RS61678B1

RS61678B1 - Anti-gitr antitela i postupci za njihovu primenu

Info

Publication number: RS61678B1
Application number: RS20210303A
Authority: RS
Inventors: Dennis J Underwood; Olivier Leger; Volker Siebert; Dijk Marc Van; David Schaer; Takemasa Tsuji; Gerd Ritter; Ana M Gonzalez; Nicolas S Wilson; Roberta Zappasodi; Taha Merghoub; Jedd David Wolchok
Original assignee: Agenus Inc; Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Ludwig Inst For Cancer Res Ltd
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2021-05-31
Also published as: PL3148579T3; KR20170020819A; JP2020048584A; EP3498295A1; IL249092B; PH12016502345A1; KR20220116578A; US20210070872A1; CA2949998A1; NZ764826A; TW202132337A; AU2015266958A1; US10577426B2; PH12016502345B1; MX377844B; LT3148579T; MA40041B1; US20150368349A1; TW201607958A; PT3148579T

Description

Opis

1. OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vežu na humani glukokortikoidom-indukovani receptor povezan sa TNFR familijom (GITR). U specifičnom aspektu, antitela se specifično vežu na humani GITR i moduliraju GITR aktivnost, npr., pojačavaju, aktiviraju ili indukuju aktivnost GITR-a, koristeći takva antitela. Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke za lečenje poremećaja, poput kancera i zaraznih bolesti, administracijom antitela koje se specifično veže na humani GITR i modulira GITR aktivnost, npr., pojačava, aktivira ili indukuje GITR aktivnost.

2. STANJE TEHNIKE

[0002] Glukokortikoidom-indukovani protein povezan sa TNFR-om (GITR), član TNFR familije, eksprimira se u mnogim komponentama urođenog i adaptivnog imunološkog sistema i stimuliše i stečeni i urođeni imunitet (Nocentini G i saradnici, (1994) PNAS 94: 6216-6221; Hanabuchi S i sar., (2006) Blood 107: 3617-3623; Nocentini G & Riccardi C (2005) Eur J Immunol 35: 1016-1022; Nocentini G i saradnici, (2007) Eur J Immunol 37: 1165-1169). Eksprimira se u nekoliko ćelija i tkiva, uključujući T, B, dendritične (DC) i ćelije prirodne ubice (NK), a aktivira se njihovim ligandom, GITRL, uglavnom eksprimiranim na antigen prezentujućim ćelijama (APC), na endotelnim ćelijama, a takođe u ćelijama tumora. Sistem GITR/GITRL učestvuje u razvoju autoimunih/upalnih odgovora i pojačava odgovor na infekciju i tumore. Na primer, lečenje životinja fuzionim proteinom GITR-Fc ublažava autoimune/upalne bolesti, dok je aktiviranje GITR-a efikasno u lečenju virusnih, bakterijskih i parazitskih infekcija, kao i u jačanju imunološkog odgovora na tumore (Nocentini G i sar., (2012.) Br J Pharmacol 165: 2089-99). Ti su efekti rezultat nekoliko istovremenih mehanizama, uključujući: koaktivaciju efektorskih T-ćelija, inhibiciju regulatornih T (Treg) ćelija, koaktivaciju NK-ćelija, aktivaciju makrofaga, modulaciju funkcije dendritičnih ćelija i regulaciju procesa ekstravazacije. Ekspresija GITR-a na membrani povećana je nakon aktivacije T ćelija (Hanabuchi S i sar., (2006) gore; Nocentini G & Riccardi C gore). Njegova aktivacija koaktivira efektorske T limfocite (McHugh RS i saradnici, (2002) Immunity 16: 311-323; Shimizu J i sar., (2002) Nat Immunol 3: 135-142; Roncheti S i sar., (2004) Eur J Immunol 34: 613-622; Tone M i saradnici, (2003) PNAS 100: 15059-15064). Aktivacija GITR-a povećava otpornost na tumore i virusne infekcije, uključena je u autoimune/upalne procese i reguliše ekstravazaciju leukocita (Nocentini G & Riccardi C (2005) gore; Cuzzocrea S i sar., (2004) J Leukoc Biol 76: 933-940; Shevach EM i Stephens GL (2006) Nat Rev Immunol 6: 613-618; Cuzzocrea S i sar., (2006) J Immunol 177: 631-641; Cuzzocrea S i sar., (2007) FASEB J 21: 117-129).

[0003] Humani GITR eksprimira se na vrlo niskim nivoima u perifernim (neaktiviranim) T ćelijama. Nakon aktivacije T ćelija, GITR je snažno pozitivno regulisan nekoliko dana i u CD4<+>i CD8<+>ćelijama (Kwon B i saradnici, (1999) J Biol Chem 274: 6056-6061; Gurney AL i saradnici, (1999) Curr Biol 9: 215-218; Ronchetti S i sar., (2004) gore; Shimizu J i sar., (2002) sapra; Ji HB i sar., (2004) gore; Ronchetti S i sar., (2002) Blood 100: 350-352; Li Z i sar., (2003) J Autoimmun 21: 83-92), sa CD4<+>ćelijama koje imaju višu ekspresiju GITR-a od CD8<+>ćelija (Kober J i sar., (2008) Eur J Immunol 38 (10): 2678-88; Bianchini R i sar., (2011) Eur J Immunol 41 (8): 2269-78). WO 2013/039954 stavlja na uvid javnosti anti-GITR antitela. WO 2006/105021 stavlja na uvid javnosti antitelo 6C8 koje se veže na GITR.

[0004] S obzirom na ulogu humanog GITR u modulisanju imunoloških odgovora, ovde su navedena antitela koja se specifično vežu za GITR i primena tih antitela za modulaciju GITR aktivnosti.

3. REZIME

[0005] U jednom aspektu, ovde su obezbeđena antitela i njihovi fragmenti koja se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR). U jednom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) delimično inhibira vezivanje GITR liganda (npr., humanog GITRL-a) za GITR kako je procenjeno postupkom koji je poznat stručnjaku iz oblasti ili koji je ovde opisan (videti, npr., odeljke 6.2.5.2 i 6.2.5.4, dole). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od 1000ng/ml inhibra manje od 80% 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) da se veže za GITR spojen sa perlicama (npr., humani GITR spojen sa Luminex® perlicama) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM GITRL-a za GITR spojen sa perlicama u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira 40% do 70%, 50% do 70%, 50% do 80%, ili 40% do 80% GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) da se veže za GITR (npr., humani GITR). U drugom specifičnom aspektu, najmanje 20% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu: (a) povezivanje GITR-a (npr., humanog GITR-a) sa perlicama u koncentraciji od 5pg/ml/perlica; (b) inkubacija perlica sa vezanim GITR (npr., humanim GITR) u koncentraciji od 40 perlica/µl sa ili bez antitela u bunariću; (c) dodavanje obeleženog GITRL (npr., obeleženog humanog GITRL-a) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) i 20 perlica/µl perlica sa vezanim GITR; i (d) detekcija obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) vezanog za perlice sa vezanim GITR (npr., humanim GITR) pomoću, npr., testa niza suspenzija. U nekim aspektima, 20% do 60%, 20% do 50%, 30% do 60% ili 30% do 50% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta.

[0006] U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže:

(a) region za određivanje komplementarnosti (CDR) 1, varijabilnog regiona (VH) teškog lanca, koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1YX2MX3(SEQ ID NO (SEK ID BR): 1), pri čemu

X1je D, E, G ili A;

X2je A, V, L, I, P, F, M ili Y; i

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F ili H;

(b) VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1IX2X3X4SGX5X6X7YX8QKFX9X10(SEQ ID NO: 2), pri čemu

X1je V, A, L, I, P, F, M ili T;

X2je R, K, H, Q ili A;

X3je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili P;

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, ili A;

X5je D, E, G ili A;

X6je V, A, L, I, P, F, M ili T;

X7je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I, P ili A;

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X9je K, R, H, Q ili A; i

X10je D, E, G ili A;

(c) VH CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence SGTVRGX1X2X3(SEQ ID NO: 3), pri čemu

X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S;

X2je A ili D; i

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V;

(d) CDR1 varijabilnog regiona (VL) lakog lanca koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence KSSQSX1X2X3X4X5X6X7KX8YLX9(SEQ ID NO: 4), pri čemu:

X1je L, A, V, I, P, F ili M;

X2je L, A, V, I, P, F, M ili S;

X3je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X4je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A;

X5je G, N, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X6je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X7je Q, G, N, S, T, C, W, Y ili A;

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A; i

X9je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili A;

(e) VL CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1ASTRX2X3(SEQ ID NO: 5), pri čemu:

X1je W, G, N, Q, S, T, C, Y, F, H ili A;

X2je E, D ili A; i

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A; i

(f) VL CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence QX1X2YX3X4PYT (SEQ ID NO: 6), pri čemu:

X1je N, G, Q, S, T, C, W ili Y;

X2je D, E ili Y; i

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A, i

X4 je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, L, ili A.

U drugim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži:

(a) CDR1, varijabilnog regiona (VH) teškog lanca, koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1YX2MX3(SEQ ID NO: 7), pri čemu

X1je D, E ili G;

X2je A ili V; i

X3je Y ili H;

(b) VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1IX2TX3SGX4X5X6YNQKFX7X8(SEQ ID NO: 8), pri čemu

X1je V ili L;

X2je R, K ili Q;

X3je Y ili F;

X4je D, E ili G;

X5je V ili L;

X6je T ili S;

X7je K, R ili Q; i

X8je D, E ili G;

(c) VH CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence SGTVRGFAY (SEQ ID NO: 9);

(d) CDR1, varijabilnog regiona (VL) lakog lanca, koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence KSSQSLLNSX1NQKNYLX2(SEQ ID NO: 10), pri čemu

X1je G ili S; i

X2je T ili S;

(e) VL CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence WASTRES (SEQ ID NO: 11); i

(f) VL CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence QNX1YSX2PYT (SEQ ID NO: 12), pri čemu

X1je D ili E; i

X2je Y, F ili S.

[0007] U nekim aspektima, ovde obezbeđeno je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), koji sadrži:

(a) region za određivanje komplementarnosti (CDR) 1, varijabilnog regiona (VH) teškog lanca, koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1YX2MX3(SEQ ID NO: 1), pri čemu

X1je D, E, G ili A;

X2je A, V, L, I, P, F, M ili Y; i

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F ili H;

X1je V, A, L, I, P, F, M ili T;

X2je R, K, H, Q ili A;

X3je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili P;

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, ili A;

X5je D, E, G ili A;

X6je V, A, L, I, P, F, M ili T;

X7je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I, P ili A;

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X9je K, R, H, Q ili A; i

X10je D, E, G ili A;

X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S;

X2je A, ili D; i

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V;

(d) CDR1, varijabilnog regiona (VL) lakog lanca, koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence KSSQSX1X2X3X4X5X6X7KX8YLX9(SEQ ID NO: 4), pri čemu:

X1je L, A, V, I, P, F ili M;

X2je L, A, V, I, P, F, M ili S;

X3je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X4je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A;

X5je G, N, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X6je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A;

X7je Q, G, N, S, T, C, W, Y ili A;

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A; i

X9je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili A;

X1je W, G, N, Q, S, T, C, Y, F, H ili A;

X2je E, D ili A; i

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A; i

X1je N, G, Q, S, T, C, W ili Y;

X2je D, E ili Y; i

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A, i

X4 je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, L, ili A. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 19-23, i 117-119. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO:116. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 24-33, i 120-188. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 114, 115, i 194. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 34 i 189. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16 i 101-104. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17 i 105. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VL CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 106-109, 192, i 193. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu od VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 antitela u Tabeli 2. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu od VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 antitela u Tabeli 6. U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu od VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 antitela u Tabeli 1. U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu od VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 antitela u Tabeli 5. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment delimično inhibira vezivanje GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) kao što je procenjeno postupkom koji je poznat stručnjaku iz oblasti ili koji je opisan ovde (videti, npr., Odeljke 6.2.5.2 i 6.2.5.4, dole). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od 1000ng/ml inhibra manje od 80% 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) da se veže sa perlicama sa vezanim GITR-om (npr., humani GITR vezan sa Luminex® perlicama) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira 40% do 70%, 50% do 70%, 50% do 80%, ili 40% do 80% GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) da se veže sa GITR (npr., humanim GITR). U specifičnim aspektima, najmanje 20% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu koji obuhvata sledeće korake: (a) povezivanje GITR-a (npr., humanog GITR) za perlice u koncentraciji od 5pg/ml/perlica; (b) inkubiranje perlica povezanih sa GITR (npr., humanim GITR) u koncentraciji od 40 perlica/µl sa ili bez antitela u bunariću; (c) dodavanje obeleženog GITRL (npr., obeleženog humanog GITRL) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) 20 perlica/µl perlica povezanih sa GITR; i (d) detekcija obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL) vezanog za perlice sa povezanim GITR (npr., humanim GITR) pomoću, npr., testa niza suspenzija. U nekim aspektima, 20% do 60%, 20% do 50%, 30% do 60% ili 30% do 50% količine GITRL (npr., humanog GITRL) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0008] U drugom aspektu, ovde obezbeđeno je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), koji sadrži:

X1je D, E ili G;

1

X2je A ili V; i

X3je Y ili H;

X1je V ili L;

X2je R, K ili Q;

X3je Y ili F;

X4je D, E ili G;

X5je V ili L;

X6je T ili S;

X7je K, R ili Q; i

X8je D, E ili G;

X1je G ili S; i

X2je T ili S;

X1je D ili E; i

X2je Y, F ili S.

U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 19-23, i 117-119. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od 35 i 116. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 24-33, i 120-188. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 114, 115, i 194. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 34 i 189. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, i 101-104. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17 i 105. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 106-109, 192, i 193. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu od VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 antitela u Tabeli 2. U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu od VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ne sprečava GITRL (npr., humani GITRL) da se veže sa GITR (npr., humanim GITR) kao što je procenjeno postupkom koji je poznat stručnjaku iz oblasti ili koji je opisan ovde (videti, npr., Odeljke 6.2.5.2 i 6.2.5.4, dole). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od 1000ng/ml inhibra manje od 80% 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) da se veže sa GITR-om vezanim za perlice (npr., humanim GITR-om vezanim za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira 40% do 70%, 50% do 70%, 50% do 80%, ili 40% do 80% GITRL-a (npr., humanog GITRL) da se veže sa GITR-om (npr., humanim GITR). U specifičnim aspektima, najmanje 20% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu koji obuhvata sledeće korake: (a) povezivanje GITR-a (npr., humanog GITR) za perlice u koncentraciji od 5pg/ml/perlica; (b) inkubiranje perlica vezanih za GITR (npr., humani GITR) u koncentraciji od 40 perlica/µl sa ili bez antitela u bunariću; (c) dodavanje obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) i 20 perlica/µl perlica povezanih sa GITR; i (d) detekcija obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL) vezanog za perlice povezana sa GITR-om (npr., humanim GITR) pomoću, npr., testa niza suspenzija. U nekim aspektima, 20% do 60%, 20% do 50%, 30% do 60% ili 30% do 50% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta.

[0009] U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za humani GITR, koji sadrži: (a) CDR1, varijabilnog regiona (VH) teškog lanca, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu DYAMY (SEQ ID NO: 13); (b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VIRTYSGDVTYNQKFKD (SEQ ID NO: 14); (c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SGTVRGFAY (SEQ ID NO: 15); (d) CDR1, varijabilnog regiona (VL) lakog lanca, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 16); (e) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRES (SEQ ID NO: 17); i (f) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 18). U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za humani GITR, koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR 3 od antitela 22 u Tabeli 1 i Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment delimično inhibira vezivanje GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) kao što je procenjeno postupkom koji je poznat stručnjaku iz oblasti ili koji je opisan ovde (videti, npr., odeljke 6.2.5.2 i 6.2.5.4, dole). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od 1000ng/ml inhibra manje od 80% od GITR vezanog za perlice (npr., humanog GITR vezanog za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL)

1

za perlice sa vezanim GITR-om (npr., humanim GITR vezanim za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira 50% do 70% vezivanja humanog GITRL-a za humani GITR. U specifičnim aspektima, najmanje 20% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu koji obuhvata sledeće korake: (a) povezivanje GITR-a (npr., humanog GITR) za perlice u koncentraciji od 5pg/ml/perlica; (b) inkubiranje perlica vezanih sa GITR (npr., humani GITR) u koncentraciji od 40 perlica/µl sa ili bez antitela u bunariću; (c) dodavanje obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) i 20 perlica/µl perlica povezanih sa GITR; i (d) detekcija obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL) vezanog za perlice sa povezanim GITR (npr., humanim GITR) pomoću, npr., testa niza suspenzija. U nekim aspektima, 20% do 60%, 20% do 50%, 30% do 60% ili 30% do 50% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL) koji se vezuje za GITR (npr., human GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U nekim aspektima, 30% do 50% količine humanog GITRL koji se vezuje za humani GITR u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za humani GITR u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Antitelo pronalaska ili njegov antigen-vezujući fragment je agonističan.

[0010] U određenim aspektima, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence, varijabilnog regiona teškog lanca, SEQ ID NO: 203. U nekim aspektima, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa jednim, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona teškog lanca, odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 206, i SEQ ID Nos (SEK ID BROJEVIMA): 215 do 389. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region teškog lanca, koji ima humane izvedene okvirne regione. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni okvirni region teškog lanca koji je ili je izveden iz aminokiselinske sekvence kodirane humanim genom, pri čemu aminokiselinska sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od IGHV1-2*02 (SEQ ID NO: 601), IGHV1-3*01 (SEQ ID NO: 602), IGHV1-46*01 (SEQ ID NO: 603), IGHV1-18*01 (SEQ ID NO: 604), IGHV1-69*01 (SEQ ID NO: 605), i IGHV7-4-1*02 (SEQ ID NO: 606). U specifičnim aspektima, varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence sa do 10 aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija, poželjno do 10 aminokiselinskih supstitucija. U posebnom aspektu, varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka koji su supstituisani aminokiselinom nađenom na analognom položaju u odgovarajućem nehumanom varijabilnom okvirnom regionu teškog lanca. U specifičnom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 601, pri čemu najmanje jedna, dve, tri, četiri, ili pet (u određenim aspektima do 10) aminokiselina aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 601 je supstituisano sa aminokiselinom nađenom na analognom položaju u odgovarajućem ne-humanom varijabilnom okvirnom regionu teškog lanca. U određenim aspektima, aminokiselinska supstitucija je na aminokiselinskom položaju odabranom iz grupe koja se sastoji od 24, 48, 67, 71, 73, i 94, pri čemu aminokiselinski položaj svakog člana grupe je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu. U specifičnim aspektima, aminokiselinska supstitucija je odabrana iz grupe koja se sastoji od 24G, 481, 67A, 71V, 73K, i 94K, pri čemu aminokiselinski položaj svakog člana grupe je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu

[0011] U drugom aspektu, ovde obezbeđeno je antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, i SEQ ID NOS: 215 do 389. U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 203. U drugom specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206. Predmetni pronalazak se odnosi na izolovano agonističko antitelo koje se specifično vezuje za humani glukokortikoidomindukovani protein povezan sa TNFR-om (GITR) koje sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206 i koje sadrži varijabilni region

1

(VL) lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208, pri čemu antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca.

[0012] U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos: 553, 554 i 567 do 570. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 581 i 582.

[0013] U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 204 ili SEQ ID NO: 205. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% identična sa jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, i SEQ ID NOs: 400-518. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% identična sa jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 519. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilnu sekvencu lakog lanca koja ima humane izvedene okvirne regione. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni okvirni region lakog lanca koji je ili je izveden iz aminokiselinske sekvence koja je kodirana humanim genom, pri čemu aminokiselinska sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od IGKV4-1*01 (SEQ ID NO: 607) i IGKV3-7*02 (SEQ ID NO: 608). U specifičnim aspektima, varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence ali za prisustvo do 10 aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija, poželjno do 10 aminokiselinskih supstitucija. U posebnom aspektuthe varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka koji su supstituisani za aminokiselinu nađenu na analognom položaju u odgovarajućem ne-humanom

1

varijabilnom okvirnom regionu lakog lanca. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni okvirni region lakog lanca koji je ili je izveden iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 607 ili SEQ ID NO: 608 pri čemu najmanje jedna, dve, tri, četiri, ili pet (u određenim aspektima do 10) aminokiselina aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 607 ili SEQ ID NO: 608 je supstituisano sa aminokiselinom nađenom na analognom položaju u odgovarajućem nehumanom varijabilnom okvirnom regionu lakog lanca. U određenim aspektima, aminokiselinska supstitucija je na aminokiselinskom položaju 87, pri čemu aminokiselinski položaj je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu. U specifičnim aspektima, aminokiselinska supstitucija je je aminokiselinska supstitucija od 87H, pri čemu aminokiselinski položaj je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu.

[0014] U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 i SEQ ID NOs: 400 do 518. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koja sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 519. U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 204 ili SEQ ID NO: 205. U drugom specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207. U drugom specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208. Predmetni pronalazak se odnosi na izolovano agonističko antitelo koje se specifično vezuje za humani glukokortikoidom-indukovani protein u vezi sa TNFR-om (GITR) koje sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206 i koje sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208, pri čemu antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca.

[0015] U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 555, 556 i 571 do 576.

1

[0016] U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence od antitela u tabeli sa Slike 23 ili bilo koje od Slika 24A-24C. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence antitela u Tabeli 17. U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207. Antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) pronalaska sadrži (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208.

[0017] U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 i okvirne regione izvedene iz humanog imunoglobulina, pri čemu VH CDR1 sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence od DYAMY (SEQ ID NO: 13), VH CDR2 sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence od VIRTYSGDVTYNQKFKD (SEQ ID NO: 14) i VH CDR3 sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence od SGTVRGFAY (SEQ ID NO: 15). U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3 i okvirne regione izvedene iz humanog imunoglobulina, pri čemu VL CDR1 sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence od KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 16), VL CDR2 sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence od WASTRES (SEQ ID NO: 17) i VL CDR3 sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence od QNDYSYPYT (SEQ ID NO: 18). U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 203, 206 i 215-389. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208 i 400-518. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo

1

ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 519. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment delimično inhibira vezivanje GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) kao što je procenjeno postupkom koji je poznat stručnjaku iz oblasti ili koji je opisan ovde (videti, npr., odeljke 6.2.5.2 i 6.2.5.4, dole). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od 1000ng/ml inhibra manje od 80% 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) da se veže sa GITR-om vezanim za perlice (npr., humanim GITR vezanim za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U specifičnim aspektima, najmanje 20% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu koji obuhvata sledeće korake: (a) povezivanje GITR-a (npr., humanog GITR) za perlice u koncentraciji od 5pg/ml/perlica; (b) inkubiranje perlica sa vezanim GITR-om (npr., humanim GITR) u koncentraciji od 40 perlica/µl sa ili bez antitela u bunariću; (c) dodavanje obeleženog GITRL (npr., obeleženog humanog GITRL) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) i 20 perlica/µl perlica povezanih sa GITR; i (d) detekcija obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL) vezanog za perlice sa GITR-om (npr., humanim GITR) pomoću, npr., testa niza suspenzija. U nekim aspektima, 20% do 60%, 20% do 50%, 30% do 60% ili 30% do 50% količine GITRL-a (npr., humanog GITRL) koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u odsustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.i

[0018] U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., human GITR) koji sadrže varijabilni region (VH) teškog lanca i varijabilni region (VL) lakog lanca, pri čemu VH i VL sadrže aminokiselinsku sekvencu od antitela na Slici 23 ili bilo koje od Slika 24A-24C. U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca i varijabilni region (VL) lakog lanca, pri čemu VH i VL sadrže aminokiselinsku sekvencu antitela u Tabeli 17.

[0019] U određenim aspektima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži konstantne regione teškog i/ili lakog lanca. Antitelo pronalaska

1

sadrži konstantni region teškog lanca. U nekim tehničkim rešenjima, konstantni region teškog lanca je odabran iz grupe humanih imunoglobulina koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. U određenim tehničkim rešenjima, konstantni region lakog lanca je odabran iz grupe humanih imunoglobulina koja se sastoji od IgGκ i IgGλ. U specifičnom tehničkom rešenju, IgG1je nefukozilovan IgG1. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo je IgG1koji sadrži N297A ili N297Q mutaciju. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo je IgG4koji sadrži S228P mutaciju. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo je IgG2 koji sadrži C127S mutaciju. U određenim aspektima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 557-562. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži konstantni region teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 583 i 584. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 557-560 sa aminokiselinskom supstitucijom iz N u A ili Q na aminokiselinskom položaju 180. U određenim aspektima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 588-591. U određenim aspektima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 563-566.

[0020] U specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 553, 554, i 567 do 570; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 555, 556, i 571 do 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 554; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 581; i

2

(b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 582; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 555. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 554; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 555. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 567; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 573. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 567; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 554; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 581; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 582; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576.

[0021] U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553 sa aminokiselinskom supstitucijom iz N u A ili Q na aminokiselinskom položaju 298; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 555, 556, i 571 do 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553 sa aminokiselinskom supstitucijom iz N u A ili Q na aminokiselinskom položaju 298; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553 sa aminokiselinskom supstitucijom iz N u A ili Q na aminokiselinskom položaju 298; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 555.

[0022] U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za isti epitop od GITR (npr., humanog GITR) kao ovde opisano antitelo. U drugom aspektu, ovde obezbeđeno je izolovano antitelo koje se specifično vezuje za svaki od i) humani GITR, pri čemu humani GITR sadrži ostatke 26-241 od SEQ ID NO: 701 i ii) varijantu cinomolgusovog GITR-a koja sadrži ostatke 26-234 od SEQ ID NO: 699, pri čemu se antitelo ne vezuje specifično za cinomolgusov GITR koji sadrži ostatke 26-234 od SEQ ID NO: 704. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za svaki od i) humani GITR, pri čemu humani GITR sadrži ostatke 26-241 od SEQ ID NO: 701 i ii) varijantu cinomolgusovog GITR-a koja sadrži ostatke 26-234 od SEQ ID NO: 699, pri čemu antitelo ne prikazuje suštinsko vezivanje za cinomolgusov GITR koji sadrži ostatke 26-234 od SEQ ID NO: 704. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu humani GITR sadrži ostatke 26-241 od SEQ ID NO: 701, pri čemu je vezivanje između anttela i GITR varijante suštinski oslabljeno u odnosu na vezivanje između antitela i humanog GITR, i pri čemu varijantni GITR sadrži ostatke 26-241 od SEQ ID NO: 701 izuzev aminokiselinsku supstituciju odabranu iz grupe koja se sastoji od D60A i G63A. U jednom aspektu, supstitucija je D60A. U drugom aspektu, supstitucija je G63A. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu humani GITR sadrži ostatke 26-241 od SEQ ID NO: 701, i pri čemu antitelo se vezuje za epitop koji sadrži ostatke 60-63 od SEQ ID NO: 701. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koji se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu humani GITR sadrži ostatke 26-241 od SEQ ID NO: 701, i pri čemu antitelo se vezuje za najmanje jedan ostatak unutar aminokiselinske sekvence prikazane pomoću ostataka 60-63 od SEQ ID NO: 701. U jednom aspektu, antitelo se vezuje za najmanje jedan ostatak odabran iz grupe koja se sastoji od ostataka 60, 62, i 63 od SEQ ID NO: 701. U jednom aspektu, antitelo se vezuje za najmanje jedan ostatak odabran iz grupe koja se sastoji od ostataka 62 i 63 od SEQ ID NO: 701. U jednom aspektu, antitelo aktivira ili poboljšava aktivnost humanog GITR. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu humani GITR sadrži ostatke 26-241 od SEQ ID NO:701, i pri čemu antitelo vezuje epitop humanog GITR-a koji sadrži najmanje jedan od ostataka 60 ili 63 od SEQ ID NO:701. U drugom aspektu ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu antitelo ispoljava, kada se poredi sa vezivanjem za humani GITR, smanjeno ili odsutno vezivanje za protein identičan sa humanim GITR izuzev prisustva D60A ili G63A aminokiselinske supstitucije. U jednom aspektu, antitelo indukuje, aktivira ili poboljšava aktivnost humanog GITR. U drugom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se takmiči sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR). U specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se takmiči sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) do mere da se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji su ovde opisani takmiče sami sa sobom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR). U drugom specifičnom aspektu, ovde je obezbeđeno prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se takmiči sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR), pri čemu se prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment takmiči za vezivanje u testu koji obuhvata sledeće korake: (a) inkubiranje GITR-transfektovanih ćelija sa prvim antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom u neobeleženom obliku u posudi; (b) dodavanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u obeleženom obliku ćelijama u posudi i inkubiranje ćelija u posudi; i (c) detektovanje vezivanja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u obeleženom obliku za ćelije. U drugom specifičnom aspektu, ovde obezbeđeno prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se takmiči sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR), pri čemu se kompeticija ispoljava kao smanjenje vezivanja prvog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta za GITR (npr., humani GITR) za više od more than 80% (npr., 85%, 90%, 95%, ili 98%, ili između 80% do 85%, 80% do 90%, 85% do 90%, ili 85% do 95%).

[0023] U određenim tehničkim rešenjima, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), aktivira, indukuje ili poboljšava aktivnost GITR-a (npr., humanog GITR). U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), je humanizovano antitelo, murinsko antitelo ili himerno antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa KDu opsegu od 0.5 nM do 5 nM. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži oznaku koja se može detektovati. U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo obezbeđeno ovde je izolovano.

2

[0024] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili fragment ovde opisani, koji imunospecifično se vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje, aktivira ili poboljšava aktivnost humanog GITR-a u ćeliji nezavisno od TCR okidanja. U specifičnim tehničkim rešenjima, ćelija je T ćelija. U specifičnim tehničkim rešenjima, ćelija nije T ćelija. U specifičnim tehničkim rešenjima, ćelija je odabrana iz grupe koja se sastoji od B ćelije, plazma ćelije, memorijske ćelije, ćelije prirodne ubice, granulocita, neutrofila, eozinofila, bazofila, mast ćelije, monociat, dendritičke ćelije, plazmacitoidne dendritičke ćelije, NKT ćelije, i makrofaga. U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde, koje imunospecifično se vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje, aktivira, ili poboljšava aktivnost NF-κB nezavisno od TCR okidanja. U određenim tehničkim rešenjima, aktivnost od NF-κB može da se proceni u, npr., testu koji obuhvata sledeće korake: (a) inkubiranje T ćelija (npr., Jurkat ćelija) koje eksprimiraju NF-κB-luciferaza reporterski konstrukt (npr., GloResponse NF-κB-luc2P konstrukt) i GITR (npr., humani GITR) sa antitelom opisanim ovde ili izotipskim kontrolnim antitelom, pri koncentraciji antitela od, npr., 12.5, 10, 5, 2.5, 1.25, ili 0.625 µg/ml, u odsustvu anti-CD3 antitela; i (b) očitavanje luciferaza signala nakon, npr., 2, 5, 6, 8 ili 18 sati inkubacije primenom, npr., EnVision višeznačnog čitača 2100, pri čemu pozitivni luciferaza signal u odnosu na izotipsko kontrolno antitelo naznačava aktivnost od NF-κB. U posebnom tehničkom rešenju, luciferaza signal se čita nakon 5 sati inkubacije.

[0025] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili fragment ovde opisan, koji imunospecifično se vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava procenat polifunkcionalnih (IFNγ+ TNFα+) T ćelija. U specifičnim tehničkim rešenjima, porast u procentu polifunkcionalnih (IFNγ+ TNFα+) T ćelija može da se proceni u, npr., testu koji obuhvata sledeće korake: (a) inkubiranje, npr., humanih PBMC sa, npr., anti-CD3 antitelom pri raznim suboptimalnim koncentracijama (npr., 0.3-5 µg/ml); i, npr., antitelom opisanim ovde, koje imunospecifično se vezuje za GITR (npr., humani GITR), pri, npr., 5 µg/ml ili izotipskim kontrolnim antitelom, tokom, npr., 3-4 dana na 37°C i 5% CO2; (b) tretiranje ćelija sa, npr., Brefeldin A tokom, npr., 6 sati na 37°C i 5% CO2; (c) bojenje površine ćelija primenom, npr., anti-CD3 antitela, anti-CD4 antitela, i anti-CD8α antitela; (d) bojenje intraćelijsko primenom, npr., anti-IFNy antitela i anti-TNFa antitela; i (e) određivanje procenta polifunkcionalnih (IFNγ+ TNFα+) T ćelija u odnosu na izotipsko kontrolno antitelo. U specifičnim tehničkim rešenjima, polifunkcionalne (IFNγ+ TNFα+) T cells are odabrane iz grupe koja se sastoji od polifunkcionalne (IFNγ+ TNFα+) CD4+ T ćelije i polifunkcionalne (IFNγ+ TNFα+) CD8+ T ćelije.

[0026] U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), kada je vezano za aktivirane regulatorne T ćelije, se vezuje za aktivirajuće Fc gama receptore odabrane iz grupe koja se sastoji od CD16, CD32A i CD64 u većoj meri (npr., 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta) nego antitelo, kada je vezano za aktivirane efektorske T ćelije, se vezuje za aktivirajuće Fc gama receptore odabrane iz grupe koja se sastoji od CD16, CD32A i CD64, kao što je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjacima iz blasti (npr., Fc gama receptor IIIA (CD16) reporterski test ili kao što je opisano u primerima, dole). U specifičnim tehničkim rešenjima, aktivirajući Fc gama receptori su eksprimirani na ćeliji odabranoj iz grupe koja se sastoji od mijeloid-izvedenih efektorskih ćelija i limfocit-izvedenih efektorskih ćelija. U posebnom tehničkom rešenju, aktivirajući Fc gama receptor je CD16.

[0027] U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), kada je vezano za aktivirane regulatorne T ćelije, izaziva jaču aktivaciju aktivirajućih Fc gama receptora odabranih iz grupe koja se sastoji od CD16, CD32A i CD64 nego antitelo, kada je vezano za aktivirane efektorske T ćelije, izaziva aktivaciju aktivirajućih Fc gama receptora odabranih iz grupe koja se sastoji od CD16, CD32A i CD64. U posebnim tehničkim rešenjima, aktivacija aktivirajućih Fc gama receptora, kada antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), je vezano za aktivirane regulatorne T ćelije, je najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta jača nego aktivacija aktivirajućih Fc gama receptora, kada antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), je vezano za aktivirane efektorske T ćelije, kao što je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjacima iz oblasti (npr., Fc gama receptor IIIA (CD16) reporterski test ili kao što je opisano u primerima, dole). U specifičnim tehničkim rešenjima, aktivirajući Fc gama receptori su eksprimirani na ćeliji odabranoj iz grupe koja se sastoji od mijeloidno-izvedenih efektorskih ćelija i limfocitnoizvedenih efektorskih ćelija. U posebnom tehničkom rešenju, aktivirajući Fc gama receptor je CD16.

[0028] U određenim aspektima, antitelo ili fragment ovde opisani, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava površinsko eksprimiranje od OX40 i/ili PD-1 u aktiviranim T ćelijama za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta,

2

3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, 100 puta, 200 puta, 300 puta, 400 puta, 500 puta, 600 puta, 700 puta, 800 puta, 900 puta, ili 1000 puta kao što je procenjeno postupcima opisanim ovde i/ili poznatim obučenima u oblasti, u odnosu na površinsko eksprimiranje od OX40 i/ili PD-1 u aktiviranim T ćelijama bez antitela koje je ovde opisano.

[0029] U drugom tehničkom rešenju, ovde su obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca, ili laki lanac i/ili teški lanac od antitela pronalaska. U specifičnom tehničkom rešenju, molekul nukleinske kiseline kodira varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 209. U drugom specifičnom aspektu, molekul nukleinske kiseline kodira varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 210 ili SEQ ID NO: 211. U specifičnim tehničkim rešenjima, molekul nukleinske kiseline je izolovan. U određenim tehničkim rešenjima, vektor (npr., izolovani vektor) sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca, ili laki lanac i/ili teški lanac od antitela pronalaska. U određenim tehničkim rešenjima, ćelija domaćina sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor. Primeri ćelije domaćina uključuju E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, kvasac, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 ćelije, biljne ćelije, ćelije insekta, i humane ćelije u kulturi tkiva. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđen postupak proizvodnje antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina tako da se molekul nukleinske kiseline eksprimira i antitelo se proizvodi.

[0030] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za poboljšavanje ko-stimulacije T ćelija koji obuhvata inkubiranje ex vivo T ćelija, koje su stimulisane agensom za stimulaciju kompleksa T ćelijskog receptora (TCR) (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo), sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U drugom aspektu, ovde su obezbeđen je postupak za aktiviranje T ćelije koji obuhvata inkubiranje ex vivo T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U nekim aspektima, postupak dalje obuhvata, pre, istovremeno sa, ili nakon inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, inkubiranje ex vivo T ćelija sa stimulirajućim agensom TCR kompleksa (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili stimulirajuće antitelo TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i

2

anti-CD28 antitelo). U nekim aspektima, T ćelije su izolovane iz subjekta. U određenoj objavi, stimulisane i/ili aktivirane T ćelije se infuzirane subjektu. U nekoj objavi, T ćelije koje su infuzirane subjektu su autologe ili alogene. U specifičnom tehničkom rešenju, subjekt je čovek. U drugoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za preferencijalno širenje efektorskih T-ćelija naspram T-regulatornih ćelija kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde. U specifičnoj objavi, subjekt je čovek.

[0031] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za povećanje ekspanzije T ćelija (npr., CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelija) i/ili T ćelijske efektorske funkcije, koji obuhvata inkubiranje ex vivo T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U nekim aspektima, postupak dalje obuhvata, pre, istovremeno sa, ili nakon inkubiranja T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, inkubiranje T ćelija sa sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (TCR) (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili stimulirajuće antitelo TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U određenim aspektima, T ćelije su izolovane iz subjekta. U nekoj objavi, postupak dalje obuhvata infuziju T ćelija nakon njihove ekspanzije i/ili nakon što je njihova efektorska funkcija postignuta kod subjekta. U određenoj objavi, T ćelije koje su infuzirane subjektu su autologe ili alogene. U specifičnoj objavi, subjekt je čovek.

[0032] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za povećanje ekspanzije CD8<+>T ćelije, koji obuhvata inkubiranje ex vivo T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U nekim aspektima, postupak dalje obuhvata, pre, istovremeno sa, ili nakon inkubiranja T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, inkubiranje T ćelija sa sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (TCR) (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili stimulirajuće antitelo TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U određenim aspektima, T ćelije su izolovane iz subjekta. U nekoj objavi, postupak dalje obuhvata infuziju T ćelija nakon njihove ekspanzije i/ili nakon što je njihova efektorska funkcija postignuta kod subjekta. U određenoj objavi, T ćelije koje su infuzirane subjektu su autologe ili alogene. U specifičnoj objavi, subjekt je čovek.

[0033] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za povećanje ekspanzije CD4<+>T ćelija, koji obuhvata inkubiranje ex vivo T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U nekim aspektima, postupak dalje obuhvata, pre, istovremeno sa, ili nakon inkubiranja T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, inkubiranje T ćelija sa sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (TCR)

2

(npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili stimulirajuće antitelo TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U određenim aspektima, T ćelije su izolovane iz subjekta. U nekoj objavi, postupak dalje obuhvata infuziju T ćelija nakon njihove ekspanzije i/ili nakon što je njihova efektorska funkcija postignuta kod subjekta. U određenoj objavi, T ćelije koje su infuzirane subjektu su autologe ili alogene. U specifičnoj objavi, subjekt je čovek.

[0034] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak aktiviranja GITR ili aktiviranja NF-κB koji obuhvata inkubiranje ex vivo T ćelija, koje nisu bile stimulisane sa sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (TCR) (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili stimulirajuće antitelo TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo), sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U nekim aspektima, T ćelije su izolovane iz subjekta. U određenoj objavi, aktivirane T ćelije se infuzirane subjektu. U nekoj objavi, T ćelije koje su infuzirane subjektu su autologe ili alogene. U specifičnoj objavi, subjekt je čovek.

[0035] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak aktiviranja T ćelija nezavisno od TCR okidanja koji obuhvata stupanje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde.

[0036] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak indukovanja, aktiviranja ili povećanja aktivnosti od NF-κB nezavisno od TCR okidanja koji obuhvata stupanje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde.

[0037] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak povećanja procenta polifunkcionalnih (IFNγ+ TNFα+) T ćelija koji obuhvata stupanje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde.

[0038] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak povećanja površinskog eksprimiranja OX40 i/ili PD-1 u aktiviranim T ćelijama koji obuhvata stupanje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde.

[0039] U drugom tehničkom rešenju, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo, ili molekul nukleinske kiseline pronalaska, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija može se primeniti za modulisanje imunog odgovora i/ili za lečenje i/ili sprečavanje poremećaja, kao što je kancer ili infektivna bolest. U specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak modulisanja imunog odgovora kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde. U posebnom aspektu, imuni odgovor je poboljšan ili indukovan. U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za povećanje ekspanzije T ćelija i/ili T ćelijske efektorske funkcije kod

2

subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde. U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za povećanje ekspanzije CD8+ T ćelija kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde. U nekim aspektima, objava obezbeđuje primenu antitela kao što je opisano ovde u proizvodnji leka za lečenje kancera. U određenim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje antitelo kao što je opisano ovde za primenu u lečenju kancera. U određenim aspektima, objava obezbeđuje primenu farmaceutske kompozicije kao što je opisana ovde u proizvodnji leka za lečenje kancera. U određenim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju kao što je opisana ovde za primenu u lečenju kancera. U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde. U određenoj objavi, postupak lečenja kancera dalje obuhvata administriranje agensa protiv kancera subjektu. Primeri agenasa protiv kancera koji se mogu administrirati subjektu u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom opisanom ovde su opisani u odeljku 5.4, dole (npr., odeljci 5.4.1 i 5.4.1.1). U specifičnom aspektu, agens protiv kancera je vakcina. U posebnom aspektu, vakcina sadrži peptidni kompleks proteina toplotnog šoka (HSPPC), u kojoj HSPPC sadrži protein toplotnog šoka (npr., gp96 protein) kompleksiran sa jednim ili više antigenih peptida (npr., antigeni peptidi povezani sa tumorom). U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči je kancer skvamoznih ćelija, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, Hodgkinov ili ne-Hodgkinov limfom, kancer pankreasa, glioblastom, gliom, kancer grlića materice, kancer jajnika , kancer jetre, kancer mokraćne bešike, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, endometrijalni karcinom, mijelom, karcinom pljuvačne žlezde, kancer bubrega, karcinom bazalnih ćelija, melanom, kancer prostate, kancer vulve, kancer štitne žlezde, kancer testisa, kancer jednjaka ili vrsta kancera glave ili vrata. U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči je dezmoplastični melanom, upalni U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči je kancer dojke, timom, kancer rektuma, analni kancer ili gliom moždanog stabla koji se može hirurški ili nehirurški tretirati. U specifičnom tehničkom rešenju, subjekt koji se leči je čovek.

[0040] U drugoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za aktiviranje T ćelija nezavisno od TCR okidanja kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde.

[0041] U drugoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za indukovanje, aktiviranje ili poboljšanje aktivnosti od NF-κB nezavisno od TCR okidanja kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde.

2

[0042] U drugoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za povećanje procenta polifunkcionalnih (IFNγ+ TNFα+) T ćelija kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde.

[0043] U drugoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za povećanje površinskog eksprimiranja OX40 i/ili PD-1 u aktiviranim T ćelijama kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde.

[0044] Antitelo kao što je opisano ovde može da se primeni u kombniaciji sa IDO inhibitorom za lečenje kancera. U jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde, pri čemu postupak dalje obuhvata administriranje subjektu inhibitora indoleamin-2,3-dioksigenaze (IDO). IDO inhibitor kao što je opisano ovde za primenu u lečenju kancera je prisutan u čvrstom doznom obliku farmaceutske kompozicije kao što je tableta, pilula ili kapsula, pri čemu farmaceutska kompozicija uključuje IDO inhibitor i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Kao takvo, antitelo kao što je opisano ovde i IDO inhibitor kao što je opisan ovde mogu da se administriraju zasebno, u nizu ili istovremeno kao zasebni dozni oblici. U jednom aspektu, antitelo je administrirano parenteralno i IDO inhibitor je administriran oralno. U posebnim aspektima, inhibitor je odabran iz grupe koja se sastoji od epakadostat (Incyte Corporation), F001287 (Flexus Biosciences), indoksimod (NewLink Genetics), i NLG919 (NewLink Genetics). Epakadostat je opisan u PCT objavi sa br. WO 2010/005958. U jednom aspektu, inhibitor je epakadostat. U drugom aspektu, inhibitor je F001287. U drugom aspektu, inhibitor je indoksimod. U drugom aspektu, inhibitor je NLG919.

[0045] Antitelo kao što je opisano ovde može da se primeni u kombniaciji sa agensom za ciljanje kontrolne tačke za lečenje kancera. U jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde, pri čemu postupak dalje obuhvata administriranje subjektu agensa za ciljanje kontrolne tačke. U nekim aspektima, agens za ciljanje kontrolne tačke je odabran iz grupe koja se sastoji od antagonista za PD-1 (npr., antagonističko anti-PD-1 antitelo), antagonista za PD-L1 (npr., antagonističko anti-PD-L1 antitelo), antagonista za PD-L2 (npr., antagonističko anti-PD-L2 antitelo), antagonista za CTLA-4 (npr., antagonističko anti-CTLA-4 antitelo), antagonista za TIM-3 (npr., antagonističko anti-TIM-3 antitelo), antagonista za LAG-3 (npr., antagonističko anti-LAG-3 antitelo), i agonista za OX40 (npr., agonističko anti-OX40 antitelo). U nekim aspektima, agens za ciljanje kontrolne tačke je, npr., antagonist za PD-1 (npr., antagonističko anti-PD-1 antitelo) ili agonist za OX40 (npr., agonistsičko anti-OX40 antitelo) je administrirano istovremeno sa anti-GITR antitelom. U nekim aspektima, agens za ciljanje kontrolne tačke, npr., antagonist za PD-1 (npr., antagonističko anti-PD-1 antitelo) ili agonist za OX40 (npr., agonističko anti-OX40 antitelo) je administrirano pre administracije anti-GITR antitela. U nekim aspektima, agens za ciljanje kontrolne tačke, npr., antagonist za PD-1 (npr., antagonističko anti-PD-1 antitelo) ili agonist za OX40 (npr., agonističko anti-OX40 antitelo) je administrirano nakon administracije anti-GITR antitela.

[0046] Antitelo kao što je opisano ovde može da se primeni u kombniaciji sa anti-CD25 antitelom. U nekim aspektima, anti-CD25 antitelo je administrirano istovremeno sa anti-GITR antitelom. U nekim aspektima, anti-CD25 antitelo je administrirano pre administracije anti-GITR antitela. U nekim aspektima, anti-CD25 antitelo je administrirano nakon administracije anti-GITR antitela.

[0047] U drugoj specifičnoj objaviaspektu, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera kod subjekta koji obuhvata administriranje antagonističkog anti-PD-1 antitela subjektu koji ima potrebu za njim koji je primio anti-GITR antitelo, pri čemu je PD-1 antitelo administrirano u vreme u kome je anti-GITR antitelo povećalo eksprimiranje PD-1 kod subjekta u odnosu na eksprimiranje PD-1 kod subjekta u vreme administriranja. U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera kod subjekta koji obuhvata administriranje agonističkog anti-OX40 antitela subjektu koji ima potrebu za njim koji je primio anti-GITR antitelo, pri čemu OX40 antitelo je administrirano u vreme u kome je anti-GITR antitelo povećalo eksprimiranje OX40 kod subjekta u odnosu na eksprimiranje OX40 kod subjekta u vreme administriranja. U određenim aspektima, anti-GITR antitelo indukuje, aktivira, ili poboljšava aktivnost GITR-a.

[0048] U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera kod subjekta koji obuhvata administriranje anti-GITR antitela subjektu koji ima potrebu za njim, pri čemu anti-GITR antitelo povećava eksprimiranje PD-1 kod subjekta u odnosu na eksprimiranje PD-1 kod subjekta u vreme administriranja, i administriranje antagonističkog anti-PD-1 antitela subjektu kada je eksprimiranje PD-1 povećano. U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera kod subjekta koji obuhvata administriranje anti-GITR antitela subjektu koji ima potrebu za njim, pri čemu anti-GITR antitelo povećava eksprimiranje OX40 kod subjekta u odnosu na eksprimiranje OX40 kod subjekta u vreme administriranja, i administriranje agonist ičkog OX40 antitela subjektu kada je eksprimiranje OX40 povećano. U određenim aspektima, anti-GITR antitelo indukuje, aktivira, ili poboljšava aktivnost GITR-a.

[0049] U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera ili virusne infekcije kod subjekta, postupak koji obuhvata korake: (a) inkubiranje T ćelija ex vivo sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde; i (b) infuziranje T ćelija

1

subjektu. U specifičnoj objavi, T ćelije infuzirane subjektu su autologe ili alogene. U određenoj objavi, T ćelije su izolovane iz subjekta. U nekoj objavi, T ćelija nisu inkubirane sa sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (TCR) (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili stimulirajuće antitelo TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U određenoj objavi, postupak dalje obuhvata, pre koraka (a): (1) testiranje T ćelija za eksprimiranje GITR-a na površini ćelije; i (2) ukoliko korak (1) ne rezultira detekcijom GITR-a iznad vrednosti praga, indukciju eksprimiranja GITR-a na površini T ćelija inkubiranjem T ćelija sa sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (TCR) (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili stimulirajuće antitelo TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U nekoj objavi, postupak dalje obuhvata, pre, istovremeno sa ili nakon koraka (a), inkubiranje T ćelija sa sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (TCR) fitohemaglutininom (PHA) i/ili forbol miristat acetatom (PMA), ili stimulirajućim antitelom TCR kompleksa, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U specifičnom aspektu, subjekt koji je lečen je čovek.

[0050] U drugoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja i/ili sprečavanja infektivne bolesti kod subjekta koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde. Videti Odeljak 5.4.1.2 ispod za primere infektivnih bolesti. U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja virusne infekcije kod subjekta, koji obuhvata administriranje subjektu efikasne količine farmaceutske kompozicije opisane ovde. U jednom tehničkom rešenju, pronalazak se odnosi na antitelo pronalaska, ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za primenu u lečenju virusne infekcije. U određenim tehničkim rešenjima, virusna infekcija koja je lečena je izazvana humanim papiloma virusom (HPV), Herpes simplex ili drugim herpes virusom, hepatitis B virusom (HBV), hepatitis C virusom (HCV) ili drugim hepatitis virusom, virusom malih boginja, HIV ili Epstein Barr-ovim virusom (EBV). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili farmaceutska kompozicija za primenu u lečenju virusne infekcije dalje obuhvata administriranje anti-virusnog agensa subjektu. U specifičnom tehničkom rešenju, subjekt koji je lečen je čovek.

[0051] U drugom specifičnom aspektu, ovde je obezbeđen postupak identifikovanja anti-GITR antitela koje je sposobno za indukovanje, aktiviranje, ili poboljšanje aktivnosti GITR-a u odsustvu TCR agonista koji obuhvata stupanje u kontakt GITR koji se eksprimira na ćeliji san anti-GITR antitelom u odsustvu TCR agonista i merenje GITR aktivnosti, pri čemu povećana GITR aktivnost u odnosu na GITR aktivnost u odsustvu anti-GITR antitela ukazuje da je anti-GITR antitelo sposobno da indukuje, aktivira, ili poboljšava aktivnost GITR-a u odsustvu TCR agonista. U određenim aspektima, GITR aktivnost je procenjena merenjem NF-κB aktivnosti.

2

U određenim aspektima, GITR aktivnost je procenjena merenjem aktivacije TRAF adaptorom posredovanih signalnih putanja, pri čemu TRAF adaptor je odabran iz grupe koja se sastoji od TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, i TRAF5. U određenim aspektima, GITR aktivnost je procenjena merenjem aktivacije MAPK/ERK putanje. U određenim aspektima, anti-GITR antitelo povećava GITR aktivnost najmanje dvostuko u poređenju sa GITR aktivnošću u odsustvu anti-GITR antitela. U određenim aspektima, anti-GITR antitelo povećava GITR aktivnost dvostuko do dvadesetostruko u poređenju sa GITR aktivnošću u odsustvu anti-GITR antitela. U određenim aspektima, anti-GITR antitelo povećava GITR aktivnost dvostruko do desetostruko u poređenju sa GITR aktivnošću u odsustvu anti-GITR antitela. U određenim aspektima, ćelija je T ćelija. U određenim aspektima, ćelija nije T ćelija.

[0052] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđeno anti-GITR antitelo pronalaska koje se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu navedeno antitelo je sposobno da indukuje, aktivira, ili poboljša aktivnost GITR-a u ćeliji u odsustvu TCR okidanja. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđeno anti-GITR antitelo koji se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu navedeno antitelo indukuje, aktivira, ili poboljšava aktivnost NF-κB u ćeliji u odsustvu TCR okidanja. U drugoj specifičnoj objavi, ovde je obezbeđen postupak lečenja kancera koji obuhvata administriranje subjektu koji ima potrebu za njim anti-GITR antitela koje se specifično vezuje za humani GITR, pri čemu navedeno antitelo je sposobno da indukuje, aktivira, ili poboljša aktivnost GITR-a i/ili NF-κB u odsustvu TCR okidanja.

3.1 Terminologija

[0053] Kao što je ovde primenjeno, pojmovi "oko" i "približno," kada su primenjeni da modifikuju numeričku vrednost ili numerički opseg, naznačavaju odstupanja od 5% do 10% iznad i 5% do 10% ispod vrednosti ili opsega koja ostaju unutar namenjenog značenja navedene vrednosti ili opsega.

[0054] Kao što je ovde primenjeno, vezivanje između ispitivanog antitela i prvog antigena je "suštinski oslabljeno" u odnosu na vezivanje između ispitivanog antitela i drugog antigena ukoliko vezivanje između ispitivanog antitela i prvog antigena je smanjeno za najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ili 80% u odnosu na vezivanje između ispitivanog antitela i drugog antigena, npr., u datom eksperimentu, ili primenom srednjih vrednosti iz višestrukih eksperimenata, kao što je procenjeno pomoću, npr., testa koji obuhvata sledeće korake: (a) eksprimiranje na površini ćelije (npr., 1624-5 ćelije) prvog antigena ili drugog antigena; (b) bojenje ćelije koja eksprimira prvi antigen ili drugi antigen primenom, npr., 2 µg/ml ispitivanog antitela ili poliklonalnog antitela u analizi protočne citometrije i snimanje vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI - mean fluorescence intensity), npr., kao srednju vrednost više od jednog merenja, pri čemu poliklonalno antitelo prepoznaje i prvi antigen i drugi antigen; (c) deljenje MFI vrednosti ispitivanog antitela za ćelije koje eksprimiraju drugi antigen sa MFI vrednošću poliklonalnog antitela za ćelije koje eksprimiraju drugi antigen (MFI odnos2); (d) deljenje MFI vrednosti ispitivanog antitela za ćelije koje eksprimiraju prvi antigen sa MFI vrednošću poliklonalnog antitela za ćelije koje eksprimiraju prvi antigen (MFI odnos1); i (e) određivanje procenta smanjenja vezivanja izračunavanjem 100%<∗>(1-(MFI odnos1/MFI odnos2)).

[0055] Kao što je ovde primenjeno, antitelo ne pokazuje "suštinsko vezivanje" za antigen ukoliko kada je mereno u analizi protočne citometrije, vrednost srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) antitela na antigen nije suštinski viša od MFI vrednosti izotipskog kontrolnog antitela na antigen ili MFI vrednosti u odsustvu bilo kog antitela.

[0056] Kao što je ovde primenjeno, pojmovi "antitelo" i "antitela" su pojmovi iz oblasti i mogu se koristiti zamenski ovde i odnose se na molekul sa mestom za vezivanje antigena koje specifično vezuje antigen.

[0057] Antitela mogu da uključe, na primer, monoklonska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, monospecifična antitela, multispecifična antitela (uključujući bispecifična antitela), humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, imunoglobuline, sintetička antitela, tetramerna antitela koja sadrže molekule dva teška lanca i dva laka lanca, monomer lakog lanca antitela, monomer teškog lanca antitela, dimer lakog lanca antitela, dimer teškog lanca antitela, par laki lanac antitela- teški lanac antitela, intratela, heterokonjugat antitela, jednodomenska antitela, monovalentna antitela, jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), kamelizovana antitela, afitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, disulfid-vezani Fv (sdFv), anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-anti-Id antitela), i antigen-vezujuće fragmenta bilo kog od iznad navedenih. U određenim aspektima, antitela opisana ovde se odnose na populacije poliklonskih antitela. Antitela mogu biti bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY), bilo koje klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1ili IgA2), ili bilo koje podklase (npr., IgG2aili IgG2b) molekula imunoglobulina. U određenim tehničkim rešenjima, antitela opisana ovde su IgG antitela, ili njihova klasa (npr., humani IgG1ili IgG4) ili podklasa. U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo je humano monoklonsko antitelo, poželjno je imunoglobulin. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde je IgG1, ili IgG4antitelo.

4

[0058] Kao što je ovde primenjeno, pojmovi "antigen-vezujući domen," "antigen-vezujući region," "antigen-vezujući fragment," i slični pojmovi se odnose na deo molekula antitela koji sadrži aminokiselinske ostatke koji dodeljuju molekulu antitela njegovu specifičnost za antigen (npr., regioni za određivanje komplementarnosti (CDR)). Antigen-vezujući region može da se izvede iz bilo koje životinjske vrste, poput glodari (npr., miš, pacov ili hrčak) i ljudi.

[0059] Kao što je ovde primenjeno, pojmovi "varijabilni region" ili "varijabilni domen" se primenjuju zamenski i uobičajeni su u oblasti. Varijabilni region se obično odnosi na deo antitela, uopšteno, deo lakog ili teškog lanca, obično oko amino-terminalnih 110 do 120 aminokiselina u zrelom teškom lancu i oko 90 do 115 aminokiselina u zrelom lakom lancu, koji se razlikuju znatno u sekvenci među antitelima i koriste se u vezivanju i specifičnosti posebnog antitela za njegov poseban antigen. Varijabilnost u sekvenci je koncentrisana u onim regionima koji se zovu regioni za određivanje komplementarnosti (CDR-ovi) dok se visoko konzervirani regioni u varijabilnom domenu zovu okvirni regioni (FR). Bez želje da za vezivanjem sa bilo kakvim posebnim mehanizmom ili teorijom, smatra se da CDR-ovi lakih i teških lanaca su primarno odgovorni za interakcije i specifičnost antitela sa antigenom. U određenim tehničkim rešenjima, varijabilni region je humani varijabilni region. U određenim tehničkim rešenjima, varijabilni region sadrži glodarske ili murinske CDR-ove i humane okvirne regione (FR-ove). U posebnim tehničkim rešenjima, varijabilni region je varijabilni region primata (npr., primata koji nije čovek). U određenim tehničkim rešenjima, varijabilni region sadrži glodarske ili murinske CDR-ove i okvirnwe regione (FR-ove) primata (npr., primata koji nije čovek)

[0060] Pojmovi "VL" i "VL domen" se koriste zamenski da označe varijabilni region lakog lanca antitela.

[0061] Pojmovi "VH" i "VH domen" se koriste zamenski da označe varijabilni region teškog lanca antitela.

[0062] Pojam "numerisanje prema Kabatu" i slični pojmovi su prepoznati u oblasti i odnose se na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela. U određenim aspektima, CDR-ovi antitela mogu biti određeni u skladu sa sistemom numerisanja prema Kabatu (videti, npr., Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 i Kabat EA i sar., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, američki Departman za zravstvo i ljudske resurse, NIH objava br.91-3242). Primenom sistema numerisanja prema Kabatu, CDR-ovi unutar molekula teškog lanca antitela su obično predstavljeni na aminokiselinskim položajima 31 do 35, koji po izboru mogu da uključe jednu ili dve dodatne aminokiseline, praćenjem 35 (naznačeno na shemi numerisanja prema Kabatu kao 35A i 35B) (CDR1), aminokiselinskim položajima 50 do 65 (CDR2), i aminokiselinskim položajima 95 do 102 (CDR3). Primenom sistema numerisanja prema Kabatu, CDR-ovi unutar molekula lakog lanca antitela su obično predstavljeni na aminokiselinskim položajima 24 do 34 (CDR1), aminokiselinskim položajima 50 do 56 (CDR2), i aminokiselinskim položajima 89 do 97 (CDR3). U specifičnom tehničkom rešenju, CDR-ovi antitela opisanog ovde su određeni u skladu sa shemom numerisanja prema Kabatu.

[0063] Kao što je ovde primenjeno, pojam "konstantni region" ili "konstantni domen" su zamenjivi i imaju svoje značenje uobičajeno u oblasti. Konstantni region je deo antitela, npr., karboksil terminalni deo lakog i/ili teškog lanca koji nije direktno uključen u vezivanje antitela za antigen ali koji može da ispolji razne efektorske funkcije, kao što je interakcija sa Fc receptorom. Konstantni region molekula imunoglobulina uopšteno ima više konzervisanu aminokiselinsku sekvencu u odnosu na imunoglobulinski varijabilni domen.

[0064] Kao što je ovde primenjeno, pojam "težak lanac" kada se koristi u odnosu na antitelo može se odnositi na bilo koji poseban tip, npr., alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) i mu (µ), na bazi aminokiselinske sekvence konstantnog domena, koji dovode do IgA, IgD, IgE, IgG i IgM klasa antitela, redom, uključujući podklase od IgG, npr., IgG1, IgG2, IgG3i IgG4.

[0065] Kao što je ovde primenjeno, pojam "laki lanac" kada se koristi u odnosu na antitelo može se odnositi na bilo koji poseban tip, npr.,kapa (κ) ili lambda (λ) bazirano na aminokiselinskoj sekvenci konstantnih domena. Aminokiselinske sekvence lakog lanca su dobro poznate u oblasti. U specifičnim tehničkim rešenjima, laki lanac je human laki lanac.

[0066] "Afinitet vezivanja" uopšteno se odnosi na jačinu ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog vezujućeg mesta molekula (npr., antitelo) injegovog vezujućeg partnera (npr., antigen). Sem ako nije drugačije naznačeno, kao što je ovde primenjeno, "afinitet vezivanja" odnosi se na svojstveni afinitet vezivanja koji odražava 1:1 interakciju između članova veznog para (npr., antitelo i antigen). Afinitet molekula X za njegov partner Y može uopšteno da se predstavi konstantom disocijacije (KD). Afinitet može da se meri i/ili izrazi na više načina poznatih u oblasti, uključujući, ali bez ograničenja, ravnotežnu konstantu disocijacije (KD), i ravnotežnu konstantu asocijacije (KA). KDse izračunava iz količnika koff/kon, dok se KAizračunava se iz količnika kon/koff. konse odnosi na konstantu brzine asocijacije od, npr. antitela na antigen i koffse odnosi na disocijaciju, npr. antitela na antigen. koni koffmogu se odrediti tehnikama poznatim uobičajenim stručnjacima, poput BIAcore® ili KinExA.

[0067] Kako se ovde koristi, "konzervativna supstitucija aminokiselina" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju bočne lance definisane su u struci. Te familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). U određenim aspektima, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar CDR-a(CDR-ova) ili unutar okvirnog regiona(okvirnih regiona) antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen može se zameniti aminokiselinskim ostatkom sa sličnim bočnim lancem.

[0068] Kao što je ovde primenjeno, "epitop" je pojam u struci i odnosi se na lokalizovani region područje antigena na koje se antitelo može specifično vezati. Epitop mogu biti, na primer, susedne aminokiseline polipeptida (linearni ili susedni epitop) ili epitop, na primer, može nastati iz dva ili više nesusednih područja polipeptida ili polipeptida (konformacijski, nelinearni, diskontinuirani ili nesusedni epitop). U određenim aspektima, epitop za koji se antitelo veže može se odrediti pomoću, npr. NMR spektroskopije, rentgenskih difrakcijskih kristalografskih ispitivanja, ELISA testova, izmene vodika/deuterijuma u kombinaciji sa masenom spektrometrijom (npr. tečna hromatografija sa elektrosprej masenom spektrometrijom), testovi skeniranja oligo-peptida na bazi niza i/ili mapiranje mutageneze npr., mapiranje mutageneze usmerene na mesto). Za rendgensku kristalografiju, kristalizacija se može postići korišćenjem bilo koje poznate metode u struci (npr. Giegé R i sar., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Struktura 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Antitelo: antigen kristali mogu se proučavati dobro poznatim tehnikama difrakcije X-zraka i mogu se prečišćavati pomoću računarskog softvera kao što je X-PLOR (Univerzitet Yale, 1992, distribuira Molecular Simulations, Inc .; vidi npr. Meth Enzymol (1985) tomovi 114 i 115, ur. Wyckoff HW i sar.,; U.S. 2004/0014194) i BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P i sar., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10): 1316-1323). Studije mapiranja mutageneze mogu se izvesti korišćenjem bilo koje metode poznate stručnjaku. Videti npr. Champe M i sar., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 i Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 za opis tehnika mutageneze, uključujući tehnike mutageneze skeniranjem alanina. U specifičnom aspektu, epitop antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen određuje se korišćenjem studija mutageneze skeniranja alanina, kao što je opisano u odjeljku 6, niže.

[0069] Kako se ovde koristi, izrazi "imunospecifično se veže", "imunospecifično prepoznaje", "specifično veže" i "specifično prepoznaje" analogni su izrazi u kontekstu antitela i odnose se na molekule koje se vežu na antigen (npr, epitop ili imuni kompleks) kako takvo vezanje razume stručnjak u oblasti. Na primer, molekul koji se specifično veže za antigen može se vezati za druge peptide ili polipeptide, uopšteno sa nižim afinitetom kako je određeno, npr., imunotestovima, BIAcore®, instrumentom KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID) ili drugim testovima poznatim u struci. U specifičnom tehničkom rešenju, molekuli koji se imunospecifično vežu na antigen vežu se na antigen sa KAkoja je najmanje 2 log, 2,5 log, 3 log, 4 log ili veća od KAkada se molekuli vežu za drugi antigen.

