão de o/a a qual activou a droga e promoveu a absorção e incorporação da droga pelo animal. Controlou-se o Ca⁺² do soro para calcular a eficácia do sistema transportador de microemulsão.

Formulações

Prepararam-se as preparações de teste sólidas utilizando um óleo de elevado ponto de fusão, neste caso uma mistura de óleo de coco hidrogenado e óleo de palma, HB-108 (HYDROKOTE 108) que possui um ponto de fusão de 42°C.

872

AFBI - 0288

Os grupos de microemulsões (ME) A e B foram preparados na forma de microemulsões líquidas à temperatura ambiente. A ME A foi o controlo líquido e não continha calcitonina. O grupo de ME B foi a amostra de calcitonina líquida. As ME C e D foram preparadas na forma de sólidos à temperatura ambiente formulando primeiro a microemulsão e depois misturando o óleo HB-108 com a microemulsão. Misturaram-se os componentes da microemulsão num contentor a uma temperatura elevada de cerca de 40“C aos quais se adicionou a calcitonina contida num tampão acetato. Uma vez formada a microemulsão, adicionou-se o componente HB-108 contendo 10% de Capmul. A ME C foi a ME de controlo sólida e a ME D foi a amostra de calcitonina.

FORMULAÇÕES

Grupo A Dose Controlo	Grupo B 40 U/ml de Calcitonina	Grupo C* Controlo	Grupo D* 40 U/ml de Calcitonina
Capmul MCM	157 μΐ	157 μΐ	57 Ml	57 Ml
Captex 200	1,413 ml	1,413 ml	513 Ml	513 Ml
Centrophase 31 (lecitina)	35 μΐ	35 μΐ	35 Ml	35 Ml
Cremophor EL	298 μΐ	298 Ml	298 Ml	298 Ml
Solução salina	100 μΐ	92 Ml	100 Ml	92 Ml
Calcitonina de salmão (10000 U/ml)	—	8 Ml	—	8 Ml
1 HB-108	—	—	0,9 ml	0,9 ml
Capmul MCM**	—	—	0,1 ml	0,1 ml
Volumes totais	2 ml	2 ml	2 ml	2 ml

* A base do s/xpositório continha pequenas quantidades de metilparabeno, propilparabeno e BHT.

872

AFBI - 0288

** As ME C e D foram preparadas primeiro e estes componentes da base dos supositórios foram adicionados para formular a ME final que era sólida à temperatura ambiente.

Processo de teste

Cada grupo de teste continha quatro animais (ratazanas macho jovens, ratazanas Spraque-Dawley aprox. 110 gm). Os grupos B e D receberam 250 μΐ da respectiva microemulsão, 100 U/ml de calcitonina; os controlos receberam 250 μΐ da microemulsão de controlo.

Os animais foram alimentados forçadamente por via oral com a ME líquida e a ME sólida derretida e depois rapidamente anestesiados e recolheu-se uma amostra de sangue pela cavidade orbital para estabelecer uma linha de base. Após 120 min., recolheu-se uma segunda amostra de sangue. Analisou-se o nível de Ca⁺² em ambas as amostras e compararam-se para determinar a activação e a absorção e incorporação da droga. Os níveis de Ca⁺² no soro (cálcio ionizado livre) foram determinados utilizando um equipamento de ensaio clínico de cálcio Beckman 700.

Resultados

Os resultados deste estudo estão mostrados na tabela seguinte a qual sumariza a actividade das microemulsões A, B, C e D. Verificou-se que o nível de Ca⁺² no soro após 120 min. estava significativamente reduzido, quando comparado com o controlo, apenas na formulação de microemulsão sólida, ME D. O nível de Ca⁺² no soro não foi significativamente reduzido utilizando a amostra líquida de calcitonina, ME B, quando comparado com o controlo.

872

AFBI - 0288

SUMÁRIO DOS NÍVEIS DE CÁLCIO NO SORO DUAS HORAS APÓS A ALIMENTAÇÃO FORÇADA COM AS MICROEMULSÕES LÍQUIDAS OU SÓLIDAS DERRETIDAS, COM OU SEM CALCITONINA DE SALMÃO NA FASE AQUOSA

Grupo	Tratamento	Calcitonina MRC U/ml	Ca⁺² no soro 2h após a dose	SD	^ZP^Z Dif
A	ME	líquida	0	13,9	2,75	—
B	ME	líquida	40	12,2	0,82	0,860
C	ME	sólida	0	13,5	2,89	—
D	ME	sólida	40	9,0	2,70	0,033

Valores ^ZP^Z < 0,05 são considerados significativos.

EXEMPLO 16

Prepararam-se formulações de microemulsões de a/o estáveis as quais, após conversão com água adicional, formam microemulsão de o/a. As microemulsões de a/o foram formuladas com um sorbitol em solução salina que permitiu a formação da microemulsão de a/o a valores de HLB mais elevados do que os necessários para formar a microemulsão de a/o sem a presença da solução de sorbitol. O valor de HLB mais elevado permite que o sistema se converta numa microemulsão de o/a.

A amostra das microemulsões de a/o que se convertem em microemulsões de o/a foi preparada de acordo com os sistemas descritos abaixo. 0 componente HB-95 é uma mistura purificada de óleo de coco e óleo de palma, manufacturada por Karlshamns Lipid Specialties of Columbus, OH, possuindo um ponto de fusão de 35°C. Myverol 18-92 é um tensioactivo possuindo um valor de HLB = 4 e é manufacturado por Eastman Chemicals. Capmul MCM é um tensioactivo possuindo um valor de HLB = 5,5-6,0 e é manufacturado por Karlshamns Lipid Specialties. Tween 80 é um tensioactivo possuindo um valor de HLB = 15 e foi adquirido em Spectrum Chemicals. Dissolveu-se o sorbitol numa solução salina de NaCl 0,15 M. Determinou-se o HLB utilizando um volume médio. A temperatura foi a temperatura a que se formou a microemulsão.

