RS62749B1 - Anti-c5 antitela i načini njihove upotrebe - Google Patents

Anti-c5 antitela i načini njihove upotrebe

Info

Publication number
RS62749B1
RS62749B1 RS20211548A RSP20211548A RS62749B1 RS 62749 B1 RS62749 B1 RS 62749B1 RS 20211548 A RS20211548 A RS 20211548A RS P20211548 A RSP20211548 A RS P20211548A RS 62749 B1 RS62749 B1 RS 62749B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
antibodies
hvr
Prior art date
Application number
RS20211548A
Other languages
English (en)
Inventor
Yoshinao Ruike
Zenjiro Sampei
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of RS62749B1 publication Critical patent/RS62749B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)

Description

Opis
Ovaj opis se generalno odnosi na anti-C5 antitela i načine njihove upotrebe. Ovaj pronalazak se odnosi na antitelo koje se vezuje za C5, pri čemu se to antitelo vezuje za epitop unutar fragmenta C5, koji se sastoji od aminokiselina 19 do 180 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40) sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini u odnosu na kiselu pH sredinu, gde His70 i His110 doprinose zavisnosti od pH vrednosti, i gde se antitelo takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL odabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO: 1 i VL iz SEQ ID NO: 11; (b) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO: 15; (c) VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 14; (d) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16; (e) VH iz SEQ ID NO: 2 i VL iz SEQ ID NO: 12; (f) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (g) VH iz SEQ ID NO: 9 i VL iz SEQ ID NO: 19; (h) VH iz SEQ ID NO: 7 i VL iz SEQ ID NO: 17; (i) VH iz SEQ ID NO: 8 i VL iz SEQ ID NO: 18; i (j) VH iz SEQ ID NO: 10 i VL iz SEQ ID NO: 20.
Stanje tehnike
Sistem komplementa igra centralnu ulogu u uklanjanju imunoloških kompleksa i u imunološkom odgovoru na infektivne agense, strane antigene, ćelije zaražene virusom i ćelije tumora. Postoji oko 25-30 proteina komplementa, koji se nalaze kao složena kolekcija proteina u plazmi i kofaktori membrane.
Komponente komplementa postižu svoje imunološke odbrambene funkcije interakcijom u seriji zamršenih enzimskih cepanja i slučajevima vezivanja za membranu. Rezultujuće kaskade komplementa dovode do stvaranja proizvoda sa opsoničnim, imunoregulatornim i litičkim funkcijama.
Trenutno je opšte prihvaćeno da se sistem komplementa može aktivirtati kroz tri različita puta: klasičnim putem, lektinskim putem i alternativnim putem. Ovi putevi dele mnoge komponente i, iako se razlikuju u početnim koracima, konvergiraju i dele iste završne komponente komplementa (C5 do C9) odgovorne za aktivaciju i uništenje ciljnih ćelija.
Klasični put se normalno aktivira stvaranjem kompleksa antigen-antitelo. Nezavisno, prvi korak u aktivaciji lektinskog puta je vezivanje specifičnih lektina, kao što su manan vezujući lektin (MBL), H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin i C-tip lektina CL-11. Nasuprot tome, alternativni put spontano prolazi kroz nizak nivo aktivacije preokreta, koji se lako može pojačati na stranim ili drugim abnormalnim površinama (bakterije, kvasac, ćelije zaražene virusom ili oštećeno tkivo). Ovi putevi konvergiraju na mestu gde se komponenta komplementa C3 cepa dejstvom aktivne proteaze da bi se dobili C3a i C3b.
C3a je anafilatoksin. C3b se vezuje za bakterijske i druge ćelije, kao i za određene viruse i imunološke komplekse, i označava ih za uklanjanje iz cirkulacije (uloga poznata kao opsonizacija). C3b takođe formira kompleks sa drugim komponentama da se sintetiše C5 konvertaza, koja cepa C5 na C5a i C5b.
C5 je 190 kDa protein koji se nalazi u normalnom serumu sa približno 80 mikrograma/ml (0,4 mikro M). C5 je glikoziliran, pri čemu se oko 1,5-3% njegove mase pripisuje ugljenim hidratima. Zreli C5 je heterodimer od 115 kDa alfa lanca koji je disulfid povezan sa 75 kDa beta lancem. C5 se sintetiše kao prekursorski protein sa jednim lancem (pro-C5 prekursor) od 1676 aminokiselina (videti , na primer, PTL1 i PTL2). Pro-C5 prekursor se cepa da bi se dobio beta lanac kao završni amino fragment i alfa lanac kao završni karboksilni fragment. Polipeptidni fragmenti alfa lanca i beta lanca su međusobno povezani disulfidnom vezom i čine zreli C5 protein.
Zreli C5 se cepa na fragmente C5a i C5b tokom aktivacije puteva komplementa. C5a se cepa od alfa lanca C5 dejstvom C5 konvertaze kao završni amino fragment koji sadrži prvih 74 aminokiselina alfa lanca. Preostali deo zrelog C5 je fragment C5b, koji sadrži ostatak alfa lanca sa disulfidnim vezama za povezivanje sa beta lancem. Približno 20% mase 11 kDa C5a pripada ugljenim hidratima.
C5a je još jedan anafilatoksin. C5b se kombinuje sa C6, C7, C8 i C9 da bi formirao kompleks za napad na membranu (MAC, C5b-9, terminalni kompleks komplementa (TCC)) na površini ciljne ćelije. Kada se dovoljan broj MAC-ova ugradi u membrane ciljnih ćelija, formiraju se MAC pore da posreduju u brzoj osmotskoj lizi ciljnih ćelija.
Kao što je napred pomenuto, C3a i C5a su anafilotoksini. Oni mogu pokrenuti degranulaciju mastocita, koja oslobađa histamin i druge posrednike upale, što rezultira kontrakcijom glatkih mišića, povećanom vaskularnom propustljivošću, aktivacijom leukocita i drugim zapaljenskim fenomenima, uključujući i ćelijsku proliferaciju koja rezultira hipercelularnošću. C5a takođe funkcioniše kao hemotaktički peptid koji služi da privuče granulocite, kao što su neutrofili, eozinofili, bazofili i monociti, na mesto aktivacije komplementa.
Aktivnost C5a je regulisana enzimom karboksipeptidaza N u plazmi, koji uklanja karboksi-terminalni arginin iz C5a formirajući derivat C5a-des-Arg. C5ades-Arg ispoljava samo 1% anafilaktičke aktivnosti i polimorfonuklearne hemotaktičke aktivnosti nemodifikovanog C5a.
Iako sistem komplementa koji pravilno funkcioniše pruža snažnu odbranu protiv infekcije mikroorganizmima, neodgovarajuća regulacija ili aktivacija komplementa implicira patogenezu različitih poremećaja, uključujući i, na primer, reumatoidni artritis (RA); lupusni nefritis; ishemijsko-reperfuziono oštećenje; paroksizmalnu noćnu hemoglobinuriju (PNH); atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS); bolest gustog depozita (DDD); makularnu degeneraciju (na primer, starosnu makularnu degeneraciju (AMD)); hemolizu, sindrom povišenog nivoa enzima jetre i niskog broja trombocita (HELLP); trombotičnu trombocitopenijsku purpuru (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauciimunološki vaskulitis; buloznu epidermolizu; ponavljani gubitak fetusa; multiplu sklerozu (MS); traumatska oštećenja mozga; i oštećenja kao posledice infarkta miokarda, kardiopulmonalni bajpas i hemodijalizu (videti, npr. NPL1). Zbog toga, inhibicija prekomerne ili nekontrolisane aktivacije kaskade komplementa može pružiti klinički boljitak pacijentima sa takvim poremećajima.
Paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH) je neuobičajen poremećaj krvi, pri čemu su crvena krvna zrnca kompromitovana, zbog čega se uništavaju brže u odnosu na normalna crvena krvna zrnca. PNH je rezultat klonske ekspanzije hematopoetskih matičnih ćelija sa somatskim mutacijama u genu PIG-A (fosfatidilinozitol glikan klase A), koji se nalazi na X hromozomu. Mutacije u PIG-A dovode do ranog zaustavljanja u procesu sinteze glikozilfosfatidilinozitol (GPI), molekula koji je potreban za sidrenje mnogih proteina na ćelijske površine. Sledstveno tome, krvne ćelije u PNH imaju nedostatak proteina koji se mogu usidriti preko GPI, što uključuje i CD55 i CD59, regulatorne proteine komplementa. U normalnim okolnostima, ovi proteini koji regulišu komplement, blokiraju stvaranje MAC na ćelijskim površinama, sprečavajući tako lizu eritrocita. Odsustvo GPI usidrenih proteina izaziva komplementom posredovanu hemolizu u PNH.
PNH karakterišu hemolitička anemija (smanjen broj crvenih krvnih zrnaca), hemoglobinurija (prisustvo hemoglobina u urinu, naročito evidentno posle spavanja) i hemoglobinemija (prisustvo hemoglobina u krvotoku). Poznato je da osobe obolele od PNH, imaju paroksizme, koji su ovde definisani kao pojavljivanja tamno prebojenog urina. Hemolitička anemija nastaje usled intravaskularnog uništavanja crvenih krvnih zrnaca komponentama komplementa. Drugi poznati simptomi uključuju disfaziju, umor, erektilnu disfunkciju, trombozu i rekurentni bol u trbuhu.
Ekulizumab je humanizovano monoklonsko antitelo usmereno protiv C5 proteina komplementa i prva odobrena terapija za lečenje paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH) i atipičnog hemolitičkog uremijskog sindroma (aHUS) (videti, npr. NPL2). Ekulizumab inhibira cepanje C5 na C5a i C5b pomoću C5 konvertaze, koja sprečava stvaranje završnog kompleksa komplementa C5b-9. I C5a i C5b-9 uzrokuju događaje posredovane završnim komplementom koji su karakteristični za PNH i aHUS (videti, takođe, PTL3, PTL4, PTL5 i PTL6).
Nekoliko izveštaja opisuje anti-C5 antitela. Na primer, u WO 95/29697 (PTL7) je opisano anti-C5 antitelo koje se vezuje za alfa lanac C5, ali se ne vezuje za C5a i blokira aktivaciju C5, dok je u WO 2002/30985 (PTL8) opisano anti-C5 monoklonsko antitelo koje inhibira stvaranje C5a. S druge strane, u WO 2004/007553 (PTL9), opisano je anti-C5 antitelo koje prepoznaje proteolitičko mesto za C5 konvertazu na alfa lancu C5 i inhibira konverziju C5 u C5a i C5b. U WO 2010/015608 (PTL10), opisano je anti-C5 antitelo koje ima konstantu afiniteta od najmanje 1 x 10<7>M<-1>.
Antitela (IgG) se vezuju za neonatalni Fc receptor (FcRn) i imaju dugo vreme zadržavanja u plazmi. Vezivanje IgG za FcRn se tipično primećuje u kiselim uslovima (npr. pH 6,0), a retko u neutralnim uslovima (npr. pH 7,4). Tipično, IgG se nespecifično ugrađuju u ćelije putem endocitoze, i vraćaju se na ćelijske površine vezivanjem za endozomalni FcRn pod kiselim uslovima u endozomima. Zatim se IgG odvajaju od FcRn pod neutralnim uslovima u plazmi. IgG, koji ne uspeju da se vežu za FcRn, razgrađuju se u lizozomima. Kada se sposobnost vezivanja FcRn IgG u kiselim uslovima eliminiše uvođenjem mutacija u njegovu Fc oblast, IgG se ne reciklira iz endozoma u plazmu, što dovodi do značajnog poremećaja zadržavanja IgG u plazmi. Objavljena je metoda koja poboljšava zadržavanje IgG u plazmi, pojačavanjem vezivanja za njihovu FcRn u kiselim uslovima. Kada se poboljša vezivanje FcRn antitela IgG u kiselim uslovima, uvođenjem supstitucije aminokiseline u njihov Fc region, IgG se efikasnije reciklira iz endozoma u plazmu i time pokazuje poboljšanje zadržavanja u plazmi. Kada se poboljša FcRn vezivanje IgG u kiseloj sredini uvođenjem supstitucije aminokiseline u regionu Fc, IgG se efikasnije recikliraju iz endozoma u plazmu i tako pokazuju poboljšano zadržavanje u plazmi. U međuvremenu, takođe je objavljeno da se IgG sa pojačanim vezivanjem FcRn u neutralnoj sredini ne odvaja od FcRn u neutralnoj sredini u plazmi, čak i kada se vraća na ćelijsku površinu vezivanjem za FcRn u kiseloj sredini u endozomima, pa posledično njegovo zadržavanje u plazmi ostaje nepromenjeno ili, bolje rečeno, pogoršava se (videti, npr. NPL3; NPL4; NPL5).
Nedavno je izvešteno o antitelima koja se vezuju za antigene na način zavisan od pH (videti, npr. PTL11 i PTL12). Ova antitela se snažno vezuju za antigene u neutralnim uslovima u plazmi i odvajaju od antigena u kiselim uslovima endozoma. Posle odvajanja od antigena, antitela ponovo postaju sposobna da se vezuju za antigene, kada se recikliraju u plazmu putem FcRn. Tako se jedan molekul antitela može ponavljano vezivati za više molekula antigena. Generalno, zadržavanje antigena u plazmi je mnogo kraće od zadržavanja antitela, koje ima napred pomenuti mehanizam recikliranja posredovan FcRn. Stoga, kad je antigen vezan za antitelo, antigen obično pokazuje produženo zadržavanje u plazmi, što dovodi do povećanja koncentracije antigena u plazmi. S druge strane, objavljeno je da napred opisana antitela, koja se vezuju za antigene na pH zavisan način, brže uklanjaju antigene iz plazme nego tipična antitela jer se odvajaju od antigena unutar endozoma tokom FcRn posredovanog procesa recikliranja. U WO 2011/111007 (PTL13) je takođe opisana analiza kompjuterskog modeliranja, koja pokazuje da antitelo sa pH zavisnim vezivanjem, usmerenim protiv C5, može produžiti uništavanje antigena.
Reference
Patentna literatura
[PTL1] US Patent No. 6,355,245
[PTL2] US Patent No. 7,432,356
[PTL3] WO2005/074607
[PTL4] WO 2007/106585
[PTL5] WO 2008/069889
[PTL6] WO 2010/054403
[PTL7] WO 95/29697
[PTL8] WO 2002/30985
[PTL9] WO 2004/007553
[PTL 10] WO 2010/015608
[PTL11] WO 2009/125825
[PTL12] WO 2011/122011
[PTL13] WO 2011/111007
Nepatentna literatura
[NPL1] Holers et al., Immunol. Rev. 223:300-316 (2008)
[NPL2] Dmytrijuk et al., The Oncologist 13(9):993-1000 (2008) [NPL3] Yeung et al., J Immunol. 182(12): 7663-7671 (2009) [NPL4] Datta-Mannan et al., J Biol. Chem. 282(3):1709-1717 (2007) [NPL5] Dall’Acqua et al., J. Immunol. 169(9):5171-5180 (2002)
Rezime pronalaska
Pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela i izložen je u priloženom setu patentnih zahteva.
U nekim izvođenjima ovog pronalaska, izolovano anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar fragmenta aminokiselina 19-180 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40). U nekim izvođenjima ovog pronalaska, izolovano anti-C5 antitelo se vezuje za epitop u okviru MG1-MG2 domena beta lanca C5. U nekim izvođenjima ovog pronalaska, izolovano anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 33-124 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40). U nekim izvođenjima ovog pronalaska, izolovano anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar beta lanca (SEQ ID NO: 40) koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz grupe koju čine aminokiseline 47-57, 70-76 i 107-110. U nekim izvođenjima ovog pronalaska, izolovano anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar fragmenta beta lanca (SEQ ID NO: 40) koji sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110 iz SEQ ID NO: 40. U daljim izvođenjima, to antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U daljim izvođenjima, to antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8. U drugom izvođenju, izolovano anti-C5 antitelo ovog pronalaska se vezuje za isti epitop kao i antitelo opisano u Tabeli 2. U daljim izvođenjima, antitelo se vezuje za isti epitop kao i antitelo opisano u Tabeli 2 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8. U daljem izvođenju, anti-C5 antitelo ovog pronalaska vezuje se za isti epitop kao i antitelo opisano u Tabelama 7 ili 8. U daljim izvođenjima, antitelo se vezuje za isti epitop kao i antitelo opisano u Tabelama 7 ili 8 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
U kontekstu ovog pronalaska, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje za C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran od: (a) VH iz SEQ ID NO:1 i VL iz SEQ ID NO: 11; (b) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO:15; (c) VH iz SEQ ID NO:4 i VL iz SEQ ID NO:14; (d) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16; (e) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO: 12; (f) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (g) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO:19; (h) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO: 17; (i) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO: 18; i (j) VH iz SEQ ID NO: 10 i VL iz SEQ ID NO:20. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
U nekim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, izolovano anti-C5 antitelo iz ovog otkrića ima karakteristiku odabranu iz grupe koju čine: (a) antitelo stupa u kontakt sa aminokiselinama D51 i K109 iz C5 (SEQ ID NO:39); (b) afinitet antitela za C5 (SEQ ID NO:39) je veći od antitela za mutant C5 koji sadrži supstituciju E48A iz SEQ ID NO:39; ili (c) antitelo se vezuje za C5 protein koji se sastoji od sekvence aminokiselina iz SEQ ID NO:39 pri pH 7,4, ali se ne vezuje za C5 protein koji se sastoji od sekvence aminokiselina iz SEQ ID NO:39 sa supstitucijom H72Y pri pH 7,4. U daljim izvođenjima, antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U daljim izvođenjima, antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
1
U nekim izvođenjima, izolovano anti-C5 antitelo iz ovog pronalaska inhibira aktivaciju C5. U nekim izvođenjima, izolovano anti-C5 antitelo ovog pronalaska inhibira aktivaciju C5 varijante R885H. U nekim izvođenjima, izolovano anti-C5 antitelo ovog pronalaska je monoklonsko antitelo. U nekim izvođenjima, izolovano anti-C5 antitelo ovog pronalaska je humano, humanizovano ili himerično antitelo. U nekim izvođenjima, izolovano anti-C5 antitelo ovog pronalaska je fragment antitela koje se vezuje za C5. U nekim izvođenjima, izolovano anti-C5 antitelo ovog pronalaska je IgG1 ili IgG4 antitelo pune dužine.
U nekim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, izolovano anti-C5 antitelo ovog otkrića sadrži (a) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina DX1GYX2X3PTHAMX4X5, gde je X1G ili A, X2je V, Q ili D, X3je T ili Y, X4je Y ili H, X5je L ili Y (SEQ ID NO: 128), (b) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina QX1TX2VGSSYGNX3, gde je X1S, C, N ili T, X2je F ili K, X3je A, T ili H (SEQ ID NO: 131), i (c) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG, gde je X1C, A ili G, X2je Y ili F, X3je T, D ili E, X4je Y, K ili Q, X5je S, D ili E, X6je A ili V (SEQ ID NO: 127).
U nekim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, izolovano anti-C5 antitelo ovog otkrića sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SSYYX1X2, gde je X1M ili V, X2je C ili A (SEQ ID NO: 126), (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina X1IX2TGSGAX3YX4AX5WX6KG, gde je X1C, A ili G, X2je Y ili F, X3je T, D ili E, X4je Y, K ili Q, X5je S, D ili E, X6je A ili V (SEQ ID NO:127), i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina DX1GYX2X3PTHAMX4X5, gde je X1G ili A, X2je V, Q ili D, X3je T ili Y, X4je Y ili H, X5je L ili Y (SEQ ID NO: 128). U daljim izvođenjima, to antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina X1ASQX2IX3SX4LA, gde je X1Q ili R, X2je N, Q ili G, X3je G ili S, X4je D, K ili S (SEQ ID NO: 129); (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina GASX1X2X3S, gde je X1K, E ili T, X2je L ili T, X3je A, H, E ili Q (SEQ ID NO: 130); i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina QX1TX2VGSSYGNX3, gde je X1S, C, N ili T, X2je F ili K, X3je A, T ili H (SEQ ID NO: 131).
U nekim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, izolovano anti-C5 antitelo ovog otkrića sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina X1ASQX2IX3SX4LA, gde je X1Q ili R, X2je N, Q ili G, X3je G ili S, X4je D, K ili S (SEQ ID NO: 129); (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina GASX1X2X3S, gde je X1K, E ili T, X2je L ili T, X3je A, H, E ili Q (SEQ ID NO: 130); i (c) aHVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina QX1TX2VGSSYGNX3, gde je X1S, C, N ili T , X2je F ili K, X3je A, T ili H (SEQ ID NO: 131).
U nekim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, okvir varijabilnog domena teškog lanca izolovanog anti-C5 antitela iz ovog otkrića sadrži FR1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 132-134; FR2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 135-136; FR3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 137-139; i FR4 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 140-141. U nekim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, okvir varijabilnog domena lakog lanca izolovanog anti-C5 antitela iz ovog otkrića, sadrži FR1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 142-143; FR2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 144-145; FR3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 146-147; i FR4 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NO: 148.
U nekim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, izolovano anti-C5 antitelo iz ovog otkrića sadrži (a) VH sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 10, 106-110; (b) VL sekvencu koja je najmanje 95% identična sekvenci aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 20, 111-113; ili (c) VH sekvencu kao iz (a) i VL sekvencu kao iz (b). U daljim izvođenjima, to antitelo sadrži VH sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 10, 106-110. U daljim izvođenjima, antitelo sadrži VL sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 20, 111-113.
Ovo otkriće navodi, samo u svrhe ilustrovanja, antitelo koje sadrži VH sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 10, 106-110 i VL sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 20, 111-113.
Pronalazak takođe navodi izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju anti-C5 antitelo ovog pronalaska. Pronalazak takođe navodi ćelije domaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu ovog pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina tako da se proizvodi antitelo.