[0070] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, molekuli koji se imunospecifično vežu na antigen ne reaguju ukršteno sa drugim proteinima pod sličnim uslovima vezanja. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, molekuli koji se imunospecifično vežu na antigen ne reaguju ukršteno sa drugim proteinima koji nisu GITR. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se veže na GITR većim afinitetom nego na drugi nepovezani antigen. U određenim tehničkim rešenjima, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se veže na GITR (npr. ljudski GITR) sa 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili većim afinitetom u odnosu na drugi, nepovezani antigen izmereno pomoću npr., radioimunološkog testa, površinske plazmonske rezonancije ili testa kinetičke isključenosti. U specifičnom tehničkom rešenju, opseg vezanja ovde opisanog anti-GITR antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen na nepovezan, ne-GITR protein je manji od 10%, 15% ili 20% vezanja antitela na GITR protein mereno, npr., radioimunološkim testom.

[0071] U specifičnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za humani GITR sa većim afinitetom nego na drugu vrstu GITR-a. U određenim tehničkim rešenjima, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koji se veže na humani GITR sa 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 %, 60%, 65%, 70% ili većim afinitetom u odnosu na drugu vrstu GITR-a mereno, npr., radioimunološkim testom, površinskom plazmonskom rezonancijom ili testom kinetičke isključenosti. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se veže na humani GITR, vezaće se na drugu vrstu GITR proteina sa manje od 10%, 15% ili 20% vezivanja antitela ili njegovog fragmenta na ljudski GITR protein kako je izmereno, npr., radioimunološkim testom, površinskom plazmonskom rezonancijom ili testom kinetičke isključenosti.

[0072] Kao što je ovde primenjeno, izrazi "receptor povezan sa familijom TNFR-a indukovan glukokortikoidima" ili "GITR" ili "GITR polipeptid" odnose se na GITR, uključujući, ali bez ograničenja, nativni GITR, izoformu GITR ili interspecijski GITR homolog GITR. GITR je transmembranski protein tipa I od 26 kDa. Pristupni brojevi GenBank™ BC152381 i BC152386 pružaju tipične sekvence nukleinske kiseline humanog GITR. Swiss-Prot pristupni broj Q9Y5U5-1 (TNR18 HUMAN; SEQ ID NO: 701) i pristupni broj GenBank™ NP_004186 pružaju tipične humane GITR aminokiselinske sekvence za izoformu 1. Ova aminokiselinska sekvenca duga je 241 aminokiselina sa prvih 25 amino kiselinskih ostataka koji kodiraju signalni niz. Izoforma 1 je membranski protein tipa I. Primer zrele aminokiselinske sekvence humanog GITR-a je dat kao SEQ ID NO: 700. Nasuprot tome, izoforma 2 je sekretovani oblik humanog GITR-a i duga je približno 255 aminokiselina. Swiss-Prot pristupni broj Q9Y5U5-2 i pristupni broj GenBank™ NP_683699 pružaju tipične humane GITR aminokiselinske sekvence za izoformu 2. Izoforma 3 humanog GITR je približno dužine od 234 aminokiselina. Swiss-Prot pristupni broj Q9Y5U5-3 i pristupni broj GenBank™ NP_683700 (prekursor izoforme 3) pružaju tipične humane GITR aminokiselinske sekvence za izoformu 3. U specifičnom tehničkom rešenju, GITR je humani GITR. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, GITR je humana GITR izoforma 1 (SEQ ID NO: 701). U određenim tehničkim rešenjima, GITR je humana izoforma 2 (SEQ ID NO: 702) ili izoforma 3 (SEQ ID NO: 703). GITR je takođe poznat kao član 18 superfamilije receptora faktora nekroze tumora (TNFRSF18), receptor familije TNFR indukovan aktivacijom (AITR), GITR-D i CD357. Humani GITR je označen GenID: 8784 od strane Entrez Gene.

[0073] Aminokiselinska sekvenca nezrelog oblika tipičnog GITR proteina cinomolgus majmuna navedena je u SEQ ID NO: 704. Zreli oblik ovog proteina uzetog kao primer su aminokiseline 26-234 iz SEQ ID NO: 704.

[0074] Kao što je ovde primenjeno, pojmovi "GITR ligand" i "GITRL" odnose se na proteinski ligand povezan sa TNFR-om izazvan glukokortikoidima. GITRL je inače poznat kao ligand povezan sa TNF-om (AITRL) i član 18 superfamilije liganada faktora tumorske nekroze (TNFSF18). Pristupni broj GenBank™ AF125303 pruža tipičnu sekvencu nukleinske kiseline humanog GITRL-a. GenBank™ pristupni broj NP_005083 i Swiss-Prot pristupni broj Q9UNG2 pružaju tipične humane GITRL aminokiselinske sekvence. U posebnom tehničkom rešenju, GITRL je humani GITRL sa SEQ ID NO: 716.

[0075] Kao što je ovde primenjeno, pojam "ćelija domaćina" može biti bilo koji tip ćelije, npr. primarna ćelija, ćelija u kulturi ili ćelija iz ćelijske linije. U specifičnim tehničkim rešenjima, pojam "ćelija domaćina" odnosi se na ćeliju transficiranu molekulom nukleinske kiseline i potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Potomstvo takve ćelije možda neće biti identično matičnoj ćeliji transficiranoj molekulom nukleinske kiseline, npr. Zbog mutacija ili uticaja okoline koji se mogu pojaviti u sledećim generacijama ili integracije molekula nukleinske kiseline u genom ćelije domaćina.

[0076] Kao što je ovde primenjeno, pojam "efikasna količina" u kontekstu administracije terapije subjektu se odnosi na količinu terapije koja postiže željeni profilaktički ili terapijski učinak. Primeri efikasnih količina su dati u Odeljku 5.4.1.3, ispod.

[0077] Kao što je ovde primenjeno, pojmovi "subjekt" i "pacijent" koriste se naizmenično. Subjekt može biti životinja. U nekim tehničkim rešenjima, subjekt je sisar kao što je ne-primat (npr. krava, svinja, konj, mačka, pas, pacov itd.) ili primat (npr. majmun ili čovek), najpoželjnije čovek. U određenim tehničkim rešenjima takvi se izrazi odnose na životinju koja nije čovek (npr. životinja koja nije čovek, poput svinje, konja, krave, mačke ili psa). U nekim tehničkim rešenjima, takvi se izrazi odnose na kućnog ljubimca ili domaću životinju. U određenim tehničkim rešenjima, takvi se izrazi odnose na čoveka.

4. KRATAK OPIS SLIKA

[0078]

Slika 1 "Western Blot" pod neredukujućim uslovima pokazuje specifičnost anti-GITR antitela 231-32-15 u odnosu na izotipsku kontrolu. Antitelo se „blotuje“ na humani GITR rekombinantni protein (Hu GITR rekomb protein), mišji GITR rekombinantni protein (Mu GITR rekomb protein), CMS5A ćelije koje eksprimiraju rekombinantni humani GITR (CMS5A-huGITR), divljeg tipa CMS5A ćelije (CMS5A-wt), proteine iz CD4<+>aktivirane ćelije (CD4<+>aktiviran) i proteine iz CD4<+>netretiranih ćelija (CD4<+>netretirani). Vidi se reaktivnost 231-32-15 na humani GITR, rekombinantni humani GITR u ćelijama CMS5A i prirodni humani GITR u aktiviranim CD4<+>ćelijama.

Slike 2A i 2B prikazuju FACS analizu kompetitivnog vezivanja anti-GITR antitela naspram komercijalnog (R&D Systems) anti-GITR mAb(mAt – monoklonsko antitelo). Na Slici 2A blokiranje mAb (mAt) od R&D Systems-a je testirano primenom R&D mAb i test antitela (antitelo 1042-7, antitelo 1039-45, antitelo 1333-21 i antitelo 32-15) kao što je naznačeno na slici. Uslov 'bez antitela' prikazuje vezivanje mAb od R&D Systems-a zasebno, u odsustvu test antitela. Slika 2B prikazuje blokiranje anti-GITR antitela 231-1039-45 bez primene mAb, mAb od R&D Systems-a i test antitela (antitelo 1042-7, antitelo 1039-45, antitelo 1333-21 i antitelo 32-14) kao što je naznačeno na slici. Uslov 'bez antitela' prikazuje vezivanje antitela 231-1039-45 zasebno, u odsustvu test antitela.

4

Slike 3A, 3B i 3C: Slika 3A prikazuje bojenje CMS5A-GITR-a pomoću antitela 1333-21 serija 1, 1333-21 serija 2 i R&D antitela pri različitim koncentracijama antitela. Slika 3B prikazuje grafik intenziteta fluorescencije od ex-vivo PBMC CD3-CD19-GITR+ i CD4+CD25+GITR+ ćelija na bojenje antitelima 1042-7, 32-15, 1039-45, 1333-21 i R&D antitelom. Slika 3C obezbeđuje FACS analizu CD3-CD19-GITR+ i CD4+CD25+GITR+ ćelija pomoću antitela 1333-21 i antitela od R&D Systems-a. Slika 4 prikazuje procenu kostimulatornog efekta anti-GITR antitela na CD4+ T ćelije u kombinaciji sa raznim koncentracijama anti-CD3 (OKT3) antitela. U gornjoj ploči % ćelija sa niskim CFSE je grafički prikazan za svako testirano antitelo (PBS kontrola, R&D, 1042-7, 32-15, 1039-45 i 1333-21) u kombinaciji sa smajujućim koncentracijama OKT3 antitela (5µg/ml, 1µg/ml, 0.2µg/ml, 0.04µg/ml i 0µg/ml). U donjoj ploči koncentracija od IFNγ (pg/ml) je grafički prikazana za svako testirano antitelo (PBS kontrola, R&D, 1042-7, 32-15, 1039-45 i 1333-21) u kombinaciji sa smanjujućim koncentracijama OKT3 antitela (5µg/ml, 1µg/ml, 0.2µg/ml, 0.04µg/ml i 0µg/ml). Slika 5 prikazuje GITRL-PE vezivanje za GITR u prisustvu anti-GITR antitela himernih roditeljskih 231-32-15 i m6C8. Dalje antitelo SK48E26, koje prepoznaje IL-1β, je primenjeno kao negativna kontrola. Procenat GITRL-PE vezivanja je meren pomoću tehnologije niza suspenzije (Luminex® 200 sistem) u prisustvu rastućih koncentracija antitela (12, 37, 111, 333, 1000, 3000 i 9000ng/ml). Slika 5 prikazuje rezultate iz četiri nezavisna ponavljanja ovog testa izvedenog u duplikatu i standardna devijacija je određena od n=8.

Slika 6 je sličan grafik onome prikazanom na Slici 5 gde je procenat GITRL-PE vezivanja meren pomoću tehnologije niza suspenzije (Luminex® 200 sistem) u prisustvu rastućih koncentracija antitela (12, 37, 111, 333, 1000, 3000 i 9000ng/ml). Anti-GITR antitela koja su testirana su himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo i dve humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2. Ova slika prikazuje rezultate iz eksperimenta izvedenog u duplikatu.

Slika 7 prikazuje vezivanje GITR liganda za GITR u prisustvu mAb-ova kako je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom (BIAcore® T100/200). Testirana anti-GITR antitela su himerno roditeljsko 231-32-15, humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2 i m6C8. Negativna kontrola je bila anti-IL-1β antitelo SK48E26.

Slike 8A i 8B prikazuju FACS grafički ucrtane rezultate testa suboptimalne CD3 stimulacije za procenu efekata stimulacije anti-GITR antitela na obogaćene CD4<+>T ćelije iz dva različita „buffy coat-a“ (leukocitno-trombocitni sloj iz cele krvi). Slika 8A prikazuje FACS analizu broja ćelija i proliferacije CD4 T ćelija iz visokog respondera na stimulaciju („buffy coat“ 6), dok Slika 8B prikazuje FACS analizu za niskog respondera („buffy coat“ 8). Ćelijska proliferacija (CFSE; x-osa) je prikazana za 10µg/ml anti-GITR antitela (himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo i humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2). Primenjene kontrole su bile bilo anti-CD3/anti-CD28 antitelo zasebno ili bez stimulacije. Test je izveden u triplikatu.

Slike 9A i 9B su histogrami koji prikazuju efekat anti-GITR humanizovanih varijantnih antitela Hum231#1 i Hum231#2 na obogaćenu CD4 T ćelijsku proliferaciju (Slika 9A) i broj ćelija (Slika 9B), u poređenju sa antitelom m6C8, u testu suboptimalne CD3 stimulacije. Antitela su korišćena u koncentraciji od 10µg/ml. Krajnja kolona (puna crna ispuna; Slike 9A i 9B) naznačava anti-CD3/anti-CD28 simulaciju bez dodavanja bilo kakvog anti-GITR antitela.

Slike 10A, 10B, 10C i 10D prikazuju analizu proizvodnje citokina IFNγ, IL-6, IL-10 i TNFα, redom indukovane administracijom anti-GITR antitela u suboptimalnom CD3 estirana anti-GITR antitela su bila himerno roditeljsko 231-32-15 i humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2 pri koncentracijama od 10µg/ml i 5µg/ml.

Slika 11 je a histogram koji prikazuje dalju titraciju anti-GITR antitela i njihov efekat na ćelijsku proliferaciju u testu suboptimalne CD3 stimulacije. Himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo i humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2 su primenjene pri koncentracijama od 10µg/ml, 5µg/ml i 2.5µg/ml.

Slike 12A i 12B prikazuju dalju titraciju anti-GITR antitela i njihov efekat na IFNγ proizvodnju u testu suboptimalne CD3 stimulacije. Himerno roditeljsko 231-32-i15 antitelo i humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2 su primenjeni pri koncentracijama od 10µg/ml, 5µg/ml i 2.5µg/ml kao vezana za pločicu (Slika 12A) ili 20µg/ml, 10µg/ml i 5µg/ml kao rastvorljiva antitela (Slika 12B).

Slika 13 je skup trakastih grafikona koji prikazuju rezultate kostimulacije sa 5 µg/ml, za pločicu vezanog Hum231#2 na sekreciju citokina pomoću PBMC u testu suboptimalne CD3 stimulacije. Podaci prikazani na Slici 13 su od dva donora testirana na dan 2 i dan 4 nakon stimulacije. Maksimalna indukcija preko izotipske kontrole je grafički ucrtana za šest različitih citokina (IFNγ, IL-2, TNFα, IL-10, IL-13 i IL-4). Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju za dva ponavljanja za svaki citokin. Svaki donor je testiran u najmanje tri individualna eksperimenta.

Slike 14A, 14B i 14C su rezultati testova unutarćelijskog citokinskog bojenja u kojima se meri prozvodnja IFNy i TNFα, indukovanog sa za pločicu vezanim Hum231#2, Hum23 1#2w ili pab1989 (IgG4 par od Hum231#2w) pod suboptimalnom CD3 stimulacijom. Slika 14A je skup grafičkih prikaza protočne citometrije koji prikazuju zajedničko bojenje IFNy i TNFα za CD4+ i CD8+ T ćelije. Procenat IFNγ+ monofunkcionalnih T ćelija, TNFα+ monofunkcionalnih T ćelija ili IFNγ+ TNFα+ polifunkcionalnih T ćelija je grafički ucrtan za Hum231#2, Hum231#2w, pab1989 ili izotipsku kontrolu preko opsega koncentracija suboptimalnog anti-CD3 antitela (slike 14B i 14C). Svaka tačka na slikama 14B i 14C predstavlja dva ponavljanja za testirani uslov. Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. Anti-GITR antitela su primenjena u koncentraciji od 5 µg/ml. Grafikoni su reprezentativni za eksperimente koji primenjuju PBMC od šest (Slike 14A i 14B) i četiri (Slika 14C) različita donora, redom.

Slike 15A, 15B i 15C su skup trakastih grafikona koji prikazuju rezultate eksperimenata u kojima se upoređuju anti-GITR antitelo Hum231#2 pod različitim uslovima ukrštenog povezivanja. Slika 15A je trakasti grafikon koji prikazuje maksimalnu indukciju iz izotipske kontrole za procenat IFNγ+ TNFα+ polifunkcionalnih CD8+ T ćelija primenom PBMC-a zajednički stimulisanih sa 5 µg/ml za pločicu vezanog (PB - platebound) ili rastvorljivog Hum231#2 ili izotipske kontrole. Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. * predstavlja p < 0.05 i ** predstavlja p < 0.005 (nespareni T-test). Na slikama 15B i 15C, maksimalna indukcija preko izotipske kontrole za šest različitih citokina je grafički ucrtana bilo za Hum231#2 vezan za pločicu (Slika 15B) ili anti-Fc ukršteno povezani Hum231#2 (Slika 15C). Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju dva ponavljanja za svaki citokin.

Slike 16A i 16B prikazuju rezultate stimulacije anti-CD3/anti-CD28 i anti-GITR antitela na T efektorske (T-ef) i T regulatorne ćelije (Treg). Slika 16A prikazuje da aktivirane T-efektorske i T-regulatorne ćelije eksprimiraju GITR na njihovoj ćelijskoj površini nakon stimulacije sa anti-CD3/anti-CD28 zasebno ili u vezi sa anti-GITR antitelima. Međutim, kao što je prikazano na Slici 16B, kostimulacija sa anti-GITR antitelima preferencijalno širi efektorske T-ćelije nad T-regulatornim ćelijama. Ćelijska ekspanzija/proliferacija (CFSE; y-osa) je prikazana za 10µg/ml anti-GITR antitela (himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo i humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2) na „buffy coat“ 8. Primenjene kontrole su bile bilo anti-CD3/anti-CD28 antitelo pri 125ng/ml zasebno bilo bez stimulacije.

4

Slike 17A i 17B prikazuju rezultate na T ćelijsku proliferaciju od strane testiranih anti-GITR antitela. Slika 17A prikazuje proliferaciju CD4 ćelija i Slika 17B prikazuje proliferaciju CD8 ćelija u ukupnim PBMC stimulisanim sa 31.25ng/ml anti-CD3 antitela. Himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo i humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2 su testirani u koncentraciji od 10µg/ml.

Slike 18A, 18B i 18C su grafikoni koji prikazuju rezultate GITR NF-κB-luciferaza reporterskog testa u odsustvu ili prisustvu 0.3 µg/ml anti-CD3 antitela vezanog za pločicu (Klon SP34). Slika 18A je grafikon koji prikazuje relativne svetlosne jedinice (RLU - relative light units) luciferaze u opsegu koncentracija anti-GITR antitela pri 18-satnoj post-stimulaciji u prisustvu anti-CD3 antitela. Slika 18B je grafikon koji prikazuje RLU luciferaze pri različitim koncentracijama anti-GITR antitela pri 5-satnoj post-stimulaciji u odsustvu anti-CD3 antitela. Slika 18C je grafikon koji prikazuje najviše odnose eksprimiranja luciferaze (GITR Ab/izotipska kontrola) pri 0, 2, 5, 6, 8 i 18 sati post-stimulacije. Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju duplikata. Testirana anti-GITR antitela su bila Hum231#2w i m6C8. Prikazani podaci su reprezentativni za četiri eksperimenta sa anti-CD3 antitelom ili dva eksperimenta bez anti-CD3 antitela.

Slika 19A je trakasti grafikon koji prikazuje normalizovanu gustinu receptora humanog GITR na aktiviranim nTreg, CD4+ T ćelijama ili CD8+ T ćelijama kako je izmereno protočnom citometrijom. Primenjeno anti-GITR antitelo je bilo PE-konjugovano mišje anti-humano GITR antitelo (Biolegend: 621; 311604/B171072). Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. Slika 19B je grafikon koji ispituje anti-GITR antitelo Hum231#2w primenom reporterske ćelijske linije Fc gama receptora IIIA (CD16). Jurkat NFAT-luciferaza reporterske ćelije koje prekomerno eksprimiraju CD16A sa visokim afinitetnim 158 V/V polimorfizmom se zajednički kultivišu sa aktiviranim primarnim nTreg ćelijama i T efektorskim ćelijama tokom 20 sati na 37°C u prisustvu Hum231#2w ili izotipske kontrole. Relativne svetlosne jedinice (RLU) su zabeležene nakon 20 sati, predstavljajući CD16A vezivanje. Δ RLU predstavlja RLU anti-GITR antitela minus onu od izotipske kontrole. Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju (n=2). Prikazani podaci su reprezentativni za eksperimente koji koriste ćelije od tri donora. Slika 19C je skup histograma koji prikazuju površinsko eksprimiranje GITR-a mereno protočnom citometrijom. Uzorci su prikupljeni iz krvi zdravih donora-ljudi (a-c, n=3) ili iz tumorskih tkiva pacijenata sa nesitnoćelijskim kancerom pluća (NSCLC) (d-f, n=3). Ćelijske populacije su definisane kao: Tconv (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25nisko, FOXP3-) ili Treg (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25visoko, FOXP3+).

Slike 20A, 20B i 20C su rezultati iz eksperimenata koji koriste PBMC-e iz afričkog zelenog majmuna (AGM - African green monkey). Slika 20A je skup prikaza protočne citometrije bojenja aktiviranih CD4+ i CD8+ T ćelija afričkog zelenog majmuna (AGM) primenom anti-GITR antitela Hum231#2 i anti-PD-1 antitela. PBMC-e zdravog AGM su aktivirane sa anti-CD3 antitelom (klon SP34.2) ili ConA plus IL-2 (20 U/ml) tokom 3 dana. Prikazi protočne citometrije su reprezentativni za eksperimente koji koriste PBMC-e iz tri različita AGM-a. Slike 20B i 20C su rezultati testa CD3 stimulacije koji primenjuje AGM PBMC-e. Slika 20B je par crteža-prikaza protočne citometrije koji prikazuje zajedničko bojenje CD8 i IFNγ za ćelije ko-stimulisane sa Hum231#2w ili izotipskom kontrolom. Na Slici 20C, Procenat IFNγ+ AGM CD8+ T ćelija je grafički ucrtan za različite koncentracije anti-GITR antitela. Svaka tačka predstavlja duplikat dva bunarića i stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. Podaci prikazani na Slikama 20B i 20C su reprezentativni za eksperimente koji koriste PBMC-e od dva AGM-a.

Slike 21A i 21B su rezultati bojenja površinskih OX40 i PD-1 na CD4+ i CD8+ T ćelijama stimulisanim sa 0.8 µg/ml anti-CD3 antitela vezanog za pločicu i 5 µg/ml anti-GITR antitela Hum231#2. Slika 21A je skup prikaza protočne citometrije i histograma koji prikazuju zajedničko bojenje OX40 i PD-1. Na Slici 21B, svaka traka prikazuje MFI vrednost za PD-1 i OX40 na CD4+ i CD8+ T ćelijama stimulisanim sa Hum231#2 (crne trake), izotipskom kontrolom (sive trake) ili medijumom samo (bele trake). Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. Prikazi protočne citometrije i grafikoni su reprezentativni za eksperimente koji koriste PBMC-e od jednog donora.

Slike 22A i 22B prikazuju dizajn mutiranih biblioteka za generisanje varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji. Različiti okvirni i CDR položaji uključeni u biblioteku na bazi IGHV1-2<∗>02 VH humane germinativne linije su prikazani na Slici 22A (SEQ ID NOS 37-53, redom, po redu pojavljivanja) a za biblioteku na bazi IGKV4-1<∗>01 VL humane germinativne linije na Slici 22B (SEQ ID NOS 54-71, redom, po redu pojavljivanja).

Slika 23 je tabela koja prikazuje 17 varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji i detalje varijabilnih regiona njihovih teških i lakih lanaca sa odgovarajućim SEQ ID brojevima. Tabela prikazuje broj dodatnih germinativnih aminokiselina i srednji

4

relativni afinitet varijantnih antitela u poređenju sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom.

Slike 24A-C su tabela koja prikazuje 107 varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji i detalje varijabilnih regiona njihovih teških i lakih lanaca sa odgovarajućim SEQ ID brojevima.

Slike 25A i 25B prikazuju GITRL-PE vezivanje za GITR u prisustvu odabira anti-GITR varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji. Procenat GITRL-PE vezivanja je meren pomoću tehnologije niza suspenzije (Luminex® 200 sistem) u prisustvu rastućih koncentracija antitela (12, 37, 111, 333, 1000, 3000 i 9000ng/ml).

Slike 26A i 26B prikazuju efekat na ćelijsku proliferaciju (% CFSE nisko) varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji u poređenju sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom i humanizovanim varijantama Hum231#1 i Hum231#2 na obogaćenim CD4 T ćelijama iz dva „buffy coat-a“, BC4 (Slika 26A) i BC9 (Slika 26B). Test suboptimalne CD3 stimulacije je izveden primenom anti-CD3 antitelo vezanog za pločicu pri 125ng/ml sa bilo vezanom za pločicu bilo rastvorljivom izotipskom kontrolom. Anti-GITR antitela su primenjena u koncentraciji od 10µg/ml.

Slike 27A i 27B prikazuju efekat na oslobađanje citokina IFNγ i IL-10, redom varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji u poređenju sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom i humanizovanim varijantama Hum231#1 i Hum231#2 na obogaćenim CD4 T ćelijama iz „buffy coat-a“ BC4. Test suboptimalne CD3 stimulacije je izveden primenom anti-CD3 antitelo vezanog za pločicu pri 125ng/ml sa bilo vezanom za pločicu bilo rastvorljivom izotipskom kontrolom. Anti-GITR antitela su primenjena u koncentraciji od 10µg/ml i nivoi citokina su izmereni u supernatantu kulture.

Slike 28A i 28B prikazuju efekat na oslobađanje citokina IFNy i IL-10, redom varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji u poređenju sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom i humanizovanim varijantama Hum231#1 i Hum231#2 na obogaćenim CD4 T ćelijama iz „buffy coat-a“ BC9. Test suboptimalne CD3 stimulacije je izveden primenom anti-CD3 antitelo vezanog za pločicu pri 125ng/ml sa bilo vezanom za pločicu bilo rastvorljivom izotipskom kontrolom. Anti-GITR antitela su primenjena u koncentraciji od 10µg/ml nivoi citokina su izmereni u supernatantu kulture.

Slike 29A i 29B prikazuju procenat IFNy pozitivnih CD4<+>T-ćelija (kako je izmereno pomoću unutarćelijskog bojenja) varijanti antitela obrađenih ka germinativnoj liniji u poređenju sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom i humanizovanim varijantama Hum231#1 i Hum231#2 na obogaćenim CD4 T ćelijama iz dva „buffy coat-a“. Slika

4

29A prikazuje rezultate iz „buffy coat-a“ 13 (BC13) i Slika 29B prikazuje rezultate iz „buffy coat-a“ 18 (BC18).

Slike 30A-C su skup grafikona koji prikazuju rezultate GITR NF-κB-luciferaza reporterskog testa u prisustvu 0.3 µg/ml anti-CD3 antitela. Testirana anti-GITR antitela u ovom testu su Hum231#2w i 20 germinativnih varijanti: pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, pab2159, pab2160 i pab2161. Na Slikama 30A-C, luciferaza RLU pri 18-satnoj post-stimulaciji je grafički ucrtana za različite testirane koncentracije anti-GITR antitela. Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. Slike 30D-F su skup grafikona koji prikazuju rezultate GITR NF-κB-luciferaza reporterskog testa u odsustvu anti-CD3 antitela. Testirana anti-GITR antitela u ovom testu su bila m6C8, Hum231#2w i 20 germinativnih varijanti: pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, pab2159, pab2160 i pab2161. Na Slikama 30D-F, luciferaza RLU pri 6-satnoj post-stimulaciji je grafički ucrtana za različite testirane koncentracije anti-GITR antitela. Stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju. Grafikoni i prikazi su reprezentativni za podatke iz dva eksperimenta (Slike 30A-C) ili iz jednog eksperimenta (Slike 30D-F).

Slika 31 prikazuje gubitak vezivanja 1624-5 pre-B ćelija koje eksprimiraju himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo na biotinilovani GITR (GITR-bio) kada je GITR-bio preinkubiran sa himernim roditeljskim 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 antitelima. Slika 31 profil sa desne strane prikazuje vezivanje 1624-5 pre-B ćelija koje eksprimiraju himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo na GITR-bio. Međutim na profilu sa leve strane, prikazan je gubitak vezivanja 1624-5 ćelija koje eksprimiraju himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo na GITR-bio nakon pre-inkubacije GITR-bio sa bilo kojim himernim roditeljskim 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 antitelom.

Slika 32 prikazuje rezultate testa nadmetanja epitopa mereno površinskom plazmonskom rezonancom (BIAcore® T100/200). GITR antigen je imobilisan na CM5 senzorskom čipu i anti-GITR antitela primenjena u koncentraciji od 300nM. Himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo je primenjeno prvo praćeno primenom murinskog antitela 6C8.

Slike 33A i 33B su rezultati eksperimenta mapiranja epitopa koji koristi ćelijsku biblioteku koja pokazuje GITR varijante generisane pomoću PCR-a koji je sklon grešci. Na Slikama 33A i 33B je prikazano poravnanje sekvenci iz GITR varijanti koje se

4

vezuju za poliklonsko anti-GITR antitelo ali se ne vezuju za anti-GITR himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo.

Slike 34A i B su rezultat eksperimenta mapiranja epitopa koji koristi skeniranje alanina. Sledeći položaji u humanom GITR-u (numerisani prema SEQ ID NO: 701) odvojeno su mutirani u alanin: P28A, T29A, G30A, G31A, P32A, T54A, T55A, R56A, C57A, C58A, R59A, D60A, Y61A, P62A, G63A, E64A, E65A, C66A, C67A, S68A, E69A, W70A, D71A, C72A, M73A, C74A, V75A i Q76A. Testirana antitela u eksperimentu prikazanom na Slici 34A uključuju: monoklonska anti-GITR antitela Hum231#2, tri germinativne varijante (pab1967, pab1975 i pab1979) i m6C8 antitelo; i poliklonsko anti-GITR antitelo (AF689, R&D systems). Slika 34A je tabela u kojoj je rezimirano vezivanje Hum231#2, tri germinativne varijante (pab1967, pab1975 i pab1979) i referentnog antitela m6C8 za 1624-5 ćelije koje eksprimiraju alaninske mutante humanog GITR-a. Slika 34B je skup prikaza protočne citometrije koji prikazuje bojenje 1624-5 ćelija koje eksprimiraju humani GITR divljeg tipa, D60A mutant, ili G63A mutant primenom monoklonskog antitela 231-32-15, Hum231#2, ili m6C8, ili poliklonskog antitela. Procenat GITR pozitivnih ćelija je naznačen u svakom grafičkom prikazu.

Slika 35A je poravnanje sekvenci humanog GITR-a, V1M cinomolgusovog GITR-a, i V1M/Q62P/S63G cinomolgusnog GITR-a, naglašavajući položaje 62 i 63 gde su dve aminokiseline iz cinomolgusnog GITR-a (GlnSer) zamenjene odgovarajućim ostacima u humanom GITR-u (ProGly). Slika 35B je skup prikaza protočne citometrije koji prikazuje bojenje 1624-5 ćelija koje eksprimiraju humani GITR, V1M cinomolgusni GITR, ili V1M/Q62P/S63G cinomolgusov GITR primenom monoklonskih antitela 231-32-15, Hum231#2, ili m6C8, ili poliklonskog anti-GITR antitela.

5. DETALJNI OPIS

[0079] Ovde su navedena antitela (npr., monoklonska antitela) i njihovi fragmenti koji vežu antigen, a koji se specifično vežu na GITR (npr., ljudski GITR) i moduliraju GITR aktivnost. Na primer, u jednom aspektu, ovde dato antitelo(a) ili njegov fragment(i) koji se specifično vezuje na GITR i poboljšava, indukuje ili povećava jednu ili više GITR aktivnosti. U specifičnom tehničkom rešenju izoluje se antitelo(a) ili fragment(i) koji veže antigen.

[0080] Takođe su obezbeđene izolovane nukleinske kiseline (polinukleotidi), poput komplementarne DNK (cDNK), koja kodira takva antitela, i njihovi fragmenti koji vežu

4

antigen. Dalje su obezbeđeni vektori (npr. ekspresioni vektori) i ćelije (npr. ćelije domaćina) koje sadrže nukleinske kiseline (polinukleotide) koje kodiraju takva antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen. Takođe su pruženi postupci stvaranja takvih antitela. U drugim aspektima, ovde su dati postupci i primene za indukovanje, povećanje ili poboljšanje GITR aktivnosti i lečenje određenih stanja, poput kancera i zaraznih bolesti. Srodne kompozicije (npr, farmaceutske kompozicije), kitovi i postupci detekcije su obezbeđeni.

5.1 Antitela

[0081] U specifičnom aspektu, ovde su obezbeđena are antitela (npr., monoclonal antitela, poput himerna ili humanizovana antitela) i njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) kako je definisano u patentnim zahtevima. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde delimično inhibira vezivanje GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) sa GITR (npr., humanim GITR). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde inhibira vezivanje GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% kako je procenjeno testom poznatim stručnjacima iz oblasti ili opisanim ovde. U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde inhibira vezivanje GITRL-a (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% kako je procenjeno testom opisanim u Primeru 2, dole (npr., Odeljci 6.2.5.2 ili 6.2.5.4, dole). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 1000 ng/ml, 950 ng/ml, 900 ng/ml, 850 ng/ml, 800 ng/ml, 750 ng/ml, 700 ng/ml, 650 ng/ml, 600 ng/ml, 550 ng/ml, 500 ng/ml, 450 ng/ml, 400 ng/ml, 350 ng/ml, 333 ng/ml, 300 ng/ml, 250 ng/ml, 200 ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml ili 10ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., GITRL-PE) za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u

4

testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde pri koncentraciji 1000 ng/ml do 750 ng/ml, 1000 ng/ml do 500 ng/ml, 850 ng/ml do 500 ng/ml, 750 ng/ml do 500 ng/ml, 600 ng/ml do 500 ng/ml, 500 ng/ml do 400 ng/ml, 400 ng/ml do 300 ng/ml, ili 300 ng/ml do 200 ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., GITRL-PE) za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u koncentraciji od 1000ng/ml inhibra manje od 80% (u nekim tehničkim rešenjima, 40% do 70%, 50%, do 80%, ili 40% do 80%) 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) da se veže sa GITR-om vezanim za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija.

[0082] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde pri koncentraciji od 3500 ng/ml, 3400 ng/ml, 3300 ng/ml, 3200 ng/ml, 3100 ng/ml, 3000 ng/ml, 2900 ng/ml, 2800 ng/ml, 2700 ng/ml, 2600 ng/ml, 2500 ng/ml, 2400 ng/ml, 2300 ng/ml, 2200 ng/ml, 2100 ng/ml, 2000 ng/ml, 1900 ng/ml, 1800 ng/ml, 1700 ng/ml, 1600 ng/ml, 1500 ng/ml, 1400 ng/ml, 1300 ng/ml, 1200 ng/ml, ili 1100 ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., GITRL-PE) za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde pri koncentraciji od 3500 ng/ml do 3200 ng/ml, 3500 ng/ml do 3000ng/ml, 3200 ng/ml do 2500 ng/ml, 3000 do 2200 ng/ml, 2500 ng/ml do 1800 ng/ml, 2000 ng/ml do 1500 ng/ml, 1700 ng/ml do 1200 ng/ml, ili 1500 ng/ml do 1000 ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., GITRL-PE) za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0083] U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 3000ng/ml inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85% ili manje od 80% (u nekim tehničkim rešenjima, 60% do 85%, 60% do 80%, 70% do 85% ili 70% do 80%) kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 1000ng/ml inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85%, manje od 80% ili manje od 75% (u nekim tehničkim rešenjima, 60% do 85%, 60% do 80%, 70% do 85% ili 70% do 80%) kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 333ng/ml inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 70% ili manje od 65% (u nekim tehničkim rešenjima, 50% do 70%, 55% do 70%, 50% do 65% ili 50% do 60%) kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim

1

GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 111ng/ml inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 65%, manje od 60% ili manje od 55% (u nekim tehničkim rešenjima, 40% do 65%, 40% do 60%, 40% do 55% ili 30% do 60%) kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 37ng/ml inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 40% (u nekim tehničkim rešenjima, 20% do 40%, 20% do 30%, ili 15% do 35%) kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 12ng/ml inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 20% (u nekim tehničkim rešenjima, 10% do 20%) kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0084] U određenim tehničkim rešenjima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde procenjeno testom poznatim stručnjacima iz oblasti ili opisanim ovde. U specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde kako je procenjeno testom opisanim u Primeru 2, dole (npr., odeljak 6.2.5.2 ili 6.2.5.4, dole). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% od 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM,

2

0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u prisustvu 1000 ng/ml, 950 ng/ml, 900 ng/ml, 850 ng/ml, 800 ng/ml, 750 ng/ml, 700 ng/ml, 650 ng/ml, 600 ng/ml, 550 ng/ml, 500 ng/ml, 450 ng/ml, 400 ng/ml, 350 ng/ml, 333 ng/ml, 300 ng/ml, 250 ng/ml ili 200 ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% od 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u prisustvu 1000 ng/ml do 900 ng/ml, 1000 ng/ml do 850 ng/ml, 900 ng/ml do 800 ng/ml, ili 850 ng/ml do 750 ng/ml, ili 800 do 750 ng/ml u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 20%, najmanje 25% ili najmanje 30% od 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u prisustvu 1000ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija.

[0085] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% od 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u prisustvu 3500 ng/ml, 3400 ng/ml, 3300 ng/ml, 3200 ng/ml, 3100 ng/ml, 3000 ng/ml, 2900 ng/ml, 2800 ng/ml, 2700 ng/ml, 2600 ng/ml, 2500 ng/ml, 2400 ng/ml, 2300 ng/ml, 2200 ng/ml, 2100 ng/ml, 2000 ng/ml, 1900 ng/ml, 1800 ng/ml, 1700 ng/ml, 1600 ng/ml, 1500 ng/ml, 1400 ng/ml, 1300 ng/ml, 1200 ng/ml, 1100 ng/ml ili 1000 ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% od 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u prisustvu 3500 ng/ml do 3200 ng/ml, 3500 ng/ml do 3000ng/ml, 3200 ng/ml do 2500 ng/ml, 3000 do 2200 ng/ml, 2500 ng/ml do 1800 ng/ml, 2000 ng/ml do 1500 ng/ml, 1700 ng/ml do 1200 ng/ml, ili 1500 ng/ml do 1000 ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0086] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 20%, najmanje 25% ili najmanje 30% od 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u prisustvu 3000ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, ili najmanje 50% (u nekim tehničkim rešenjima, 25% do 60%, 40% do 60%, 40% do 70%, ili 25% do 50%) 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u prisustvu 1000ng/ml

4

antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50% ili najmanje 60% (u nekim tehničkim rešenjima, 30% do 60%, 40% do 60%, 40% do 70%, ili 30% do 50%) 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u prisustvu 333ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60% ili najmanje 65% (u nekim tehničkim rešenjima, 40% do 70%, 40% do 60%, 40% do 65%, ili 40% do 50%) 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u prisustvu 111ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 60%, najmanje 70% ili najmanje 80% (U nekim tehničkim rešenjima 60% do 80%, 70% do 80% ili 75% do 85%) 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u prisustvu 37ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, najmanje 80%, najmanje 85% ili najmanje 90% (u nekim tehničkim rešenjima 80% do 90% ili 85% do 95%) 0.5nM obeleženog GITRL-a (npr., obeleženog humanog GITRL, poput hGITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u prisustvu 12ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija [0087] U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 3000ng/ml ne inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za više od 15% ili više od 20% kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 1000ng/ml ne inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za više od 15%, više od 20% ili više od 25% kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 333ng/ml ne inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za više od 30% ili više od 35% kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 111ng/ml ne inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za više od 35%, više od 40% ili više od 45% kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 37ng/ml ne inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za više od 60% kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 12ng/ml ne inhibira vezivanje 0.5nM GITRL-a (npr., humanog GITRL-a) za GITR (npr., humani GITR) za više od 80% kada GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL-a za perlice sa vezanim GITR-om u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0088] U drugom tehničkom rešenju, određena količina obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u postupku koji obuhvata: (a) povezivanje GITR-a (npr., humanog GITR-a) za perlice u koncentraciji od približno 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici; (b) inkubiranje perlica povezanih sa GITR u koncentraciji od približno 30 perlica/µl, 40 perlica/µl, ili 50 perlica/µl sa 3000ng/ml, 2500ng/ml, 2000ng/ml, 1500ng/ml, 1000ng/ml, 750ng/ml, 500ng/ml, 250ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 25ng/ml ili 10ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u bunariću tokom prvog perioda vremena (npr., 30 minuta, 60 minuta, 1.5 sata, 2 sata, 2.5 sata ili 3 sata); (c) dodavanje obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL-PE) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od približno 1.5nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL-a i približno 15 perlica/µl, 20 perlica/µl, ili 25 perlica/µl, i inkubiranje tokom drugog perioda vremena (npr., 30 minuta, 1 sata, 1.5 sata, 2 sata, 2.5 sata ili 3 sata); i (d) detekciju obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u, npr., testu niza suspenzija poput Luminex® 200 sistema. U specifičnim tehničkim rešenjima, količina obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u prisustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta je određena u odnosu na količinu obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U određenim tehničkim rešenjima, odsustvo anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta znači da nema prisutnog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u bunariću. U drugim tehničkim rešenjima, odsustvo anti-GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta znači da se izotipsko kontrolno antitelo ne vezuje za GITR prisutan u bunariću. U skladu sa ovim tehničkim rešenjima, količina obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u prisustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta je određena da bude, u nekim tehničkim rešenjima, najmanje 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ili 60% ili 15% do 60%, 20% do 60%, 30% do 70%, ili 20% do 50% količine obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0089] U drugom tehničkom rešenju, određena količina obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL-PE) se vezuje za GITR koji je vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u postupku koji obuhvata: (a) povezivanje GITR-a (npr., humanog GITR-a) za perlice u koncentraciji od približno 5pg/ml po perlici; (b) inkubiranje perlica povezanih sa GITR u koncentraciji od približno 40 perlica/µl sa 3000ng/ml, 2500ng/ml, 2000ng/ml, 1500ng/ml, 1000ng/ml, 750ng/ml, 500ng/ml, 250ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml ili 10ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde u bunariću tokom prvog perioda vremena (npr., 30 minuta, 60 minuta, 1.5 sata, 2 sata, 2.5 sata ili 3 sata); (c) dodavanje obeleženog GITRL-a (npr., humanog GITRL-PE) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od 0.5nM obeleženog GITRL-a i približno 20 perlica/µl, i inkubiranje tokom drugog perioda vremena (npr., 30 minuta, 1 sata, 1.5 sata, 2 sata, 2.5 sata ili 3 sata); i (d) detekciju obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u, npr., testu niza suspenzija poput Luminex® 200 sistema. U specifičnim tehničkim rešenjima, količina obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u prisustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta je određena u odnosu na količinu obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U određenim tehničkim rešenjima, odsustvo anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta znači da nema prisutnog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u bunariću. U drugim tehničkim rešenjima, odsustvo anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta znači da se izotipsko kontrolno antitelo ne vezuje za GITR prisutan u bunariću. U skladu sa ovim tehničkim rešenjima, količina obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u prisustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta je određena da bude, u nekim tehničkim rešenjima, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ili 60% ili 20 do 70%, 20% do 60%, 30% do 70%, ili 20% do 50% količine obeleženog GITRL-a vezanog za perlice sa vezanim GITR-om u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta.

[0090] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 150nM, 145nM, 140nM, 135nM, 130nM, 125nM, 120nM, 115nM, 110nM, 105nM ili 100nM vezan za GITR (npr., humani GITR) imobilisan na čipu (npr., CM5 senzorskom čipu) inhibira vezivanje 150nM, 145nM, 140nM, 135nM, 130nM, 125nM, 120nM, 115nM, 110nM, 105nM ili 100nM GITRL (npr., nekovalentno vezanog trimera humanog GITRL-a) za GITR imobilisan na čipu za manje od 60%, manje od 55%, manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%, manje od 35%, manje od 30%, manje od 25%, manje od 20% ili manje od 15%. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde u koncentraciji od 125nM vezan za GITR (npr., humani GITR) imobilisan na čipu (npr., CM5 senzorskom čipu) inhibira vezivanje 125nM GITRL-a (npr., nekovalentno vezanog trimera humanog GITRL-a) za GITR imobilisan na čipu za manje od 60%, manje od 55%, manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%, manje od 35%, manje od 30%, manje od 25%, manje od 20% ili manje od 15%.

[0091] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa konstantom brzine disocijacije (koff) od 8.5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 1 x 10<-3>s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-4>s<-1>ili manje, 5 x10<-4>s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-4>s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-4>s<-1>ili manje, 1 x 10<-4>s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 1 x 10<-5->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-6->s<-1>ili manje, 5 x10<-6->s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-6->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-6->s<-1>ili manje, 1 x 10<-6->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-7->s<-1>ili manje, 5 x 10<-7->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-7->s<-1>ili manje, 1 x 10<-7->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-8->s<-1>ili manje, 5 x 10<-8->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-8->s<-1>ili manje, 1 x 10<-8->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-9->s<-1>ili manje, 5 x 10<-9>s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-9->s<-1>ili manje, ili 1 x 10<-9->s<-1>ili manje. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa koffod između 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-9->s<-1>, 8.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-9->s<-1>, 5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-9->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-8->s<-1>, 5 x 10<-5>s<-1>do 1 x 10<-8->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-7->s<-1>, 5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-7->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 5 x 10<-6->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-5->s<-1>, 8.5 x 10<-3>s<-1>do 1 x 10<-4>s<-1>, 5 x 10<-3>s<-1>do 2.5 x 10<-4>s<-1>, 8.5 x 10<-3>s<-1>, do 1 x 10<-5>s<-1>, 8.5 x 10<-5->s<-1>do 5 x 10<-5->s<-1>. U određenim tehničkim rešenjima, koffje određena primenjujući monovalentno antitelo, poput Fab fragmenta, kao što je mereno, npr., BIAcore® površinskom plazmonskom tehnologijom. U drugim tehničkim rešenjima, koffje određena primenjujući bivalentno antitelo kao što je mereno, npr., BIAcore® površinskom plazmonskom tehnologijom. U posebnom tehničkom rešenju, koffje određena primenjujući test opisan u odeljku 6, dole.

[0092] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa konstantom brzine asocijacije (kon) od najmanje 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 2.5 x 10<5>M<-1>S<-1>, najmanje 3.5 x 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<5>M<-1>S<-1>, najmanje 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 2.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 3.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 10<8>M<-1>s<-1>, najmanje 510<8>M<-1>s<-1>ili najmanje 10<9>M<-1>s<-1>. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa konod između 1 x 10<5>m<-1>s<-1>do 5 x 10<5>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>m<-1>s<-1>do 1 x 10<6>M<-1>s<-1>, 3.5 x 10<5>m<-1>s<-1>do 2.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, 3.5 x 10<5>m<-1>s<-1>do 3.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>m-<1>s<-1>do 5 x 10<6>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<->do 1 x 10<7>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 5 x 10<7>M<-1>S<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 10<8>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 1 x 10<9>m<-1>s<-1>, 1 x 10<6>M<-1>s<->do 1 x 10<7>M<-1>s<-1>, 1 x 10<6>m<-1>s<-1>do 1 x 10<8>M<-1>s<-1>, 1 x 10<6>m<-1>s<-1>do 1 x 10<9>M<-1>s<-1>, 1 x 10<7>m<-1>s<-1>do 1 x 10<8>M<-1>s<-1>, 1 x 10<7>m<-1>s<-1>do 1 x 10<9>M<-1>s<-1>, 1 x 10<8>m<-1>s<-1>do 1 x 10<9>M<-1>s<-1>, U određenim tehničkim rešenjima, konje određena primenjujući monovalentno antitelo, poput Fab fragmenta, kao što je mereno, npr., BIAcore<®>površinskom plazmonskom tehnologijom. U drugim tehničkim rešenjima, konje određena primenjujući bivalentno antitelo kao što je mereno, npr., BIAcore<®>površinskom plazmonskom tehnologijom. U posebnom tehničkom rešenju, konje određena primenjujući test opisan u odeljku 6, dole.

[0093] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa KDod manje od 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM, ili 0.1 nM. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa KDod oko 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM, ili 0.1 nM. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde se vezuje za GITR (npr., humani GITR) sa KDod 7 nM do 2 nM, 5 nM do 3 nM, 5 nM do 1 nM, 4 nM do 3 nM, 4 nM do 2 nM, 3 nM do 2 nM, 3 nM do 1 nM, 2 nM do 1 nM, 3 nM do 0.1 nM, 2 nM do 0.1 nM, 1 nM do 0.1 nM, ili 0.5 nM do 0.1 nM. U određenim tehničkim rešenjima, KDje računat kao količnik koff/kon, i koni koffsu određeni primenjujući monovalentno antitelo, poput Fab fragmenta, kao što je mereno, npr., BIAcore<®>površinskom plazmonskom tehnologijom. U drugim tehničkim rešenjima, KDje računat kao količnik koff/kon, i koni koffsu određeni primenjujući bivalentno antitelo, poput Fab fragmenta, kao što je mereno, npr., BIAcore® površinskom plazmonskom tehnologijom. U specifičnom tehničkom rešenju, KDje određena kao što je prikazano u primerima u odeljku 6, dole (npr., Primer 2).

[0094] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži:

(a) VL CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence KSSQSX1X2X3X4X5X6X7KX8YLX9(SEQ ID NO: 4), pri čemu:

X1je L, A, V, I, P, F ili M

X2je L, A, V, I, P, F, M ili S

X3je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X4je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X5je G, N, Q, S, T, C, W, Y ili A

X6je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X7je Q, G, N, S, T, C, W, Y ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili A; i/ili

(b) VL CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1ASTRX2X3(SEQ ID NO: 5), pri čemu:

X1je W, G, N, Q, S, T, C, Y, F, H ili A

X2je E, D ili A

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A; i/ili

(c) VL CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence QX1X2YX3X4PYT (SEQ ID NO: 6), pri čemu:

X1je N, G, Q, S, T, C, W ili Y

X2je D, E ili Y

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, L, ili A.

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, ili tri VL CDR-a pomenuta iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VL CDR-a jednog od antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu Tabele 1, na primer, svi VL CDR-ovi su iz antitela 231-32-15). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione opisane ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione (FR-ove) od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., jedan, dva, tri, ili četiri okvirna regiona u jednom redu Tabele 3).

1

[0095] U drugom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži:

(a) VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1YX2MX3(SEQ ID NO: 1), pri čemu

X1je D, E, G ili A

X2je A, V, L, I, P, F, M ili Y

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F ili H; i/ili

X1je V, A, L, I, P, F, M ili T

X2je R, K, H, Q ili A

X3je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili P

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, ili A

X5je D, E, G ili A

X6je V, A, L, I, P, F, M ili T

X7je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I, P ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je K, R, H, Q ili A

X10je D, E, G ili A; i/ili

X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S

X2je A, ili D

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V.

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH CDR1 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 jednog od antitela u

2

Tabeli 2. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu Tabele 2, na primer, svi od VH CDR-ova su iz antitela 231-32-15). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione opisane ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona u jednom redu Tabele 4).

Tabela 1. VL CDR Aminokiselinske sekvence

Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:) VL CDR2 VL CDR3 (SEQ

4

Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:) VL CDR2 VL CDR3 (SEQ

1

Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:) VL CDR2 VL CDR3 (SEQ

2

Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:) VL CDR2 VL CDR3 (SEQ

4

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

1 VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

2

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

4

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

1

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

2

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

4

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

1

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID

NO:) NO:) ID NO:)

NO:

1 1

Tabela 4. VH FR Aminokiselinske sekvence<4>

12

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

14

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

11

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

11

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

11

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

11

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

11

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

11

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

11

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ

<4>VH okvirni regioni opisani u Tabeli 4 su određeni na osnovu granica sistema numerisanja prema Kabatu za CDR-ove. Drugim rečima, VH CDR-ovi su određeni prema Kabatu i okvirni regioni su aminokiselinski ostaci koji okružuju CDR-ove u varijabilnom regionu u formatu FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.

[0096] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži:

X1je L, A, V, I, P, F ili M

X2je L, A, V, I, P, F, M ili S

12

X3je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X4je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X5je G, N, Q, S, T, C, W, Y ili A

X6je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X7je Q, G, N, S, T, C, W, Y ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili A; i/ili

X1je W, G, N, Q, S, T, C, Y, F, H ili A

X2je E, D ili A

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A; i/ili

X1je N, G, Q, S, T, C, W ili Y

X2je D, E ili Y

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, L, ili A.

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, ili tri VL CDR-a pomenuta iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 jednog od antitela u Tabeli 5. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 jednog od antitela u Tabeli 5. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 jednog od antitela u Tabeli 5. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VL CDR-a jednog od antitela u Tabeli 5 (npr., VL CDR-ove u jednom redu Tabele 5, na primer, svi VL CDR-ovi su iz antitela 231-32-15). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione opisane ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione (FRe) antitela prikazanog u Tabeli 7 (npr., jedan, dva, tri, ili četiri okvirna regiona u jednom redu Tabele 7).

[0097] U drugom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži:

X1je D, E, G ili A

X2je A, V, L, I, P, F, M ili Y

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F ili H; i/ili

X1je V, A, L, I, P, F, M ili T

X2je R, K, H, Q ili A

X3je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili P

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, ili A

X5je D, E, G ili A

X6je V, A, L, I, P, F, M ili T

X7je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I, P ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je K, R, H, Q ili A

X10je D, E, G ili A; i/ili

X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S

X2je A, ili D

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V.

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH CDR1 jednog od antitela u Tabeli 6. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 jednog od antitela u Tabeli 6. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 jednog od antitela u Tabeli 6. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 6 (npr., VH CDR-ove u jednom redu Tabele 6, na primer, svi od VH CDR-ova su iz antitela 231-32-15). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione opisane ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 8 (npr., jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona u jednom redu Tabele 8).

Tabela 5. VL CDR Aminokiselinske sekvence

12

VL CDR2 VL CDR3 (SEQ Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:)

12

VL CDR2 VL CDR3 (SEQ Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:)

12

VL CDR2 VL CDR3 (SEQ Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:)

12

VL CDR2 VL CDR3 (SEQ Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:)

12

VL CDR2 VL CDR3 (SEQ Antitelo VL CDR1 (SEQ ID NO:)

12

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

1

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

1 1

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

1 2

1 VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

1 4

VH CDR1 VH CDR3 (SEQ Antitelo VH CDR2 (SEQ ID NO:)

(SEQ ID NO:) ID NO:)

1

Tabela 7. VL FR Aminokiselinske sekvence<3>

1

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

1

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

1

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

1

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

14

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

14

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

14

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

14

VL FR2

VL FR1 (SEQ ID VL FR4 (SEQ Antitelo (SEQ ID VL FR3 (SEQ ID NO:)

ID

<3>VL okvirni regioni opisani u Tabeli 7 su određeni zasnovano na granicama sistema numerisanja prema Kabatu za CDR-ove. Drugim rečima, VL CDR-ovi su određeni prema Kabatu i okvirni regioni su aminokiselinski ostaci koji okružuju CDR-ove u varijabilnom regionu u formatu FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.

14

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

14

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

14

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

1 1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

1 2

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

1 4

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

1

VH FR2

VHFR1 (SEQ ID VH FR3 (SEQ ID VH FR4 (SEQ ID

VH okvirni regioni opisani u Tabeli 8 su određeni zasnovano na granicama sistema numerisanja prema Kabatu za CDR-ove. Drugim rečima, VH CDR-ovi su određeni prema Kabatu i okvirni regioni su aminokiselinski ostaci koji okružuju CDR-ove u varijabilnom regionu u formatu FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.

[0098] U drugom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži:

X1je L, A, V, I, P, FiliM

X2je L, A, V, I, P, F, M ili S

X3je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X4je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X5je G, N, Q, S, T, C, W, Y ili A

1

X6je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X7je Q, G, N, S, T, C, W, Y ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili A; i/ili

X1je W, G, N, Q, S, T, C, Y, F, H ili A

X2je E, D ili A

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A; i/ili

X1je N, G, Q, S, T, C, W ili Y

X2je D, E ili Y

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, L, ili A; i/ili

(d) VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1YX2MX3(SEQ ID NO: 1), pri čemu

X1je D, E, G ili A

X2je A, V, L, I, P, F, M ili Y

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F ili H; i/ili

(e) VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1IX2X3X4SGX5X6X7YX8QKFX9X10(SEQ ID NO: 2), pri čemu

X1je V, A, L, I, P, F, M ili T

X2je R, K, H, Q ili A

X3je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili P

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, ili A

X5je D, E, G ili A

X6je V, A, L, I, P, F, M ili T

1

X7je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I, P ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je K, R, H, Q ili A

X10je D, E, G ili A; i/ili

(f) VH CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence SGTVRGX1X2X3(SEQ ID NO: 3), pri čemu

X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S

X2je A, ili D

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V.

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili svih šest od CDR-ova iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR1 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 jednog od antitela u Tabeli 2. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu Tabele 2, na primer, svi od VH CDR-ova su iz antitela 231-32-15). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VL CDR-a jednog od antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu Tabele 1, na primer, svi od VLCDR-ovi su iz antitela 231-32-15).

[0099] U drugom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca i varijabilni region (VH) teškog lanca, pri čemu

(i) VL sadrži:

1

X1je L, A, V, I, P, F ili M

X2je L, A, V, I, P, F, M ili S

X3je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X4je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X5je G, N, Q, S, T, C, W, Y ili A

X6je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X7je Q, G, N, S, T, C, W, Y ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili A; i/ili

X1je W, G, N, Q, S, T, C, Y, F, H ili A

X2je E, D ili A

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A; i/ili

X1je N, G, Q, S, T, C, W ili Y

X2je D, E ili Y

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, L, ili A; i

(ii) VH sadrži:

X1je D, E, G ili A

X2je A, V, L, I, P, F, M ili Y

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F ili H; i/ili

1

X1je V, A, L, I, P, F, M ili T

X2je R, K, H, Q ili A

X3je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili P

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, ili A

X5je D, E, G ili A

X6je V, A, L, I, P, F, M ili T

X7je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I, P ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je K, R, H, Q ili A

X10je D, E, G ili A; i/ili

X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S

X2je A, ili D

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V.

U specifičnim aspektima, VL sadrži dva ili sva tri od VL CDR-a iznad i/ili VH sadrži dva ili sva tri od VH CDR-a iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR1 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 jednog od antitela u Tabeli 2. U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu Tabele 2). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži

1 1

jedan, dva ili sva tri od VL CDR-a jednog od antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu u Tabeli 1).

[0100] U drugom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži:

(a) VL CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence KSSQSLLNSX1NQKNYLX2(SEQ ID NO: 10), pri čemu

X1je G ili S

X2je T ili S; i/ili

(b) VL CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence WASTRES (SEQ ID NO: 11); i/ili

(c) VL CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence QNX1YSX2PYT (SEQ ID NO: 12), pri čemu

X1je D ili E

X2je Y, F ili S.

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, ili tri VL CDR-a pomenuta iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VL CDR-a jednog od antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu Tabele 1). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione opisane ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione (FR-e) od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., jedan, dva, tri, ili četiri okvirna regiona u jednom redu Tabele 3).

[0101] U drugom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži:

1 2

(a) VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1YX2MX3(SEQ ID NO: 7), pri čemu

X1je D, E ili G

X2je A ili V

X3je Y ili H; i/ili

X1je V ili L

X2je R, K ili Q

X3je Y ili F

X4je D, E ili G

X5je V ili L

X6je T ili S

X7je K, R ili Q

X8je D, E ili G; i/ili

(c) VH CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence SGTVRGFAY (SEQ ID NO: 9).

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH CDR1 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 jednog od antitela u Tabeli 2. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu u Tabeli 2). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione opisane ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabelama 4 (npr., jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona u jednom redu Tabele 4).

1

[0102] U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži:

X1je G ili S

X2je T ili S; i/ili

X1je D ili E

X2je Y, F ili S.

(d) VH CDR1 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1YX2MX3(SEQ ID NO: 7), pri čemu

X1je D, E ili G

X2je A ili V

X3je Y ili H; i/ili

(e) VH CDR2 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence X1IX2TX3SGX4X5X6YNQKFX7X8(SEQ ID NO: 8), pri čemu

X1je V ili L

X2je R, K ili Q

X3je Y ili F

X4je D, E ili G

X5je V ili L

X6je T ili S

X7je K, R ili Q

X8je D, E ili G; i/ili

1 4

(f) VH CDR3 koji sadrži, sastoji se od, ili se sastoji suštinski od aminokiselinske sekvence SGTVRGFAY (SEQ ID NO: 9).

U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili svih šest od CDR-ova iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR1 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR1 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 jednog od antitela u Tabeli 2. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu u Tabeli 2). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VL CDR-a jednog od antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu u Tabeli 1).

[0103] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca i varijabilni region (VH) teškog lanca, pri čemu

(i) VL sadrži:

X1je G ili S

X2je T ili S; i/ili

X1je D ili E

X2je Y, F ili S; i

1

(ii) VH sadrži:

X1je D, E ili G

X2je A ili V

X3je Y ili H; i/ili

X1je V ili L

X2je R, K ili Q

X3je Y ili F

X4je D, E ili G

X5je V ili L

X6je T ili S

X7je K, R ili Q

X8je D, E ili G; i/ili

U specifičnim aspektima, VL sadrži dva ili sva tri od VL CDR-a iznad i/ili VH sadrži dva ili sva tri od VH CDR-a iznad. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VL CDR1 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR2 jednog od antitela u Tabeli 1. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL CDR3 jednog od antitela u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH CDR1 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR2 jednog od antitela u Tabeli 2. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH CDR3 jednog od antitela u Tabeli 2. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VH CDR-a jednog od antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu u Tabeli 2). U određenim aspektima, antitelo ili

1

njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva ili sva tri od VL CDR-a jednog od antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu u Tabeli 1).

[0104] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca i varijabilni region (VH) teškog lanca, pri čemu

(i) VL sadrži:

X1je G ili S

X2je T ili S; i/ili

X1je D ili E

X2je Y, F, ili S; i

(ii) VH sadrži:

X1je D, E ili G

X2je A ili V

X3je Y ili H; i/ili

X1je V ili L

X2je R, K ili Q

1

X3je Y ili F

X4je D, E ili G

X5je V ili L

X6je T ili S

X7je K, R ili Q

X8je D, E ili G; i/ili

X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S

X2je A ili D

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V.

[0105] U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) i sadrži jedan, dva ili tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR-ove) varijabilnog regiona (VL) lakog lanca antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu Tabele 1). U nekim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) i sadrži jedan, dva ili tri CDR-a varijabilnog regiona (VH) teškog lanca bilo kog bilo kog od antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu Tabele 2).

[0106] U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) i sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži jedan, dva ili sva tri VL CDR-a od antitela u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ove u jednom redu Tabele 1). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona opisana ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri od VL okvirna regiona (FR-a) prikazana u Tabeli 3 (npr., jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona u jednom redu u Tabeli 3).

[0107] U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) i sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži jedan, dva ili sva tri VH CDR-a antitela u Tabeli 2 (npr., VH CDR-ove u jednom redu Tabele 2). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona opisana ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili

1

njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona (FR-e) prikazane u Tabeli 4 (npr., jedan, dva, tri, ili četiri okvirna regiona u jednom redu u Tabeli 4).

[0108] U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo ili njegov fragment koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) i sadrži CDR-ove varijabilnog regiona (VL) lakog lanca i CDR-ove varijabilnog regiona (VH) teškog lanca bilo kog od antitela Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, na primer kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (npr., VH CDR-i i VL CDR-i u istom redu su svi iz istog antitela kao što je naznačeno nazivom antitela u prvoj koloni Tabela 1 i 2, na primer, VL CDR-i i VH CDR-i u prvom redu Tabela l i 2 redomsvi iz antitela 231-32-15). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione opisane ovde. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione (FR-ove) i VH okvirne regione prikazane u Tabelama 3 i 4 (npr., VL FR-i i VH FR-i su svi iz istog antitela).

[0109] U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 kao što su prikazani u Tabeli 1, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 bilo kog od antitela Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, (npr., VL CDR-i su u jednom redu Tabele 1). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., jedan, dva, tri, ili četiri okvirna regiona u jednom redu u Tabeli 3). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 204 ili SEQ ID NO: 205. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% identična sa jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, i SEQ ID NOs: 400-518. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100%

1

identična sa jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 519. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni okvirni region lakog lanca koji je ili je izveden iz aminokiselinske sekvence koja je kodirana humanim genom, pri čemu aminokiselinska sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od IGKV4-1<∗>01 (SEQ ID NO: 607) i IGKV3-7<∗>02 (SEQ ID NO: 608). U specifičnim aspektima, varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence ali za prisustvo do 10 aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija, poželjno do 10 aminokiselinskih supstitucija. U posebnom aspektu, varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka koji su supstituisani za aminokiselinu nađenu na analognom položaju u odgovarajućem ne-humanom varijabilnom okvirnom regionu lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 607 ili SEQ ID NO: 608, pri čemu najmanje jedna aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 607 ili SEQ ID NO: 608 je supstituisana aminokiselinom u analognom položaju u odgovarajućem nehumanom varijabilnom okvirnom regionu lakog lanca. U specifičnom aspektu, aminokiselinska supstitucija je na aminokiselinskom položaju 87, pri čemu aminokiselinski položaj je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu. U posebnim aspektima, aminokiselinska supstitucija je 87H, pri čemu aminokiselinski položaj je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu.

[0110] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od Hum231#1, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od Hum231#1 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 16, 17, i 18, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od Hum231#1).

[0111] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od Hum231#2, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od Hum231#2 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 16, 17, i 18, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment

1

dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od Hum231#2).

[0112] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl964, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl964 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 101, 105, i 106, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1964).

[0113] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od A pab1965, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1965 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 102, 105, i 107, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1965).

[0114] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1966, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1966 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 102, 105, i 107, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1966).

[0115] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl967, na primer,

1 1

VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl967 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 103, 105, i 108, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1967).

[0116] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl968, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl968 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 101, 105, i 107, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1968).

[0117] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl969, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl969 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 103, 105, i 109, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1969).

[0118] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1970, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1970 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 101, 105, i 109, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1970).

1 2

[0119] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1971, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl971 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 103, 105, i 107, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab 1971).

[0120] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1972, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1972 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 104, 105, i 107, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1972).

[0121] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1973, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1973 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 103, 105, i 107, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1973).

[0122] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl975, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl975 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 102, 105, i 107, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog

1

lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1975).