	73 872
	AFBI - 0288

O número médio do tamanho das partículas da microemulsão convertida variou de cerca de 20 a cerca de 70 nanometros. A quantidade de água utilizada para converter a microemulsão de a/o na microemulsão de o/a variou de cerca de 10 a cerca de 1000 vezes a quantidade do volume da microemulsão de a/o original.

Formulações de microemulsões de a/o que se convertem em microemulsões de o/a

Sorbitol Sorbitol a 20% em a 30% em Amos- Captex Myverol Capmul Tween solução solução

tra ID	HB-95 (Mi)	200 (Ml)	18-92 (μΐ)	MCM (Ml)	80 (Ml)	salina (Ml)	salina (MD	HLB	Temp (’C)
A	—	700	130	90	650	360	—	12,4	25
B	700	—	130	90	650	—	360	12,4	40
C	400	300	140	160	570	460	—	11,5	37
D	400	300	100	160	610	460	—	12,0	37
E	400	300	60	160	650	460	—	12,5	37

EXEMPLO 17

Realizou-se uma série de experiências utilizando ratazanas com a microemulsão de a/o deste invento para a avaliar como veículo para a distribuição da hormona do crescimento humana, hGH. Os fluidos corporais das ratazanas serviram para converter a microemulsão numa emulsão de o/a a qual activou a droga e promoveu a absorção e incorporação da droga através da membrana mucosa do cólon da ratazana.

Formulações

Prepararam-se os sistemas de microemulsão de teste como se apresenta abaixo. O grupo A foi uma formulação de supositório preparada com uma formulação de microemulsão do presente invento. A microemulsão do grupo A foi preparada primeiro na forma de um líquido e depois dispersa dentro de um óleo de

872

AFBI - 0288

-53elevado ponto de fusão. Os outros grupos eram soluções tampão e não microemulsões.

Grupo A

Captex 200 com 10% de	1,14 ml
Capmul MCM
Lecitina	0,07 ml
Cremophor EL	0,59 ml
hGH em H₂0 estéril	0,20 ml
HB-108 com 10% de	2,00 ml

Capmul MCM

O grupo A continha 0,096 U hGH/ml. 0 grupo B era uma solução tampão NaPO₄ 5 mM a pH=7,8 com 0,096 U hGH/ml. O grupo C era uma solução tampão NaPO₄ 5 mM a pH=7,8 com 0,024 U hGH/ml. O grupo D não continha hGH e era uma solução tampão NaPO₄ 5 mM a pH=7,8.

Processo de teste

Dividiram-se as ratazanas de teste em quatro grupos: A, B, C e D. Os grupos A, B e C receberam a hormona do crescimento extractada enquanto o grupo D foi um controlo e não recebeu a hormona. As ratazanas tinham aproximadamente 100 gramas e foram mantidas em jejum durante 24 horas antes do teste.

A dosagem e o tamanho dos grupos está mostrado na tabela abaixo. O grupo injectado, Grupo C, recebeu a hGH extractada numa solução tampão a uma dose equivalente humana de 0,05 mg/Kg de peso corporal. Os dois grupos de administração rectal, grupos A e B, receberam dez vezes a dose equivalente humana.

872

AFBI - 0288

Grupo	Via	(Vol/forma de dosagem)	ΓDrogai/ratazana	N^a
A	rectal	250 μΐ/supositório	0,024 unidades	18
B	rectal	250 μΐ/tampão	0,024 unidades	12
C	SQ	100 μΐ/tampão	0,0024 unidades	12
D	controlo	0	0	2

Anestesiaram-se as ratazanas imediatamente antes da dosagem. Os supositórios (grupo A) e a solução tampão (grupo B) administradas rectalmente foram selados no recto por um bujão e aglutinante líquido. Os animais do grupo C foram injectados sub-cutaneamente (SQ). Após a administração da dosagem, determinaram-se os níveis de hGH do soro a 30, 60, 120, 180, 240 e 300 minutos. Os três animais do grupo A foram utilizados para pontos de dados. Dois animais dos grupos B e C foram usados para pontos de dados. Dois animais foram utilizados a 0 minutos para uma linha de base no grupo de controlo, grupo D. Recolheram-se as amostras de sangue da cavidade orbital. Centrifugou-se o sangue e ensaiou-se o soro por ELISA hGH (Medix Lab, Foster City, CA) para a quantificação da hormona de crescimento extractada.

Resultados

Com dez vezes o nível da dose equivalente humana, as formulações de supositório (grupo A) mostraram uma biodisponibilidade equivalente à da dose injectada (grupo C). A ASC (área sob a curva) para ambas as vias de administração foi determinada utilizando a regra dos trapézios (M.Gibaldi, Biopharmaceutics and Clinicai Pharmacokinetics, Lea e Febiger, Philadelphia, PA, 1984, pp. 315-16). A ASC foi aproximadamente

24,5 ng-h/ml tanto para a injecção SQ como para o supositório. A hGH em tampão que foi administrada rectalmente na mesma dose que a formulação de supositório não mostrou absorção nem incorporação da droga. A biodisponibilidade da formulação do supositório foi de cerca de 10% quando comparada com uma dose inj ectada.