Dalje, otkriće navodi, samo u svrhe ilustrovanja, postupak za proizvodnju anti-C5 antitela. U nekim izvođenjima, taj postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži MG1-MG2 domen (SEQ ID NO: 43) beta lanca C5. U nekim izvođenjima, postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži region koji odgovara aminokiselinama na pozicijama 33 do 124 beta lanca SEQ ID NO: 40) C5. U nekim izvođenjima, postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži najmanje jedan fragment izabran između aminokiselina 47-57, 70-76 i 107-110 beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5. U nekim izvođenjima, postupak obuhvata imunizaciju životinje protiv polipeptida koji sadrži fragment beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5, koji
1
sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu između Glu48, Asp51, His70, His72, Lys 109 i His110.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja obuhvata anti-C5 antitelo ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na:
[1] Antitelo koje se vezuje za C5, pri čemu se antitelo vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 19 do 180 beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini, pri čemu His70 i His110 doprinose pH zavisnosti, i pri čemu se antitelo takmiči za vezivanje C5, sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran između:
(a) VH iz SEQ ID NO: 1 i VL iz SEQ ID NO: 11;
(b) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO: 15;
(c) VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 14;
(d) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16;
(e) VH iz SEQ ID NO: 2 i VL iz SEQ ID NO: 12;
(f) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13;
(g) VH iz SEQ ID NO: 9 i VL iz SEQ ID NO: 19;
(h) VH iz SEQ ID NO: 7 i VL iz SEQ ID NO: 17;
(i) VH iz SEQ ID NO: 8 i VL iz SEQ ID NO: 18; i
(j) VH iz SEQ ID NO: 10 i VL iz SEQ ID NO: 20.
[2] Antitelo iz [1], pri čemu se antitelo vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
[3] Antitelo iz [1] ili [2], pri čemu se antitelo vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 33 do 124 beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5.
[4] Antitelo iz bilo kog od [1] do [3], pri čemu se antitelo vezuje za epitop unutar beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz grupe koju čine 47 do 57, 70 do 76 i 107 do 110.
[5] Antitelo iz bilo kog od [1] do [4], pri čemu se antitelo vezuje za epitop unutar beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110.
[6] Antitelo iz bilo kog od [1] do [5], koje inhibira aktivaciju C5 i/ili aktivaciju C5 varijante R885H.
[7] Antitelo iz bilo kog od [1] do [6], koje je
(a) monoklonsko antitelo;
(b) humano, humanizovano ili himerično antitelo; i/ili (c) fragment antitela koji se vezuje za C5.
[8] Antitelo iz bilo kog od [1] do [7], koje je IgG1 ili IgG4 antitelo pune dužine.
[9] Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo iz bilo kog od [1] do [8].
[10] Ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu iz [9].
[11] Postupak za proizvodnju antitela iz bilo kog od [1] do [8], koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina iz [10] tako da se proizvodi antitelo.
[12] Farmaceutska formula koja sadrži antitelo iz bilo kog od [1] do [8] i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[13] Antitelo iz bilo kog od [1] do [8] za upotrebu u postupku lečenja bolesti izabranih iz grupe koju čine reumatoidni artritis (RA); lupusni nefritis; ishemijsko-reperfuziono oštećenje; paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH); atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS); bolest gustog depozita (DDD); makularna degeneracija; hemoliza, povišeni enzimi jetre i sindrom niskog broja trombocita (HELLP); trombotična trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauci-imuni vaskulitis; bulozna epidermoliza; rekurentni-ponavljajući gubitak fetusa; multipla skleroza (MS); traumatska povreda mozga; oštećenje nastalo usled infarkta miokarda, kardiopulmonalnog bajpasa i hemodijalize.
1
Kratak opis crteža
[Sl. 1]
Slika 1 ilustruje grupisanje epitopnih kompetativnih parova anti-C5 antitela, kao što je opisano u Primeru 2.2. Antitela grupisana u “bin” za isti epitop su uokvirena punom debelom linijom.
[Sl. 2A]
Slika 2A ilustruje BIACORE (registrovani zaštitini znak) senzorgrame anti-C5 antitela pri pH 7,4 (puna linija) i pri pH 5,8 (isprekidana linija) za procenu pH zavisnosti, kao što je opisano u Primeru 3.2. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538 i CFA0599 su antitela grupisana u epitop C, kao što je opisano u Primeru 2.2.
[Sl. 2B]
Slika 2B ilustruje BIACORE (registrovani žig) senzorgrame anti-C5 antitela pri pH 7,4 (puna linija) i pH 5,8 (isprekidana linija) za procenu pH zavisnosti, kao što je opisano u Primeru 3.2. CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C, a CFA0330 i CFA0341 su antitela grupisana u epitop B, kao što je opisano u Primeru 2.2. 305LO5 je humanizovano antitelo iz CFA0305, kao što je opisano u Primeru 2.3.
[Sl. 3]
Slika 3 ilustruje Western Blot analizu protiv fragmenata izvedenih iz beta lanca C5 (aminokiseline 19-180, 161-340, 321-500 i 481-660 iz SEQ ID NO:40) spojenih sa GST-oznakom, kao što je opisano u Primeru 4.1. CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C. Anti-GST antitelo je pozitivna kontrola. Položaj GST-spojenih C5 fragmenata (46-49 kDa) je označen strelicom.
[Sl. 4]
Slika 4 ilustruje BIACORE (registrovani žig) senzorgrame anti-C5 antitela na MG1-MG2 domen beta lanca C5, kao što je opisano u Primeru 4.3. Gornji panel pokazuje rezultate CFA0305 (puna linija), CFA0307 (isprekidana linija),
1
CFA0366 (isprekidano-tačkasta linija), i ekulizumaba (tačkasta linija). Srednji panel pokazuje rezultate CFA0501 (puna linija), CFA0599 (isprekidana linija), CFA0538 (isprekidano-tačkasta linija) i ekulizumaba (tačkasta linija). Donji panel pokazuje rezultate CFA0666 (puna linija), CFA0672 (isprekidana linija), CFA0675 (isprekidano-tačkasta linija) i ekulizumaba (tačkasta linija).
CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 su antitela grupisana u epitop C. Ekulizumab je kontrolno anti-C5 antitelo.
[Sl. 5A]
Slika 5A ilustruje Western Blot analizu protiv peptidnih fragmenata izvedenih iz domena MG1-MG2 (aminokiseline 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 i 45-111 iz SEQ ID NO:40) spojenih na GST-oznaku, kao što je opisano u Primeru 4.4. Anti-GST antitelo se koristi kao antitelo za reakciju. Položaj GST-spojenih C5 fragmenata (35-37kDa) je označen strelicom.
[Sl. 5B]
Slika 5B ilustruje Western Blot analizu protiv peptidnih fragmenata izvedenih iz MG1-MG2 (aminokiseline 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 i 45-111 iz SEQ ID NO:40) spojenih na GST-oznaku, kao što je opisano u Primeru
4.4. CFA0305 se koristi kao antitelo za reakciju.
[Sl. 5C]
Slika 5C sumira reakcije vezivanja anti-C5 antitela za fragmente izvedene iz beta lanca C5, kao što je opisano u Primeru 4.4. Fragmenti za koje se vezuju anti-C5 antitela grupisana u epitop C (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675) su prikazani sivom bojom, a fragmenti za koje se ne vezuju su prikazani belom bojom.
[Sl. 6]
Slika 6 ilustruje Western Blot analizu protiv mutanata C5 tačke u kojima su E48, D51 i K109 beta lanca supstituisani alaninom (E48A, D51A i K109A, respektivno), kao što je opisano u Primeru 4.5. Na levom panelu, ekulizumab
1
(anti-C5 antitelo, “vezivo” alfa lanca) se koristi kao antitelo za reakciju, a položaj alfa lanca C5 (približno 113kDa) je označen strelicom. Na desnom panelu, CFA0305 (grupisan u epitop C, “vezivo” beta lanca) se koristi kao antitelo za reakciju, i položaj beta lanca C5 (približno 74kDa) je označen vrhom strelice.
[Sl. 7]
Slika 7 predstavlja BIACORE (registrovani žig) senzorgrame koji pokazuju interakciju ekulizumaba-F760G4 (gornji panel) ili 305LO5 (donji panel) sa C5 mutantima, kao što je opisano u Primeru 4.6. Senzorgrami su dobijeni ubrizgavanjem C5-wt (puna debela kriva), C5-E48A (kriva sa kratkim crticama), C5-D51A (kriva sa dugim crticama) i C5-K109A (puna tanka kriva), respektivno, preko površine senzora imobilisane ekulizumabom-F760G4 ili 305LO5. Ekulizumab je kontrolno anti-C5 antitelo. 305LO5 je humanizovano antitelo CFA0305 (grupisano u epitop C), kao što je opisano u Primeru 2.3.
[Sl. 8]
Slika 8 predstavlja BIACORE (registrovani zaštitini znak) senzorgrame koji pokazuju interakciju 305LO5 sa C5 His-mutantima za procenu pH-zavisnosti, kao što je opisano u Primeru 4.7. Senzorgrami su dobijeni ubrizgavanjem C5-wt (puna debela kriva), C5-H70Y (kriva sa dugim crticama), C5-H72Y (kriva sa kratkim crticama), C5-H110Y (tačkasta kriva) i C5-H70Y+H110Y (puna tanka kriva), respektivno, preko površine senzora imobilisane sa 305LO5. Kompleksima antitelo/antigen je “dozvoljeno” da se razdvoje pri pH 7,4, nakon čega je usledilo dodatno razdvajanje pri pH5,8 (pokazano strelicom) da bi se procenile interakcije zavisne od pH.
[Sl. 9A]
Slika 9A ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane lize lipozoma, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.1. Prikazani su rezultati za CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675 grupisanih u epitop C, kao što je opisano u Primeru 2.2.
[Sl. 9B]
1
Slika 9B ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane lize lipozoma, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.1. Prikazani su rezultati za antitela CFA0330 i CFA0341 grupisana u epitop B, kao što je opisano u Primeru 2.2. [Sl. 10A]
Slika 10A ilustruje inhibiciju stvaranja C5a anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.2. C5a koncentracije su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lize lipozoma, opisanog na Slici 9A.
[Sl. 10B]
Slika 10B ilustruje inhibiciju stvaranja C5a anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.2. C5a koncentracije su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lize lipozoma, opisanog na Slici 9B.
[Sl. 11]
Slika 11 ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane hemolize, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.3. Komplementi su aktivirani preko klasične putanje.
[Sl. 12]
Slika 12 ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane hemolize, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 5.4. Komplementi su aktivirani preko alternativne putanje.
[Sl. 13]
Slika 13 ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane lize lipozoma, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 8.1. Prikazani su rezultati antitela 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422 i 305LO20-SG115.
[Sl. 14]
Slika 14 ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane lize lipozoma, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 8.1. Prikazani su rezultati antitela 305LO15-SG115 i 305LO23-SG429.
[Sl. 15]
1
Slika 15 ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane lize lipozoma, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 8.1. Prikazani su rezultati antitela 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 i 305LO23-SG422.
[Sl. 16]
Slika 16 ilustruje inhibiciju stvaranja C5a, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 8.2. C5a koncentracije su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lize lipozoma, opisanog na Slici 13.
[Sl. 17]
Slika 17 ilustruje inhibiciju stvaranja C5a, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 8.2. C5a koncentracije su kvantifikovane u supernatantima dobijenim tokom testa lize lipozoma, opisanog na Slici 14.
[Sl. 18]
Slika 18 ilustruje inhibiciju aktivnosti komplementa u plazmi majmuna, anti-C5 antitelima, kao što je opisano u Primeru 8.3. Anti-C5 antitela su administrirana kinomolgus majmunima, a aktivnosti komplementa u plazmi majmuna su merene hemoliznim testom.
[Sl. 19]
Slika 19 ilustruje inhibiciju biološke aktivnosti divljeg tipa C5 (WT) i C5 varijanti (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D), anti-C5 antitelom (ekulizumab), kao što je opisano u Primeru 8.4.
[Sl. 20]
Slika 20 ilustruje inhibiciju biološke aktivnosti divljeg tipa C5 (WT) i C5 varijanti (V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D) anti-C5 antitelom (varijanta 305), kao što je opisano u Primeru 8.4.
[Sl. 21]
Slika 21 ilustruje inhibiciju komplement-aktivirane lize lipozoma, anti-C5 antitelima (BNJ441 i varijantom 305), kao što je opisano u Primeru 8.5.
[Sl. 22]
2
Slike 22A i 22B ilustruju kristalnu strukturu 305 Fab vezanog za ljudski C5 (hC5)-MG1 domen, kao što je opisano u primeru 9.6. Slika 22A prikazuje asimetričnu jedinicu. MG1 je prikazan u površinskom prikazu, a 305 Fab je prikazan u trakama (tamno siva: teški lanac, svetlo siva: laki lanac). Slika 22B prikazuje molekule 1 i 2 koji su preklopljeni (tamno sivi: molekul 1, svetlo sivi: molekul 2).
[Sl. 23A]
Slika 23A ilustruje epitop kontaktnog regiona 305 Fab na MG1 domenu, kao što je opisano u Primeru 9.6.
Slika 23A ilustruje mapiranje epitopa u sekvenci aminokiselina MG1 (tamno siva: bliže od 3,0 angstrema, svetlo siva: bliže od 4,5 angstrema).
[Sl. 23B]
Slika 23B ilustruje epitop kontaktnog regiona 305 Fab na MG1 domenu, kao što je opisano u Primeru 9.6.
Slika 23B ilustruje mapiranje epitopa u kristalnoj strukturi (tamno sive sfere: bliže od 3,0 angstrema, svetlo sivi štapići: bliže od 4,5 angstrema).
[Sl. 24A]
Slika 24A ilustruje pogled izbliza na interakcije E48, D51 i K109 (štapićasta reprezentacija) sa 305 Fab (površinska reprezentacija), kao što je opisano u Primeru 9.7.
[Sl. 24B]
Slika 24B ilustruje interakcije između E48 i njegovog okruženja (tamno siva tačkasta linija: vodonična veza sa Fab, svetlo siva tačkasta linija: vodonična veza posredovana vodom), kao što je opisano u Primeru 9.7.
[Sl. 24C]
Slika 24C ilustruje interakcije između D51 i njegovog okruženja (tamno siva tačkasta linija: vodonična veza sa Fab), kao što je opisano u Primeru 9.7.
[Sl. 24D]
Slika 24D ilustruje interakcije između K109 i njegovog okruženja (tamno siva tačkasta linija: vodonična veza sa Fab, svetlo siva tačkasta linija: slani most sa H-CDR3_D95), kao što je opisano u Primeru 9.7.
[Sl. 25A]
Slika 25A ilustruje pogled izbliza na interakcije H70, H72 i H110 (štapićasta reprezentacija) sa 305 Fab (štapićasta reprezentacija), kao što je opisano u Primeru 9.8, u istoj orijentaciji kao na Slici 24A.
[Sl. 25B]
Slika 25B ilustruje interakcije između H70 i njegovog okruženja, kao što je opisano u Primeru 9.8. Ovaj histidinski ostatak je označen u štapićastoj i mrežastoj reprezentaciji. Vodonična veza je označena tačkastom linijom.
[Sl. 25C]
Slika 25C ilustruje interakcije između H72 i njegovog okruženja, kao što je opisano u Primeru 9.8. Ovaj histidinski ostatak je označen u štapićastoj i mrežastoj reprezentaciji. Vodonična veza je označena tačkastom linijom.
[Sl. 25D]
Slika 25D ilustruje interakcije između H110 i njegovog okruženja, kao što je opisano u Primeru 9.8. Ovaj histidinski ostatak je označen u štapićastoj i mrežastoj reprezentaciji. Udaljenost između H110 i H-CDR3_H100c je prikazana tačkastom linijom.
Opis izvođenja
Tehnike i procedure koje su ovde opisane ili se navode iz referenci su generalno dobro poznate i u uobičajenoj upotrebi, korišćenjem konvencionalne metodologije od strane stručnjaka, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. DEFINICIJE
Osim ako nije drugačije definisano, tehnički i naučni termini korišćeni kao što je ovde naznačeno, imaju isto značenje koje uobičajeno razume običan stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), pruža
2
stručnjaku u ovoj oblasti opšti vodič za mnoge termine koji se koriste u ovoj prijavi.
Za potrebe tumačenja ove specifikacije, primenjivaće se sledeće definicije i, kadgod je to prikladno, izrazi koji se koriste u jednini će takođe uključivati i množinu i obrnuto. Treba razumeti da je korišćena terminologija, kao što je ovde naznačeno, samo u svrhu opisa određenih izvođenja, i nije namera da bude ograničavajuća. U slučaju da je bilo koja niže navedena definicija u sukobu sa bilo kojim citiranim dokumentom, važi niže navedena definicija.
„Akceptorski humani okvir”, za svrhe koje su ovde naznačene, je okvir koji sadrži sekvencu aminokiselina iz okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili iz okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) izvedenu iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Akceptorski humani okvir “izveden iz” okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može sadržati istu njegovu sekvencu aminokiselina, ili može sadržati promene sekvence aminokiselina. U nekim izvođenjima, broj promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje ili 2 ili manje. U nekim izvođenjima, VL akceptorskog humanog okvira je identičan po sekvenci VL okvira humanog imunoglobulina ili sekvenci okvira humanog konsenzusa.
"Afinitet" se odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih reakcija između pojedinog mesta za vezivanje molekula (npr. antitela) i njegovog partnera za koji se vezuje (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naglašeno, onako kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja, koji odražava interakciju u odnosu 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y se generalno može predstaviti konstantom disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u okviru struke, uključujući i one koji su ovde naznačeni. U nastavku su opisana konkretna ilustrativna i egzemplarna izvođenja za merenje afiniteta vezivanja.
“Afinitetno sazrelo” antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više promena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa roditeljskim antitelom koje ne poseduje takve promene, takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela prema antigenu.
Izrazi "anti-C5 antitelo" i "antitelo koje se vezuje za C5" se odnose na antitelo koje je sposobno da se veže za C5 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo upotrebljivo kao dijagnostički i/ili terapijski agens naciljan prema C5. U jednom izvođenju, stepen vezivanja anti-C5 antitela za nepovezani, protein koji nije C5 protein je manji od približno 10% vezivanja antitela za C5 kao što je mereno, npr. radioimunoesejom (RIA). U određenim izvođenjima, antitelo koje se vezuje za C5 ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 mikro M, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr. 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop C5 koji je sačuvan među C5 iz različitih vrsta.
Izraz “antitelo”, kao što je ovde naznačeno, koristi se u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući i monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
“Fragment antitela” se odnosi na molekul koji nije intaktno antitelo, koji sadrži deo intaktnog antitela koji vezuje antigen za koji se vezuje intaktno antitelo. Primeri fragmenata antitela uključuju Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2;
2
dijabodije; linearna antitela; jednolančane moleule antitela (npr. scFv); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
“Antitelo koje se vezuje za isti epitop”, kao referentno antitelo, odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u testu kompeticije, i/ili obrnuto, referentno antitelo koje blokira vezivanje antitela za njegov antigen u testu kompeticije. Ovde je dat jedan ogledni test kompeticije.
Izraz “himerično “ antitelo se odnosi na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen iz određenog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen iz drugog izvora ili vrste.
“Klasa” antitela se odnosi na tipove konstantnog domena ili konstantnog regiona koje poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko od njih se može dalje podeliti u podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno.
Izraz “citotoksični agens”, kako je ovde korišćen, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkcije ćelije i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapijske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloidi (vinkristine, vinblastine, etopozide), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalacione agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili
2
životinjskog porekla, uključujući i njihove fragmente i/ili varijante; i različite antitumorske ili antikancerske agense opisane u nastavku.
"Efektorske funkcije" se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); Fc vezivanje za receptor; citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnim od antitela (ADCC); fagocitozu; “down regulaciju”, to jest smanjenje broja receptora na površini ćelije (npr. receptora B ćelija); i aktivaciju B ćelija.
“Efektivna količina” agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na neophodnu efikasnu količinu, u dozama i tokom vremenskih perioda, da se postigne željeni terapijski ili profilaktički rezultat.
Izraz “epitop” uključuje bilo koju determinantu sposobnu da bude vezana antitelom. Epitop je region antigena na koji se vezuje antitelo koje cilja taj antigen, i uključuje specifične aminokiseline koje direktno stupaju u kontakt sa antitelom. Determinante epitopa mogu uključivati hemijski aktivne površinske grupacije molekula, kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforilne ili sulfonilne grupe, i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen će preferencijalno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula.
Izraz "Fc region" se u ovom dokumentu koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži bar delić konstantnog regiona. Ovaj izraz uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom izvođenju, Fc region teškog lanca humanog IgG se proteže od Cys226, ili
2
od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može ili ne mora biti prisutan. Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu se obavlja prema sistemu numerisanja EU, koji se takođe naziva EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5<th>Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Okvir" ili "FR" se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena se generalno sastoji od četiri domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence se generalno pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Izrazi "antitelo pune dužine", "intaktno antitelo" i "celo antitelo" se ovde koriste naizmenično, a odnose se na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu nativnom antitelu ili ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je definisano. Izrazi "ćelija domaćin", "linija ćelije domaćina" i "kultura ćelije domaćina" se koriste kao međusobno zamenljivi i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući i potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju “transformante” i “transformisane ćelije”, koje uključuju primarnu transformisanu ćeliju i potomstvo izvedeno iz nje bez obzira na broj pasaža (generacija). Potomstvo ne mora biti potpuno identično u sadržaju nukleinskih kiselina kao roditeljska ćelija, ali može sadržati mutacije. Ovde je uključeno mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je skrinirano ili selektovano u prvobitno transformisanoj ćeliji.
"Humano antitelo" je ono koje poseduje sekvencu aminokiselina koja odgovara onoj iz antitela koje proizvodi čovek ili ljudska ćelija, ili je derivat iz
2
ne-ljudskog izvora koji koristi repertoar humanih antitela ili druge sekvence koje kodiraju humana antitela. Ova definicija humanog antitela konkretno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-ljudske-humane antigen-vezujuće ostatke. "Okvir humanog konsenzusa" je okvir koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u selekciji sekvenci VL ili VH okvira humanog imunoglobulina. Generalno, selekcija VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. U jednom izvođenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I kao u Kabat et al., supra. U jednom izvođenju, za VH, podgrupa je podgrupa III kao u Kabat et al., supra.