[0123] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl976, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl976 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 101, 105, i 107 , redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1976).

[0124] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl977, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl977 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 103, 105, i 107 , redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1977).

[0125] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl979, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl979 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 102, 105, i 107 , redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pabl979).

[0126] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl980, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl980 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 101, 105, i 107 , redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela

1 4

primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1980).

[0127] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl981, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pabl981 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 103, 105, i 107 , redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1981).

[0128] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1983, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab1983 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 102, 105, i 107 , redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab1983).

[0129] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab2159, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab2159 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 102, 105, i 109, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab2159).U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab2160, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab2160 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 102, 105, i

1

107 , redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab2160).

[0130] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab2161, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 od pab2161 kao što je prikazano u Tabeli 1 (SEQ ID NOS: 103, 105, i 109, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz varijabilnekapa podfamilije humanog lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 3 (npr., okvirne regione od pab2161).

[0131] U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 kao što je prikazano u Tabeli 2, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, (npr., VH CDR-i u jednom redu u Tabeli 2). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., jedan, dva, tri, ili četiri okvirna regiona u jednom redu u Tabeli 4). U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona teškog lanca, SEQ ID NO: 203. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži jedan, dva, tri, ili četiri okvirna regiona sekvence, varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona teškog lanca, odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 206, i SEQ ID NOS: 215 do 389. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži varijabilni okvirni region teškog lanca koji je ili je izveden iz aminokiselinske sekvence koja je kodirana humanim genom, pri čemu aminokiselinska sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od IGHV1-2<∗>02 (SEQ ID NO: 601), IGHV1-3<∗>01

1

(SEQ ID NO: 602), IGHV1-46<∗>01 (SEQ ID NO: 603), IGHV1-18<∗>01 (SEQ ID NO: 604), IGHV1-69<∗>01 (SEQ ID NO: 605), i IGHV7-4-1<∗>02 (SEQ ID NO: 606). U specifičnim aspektima, varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence ali za prisustvo do 10 aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija, poželjno do 10 aminokiselinskih supstitucija. U posebnom aspektu, varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka koji su supstituisani aminokiselinom nađenom na analognom položaju u odgovarajućem ne-humanom varijabilnom okvirnom regionu teškog lanca. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 601, pri čemu najmanje jedna aminokiselina aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 601 je supstituisana aminokiselinom na analognom položaju u odgovarajućem ne-humanom varijabilnom okvirnom regionu teškog lanca. U određenim aspektima, aminokiselinska supstitucija je na aminokiselinskom položaju odabranom iz grupe koja se sastoji od 24, 48, 67, 71, 73, i 94, pri čemu aminokiselinski položaj svakog člana grupe je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu. U specifičnim aspektima, aminokiselinska supstitucija odabrana iz grupe koja se sastoji od 24G, 48I, 67A, 71V, 73K, i 94K, pri čemu aminokiselinski položaj svakog člana grupe je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu.

[0132] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#1, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#1 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 13, 14, i 15, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od Hum231#1).

[0133] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#2, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#2 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 13, 14, i 15, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela

1

primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od Hum231#2).

[0134] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1964, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1964 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 19, 24, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1964).

[0135] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1965, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1965 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 19, 25, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1965).

[0136] U posebnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1966, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1966 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 19, 26, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigenvezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili

1

njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1966).

[0137] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1967, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1967 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 20, 27, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1967).

[0138] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1968, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1968 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 21, 28, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1968).

[0139] U posebnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1969, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1969 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigenvezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1969).

[0140] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1970, na

1

primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1970 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 21, 24, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1970).

[0141] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1971, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pabl971 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 21, 177, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1971).

[0142] U posebnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1972, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1972 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 23, 31, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigenvezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1972).

[0143] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1973, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1973 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 19, 32, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva,

1

tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab 1973).

[0144] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1975, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1975 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1975).

[0145] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1976, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1976 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1976).

[0146] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1977, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1977 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1977).

1 1

[0147] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1979, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1979 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 33, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1979).

[0148] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pabl980, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pabl980 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 33, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1980).

[0149] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1981, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1981 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 33, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1981).

[0150] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1983, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1983 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 19, 24, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment

1 2

dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab1983).

[0151] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2159, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2159 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 19, 144, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab2159).

[0152] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2160, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2160 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 119, 162, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab2160).

[0153] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2161, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2161 kao što je prikazano u Tabeli 2 (SEQ ID NOS: 22, 121, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U specifičnim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz varijabilne podfamilije humanog teškog lanca (npr., jedne od podfamilija 1 do 7). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući

1

fragment sadrži VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabeli 4 (npr., okvirne regione od pab2161).

[0154] U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (i) varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 kao što je prikazano u Tabeli 2, na primer, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, (npr. VH CDR-ovi u jednom redu u Tabeli 2), i (ii) varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 kao što je prikazano u Tabeli 1, na primer, VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, (npr., VL CDR-ove u jednom redu u Tabeli 1). U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanog u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od jednog antitela kako je naznačeno njegovim nazivom, na primer, svi FR-i su iz Hum231#1 ili Hum231#2).

[0155] U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona teškog lanca, koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sa jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence, varijabilnog regiona teškog lanca, odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 206, i SEQ ID NOS: 215 do 389. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži varijabilni okvirni region teškog lanca koji je ili je izveden iz aminokiselinske sekvence koja je kodirana humanim genom, pri čemu aminokiselinska sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od IGHV1-2<∗>02 (SEQ ID NO: 601), IGHV1-3<∗>01 (SEQ ID NO: 602), IGHV1-46<∗>01 (SEQ ID NO: 603), IGHV1-18<∗>01 (SEQ ID NO: 604), IGHV1-69<∗>01 (SEQ ID NO: 605), i IGHV7-4-1<∗>02 (SEQ ID NO: 606). U specifičnim aspektima, varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence ali za prisustvo do 10 aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija, poželjno do 10 aminokiselinskih supstitucija. U posebnom aspektu, varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka koji su supstituisani aminokiselinom nađenom

1 4

na analognom položaju u odgovarajućem ne-humanom varijabilnom okvirnom regionu teškog lanca. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži varijabilni okvirni region teškog lanca koji je izveden iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 601, pri čemu najmanje jedna aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 601 je supstituisana aminokiselinom u analognom položaju u odgovarajućem nehumanom varijabilnom okvirnom regionu lakog lanca. U određenim aspektima, aminokiselinska supstitucija je na aminokiselinskom položaju odabranom iz grupe koja se sastoji od 24, 48, 67, 71, 73, i 94, pri čemu aminokiselinski položaj svakog člana grupe je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu. U specifičnim aspektima, aminokiselinska supstitucija je odabrana iz grupe koja se sastoji od 24G, 48I, 67A, 71V, 73K, i 94K, pri čemu aminokiselinski položaj svakog člana grupe je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu.

[0156] U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži VL okvirne regione od antitela prikazanih u Tabeli 3. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 204 ili SEQ ID NO: 205. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% identična sa jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, i SEQ ID NOs: 400-518. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% identična sa jedan, dva, tri ili četiri od okvirnih regiona sekvence varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 519. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži varijabilni okvirni region lakog lanca koji je ili je izveden iz aminokiselinske sekvence koja je kodirana humanim genom, pri čemu aminokiselinska sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od IGKV4-1<∗>01 (SEQ ID NO: 607) i IGKV3-7<∗>02 (SEQ ID NO: 608). U specifičnim aspektima, varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence ali za prisustvo do 10 aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija, poželjno do 10 aminokiselinskih supstitucija. U posebnom aspektu, varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz pomenute aminokiselinske sekvence se sastoji od pomenute aminokiselinske sekvence sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka koji su supstituisani za aminokiselinu nađenu na analognom položaju u odgovarajućem ne-

1

humanom varijabilnom okvirnom regionu lakog lanca. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži varijabilni okvirni region lakog lanca koji je izveden iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 607 ili SEQ ID NO: 608, pri čemu najmanje jedna aminokiselina aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 607 ili SEQ ID NO: 608 sa aminokiselinom na analognom položaju u odgovarajućem ne-humanom varijabilnom okvirnom regionu lakog lanca. U specifičnom aspektu, aminokiselinska supstitucija je na aminokiselinskom položaju 87, pri čemu aminokiselinski položaj je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu. U posebnim aspektima, aminokiselinska supstitucija je 87H, pri čemu aminokiselinski položaj je naznačen u skladu sa numerisanjem prema Kabatu.

[0157] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#1, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#1 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 16, 17, 18, 13, 14, i 15, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od Hum231#1).

[0158] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#2, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od Hum231#2 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 16, 17, 18, 13, 14, i 15, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione jednog antitela kako je naznačeno njegovim nazivom, na primer, okvirne regione od Hum231#1 ili Hum231#2).

[0159] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1964, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1964 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 101, 105, 106,

1

19, 24, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1964).

[0160] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1965, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1965 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 102, 105, 107, 19, 25, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1965).

[0161] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1966, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1966 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 102, 105, 107, 19, 26, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1966).

[0162] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1967, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1967 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 103, 105, 108, 20, 27, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH

1

okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1967).

[0163] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1968, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1968 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 101, 105, 107, 21, 28, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1968).

[0164] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1969, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1969 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 103, 105, 109, 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1969).

[0165] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1970, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1970 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 101, 105, 109, 21, 24, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1970).

[0166] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2,

1

i VH CDR3 od pab1971, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1971 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 103, 105, 107, 21, 177, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1971).

[0167] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1972, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1972 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 104, 105, 107, 23, 31, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1972).

[0168] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pabl973, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1973 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 103, 105, 107, 19, 32, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1973).

[0169] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1975, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1975 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 102, 105, 107, 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i

1

jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1975).

[0170] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pabl976, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1976 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 101, 105, 107, 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1976).

[0171] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1977, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1977 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 103, 105, 107, 22, 29, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1977).

[0172] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pabl979, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1979 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 102, 105, 107, 22, 33, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1979).

1

[0173] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1980, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1980 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 101, 105, 107, 22, 33, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1980).

[0174] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1981, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1981 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 103, 105, 107, 22, 33, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1981).

[0175] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1983, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab1983 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 102, 105, 107, 19, 24, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab1983).

[0176] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2159, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2159 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 102, 105, 109,

1 1

19, 144, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab2159).

[0177] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2160, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2160 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 102, 105, 107, 119, 162, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab2160).

[0178] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2161, na primer, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 od pab2161 kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2 (SEQ ID NOS: 103, 105, 109, 22, 121, i 34, redom). U određenim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući fragment dalje sadrži jedan, dva, tri ili sva četiri VL okvirna regiona izvedena iz VL humanog ili antitela primata i jedan, dva, tri ili sva četiri VH okvirna regiona izvedena iz VH humanog ili antitela primata. U nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži VL okvirne regione i VH okvirne regione od antitela prikazanih u Tabelama 3 i 4, redom (npr., okvirne regione od pab2161).

[0179] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VL domena od antitela navedenog na Slici 23 ili bilo kog sa Slika 24A-24C (npr., VL domen u jednom redu sa Slike 23 ili bilo koje od Slika 24A-24C). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VL domena od antitela navedenog u Tabeli 17 (npr., VL domen u jednom redu Tabele 17). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 207 (npr.,

1 2

antitelo Hum231#1). Antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) pronalaska sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 208 (npr., antitelo Hum231#2). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 435 (npr., antitelo pab1964). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 437 (npr., antitelo pab1965). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1966). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 441 (npr., antitelo pab1967). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 444 (npr., antitelo pab1968). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 458 (npr., antitelo pab1969). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 459 (npr., antitelo pab1970). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 453 (npr., antitelo pab1971). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 463 (npr., antitelo pab1972). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 519 (npr., antitelo pab1973). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1975). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 444 (npr., antitelo pab1976). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 453 (npr., antitelo pab1977). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1979). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 444 (npr., antitelo pab1980). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 453 (npr., antitelo pab1981). U

1

specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1983). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 408 (npr., antitelo pab2159). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 423 (npr., antitelo pab2160). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 486 (npr., antitelo pab2161).

[0180] U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence VL domena od antitela navedenog na Slici 23 ili bilo kojoj od Slika 24A-24C (npr., VL domen u jednom redu sa Slike 23 ili bilo koje od Slika 24A-24C). U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence VL domena od antitela navedenog u Tabeli 17 (npr., VL domen u jednom redu Tabele 17). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 207 (npr., antitelo Hum231#1). U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 208 (npr., antitelo Hum231#2). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 435 (npr., antitelo pab1964). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 437 (npr., antitelo pab1965). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1966). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 441 (npr., antitelo pab1967). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 444 (npr., antitelo pab1968). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 458 (npr., antitelo pab1969). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr.,

1 4

humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 459 (npr., antitelo pab1970). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 453 (npr., antitelo pab1971). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 463 (npr., antitelo pab1972). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 519 (npr., antitelo pab1973). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1975). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 444 (npr., antitelo pab1976). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 453 (npr., antitelo pab1977). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1979). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 444 (npr., antitelo pab1980). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 453 (npr., antitelo pab1981). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 (npr., antitelo pab1983). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 408 (npr., antitelo pab2159). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 423 (npr., antitelo pab2160). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 486 (npr., antitelo pab2161).

[0181] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH domena od antitela navedenog na Slici 23 ili bilo kojoj od Slika 24A-24C (npr., VH domen u jednom redu

1

na Slici 23 ili bilo kojoj od Slika 24A-24C). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VH domena od antitela navedenog u Tabeli 17 (npr., VH domen u jednom redu u Tabeli 17). Antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) pronalaska sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#1Antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) pronalaska sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#2). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1964). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 251 (npr., antitelo pab1965). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 254 (npr., antitelo pab1966). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 255 (npr., antitelo pab1967). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 259 (npr., antitelo pab1968). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1969). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 277 (npr., antitelo pab1970). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 280 (npr., antitelo pab1971). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 284 (npr., antitelo pab1972). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 304 (npr., antitelo pab1973). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1975). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1976). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1977). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo

1

pab1979). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1980). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1981). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1983). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 224 (npr., antitelo pab2159). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 237 (npr., antitelo pab2160). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 315 (npr., antitelo pab2161).

[0182] U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence VH domena od antitela navedenog na Slici 23 ili bilo kojoj od Slika 24A-24C (npr., VH domen u jednom redu na Slici 23 ili bilo kojoj od Slika 24A-24C). U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence VH domena od antitela navedenog u Tabeli 17 (npr., VH domen u jednom redu u Tabeli 17). Antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) pronalaska sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#1). Antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) pronalaska sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#2). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1964). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 251 (npr., antitelo pab1965). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 254 (npr., antitelo pab1966). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 255 (npr., antitelo pab1967). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR)

1

sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 259 (npr., antitelo pab1968). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1969). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 277 (npr., antitelo pab1970). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 280 (npr., antitelo pab1971). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 284 (npr., antitelo pab1972). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 304 (npr., antitelo pab1973). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1975). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1976). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1977). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1979). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1980). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1981). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1983). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 224 (npr., antitelo pab2159). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 237 (npr., antitelo pab2160). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za

1

GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 315 (npr., antitelo pab2161).

[0183] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen i VL domen, pri čemu VH domen i VL domen sadrže aminokiselinsku sekvencu VH domena i VL domena od antitela navedenog na Slici 23 ili bilo kojoj od Slika 24A-24C (npr., VH domen i VL domen u jednom redu sa Slike 23 ili bilo koje od Slika 24A-24C). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen i VL domen, pri čemu VH domen i VL domen sadrže aminokiselinsku sekvencu VH domena i VL domena od antitela navedenog u Tabeli 17 (npr., VH domen i VL domen u jednom redu Tabele 17). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 207 i VH domen koja sadrži SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#1). Antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) pronalaska sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 208 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#2). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 435 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1964). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 437 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 251 (npr., antitelo pab1965). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 254 (npr., antitelo pab1966). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 441 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 255 (npr., antitelo pab1967). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 444 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 259 (npr., antitelo pab1968). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 458 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1969). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 459 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 277 (npr., antitelo pab1970). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 453 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 280 (npr., antitelo pab1971). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se

1

specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 463 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 284 (npr., antitelo pab1972). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 519 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 304 (npr., antitelo pab1973). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1975). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 444 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1976). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 453 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1977). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1979). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 444 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1980). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 453 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1981). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 440 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1983). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 408 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 224 (npr., antitelo pab2159). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 423 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 237 (npr., antitelo pab2160). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen koji sadrži SEQ ID NO: 486 i VH domen koji sadrži SEQ ID NO: 315 (npr., antitelo pab2161).

[0184] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen i VL domen, pri čemu VH domen i VL domen se sastoje od ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence VH domena i VL domena od antitela navedenog na Slici 23 ili bilo kojoj od Slika 24A-24C (npr., VH domen i VL domen u jednom redu sa Slike 23 ili bilo koje od Slika 24A-24C). U određenim aspektima, antitelo ili njegov

2

fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VH domen i VL domen, pri čemu VH domen i VL domen se sastoje od ili se suštinski sastoje od aminokiselinske sekvence VH domena i VL domena od antitela navedenog u Tabeli 17 (npr., VH domen i VL domen u jednom redu Tabele 17). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 207 i VH domen koji se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#1). U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 208 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 206 (npr., antitelo Hum231#2). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 435 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1964). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 437 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 251 (npr., antitelo pab1965). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 254 (npr., antitelo pab1966). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 441 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 255 (npr., antitelo pab1967). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 444 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 259 (npr., antitelo pab1968). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 458 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1969). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 459 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 277 (npr., antitelo pab1970). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se

2 1

specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 453 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 280 (npr., antitelo pab1971). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 463 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 284 (npr., antitelo pab1972). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 519 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 304 (npr., antitelo pab1973). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1975). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 444 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1976). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 453 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 276 (npr., antitelo pab1977). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1979). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 444 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1980). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 453 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 345 (npr., antitelo pab1981). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 440 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 249 (npr., antitelo pab1983). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i

2 2

VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 408 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 224 (npr., antitelo pab2159). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 423 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 237 (npr., antitelo pab2160). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen, pri čemu se VL domen sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 486 i VH domen se sastoji od ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 315 (npr., antitelo pab2161).

[0185] U određenim aspektima, antitelo opisano ovde može biti opisano svojim VL domenom zasebno, ili svojim VH domenom zasebno, ili pomoću svoja 3 VL CDR-a zasebno, ili svoja 3 VH CDR-a zasebno. Videti, na primer, Rader C i sar., (1998) PNAS 95: 8910-8915, koji opisuje humanizaciju mišjeg anti-αvβ3 antitela identifikovanjem komplementarnog lakog lanca ili teškog lanca, redom, iz biblioteke humanog lakog lanca ili teškog lanca, rezultujući varijantama humanizovanog antitela koje imaju afinitete visoke kao ili više od afiniteta originalnog antitela. Videti takođe, Clackson T i sar., (1991) Nature 352: 624-628, koje opisuje postupke proizvodnje antitela koja vezuju specifični antigen primenom specifičnog VL domena (ili VH domena) i skrininga biblioteke za komplementarne varijabilne domene. Pretraga je proizvela 14 novih partnera za specifini VH domen i 13 novih partnera za specifični VL domen, koji su bili jaki veznici, kako je određeno pomoću ELISA. Videti takođe, Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, koje opisuje postupke proizvodnje antitela koja vezuju specifični antigen primenom specifičnog VH domena i skrininga biblioteke (npr., biblioteke humanih VL) za komlementarne VL domene; odabrani VL domeni zapravo bi se mogli koristiti za usmeravanje odabira dodatnih komplementarnih (npr., humanih) VH domena.

[0186] U određenim aspektima, CDR-i antitela mogu da se odrede prema Chothia numeracijskoj shemi, koja se odnosi na mesto imunoglobulinskih strukturnih petlji (videti, npr., Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B i sar., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C i sar., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A i sar., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; i američki patent br.7,709,226). Tipično, kada se primenjuje konvencija numerisanja prema Kabatu, Chothia CDR-H1 petlja je prisutna na aminokiselinama 26 do 32, 33, ili 34 teškog lanca, Chothia CDR-H2 petlja je prisutna na aminokiselinama 52 do 56 teškog lanca, i Chothia CDR-H3 petlja je prisutna na aminokiselinama 95 do 102 teškog lanca, dok Chothia CDR-L1 l petlja je prisutna na aminokiselinama 24 do 34 lakog lanca, Chothia CDR-L2 petlja je prisutna na aminokiselinama

2

50 do 56 lakog lanca, i Chothia CDR-L3 petlja je prisutna na aminokiselinama 89 do 97 lakog lanca. Kraj Chothia CDR-HI petlje kada je numerisan primenom Kabat numeracijske konvencije varira između H32 i H34 zavisno od dužine petlje (ovo je zbog toga što Kabat numeracijska shema postavlja insercije na H35A i H35B; ukoliko ni 35A niti 35B nije prisutno, petlja se završava na 32; ukoliko je samo 35A prisutno, petlja se završava na 33; ukoliko oba i 35A i 35B su prisutna, petlja se završava na 34).

[0187] U određenim aspektima, ovde su obezbeđena antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) i sadrže jedan ili više Chothia VL CDR-a od VL bilo kog od antitela opisanih ovde, (npr., bilo kog od Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161) i/ili jedan ili više Chothia VH CDR-a od VH bilo kog od antitela opisanih ovde (npr., bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161,). U određenim aspektima, antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) sadrže jedan ili više CDR-a, u kojima Chothia i Kabat CDR-i imaju istu aminokiselinsku sekvencu . U određenim aspektima, ovde su obezbeđena antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) i sadrže kombinacije Kabat CDR-a i Chothia CDR-a. U posebnom aspektu, ovde su obezbeđena antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) i sadrže Chothia CDR-e bilo kog od antitela opisanih ovde (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161).

[0188] U određenim aspektima, CDR-i od antitela mogu biti određena prema IMGT numeracijskom sistemu kao što je opisano u Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 i Lefranc M-P i sar., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. Prema IMGT numeracijskoj shemi, VH-CDR1 je na položajima 26 do 35, VH-CDR2 je na položajima 51 do 57, VH-CDR3 je na položajima 93 do 102, VL-CDR1 je na položajima 27 do 32, VL-CDR2 je na položajima 50 do 52, i VL-CDR3 je na položajima 89 do 97. U posebnom aspektu, ovde su obezbeđena antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) i sadrže CDR-e bilo kog od antitela opisanih ovde (npr., bilo kog antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972,

2 4

pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), koji su određeni pomoću IMGT numeracijskog sistema, na primer, kao što je opisano u Lefranc M-P (1999) gore i Lefranc M-P i sar., (1999) gore).

[0189] U određenim aspektima, CDR-i antitela mogu biti određena prema MacCallum RM i sar., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. Videti takođe, npr., Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domens," u inženjeringu antitela, Kontermann i Dübel, eds., poglavlje 31, str. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). U posebnom aspektu, ovde su obezbeđena antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) i sadrže CDR-e bilo kog od antitela opisanih ovde (npr., bilo kog antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), koji su određeni postupkom u MacCallum RM i sar.

[0190] U određenim aspektima, CDR-i od antitela mogu biti određeni prema AbM numeracijskoj shemi, koja se odnosi na AbM hipervarijabilne regione koji predstavljaju kompromis između Kabat CDR-a i Chothia strukturnih petlji, i koriste se od strane Oksfordskog molekularnog AbM softvera za modelovanje antitela (Oxford Molecular Group, Inc.). U posebnom aspektu, ovde su obezbeđena antitela ili njihovi fragmenti koji se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) i sadrže CDR-e bilo kog od antitela opisanih ovde (npr., bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161,), koji su određeni pomoću AbM numeracione sheme.

[0191] U specifičnom aspektu, položaj jednog ili više CDR-a duž VH (npr., CDR1, CDR2, ili CDR3) i/ili VL (npr., CDR1, CDR2, ili CDR3) regiona antitela opisanog ovde može da varira za jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest aminokiselinskih položaja sve dok se imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) održava (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%). Na primer, u jednom aspektu, položaj koji definiše CDR bilo kog antitela opisanog ovde (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161) može da varira pomeranjem N-terminalne i/ili C-terminalne granice CDR-a za jednu, dve, tri, četiri, pet,

2

ili šest aminokiselina, u odnosu na CDR položaj bilo kog od antitela opisanih ovde (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, identifikovanih u, npr., Tabeli 1), sve dok se imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) održava (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%). U drugom aspektu, dužina jednog ili više CDR-a duž VH (npr., CDR1, CDR2, ili CDR3) i/ili VL (npr., CDR1, CDR2, ili CDR3) regiona antitela opisanog ovde može da varira (npr., da bude kraća ili duža) za jednu, dve, tri, četiri, pet, ili više aminokiselina, sve dok se imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) održava (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%).

[0192] U jednom aspektu, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i/ili VH CDR3 opisan ovde može biti jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselina kraći nego jedan ili više CDR-a opisanih ovde (npr., SEQ ID NO: 1-34, 101-109, ili 114-189 ili SEQ ID NO: 35 ili 191-194) sve dok imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) je održano (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%). U drugom aspektu, VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i/ili VH CDR3 opisan ovde može biti jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselina duži nego jedan ili više CDR-a opisanih ovde (npr., SEQ ID NO: 1-34, 101-109, ili 114-189 ili SEQ ID NO: 35 ili 191-194) sve dok imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) je održano (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%). U drugom aspektu, amino terminus od VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i/ili VH CDR3 opisanih ovde može biti produžen za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselina u poređenju sa jednim ili više CDR-a opisanih ovde (npr., SEQ ID NO: 1-34, 101-109, ili 114-189 ili SEQ ID NO: 35 ili 191-194) sve dok imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) je održano (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%). U drugom aspektu, karboksi terminus od VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i/ili VH CDR3 opisanih ovde može biti produžen za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselina u poređenju sa jednim ili više CDR-a opisanih ovde (npr., SEQ ID NO: 1-34, 101-109, ili 114-189 ili SEQ ID NO: 35 ili 191-194) sve dok imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) je održano (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje

2

90%, najmanje 95%). U drugom aspektu, amino terminus od VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i/ili VH CDR3 opisanih ovde može biti skraćen za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselina u poređenju sa jednim ili više CDR-a opisanih ovde (npr., SEQ ID NO: 1-34, 101-109, ili 114-189 ili SEQ ID NO: 35 ili 191-194) sve dok imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) je održano (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%). U jednom aspektu, karboksi terminus od VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, i/ili VH CDR3 opisanih ovde može biti skraćen za jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselina u poređenju sa jednim ili više CDR-a opisanih ovde (npr., SEQ ID NO: 1-34, 101-109, ili 114-189 ili SEQ ID NO: 35 ili 191-194) sve dok imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) je održano (npr., suštinski se održava, na primer, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%). Bilo koji postupak poznat u oblasti može da se primeni da se utvrdi da li imunospecifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR) je održano, na primer, testovi vezivanje i uslovi opisani u odeljku "Primeri" (odeljku 6) ovde su obezbeđeni.

[0193] U specifičnim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo koja sadrži laki lanac i teški lanac antitela, npr., odvojeni laki lanac i teški lanac. S obzirom na laki lanac, u specifičnom tehničkom rešenju, laki lanac antitela opisanog ovde je kapa laki lanac. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, laki lanac antitela opisanog ovde je lambda laki lanac. U još jednom specifičnom tehničkom rešenju, laki lanac antitela opisanog ovde je humani kapa laki lanac ili humani lambda laki lanac. U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR polipeptie (npr., humani GITR) sadrži laki lanac pri čemu aminokiselinska sekvenca VL domena sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, ili 400-518), i pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog kapa lakog lanca. U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR polipeptid (npr., humani GITR) sadrži laki lanac pri čemu aminokiselinska sekvenca VL domena sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., SEQ ID NO: 519), i pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog kapa lakog lanca. U drugom posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje imunospecifično vezuje GITR (npr., humani GITR) sadrži laki lanac pri čemu aminokiselinska sekvenca VL domena može da sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, ili 400-518), i pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog lambda lakog lanca. U drugom posebnom aspektu, antitelo

2

opisano ovde, koje imunospecifično vezuje GITR (npr., humani GITR) sadrži laki lanac pri čemu aminokiselinska sekvenca VL domena može da sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., SEQ ID NO: 519), i pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog lambda lakog lanca. U specifičnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži laki lanac pri čemu aminokiselina VL domena sadrži (SEQ ID NOs: 207 ili 208) i pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog kapa ili lambda lakog lanca. Neograničavajući primeri sekvenci humanog konstantnog regiona su opisani u stanju tehnike, npr., videti američki patent br. 5,693,780 i Kabat EA i sar., (1991) gore.

[0194] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 555, 556, 571-576, i 580. U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 571-576.

[0195] U pogledu na težak lanac, u specifičnom tehničkom rešenju, težak lanac antitela opisanog ovde može biti alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) ili mu (µ) težak lanac. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, težak lanac antitela koje je opisano može da sadrži humani alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) ili mu (µ) težak lanac. U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži teški lanac pri čemu aminokiselinska sekvenca VH domena može da sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., bilo koju od SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389), i pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog gama (γ) teškog lanca. U specifičnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži teški lanac pri čemu aminokiselinska sekvenca VH domena sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 553, 554, 567-570, i 579, i pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži amino kiselinu humanog teškog lanca opisanog ovde ili poznatog u oblasti. U specifičnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži teški lanac pri čemu aminokiselinska sekvenca VH domena sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 581 i 582, i pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži amino kiselinu humanog teškog lanca opisanog ovde ili poznatog u oblasti.

2

Neograničavajući primeri sekvenci humanog konstantnog regiona su opisani u oblasti, npr., videti američki patent br.5,693,780 i Kabat EA i sar., (1991) gore.

[0196] U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 553, 554, 567-570, i 579. U posebnom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 581 i 582. U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment, koji se vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 567-570.

[0197] U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen koji sadrže aminokiselinske sekvence pronalaska, i pri čemu konstantni regioni sadrže aminokiselinske sekvence konstantnih regiona IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY molekula imunoglobulina, ili humanog IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY molekula imunoglobulina. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen koji sadrže aminokiselinske sekvence pronalaska, i pri čemu konstantni regioni sadrže aminokiselinske sekvence konstantnih regiona IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY molekula imunoglobulina, bilo koje klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2), ili bilo koje podklase (npr., IgG2ai IgG2b) molekula imunoglobulina. U posebnom tehničkom rešenju, konstantni regioni sadrže aminokiselinske sekvence konstantnih regiona humanog IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY molekula imunoglobulina, bilo koje klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2), ili bilo koje podklase (npr., IgG2ai IgG2b) molekula imunoglobulina.

[0198] U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL domen i VH domen koji sadrže aminokiselinske sekvence pronalaska, i pri čemu konstantni regioni sadrže aminokiselinske sekvence konstantnih regiona humanog IgG1(npr., alotipovi G1m3, G1m17,1 ili G1m17, 1, 2) ili humanog IgG4. U posebnom tehničkom rešenju, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži VL domen i VH domen koji sadrže aminokiselinske sekvence pronalaska, i pri čemu konstantni regioni sadrže aminokiselinske sekvence konstantnog regiona humanog IgG1(alotip Glm3). Neograničavajući primeri humanih konstantnih regiona su opisani u oblasti, npr., videti Kabat EA i sar., (1991) gore.

2

[0199] U drugom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 555, 556, 571-576, i 580 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 553, 554, 567-570, i 579. U drugom aspektu, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:576 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 581 i 582. U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 555 ili 556 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 554.

[0200] U određenim tehničkim rešenjima, jedna, dve, ili više mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija) je uvedeno u Fc region antitela opisanog ovde ili njegov fragment (npr., CH2 domen (ostaci 231-340 humanog IgG1) i/ili CH3 domen (ostaci 341-447 humanog IgG1) i/ili zglobni region, sa numeracijom prema Kabat numeracijskom sistemu (npr., EU indeks kod Kabat-a)) da se promeni jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, poput polu-života u serumu, fiksacije komplementa, Fc receptorskog vezivanja i/ili antigen-zavisne ćelijske citotoksičnosti.

[0201] U određenim tehničkim rešenjima, jedna, dve, ili više mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija) je uvedeno u zglobni region Fc regiona (CH1 domen) tako da broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu je promenjen (npr., povećan ili smanjen) kao što je opisano u, npr., američkom patentu br. 5,677,425. Broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu CH1 domena može biti promenjen da se, npr., olakša sastavljanje lakog i teškog lanca, ili da se promeni (npr., poveća ili smanji) stabilnost antitela.

[0202] U nekim tehničkim rešenjima, jedna, dve, ili više mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija) je uvedeno u Fc region antitela opisanog ovde ili njegov fragment (npr., CH2 domen (ostatci 231-340 humanog IgG1) i/ili CH3 domen (ostaci 341-447 humanog IgG1) i/ili zglobni region, sa numerisanjem prema Kabat numeracijskom sistemu (npr., EU indeks prema Kabatu)) da se poveća ili smanji afinitet antitela za Fc receptor (npr., aktiviran Fc receptor) na površini efektorske ćelije. Mutacije u Fc regionu antitela ili njegovog fragmenta koje smanjuju ili povećavaju afinitet antitela za Fc receptor i tehnike za uvođenje takvih mutacija u Fc receptor ili njegov fragment su poznati obučenima u oblasti. Primeri mutacija u Fc receptoru antitela koje mogu biti učinjene da se izmeni afinitet antitela za Fc receptor su opisane u, npr., Smith P i sar., (2012) PNAS 109: 6181-6186, američkom patentu br.6,737,056, i međunarodnoj objavi sa brojevima WO 02/060919; WO 98/23289; i WO 97/34631.

21

[0203] U specifičnom tehničkom rešenju, jedna, dve, ili više aminokiselinskih mutacija (tj., supstitucija, insercija ili delecija) je uvedeno u IgG konstantni domen, ili njegov FcRnvezujući fragment (poželjno Fc ili zglob-Fc domenski fragment) da se promeni (npr., smanji ili poveća) polu-život antitela in vivo. Videti, npr., međunarodnu publikaciju sa brojevima WO 02/060919; WO 98/23289; i WO 97/34631; i američke patente sa brojevima 5,869,046, 6,121,022, 6,277,375 i 6,165,745 za primere mutacija koje će promeniti (npr., smanjiti ili povećati) polu-život antitela in vivo. U nekim tehničkim rešenjima, jedna, dve, ili više aminokiselinskih mutacija (tj., supstitucija, insercija ili delecija) je uvedeno u IgG konstantni domen, ili njegov FcRn-vezujući fragment (poželjno Fc ili zglob-Fc domenski fragment) da se smanji polu-život antitela in vivo. U drugim tehničkim rešenjima, jedna, dve, ili više aminokiselinskih mutacija (tj., supstitucija, insercija ili delecija) je uvedeno u IgG konstantni domen, ili njegov FcRn-vezujući fragment (poželjno Fc ili zglob-Fc domenski fragment) da se poveća polu-život antitela in vivo. U specifičnom tehničkom rešenju, antitela mogu imati jednu ili više aminokiselinskih mutacija (npr., supstitucija) u drugom konstantnom (CH2) domenu (ostaci 231-340 humanog IgG1) i/ili trećem konstantnom (CH3) domenu (ostaci 341-447 humanog IgG1), sa numeracijom prema EU indeksu prema Kabatu (Kabat EA i sar., (1991) gore). U specifičnom tehničkom rešenju, konstantni region IgG1antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde sadrži metionin (M) u tirozin (Y) supstituciju na položaju 252, serin (S) u treonin (T) supstituciju na položaju 254, i treonin (T) u glutaminska kiselina (E) supstituciju na položaju 256, numerisano prema EU indeksu kao prema Kabatu. Videti američki patent br. 7,658,921. Pokazano je da ovaj tip mutantnog IgG, označen kao "YTE mutant" prikazuje četvorostruko povećani polu-život u poređenju sa verzijama divljeg tipa istog antitela (videti Dall'Acqua WF i sar., (2006) J Biol Chem 281: 23514-24). U određenim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži IgG konstantni domen koji sadrži jednu, dve, tri ili više aminokiselinskih supstitucija aminokiselinskih ostataka na položajima 251-257, 285-290, 308-314, 385-389, i 428-436, numerisanim prema EU indeksu kao prema Kabatu.

[0204] U daljem tehničkom rešenju, jedna, dve ili više aminokiselinskih supstitucija je uvedeno u Fc region IgG konstantnog domena da se promeni efektorska funkcija(e) antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina odabranih od aminokiselinskih ostataka 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322, numberisanih prema EU indeksu kao prema Kabatu, može biti zamenjeno sa drugačijim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima promenjen afinitet za efektorski ligand ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost roditeljskog antitela. Efektorski ligand prema kome je afinitet promenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa.

Pristup je opisan detaljnije u američkim patentima sa brojevima 5,624,821 i 5,648,260. U nekim tehničkim rešenjima, delecija ili inaktivacija (preko tačkastih mutacija ili drugih načina) domena konstantnog regiona može da smanji Fc receptorsko vezivanje cirkulišućeg antitela time povećavajući tumorsku lokalizaciju. Videti, npr., američki patent sa brojevima 5,585,097 i 8,591,886 za opis mutacija koje deletiraju ili inaktiviraju konstantni domen i time povećavaju tumorsku lokalizaciju. U određenim tehničkim rešenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija može biti uvedeno u Fc region antitela opisanog ovde da se uklone potencijalna mesta glikozilacije na Fc regionu, što može da smanji Fc receptorsko vezivanje (videti, npr., Shields RL i sar., (2001) J Biol Chem 276: 6591-604). U raznim tehničkim rešenjima, jedna ili više od sledećih mutacija u konstantnom regionu antitela opisanog ovde mogu biti izvršene: N297A supstitucija; N297Q supstitucija; L235A supstitucija i L237A supstitucija; L234A supstitucija i L235A supstitucija; E233P supstitucija; L234V supstitucija; L235A supstitucija; C236 delecija; P238A supstitucija; D265A supstitucija; A327Q supstitucija; ili P329A supstitucija, numerisano prema EU indeksu prema Kabatu.

[0205] U specifičnom tehničkom rešenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde sadrži konstantni domen od IgG1sa N297Q ili N297A aminokiselinskom supstitucijom.

[0206] U određenim tehničkim rešenjima, jedna ili više aminokiselina odabranih od aminokiselinskih ostataka 329, 331 i 322 u konstantnom regionu antitela opisanog ovde, numerisanih prema EU indeksu prema Kabatu, može biti zamenjeno sa različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima promenjeno C1q vezivanje i/ili smanjenu ili ukinutu komplement zavisnu citotoksičnost (CDC). Pristup je opisan detaljnije u američkom patentu br. 6,194,551 (Idusogie i sar). U nekim tehničkim rešenjima, jedan ili više aminokiselinskih ostataka na aminokiselinskim položajima 231 do 238 u N-terminalnom regionu CH2 domena antitela opisanog ovde su promenjeni da se time promeni sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je opisan detaljnije u međunarodnoj objavi sa brojem WO 94/29351. U određenim tehničkim rešenjima, Fc region antitela opisanog ovde je modifikovan da poveća sposobnost antitela da posreduje antitelo zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela za Fcγ receptor mutiranjem jedne ili više aminokiselina (npr., uvođenje aminokiselinskih supstitucija) na sledećim položajima: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439, numerisano prema EU indeksu prema Kabatu. Ovaj pristup je opisan dalje u međunarodnoj objavi br. WO 00/42072.

[0207] U određenim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde sadrži konstantni region IgG4antitela i serin na aminokiselinskom ostatku 228 teškog lanca, numerisano prema EU indeksu prema Kabatu, je supstituisan za prolin.

[0208] Antitela sa smanjenim sadržajem fukoze su zabeležena da imaju povećani afinitet za Fc receptore, kao što je, npr., FcyRIIIa. Prema tome, u određenim tehničkim rešenjima, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde imaju smanjeni sadržaj fukoze ili su bez fukoznog sadržaja. Takva antitela mogu biti proizvedena primenom tehnika poznatih stručnjaku u oblasti. Na primer, antitela mogu biti eksprimirana u ćelijama deficijentnim ili kojima nedostaje sposobnost fukozilacije. U specifičnom primeru, ćelijske linije sa nokautom (eng. knockout) oba alela α1,6-fukoziltransferaze mogu biti primenjene da proizvedu antitela sa smanjenim sadržajem fukoze. Potelligent® sistem (Lonza) je primer takvog sistema koji može biti primenjen za proizvodnju antitela sa smanjenim sadržajem fukoze. Alternativno, antitela ili antigen-vezujući fragmenti sa smanjenim sadržajem fukoze ili bez fukoznog sadržaja mogu se proizvesti, npr.: (i) kultivacijom ćelija pod uslovima koji sprečavaju ili smanjuju fukozilaciju; (ii) posttranslacionim uklanjanjem fukoze (npr., fukozidaza enzimom); (iii) post-translacionim dodavanjem željenog ugljenoghidrata, npr., nakon rekombinantnog eksprimiranja neglikozilovanog glikoproteina; ili (iv) prečišćavanjem glikoproteina tako da se odaberu antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji nisu fukozilovani. Videti, npr., Longmore GD & Schachter H (1982) Carbohydr Res 100: 365-92 i Imai-Nishiya H i sar., (2007) BMC Biotechnol. 7: 84 za postupke proizvodnje antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata bez fukoznog sadržaja ili sa smanjenim sadržajem fukoze.

[0209] U određenim tehničkim rešenjima, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde imaju povećani afinitet za CD32B (takođe poznat kao FcyRIIB ili FCGR2B), npr., u poređenju sa antitelom sa Fc regionom divljeg tipa, npr., IgG1 Fc. U određenim tehničkim rešenjima, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde imaju selektivno povećani afinitet za CD32B (FcyRIIB) iznad oba CD32A (FcyRIIA) i CD16 (FcyRIIIA). Promene sekvenci koje dovode do povećanog afiniteta za CD32B su obezbeđene, na primer, u Mimoto i sar., Protein Engineering, Design & Selection 10: 589-598 (2013), Chu i sar., Molecular Immunology 45: 3926-3933 (2008), i Strohl, Current Opinion in Biology 20: 685-691 (2009). U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od: G236D, P238D, S239D, S267E, L328F, L328E, arginin umetnut nakon položaja 236, i njihovih kombinacija, numerisanih prema EU indeksu (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest,

21

Departman za zdravstvo i ljudske resurse SAD, Bethesda (1991)). U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži S267E i L328F supstitucije. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži P238D i L328E supstitucije. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži P238D supstituciju i supstituciju odabranu iz grupe koja se sastoji od E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, i njihovih kombinacija. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži P238D, E233D, G237D, H268D, P271G, i A330R supstitucije. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigenvezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži G236D i S267E. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži S239D i S267E. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži S267E i L328F. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment sa povećanim afinitetom za CD32B sadrži konstantni region teškog lanca, npr., IgG1 konstantni region, ili njegov fragment koji sadrži arginin umetnut nakon položaja 236 i L328R.

[0210] U drugom posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži laki lanac i teški lanac, pri čemu (i) laki lanac sadrži VL domen koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 koji ima aminokiselinske sekvence bilo kog od Hum231#2, pab 1964, pab 1965, pab 1966, pab 1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., oni navedeni u Tabeli 1); (ii) težak lanac sadrži VH domen koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 koji ima aminokiselinske sekvence bilo kog od Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., oni navedeni u Tabeli 2); (iii) laki lanac dalje sadrži konstantni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog kapa lakog lanca; i (iv) težak lanac dalje sadrži konstantni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG1(po izboru IgG1(alotip Glm3)) teškog lanca.

[0211] U drugom posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži laki lanac i teški lanac, pri čemu (i) laki lanac sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, ili 400-518 ili SEQ ID NO:519); (ii) težak lanac sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu i jedno od antitela Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, (npr., SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389); (iii) laki lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog kapa lakog lanca; i (iv) težak lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencukonstantnog domena humanog IgG1(po izboru IgG1(alotipski Glm3)) teškog lanca.

[0212] U drugom posebnom tehničkom rešenju, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži laki lanac i teški lanac, pri čemu (i) laki lanac sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 208); (ii) težak lanac sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 206); (iii) laki lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog kapa lakog lanca; i (iv) težak lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG1(po izboru IgG1(alotipski Glm3)) teškog lanca.

[0213] U drugom posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži laki lanac i teški lanac, pri čemu (i) laki lanac sadrži VL domen koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., oni navedeni u Tabeli 1); (ii) težak lanac sadrži

21

VH domen koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., oni navedeni u Tabeli 2); (iii) laki lanac dalje sadrži konstantni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG4; i (iv) težak lanac dalje sadrži konstantni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG4teškog lanca.

[0214] U drugom posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži laki lanac i teški lanac, pri čemu (i) laki lanac sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanog ovde, npr., Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, ili 400-518 ili SEQ ID NO: 519); (ii) težak lanac sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanog ovde, npr., Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389); (iii) laki lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG4lakog lanca; i (iv) težak lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG4teškog lanca.

[0215] U drugom posebnom tehničkom rešenju, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži laki lanac i teški lanac, pri čemu (i) laki lanac sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 208); (ii) težak lanac sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 206); (iii) laki lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG4lakog lanca; i (iv) težak lanac dalje sadrži konstantni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog domena humanog IgG4teškog lanca.

[0216] U specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 553, 554, i 567 do 570; i (b) laki lanac koji sadrži

21

aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 555, 556, i 571 do 576. U specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 581 ili 582; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 554; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 581; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 582; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 555. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 554; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 555. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 567; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 573. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 567; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 554; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 581; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo

21

obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 582; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 576.

[0217] U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553 sa aminokiselinskom supstitucijom iz N u A ili Q na aminokiselinskom položaju 298; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 555, 556, i 571 do 576. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553 sa aminokiselinskom supstitucijom iz N u A ili Q na aminokiselinskom položaju 298; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 556. U drugom specifičnom aspektu, antitelo obezbeđeno ovde, koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 553 sa aminokiselinskom supstitucijom iz N u A ili Q na aminokiselinskom položaju 298; i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 555.

[0218] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri, ili četiri VL okvirna regiona (FR-a) koji imaju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde za bilo koje od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., videti Tabelu 3). U nekim aspektima antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) sadrži jedan, dva, tri, ili četiri VH okvirna regiona (FR-a) koja imaju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde za bilo koje od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., see Table 4). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, ili osam FR-a jednog od antitela opisanih ovde (npr., Hum231#1 Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161). U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan

21

ovde, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži okvirne regione (npr., okvirne regione VL domena i/ili VH domena) koji su humani okvirni regioni ili izvedeni iz humanih okvirnih regiona. Neograničavakjući primeri humanih okvirnih regiona su opisani u oblasti, npr., videti Kabat EA i sar., (1991) gore). U određenom aspektu, antitelo opisano ovde sadrži okvirne regione (npr., okvirne regione VL domena i/ili VH domena) koji su okvirni regioni primata (npr., nehumanog primata) ili izvedeni iz okvirnih regiona primata (npr., nehumanog primata).

[0219] Na primer, CDR-i iz antigen-specifičnih nehumanih antitela, tipično porekla iz glodara (npr., miš ili pacov), su graftovani na homologne akceptorske okvirne regione humanog ili nehumanog primata. U jednom aspektu, akceptorski okvirni regioni nehumanog primata su od majmuna Starog sveta. U specifičnom aspektu, akceptorski okvirni region majmuna Starog sveta je iz Pan troglodytes, Pan paniscus ili Gorilla gorilla. U posebnom aspektu, akceptorski okvirni regioni nehumanog primata su od šimpanze Pan troglodytes. U posebnom aspektu, akceptorski okvirni regioni nehumanog primata su akceptorski okvirni regioni majmuna Starog sveta. U specifičnom aspektu, akceptorski okvirni regioni majmuna Starog sveta su iz roda Macaca. U određenom aspektu, akceptorski okvirni regioni majmuna Starog sveta su izvedeni iz cinomolgus majmuna Macaca cynomolgus. Okvirne sekvence nehumanog primata su opisane u američkoj objavi patentne prijave sa br. US 2005/0208625.

[0220] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dve ili više VL okvirnih regiona (FR-a) koji imaju aminokiselinske sekvence opisane ovde za bilo koje od antitela prikazanih u Tabeli 3, gore. U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva ili više VH okvirnih regiona (FR-a) koji imaju aminokiselinske sekvence opisane ovde za bilo koje od antitela prikazanih u Tabeli 4, gore. U specifičnim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dve ili više VL okvirnih regiona koji imaju aminokiselinske sekvence opisane ovde za bilo koje od antitela prikazanih u Tabeli 3, gore, i jedan, dva ili više VH okvirnih regiona koji imaju aminokiselinske sekvence opisane ovde za antitela prikazana u Tabeli 4, gore.

[0221] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži okvirne regione VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-452, 454-464, 467-477, 481-486, 488-513, ili 515-518 i/ili okvirne regione VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe

21

koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 271-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, 362-368, 380, 384, ili 387. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži okvirne regione VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-464, 467-477, 481-486, 488-513, ili 515-519 i/ili okvirne regione VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 270-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, ili 362-368. U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107 (npr., SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-452, 454-464, 467-477, 481-486, 488-513, ili 515-518) sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više aminokiselinskih mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija, poput konzarvativnih aminokiselinskih supstitucija) i/ili okvirne regione VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107 (npr., SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 271-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, 362-368, 380, 384, ili 387). U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-464, 467-477, 481-486, 488-513, ili 515-519) sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više aminokiselinskih mutacija (npr.,

22

aminokiselinskih supstitucija, poput konzarvativnih aminokiselinskih supstitucija) i/ili okvirne regione VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 270-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, ili 362-368). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161 (npr., SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389) sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više aminokiselinskih mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija, poput konzervativnih aminokiselinskih supstitucija) i/ili okvirne regione VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389). U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107 (npr., SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-452, 454-464, 467-477, 481-486, 488-513, ili 515-518) with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više aminokiselinskih mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija, poput konzervativnih aminokiselinskih supstitucija) i/ili jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389 sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više aminokiselinskih mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija, poput konzervativnih aminokiselinskih supstitucija). U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od antitela opisanih ovde, npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-464, 467-477, 481-486, 488-513, ili 515-519) sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više aminokiselinskih mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija, poput konzervativnih aminokiselinskih supstitucija) i/ili jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389 sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više aminokiselinskih mutacija (npr., aminokiselinskih supstitucija, poput konzervativnih aminokiselinskih supstitucija).

[0222] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL okvirne regione (FR-a) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VL okvirnim regionima opisanim ovde u Tabeli 3, gore. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH okvirne regione (FR-e) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VH okvirnim regionima opisanim ovde u Tabeli 4, gore. U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH okvirne regione (FR-e) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VH okvirnim regionima opisanim ovde u Tabeli 4, gore, i VL okvirnim regionima (FR-ima) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VL okvirnim regionima opisanim ovde u Tabeli 3, gore.

[0223] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL okvirne regione (FR-e) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VL okvirnim regionima opisanim ovde za antitelo Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., kao što je prikazano u Tabeli 3). U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH okvirne regione (FR-e) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VH okvirnim regionima opisanim ovde za antitelo Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., kao što je prikazano u Tabeli 4). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži: (i) VL okvirne regione (FR-e) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VL okvirnim regionima oisanim ovde za Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., kao što je prikazano u Tabeli 3); i (ii) VH okvirne regione (FR-e) koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa VH okvirnim regionima opisanim ovde za Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., kao što je prikazano u Tabeli 4).

[0224] Određivanje procentualne identičnosti između dve sekvence (npr., aminokiselinskih sekvenci ili sekvenci nukleinskih kiselina) može takođe biti postignuto primenom matematičkog algoritma. Specifični, neograničavajući primer matematičkog algoritma korišćenog za poređenje dve sekvence je algoritam od Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268, modifikovan kao u Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Takav algoritam ugrađen je u programe NBLAST i XBLAST Altschul SF i sar., (1990) J Mol Biol 215: 403. BLAST pretrage nukleotida mogu se izvoditi postavkom NBLAST nukleotidnih programskih parametara, npr. za rezultat=100, dužina reči=12 da se dobiju nukleotidne sekvence homologne ovde opisanim molekulima nukleinske kiseline. Pretrage proteina BLAST mogu se izvoditi postavkom XBLAST programskih parametara, npr. da rezultata 50, dužina reči=3 da se dobiju aminokiselinske sekvence homologne ovde opisanom molekulu proteina. Da bi se postigla poravnanja sa prazninama za svrhe poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kako je opisano u Altschul SF i sar., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402. Alternativno, PSI BLAST se može koristiti za ponavljanje pretraživanja koje otkriva udaljene veze između molekula (Id.). Kada se koriste programi BLAST, Gapped BLAST i PSI Blast, zadati parametri odgovarajućih programa (npr., od XBLAST i NBLAST) mogu se koristiti (videti, npr., Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI) na svetskoj mreži, ncbi.nlm.nih.gov). Sledeći specifičan, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se

22

koristi za poređenje sekvenci je algoritam Myers i Miller, 1988., CABIOS 4:11 17. Takav algoritam ugrađen je u program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnavanje GCG sekvence. Kada se koristi program ALIGN za poređenje aminokiselinskih sekvenci, može se koristiti tablica ostataka mase PAM120, vrednost dužine praznine od 12 i vrednost praznine (eng. gap penalty) od 4.

[0225] Procentualna identičnost između dve sekvence može se odrediti primenom tehnika sličnih onima koje su opisane iznad, sa ili bez dopuštanja praznina. U računanju procentualne identičnosti, tipično samo tačna podudaranja se računaju.

[0226] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VL domena bilo kog od antitela Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, ili 400-518 ili SEQ ID NO:519). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VL domena bilo kog od antitela Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, Hum231#1, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, ili 400-518 ili SEQ ID NO:519), pri čemu antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži CDR-e (npr., VL CDR-e) koji su identični sa CDR-ima (npr., VL CDR-ima) od antitela prikazanih u Tabeli 1 i/ili Tabeli 2 (npr., CDR-i su identični sa CDR-ima posebnog antitela naznačenog nazivom u Tabelama 1 i/ili 2).

[0227] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL domen koji sadrži VL okvirne regione koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom od okvirnih regiona odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, i 400-518. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VL domen koji sadrži VL okvirne regione koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 519. U posebnom aspektu, antitelo sadrži VL CDR-e koji su identični sa VL CDR-ima od antitela prikazanih u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ima u jednom redu u Tabeli 1).

[0228] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VH domena SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VH domena SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389, pri čemu antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži CDR-e (npr., VL CDR-e) koji su identični sa CDR-ima (npr., VL CDR-ima) od antitela prikazanih u Tabeli 1 i/ili Tabeli 2 (npr., CDR-i su identični sa CDR-ima posebno nazvanog antitela spomenutog po nazivu u Tabelama 1 i/ili 2).

[0229] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH domen koji sadrži VH okvirne regione koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom okvirnih regiona odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389. U posebnom aspektu, antitelo sadrži VH CDR-e koji su identični sa VH CDR-ima od antitela prikazanih u Tabeli 2 (npr., VH CDR-i u jednom redu u Tabeli 2).

[0230] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži: (i) VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VL domena odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, i 400-518; i (ii) VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VH domena SEQ ID NO: 201, 203, 206, ili 215-389. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži: (i) VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 519; i (ii) VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VH domena SEQ ID NO: 304. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži: (i) VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje

22

95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VL domena odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, i 400-518; i (ii) VH domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VH domena odabranom iz grupe od SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389, pri čemu antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži CDR-e (npr., VL CDR-e) koji su identični sa CDR-ima (npr., VL CDR-ima) od antitela prikazanih u Tabeli 1 i/ili Tabeli 2 (npr., CDR-i su identični sa CDR-ima posebnog antitela pomenutog nazivom u Tabelama 1 i/ili 2). U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži: (i) VL domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:519; i (ii) VH domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:304, pri čemu antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži CDR-e (npr., VL CDR-e) koji su identični sa CDR-ima (npr., VL CDR-ima) od antitela prikazanih u Tabeli 1 i/ili Tabeli 2 (npr., CDR-i su identični sa CDR-ima posebnog antitela spomenutog pod nazivom u Tabelama 1 i/ili 2).

[0231] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži: (i) VL domen koja sadrži VL okvirne regione koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom od okvirnih regiona odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, i 208; i (ii) VH domen koja sadrži VH okvirne regione koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom od okvirnih regiona odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389. U posebnom aspektu, antitelo sadrži VL CDR-e koji su identični sa VL CDR-ima od antitela prikazanih u Tabeli 3 i/ili VH CDR-ima koji su identični sa VH CDR-ima od antitela prikazanog u Tabeli 4.

[0232] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VH domena odabranom iz grupe od SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH domen koji ima najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom VH domena odabranom iz grupe od SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389, pri čemu antitelo ili antigen-

22

vezujući fragment sadrži CDR-e (npr., VL CDR-e) koji su identični sa CDR-ima (npr., VL CDR-ima) od antitela prikazanih u Tabeli 1 i/ili Tabeli 2 (npr., CDR-i su identični sa CDR-ima posebnog antitela naznačenog u Tabelama 1 i/ili 2).

[0233] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), sadrži VH domen koji sadrži VH okvirne regione koji imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom od okvirnih regiona odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389. U posebnom aspektu, antitelo sadrži VH CDR-e koji su identični sa VH CDR-ima od antitela prikazanih u Tabeli 2 (npr., VH CDR.i u jednom redu u Tabeli 2).

[0234] U drugom aspektu, ovde su obezbeđena antitela koja vezuju isti ili preklavajući epitop GITR-a (npr., epitop humanog GITR-a) kao antitelo opisano ovde (npr., antitelo Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107), ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w. U određenim aspektima, epitop antitela može se odrediti pomoću, npr., NMR spektroskopije, studija kristalografije rendgenske difrakcije, ELISA testova, vodonik/deuterijum izmene povezane sa masenom spektrometrijom (npr., tečna hromatografija elektrosprej masena spektrometrija), oligo-peptidni skenirajući testovi zasnovani na nizu, i/ili mapiranje mutageneze (npr., mapiranje mutageneze usmerene na mesto). Za rendgensku kristalografiju, kristalizacija može da se postigne primenom bilo kojeg od poznatih postupaka u oblasti (npr., Giegé R i sar., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Antitelo:antigen kristali mogu se ispitivati primenom dobro poznatih tehnika rendgenske difrakcije i mogu se prečistiti primenom računarskog softvera poput X-PLOR (Jejl Univerzitet, 1992, distribuiran od strane Molecular Simulations, Inc.; videti npr. Meth Enzymol (1985) tomovi 114 & 115, eds Wyckoff HW i sar.,; američka patentna prijava br.

2004/0014194), i BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P i sar., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Studije mapiranja mutageneze se mogu postići primenom bilo kog postupka poznatog stručnjaku u oblasti. Videti, npr., Champe M i sar., (1995) gore i Cunningham BC & Wells JA (1989) gore za opis tehnika mutageneze, uključujući tehnike mutageneze skeniranjem alanina. U specifičnom aspektu, epitop antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta je određea primenom studija

22

mutageneze skeniranjem alanina, kako je opisano u odeljku 6, dole. Dodatno, antitela koja prepoznaju i vezuju se za iste ili preklapajuće epitope od GITR (npr., humanog GITR-a) mogu se identifikovati primenom rutinskih tehnika imunoesej, na primer, prikazujući sposobnost jednog antitela da blokira vezivanje drugog antitela za ciljni antigen, tj., esej kompetitivnog vezivanja. Eseji kompetitivnog vezivanja takođe se mogu koristiti da se odredi da li dva antitela imaju sličnu vezujuću specifičnost za epitop. Kompetitivno vezivanje može se odrediti u testu u kome imunoglobulin pod ispitivanjem inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen, poput GITR-a. Brojni tipovi testova kompetitivnog vezivanja su poznati, na primer: direktni ili indirektni radioimunotest u čvrstoj fazi (RIA), direktni ili indirektni enzimski imunotest u čvrstoj fazi (EIA), sendvič test kompeticije (videti Stahli C i sar., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); direktni biotin-avidin EIA u čvrstoj fazi (videti Kirkland TN i sar., (1986) J Immunol 137: 3614-9); test direktno obeležene čvrste faze, sendvič test direktno obeležene čvrste faze (videti Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); direktni sa oznakom RIA u čvrstoj fazu primenom 1-125 oznake (videti Morel GA i sar., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); direktni biotin-avidin EIA u čvrstoj fazi(Cheung RC i sar., (1990) Virology 176: 546-52); i direktni obeleženi RIA. (Moldenhauer G i sar., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Tipično, takav test uključuje primenu prečišćenog antigena (npr., GITR poput humanog GITR-a) vezanog za a čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo koji od ovih, neogeleženi test imunoglobulin i obeleženi referentni imunoglobulin. Kompetitivna inhibicija može da se izmeri određivanjem količine oznake vezane za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test imunoglobulina. Obično je test imunoglobulin prisutan u višku. Obično, kada je kompetitivno antitelo prisutno u višku, ono će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% ili više. Test kompetitivnog vezivanja može se konfigurisati u velikom broju različitih formata primenom bilo obeleženog antigena bilo obeleženog antitela. U uobičajenoj verziji ovog testa, antigen je imobilisan na ploču sa 96 bunarića. Sposobnost neobeleženog antitela da blokira vezivanje obeleženog antitela za antigen je zatim merena primenom radioaktivnih ili enzimskih oznaka. Za dalje detalje videti, na primer, Wagener C i sar., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C i sar., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M i sar., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M i sar., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M i sar., (1992) Hybridoma 11: 391-407 and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editors gore, str.386-389.

[0235] U jednom aspektu, test kompeticije sprovodi se pomoću površinske plazmonske rezonancije (BIAcore®), npr. "u tandemskom pristupu" kakav je opisao Abdiche YN i sar.

22

(2009) Analytical Biochem 386: 172-180, pri čemu se GITR antigen imobiliše na površini čipa, na primer, čip CM5 senzora i anti-GITR antitiela prelaze preko čipa. Da bi se utvrdilo da li se antitielo takmiči sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom ovde opisanim, anti-GITR antitelo prvo prelazi preko površine čipa da bi se postiglo zasićenje, a zatim se dodaje potencijalno, konkurentsko antitelo. Tada se vezivanje konkurentskog antitela može odrediti i kvantifikovati u odnosu na nekonkurentnu kontrolu.

[0236] U određenim aspektima, testovi vezivanja za konkurenciju mogu se koristiti za utvrđivanje da li je antitelo kompetitivno blokirano, npr. na način koji zavisi od doze, drugim antitelom, na primer, antitelo veže u suštini isti epitop ili preklapajuće epitope kao referentno antitelo, kada ta dva antitela prepoznaju identične ili sterički preklapajuće epitope u testovima vezivanja za konkurenciju, kao što su ELISA testovi za konkurenciju, koji se mogu konfigurisati u svim brojnim formatima, koristeći ili označeni antigen ili obeleženo antitelo. U određenom aspektu, antitelo se može testirati u testovima vezivanja za konkurenciju sa ovde opisanim antitelima (npr., antitelo Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w), ili njihovim himernim ili Fab antitelom, ili antitelom koje sadrži VH CDR-e i VL CDR-e od antitela opisanog ovde (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w).

[0237] U drugom aspektu, ovde su obezbeđena antitela koja se nadmeću (npr., na način zavisan od doze) za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) sa antitelom opisanim ovde (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107), ili antitelima pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w, kao što je određeno primenom testova poznatih stručnjacima iz oblasti ili opisanim ovde (npr., ELISA kompetitivni testovi ili površinska plazmonska rezonanca). U drugom aspektu, ovde su obezbeđena antitela koja kompetitivno inhibiraju (npr., na dozno zavisan način) antitelo opisano ovde (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w) da se veže sa GITR (npr., humanim GITR), kao što je određeno primenom testova poznatih stručnjacima iz oblasti ili opisanim ovde

22

(npr., ELISA kompetitivni testovi, ili test niza suspenzija ili površinske plazmonske rezonance opisani u Primeru 6, dole). U posebnim aspektima, takvo kompetitivno blokirajuće antitelo aktivira, indukuje ili poboljšava jednu ili više GITR aktivnosti. U specifičnim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo koje se takmiči (npr., na dozno zavisan način) za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR), sa antitelom koje sadrži aminokiselinske sekvence opisane ovde (npr., VL i/ili VH aminokiselinske sekvence antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161, ili Hum231#2w), kao što je određeno primenom testova poznatih stručnjacima iz oblasti ili opisanim ovde (npr., ELISA kompetitivni testovi, ili test niza suspenzije ili površinske plazmonske rezonance opisan u Primeru 6, dole).

[0238] U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo koje se takmiči sa antitelom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) do iste mere kojom se antitelo opisano ovde takmiči sa samim sobom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR). U nekim aspektima, ovde je obezbeđeno prvo antitelo koje se takmiči sa antitelom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR), pri čemu se prvo antitelo takmiči za vezivanje u testu koji obuhvata sledeće korake: (a) inkubiranje GITR-transfektovanih ćelija sa prvim antitelom u neobeleženom obliku u posudi; i (b) dodavanje antitela opisanog ovde u obeleženom obliku u posudu i inkubiranje ćelija u posudi; i (c) detektovanje vezivanja antitela opisanog ovde u obeleženom obliku za ćelije. U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno prvo antitelo koje se takmiči sa antitelom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR), pri čemu je kompeticija izražena kao smanjeno vezivanje prvog antitela za GITR za više od 80% (npr., 85%, 90%, 95%, ili 98%, ili između 80% do 85%, 80% do 90%, 85% do 90%, ili 85% do 95%).

[0239] U specifičnim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo koje se takmiči (npr., na dozno zavisan način) za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR), sa antitelom koje sadrži VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-452, 454-464, 467-477, 481-486, 488-513, i 515-518, i VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 271-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 350, 354-356, 358-360, 362-368, 380, 384 i 387. U specifičnim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo koje se takmiči (npr., na dozno zavisan način) za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR), sa

2

antitelom koje sadrži VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-452, 454-464, 467-477, 481-486, 488-513, i 515-519, i VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 270-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, i 362-368.

[0240] U specifičnim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo koje se takmiči (npr., na dozno zavisan način) za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR), sa antitelom koje sadrži (i) VL domen koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence od VL CDR-a od antitela navedenog u Tabeli 1; i (ii) VH domen koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence od CDR-a od antitela navedenog u Tabeli 2 (npr., VH CDR-i posebnog antitela naznačenog po nazivu u Tabeli 1, poput 231-32-15, Hum231#1, ili Hum231#2).