872

AFBI - 0288

-55hGH injectada hGH em supositório

Tempo (Grupo C) (Grupo A)

(min.)	(ng/ml)	SD	(nq/ml)	SD
30	16,5	5,00	16,000	4,360
60	10,0	0,00	14,700	8,330
120	6,0	1,40	2,000	2,000
180	2,5	2,12	1,670	1,160
240	0,5	0,71	1,670	0,580
300	0,0	0,00	0,333	0,577

Injectado n=2; supositório n=3

EXEMPLO 18

Realizaram-se experiências utilizando ratazanas com as microemulsões de a/o deste invento para as avaliar como veículo para a distribuição do péptido ciclo(SjSj-N^-acetil-Cys-ÍNG-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂.

Formulações

Prepararam-se os sistemas de microemulsões de teste de acordo com os processos da descrição com o péptido adicionado ao último sistema.

COMPOSIÇÃO DAS MICROEMULSÕES (% EM PESO) )

COMPONENTE

(% EM PESO)	ME-1	ME-2	ME-3	ME-4	ME-5	ME-6
CAPTEX 200	68,30	76,47		76,57	76,65	76,49
MYVACET			76,91
CAPMUL MCM	8,31		9,09		9,28	9,26
DICAPRIN				9,26
CENTROPHASE 31	1,60	1,61		0,96	2,13
MYVEROL 18-92			1,04			1,06
CREMOPHOR EL	16,52	16,63	9,82	10,01		10,00
TWEEN 80					8,74
SOL. SALINA (PÉPTIDO)	5,26	5,30	3,13	3,19	3,20	3,19

872

AFBI - 0288

Processo de teste

Administração intravenosa (i.v.): Anastesiaram-se ratazanas em jejum com uma injecção intraperitonial (i.p. ) e equiparam-se cirurgicamente com um cateter jugular (protocolo ACUD #90-151). Deixam-se as ratazanas recuperar da cirurgia durante um dia. Mantiveram-se as ratazanas em jejum com o cateter durante 18 h antes da experiência.. Cada ratazana recebeu uma dose de 1 mg ou de 3 mg de péptido/Kg por administração na veia lateral da cauda. Recolheram-se amostras de sangue em alíquotas de 0,5 ml a 0, 1, 3, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 min. A amostra a 0 min. foi recolhida 15 min. antes da administração da dose. Removeu-se o plasma do sangue completo por centrifugação a 1600 x g durante 5 min., e depois armazenou-se o plasma a -20°C em alíquotas de 250 μΐ por amostra. Reconstituiu-se a pelota de sangue com 12,5 unidades de solução salina heparinizada e repôs-se na ratazana apropriada pelo cateter jugular. Após a experiência, praticou-se eutanásia nas ratazanas com administração i.v. de pentobarbital.

Administração intraduodenal fi.d.): Administrou-se a ratazanas em jejum uma injecção i.p. de uma mistura de anastesias e equiparam-se cirurgicamente com cateteres jugular e duodenal. Deixaram-se as ratazanas recuperar da cirurgia durante 4-5 dias (protocolo ACUD #91-055). Mantiveram-se as ratazanas em jejum com os cateteres 18-20 h antes da experiência. Cada grupo de ratazanas recebeu 10 mg de péptido/Kg em cada microemulsão (3,3 ml/Kg) ou 6,5 mg de péptido/Kg em cada microemulsão (3,3 ml/Kg). Administrou-se uma solução salina de controlo a um grupo de ratazanas contendo 10 mg de péptido/Kg numa solução salina. Recolheram-se amostras de sangue em alíquotas de 0,5 ml pelo cateter jugular em tubos eppendorf heparinizados a 0, 10, 30, 60, 120, 180, 240 e 1440 min. A amostra a 0 min. foi recolhida 15 min. antes da administração da dose pelo cateter duodenal. Recolheu-se o plasma para análise e repôs-se o sangue nas ratazanas como se descreveu no protocolo da administração i.v. Após 24 h, praticou-se eutanásia nas ratazanas por administração

i.v. de pentobarbital, sangraram-se, e realizou-se a observação macroscópica do aparelho intestinal.

872

AFBI - 0288

-57Ensaio de fluorescência pós-coluna de HPLC: Para as amostras e padrões, precipitaram-se os componentes do plasma com 0,6 ml de cetonitrilo, e depois sedimentaram-se por centrifugação a 16000 x g durante 20 min. Removeu-se o sobrenadante, e depois secou-se a um pó sob N₂ a 40°C. Dissolveu-se o pó em 0,5 ml de solução de TFA a 1%, e depois processou-se pelo procedimento de extracção em fase sólida (SPEP). 0 SPEP foi como se segue: 1) condicionaram-se colunas de c₁₈ de 1 ml com metanol, e depois enxaguaram-se as colunas com 1 ml de água, 2) aplicaram-se as amostras e os padrões nas colunas, e depois enxaguaram-se duas vezes com 1 ml de água, 3) recolheram-se as amostras e os padrões em tubos após a eluição da coluna com metanol em duas alíquotas de 0,5 ml. Secaram-se as amostras e os padrões em pós sob N₂ a 40°C, e depois dissolveram-se em 100 μΐ de metanol a 10%: solução de água ultra-pura a 90%. Colocaram-se as amostras

e os padrões em frascos de HPLC. Colocaram-se os frascos com os padrões antes e depois dos frascos contendo as amostras para análise por HPLC. Para os péptidos padrão, injectou-se uma alíguota para análise baseada na concentração dos padrões como se segue: injectou-se uma alíquota de 50 μΐ para análise por detecção de fluorescência pós-coluna. Recolheram-se os dados da cromatografia de fluorescência e integraram-se utilizando o Nelson Chromatography Data System. Utilizaram-se a razão de áreas dos picos (Y) e a concentração padrão de péptido (X) para determinar o declive de uma linha que se forçou a passar pela origem pela equação: declive=(somatório de X*Y)/(somatório de X²). 0 declive representava a relação entre a razão das áreas dos picos e a concentração de péptido no plasma para as amostras.