"Humanizovano" antitelo se odnosi na himerično antitelo koje sadrži ostatke aminokiselina iz ne-ljudskih HVR i ostatke aminokiselina iz humanih FR. U određenim izvođenjima, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve, od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima ne-ljudskog antitela, i svi ili suštinski svi FR odgovaraju onima humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje jedan deo konstantnog regiona antitela, a koji je derivat humanog antitela. “Humanizovani oblik” antitela, npr. antitelo koje nije ljudsko, odnosi se na antitelo koje je prošlo humanizaciju.
Izraz “hipervarijabilni region” ili "HVR", kako se ovde koristi, odnosi se na svaki od regiona varijabilnog domena antitela, koji su hipervarijabilni u sekvenci ("regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDR") i/ili formiraju strukturno definisane petlje ("hipervarijabilne petlje") i/ili sadrže ostatke koji dolaze u kontakt sa antigenom ("antigenski kontakti"). Generalno, antitela obuhvataju šest HVR: tri u VH (HI, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). Primeri HVR u ovom dokumentu uključuju: (a) hipervarijabilne petlje koje se javljaju na ostacima
2
aminokiselina 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) regione CDR koji se javljaju na ostacima aminokiselina 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)); (c) antigenske kontakte koji se javljaju na ostacima aminokiselina 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (HI), 47-58 (H2) i 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); i (d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući i HVR ostatke aminokiselina 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (HI), 26-35b (HI), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. ostaci FR) su ovde numerisani u skladu sa Kabat et al., supra.
“Imunokonjugat” je antitelo konjugovano za jedan ili više heterologni(h) molekul(a), uključujući i citotoksični agens.
“Pojedinac” ili “subjekt” je sisar. Sisari uključuju pripitomljene životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ostale primate, kao što su majmuni), zečeve, i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim izvođenjima, pojedinac ili subjekt je čovek.
“Izolovano” antitelo je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim izvođenjima , antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, a čistoća se određuje, na primer, elektroforetskim (npr. SDS-PAGE, izoelektroično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografskim (npr. jonska razmena ili reverzna faza HPLC) postupcima. Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, videti, npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
“Izolovana” nukleinska kiselina se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina obuhvata molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomno ili na hromozomskoj lokaciji koja je različita od njegove prirodne hromozomske lokacije.
"Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-C5 antitelo" se odnosi na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući i takav(takve) molekul(e) nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takav(takve) molekul(e) nukleinske kiseline prisutan(prisutne) na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Izraz "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, osim mogućih varijanti antitela, npr. koja sadrže mutacije nastale prirodnim putem ili se pojavljuju tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, pri čemu su takve varijante generalno prisutne u minornim količinama. Za razliku od preparata poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo preparata monoklonskog antitela je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Time, premodifikator "monoklonalno" označava karakter antitela, odnosno da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba ga shvatiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela, koja
1
će se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, mogu biti proizvedena različitim tehnikama, uključujući i postupkom hibridoma, postupcima rekombinovane DNK, postupcima “phage-display” i postupcima koji koriste transgene životinje, koje sadrže ceo ili delimičan lokus humanog imunoglobulina, i ovde se opisuju takvi postupci i drugi primeri postupaka za proizvodnju monoklonskih antitela.
“Golo antitelo” se odnosi na antitelo koje nije konjugovano za heterologni deo (npr. citotoksični deo) ili radioobeleživač. Golo antitelo može biti prisutno u farmakološkoj formuli.
"Nativna antitela" se odnose na molekule imunoglobulina koji se pojavljuju prirodno sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetrametrički glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koja su vezana disulfidom. Od N-do C-završetka, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe naziva varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, a zatim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-završetka, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe naziva varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, a potom sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se dodeliti jednom od dva tipa, koji se nazivaju kapa (kappa) i lambda (lambda), na osnovu sekvence aminokiseline njegovog konstantnog domena.
Izraz “uputstvo za lek” se odnosi na uputstva koja su uobičajeno sadržana u komercijalnim pakovanjima terapijskih proizvoda, koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda.
2
"Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina" u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu je definisan kao procenat ostataka aminokiselina u sekvenci kandidata koji su identični ostacima aminokiselina u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, posle poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u razmatranje bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnanje u svrhe određivanja procenta identičnosti sekvence aminokiselina može se postići na različite načine koji su u okviru stručne osposobljenosti, na primer, korišćenjem javno dostupnih kompjuterskih softvera, kao što je softver BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNAS-TAR). Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnanje sekvenci, uključujući i sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravanja preko cele dužine sekvenci koje se porede. Međutim, za ovde navedene potrebe, procenti (%) vrednosti identičnosti sekvence aminokiselina se generišu korišćenjem kompjuterskog programa ALIGN-2. Autor kompjuterskog programa za poređenje sekvenci, ALIGN-2, je Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet uz korisničku dokumentaciju u US Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod US Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan kod Genentech, Inc., South San Francisco, California, ili se može kompilirati iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba kompilirati za upotrebu na operativnom sistemu UNIX, uključujući i digitalnom UNIX V4.0D. Svi parametri poređenja sekvenci su podešeni programom ALIGN-2 i ne variraju.
U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje sekvenci aminokiselina, % identičnosti sekvenci aminokiselina date sekvence aminokiselina A prema, sa, ili protiv date sekvence aminokiselina B (koja se alternativno može izraziti kao data sekvenca aminokiselina A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence aminokiselina prema, sa, ili protiv date sekvence aminokiselina B), izračunava se na sledeći način: 100 puta razlomak X/Y, gde je X broj ostataka aminokiselina koji se beleže, programom za poravnanje sekvenci ALIGN-2, kao identična poklapanja u tom programu, koji proverava poravnanje A i B, i gde je Y ukupan broj ostataka aminokiselina u B. Zapaža se da, tamo gde dužina sekvence aminokiselina A nije jednaka dužini sekvence aminokiselina B, % identičnosti sekvence aminokiselina od A do B neće biti jednak % identičnosti sekvence aminokiselina od B do A. Osim ako nije drugačije konkretno navedeno, svi % vrednosti identičnosti sekvence aminokiselina, koji se ovde koriste, dobijeni su kao što je opisano u neposredno prethodnom paragrafu korišćenjem kompjuterskog programa ALIGN-2.
Izraz "farmaceutska formula" se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da dozvoljava da biološka aktivnost aktivnog sastojka u njemu bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekt kojem bi formulacija bila administrirana.
“Farmaceutski prihvatljiv nosač” se odnosi na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, različit od aktivnog sastojka, koji nije toksičan po subjekt. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje pufer, ekscipijent ili konzervans.
“Izraz "C5", kako se ovde koristi, obuhvata bilo koji prirodni C5 iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući i sisare, kao što su primati (npr. ljudi i majmuni) i glodari (npr, miševi i pacovi). Osim ako nije drugačije naznačeno, izraz "C5" se odnosi na humani C5 protein koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEQ ID NO: 39 i sadži sekvencu beta lanca prikazanu u SEQ ID NO: 40. Izraz obuhvata neprocesirani C5 “pune dužine”, kao i bilo koji oblik C5 koji je rezultat procesiranja u ćeliji. Izraz takođe obuhvata varijante C5 koje se prirodno pojavljuju, npr. varijante spajanja ili alelne varijante. Primer sekvence aminokiselina humanog C5 je prikazan u SEQ ID NO: 39 ("divlji“ tip ili "WT"
4
C5). Primer sekvence aminokiselina beta lanca humanog C5 je prikazan u SEQ ID NO: 40. Primeri sekvenci aminokiselina MG1, MG2 i MG1-MG2 domena beta lanca humanog C5 su prikazani u SEQ ID NO: 41, 42 i 43, respektivno. Primeri sekvenci aminokiselina C5 cinomolgus majmuna i miševa su prikazani u SEQ ID NO: 44 i 105, respektivno. Ostaci aminokiselina 1-19 iz SEQ ID NOs: 39, 40, 43, 44 i 105 odgovaraju signalnoj sekvenci koja se uklanja tokom obrade u ćeliji i stoga nedostaje u odgovarajućem primeru sekvenci aminokiselina.
Kako se ovde koristi, “lečenje” (i njegove gramatičke varijacije, kao što su “lečiti” ili "lečenjem") se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok bolesti pojedinca koji se leči, i može se izvesti ili radi profilakse ili tokom kliničkog lečenja. Poželjni efekti lečenja uključuju i sprečavanje pojave ili ponovnog pojavljivanja bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo koje direktne ili indirektne patološke posledice bolesti, sprečavanje metastaza, smanjenje stope progresije bolesti, poboljšanje ili smanjenje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim izvođenjima, antitela pronalaska se koriste za odlaganje bolesti ili za usporavanje progresije bolesti.
Izraz “varijabilni region” ili “varijabilni domen” se odnosi na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (VH i VL, respektivno) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti , npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007)). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da dodeli specifičnost vezivanja antigena. Štaviše, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati korišećenjem VH ili VL domena iz antitela koje se vezuje za antigen, čime se postiže skrining biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, respektivno. Videti , npr.
Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Izraz “vektor”, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Izraz uključuje i vektor kao samoreplikujuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je ubačen. Odeđeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde nazivaju “vektorima ekspresije”.
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
U jednom aspektu, pronalazak je delimičnio zasnovan na anti-C5 antitelima i njihovoj upotrebi. U određenim izvođenjima, obezbeđena su antitela koja se vezuju za C5. Antitela pronalaska su, na primer, korisna za postavljanje dijagnoze ili lečenje bolesti.
A. Primeri anti-C5 antitela
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za C5, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar beta lanca C5. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar domena MG1-MG2 beta lanca C5. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 19-180 beta lanca C5. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar MG1 domena (aminokiseline 20-124 iz SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 41)) beta lanca C5. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 33-124, iz beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40). U jednom drugom izvođenju, antitelo se ne vezuje za fragment kraći od fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 33-124 iz beta lanca C5, npr. fragment koji se sastoji od aminokiselina 45-124, 52-124, 33-111, 33-108 ili 45-111 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40).
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitela ovog pronalaska pokazuju pH- zavisne karakteristike vezivanja. Kako je ovde korišćen, izraz “pH-zavisno vezivanje” znači da antitelo pokazuje “smanjeno vezivanje za C5 u kiseloj pH sredini u poređenju sa njegovim vezivanjem u neutralnoj pH sredini” (za potrebe ovog otkrića oba izraza se koriste naizmenično). Na primer, antitela "sa karakteristikama zavisno od pH" uključuju antitela koja se vezuju za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U određenim izvođenjima, antitela ovog pronalaska se vezuju za C5 sa najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U nekim izvođenjima, antitela se vezuju za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8. U daljim izvođenjima, antitela ovog pronalaska se vezuju za C5 sa najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
"Afinitet" antitela za C5, u svrhe ovog otkrića, izražava se u KD antitela. KD antitela se odnosi na ekvilibrijum konstante disocijacije interakcije antiteloantigen. Što je veća vrednost KD za vezivanje antitela za njegov antigen, to je slabiji afinitet njegovog vezivanja za taj konkretan antigen. Prema tome, onako kako se ovde koristi, izraz "viši afinitet u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini" (ili ekvivalentan izraz "pH-zavisno vezivanje") znači da je KD za vezivanje antitela za C5 u kiseloj pH sredini veća nego KD za vezivanje antitela za C5 u neutralnoj pH sredini. Na primer, u kontekstu ovog pronalaska, smatra se da se antitelo vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini ukoliko je KD vezivanja antitela za C5 u kiseloj pH sredini najmanje 2 puta veća nego KD vezivanja antitela za C5 u neutralnoj pH sredini. Tako ovo otkriće obuhvata antitela koja se vezuju za C5 u kiseloj pH sredini sa KD koja je najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veća nego KD vezivanja antitela za C5 u neutralnoj pH sredini. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela u neutralnoj pH sredini može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10-
<11>M, 10<-12>M ili manja. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela u kiseloj pH sredini može biti 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M ili veća.
U daljim izvođenjima, smatra se da se antitelo vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini ukoliko je KD vezivanja antitela za C5 pri pH 5,8 najmanje 2 puta veća nego KD vezivanja antitela za C5 pri pH 7,4. U nekim izvođenjima, obezbeđena antitela se vezuju za C5 pri pH 5,8 sa KD koja je najmanje 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veća nego KD vezivanja antitela za C5 pri pH 7,4. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela pri pH 7,4 može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili manja. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela pri pH 5,8 može biti 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M ili veća.
Karakteristike vezivanja antitela za konkretan antigen mogu se takođe izraziti u odnosu na kd anitela. Ova kd antitela se odnosi na konstantu brzine disocijacije antitela u odnosu na konkretan antigen i izražava se u recipročnim sekundama (tj. sec<-1>). Povećanje vrednosti kd označava slabije vezivanje antitela za njegov antigen. Ovo otkriće stoga obuhvata antitela koja se vezuju za C5 uz veću vrednost kd u kiseloj pH sredini nego u neutralnoj pH sredini. Ovo otkriće obuhvata antitela koja se vezuju za C5 u kiseloj pH sredini sa kd koja je najmanje 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veća nego kd vezivanja antitela za C5 u neutralnoj pH sredini. U jednom drugom izvođenju, vrednost kd antitela u neutralnoj pH sredini može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manja. U jednom drugom izvođenju, vrednost kd antitela u kiseloj pH sredini može biti 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća. Ovaj pronalazak takođe obuhvata antitela koja se vezuju za C5 uz veću vrednost kd pri pH 5,8 nego pri pH 7,4. Ovo otkriće obuhvata antitela koja se vezuju za C5 pri pH 5,8 sa kd koja je najmanje 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili više puta veća nego kd vezivanja antitela za C5 pri pH 7,4. U jednom drugom izvođenju, vrednost kd antitela pri pH 7,4 može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manje. U jednom drugom izvođenju, vrednost kd antitela pri pH 5,8 može biti 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća.
U određenim slučajevima, "smanjeno vezivanje za C5 u kiseloj pH sredini u poređenju sa vezivanjem u neutralnoj pH sredini" izražava se kroz odnos KD vrednosti vezivanja antitela za C5 u kiseloj pH sredini u odnosu na vrednost KD vezivanja antitela za C5 u neutralnoj pH sredini (ili obrnuto). Na primer, može se smatrati da antitelo pokazuje "smanjeno vezivanje za C5 u kiseloj pH sredini u poređenju sa njegovim vezivanjem u neutralnoj pH sredini", u svrhe ovog pronalaska, ukoliko antitelo pokazuje odnos kisela/neutralna KD koji iznosi 2 ili više. U određenim primerima izvođenja, odnos pH 5,8/pH 7,4 KD za antitelo ovog pronalaska iznosi 2 ili više. U određenim primerima izvođenja, odnos kisela/neutralna KD za antitelo ovog pronalaska može biti 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veći. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela u neutralnoj pH sredini može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili manja. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela u kiseloj pH sredini može biti 10-
<9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M ili veća. U daljim slučajevima se može smatrati da antitelo pokazuje "smanjeno vezivanje za C5 u kiseloj pH sredini u poređenju sa njegovim vezivanjem u neutralnoj pH sredini", u svrhe ovog pronalaska, ukoliko antitelo pokazuje odnos pH 5,8/pH 7,4 KD od 2 ili veći. U određenim primerima izvođenja, odnos pH 5,8/pH 7,4 KD za antitelo ovog pronalaska može biti 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veći. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela pri pH 7,4 može biti 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M ili manja. U jednom drugom izvođenju, vrednost KD antitela pri pH 5,8 može biti 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M ili veća.
U određenim slučajevima, "smanjeno vezivanje za C5 u kiseloj pH sredini u poređenju sa vezivanjem u neutralnoj pH sredini" izražava se kroz koeficijent vrednosti kd vezivanja antitela za C5 u kiseloj pH sredini u odnosu na vrednost kd vezivanja antitela za C5 u neutralnoj pH sredini (ili obrnuto). Na primer, može se smatrati da antitelo pokazuje "smanjeno vezivanje za C5 u kiseloj pH sredini u poređenju sa vezivanjem u neutralnoj pH sredini", u svrhe ovog pronalaska, ukoliko antitelo pokazuje odnos-koeficijent kisela/neutralna kd od 2 ili veći. U određenim primerima izvođenja, odnos pH 5,8/pH 7,4 kd za antitelo iz ovog pronalaska je 2 ili veći. U određenim primerima izvođenja, odnos kisela/neutralna KD za antitelo ovog pronalaska može biti 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veća. U daljim primerima izvođenja, odnos pH 5,8/pH 7,4 kd za antitelo ovog pronalaska može biti 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 ili veći. U jednom drugom izvođenju, vrednost kd antitela u neutralnoj pH sredini može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manja. U daljem izvođenju, vrednost kd antitela pri pH 7,4 može biti 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s ili manja. U jednom drugom izvođenju, vrednost kd antitela u kiseloj pH sredini može biti 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća. U daljem izvođenju, vrednost kd antitela pri pH 5,8 može biti 10-
<3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s ili veća.
4
Onako kako se ovde koristi, izraz "kisela pH sredina" znači pH od 4,0 do 6,5. Izraz "kisela pH sredina" uključuje bilo koju od sledećih vrednosti: 4,0; 4,1; 4,2; 4,3; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 4,9; 5,0; 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; i 6,5. U konkretnim aspektima, "kisela pH sredina" je 5,8.
Onako kako se ovde koristi, izraz "neutralna pH sredina" znači pH od 6,7 do oko 10,0. Izraz "neutralna pH" uključuje bilo koju od sledećih vrednosti: 6,7; 6,8; 6,9; 7,0; 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; 8,6; 8,7; 8,8; 8,9; 9,0; 9,1; 9,2; 9,3; 9,4; 9,5; 9,6; 9,7; 9,8; 9,9; i 10,0. U konkretnim aspektima, "neutralna pH sredina" je 7,4.
Vrednosti KD, i vrednosti kd, kako su ovde izražene, mogu se utvrditi korišćenjem SPR biosenzora (eng. Surface Plasmon Resonance-based biosensors) za karakterizaciju interakcija antitelo-antigen. (Videti npr. Primer 3 u ovom dokumentu). KD vrednosti i kd vrednosti se mogu odrediti na 25 stepeni C ili 37 stepeni C.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se vezuje za epitop unutar beta lanca C5 koji se sastoji od domena MG1 (SEQ ID NO:41). U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se vezuje za epitop unutar beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40) koji obuhvata najmanje jedan fragment odabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 47-57, 70-76 i 107-110. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se vezuje za epitop unutar fragmenta beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40) koji obuhvata najmanje jednu aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 i His110. U određenim izvođenjima, vezivanje anti-C5 antitela ovog pronalaska za mutant C5 se smanjuje u poređenju sa njegovim vezivanjem za „divlji“ tip C5, u kome mutant C5 ima najmanje jednu supstituciju aminokiseline na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od Glu48, Asp51, His72 i Lys109. U jednom drugom izvođenju, pH-zavisno vezivanje anti-C5 antitela ovog pronalaska za mutant C5 se smanjuje u poređenju sa njegovim pH-zavisnim vezivanjem za „divlji“ tip C5, u kome mutant C5 ima najmanje jednu supstituciju aminokiseline na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od His70, His72 i His110. U daljem izvođenju, aminokiselina na poziciji odabranoj iz Glu48, Asp51 i Lys109 se supstituiše alaninon, a aminokiselina na poziciji odabranoj iz His70, His72 i His110 se supstituiše tirozinom u mutantu C5.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL odabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO:1 i VL iz SEQ ID NO:11; (b) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO: 15; (c) VH iz SEQ ID NO:4 i VL iz SEQ ID NO: 14; (d) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16; (e) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO: 12; (f) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (g) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO:19; (h) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO: 17; (i) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO: 18;; i (j) VH iz SEQ ID NO: 10 i VL iz SEQ ID NO:20.
U određenim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, anti-C5 antitelo ovog otkrića vezuje C5 i dolazi u kontakt sa aminokiselinom Asp51 (D51) iz SEQ ID NO:39. U dodatnim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog otkrića vezuje C5 i dolazi u kontakt sa aminokiselinom Lys109 (K109) iz SEQ ID NO:39. U daljem izvođenju, anti-C5 antitelo ovog otkrića vezuje C5 i dolazi u kontakt sa aminokiselinom Asp51 (D51) i aminokiselinom Lys109 (K109) iz SEQ ID NO:39.
U određenim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, vezivanje anti-C5 antitela ovog otkrića za mutant C5 se smanjuje u poređenju sa njegovim vezivanjem za „divlji“ tip, u kome mutant C5 ima supstituciju Glu48Ala (E48A) iz SEQ ID NO:39. U jednom drugom izvođenju, koje se daje samo u svrhe ilustrovanja, pH-zavisno vezivanje anti-C5 antitela ovog otkrića za mutant C5 se smanjuje u poređenju sa njegovim pH-zavisnim vezivanjem za „divlji“ tip C5, u kome C5 mutant ima supstituciju Glu48Ala (E48A) iz SEQ ID NO:39.
U daljem izvođenju, koje se daje samo u svrhe ilustrovanja, anti-C5 antitelo se vezuje za protein C5 koji se sastoji od sekvence aminokiseline iz SEQ ID NO:39, ali se ne vezuje za protein C5 koji se sastoji od sekvence aminokiseline iz SEQ ID NO:39 sa supstitucijom H72Y, gde se protein C5 i H72Y supstituisan protein C5 pripremaju i prolaze skrining pod istim uslovima. U daljem izvođenju, anti-C5 antitelo se vezuje za protein C5 koji se sastoji od sekvence aminokiseline iz SEQ ID NO:39 pri pH 7,4, ali se ne vezuje za H72Y supstituisan protein C5 pri pH 7,4.