[0241] U posebnom aspektu, ovde je obezbeđeno antitelo koje se takmiči (npr., na dozno zavisan način), za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR), sa antitelom koje sadrži VH i VL CDR-e od 231-32-15 (SEQ ID NO: 201 i 202).

[0242] U specifičnom aspektu, antitelo opisano ovde je ono koje je kompetitivno blokirano (npr., na dozno zavisan način) antitelom koje sadrži VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-452, 454-464, 467-477, 481-486, 488-513, i 515-518 i VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 271-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, 362-368, 380, 384, i 387, za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR). U specifičnom aspektu, antitelo opisano ovde je ono koje je kompetitivno blokirano (npr., na dozno zavisan način) antitelom koje sadrži VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-464, 467-477, 481-486, 488-513, i 515-519 i VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 270-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, i 362-368, za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR).

2 1

[0243] U jednom aspektu, antitelo opisano ovde je ono koje je kompetitivno blokirano antitelom koje sadrži VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207 ili 208 i VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206 za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR).

[0244] U drugom specifičnom aspektu, antitelo opisano ovde je ono koje je kompetitivno blokirano (npr., na dozno zavisan način) antitelom koje sadrži (i) VL domen koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence CDR-ova antitela navedenog u Tabeli 1 (npr., VL CDR-ova posebnog antitela naznačenog imenom u Tabeli 1); i (ii) VH domen koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence CDR-ova antitela navedenog u Tabeli 2.

[0245] U specifičnim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se imunospecifično vezuje za isti epitop kao onaj od antitela (npr., bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w) koje sadrži aminokiselinske sekvence opisane ovde (videti, npr., Tabele 1-4) za specifično vezivanje za GITR (npr., humani GITR). Testovi poznati stručnjacima iz oblasti ili opisani ovde (npr., rendgenska kristalografija, ELISA testovi, itd.) mogu se koristiti da se odredi da li se dva antitela vezuju za isti epitop.

[0246] U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde se imunospecifično vezuje za isti epitop kao onaj od antitela (npr., bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967,pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977,pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107) koje sadrži VL domen koji ima aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-452, 454-464, 467-477, 481-486, 488-513, i 515-518, i VH domen koji ima aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 271-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, 362-368, 380, 384, i 387). U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde se imunospecifično vezuje za isti epitop kao onaj od antitela (npr., bilo kog od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela

2 2

pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w) koje sadrži VL domen koji ima aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 207, 208, 400-411, 413-416, 418-421, 423-448, 450-464, 467-477, 481-486, 488-513, i 515-519, i VH domen koji ima aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 206, 215, 217-234, 236-256, 258, 259, 261-265, 267, 268, 270-273, 276, 277, 280, 281, 283-285, 287, 288, 290, 291, 294, 296-299, 301, 304-306, 308, 313-316, 319, 320, 322-325, 327, 328, 333, 336, 338-340, 342, 343, 345, 350, 354-356, 358-360, i 362-368).

[0247] U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde se imunospecifično vezuje za isti epitop kao onaj vezan antitelom koji sadrži VH domen i VL domen antitela Hum231#1 ili Hum231#2 (SEQ ID NOs: 206 i 207 ili SEQ ID NOs: 206 i 208, redom), ili epitop koji preklapa epitop antitela koji sadrži VH domen i VL domen antitela Hum231#1 ili Hum231#2 (SEQ ID NOs: 206 i 207 ili SEQ ID NOs: 206 i 208, redom).

[0248] U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde, se imunospecifično vezuje za isti epitop kao onaj od antitela koje sadrži (i) VL domen koji sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence CDR-ova antitela navedenog u Tabeli 1 (npr., VL CDR-e posebnog antitela naznačenog po nazivu u Tabeli 1) i (ii) VH domen koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 koji imaju aminokiselinske sekvence CDR-ova antitela navedenog u Tabeli 2 (npr., VH CDR-e posebnog antitela naznačenog po nazivu u Tabeli 2).

[0249] U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) i kompetitivno blokira (npr., na dozno zavisan način) vezivanje antitela 231-32-15, Hum231#1, Hum231#2 ili Hum231#2w sa GITR-om (npr., humanim GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca i varijabilni region (VH) teškog lanca, pri čemu

(i) VL sadrži:

(a) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KSSQSX1X2X3X4X5X6X7KX8YLX9(SEQ ID NO: 4), pri čemu:

X1je L, A, V, I, P, F ili M

X2je L, A, V, I, P, F, M ili S

X3je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X4je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X5je G, N, Q, S, T, C, W, Y ili A

X6je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X7je Q, G, N, S, T, C, W, Y ili A

2

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili A; i/ili

(b) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvnencu X1ASTRX2X3(SEQ ID NO: 5), pri čemu: X1je W, G, N, Q, S, T, C, Y, F, H ili A

X2je E, D ili A

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A; i/ili

(c) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QX1X2YX3X4PYT (SEQ ID NO: 6), pri čemu:

X1je N, G, Q, S, T, C, W ili Y

X2je D, E ili Y

X3je S, G, N, Q, T, C, W, Y ili A

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, L, ili A; i (ii) VH sadrži:

(a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu X1YX2MX3(SEQ ID NO: 1), pri čemu X1je D, E, G ili A

X2je A, V, L, I, P, F, M ili Y

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F ili H; i/ili

(b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu X1IX2X3X4SGX5X6X7YX8QKFX9X10(SEQ ID NO: 2), pri čemu X1je V, A, L, I, P, F, M ili T

X2je R, K, H, Q ili A

X3je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I ili P

X4je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H, ili A

X5je D, E, G ili A

X6je V, A, L, I, P, F, M ili T

X7je T, G, N, Q, S, C, W, Y, V, I, P ili A

X8je N, G, Q, S, T, C, W, Y ili A

X9je K, R, H, Q ili A

X10je D, E, G ili A; i/ili

(c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SGTVRGX1X2X3(SEQ ID NO: 3), pri čemu X1je F, A, V, L, I, P, M, Y, W, H ili S

X2je A, ili D

X3je Y, G, N, Q, S, T, C, W, F, H ili V.

2 4

[0250] U posebnom aspektu, antitelo opisano ovde, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) i kompetitivno blokira (npr., na dozno zavisan način) vezivanje antitela 231-32-15, Hum231#1, Hum231#2 ili Hum231#2w sa GITR-om (npr., humanim GITR), sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca i varijabilni region (VH) teškog lanca, pri čemu

(i) VL sadrži:

(a) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KSSQSLLNSX1NQKNYLX2(SEQ ID NO: 10), pri čemu

X1je G ili S

X2je T ili S; i/ili

(b) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRES (SEQ ID NO: 11); i/ili (c) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QNX1YSX2PYT (SEQ ID NO: 12), pri čemu

X1je D ili E

X2je Y, F ili S i (ii) VH sadrži:

(a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu X1YX2MX3(SEQ ID NO: 7), pri čemu

X1je D, E ili G

X2je A ili V

X3je Y ili H; i/ili

(b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu X1IX2TX3SGX4X5X6YNQKFX7X8(SEQ ID NO: 8), pri čemu

X1je V ili L

X2je R, K ili Q

X3je Y ili F

X4je D, E ili G

X5je V ili L

X6je T ili S

X7je K, R ili Q

X8je D, E ili G; i/ili

(c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SGTVRGFAY (SEQ ID NO: 9).

[0251] U nekim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde

2

opisanog antitela (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w) sprečava vezivanje GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% kako je procenjeno testom poznatim stručnjaku u oblasti ili opisanim ovde. U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, inhibira vezivanje GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% kako je procenjeno testom opisanim u Primeru 2, dole (npr., Odeljak 6.2.5.2 ili 6.2.5.4, dole). U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 1000 ng/ml, 950 ng/ml, 900 ng/ml, 850 ng/ml, 800 ng/ml, 750 ng/ml, 700 ng/ml, 650 ng/ml, 600 ng/ml, 550 ng/ml, 500 ng/ml, 450 ng/ml, 400 ng/ml, 350 ng/ml, 333 ng/ml, 300 ng/ml, 250 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml ili 10 ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL (npr., GITRL-PE) za GITR vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 1000 ng/ml do 750 ng/ml, 1000 ng/ml do 500 ng/ml, 850 ng/ml do 500 ng/ml, 750 ng/ml do 500 ng/ml, 600 ng/ml do 500 ng/ml, 500 ng/ml do 400 ng/ml, 400 ng/ml do 300 ng/ml, ili 300 ng/ml do 200 ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL (npr., GITRL-PE) za GITR vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex®

2

perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0252] U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop antitela opisanog ovde, pri koncentraciji od 3500 ng/ml, 3400 ng/ml, 3300 ng/ml, 3200 ng/ml, 3100 ng/ml, 3000 ng/ml, 2900 ng/ml, 2800 ng/ml, 2700 ng/ml, 2600 ng/ml, 2500 ng/ml, 2400 ng/ml, 2300 ng/ml, 2200 ng/ml, 2100 ng/ml, 2000 ng/ml, 1900 ng/ml, 1800 ng/ml, 1700 ng/ml, 1600 ng/ml, 1500 ng/ml, 1400 ng/ml, 1300 ng/ml, 1200 ng/ml, ili 1100 ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL (npr., GITRL-PE) za GITR vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL za perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, pri koncentraciji od 3500 ng/ml do 3200 ng/ml, 3500 ng/ml do 3000ng/ml, 3200 ng/ml do 2500 ng/ml, 3000 do 2200 ng/ml, 2500 ng/ml do 1800 ng/ml, 2000 ng/ml do 1500 ng/ml, 1700 ng/ml do 1200 ng/ml, ili 1500 ng/ml do 1000 ng/ml inhibira vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL (npr., GITRL-PE) za GITR vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici za manje od 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ili 10% u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL za

2

perlice sa vezanim GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0253] U određenim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 3000ng/ml sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85% ili manje od 80% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane sa GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop antitela opisanog ovde, u koncentraciji od 1000ng/ml sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 85%, manje od 80% ili manje od 75% kada je GITR (npr., humani GITR) je vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane sa GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 333ng/ml sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 70% ili manje od 65% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane za GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 111ng/ml sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 65%, manje od 60% ili manje od 55% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane sa GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr.,

2

Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 37ng/ml sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 40% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane sa GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 12ng/ml sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za manje od 20% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane sa GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0254] U drugom aspektu, određena količina obeleženog GITRL (npr., humani GITRL-PE) vezuje se za GITR vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u prisustvu antitela, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop antitela opisanog ovde, u postupku koji uključuje: (a) povezivanje GITR (npr., humanog GITR) za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici; (b) inkubiranje perlica vezanih sa GITR u koncentraciji od 40 perlica/µl sa 3000ng/ml, 2500ng/ml, 2000ng/ml, 1500ng/ml, 1000ng/ml, 750ng/ml, 500ng/ml, 250ng/ml, 100ng/ml, 50ng/ml ili 10ng/ml kompetirajućeg antitela ili antitela koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop u bunariću tokom prvog vremenskog perioda (npr., 30 minuta, 60 minuta, 1.5 sat, 2 sata, 2.5 sata ili 3 sata), pri čemu bunarić sadrži 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 ili 1500 perlica; (c) dodavanje obeleženog GITRL (npr., humanog GITRL-PE) u bunarić da se dobije konačna koncentracija od 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM (u specifičnim aspektima, 0.5nM) obeleženog GITRL i 20 perlica/µl povezanih sa GITR, i inkubiranje tokom drugog vremenskog perioda (npr., 30 minuta, 1 sat, 1.5 sat, 2 sata, 2.5 sata ili 3 sata); i (d) detekcija obeleženog GITRL vezanog za perlice povezane sa GITR u, npr., testu niza suspenzija kao što je Luminex® 200 sistem. U specifičnim aspektima, količina obeleženog GITRL vezanog za perlice povezane sa GITR u prisustvu

2

kompetirajućeg antitela ili antitela koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop određena je relativno prema količini obeleženog GITRL vezanog za perlice povezane sa GITR u odsustvu kompetirajućeg antitela ili antitela koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop. U određenim aspektima, odsustvo kompetirajućeg antitela ili antitela koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop znači da u bunariću nema antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U drugim aspektima, odsustvo kompetirajućeg antitela ili antitela koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop znači da je u bunariću prisutno izotipsko kontrolno antitelo koje se ne vezuje za GITR. U skladu sa ovim aspektima, određeno je da količina obeleženog GITRL vezanog za perlice povezane sa GITR u prisustvu kompetirajućeg antitela ili antitela koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop, u nekim aspektima, iznosi najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ili 60%, ili 20% do 60%, 30% do 50%, ili 20% do 70% količine obeleženog GITRL vezanog za perlice povezane sa GITR u odsustvu kompetirajućeg antitela ili antitela koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop.

[0255] U određenim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% GITRL (npr., humanog GITRL) vezuje se za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, što je procenjeno testom poznatim stručnjaku u oblasti ili opisanim ovde. U specifičnom aspektu, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% GITRL (npr., humanog GITRL) se vezuje za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, kako je procenjeno testom opisanim u Primeru 2, dole (npr., Odeljci 6.2.5.2 ili 6.2.5.4, dole). U drugom specifičnom aspektu, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL (npr., obeleženog humanog GITRL, kao što je hGITRL-PE) vezuje se za GITR vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u prisustvu 1000 ng/ml, 950 ng/ml, 900 ng/ml, 850 ng/ml, 800 ng/ml, 750 ng/ml, 700 ng/ml, 650 ng/ml, 600 ng/ml, 550 ng/ml, 500 ng/ml, 450 ng/ml, 400 ng/ml, 350 ng/ml, 333 ng/ml, 300 ng/ml, 250 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml ili 10 ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde

24

opisanog antitela, u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL za perlice povezane sa GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U drugom specifičnom aspektu, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75% 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL (npr., obeleženog humanog GITRL, kao što je hGITRL-PE) vezuje se za GITR vezan za perlice (npr., humani GITR vezan za Luminex® perlice) u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u prisustvu 3500 ng/ml, 3400 ng/ml, 3300 ng/ml, 3200 ng/ml, 3100 ng/ml, 3000 ng/ml, 2900 ng/ml, 2800 ng/ml, 2700 ng/ml, 2600 ng/ml, 2500 ng/ml, 2400 ng/ml, 2300 ng/ml, 2200 ng/ml, 2100 ng/ml, 2000 ng/ml, 1900 ng/ml, 1800 ng/ml, 1700 ng/ml, 1600 ng/ml, 1500 ng/ml, 1400 ng/ml, 1300 ng/ml, 1200 ng/ml, ili 1100 ng/ml antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u odnosu na vezivanje 1.5nM, 1.4nM, 1.3nM, 1.2nM, 1.1nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM ili 0.1nM obeleženog GITRL za perlice povezane sa GITR u koncentraciji od 9pg/ml, 8pg/ml, 7pg/ml, 6pg/ml, 5pg/ml, 4pg/ml ili 3pg/ml po perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0256] U određenim aspektima, antitelo koje u vezivanju kompetira sa antitelom opisanim ovde za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 3000ng/ml ne sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za više od 15% ili više od 20% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane za GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 1000ng/ml ne sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za više od 15%, više od 20% ili više od 25% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane sa GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 333ng/ml ne sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za više od 30% ili više od 35% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane za GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 111ng/ml ne sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za više od 35%, više od 40% ili više od 45% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml po perlici u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane za GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 37ng/ml ne sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za više od 60% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane za GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta po perlici u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem). U određenim aspektima, antitelo, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 12ng/ml ne sprečava vezivanje 0.5nM GITRL (npr., humanog GITRL) za GITR (npr., humani GITR) za više od 85% kada je GITR (npr., humani GITR) vezan za perlice (npr., Luminex® perlice) u koncentraciji od 5pg/ml u odnosu na vezivanje 0.5nM obeleženog GITRL za perlice vezane za GITR u koncentraciji od 5pg/ml/perlici u odsustvu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta po perlici u testu niza suspenzija (npr., Luminex® 200 sistem).

[0257] U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humanim GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, u koncentraciji od 150nM, 145nM, 140nM, 135nM, 130nM, 125nM, 120nM, 115nM, 110nM, 105nM ili 100nM vezano za GITR (npr., human GITR) imobilisan na čipu (npr., CM5 senzornom čipu) inhibira vezivanje 150nM, 145nM, 140nM, 135nM, 130nM, 125nM, 120nM, 115nM, 110nM, 105nM ili 100nM GITRL (npr., nekovalentno vezanog trimera humanog GITRL) za GITR imobilisan na čipu za manje od 60%, manje od 55%, manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%, manje od 35%, manje od 30%, manje od 25%, manje od 20% ili manje od 15%. U određenim aspektima, ovde je obezbeđeno antitelo, koje u vezivanju kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje sa GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, pri čemu kompetirajuće antitelo ili antitelo koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop u koncentraciji od 125nM vezano za GITR (npr., humani GITR) imobilisan na čipu (npr., CM5 senzorni čip) inhibira vezivanje 125nM GITRL (npr., nekovalentno povezani trimer humanog GITRL) za GITR imobilisan na čipu za manje od 60%, manje od 55%, manje od 50%, manje od 45%, manje od 40%, manje od 35%, manje od 30%, manje od 25%, manje od 20% ili manje od 15%.

[0258] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji kompetira sa antitelom opisanim ovde za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop antitela opisanog ovde, vezuje se za GITR (npr., humani GITR) sa konstantom stope disocijacije (koff) od 8.5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-3>s<-1>ili manje, 1 x 10<-3>s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-4>s<-1>ili manje, 5 x10<-4>s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-4>s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-4>s<-1>ili manje, 1 x 10<-4>s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-5->s<-1>ili manje, 1 x 10<-5->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-6->s<-1>ili manje, 5x10<-6->s<-1>ili manje, 3.5 x 10<-6->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-6->s<-1>ili manje, 1 x 10<-6->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-7->s<-1>ili manje, 5 x 10<-7->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-7->s<-1>ili manje, 1 x 10<-7->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-8->s<-1>ili manje, 5 x 10<-8->s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-8->s<-1>ili manje, 1 x 10<-8->s<-1>ili manje, 8.5 x 10<-9->s<-1>ili manje, 5 x 10<-9>s<-1>ili manje, 2.5 x 10<-9->s<-1>ili manje, ili 1 x 10<-9->s<-1>ili manje. U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, vezuje se za GITR (npr., humani GITR) sa koffizmeđu 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-9->s<-1>, 8.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-9->s<-1>, 5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-9->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-8->s<-1>, 5 x 10<-5>s<-1>do 1 x 10<-8->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-7->s<-1>, 5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-7->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 5 x 10<-6->s<-1>, 9.5 x 10<-5->s<-1>do 1 x 10<-5->s<-1>, 8.5 x 10<-3>s<-1>do 1 x 10<-4>s<-1>, 5 x 10<-3>s<-1>do 2.5 x 10<-4>s<-1>, 8.5 x 10<-3>s<-1>, do 1 x 10<-5>s<-1>, 8.5 x 10<-5->s<-1>do 5 x

24

10<-5->s<-1>. U određenim aspektima, koffje određena korišćenjem monovalentnog antitela, kao što je Fab fragment, kako je izmereno, npr., BIAcore<®>tehnologijom baziranom na rezonanciji površinskog plazmona. U drugim aspektima, koffje određena korišćenjem bivalentnog antitela kako je izmereno, npr., BIAcore<®>tehnologijom baziranom na rezonanciji površinskog plazmona. U posebnom aspektu, koffje određena korišćenjem testa opisanog u Odeljku 6, dole.

[0259] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop opisanog ovde antitela, vezuje se za GITR (npr., humani GITR) sa konstantom stope asocijacije (kon) od najmanje 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 2.5 x 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 3.5 x 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 2.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 3.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 5 x 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 10<8>M<-1>s<-1>, najmanje 5 10<8>M<-1>s<-1>ili najmanje 10<9>M<-1>s<-1>. U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, vezuje se za GITR (npr., humani GITR) sa konizmeđu 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 5 x 10<5>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 1 x 10<6>M<-1>s<-1>, 3.5 x 10<5>M<-1>s<-1>do 2.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, 3.5 x 10<5>M<-1>s<-1>do 3.5 x 10<6>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 5 x 10<6>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<->do 1 x 10<7>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 5 x 10<7>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 10<8>M<-1>s<-1>, 1 x 10<5>M<-1>s<-1>do 1 x 10<9>M<-1>s<-1>, 1 x 10<6>M<-1>s<->do 1 x 10<7>M<-1>s<-1>, 1 x 10<6>M<-1>s<-1>do 1 x 10<8>M<-1>s<-1>, 1 x 10<6>M<-1>s<-1>do 1 x 10<9>M<-1>s<-1>, 1 x 10<7>M<-1>s<-1>do 1 x 10<8>M<-1>s<-1>, 1 x 10<7>M<-1>s<-1>do 1 x 10<9>M<-1>s<-1>, 1 x 10<8>M<-1>s<-1>do 1 x 10<9>M<-1>s<-1>. U određenim aspektima, konje određena korišćenjem monovalentnog antitela, kao što je Fab fragment, kako je izmereno, npr., BIAcore<®>tehnologijom baziranom na rezonanciji površinskog plazmona. U drugim aspektima, konje određena korišćenjem bivalentnog antitela kako je izmereno, npr., BIAcore<®>tehnologijom baziranom na rezonanciji površinskog plazmona. U posebnom aspektu, konje određena korišćenjem testa opisanog u Odeljku 6, dole.

[0260] U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, vezuje se za GITR (npr., humani GITR) sa KDmanjom od 7 nM, 6nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM, ili 0.1 nM. U nekim aspektima, antitelo ili njegov fragment, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, vezuje se za GITR (npr., humani GITR) sa KDod oko 7nM, 6nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, 0.75 nM, 0.5 nM, 0.25 nM, ili 0.1 nM. U određenim aspektima, antitelo ili njegov fragment opisan ovde, koji kompetira sa ovde opisanim antitelom za vezivanje za GITR (npr., humani GITR) ili se vezuje za isti epitop ili preklapajući epitop ovde opisanog antitela, vezuje se za GITR (npr., humani GITR) sa KDod 7 nM do 4 nM, 7 nM do 5 nM, 6 nM do 4 nM, 5 nM do 3 nM, 5 nM do 1 nM, 5 nM do 0.5 nM, 4 nM do 3 nM, 4 nM do 2 nM, 4 nM do 1 nM, 4 nM do 0.5 nM, 3 nM do 2 nM, 3 nM do 1 nM, 3 nM do 0.5 nM, 2 nM do 1 nM, 2 nM do 0.5 nM, 3 nM do 0.1 nM, 2 nM do 0.1 nM, 1 nM do 0.1 nM, ili 0.5 nM do 0.1 nM. U određenim aspektima, KDje izračunata kao količnik koff/kon, a koni koffsu određene korišćenjem monovalentnog antitela, kao što je Fab fragment, kako je izmereno, npr., BIAcore<®>tehnologijom baziranom na rezonanciji površinskog plazmona. U drugim aspektima, KDje izračunata kao količnik koff/kon, a koni koffsu određene korišćenjem bivalentnog antitela, kao što je Fab fragment, kako je izmereno, npr., BIAcore<®>tehnologijom baziranom na rezonanciji površinskog plazmona. U specifičnom aspektu, KDje određena kako je izloženo u Primerima u Odeljku 6, dole (npr., Primer 2).

[0261] U određenim aspektima, epitop ovde opisanog antitela upotrebljen je kao imunogen za proizvodnju antitela. Vidi, npr., Odeljak 5.2 dole za postupke proizvodnje antitela.

[0262] U specifičnim aspektima, opisano antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), ne inhibira (npr., na dozno-zavisan način) vezivanje mišjeg antitela 6C8 za GITR (npr., humani GITR) u testu koji je poznat stručnjaku u oblasti ili opisan ovde. Vidi, npr., U.S. Patent br.7,812,135 za opis mišjeg antitela 6C8. U određenim aspektima, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više mišjeg antitela 6C8 vezuje se za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), kako je procenjeno u testu koji je poznat stručnjaku u oblasti ili opisan ovde. U specifičnom aspektu, opisano antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), ne inhibira (npr., na dozno-zavisan način) vezivanje mišjeg antitela 6C8 za GITR (npr., humani GITR) kako je procenjeno u testu opisanom u Primeru 6, dole. U određenim aspektima, najmanje 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više mišjeg antitela 6C8 vezuje se za GITR (npr., humani GITR) u prisustvu opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), kako je procenjeno u testu opisanom u Primeru 6, dole.

[0263] U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitela opisana ovde mogu biti multispecifična antitela, npr., bispecifična antitela. U posebnom tehničkom rešenju, ovde opisano anti-GITR antitelo je bispecifično antitelo, pri čemu antitelo ima specifičnosti za najmanje dva različita, tipično nepreklapajuća epitopa. U posebnom tehničkom rešenju,

24

bispecifično antitelo sadrži jednu ručicu sačinjenu od ovde opisanog antitela sa specifičnošću za GITR (npr., humani GITR), i drugu ručicu koja sadrži antitelo sa specifičnošću za različiti epitop na GITR (npr., humanom GITR) ili epitop na različitom molekulu, npr., PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG-3 ili OX40. Na primer, bispecifično antitelo može sadržati jednu ručicu koja sadrži antitelo opisano ovde sa specifičnošću za GITR (npr., humani GITR) i drugu ručicu koja sadrži antitelo sa specifičnošću za CTLA-4, kao tremelimumab (Pfizer), ipilimumab (Yervoy®, Bristol-Meyers Squibb), antitelo koje se vezuje za isti epitop kao tremelimumab ili sa tim preklapajući epitop, ili antitelo koje se vezuje za isti epitop kao ipilimumab ili sa tim preklapajući epitop.

[0264] U specifičnim aspektima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), funkcioniše kao agonist.

[0265] U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava aktivnost GITR (npr., humanog GITR) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta kako je procenjeno postupcima koji su ovde opisani i/ili poznati stručnjaku u oblasti, u odnosu na aktivnost GITR (npr., humanog GITR) u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR). U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava aktivnost GITR (npr., humanog GITR) za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% kako je procenjeno postupcima koji su ovde opisani i/ili poznati stručnjaku u oblasti, u odnosu na aktivnost GITR (npr., humanog GITR) u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR). Neograničavajući primeri aktivnosti GITR (npr., humanog GITR) mogu uključiti proliferaciju ćelija, signalizaciju GITR (npr., humanim GITR), preživljavanje ćelija, i proizvodnju citokina (npr., IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, i IFN-γ). U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje ili povećava aktivnost GITR (npr., humanog GITR) zajedno sa GITRL (npr., humanim GITRL). U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje, pojačava, ili povećava aktivnost GITR (npr., humanog GITR) u odsustvu GITRL

24

(npr., humanog GITRL). U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo ili vezujući fragment antitela indukuje, pojačava, ili povećava aktivnost GITR i ne inhibira (npr., ne inhibira potpuno ili inhibira samo delimično) vezivanje GITRL za GITR. U specifičnim tehničkim rešenjima, porast aktivnosti GITR procenjena je kao što je opisano u Primerima, dole.

[0266] U određenim aspektima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje, pojačava, ili povećava proliferaciju ćelija koje eksprimiraju GITR i koje odgovaraju na signalizaciju GITR (npr., ćelije koje proliferišu u odgovoru na stimulaciju GITR i signalizaciju GITR, kao što su T ćelije). Testovi proliferacije ćelija opisani su u struci, to su na primer test inkorporacije<3>H-timidina, test inkorporacije BrdU ili CFSE test, kao što je opisano u Primeru 3, i može ih lako izvesti stručnjak u oblasti. U specifičnim tehničkim rešenjima, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu proliferaciju u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). Vidi Primer 3, dole, koji prikazuje porast proliferacije T ćelija u prisustvu ovde opisanog antitela koje se imunospecifično vezuje za GITR.

[0267] U jednom tehničkom rešenju, CD8<+>T ćelije stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu ćelijsku proliferaciju u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U još jednom tehničkom rešenju, CD4<+>T ćelije stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu ćelijsku proliferaciju u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija

24

(npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U još jednom tehničkom rešenju, CD4<+>T ćelije i CD8<+>T ćelije stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu ćelijsku proliferaciju u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo). U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije koje nisu bile stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu aktivnost GITR i/ili povećanu aktivnost NF-κB u odnosu na T ćelije kada nisu u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR).

[0268] U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava proliferaciju ćelija (npr., T ćelija, kao što su CD4 i CD8 efektorske T ćelije) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test inkorporacije<3>H-timidina, test inkorporacije BrdU ili CFSE test, kao što je opisano u Primeru 3, dole), u odnosu na aktivnost GITR (npr., humanog GITR) u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR). U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava proliferaciju ćelija (npr., T ćelija kao što su CD4 i CD8 efektorske T ćelije) za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test inkorporacije<3>H-timidina, test inkorporacije BrdU ili CFSE test, kako je opisano u Primeru 3, dole), u odnosu na aktivnost GITR (npr., humanog

24

GITR) u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR).

[0269] U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija (npr., anti-CD3 antitelom ili forbol estrom) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju ćelijsku proliferaciju povećanu za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija, kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test inkorporacije<3>H-timidina, test inkorporacije BrdU ili CFSE test, kako je opisano u Primeru 3, dole). U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu ćelijsku proliferaciju za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo), kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test inkorporacije<3>H-timidina, test inkorporacije BrdU ili CFSE test, kako je opisano u Primeru 3, dole). U specifičnom tehničkom rešenju, proliferacija ćelija procenjena je kao što je opisano u Primeru 3, dole.

[0270] U određenim aspektima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava preživljavanje ćelija (npr., T ćelija, kao što su CD4 i CD8 efektorske T ćelije). U specifičnom tehničkom rešenju, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo), u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećano preživljavanje u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija. Testovi preživljavanja ćelija opisani su u struci (npr., test isključivanja tripan plavog) i može ih lako izvesti stručnjak u oblasti.

24

[0271] U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava preživljavanje ćelija (npr., T ćelija, kao što su CD4 i CD8 efektorske T ćelije) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test isključivanja tripan plavog), u odnosu na preživljavanje ćelija u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR). U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), povećava preživljavanje ćelija (npr., T ćelija, kao što su CD4 i CD8 efektorske T ćelije) za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test isključivanja tripan plavog), u odnosu na preživljavanje ćelija u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR).

[0272] U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija (npr., anti-CD3 antitelom ili forbol estrom) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećano ćelijsko preživljavanje za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo), kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test isključivanja tripan plavog). U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećano ćelijsko preživljavanje za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,

2

95%, 98%, ili 99% u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija, kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., test isključivanja tripan plavog).

[0273] U određenim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), štiti efektorske T ćelije (npr., CD4<+>i CD8<+>efektorske T ćelije) od ćelijske smrti indukovane aktivacijom. U nekim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje otpornost efektorskih T ćelija (npr., CD4<+>i CD8<+>efektorskih T ćelija) na Treg-posredovanu supresiju.

[0274] U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje, pojačava, ili povećava proizvodnju citokina (npr., IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, i IFN-γ) za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99%, kako je procenjeno postupcima koji su ovde opisani (vidi Primere, dole, kao što je Primer 3) ili poznati stručnjaku u oblasti, u odnosu na proizvodnju citokina u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR). U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo ili njegov fragment, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje ili pojačava proizvodnju citokina (npr., IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, i IFN-γ) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, kako je procenjeno postupcima koji su opisani ovde (vidi Primere, dole, kao što je Primer 3) ili poznati stručnjaku u oblasti, u odnosu na proizvodnju citokina u prisustvu ili odsustvu stimulacije GITRL (npr., humanim GITRL) bez ikakvog antitela ili sa nesrodnim antitelom (npr., antitelom koje se ne vezuje imunospecifično za GITR).

[0275] U određenim tehničkim rešenjima, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu proizvodnju citokina (npr., IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, i IFN-γ) za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili

2 1

sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo), kako je opisano postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., ELISA test ili kao što je opisano u Primerima, dole). U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije (npr., CD4<+>ili CD8<+>efektorske T ćelije) stimulisane mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) u prisustvu ovde opisanog antitela ili njegovog fragmenta, koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), imaju povećanu proizvodnju citokina (npr., IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, i IFN-γ) za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta, u odnosu na T ćelije stimulisane samo mitogenom T ćelija ili sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija (npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo), kako je procenjeno postupcima opisanim ovde ili poznatim stručnjaku u oblasti (npr., ELISA test ili kao što je opisano u Primerima, dole).

[0276] U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment indukuje, pojačava ili aktivira aktivnost GITR, u odsustvu TCR agonista (npr., anti-CD3 antitela). Aktivnost GITR može da se proceni merenjem aktivacije kanonskog i nekanonskog NF-κB puta. Aktivnost GITR može da se proceni merenjem aktivacije signalnih puteva posredovanih TRAF adapterom. TRAF adapter je odabran iz grupe koja se sastoji od TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, i TRAF5. Aktivnost GITR može da se proceni merenjem aktivacije MAPK/ERK puta (nazvanog još i Ras-Raf-MEK-ERK put). Primeri "TCR agonista" uključuju, ali se ne ograničavaju na antitela koja ciljaju receptorski kompleks T ćelija (npr., anti-CD3 antitelo) i peptide vezane za antigene leukocita čoveka, npr., MHC klase I i MHC klase II, pri čemu su peptidi izvedeni iz sopstvenih, sopstvenih mutiranih, ili sa patogenom udruženih proteina (npr., virusnih ili bakterijskih).

[0277] Anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može biti fuzionisan ili konjugovan (npr., kovalentno ili nekovalentno spojen) sa detektabilnim obeleživačem ili supstancom. Primeri detektabilnih obeleživača ili supstanci uključuju enzimske obeleživače, kao što je glukoza oksidaza; radioizotope, kao što su jod (<125>I,<121>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<121>In), i tehnicijum (<99>Tc); luminescentne obeleživače, kao što je luminol; i fluorescentne obeleživače, kao što su fluorescein i rodamin, i biotin. Tako obeležena

2 2

antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu da se koriste za detektovanje GITR (npr., humanog GITR) proteina. Vidi, npr., Odeljak 5.4.2, dole.

5.2 Proizvodnja antitela

[0278] Antitela ili njihovi fragmenti koji se imunospecifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) mogu se proizvesti bilo kojim u struci poznatim postupkom za sintezu antitela, na primer, hemijskom sintezom ili tehnikama rekombinantne ekspresije. U ovde opisanim postupcima upotrebljavaju se, ukoliko nije drugačije navedeno, konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije, genetičke analize, rekombinantne DNK, organske hemije, biohemije, PCR, sinteze i modifikacije oligonukleotida, hibridizacije nukleinskih kiselina, i srodnih oblasti u okvirima obučenosti u struci. Ove tehnike opisane su, na primer, u ovde citiranim referencama i u potpunosti su objašnjene u literaturi. Vidi, npr., Maniatis T i sar., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J i sar., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J i sar., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM i sar., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 i godišnja obnavljanja); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 i godišnja obnavljanja) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B i sar., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[0279] U specifičnom tehničkom rešenju, ovde opisano antitelo je antitelo (npr., rekombinantno antitelo) pripremljeno, eksprimirano, stvoreno ili izolovano na bilo koji način koji uključuje stvaranje, npr., sintezom, genetičkim inženjeringom DNK sekvenci. U određenim tehničkim rešenjima, takvo antitelo sadrži sekvence (npr., DNK sekvence ili aminokiselinske sekvence) koje prirodno ne postoje u repertoaru antitela germinativne linije životinje ili sisara (npr., čoveka) in vivo.

[0280] U određenom aspektu, ovde je obezbeđen postupak pravljenja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji uključuje kultivisanje ćelije ili ćelije-domaćina opisane ovde. U određenom aspektu, ovde je obezbeđen postupak pravljenja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) koji uključuje eksprimiranje (npr.,

2

rekombinantno eksprimiranje) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta korišćenjem ćelije ili ćelije-domaćina opisane ovde (npr., ćelije ili ćelije-domaćina koja sadrži polinukleotide koji kodiraju ovde opisano antitelo). U posebnom tehničkom rešenju, ćelija je izolovana ćelija. U posebnom tehničkom rešenju, egzogeni polinukleotidi uvedeni su u ćeliju. U posebnom tehničkom rešenju, postupak uključuje još i korak prečišćavanja antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta dobijenog iz ćelije ili ćelije-domaćina.

[0281] Postupci za proizvodnju poliklonskih antitela poznati su u struci (vidi, na primer, Poglavlje 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM i sar., eds., John Wiley and Sons, Njujork).

[0282] Monoklonska antitela mogu da se pripreme korišćenjem velikog broja različitih tehnika poznatih u struci uključujući upotrebu tehnologije hibridoma, rekombinantne tehnologije i tehnologije prikazivanja na fagu, ili njihovu kombinaciju. Na primer, monoklonska antitela mogu se proizvesti korišćenjem tehnika hibridoma uključujući one koje su poznate u struci i objašnjene, na primer, u Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling GJ i sar., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681 (Elsevier, N.Y., 1981). Izraz "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi, nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Na primer, monoklonska antitela mogu da se proizvedu rekombinantno u ćeliji-domaćinu koja egzogeno eksprimira ovde opisano antitelo ili njegov fragment, na primer, laki lanac i/ili teški lanac takvog antitela.

[0283] U specifičnim tehničkim rešenjima, "monoklonsko antitelo," kako se ovde koristi, je antitelo proizvedeno u jednoj ćeliji (npr., hibridoma ili ćelija-domaćin koja proizvodi rekombinantno antitelo), pri čemu se antitelo imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) kako je određeno, npr., pomoću ELISA ili drugog testa vezivanja antigena ili kompetitivnog vezivanja, poznatog u struci ili obezbeđenog ovde u Primerima. U posebnim tehničkim rešenjima, monoklonsko antitelo može biti himerno antitelo ili humanizovano antitelo. U određenim tehničkim rešenjima, monoklonsko antitelo je monovalentno antitelo ili multivalentno (npr., bivalentno) antitelo. U posebnim tehničkim rešenjima, monoklonsko antitelo je monospecifično ili multispecifično antitelo (npr., bispecifično antitelo). Monoklonska antitela opisana ovde mogu, na primer, biti napravljena postupkom hibridoma kako je opisano u Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495 ili može, npr., biti izolovano iz biblioteka faga korišćenjem ovde opisanih tehnika, na primer. Drugi postupci za pripremanje klonskih ćelijskih linija i monoklonskih antitela u njima eksprimiranih dobro su poznati u struci

2 4

(vidi, na primer, Poglavlje 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM i sar., gore).

[0284] Postupci za proizvodnju i pretraživanje specifičnih antitela korišćenjem tehnologije hibridoma rutinski su i dobro poznati u struci. Na primer, u postupku hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja-domaćin, kao ovca, koza, zec, pacov, hrčak, ili makaki majmun, imunizuje se da bi se pobudili limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein (npr., GITR (npr., humani GITR)) upotrebljen za imunizaciju. Alternativno, limfociti se mogu immunizovati in vitro. Limfociti se zatim fuzionišu sa ćelijama mijeloma korišćenjem pogodnog fuzionog sredstva, kao što je polietilen glikol, da se formira ćelija hibridoma (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str.59-103 (Academic Press, 1986)). Pored toga, za imunizovanje životinje može se koristiti RIMMS (repetitive immunization multiple sites, ponavljana imunizacija na velikom broju mesta) tehnika (Kilpatrick KE i sar., (1997) Hybridoma 16:381-9).

[0285] U nekim aspektima, miševi (ili druge životinje, kao što su pacovi, majmuni, magarci, svinje, ovce, hrčak, ili psi) mogu se imunizovati antigenom (npr., GITR (npr., humanim GITR)) i kada se detektuje imunski odgovor, npr., u mišjem serumu detektuju se antitela specifična za antigen, izvadi se slezina miša i izoluju se splenociti. Splenociti se zatim fuzionišu dobro poznatim tehnikama sa bilo kojim pogodnim ćelijama mijeloma, na primer ćelijama iz ćelijske linije SP20 koje se mogu dobiti od American Type Culture Collection (ATCC®) (Manassas, VA), da se formiraju hibridomi. Hibridomi se biraju i kloniraju postupkom velikog razblaženja. U određenim aspektima, izoluju se limfni čvorovi imunizovanih miševa i ćelije fuzionišu sa NS0 ćelijama mijeloma.

[0286] Tako pripremljene ćelije hibridoma zaseju se i gaje u odgovarajućem medijumu za kulturu koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljskim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT ili HPRT), kultivacioni medijum za hibridome tipično će uključivati hipoksantin, aminopterin, i timidin (HAT medijum), što su supstance koje sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija.

[0287] U specifičnim aspektima upotrebljavaju se ćelije mijeloma koje se efikasno fuzionišu, podržavaju stabilnu proizvodnju visokog nivoa antitela u odabranim ćelijama koje proizvode antitelo, i osetljive su na medijum kakav je HAT medijum. Među ovim ćelijskim linijama mijeloma su linije mijeloma miša, kao što je NS0 ćelijska linija ili linije izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 mišjih tumora, koje se mogu nabaviti od Salk Institute Cell Distribution Center, San

2

Diego, CA, USA, i SP-2 ili X63-Ag8.653 ćelije koje se mogu nabaviti od American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. Ćelijske linije humanog mijeloma i ćelijske linije mišjeg-humanog heteromijeloma takođe su bile opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur i sar., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Njujork, 1987)).

[0288] Medijum kulture u kojoj rastu ćelije hibridoma ispitivan je u pogledu proizvodnje monoklonskih antitela usmerenih protiv GITR (npr., humanog GITR). Vezujuća specifičnost monoklonskih antitela proizvedenih ćelijama hibridoma određena je postupcima poznatim u struci, na primer, imunoprecipitacijom ili in vitro testovima vezivanja, kao što je radioimunski test (RIA) ili imunoenzimski test (enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA).

[0289] Posle identifikovanja ćelija hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili aktivnosti, klonovi se mogu subklonirati postupcima velikog razblaženja i gajiti standardnim postupcima (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, gore). Pogodni tome namenjeni kultivacioni medijumi uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI 1640 medijum. Pored toga, ćelije hibridoma mogu se gajiti in vivo kao ascitni tumori u životinji.

[0290] Monoklonska antitela koja sekretuju subklonovi su na odgovarajući način izdvojena iz kultivacionog medijuma, ascitne tečnosti, ili seruma konvencionalnim procedurama prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, protein A-sefaroza, hromatografija na hidroksilapatitu, elektroforeza na gelu, dijaliza, ili afinitetna hromatografija.

[0291] Ovde opisana antitela uključuju fragmente antitela koji prepoznaju specifični GITR (npr., humani GITR) i mogu se stvoriti bilo kojom tehnikom poznatom stručnjacima u oblasti. Na primer, Fab i F(ab')2fragmenti opisani ovde mogu se proizvesti proteolitičkim sečenjem imunoglobulinskih molekula, korišćenjem enzima kao što su papain (da bi se proizveli Fab fragmenti) ili pepsina (da bi se proizveli F(ab')2fragmenti). Fab fragment odgovara jednoj od dve identične ručice molekula antitela i sadrži kompletan laki lanac sparen sa VH i CH1 domenima teškog lanca. F(ab')2fragment sadrži dve antigen-vezujuće ručice molekula antitela povezane disulfidnim vezama u regionu šarke.

[0292] Pored toga, ovde opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu se napraviti i korišćenjem različitih postupaka prikazivanja na fagima, poznatim u struci. U postupcima prikazivanja na fagima, funkcionalni domeni antitela prikazuju se na površini čestica faga koji nose za njih kodirajuće polinukleotidne sekvence. Posebno, DNK sekvence koje kodiraju VH i VL domene amplifikuju se iz biblioteka životinjskih cDNK (npr., biblioteke humanih ili mišjih cDNK iz pogođenih tkiva). DNK koje kodiraju VH i VL domene rekombinuju se zajedno sa scFv linkerom putem PCR i kloniraju u fagemidni vektor. Vektor se

2

elektroporacijom uvede u E. coli i E. coli se inficira pomažućim fagom. Fagi upotrebljeni u ovim postupcima su tipično filamentozni fagi uključujući fd i M13, a VH i VL domeni su obično rekombinantno fuzionisani za gen III ili gen VIII faga. Fag koji eksprimira antigen-vezujući domen koji se vezuje za određeni antigen može se odabrati ili identifikovati antigenom, npr., korišćenjem obeleženog antigena ili antigena vezanog ili kaptiranog na čvrstoj površini ili perlici. Primeri postupaka prikazivanja na fagima koji se mogu upotrebiti za pravljenje ovde opisanih antitela uključuju one objavljene u Brinkman U i sar., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS i sar., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA i sar., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L i sar., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT patentna prijava br. PCT/GB91/001134; Međunarodne publikacije br. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, i WO 97/13844; i U.S. patenti br.5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 i 5,969,108.

[0293] Kao što je opisano u gornjim referencama, posle selekcije faga, regioni koji kodiraju antitelo iz faga mogu da se izoluju i upotrebe za stvaranje celih antitela, uključujući humana antitela, ili bilo kojeg drugog željenog antigen-vezujućeg fragmenta, i eksprimiraju u bilo kojem željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, ćelije biljaka, kvasac, i bakterije, npr., kako je opisano dole. Tehnike za rekombinantnu proizvodnju fragmenata antitela kao što su Fab, Fab' i F(ab')2fragmenti mogu se takođe upotrebiti korišćenjem postupaka poznatih u struci kao što su oni objavljeni u PCT publikaciji br. WO 92/22324; Mullinax RL i sar., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H i sar., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; i Better M i sar., (1988) Science 240: 1041-1043.

[0294] U jednom aspektu, da bi se stvorila cela antitela, PCR prajmeri koji uključuju VH ili VL nukleotidne sekvence, restrikciono mesto, i bočnu sekvencu za zaštitu restrikcionog mesta mogu se koristiti za amplifikovanje VH ili VL sekvenci sa templata, npr., scFv klonova. Korišćenjem tehnika kloniranja poznatih stručnjacima u oblasti, VH domeni amplifikovani pomoću PCR mogu se klonirati u vektore koji eksprimiraju konstantni region VH, a VL domeni amplifikovani pomoću PCR mogu se klonirati u vektore koji eksprimiraju konstantni region VL, npr., humani kapa ili lambda konstantni region. VH i VL domeni mogu i da se kloniraju u jedan vektor koji eksprimira potrebne konstantne regione. Vektori za konverziju teškog lanca i vektori za konverziju lakog lanca se zatim kotransfektuju u ćelijske linije da bi se stvorile stabilne ili prolazne ćelijske linije koje eksprimiraju antitela pune dužine, npr., IgG, korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima u oblasti.

2

[0295] Himerno antitelo je molekul u kojem su različiti delovi antitela poreklom iz različitih imunoglobulinskih molekula. Na primer, himerno antitelo može sadržati varijabilni region mišjeg ili pacovskog monoklonskog antitela fuzionisan sa konstantnim regionom humanog antitela. Postupci za proizvodnju himernih antitela poznati su u struci. Vidi, npr., Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD i sar., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; i U.S. patenti br.

5,807,715, 4,816,567, 4,816,397, i 6,331,415.

[0296] Humanizovano antitelo je sposobno da se veže za unapred određeni antigen i sadrži region okvira koji suštinski ima aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i CDR koji suštinski imaju aminokiselinsku sekvencu nehumanog imunoglobulina (npr., mišjeg imunoglobulina). U posebnim tehničkim rešenjima, humanizovano antitelo sadrži i najmanje deo konstantnog regiona (Fc) imunoglobulina, tipično onaj humanog imunoglobulina. Antitelo takođe može da uključuje CH1, šarku, CH2, CH3, i CH4 regione teškog lanca. Humanizovano antitelo može biti odabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kojeg izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3i IgG4. Humanizovana antitela mogu da se proizvedu korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući ali ne ograničavajući se na CDR-graftovanje (Evropski patent br. EP 239400; Međunarodna publikacija br. WO 91/09967; i U.S. patenti br.5,225,539, 5,530,101, i 5,585,089), "furniranje" ili preoblikovanje površine (Evropski patent br. EP 592106 i EP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM i sar., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; i Roguska MA i sar., (1994) PNAS 91: 969-973), mešanje lanaca (U.S. patent br. 5,565,332), i tehnike objavljene, npr., u U.S. pat. br. 6,407,213, U.S. pat. br. 5,766,886, Međunarodnoj publikaciji br. WO 93/17105; Tan P i sar., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C i sar., (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V i sar., (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M i sar., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA i sar., (1996) Protein Eng 9(10): 895904; Couto JR i sar., (1995) Cancer Res.55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR i sar., (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 i Pedersen JT i sar., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73. Vidi i U.S. objavljena prijava br. US 2005/0042664 A1 (24. februar 2005).

[0297] Postupci za pravljenje multispecifičnih (npr., bispecifičnih antitela) bili su opisani, vidi, na primer, U.S. patenti br.7,951,917; 7,183,076; 8,227,577; 5,837,242; 5,989,830; 5,869,620; 6,132,992 i 8,586,713.

[0298] Jednodomenska antitela, na primer, antitela kojima nedostaju laki lanci, mogu se proizvesti postupcima koji su dobro poznati u struci. Vidi Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD i sar., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-

2

263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; U.S. patent br. 6,005,079; i Međunarodna publikacija br. WO 94/04678, WO 94/25591 i WO 01/44301.

[0299] Pored toga, antitela koja se imunospecifično vezuju za GITR antigen mogu još da se koriste za stvaranje antiidiotipskih antitela koja "imitiraju" antigen upotrebom tehnika dobro poznatih stručnjacima u oblasti. (Vidi, npr., Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; i Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438).

[0300] U posebnim aspektima, ovde opisano antitelo, koje se vezuje za isti epitop GITR (npr., humanog GITR) kao anti-GITR antitelo opisano ovde, je humano antitelo ili njegov antigenvezujući fragment. U posebnim aspektima, antitelo opisano ovde, koje kompetitivno blokira (npr., na dozno-zavisan način) bilo koje od antitela opisanih ovde, (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w) da se veže sa GITR (npr., humanim GITR), je humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Humana antitela mogu da se proizvedu korišćenjem bilo kojeg postupka poznatog u struci. Na primer, mogu da se koriste transgeni miševi koji ne mogu da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da eksprimiraju humane imunoglobulinske gene. Posebno, humani teško- i lakolančani imunoglobulinski genski kompleksi mogu da se uvedu nasumično ili homolognom rekombinacijom u mišje embrionalne matične ćelije. Alternativno, humani varijabilni region, konstantni region, i region diverziteta mogu da se uvedu u mišje embrionalne matične ćelije pored humanih gena za teški i laki lanac. Mišji geni za teški i laki lanac imunoglobulina mogu se učiniti nefunkcionalnim zasebno ili istovremeno sa uvođenjem humanih imunoglobulinskih lokusa homologom rekombinacijom. Posebno, homozigotna delecija JHregiona sprečava proizvodnju endogenog antitela. Modifikovane embrionalne matične ćelije ekspandiraju se i mikroinjektiraju u blastociste da bi se proizveli himerni miševi. Himerni miševi se zatim ukrštaju da bi se proizvelo homozigotno potomstvo koje eksprimira humana antitela. Transgeni miševi se imunizuju na normalan način odabranim antigenom, npr., celim ili delom antigena (npr., GITR). Monoklonska antitela usmerena protiv antigena mogu se dobiti od imunizovanih, transgenih miševa korišćenjem konvencionalne tehnologije hibridoma. Humani imunoglobulinski transgeni koje nose transgeni miševi rearanžiraju se tokom diferencijacije B ćelija, i posledično podležu klasičnom prebacivanju i somatskoj mutaciji. Prema tome, korišćenjem te tehnike, moguće je proizvesti terapijski korisna IgG, IgA, IgM i IgE antitela. Za pregled ove tehnologije proizvodnje humanih antitela, vidi Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93. Za detaljno razmatranje ove

2

tehnologije proizvodnje humanih antitela i humanih monoklonskih antitela i protokole za proizvodnju takvih antitela, vidi, npr., Međunarodne publikacije br. WO 98/24893, WO 96/34096 i WO 96/33735; i U.S. patente br. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 i 5,939,598. Primeri miševa sposobnih da proizvode humana antitela uključuju Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; U.S. patenti br.6,075,181 i 6,150,184), HuAb-Mouse™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; U.S. patenti br. 5,545,806 i 5,569, 825), Trans Chromo Mouse™ (Kirin) i KM Mouse™ (Medarex/Kirin).

[0301] Humana antitela koja se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) mogu da se naprave različitim postupcima poznatim u struci uključujući postupke prikazivanja na fagima opisane gore korišćenjem biblioteka antitela izvedenih iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. Vidi takođe U.S. patenti br. 4,444,887, 4,716,111, i 5,885,793; i Međunarodne publikacije br. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, i WO 91/10741.

[0302] U nekim aspektima, humana antitela mogu da se proizvedu korišćenjem mišjiihhumanih hibridoma. Na primer, limfociti periferne krvi čoveka transformisani Epstein-Barrovim visrusom (EBV) mogu da se fuzionišu sa ćelijama mijeloma miša da bi se proizveli mišji-humani hibridomi koji sekretuju humana monoklonska antitela, a ovi mišji-humani hibridomi mogu da se pretraže da bi se odredili oni koji sekretuju humana monoklonska antitela koja se imunospecifično vezuju za ciljni antigen (npr., GITR (npr., humani GITR)). Takvi postupci su poznati i opisani su u struci, vidi, npr., Shinmoto H i sar., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y i sar., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.

5.2.1 Polinukleotidi

[0303] U određenim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde opisano antitelo ili njegov fragment (npr., varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca) koji se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) antigen, i vektori, npr., vektori koji sadrže takve polinukleotide za rekombinantnu ekspresiju u ćelijama-domaćinima (npr., E. coli i ćelije sisara). Ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju bilo koje od antitela obezbeđenih ovde, kao i vektori koji sadrže takve polinukleotidne sekvence, npr., ekspresioni vektori za njihovu efikasnu ekspresiju u ćelijama-domaćinima, npr., ćelijama sisara.

[0304] Kako se ovde koristi, "izolovani" polinukleotid ili molekul nukleinske kiseline je onaj koji je odvojen od drugih molekula nukleinske kiseline koji su prisutni u prirodnom izvoru

2

(npr., u mišu ili čoveku) molekula nukleinske kiseline. Pored toga, "izolovani" molekul nukleinske kiseline, kao što je cDNK molekul, može da suštinski ne sadrži drugi ćelijski materijal, ili kultivacioni medijum, kada je proizveden rekombinantnim tehnikama, ili da suštinski ne sadrži hemijske prekursore ili druge hemikalije kada je hemijski sintetisan. Na primer, izraz "suštinski ne sadrži" obuhvata preparate polinukleotida ili molekula nukleinske kiseline sa manje od oko 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, ili 0.1% (posebno manje od oko 10%) drugog materijala, npr., ćelijskog materijala, kultivacionog medijuma, drugih molekula nukleinske kiseline, hemijskih prekursora i/ili drugih hemikalija. U specifičnom tehničkom rešenju, molekul(i) nukleinske kiseline koji kodira ovde opisano antitelo izolovan je ili prečišćen.

[0305] U posebnim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidne sekvence kodirajuće za antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, koji se imunospecifično vezuju za GITR polipeptid (npr., humani GITR) i sadrže aminokiselinsku sekvencu ovde opisanu, kao i antitela koja kompetiraju sa takvim antitelima u vezivanju za GITR polipeptid (npr., na dozno-zavisan način), ili koja se vezuje za isti epitop kao što je onaj takvih antitela.

[0306] U određenim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac ili teški lanac ovde opisanog antitela. Polinukleotidi mogu sadržati nukelotidne sekvence koje kodiraju laki lanac koji sadrži VL FR i CDR ovde opisanih antitela (vidi, npr., Tabele 1 i 3). Polinukleotidi mogu sadržati nukleotidne sekvence koje kodiraju teški lanac koji sadrži VH FR i CDR ovde opisanih antitela (vidi, npr., Tabele 2 i 4). U specifičnim aspektima, polinukleotid opisan ovde kodira VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, i 400-518. U specifičnim aspektima, polinukleotid opisan ovde kodira VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 519. U specifičnim aspektima, polinukleotid opisan ovde kodira VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389. U specifičnim aspektima, polinukleotid opisan ovde kodira VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kojeg od antitela 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 202, 207 ili 208). U specifičnim aspektima, polinukleotid opisan ovde kodira VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kojeg od antitela 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 201 ili 206). U specifičnim aspektima, polinukleotid opisan ovde kodira VL domen i VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo kojeg od antitela 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 201-202 i/ili 206-208).

2 1

[0307] U posebnim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-GITR antitelo koje sadrži tri CDR VL lanca, npr., sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 bilo kojeg od antitela opisanih ovde (npr., vidi Tabelu 1, na primer, VL CDR u jednom redu u Tabeli 1). U specifičnim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže tri CDR VH lanca, npr., sadrže VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 bilo kojeg od antitela opisanih ovde (npr., vidi Tabelu 2, na primer, VH CDR u jednom redu u Tabeli 2). U specifičnim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-GITR antitelo koje sadrži tri CDR VH lanca, npr., sadrži VL CDR1, VL CDR2, i VL CDR3 bilo kojeg od antitela opisanih ovde (npr., vidi Tabelu 1, npr., VL CDR u jednom redu u Tabeli 1) i tri CDR VH lanca, npr., sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 bilo kojeg od antitela opisanih ovde (npr., vidi Tabelu 2, npr., VH CDR u jednom redu u Tabeli 2). U specifičnim aspektima, ovde opisani polinukleotid kodira VL CDR bilo kojeg od antitela 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 16, 17, ili 18). U specifičnim aspektima, ovde opisani polinukleotid kodira VH CDR bilo kojeg od antitela 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 13, 14, ili 15). U specifičnim aspektima, ovde opisani polinukleotid kodira VL CDR i VH CDR bilo kojeg od antitela 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 (npr., SEQ ID NO: 13-18).

[0308] U posebnim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu kodirajuću za anti-GITR antitelo koje sadrži VL domen, npr., sadrži FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, sa aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., vidi Tabele 1 i 3, npr., VL CDR i VLFR određenog antitela identifikovanog imenom u tabelama). U specifičnim aspektima, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu kodirajuću za anti-GITR antitelo koje sadrži VH domen, npr., sadrži FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, sa aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., vidi Tabele 2 i 4, npr., VH CDR i VH FR određenog antitela identifikovanog imenom u Tabelama).

[0309] U određenim aspektima, polinukleotid opisan ovde sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde obezbeđeno antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208, i 400-518 ili SEQ ID NO:519), pri čemu se antitelo imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR). U određenom aspektu, polinukleotid opisan ovde sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitela Hum231#1 ili Hum231#2 ili Hum23 1#2w obezbeđena ovde koja sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., SEQ ID NO: 207 ili 208).

[0310] U određenim aspektima, polinukleotid opisan ovde sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde obezbeđeno antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca sa

2 2

aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389), pri čemu se antitelo imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR). U određenom tehničkom rešenju, polinukleotid opisan ovde sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitela Hum231#1, Hum231#2 ili Hum231#2w obezbeđena ovde koja sadrže varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., SEQ ID NO: 206).

[0311] U određenim aspektima, polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu kodirajuću za ovde opisano antitelo koje sadrži VL domen koji sadrži jedan ili više VL FR sa aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., vidi Tabelu 3, npr., regioni okvira u jednom redu tabele), pri čemu se antitelo imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR). U određenim aspektima, polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu kodirajuću za ovde opisano antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži jedan ili više VH FR sa aminokiselinskom sekvencom opisanom ovde (npr., vidi Tabelu 4, npr., regioni okvira u jednom redu tabele), pri čemu se antitelo imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR).

[0312] U specifičnim aspektima, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde opisano antitelo koje sadrži: regione okvira (npr., region okvira VL domena i VH domena) koji su humani regioni okvira, pri čemu se antitelo imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR). U određenim aspektima, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili njegov fragment (npr., CDR ili varijabilni domen) opisan u Odeljku 5.1 gore.

[0313] U specifičnim aspektima, ovde je obezbeđen polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu kodirajuću za antitelo koje sadrži laki lanac i teški lanac, npr., zasebni laki lanac i teški lanac. U pogledu lakog lanca, u specifičnom tehničkom rešenju, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira kapa laki lanac. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira lambda laki lanac.

U još jednom specifičnom tehničkom rešenju, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde opisano antitelo koje sadrži humani kapa laki lanac ili humani lambda laki lanac. U posebnom aspektu, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo opisano ovde koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), pri čemu antitelo sadrži laki lanac, i pri čemu aminokiselinska sekvenca VL domena može sadržati bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208 i 400-518 ili SEQ ID NO:519), i pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog kapa lakog lanca. U još jednom posebnom aspektu, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukelotidnu

2

sekvencu koja kodira antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), i sadrži laki lanac, pri čemu aminokiselinska sekvenca VL domena može sadržati bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., SEQ ID NO: 202, 204, 205, 207, 208 i 400-518 ili SEQ ID NO:519), i pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog lambda lakog lanca. Na primer, sekvence humanog konstantnog regiona mogu biti one koje su opisane u U.S. patentu br.

5,693,780.

[0314] U posebnom aspektu, ovde obezbeđeni polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), pri čemu antitelo sadrži teški lanaca, pri čemu aminokiselinska sekvenca VH domena može sadržati bilo koju aminokiselinsku sekvencu opisanu ovde (npr., SEQ ID NO: 201, 203, 206 i 215-389), i pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona humanog gama (γ) teškog lanca.

[0315] U određenom aspektu, polinukleotid obezbeđen ovde sadrži nukleotidnu sekvencu (-e) koja kodira VH domen i/ili VL domen ovde opisanih antitela (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107 kao što su SEQ ID NO: 209 ili 800-974 za VH domen ili SEQ ID NO: 210, 211 ili 1001-1126 za VL domen), koja se imunospecifično vezuju za GITR (npr., humani GITR). U određenom aspektu, polinukleotid obezbeđen ovde sadrži nukleotidnu sekvencu (-e) koja kodira VH domen i/ili VL domen antitela opisanih ovde (npr., Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 kao što su SEQ ID NO: 209 ili 800-974 za VH domen ili SEQ ID NO: 210, 211 ili 1000-1118 za VL domen), koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR). U određenom aspektu, polinukleotid obezbeđen ovde sadrži nukleotidnu sekvencu (-e) koja kodira VH domen i/ili VL domen antitela Hum231#1 ili Hum231# (npr., SEQ ID NO: 209-211).

[0316] U još jednom specifičnom aspektu, polinukleotid obezbeđen ovde sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ovde opisano antitelo (ili njegov antigen-vezujući fragment), koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), pri čemu antitelo sadrži VL domen i VH domen koji sadrže bilo koje aminokiselinske sekvence opisane ovde, i pri čemu konstantni regioni sadrže aminokiselinske sekvence konstantnih regiona humanog IgG1(npr., alotip 1, 17, ili 3) ili humanog IgG4.

2 4

[0317] U specifičnom aspektu, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-GITR antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment ili njegov domen, dizajniran ovde, vidi, npr., Tabele 1-4, na primer antitelo Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15, ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, pab2161, ili Hum231#2w.

[0318] Isto tako, ovde su obezbeđeni polinukleotidi koji kodiraju anti-GITR antitelo ili njegov fragment optimizovan, npr., kodon/RNK optimizacijom, zamenom heterologim signalnim sekvencama, i eliminacijom elemenata nestabilnosti iRNK. Postupci stvaranja optimizovanih nukleinskih kiselina koje kodiraju anti-GITR antitelo ili njegov fragment (npr., laki lanac, teški lanac, VH domen, ili VL domen) za rekombinantnu ekspresiju uvođenjem promena kodona i/ili eliminisanjem inhibitornih regiona u iRNK mogu se izvesti prilagođavanjem postupaka opisanih, npr., u U.S. patentima br. 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; i 6,794,498, prema tome. Na primer, potencijalna mesta splajsovanja i elementi nestabilnosti (npr., elementi bogati A/T ili A/U) unutar RNK mogu se mutirati bez izmene amino-kiselina kodiranih sekvencama nukleinske kiseline da bi se povećala stabilnost RNK za rekombinantnu ekspresiju. Izmene koriste degenerisanost genetičkog koda, npr., upotrebom alternativnog kodona za identičnu amino-kiselinu. U nekim aspektima, može biti poželjno zameniti jedan ili više kodona da bi se kodirala konzervativna mutacija, npr., slična amino-kiselina sa sličnom hemijskom strukturom i osobinama i/ili funkcijom kao originalna amino-kiselina. Takvi postupci mogu povećati ekspresiju anti-GITR antitela ili njegovog fragmenta za najmanje 1 put, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, ili 100 puta ili više u odnosu na ekspresiju anti-GITR antitela kodiranog polinukleotidima koji nisu bili optimizovani.

[0319] U određenim tehničkim rešenjima, optimizovana polinukleotidna sekvenca koja kodira anti-GITR antitelo opisano ovde ili njegov fragment (npr., VL domen i/ili VH domen) može da se hibridizuje sa nekodirajućim (npr., komplementarnim) polinukleotidom neoptimizovane polinukleotidne sekvence koja kodira anti-GITR antitelo opisano ovde ili njegov fragment (npr., VL domen i/ili VH domen). U specifičnim tehničkim rešenjima, optimizovana nukleotidna sekvenca koja kodira anti-GITR antitelo opisano ovde ili fragment hibridizuje se pod uslovima visoke stringentnosti sa nekodirajućim polinukleotidom neoptimizovane polinukleotidne sekvence koja kodira anti-GITR antitelo opisano ovde ili njegov fragment. U specifičnom tehničkom rešenju, optimizovana nukleoetidna sekvenca koja kodira anti-GITR antitelo opisano ovde ili njegov fragment hibridizuje se pod uslovima visoke stringentnosti,

2

intermedijarne ili niže stringentnosti sa nekodirajućim polinukleotidom neoptimizovane nukleotidne sekvence koja kodira anti-GITR antitelo opisano ovde ili njegov fragment. Opisane su informacije u vezi sa uslovima hibridizacije, vidi, npr., U.S. objavljena patentna prijava br. US 2005/0048549 (npr., paragrafi 72-73).