Resultados

Determinou-se a área sob a curva da concentração de plasma (ASC) para cada grupo de teste. Determinou-se a percentagem de biodisponibilidade pela equação com a ASC média da administração i.v.:[(AUC_id/AUC_iv)*(mg/Kg_iv/mg/Kg_id)]*100. o sumário dos resultados está listado abaixo em que as formulações de microemulsões do presente invento mostraram um aumento significativo na biodisponibilidade do péptido em comparação com

872

AFBI - 0288

-58a solução salina.

FORMULAÇÃO

DOSE(mg/Kg) N

AUC¹ BAC² (%)

SOL. SALINA	10,0	3	0,011	+	0,005	0,5	+	0,3
ME-1	6,5	3	0,405	+	0,099	29,1	+	7,1
ME-2	6,5	3	0,269	+	0,164	19,4	+	11,8
ME-3	10,0	3	0,115	+	0,042	5,4	+	2,2
ME-4	10,0	3	0,054	+	0,04	2,5	+	1,9
ME-5	10,0	1	0,8			7,4
ME-6	10,0	3	0,308	+	0,094	14,4	+	4,4

Área sob a curva (mg*min/ml) ² Biodisponibilidade relativa ao péptido injectado i.v.

EXEMPLO 19

Formulou-se uma microemulsão de a/o de acordo com a ME-1 do exemplo 18 com o péptido de libertação da hormona do crescimento His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂. A composição da microemulsão foi:

Captex 200	68,3% p/p
Capmul MCM	8,3% p/p
Centrophase 31	1,6% P/P
Cremophor EL	16,5% p/p

Sol. aquosa

5,3% p/p

A solução aquosa continha 25,43 mg de péptido/ml.

EXEMPLOS 20-24

Formula-se uma microemulsão de a/o de acordo com as ME-2, ME-3, ME-4, ME-5 e ME-6 do exemplo 18 com o péptido de libertação da hormona do crescimento His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂ tanto a cerca de 25 mg/ml como a 75 mg/ml do meio aquoso.

872

AFBI - 0288

EXEMPLO 25

Prepararam-se vários diagramas de fases misturando os tensioactivos nas razões de pesos indicadas nas figuras seguintes e depois misturando a mistura de tensioactivos com o óleo em várias razões de pesos. Titularam-se então as misturas de óleo/tensioactivo com quantidades crescentes de uma solução salina a 0,9% p/p. As experiências foram realizadas à temperatura ambiente, 22-23°C, a menos que indicado em contrário. As regiões da microemulsão de água-em-óleo foram estáveis durante pelo menos 24 horas como determinado mantendo o sistema numa única fase. A presença de fases líquidas cristalinas foi determinada por observação das amostras entre polarizadores cruzados, estes sistemas não foram definidos nas figuras como microemulsões de água-em-óleo.

Os componentes das microemulsões de água-em-óleo são:

Captex 200 Capmul MCM

Cremophor EL ésteres de propilenoglicol dos ácidos cáprico/ caprílico (Karlshamns Lipid Specialties,

Columbus,OH) mono e diglicéridos de ácidos gordos de cadeia média (cáprico e caprílico) (Karlshamns Lipid Specialties, Columbus, OH) (HLB=5,0) tri-ricinoleato de polioxietilenoglicerol 35 DAC (BASF, Inc.) (HLB=13,5)

Myverol 18-92 monolinoleato de glicerol (HLB=3,8-4,0)

Centrophase 31 -lecitina (peso mol. - 800) (Central Soya, Fort

Tween 80 Wayne, IN) (HLB=4,0) mono-oleato de polioxietileno-sorbitano, Sigma Corp. (HLB=15)

Whitepsol H-15 - uma mistura de triésteres:diésteres de glicerol a 90:10% em peso e ácido láurico com menos que 2% em peso de monoglicéridos, p.f. 33-36°C.

Na fig. 1, a região definida por A é a região da microemulsão de água-em-óleo enquanto que a região definida por

B é uma região de solução de micelas. Na fig. 1, o óleo é

Captex 200, a fase aquosa é uma solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Myverol

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18-92:Cremophor EL numa razão de pesos de 45,5:5,2:49,2. A ME-6 do exemplo 18 está incluída dentro deste diagrama de fases.

Na fig. 2 o óleo é Captex 200, a fase aquosa é solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Centrophase 31:Tween 80 numa razão de pesos de 46:10,6:43,4.

Na fig. 3 o óleo é Captex 200, a fase aquosa é solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Centrophase 31:Cremophor EL numa razão de pesos de 31,5:6:62,5. Este sistema inclui a ME-1 utilizada no exemplo 18.

Na fig. 4 o óleo é Whitepsol H-15, a fase aquosa é uma solução aquosa de Sorbitol a 20% em peso em solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Myverol 18-92:Tween 80 numa razão de pesos de 15,4:8,5:76.

Na fig. 5 o óleo é MYVACET 9-45K, a fase aquosa é solução aquosa de NaCl a 0,9% em peso, e a mistura de tensioactivos é Capmul MCM:Myverol 18-92:Cremophor EL numa razão de pesos de 45,5:5,2:49,2.

EXEMPLO 26

As microemulsões de água-em-óleo representadas nas figs. 1-5 podem ser preparadas utilizando tanto cerca de 25 mg de péptido/ml como 75 mg de péptido/ml de fase aquosa utilizando ambos os péptidos ciclo(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ e His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂.