Ne ograničavajući se na neku konkretnu teoriju, može se nagađati da se vezivanje anti-C5 antitela za C5 smanjuje (ili skoro gubi) kada se ostatak aminokiseline na C5 supstituiše drugom aminokiselinom, što znači da je ostatak aminokiseline na C5 kritičan za interakcije između anti-C5 antitela i C5, i da antitelo može da prepozna epitop oko ostatka aminokiseline na C5.
U ovom otkriću je otkriveno da grupa anti-C5 antitela koja se međusobno takmiči ili vezuje za isti epitop može pokazivati pH-zavisne karakteristike vezivanja. Među aminokiselinama, histidin, sa vrednošću pKa od približno 6,0 do 6,5, može imati različita stanja protonske disocijacije između neutralne i kisele pH vrednosti. Stoga, ostatak histidina na C5 može doprinositi pH-zavisnim interakcijama između anti-C5 antitela i C5. Ne ograničavajući se na neku konkretnu teoriju, može se nagađati da anti-C5 antitelo može da prepozna konformacionu strukturu oko ostatka histidina na C5, koja je promenljiva u
4
zavisnosti od pH vrednosti. Takvo nagađanje može biti konzistentno sa niže opisanim eksperimentalnim rezultatima: da se pH-zavisnost anti-C5 antitela smanjuje (ili skoro gubi) kada se ostatak histidina na C5 supstituiše nekom drugom aminokiselinom (tj. anti-C5 antitelo sa pH-zavisnim karakteristikama vezivanja se vezuje za mutant histidina C5 sa sličnim afinitetom prema „divljem“ tipu C5 u neutralnoj pH sredini, dok se isto antitelo vezuje za mutant histidina C5 sa višim afinitetom nego „divilji“ tip C5 u kiseloj pH sredini).
U određenim izvođenjima, koja su data samo u svrhe ilustrovanja, anti-C5 antitelo ovog otkrića se vezuje za C5 iz više od jedne vrste. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 iz čoveka i ne-ljudske životinje. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 od čoveka i majmuna (npr. kinomolgusa, rezus makakija, marmoseta, šimpanze ili pavijana).
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela koja inhibiraju aktivaciju C5. U određenim izvođenjima, obezbeđuju se anti-C5 antitela koja sprečavaju cepanje C5 radi formiranja C5a i C5b, tako sprečavajući stvaranje anafilatoksične aktivnosti koja se dovodi u vezu sa C5a, kao i sprečavajući spajanje C5b-9 kompleksa za napad na membranu (MAC) koji se dovodi u vezu sa C5b. U određenim izvođenjima, obezbeđuju se anti-C5 antitela koja blokiraju pretvaranje C5 u C5a i C5b pomoću konvertaze C5. U određenim izvođenjima, obezbeđuju se anti-C5 antitela koja blokiraju pristup konvertaze C5 mestu cepanja na C5. U određenim izvođenjima, obezbeđuju se anti-C5 antitela koja blokiraju hemolitičku aktivnost prouzrokovanu aktivranjem C5. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitela ovog pronalaska inhibiraju aktivaciju C5 klasičnim putem i/ili alternativnim putem.
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela koja inhibiraju aktivaciju varijante C5. Varijanta C5 označava genetsku varijantu C5 koja nastaje zbog neke genetske varijacije, kao što je mutacija, polimorfizam ili alelska varijacija. Genetska varijacija može da obuhvatata deleciju, supstituciju ili ubacivanje jednog ili više nukleotida. Varijanta C5 može obuhvatiti jednu ili više genetskih varijacija u C5. U određenim izvođenjima, varijanta C5 ima biološku aktivnost sličnu „divljem“ tipu C5. Takva varijanta C5 može obuhvatati najmanje jednu varijaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D. U ovom dokumentu, R885H, na primer, označava genetsku varijaciju gde se arginin na poziciji 885 supstituiše histidinom. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska inhibira aktivaciju i divljeg tipa C5 i najmanje jedne varijante C5 odabrane iz grupe koja se sastoji od V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D.
Sledeći aspekti/izvođenja navedeni u paragrafima [0098] do [0134] su prisutni samo u svrhu ilustracije.
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45-54; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55-64; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65-74; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75-84; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85-94; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95-104.
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz: (a) HVR-H1 koja sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45-54; (b) HVR-H2 koja sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55-64; i (c) HVR-H3 koja sadrži sekvencu aminokiselinea bilo koje od SEQ ID
4
NOs: 65-74. U jednom izvođenju, to antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65-74. U jednom drugom izvođenju, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65-74 i HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95-104. U daljem izvođenju, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65-74, HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95-104 i HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55-64. U daljem izvođenju, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45-54; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55-64; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65-74.
U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence odabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75-84; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85-94; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina od bilo koje SEQ ID NOs: 95-104. U jednom izvođenju, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75-84; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85-94; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95-104.
U jednom drugom aspektu, antitelo pronalaska obuhvata (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence odabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45-54, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55-64, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65-74; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve
4
ili sve tri VL HVR sekvence odabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75-84, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiseline bilo koje od SEQ ID NOs: 85-94, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95-104.
U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45-54; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55-64; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65-74; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75-84; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85-94; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95-104.
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo koje sadrži najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR odabranih iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45, 54, 117, 126; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75, 84, 122, 129; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85, 94, 123-124, 130; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence odabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45, 54, 117, 126; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od
4
SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128. U jednom izvođenju, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128. U jednom drugom izvođenju, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128 i HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131. U daljem izvođenju, antitelo obuhvata HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128, HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131, i HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127. U daljem izvođenju, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45, 54, 117, 126; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence odabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75, 84, 122, 129; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85, 94, 123-124, 130; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131. U jednom izvođenju, antitelo obuhvata (a) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75, 84, 122, 129; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85, 94, 123-124, 130; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131.
U jednom drugom aspektu, antitelo pronalaska obuhvata (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri sekvence VH HVR odabrane iz: (i) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs:
4
45, 54, 117, 126, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence odabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75, 84, 122, 129, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85, 94, 123-124, 130, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131.
U jednom drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 45, 54, 117, 126; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 75, 84, 122, 129; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 85, 94, 123-124, 130; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje od SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131.
U određenim izvođenjima, bilo koja pojedina ili više aminokiselina anti-C5 antitela, kao što je napred navedeno, supstituisane su na sledećim HVR pozicijama: (a) u HVR-H1 (SEQ ID NO: 45), na pozicijama 5 i 6; (b) u HVR-H2 (SEQ ID NO: 55), na pozicijama 1, 3, 9, 11, 13 i 15; (c) u HVR-H3 (SEQ ID NO: 65), na pozicijama 2, 5, 6, 12 i 13; (d) u HVR-L1 (SEQ ID NO: 75), na pozicijama 1, 5, 7 i 9; (e) u HVR-L2 (SEQ ID NO: 85), na pozicijama 4, 5 i 6; i (f) u HVR-L3 (SEQ ID NO: 95), na pozicijama 2, 4 i 12.
U određenim izvođenjima, supstitucije su konzervativne supstitucije, kao što je ovde navedeno-su predviđene u ovom dokumentu. U određenim
4
izvođenjima, bilo koja ili više od sledećih supstitucija mogu biti izvedene u bilo kojoj kombinaciji: (a) u HVR-H1 (SEQ ID NO: 45), M5V ili C6A; (b) u HVR-H2 (SEQ ID NO: 55), C1A ili G, Y3F, T9D ili E, Y11K ili Q, S13D ili E, ili A15V; (c) u HVR-H3 (SEQ ID NO: 65), G2A, V5Q ili D, T6Y, Y12H, ili L13Y; (d) u HVR-L1 (SEQ ID NO: 75), Q1R, N5Q ili G, G7S, D9K ili S; (e) u HVR-L2 (SEQ ID NO: 85), K4T ili E, L5T, ili A6H, A6 E, ili A6Q; (f) u HVR-L3 (SEQ ID NO: 95) C2S, C2N, ili C2T, F4K; ili A12T ili A12H.
Sve moguće kombinacije gore navedenih supstitucija obuhvaćene su konsenzusom sekvence SEQ ID NOs: 126, 127, 128, 129, 130 i 131 za HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, respektivno.
U svakom od napred navedenih izvođenja, anti-C5 antitelo je humanizovano. U jednom izvođenju, anti-C5 antitelo se sastoji od regiona HVR kao u bilo kom od napred navedenih izvođenja, i dalje sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzus okvir. U jednom drugom izvođenju, anti-C5 antitelo sadrži regione HVR kao u bilo kom od napred navedenih izvođenja, i dalje obuhvata VH ili VL koji sadrži FR sekvencu, gde su FR sekvence kako sledi. Za varijabilni domen teškog lanca, FR1 sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 132-134, FR2 sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 135-136, FR3 sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 137-139, FR4 sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 140-141. Za varijabilni domen lakog lanca, FR1 sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 142-143, FR2 sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 144-145, FR3 sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 146-147, FR4 sadrži sekvence aminokiselina iz SEQ ID NO: 148.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo obuhvata sekvence teškog lanca varijabilnog domena (VH) koje imaju najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, sekvenci aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 1-10. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja, ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili deletirano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1-10. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima izvan HVR (npr. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo sadrži VH sekvencu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1-10, uključujući i post-translacione modifikacije te sekvence. U određenom izvođenju, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR odabrana iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 45-54, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 55-64, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 65-74.
U jednom drugom aspektu, navedeno-obezbeđeno je anti-C5 antitelo, gde to antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, sa sekvencom aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 11-20. U određenim izvođenjima, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili deletirano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 11-20. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima izvan HVR
1
(npr. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo sadrži VL sekvencu u bilo kojoj od SEQ ID NOs:11-20, uključujući i post-translacione modifikacije te sekvence. U određenom izvođenju, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR odabrana iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 75-84; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 85-94; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvence aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 95-104.
U jednom drugom aspektu, obezbeđeno je anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo sadrži VH kao u bilo kojim od napred navedenih izvođenja, i VL kao u bilo kojim od napred navedenih izvođenja. U jednom izvođenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 1-10 i bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 11-20, respektivno, uključujući i post-translacione modifikacije tih sekvenci.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 10, 106-110. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili obrisano u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 10, 106-110. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo sadrži VH sekvencu u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 10, 106-110, uključujući i post-translacione modifikacije te sekvence. U jednom posebnom izvođenju, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR
2
izabrana od-from: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 45, 54, 117, 126, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje iz SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline bilo koje iz SEQ ID NOs: 10, 106-110. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je bilo supstituisano, ubacivano i/ili deletirano u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 10, 106-110. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 10, 106-110, uključujući i posttranslacione modifikacije te sekvence. U jednom posebnom izvođenju, VH obuhvata jednu, dve ili tri HVR izabrane iz : (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline bilo koje iz SEQ ID NOs: 45, 54, 117, 126, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline bilo koje iz SEQ ID NOs: 55, 64, 118-120, 127, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline bilo koje iz SEQ ID NOs: 65, 74, 121, 128.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo sadrži VH sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline iz SEQ ID NO: 10. U određenim izvođenjima, VH sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 10. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina su supstituisane, ubacivane i/ili deletirane u SEQ ID NO: 10. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu u SEQ ID NO: 10, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U jednom posebnom izvođenju, VH obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabranih iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 54, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 64, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 74.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 106. U određenim izvođenjima, VH sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 106. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identita sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina su suptituisane, ubačene i/ili deletirane iz SEQ ID NO: 106. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu u SEQ ID NO: 106, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VH obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabranih iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži
4
sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 118, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 107. U određenim izvođenjima, VH sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO:107. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina su supstituisane, ubačene i/ili deletirane u SEQ ID NO: 107. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu u SEQ ID NO:107, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VH obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabranih iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 119, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 108. U određenim izvođenjima, ta VH sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 108. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina su supstituisane, ubačene i/ili deletirane u SEQ ID NO: 108. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu u SEQ ID NO: 108, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VH obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 118, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 109. U određenim izvođenjima, VH sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 109. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina su supstituisane, ubačene i/ili deletirane u SEQ ID NO: 109. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu u SEQ ID NO: 109, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VH obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 118, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121.
U jednom drugom aspektu, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 110. U određenim izvođenjima, VH sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 110. U određenim izvođenjima, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina su supstituisane, ubačene i/ili deletirane u SEQ ID NO: 110. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VH sekvencu u SEQ ID NO: 110, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VH obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 120, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121.
U jednom drugom aspektu, obezbeđen je anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema bilo kojoj sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NOs: 20, 111-113. U određenim izvođenjima, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina su supstituisne, ubačene i/ili deletirane u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 20, 111-113. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VL sekvencu u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 20, 111-113, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VL obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline bilo koje iz SEQ ID NOs: 75, 84, 122, 129; (b) HVR-L2 koji sadrži bilo koju sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NOs: 85, 94, 123-124, 130; i (c) HVR-L3 koji sadrži bilo koju sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NOs: 95, 104, 125, 131.
U jednom drugom aspektu, navodi se anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VL koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 20. U određenim izvođenjima, VL sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO:20. U određenim izvođenjima, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili brisano u SEQ ID NO: 20. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VL sekvencu u SEQ ID NO: 20, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VL obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 84; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 94; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 104.
U jednom drugom aspektu, obezbeđeno je anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VL koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 111. U određenim izvođenjima, VL sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 111. U određenim izvođenjima, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili izbrisano u SEQ ID NO: 111. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VL sekvencu u SEQ ID NO: 111, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VL obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 123; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 125.
U jednom drugom aspektu, obezbeđeno je anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VL koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 112. U određenim izvođenjima, VL sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 112. U određenim izvođenjima, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili izbrisano u SEQ ID NO: 112. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VL sekvencu u SEQ ID NO: 112, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VL obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 123; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 125.
U jednom drugom aspektu, obezbeđeno je anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VL koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci aminokiseline iz SEQ ID NO: 113. U određenim izvođenjima, VL sekvenca je sekvenca aminokiseline iz SEQ ID NO: 113. U određenim izvođenjima, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije koje se odnose na referentnu sekvencu, ali anti-C5 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za C5. U određenim izvođenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili izbrisano u SEQ ID NO: 113. U određenim izvođenjima, supstitucije, insercije ili delecije nastaju u regionima izvan HVR (tj. u regionima FR). Opciono, anti-C5 antitelo obuhvata VL sekvencu u SEQ ID NO: 113, uključujući i posttranslacijske modifikacije te sekvence. U posebnom izvođenju, VL obuhvata jedan, dva ili tri HVR izabrana iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 124; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 125.
U jednom drugom aspektu, obezbeđeno je anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VH kao i u svakom od izvođenja koja su napred izneta i VL kao i u svakom od izvođenja koja su napred data. U jednom izvođenju, antitelo obuhvata VH i VL sekvence u bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 10, 106-110 i bilo kojoj iz SEQ ID NO: 20, 111-113, respektivno, uključujući i posttranslacijske modifikacije tih sekvenci. U jednom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 10 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 20. U jednom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 106 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 111. U jednom drugom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 107 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 111. U dodatnom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 108 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 111. U jednom drugom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 109 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 111. U jednom drugom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 109 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 112. U jednom drugom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 109 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 113. U jednom drugom izvođenju, antitelo obuhvata VH sekvencu iz SEQ ID NO: 110 i VL sekvencu iz SEQ ID NO: 113.
U jednom aspektu, navodi se anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VH sekvencu koja sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 54, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 64, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 74, i VL sekvencu koja sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 84; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 94; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 104.
U jednom drugom aspektu, navedeno je anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VH sekvencu koja sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 118, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121, i VL sekvencu koja sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 123; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 125.
1
U jednom drugom aspektu, navodi se anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VH sekvencu koja sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 119, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121, i VL sekvencu koja sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 123; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 125.
U jednom drugom aspektu, navodi se anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VH sekvencu koja sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 118, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121, i VL sekvencu koja sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 124; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 125.
U jednom drugom aspektu, navodi se anti-C5 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata VH sekvencu koja sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 117, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 120, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 121, i VL sekvencu koja sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 124; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO: 125.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska obuhvata VH kao i u svakom od napred navedenih izvođenja i konstantni region teškog lanca
2
koji sadrži sekvencu aminokiseline bilo koje iz SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 114, 115 i 116. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska obuhvata VL kao i u svakom od napred navedenih izvođenja i konstantni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiseline bilo koje iz SEQ ID NOs: 36, 37 i 38.
U jednom drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-C5 antitelo navedeno u ovom dokumentu. Na primer, u određenim izvođenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i antitelo opisano u Tabeli 2. Kako je pokazano radnim primerima u nastavku, sva anti-C5 antitela opisana u Tabeli 2 su grupisana u istu „korpu“ epitopa C5 i pokazuju pH-zavisne karakteristike vezivanja.
U jednom dodatnom aspektu, ovaj pronalazak navodi antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i antitelo obezbeđeno u ovom dokumentu. U jednom daljem aspektu, pronalazak navodi antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i antitelo opisano u Tabelama 7 ili 8. U određenim izvođenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 33-124 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40). U određenim izvođenjima, obezbeđuje se antitelo koje se vezuje za epitop unutar beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40) koji obuhvata najmanje jedan fragment odabran iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 47-57, 70-76 i 107-110. U određenim izvođenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40) koji obuhvata najmanje jednu aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 i His110. U jednom drugom izvođenju, epitop anti-C5 antitela ovog pronalaska je konformacioni epitop.
U daljem aspektu pronalaska, anti-C5 antitelo prema bilo kom od napred navedenih izvođenja je monoklonsko antitelo, uključujući i himerično , humanizovano ili humano antitelo. U jednom izvođenju, anti-C5 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo ili F(ab’)2fragment. U jednom drugom izvođenju, antitelo je antitelo pune dužine, npr. neoštećeno IgG1 ili IgG4 antitelo ili neka druga klasa antitela ili izotop, kako je ovde definisano.
U jednom daljem aspektu, anti-C5 antitelo prema svakom od napred navedenih izvođenja, koja nisu tema pronalaska i navode se samo u svrhe ilustrovanja, mogu inkorporirati bilo koju karakteristiku, pojedinačno ili u kombinaciji, kako je opisano u Odeljcima 1-7 u nastavku:
1. Afinitet antitela
U određenim izvođenjima, ovde navedeno antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1 mikro M, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr. 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
U jednom izvođenju, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA).<.>U jednom izvođenju, RIA test se izvodi sa Fab fragmentom antitela od interesa i njegovim ogovarajućim antigenom. Na primer, afinitet Fab-a za antigen u rastvoru se meri uravnotežavanjem Fab-a sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog radioaktivnim jodom<125>I, u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, a zatim «hvatanjem» vezanog antigena za mikrotitracionu ploču obloženu anti-Fab antitelima (videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Da bi se uspostavili uslovi reakcije, MICROTITER (registrovani žig) višekomorne ploče (Thermo Scientific) su obložene preko noći sa 5 mikro g/ml vezivnog anti-Fab antitela (zahvatanje
4
kompleksa) (CappelLabs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim blokirane sa 2% (w/v) bovin serum albuminom u PBS puferu od 2 do 5 sati na sobnoj temperaturi (približno 23 stepena C). U neadsorpcionoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM<125>I obeleženog antigena se pomeša sa serijski razblaženim Fab od interesa (npr. konzistentno sa procenom anti-<10>VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija se može nastaviti duži vremenski period (npr. oko 65 sati) da bi se obezbedilo dostizanje ravnoteže. Nakon toga, ove mešavine se prenose u plocice za vezivanje (detekciju) i inkubiraju se na sobnoj temperature (npr 1 sat). Rastvor se onda odstrani i ploča se ispira osam puta sa 0.1 % polisorbatom 20 (TWEEN-20, registrovani žig) u PBS puferu. Kad se ploče osuše, dodaje se u svaku komoru 150 mikro l scintilatora (MICROSCINT-20™; Packard) i radioaktvnost se očitava u TOPCPUNT gamma brojaču (Packard) deset minuta. Za testove kompetitivnog vezivanja biraju se koncentracije svakog Fab-a koje daju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja.
Prema jednom drugom izvođenju, Kd se meri BIACORE (registrovani žig) uredajem ili testom površinske plazmonske rezonance. Na primer, analiza korišćenjem BIACORE (registrovani žig)-2000 ili BIACORE (registrovani žig)-3000 (BIACORE (registrovani žig), Inc., Piscataway, NJ) se izvodi na 25 stepeni C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom na ∼ 10 jedinica odgovora (RU). U jednom izvođenju, karboksimetil-dekstran biosenzorski čipovi (CM5, BIACORE (registrovani žig), Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima fabrikanta. Antigen se razblaži sa 10 mM natrijumacetatom, pH 4,8, do koncentracije od 5 mikro g/ml (~0,2 mikro M) pre ubrizgavanja pri brzini protoka od 5 mikro l/minuti da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) vezanog proteina. Nakon injekcije antigena, 1 M etanolamin se ubrizgava da blokiraju slobodne grupe. Za kinetička merenja, serija dvostrukih razblaženja Fab-s (0,78 nM do 500 nM) se ubrizgavaju u rastvoru PBS sa 0,05% surfaktanta polisorbata 20 (TWEEN-20™) (PBST) na 25 stepeni C pri brzini protoka od približno 25 mikro l /minutu. Konstante asocijacije (kon) i konstante disocijacije (koff) se izračunavaju korišćenjem jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja jedan-prema-jedan (BIACORE (registrovani žig) Evaluation Softvare verzija 3.2) istovremenim fitovanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) se izračunava kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako u ovom gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance brzina vezivanja premašuje 10<6>M<-1>s<-1>, tada se brzina vezivanja može odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescencije koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, propusni opseg 16 nm) na 25 stepeni C za koncentraciju od 20 nM anti-antigen antitela (Fab verzija) u PBS, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je Spektrofotometar opremljen funkcijom prekida protoka (Aviv Instruments) ili 8000-serije SLM-AMINCO™ spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa kivetom za mešanje.