[0320] Polinukleotidi se mogu dobiti, i nukleotidna sekvenca polinukleotida odrediti, bilo kojim postupkom poznatim u struci. Nukleotidne sekvence koje kodiraju ovde opisana antitela, npr., antitela opisana u Tabelama 1-4, i modifikovane verzije ovih antitela mogu se odrediti korišćenjem postupaka dobro poznatih u struci, tj., nukleotidni kodoni za koje se zna da kodiraju određene amino-kiseline sklapaju se na takav način da stvaraju nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. Takav polinukleotid koji kodira antitelo može se sklopiti od hemijski sintetisanih oligonukleotida (npr., kako je opisano u Kutmeier G i sar., (1994), BioTechniques 17: 242-6), što, ukratko, uključuje sintezu preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo, sparivanje i povezivanje ovih oligonukleotida, i zatim amplifikaciju povezanih oligonukleotida pomoću PCR.

[0321] Alternativno, polinukeleotid koji kodira antitelo opisano ovde može se napraviti od nukleinske kiseline iz pogodnog izvora (npr., hibridoma) korišćenjem postupaka dobro poznatih u struci (npr., PCR i drugi postupci molekularnog kloniranja). Na primer, PCR amplifikacija u kojoj se koriste veštački prajmeri koji mogu da se hibridizuju sa 3' i 5' krajem poznate sekvence može se izvesti korišćenjem genomske DNK dobijene iz ćelija hibridoma koje proizvode antitelo od interesa. Takvi postupci PCR amplifikacije mogu se upotrebiti za dobijanje nukleinskih kiselina koje sadrže sekvencu koja kodira laki lanac i/ili teški lanac antitela. Takvi postupci PCR amplifikacije mogu se upotrebiti za dobijanje nukleinskih kiselina koje sadrže sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca antitela. Amplifikovane nukleinske kiseline mogu se klonirati u vektore za ekspresiju u ćelijama-domaćinima i za dalje kloniranje, na primer, za stvaranje himernih i humanizovanih antitela.

[0322] Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira određeno antitelo nije na raspolaganju, ali je sekvenca molekula antitela poznata, nukleinska kiselina koja kodira imunoglobulin može se hemijski sintetisati ili dobiti iz pogodnog izvora (npr., biblioteke cDNK antitela ili biblioteke cDNK napravljene iz, ili nukleinske kiseline, poželjno poli A+ RNK, izolovane iz, bilo kog tkiva ili ćelija koji eksprimiraju antitelo, kao što su ćelije hibridoma selektovane da eksprimiraju antitelo opisano ovde) PCR amplifikacijom uz korišćenje veštačkih prajmera koji mogu da se hibridizuju sa 3' i 5' krajem sekvence ili kloniranjem uz korišćenje oligonukleotidne probe specifične za određenu gensku sekvencu da se

2

identifikuje, npr., cDNK klon iz biblioteke cDNK koji kodira antitelo. Amplifikovane nukleinske kiseline napravljene pomoću PCR tada mogu da se kloniraju u replikabilne klonirajuće vektore korišćenjem postupaka dobro poznatih u struci.

[0323] DNK koja kodira anti-GITR antitela opisana ovde može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., korišćenjem oligonukleotidnih proba koje mogu da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance anti-GITR antitela). Ćelije hibridoma mogu da služe kao izvor takve DNK. Kada se izoluje, DNK može da se uvede u ekspresione vektore, koji se onda transfektuju u ćelije-domaćine kao što su ćelije E. coli, simian COS ćelije, ćelije ovarijuma kineskog hrčka (Chinese hamster ovary, CHO) (npr., CHO ćelije iz CHO GS System™ (Lonza)), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, da bi se dobila sinteza anti-GITR antitela u rekombinantnim ćelijama-domaćinima.

[0324] Da bi se napravila cela antitela, PCR prajmeri koji uključuju VH ili VL nukleotidne sekvence, restrikciono mesto, i bočnu sekvencu za zaštitu restrikcionog mesta mogu se upotrebiti za amplifikovanje VH ili VL sekvence u scFv klonovima. Korišćenjem tehnika kloniranja koje su poznate stručnjacima u oblasti, VH domeni amplifikovani pomoću PCR mogu da se kloniraju u vektore koji eksprimiraju konstantni region teškog lanca, npr., humani gama 4 konstantni region, a VL domeni amplifikovani pomoću PCR mogu da se kloniraju u vektore koji eksprimiraju konstantni region lakog lanca, npr., humane kapa ili lambda konstantne regione. U određenim tehničkim rešenjima, vektori za ekspresiju VH ili VL domena sadrže EF-1α promotor, sekrecioni signal, klonirajuće mesto za varijabilni domen, konstantne domene, i selekcioni marker kao što je neomicin. VH i VL domeni mogu i da se kloniraju u jedan vektor koji eksprimira neophodne konstantne regione. Vektori za konverziju teškog lanca i vektori za konverziju lakog lanca se zatim kotransfektuju u ćelijske linije da bi se stvorile stabilne ili prolazne ćelijske linije koje eksprimiraju antitela pune dužine, npr., IgG, korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima u oblasti.

[0325] DNK može i da se modifikuje, na primer, supstituisanjem kodirajućih sekvenci konstantnih domena humanog teškog i lakog lanca na mesto mišjih sekvenci, ili kovalentnim pripajanjem imunoglobulin-kodirajućoj sekvenci cele ili dela kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid.

[0326] Obezbeđeni su i polinukleotidi koji se hibridizuju pod hibridizacionim uslovima visoke stringentnosti, intermedijarne ili niže stringentnosti sa polinukleotidima koji kodiraju ovde opisano antitelo. U specifičnim aspektima, polinukleotidi opisani ovde hibridizuju se pod hibridizacionim uslovima visoke stringentnosti, intermedijarne ili niže stringentnosti sa

2

polinukleotidima koji kodiraju VH domen (npr., SEQ ID NO: 201, 203, 206, i 215-389) i/ili VL domen (npr., 202, 204, 205, 207, 208, i 400-518 ili SEQ ID NO: 519) obezbeđenim ovde.

[0327] Uslovi hibridizacije opisani su u struci i poznati su stručnjaku u oblasti. Na primer, hibridizacija pod stringentnim uslovima može uključivati hibridizaciju sa DNK vezanu za filter u 6x natrijum hloridu/natrijum citratu (sodium chloride/sodium citrate, SSC) na oko 45° C praćenu jednim ili više ispiranja u 0.2xSSC/0.1% SDS na oko 50-65° C; hibridizacija pod uslovima visoke stringentnosti može uključivati hibridizaciju sa nukleinskom kiselinom vezanom za filter u 6xSSC na oko 45° C praćenu jednim ili više ispiranja u 0.1xSSC/0.2% SDS na oko 68° C. Hibridizacija pod drugim stringentnim uslovima hibridizacije poznata je stručnjacima u oblasti i opisana je, vidi, na primer, Ausubel FM i sar., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Njujork na stranama 6.3.1-6.3.6 i 2.10.3.

5.2.2 Ćelije i vektori

[0328] U određenim aspektima, ovde su obezbeđene ćelije (npr., ćelije-domaćini) koje eksprimiraju (npr., rekombinantno) antitela opisana ovde (ili njihov antigen-vezujući fragment) koja se specifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) i polinukleotidi i ekspresioni vektori povezani sa njima. Ovde su obezbeđeni vektori (npr., ekspresioni vektori) koji sadrže polinukleotide koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju anti-GITR antitela ili fragment za rekombinantnu ekspresiju u ćelijama-domaćinima, poželjno u ćelijama sisara. Ovde su obezbeđene i ćelije-domaćini koje sadrže takve vektore za rekombinantnu ekspresiju anti-GITR antitela opisanih ovde (npr., humano ili humanizovano antitelo). U posebnom aspektu, ovde su obezbeđeni postupci za proizvodnju ovde opisanog antitela, koji uključuju eksprimiranje takvog antitela u ćeliji-domaćinu.

[0329] Rekombinantna ekspresija ovde opisanog antitela (npr., antitela pune dužine, teškog i/ili lakog lanca antitela, ili jednolančanog antitela opisanog ovde) koje se specifično vezuje za GITR (npr., humani GITR) uključuje konstruisanje ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo. Kada se dobije polinukleotid koji kodira molekul antitela, teški i/ili laki lanac antitela, ili fragment istog (npr., varijabilni domeni teškog i/ili lakog lanca) opisan ovde, vektor za proizvodnju molekula antitela može se proizvesti tehnologijom rekombinantne DNK korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci. Prema tome, ovde su opisani postupci za pripremanje proteina ekspresijom polinukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili fragment antitela (npr., laki lanac ili teški lanac). Postupci koji su dobro

2

poznati stručnjacima u oblasti mogu se koristiti za konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela (npr., laki lanac ili teški lanac) i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne signale. Ovi postupci uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, tehnike sinteze, i in vivo genetičku rekombinaciju. Obezbeđeni su i replikabilni vektori koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira molekul antitela opisanog ovde, teški ili laki lanac antitela, varijabilni domen teškog ili lakog lanca antitela ili fragment istog, ili CDR teškog ili lakog lanca CDR, operabilno povezan sa promotorom. Takvi vektori mogu, na primer, uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (vidi, npr., Međunarodna publikacija br. WO 86/05807 i WO 89/01036; i U.S. patent br.5,122,464) i varijabilni domeni antitela mogu da se kloniraju u takav vektor za ekspresiju celog teškog, celog lakog lanca, ili celog i teškog i lakog lanca.

[0330] Ekspresioni vektor može da se uvede u ćeliju (npr., ćeliju-domaćina) konvencionalnim tehnikama i rezultujuće ćelije mogu da se kultivišu konvencionalnim tehnikama da bi proizvele ovde opisano antitelo (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161) ili njegov fragment. Prema tome, ovde su obezbeđene ćelije-domaćini koje sadrže polinukleotid koji kodira ovde opisano antitelo ili njegove fragmente, ili njegov teški ili laki lanac, ili fragment istog, ili jednolančano antitelo opisano ovde (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), operabilno povezane sa promotorom za ekspresiju takvih sekvenci u ćeliji-domaćinu. U određenim tehničkim rešenjima, za ekspresiju dvolančanih antitela, vektori koji kodiraju i teške i lake lance, pojedinačno, mogu da se eksprimiraju u ćeliji-domaćinu za ekspresiju celog imunoglobulinskog molekula, kao što je detaljno opisano dole. U određenim tehničkim rešenjima, ćelija-domaćin sadrži vektor koji sadrži polinukleotid kodirajući za teški lanac i laki lanac antitela opisanog ovde (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), ili njegov fragment. U specifičnim tehničkim rešenjima, ćelija-domaćin sadrži dva različita vektora, prvi vektor koji sadrži polinukleotid koji

2

kodira teški lanac ili varijabilni region teškog lanca antitela opisanog ovde (npr., antitela koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), ili fragment istog, i drugi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac ili varijabilni region lakog lanca antitela opisanog ovde (npr., antitela koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), ili fragment istog. U drugim tehničkim rešenjima, prva ćelijadomaćin sadrži prvi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac ili varijabilni region teškog lanca antitela opisanog ovde (npr., antitela koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), ili fragment istog, i druga ćelija-domaćin sadrži drugi vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac ili varijabilni domen lakog lanca antitela opisanog ovde (npr., antitela koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161). U specifičnim tehničkim rešenjima, teški lanac/varijabilni region teškog lanca eksprimiran u prvoj ćeliji udružuje se sa lakim lancem/varijabilnim regionom lakog lanca druge ćelije da se formira anti-GITR antitelo opisano ovde (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161) ili njegov antigen-vezujući fragment. U određenim tehničkim rešenjima, ovde je obezbeđena populacija ćelija-domaćina koja sadrži takvu prvu ćeliju-domaćina i takvu drugu ćelijudomaćina.

[0331] U posebnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđena populacija vektora koja sadrži prvi vektor koji sadrži polinukleotid kodirajući za laki lanac/varijabilni region lakog lanca anti-GITR antitela opisanog ovde (npr., antitela koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-

2

32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161), i drugi vektor koji sadrži polinukleotid kodirajući za teški lanac/varijabilni region teškog lanca anti-GITR antitela opisanog ovde (npr., antitela koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161).

[0332] Različiti sistemi domaćin-ekspresioni vektor mogu se koristiti za ekspresiju molekula antitela opisanog ovde (npr., antitela koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161 (vidi, npr., U.S. patent br.

5,807,715). Takvi domaćin-ekspresioni sistemi predstavljaju prenosnike kojima se kodirajuće sekvence od interesa mogu proizvesti i potom prečistiti, ali predstavljaju i ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transfektuju odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, eksprimirati molekul antitela opisanog ovde in situ. Oni uključuju ali se ne ograničavaju na mikroorganizme kao što su bakterije (npr., E. coli i B. subtilis) transformisane rekombinantnim bakteriofagnim DNK, plazmidnim DNK ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; kvasac (npr., Saccharomyces Pichia) transformisan rekombinantnim kvaščevim ekspresionim vektorima koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; insekatske ćelijske sisteme inficirane rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr., bakulovirus) koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; biljne ćelijske sisteme (npr., zelene alge kao što je Chlamydomonas reinhardtii) inficirane rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr., virus mozaika karfiola (cauliflower mosaic virus), CaMV; virus mozaika duvana (tobacco mosaic virus), TMV) ili transformisani rekombinantnim plazmidnim ekspresionim vektorima (npr., Ti plazmid) koji sadrže sekvence koje kodiraju antitelo; ili sisarske ćelijske sisteme (npr., COS (npr., COS1 ili COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, i NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 i BMT10 ćelije) koji nose rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotore izvedene iz genoma ćelija sisara (npr., metalotioneinski promotor) ili iz sisarskih virusa (npr., kasni promotor adenovirusa; 7.5K promotor vaccinia virusa). U specifičnom tehničkom rešenju, ćelije za eksprimiranje antitela opisanih ovde (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili

2 1

antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161) ili antigen-vezujućeg fragmenta istog su CHO ćelije, na primer CHO ćelije iz CHO GS System™ (Lonza). U posebnom tehničkom rešenju, ćelije za eksprimiranje ovde opisanih antitela su humane ćelije, npr., humane ćelijske linije. U specifičnom tehničkom rešenju, sisarski ekspresioni vektor je pOptiVEC™ ili pcDNA3.3. U posebnom tehničkom rešenju, bakterijske ćelije kao što je Escherichia coli, ili eukariotske ćelije (npr., sisarske ćelije), posebno za ekspresiju celog molekula rekombinantnog antitela, koriste se za ekspresiju molekula rekombinantnog antitela. Na primer, sisarske ćelije kao što su ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), u sprezi sa vektorom kao što je glavni intermedijarni rani genski promotorski element iz humanog citomegalovirusa predstavljaju efikasan ekspresioni sistem za antitela (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; i Cockett MI i sar., (1990) Biotechnology 8(7): 662-7). U određenim tehničkim rešenjima, antitela opisana ovde proizvode se CHO ćelijama ili NS0 ćelijama. U specifičnom tehničkom rešenju, ekspresija nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antitela opisana ovde koja se imunospecifično vezuju za GITR (npr., humani GITR) regulisana je konstitutivnim promotorom, inducibilnim promotorom ili tkivno-specifičnim promotorom.

[0333] U bakterijskim sistemima, brojni ekspresioni vektori mogu se pogodno odabrati u zavisnosti od nameravane upotrebe molekula antitela koje se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog antitela, za pravljenje farmaceutskih kompozicija molekula antitela, poželjni mogu biti vektori koji vode ekspresiju visokih nivoa fuzionih proteinskih proizvoda koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali se ne ograničavaju na ekspresioni vektor E. coli pUR278 (Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794), u kojem sekvenca koja kodira antitelo može biti vezana individualno u vektoru u ramu sa lac Z kodirajućim regionom tako da se proizvede fuzioni protein; pIN vectori (Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509); i slično. Na primer, pGEX vektori mogu da se koriste i za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation 5-transferazom (glutathione 5-transferase, GST). Obično, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i mogu se lako prečistiti iz liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matriksne glutation-agarozne perlice što je praćeno elucijom u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori dizajnirani su da uključuju mesto sečenja trombinom ili proteazom faktor Xa tako da klonirani ciljni genski proizvod može da se oslobodi iz GST komponente.

[0334] U insekatskom sistemu, virus nukleusne poliedroze Autographa californica (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV), na primer, može da se koristi kao vektor za eksprimiranje stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera

2 2

frugiperda. Sekvenca koja kodira antitelo može da se klonira individualno u neesencijalne regione (na primer gen za poliedrin) virusa i postavi pod kontrolu AcNPV promotora (na primer poliedrinski promotor).

[0335] U sisarskim ćelijama-domaćinima, mogu se koristiti brojni ekspresioni sistemi na bazi virusa. U slučajevima kada se kao ekspresioni vektor koristi adenovirus, sekvenca koja kodira antitelo od interesa može biti vezana za adenovirusni transkripcioni/translacioni kontrolni kompleks, npr., kasni promotor i trodelnu lidersku sekvencu. Ovaj himerni gen može zatim da se insertuje u adenovirusni genom in vitro ili in vivo rekombinacijom. Insercija u neesencijalni region virusnog genoma (npr., region El ili E3) za rezultat će imati rekombinantni virus koji je vijabilan i sposoban da eksprimira molekul antitela u inficiranim domaćinima (npr., vidi Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9). Specifični inicijacioni signali takođe mogu biti potrebni za efikasnu translaciju insertovanih sekvenci koje kodiraju antitelo. Ovi signali uključuju ATG inicijacioni kodon i susedne sekvence. Pored toga, inicijacioni kodon mora biti u fazi sa ramom čitanja željene kodirajuće sekvence da bi se osigurala translacija čitavog inserta. Ovi egzogeni translacioni kontrolni signali i inicijacioni kodoni mogu biti različitog porekla, i prirodni i sintetski. Efikasnost ekspresije može se pojačati uključivanjem odgovarajućih transkripcionih enhenserskih elemenata, terminatora transkripcije, itd. (vidi, npr., Bitter G i sar., (1987) Methods Enzymol.153: 516-544).

[0336] Pored toga, može da se odabere soj ćelije-domaćina koji moduliše ekspresiju insertovanih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na specifičan željeni način. Takve modifikacije (npr., glikozilacija) i obrada (npr., sečenje) proteinskih proizvoda mogu biti važni za funkcionisanje proteina. Različite ćelije-domaćini imaju karakteristike i specifične mehanizme za posttranslacionu obradu i modifikovanje proteina i genskih proizvoda. Pogodne ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu se odabrati tako da osiguraju ispravnu modifikaciju i obradu stranog eksprimiranog proteina. U tom cilju, mogu se upotrebiti eukariotske ćelijedomaćini koje poseduju ćelijsku mašineriju za ispravnu obradu primarnog transkripta, glikozilaciju, i fosforilaciju genskog proizvoda. Takve sisarske ćelije-domaćini uključuju, ali se ne ograničavaju na CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, NS0 (ćelijska linija mišjeg mijeloma koja endogeno ne proizvodi nikakve imunoglobulinske lance), CRL7O3O, COS (npr., COS1 ili COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 i HsS78Bst ćelije. U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitela opisana ovde (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973,

2

pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161) proizvode se u sisarskim ćelijama kao što su CHO ćelije.

[0337] U specifičnom tehničkom rešenju, antitela opisana ovde ili njihovi antigen-vezujući fragmenti imaju smanjeni sadržaj fukoze ili uopšte ne sadrže fukozu. Takva antitela mogu da se proizvedu korišćenjem tehnika poznatih stručnjaku u oblasti. Na primer, antitela mogu da se eksprimiraju u ćelijama koje su deficijentne ili nemaju sposobnost da u fukozilat. U specifičnom primeru, ćelijske linije sa nokautom oba alela za α1,6-fukoziltransferazu mogu se upotrebiti za proizvodnju antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata sa smanjenim sadržajem fukoze. Potelligent® sistem (Lonza) je primer takvog sistema koji može da se koristi za proizvodnju antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata sa amanjenim sadržajem fukoze.

[0338] Za dugotrajnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa visokim prinosom, mogu se stvoriti ćelije sa stabilnom ekspresijom. Na primer, mogu se inženjerisati ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju ovde opisano anti-GITR antitelo (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili antitela pab2159, pab2160, ili pab2161) ili njegov antigen-vezujući fragment. U specifičnim tehničkim rešenjima, ovde obezbeđena ćelija stabilno eksprimira laki lanac/varijabilni domen lakog lanca i teški lanac/varijabilni domen teškog lanca koji se udružuju da bi formirali ovde opisano antitelo (npr., antitelo koje sadrži CDR bilo kojeg od antitela Hum231#1, Hum231#2, pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, 231-32-15 ili antitela 1-107, ili anti pab2159, pab2160, ili pab2161) ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0339] U određenim aspektima, umesto da se koriste ekspresioni vektori koji sadrže virusna mesta početka replikacije, ćelije-domaćini mogu da se transformišu pomoću DNK koja je kontrolisana odgovarajućim ekspresionim kontrolnim elementima (npr., promotor, enhenser, sekvence, terminatori transkripcije, poliadenilaciona mesta, itd.), i selektabilnim markerom. Posle uvođenja strane DNK/polinukleotida, inženjerisane ćelije mogu da se ostave da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu, i da se zatim prebace na selektivni medijum. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu daje rezistenciju na selekciju i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu da bi formirale fokuse koji će dalje moći da se kloniraju i ekspandiraju u ćelijske linije. Ovaj postupak se može korisno upotrebiti za inženjerisanje ćelijskih linija koje eksprimiraju ovde opisano anti-GITR antitelo ili njegov

2 4

fragment. Takve inženjerisane ćelijske linije mogu biti posebno korisne u pretraživanju i evaluaciji kompozicija koje direktno ili indirektno interaguju sa molekulom antitela.

[0340] Mogu se koristiti brojni selekcioni sistemi, uključujući ali ne ograničavajući se na gene za timidin kinazu herpes simpleks virusa (Wigler M i sar., (1977) Cell 11(1): 223-32), hipoksantinguanin fosforiboziltransferazu (Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) i adenin fosforiboziltransferazu (Lowy I i sar., (1980) Cell 22(3): 817-23) koji mogu da se koriste u tk-, hgprt-, odnosno aprt-ćelijama. Isto tako, antimetabolitska rezistencija može da se koristi kao baza za selekciju sledećih gena: dhfr, koji daje rezistenciju na metotreksat (Wigler M i sar., (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K i sar., (1981) PNAS 78: 1527-31); gpt, koji daje rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); neo, koji daje rezistenciju na aminoglikozid G-418 (Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; i Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); i hygro, koji daje rezistenciju na higromicin (Santerre RF i sar., (1984) Gene 30(1-3): 147-56). Postupci koji su opštepoznati u oblasti tehnologije rekombinantne DNK mogu se rutinski primeniti za selektovanje željenog rekombinantnog klona i ti postupci opisani su, na primer, u Ausubel FM i sar., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); i u Poglavljima 12 i 13, Dracopoli NC i sar., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbère-Garapin F i sar., (1981) J Mol Biol 150: 1-14.

[0341] Nivoi ekspresije molekula antitela mogu se povećati vektorskom amplifikacijom (za pregled, vidi Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, Njujork, 1987)). Kada marker u vektorskom sistemu koji eksprimira antitelo može da se amplifikuje, porast nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelije-domaćina povećaće broj kopija markerskog gena. Pošto je amplifikovani region udružen sa genom za antitelo, proizvodnja antitela će takođe porasti (Crouse GF i sar., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).

[0342] Ćelija-domaćin može da se kotransfektuje korišćenjem dva ili više ekspresionih vektora opisanih ovde, prvi vektor kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržati identične selektabilne markere koji omogućavaju jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Ćelije-domaćini mogu da se kotransfektuju različitim količinama dva ili više ekspresionih vektora. Na primer, ćelije-

2

domaćini mogu da se transfektuju bilo kojim od sledećih odnosa prvog ekspresionog vektora i drugog ekspresionog vektora: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, ili 1:50.

[0343] Alternativno, može da se upotrebi jedan vektor koji kodira, i sposoban je da eksprimira, polipeptide i teškog i lakog lanca. U takvim situacijama, laki lanac treba da se stavi pre teškog lanca da bi se izbegao višak toksičnog slobodnog teškog lanca (Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; i Kohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). Sekvence koje kodiraju teške i lake lance mogu sadržati cDNK ili genomsku DNK. Ekspresioni vektor može biti monocistronski ili multicistronski. Multicistronski konstrukt nukleinske kiseline može kodirati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više, ili u rasponu od 2-5, 5-10 ili 10-20 gena/nukleotidnih sekvenci. Na primer, bicistronski nukleinsko-kiselinski konstrukt može sadržati, sledećim redom, promotor, prvi gen (npr., teški lanac ovde opisanog antitela), i drugi gen i (npr., laki lanac ovde opisanog antitela). U takvom ekspresionom vektoru, transkripcija oba gena može da bude vođena promotorom, dok translacija iRNK sa prvog gena može biti po "cap"-zavisnom skenirajućem mehanizmu i translacija iRNK sa drugog gena može biti po "cap"-nezavisnom mehanizmu, npr., putem IRES.

[0344] Kada se molekul ovde opisanog antitela proizvede rekombinantnom ekspresijom, on može da se prečisti bilo kojim postupkom poznatim u struci prečišćavanja imunoglobulinskog molekula, na primer, hromatografijom (npr., jonoizmenjivačkom, afinitetnom, posebno afinitetnom za specifični antigen posle Proteina A, i hromatografijom baziranoj na veličini čestica, na koloni), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom prečišćavanja proteina. Pored toga, ovde opisana antitela mogu da se fuzionišu sa heterolognim polipeptidnim sekvencama opisanim ovde ili drugim poznatim u struci da bi se olakšalo prečišćavanje.

[0345] U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde izoluje se ili prečišćava. Generalno, izolovano antitelo je ono koje je suštinski oslobođeno od drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti od onih koje ima izolovano antitelo. Na primer, u posebnom tehničkom rešenju, preparat ovde opisanog antitela je suštinski oslobođen od ćelijskog materijala i/ili hemijskih prekursora. Izraz "suštinski oslobođen od ćelijskog materijala" uključuje preparate antitela u kojima je antitelo odvojeno od ćelijskih komponenti ćelije iz koje je izolovano ili rekombinantno proizvedeno. Prema tome, antitelo koje je suštinski oslobođeno od ćelijskog materijala uključuje preparate antitela sa manje od oko 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, ili 0.1% (po suvoj težini) heterolognog proteina (ovde označen i kao "kontaminirajući protein") i/ili varijanti antitela, na primer, različite

2

posttranslaciono modifikovane forme antitela ili druge različite verzije antitela (npr., fragmenti antitela). Kada je antitelo proizvedeno rekombinantno, ono je takođe obično suštinski oslobođeno od kultivacionog medijuma, tj., kultivacioni medijum predstavlja manje od oko 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, ili 0.1% zapremine proteinskog preparata. Kada se antitelo proizvede hemijskom sintezom, ono je obično suštinski oslobođeno od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, tj., ono je odvojeno od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezu proteina. Prema tome, takvi preparati antitela imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, ili 5% (po suvoj težini) hemijskih prekursora ili jedinjenja različitih od antitela od interesa. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde opisana antitela izolovana su ili prečišćena.

5.3 Farmaceutske kompozicije

[0346] Ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa željenim stepenom čistoće u fiziološki prihvatljivom nosaču, ekscipijentu ili stabilizeru (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Prihvatljivi nosači, ekscipijenti, ili stabilizeri su netoksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama, a uključuju pufere kao što su fosfatni, citratni, i drugih organskih kiselina; antioksidante uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; prezervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekularne težine (manje od oko 10 rezidua); proteine, kao što su serum albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što su polivinilpirolidon; amino-kiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., kompleks Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (polyethylene glycol, PEG).

[0347] U specifičnom tehničkom rešenju, farmaceutske kompozicije sadrže antitelo pronalaska, i opciono jedno ili više dodatnih profilaktičkih ili terapijskih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U specifičnom tehničkom rešenju, farmaceutske kompozicije sadrže efikasnu količinu antitela pronalaska, i opciono jedno ili više dodatnih profilaktičkih ili terapijskih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Vidi Odeljak 5.4, dole, za primere profilaktičkih ili terapijskih sredstava. U nekim tehničkim rešenjima, antitelo je jedini aktivni

2

sastojak uključen u farmaceutsku kompoziciju. Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu biti korisne za pojačavanje, indukovanje ili aktivaciju GITR aktivnosti i lečenje stanja, kao što su kancer i infektivna bolest.

[0348] Farmaceutski prihvatljivi nosači upotrebljeni u parenteralnim preparatima uključuju vodene prenosnike, nevodene prenosnike, antimikrobna sredstva, izotonična sredstva, pufere, antioksidante, lokalne anestetike, suspendujuća i dispergujuća sredstva, emulgujuća sredstva, sekvestrirajuća ili helirajuća sredstva i druge farmaceutski prihvatljive supstance. Primeri vodenih prenosnika uključuju natrijum hlorid za injekciju, Ringerov rastvor za injekciju, izotoničnu dekstrozu za injekciju, sterilnu vodu za injekciju, Ringerov rastvor sa dekstrozom i laktatom za injekciju. Nevodeni parenteralni prenosnici uključuju fiksirana ulja biljnog porekla, ulje semena pamuka, kukuruzno ulje, susamovo ulje i ulje kikirikija. Antimikrobna sredstva u bakteriostatskim ili fungistatskim koncentracijama mogu se dodati parenteralnim preparatima pakovanim u kontejnerima sa više doza koji uključuju fenole ili krezole, jedinjenja žive, benzil alkohol, hlorobutanol, metil i propil estre p-hidroksibenzoeve kiseline, timerosal, benzalkonijum hlorid i benzetonijum hlorid. Izotonična sredstva uključuju natrijum hlorid i dekstrozu. Puferi uključuju fosfat i citrat. Antioksidanti uključuju natrijum bisulfat. Lokalni anestetici uključuju prokain hidrohlorid. Suspendujuća i dispergujuća sredstva uključuju natrijum karboksimetilcelulozu, hidroksipropil metilcelulozu i polivinilpirolidon. Emulgujuća sredstva uključuju Polysorbate 80 (TWEEN® 80). Sredstvo za sekvestriranje ili heliranje metalnih jona uključuje EDTA. Farmaceutski nosači takođe uključuju etil alkohol, polietilen glikol i propilen glikol kao prenosnike koji se mešaju sa vodom; i natrijum hidroksid, hlorovodoničnu kiselinu, limunsku kiselinu ili mlečnu kiselinu za podešavanje pH.

[0349] Farmaceutska kompozicija može biti formulisana za bilo koji put primene kod subjekta. Specifični primeri puteva primene uključuju intranazalni, oralni, plućni, transdermalni, intradermalni, i parenteralni. Parenteralna primena, koja se karakteriše supkutanim, intramuskularnim ili intravenskim injektiranjem, takođe se ovde razmatra. Injekcije mogu da se pripreme u konvencionalnim formama, kao tečni rastvori ili suspenzije, čvrste forme pogodne za rastvaranje ili suspendovanje u tečnosti pre injektiranja, ili kao emulzije. Injekcije, rastvori i emulzije sadrže i jedan ili više ekscipijenata. Pogodni ekscipijenti su, na primer, voda, slani rastvor, dekstroza, glicerol ili etanol. Pored toga, po želji, farmaceutske kompozicije koje će se primeniti mogu sadržati i male količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su vlažeća ili emulgujuća sredstva, pH-puferišuća sredstva, stabilizeri, pojačivači rastvorljivosti, i druga takva sredstva, kao što su na primer, natrijum acetat, sorbitan monolaurat, trietanolamin oleat i ciklodekstrini.

2

[0350] Preparati za parenteralnu primenu antitela uključuju sterilne rastvore spremne za injektiranje, sterilne suve rastvorljive proizvode, kao što su liofilizovani praškovi, spremni da se kombinuju sa rastvaračem neposredno pre upotrebe, uključujući hipodermalne tablete, sterilne suspenzije spremne za injektiranje, sterilne suve nerastvorljive proizvode spremne da se kombinuju sa prenosnikom neposredno pre upotrebe i sterilne emulzije. Rastvori mogu biti vodeni ili nevodeni.

[0351] Ako se primenjuju intravenski, pogodni nosači uključuju fiziološki slani rastvor ili slani rastvor puferisan fosfatom (phosphate buffered saline, PBS), i rastvore koji sadrže sredstva za zgušnjavanje i sredstva za solubilizaciju, kao što su glukoza, polietilen glikol, i polipropilen glikol i njihove mešavine.

[0352] Površinske mešavine koje sadrže antitelo pripremaju se kao što je opisano za lokalnu i sistemsku primenu. Dobijena mešavina može biti rastvor, suspenzija, emulzija ili slično i može se formulisati u vidu kremova, gelova, masti, emulzija, rastvora, eliksira, losiona, suspenzija, tinktura, pasti, pena, aerosola, sredstava za irigaciju, sprejova, supozitorija, zavoja, dermalnih flastera ili bilo kojih drugih formulacija pogodnih za površinsku primenu.

[0353] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisani ovde mogu se formulisati u vidu aerosola za površinsku primenu, kao što je inhalacija (vidi, npr., U.S. patenti br.

4,044,126, 4,414,209 i 4,364,923, koji opisuju aerosole za dostavu steroida korisnih za lečenje zapaljenskih oboljenja, posebno astme). Ove formulacije za primenu preko respiratornog trakta mogu biti u formi aerosola ili rastvora za nebulizer, ili u vidu mikrofinih čestica za insuflaciju, sami ili u kombinaciji sa inertnim nosačem kao što je laktoza. U tom slučaju, čestice formulacije će, u jednom aspektu, imati dijametar manji od 50 mikrona, u jednom aspektu manji od 10 mikrona.

[0354] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisani ovde mogu se formulisati za lokalnu ili površinsku primenu, kao što je površinska primena preko kože i mukoznih membrana, kao što je u oku, u formi gelova, kremova i losiona za primenu preko oka ili za intracisternalnu ili intraspinalnu primenu. Površinska primena je predviđena za transdermalnu dostavu i takođe za primenu na očima ili mukozi, ili za inhalacione terapije. Nazalni rastvori antitela samog ili u kombinaciji sa drugim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima takođe se mogu primenjivati.

[0355] Transdermalni flasteri, uključujući jonoforetske i elektroforetske uređaje, dobro su poznati stručnjacima u oblasti, i mogu se upotrebiti za primenu antitela. Na primer, takvi flasteri objavljeni su u U.S. patentima br. 6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010715, 5,985,317, 5,983,134, 5,948,433, i 5,860,957.

2

[0356] U određenim tehničkim rešenjima, farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo pronalaska je liofilizovani prašak, koji može da se rekonstituiše za primenu u vidu rastvora, emulzija i drugih mešavina. Može se rekonstituisati i formulisati i u vidu čvrstih supstanci ili gelova. Liofilizovani prašak se priprema rastvaranjem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili farmaceutski prihvatljivog derivata istog, u pogodnom rastvaraču. U nekim tehničkim rešenjima, liofilizovani prašak je sterilan. Rastvarač može sadržati ekscipijent koji poboljšava stabilnost, ili druge farmakološke komponente praška ili rekonstituisanog rastvora, pripremljenog od praška. Ekscipijenti koji mogu da se upotrebe uključuju, ali se ne ograničavaju na dekstrozu, sorbitol, fruktozu, kukuruzni sirup, ksilitol, glicerin, glukozu, saharozu ili drugo pogodno sredstvo. Rastvor može sadržati i pufer, kao što je citratni, natrijum ili kalijum fosfatni ili drugi takav pufer poznat stručnjacima u oblasti, u jednom tehničkom rešenju na pH oko neutralnog. Sterilna filtracija rastvora koja sledi, praćena liofilizacijom pod standardnim uslovima poznatim stručnjacima u oblasti daje željenu formulaciju. U jednom tehničkom rešenju, rezultujući rastvor će se rasporediti u fiole za liofilizaciju. Svaka fiola sadržaće jednu dozu ili više doza jedinjenja. Liofilizovani prašak može da se uskladišti pod odgovarajućim uslovima, na primer na oko 4°C do sobne temperature.

[0357] Rekonstitucija ovog liofilizovanog praška sa vodom za injekciju daje formulaciju za korišćenje u parenteralnoj primeni. Za rekonstituciju, liofilizovani prašak se dodaje u sterilnu vodu ili drugi pogodni nosač. Tačna količina zavisi od izabranog jedinjenja. Ta količina se može odrediti empirijski.

[0358] Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde i druge kompozicije obezbeđene ovde mogu se formulisati i tako da budu usmerene ka određenom tkivu, receptoru, ili drugoj oblasti tela subjekta koji treba da se leči. Mnogi takvi postupci ciljanja dobro su poznati stručnjacima u oblasti. Svi takvi postupci ciljanja razmatraju se ovde za upotrebu u sadašnjim kompozicijama. Za neograničavajuće primere postupaka ciljanja, vidi, npr., U.S. patente br. 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 i 5,709,874. U specifičnom aspektu, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde usmeren je ka tumoru.

[0359] Kompozicije koje će se upotrebiti za in vivo primenu mogu biti sterilne. Ovo se lako postiže filtriranjem kroz, npr., sterilne filtracione membrane.

5.4 Upotrebe i postupci

2

5.4.1 Terapijske upotrebe i postupci

[0360] U jednom aspektu, ovde su predstavljeni postupci za modulisanje jedne ili više imunskih funkcija ili odgovora kod subjekta, koji uključuju, kod subjekta kojem je to potrebno, primenu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili kompozicije istog. U specifičnoj objavi, ovde su predstavljeni postupci za aktivaciju, pojačavanje ili indukovanje jedne ili više imunskih funkcija ili odgovora kod subjekta, koji uključuju, kod subjekta kojem je to potrebno, primenu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili kompozicije istog. U specifičnoj objavi, ovde su predstavljeni postupci za prevenciju i/ili lečenje oboljenja u kojima je poželjno aktivirati ili pojačati jednu ili više imunskih funkcija ili odgovora, koji uključuju, kod subjekta kojem je to potrebno, primenu anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde ili kompozicije istog. U sledećoj specifičnoj objavi, postupak uključuje kombinovano lečenje, pri čemu se anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa drugom terapijom, kao što je ona opisana dole, da bi se aktivirala ili pojačala jedna ili više imunskih funkcija ili odgovora. U određenoj objavi, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment primenjuje se kao adjuvans u kombinaciji sa antigenskom kompozicijom. U određenim aspektima, antigenska kompozicija sadrži kancerski ili tumorski antigen (npr., bcr/abl antigen u leukemiji, HPVE6 i E7 antigene onkogenih virusa udruženih sa kancerom cerviksa, MAGE1 i MZ2-E antigene u ili udružene sa melanomom, ili MVC-1 i HER-2 antigene u ili udružene sa kancerom dojke). U nekim aspektima, antigenska kompozicija sadrži antigen poreklom iz patogena (npr., virusni antigen, parazitski antigen, bakterijski antigen ili gljivični antigen). Primeri virusnih antigena uključuju nukleoprotein (nucleoprotein, NP) virusa influence, HIV antigene (npr., gag proteine HIV, HIV env protein (npr., gp120 i/ili gp41), HIV Nef protein, HIV Pol proteine, HIV reverznu transkriptazu, ili HIV proteazu), antigene Ebola virusa (EBOV) (npr., EBOV NP ili glikoprotein), antigene virusa variole, antigene virusa hepatitisa A, B ili C, antigene humanog rinovirusa, antigene Herpes simplex virusa, antigene poliovirusa, antigene virusa slinavke i šapa (foot-and-mouth disease virus, FMDV), antigene virusa besnila, antigene rotavirusa, antigene koksaki virusa, i antigene humanog papiloma virusa (human papilloma virus, HPV). Primeri bakterijskih antigena uključuju antigene Bordetella pertussis (npr., P69 protein i filamentozni hemaglutinin (filamentous haemagglutinin, FHA) antigene), antigene Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, i E. coli kao što su subjedinica B toksina labilnog na toploti (LT-B) E. coli , K88 antigeni E. coli, i enterotoksigeni antigeni E. coli.

2 1

[0361] Kako se ovde koristi, izraz "u kombinaciji" odnosi se na upotrebu više od jedne terapije (npr., jednog ili više profilaktičkih i/ili terapijskih sredstava). Upotreba izraza "u kombinaciji" ne ograničava redosled kojim se terapije primenjuju kod subjekta sa bolešću ili poremećajem, ili put primene. Prva terapija (npr., profilaktičko ili terapijsko sredstvo) može se primeniti pre (npr., 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja, ili 12 nedelja pre), istovremeno, ili posle (npr., 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja, ili 12 nedelja posle) primene druge terapije (npr., profilaktičko ili terapijsko sredstvo) kod subjekta sa bolešću ili poremećajem ili njihovim simptomima. U određenoj objavi, terapija (npr., sredstvo) primenjena u kombinaciji sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kod subjekta primenjuje se u istoj kompoziciji (npr., farmaceutskoj kompoziciji). U drugoj objavi, terapija (npr., sredstvo) primenjena u kombinaciji sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kod subjekta primenjuje se u različitoj kompoziciji (npr., dve ili više farmaceutskih kompozicija). Dve kompozicije mogu se primeniti u isto vreme ili u različitim vremenima i/ili istim ili različitim putevima primene. U posebnoj objavi, anti-GITR antitelo ili njegov antigenvezujući fragment opisan ovde primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa kompozicijom za vakcinu da bi se indukovao, aktivirao ili pojačao imunski odgovor pobuđen kompozicijom za vakcinu. U jednom aspektu, kompozicija za vakcinu je kancerska vakcina. Kancerska vakcina je agens, molekul, ili imunogen koji stimuliše ili pobuđuje endogeni imunski odgovor kod individue ili subjekta protiv jednog ili više kancerskih antigena. Kancerski antigen može biti peptid ili protein udružen sa tumorom, koji indukuje ili pojačava imunski odgovor i izveden je iz gena udruženih sa tumorom i kodiranih proteina uključujući, na primer, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-A13, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-1, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGEXp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (AGE-B4), tirozinazu, moždanu glikogen fosforilazu, Melan-A, MAGE-C1, MAGE-C2, NY-ESO-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, CT-7, alfa-aktinin-4, Bcr-Abl fuzioni protein, Casp-8, beta-katenin, cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-1, dek-can fuzioni protein, EF2, ETV6-AML1 fuzioni protein, LDLR-fukoziltransferazaAS fuzioni protein, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, Mart2, Mum-2, i 3, neo-PAP, miozin klase I, OS-9, pml-RARα fuzioni protein, PTPRK, K-ras, N-ras, triozafosfat izomerazu, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1,

2 2

Mage-C2, NA-88, /Lage-2, SP17, i TRP2-Int2, (MART-I), gp100 (Pmel 17), TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, p15(58), CEA, NY-ESO (LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antigene Epstein Barr virusa, EBNA, antigene humanog papilomavirusa (HPV) E6 i E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-katenin, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerazu, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, .alfa.-fetoprotein, 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\170K, NYCO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 vezujući protein\ciklofilin C-udruženi protein), TAAL6, TAG72, TLP, i TPS. Kancerske vakcine su korisne za povećanje prepoznavanja kancerskih ćelija imunskim sistemom ili pojačavanje anti-tumorskog odgovora preko aktivacije limfocita. Efektorske T ćelije bile su uspešno generisane imunizacijom intaktnim tumorskim ćelijama ili ekstraktom, prečišćenim antigenima, korišćenjem peptida optimizovanih za vezivanje i sa MHC i sa TcR, imunski dominantnih peptida, DNK kodirajuće za tumorske antigene, rekombinantnih virusa koji kodiraju tumorske antigene ili antigen-prezentujućih ćelija podstaknutih antigenom. U nekom aspektu, pojačavanje imunskog prepoznavanja i ekspanzija ćelija mogu se poboljšati upotrebom kostimulatora i citokina, injekcijom vektora da bi se eksprimirali citokini, in vitro antigen-pobuđenih i aktiviranih autolognih dendritskih ćelija i blokiranjem negativnih modulatora (npr., korišćenjem sredstava koja ciljaju imunske tačke kontrole) i iscrpljivanjem T-regulatornih ćelija.

[0362] U specifičnom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa tumorskom vakcinom na bazi proteina toplotnog šoka ili patogenskom vakcinom na bazi proteina toplotnog šoka. Vidi Odeljke 5.4.1.1 i 5.4.1.2 dole, u vezi sa tumorskim vakcinama na bazi proteina toplotnog šoka ili patogenskim vakcinama na bazi proteina toplotnog šoka za upotrebu u kombinaciji sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde.

[0363] U posebnom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde primenjuje se u kombinaciji sa adjuvansom da bi se indukovali, aktivirali ili pojačali agonistički efekti anti-GITR antitela. Mogu se koristiti različiti adjuvansi u zavisnosti od konteksta lečenja. Neograničavajući primeri odgovarajućih adjuvanasa uključuju, na primer, kompletni Freundov adjuvans (Complete Freund's Adjuvant, CFA), nekompletni Freundov adjuvans (Incomplete Freund's Adjuvant, IFA), motanide ISA (nekompletni Sepikov adjuvans), Ribi adjuvansni sistem (Ribi adjuvant system, RAS), Titer Max, muramil peptid, Syntex

2

adjuvansnu formulaciju (Syntex Adjuvant Formulation, SAF), alum (aluminijum hidroksid i/ili aluminijum fosfat), adjuvansne aluminijumske soli, Gerbu® adjuvansi, antigen apsorbovan nitrocelulozom, inkapsulirani ili imobiliani antigen, imunostimulatorne komplekse kao što su saponini, Quil A, QS-21 i drugi. Drugi adjuvansi uključuju CpG oligonukleotide i dvolančane RNK molekule, kao što su poli(A), poli(U). Kombinacije gornjih adjuvanasa takođe se mogu koristiti. U nekim tehničkim rešenjima, jedan ili više adjuvanasa su saponin, kao QS-21, QS-21 i 3 De-O-acilisani monofosforil lipid A (3 D-MPL), i imunostimulatorni oligonukleotidi i saponinski adjuvansi kako je objavljeno u U.S. patentima br. 6,645,495; 7,029,678, odnosno 7,858,589.

[0364] U određenim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za pojačanje stimulacije ćelija koje odgovaraju na GITR (npr., T ćelija, kao što su efektorske T-ćelije) koji uključuju inkubiranje ex vivo ćelija koje odgovaraju na GITR (npr., T ćelija) sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U nekim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR inkubiraju se sa stimulišućim sredstvom (npr., fitohemaglutininom (PHA) i/ili forbol miristat acetatom (PMA), ili antitelom koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) pre, istovremeno ili posle inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom. U određenim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR (npr., T ćelije) se izoluju iz subjekta (npr., čoveka). U nekoj objavi, ćelije koje odgovaraju na GITR posle stimulacije anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom primenjuju se kod subjekta (npr., čoveka). Ćelije koje odgovaraju na GITR (npr., T ćelije) mogu se primeniti kod istog ili različitog subjekta od onog iz kojeg su ćelije originalno bile izolovane.

[0365] U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za aktiviranje ćelija koje odgovaraju na GITR (npr., T ćelija) koji uključuju inkubiranje ćelija koje odgovaraju na GITR (npr., T ćelija) sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U određenim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR inkubiraju se sa stimulatornim sredstvom (npr., sredstvom koje stimuliše receptorski kompleks T ćelija kao što je, npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) pre, istovremeno ili posle inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom. U nekim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR (npr., T ćelije) izolovane su iz subjekta (npr., čoveka). U određenim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR posle aktivacije anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom primenjuju se kod subjekta (npr., čoveka). Ćelije koje odgovaraju na GITR (npr.,

2 4

T ćelije) mogu se primeniti kod istog ili različitog subjekta nego što je onaj iz kojeg su ćelije originalno izolovane

[0366] U nekoj objavi, ćelije koje odgovaraju na GITR (tj., ćelije koje se odazivaju na GITR) inkubiraju se u kulturi ćelija sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde, i primenjuju se kod subjekta da bi se pojačala imunska funkcija (npr., da bi se pojačala ekspanzija/proliferacija ćelija koje odgovaraju na GITR, kao što su T ćelije, i/ili pojačala efektorska funkcija T ćelija) i/ili lečio kancer i/ili sprečila ili lečila infektivna bolest. Primeri kancera i infektivnih bolesti dati su u ovom tekstu. Vidi, npr., Primer 7 dole za primere postupaka. U specifičnim tehničkim rešenjima, ćelije koje odgovaraju na GITR su efektorske T ćelije (npr., CD4<+>i CD8<+>). U nekim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR su izolovane iz subjekta. U nekim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR su procenjene u pogledu ekspresije GITR pre inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U određenim aspektima, ćelije koje odgovaraju na GITR inkubiraju se sa mitogenom (npr., mitogenom T ćelija, kao što je, npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo) pre, istovremeno ili posle inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. Ćelije koje odgovaraju na GITR mogu se inkubirati sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde tokom, npr., 5 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sata, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 8 sati, 12 sati, 18 sati, 24 sata ili duže. U određenoj objavi, ćelije koje odgovaraju na GITR koje se primenjuju kod subjekta poreklom su iz subjekta (tj., ćelije koje odgovaraju na GITR su autologne). U drugoj objavi, ćelije koje odgovaraju na GITR koje se primenjuju kod subjekta poreklom su iz različitog subjekta. Ćelije koje odgovaraju na GITR posle inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom mogu se kod subjekta primeniti lokalno ili sistemski bilo kojim putem poznatim stručnjaku u oblasti (npr., parenteralna primena, kao što je supkutana, intravenska, ili intramuskularna primena, ili intratumorska primena). U određenim aspektima, pogodna doza ćelija koje odgovaraju na GITR posle inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom primenjenim kod subjekta može iznositi najmanje 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1,000, 5,000, 10,000, 25,000, 50,000, 100,000, 1 x10<6>, 1 x10<7>, ili 1 x10<8>ćelija. Ćelije koje odgovaraju na GITR posle inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom mogu se primeniti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više puta. Učestalost i doza ćelija koje odgovaraju na GITR posle inkubacije sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koje se primenjuju kod subjekta variraće u zavisnosti

2

od nekoliko faktora, uključujući, npr., stanje pacijenta. U još jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za pojačavanje ekspanzije T ćelija (npr., CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelija) kod subjekta, koji uključuje primenu kod subjekta efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili farmaceutske kompozicije opisane ovde. U još jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za pojačavanje ekspanzije CD8<+>T ćelija kod subjekta, koji uključuje primenu kod subjekta efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili farmaceutske kompozicije opisane ovde. U još jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za pojačavanje ekspanzije CD4<+>T ćelija kod subjekta, koji uključuje primenu kod subjekta efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili farmaceutske kompozicije opisane ovde. U specifičnom aspektu, subjekt je čovek.

[0367] U još jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za pojačavanje ekspanzije T ćelija (npr., CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelija) i/ili efektorske funkcije T ćelija kod subjekta, koji uključuje primenu kod subjekta efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili farmaceutske kompozicije opisane ovde. U još jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za pojačavanje ekspanzije CD8<+>T ćelija i/ili T efektorske funkcije T ćelija kod subjekta, koji uključuje primenu kod subjekta efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili farmaceutske kompozicije opisane ovde. U još jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za pojačavanje ekspanzije CD4<+>T ćelija i/ili T efektorske funkcije T ćelija kod subjekta, koji uključuje primenu kod subjekta efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili farmaceutske kompozicije opisane ovde. U specifičnom aspektu, subjekt je čovek.

[0368] U još jednom aspektu, ovde je obezbeđen postupak za preferencijalnu ekspanziju efektorskih T ćelija u odnosu na ekspanziju T-regulatornih ćelija, koji uključuje inkubiranje ex vivo T-ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U određenim aspektima, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ekspandira efektorske T ćelije u odnosu na T-regulatorne ćelije za 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ili više. U nekim aspektima, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ekspandira efektorske T ćelije u odnosu na T-regulatorne ćelije za 10% do 20%, 15% do 25%, 25% do 50%, 30% do 60%, 50% do 75% ili 65% do 85%. Efektorske T-ćelije i regulatorne T-ćelije mogu se razlikovati jedne od drugih po ćelijskim površinskim markerima kao što su oni objavljeni u primerima dole. U nekim aspektima, T-ćelije su izolovane iz subjekta (npr., čoveka). U određenoj objavi, T-ćelije posle ekspanzije primenjuju se kod subjekta (npr., čoveka).

2

[0369] U još jednoj objavi, ovde je obezbeđen postupak za preferencijalnu ekspanziju efektorskih T-ćelija u odnosu na ekspanziju T-regulatornih ćelija kod subjekta, koji uključuje primenu kod subjekta efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde, ili njihove kompozicije. U određenoj objavi anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ekspandira efektorske T-ćelije u odnosu na T-regulatorne ćelije za 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ili više. U nekoj objavi, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ekspandira efektorske T-ćelije u odnosu na T-regulatorne ćelije za 10% do 20%, 15% do 25%, 25% do 50%, 30% do 60%, 50% do 75% ili 65% do 85%. Efektorske T-ćelije i regulatorne T-ćelije mogu se razlikovati jedne od drugih po ćelijskim površinskim markerima i/ili unutarćelijskim markerima, kao što su oni objavljeni u primerima dole. U specifičnom aspektu, subjekt je čovek.

[0370] U određenim tehničkim rešenjima, lečenjem subjekta anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde, ili kompozicijom istog postiže se jedan, dva, tri, četiri ili više od sledećih efekata: (i) smanjenje ili ublažavanje jačine bolesti ili simptoma udruženih sa njom; (ii) smanjenje trajanja simptoma udruženog sa bolešću; (iii) inhibicija progresije bolesti ili simptoma udruženih sa njom; (iv) povlačenje bolesti ili simptoma udruženih sa njom; (v) sprečavanje razvoja ili pojave simptoma udruženih sa bolešću koja je prisutna kod pacijenta; (vi) inhibicija povratka simptoma udruženih sa bolešću; (vii) smanjenje hospitalizacija subjekta; (viii) smanjenje dužine hospitalizacije; (ix) porast preživljavanja subjekta koji ima bolest; (x) smanjenje broja simptoma udruženih sa bolešću; i (xi) pojačanje, poboljšanje, suplementacija, komplementacija ili povećanje terapijskog efekta (-kata) druge terapije. U alternativnom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koristi se za prevenciju poremećaja, kao što je infektivna bolest.

[0371] U nekoj objavi, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, ili kompozicija istog primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa imunoterapijskim sredstvom. Imunoterapijska sredstva za upotrebu u kombinovanim lečenjima objavljenim ovde uključuju, ali se ne ograničavaju na Her2/neu receptorsko antitelo kao što je trastuzumab (na tržištu kao Herceptin®), anti-CD52 antitelo kao što je alemtuzumab (na tržištu kao Campath®. MabCampath® ili Campath-1H), anti-CD33 antitelo kao što je gemtuzumab povezano sa kalihemicinom (na tržištu kao Mylotarg®), anti-CD20 antitelo kao što je rituksimab (na tržištu kao Rituxan® i MabThera®), ibritumomab tiuksetan (na tržištu kao Zevalin®), anti-TNFa antitela kao infliksimab (na tržištu kao Remicade®) ili adalimumab (na tržištu kao Humira®), rastvorljivi TNFR2 molekul kao što je etanercept (na tržištu kao Enbrel®), antitelo na CD25

2

lanac IL-2 receptora kao što je baziliksimab (na tržištu kao Simulect®), anti-CD40/CD40L antitelo kao što je humanizovano IgG1anti-humano CD40 antitelo (SGN-40), agoniste slične "toll" receptoru kao što je monofosforil lipid A (MPL®), CpG, jednolančanu RNK, nukleotide, nukleotidni analog, CL087 (TLR7-specifični ligand), loksoribin, poliinozinpolicitidilnu kiselinu, flagelin, resikvimod, imikvimod, gardikvimod, NOD ligande kao što su muramil dipeptid, murabutid, peptidoglikan i muramildipeptid, CD1d agoniste, kao što su α-galaktozil ceramid (a-GalCer) i treitol ceramid (ThrCer), antitelo kao što je Fresolimumab® (GC1008), antitelo koje cilja inhibirajuće izoforme TGF-beta 1, 2 ili 3, Fc fuziju, dalantercept (Alk-Fc), LY2157299 sa malim molekulom (inhibitor receptorske kinaze).

[0372] Bolesti koje se mogu lečiti pojačanjem imunske funkcije uključuju kancer i infektivne bolesti. Različiti kanceri i infektivne bolesti opisani su dole. U specifičnom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde može se upotrebiti za lečenje stanja udruženih sa kancerom ili stanjem koje je rezultat primene antikancerske terapije (kao što je, npr., hemioterapija ili zračenje). U posebnom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigenvezujući fragment mogu se upotrebiti za lečenje ili kontrolisanje limfocitopenije. U još jednoj objavi, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment primenjuje se kod pacijenta kojem je dijagnostikovan kancer da bi se povećala proliferacija i/ili efektorska funkcija jedne ili više populacija imunskih ćelija (npr., efektorske T ćelije, kao što su CD4<+>i CD8<+>T ćelije) kod pacijenta.

[0373] U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde aktivira ili pojačava ili indukuje jednu ili više imunskih funkcija ili odgovora kod subjekta za najmanje 99%, najmanje 98%, najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 45%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 35%, najmanje 30%, najmanje 25%, najmanje 20%, ili najmanje 10%, ili u rasponu od 10% do 25%, 25% do 50%, 50% do 75%, ili 75% do 95% u odnosu na imunsku funkciju kod subjekta kod kojeg se ne primenjuje anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde, korišćenjem testova dobro poznatih u struci, npr., ELISPOT, ELISA, i testovi proliferacije ćelija. U specifičnom tehničkom rešenju, imunska funkcija je proizvodnja citokina (npr., proizvodnja interferona-gama, IL-2, IL-5, IL-10, IL-12, ili transformišućeg faktora rasta (transforming growth factor, TGF) -alfa). U još jednom tehničkom rešenju, imunska funkcija je proliferacija/ekspanzija T-ćelija, koja se može testirati, npr., protočnom citometrijom da bi se detektovao broj ćelija koje eksprimiraju markere T ćelija (npr., CD3, CD4, ili CD8). U još jednom tehničkom rešenju, imunska funkcija je proizvodnja antitela, koja može da se testira, npr., korišćenjem ELISA. U nekim tehničkim

2

rešenjima, imunska funkcija je efektorska funkcija, koja može da se testira, npr., testom citotoksičnosti ili drugim testovima dobro poznatim u struci. U još jednom tehničkom rešenju, imunska funkcija je odgovor Th1. U još jednom tehničkom rešenju, imunska funkcija je odgovor Th2. U još jednom tehničkom rešenju, imunska funkcija je memorijski odgovor.

[0374] U specifičnim tehničkim rešenjima, neograničavajući primeri imunskih funkcija koje mogu da se pojačaju ili indukuju anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom su proliferacija/ekspanzija efektorskih limfocita (npr., porast broja efektorskih T limfocita), inhibicija apoptoze efektorskih limfocita (npr., efektorskih T limfocita), i supresija Treg. U posebnim tehničkim rešenjima, imunska funkcija pojačana ili indukovana anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde je proliferacija/ekspanzija broja ili aktivacije CD4<+>T ćelija (npr., Th1 i Th2 pomažuće T ćelije), CD8<+>T ćelija (npr., citotoksični T limfociti, alfa/beta T ćelije, i gama/delta T ćelije), B ćelija (npr., plazma-ćelije), memorijskih T ćelija, memorijskih B ćelija, tumor-rezidentnih T ćelija, CD122<+>T ćelija, ćelija prirodnih ubica (NK), makrofaga, monocita, dendritskih ćelija, mastocita, eozinofila, bazofila ili polimorfonuklearnih leukocita. U jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde aktivira ili pojačava proliferaciju/ekspanziju ili broj limfocitnih progenitora. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde povećava broj CD4<+>T ćelija (npr., Th1 i Th2 pomažuće T ćelije), CD8<+>T ćelija (npr., citotoksični T limfociti, alfa/beta T ćelije, i gama/delta T ćelije), B ćelija (npr., plazma-ćelije), memorijskih T ćelija, memorijskih B ćelija, tumor-rezidentnih T ćelija, CD122<+>T ćelija, ćelija prirodnih ubica (NK ćelija), makrofaga, monocita, dendritskih ćelija, mastocita, eozinofila, bazofila ili polimorfonuklearnih leukocita za približno najmanje 99%, najmanje 98%, najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 45%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 35%, najmanje 30%, najmanje 25%, najmanje 20%, ili najmanje 10%, ili u rasponu između 10% do 25%, 25% do 50%, 50% do 75%, ili 75% do 95% u odnosu ne negativnu kontrolu (npr., broj respektivnih ćelija koje nisu tretirane, kultivisane ili nisu bile u kontaktu sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde).

[0375] U posebnim tehničkim rešenjima, ovde opisano antitelo, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje, aktivira ili pojačava aktivnost humanog GITR nezavisno od aktivacije TCR. U specifičnim tehničkim rešenjima, antitelo opisano ovde, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), indukuje, aktivira ili pojačava aktivnost NF-κB nezavisno od aktivacije TCR. U određenim tehničkim rešenjima, aktivnost

2

NF-κB može da se proceni u, npr., testu koji obuhvata sledeće korake: (a) inkubiranje T ćelija (npr., Jurkat ćelije) koje eksprimiraju konstrukt NF-κB-luciferazni reporter (npr., GloResponse NF-κB-luc2P konstrukt) i GITR (npr., humani GITR) sa ovde opisanim antitelom ili izotipskim kontrolnim antitelom pri koncentraciji antitela od, npr., 12.5, 10, 5, 2.5, 1.25, ili 0.625 µg/ml, u odsustvu anti-CD3 antitela; i (b) očitavanje signala luciferaze posle, npr., 2, 5, 6, 8 ili 18 sati inkubacije korišćenjem, npr., EnVision multilabel reader 2100, pri čemu pozitivni signal luciferaze u odnosu na izotipsko kontrolno antitelo ukazuje na aktivnost NP-κB. U posebnom tehničkom rešenju, signal luciferaze očitava se posle 5 sati inkubacije.

[0376] U drugom aspektu, ovde je obezbeđen postupak aktivacije T ćelija nezavisno od aktivacije TCR koji uključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom opisanim ovde. U posebnim aspektima, ovde je obezbeđen postupak indukovanja, aktivacije ili pojačavanja aktivnosti NF-κB nezavisno od aktivacije TCR koji uključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. U određenim aspektima, aktivnost NF-κB može da se proceni u, npr., testu koji obuhvata sledeće korake: (a) inkubiranje T ćelija (npr., Jurkat ćelija) koje eksprimiraju konstrukt NP-κB-luciferazni reporter (npr., GloResponse NF-κB-luc2P konstrukt) i GITR (npr., humani GITR) sa antitelom opisanim ovde ili izotipskim kontrolnim antitelom pri koncentraciji antitela od, npr., 12.5, 10, 5, 2.5, 1.25, ili 0.625 µg/ml, u odsustvu anti-CD3 antitela; i (b) očitavanje signala luciferaze posle, npr., 2, 5, 6, 8 ili 18 sati inkubacije korišćenjem, npr., EnVision multilabel reader 2100, pri čemu pozitivni signal luciferaze u odnosu na izotipsko kontrolno antitelo ukazuje na aktivnost NP-κB. U posebnom aspektu, signal luciferazni očitava se posle 5 sati inkubacije.

[0377] U posebnim aspektima, ovde je obezbeđen postupak povećanja procenta polifunkcionalnih (IFNy+ TNPα+) T ćelija koji uključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. Povećanje procenta polifunkcionalnih (IFNy+ TNPα+) T ćelija može se proceniti u, npr., testu koji obuhvata sledeće korake: (a) inkubiranje, npr., humanih PBMC sa, npr., anti-CD3 antitelom u različitim suboptimalnim koncentracijama (npr., 0.3-5 µg/ml); i, npr., ovde opisanim antitelom, koje se imunospecifično vezuje za GITR (npr., humani GITR), pri, npr., 5 µg/ml ili izotipskim kontrolnim antitelom, tokom, npr., 3-4 dana na 37°C i 5% CO2; (b) tretiranje ćelija, npr., brefeldinom A tokom, npr., 6 sati na 37°C i 5% CO2; (c) bojenje površine ćelija korišćenjem, npr., anti-CD3 antitela, anti-CD4 antitela, i anti-CD8α antitela; (d) bojenje unutrašnjosti ćelije korišćenjem, npr., anti-IFNy antitela i anti-TNFa antitela; i (e) određivanje procenta polifunkcionalnih (IFNy+ TNPα+) T ćelija u odnosu na izotipsko kontrolno antitelo.

2

U specifičnim aspektima, polifunkcionalne (IFNy+ TNPα+) T ćelije odabrane su iz grupe koja se sastoji od polifunkcionalnih (IFNy+ TNPα+) CD4+ T ćelija i polifunkcionalnih (IFNy+ TNPα+) CD8+ T ćelija.

[0378] U posebnim aspektima, ovde je obezbeđen postupak povećanja površinske ekspresije OX40 i PD-1 u aktiviranim T ćelijama koji uključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde. Površinska ekspresija OX40 i PD-1 u aktiviranim T ćelijama može biti povećana za najmanje oko 1.2 puta, 1.3 puta, 1.4 puta, 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3 puta, 3.5 puta, 4 puta, 4.5 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta, 60 puta, 70 puta, 80 puta, 90 puta, 100 puta, 200 puta, 300 puta, 400 puta, 500 puta, 600 puta, 700 puta, 800 puta, 900 puta, ili 1000 puta kako je procenjeno postupcima opisanim ovde i/ili poznatim stručnjaku u oblasti, u odnosu na površinsku ekspresiju OX40 i PD-1 u aktiviranim T ćelijama bez ovde opisanog antitela.

5.4.1.1 Kancer

[0379] U specifičnom aspektu, ovde su predstavljeni postupci za lečenje kancera, koji uključuju primenu kod subjekta kojem je to potrebno efikasne količine anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde ili kompozicije istog. U jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo pronalaska, ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u lečenju kancera. U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde ili kompozicija istog je jedino aktivno sredstvo koje se primenjuje kod subjekta.

[0380] Efekat anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde na proliferaciju kancerskih ćelija može se detektovati rutinskim testovima, kao što je test kojim se meri preuzimanje radioobeleženog timidina. Alternativno, vijabilnost ćelija može se meriti testovima kojima se meri laktat dehidrogenaza (lactate dehydrogenase, LDH), stabilni citosolni enzim koji se oslobađa posle lize ćelije, ili oslobađanje [<51>Cr] posle lize ćelije. U jednom aspektu, nekroza se meri sposobnošću ili nesposobnošću ćelije da preuzima boju kao što je neutralno crveno, tripan plavo, ili ALAMAR™ plavo (Page B i sar., (1993) Intl J Oncology 3: 473-6). U takvom testu, ćelije se inkubiraju u medijumu koji sadrži boju, ćelije se isperu, i preostala boja, koja odražava preuzimanje boje u ćelije, meri se spektrofotometrijski.