Claims

1 - Microemulsão de água-em-óleo, caracterizada por compreender:

(a) até cerca de 60 por cento em volume, com base no volume total da microemulsão, de uma fase aquosa internamente dispersa compreendendo uma quantidade eficaz de um material terapêutico solúvel em água e biologicamente activo;

(b) um fase oleosa contínua compreendendo pelo menos um óleo farmaceuticamente aceitável; e (c) um tensioactivo ou mistura de tensioactivos, possuindo o tensioactivo ou a mistura de tensioactivos um valor do balanço hidrofílico-lipofílico de cerca de 7 a 14, sendo o material activo seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, antagonistas de fibrinogénio, péptidos de libertação da hormona de crescimento, interleucinas, eritropoetinas, factores estimulantes de colónias, péptidos RGD, péptidos hemato-reguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, eritropoetinas, heparinas, interleucinas, factores de coagulação, factores estimulantes de colónias, péptidos de libertação hipotalâmica, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral.

2 - Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a fase oleosa compreender um componente oleoso selec-cionado de entre o grupo que consiste em triésteres de glicerol possuindo entre cerca de 9 e 83 átomos de carbono, e diésteres de propilenoglicol possuindo entre cerca de 7 e 55 átomos de carbono.

3 - Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o tensioactivo ou mistura de tensioactivos ser seleccionado de entre o grupo que consiste em brometo de cetildimetiletilamónio, cloreto de cetilpiridínio e outros sais; ácidos gordos C₈_3₂ ® seus sais; ácido eólico e seus derivados tais como o desoxicolato, e seus sais, ácido ursodesoxicólico, e

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-62ácido taurocólico; diésteres C₈_₅₆ do ácido tartárico; fosfolípidos tais como o ácido fosfatídico e a fosfatidilserina; monoésteres C₅_₂₉ de ácido láctico; sulfonatos C₈_₂q, incluindo derivados alquilo, olefino, e alquilarilo; ácidos tridecil- e dodecilbenzenossulfónicos; e derivados C₅_₃₃ de sarcosina e betaína; fosfatidiletanolamina, esfingomielinas, óleo de ricínio etoxilado; monoglicéridos C₅_₂9 ^e seus derivados etoxilados; diglicéridos Ci₅_6₀ e seus derivados de polioxietileno possuindo 1 a 90 grupos POE; ésteres C^q_₄₀ de ácidos gordos de cadeia longa; álcoois C₁₀_₄₀; ésteres gordos etoxilados C₈_₉g; ésteres gordos de sacarose ^ci4-i30' ^e monoésteres, diésteres e triésteres de sorbitol e sorbitano ^c20-130' ^{e seus} derivados de ¹ polioxietileno (POE) possuindo 0 a 90 grupos POE.

4 - Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a microemulsão conter um modificador na fase aquosa, sendo o modificador seleccionado de entre o grupo que consiste em sorbitol, polietilenoglicol, propilenoglicol, manitol, e mono e dissacáridos e estando presente numa quantidade suficiente para fazer com que a microemulsão de água-em-óleo se converta numa microemulsão de óleo-em-água com a adição de um meio aquoso.

5 - Composição de acordo com a reivindicação 3, caractéri) zada por a fase oleosa consistir essencialmente em diésteres de propilenoglicol possuindo entre cerca de 7 e 55 átomos de carbono.

6 - Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o balanço hidrofílico-lipofílico do tensioactivo ou da mistura de tensioactivos ser de entre cerca de 8 e 13.

7 - Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o tensioactivo ou mistura de tensioactivos serem seleccionados de entre o grupo que consiste em monoglicéridos ^c5-29' diglicéridos C₁₅_₆₀, ésteres gordos etoxilados Cg-gg, monoésteres, diésteres e triésteres de sorbitol e sorbitano C₂₀_ ₁₃₀, e seus derivados de polioxietileno (POE) possuindo 0 a 90

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AFBI - 0288 grupos POE.

8 - Composição de acordo com a reivindicação 4 ou 7, caracterizada por as percentagens em volume da microemulsão de água-em-óleo serem de entre cerca de 0,1 e cerca de 15 para a fase aquosa; entre cerca de 50-90 para a fase oleosa; e entre cerca de 2-50 para o tensioactivo ou mistura de tensioactivos.

9 - Composição de acordo com as reivindicações 3, 4 ou 8, caracterizada por o material activo ser um antagonista de f ibrinogénio.

10 - Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o agente activo ser um péptido possuindo a sequência ciclo-(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂·

11 - Composição de acordo com as reivindicações 3, 4 ou 8, caracterizada por o material activo ser um péptido de libertação da hormona do crescimento.

12 - Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o agente activo ser um péptido possuindo a sequência His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂·

13 - Composição de acordo com as reivindicações 3, 4 ou 8, caracterizada por o agente activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas e hormonas do crescimento humanas.

14 - Processo de preparação de uma microemulsão de água-em-óleo, caracterizada por compreender:

(b) uma fase oleosa contínua consistindo essencialmente em diésteres de propilenoglicol possuindo entre cerca de 7 e 55

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átomos de carbono e triésteres de glicerol possuindo entre cerca de 9 e 83 átomos de carbono; e (c) um tensioactivo ou mistura de tensioactivos, possuindo o tensioactivo ou mistura de tensioactivos um valor do balanço hidrofílico-lipofilico entre cerca de 7 e 14.

15 - Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o material biologicamente activo ser uma proteína, um péptido, um imunogénio, ou um material farmaceuticamente activo e por a fase oleosa consistir em diésteres de propilenoglicol possuindo entre cerca de 7 e 55 átomos de carbono.