2. Fragmenti antitela
U određenim izvođenjima, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti antitela mogu biti Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmenti i drugi fragmenti opisani u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Za analizu fragemenata scFv, videti, npr. Pluckthun, u Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), str. 269-315 (1994); takođe videti i WO 93/16185; i US Patent Nos. 5,571,894 i 5,587,458. Za diskusiju o Fab i F(ab’)2fragmentima koji sadrže «spasonosne» epitope koji se vezuju za receptor i koji imaju produženo poluživot in vivo, videti, US Patent No. 5,869,046.
Dijatela su fragmgenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Triabodies and tetrabodies u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže ceo ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili ceo ili deo varijabailnog domena lakog lanca antitela. U određenim izvođenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr. US Patent No. 6,248,516).
Fragmenti antitela se mogu praviti različitim tehnikama, uključujući i proteolitičku digestiju intaktnog antitela, kao i proizvodnju rekombinovanim ćelijama domaćina (npr. E. coli ili phage), kao što je opisano u ovom dokumentu.
3. Himerična i humanizovana antitela
U određenim izvođenjima, navedeno antitelo u ovom dokumentu je himerično antitelo. Određena himerična antitela su opisana, npr. u US Patent No. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerično antitelo obuhvata ne-ljudski varijabilni region (npr. varijabilni region izveden od miša, pacova, hrčka, zeca ili ne-ljudskih primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U jednom daljem primeru, himerično antitelo je antitelo pomereno „za klasu“ (engl."class switched") u delu koje se vezuje za receptor, u kome je klasa ili podklasa promenjena u odnosu na antitelo roditelja. Himerična antitela uključuju fragmente vezivanja antigena istih.
U određenim izvođenjima, himerično antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, ne-ljudsko antitelo je humanizovano da smanji imunogenicitet prema ljudima, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet roditeljskog ne-ljudskog antitela. Generalno, humanizovano antitelo obuhvata jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR, npr. CDR, (ili delovi istih) izvedeni iz ne-ljudskog antitela, a regioni FR (ili delovi istih) su izvedeni iz sekvenci humanog antitela. Opciono, humanizovano antitelo će takođe obuhvatati najmanje jedan deo regiona humane konstante. U nekim izvođenjima, neki ostaci FR u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima iz ne-ljudskog antitela (npr. antitela iz koga su izvedeni HVR ostaci), npr. radi obnavljanja ili poboljšanja specifičnosti ili afiniteta antitela.
Humanizovana antitela i postupci njihovog pravljenja su analizirani, npr. u Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), a dodatno su opisani, npr. u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (opisuju specifičnost utvrđivanja presađivanja regiona (SDR)); Padlan, Mol. Immunol.
28:489-498 (1991) (opisuje proces menjanja površine jednog antitela da mu se promeni specifičnost – eng. “resurfacing"); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (opisuju "nasumično kombinovanje FR"); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer 83:252-260 (2000) (opisuju pristup „vođene selekcije“ prema nasumičnom kombinovanju FR).
Humani okvirni regioni koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju okvirne regione odabrane korišćenjem najpogodnijeg ("best-fit") postupka (videti, npr. Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); okvirne regione izvedene iz konsenzus sekvence humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr. Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); i Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)); humanih zrelih (somatski mutiranih) okvirnih regiona ili humanih okvirnih regiona zametne linije (videti, npr. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirnih regiona izvedenih iz skrininga FR biblioteka (videti, npr. Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Humana antitela
U određenim izvođenjima, ovde navedeno antitelo je humano antitelo. Humana antitela se mogu proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su uopšteno opisana u van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharma. 5:368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Humana antitela se mogu pripremati administriranjem imunogena u transgensku životinju koja je modifikovana da proizvodi neoštećena humana antitela ili neoštećena antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže sve ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, koji zamenjuju endogene imunoglobulinske lokuse, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u hromozome date životinje. Kod takvih transgenskih miševa, endogenski imunoglobulinski lokusi su generalno inaktivisani. Za analizu postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenskih životinja, videti Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Videti takođe, npr. US Patent Nos. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; US Patent No. 5,770,429 koji opisuje tehnologiju HUMAB (REGISTROVANI ŽIG); US Patent No. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE (registrovani žig), i US Patent Application Publication (objavljivanje patentne prijave) No. US 2007/0061900, koji opisuje tehnologiju VELOCI-MOUSE (REGISTROVANI ŽIG)). Humani varijabilni regioni iz neoštećenih antitela koja generišu takve životinje mogu se dodatno modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela se takođe mogu proizvoditi postupcima zasnovanim na hibridomima. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Videti, npr. Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991)). Humana antitela generisana putem tehnologije humanog hibridoma B-ćelije su takođe opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one koji su opisani, na primer, u US Patent No. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006) (opisuje humane ćelije-humani hibridomi). Tehnologija humanih hibridoma (Trioma tehnologija) je takođe opisana u Vollmers, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) i Vollmers, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3): 185-191 (2005).
Humana antitela se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona odbranih iz biblioteka prikaza humano-izvedenih fagova. Takve varijabilne sekvence domena mogu se zatim kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom. Niže su opisane tehnike za selekciju humanih antitela iz biblioteka antitela.
5. Antitela izvedena iz biblioteka
Antitela ovog pronalaska se mogu izolovati skriningom kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnositma. Na primer, u struci su poznati razni postupci za generisanje biblioteka prikaza fagova i skrining takvih biblioteka na antitela koja poseduju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su analizirani, npr. u Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i dalje opisani, npr. u McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks, Meth.Mol. Biol.
248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
U određenim postupcima prikaza fagova, repertoari VH i VL gena se separatno kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i nasumice rekombinuju u bibliotekama fagova, koje zatim mogu da se skriniraju na fag vezivanja antigena, kako je opisano u Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Fag tipično prikazuje fragmente antitela, bilo kao fragmente jednog lanca Fv (scFv) ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imuniziranih izvora obezbeđuju antitela visokog afiniteta na imunogen bez zahteva za konstruisanje hibridoma. Alternativno, može da se klonira nativni repertoar (npr. od čoveka) da bi se obezbedila antitela iz jednog izvora za široku lepezu nesamostalnih (engl. non-self), kao i samostalnih (eng. self) antigena bez ikakve imunizacije, kao što su opisali Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Konačno, nativne
1
biblioteke se mogu praviti i sintetički kloniranjem nerearanžiranih segmenata V-gena iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže nasumičnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i postizanje rearanžiranja in vitro, kako je opisao Hoogenboom, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke fagova humanog antitela uključuju, na primer: US Patent No. 5,750,373, i US Publ. Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
U određenim izvođenjima, ovde navedeno antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim izvođenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za C5, a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim izvođenjima, bispecifična antitela se mogu vezivati za dva različita epitopa C5. Bispecifična antitela se mogu takođe koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa za ćelije koje eksprimiraju C5. Bispecifična antitela se mogu pripremati kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za proizvodnju multispecifičnih antitela uključuju istovremenu rekombinantnu ekspersiju dva para imunoglobulinskog teškog lanca – lakog lanca koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)) i tzv. „ključ-brava“ ("knob-in-hole") inžinjering (videti, npr. US Patent No.
5,731,168). Multispecifična antitela se takođe mogu proizvoditi inženjeringom
2
elektrostatičkih efekata upravljanja za proizvodnju Fc-heterodimerskih molekula antitela (WO 2009/089004A1); unakrsnim vezivanjem dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr. US Patent No. 4,676,980, i Brennan et al., Science 229:81 (1985)); korišćenjem leucinskih patentnih zatvarača (makaza) za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr. Kostelny et al., J. Immunol.
148(5): 1547-1553 (1992)); korišćenjem tehnologije "dijatela" za proizvodnju fragmenata bispecifičnih antitela (videti, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (scFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)); i preparacijom trispecifičnih antitela kako je opisano, npr. u Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena dobijena inženjeringom, uključujući i "antitela hobotnice", takođe obuhvaćena ovim dokumentom (videti, npr. US 2006/0025576).
Antitelo ili fragment u ovom dokumentu takođe obuvhata i „dualno dejstvujući FAb ili "DAF" koji sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za C5 kao i jedan drugi, različiti antigen (videti, na primer, US 2008/0069820).
7. Varijante antitela
U određenim izvođenjima, varijante sekvenci aminokiseline antitela koje su ovde date su zamišljene. Na primer, može se desiti da je poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva datog antitela. Varijante sekvenci aminokiseline nekog antitela se mogu pripremati uvođenjem odgovarajućih modifikacija u kodiranje nukleotidne sekvence antitela ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije iz, i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar sekvenci aminokiseline antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije može da se izvede da bi se došlo do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt poseduje željene karakteristike, npr. vezivanje antigena.
a. Varijante supstitucija, insercija i delecija
U određenim izvođenjima, date su varijante antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselilna. Mesta od interesa za supstitucionalu mutagenezu uključuju regione HVR i FR. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 u rubrici "Poželjne supstitucije". Suštinskije promene su date u Tabeli 1 u rubrici "Egzemplarne supstitucije" i kako su dalje niže opisane u vezi sa klasama bočnog lanca aminokiselina. Supstitucije aminokiseline se mogu uvesti u antitelo od interesa i proizvodi koji su skrinirani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjen imunogenecitet ili poboljšan ADCC ili CDC.
4
[Tabela 1]
Aminokiseline se mogu grupisati prema zajedničkim svojstvima bočnog lanca na: (1) hidrofobne: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutralno hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) kisele: Asp, Glu; (4) bazne: His, Lys, Arg; (5) ostatke koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i (6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije će povlačiti za sobom zamenu jednog člana iz ovih klasa za drugu klasu.
Jedna vrsta supsticione varijante tiče se supstituisanja jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultirajuća(e) varijanta(e) izabrana(e) za dalja proučavanja će imati modifikacije (npr. poboljšanja) u određenim biološkim svojstvima (npr. povećani afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na roditeljsko antitelo i/ili će imati značajno zadržana određena biološka svojstva roditeljskog antitela. Egzemplarna supsticiona varijanta je antitelo zrelog afiniteta, koja se može pogodno generisati, npr. korišćenjem tehnika zrelosti afiniteta zasnovanih na prikazu fagova, kao što su one opisane u ovom dokumentu. Ukratko, jedan ili više ostataka HVR mutiraju, a varijante antitela se prikazuju za fag i skriniraju na određenu biološku aktivnosti (npr. afinitet vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) se mogu vršiti u regionima HVR, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene se mogu vršitu u „žarištima“ ("hotspots,") HVR, tj. ostacima koje kodiraju kodoni koji prolaze mutaciju na visokoj frekevnci tokom procesa somatskog sazrevanja (videti, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji kontaktiraju antigen, sa rezultujućom varijantom VH ili VL koja se testira na afinitet vezivanja. Opisano je afinitetno sazrevanje konstruisanjem i reselekcijom iz sekundarnih biblioteka, npr. u Hoogenboom et al., u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). U nekim izvođenjima afinitetnog sazrevanja, uvodi se diverzitet u varijabilne gene odabrane za sazrevanje bilo kojim od varijeteta postupaka (npr. pomoću PCR sklonog grešci, nasumičnim premeštanjem lanaca ili oligonukeotidno-usmeravavnoj mutagenezi). Potom se kreira sekundarna biblioteka. Zatim se vrši skrining biblioteke radi identifikovanja svih varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje diverziteta uključuje pristupe usmerene na HVR, u kojima se vrši randomizacija nekoliko ostataka HVR (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena se mogu specifično identifikovati, npr. korišćenjem mutageneze skeniranja alaninom ili modeliranjem. Često se targetiraju naročito CDR-H3 i CDR-L3.
U određenim izvođenjima, moguće su pojave supstitucija, insercija ili delecija unutar jednog ili više HVR, sve dok takve promene značajno ne umanjuju sposobnost antitela da veže antigen. Na primer, konzervativne alteracije (npr. konzervativne supstitucije kako su date u ovom dokumentu) koje značajno ne smanjuju afinitet vezivanja mogu da se vrše u regionima HVR. Takve alteracije mogu, na primer, biti izvan antigena koji dolazi u kontakt sa ostacima u regionima HVR. U određenim izvođenjima varijantnih VH i VL sekvenci koje su napred date, svaki HVR je ili nepromenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiseline.
Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji se mogu ciljati za mutagenezu se naziva "mutageneza skeniranja alaninom", kao što ju je opisao Cunningham, Science 244:1081-1085 (1989). U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) radi utvrđivanja da li je došlo do interakcije antitela sa antigenom. Moguće je uvoditi dalje supstitucije na lokacije aminokiseline čime se pokazuje funkcionalna osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigenantitelo za identifikaciju kontaktnih tačaka između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu da se ciljaju ili eliminišu kao kandidati za supstituisanje. Varijante mogu da se skriniraju da se utvrdi da li sadrže željena svojstva.
Insercije sekvenci aminokiseline uključuju amino- i/ili fuzije sa karboksilnim završetkom koje po dužini variraju od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencijalne insercije jednog ili više ostataka aminokiseline. Primeri završnih insercija uključuju antitelo sa ostatkom N-terminalnog metionila. Druge varijante insercija molekula antiteta uključuju fuziju sa Nor C-terminusom antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptid koji povećava vreme poluraspada antitela u serumu.
b. Varijante glikozilacije
U određenim izvođenjima, ovde navedeno antitelo je promenjeno kako bi se povećao ili smanjio stepen glikolizacije antitela. Dodavanje ili delecija mesta glikozilacije na antitelu može prikladno da se postigne menjanjem sekvenci aminokiseline tako da se kreira ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
Kada antitelo obuhvata region Fc, ugljeni hidrat sa kojim je spojen može da se izmeni. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranat, biantenarni oligosaharid koji je generalno spojen N-vezom sa Asn297 domena CH2 iz regiona Fc. Videti, npr. Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da sadrži različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijaličnu kiselinu, kao i fukozu spojenu sa GlcNAc u "stablu" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim izvođenjima, mogu da se naprave modifikacije oligosaharida u antitelu ovog pronalaska kako bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
U jednom izvođenju, obezbeđene su varijante antitela koje imaju ugljenohidratnu strukturu kojoj nedostaje fukoza spojena (direktno ili indirektno) sa nekim regionom Fc. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može da bude od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze unutar lanca šećera na Asn297, u odnosu na sumu svih glikostruktura spojenih sa Asn 297 (npr. kompleksnih, hibridnih i visoko-manoznih struktura) merenu masenim spektrometrom MALDI-TOF kako je opisano, na primer, u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi otprilike na poziciji 297 u Fc regionu (numerisanje ostataka regiona Fc prema EU); međutim, Asn297 se takođe može nalaziti na oko /- 3 aminokiselina na gore ili na dole od pozicije 297, tj. između pozicija 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci u antitelima. Moguće je da su takve varijante fukosilacije poboljšale funkciju ADCC. Videti, npr. US Patent Publication Nos. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koje se tiču "defukolizovanih" ili "fukoza-deficientnih" varijanti antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol.Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode defukolizovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije deficijentne u protein fukozilaciji (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108, Presta, L; i WO 2004/056312, Adams et al., naročito u Primeru (Example) 11), i knockout ćelijske linije, kao što je alfa-1,6-fukozil-transferaza gen, FUT8, knockout CHO ćelije (videti, npr. Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante antitela su dalje date sa biseciranim oligosaharidima, npr. u kojima je biantenarni oligosaharid spojen sa Fc regionom antitela biseciran od strane GlcNAc. Moguće je da su takve varijante antitela smanjile fukozilaciju i/ili poboljšale funkciju ADCC. Primeri ovakvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent No. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su date varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu spojene sa regionom Fc. Moguće je da su takve varijante antitela poboljšale funkciju CDC. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c. Varijante Fc regiona
U određenim izvođenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina mogu se uvesti u Fc region antitela koje je navedeno u ovom dokumentu, stvarajući na taj način varijantu Fc regiona. Varaijanta Fc regiona može sadržati sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. neku supstituciju) na jednoj ili više pozicija aminokiselina.
U određenim izvođenjima, ovaj pronalazak razmatra varijantu antitela koja poseduje neke, ali ne sve efektorske funkcije, koje je čine poželjnim kandidatom za aplikacije u kojima je vreme poluraspada antitela in vivo važno, a ipak određene funkcije efektora (kao što su komplement i ADCC) su nepotrebne ili štetne. Mogu se sprovoditi in vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti radi potvrđivanja smanjenja/nestajanja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, mogu se izvoditi testovi vezivanja Fc receptora (FcR) kako bi se osiguralo da antitelo nema Fc gama R vezivanje (stoga verovatno nema aktivnost ADCC), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, izražavaju samo Fc gama RIII, dok monociti izražavaju Fc gama RI, Fc gama RII i Fc gama RIII. Izražavanje FcR na hematopietske ćelije je sumirano u Tabeli 3 na strani 464 u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa su opisani u US Patent No. 5,500,362 (videti, npr. Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); US Pat. No. 5,821,337 (videti Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu se upotrebiti postupci testiranja koji nisu radioaktivni (videti, na primer, ACTI™ neradioaktivan test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96 (registrovani žig) neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i prirodne ćelije ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa se može procenjivati in vivo, npr. u životinjskom modelu, kao što je onaj koji je objavljen u Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi C1q vezivanja se takođe mogu vršiti da se potvrdi da antitelo nije sposobno da se veže za C1q i otuda nema aktivnost CDC. Videti, npr. ELISA vezivanje C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Radi procene aktivacije komplementa, može se obaviti CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). Takođe mogu da se vrše FcRn vezivanje i in vivo određivanja klirensa/poluraspada korišćenjem postupaka
1
koji su poznati u struci (videti, npr. Petkova et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US Patent No. 6,737,056). Takvi mutanti Fc uključuju Fc mutante sa supstitucijama na jednoj ili više pozicija aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući i takozvani "DANA" Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent No. 7,332,581).
Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili oslabljenim vezivanjem za FcRs. (Videti, npr. US Patent No. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)).
U određenim izvođenjima, varijanta antitela obuhvata region Fc sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na pozicijama 298, 333 i/ili 334 regiona Fc (EU numerisanje ostataka).
U nekim izvođenjima, pravljene su alteracije u regionu Fc koje su rezultirale promenjenim (tj. bilo poboljšanim ili oslabljenim) vezivanjem C1q i/ili citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), npr. kako je opisano u US Patent No. 6,194,551, WO 1999/51642 i Idusogie et al., J. Immunol.
164:4178-4184 (2000).
Antitela sa povećanim vremenom poluraspada i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer majčinih IgGs na fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934 (Hinton et al.). Ta antitela obuhvataju
2
region Fc sa jednom ili više supstitucija u njemu koje poboljšavaju vezivanje regiona Fc za FcRn. Takve varijante Fc uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka regiona Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstituciju ostatka regiona Fc 434 (US Patent No. 7,371,826).
Videti takođe i Duncan, Nature 322:738-40 (1988); US Patent No.
5,648,260; US Patent No. 5,624,821; i WO 1994/29351 koji se tiču drugih primera varijanti regiona Fc.
d. Varijante antitela dobijene inženjeringom cisteina
U određenim izvođenjima, može biti poželjno kreirati antitela sa cisteinom, npr. "thioMAbs", u kojima je jedan ili više ostataka antitela supstituisano ostacima cisteina. U posebnim izvođenjima, ti supstituisani ostaci nastaju na dostupnim mestima antitela. Supstituisanjem ovih ostataka cisteinom, reaktivne tiol grupe se time pozicioniraju na dostupna mesta antitela i mogu se koristiti za spregu antitela sa drugim delovima, kao što su delovi lekova ili linker-lek komonente, radi kreiranja imunokonjugata, kako je ovde opisano u nastavku ovog dokumenta. U određenim izvođenjima, bilo koji od, ili više sledećih ostataka se mogu supstituisati cisteinom: V205 (numeracija određena prema Kabat-u) iz lakog lanca; A118 (numeracija prema EU) iz teškog lanca; i S400 (numeracija prema EU) iz teškog lanca Fc regiona. Antitela dobijena inženjeringom cisteina se mogu generisati kako je opisano, npr. u US Patent No. 7,521,541.
e. Derivati antitela
U određenim izvođenjima, ovde navedeno antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske grupe koje su poznate u struci i svuda dostupne. Grupe pogodne za derivatizaciju antitela uključuju polimere rastvorive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorivih u vodi uključuju polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetil celulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, etilen/malenski anhidrid kopolimer, poliamino kiseline (bilo homopolimere ili nasumice odabrane kopolimere) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilenglikol, polipropilen glikol, polipropilen glikol homopolimere, polipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekolarnu težinu i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera pripojenih antitelu može da varira i, ukoliko je pripojeno više od jednog polimera, oni mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući i posebna svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima itd.
U jednom drugom izvođenju, obezbeđeni su konjugati antitela i neproteinske grupe koje se mogu selektivno zagrevati izalganjem zračenju. U jednom izvođenju, neproteinska grupa je ugljenična nanocev (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i obuhvata talasne dužine koje ne štete običnim ćelijama, ali koje greju neproteinsku grupu do temperature na kojoj se ubijaju ćelije u blizini antitelo-neproteinske grupe.
4
B. Rekombinantni postupci i kompozicije
Antitela se mogu proizvoditi korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr. kako je opisano u US Patent No. 4,816,567. U jednom izvođenju, navedena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-C5 antitelo koje je opisano u ovom dokumentu. Takva nukleinska kiselina može da kodira sekvencu amino kiseline koja sadrži VL i/ili sekvencu aminokiseline koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U daljem izvođenju, naveden je jedan ili više vektora (npr. ekspresivni vektori) koji sadrži(e) takvu nukleinsku kiselinu. U daljem izvođenju, navodi se ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom izvođenju, ćelija domaćina obuhvata (npr. transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu aminokiseline koja sadrži VL antitela i sekvencu aminokiseline koja sadrži VH anatitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu aminokiseline koja sadrži VL antitela i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu aminokiseline koja sadrži VH antitela. U jednom izvođenju, ćelija domaćina je eukariotična, npr. ovarijalna ćelija kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom izvođenju, naveden je postupak pravljenja anti-C5 antitela, pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je napred navedeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela i, opciono, rekuperaciju antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma kulture ćelije domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju anti-C5 antitela, nukleinska kiselina, koja kodira antitelo, npr. kako je napred opisano, se izoluje i umeće u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina.Takva nukleinska kiselina se može lako izolovati i sekvencionisati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su u stanju da specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Ćelije domaćina pogodne za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije opisane u ovom dokumentu. Na primer, antitela se mogu proizvoditi u bakterijama, posebno kada nisu neophodne glikosilacija i funkcija Fc efektora. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti, npr. US Patent Nos. 5,648,237, 5,789,199 i 5,840,523. (Videti, takođe i Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, gde se opisuje ekspresija fragmenata antitela u E. coli). Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u solubilnoj frakciji i može se dalje prečišćavati.