[0381] U drugom aspektu, boja je sulforodamin B (sulforhodamine B, SRB), čije vezivanje za proteine može da se koristi kao mera citotoksičnosti (Skehan P i sar., (1990) J Nat Cancer Inst 82: 1107-12). U još jednom aspektu, tetrazolijum so, kao što je MTT, koristi se u

2 1

kvantitativnom kolorimetrijskom testu za preživljavanje i proliferaciju sisarskih ćelija detektovanjem živih, ali ne i mrtvih ćelija (vidi, npr., Mosmann T (1983) J Immunol Methods 65: 55-63).

[0382] U drugim aspektima, apoptotske ćelije se mere bilo da su prikačene ili se nalaze u "plutajućem" kompartmentu kultura. Oba kompartmenta se sakupe uklanjanjem supernatanta, tripsinizacijom prikačenih ćelija, i kombinovanjem oba preparata posle koraka ispiranja centrifugiranjem (10 minuta, 2000 rpm). Protokol za tretiranje kultura tumorskih ćelija sulindakom i sličnim jedinjenjima da bi se dobila značajna količina apoptoze opisan je u literaturi (vidi, npr., Piazza GA i sar., (1995) Cancer Res 55: 3110-6). Odlike ovog postupka uključuju sakupljanje plutajućih i prikačenih ćelija, identifikaciju optimalnih vremena tretmana i raspona doza za uočavanje apoptoze, i identifikaciju optimalnih uslova za ćelijsku kulturu.

[0383] U drugom aspektu, apoptoza je kvantifikovana merenjem fragmentacije DNK. Na raspolaganju postoje komercijalni fotometrijski postupci za kvantitativno in vitro određivanje fragmentacije DNK. Primeri takvih testova, uključujući TUNEL (koji detektuje ugrađivanje obeleženih nukleotida u fragmentisanu DNK) i testove na bazi ELISA, opisani su u Biochemica, (1999) 2: 34 37 (Roche Molecular Biochemicals). U još jednom aspektu, apoptoza može da se posmatra morfološki.

[0384] Kancerske ćelijske linije na kojima se mogu izvesti testovi dobro su poznate stručnjacima u oblasti. Testovi za apoptozu, nekrozu i proliferaciju ćelija mogu se izvesti i na primarnim ćelijama, npr., na tkivnom eksplantu.

[0385] U specifičnim tehničkim rešenjima, primenom anti-GITR antitela ili njegove kompozicije za upotrebu u pronalasku kod subjekta sa kancerom (u nekim tehničkim rešenjima, u animalnom modelu kancera) postiže se najmanje jedan, dva, tri, četiri ili više sledećih efekata: (i) smanjenje ili ublažavanje jačine jednog ili više simptoma kancera; (ii) smanjenje dužine trajanja jednog ili više simptoma udruženih sa kancerom; (iii) prevencija vraćanja simptoma udruženih sa kancerom; (iv) smanjenje hospitalizacije subjekta; (v) smanjenje dužine hospitalizacije; (vi) porast preživljavanja subjekta; (vii) pojačavanje ili poboljšanje terapijskog efekta druge terapije; (viii) inhibicija razvoja ili pojave jednog ili više simptoma udruženih sa kancerom; (ix) smanjenje broja simptoma udruženih sa kancerom; (x) poboljšanje kvaliteta života, procenjeno postupcima dobro poznatim u struci; (x) inhibicija vraćanja tumora; (xi) regresija tumora i/ili jednog ili više simptoma udruženih sa njima; (xii) inhibicija progresije tumora i/ili jednog ili više simptoma udruženih sa njima; (xiii) smanjenje rasta tumora; (xiv) smanjenje veličine tumora (npr., zapremine ili prečnika); (xv) smanjenje formiranja novoformiranog tumora; (xvi) iskorenjivanje, uklanjanje, ili kontrola primarnih, regionalnih

2 2

i/ili metastatskih tumora; (xvii) smanjenje broja ili veličine metastaza; (xviii) smanjenje smrtnosti; (xix) povećano preživljavanje bez pogoršanja; (xx) veličina tumora se održava i ne povećava se ili se povećava manje nego što se tumor povećava posle primene standardne terapije, mereno konvencionalnim postupcima koji su na raspolaganju stručnjaku u oblasti, kao što su dobijanje slike magnetnom rezonancijom (magnetic resonance imaging, MRI), dinamičnom kontrastom pojačanom MRI (dynamic contrast-enhanced MRI, DCE-MRI), X-zracima, i skeniranjem kompjuterizovanom tomografijom (computed tomography, CT), ili skeniranjem pozitron-emisionom tomografijom (positron emission tomography, PET); i/ili (xxi) porast dužine remisije kod pacijenata.

[0386] U određenim tehničkim rešenjima, kod subjekta se primenjuju dva ili više različitih anti-GITR antitela. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa jednom ili više terapija, npr., antikancerskim sredstvima, citokinima, ćelijskim vakcinama ili antihormonskim sredstvima, da bi se lečio kancer.

[0387] U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo primenjuje se u kombinaciji sa zračnom terapijom koja uključuje, npr., upotrebu x-zraka, gama zraka i drugih izvora zračenja da bi se uništile kancerske ćelije. U specifičnim tehničkim rešenjima, lečenje zračenjem primenjuje se u vidu spoljašnje zračne terapije ili teleterapije pri čemu se zračenje usmerava sa udaljenog izvora. U drugim tehničkim rešenjima, lečenje zračenjem primenjuje se u vidu unutrašnje terapije ili brahiterapije pri čemu se izvor radioaktivnosti postavlja unutar tela, u blizini kancerskih ćelija ili tumorske mase. U jednom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde može aktivirati ili pojačati imunsku funkciju ili odgovor kod pacijenta sa kancerom kojem je imunski sistem kompromitovan zbog antikancerske terapije.

[0388] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo se primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa hemioterapijom. U tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo može da se koristi pre, tokom ili posle zračne terapije ili hemioterapije. Primeri hemioterapijskih sredstava uključuju ciklofosfamid, metotreksat, ciklosporin A, leflunomid, cisplatin, ifosfamid, taksane kao što su taksol i paklitaksol, inhibitore topoizomeraze I (npr., CPT 11, topotekan, 9 AC, i GG 211), gemcitabin, vinorelbin, oksaliplatin, 5-fluorouracil (5-FU), leukovorin, vinorelbin, temodal, citohalazin B, gramicidin D, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1 dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicinske homologe, i citoksan.

2

[0389] U jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo se primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa ciklofosfamidom, npr., niskom dozom ciklofosfamida. Ciklofosfamid (Elostan, Cytoxan), je hemioterapijsko sredstvo koje ima imunomodulatornu funkciju kada se koristi u niskim dozama (npr., do 300 mg/m<2>, 300 mg/m<2>ili oko 300 mg/m<2>kada se primenjuje intravenski). Specifično, niske doze ciklofosfamida mogu smanjiti broj i proliferativni kapacitet regulatornih T ćelija (Treg) (npr., CD4+CD25+FoxP3+ ćelija ili, alternativno, CD45+CD3+CD4+CD8-FOXP3+CD25hiCD127low ćelija) i modulisati imunosupresivne mreže. U nekim tehničkim rešenjima, doza primene ciklofosfamida je oko 50 mg/m<2>, 100 mg/m<2>, 200 mg/m<2>, 300 mg/m<2>, 500 mg/m<2>, ili veća. U nekim tehničkim rešenjima, doza primene ciklofosfamida je u rasponu od 10 mg/m<2>do 100 mg/m<2>, 50 mg/m<2>do 200 mg/m<2>, 50 mg/m<2>do 300 mg/m<2>, 50 mg/m<2>do 500 mg/m<2>. U nekim tehničkim rešenjima, ciklofosfamid se kod subjekta primenjuje u okviru 1 sata, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati, 1 dana, 5 dana ili više pre ili posle inicijalne primene anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo ili njegov antigenvezujući fragment opisan ovde koristi se u kombinaciji sa ciklofosfamidom, npr., niskom dozom ciklofosfamida, za lečenje metastatskog karcinoma bubrežnih ćelija (renal cell carcinoma, RCC).

[0390] U jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa Treg-inhibitornim sredstvom. Primeri Treg-inhibitornih sredstava uključuju Zenapax® (daklizumab) (Roche), koji je humano anti-CD25 monoklonsko antitelo koje se koristi, npr., za indukovanje imunosupresije kod transplantacije organa. Daklizumab blokira vezivanje IL-2 za CD25, koje je signal za održavanje Treg. Još jedno sredstvo koje inhibira Treg je Sutent® (Sunitinib) (Pfizer) koji je inhibitor tirozin kinaze sa malim molekulom, sa više ciljeva, odobren za lečenje karcinoma bubrežnih ćelija (RCC) i drugih kancera. Još jedno sredstvo koje može da inhibira Treg je 1-metil-D-triptofan (1-methyl-D-tryptophan, 1-MT), kompetitivni inhibitor indolamin 2,3-dioksigenaze (indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO). IDO je imunosupresivno sredstvo koje se eksprimira u određenim normalnim i neoplastičnim ćelijama i može biti udruženo sa porastom Treg kod pacijenata sa kancerom. Dodatni inhibitori Treg uključuju sredstva koja blokiraju transport Treg u tumorsku mikrosredinu. Takva sredstva mogu uključivati antitela protiv određenih hemokina i hemokinskih receptora kao što su CCL17, CCL22 i CCR4.

[0391] Drugi primeri Treg-inhibitornih sredstava koja mogu da se koriste prema postupcima opisanim ovde objavljeni su u sledećim patentnim prijavama: U.S. patentne publikacije br. US

2 4

2009/0214533, US 2012/0142750, US 2011/0305713, US 2009/0004213, US 2012/0219559, US 2010/0278844, US 2013/0323283 i US 2008/0152665.

[0392] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo može da se primeni kod subjekta pre, tokom ili posle operacije.

[0393] U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa imunskim modulatorom ili antitelom. Imunski modulatori ili antitela mogu biti, ali se ne ograničavaju na adjuvanse, antigene, anti-CD3 (npr., OKT3), sredstva koja ciljaju kontrolnu tačku ili modulatore, ili interleukine. Izrazi "sredstvo koje cilja kontrolnu tačku" ili "modulator kontrolne tačke" mogu se koristiti naizmenično i odnose se na sredstvo koje selektivno moduliše ekspresiju ili aktivnost regulatornog molekula (npr., koinhibitorni molekul kontrolne tačke (npr., protein) ili kostimulatorni molekul kontrolne tačke (npr., protein), koji može biti, npr., receptor ili ligand) kontrolne tačke imunskog sistema. Sredstva koja ciljaju kontrolne tačke mogu biti odabrana iz grupe koja se sastoji od agonista molekula kontrolne tačke, antagonista molekula kontrolne tačke, polipeptida (npr., peptidnog liganda, antitela, fragmenta antitela) koji selektivno cilja molekul kontrolne tačke; malog molekula koji selektivno cilja molekul kontrolne tačke; i regulatorne nukleinske kiseline (npr., siRNK (short interfering, mala interferirajuća RNK), miRNK (mikroRNK)) koja selektivno moduliše ekspresiju ili aktivnost molekula kontrolne tačke. U jednom aspektu, sredstvo koje cilja kontrolnu tačku može se odabrati iz grupe koja se sastoji od antagonista PD-1, antagonista PD-L1, antagonista PD-L2, antagonista CTLA-4, antagonista TIM-3, antagonista LAG-3, agonista GITR, i agonista OX40. Prema tome, u nekim aspektima, anti-GITR agonističko antitelo (npr., Hum231#1, Hum231#2 ili Hum23 1#2w) ili njegov antigen-vezujući fragment, može se primeniti u kombinaciji sa, npr., anti-CTLA-4 antagonističkim antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom, ili drugim sredstvom koje cilja kontrolnu tačku, u jednoj farmaceutskoj kompoziciji, ili u zasebnim farmaceutskim kompozicijama primenjenim zajedno ili razdvojeno.

[0394] U nekoj objavi, ovde su obezbeđeni postupci za lečenje kancera kod subjekta koji uključuju primenu kod subjekta anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i agonista OX40 i/ili antagonista LAG-3, TIM-3, PD-1 i/ili CTLA-4. U nekim tehničkim rešenjima, kancer je odabran između multiformnog glioblastoma, metastatskog melanoma, rezistentnog metastatskog melanoma, metastatskog kancera ovarijuma, metastatskog karcinoma bubrežnih ćelija, kancera glave i vrata, kancera želuca, kancera jednjaka, nesitnoćelijskog kancera pluća, tumora mozga kod dece, astrocitoma niskog stadijuma, ependimoma, i meduloblastoma.

2

[0395] U specifičnom aspektu, anti-GITR antitelo se primenjuje kod subjekta u kombinaciji sa sredstvom koje inhibira (delimično ili potpuno) CTLA-4 signalnu transdukciju, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani CTLA-4 (npr., tremelimumab (Pfizer); ipilimumab (Yervoy®, Bristol-Myers Squibb)) ili CTLA-4-Ig fuzioni protein. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska upotrebljava se u kombinaciji sa antagonistom CTLA-4 (npr., tremelimumab ili ipilimumab) za lečenje metastatskog kancera ovarijuma. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska upotrebljava se u kombinaciji sa antagonistom CTLA-4 (npr., tremelimumab ili ipilimumab) za lečenje metastatskog kancera ovarijuma koji je rezistentan na antagonist CTLA-4 (npr., tremelimumab ili ipilimumab). U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska i antagonist CTLA-4 (npr., tremelimumab ili ipilimumab) koriste se za lečenje multiformnog glioblastoma. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je povratan. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je novodijagnostikovan. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je prisutan kod subjekta koji ima nemetilisane MGMT promotore. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je refraktoran na lečenje bevacizumabom. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je prisutan kod subjekta koji nije primao terapiju bevacizumabom. Primeri anti-CTLA-4 antitela koja se mogu koristiti u postupcima lečenja objavljenim ovde objavljeni su u sledećim patentima i patentnim prijavama: Međunarodne publikacije br. WO 00/037504, WO 01/014424 i WO 09/100140; U.S. patenti br. 6,207,156 i 7,034,121. Drugi primeri anti-CTLA-4 antitela koja se mogu koristiti u skladu sa ovde opisanim postupcima objavljeni su u sledećim patentima i patentnim prijavama: U.S. patenti br.7,465,446, 8,263,073; 8,142,778 i 8,226,946; i U.S. prijava br. US 2003/086930, US 2005/226875, US 2007/243184, US 2009/123477 i US 2011/044953.

[0396] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se u kombinaciji sa sredstvom koje inhibira (delimično ili potpuno) LAG-3 signalnu transdukciju, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani LAG-3. Primeri anti-LAG-3 antitela ili fragmenata tih antitela koji se mogu koristiti u postupcima lečenja opisanim ovde objavljeni su u sledećim patentima i patentnim prijavama: U.S. patenti br. 6,143,273 i 6,197,524; U.S. patentna publikacija br. US 2011/0150892, US 2010/0233183 i US 2010/196394.

[0397] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se u kombinaciji sa sredstvom koje inhibira (delimično ili potpuno) TIM-3 signalnu transdukciju, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani TIM-3. Primeri anti-TIM-3 antitela ili fragmenata tih antitela koji se mogu koristiti u postupcima lečenja opisanim ovde objavljeni su

2

u sledećim patentima i patentnim prijavama: U.S. patenti br. 7,470,428 i 8,101,176; U.S. publikacija br. US 2013/0022623, US 2010/0100131, US 2010/0100131 i US 2010/061992.

[0398] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se u kombinaciji sa sredstvom koje inhibira (delimično ili potpuno) PD-1 signalnu transdukciju, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani PD-1. U nekim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo ili fragment tog antitela primenjuje se kod subjekta kako je ovde opisano. U nekim tehničkim rešenjima, anti-PD-1 antitelo je nivolumab (BMS-936558 ili MDX1106) ili lambrolizumab (MK-3475) ili pidilizumab (CT-011). Drugi neograničavajući primeri anti-PD-1 antitela koja se mogu koristiti u postupcima lečenja objavljenim ovde objavljeni su u sledećim patentima i patentnim prijavama: U.S. patenti br.6,808,710; 7,488,802; 8,008,449; 8,114,845 i 8,168,757, U.S. publikacija br. US 2013/0202623 i PCT publikacija br. WO 2013/033091.

[0399] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se u kombinaciji sa sredstvom koje inhibira (delimično ili potpuno) aktivnost PD-L1, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani PD-L1. U nekim tehničkim rešenjima, anti-PD-L1 antitelo je BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736 ili MSB0010718C. Drugi neograničavajući primeri anti-PD-L1 antitela koja se mogu koristiti u postupcima lečenja objavljenim ovde objavljeni su u sledećim patentima i patentnim prijavama: U.S. patent br. 8,168,179 i U.S. publikacije br. US 2010/0203056 i US 2003/0232323. U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska se primenjuje u kombinaciji sa sredstvom koje inhibira (delimično ili potpuno) aktivnost PD-L2, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani PD-L2.

[0400] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se u kombinaciji sa sredstvom koje aktivira ili pojačava OX-40 signalnu transdukciju, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za humani OX-40. Primeri anti-OX40 antitela ili fragmenata tih antitela koji se mogu koristiti u postupcima lečenja opisanim ovde objavljeni su u sledećim patentima i patentnim prijavama: U.S. patenti br.7,550,140; 7,807,156; 8,283,450; 8,614,295 i 7,531,170; U.S. publikacije br. US 2010/0196359, US 2010/0136030 i US 2013/0183315.

[0401] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa vakcinom, kako je opisano ovde, uključujući Odeljak 5.4.1 gore. U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa tumorskom vakcinom na bazi proteina toplotnog šoka. Proteini toplotnog šoka (heat shock proteins, HSP) su familija visokokonzervisanih sveprisutnih proteina nađenih kod svih vrsta. Njihova ekspresija može da se snažno indukuje do mnogo viših nivoa kao rezultat toplotnog šoka ili drugih formi stresa, uključujući izlaganje toksinima, oksidativnom stresu ili padu nivoa glukoze. Na osnovu molekularne težine klasifikovani su u pet familija: HSP-110, -

2

90, -70, -60 i -28. HSP dostavljaju imunogene peptide preko puta unakrsne prezentacije u antigen-prezentujućim ćelijama (antigen presenting cell, APC) kao što su makrofagi i dendritske ćelije (dendritic cell, DC), dovodeći do aktivacije T ćelija. HSP funkcionišu kao šaperonski nosači antigenskih peptida udruženih sa tumorom, formirajući komplekse koji mogu da indukuju tumor-specifični imunitet. Posle oslobađanja iz umirućih tumorskih ćelija, kompleksi HSP-antigen bivaju preuzeti u antigen-prezentujuće ćelije (APC) pri čemu se antigeni obrađuju u peptide koji se vezuju za molekule MHC klase I i klase II dovodeći do aktivacije antitumorskih CD8+ i CD4+ T ćelija. Imunitet pobuđen HSP kompleksima poreklom iz tumorskih preparata specifično je usmeren protiv jedinstvenog repertoara antigenskih peptida koje eksprimira kancer svakog subjekta.

[0402] Kompleks proteina toplotnog šoka i peptida (HSPPC) je proteinsko-peptidni kompleks koji se sastoji od proteina toplotnog šoka nekovalentno kompleksovanog sa antigenskim peptidima. HSPPC pobuđuju i urođeni i adaptivni imunski odgovor. U specifičnom tehničkom rešenju, antigenski peptid(-i) pokazuje antigenost kancera koji se leči. HSPPC se efikasno drže za APC preko membranskih receptora (uglavnom CD91) ili vezivanjem za receptore slične "toll" proteinu. Internalizacija HSPPC za rezultat ima funkcionalnu maturaciju APC uz proizvodnju hemokina i citokina što dovodi do aktivacije ćelija prirodnih ubica (NK), monocita i Th1 i Th-2-posredovanih imunskih odgovora. U nekim tehničkim rešenjima, HSPPC upotrebljeni u postupcima objavljenim ovde sadrže jedan ili više proteina toplotnog šoka iz hsp60, hsp70, ili hsp90 familije proteina stresa kompleksovane sa antigenim peptidima. U nekim tehničkim rešenjima, HSPPC sadrže hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, kalretikulin, ili kombinacije dva ili više njih.

[0403] U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa kompleksom proteina toplotnog šoka i peptida (HSPPC), npr., kompleks proteina toplotnog šoka i peptida-96 (HSPPC-96), za lečenje kancera, npr., multiformnog glioblastoma. HSPPC-96 sadrži protein toplotnog šoka od 96 kDa (Hsp), gp96, u kompleksu sa antigenim peptidima. HSPPC-96 je kancerska imunoterapija izrađena od pacijentovog tumora i sadrži antigenski "fingerprint" ("otisak prsta") kancera. U nekim tehničkim rešenjima, ovaj "fingerprint" sadrži jedinstvene antigene koji su prisutni samo u tim posebnim subjektovim kancerskim ćelijama i injektiranje vakcine je namenjeno stimulisanju subjektovog imunskog sistema da prepozna i napadne sve ćelije koje imaju specifičan kancerski "fingerprint".

[0404] U nekim tehničkim rešenjima, HSPPC, npr., HSPPC-96, je proizveden od tumorskog tkiva subjekta. U specifičnom tehničkom rešenju, HSPPC (npr., HSPPC-96) je proizveden od

2

tumora tipa kancera ili njegove metastaze, koji se leči. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, HSPPC (npr., HSPPC-96) je autolog za subjekta koji se leči. U nekim tehničkim rešenjima, tumorsko tkivo je nenekrotično tumorsko tkivo. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje 1 gram (npr., najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, ili najmanje 10 grama) nenekrotičnog tumorskog tkiva upotrebljeno je za proizvodnju vakcinskog režima. U nekim tehničkim rešenjima, posle hirurške resekcije, nenektorično tumorsko tkivo se zamrzne pre korišćenja za pripremu vakcine. U nekim tehničkim rešenjima, HSPPC, npr., HSPPC-96, je izolovan iz tumorskog tkiva tehnikama prečišćavanja, filtriran i pripremljen za injektabilnu vakcinu. U nekim tehničkim rešenjima, subjektu se daje 6-12 doza HSPPC, npr., HSPCC-96. U takvim tehničkim rešenjima, prve 4 doze HSPPC, npr., HSPPC-96, mogu se primenjivati nedeljno, a zatim se dodatnih 2-8 doza mogu primenjivati na dve nedelje.

[0405] U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska upotrebljeno je u kombinaciji sa HSPPC-96 za lečenje metastatskog melanoma (npr., rezistentnog metastatskog melanoma), metastatskog kancera ovarijuma, ili metastatskog karcinoma bubrežnih ćelija. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska upotrebljeno je u kombinaciji sa HSPPC-96 za lečenje multiformnog glioblastoma. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska i antagonist CTLA-4 koriste se u kombinaciji sa HSPPC-96 za lečenje multiformnog glioblastoma. U nekim tehničkim rešenjima, subjekt koji se leči je imunosuprimiran (npr., zbog infekcije, npr., HIV, ili zato što je podvrgnut antikancerskoj terapiji (npr., hemioterapija, zračenje) pre primene HSPPC.

[0406] Drugi primeri HSPPC koji se mogu koristiti u skladu sa postupcima opisanim ovde objavljeni su u sledećim patentima i patentnim prijavama: U.S. patenti br. 6,391,306, 6,383,492, 6,403,095, 6,410,026, 6,436,404, 6,447,780, 6,447,781 i 6,610,659.

[0407] U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa jedinjenjem koje cilja imunomodulatorni enzim (-e) kao što je IDO (indolamin-(2,3)-dioksigenaza) i TDO (tryptophan 2,3-dioxygenase, triptofan 2,3-dioksigenaza). U posebnim tehničkim rešenjima, takvo jedinjenje je odabrano iz grupe koja se sastoji od epakadostata (Incyte Corporation), F001287 (Flexus Biosciences), indoksimoda (NewLink Genetics), i NLG919 (NewLink Genetics). U jednom tehničkom rešenju, jedinjenje je epakadostat. U još jednom tehničkom rešenju, jedinjenje je F001287. U još jednom tehničkom rešenju, jedinjenje je indoksimod. U još jednom tehničkom rešenju, jedinjenje je NLG919.

2

[0408] Povišeni brojevi CD4<+>CD25<+>Treg kod pacijenata sa kancerom sprečavaju uspostavljanje efikasnog antitumorskog imunskog odgovora kod domaćina. Pored toga, visoke zastupljenosti Treg udružene su sa smanjenim preživljavanjem pacijenata (Curiel TJ i sar., (2004) Nat Medicine 10(9): 942-9; Woo EY i sar., (2002) J Immunol 168: 4272-6). Međutim, pojačanje imunske aktivnosti PBMC kod pacijenata sa kancerom zapaženo je posle iscrpljivanja regulatornih T ćelija (Dannull J i sar., (2005) J Clin Invest 115(12): 3623-33). Treg koje eksprimiraju visoke nivoe GITR na svojoj površini mogu se iscrpiti anti-GITR antitelom, DTA-1 (Coe D i sar., (2010) Cancer Immunol Immunother 59: 1367-77). U jednom tehničkom rešenju, imunski bazirana strategija može uključiti ex-vivo ili in-vivo iscrpljivanje Treg anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji dovodi do iscrpljivanja GITR-pozitivnih Treg ćelija.

[0409] U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa onkolitičkim virusom kao Talimogene laherparepvec (OncoVEX GM-CSF) i CGTG-102 (Ad5/3-D24-GMCSF).

[0410] U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa citokinom (-kinima) efektivnim u inhibiciji tumorskog rasta/metastaza. Takvi citokini, limfokini, ili drugi hematopoetski faktori uključuju, ali se ne ograničavaju na M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFα, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoetin, faktor matičnih ćelija, i eritropoetin.

[0411] U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa inhibitorom (-ima) receptorske tirozin kinaze kao što su imatinib mezilat (na tržištu kao Gleevec® ili Glivac®), erlotinib (inhibitor EGF receptora) sada na tržištu kao Tarveca, ili sunitinib (na tržištu kao Sutent®).

[0412] U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa antagonističkim TGF-beta antitelom, kao što je Fresolimumab® (GC1008), antitelo koje cilja i inhibira TGF-beta izoforme 1, 2 ili 3.

[0413] U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska ili njegova kompozicija primenjuje se kod subjekta koji boluje ili mu je dijagnostikovan kancer. U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo ili njegova kompozicija primenjuje se kod subjekta koji boluje ili mu je dijagnostikovan multiformni glioblastom. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je povratan. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je novodijagnostikovan. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je prisutan kod subjekta koji ima nemetilisane MGMT promotore. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je povratan. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je novodijagnostikovan. U nekim tehničkim rešenjima multiformni glioblastom je prisutan kod subjekta koji ima nemetilisane MGMT promotore. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je refraktoran na terapiju bevacizumabom. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je prisutan kod subjekta koji nije primao terapiju bevacizumabom.

[0414] U određenim tehničkim rešenjima, pacijenti koji se leče u skladu sa ovde opisanim antitelima pronalaska su pacijenti koji su već lečeni antibioticima, antikancerskim sredstvima, ili drugom biološkom terapijom/imunoterapijom. Među ovim pacijentima su refraktorni pacijenti, pacijenti koji su suviše mladi za konvencionalne terapije, i pacijenti sa ponavljajućim virusnim infekcijama uprkos kontroli ili lečenju postojećim terapijama.

[0415] U nekim tehničkim rešenjima, subjekt kod kojeg se primenjuje anti-GITR antitelo pronalaska ili njegova kompozicija nije primao terapiju pre primene antitela ili njegove kompozicije. U drugim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska ili njegova kompozicija primenjuje se kod subjekta koji je primao terapiju pre primene antitela ili njegove kompozicije.

[0416] U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska, ili njegova kompozicija primenjuje se kod subjekta koji prima ili se oporavlja od imunosupresivne terapije. U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta sa kancerom i kancerske ćelije eksprimiraju GITRL. U nekim tehničkim rešenjima, subjekt koji treba da se leči u skladu sa antitelima pronalaska je imunosuprimiran (npr., zbog infekcije, npr., HIV, ili zbog toga što je podvrgnut antikancerskoj terapiji (npr., hemioterapija zračenje).

[0417] Kako je ovde opisano, anti-GITR antitela utiču na površinsku ekspresiju proteina uključujući OX40, CD25, i PD-1. Prema tome, u određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska ili njegova kompozicija primenjuje se pre primene antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji se vezuje za OX40, CD25, ili PD-1.

[0418] Antagonističko PD-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti u vreme kada su agonističko GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment povećali površinsku ekspresiju PD-1 kod subjekta u odnosu na ekspresiju PD-1 kod subjekta u vreme primene. Na primer, antagonističko PD-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primenti najmanje 12 sati, najmanje 1 dan, najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 4 dana, najmanje 5 dana, najmanje 6 dana, ili najmanje 7 dana posle primene agonističkog GITR antitela. Antagonističko PD-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12 sati do dve nedelje, od 1 dana do dve nedelje, od 2 dana do dve nedelje, ili od 3 dana do dve nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg

1

fragmenta. Antagonističko PD-1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12 sati do jedne nedelje, od 1 dana do jedne nedelje, od 2 dana do jedne nedelje, ili od 3 dana do jedne nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta.

[0419] Agonističko OX40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti u vreme u koje je agonističko GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment povećao površinsku ekspresiju OX40 kod subjekta u odnosu na ekspresiju OX40 kod subjekta u vreme primene. Na primer, agonističko OX40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti najmanje 12 sati, najmanje 1 dan, najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 4 dana, najmanje 5 dana, najmanje 6 dana, ili najmanje 7 dana posle primene agonističkog GITR antitela. Agonističko OX40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12 sati do dve nedelje, od 1 dana do dve nedelje, od 2 dana do dve nedelje, ili od 3 dana do dve nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Agonističko OX40 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12 sati do jedne nedelje, od 1 dana do jedne nedelje, od 2 dana do jedne nedelje, ili od 3 dana do jedne nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0420] Anti-CD25 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti u vreme u koje je agonističko GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment povećao površinsku ekspresiju CD25 kod subjekta u odnosu na ekspresiju CD25 kod subjekta u vreme primene. Na primer, anti-CD25 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti najmanje 12 sati, najmanje 1 dan, najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 4 dana, najmanje 5 dana, najmanje 6 dana, ili najmanje 7 dana posle primene agonističkog GITR antitela. Anti-CD25 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12 sati do dve nedelje, od 1 dana do dve nedelje, od 2 dana do dve nedelje, ili od 3 dana do dve nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Anti-CD25 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12 sati do jedne nedelje, od 1 dana do jedne nedelje, od 2 dana do jedne nedelje, ili od 3 dana do jedne nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0421] Antagonističko CTLA-4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Na primer, antagonističko CTLA-4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti najmanje 12 sati, najmanje 1 dan, najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 4 dana, najmanje 5 dana, najmanje 6 dana, ili najmanje 7 dana posle primene agonističkog GITR antitela. Antagonističko CTLA-4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12

2

sati do dve nedelje, od 1 dana do dve nedelje, od 2 dana do dve nedelje, ili od 3 dana do dve nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Antagonističko CTLA-4 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se primeniti od 12 sati do jedne nedelje, od 1 dana do jedne nedelje, od 2 dana do jedne nedelje, ili od 3 dana do jedne nedelje posle primene agonističkog GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0422] Primeri kancera koji se mogu lečiti prema postupcima opisanim ovde uključuju, ali se ne ograničavaju na limfome B ćelija (npr., hronična limfocitna leukemija B ćelija, ne-Hodgkinov limfom B ćelija, limfom B ćelija kože, difuzni B-krupnoćelijski limfom), karcinom bazalnih ćelija, kancer mokraćne bešike, blastom, metastaze na mozgu, kancer dojke, Burkittov limfom, karcinom (npr., adenokarcinom (npr., gastroezofagealnog spoja)), kancer cerviksa, kancer kolona, kolorektalni kancer (kancer kolona i rektalni kancer), karcinom endometrijuma, kancer ezofagusa, Ewingov sarkom, folikularni limfom, kancer želuca, karcinom gastroezofagealnog spoja, gastrointestinalni kancer, glioblastom (npr., multiformni glioblastom, npr., novodijagnostikovani ili rekurentni), gliom, kancer glave i vrata (npr., karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata), metastaze na jetri, Hodgkinov i ne-Hodgkinov limfom, kancer bubrega (npr., karcinom bubrežnih ćelija i Wilmsovi tumori), kancer larinksa, leukemiju (npr., hronična mijelocitna leukemija, leukemija vlatastih ćelija), kancer jetre (npr., hepatični karcinom i hepatom), kancer pluća (npr., nesitnoćelijski kancer pluća i sitnoćelijski kancer pluća), limfoblastni limfom, limfom, limfom plaštanih ćelija, metastatski tumor mozga, metastatski kancer, mijelom (npr., multipli mijelom), neuroblastom, melanom oka, kancer orofarinksa, osteosarkom, kancer ovarijuma, kancer pankreasa (npr., adenokarcinom pankreasnih kanala), kancer prostate (npr., hormon-refraktorni (npr., rezistentan na kastraciju), metastatski, metastatski hormon-refraktorni (npr., rezistentan na kastraciju, androgen nezavisni)), karcinom bubrežnih ćelija (npr., metastatski), karcinom pljuvačnih žlezdi, sarkom (npr., rabdomiosarkom), kancer kože (npr., melanom (npr., metastatski melanom)), sarkom mekog tkiva, solidni tumor, karcinom skvamoznih ćelija, sinovijalni sarkom, kancer testisa, kancer tiroidee, kancer prelaznih ćelija (kancer urotelnih ćelija), uvealni melanom (npr., metastatski), verukozni karcinom, kancer vulve, i Waldenstromovu makroglobulinemiju.

[0423] U nekim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je humani sarkom ili karcinom, npr., fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteogeni sarkom, hordom, angiosarkom, endoteliosarkom, limfangiosarkom, limfangioendoteliosarkom, sinoviom, mezoteliom, Ewingov tumor, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom kolona, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer ovarijuma, kancer prostate, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojne žlezde, karcinom lojne žlezde, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinomi, cistadenokarcinom, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija (npr., metastatski), hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, seminom, embrionalni karcinom, Wilmsov tumor, cervikalni kancer, testikularni tumor, karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom mokraćne bešike, epitelni karcinom, gliom, multiformni glioblastom, astrocitom, meduloblastom, kraniofaringiom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogliom, meningeom, melanom, neuroblastom, retinoblastom. U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je akutna limfocitna leukemija ili akutna mijelocitna leukemija (npr., mijloblastna, promijelocitna, mijelomonocitna, monocitna i eritroleukemija); hronična leukemija (hronična mijelocitna (granulocitna) leukemija ili hronična limfocitna leukemija); Hodgkinova bolest; ne-Hodgkinova bolest; akutna mijeloidna leukemija; limfom B-ćelija; limfom T-ćelija; anaplastični krupnoćelijski limfom; intraokularni limfom; folikularni limfom; limfom tankog creva; ili limfom marginalne zone slezine. U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je multipli mijelom, Waldenstromova makroglobulinemija, bolest teških lanaca, tumori gastrointestinalne strome, kancer glave i/ili vrata (npr., karcinom skvamoznih ćelija hipofarinska, karcinom skvamoznih ćelija larinksa, ćelijski karcinom orofarinksa, ili verukozni karcinom larinksa), sarkom strome endometrijuma, sarkom mastocita, sarkom adultnih mekih tkiva, sarkom uterusa, karcinom Merkelovih ćelija, karcinom urotela, melanom sa metastazama na mozgu, uvealni melanom, uvealni melanom sa metastazama na jetri, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer rektuma, ili mijelodisplastični sindrom, U nekim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je metastatski.

[0424] U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska opisanim ovde uključuje kancer prostate, kancer dojke, kancer pluća, kolorektalni kancer, melanom, bronhijalni kancer, kancer mokraćne bešike, kancer mozga ili centralnog nervnog sistema, kancer uterusa ili endometrijuma, kancer usne duplje ili farinksa, ne-Hodgkinov limfom, kancer tiroide, kancer bubrega, kancer žučnih puteva, kancer tankog creva ili apendiksa, kancer pljuvačne žlezde, kancer tiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, kancer skvamoznih ćelija, mezoteliom, osteokarcinom, timom/karcinom timusa, glioblastom, mijelodisplastični sindrom, sarkom mekog tkiva, DIPG, adenokarcinom, osteosarkom, hondrosarkom, leukemiju, ili kancer pankreasa. U nekim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska uključuje karcinom (npr., adenokarcinom), limfom,

4

blastom, melanom, sarkom ili leukemiju. U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska uključuje kancer skvamoznih ćelija, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, gastrointestinalni kancer, Hodgkinov limfom, ne-Hodgkinov limfom, kancer pankreasa, glioblastom, gliom, cervikalni kancer, kancer ovarijuma, kancer jetre (npr., hepatični karcinom i hepatom), kancer mokraćne bešike, kancer dojke, zapaljenski kancer dojke, karcinom Merkelovih ćelija, kancer kolona, kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer mokraćne bešike, karcinom endometrijuma, mijelom (npr., multipli mijelom), pljuvačne žlezde, karcinom, kancer bubrega (npr., karcinom bubrežnih ćelija i Wilmsovi tumori), karcinom bazalnih ćelija, melanom, kancer prostate, kancer vulve, kancer tiroidee, kancer testisa, kancer ezofagusa, serozni adenokarcinom ili različite tipove kancera glave i vrata. U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska uključuje dezmoplastični melanom, zapaljenski kancer dojke, timom, kancer rektuma, analni kancer, ili gliom moždanog stabla koji se može lečiti operativno ili koji se ne može lečiti operativno. U specifičnom tehničkom rešenju, kancer je solidni tumor. U drugom specifičnom tehničkom rešenju, kancer je multiformni glioblastom. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je rekurentan. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je novodijagnostikovan. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je prisutan kod subjekta koji ima nemetilisane MGMT promotore. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je refraktoran na terapiju bevacizumabom. U nekim tehničkim rešenjima, multiformni glioblastom je prisutan kod subjekta koji nije primao terapiju bevacizumabom.

[0425] U nekim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je metastatski melanom (npr., rezistentni metastatski melanom), metastatski kancer ovarijuma, ili metastatski karcinom bubrežnih ćelija. U određenim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je melanom koji je rezistentan na ipilimumab. U nekim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je melanom koji je rezistentan na nivolumab. U nekim tehničkim rešenjima, kancer koji se leči u skladu sa antitelima pronalaska je melanom koji je rezistentan na ipilimumab i nivolumab.

5.4.1.2 Infektivne bolesti

[0426] U specifičnom aspektu, ovde su predstavljeni postupci za prevenciju i/ili lečenje infektivne bolesti, koji uključuju primenu kod subjekta kojem je to potrebno efikasne količine anti-GITR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde ili kompozicije istog. U jednoj objavi, ovde su obezbeđeni postupci za prevenciju i/ili lečenje infekcije (npr., virusne infekcije, bakterijske infekcije, gljivične infekcije, infekcije protozoama, ili parazitske infekcije). Infekcija koja se sprečava i/ili leči u skladu sa postupcima može biti izazvana infektivnim sredstvom identifikovanim ovde. U jednom tehničkom rešenju, predmetni pronalazak odnosi se na antitelo pronalaska, ili na farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u lečenju virusne infekcije. U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska ili njegova kompozicija je jedino aktivno sredstvo koje se primenjuje kod subjekta. U nekim aspektima, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde ili kompozicija istog koristi se u kombinaciji sa antiinfektivnim intervencijama (npr., antivirusnim, antibakterijskim, antigljivičnim, ili antihelmintskim) za lečenje infektivnih bolesti.

[0427] Infektivne bolesti koje se mogu lečiti i/ili sprečiti anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde izazvane su infektivnim agensima koji uključuju ali se ne ograničavaju na bakterije, parazite, gljivice, protozoe, i viruse. U specifičnom tehničkom rešenju, infektivna bolest koja se leči anti-GITR antitelom pronalaska izazvana je virusom. Virusne bolesti ili virusne infekcije koje se mogu sprečiti i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim postupcima uključuju, ali se ne ograničavaju na one koje su izazvane virusom hepatitisa tipa A, hepatitisa tipa B, hepatitisa tipa C, influence (npr., influenca A ili influenca B), varičele, adenovirusom, virusom herpes simpleks tipa I (HSV-I), herpes simpleks tipa II (HSV-II), goveđe kuge, rinovirusom, ehovirusom, rotavirusom, virusom respiratornog sincicijuma, papiloma virusom, papova virusom, citomegalovirusom, ehinovirusom, arbovirusom, huntavirusom, koksaki virusom, virusom zauški, virusom malih boginja, virusom rubele, polio virusom, virusom variole, Epstein Barr virusom, virusom humane imunodeficijencije tipa I (HIV-I), virusom humane imunodeficijencije tipa II (HIV-II), i agensima virusnih bolesti kao što su virusni meningitis, encefalitis, denga ili variola.

[0428] Bakterijske infekcije koje se mogu sprečiti i/ili lečiti uključuju infekcije koje izazivaju Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, i Pseudomonas aeruginosa. Bakterijske bolesti izazvane bakterijama (npr., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, i Pseudomonas aeruginosa) koje se mogu sprečiti i/ili lečiti u skladu sa postupcima opisanim ovde uključuju, ali se ne ograničavaju na Mycobacteria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria, S.pneumonia, Borrelia burgdorferi (Lymeska bolest), Bacillus antracis (antraks), tetanus, Streptococcus, Staphylococcus, mycobacterium, veliki kašalj, koleru, kugu, difteriju, chlamydia, S. aureus i legionella.

[0429] Protozojske bolesti ili protozojske infekcije izazvane protozoama koje se mogu sprečiti i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim postupcima uključuju, ali se ne ograničavaju na lejšmaniju, kokcidiozu, tripanozomu šizostomu ili malariju. Parazitske bolesti ili parazitske infekcije izazvane parazitima koje se mogu sprečiti i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim postupcima uključuju, ali se ne ograničavaju na hlamidiju i rikeciju.

[0430] Gljivične bolesti ili gljivične infekcije koje se mogu sprečiti i/ili lečiti u skladu sa ovde opisanim postupcima uključuju, ali se ne ograničavaju na Candida infekcije, zigomikozu, Candida mastitis, progresivnu diseminiranu trihosporonozu sa latentnom trihosporonemijom, diseminiranu kandidijazu, plućnu parakokcidiomikozu, plućnu aspergilozu, Pneumocystis carinii pneumoniju, kriptokokni meningitis, kokcidijalni meningoencefalitis i cerebrospinalni vaskulitis, Aspergillus niger infekciju, Fusarium keratitis, mikoze paranazalnih sinusa, Aspergillus fumigatus endokarditis, dishondroplaziju tibije, Candida glabrata vaginitis, orofaringealnu kandidijazu, X-vezanu hroničnu granulomatoznu bolest, tinea pedis, kožnu kandidijazu, mikotički placentitis, diseminiranu trihosporonozu, alergijsku bronhopulmonalnu aspergilozu, mikotički keratitis, Cryptococcus neoformans infekciju, gljivični peritonitis, Curvularia geniculata infekciju, stafilokokni endoftalmitis, sporotrihozu, i dermatofitozu.

[0431] U određenim tehničkim rešenjima, primenom anti-GITR antitela pronalaska ili njegove kompozicije kod subjekta (u nekim tehničkim rešenjima, animalni model) postižu se jedan, dva, tri, četiri ili više od sledećih efekata: (i) smanjenje ili ublažavanje jačine infektivne bolesti, infekcije ili simptoma udruženih sa njom; (ii) smanjenje trajanja infektivne bolesti, infekcije ili simptoma udruženih sa njom; (iii) zaustavljanje napredovanja infektivne bolesti, infekcije ili simptoma udruženih sa njom; (iv) regresija infektivne bolesti, infekcije ili simptoma udruženih sa njom; (v) zaustavljanje razvoja ili pojave infektivne bolesti, infekcije ili simptoma udruženih sa njom; (vi) zaustavljanje vraćanja infektivne bolesti, infekcije ili simptoma udruženih sa njom; (vii) smanjenje ili zaustavljanje širenja infektivnog agensa od jedne ćelije do druge ćelije, jednog tkiva do drugog tkiva, ili jednog organa do drugog organa; (viii) zaustavljanje ili smanjenje širenja/transmisije infektivnog agensa sa jednog subjekta na drugog subjekta; (ix) smanjenje otkazivanja organa udruženog sa infektivnom bolešću; (x) smanjenje hospitalizacije subjekata; (xi) smanjenje dužine hospitalizacije; (xii) porast preživljavanja subjekta sa infektivnom bolešću ili infekcijom; (xiii) eliminacija infektivne bolesti ili infekcije; (xiii) zaustavljanje ili smanjenje replikacije infektivnog agensa ili infekcije; (xiv) inhibicija ili smanjenje ulaska infektivnog agensa u ćeliju (-e); (xv) zaustavljanje ili smanjenje replikacije genoma infektivnog agensa; (xvi) zaustavljanje ili smanjenje sinteze proteina infektivnog agensa; (xvii) zaustavljanje ili smanjenje sklapanja infektivnih agenasa; (xviii) zaustavljanje ili smanjenje oslobađanja infektivnih agenasa iz ćelije (-a); (xviii) smanjenje broja ili titra infektivnog agensa; (xix) smanjenje broja simptoma udruženih sa infektivnom bolešću ili infekcijom; (xx) pojačanje, poboljšanje, suplementacija, komplementacija ili pojačavanje profilaktičkog ili terapijskog efekta (-kata) druge terapije; i/ili (xxi) sprečavanje pojave ili napredovanja sekundarne infekcije udružene sa infektivnom bolešću.

[0432] U određenim tehničkim rešenjima, kod subjekta se primenjuju dva ili više različitih anti-GITR antitela pronalaska. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa jednom ili više drugih terapija. U jednom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde primenjuje se u kombinaciji sa jednim ili više antigljivičnih sredstava.

[0433] U specifičnom aspektu, anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa jednim ili više antibiotika. primeri antibiotika koji se mogu koristiti u kombinaciji sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde uključuju aminoglikozidne antibiotike, glikopeptide, amfenikolske antibiotike, ansamicinske antibiotike, cefalosporine, cefamicine oksazolidinone, peniciline, hinolone, streptogamine, tetracikline, i njihove analoge.

[0434] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se u kombinaciji sa jednim ili više antivirusnih sredstava. primeri antivirussnih sredstava koja se mogu koristiti u kombinaciji sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom opisanim ovde uključuju nenukleozidne inhibitore reverzne transkriptaze, nukleozidne inhibitore reverzne transkriptaze i inhibitore fuzije. U jednom tehničkom rešenju, antivirusno sredstvo je amantadin, oseltamivir fosfat, rimantadin, i zanamivir. U još jednom tehničkom rešenju, antivirusno sredstvo je nenukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze kao delavirdin, efavirenz ili nevirapin. U još jednom tehničkom rešenju, antivirusno sredstvo je nukleozidni inhibitor reverzne transkriptaze kao abakavir, didanozin, emtricitabin, emtricitabin, lamivudin, stavudin, tenofovir DF, zalcitabin ili zidovudin. U još jednom tehničkom rešenju, antivirusno sredstvo je inhibitor proteaze kao amprenavir, atazanavir, fosamprenav, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir ili sakvinavir. U još jednom tehničkom rešenju, antivirusno sredstvo je inhibitor fuzije kao što je enfuvirtid. U još jednom tehničkom rešenju, antivirusno sredstvo je oseltamivir fosfat, amfotericin B ili palivizumab.

[0435] U specifičnom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa vakcinom koja je preparat proteina toplotnog šoka i sadrži protein toplotnog šoka kompleksovan sa antigenim peptidima koji sadrže antigen patogena (npr., virusa, bakterije, gljivice, itd.). U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska primenjuje se kod subjekta u kombinaciji sa vakcinom koja je preparat proteina toplotnog šoka i sadrži protein toplotnog šoka kompleksovan sa antigenim peptidima koji sadrže virusne antigene (npr., antigene HSV-1 ili HSV-2). U nekim tehničkim rešenjima, preparat proteina toplotnog šoka koji sadrži proteine toplotnog šoka kompleksovane sa antigenim peptidima koji uključuju virusne antigene (npr., antigene HSV-1 ili HSV-2) kombinovan je sa adjuvansom, kao što je QS-21. U nekim tehničkim rešenjima, vakcina je HerpV (Agenus Inc.), koja predstavlja vakcinu za lečenje herpesnih infekcija. Neograničavajući primer pogodne vakcine objavljen je u Mo A., i sar., (2011), Vaccine 29: 8530-8541. Dodatni neograničavajući primeri objavljeni su u U.S. patentu br.8,541,002.

[0436] U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska, ili njegova kompozicija primenjuje se kod subjekta koji pati od infektivne bolesti prouzrokovane virusima. U određenim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska, ili njegova kompozicija primenjuje se kod subjekta kojem je dijagnostikovana infektivna bolest prouzrokovana virusima. U nekim tehničkim rešenjima, anti-GITR antitelo pronalaska, ili njegova kompozicija primenjuje se kod subjekta sa virusnom infekcijom. U nekim tehničkim rešenjima, subjekt lečen u skladu sa antitelom pronalaska je imunokompromitovan ili imunosuprimiran. U određenim tehničkim rešenjima, subjekt lečen u skladu sa antitelom pronalaska primao je, prima ili će primati drugu terapiju (npr., antivirusno sredstvo, antibiotik, ili antigljivično sredstvo).

5.4.1.3 Putevi primene i doziranje

[0437] Antitelo ili kompozicija pronalaska mogu se dostaviti subjektu različitim putevima. Oni uključuju, ali se ne ograničavaju na parenteralni, intranazalni, intratrahealni, oralni, intradermalni, površinski, intramuskularni, intraperitonealni, transdermalni, intravenski, intratumorski, konjunktivalni i supkutani put. Može se koristiti i primena preko pluća, npr., upotrebom inhalera ili nebulizera, i formulacije sa aerosolizujućim sredstvom za upotrebu u vidu spreja.

[0438] Količina antitela, ili kompozicije pronalaska koja će biti efikasna u lečenju i/ili sprečavanju stanja zavisiće od prirode bolesti, i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama.

[0439] Tačna doza koja će se upotrebiti u kompoziciji zavisiće i od puta primene, i ozbiljnosti infekcije ili bolesti prouzrokovane njome, i treba da se određuje u skladu sa procenom stručnjaka i okolnostima u vezi sa svakim pojedinačnim subjektom. Na primer, efikasne doze mogu varirati i u zavisnosti od načina primene, ciljnog mesta, fiziološkog stanja pacijenta (uključujući starost, telesnu težinu i zdravlje), da li je pacijent čovek ili životinja, drugih primenjivanih lekova, ili da li je tretman profilaktički ili terapijski. Obično, pacijent je čovek, ali mogu se lečiti i nehumani sisari uključujući transgene sisare. Doze tretmana su optimalno titrovane radi optimizacije bezbednosti i efikasnosti.

[0440] U određenim tehničkim rešenjima, in vitro test se koristi za identifikovanje optimalnih doznih raspona. Efikasne doze mogu se ekstrapolirati na osnovu krivih doznog odgovora, dobijenih u testnim sistemima in vitro ili u životinjskim modelima.

[0441] Za pasivnu imunizaciju antitelom (ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom), doza je u rasponu od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i običnije 0.01 do 15 mg/kg, pacijentove telesne težine. Na primer, doze mogu iznositi 1 mg/kg telesne težine, 10 mg/kg telesne težine, ili u opsegu od 1-10 mg/kg ili drugim rečima, 70 mg ili 700 mg ili u opsegu od 70-700 mg, respektivno, za pacijenta teškog 70 kg. U nekim tehničkim rešenjima, doza primenjena kod pacijenta je oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg pacijentove telesne težine. Uopšteno, humana antitela imaju duži poluživot u čovečjem telu nego antitela iz drugih vrsta zbog imunskog odgovora na strane polipeptide. Prema tome, niže doziranje humanih antitela i manja učestalost primene često su moguće.

[0442] Primer režima lečenja podrazumeva primenu jednom na svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom na 3 do 6 meseci tokom perioda od jedne godine ili tokom nekoliko godina, ili u intervalima od nekoliko godina. U nekim postupcima, dva ili više antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata sa različitim vezujućim specifičnostima primenjivaće se kod subjekta istovremeno. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obično se primenjuju u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti nedeljno, mesečno, svaka 3 meseca, svakih 6 meseci ili godišnje.

5.4.2 Detekcione i dijagnostičke upotrebe

[0443] Anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde (vidi, npr., Odeljak 5.1) može se koristiti za testiranje nivoa GITR proteina u biološkom uzorku korišćenjem klasičnih imunohistoloških postupaka poznatih stručnjacima u oblasti, uključujući imunotestove, kao što su enzimski imunotest (ELISA), imunoprecipitacija, ili Western

1

blotovanje. Pogodni obeleživači za testove sa antitelima poznati su u struci i uključuju enzimske obeleživače, kao što je glukoza oksidaza; radioizotope, kao što su jod (<125>I,<121>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<121>In), i tehnicijum (<99>Tc); luminescentne obeleživače, kao što je luminol; i fluorescentne obeleživače, kao što su fluorescein i rodamin, i biotin. Takvi obeleživači mogu da se koriste za obeležavanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisanog ovde. Alternativno, sekundarno antitelo koje prepoznaje anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde može da se obeleži i koristi u kombinaciji sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom za detektovanje nivoa GITR proteina.

[0444] Testiranje nivoa ekspresije GITR proteina treba da uključi kvalitativno i kvantitativno merenje ili procenjivanje nivoa GITR proteina u prvom biološkom uzorku direktno (npr., određivanjem ili procenjivanjem apsolutnog nivoa proteina) ili relativno (npr., upoređivanjem sa nivoom proteina udruženim sa bolešću u drugom biološkom uzorku). Nivo ekspresije GITR polipeptida u prvom biološkom uzorku može da se izmeri ili proceni i uporedi sa standardnim nivoom GITR proteina, standard se uzima iz drugog biološkog uzorka dobijenog od osobe koja nema poremećaj ili se određuje uprosečavanjem nivoa iz populacije individua koje nemaju poremećaj. Kao što će se razumeti u struci, kada je poznat "standardni" nivo GITR polipeptida, on se ponavljano može koristiti kao standard za upoređivanje.

[0445] Kako se ovde koristi, izraz "biološki uzorak" odnosi se na bilo koji biološki uzorak dobijen od subjekta, iz ćelijske linije, tkiva, ili drugog izvora ćelija koje potencijalno eksprimiraju GITR. Postupci dobijanja tkivnih bioptata i telesnih tečnosti iz životinja (npr., ljudi) dobro su poznati u struci. Biološki uzorci uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi.

[0446] Anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment opisan ovde može se koristiti za primenu u prognostici, dijagnostici, praćenju i pretraživanju, uključujući in vitro i in vivo primene dobro poznate i standardne za iskusnog stručnjaka i bazirane na predmetnom opisu. Prognostički, dijagnostički, testovi praćenja i pretraživanja i kitovi za in vitro procenu i evaluaciju statusa imunskog sistema i/ili imunskog odgovora mogu se upotrebiti za predviđanje, dijagnostikovanje i praćenje da bi se evaluirali pacijentovi uzorci uključujući one za koje se zna da imaju ili su suspektni na disfunkciju imunskog sistema ili u vezi sa predviđenim ili željenim odgovorom imunskog sistema, odgovor na antigen ili odgovor na vakcinu. Procena i evaluacija statusa imunskog sistema i/ili imunskog odgovora takođe koristi za određivanje podesnosti pacijenta za kliničku studiju leka ili za primenu određenog hemioterapijskog sredstva ili antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, uključujući kombinacije istog, u odnosu na drugo sredstvo ili antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

11

Ovaj tip prognostičkog i dijagnostičkog praćenja i procene već se praktikuje uz korišćenje antitela protiv HER2 proteina u kanceru dojke (HercepTest™, Dako) gde se test koristi i za evaluaciju pacijenata u vezi sa terapijom antitelima korišćenjem Herceptin®. In vivo primene uključuju usmerenu ćelijsku terapiju i modulaciju imunskog sistema i radio-imidžing imunskih odgovora.

[0447] U jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska može se koristiti za imunohistohemijsku analizu uzoraka dobijenih biopsijom.

[0448] U još jednom tehničkom rešenju, anti-GITR antitelo pronalaska može se koristiti za detektovanje nivoa GITR, ili nivoa ćelija koje sadrže GITR na površini svoje membrane, ti nivoi se zatim mogu povezati sa određenim simptomima bolesti. Anti-GITR antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde mogu nositi detektabilan ili funkcionalan obeleživač. Kada se koriste fluorescentni obeleživači, trenutno raspoloživi metodi mikroskopije i fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (fluorescence-activated cell sorter analysis, FACS) ili kombinovane procedure oba postupka poznata u struci mogu služiti za identifikovanje i kvantifikaciju specifičnih učesnika u vezivanju. Anti-GITR antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde mogu nositi fluorescentni obeleživač. Primeri fluorescentnih obeleživača uključuju, na primer, reaktivne i konjugovane probe npr. aminokumarin, fluorescein i Texas crveno, Alexa fluor boje, cijano boje i DyLight boje. Anti-GITR antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu nositi radioaktivni obeleživač, na primer izotope<3>H, 1<4>C,<32>P,<35>S,<36>Cl,<51>Cr,<57>Co,<58>Co,<59>Fe,<67>Cu,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<117>Lu,<121>I,<124>I,<125>I,<131>I,<198>Au,<211>At,<213>Bi, 2<25>Ac i<186>Re. Kada se koriste radioaktivni obeleživači, trenutno raspoložive procedure merenja signala poznate u struci mogu se koristiti za identifikovanje i kvantifikaciju specifičnog vezivanja anti-GITR antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta za GITR (npr., humani GITR). U slučaju kada je obeleživač enzim, detekcija može da se obavi bilo kojom od kolorimetrijskih, spektrofotometrijskih, fluorospektrofotometrijskih, amperometrijskih ili gasometrijskih tehnika koje se danas koriste, kao što je poznato u struci. Ovo se može postići dovođenjem u kontakt uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-GITR antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i GITR. Svi kompleksi koji se formiraju između antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i GITR detektuju se i upoređuju u uzorku i kontroli. U svetlu specifičnog vezivanja ovde opisanih antitela za GITR, anitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu da se koriste za specifičnu detekciju ekspresije GITR na površini ćelija. Anitela ili njihovi antigen-

12

vezujući fragmenti opisani ovde mogu da se koriste i za prečišćavanje GITR putem imunoafinitetnog prečišćavanja.

[0449] Isto tako, ovde je uključen i testni sistem koji može da se pripremi u formi testnog kita za kvantitativnu analzu mere prisustva, na primer, GITR ili GITR/GITRL kompleksa. Sistem ili testni kit mogu sadržati obeleživačku komponentu, npr., obeleženo antitelo, i jedan ili više dodatnih imunohemijskih reagenasa. Vidi, npr., Odeljak 5.5 dole za više informacija o kitovima.

5.5 Kitovi

[0450] Ovde su obezbeđeni kitovi koji sadrže jedno ili više ovde opisanih antitela ili njihovih fragmenata ili konjugata istog. U specifičnom tehničkom rešenju, ovde je obezbeđen farmaceutski paket ili kit koji sadrži jedan ili više kontejnera ispunjenih jednim ili više sastojaka farmaceutskih kompozicija opisanih ovde, kao što su jedno ili više antitela obezbeđenih ovde ili njihovi antigen-vezujući fragmenti. U nekim tehničkim rešenjima, kitovi sadrže farmaceutsku kompoziciju opisanu ovde i neko profilaktičko ili terapijsko sredstvo, kao što su ovde opisana. U određenim tehničkim rešenjima, kitovi mogu sadržati mitogen T ćelija, kao što je, npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Opciono, sa takvim kontejnerom (-ima) može biti udružena napomena u formi koju propisuje Vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih sredstava ili bioloških proizvoda, napomena saopštava da je agencija odobrila proizvodnju, upotrebu ili prodaju za primenu kod ljudi.

[0451] Ovde su obezbeđeni i kitovi koji mogu da se koriste u gornjim postupcima. U jednom aspektu, kit sadrži ovde opisano antitelo, poželjno prečišćeno antitelo, u jednom ili više kontejnera. U specifičnom aspektu, kitovi opisani ovde sasdrže suštinski izolovan GITR antigen (npr., humani GITR) kao kontrolu. U drugom specifičnom aspektu kitovi opisani ovde sasdrže još i kontrolno antitelo koje ne reaguje sa GITR antigenom. U sledećem specifičnom aspektu, kitovi opisani ovde sasdrže jedan ili više elemenata za detektovanje vezivanja antitela za GITR antigen (npr., antitelo može biti konjugovano sa detektabilnim supstratom kao što je fluorescentno jedinjenje, supstrat enzima, radioaktivno jedinjenje ili luminescentno jedinjenje, ili drugo antitelo koje prepoznaje prvo antitelo može biti konjugovano sa detektabilnim supstratom). U specifičnim aspektima, kit obezbeđen ovde može uključivati rekombinantno proizveden ili hemijski sintetisan GITR antigen. GITR antigen obezbeđen u kitu može takođe

1

biti prikačen za čvrstu podlogu. U specifičnijem aspektu, detektujuće sredstvo kita opisanog gore uključuje čvrstu podlogu za koju je prikačen GITR antigen. Takav kit može sadržati i neprikačeno reporterom obeleženo antihumano antitelo ili anti-mišje/pacovsko antitelo. U ovom aspektu, vezivanje antitela za GITR antigen može se detektovati vezivanjem pomenutog reporterom obeleženog antitela.

[0452] Primeri koji slede ponuđeni su kao ilustracije a ne kao ograničenja.

6. PRIMERI

[0453] Primeri u ovom Odeljku (tj., Odeljku 6) ponuđeni su kao ilustracije, a ne kao ograničenja.

6.1 Primer 1: Stvaranje novih antitela protiv humanog GITR

[0454] Ovaj primer opisuje stvaranje i karakterizaciju mišjih antitela koja se vezuju za humani GITR. Posebno, primer opisuje stvaranje mišjih antitela koja se specifično vezuju za humani GITR i ispoljavaju kostimulatorni efekat na CD4<+>T ćelije.

[0455] Da bi se stvorila nova GITR antitela, mišje CMS5a ćelije transfektovane humanim GITR koriste se kao imunogen u kombinaciji sa adjuvansom (monofosforil lipid A (monophosphoryl lipid, MPL), trehaloza dimiokloatom (trehalose dimyocloate, TDM), muramil dipeptidom (muramyl dipeptide, MDP) i Freundovim adjuvansom (freund’s adjuvant, FA)) u BALB/c miševima. Ćelije slezine imunizovanih miševa fuzionišu se sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma SP2/0. Supernatanti novostvorenih klonova pretražuju se u mešovitim hemadsorpcionim testovima u pogledu prisustva hGITR-transfektovanih CMS5a i divljeg tipa CMS5a ćelija. Odabrani supernatanti se dodatno testiraju korišćenjem ELISA na prisustvo rekombinantnog hGITR proteina (HGITR-Fc, Sigma). Rezultat fuzije #231 su četiri hibridoma (231-32-15, 231-1039-45, 231-1042-7 i 231-1333-21) sa selektivnom reaktivnošću za humani GITR (ponekad ovde označen kao hGITR ili huGITR) korišćenjem MHA ELISA. Za dalje testiranje antitela (sva IgG1) se prečišćavaju afinitetnom hromatografijom na proteinu G.

[0456] Specifičnost anti-GITR-antitela testira se Western blotom u odnosu na prečišćeni rekombinantni humani GITR, rekombinantni mišji GITR, CMS5a ćelije transfektovane humanim GITR, divlji tip CMS5a ćelije, aktivirane CD4<+>T ćelije i netretirane CD4<+>T ćelije. Western blot, pod neredukujućim uslovima, prikazan je na Slici 1. Anti-GITR antitela su reaktivna sa prečišćenim rekombinantnim humanim GITR, nisu reaktivna sa rekombinantnim

14

mišjim GITR, reaktivna su sa rekombinantnim humanim GITR u CMS5a ćelijama, i reaktivna su sa prirodnim humanim GITR u aktiviranim CD4<+>T ćelijama.

[0457] Analiza vezivanja liganda (GITR-L) i monoklonskog antitela za imobilisani huGITR izvedena je rezonancijom površinskog plazmona i merena na BIAcore®. GITR (∼1100 RU) imobilisan je na CM5 senzornom čipu korišćenjem standardnog povezivanja amina. Analiti se injektiraju na imobilisani GITR tokom 15 minuta pri stopi protoka od 5 µl/min posle čega sledi period disocijacije od 10 minuta. Posle izvođenja kinetičkih ciklusa konstante afiniteta i disocijacije izračunavaju se istovremeno, uz korišćenje BiaEvaluation® softvera (Biacore Life Sciences). Vezivanje humanog GITR-L analizira se duž koncentracionog raspona od 12.5-200 nM i mišja anti-GITR monoklonska antitela analiziraju se u konentracijama u rasponu od 6.25-100 nM. Antitela se nisu vezivala za imobilisani mišji GITR. Konstante afiniteta i disocijacije za antitela tabelarno su prikazane dole u Tabeli 9.