16 - Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por o material activo ser uma proteína ou um péptido e por o coeficiente de partição água:óleo do agente activo ser superior a 10:1.

17 - Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o tensioactivo ou mistura de tensioactivos ser seleccionado de entre o grupo que consiste em brometo de cetildimetiletilamónio, cloreto de cetilpiridínio e outros sais; ácidos gordos C₈_₃₂ e seus sais; ácido eólico e seus derivados tais como o desoxicolato, e seus sais, ácido ursodesoxicólico, e ácido taurocólico; diésteres C₈_₅₆ do ácido tartárico; fosfolípidos tais como o ácido fosfatídico e a fosfatidilserina; monoésteres C₅_₂₉ do ácido láctico; sulfonatos C₈_₂₀, incluindo derivados alquil-, olefino- e alquilarilo; ácidos tridecil- e dodecilbenzenossulfónicos; e derivados C₅_₃₃ de sarcosina e betaína; fosfatidiletanolamina, esfingomielinas, óleo de ricínio etoxilado; monoglicéridos C₅_₂₉ e seus derivados etoxilados; diglicéridos C₁₅_₆₀ e seus derivados de polioxietileno possuindo 1 a 90 grupos POE; ésteres C₁₀_₄₀ de ácidos gordos de cadeia longa; álcoois C₁₀_₄₀; ésteres gordos etoxilados C₈_₉₆; ésteres gordos de sacarose C₁₄_₁₃₀; e monoésteres, diésteres e triésteres de sorbitol e sorbitano C₂₀_₁₃₀, e seus derivados de polioxietileno (POE) possuindo 0 a 90 grupos POE.

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18 - Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por o balanço hidrofílico-lipofílico do tensioactivo ou da mistura de tensioactivos ser de entre cerca de 8 e 13.

19 - Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por a microemulsão conter um modificador na fase aquosa, sendo o modificador seleccionado de entre o grupo que consiste em sorbitol, polietilenoglicol, propilenoglicol, manitol, e mono e dissacáridos e estando presente numa quantidade suficiente para fazer com que a microemulsão de água-em-óleo se converta numa microemulsão de óleo-em-água com a adição de um meio aquoso.

20 - Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por a fase não aquosa estar essencialmente isenta de esteróis.

21 - Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por o tensioactivo ou mistura de tensioactivos conter pelo menos um tensioactivo possuindo um valor de HLB inferior a cerca de 5 e pelo menos um tensioactivo possuindo um valor de HLB superior a cerca de 9.

22 - Composição de acordo com a reivindicação 17 ou 19, caracterizada por as percentagens em volume da microemulsão de água-em-óleo serem de entre cerca de 0,1 e cerca de 15 para a fase aquosa; entre cerca de 50-90 para a fase oleosa; e entre cerca de 2-50 para o tensioactivo ou mistura de tensioactivos.

23 - Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o tamanho das partículas ser inferior a cerca de 150 nanómetros.

24 - Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por o tensioactivo ou mistura de tensioactivos serem seleccionados de entre o grupo que consiste em monoglicéridos ^c5-29^z diglicéridos C₁₅_₆₀, ésteres gordos etoxilados C₈_₉₆, monoésteres, diésteres e triésteres de sorbitol e sorbitano

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AFBI - 0288 ^c20-130' ^{e seus} derivados de polioxietileno (POE) possuindo 0 a 90 grupos POE.

25 - Composição de acordo com as reivindicações 17, 19 ou 24, caracterizada por o material activo ser um antagonista de fibrinogénio.

26 - Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por o material activo ser um péptido possuindo a sequência ciclo-(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂.

) 27 - Composição de acordo com as reivindicações 17, 19 ou

24, caracterizada por o material activo ser um péptido de libertação da hormona do crescimento.

28 - Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por o material activo ser um péptido possuindo a sequência His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂.

29 - Composição de acordo com as reivindicações 17, 19 ou 24, caracterizada por o material activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, antagonistas de fibrinogéneo, péptidos de libertação da hormona

J do crescimento, interleucinas, eritropoetinas, factores estimulantes de colónias, péptidos RGD, péptidos hematoreguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, eritropoetinas, heparinas, interleucinas, factores de coagulação, péptidos de libertação hipotalâmica, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral.

30 - Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por o material activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas e hormonas do crescimento humanas.

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AFBI - 0288

31 - Microemulsão de água-em-óleo a qual é sólida à temperatura ambiente, caracterizada por compreender:

(b) uma fase oleosa contínua compreendendo pelo menos um óleo farmaceuticamente aceitável; e (c) um tensioactivo ou mistura de tensioactivos, possuindo o tensioactivo ou mistura de tensioactivos possui um valor do balanço hidrofílico-lipofílico de entre cerca de 7 e 14.

32 - Composição de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por o material biologicamente activo ser uma proteína, um péptido, um imunogénio, ou um material farmaceuticamente activo.

33 - Composição de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por o material activo ser uma proteína ou um péptido e por o coeficiente de partição água:óleo do material activo ser superior a 10:1.

34 - Composição de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por a fase oleosa compreender um óleo seleccionado de entre o grupo que consiste em triésteres de glicerol possuindo entre cerca de 9 e 83 átomos de carbono, e diésteres de propilenoglicol possuindo entre cerca de 7 e 55 átomos de carbono.