Pored prokariotskih, eukariotski mikroorganizmi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su za kloniranje ili ekspresiju domaćina za vektore koji kodiraju antitela, uključujući i sojeve gljivica i kvasca čije su putanje glikozilacije „humanizovane“, što dovodi do proizvodnje antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Videti Gerngross, Nat. Biotech.
22:1409-1414 (2004), i Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Ćelije domaćina pogodne za ekspresiju glikoziliranog antitela su takođe izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakuloviralni sojevi koji se mogu koristiti u konjukciji sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture ćelija biljaka se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr. US Patent Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 (gde se opisuje tehnologija PLANTITELA™ za proizvodnju antitela u transgenskim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se takođe mogu koristiti kao domaćini. Na primer, mogu biti korisne linije ćelija sisara koje su prilagođene da rastu u suspenziji. Drugi primeri korisnih linija ćelija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); linija humanog embriona bubrega (ćelije 293 ili 293 kako su opisane, npr. u Graham et al., J. Gen Virol.
36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK); sertolijeve ćelije miševa (TM4 ćelije kako su opisane, npr. u Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkih zelenih majmuna (VERO-76); ćelije humanog cervikalnog karcinoma (HELA); ćelije bubrega psa (MDCK; ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A); humane plućne ćelije (W138); humane ćelije jetre (Hep G2); tumor dojke miša (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne linije ćelija domaćina sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući i DHFR- CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i linije ćelija mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Za analizu određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr. Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), str.
255-268 (2003).
Poželjno je da se poliklonska antitela gaje u životinjama višestrukim subkutanim (sc) ili intraperitonealnim (ip) ubrizgavanjima relevantnog antigena i ađuvansa. Korisno bi bilo konjugovati relevantni antigen sa proteinom koji je imunogeničan u vrstama koje treba imunizovati, npr. do ključnog prilepka hemocijanina, serum albumina, tireoglobulina govečeta, ili inhibitora tripsina sirove soje korišćenjem bifunkcionalnog ili derivativnog agensa, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid estra (konjukcijom kroz ostatke cisteina), N-hidroksisukcinimidom (kroz ostatke lizina), glutaraldehida, sukcinskog anhidrida, SOCl2, ili R<1>N=C=NR, gde su R i R<1>različite alkil grupe.
Životinje (obično ne-ljudske životinje, sisari) se imunizuju protiv antigena, imunogenskih konjugata ili derivata kombinovanjem, npr. 100 mikro g ili 5 mikro g proteina ili konjugata (za zečeve odnosno miševe) sa 3 zapremine kompletnog Freund-ovog ađuvansa i ubrizgavanjem rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije, životinje dobijaju buster dozu od 1/5 do 1/10 početne količine peptida ili konjugata u kompletnom Freund-ovom ađuvansu subkutanim ubrizgavanjem na više mesta. Sedam do 14 dana kasnije, životinjama se uzima krv i serum se testira na titar antitela. Životinje dobijaju buster dozu sve dok titar ne dostigne plato. Poželjno je da se životinji da buster doza konjugata istog antigena, ali konjugovana sa različitim proteinom i/ili kroz različiti reagens za unakrsno povezivanje. Konjugati se takođe mogu praviti u kulturi ćelije rekombinanta kao fuzije proteina. Takođe, agregirajući reagensi, kao što je stipsa, su pogodni za korišćenje radi povećanja imunološkog odgovora.
Monoklonska antitela se dobijaju iz populacije značajno homogenih antitela, tj. individualna antitela koja čine tu populaciju su identična, osim eventualno prirodno nastalih mutacija i/ili posttranslacionih modifikacija (npr. izomerizacija, amidacija) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Stoga premodifikator "monoklonsko" označava karakter antitela koje nije mešavina diskretnih antitela.
Na primer, monoklonska antitela se mogu proizvoditi korišćenjem postupka hibridoma koji su prvi put opisali Kohler et al. Nature 256(5517):495-497 (1975). U postupku hibridoma, miš ili neka druga odgovarajuća životinjadomaćin, kao što je hrčak, se imunizuje na ovde napred opisan način da podstakne limfocite koji produkuju ili su sposobni da produkuju antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti se mogu imunizovati in vitro.
Sredstvo za imunizaciju će tipično uključivati antigenski protein ili varijantu fuzije istog. Generalno, koriste se ili periferni krvni limfociti (PBL) ukoliko se žele ćelije humanog porekla, ili se koriste ćelije jetre ili ćelije limfnog čvora ukoliko se žele izvori sisara koji nisu humanog porekla. Limfociti se zatim spajaju imortalizovanom ćelijskom linijom korišćenjem pogodnog fuzionišućeg agensa, kao što je polietilen glikol, da formiraju ćeliju hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), str. 59-103).
Imortalizovane linije ćelija su obično transformisane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma glodara, goveda i humanog porekla. Obično se koriste linije ćelija mijeloma pacova ili miša. Tako pripremljene ćelije hibridoma se zasejavaju i gaje u pogodnom medijumu za uzgoj kulture za koji je poželjno da sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili opstanak nefuzionisanih ćelija roditeljskog mijeloma. Na primer, ukoliko ćelijama roditeljskog mijeloma nedostaje enzim hipoksantin-guanin forsforiboziltransferaza (HGPRT ili HPRT), mikrobiološka hranjiva podloga za uzgoj kulture za hibridome će tipično uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), a to su supstance koje sprečavaju rast HGPRT-deficitarnih ćelija.
Preferirane imortalizovane ćelije mijeloma su one koje se efikasno fuziraju, podržavaju stabilan visok stepen proizvodnje antitela od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela i senzitivne su na mikrobiološke hranjive podloge, kao što je HAT podloga. Među njima, preferirane su ćelijske linije murinskog mijeloma, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 tumora miševa, koje se mogu nabaviti od Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, i SP-2 ćelije (i njihovi derivati, npr. X63-Ag8-653) koje se mogu nabaviti od American Type Culture Collection, Manassas, Virginia USA. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog hetermiojeloma su takođe opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor et al., J Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), str. 51-63).
Mikrobiološka hranjiva podloga na kojoj se gaje ćelije hibridoma se testira za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena. Po mogućustvu, specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koja su proizvele ćelije hibridoma se utvrđuje imunoprecipitacijom ili pomoću testa vezivanja in vitro, kao što su radioimunološki test (RIA) ili enzimski povezan imunosorbentni test (ELISA). Takve tehnike i testovi su poznati u struci. Na primer, afinitet vezivanja se može utvrditi Scatchard-ovom analizom iz Munson, Anal Biochem.
107(1):220-239 (1980).
Nakon identifikovanja ćelija hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonirane ćelije se mogu subklonirati ograničavanjem procedura razblaživanja i mogu se uzgajati standarnim postupcima (Goding, supra). Pogodne mikrobiološke hranjive podloge za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 podlogu. Pored toga, ćelije hibridoma se mogu uzgajati in vivo kao tumori u nekom sisaru.
Monoklonska antitela sekretovana pomoću subklonova se pogodno odvajaju od mikrobiološke hranjive podloge, ascitne tečnosti ili seruma klasičnim procedurama prečišćavanja imunoglobulina, kao što su, na primer, protein A-Sefaroza, hidroksiapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili hromatografija koja se zasniva na afinitetu.
Antitela se mogu proizvoditi imunizacijom odgovarajuće životinje domaćina protiv antigena. U jednom izvođenju, koje se daje samo u svrhe ilustrovanja, taj antigen je polipeptid koji sadrži C5 punog lanca. U jednom izvođenju, taj antigen je polipeptid koji sadrži beta lanac C5 (SEQ ID NO: 40). U jednom izvođenju, koje se daje samo u svrhe ilustrovanja, taj antigen je polipeptid koji sadrži domen MG1-MG2 (SEQ ID NO: 43) beta lanca C5. U jednom izvođenju, taj antigen je polipeptid koji sadrži domen MG1 (SEQ ID NO: 41) beta lanca C5. U jednom izvođenju, antigen je polipeptid koji sadrži region koji korespondira aminokiselinama na pozicijama 19 do 180 beta lanca C5. U jednom izvođenju, antigen je polipeptid koji sadrži region koji korespondira aminokiselinama na pozicijama 33 do 124 beta lanca C5. U jednom izvođenju, antigen je polipeptid koji sadrži najmanje jedan fragment odabran od aminokiselina 47-57, 70-76 i 107-110 beta lanca C5 (SEQ ID NO: 40). U jednom izvođenju, taj antigen je polipeptid koji sadrži fragment beta lanca C5 koji obuhvata najmanje jednu aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Thr47, Glu48, Ala49, Phe50, Asp51, Ala52, Thr53, Lys57, His70, Val71, His72, Ser74, Glu76, Val107, Ser108, Lys109 i His110. U jednom izvođenju, taj antigen je polipeptid koji sadrži fragment beta lanca C5 koji obuhvata najmanje jednu aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji od Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110. Takođe uključena u ovo otkriće su i antitela proizvedena imunizacijom životinje protiv tog antigena. Ta antitela mogu da inkorporiraju bilo koje od svojstava, pojedinačno ili u kombinaicji, kako je napred opisano u "Primerima anti-C5 antitela".
Sledeći aspekti/izvođenja saopšteni u odeljcima C. i D. nisu prema pronalasku i dati su samo u svrhe ilustrovanja.
1
C. Testovi
Anti-C5 antitela navedena u ovom dokumentu mogu se identifikovati, za njih se može uraditi skrining ili se mogu okarakterisati prema njihovim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkim aktivnostima različitim testovima poznatim u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, antitelo ovog pronalaska je testirano na njegovu aktivnost vezivanja antigena, npr. poznatim postupcima, kao što su ELISA, Western blot, BIACORE (registrovani žig) itd.
U jednom drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči za vezivanje za C5 sa anti-C5 antitelom opisanom u ovom dokumentu. U određenim izvođenjima, kada je takvo takmičarsko antitelo prisutno u prekomernoj količini, ono blokira (npr. smanjuje) vezivanje referentnog antitela za C5 za najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili više. U određenim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili više. U određenim izvođenjima, takvo takmičarsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) koji je vezan anti-C5 antitelom opisanim u ovom dokumentu (npr. anti-C5 antitelom opisanim u Tabeli 2). Detaljni reprezentativni postupci za mapiranje epitopa, za koji se vezuje antitelo, su dati u: Morris, "Epitope Mapping Protocols," u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) (1996).
U reprezentativnom kompetitivnom testu, imobilisano C5 je inkubirano u rastvoru koji sadrži prvo markirano (referentno) antitelo koje se vezuje za C5 i
2
drugo nemarkirano antitelo koje se testira na njegovu sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom za vezivanje sa C5. To drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrolno, imobilisano C5 je inkubirano u rastvoru koji sadrži prvo markirano antitelo, ali ne i drugo nemarkirano antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje prvog antitela za C5, višak nevezanog antitela se uklanja, a meri se količina markera koja se dovodi u vezu sa imobiliziranim C5. Ukoliko se količina markera koja se dovodi u vezu sa imobilisanim C5 značajno smanji u ispitnom uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, onda to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za C5. Videti: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1988).
U jednom drugom reprezentativnom kompetitivnom testu, korišćena je analiza BIACORE (registrovani žig) za utvrđivanje spsobnosti ispitnog anti-C5 antitela da se takmiči sa vezivanjem za C5 od strane drugog (referentnog) anti-C5 antitela. U dodatnom aspektu u kome se BIACORE (registrovani žig) instrument (na primer, BIACORE (registrovani žig) 3000) koristi prema preporukama proizvođača, C5 protein se hvata na čipu CM5 BIACORE (registrovani žig) korišćenjem standardne tehnike poznate u struci da se generiše površina prekrivena sa C5. Tipično bi se na čipu uparivalo 200-800 rezonantnih jedinica C5 (količina koja daje lako merljive nivoe vezivanja, ali koja brzo postaje zasićena koncentracijama ispitnog antitela koje se koristi). Ova dva antitela (tj. ispitno i referentno antitelo) čiju sposobnost da se međusobno takmiče treba proceniti, se mešaju u molarnom odnosu mesta vezivanja 1:1 u odgovarajućem puferu radi stvaranja ispitne smeše. Kada se izračunavaju koncentracije na osnovu mesta vezivanja, pretpostavlja se da je molekularna težina ispitnog ili referentnog antitela ukupna molekarularna težina odgovarajućeg antitela podeljena sa brojem mesta vezivanja C5 na antitelu. Koncentracija svakog antitela (tj. ispitnog i referentnog antitela) u ispitnoj mešavini treba da bude dovoljno visoka da odmah saturiše mesta vezivanja za to antitelo na molekulima C5 uhvaćenim na čipu BIACORE (registrovani žig). Ispitna i referentna antitela u mešavini su iste molarne koncentracije (na osnovu vezivanja), tipično između 1,00 i 1,5 mikromolara (na osnovu mesta vezivanja). Takođe su pripremani odvojeni rastvori koji sadrže samo ispitno antitelo i samo referentno antitelo. Ispitno antitelo i referentno antitelo u ovim rastvorima treba da budu u istom puferu i u istoj koncentraciji i uslovima kao i u ispitnoj mešavini. Ispitna mešavaina koja sadrži ispitno antitelo i referentno antitelo se propušta preko čipa BIACORE (registrovani žig) prevučenog sa C5 i beleži se ukupna količina vezivanja. Čip se zatim tretira na takav način da se ukloni vezano ispitno ili referentno antitelo, a da se pri tome ne ošteti C5 vezan za čip. Ovo se uobičajeno radi tretiranjem čipa sa 30 mM HC1 u trajanju od 60 sekundi. Zatim se rastvor koji sadrži samo ispitno antitelo propušta preko površine prevučene sa C5 i beleži se količina vezivanja. Čip se ponovo tretira da se ukloni celokupno vezano antitelo, a da se pri tom ne ošteti C5 vezan za čip. Rastvor samo referentnog antitela se zatim propušta preko površine prevučene sa C5 i beleži se količina vezivanja. Maksimalno teoretsko vezivanje smeše ispitnog antitela i referentnog antitela se zatim izračunava, i to predstavlja zbir vezivanja svakog antitela (tj. ispitnog i referentnog) kada se propušta samo preko površine C5. Ukoliko stvarno zabeleženo vezivanje smeše iznosi manje od ovog teoretskog maksimuma, onda se ispitno antitelo i referentno antitelo međusobno takmiče za vezivanje C5. Otuda je, generalno, ispitno anti-C5 antitelo koje se takmiči je ono koje će se vezati za C5 u napred navedenom BIACORE (registrovani žig) testu blokiranja tako da, u toku testa i u prisustvu referentnog anti-C5 antitela, zabeleženo vezivanje iznosi između 80% i 0,1% (npr. 80% > do 4%) od maksimalnog teoretskog vezivanja, konkretno između 75% i 0,1 % (npr. 75% do 4%) od maksimalnog teoretskog vezivanja i, još konkretnije, između 70% i 0,1% (npr. 70% do 4%) od maksimalnog teoretskog vezivanja (kao što je napred definisano) ispitnog antitela i referentnog antitela u kombinaciji.
4
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par VH i VL odabran iz antitela CFA0341 i CFA0330. U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom odabranim iz: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 i CFA0672. U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom CFA0329. U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom CFA0666.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par antitela CFA0305 ili 305LO5.
U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par selektovan iz: CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0675 i CFA0672. U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom CFA0666. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH i VL par antitela CFA0305 ili 305LO5. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži par VH i VL odabran iz VH iz SEQ ID NO:22 i VL iz SEQ ID NO:26, ili VH iz SEQ ID NO:21 i VL iz SEQ ID NO:25. U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par VH i VL odabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO: 15; (b) VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 14; (c) VH iz SEQ ID NO:6 i VL iz SEQ ID NO:16; (d) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO:12; (e) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (f) VH iz SEQ ID NO: 1 i VL iz SEQ ID NO: 11; (g) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO:19; (h) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO:17; i (i) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO:18. U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH iz SEQ ID NO:23 i VL iz SEQ ID NO:27. U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje sadrži VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO:17.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par VH i VL odabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO:1 i VL iz SEQ ID NO:11; (b) VH iz SEQ ID NO: 22 i VL iz SEQ ID NO:26; (c) VH iz SEQ ID NO:21 i VL iz SEQ ID NO:25; (d) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO:15; (e) VH iz SEQ ID NO:4 i VL iz SEQ ID NO:14; (f) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16; (g) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO:12; (h) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (i) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO:19; (j) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO: 17; (k) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO:18; (l) VH iz SEQ ID NO: 23 i VL iz SEQ ID NO:27; i (m) VH iz SEQ ID NO:10 i VL iz SEQ ID NO:20.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par VH i VL odabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO: 22 i VL iz SEQ ID NO:26; (b) VH iz SEQ ID NO:21 i VL iz SEQ ID NO:25; (c) VH iz SEQ ID NO:5 i VL iz SEQ ID NO:15; (d) VH iz SEQ ID NO:4 i VL iz SEQ ID NO:14; (e) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16; (f) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO:12; (g) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (h) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO:19; (i) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO: 17; (j) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO:18; (k) VH iz SEQ ID NO: 23 i VL iz SEQ ID NO:27.
U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo ovog pronalaska se takmiči za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par VH i VL odabran iz VH iz SEQ ID NO:1 i VL iz SEQ ID NO:11, ili VH iz SEQ ID NO: 10 i VL iz SEQ ID NO:20.
U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini. U određenim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini i takmiči se za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par VH i VL odabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO:1 i VL iz SEQ ID NO:11; (b) VH iz SEQ ID NO:5 i VL iz SEQ ID NO:15; (c) VH iz SEQ ID NO:4 i VL iz SEQ ID NO:14; (d) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16; (e) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO:12; (f) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (g) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO:19; (h) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO: 17; (i) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO:18; i (j) VH iz SEQ ID NO:10 i VL iz SEQ ID NO:20. U daljim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini i takmiči se za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par VH i VL odabran iz: (a) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO: 15; (b) VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 14; (c) VH iz SEQ ID NO:6 i VL iz SEQ ID NO:16; (d) VH iz SEQ ID NO:2 i VL iz SEQ ID NO:12; (e) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13; (f) VH iz SEQ ID NO: 1 i VL iz SEQ ID NO: 11; (g) VH iz SEQ ID NO:9 i VL iz SEQ ID NO:19; (h) VH iz SEQ ID NO:7 i VL iz SEQ ID NO:17; i (i) VH iz SEQ ID NO:8 i VL iz SEQ ID NO:18. U daljim izvođenjima, ovo anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
U nekim izvođenjima, anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini i takmiči se za vezivanje C5 sa antitelom koje uključuje par odabran iz VH iz SEQ ID NO:1 i VL iz SEQ ID NO:11 ili VH iz SEQ ID NO:10 i VL iz SEQ ID NO:20. U daljim izvođenjima, ovo anti-C5 antitelo se vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
U određenim izvođenjima, da li se neko anti-C5 antitelo ovog pronalaska vezuje za određeni epitop može da se odredi kako sledi: mutanti tačke C5 u kojima se amino kiselina (izuzev alanina) na C5 supstituiše alaninom se eksprimiraju na 293 ćelije, a vezivanje anti-C5 antitela za C5 mutante se testira postupcima ELISA, Western blot ili BIACORE (registrovani žig); u kojima značajno smanjenje ili eliminacija vezivanja ovog anti-C5 antitela za C5 mutant u odnosu na njegovo vezivanje za divlji tip C5 ukazuje na to da se ovo anti-C5 antitelo vezuje za epitop koji uključuje tu amino kiselinu na C5. U određenim izvođenjima, amino kiselina na C5 koja će biti supstituisana alaninom se bira iz grupe koja se sastoji iz Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110 beta lanca C5 (SEQ ID NO:40). U daljim izvođenjima, amino kiselina na C5 koja će biti zamenjena alaninom je Asp51 ili Lys109 beta lanca C5 (SEQ ID NO:40).
U jednom drugom izvođenju, da li se neko anti-C5 antitelo sa pH-zavisnim karakteristikama vezivanja vezuje za određeni epitop može da se odredi kako sledi: mutanti tačke C5 u kojima se histidinski ostatak na C5 supstituiše drugom amino kiselinom (npr., tirozinom) su eksprimirani na 293 ćelije, a vezivanje anti-C5 antitela za C5 mutante se testira postupcima ELISA, Western blot ili BIACORE (registrovani žig); pri tome značajno smanjivanje vezivanja ovog anti-C5 antitela za divlji tip C5 u kiseloj pH sredini u odnosu na njegovo vezivanje za C5 mutant u kiseloj pH sredini, ukazuje da se anti-C5 antitelo vezuje za epitop koji uključuje onaj histidinski ostatak na C5. U daljim izvođenjima, vezivanje anti-C5 antitela za divlji tip C5 u neutralnoj pH sredini nije značajno smanjeno u odnosu na njegovo vezivanje za C5 mutant u neutralnoj pH sredini. U određenim izvođenjima, ovaj histidinski ostatak na C5 koji će biti supstituisan drugom amino kiselinom se bira iz grupe koja uključuje His70, His72 i His110 beta lanca C5 (SEQ ID NO:40). U jednom daljem izvođenju, ovaj histidinski ostatak His70 je supstituisan tirozinom.