Tabela 9

[0458] Hibridomi 231-32-15, 231-1039-45, 231-1042-7 i 231-1333-21 su sekvencirani i nađeno je da imaju iste sekvence cDNK i proteina. Proteinske sekvence VH i VL potvrđene su N-terminalnim sekvenciranjem proteina i masenom spektrometrijom (mass spectrometry, MS) triptinskih digestata. Varijabilna sekvenca teškog lanca anti-GITR antitela je SEQ ID NO: 201 i varijabilna sekvenca lakog lanca anti-GITR antitela je SEQ ID NO: 202. Sekvence regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) variijabilnog regiona teškog lanca (VH), VH CDR1, VH CDR2 i VH CDR3 imaju SEQ ID NO: 13, 14, odnosno 15, a CDR sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL), VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3 imaju SEQ ID NO: 16, 17, odnosno 18. [0459] Kompetitivno vezivanje novih 231- GITR antitela upoređeno je sa komercijalno dostupnim anti-GITR monoklonskim antitelom (R&D Systems mAb689 klon 110416). Korišćene su GITR-transfektovane CMS5a ćelije i inkubirane su sa neobeleženim anti-GITR mAb, što je praćeno dodavanjem PE-konjugovanog R&D mAb ili Alexa 488-konjugovanog

1

231-1039-45 ili 213-1333-21 antitela (podaci za Alexa 448-konjugovano 213-1333-21 antitelo nisu prikazani), a rezultati su procenjivani FACS analizom. Blokirajuće studije R&D Systems anti-GITR mAb prikazane su na Slici 2A i blokirajuće studije 231 antitela (1039-45) prikazane su na Slici 2B. U ovim studijama, nijedno antitelo, neobeleženo R&D antitelo ili neobeležena testna antitela (antitela 1042-7, 1039-45, 1331-21 ili 32-15) najpre se dodaju i inkubiraju sa M5Sa-GITR transfektovanim ćelijama. Ovo je zatim praćeno dodavanjem obeleženog R&D Systems antitela (Slika 2A) ili obeleženog 231-anti-GITR antitela 1039-45 (Slika 2B). Nova 231 antitela (1042-7, 1039-45, 1333-21 ili 32-15) samo delimično blokiraju vezivanje R&D antitela, moguće zbog steričnog ometanja (Slika 2A). Slika 2B pokazuje da R&D antitelo nije blokiralo vezivanje 231-1039-45 antitela. Vezivanje 1039-45 bilo je inhibirano svakim od 231 antitela (tj., antitelom 1042-7, 1039-45, 1333-21 ili 32-15).

[0460] Vezujuće karakteristike 231- GITR antitela analizirane su korišćenjem FACS i rezultati su prikazani na Slikama 3A-C. Slika 3A prikazuje bojenje CMS5a-GITR ćelija anti-humanim GITR IgG11333-21 antitelom iz dve različite serije (1 i 2) i antitelom R&D Systems. Na Slici 3B, prikazan je intenzitet fluorescencije ex-vivo CD3-CD19<->GITR<+>i CD4<+>CD25<+>GITR<+>poreklom iz PMBC posle bojenja korišćenjem 1042-7, 32-15, 1039-45, 1333-21 i antitela R&D Systems. FACS analiza ovih PBMC ćelija in vivo porekla posle vezivanja 1333-21 ili R&D Systems antitela (mAb689 klon 110416) prikazana je na Slici 3C.

[0461] Zatim, izvršene su studije za procenu kostimulatornog efekta anti-GITR antitela na CD4<+>T ćelije u kombinaciji sa anti-CD3 (OKT3) antitelom. Najznačajniji relativni kostimulatorni efekat zapažen je kombinovanjem anti-GITR antitela (231-1042-7, 231-32-15, 231-1039-45, 231-1333-21) sa suboptimalnim koncentracijama (0.2 µg/ml) OKT3. Anti-GITR antitelo (5 µg/ml) i OKT-3 antitelo u različitim koncentracijama bila su vezana za ploče za kulturu tkiva i zatim inkubirana sa CSFE-obeleženim CD4<+>ćelijama. U medijum je dodat IL-2 (10 U/ml) i ćelije i antitela inkubirani su narednih 5 dana. Posle 5 dana, evaluiran je intenzitet CFSE pri čemu su podeljene ćelije imale nizak intenzitet CFSE. IFNγ je takođe meren. Rezultati za anti-GITR antitela prikazani su na Slici 4. Pri suboptimalnoj koncentraciji OKT3 antitela (0.2 µg/ml), anti-GITR antitela imaju značajan relativni efekat na proliferaciju CD4<+>ćelija. Porast IFNγ u poređenju sa kontrolama viđen je u prisustvu anti-GITR antitela kombinovanog sa svim ispitivanim nivoima OKT3, pri čemu je najizraženiji efekat zapažen na 0.2 µg/ml i 0.04 µg/ml. Varijacija između testiranih antitela može se pripisati unutartestnoj varijabilnosti i prirodnoj varijabilnosti između svakog preparata antitela (npr. zasebna priprema). Što je značajno, u odsustvu OKT3, nije bilo stimulacije anti-GITR antitelima. Kostimulatorni efekat

1

anti-GITR antitela sa OKT3 dozno je zavisio od količine anti-GITR antitela (podaci nisu prikazani).

[0462] U zaključku, izolovana su nova anti-GITR antitela koja su specifična za humani GITR i prepoznaju rekombinantni i prirodni GITR. Ova antitela vezuju se za hGITR eksprimiran na hGITR-transfektovanim CMS5a ćelijama pri 2.5-5 ng/ml i pokazuju dobro vezivanje, prema FACS analizi. Antitela se vezuju i za humane PBMC uključujući T ćelije koje eksprimiraju prirodni hGITR. Njihov afinitet za GITR prema BIAcore® je KA(1/m) približno 4.2 x 10<8>, KD(m) 2.4 x 10<-9>(prema GITRL (ligand) KAod 1.8 x 10<8>i KD5.5 x 10<-9>). Ova antitela vezuju se za različito mesto na hGITR u poređenju sa komercijalno dostupnim GITR mAb (R&D).

[0463] Pokazan je kostimulatorni efekat anti-GITR monoklonskog antitela sa suboptimalnim koncentracijama (0.2 µg/ml i 0.04 µg/ml) anti-CD3 mAb (OKT3) na CD4<+>T ćelije. Uprkos prisustvu T-regulatornih ćelija u obogaćenoj populaciji CD4<+>T ćelija, anti-GITR antitela pojačavaju aktivnost CD4 T ćelija.

6.2 Primer 2: Humanizacija mišjeg monoklonskog antitela 231-32-15

[0464] Ovaj primer opisuje humanizaciju mišjeg antitela 231-32-15 i karakterizaciju humanizovanih antitela.

6.2.1 Humanizacija mišjeg antitela 231-32-15

[0465] Ovde je opisana humanizacija anti-humanog GITR mišjeg antitela 231-32-15 uključujući odabir humanih akceptorskih regiona okvira.

6.2.2 Himerizacija mišjeg antitela 231-32-15

[0466] Mišji VH i VL (kapa) varijabilni regioni iz mišjeg 231-32-15 koji imaju sekvencu SEQ ID NO: 201, odnosno 202, sintetisanu su od strane GeneArt® (Life Technologies™). Uključene su prirodne liderske sekvence iz originalnih mišjih varijabilnih domena zajedno sa adapterima sa restrikcionim mestima da bi se omogućilo kloniranje ovih varijabilnih regiona direktno u standardni humani IgG1Vh vektor (CH1-2-3 domeni) naše kuće, i Vk vektor (Ck1), kako bi se stvorili himerni geni sa mišjim Vh ili Vk, i humanim konstantnim regionima. Ekspresioni vektori za himerni teški i laki lanac se zatim kotransfektuju u CHO ćelije u suspenziji da bi se proizveo himerni protein antitela za upotrebu u testovima koji se izvode dole. Ovo himerno antitelo je označeno u Primerima u Odeljku 6 kao "himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo". Ovo himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo sadrži T109S supstituciju (tj., supstituciju treonina

1

serinom na poziciji 109 u odnosu na divlji tip Fc sekvence), numerisano po Kabatu, u konstantnom domenu lakog lanca, što olakšava kloniranje varijabilnog regiona u ramu sa konstantnim regionom. Ova mutacija je konzervativna modifikacija koja ne utiče na vezivanje ili funkciju antitela.

[0467] Homologno podudaranje upotrebljeno je da bi se odabrali humani akceptorski regioni okvira za graftovanje CDR antitela 231-32-15. Baze podataka, npr., baza podataka varijabilnih gena germinativne linije sa imunoglobulinskih lokusa čoveka i miša (baza podataka IMGT (međunarodni ImMunoGeneTics information system®; Lefranc MP i sar., (1999) Nucleic Acids Res 27(1): 209-12; Ruiz M i sar., (2000) Nucleic Acids Res 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res 31(1): 307-10; Lefranc MP i sar., (2005) Dev Compo Immunol 29(3): 185-203; Kaas Q i sar., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics 6(4): 253-64) ili VBASE2 (Retter I i sar., (2005) Nucleic Acids Res 33, Database issue D671-D674) ili Kabatova baza podataka (Johnson G i sar., (2000) Nucleic Acids Res 28: 214-218)) ili publikacije (npr., Kabat EA i sar., gore) mogu se koristiti za identifikovanje humanih potfamilija kojima pripadaju varijabilni regioni teškog i lakog lanca miša i određivanje najpogodnijeg regiona okvira humane germinativne linije koji će se upotrebiti kao akceptorski molekul. Selekcija sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca (VH i VL) u okviru ovih potfamilija koje će se upotrebiti kao akceptor može se zasnivati na homologiji sekvence i/ili podudaranju strukture CDR1 i CDR2 regiona da bi se pomoglo u očuvanju pogodne relativne prezentacije šest CDR posle graftovanja.

[0468] Pretraživanje IMGT baze podataka uz korišćenje IgBLAST (dostupno na veb-stranici NCBI) pokazalo je dobru homologiju između 231-32-15 okvira varijabilnog regiona teškog lanca i članova potfamilija 1 i 7 varijabilnog regiona humanog teškog lanca. Najveća homologija i identičnost i CDR sekvenci i sekvenci okvira zapažene su za sekvence germinativne linije: IGHV1-2<∗>02 (poznata i kao DP75; SEQ ID NO: 601) (59.2% identičnosti; 58 aminokiselinskih rezidua od 98), IGHV1-3<∗>01 (SEQ ID NO: 602) (58.2% identičnosti; 57/98), IGHV1-46<∗>01 (SEQ ID NO: 603) (57.1% identičnosti; 56/98), IGHV1-18<∗>01 (SEQ ID NO: 604) i IGHV1-69<∗>01 (SEQ ID NO: 605) (obe 56.1% identičnosti; 55/98) i IGHV7-4-1<∗>02 (SEQ ID NO: 606) (54.1% identičnosti; 53/98).

[0469] Korišćenjem istog pristupa, sekvenca varijabilnog domena lakog lanca 231-32-15 pokazala je dobru homologiju sa članovima potfamilija 3 i 4 varijabilnog domena humanog lakog lanca kapa. Najveća homologija i identičnost i CDR sekvenci i sekvenci okvira zapažene su za sekvence germinativne linije: IGKV4-1<∗>01 (SEQ ID NO: 607) (79.2% identičnosti; 80

1

aminokiselinskih rezidua od 101) i IGKV3-7<∗>02 (SEQ ID NO: 608) (64.4% identičnosti; 65/101).

[0470] Kao polazna tačka procesa humanizacije, CDR-graftovana verzija mišjeg 231-32-15 VH stvara se korišćenjem humanog IGHV1-2<∗>02 kao humanog akceptorskog okvirnog regiona. Brojne povratne mutacije napravljene su na pozicijama rezidua koje mogu uticati na konformacije CDR ili pakovanje intervarijabilnih domena i stoga mogu biti strukturno važne za održavanje pune aktivnosti antitela. U okvirnom regionu 1, rezidua Kabat H24 zadržava se kao mišja jer je ona kanonska rezidua za CDR1 (petlja duga 5 aminokiselinskih rezidua kako je definisano po Kabatu). To je Gly u mišjoj sekvenci i Ala u sekvenci humane germinativne linije. U okvirnom regionu 2, rezidua Kabat H48 zadržava se kao mišja jer je ona poznata kao Vernierova rezidua (tj., u blizini je CDR). To je Ile u mišjoj sekvenci i Met u sekvenci humane germinativne linije. U okvirnom regionu 3, rezidue Kabat H67 i 73, koje su Vernierove rezidue zadržavaju se kao mišje. H67 je Ala u mišjoj sekvenci i Val u sekvenci IGHV1-2<∗>02 humane germinativne linije. H73 je Lys u mišjoj sekvenci i Thr u sekvenci IGHV1-2<∗>02 humane germinativne linije. Rezidua H71, koja je kritična kanonska rezidua za CDR2 zadržava se kao mišja (to je Arg u humanoj germinativnoj liniji i Val u mišjoj sekvenci). Rezidua Kabat H94, koja je kanonska rezidua za CDR1 zadržava se kao mišja (to je Arg u humanoj germinativnoj liniji i Lys u mišjoj sekvenci). Finalna humanizovana sekvenca označena je kao Verzija VH A (SEQ ID NO: 206) i ima 79.6% identičnosti (78 aminokiselinskih rezidua od 98) sa IGHV1-2<∗>02 humane germinativne linije.

[0471] Prva CDR-graftovana verzija mišjeg 231-32-15 VL napravljena je korišćenjem humanog IGKV3-7<∗>02 kao humanog akceptorskog regiona okvira. Razmatrane su povratne mutacije na različitim pozicijama rezidua i kao rezultat u regionu okvira 3, rezidua Kabat L87 zadržava se kao mišja jer ona može imati kritičnu ulogu u VH/VL interfejsu. L87 je His u mišjoj sekvenci i Tyr IGKV3-7<∗>02 humane germinativne linije. Finalna humanizovana sekvenca označena je kao Verzija VK A1 (SEQ ID NO: 207) i ima 81.2% identičnosti (82 aminokiselinske rezidue od 101) sa IGKV3-7<∗>02 humane germinativne linije.

[0472] Druga CDR-graftovana verzija mišjeg 231-32-15 VL napravljena je korišćenjem humanog IGKV4-1<∗>01 kao humanog akceptorskog regiona okvira. Razmatrane su povratne mutacije na različitim pozicijama rezidua i kao rezultat u regionu okvira 3, rezidua Kabat L87 zadržava se kao mišja jer ona može imati kritičnuulogu u VH/VL interfejsu. L87 je His u mišjoj sekvenci i Tyr u IGKV4-1<∗>01 humane germinativne linije. Finalna humanizovana sekvenca

1

označena je kao Verzija VK A2 (SEQ ID NO: 208) i ima 91.1% identičnosti (92 aminokiselinske rezidue od 101) sa IGKV4-1<∗>01 humane germinativne linije.

[0473] Tabela 10 prikazuje rezidue (numerisanje po Kabatu) koje se razlikuju u regionima okvira mišjeg i humanog antitela u CDR-graftovanim verzijama VH i VL mišjeg 231-32-15 opisanim gore.

Tabela 10: Poređenje 231-32-15 i humanog akceptorskog teškolančanog varijabilnog IGHV1-2<∗>02 i humanog akceptorskog lakolančanog varijabilnog IGKV4-1<∗>01 i IGKV3-7<∗>02 regiona okvira.

6.2.3 Ekspresija humanizovanih varijanti

[0474] Varijabilni regioni IGHV1-2<∗>02, IGK4-1<∗>01 i IGK3-7<∗>02 sintetisani su od strane Life Technologies™ i klonirani u standardne ekspresione vektore (pPEP), kako je opisano dole. Ovi konstrukti su zatim upotrebljeni za transfektovanje CHO ćelija i eksprimirana antitela su testirana korišćenjem tehnologije niza suspenzija (Luminex® 200 sistem, Millipore) i rezonancije površinskog plazmona (BIAcore®, GE Healthcare) kako je opisano dole. Izraz "varijabilni region" u ovom Primeru označava VDJ rearanžirane gene za teške lance IGHV1-2<∗>02 i VJ rearanžirane gene za lake lance IGK4-1<∗>01 i IGK3-7<∗>02. Ekspresioni vektor sadržao je CMV promotor, imunoglobulinski konstantni region, WPRE element (posttranscriptional response element, element posttranskripcionog odgovora) i BGH poliadenilacioni signal. Tri

2

različite varijante ekspresionih vektora korišćene su za kloniranje varijabilnog regiona IGHV1-2<∗>02. Dve varijante ekspresionih vektora sadržale su različite imunoglobulinske konstantne regione - IGHG1 i IGHG4 i treća varijanta ekspresionog vektora sadržala je fragment IGHG1 da se proizvedu Fab fragmenti antitela. Varijabilni regioni lakih lanaca IGK4-1<∗>01 i IGK3-7<∗>02 klonirani su u ekspresioni vektor koji sadrži immunoglobulinski IGKC konstantni region.

6.2.3.1 Kloniranje u ekspresione vektore za transfekciju CHO ćelija

[0475] Sintetisani varijabilni regioni kloniraju se u pPEP ekspresioni vektor koji sadrži odgovarajući imunoglobulinski konstantni region. Za kloniranje varijabilnih regiona IGHV1-2<∗>02, konstrukti 3592 (pPEP-InsX-Cg(iso3), 4192 (pPEP-InsX-IgG4) i 4215 (pPEP-InsX-Fab-Xa-6xHis) ("6xHis" objavljen kao SEQ ID NO: 36) digestiraju se korišćenjem HindIII/Eco47III na 37°C u trajanju od 4 sata. Posle digestije, trake veličine 4952bp, 4952bp i 4313bp prečiste se na gelu (Macherey & Nagel, NucleoSpin Gel i PCR cleanup). Za kloniranje varijabilnih regiona kapa lakog lanca IGK4-1<∗>01 i IGK3-7<∗>02, konstrukt 3593 (pPEP-Ins-Ck) digestira se korišćenjem HindIII/Eco47III na 37°C u trajanju od 4 sata i trake veličine 4474 bp prečiste se na gelu. Sintetisani varijabilni regioni antitela digestiraju se korišćenjem HindIII/Eco47III na 37°C u trajanju od 4 sata i trake veličine 422 bp (IGHV1-2<∗>02) i 411 bp (IGK4-1<∗>01 i IGK3-7<∗>02) prečiste se na gelu.

[0476] Digestirani i prečišćeni varijabilni regioni antitela (IGHV1-2<∗>02, IGK4-1<∗>01, IGK3-7<∗>02) povežu se u ramu u pPEP vektore (50 ng) koji sadrže odgovarajuće imunoglobulinske konstantne regione. Povezivanje se izvodi preko noći na 16°C uz odnos vektora prema insertu od 1:3. Posle toga 1 µl reakcije povezivanja elektroporiše se u DH10B ćelije (E.coli ElectroMax DH10B elektrokompetentne ćelije, Invitrogen) (1900V/ 5ms). Zatim se 5-50 µl elektroporisanih bakterije nanese na ploče koje sadrže LB-agar 100 µg/ml ampicilina. Od svakog konstrukta izaberu se oko 2-3 kolonije i gaje preko noći.

[0477] Iz svakog klona izvrši se pripremanje DNK plazmida u malim razmerama (Macherey & Nagel, NucleoSpin Plasmid). Digestija za potvrđivanje prisustvo i ispravna veličina kloniranog inserta obavljaju se korišenjem HindIII/Eco47III (H/E) i ApaLI (A) digestija se koristi za potvrdu ispravne vektorske osovine. Integritet vektora ispituje se separacijom neisečene plazmidne DNK. Iz svakog pozitivnog klona i DNK, vrše se priprema u većim razmerama, kontrolna digestija i sekvenciranje korišćenjem prajmera 892-Je (Sekvenca: 5' gaccaatagaaactgggcttgtc 3'; SEQ ID NO: 705). Svaki konstrukt dobija svoj broj, kao jedinstveni identifikator i priprema se glicerolni stok.

21

Tabela 11: Karakterizacija konstrukta u ekspresionim vektorima

6.2.3.2 Kloniranje u retrovirusne ekspresione vektore

[0478] Variajbilni regioni IGHV1-2<∗>02, IGK3-7<∗>02 i IGK4-1<∗>01 sintetisani su od strane Life Technologeis™ i klonirani u retrovirusne ekspresione vektore (pCMA). Ovi konstrukti su zatim korišćeni za transdukovanje preB ćelija i za ekspresiju antitela na površini korišćenjem Retrocyte Display® tehnologije. Retrovirusni ekspresioni vektor sadržao je MSCV-bazirane 5' i 3 'LTR, imunoglobulinski konstantni region (IGHG1 ili IGKC) sa frakcijom za ukotvljavanje u membranu (IGHG1) i CD8 površinski markerski gen.

[0479] Sintetisani varijabilni regioni kloniraju se u retrovirusni ekspresioni vektor koji sadrži odgovarajući imunoglobulinski konstantni region. Za kloniranje varijabilnog regiona teškog lanca, konstrukt 3956 (pCMA-InsX Cg(iso3) loxP2-I-tr_huCD8-loxP) digestira se korišćenjem HindIII/Eco47III na 37°C u trajanju od 4 sata i trake veličine 7616 bp prečiste se na gelu. Za kloniranje varijabilnih regiona kapa lakog lanca, konstrukt 3957 (pCMA-InsX Ck-I-tr_huCD8) digestira se korišćenjem HindIII/Eco47III na 37°C u trajanju od 4 sata i trake veličine 6718 bp prečiste se na gelu. Sintetisani varijabilni regioni antitela digestiraju se kako je opisano u Odeljku 6.2.1 gore.

[0480] Digestirani i prečišćeni varijabilni regioni antitela povežu se u ramu u retrovirusne ekspresione vektore (50 ng) koji sadrže odgovarajuće imunoglobulinske konstantne regione. Povezivanje, transformacija i potvrda klonova izvode se kako je opisano u Odeljku 6.2.3.1 gore. Preparati DNK plazmida većih razmera sekvenciraju se korišćenjem prajmera 327-Je (Sekvenca: 5' ctcgatcctccctttatccag 3'; SEQ ID NO: 706). Svaki konstrukt dobija svoj broj, kao jedinstveni identifikator i priprema se glicerolni stok.

Tabela 12: Karakterizacija konstrukta u retrovirusnim ekspresionim vektorima

22

6.2.4 Ekspresija rekombinantnih antitela

[0481] Rekombinantna antitela eksprimiraju se prolaznom transfekcijom FreeStyleCHO-S ćelija (Invitrogen, R800-07) u suspenziji. Ukratko, gustina ćelija se podesi na 8 x 10<6>ćel/ml u PowerCHO2 medijumu (Lonza, 12-771Q) koji je dopunjen sa 4 mM L-glutamina (Biochrom, K 0283) i 1X HT suplementa (GIBCO, 11067-030). DNK koja odgovara lakom lancu antitela (2.5 µg/ml) i teškom lancu (2.5 µg/ml) doda se ćelijskoj suspenziji uz blagu agitaciju. Posle dodavanja BKN, ćelijska suspenzija se dopuni sa 10µl/ml TransIT-Pro transfekcionog reagensa (MIRUS, MIR5700) i 0.5mM (finalna koncnetracija) valproinske kiseline (Sigma-Aldrich, P4543). Ćelijska suspenzija se inkubira 6 dana na 31°C, 8% CO2uz šejkiranje (200 rpm).

[0482] Supernatant kulture se sakupi centrifugiranjem (9000g, 10 min na 10°C) i filtrira kroz 0.45 µm filter. Vivaspin 20 ultrafiltracioni uređaj (Sartorius, VS2032, MWCO 50 kDa) koristi se za koncentrisanje supernatanta do finalne zapremine od 0.6ml na 1000g, 10°C u trajanju od približno 60 minuta. Za prečišćavanje rekombinantnog antitela protein A HP Spin Trap kolona (GE Healthcare, 28-9031-32) ekvilibriše se puferom za vezivanje (20 mM fofsfatni pufer pH 7.0) i nanese se 0.6 ml koncentrata. Kolona se hermetički zatvori poklopcem i inkubira na vertikalnoj mešalici na sobnoj temperaturi. Posle 30 min, kolona se ispere 2x nanošenjem 600µl pufera za vezivanje i zatim centrifugiranjem na 100g u trajanju od 1 minuta. Vezano rekombinantno antitelo se eluira sa spin kolone dodavanjem 400µl elucionog pufera (100mM glicina, pH 2.0) i centrifugiranjem na 100g u trajanju od 1 minuta. Eluati se odmah neutralizuju koriščenjem 40µl neutralizacionog pufera (1M Tris-HCl, pH 9.0). Prečišćeno rekombinantno antitelo skladišti se u protein LoBind epruvetama (Eppendorf, 0030108.116) na 4°C do dalje obrade za studije karakterizacije.

[0483] Za kvantifikaciju, supernatanti ćelijske kulture i prečišćeni uzorci koji sadrže humane IgG razblaže se u testnim puferu (Roche, 11112589001) i razblaženja se ispituju u duplikatima na pločama sa 96 bunarića sa prepolovljenom radnom zapreminom (96-half well plate, Corning,

2

3884). Ukratko, uzorci od 25µl inkubiraju se u mraku (20°C, 650 rpm) tokom 1 sata sa zapreminom od 5 µl koja sadrži 1200 Luminex-COOH-perlice za koje je aminskim povezivanjem vezan kozji anti-humani IgG, specifičan za F(ab’)2fragment (Jackson ImmunoResearch, 109-006-09). Standardne krive naprave se korišćenjem niza 1:3 razblaženja u duplikatima (0.08 - 60ng/ml), u zapremini od po 25µl, celog molekula ChromPure humanog IgG (Jackson ImmunoResearch, 009-000-003). Detekcija se vrši dodavanjem 30µl antihumanog IgG, Fc-specifičnog, obeleženog pomoću R-PE (5µg/ml; Jackson ImmunoResearch, 109-116-098) i dodatnom inkubacijom u trajanju od 1h. Ploče se očitavaju i analiziraju koriščenjem Luminex® 200 instrumenta (Millipore) uz sledeća podešavanja: 100 perlica, veličina uzorka 50µl.

[0484] Kontrola kvaliteta prečišćenih uzoraka obuhvata analizu pomoću SDS-PAGE i hromatografije bazirane na veličini čestica (SEC) na HPLC. SDS-PAGE analiza izvodi se pod redukujućim i neredukujućim uslovima na 12% i 8% poliakrilamidnim gelovima, respektivno, prema protokolu Laemmli (Laemmli UK (1970) Nature, 227(5259): 680-5). Poliakrilamidni gelovi boje se rastvorom Commassie brilijant plavog za vizuelizaciju. SEC se izvodi na Agilent Infinity 1260 sistemu (Agilent Technologies) koji je opremljen binarnom pumpom, jedinicom za degasifikaciju, jedinicom za automatsko uzorkovanje i UV detektorom na bazi niza dioda. Za separaciju korišćena je Zenix-C 300 kolona (veličina čestica 3 µm, 4.5 x 300 mm, Sepax, 233300-4630). Po 3µg od svakog uzorka naneto je i razdvajano u 100mM fosfatnom puferu pH 7.0 (dopunjenom sa 150mM NaCl) na 0.35ml/min tokom 15 minuta i detekcija je vršena na 220 nm.

6.2.5 Karakterizacija humanizovanih varijanti

[0485] Vezujuće osobine humanizovanih varijanti (Hum231#1: IGHV1-2<∗>02 i IGK3-7<∗>02; Hum231#2:IGHV1-2<∗>02 i IGK4-1<∗>01) i himernog roditeljskog antitela 231-32-15 karakterisane su brojnim testovima, kako je dole opisano.

6.2.5.1 Kvantifikacija i analiza vezivanja tehnologijom niza suspenzija

[0486] Prečišćeni materijal humanizovanih varijanti i himernog roditeljskog antitela 231-32-15 razblaži se u testnom puferu (Roche 11112589001) 1:10,000 i 1:100,000. Ukratko, po 25µl od svakog razblaženja inkubira se u mraku (20°C, 650rpm) sa 1500 Luminex® perlica (u 5µl testnog pufera) u trajanju od 1 sata na filter-pločama sa 96 bunarića sa prepolovljenom radnom zapreminom (Millipore, MABVN1250). Luminex® perlice (Luminex Corp, # 5 LC10005-01 i

24

# 14 LC10014-01) povežu se sa antihumanim IgG (F(ab)2-specifičnim, JIR, 105-006-097) ili GITR antigenom (R&D systems, disulfidno spojeni homodimer; 689-GR) aminskim povezivanjem preko COOH na površini perlica. Standardne krive naprave se korišćenjem po 25µl, u duplikatima, niza 1:3 razblaženja (0.08 - 540ng/ml), celog molekula (JIR, 009-000-003) za IgG1verzije. Za antitela u IgG4formatu, koristi se različiti standard - prečišćeni Imunoglobulin (Sigma, 14639). Detekcija se vrši korišćenjem 60µl kozjeg anti-humanog IgG F(ab)2obeleženog korišćenjem R-PE (2.5µg/ml; JIR 109-116-098, AbDSerotec kit za brzu konjugaciju RPE i antitela, LNK022RPE) uz vreme inkubacije od 1 sata (20°C, 650 rpm). Ploče se analiziraju korišćenjem Luminex® 200 sistema (Millipore). Broji se 100 perlica po bunariću u zapremini uzorka od 48µl. Relativni afiniteti se izračunavaju u odnosu na MFI vrednosti himernog roditeljskog 231-32-15 antitela (podešeno na 100% vezivanja) i u skladu sa IgG vrednostima prisutnim u uzorku. Obe humanizovane varijante pokazale su relativne afinitete blizu 100%.

6.2.5.2 Ligand-blokirajuća aktivnost uz korišćenje tehnologije niza suspenzija

[0487] Da bi se odredilo da li anti-GITR antitela blokiraju vezivanje liganda (GITRL) za GITR, postavljen je test rangiranja, uz korišćenje tehnologije niza suspenzija. 1200 Luminex® perlica u 5µl testnog pufera (Luminex Corp, #14 LC10014-01) doda se u svaki bunarić ploča sa 96 bunarića sa prepolovljenom radnom zapreminom (Corning, Inc., 3884). Perlice su povezane sa GITR antigenom (R&D systems, disulfidno povezani homodimer; 689-GR) aminskim povezivanjem sa COOH na površini perlica. Reakcija povezivanja izvodi se korišćenjem 50 µg/ml GITR antigena i 1x10<7>Luminex perlica po ml. Standardne hemijske reakcije NHS estara upotrebljavaju se za formiranje karbodiimidnih veza između primarnih aminskih grupa antigena i karboksilnih grupa na površini perlice (Luminex Xmap cookbook poglavlje 3).

[0488] Povezivanje antigena sa proteinima je jednostavna karbodiimidna procedura u dva koraka tokom koje se karboksilne grupe na površini mikrosfera prvo aktiviraju pomoću EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodi-imid hidrohlorid) reagensa u prisustvu sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide, N-hidroksisulfosukcinimid) da se formira sulfo-NHS-estarski intermedijar. Reaktivni intermedijar se zatim zameni reakcijom sa primarnim aminom ciljnog molekula (antitelo, protein ili peptid) da se formira kovalentna amidna veza. Ovako povezane perlice inkubiraju se sa različitim koncentracijama anti-GITR antitela (koncentracije od 9000ng/ml do 12ng/ml u 25µl testnog pufera po bunariću) tokom 1h na 20°C i 650 rpm. Posle

2

toga 30µl R-PE-obeleženog GITR-liganda (koncentracija 1nM; monomerni, R&D systems 694-GF/CF) doda se u svaki bunarić, dovodeći ukupnu zapreminu u bunariću do 60µl (1200 perlica po bunariću i finalna koncentracija od 0.5nM obeleženog GITRL). Obeležavanje liganda obavljeno je u našoj kući, korišćenjem R-PE kitova za obeležavanje (AbDSerotec, LYNX kit za brzu konjugaciju RPE i antitela, LNK023RPE) prema protokolu proizvođača. Ploče se analiziraju korišćenjem Luminex® 200 sistema (Millipore). Broji se 100 perlica po bunariću u zapremini uzorka od 50µl. Ligand-blokirajući potencijal izračunava se korišćenjem MFI vrednosti za nekompetirajući signal (100% vezivanja) kontrole samo sa ligandom. PE detektabilni signal pokazatelj je vezivanja liganda za antigen.

[0489] U prvom testu, ispituju se anti-GITR antitela, himerni roditeljski 231-32-15 i m6C8 (WO 06/105021) kao i kontrolno antitelo koje prepoznaje IL-1β (SK48E26; Međunarodna publikacija br. WO 95/001997). Antitelo m6C8 je IgG1 antitelo napravljeno na bazi varijabilnih regiona antitela 6C8 obezbeđenih u WO 06/105021. Teški lanac m6C8 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 585. Laki lanac m6C8 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 586. Rezultati ovog testa prikazani su na Slici 5, na kojoj se može videti da se u koncentracijama 6C8 antitela iznad 333ng/ml, ne detektuje PE signal i da prema tome ne dolazi do vezivanja GITRL za GITR. Nasuprot tome, za himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo, u svim testiranim koncentracijama, PE signal se detektuje što ukazuje na to da je GITRL i dalje u stanju da se veže za GITR kada je himerno roditeljsko l 231-32-15 antitelo takođe vezano za GITR. Podaci pokazani na Slici 5 su dobijeni u četiri ponavljanja ovog testa, izvedena u duplikatima, sa standardnom devijacijom izračunatom za n=8.

[0490] U drugom testu, vezivanje GITRL-PE za GITR ispitivano je u prisustvu himernog roditeljskog 231-32-15 anti-GITR antitela i humanizovanih varijanti Hum231#1 i Hum231#2. Slika 6 pokazuje da ova tri anti-GITR antitela kada su vezana za GITR, i dalje dopuštaju vezivanje GITRL za GITR i sva tri antitela pokazuju uporedivu ligand-blokirajuću aktivnost.

6.2.5.3 Kinetička analiza rezonancijom površinskog plazmona

[0491] Rezonancija površinskog plazmona korišćena je za određivanje afiniteta humanizovanih varijanti i himernog roditeljskog 231-32-15 antitela (BIAcore® T100/T200 sistem pojačane senzitivnosti (GE Healthcare) i test kaptiranja Fab fragmenata). Sve interakcije su analizirane na 25°C korišćenjem 1xDPBS (PAA, H15-002) plus P20 (0.05%, Pierce, 28320) kao radnog pufera. Anti-GITR antitela (8µg/ml u radnom puferu) kaptiraju se za površinu CM5 senzornog čipa (GE Healthcare, serija S CM5, BR-1005-30) putem imobilisanog antihumanog Fab antitela

2

(GE Healthcare, kit za kaptiranje Fab, 28958325). Za detektovanje nespecifičnih interakcija GITR antigena, kaptiranje antitela vrši se samo u protočnoj ćeliji 2, dok se u protočnoj ćeliji 1 imobiliše samo kaptirajuće antitelo. Pored toga, nesrodno antitelo (anti-IL-1β; SK48E26; Međunarodna publikacija br. WO 95/001997) koristi se za procenu specifičnosti vezivanja GITR. Posle kaptiranja anti-GITR antitela GITR antigen (R&D systems, disulfideno povezani homodimer; 689-GR) se propušta kroz obe protočne ćelije u različitim količinama (40nM, 10nM i 2.5nM) za svako antitelo. U svaki ciklus uključena je i kontrolna kriva (samo radni pufer). Asocijacija se odvija 90s i disocijacija 600s uz stopu protoka od 10µl/min. Posle svakog ciklusa izvodi se korak regeneracije sa 10mM glicinom pH2.0 (GE Healthcare, BR-1003-55) u trajanju od 60s, sa 30µl/min. Krive vezivanja evaluiraju se korišćenjem BIAcore® T200 softvera za evaluaciju verzija 2.0.1 primenom Langmuirovog 1:1 modela sa globalnim podešavanjem Rmax.

[0492] Iz ovih vrednosti izračunava se vrednost afiniteta (KD(M)) i vrednosti su prikazane u Tabeli 13 dole. Humanizovane varijante Hum231#1 i Hum123#2 pokazale su poboljšane stope asocijacije ali smanjene stope disocijacije što rezultuje KDvrednostima od 0.7nM, odnosno 0.6nM. Himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo ima afinitet od 2nM.

Tabela 13: Zbirni pregled stopa asocijacije (kon) i disocijacije (koff) i izračunatih KD(M)

6.2.5.4 Ligand-blokirajuća analiza rezonancijom površinskog plazmona

[0493] Očekivano je da obe humanizovane varijante Hum231#1 i Hum231#2 pokazuju istu ligand-blokirajuću kinetiku kao himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo. Ovo je potvrđeno korišćenjem ligand-blokirajućeg testa, kako je izmereno rezonancijom površinskog plazmona (BIAcore® T100/T200 sistem pojačane senzitivnosti (GE Healthcare)).

[0494] U prvom eksperimentu evaluirano je vezivanja GITR liganda za imobilisani GITR antigen. GITR antigen (R&D systems, disulfidno spojeni homodimer; 689-GR) imobilisan je pri visokoj gustini (4371 RU) na CM5 senzornom čipu (GE Healthcare, Series S CM5, BR-1005-30). U drugoj protočnoj ćeliji imobilisan je ovalbumin (1289 RU, Pierce ThermoFisher

2

77120) kao referenca. Imobilizacija je izvedena prema standardnom protokolu proizvođača (GE Healthcare) za aminsko povezivanje (aktivacija površine korišćenjem 0.4 M EDC i 0.1 M NHS, GE Healthcare kit za aminsko povezivanje, BR-1000-50). Neodreagovale grupe su inaktivirane korišćenjem 1M etanol-amin-HCl pH 8.5. Posle toga dva GITR liganda (monomer R&D, 694-GL i nekovalentno vezani homotrimer R&D, 6987) propuste se preko površine čipa u različitim količinama (500nM, 250nM i 125nM) da bi se odredili uslovi zasićenja. Korišćeno je vreme asocijacije od 240s i vreme disocijacije od 300s uz stopu protoka od 5µl/min. Regeneracija površine čipa obavljena je korišćenjem 10mM glicina pH2.0 (GE Healthcare, BR-1003-55) tokom 60s pri 10µl/min. Najpovoljniji uslovi zasićenja postignuti su sa GITR trimernim ligandom pri 125nM i ova postavka je stoga upotrebljena sa anti-GITR antitelima u istoj količini. U drugom eksperimentu, upotrebljena je obrnuta postavka tako da su prvo anti-GITR antitela (125nM) vezana za GITR antigen na čipu, a GITR ligand (nekovalentno spojeni trimer pri 125nM) je dodat posle toga.

[0495] Kako je prikazano na Slici 7, kada se GITR antigen imobiliše na čipu i doda GITRL u prisustvu anti-GITR antitela himernog 231-32-15 antitela, Hum231#1 i Hum231#2, zapaža se vezivanje GITRL. Nasuprot tome, vezivanje GITRL se ne zapaža u prisustvu anti-GITR antitela m6C8. Ovi podaci ukazuju na to da himerno 231-32-15 antitelo, Hum231#1 i Hum231#2 ne inhibiraju vezivanje humanog GITR sa GITRL.

6.3 Primer 3: Funkcionalna karakterizacija humanizovanih antitela

[0496] Ovaj primer pokazuje sposobnost humanizovanih anti-GITR antitela stvorenih postupcima opisanim gore da funkcionišu kao agonisti GITR. Anti-GITR antitelo Hum231#2 sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 567 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 587. Antitelo Hum231#2 je humano IgG1 antitelo koje sadrži T109S supstituciju (tj., supstituciju treonina serinom na poziciji 109 u odnosu na Fc sekvencu divljeg tipa), numerisano prema Kabatu, u konstantnom domenu lakog lanca, što olakšava kloniranje varijabilnog regiona u ramu sa konstantnim regionom. Mutacija je konzervirana modifikacija koja ne utiče na vezivanje ili funkciju antitela. Parnjak divljeg tipa, nazvan Hum231#2w, koji sadrži treonin na poziciji 109, numerisanje prema Kabatu, takođe je napravljen. Antitelo Hum231#2w je humano IgG1 antitelo koje sadrži teški lanac SEQ ID NO: 567 i laki lanac SEQ ID NO: 576.

[0497] Ova anti-GITR antitela su takođe testirana da bi se odredila njihova sposobnost da kostimulišu primarne humane CD4<+>ili CD8<+>T-ćelije. Ovaj rad, kako je opisano u odeljku 6.3.1

2

do 6.3.3 i 6.3.7 dole, urađen je sa materijalom dobijenim od više donora. Humani leukociti upotrebljeni u pretraživanju i testiranju kandidatskih antitela nabavljeni su od Njujork Blood Center (Njujork City).

[0498] Funkcionalna aktivnost anti-GITR antitela pokazana je na obogaćenoj populaciji CD4 pozitivnih (poznate i kao CD4<+>) T ćelija, CD8 pozitivnim (poznate i kao CD8<+>) T ćelijama i PBMC. Za studije proliferacije humanih T-ćelija, sveže pripremljeni, donorski pakovani leukociti sakupljeni su i obrađeni korišćenjem tehnika sterilne kulture tkiva. Leukociti se obrađuju za izdvajanje mononuklearnih imunskih ćelija (PBMC) pomoću gustinskog gradijenta (Lymphocyte Separation Media, Corning). PBMC se nalaze u leukocitno-trombocitnom sloju ("buffy coat") fikolnog gustinskog gradijenta.

[0499] Obogaćena populacija CD4 ćelija priprema se od PBMC negativnom selekcijom korišćenjem RosetteSep® Human CD4<+>T Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies, Vancouver, BC Canada). Preparati obogaćene populacije CD4<+>T-ćelija odvajaju se od crvenih krvnih ćelija gustinskim centrifugiranjem na Lymphocyte separation media (Corning). Sakupljene ćelije se ispiraju i alikvotiraju za skladištenje u tečnom azotu. Da bi se objasnila varijabilnost u odgovoru donora na stimulaciju, različite koncentracije anti-CD3 upotrebljene su za podešavanje donor-specifične sposobnosti za odgovor. Stoga, pre pretraživanja anti-GITR antitela, leukocitno-trombocitni slojevi se procenjuju u pogledu sposobnosti da oslobađaju citokine i proliferaciji u odgovoru na CD3 stimulaciju titrovanim nivoima anti-CD3 (Clone SP34; BD Pharmingen; koncentracija u rasponu od 31.5ng/ml do 250ng/ml), sa ili bez referentnog anti-GITR himernog roditeljskog 231-32-15 antitela da bi se uspostavila bazalna vrednost proliferacije T-ćelija i proizvodnje citokina i odredili pogodni uslovi stimulacije za svaki donorski leukocitno-trombocitni sloj.

6.3.1 Efekat agonističkih anti-GITR antitela na anti-CD3-stimulisanu proliferaciju CD4+ T ćelija

[0500] Procenjivana je agonistička aktivnost anti-GITR antitela preko njihove kostimulacije CD4+ T ćelija. Agonistička aktivnost himernog roditeljskog 231-32-15 antitela upoređivana je sa dve humanizovane verzije: Hum231#1 i Hum231#2. Test kostimulacije izveden je na sledeći način: Za uslove stimulacije na ploči, anti-CD3 antitela, anti-GITR antitela i gde je indikovano izotipska kontrola, nanesu se na ravno dno ili zaobljeno dno sterilnih ploča za kulturu tkiva u trajanju od dva sata i višak antitela se ukloni ispiranjem. Za uslove kostimulacije u rastvoru, anti-CD3 antitelo se nanese na ploču dok se kostimulacija anti-GITR antitelima obezbeđuje u

2

rastvoru. Testirana anti-GITR antitela bila su Hum231#1 i Hum231#2, himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo (poznato i kao REF-231) ili negativne izotipske kontrole (pAB1915). Pored toga, za uslove kostimulacije na ploči i u rastvoru, anti-CD28 antitelo (125ng/ml; BD Pharmingen) i 10U IL-2 obezbeđeni su takođe u rastvoru.

[0501] Proliferacija ćelija određena je praćenjem razblaženja karboksifluorescein diacetat sukcinimidil estarske (carboxyfluorescein diacetate sucinimidyl ester, CFSE) boje u podeljenim ćelijama (Quah BJ i sar., (2007) Nat Protoc, 2(9): 2049-56). Obogaćena populacija CD4<+>T ćelija obeleži se korišćenjem 1-2µM CFSE. CFSE-obeležena obogaćena populacija CD4<+>T ćelija se ispere i zatim stimuliše anti-CD3 (125ng/ml) vezanim za ploču, rastvorljivim anti-CD28 (125ng/ml) i 10 U IL-2, zajedno sa 5µg/ml ili 10µg/ml za ploču vezanih anti-GITR antitela ili u odsustvu antitela. Ćelijama se dopusti da se dele 3 do 6 dana u kulturi na 37°C zavisno od optimalne aktivacije svake donorske ćelije, posle čega se supernatanti kultura i ćelije sakupe sa ploče.

[0502] Slike 8A i 8B pokazuju reprezentativnu FACS analizu proliferacije CD4<+>T ćelija indukovanu kostimulacijom anti-GITR antitelima izvedenu u triplikatu na leukocitnotrombocitnom sloju 6, odnosno 8. Ove slike pokazuju broj ćelija (Y-osa) i nivo fluorescencije (X-osa) koju emituju CFSE-obeležene CD4<+>T ćelije. Korišćeno je 10µg/ml anti-GITR antitela (himerno roditeljsko 231-32-15 (REF 231-32-15), Hum231#1 i Hum231#2). Pojačana proliferacija CD4<+>T ćelija prikazana je povećanjem procenta ćelija sa smanjenim nivoom fluorescencije emitovane od strane CFSE (nizak CFSE). Slike 8A i 8B ilustruju da anti-GITR antitela (himerno roditeljsko 231-32-15 (REF 231-32-15), Hum231#1 i Hum231#2) pokazuju agonističku aktivnost kada se dodaju ćelijama aktiviranim suboptimalnim koncentracijama anti-CD3 antitela, za ćelije sa visokim odgovorom (leukocitno-trombocitni sloj 6, Slika 8A), a čak i za ćelije sa niskim odgovorom (leukocitno-trombocitni sloj 8; Slika 8B).

[0503] Slike 9A i 9B su histogrami reprezentativnih rezultata iz gornje studije za anti-GITR antitela vezana za ploču (himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo, Hum231#1, Hum231#2, i m6C8) u koncentraciji od 10µg/ml. U primeru pokazanom na Slici 9A, kostimulacija sa Hum231#1 ili Hum231#2 indukovala je proliferaciju CD4+ T ćelija pri 10µg/ml. Približno više od 50% CD4<+>T ćelija proliferisalo je (ćelije sa niskim CFSE) kada su bile kostimulisane sa 10µg/ml Hum231#1 ili Hum231#2. Nasuprot tome, pod stimulacijom korišćenjem anti-CD3/anti-CD28 bez kostimulacije posredovane anti-GITR antitelima, samo približno 35% CD4<+>T ćelija je proliferisalo (ćelije sa niskim CFSE). Slika 9B ilustruje da dodavanje anti-GITR kostimulacije stimulaciji posredovanoj učešćem anti-CD3/anti-CD28 takođe dovodi do porasta apsolutnog broja CD4<+>T ćelija u kulturi tokom 5 dana u poređenju sa stimulacijom korišćenjem samo anti-CD3/anti-CD28. Na primer, stimulacija pomoću anti-CD3/anti-CD28 zajedno sa 10µg/ml antitela himernog roditeljskog 231-32-15 antitela (REF 231) dovodi do ekspanzije broja CD4<+>T ćelija indukovane GITR kostimulacijom sa 7.5 x 10<4>na 12.0 x10<4>.

[0504] Pored toga, Hum231#1-posredovana kostimulacija pri 10µg/ml takođe indukuje ekspanziju CD4<+>T ćelija sa 7.5 x 10<4>na 11.5 x 10<4>. Pri koncentraciji antitela od 10µg/ml, kostimulacija korišćenjem Hum231#2 takođe indukuje proliferaciju CD4<+>T ćelija sa 7.5 x 10<4>na 10.6 x 10<4>. Što je značajno, kostimulacija CD4<+>T-ćelija korišćenjem 10µg/ml m6C8 (Međunarodna publikacija br: WO 06/105021) nije dovela do dodatnog porasta apsolutnog broja ćelija posle 5 dana kulture iznad onog koji je viđen pod stimulacijom korišćenjem samo anti-CD3/anti-CD28.

6.3.2 Efekat agonističkih anti-GITR antitela na anti-CD3-indukovanu proizvodnju citokina u CD4+ T-ćelijama

[0505] Kao još jedan dokaz agonističke kostimulatorne aktivnosti anti-GITR antitela, citokini (IFNγ, IL-6, TNFα, i IL-10) oslobođeni iz CD4+ T ćelija mereni su višestrukim ELISA (Flowcytomix, FACS na perlicama bazirani citokinski ELISA, eBioscience). Supernatanti sakupljeni iz testova proliferacije prikupljaju se i koriste za analizu citokina. Slike 10A do 10D pokazuju efekat 10µg/ml ili 5µg/ml himernog roditeljskog 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 anti-GITR antitela na proizvodnju citokina u humanim CD4<+>T ćelijama. Dodavanje 10µg/ml ili 5µg/ml himernog roditeljskog 231-32-15 antitela, Hum231#1 ili Hum231#2 anti-CD3/anti-CD28 stimulisanim T-ćelijama značajno povećava proizvodnju IFNγ, TNFα, IL-10 i IL-6 u poređenju sa stimulacijom korišćenjem samo anti-CD3/anti-CD28. Nije zapažena kostimulatorna aktivnost za agonistička anti-GITR antitela u odsustvu anti-CD3/anti-CD28 stimulusa.

6.3.3 Titracija humanizovanih 231-32-15 klonova

[0506] Da bi se evaluirao raspon koncentracija anti-GITR antitela koje indukuju proliferaciju T-ćelija i proizvodnju citokina, obogaćena populacija CD4<+>T-ćelija stimuliše se korišćenjem 125ng/ml anti-CD3/anti-CD28 i kostimuliše titrovanim, za ploču vezanim himerinim roditeljskim 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 anti-GITR antitelima. Rezultat prikazan na Slici 11 ukazuje na to da kostimulacija himernim roditeljskim 231-32-15, Hum231#1 i Hum231#2 u koncentraciji od 10µg/ml, 5µg/ml ili 2.5µg/ml indukuje proliferaciju T ćelija,

1

kako je praćeno razblaženjem CFSE. Štaviše, u odsustvu bilo kakvog anti-CD3/anti-CD28 stimulusa, anti-GITR antitela ne stimulišu proliferaciju CD4<+>T ćelija.

[0507] Slika 12A pokazuje da stimulacija korišćenjem anti-CD3/anti-CD28 i kostimulacija anti-GITR antitelima (himerno roditeljsko 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2) duž raspona koncentracija (10µg/ml, 5µg/ml ili 2.5µg/ml) pojačavaju proizvodnju IFNγ u CD4<+>T-ćelijama. Što je značajno, u odsustvu anti-CD3/anti-CD28 stimulacije, anti-GITR antitela (himerno roditeljsko 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2) ne indukuju proizvodnju IFNγ.

[0508] Da bi se ispitala dalja funkcionalna aktivnost himernog roditeljskog 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 anti-GITR antitela u rastvoru, obogaćena populacija CD4<+>T ćelija stimuliše se korišćenjem 125ng/ml anti-CD3/anti-CD28 i kostimuliše titrovanim rastvorljivim anti-GITR antitelima. Rastvorljiva Hum231#1 ili Hum231#2 anti-GITR antitela takođe kostimulišu proizvodnju IFNγ u CD4<+>T ćelijama, kako je pokazano na Slici 12B.

6.3.4 Efekat agonističkog anti-GITR antitela na anti-CD3-indukovanu proizvodnju citokina u PBMC

[0509] U ovom primeru, proizvodnja citokina indukovana kostimulacijom anti-GITR antitelom Hum231#2 ispitivana je korišćenjem PBMC. PBMC izolovane pomoću fikolnog gradijenta iz leukocitno-trombocitnog sloja zdravih donora (Research Blood Components, LLC) uskladište se u tečnom azotu i odlede na dan eksperimenta. Ćelije se resuspenduju u medijumu za kulturu ćelija (RPMI 10% FBS 20 U/ml IL-2) i prenesu na ploče za kulturu sa 96 bunarića koje sadrže za ploču vezano anti-CD3 antitelo u različitim suboptimalnim koncentracijama (0.3-5 µg/ml) i 5 µg/ml za ploču vezanog anti-GITR antitela ili izotipskog kontrolnog IgG1 antitela. Uzorci se inkubiraju 4 dana na 37°C i 5% CO2i supernatanti ćelijskih kultura se sakupe na dan 2 i dan 4. Uzorci se testiraju korišćenjem V-PLEX proinflamatorni panel1 (humani) kita (Meso Scale Discovery) za merenje sekretovanih citokina (IFNγ, IL-2, TNFα, IL-10, IL-13 i IL-4) prema uputstvima proizvođača.

[0510] Kako je prikazano na Slici 13, kostimulacija za ploču vezanim anti-GITR antitelom Hum231#2 indukovala je sekreciju više citokina iz PBMC iz dva različita donora.

6.3.5 Efekat agonističkih anti-GITR antitela na proizvodnju citokina merenu bojenjem unutarćelijskih citokina

[0511] Agonistička aktivnost Hum231#2 u proizvodnji citokina dodatno je analizirana bojenjem unutarćelijskih citokina. PBMC izolovane pomoću fikolnog gradijenta iz leukocitno-

2

trombocitnog sloja zdravih donora (Research Blood Components, LLC) uskladište se u tečnom azotu i odlede na dan eksperimenta. Ćelije se resuspenduju u medijumu za kulturu ćelija (RPMI 10% FBS 20 U/ml IL-2) i prenesu na ploče za kulturu sa 96 bunarića koje sadrže za ploču vezano anti-CD3 antitelo u različitim suboptimalnim koncentracijama (0.3-5 µg/ml) i 5 µg/ml za ploču vezanog anti-GITR antitela ili izotipskog kontrolnog IgG1 antitela. Uzorci se inkubiraju 3-4 dana na 37°C i 5% CO2. Posle aktivacije, da bi se zaustavio transport proteina u ćeliji, ćelije se tretiraju brefeldinom A (BD Biosciences) prema uputstvima proizvođača i uzorci se inkubiraju 6 sati na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, ćelije se boje FITC aminskom bojom za određivanje vijabilnosti (Life technologies) za bojenje mrtvih ćelija. Posle ispiranja hladnim FACS puferom (1 x PBS 2% FBS, pH7.2), koktel antitela koji sadrži antitela protiv CD3 (APC Cy7, SP34.2), CD4 (PercP Cy5.5, L200) i CD8a (PE Cy7, SK1) razblažen u hladnom FACS puferu dodaje se svakom uzorku i inkubira 10 minuta na 4°C. Ćelije se fiksiraju i permeabilizuju korišćenjem Cytofix-Cytoperm (BD Biosciences) za unutarćelijsko bojenje prema uputstvima proizvođača. PBMC se boje antitelima protiv IFNγ (Alexa647, B27) i TNFα (PE, Mab11) i inkubiraju na sobnoj temperaturi 10 minuta. Uzorci se isperu korišćenjem 1 x Perm- pufera za ispiranje (BD Biosciences) i analiziraju korišćenjem FACScanto protočnog citometra (BD Biosciences). Dijagrami protočne citometrije analiziraju se korišćenjem Flojo softvera. Dijagrami protočne citometrije i grafikoni reprezentativni su za eksperimente u kojima su korišćene PBMC šest različitih donora.

[0512] GITR antitelo Hum231#2 pokazalo je kostimulatornu aktivnost na humanim T ćelijama, indukujući IPNγ+ monofunkcionalne T ćelije, TNFα+ monofunkcionalne T ćelije kao i IFNγ+ TNFα+ polifunkcionalne T ćelije duž raspona suboptimalnih koncentracija anti-CD3 antitela (Slike 14A i 14B).

[0513] Zatim, Hum231#2w, koje je humano IgG1 antitelo, konvertuje se u humano IgG4 antitelo nazvano pab1989. Antitelo pab1989 deli isti varijabilni region teškog lanca i isti laki lanac sa Hum231#2w ali sadrži konstantni region humanog IgG4. Antitelo pab1989 sadrži sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 554 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 576.

[0514] IgG4 antitelo pab1989 testirano je paralelno sa IgG1 antitelom Hum231#2w u eksperimentu bojenja unutarćelijskih citokina opisanom gore. Anti-CD3 antitelo koristi se u koncentracijama od 0.7, 0.8 i 0.9 µg/ml a anti-GITR antitela u koncentraciji od 5 µg/ml. Uzorci se inkubiraju 3-4 dana na 37°C i 5% CO2. Kako je pokazano na Slici 14C, pab1989 pokazuje sličnu agonističku aktivnost kao Hum231#2w, indukujući IFNγ+ TNFα+ polifunkcionalne CD4+ T ćelije i TNFα+ monofunkcionalne CD4+ T ćelije. Grafikoni su reprezentativni za eksperimente u kojima su korišćene PBMC iz četiri različita donora.

6.3.6 Efekat unakrsnog povezivanja na agonističku aktivnost anti-GITR antitela

[0515] Efekat unakrsnog povezivanja na funkcionalnu aktivnost anti-GITR antitela Hum231#2 ispitivan je korišćenjem anti-CD3-stimulisanih PBMC.

[0516] Za ploču vezano ili solubilno Hum231#2 testirano je u pogledu indukcije IFNγ+ TNFα+ polifunkcionalnih T ćelija u testu suboptimalne CD3-stimulacije kako je opisano u Odeljku 6.3.5. Kako je pokazano na Slici 15A, samo za ploču vezano, ali ne i rastvorljivo, Hum231#2 povećalo je procenat IFNγ+ TNFα+ polifunkcionalnih CD8+ T ćelija, u poređenju sa izotipskom kontrolom.

[0517] Test sekrecije citokina iz PBMC opisan u Odeljku 6.3.4 ponovljen je sa za ploču vezanim Hum231#2 ili Hum231#2 unakrsno vezanim sa anti-Fc antitelom. Supernatanti kulture sakupe se 4. dana da bi se merili sekretovani citokini (IFNγ, IL-2, TNFα, IL-10, IL-13 i IL-4). Kostimulacija sa Hum231#2 vezanim za ploču (Slika 15B) ili unakrsno vezanim sa anti-Fc (Slika 15C) indukovala je sekreciju citokina.

6.3.7 Aktivnost humanizovanih 231-32-15 klonova na leukocitno-trombocitni sloj 8 (BC8) i merenje efektorskih T-ćelija ili T regulatornih ćelija

[0518] U ovom primeru, efekti agonistčkih anti-GITR antitela na CD4<+>T efektorske ili CD4<+>T regulatorne ćelije meren je praćenjem njihove proliferacije. Obogaćena populacija CD4<+>T-ćelija obeleži se pomoću CFSE i stimuliše korišćenjem 125ng/ml za ploču vezanog anti-CD3 antitela. Proliferisane CD4<+>T-ćelije u obogaćenoj populaciji praćene su na osnovu razblaženja CFSE posle 5 dana u kulturi.

[0519] Populacija CD4<+>T efektorskih ili T regulatornih ćelija u okviru obogaćene populacije CD4<+>T ćelija pokazana na Slikama 16A i 16B identifikovana je protočno-citometarskim bojenjem prema njihovim površinskim markerima. Aktivirane CD4<+>T efektorske ćelije okarakterisane su kao CD25<+>, CD45RA-, CD127<Med/Low>i Foxp3<Neg>/<Low>. CD4<+>T regulatorne ćelije bile su identifikovane kao CD4<+>, CD25<+>, CD45RA-, CD127<Low>, i Foxp3<High>. FACS bojenje izvedeno je prema Tabeli 14 dole:

Tabela 14: Panel FACS bojenja

4

[0520] Rezultati testa stimulacije prikazani su na FACS dijagramima Slika 16A i 16B. Ograđivanje ("gating") CD4<+>Treg (CD4<+>, CD25<+>, CD45RA-, CD127<Low(nisko)>i Foxp3<High(visoko)>) ili aktiviranih CD4<+>T efektorskih ćelija (CD25<+>, CD45RA-, CD127<Med(sred)/Low>i Foxp3<Neg(negativno)>/<Low>) pokazuje da stimulacija korišćenjem 125ng/ml anti-CD3/anti-CD28 samih ili zajedno sa anti-GITR kostimulacijom pozitivno reguliše ekspresiju GITR na T efektorskim i T regulatornim ćelijama.

[0521] Slika 16A prikazuje FACS analizu T-efektorskih i T-regulatornih ćelija. Oba tipa ćelija eksprimiraju GITR na svojoj površini posle stimulacije anti-CD3 samim ili zajedno sa anti-GITR antitelima. Međutim, kostimulacija sa anti-GITR antitelima preferencijalno ekspandira T-efektorske ćelije u odnosu na T-regulatorne ćelije, dovodeći do porasta odnosa Tef/Treg (Slika 16B).

[0522] Kao dodatni dokaz za agonističku aktivnost anti-GITR antitela na T-ćelijama u kontekstu ćelijskog imuniteta, evaluirani su odgovori T ćelija posle stimulacije PBMC.

[0523] Stimulacija PBMC titrovana je podešavanjem anti-CD3-indukovane proliferacije PBMC. Na Slikama 17A i 17B ilustrovane su CFSE-obeležene PBMC stimulisane pomoću 31.25ng/ml za ploču vezanog anti-CD3/anti-CD28 zajedno sa za ploču vezanim anti-GITR antitelima ili izotipskom kontrolom. Kao pozitivna kontrola za aktivnost anti-GITR antitela, korišćeni su isti uslovi stimulacije kako bi se stimulisale CD4<+>T ćelije u obogaćenoj populaciji (podaci nisu prikazani).

[0524] CD4<+>ili CD8<+>T-ćelije u populaciji PBMC identifikovane su prema svom bojenju pomoću anti-CD3 i anti-CD4 ili anti-CD3 i anti-CD8. FloJo (Tree Star, Inc.) analiza dobijenih FACS uzoraka ograđenih na CD4<+>CD3<+>T ćelije ili CD8<+>CD3<+>T ćelije pokazala je da anti-GITR himerno roditeljsko 231-32-15 (REF 231), Hum231#1 i Hum231#2 antitela stimulišu proliferaciju T-ćelija (nizak % CFSE). Posebno, eksperiment prikazan na Slici 17B otkriva da su anti-GITR himerno roditeljsko 231-32-15 (REF 231), Hum231#1 i Hum231#2 antitela aktivna prema CD8<+>T ćelijama.

6.3.8 Efekat agonističkih anti-GITR antitela na GITR NF-κB-luciferaza-reportersku ćelijsku liniju

[0525] Humana GITR NF-κB-lucifera-reporterska ćelijska linija (Promega) dizajnirana je za ispitivanje kostimulatorne aktivnosti anti-GITR agonističkih antitela. Ranije je saopšteno da aktivacija GITR anti-GITR agonistčkim antitelom ili GITR ligandom aktivira NF-κB (Snell LM i sar., (2010) J Immunol 185: 7223-7234; Bulliard Y i sar., (2013) J Exp Med 210: 1685-1693; Yu KY i sar., (2003) Biochem Biophys Res Commun 310: 433-438). Prema tome, Jurkat ćelije su genetički modifikovane da stabilno eksprimiraju GloResponse NF-κB-luc2P konstrukt i humani GITR. Reporterske ćelije su resuspendovane u testnom medijumu (RPMI 1% FBS) i inkubirane sa različitim koncentracijama (12.5, 10, 5, 2.5, 1.25, i 0.625 µg/ml) za ploču vezanih anti-GITR antitela Hum231#2w, m6C8 ili izotipskog kontrolnog IgG1 u odsustvu ili prisustvu 0.3 µg/ml za ploču vezanog anti-CD3 antitela (Clone SP34). Ploče inkubirane sa anti-CD3 antitelom očitavane su posle 6 ili 18 sati inkubacije. Ploče bez anti-CD3 antitela očitavane su posle 2, 5, 6, 8 ili 18 sati inkubacije. Posle inkubacije, ploče se uravnotežavaju na sobnoj temperaturi i zatim se dodaje jednaka zapremina Bio-Glo reagensa (Promega) sobne temperature. Luminescencija se očitava korišćenjem EnVision multilabel reader 2100.

[0526] Za test sa anti-CD3 antitelom, vrednosti RLU za luciferazu 18 sati posle stimulacije unose se u grafikon za svaku testiranu koncentraciju antitela (Slika 18A). Slično tome, za test bez anti-CD3 antitela, Slika 18B predstavlja grafikon koji pokazuje relativne svetlosne jedinice (relative light units, RLU) za luciferazu 5 sati posle stimulacije za različite testirane koncentracije antitela. Na Slici 18C, prikazani su najviši odnosi ekspresije luciferaze (GITR Ab/izotipska kontrola) bez anti-CD3 antitela, među nekoliko testiranih koncentracija antitela, 0, 2, 5, 6, 8 i 18 sati posle stimulacije. Prikazani podaci su reprezentativni za četiri eksperimenta sa anti-CD3 antitelom ili dva eksperimenta bez anti-CD3 antitela.

[0527] U prisustvu anti-CD3 antitela, iako m6C8 pokazuje snažniju agonističku aktivnost posle 6 sati (podaci nisu prikazani), 18 sati posle stimulacije, Hum231#2w i m6C8 indukuju sličnu aktivaciju GITR reporterske ćelijske linije (Slika 18A). Međutim, u odsustvu anti-CD3 antitela, samo Hum231#2w ali ne i m6C8 indukuje aktivaciju GITR reporterske ćelijske linije (Slika 18B).

6.3.9 Efekat agonističkog anti-GITR antitela na Fc gama receptor IIIA (CD16) reportersku ćelijsku liniju

[0528] U ovom primeru, ispitivana je ekspresija humanog GITR u aktiviranim nTreg ćelijama i T efektorskim ćelijama. PBMC izolovane iz zdravih donora obogaćene su CD3+ T ćelijama (Tef) ili CD4+CD25+CD45RA+ T ćelijama (nTreg) korišćenjem tehnika separacije na bazi magneta. T limfociti se zatim aktiviraju CD3-CD28 ekspanzionim perlicama sa 500U rIL-2 u trajanju od 4 dana, i 50U rIL-2 u trajanju od još 5 dana. Količina GITR receptora određuje se protočnom citometrijom ograđivanjem na CD4+ i CD8+ Tef naspram nTreg. Quantibrite perlice (BD Biosciences) propuštaju se istovremeno i koriste za kvantifikaciju površinske gustine GITR receptora.

[0529] Kao što je pokazano na Slici 19A, površinska ekspresija humanog GITR na aktiviranim nTreg ćelijama 9. dana (i u svim evaluiranim vremenskim tačkama) bila je viša od one na aktiviranim CD4+ ili CD8+ T efektorskim ćelijama.