35 - Composição de acordo com a reivindicação 34, caracterizada por o tensioactivo ou mistura de tensioactivos serem seleccionados de entre o grupo que consiste em brometo de cetildimetiletilamónio, cloreto de cetilpiridínio e outros sais;

ácidos gordos Cg_₃₂ ^e seus sais;

ácido eólico e seus derivados tais como o desoxicolato, e seus sais, ácido ursodesoxicólico, e ácido taurocólico; diésteres Cg_gg do ácido tartárico;

fosfolipidos tais como o ácido fosfatídico e a fosfatidilserina;

monoésteres C₅_₂₉ do ácido láctico; sulfonatos C₈_₂₀, incluindo derivados alquil-, olefino-, e alquilarilo; ácidos tridecil- e

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AFBI - 0288

-68dodecilbenzenossulfónicos; e derivados C₅_₃₃ de sarcosina e betaína; fosfatidiletanolamina, esfingomielinas, óleo de ricínio etoxilado; monoglicéridos C₅_₂₉ e seus derivados etoxilados; diglicéridos C₁₅_₆₀ e seus derivados de polioxietileno possuindo 1 a 90 grupos POE; ésteres Cio-40 ^acidos gordos de cadeia longa; álcoois C10_40; ésteres gordos etoxilados C8_96; ésters gordos de sacarose ^ci4-i30' ^e monoésteres, diésteres e triésteres de sorbitol e sorbitano C2q_i₃q, e seus derivados de polioxietileno (POE) possuindo 0 a 90 grupos POE.

36 - Composição de acordo com a reivindicação 35, caracterizada por o balanço hidrofílico-lipofílico do tensioactivo ou da mistura de tensioactivos ser de entre cerca de 8 e 13.

37 - Composição de acordo com a reivindicação 35, caracterizada por o tensioactivo ou mistura de tensioactivos conter pelo menos um tensioactivo possuindo um valor de HLB inferior a cerca de 5 e pelo menos um tensioactivo possuindo um valor de HLB superior a cerca de 9.

38 - Composição de acordo com a reivindicação 35, caracterizada por a fase aquosa constituir entre cerca de 0,1 e cerca de 20 por cento em volume da microemulsão.

39 - Composição de acordo com a reivindicação 38, caracterizada por a fase oleosa constituir entre cerca de 50-90 por cento em volume da microemulsão e o tensioactivo constituir entre cerca de 2-50 por cento em volume da microemulsão.

40 - Composição de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por o tamanho das partículas ser inferior a cerca de 150 nanómetros.

41 - Composição de acordo com a reivindicação 35 ou 39, caracterizada por a microemulsão conter um modificador na fase aquosa, sendo o modificador seleccionado de entre o grupo que consiste em sorbitol, polietilenoglicol, propilenoglicol, manitol, e mono- e dissacáridos e estando presente numa

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AFBI - 0288 cg*’

-69quantidade suficiente para fazer com que a microemulsão de água-em-óleo se converta numa microemulsão de óleo-em-água com a adição de um meio aquoso.

42 - Composição de acordo com a reivindicação 41, caracterizada por o óleo ser um diester de propilenoglicol possuindo entre 19-23 átomos de carbono e o tensioactivo ser uma mistura de monoglicéridos e diglicéridos de ácido cáprico e caprílico.

43 - Composição de acordo com as reivindicações 35, 39 ou 41, caracterizada por o material activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, antagonistas de fibrinogénio, péptidos de libertação da hormona de crescimento, interleucinas, eritropoetinas, factores estimulantes de colónias, péptidos RGD, péptidos hematoreguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, eritropoetinas, heparinas, interleucinas, factores de coagulação, factores estimulantes de colónias, péptidos de libertação hipotalâmica, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral.

44 - Composição de acordo com a reivindicação 43, caracterizada por o material activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, e hormonas do crescimento humanas.

45 - Composição de acordo com as reivindicações 35, 39 ou 41, caracterizada por o material activo ser um antagonista de fibrinogénio.

46 - Composição de acordo com a reivindicação 45, caracterizada por o material activo ser um péptido possuindo a sequência ciclo-(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pennh₂.

47 - Composição de acordo com as reivindicações 35, 39 ou 41, caracterizada por o material activo ser um péptido de

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AFBI - 0288 libertação da hormona do crescimento.

48 - Composição de acordo com a reivindicação 47, caracterizada por o material activo ser um péptido possuindo a sequência His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂-

49 - Microemulsão de água-em-óleo para a distribuição de um material terapêutico biologicamente activo, caracterizada por compreender:

cerca de 5-80% v/v de uma composição contendo uma mistura de triésteres:diésteres de glicerol e ácido láurico;

cerca de 15-50% v/v de monooleato de polioxietilenoJ sorbitano;

cerca de 3-11% v/v de uma mistura de mono e di-glicéridos de ácido cáprico e caprílico;

cerca de 2-6% v/v de monoglicéridos de cadeia longa;

cerca de 6-42% v/v de uma solução aquosa de sorbitol a 25% p/p e de propilenogligol a 25% p/p contendo um agente biologicamente activo.

50 - Composição de acordo com a reivindicação 49, caracterizada por o material activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, antagonistas de fibrinogénio, péptidos de libertação da hormona de crescimento, j interleucinas, eritropoetinas, factores estimulantes de colónias, péptidos RGD, péptidos hemato-reguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, heparinas, interleucinas, factores de coagulação, péptidos de libertação hipotalâmica, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral.

51 - Composição de acordo com a reivindicação 50 caracterizada por o material activo ser calcitoninas, insulinas, e hormonas do crescimento humanas.

52 - Composição de acordo com a reivindicação 49, caracterizada por o material activo ser um antagonista de fibrinogénio.