2. Testovi aktivnosti
U jednom aspektu, navedeni su testovi za identifikaciju njihovih anti-C5 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da uključuje, npr. inhibiranje aktivacije C5, sprečavanje cepanja C5 da se dobiju C5a i C5b, blokiranje pristupa C5 konvertaze mestu cepanja na C5, blokiranje hemolitičke aktivnosti izazvane aktivacijom C5 itd. Data su i antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro.
U određenim izvođenjima, antitelo ovog pronalaska se testira na takvu biološku aktivnost.
U određenim izvođenjima, da li ispitno antitelo inhibira cepanje C5 na C5a i C5b se određuje postupcima opisanim u, npr., Isenman et al., J Immunol. 124(1):326-331 (1980). U jednom drugom izvođenju, ovo se određuje postpcima za specifično otkrivanje cepanih proteina C5a i/ili C5b, npr. testovima ELISA ili Western blot. Tamo gde se otkrije smanjena količina proizvoda cepanja C5 (t.j. C5a i/ili C5b) u prisustvu ispitnog antitela (ili nakon kontakta sa njim), to ispitno antitelo se identifikuje kao antitelo koje može da inhibira cepanje C5. U određenim izvođenjima, koncentracija i/ili fiziološka aktivnost C5a može da se meri postupcima, npr. testovima hemotakse, RIA, ili ELISA (videti, npr. Ward and Zvaifler J. Clin. Invest.
50(3):606-616 (1971)).
U određenim izvođenjima, da li ispitno antitelo blokira pristup C5 konvertaze do C5 se određuje postupcima za otkrivanje interakcije proteina između C5 konvertaze i C5, npr. testovima ELISA ili BIACORE (registrovani žig). Tamo gde su interakcije smanjene u prisustvu ispitnog antitela (ili nakon kontakta sa njim), to ispitno antitelo se identifikuje kao antitelo koje može da blokira pristup C5 konvertaze do C5.
U određenim izvođenjima, aktivnost C5 može da se meri kao funkcija sposobnosti njegove ćelije za liziranje u telesnim tečnostima subjekta. Sposobnost ćelije za liziranje C5 ili smanjenje iste može da se meri postupcima dobro poznatim u struci, na primer, konvencionalnim testom hemolize, kao što je test hemolize koji su opisali Kabat and Mayer (eds), Experimental Immunochemistry, 2nd Edition, 135-240, Springfield, IL, CC
1
Thomas (1961), strane 135-139, ili konvencionalnom varijacijom tog testa, kao što je postupak hemolize eritrocita kokošaka koji je opisan u, npr. Hillmen et al., N. Engl. J. Med.350(6): 552-559 (2004). U određenim izvođenjima, aktivnost ili inhibicija C5 se kvantifikuju primenom testa CH50eq. Test CH50eq je postupak za merenje ukupne klasične aktivnosti komplementa u serumu. Ovaj test je litičan test, koji koristi eritrocite senzitizovane antitelom kao aktivator klasičnog puta komplementa, i različita razblaženja ispitinog seruma da se odredi količina potrebna da se dobije 50% liziranja (CH50). Procenat hemolize može da se odredi, na primer, korišćenjem spektrofotometra. Test CH50eq daje posrednu meru formiranja terminalnog kompleksa komplementa (TCC) jer su sami TCC direktno odgovorni za izmerenu hemolizu. Inhibicija aktivacije C5 može takođe da se otkrije i/ili izmeri navedenim postupcima, odnosno onako kako je ilustrovano u radnim primerima. Korišćenjem testova ove i drugih pogodnih vrsta, mogu da se podvrgnu skriningu antitela koja su kandidati, odnosno za koje se smatra da mogu da inhibiraju aktivaciju C5. U određenim izvođenjima, inhibicija aktivacije C5 uključuje najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, ili 40% ili veće smanjenje aktivacije C5 u nekom testu u poređenju sa dejstvom negativne kontrole u sličnim uslovima. U nekim izvođenjima, ovo se odnosi na inhibiciju aktivacije C5 za najmanje 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% ili više.
D. Imunokonjugati
Ovaj pronalazak navodi i imunokonjugate koji uključuju ovde opisano anti-C5 antitelo konjugovano u jedan ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemioterapijski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
1 1
U jednom izvođenju, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo konjugovano za jedan ili više lekova, uključujući i majtansinoid (videti, US Patent Nos. 5,208,020, 5,416,064 i Evropski patent EP 0 425 235 B1); auristatin, kao što su monometilauristatin delovi leka DE i DF (MMAE i MMAF) (videti, US Patent Nos. 5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (videti, US Patent Nos.
5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); neki antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (videti Kratz et al., Current Med. Chem.
13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.
45:4336-4343 (2002); i US Patent No. 6,630,579); metotreksat; vindesin; neki taksan, kao što su docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; neki trihotecen; i CC1065.
U jednom drugom izvođenju, imunokonjugat uključuje jedno antitelo, kako je ovde opisano, konjugovano za enzimski aktivni toksin ili njegov fragment, uključujući i A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz bakterije Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modeksina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i tricotecene.
1 2
U jednom drugom izvođenju, imunokonjugat uključuje jedno antitelo, kako je to ovde opisano, konjugovano u radioaktivni atom da se formira radioaktivno obeleženi konjugat (radiokonjugat). Za produkciju radiokonjugata postoji spektar različitih radioaktivnih izotopa. U primere spadaju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivni izotopi Lu. Kada se radiokonjugat koristi za otkrivanje, on može da uključuje radioaktivni atom za scintigrafska ispitivanja, na primer tc99m ili 1123, ili spin marker za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) poznato i pod skraćenicom mri), kao što su opet jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati jednog antitela i citotoksični agens se mogu dobiti korišćenjem različitih bifunkcionalnih agenasa za kupliranje proteina, kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan- 1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni esteri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), di-izocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, jedan ricinski imunotoksin može da se pripremi kako je opisano u Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triamin penta sirćetna kiselina (MX-DTPA) je egzemplarni helirajući agens za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Videti WO94/11026. Ovaj linker može da bude "linker koji se može cepati" koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu se koristiti linker nepostojan u kiseloj sredini, linker osetljiv na
1
peptidazu, fotolabilni linker, dimetilni linker ili linker sa sadržajem disulfida (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); US Patent br. 5,208,020).
Imunokonjugati ili ADC sadržani ovde se odnose izričito na one konjugate pripremljene sa reagensima koji sadrže unakrsni linker, koji uključuju BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr., od kompanije Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL. U.S.A).
Sledeći aspekti/izvođenja objavljeni u odeljku E. nisu uključeni u ovaj pronalazak, već se navode samo za svrhe ilustracije.
E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i otkrivanje
U određenim izvođenjima, svaki od ovde pomenutih anti-C5 antitela su korisna za otkrivanje (detekciju) prisustva C5 u biološkom uzorku. Izraz "detekcija" se ovde koristi u značenju kvalitativne ili kvantitativne detekcije. U određenim izvođenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što su serum, puna krv, plazma, bioptirani uzorak, uzorak tkiva, suspenziju ćelija, pljuvačku, sputum, oralnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, amnionsku tečnost, tečnost iz ascita, mleko, kolostrum, sekret mamarnih žlezda, limfu, urin, znoj, suznu tečnost, želudačnu tečnost, sinovijalnu tečnost, peritonealnu tečnost, tečnost očnog sočiva i mukus.
U jednom izvođenju, predstavlja se anti-C5 antitelo za korišćenje u postupku dijagnostike ili detekcije. U daljem aspektu, predstavlja se postupak za detekciju prisustva C5 u biološkom uzorku. U određenim
1 4
izvođenjima, ovaj postupak uključuje kontakt tog biološkog uzorka sa anti-C5 antitelom, kako je ovde opisano, u uslovima koji dozvoljavaju vezivanje ovog anti-C5 antitela za C5, i otkrivanje da li se formira kompleks između ovog anti-C5 antitela i C5. Ovaj postupak se može obavljati in vitro ili in vivo. U jednom izvođenju, anti-C5 antitelo se koristi da se odaberu subjekti podobni za terapiju anti-C5 antitelom, npr. tamo gde je C5 biomarker za odabir pacijenata.
U određenim izvođenjima, predstavljaju se markirana anti-C5 antitela. Ovo markiranje može da bude marker ili deo koji se otkriva neposredno (kao što su fluorescentna, hromaforna, hemiluminescentna i radioaktivna obeležavanja, kao i obeležavanje elektronskom gustinom), kao i delovi poput enzima ili liganda, koji se otkrivaju indirektno, npr. enzimskom reakcijom ili molekularnom interakcijom. U primere ovakvih markiranja spadaju radioizotopi<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofori, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, hodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (US Patent No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, ren peroksidaza (HRP), alkalna fosfataza, betagalaktosidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukozna oksidaza, galaktoza oksidaza i glukozo-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što su urikaza i ksantin oksidaza, uparena sa enzimom koji koristi vodonik peroksid da oksidizuje prekursor boje, kao što su HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin markeri, markeri bakteriofaga, stabilni slobodni radikali i slično.
1
F. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije anti-C5 antitela, kako je ovde opisano, pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni nivo čistoće sa jednim ili više opciono farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su po pravilu netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju: pufere, kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidante, uključujući i askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alohol; alkil parabene, kao što su metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide niske molekulske težine (manje od 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što su polivinilpirolidon; amino kiseline, kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući i glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuće agense, kao što su EDTA; šećere, kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone za formiranje soli, kao što su natrijum; metalni kompleksi (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). U egzemplarne farmaceutski prihvatljive nosače ovde dalje spadaju intersticijalni agensi za disperziju lekova, kao što su rastvorljivi neutralnoaktivni hijaluronidaza glikoproteini (sHASEGP), na primer, humani solubilni PH-20 hijaluronidaza glikoproteini, kao što su rHuPH20 (HYLENEX (registrovani žig), Baxter International, Inc.). Određeni egzemplarni sHASEGP i postupci za njihovu upotrebu, uključujući i rHuPH20, opisani su u US Publ. Nos. 2005/0260186 i 2006/0104968. U
1
jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednim ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što su hondroitinaze.
Egzemplarne formulacije liofilizovanih antitela opisane su u US Patent No. 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patent No. 6,171,586 i WO 2006/044908, a ova druge formulacije uključuju i histidin-acetatni pufer.
Formulacije o kojima je ovde reč mogu da sadrže i više od jednog aktivnog sastojka, po potrebi, za konkretnu indikaciju koja se leči, po mogućstvu one sa komplementarnim aktivnostima koje nemaju međusobna, odnosno uzajamna neželjena dejstva. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koja su delotvorne za namenjenu svrhu.
Aktivni sastojci se mogu spakovati u pripremljene mikrokapsule, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, respektivno, u sistemima dostave koloidnih lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u knjizi Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Mogu se pripremati i preparati sa kontrolisanom (usporenim) oslobađanjem. U odgovarajuće primere preparata sa kontrolisanim oslobađanjem spadaju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, a te matrice su u obliku formiranih proizvoda, npr. filmova ili mikrokapsula.
1
Ove formulacije koje treba da se koriste za in vivo primenu su po pravilu sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracijske membrane.
G. Terapijski postupci i kompozicije
Svako od ovde predstavljenih anti-C5 antitela može da se koristi u terapijskim postupcima.
U jednom aspektu, predstavlja se anti-C5 antitelo za upotrebu kao medikament. U dodatnim aspektima, predstavlja se anti-C5 antitelo za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim izvođenjima, predstavlja se anti-C5 antitelo za upotrebu u terapijskom postupku. U određenim izvođenjima, ovaj pronalazak predstavlja anti-C5 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest koja uključuje primenu delotvorne količine ovog anti-C5 antitela kod takvog pojedinca. U jednom takvom izvođenju, postupak dalje uključuje davanje datom pojedincu delotvorne količine najmanje još jednog terapijskog agensa. Taj "pojedinac" koji se pominje u svim gore navedenim izvođenjima je po mogućstvu čovek.
U jednom dodatnom aspektu, ovo otkriće opisuje upotrebu anti-C5 antitela u proizvodnji ili pripremi medikamenta. U jednom izvođenju, ovaj medikament se koristi za lečenje bolesti. U jednom daljem izvođenju, taj medikament se koristi u postupku lečenja bolesti koje uključuje davanje delotvorne količine ovog medikamenta pojedincu koji ima neku bolest. U jednom takvom izvođenju, taj postupak dalje uključuje davanje delotvorne količine najmanje još jednog terapijskog agensa tom pojedincu. Taj "pojedinac" koji se pominje u svim gore navedenim izvođenjima je po mogućstvu čovek.
1
U dodatnom aspektu, ovo otkriće opisuje anti-C5 antitelo u skladu sa ovim pronalaskom za upotrebu u postupku za lečenje bolesti. U jednom izvođenju, samo za svrhe ilustracije, ovaj postupak uključuje davanje, pojedincu koji ima takvu bolest, delotvorne količine anti-C5 antitela. U jednom takvom izvođenju, taj postupak dalje uključuje davanje delotvorne količine najmanje još jednog terapijskog agensa tom pojedincu. Taj "pojedinac" koji se pominje u svim gore navedenim izvođenjima može da bude čovek.
U dodatnom aspektu, ovaj pronalazak opisuje farmaceutske formulacije koje uključuju ma koje od ovde opisanih anti-C5 antitela, npr. za upotrebu u bilo kom od napred opisanih terapijskih postupaka. U jednom izvođenju, farmaceutska formulacija uključuje ma koje od ovde opisanih anti-C5 antitela i farmaceutski prihvatljivi nosač. U jednom drugom izvođenju, farmaceutska formulacija uključuje ma koje od ovde prikazanih anti-C5 antitela i najmanje još jedan terapijski agens.
U dodatnom aspektu, farmaceutska formulacija je za upotrebu u lečenju bolesti. U jednom izvođenju, ova farmaceutska formulacija se primenjuje kod pojedinca koji ima bolest. Taj "pojedinac" koji se pominje u svim napred navedenim izvođenjima je poželjno da bude čovek.
U dodatnom aspektu, ovo otkriće opisuje postupke za pripremu medikamenta ili farmaceutske formulacije, koja uključuje mešanje ma kog od anti-C5 antitela koja su ovde opisana sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, npr. za upotrebu u ma kom od napred opisanih terapijskih postupaka. U jednom izvođenju, postupci za pripremu medikamenta ili farmaceutske formulacije dalje uključuju dodavanje najmanje još jednog terapijskog agensa uz ovaj medikament ili farmaceutsku formulaciju.
1
Antitela ovog pronalaska mogu da se koriste ili samostalno ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, jedno antitelo ovog pronalaska može da se primenjuje zajedno sa najmanje još jednim dodatnim terapijskim agensom.
Ovakve, napred navedene, kombinovane terapije uključuju kombinovanu primenu (u koju su uključena dva ili više terapijskih agenasa u iste ili posebne formulacije), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela ovog pronalaska može da se obavi pre, istovremeno sa, i/ili posle primene tog dodatnog terapijskog agensa ili dodatnih terapijskih agenasa. U jednom izvođenju, primena ovog anti-C5 antitela i primena jednog dodatnog terapijskog agensa se odvijaju u roku od oko mesec dana, ili unutar otprilike jedne, dve ili tri nedelje, ili sa oprilike jednim, dva, tri, četiri, pet ili šest dana razmaka između njih.
Antitelo ovog pronalaska (i svakog dodatnog terapijskog agensa) može da se primenjuje na bilo koji odgovarajući način, uključujući i parenteralno, intrapulmonarno i intranazalno i, ako se želi za lokalnu terapiju, primenu u samu leziju. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje se može obavljati bilo kojim pogodnim putem, npr. injekcijama, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, zavisno od toga delimično da li je primena kratka ili stalna. Ovde dolaze u obzir različite sheme doziranja, uključujući i pojedinačne ili višestruke primene tokom različitih vremenskih tačaka, bolus primena i pulsna infuzija.
Antitela ovog pronalaska bi se formulisala, dozirala i primenjivala na način dosledan principima dobre medicinske prakse. Faktori koji se uzimaju u obzir u ovom kontekstu uključuju posebne bolesti koje se leče, posebnog
11
sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto na kome se isporučuje agens, način primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima u praksi. Ovo antitelo ne mora da bude, ali opciono može da bude formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Delotvorna količina tih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u toj formulaciji, vrste poremećaja ili terapije i drugih faktora o kojima se napred diskutuje. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i istim načinima primene kako je ovde opisano, ili otprilike od 1 do 99% ovde opisanih doza, ili u ma kojoj dozi i bilo kojim načinom za koji je empirijski/klinički utvrđeno da je primeren.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuće doze antitela ovog pronalaska (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapijskih agenasa) će zavisiti od vrste bolesti koju treba lečiti, tipa antitela, težine i toka bolesti, da li se to antitelo primenjuje za preventivne ili terapijske svrhe, zavisi i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na konkretno antitelo i diskrecionog mišljenja ordinirajućeg lekara. Antitelo se primereno daje pacijentu ili samo jednom ili tokom serije terapija. Zavisno od vrste i težine bolesti, oko 1 mikro g/kg do 15 mg/kg (npr.
0,1 mg/kg -10mg/kg) antitela može da bude inicijalna doza za kandidata za terapiju, odnosno pacijenta, bilo da se daje, na primer, u jednoj ili u više odvojenih primena, ili u kontinuiranoj infuziji. Jedna tipična dnevna doza bi mogla da se kreće od oko 1 mikro g/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od napred navedenih faktora. Za ponavljane primene tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja, terapija bi trebalo generalno da se održava sve dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti. Jedna ilustrativna doza antitela bi bila u rasponu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako pacijentu mogu da se daju jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo kakva njihova kombinacija). Te doze se mogu primenjivati intermitentno, npr. jednom nedeljno ili na svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti i inicijalna udarna doza posle koje sledi jedna ili više nižih doza. Napredovanje ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
Podrazumeva se da svaka od gore navedenih formulacija ili terapijskih postupaka može da se sprovodi primenom imunokonjugata ovog otkrića umesto anti-C5 antitela ili dodatno uz anti-C5 antitelo.
H. Delovi za proizvodnju
Sledeći odeljak H. nije u skladu sa ovim pronalaskom i navodi se samo za svrhe ilustracije. U drugom aspektu ovog otkrića, navodi se deo za proizvodnju koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu napred navedenih poremećaja. Deo za proizvodnju uključuje posudu i oznaku (etiketu) ili uputstvo za lek koje se postavlja na ili je povezan sa posudom. Odgovarajuće posude mogu da budu, na primer, bočice, ampule, špricevi, kese za intravenske rastvore itd. Te posude se mogu praviti od različitih materijala, kao što su staklo ili plastika. Takva posuda sadrži kompoziciju koja je sama ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom delotvorna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja i može da ima sterilni otvor za pristup (na primer, ta posuda može da bude kesa za rastvor za intravensku primenu ili bočica koja ima gumeni čep koji može da se probode iglom za injekcije). Najmanje jedan aktivni agens u ovoj kompoziciji je antitelo ovog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za lek navodi da se kompozicija koristi za lečenje odabranog stanja. Štaviše, ovaj deo za proizvodnju može da uključuje i (a) prvu posudu u kojoj se nalazi kompozicija o kojoj je ovde reč, pri čemu ta kompozicija sadrži antitelo ovog pronalaska; i (b) drugu posudu sa kompozicijom u njoj, pri čemu ta kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili neki drugi terapijski agens. Ovaj deo za proizvodnju u ovom izvođenju ovog pronalaska može dalje da sadrži uputstvo za lek koji navodi da se te kompozicije mogu da se koriste za lečenje nekog određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, taj deo za proizvodnju može dodatno da sadrži drugu (ili treću) posudu koja uključuje farmaceutski prihvatljivi pufer, kao što su bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatom puferovani fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dodatno da uključuje i druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući i druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da svaki od ovih delova za proizvodnju može da uključuje i imunokonjugat ovog otkrića umesto anti-C5 antitela ili dodatno uz njega.
[Primeri]
Ovde slede primeri postupaka i kompozicija ovog pronalaska. Podrazumeva se da se u praksi mogu koristiti i druga izvođenja, imajući u vidu opšti opis koji je napred dat.
[PRIMER 1]
Priprema C5
1.1. Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog C5 dobijenog od čoveka i cinomolgus majmuna
11
Rekombinantni humani C5 (NCBI GenBank pristupni broj: NP_001726.2, SEQ ID NO: 39) je eksprimiran tranzijentno korišćenjem ćelijske linije FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA). Kondicionirana podloga sa ekspresijom humanog C5 je razblažena jednakom zapreminom MilliQ vode, a onda je naneta na Q-sedaroznu FF ili Q-sefaroznu HP kolonu sa anjonskim izmenjivačem (GE healthcare, Uppsala, Sweden), posle čega je sledila elucija sa NaCl gradijentom. Objedinjene su frakcije sa sadržajem humanog C5, a onda su koncentracija soli i pH podešeni na 80mM NaCl odnosno pH 6,4. Dobijeni uzorak je nanet na SP-sefaroznu HP kolonu sa katjonskim izmenjivačem (GE healthcare, Uppsala, Sweden) i onda je sledila elucija sa NaCl gradijentom. Frakcije sa sadržajem humanog C5 su objedinjene i podvrgnute obradi u CHT keramičkoj koloni hidroksiapatita (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Onda je eluat humanog C5 nanet na Superdex 200 gel filtracijske kolone (GE healthcare, Uppsala, Sweden). Objedinjene su frakcije sa sadržajem humanog C5 i čuvane na temperaturi od -150 stepeni C.
Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog C5 dobijenog od cinomolgus majmuna (NCBI GenBank pristupni broj: XP_005580972, SEQ ID NO: 44) su obavljeni na isti način kao i kada se radilo o humanom C5.