[0530] Posle toga, sposobnost anti-GITR antitela Hum231#2w da istovremeno angažuje GITR i signal putem aktiviranja Fc gama receptora evaluirana je korišćenjem reporterske ćelijske linije koja eksprimira Fc gama receptor IIIA (CD16) zajedno sa aktiviranim T efektorskim (Tef) ili nTreg ćelijama, napravljenim kako je opisano. Ekspandirane Tef ili nTreg ćelije inkubirane su sa različitim dozama Hum231#2w ili izotipskim kontrolnim IgG1. Jurkat NFAT-luciferazareporterske ćelije koje prekomerno eksprimiraju CD16 (158 V/V polimorfizam) dodaju se uzorcima. Vezivanje kompleksa antitelo/antigen, gde se antigen nalazi na površini ćelije, za CD16 signale za konstrukt promotor/reporter i rezultuje transkripcijom gena za luciferazu. Ploče su inkubirane 20 sati na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, Bio-Glo Luciferase Assay Reagent (Promega) odledi se na sobnoj temperaturi i 75 µl se doda u svaki bunarić belih testnih ploča sa 96 bunarića. Luminescencija se meri u roku od 5-10 minuta. Pozadinska luminescencija se oduzme od očitavanja svakog uzorka i podešene relativne svetlosne jedinice (RLU) se zabeleže. Δ RLU predstavlja RLU za svako anti-GITR antitelo minus vrednost za izotipsku kontrolu.

[0531] Konzistentno sa diferencijalnom ekspresijom GITR na površini aktiviranih nTreg u odnosu na aktivirane CD4+ ili CD8+ T efektorske ćelije (Slika 19A), anti-GITR antitelo Hum231#2w preferencijalno aktivira CD16 kada je vezano za aktivirane nTreg ćelije (Slika 19B).

[0532] Da bi se evaluiralo da li je prekomerna ekspresija GITR odlika regulatornih T ćelija lociranih u tumorskom mikrookruženju, upoređivana je ekspresija GITR na T ćelijama izolovanim iz krvi zdravih humanih donora (Slika 19C, a-c, n=3) ili iz tumorskih tkiva pacijenata sa nesitnoćelijskim kancerom pluća (NSCLC) (Slika 19C, d-f, n=3). Da bi se eliminisalo pozadinsko vezivanje antitela za imunske populacije, sve ćelije se inkubiraju sa prečišćenim CD16/32 antitelom (10 µg/ml, 20 minuta na sobnoj temperaturi) pre dodavanja ćelijskih površinskih i unutarćelijskih antitela. Posle FcR-blokiranja, svi uzorci se inkubiraju sa APC-konjugovanim anti-GITR antitelom (klon 110416, R&D systems) ili izotipskom kontrolom i koktelom antitela za površinu ćelije (CD3-FITC, CD25-PECy7, CD4-BV650 i CD8a-PE) tokom 45 minuta na ledu (1 µg/ml svakog), isperu se tri puta FACS puferom (PBS, EDTA i 0.5% BSA), što je praćeno fiksacijom/permeabilizacijom i inkubacijom sa Pacific Blue-konjugovanim FOXP3 (fiks/perm i inkubacijom po 45 minuta na ledu, 1 µg/ml). Obojeni uzorci se zatim analiziraju korišćenjem LSRFortessa protočnog citometra (BD Biosciences). Ćelijska populacija na Slici 19C definisana je kao: Tconv (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25low, FOXP3-) ili Treg (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25high, FOXP3+).

[0533] Kako je prikazano na Slici 19C, površinska ekspresija GITR bila je najviša na regulatornim T ćelijama izolovanim iz tumorskih tkiva pacijenata sa NSCLC, uz nizak ili nedetektabilni nivo na Treg ili konvencionalnim T ćelijama iz zdravih donora.

6.3.10 Efekat agonističkog anti-GITR antitela na proizvodnju citokina u T ćelijama afričkog zelenog majmuna

[0534] Da bi se testirala unakrsna reaktivnost između vrsta, Hum231#2 evaluirano je u pogledu svog vezivanja za GITR iz afričkog zelenog majmuna (African green monkey, AGM). Ukratko, AGM PBMC (Worldwide Primates) odmrznu se i izbroje. PBMC se resuspenduju u medijumu za kulturu ćelija (RPMI 10% FBS) i stimulišu anti-CD3 antitelom (klon SP34.2, BD) ili ConA (Sigma) plus IL-2 (20 U/ml) tokom 3 dana na 37°C i 5% CO2. Posle aktivacije, ćelije se boje aminskom bojom FITC (Life technologies) 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije se isperu hladnim FACS puferom (1 X PBS 2% FBS, pH7.2) i doda se koktel antitela razblaženih u hladnom FACS puferu koji sadrži antitela protiv CD3 (APC Cy7, SP34.2), CD4 (PercP, L200), CD8 (PE Cy7, SK1) i PD-1 (PE, EH12.2H7) i inkubira 10 minuta na 4°C. Ćelije se isperu i inkubiraju sa 2.5 µg po bunariću Hum231#2 ili izotipskog kontrolnog IgG110 minuta na 4°C. Ćelije se isperu i zatim boje sekundarnim anti-Fc F(ab')2antitelom konjugovanim sa Alexa647 10 minuta na 4°C. Ćelije se isperu i fiksiraju 1.6% paraformaldehidom pre akvizicije korišćenjem FACSCanto protočnog citometra (BD Biosciences). FACS podaci analiziraju se korišćenjem FACS DIVA softvera.

[0535] Kako je prikazano na Slici 20A, anti-GITR antitelo Hum231#2 vezuje se za aktivirane AGM CD4+ i CD8+ T ćelije. Nestimulisane T ćelije iz AGM ne eksprimiraju bazalne nivoe GITR i GITR nivoi na površini ćelije pozitivno su regulisani posle aktivacije T ćelija. Dijagrami pokazani na Slici 20A reprezentativni su za eksperimente u kojima su korišćene PBMC iz tri različita AGM.

[0536] Zatim, izvodi se test CD3 substimulacije uz korišćenje PBMC iz afričkog zelenog majmuna (AGM) da bi se ispitala agonistička aktivnost Hum231#2w. Humane (Research Blood Components, LLC) ili AGM PBMC (Worldwide Primates) izoluju se putem fikolnog gradijenta iz zdravih donora i uskladište u tečnom azotu i otapaju na dan eksperimenta. Ćelije se resuspenduju u medijumu za kulturu ćelija (RPMI 10% FBS 20 U/ml IL-2) i dodaju na ploče za kulturu sa 96 bunarića koje sadrže za ploču vezano anti-CD3 antitelo (0.8 µg/ml) i različite koncentracije (2, 4, 5, 6 i 9 µg/ml) za ploču vezanog anti-GITR antitela ili izotipskog kontrolnog IgG1 antitela. Uzorci se inkubiraju 4 dana na 37°C i 5% CO2. Posle aktivacije, da bi se zaustavio transport proteina unutar ćelije, ćelije se tretiraju brefeldinom A (BD Biosciences) prema uputstvima proizvođača i uzorci se inkubiraju 6 sati na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, ćelije se boje korišćenjem FITC aminske boje za određivanje vijabilnosti (Life technologies) da bi se obojile mrtve ćelije. Posle ispiranja hladnim FACS puferom (1 x PBS 2% FBS, pH7.2), koktel antitela koji sadrži antitela protiv CD3 (APC Cy7, SP34.2), CD4 (PercP Cy5.5, L200) i CD8a (PE Cy7, SK1) razblažen u hladnom FACS puferu doda se svakom uzorku i inkubira 10 minuta na 4°C. Ćelije se fiksiraju i permeabilizuju korišćenjem Cytofix-Cytoperm (BD Biosciences) za unutarćelijsko bojenje prema uputstvima proizvođača. PBMC se boje antitelima protiv IFNγ (Alexa647, B27) i TNFα (PE, Mab11, samo za humane PBMC) i inkubiraju na sobnoj temperaturi 10 minuta. Uzorci se ispiraju korišćenjem 1 x Perm- pufera za ispiranje (BD Biosciences) i analiziraju korišćenjem FACScanto protočnog citometra (BD Biosciences). Dijagrami sa protočne citometrije analiziraju se korišćenjem Flojo softvera.

[0537] Kako je prikazano na Slikama 20B i 20C, kostimulacija sa anti-GITR antitelom Hum231#2w indukuje proizvodnju IFNγ u CD8+ AGM T ćelijama. Dijagrami i grafikoni sa protočne citometrije reprezentativni su za eksperimente u kojima su korišćene PBMC iz dva AGM.

6.3.11 Efekat istovremenog vezivanja rekombinantnog humanog GITR liganda i klonova humanizovanog 231-32-15 na anti-CD3-stimulisanim CD4+ T ćelijama

[0538] Agonističko anti-GITR antitelo koje ne sprečava vezivanje GITR za GITR ligand (GITRL) može rezultovati pojačanim imunskim odgovorom, koji se karakteriše pojačanjem proliferacije i/ili efektorske funkcije T efektorskih ćelija i/ili negativnom regulacijom supresivne funkcije T regulatornih ćelija.

[0539] Anti-GITR antitela, sama ili u kombinaciji sa rekombinantnim humanim GITRL, testirana su u pogledu agonističke aktivnosti prema CD4<+>T ćelijama. CD4<+>T ćelije u obogaćenoj populaciji obeleže se korišćenjem 1-2µM CFSE, isperu i zatim stimulišu za ploču vezanim anti-CD3 (125ng/ml), rastvorljivim anti-CD28 (125ng/ml) i 10 U IL-2, zajedno sa 10µg/ml himernog roditeljskog 231-32-15 antitela, 10µg/ml Hum231#1, 10µg/ml Hum231#2, 10µg/ml GITRL, kombinacijom 10µg/ml himernog roditeljskog 231-32-15 antitela sa 10µg/ml GITRL, kombinacijom 10µg/ml Hum231#1 sa 10µg/ml GITRL, ili kombinacijom 10µg/ml Hum231#2 sa 10µg/ml GITRL, na 37°C tokom 3 do 6 dana. Supernatanti kulture i ćelije se zatim sakupe sa ploča. Proliferacija ćelija i oslobađanje citokina ispituju se kako je opisano u Odeljcima 6.3.1, odnosno 6.3.2. Efekti istovremenog vezivanja anti-GITR antitela i GITRL na CD4<+>T efektorske ćelije ili CD4<+>T regulatorne ćelije mogu se dalje testirati kako je opisano u Odeljku 6.3.7. Ova studija može pokazati sinergistički ili aditivni efekat između GITRL i anti-GITR antitela (himerno roditeljsko 231-32-15, Hum231#1 i Hum231#2) u pojačanju imunskih odgovora.

[0540] Kao alternativa korišćenju solubilnog rekombinantnog humanog GITRL za testiranje koagonističke aktivnosti u kombinaciji sa anti-GITR antitelima opisanim ovde, moguće je takođe upotrebiti antigen-prezentujuće ćelije koje su indukovane da eksprimiraju GITRL. Takve indukovane APC mogu da se kultivišu sa CD4<+>T efektorskim ćelijama ili CD4<+>T regulatornim ćelijama, kao što je gore opisano, u prisustvu ili odsustvu anti-GITR antitela i da se procenjuje funkcija T ćelija. Da bi se indukovala ekspresija GITRL, antigen-prezentujuće ćelije kao što su makrofag ili dendritske ćelije inkubiraju se sa TLR4 ligandom (npr., LPS) tokom 1, 2, 4, 6 ili 12 sati kako je opisano, npr., u Tone M i sar., (2003) PNAS 100: 15059-15064; ili sa celim β- glikanskim česticama (whole β-glycan particles, WGP) prečišćenim iz ćelijskog zida Saccharomyces cerevisiae u trajanju od 6, 12, 24, 48 ili 72 sata, kako je opisano, npr., u Tian J i sar., (2012) PLoS One, 7(10): e46936.

6.3.12 Efekat agonističkog anti-GITR antitela na ekspresiju OX40 i PD-1 na površini T ćelija

4

[0541] U ovom primeru, agonističko anti-GITR antitelo evaluira se u pogledu svog uticaja na ekspresiju OX40 i PD-1 na površini T ćelija. PBMC izolovane putem fikolnog gradijenta iz leukocitno-trombocitnog sloja zdravih donora (Research Blood Components, LLC) skladište se u tečnom azotu i otapaju na dan eksperimenta. Ćelije se resuspenduju u medijumu za kulturu ćelija (RPMI 10% FBS 20 U/ml IL-2) i prenesu na ploče za kulturu sa 96 bunarića koje sadrže za ploču vezano anti-CD3 antitelo (klon SP34) u različitim suboptimalnim koncentracijama (0, 0.7, 0.8 i 0.9 µg/ml) i 5 µg/ml za ploču vezanog anti-GITR antitela Hum231#2 ili izotipskog kontrolnog IgG1 antitela. Uzorci se inkubiraju 4 dana na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, ćelije se boje FITC aminskom bojom za određivanje vijabilnosti (Life technologies) da bi se obojile mrtve ćelije. Posle ispiranja ćelija hladnim FACS puferom (1 x PBS 2% FBS, pH7.2), doda se anti-OX40 antitelo i inkubira 10 minuta na 4°C. Ćelije se isperu i doda se anti-humani Fc F(ab')2Alexa647 i inkubira 10 minuta na 4°C. Posle centrifugiranja i koraka ispiranja, koktel antitela koji sadrži antitela protiv CD3 (APC Cy7, SP34.2), CD4 (PercP Cy5.5, L200), CD8a (PE Cy7, SK1) i PD-1 (PE, EH12.2H7) razblažen u hladnom FACS puferu doda se svakom uzorku i inkubira 10 minuta na 4°C. Uzorci se isperu i resuspenduju u 200 µl 1.6% paraformaldehida pre analize korišćenjem FACScanto protočnog citometra (BD Biosciences). FACS dijagrami se analiziraju korišćenjem Flojo softvera. Dijagrami i grafikoni sa protočne citometrije reprezentativni su za eksperimente u kojima su korišćene PBMC iz jednog donora.

[0542] Kako je prikazano na Slici 21, kostimulacija sa anti-GITR antitelom Hum231#2 povećava ekspresiju OX40 i PD-1 na površini humanih CD4+ i CD8+ T ćelija.

6.4 Primer 4: Obrada humanizovane varijante ka germinativnoj liniji

[0543] Ovaj primer opisuje stvaranje humanizovanih varijanti sa povećanim sadržajem humane germinativne linije.

6.4.1 Dizajniranje biblioteke

[0544] Pristup u kojem se koriste biblioteke upotrebljava se za stvaranje humanizovanih varijanti sa povećanim sadržajem humane germinativne linije uvođenjem usmerenih mutacija putem degenerisanih kodona u varijabilne regione teškog i lakog lanca. Varijabilni regioni VH lanca mutirani su zamenom 17 aminokiselinskih pozicija sa 2 do 4 amino-kiseline, što za rezultat ima finalni diverzitet od 1.3E+06. Varijabilni region lakog lanca mutiran je na 9 aminokiselinskih pozicija (2-3 amino-kiseline po poziciji), što za rezultat ima finalni diverzitet

41

od 7.7E+02. Različite pozicije regiona okvira i CDR uključenih u biblioteku prikazani su na Slici 22. Biblioteke su dizajnirane korišćenjem IGHV1-2<∗>02 VH humane germinativne linije (Slika 22A) i IGKV4-1<∗>01 VL humane germinativne linije (Slika 22B).

6.4.2 Stvaranje biblioteke

[0545] Mutirani humanizovani varijabilni regioni kloniraju se u retrovirusne ekspresione vektore (pCMA). Ovi konstrukti se zatim upotrebljavaju za transdukovanje preB ćelija i ekspresiju antitela na površini korišćenjem Retrocyte Display® tehnologije. Retrovirusni ekspresioni vektor sadržao je MSCV-bazirane 5' i 3'LTR, imunoglobulinski konstantni region (IGHG1 ili IGKC) koji sadrži frakciju za ukotvljavanje u membranu (IGHG1) i CD4 površinski markerski gen. Površinski marker i imunoglobulin povezani su pomoću IRES (internal ribosome entry site, unutrašnje mesto ulaska ribozoma). Izraz "varijabilni region" u ovom primeru označava VDJ rearanžirane gene za teški lanac i VJ rearanžirane gene za lake lance.

6.4.2.1 Stvaranje biblioteke humanizovanih teških lanaca

[0546] Sintetisani humanizovani varijabilni regioni teškog lanca (Eurofins MWG GmbH) kloniraju se u retrovirusni ekspresioni vektor koji sadrži imunoglobulinski konstantni region (IGHG1) sa frakcijom za ukotvljavanje u membranu. Digestija i povezivanje izvode su u jednom koraku i jednoj epruveti korišćenjem restrikcionog enzima tipa IIS LguI i T4-DNK ligaze na 37°C tokom 1 sata. Materijal za biblioteku sintetisanih humanizovanih teških lanaca (128.7ng) poveže se u ramu u pCMA retrovirusni ekspresioni vektor (1µg) pri odnosu vektora prema insertu od 1:3. Reakcija spajanja se zatim precipitira i koncentruje (8.3-puta) do finalne koncentracije DNK od 94ng/µl.

[0547] Cela (3x 4µl) koncentrovana reakcija spajanja unese se elektroporacijom u 80µl DH10B ćelija (E.coli ElectroMax DH10B elektrokompetentne ćelije, Invitrogen, kat. br. 12033-015) (1900V/ 5ms). Doda se 1000µl SOC medijuma (Invitrogen, kat. br. 15544-034) i transformisane DH10B ćelije se izoluju na 37°C tokom 1 sata. Izvrši se razblaživanje 1:1000 da bi se odredila složenost biblioteke. Cele reakcije transformacije nanesu se na ploče koje sadrže LB-agar 100µg/ml ampicilina i inkubiraju preko noći na 37°C. Određeno je da složenost biblioteke humanizovanog VH lanca iznosi 7.3E+07 i prema tome diverzitet cele biblioteke je oporavljen.

[0548] Sve elektroporisane bakterije bile su skinute sa ploča i pripremljena su dva glicerolna stoka za dugotrajno skladištenje na -80°C. Izvršeno je pripremanje DNK plazmida u velikom

42

opsegu (Macherey & Nagel, NucleoBond Xtra Maxi Plus kit). Digestija za proveru prisustva i ispravne veličine bibliotečkog materijala kloniranog inserta humanizovanog VH lanca izvedena je korišćenjem HindIII/Eco47III (H/E). Da bi se potvrdila ispravnost vektorske osovine upotrebljena je digestija korišćenjem KpnI/BsrGI (K/B). Kao kontrola plazmidna DNK biblioteke humanizovanog VH lanca digestirana je takođe pomoću LguI da bi se proverile količine vektora bez insercija humanizovanih VH lanaca i integritet vektora je testiran separacijom neisečene plazmidne DNK.

[0549] 96 pojedinačnih klonova odabrano je i poslato na sekvenciranje kako bi se odredio finalni diverzitet biblioteke korišćenjem prajmera 89-AL (Sekvenca: 5' gcctccgcctcctcttcctccatcc 3'; SEQ ID NO: 707). U kontroli kvaliteta nisu identifikovane redundantne sekvence. Teoretski diverzitet je 1.3E+06 različitih varijanti tako da je pokrivenost svake pojedinačne sekvence oko 50 puta. 35% bibliotečkih klonova imalo je željeni obrazac mutacija (=2.5E+07) i sve željene varijante bile su prisutne u biblioteci.

6.4.2.2 Stvaranje biblioteke humanizovanog lakog lanca

[0550] Sintetisani humanizovani varijabilni regioni lakog lanca (Eurofins MWG GmbH) kloniraju se u retrovirusni ekspresioni vektor koji sadrži imunoglobulinski konstantni region (IGKC). Digestija i povezivanje izvedeni su kako je opisano u odeljku 6.4.2.1. Materijal za biblioteku sintetisanih humanizovanih lakih lanaca (227.9ng) poveže se u ramu u pCMA retrovirusni ekspresioni vektor (0.5µg) pri odnosu vektora prema insertu od 1:10. Posle toga reakcija spajanja se precipitira i koncentruje 3.6 puta do finalne koncentracije DNK od 52ng/µl.

[0551] Transformacija se izvodi kako je opisano u Odeljku 6.4.2.1 gore.2 x 4µl koncentrovane reakcije povezivanja elektroporacijom se unese u 80µl DH10B ćelije (E.coli ElectroMax DH10B elektrokompetentne ćelije, Invitrogen, kat. br.12033-015) (1900V/ 5ms). Određeno je da složenost biblioteke humanizovanog VL lanca iznosi 4.6E+07 i prema tome oporavljen je diverzitet cele biblioteke. Priprema bibliotečke plazmidne DNK i provera plazmidne DNK izvodi se kao što je opisano u Odeljku 6.4.2.1. U kontroli kvaliteta identifikovana je samo jedna redundantna sekvenca. Teorijski diverzitet je 7.7E+02 različitih varijanti tako da je pokrivenost svake pojedinačne sekvence oko 60000 puta.65% bibliotečkih klonova imalo je željeni obrazac mutacija i sve željene varijante bile su prisutne u biblioteci

6.4.3 Oporavljanje teških i lakih lanaca obrađenih ka germinativnoj liniji iz prethodno odabranih klonova preB ćelija

4

[0552] Humanizovani bibliotečki materijal stvoren kako je opisano gore (Odeljci 6.4.2.1 i 6.4.2.2) upotrebljen je u pretraživanju maturacije afiniteta tehnologijom Retrocyte Display® da bi se identifikovala antitela sa visokim sadržajem gena germinativne linije i poboljšanim biološkim i biohemijskim osobinama. Sa dve ploče sa 96 bunarića, koje sadrže 80 i 96 prethodno odabranih klonova preB ćelija, izolovani su teški i laki lanci. Ćelije su lizirane (Phusion kit za direktnu PCR humanih uzoraka, Thermo Scientific / Finnzymes kat. br. F-150) i varijabilni regioni amplifikovani direktno pomoću PCR (vidi Tabelu 15). PCR je izvedena uz korišćenje specifičnih 5' uzvodnih i 3' nizvodnih prajmera (vidi Tabelu 16). Kao templat za PCR upotrebljeno je 2µl lizata preB ćelija. Amplifikovani varijabilni regioni prečišćeni su (NucleoFast 96 PCR (Macherey - Nagel)) i klonirani u CHO ekspresione vektore (pPEP) koji sadrže imunoglobulinski konstantni region (IGHG1, IGKC).

Tabela 15: PCR programi

Tabela 16: Prajmeri za amplifikovanje varijabilnih regiona teškog i kapa lakog lanca

44

[0553] Da bi se klonirali prethodno odabrani varijabilni regioni ka germinativnoj liniji obrađenog teškog i lakog lanca, izvode se digestija i povezivanje u jednom koraku i u jednoj epruveti uz korišćenje restrikcionog enzima tipa IIS LguI i T4-DNK ligaze na 37°C u trajanju od 1 h i finalnog koraka na 80°C u trajanju od 10min, i prethodno odabrani varijabilni regioni teškog i lakog lanca obrađenog ka germinativnoj liniji, (∼60ng) spojeni su u ramu u pPEP ekspresionim vektorima (50µg). Upotrebljen je odnos vektora prema insertu od 1:12.

[0554] 2µl reakcije povezivanja prethodno odabranog ka germinativnoj liniji obrađenog teškog lanca i 6µl reakcije povezivanja prethodno odabranog ka germinativnoj liniji obrađenog kapa lakog lanca kotransfektuje se u hemijski kompetentne DH10B ćelije (30 µl) transformacijom toplotnim šokom. Doda se 1000µl SOC medijuma (Invitrogen, kat. br. 15544-034) i transformisane DH10B ćelije se izoluju na 37°C tokom 1 sata. Na kraju se doda 1000µl LB-medijuma ampicilin (finalna koncentracija: 100µg/ml) i transformisane ćelije E. coli se inkubiraju preko noći na 37°C. Obavi se pripremanje DNK plazmida u malom opsegu (Macherey & Nagel, NucleoSpin 96 Plasmid) i izvede se digestija pomoću HindIII/NotI (VH lanci) i NcoI (VK lanci) za potvrdu prisustva i ispravne veličine kloniranih varijabilnuih regiona. Integritet vektora testira se separacijom neisečene plazmidne DNK. Preparati DNK plazmida se zatim koriste za transfektovanje CHO ćelija i eksprimirana antitela se testiraju korišćenjem tehnologije niza suspenzija i u kinetičkoj analizi pomoću Octet. Sekvenca antitela potvrđuje se pomoću PCR.

6.4.4 Selektovanje varijanti germinativne linije

[0555] Vrši se selekcija nekoliko stotina antitela obrađenih ka germinativnoj liniji na osnovu kinetike vezivanja koja je određena pomoću Octet merenja (Octet RED 96 sistem; ForteBio™ Inc., Menlo Park, CA). Eksperimentalna procedura je konfigurisana prema uputstvu za korišćenje instrumenta. Biotin-GITR se veže za streptavidinski biosenzor (Streptavidin biosensor, SA) i PBS (pH 7.4) se koristi kao prazna kontrola. Ukratko, analize interakcija

4

sprovode se na 30°C u radnom puferu (PBS, 0.05% Tween, pH7.4). Senzorni vrhovi se prethodno vlaže 10 minuta u radnom puferu neposredno pre upotrebe, i mikroploče upotrebljene u Octet napune se sa 200 µl uzorka ili pufera po bunariću i agitiraju na 800 rpm. Za eksperimente, koriste se komercijalno dostupni prethodno obloženi vrhovi. Biotinzovani GITR se nanese na ForteBio SA vlakna u PBS pH7.4 10 minuta i ispira 4 minuta. Za fazu asocijacije, ligandom obloženi SA vrhovi urone se 5 minuta u supernatant ćelijske kulture razblažen 1:10 u radnom puferu pre merenja. Disocijacija kompleksa antitelo-antigen meri se u bunarićima koji sadrže samo Octet pufer, tokom 5 minuta. Posle svakog ciklusa, vrhovi se regenerišu glicinom (10mM, pH 2.0). Afinitet, Koni Koffodređuju se pomoću Octet evaluacionog softvera v6.3 uz korišćenje vezujućeg modela 1:1 uz lokalno puno podešavanje. Tabela 17 navodi sastav varijabilnih regiona teškog lanca i varijabilnih regiona lakog lanca za 56 odabranih varijanti germinativne linije i vrednosti njihovog afiniteta, Koni Koff, kako je izmereno pomoću Octet.

Tabela 17: Kinetička analiza varijanti germinativne linije

4

4 ID Vari abilni re ion Vari abilni re ion Afinitet M kon1/Ms Koff1/s

[0556] Od ovih antitela, jedan broj je odabran za narednu analizu baziranu na dodatnim Octet vrednostima i njihovoj homologiji sa germinativnom linijom. Od njih, uzorci antitela, koja su sva agonistička u testu T-ćelija (podaci nisu prikazani), karakterisani su detaljnije kako je

4

opisano dole. Slika 23 detaljno prikazuje sastav varijabilnih regiona teškog i lakog lanca ovih odabranih varijanti germinativne linije. Slike 24A, 24B i 24C detaljno prikazuje sastav varijabilnih regiona teškog i lakog lanca odabranih stvarnih ili predviđenih varijanti germinativne linije.

6.4.5 Kinetička analiza varijanti germinativne linije

[0557] Kvantifikacija i analize vezivanja varijanti germinativne linije anti-GITR antitela vršene su korišćenjem tehnologije niza suspenzija, prema postupcima opisanim u Odeljku 6.2.5.1. Prosečni relativni afiniteti varijanti germinativne linije u poređenju sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom prikazani su na Slici 23.

[0558] Pored toga, procena ligand-blokirajuće aktivnosti korišćenjem tehnologije niza suspenzija takođe je izvršena prema postupku opisanom u Primeru 6.2.5.2. Kao što se može videti na Slikama 25A i 25B, vezivanje GITRL-PE za GITR u prisustvu odabranih varijanti germinativne linije antitela odvija se po veoma sličnom obrascu za testirana antitela.

[0559] Ove varijante germinativne linije antitela dodatno su karakterisane u funkcionalnim testovima, kako je opisano dole u Primeru 5.

6.5 Primer 5: Funkcionalna aktivnost varijanti germinativne linije

6.5.1 Efekat varijanti germinativne linije na anti-CD3-stimulisanu proliferaciju CD4+ T ćelija i proizvodnju citokina

[0560] U cilju procene aktivnosti novih varijanti germinativne linije stvorenih kao što je opisano u Primeru 4, ove varijante se upoređuju sa humanizovanim antitelima Hum231#1 i Hum231#2 i himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom na obogaćenoj populaciji CD4 T ćelija iz preparata leukocitno-trombocitnog sloja, BC4, BC9, BC13 i BC18.

[0561] Test suboptimalne CD3-stimulacije izveden je kako je opisano u Odeljku 6.3.1 gore bojenjem unutarćelijskih citokina (BC13 i BC18), oslobađanja citokina (BC4 i BC9) i razblaženjem CFSE (BC4 i BC9) merenim 5 dana posle izvođenja testa stimulacije. Za ploču vezana anti-CD3 i rastvorljiva anti-CD28 antitela korišćena su sa za ploču vezanim anti-GITR antitelima, bez antitela (samo CD3), i izotipskom kontrolom (antitelo MSC8). Anti-GITR antitela korišćena su u koncentraciji od 10ug/ml. Za leukocitno-trombocitne slojeve 4 i 9, anti-CD3 antitelo upotrebljeno je u koncentraciji od 125ng/ml, anti-CD28 antitelo u koncentraciji od 125ng/ml i 10U IL-2. Za leukocitno-trombocitni sloj 13, anti-CD3 antitelo upotrebljeno je

4

u koncentraciji od 500 ng/ml i anti-CD28 antitelo u koncentraciji od 100ng/ml. Za leukocitnotrombocitni sloj 18, anti-CD3 antitelo upotrebljeno je u koncentraciji od 31.25ng/ml i anti-CD28 antitelo u koncentraciji od 100ng/ml.

[0562] Za preparate leukocitno-trombocitnog sloja BC4 i BC9, supernatanti i ćelije sakupljeni su sa ploča posle 5 dana u kulturi. Određena je proliferacija ćelija i prikazana je kao procenat CFSE nisko ("low") (Slike 26A i 26B) i supernatanti su upotrebljeni za analizu citokina (IFNγ i IL-10). Slike 27A i 27B pokazuju oslobađanje citokina za BC4 i Slike 28A i 28B pokazuju oslobađanje citokina za BC9.

[0563] ] Za preparate leukocitno-trombocitnog sloja BC13 i BC18, posle 5 dana u kulturi, u sve uzorke se doda monenzin (eBioscience) u trajanju od 6 sati da se omogući zadržavanje IFNγ unutar ćelija. Uzorci se zatim unutarćelijski boje na IFNγ-PE (eBioscience) korišćenjem BD Cytofix/Cytoperm kita (BD Biosciences) što je praćeno detekcijom protočnom citometrijom na BD FACSAria I (BD Biosciences) i analiziranjem korišćenjem FlowJo softvera (Tree Star). Rezultati efekta varijanti germinativne linije na procenat IFNγ-pozitivnih CD4 T ćelija iz BC13 i BC18 prikazani su na Slikama 29A, odnosno 29B. Posle kontakta sa varijantama germinativne linije, himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom ili humanizovanim varijantama Hum231#1 i Hum231#2, procenat IFNγ-pozitivnih CD4 T-ćelija indukovanih ovim anti-GITR antitelima bio je uporediv. Međutim, kao što je i očekivano, postojale su blage varijacije između donora.

6.5.2 Efekat varijanti germinativne linije na GITR NF-κB-luciferaza-reportersku ćelijsku liniju

[0564] U ovom primeru, varijante germinativne linije stvorene kao što je opisano u Primeru 4 testirane su korišćenjem GITR NF-κB-luciferaza-reporterske ćelijske linije (Promega) opisane u Odeljku 6.3.8.

[0565] Reporterska ćelijska linija (Promega) održavana je u kulturi u skladu sa uputstvom proizvođača. Na dan eksperimenta, ćelije se resuspenduju u testnom medijumu (RPMI 1% FBS). Ćelije (100,000 ćelija po bunariću) dodaju se na ploče sa 96 bunarića koje sadrže za ploču vezano anti-CD3 antitelo (klon SP34, 0.3 µg/ml) i različite koncentracije (12.5, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 i 0 µg/ml) za ploču vezanih anti-GITR antitela. Reporterske ćelije se inkubiraju 18 sati na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, detektuje se ekspresija luciferaze korišćenjem Bio-Glo (Promega) i EnVision multilabel reader 2100.

[0566] Anti-GITR antitela testirana u ovom testu bila su Hum231#2w i 20 varijanti germinativne linije: pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, pab2159, pab2160 i pab2161. Kako je prikazano na Slikama 30A-C, sve varijante germinativne linije pokazale su agonističku aktivnost u GITR NF-κB-luciferaza-reporterskom testu.

[0567] Verijante germinativne linije testirane su i u pogledu agonističke aktivnosti u odsustvu anti-CD3 antitela. Na dan eksperimenta, GITR NF-κB-luciferaza-reporterske ćelije (Promega) resuspendovane su u testnom medijumu (RPMI 1% FBS). Ćelije (100,000 ćelija po bunariću) se dodaju na ploče sa 96 bunarića koje sadrže različite koncentracije (12.5, 10, 5, 2.5, 1.25, i 0.625 µg/ml) za ploču vezanih anti-GITR antitela. Reporterske ćelije se inkubiraju 6 sati na 37°C i 5% CO2. Posle inkubacije, ekspresija luciferaze detektuje se korišćenjem Bio-Glo (Promega) i EnVision multilabel reader 2100.

[0568] Anti-GITR antitela testirana u ovom testu bila su m6C8, Hum231#2w i 20 varijanti germinativne linije: pab1964, pab1965, pab1966, pab1967, pab1968, pab1969, pab1970, pab1971, pab1972, pab1973, pab1975, pab1976, pab1977, pab1979, pab1980, pab1981, pab1983, pab2159, pab2160 i pab2161. Sve varijante germinativne linije pokazale su doznozavisnu aktivaciju reporterske ćelijske linije u odsustvu anti-CD3 antitela (Slike 30D-F).

6.6 Primer 6: Karakterizacija epitopa za anti-GITR antitela

[0569] Za karakterizaciju epitopa na humanom GITR koji prepoznaju himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo i humanizovana anti-GITR antitela, izvedene su dodatne studije kako je opisano dole.

6.6.1 Kompeticija za epitop - test ćelijskog vezivanja

[0570] Da bi se potvrdilo da humanizovane varijante antitela zadržavaju epitopsku specifičnost roditeljskog himernog 231-32-15 antitela izvodi se test vezivanja ćelija. 1624-5 pre-B ćelije koje eksprimiraju himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo se sakupe i 1x10<6>ćelija se resuspenduje u 200µl FACS pufera plus: i) biotinisani GITR (GITR-bio) (1:1000), preinkubiran 15 min sa 2µg himernog roditeljskog 231-32-15 antitela; ii) GITR-bio (1:1000), preinkubiran 15 min sa 2µg Hum231#1; iii) GITR-bio (1:1000), preinkubiran 15 min sa 2µg Hum231#2; ili iv) GITR-bio (1:1000). Ćelije se inkubiraju 20 min na 4°C i zatim isperu korišćenjem 4ml FACS pufera i centrifugiraju 5 min na 300g na 4°C. Ćelijski pelet se resuspenduje u 200µl FACS pufera plus streptavidin-PE (1:1000) i zatim inkubiraju i isperu kao ranije. Ćelije se zatim resuspenduju u 200µl FACS pufera za analizu korišćenjem FACSAriaII (BD Biosciences).

1

[0571] Slika 31 pokazuje da humanizovane varijante antitela zadržavaju epitopsku specifičnost himernog roditeljskog 231-32-15 antitela. Profil sa desne strane pokazuje vezivanje GITR-bio za 1624-5 pre-B ćelije koje eksprimiraju himerno roditeljsko 231-32-25 antitelo. Međutim, kada se GITR-bio preinkubira sa himernim roditeljskim 231-32-15, Hum231#1 ili Hum231#2 antitelom gubi se vezivanje GITR-bio za 1624-5 ćelije (profil sa leve strane). Preklapanje FACS profila ukazuje na to da humanizovane varijante takođe pokazuju veoma slične GITR-vezujuće odlike jedna sa drugom i sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom.

6.6.2 Kompeticija za epitop - tehnologija niza suspenzija

[0572] Anti-GITR antitela (25µl) razblaže se do 2µg/ml u testnom puferu (Roche 11112589001) i inkubiraju sa 1500 Luminex® perlica (5µl, Luminex Corp, br 5 LC10005-01) povezanih sa anti-humanim IgG (F(ab)2-specifičan, JIR, 105-006-097) preko noći u 0.5ml LoBind epruvetama (Eppendorf, 0030108.116) u uslovima šejkiranja, u mraku. Ova mešavina se zatim prenese na prethodno ovlažene filter ploče sa 96 bunarića (Millipore, MABVN1250). Ploče se isperu dva puta korišćenjem 200µl/bunariću PBS da se ukloni nevezano antitelo. U isto vreme 20µg/ml istih anti-GITR antitela, različitih anti-GITR antitela, ili testnog pufera inkubira se sa 20µl (1µg/ml) R-PE-obeleženog GITR antigena (R&D systems, disulfidno povezani homodimer; 689-GR; kod nas obeležen pomoću AbDSerotec LYNX kita, LNK022RPE) 1h u mraku na 650 rpm. Mešavina perlica i mešavina antigen/antitelo pomešaju se u odnosu 1:1 (20µl svakog) i inkubiraju još jedan sat pod uslovima šejkiranja (20°C, 650rpm). Neposredno pre merenja 40µl testnog pufera doda se u svaki bunarić i analiza se izvrši korišćenjem Luminex®200 sistema (Millipore) i očitavanjem 100 perlica u zapremini uzorka od 48µl. Vezivanje se određuje korišćenjem MFI vrednosti nekompetirajuće kontrole (100% vezivanje, samo testni pufer kao kompetirajuće jedinjenje).

[0573] Kada se himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo koristi kao kaptirano antitelo, zapaža se potpuna vezujuća kompeticija sa obe humanizovane varijante. Kada se anti-GITR antitelo m6C8 koristi kao kaptirano antitelo, ne zapaža se kompeticija u vezivanju sa himernim roditeljskim 231-32-15 antitelom ili dve humanizovane varijante (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati ukazuju na to da m6C8 i anti-GITR antitelo opisano ovde prepoznaju različite epitope na humanom GITR.

6.6.3 Kompeticija za epitop - rezonancija površinskog plazmona

2

[0574] Za binovanje epitopa korišćenjem rezonancije površinskog plazmona koristi se "tandemski pristup" (Abdiche YN i sar., (2009) Analytical Biochemistry, 386: 172-180). Za tu namenu naprave se različite podloge na CM5 senzornom čipu (GE Healthcare, Series S CM5, BR-1005-30) uz korišćenje imobilisanja GITR antigena različitih gustina (R&D systems, disulfidno spojeni homodimer; 689-GR). Protočna ćelija 2 sadrži GITR antigen u niskoj gustini (667 RU), srednja gustina je procenjena u protočnoj ćeliji 3 (1595 RU) i u protočnoj ćeliji 4 postignuta je najveća gustina (4371 RU). U protočnoj ćeliji 1 ovalbumin (1289 RU, Pierce ThermoFisher 77120) se imobiliše kao referenca. Imobilizacija se izvodi prema standardnom protokolu proizvođača (GE Healthcare) za aminsko povezivanje (aktivacija površine pomoću 0.4M EDC i 0.1M NHS, GE Healthcare kit za aminsko povezivanje, BR-1000-50). Neodreagovale grupe se inaktiviraju pomoću 1M etanol-amin-HCl pH8.5. Posle toga anti-GITR antitela se puštaju preko različitih površina u koncentraciji od 300 nM (45µg/ml) tokom 240s pri 5µl/min. Korišćenjem ovih uslova trebalo bi da se postigne zasićenje GITR površine. Vreme disocijacije od 60s uključeno je pre dodavanja kompetirajućeg antitela (300 nM, 5µl/min). Regeneracija površine čipa izvodi se korišćenjem 10mM Glicina pH2.0 (GE Healthcare, BR-1003-55) tokom 60s pri 10µl/min. Binovanje se izvodi korišćenjem rezonantnih jedinica (response units, RU) nekompetirajuće kontrole (100% vezivanje, uslovi zasićenja).

[0575] Kao što je pokazano na Slici 32, kada se himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo prvo veže za GITR ne dolazi do daljeg vezivanja ovog antitela. Međutim kada se himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo prvo veže za GITR i nanese se antitelo m6C8, ovo antitelo je i dalje sposobno da se veže za GITR.

6.6.4 Epitopsko mapiranje anti-GITR antitela

[0576] Da bi se mapirao epitop na GITR za koji se vezuju anti-GITR antitela opisana ovde, PCR sklona greškama koristi se za stvaranje varijanti humanog GITR antigena. Varijantni GITR proteini se eksprimiraju na površini ćelija u ćelijskoj biblioteci i vrši se pretraživanje ovih ćelija u pogledu vezivanja anti-GITR antitela. Kao pozitivna kontrola, koristi se poliklonsko anti-GITR antitelo da bi se potvrdilo pravilno savijanje GITR proteina. Za varijante humanog GITR antigena kod kojeg ne dolazi do vezivanja antitela ili je vezivanje smanjeno, vrši se alanin-skenirajuća mutageneza da bi se odredile tačne rezidue epitopa koje su potrebne za vezivanje sa anti-GITR ovde opisnaim antitelima.

6.6.4.1 Stvaranje varijanti humanog GITR

[0577] PCR mutageneza sklona greškama koristi se za stvaranje varijanti humanog GITR sa nasumičnim mutacijama u vanćelijskom domenu. Za PCR sklonu greškama, koristi se GeneMorphII kit za nasumičnu mutagenezu (Stratagene), prema uputstvima proizvođača. Ukratko, 20 PCR ciklusa u zapremini od 50µl izvede se korišćenjem našeg konstrukta kao templata (13ng, broj konstrukta 4377 pMA-T-huGITR), 0.05U/µl Mutazyme II DNK polimeraza, 1x Mutazyme II reakcioni pufer, 0.2µM svakog od prajmera (1152- Je (Sekvenca 5' gagctcctcgaggccaccatg 3'; SEQ ID NO: 712) i 1204-Je (Sekvenca 5' cgcggccgcgaattctta 3'; SEQ ID NO: 713)) i 0.2mM svakog od deoksinukleozid-trifosfata (dATP, dCTP, dGTP, i dTTP). Uzorci se amplifikuju korišćenjem PCR (Eppendorf, Germany) uz upotrebu sledećeg programa: 95°C tokom 2 min; 20 ciklusa na 95°C tokom 30 sec, 56°C tokom 30 sec, 72°C tokom 1 min; i korak produžavanja od 72°C tokom 10 min. PCR proizvod se prečisti na gelu uz korišćenje 1% agaroznog gela, DNK traka koja odgovara očekivanoj veličini od 720bp se iseče i ekstrakcija na gelu se obavi korišćenjem NucleoSpin gela i PCR cleanup kita, Macherey&Nagel prema uputstvu za proizvod. Prečišćena DNK se poveže u naš ekspresioni vektor putem XhoI / EcoRI mesta korišćenjem T4 DNK ligaze i odnosa od 1:3 (vektor:insert). Povezivanje (25°C) se zaustavlja posle 2 sata korakom denaturacije toplotom u trajanju od 10 min na 65°C. DNK iz reakcije povezivanja precipitira se pomoću EtOH uz korišćenje t-RNK kvasca. Koriste se standardne tehnike digestije i povezivanja. Reakcija povezivanja se elektroporacijom uvede u DH10B ćelije (E.coli ElectroMax DH10B elektrokompetentne ćelije, Invitrogen; 1900V/ 5ms). Elektroporisane bakterije se zaseju na ploče koje sadrže LB-agar 100µg/ml ampicilina i dobije se približno 1.9x10<8>kolonija.

[0578] Sve elektroporisane bakterije se zatim skinu sa ploča i upotrebe za pripremanje DNK plazmida u velikim razmerama (Macherey&Nagel, NucleoBond Xtra Maxi Plus kit), prema uputstvima proizvođača da se stvori DNK biblioteka. Digestija restrikcionim enzimima uz korišćenje XhoI/EcoRI i BsrGI/EcoRI izvodi se radi kontrole kvaliteta biblioteke. Pojedinačni klonovi se odaberu i šalju na sekvenciranje da bi se odredila finalna raznovrsnost biblioteke uz korišćenje prajmera 1155-Je (uzvod; Sekvenca 5' ccttgaacctcctcgttcg 3'; SEQ ID NO:714).

6.6.4.2 Stvaranje ćelijske biblioteke sa humanim varijantama GITR

[0579] Standardne tehnike transfekcije praćene transdukcijom koriste se za ekspresiju humanih GITR mutanata na površini 1624-5 ćelija. Za stvaranje retrovirusnih čestica, DNK biblioteka i vektori koji eksprimiraju retrovirusne proteine Gag, Pol i Env transfektuju se u ćelijske linije za pakovanje retrovirusa (HEK ćelije) uz korišćenje X-tremeGENE 9 DNK transfekcionog

4

reagensa (Roche Diagnostics GmbH, Germany). Dobijene retrovirusne čestice akumulirane su u supernatantu ćelijske kulture ćelija za pakovanje retrovirusa. Dva dana posle transfekcije supernatanti koji sadrže čestice virusnih vektora, bez ćelija, sakupljaju se i koriste u spininfekciji 1624-5 ćelija. Postiže se efikasnost transdukcije (% ćelija koje eksprimiraju humani GITR) od grubo 4%. Posle još najmanje jednog dana produženja kulture, ćelije se selektuju korišćenjem puromicina (1.5 µg/ml). Netransdukovane ćelije služe kao negativne kontrole (negative controls, NC). Posle selektovanja antibiotikom, većina ćelija stabilno eksprimira biblioteku humanog GITR antigena na ćelijskoj površini. Nevijabilne ćelije se uklanjaju korakom separacije na fikolu.

[0580] FACS se koristi za selektovanje ćelija koje eksprimiraju pravilno savijene humane GITR mutante uz korišćenje poliklonskog anti-GITR antitela i potom selektovanje pojedinačnih ćelija koje eksprimiraju varijante humanog GITR koje se ne vezuju za anti-GITR himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo. Ukratko, ćelije koje se vezuju sa antitelom analiziraju se pomoću FACS i ćelije koje ispoljavaju specifično vezivanje sa antitelom odvajaju se od nevezujuće ćelijske populacije preparativnim FACS velike brzine (FACSAriaII, BD Biosciences). Pulovi ćelija reaktivnih ili nereaktivnih sa antitelom ponovo se ekspandiraju u kulturi tkiva i, zbog stabilne ekspresije fenotipa retrovirusom transdukovanih ćelija, ciklusi sortiranja ćelija usmerenog antitelom i ekspanzija u kulturi tkiva ponavljaju se do tačke kada se dobije jasno detektabilna populacija ćelija koje ne reaguju sa anti-GITR antitelom (himerno roditeljsko 231-32-15). Ova populacija ćelija koje ne reaguju sa anti-GITR antitelom (himerno roditeljsko 231-32-15) podvrgava se finalnom koraku sortiranja pojedinačnih ćelija. Posle nekoliko dana ekspanzije ćelija, pojedinačno sortirane ćelije se ponovo testiraju u pogledu nevezivanja za anti-GITR himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo i vezivanja za poliklonsko anti-GITR antitelo korišćenjem analize na ploči sa 96 bunarića na FACSCalibur (BD Biosciences).

6.6.4.3 Analiza epitopa

[0581] Da bi se povezao fenotip (poliklonsko anti-GITR+, himerno roditeljsko 231-32-15-) sa genotipom, obavlja se sekvenciranje huGITR varijanti posle sortiranja pojedinačnih ćelija. Slika 33 pokazuje poravnavanje sekvenci iz ovih varijanti. Aminokiselinske rezidue na Slici 33 numerisane su prema nezreloj aminokiselinskoj sekvenci humanog GITR (SEQ ID NO: 701). Sekvenciranjem identifikovani regioni sa povećanjem mutacija ili "hot spots" ("vruće tačke") (npr., P62 i G63), obezbeđuju naznaku epitopa na humanom GITR koju prepoznaje anti-GITR himerno roditeljsko 231-32-15 antitelo.

[0582] Da bi se potvrdile tačne amino-kiseline humanog GITR uključene u vezivanje za anti-GITR antitela, vrši se zamena amino-kiselina "vrućih tačaka" alaninom. Sledeće pozicije (numerisane prema SEQ ID NO: 701) zasebno se mutiraju u alanin: P28A, T29A, G30A, G31A, P32A, T54A, T55A, R56A, C57A, C58A, R59A, D60A, Y61A, P62A, G63A, E64A, E65A, C66A, C67A, S68A, E69A, W70A, D71A, C72A, M73A, C74A, V75A, i Q76A. Standardne tehnike transfekcije praćene transdukcijom upotrebljene su za ekspresiju ovih alaninskih mutanata humanog GITR na površini 1624-5 ćelija.

[0583] Konačno, alaninski mutanti eksprimirani na 1624-5 ćelijama testirani su u protočnom citometru (FACSCalibur; BD Biosciences) za vezivanje anti-GITR humanizovane varijante Hum231#2, tri varijante germinativne linije (pab1967, pab1975 i pab1979) i referentnog antitela m6C8. Ukratko, 1624-5 ćelije koje eksprimiraju pojedinačne alaninske mutante humanog GITR inkubiraju se sa 2 µg/ml monoklonskih anti-GITR antitela Hum231#2, tri varijante germinativne linije (pab1967, pab1975 i pab1979), ili m6C8 antitelom; ili poliklonskim anti-GITR antitelom (AF689, R&D systems) konjugovanim sa APC, i blokom Fc receptora (1:200; BD kat. br. 553142) razblaženim u 100 µl FACS pufera (PBS 2% FCS) u trajanju od 20 min na 4°C. Posle ispiranja, ćelije se inkubiraju sa sekundarnim anti-IgG antitelom ako je potrebno za detekciju (konjugovano sa APC; BD kat. br. 109-136-097) razblaženim u 100 µl FACS pufera (PBS 2% FCS) u trajanju od 20 min na 4°C. Ove ćelije se zatim isperu i analiziraju korišćenjem protočnog citometra (BD Biosciences). Vrednost prosečnog intenziteta fluorescencije (MFI) testiranog monoklonskog antitela deli se vrednošću MFI poliklonskog anttiela, dajući MFI odnos (monoklonsko antitelo/poliklonsko antitelo) za pojedinačne GITR alaninske mutante. Prosečan MFI odnos (average MFI ratio, "AMFI ratio") izračunava se na osnovu pojedinačnih MFI odnosa za sve mutante. Slika 34A je tabela koja sumira vezivanje Hum231#2, tri varijante germinativne linije (pab1967, pab1975 i pab1979) i referentnog antitela m6C8 za1624-5 ćelije koje eksprimiraju alaninske mutante humanog GITR. Smatra se da pojedinačni MFI odnos koji je iznad 60% od AMFI odnosa ukazuje na slično vezivanje, posle normalizacije, kao ono poliklonskog antitela i predstavlja se kao "+" na Slici 34A. Pojedinačni MFI odnos koji je između 30% i 60% od AMFI odnosa predstavlja se kao "+/-" na Slici 34A. Pojedinačni MFI odnos koji je ispod 30% od AMFI odnosa predstavlja se kao "-" na Slici 34A.

[0584] Kao što je pokazano na Slici 34A, D60A mutant i G63A mutant, numerisani prema SEQ ID NO: 701, specifično narušavaju ili slabe vezivanje anti-GITR humanizovane varijante Hum231#2 i tri varijante germinativne linije (pab1967, pab1975 i pab1979), ali ne i referentnog antitela m6C8. C58A mutant narušava vezivanje svih pet antitela i verovatno je specifičan za strukturnu mutaciju a ne epitopsku. C74A mutant imao je slabu ekspresiju i nije mogao da se koristi za upoređivanje vezivanja.

[0585] Pored toga, anti-GITR antitela 231-32-15, Hum231#2, i m6C8 upoređivana su u pogledu svog vezivanja za divlji tip u poređenju sa vezivanjem za mutantni humani GITR. Ukratko, divlji tip humanog GITR i dva alaninska mutanta GITR (D60A mutant i G63A mutant, numerisani prema SEQ ID NO: 701) eksprimirani su na površini 1624-5 ćelija kao što je gore opisano i testirani protočno-citometrijskom analizom kako je opisano gore gde su ćelije prvo obojene korišćenjem 2 µg/ml monoklonskoih antitela 231-32-15, Hum231#2, i m6C8, ili poliklonskog antitela konjugovanog sa APC, i zatim obojene korišćenjem sekundarnog anti-IgG antitela ako je potrebno za detekciju (konjugovano sa APC; 1:1000; BD kat. br.109-136-097). Sve vrednosti prosečnog intenziteta fluorescencije (MFI) izračunate su kao prosek dva merenja. MFI vrednost testiranog monoklonskog antitela za određeni tip ćelije podeljen je vrednošću MFI poliklonskog antitela za isti tip ćelije, dajući ukupno devet MFI odnosa (monoklonsko antitelo/poliklonsko antitelo): MFI odnos231-32-15, WT, MFI odnosHum231#2, WT, MFI odnosm6C8, WT, MFI odnos231-32-15, D60A, MFI odnosHum231#2, D60A, MFI odnosm6C8, D60A, MFI odnos231-32-15, G63A, MFI odnosHum231#2, G63A, i MFI odnosm6C8, G63A. Procenat vezivanja antitela za GITR alaninske mutante u odnosu na divlji tip GITR izračunava se deljenjem određenog MFI odnosa za GITR alaninske mutante odgovarajućim MFI odnosom za divlji tip (npr., deljenjem MFI odnosaHum231#2, D60Asa MFI odnosomHum231#2, WT). Procenat smanjenja vezivanja određuje se izračunavanjem, npr., 100%<∗>(1-(MFI odnosHum231#2, D60A/MFI odnosHum231#2, WT)).

[0586] Kao što je prikazano na Slici 34B, D60A mutant i G63A mutant specifično narušavaju ili slabe vezivanje 231-32-15 i Hum231#2, ali ne i vezivanje m6C8. Procenti prikazani na Slici 34B su procenti GITR-pozitivnih ćelija na svakom dijagramu. Kada se testiranje vrši korišćenjem ćelija koje eksprimiraju GITR D60A, vezivanje antitela se smanjuje za 82% i 88% za 231-32-15, odnosno Hum231#2, u poređenju sa 10% smanjenja za m6C8. Slično tome, kada se testiranje vrši korišćenjem ćelija koje eksprimiraju GITR G63A, vezivanje 231-32-15 i Hum231#2 smanjuje se za 37%, odnosno 59%, dok se vezivanje m6C8 povećava za 62%.

[0587] Kao dodatni dokaz za karakteristike vezivanja anti-GITR antitela, upoređivano je vezivanje antitela za GITR cinomolgusa. Nezreli protein GITR cinomolgusa sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 704. Da bi se povećala ekspresija proteina, prva rezidua signalnog peptida cinomolgusovog GITR zameni se metioninom, dajući VIM GITR cinomolgusa. Zatim je stvoren mutantni cinomolgusov GITR V1M/Q62P/S63G, u kojem su aminokiselinske rezidue na pozicijama 62 i 63 (GlnSer), numerisane prema SEQ ID NO: 704, zamenjene odgovarajućim reziduama u humanom GITR (ProGly). Slika 35A je poravnavanje sekvenci između humanog GITR, VIM cinomolgusovog GITR, i V1M/Q62P/S63G cinomolgusovog GITR. Tri proteina prikazana na Slici 35A eksprimiraju se na površini 1624-5 ćelija kako je opisano gore i testiraju u protočno-citometrijskoj analizi kako je opisano gore gde se ćelije prvo boje korišćenjem 2 µg/ml monoklonskih antitela 231-32-15, Hum231#2, i m6C8, ili poliklonskog antitela konjugovanog sa APC, i zatim boje korišćenjem sekundarnog anti-IgG antitela (konjugovanog sa APC; 1:1000; BD kat. br.109-136-097).

[0588] Kao što je pokazano na Slici 35B, anti-GITR antitela 231-32-15 i Hum231#2 pokazuju vezivanje samo za ćelije koje eksprimiraju V1M/Q62P/S63G GITR cinomolgusa, ali ne i za ćelije koje eksprimiraju VIM GITR cinomolgusa.

6.7 Primer 7: Tretiranje T ćelija in vitro agonističkim anti-GITR antitelima praćeno infuzijom T ćelija

[0589] T ćelije koje eksprimiraju GITR, što ukazuje na aktivirano stanje, mogu se dodatno aktivirati da ubiju ciljne ćelije, kao što su tumorske ćelije, ako se kultivišu sa GITR agonističkim antitelom, npr., Hum231#1, Hum231#2, Hum231#2w, ili drugim GITR agonističkim antitelom opisnaim ovde, pre infuzije u subjekta, npr., humanog subjekta koji ima kancer.

[0590] Nivo ekspresije GITR na T ćelijama izolovanim iz subjekta, npr., humanog subjekta, procenjuje se standardnim tehnikama, npr., FACS analizom. Izvor T ćelija je, npr., periferna krv, uzorak dobijen biopsijom/operacijom limfnog čvora koji drenira mesto tumora, ili uzorak dobijen biopsijom/operacijom samog tumora u kojem se mogu nalaziti infiltrirane T ćelije. T ćelije se izoluju, npr., iz ukupnih PBMC, limfnog tkiva ili tumorskog tkiva standardnim tehnikama. Ako se zapazi da se GITR eksprimira na površini T ćelija, ćelije mogu da se inkubiraju sa GITR agonističkim antitelom, npr., Hum231#1, Hum231#2, Hum231#2w, ili drugim GITR agonističkim antitelom opisanim ovde, u koncentracijama u rasponu od, npr., 1 µg/ml do 1 mg/ml, u trajanju od, npr., 30 minuta, 1 sata, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 6, sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, ili 72 sata, praćeno, npr., intravenskom infuzijome T ćelija u subjekta.

[0591] Ako se ne zapazi da se GITR eksprimira na T ćelijama izolovanim iz subjekta, njegova ekspresija može da se indukuje koinkubacijom T ćelija sa sredstvom koje stimuliše TCR kompleks, kao što je npr., fitohemaglutinin (PHA) i/ili forbol miristat acetat (PMA), ili antitelo koje stimuliše TCR kompleks, kao što je anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo, (u koncentracijama u rasponu od, npr., 1 µg/ml do 1 mg/ml, tokom, npr., 30 minuta, 1 sata, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 6, sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, ili 72 sata). Alternativno, poželjno može biti da se T ćelije prvo inkubiraju samo sa anti-CD3 antitelom što je praćeno dodavanjem agonističkog GITR antitela 30 minuta, 1 sat, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 6, sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, ili 72 sata kasnije. Isto tako može biti poželjno da se T ćelije stimulišu tumorskim antigenom, npr., u obliku peptida ili proteina, u prisustvu antigen-prezentujućih ćelija da bi se izvršila aktivacija i ekspanzija broja tumor-specifičnih T ćelija. Posle stimulacije antigenom, T ćelije mogu da se kultivišu sa GITR agonističkim antitelom da bi se pojačao njihov status aktivacije pre infuzije.

[0592] T ćelije mogu da se daju infuzijom subjektu tokom perioda od, npr., 30 minuta, 1 sata, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 6, sati, 12 sati, ili 24 sata, i mogu se dati subjektu infuzijom jednom, dva, tri, četiri ili više puta, npr., sa razmacima od 1, 2, 3, ili 4 nedelje, ili 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 meseci. Broj T ćelija unetih infuzijom može se odrediti standardnim eksperimentalnim postupcima i može uključivati, npr., 1×10<6>ćelija, 1×10<7>ćelija, 1×10<8>ćelija, 1×10<9>ćelija ili više.

[0593] U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije mogu da se dovedu u kontakt sa sredstvom kao što je mitogen (npr., PHA) ili citokin (npr., IL-2) da se nespecifično ekspandira populacija T ćelija pre, tokom, ili posle lečenja GITR agonističkim antitelom.

[0594] U nekim tehničkim rešenjima, T ćelije mogu da se dovedu u kontakt sa dodatnim agonistom pored GITR agonističkog antitela, npr., OX40 agonističkim antitelom.

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano agonističko antitelo koje se specifično vezuje za humani glukokortikoidomindukovani sa TNFR povezani protein (GITR) koje sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO (SEK ID BR): 206 i koje sadrži varijabilni region (VL) lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 208, pri čemu antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca.

2. Antitelo iz patentnog zahteva 1, pri čemu konstantni region teškog lanca je humani imunoglobulin IgG1.

3. Antitelo iz patentnog zahteva 1, pri čemu konstantni region teškog lanca je humani imunoglobulin IgG4.

4. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 ili 2, koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 567, i/ili koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 576.

5. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 ili 3, koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 554, i/ili koje sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 576.

6. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, pri čemu antitelo indukuje, aktivira ili poboljšava aktivnost humanog GITR-a, po izboru u ćeliji nezavisnoj od TCR okidanja.

7. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira VH i/ili VL, ili laki lanac i/ili teški lanac, antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6

8. Izolovani molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 7, koji kodira VH antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6 ili koji kodira težak lanac antitela iz bilo kog od patentnih zahteva

9. Izolovani molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 7, koji kodira VL antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6 ili koji kodira laki lanac antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6

10. Izolovani molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 7, koji kodira VH i VL antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6 ili koji kodira laki lanac i teški lanac antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6

11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6 ili molekul nukleinske kiseline iz bilo kog od patentnih zahteva 7-10, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

12. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6 farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 11 za primenu u lečenju kancera.

13. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za primenu iz patentnog zahteva 12, pri čemu kancer je kancer endometrijuma, kancer želuca, kancer stomaka, kancer jednjaka, karcinom gastroezofagealnog spoja, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata, melanom, nesitnoćelijski kancer pluća, ili karcinom bubrežnih ćelija.

14. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 11 za primenu u lečenju virusne infekcije.

15. Antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, pri čemu antitelo je bispecifično.

16. Izolovani vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz bilo kog od patentnih zahteva 7-10.

17. Izolovani vektor iz patentnog zahteva 16, koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 8.

18. Izolovani vektor iz patentnog zahteva 16, koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 9.

1

19. Izolovani vektor iz patentnog zahteva 16, koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 10.

20. Populacija vektora koja sadrži prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira laki lanac ili VL antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, i drugi vektor koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira težak lanac ili VH antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6.

21. Ćelija domaćina koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz bilo kog od patentnih zahteva 7-10, ili izolovani vektor iz bilo kog od patentnih zahteva 16-19, ili populacija vektora iz patentnog zahteva 20.

22. Ćelija domaćina iz patentnog zahteva 21, koja sadrži:

(i) izolovanu nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 8, pri čemu izolovana nukleinska kiselina kodira VH antitela iz patentnog zahteva 4 ili kodira težak lanac antitela iz patentnog zahteva 4, i izolovanu nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 9, pri čemu izolovana nukleinska kiselina kodira VL antitela iz patentnog zahteva 4 ili kodira laki lanac antitela patentnog zahteva 4, ili

(ii) izolovanu nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 10, pri čemu izolovana nukleinska kiselina kodira VH i VL antitela iz patentnog zahteva 4, ili kodira laki lanac i težak lanac antitela iz patentnog zahteva 4, ili

(iii) izolovani vektor iz patentnog zahteva 17, pri čemu izolovani vektor sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira VH antitela iz patentnog zahteva 4 ili koji kodira težak lanac antitela iz patentnog zahteva 4, i izolovani vektor iz patentnog zahteva 18, pri čemu izolovani vektor sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira VL antitela iz patentnog zahteva 4 ili koji kodira laki lanac antitela iz patentnog zahteva 4, ili (iv) izolovani vektor iz patentnog zahteva 19, pri čemu izolovani vektor sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira VH antitela iz patentnog zahteva 4 i VL antitela iz patentnog zahteva 4, ili pri čemu izolovani vektor sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac antitela iz patentnog zahteva 4 i težak lanac antitela iz patentnog zahteva 4, ili

(v) populaciju vektora iz patentnog zahteva 20, pri čemu populacija vektora sadrži prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira laki lanac ili VL antitela iz patentnog zahteva 4, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira težak lanac ili VH antitela iz patentnog zahteva 4.

2

23. Ćelija domaćina iz patentnog zahteva 21, pri čemu

a) ćelija domaćina sadrži vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira težak lanac i laki lanac antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, ili

b) ćelija domaćina sadrži dva različita vektora, prvi vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac ili varijabilni region teškog lanca antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, i drugi vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac ili varijabilni region lakog lanca antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6.

24. Ćelija domaćina iz patentnog zahteva 21, pri čemu molekul nukleinske kiseline kodira laki lanac i/ili teški lanac antitela iz patentnog zahteva 4, ili pri čemu vektor(i) sadrži(sadrže) molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac i/ili teški lanac antitela iz patentnog zahteva 4.

25. Ćelija domaćina iz patentnog zahteva 21, pri čemu molekul nukleinske kiseline kodira laki lanac i/ili teški lanac antitela iz patentnog zahteva 5, ili pri čemu izolovani vektor(i) sadrži(sadrže) molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac i/ili teški lanac antitela iz patentnog zahteva 5.

26. Ćelija domaćina iz bilo kog od patentnih zahteva 21-25, koja je CHO ćelija.

27. Postupak proizvodnje agonističkog antitela koje se vezuje za humani GITR koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina iz bilo kog od patentnih zahteva 21-26, tako da molekul nukleinske kiseline(molekuli nukleinskih kiselina) je/su eksprimiran/i i antitelo je proizvedeno.

28. Postupak proizvodnje agonističkog antitela koje se vezuje za humani GITR iz patentnog zahteva 27, koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina iz patentnog zahteva 22 ili 24, pri čemu ćelija domaćina je CHO ćelija.

29. Postupak proizvodnje antitela koje se vezuje za humani GITR iz patentnog zahteva 27, koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina iz patentnog zahteva 25, pri čemu ćelija domaćina je CHO ćelija.

30. Postupak proizvodnje agonističkog antitela koje se vezuje za humani GITR iz patentnog zahteva 27, pri čemu prva ćelija domaćina sadrži prvi vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac ili varijabilni region teškog lanca antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, i druga ćelija domaćina sadrži drugi vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac ili varijabilni region lakog lanca antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, i pri čemu se težak lanac ili varijabilni region teškog lanca eksprimiran od strane prve ćelije udružuje sa lakim lancem ili varijabilnim regionom lakog lanca druge ćelije, da bi se formiralo antitelo.

4