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/' ; 53 - Composição de acordo com a reivindicação 52, caracterizada por o material activo ser um péptido possuindo a sequência ciclo-(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂. 54 - Composição de acordo com a reivindicação 49, caracterizada por o material activo ser um péptido de libertação da hormona do crescimento. 55 - Composição de acordo com a reivindicação 54, caracterizada por o material activo ser um péptido possuindo a sequência His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂. 56 - Processo de preparação de uma microemulsão de água-emóleo para a distribuição de um material terapêutico, biologicamente activo, caracterizado por as proporções relativas da fase oleosa, fase aquosa e mistura de tensioactivos serem como está descrito na área A da figura 1 e por a fase aquosa compreender o material activo. ^! ' 1 v 57 - Processo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado por o agente activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, antagonistas de fibrinogénio, péptidos de libertação da hormona de crescimento, interleucinas, eritropoetinas, factores estimulantes de colónias, péptidos RGD, péptidos hemato-reguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, heparinas, interleucinas, factores de coagulação, péptidos de libertação hipotalâmica, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral. 58 - Microemulsão de acordo com a reivindicação 57, caracterizada por o material activo ser um péptido seleccionado entre ciclo-(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ e His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂.

59 - Microemulsão de água-em-óleo para a distribuição de um

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AFBI - 0288 material terapêutico, biologicamente activo, caracterizada por as proporções relativas da fase oleosa, fase aquosa e mistura de tensioactivos serem como está descrito na área da figura 3, e por a fase aquosa compreender o material activo.

60 - Microemulsão de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por o agente activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, antagonistas de fibrinogénio, péptidos de libertação da hormona de crescimento, interleucinas, eritropoetinas, factores estimulantes de colónias, péptidos RGD, péptidos hemato-reguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de ^β I angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, heparinas, interleucinas, factores de coagulação, péptidos de libertação hipotalâmica, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral.

61 - Microemulsão de acordo com a reivindicação 60, caracterizada por o material activo ser um péptido seleccionado entre ciclo-(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-PenNH2 e His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂.

62 - Microemulsão de água-em-óleo para a distribuição de um material terapêutico, biologicamente activo, caracterizada por compreender cerca de 76% em peso de ésteres de propilenoglicol dos ácidos cáprico e caprílico; cerca de 5% em peso de solução salina compreendendo o material activo; e cerca de 1,6% em peso de lecitina; e cerca de 17% em peso de tri-ricinoleato de polioxietilenoglicerol.

63 - Microemulsão de acordo com a reivindicação 62, caracterizada por o agente activo ser seleccionado de entre o grupo que consiste em calcitoninas, insulinas, antagonistas de fibrinogénio, péptidos de libertação da hormona de crescimento, interleucinas, eritropoeitinas, factores estimulantes de colónias, péptidos RGD, péptidos hemato-reguladores, vasopressina, inibidores de colagenase, inibidores de angiotensina, hormonas de crescimento de mamíferos, heparinas,

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AFBI - 0288 interleucinas, factores de coagulação, péptidos de libertação hipotalâmica, activadores de plasminogénio tissular, péptidos natriuréticos atriais, factor de necrose tumoral.

64 - Microemulsão de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por o material activo ser um péptido seleccionado entre ciclo-(S,S)-N^a-acetil-Cys-(N^a-metil)Arg-Gly-Asp-Pen--NH₂ e His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2·

65 - Processo de armazenagem de materiais terapêuticos, biologicamente activos, caracterizado por compreender:

(a) proporcionar uma microemulsão de água-em-óleo compreendendo:

(1) até cerca de 60 por cento em volume, com base no volume total da microemulsão, de uma fase aquosa internamente dispersa compreendendo uma quantidade eficaz de um material terapêutico solúvel em água e biologicamente activo;

(2) uma fase oleosa contínua compreendendo pelo menos um óleo farmaceuticamente aceitável; e (3) um tensioactivo ou mistura de tensioactivos, possuindo o tensioactivo ou mistura de tensioactivos um valor do balanço hidrofílico-lipofílico de entre cerca de 7 e 14, e (b) armazenar a microemulsão de água-em-óleo durante pelo menos uma hora a uma temperatura próxima da ambiente ou a

I temperatura superior; e % por o coeficiente de partição água:óleo do material activo ser superior a 10:1; e por a actividade da referida fase aquosa da referida microemulsão ser superior à actividade do referido material activo que é armazenado sozinho na referida fase aquosa mas sob as mesmas condições.

66 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material activo ser uma proteína, um péptido, um imunogénio, ou um material farmaceuticamente activo.

67 - Microemulsão de água-em-óleo para o tratamento de uma ferida da pele, caracterizada por compreender:

73 872 * AFBI - 0288 (a) uma fase aquosa internamente dispersa contendo uma quantidade eficaz de um material terapêutico solúvel em água, biologicamente activo, seleccionado de entre o grupo que consiste em enzimas protease e factores de crescimento, possuindo o referido material um tamanho médio de partículas superior ao tamanho médio de partículas dos poros da epiderme da pele, (2) uma fase oleosa contínua compreendendo pelo menos um óleo farmaceuticamente aceitável, e 'i (3) um tensioactivo ou mistura de tensioactivos, em que o tensioactivo ou mistura de tensioactivos possui um valor do balanço hidrofílico-lipofílico de pelo menos cerca de 7, e ¹ ) por a percentagem em volume da fase aquosa baseada no volume total da microemulsão de água-em-óleo ser até cerca de 60 por cento; e por o coeficiente de partição água:óleo do material activo ser superior a 10:1.

68 - Microemulsão de acordo com a reivindicação 67, caracterizada por o material activo possuir um peso molecular médio de pelo menos cerca de 5000 e por o tamanho das partículas do material activo ser de cerca de 3 a cerca de 100 nanómetros.