1.2. Prečišćavanje C5 cinomolgus majmuna (cynoC5) iz plazme
Uzorak plazme uzet od cinomolgus majmuna nanet je na SSL7-agarozu (Invivogen, San Diego, CA, USA) posle čega je sledila elucija korišćenjem 100mM NaAcetatom, pH 3,5. Frakcije sa sadržajem cynoC5 su odmah neutralizovane i propuštene kroz Protein A HP kolonu (GE healthcare, Uppsala, Sweden) uporedo sa Peptid M agarozom (Invivogen, San Diego, CA, USA). Onda je protok kroz frakciju nanet na Superdex 200 gel filtracijske kolone (GE healthcare, Uppsala, Sweden). Frakcije sa sadržajem cynoC5 su objedinjene i čuvane na temperaturi od -80 stepeni C.
[PRIMER 2]
Generisanje anti-C5 antitela
2.1. Skrining na antitela
Anti-C5 antitela su pripremljena, odabrana i testirana kako sledi:
Novozelandski beli (NZW) zečevi starosti dvanaest do šesnaest nedelja su imunizovani intradermalno humanim C5 i/ili majmunskim C5 (50-100 mikro g po dozi po zecu). Ova doza je ponavljana 4-5 puta tokom perioda od 2 meseca. Nedelju dana po finalnoj imunizaciji, uzeti su slezina i krv imunizovanih zečeva. Antigen-specifične B-ćelije su prebojene markiranim antigenom, sortirane pomoću ćelijskog sortera FCM (FACS aria III, BD) i stavljene na ploče za mikrotitraciju sa 96 udubljenja, zajedno sa EL4 ćelijama, i to 25.000 ćelija po udubljenju u ploči (Evropska kolekcija ćelijskih kultura) i kondicioniranom podlogom aktiviranom zečjim T-ćelijama, koja je razblažena 20 puta, pa su gajene 7-12 dana. EL4 ćelije su tretirane mitomicinom C (Sigma, kataloški br. M4287) tokom 2 sata i unapred prane 3 puta. Ova aktivirana podloga kondicionirana T-ćelijama zeca je pripremana tako što su timociti zeca gajeni u RPMI-1640 koji sadrži fitohemaglutinina-M (Roche, Kataloški br. 1 1082132-001), forbol 12-miristat 13-acetat (Sigma, Kataloški br. P1585) i 2% FBS. Posle kultivacije, supernatanti B-ćelijske kulture su prikupljeni za dalju analizu, a peleti su čuvani zamrznuti (krioprezervacija).
11
Test ELISA je korišćen da se ispita specifičnost antitela u supernatantu B-ćelijske kulture. Streptavidin (GeneScript, Kataloški br. Z02043) je nanet na ploču sa 384 udubljenja MAXISorp (Nunc, Kataloški br.
164688) u koncentraciji od 50nM u PBS u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su onda blokirane primenom Blocking One (Nacalai Tesque, Kataloški br. 03953-95) razblaženim 5 puta. Humani ili majmunski C5 je obeležen NHS-PEG4-Biotinom (PIERCE, Kataloški br. 21329) i dodat u blokirane ELISA ploče, inkubiran 1 sat i opran. Supernatant i B-ćel i jske kul ture su doda t i ELISA pločama, inkubirani u t rajanju od 1 časa i oprani .Vezivanje je otkrivano kozjom anti-zec IgG-ren peroksidazom (BETHYL, Kataloški br. A120-111P) posle čega je sledilo dodavanje ABTS (KPL, Kataloški br. 50-66-06).
Test ELISA je korišćen da se oceni pH-zavisno vezivanje antitela protiv C5. Kozji anti-zec IgG-Fc (BETHYL, Kataloški br. A120-111A) razblažen do 1 mikro g/ml sa PBS(-) je dodat na ploču sa 384 udubljenja MAXISorp (Nunc, Kataloški br. 164688), inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi i blokiran pomoću Blocking One (Nacalai Tesque, Kataloški br.
03953-95) razblaženim 5 puta. Posle inkubacije, ploče su oprane i dodati su supernatanti B-ćelijske kulture. Ploče su inkubirane 1 sat, oprane i dodato je 500pM biotiniranog humanog ili majmunskog C5 i inkubirane 1 sat. Posle inkubacije, ploče su oprane i inkubirane ili pH 7,4 MES puferom (20 mM MES, 150 mM NaCl i 1,2 mM CaCl2) ili pH 5,8 MES puferom (20 mM MES, 150 mM NaCl i 1 mM EDTA) 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, detektovano je vezivanje biotiniliranog C5 konjugatom Streptavidin-ren peroksidaze (Thermo Scientific, Kataloški br. 21132), a potom je dodat ABTS (KPL, Kataloški br. 50-66-06).
11
Korišćen je Octet RED384 sistem (Pall Life Sciences) za ocenu afiniteta i pH-zavisnog vezivanja antitela protiv C5. Antitela sekretovana u supernatantu B-ćelijske kulture su stavljene na vrh biosenzora Proteina A (Pall Life Sciences) i uronjene u 50 nM humanog ili majmunskog C5 u pH 7,4 MES puferu da se analizira kinetika asocijacije. Kinetika disocijacije je analizirana i u puferu pH 7,4 MES i u puferu pH 5,8 MES.
Obavljen je skrining ukupno 41.439 B-ćelijskih linija na afinitet i pH-zavisno vezivanje za humani ili majmunski C5 i odabrano je 677 linija i označeno kao CFA0001-0677. RNK odabranih linija je prečišćena iz peleta sačuvanih zamrznutih ćelija korišćenjem kompleta ZR-96 Quick-RNA (ZYMO RESEARCH, Kataloški br. R1053). Promenljivi regioni teških lanaca antitela koji kodiraju DNK u odabranim linijama su amplifikovani reverznom transkripcijom PCR i rekombinovani sa DNK koja kodira F760G4 (SEQ ID NO: 33) ili F939G4 (SEQ ID NO: 34) konstantni region teških lanaca. DNK koja kodira varijabilne regione lakog lanca antitela je amplifikovana reverznom transkripcijom PCR i rekombinovana sa DNK koja kodira konstantni region lakih lanaca k0MTC (SEQ ID NO: 36). Odvojeno su sintetizovani geni teških i lakih lanaca postojećeg humanizovanog anti-C5 antitela, ekulizumaba (EcuH-G2G4, SEQ ID NO: 29 i EcuL-k0, SEQ ID NO: 30). DNK koja kodira VH (EcuH, SEQ ID NO: 31) je spojena u okviru sa DNK koja kodira modifikovano humano IgG4 CH (F760G4, SEQ ID NO: 33), a DNK koja kodira VL (EcuL, SEQ ID NO: 32) spojena je u okviru sa DNK koja kodira jedan konstanti region lakog lanca k0 (SEQ ID NO: 37). Svaka od ovih fuziranih sekvenci kodiranja je takođe klonirana u jedan vektor ekspresije. Ova antitela su eksprimirana u FreeStyle™ 293-F ćelijama (Invitrogen) i prečišćena iz supernatanta kulture da bi se ocenila funkcionalna aktivnost. Neutralizujuće aktivnosti ovih antitela su ocenjivane testiranjem inhibicije aktivnosti komplementa
11
korišćenjem testa liziranja lipozoma kako je opisano u Primeru 5.1.
2.2 Grupisanje („binovanje“) epitopa pomoću „sendvič“ ELISA testa
Za dalju analizu su odabrana anti-C5 antitela sa visokim afinitetom, pH-zavisnošću ili neutralizujućom aktivnošću. Korišćen je “sendvič” ELISA test da se grupišu odabrana antitela u različite grupe (“binove”) epitopa koji se vezuju za iste ili preklapajuće epitope C5 proteina. Neobeležena “hvatajuća” antitela su razblažena do 1 mikro g/ml sa PBS (-) i dodata na mikrotitracijske ploče sa 384 udubljenja MAXISorp (Nunc, Kataloški br. 164688). Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi i blokirane pomoću Blocking One (Nacalai Tesque, Kataloški br. 03953-95) razblaženim 5 puta. Ploče su inkubirane 1 sat, oprane i dodato je 2 nM humanog C5 i inkubirano 1 sat. Posle inkubacije, ploče su oprane i dodata su antitela obeležena za detekciju (1mikro g/mL, biotinilirana pomoću NHS-PEG4-Biotina). Posle inkubacije od 1 sata, otkriveno je vezivanje biotiniliranog antitela pomoću konjugata Streptavidin-ren peroksidaze (Thermo Scientific, Kataloški br. 21132), a potom je dodat ABTS (KPL, Kataloški br. 50-66-06).
Sva anti-C5 antitela su korišćena i kao “hvatajuće” antitelo i kao antitelo za detekciju, i sveobuhvatno su uparivana. Kao što je prikazano na Slici 1, uzajamno kompetitivna antitela su grupisana u 7 grupa (“binova”) epitopa: CFA0668, CFA0334 i CFA0319 su grupisani u epitop A, CFA0647, CFA0589, CFA0341, CFA0639, CFA0635, CFA0330 i CFA0318 su grupisani u epitop B, CFA0538, CFA0501, CFA0599, CFA0307, CFA0366, CFA0305, CFA0675, CFA0666 i CFA0672 su grupisani u epitop C, ekulizumab i CFA0322 su grupisani u epitop D, CFA0329 je grupisan u epitop E, CFA0359 i CFA0217 su grupisani u epitop F,
11
a CFA0579, CFA0328 i CFA0272 su grupisani u epitop G. Slika 1 prikazuje grupisanje (“binning”) epitopa nekih anti-C5 himernih antitela. Sekvence VH i VL anti-C5 antitela grupisane u epitop C su navedene u Tabeli 2.
[Tabela 2]
2.3. Humanizacija i optimizacija
Obavljena je humanizacija varijabilnog regiona nekih od anti-C5 antitela sa ciljem da se smanji potencijalna imunogenost tih antitela. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) anti-C5 zečjeg antitela su presađeni na homologne okvire humanog antitela (regiona FR) korišćenjem konvencionalnog pristupa presađivanjem CDR (Nature 321:522-525 (1986)). Geni koji kodiraju humanizovane VH i VL su sintetizovani i kombinovani sa modifikovanim humanim IgG4 CH (SG402, SEQ ID NO: 35), odnosno sa humanim CL (SKI, SEQ ID NO: 38), i svaka od kombinovanih sekvenci je klonirana u vektor ekspresije.
Ispitan je jedan broj mutacija i kombinacija mutacija da se identifikuju mutacije i kombinacije mutacija koje su poboljšale svojstva vezivanja nekih od vodećih antitela. Onda su multiple mutacije uvedene u humanizovane
11
varijabilne regione da bi se poboljšao afinitet vezivanja za C5 u neutralnoj pH sredini ili da bi se smanjio afinitet vezivanja C5 u kiseloj pH sredini. Stoga je iz CFA0305 generisana jedna od optimizovanih varijanti, 305LO5 (VH, SEQ ID NO: 10; VL, SEQ ID NO: 20; HVR-H1, SEQ ID NO: 54; HVR-H2, SEQ ID NO: 64; HVR-H3, SEQ ID NO: 74; HVR-L1, SEQ ID NO: 84; HVR-L2, SEQ ID NO: 94; i HVR-L3, SEQ ID NO: 104).
Antitela su eksprimirana u ćelijama HEK293 ko-transfektovanom mešavinom vektora ekspresije teških i lakih lanaca i prečišćena su proteinom A.
[PRIMER 3]
Karakterizacija vezivanja anti-C5 antitela
3.1. Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnih antitela
Rekombinantna antitela su prolazno eksprimirana korišćenjem ćelijske linije FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad,CA, USA). Obavljeno je prečišćavanje iz kondicionirane podloge koja eksprimira antitela korišćenjem konvencionalnog postupka primenom proteina A. Dalje je, po potrebi, sprovedena gel filtracija.
3.2. Procena pH zavisnosti
Procenjivani su kinetički parametri anti-C5 antitela protiv rekombinantnog humanog C5 na pH 7,4 i pH 5,8, na 37 stepeni C korišćenjem instrumenta BIACORE (registrovani žig) T200 (GE Healthcare). Imobilizovan je ProA/G (Pierce) na CM4 senzornom čipu korišćenjem kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare) prema podešavanjima koje preporučuje GE Healthcare. Antitela i analiti su razblaženi svaki u svom tekućem puferu, ACES pH 7,4 i pH 5,8 (20 mM
12
ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20, 0,005% NaN3). Svako antitelo je uhvaćeno na površinu senzora pomoću ProA/G. Nivoi „hvatanja“ antitela bili su tipično 60-90 rezonantnih jedinica (RU). Onda je rekombinantni humani C5 ubrizgan u koncentracijama od 10 i 20 nM ili 20 i 40 nM pa je usledila disocijacija. Površina je regenerisana korišćenjem 25 mM NaOH. Kinetički parametri u uslovima obe pH vrednosti su određeni uklapanjem senzorigrama u model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za evaluaciju BIACORE (registrovani žig) T200, verzija 2.0 (GE Healthcare). Senzorigrami svih antitela su prikazani na Slikama 2A i 2B. Konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd) i afinitet vezivanja (KD) ovih antitela su navedeni u Tabeli 3. Sva antitela, izuzev CFA0330 (VH, SEQ ID NO: 21 i VL, SEQ ID NO: 25) i CFA0341 (VH, SEQ ID NO: 22 i VL, SEQ ID NO: 26), su pokazala konstantu relativno brže disocijacije na pH 5,8 nego na pH 7,4.
[Tabela 3]
Kinetički parametri anti-C5 antitela u uslovima pH7,4 i pH5,8
3.3. Provera unakrsne reaktivnosti
Radi posmatranja unakrsne reaktivnosti anti-C5 antitela protiv humanog C5 (hC5) i C5 cinomolgus majmuna (cynoC5), obavljena je kinetička analiza BIACORE (registrovani žig). Podešavanje testiranja je bilo isto kao što je opisano u Primeru 3.2, Rekombinantni cynoC5 je ubrizgan u koncentracijama od 2, 10, i 50 nM. Kinetički parametri su određeni istim uklapanjem podataka kao što je opisano u Primeru 3.2. Kinetika vezivanja i afinitet pri pH 7,4 su navedeni u Tabeli 4. Kinetički parametri protiv hC5 prikazani u Tabeli 4 su rezultati Primera 3.2. Sva anti-C5 antitela, izuzev CFA0672, su pokazala uporedive KD prema hC5 i cynoC5. KD CFA0672 prema cynoC5 je bila osam puta slabija nego prema hC5.
[Tabela 4]
Kinetika vezivanja i afinitet anti-C5 antitela protiv hC5 i cynoC5 pri pH 7,4
[PRIMER 4]
Mapiranje epitopa anti-C5 antitela
4.1. Vezivanje anti-C5 Monoklonskih antitela (mAt) za peptide izvedene iz beta lanca C5
Anti-C5 monoklonska antitela (mAt) su testirana na vezivanje za peptide izvedene iz beta lanca C5 u analizi Western blot. Peptidi C5: 19-180, 161-340, 321-500 i 481-660, fuzijom spojeni sa GST-tag (pGEX-4T-1, GE Healthcare Life Sciences, 28-9545-49) su bili eksprimirani u E. coli (DH5alpha, TOYOBO, DNA-903). Uzorci E. coli su skupljeni nakon inkubacije korišćenjem 1 mM Izopropil beta-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) tokom 5 sati na 37 stepeni C, te centrifugirani na 20000 x g 1 min da se dobiju peleti. Ovi peleti su suspendovani u rastvoru uzorka pufera (2ME+) (Wako, 191-13272) i korišćeni za analizu Western blot. Ekspresija svakog peptida je potvrđena anti-GST antitelom (Abcam, ab9085) (Slika 3). Strelica pokazuje GST-fuzirane C5 peptide (46-49kDa). Anti-C5 mAt: CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675, vezana za 19-180 C5 (Slika 3).
4.2. Ekspresija i prečišćavanje domena MG1-MG2 (1-225) humanog C5
Rekombinantni MG1-MG2 domen (SEQ ID NO: 43) humanog C5 beta-lanca je prolazno eksprimiran korišćenjem ćelijske linije FreeStyle293-F (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA). Kondicionirana podloga koja eksprimira MG1-MG2 domen je razblažena pomoću 1/2 vol milliQ vode, posle čega je naneta u Q-sefaroznu kolonu sa FF anjonskim izmenjivačem (GE healthcare, Uppsala, Sweden). Protok kroz frakciju iz kolone za
12
anjonsku izmenu je podešen na pH 5,0 i nanesen na SP-sefaroznu kolonu sa HP katjonskim izmenjivačem (GE healthcare, Uppsala, Sweden) i elutiran sa gradijentom NaCl. Frakcije koje sadrže domen MG1-MG2 su preuzete iz eluenta i potom podvrgnute Superdex 75 gel filtracionoj koloni (GE healthcare, Uppsala, Sweden) koja je uravnotežena sa 1x PBS. Frakcije koje sadrže domen MG1-MG2 su potom objedinjene i čuvane na temperaturi od -80 stepeni C.
4.3. Sposobnost vezivanja za domen MG1-MG2
Merena je sposobnost vezivanja anti-C5 antitela u pravcu domena MG1-MG2 korišćenjem istih podešavanja testiranja koji su opisani u Primeru 3.2, izuzev što su merenja rađena samo u uslovima pH vrednosti 7,4. Domen MG1-MG2 je ubrizgavan u koncentracijama od 20 nM i 40 nM. Kao što pokazuje Slika 4, sva antitela, izuzev ekulizumaba-F760G4, su pokazala porast odgovora vezivanja, što ukazuje na to da ova antitela vezuju MG1-MG2. Ekulizumab-F760G4, za koji je poznato da vezuje alfa lanac, nije pokazao vezivanje sa domenom MG1-MG2.
4.4. Vezivanje anti-C5 mAt za C5 peptide izvedene iz domena MG1-MG2
Ova anti-C5 mAt su testirana na vezivanje za peptide izvedene iz domena MG1-MG2 analizom Western blot. C5 peptidi: 33-124, 45-124, 52-124, 33-111, 33-108, i 45-111 (SEQ ID NO:40), fuzijom spojeni sa GST-tag, bili su eksprimirani u E. coli. Uzorci E. coli su sakupljani posle inkubacije sa 1 mM IPTG tokom 5 sati na 37 stepeni C, i centrifugirani na 20000 x g tokom 1 min da se dobiju peleti. Peleti su suspendovani u rastvoru puferovanog uzorka (2ME+) i korišćeni za analizu Western blot. Ekspresija peptida izvedenih iz C5 potvrđena je anti-GST antitelom (Slika 5A). CFA0305 se vezao samo za peptide od 33-124 (Slika 5B). CFA0305 se vezao za beta lanac rekombinantnog humanog C5 (rhC5) (približno 70kDa), koji je korišćen kao kontrola. Slika 5C sažeto prikazuje reakciju anti-C5 mAt na peptide izvedene iz C5.
4.5. Vezivanje anti-C5 mAt za mutante C5
Pošto je predviđeno da su tri aminokiselinska ostatka u beta lancu C5: E48, D51, i K109, uključena u vezivanje između C5 i anti-C5-mAt analizom kristalne strukture, ova anti-C5 mAt su testirana na vezivanje za humane C5 tačkaste mutante u analizi Western blot. Tačkasti mutanti C5, u kojima je bilo koji od E48, D51 i K109 bio supstituisan alaninom, eksprimirani su u ćelijama FS293 lipofekcijom. Podloga za gajenje je sakupljena 5 dana po lipofekciji, a potom korišćena za Western blot. Postupak SDS-PAGE je obavljen pod redukujućim uslovima. Rezultati su prikazani na Slici 6. Ekulizumab je vezan za alfa lanac divljeg tipa (WT) C5 i tri tačkasta mutanta C5, dok je CFA0305 snažno vezan za beta lanac WT C5, slabo za E48A C5 mutant, a nije se vezao za beta lanac D51A i K109A C5 mutanata, što govori da su ova 3 aminokiselinska ostatka uključena u interakcije antitelo/antigen. Tabela 5 sažeto prikazuje rezultate analize Western blot za anti-C5 mAt (CFA0305, CFA0307, CFA0366, CFA0501, CFA0538, CFA0599, CFA0666, CFA0672 i CFA0675). Ova anti-C5 mAt su grupisana u isti epitop C, ali modeli vezivanja se neznatno razlikuju između antitela, što govori da su regioni vezivanja C5 za anti-C mAt jedni drugima blizu, ali nisu identični.
12
[Tabela 5]
Sažeti prikaz reakcija anti-C5 mAt na C5 mutante
4.6. BIACORE (registrovani žig) analiza vezivanja anti-C5 antitela sa C5 mutantima
Kako bi se ispitalo da li su ostaci E48, G51 i K109 zaista uključeni u interakcije antitelo/antigen, obavljena je BIACORE (registrovani žig) analiza vezivanja. Pripremljena su tri C5 mutanta: E48A, G51A i K109A, kako je opisano u Primeru 4.5. Pripremljeni su uzorci supernatanta kulture koji sadrže mutant C5 prekomerno eksprimiran u FS293 ćelijama u koncentraciji od 40 mikro g/ml mutanta C5. Za analizu vezivanja BIACORE (registrovani žig), ovaj uzorak je razblažen 10 x BIACORE (registrovani žig) tekućim puferom (ACES pH 7,4, 10 mg/ml BSA, 1 mg/ml karboksimetil dekstran) do finalne koncentracije uzorka od 4 mikro g/ml mutanta C5.
Procenjivane su interakcije ova tri C5 mutanta sa anti-C5 antitelima na 37 stepeni C pomoću instrumenta BIACORE (registrovani žig) T200 (GE Healthcare), korišćenjem uslova testiranja opisanog u Primeru 3.2. Korišćen je ACES pH 7,4 pufer sa sadržajem 10 mg/ml BSA, 1 mg/ml karboksimetil dekstrana kao tekući pufer. Ekulizumab-F760G4 i 305LO5 su hvatani na različitim protočnim ćelijama monoklonskim mišjim anti-humanim IgG, Fc fragment specifičnim antitelom (GE Healthcare). Protočna ćelija 1 je
12
korišćena kao referentna površina. Proteini divljeg tipa i mutanti C5 su ubrizgavani preko senzorne površine u koncentraciji od 4 mikro g/ml da bi ušli u interakciju sa uhvaćenim antitelima. Na kraju svakog ciklusa analize, senzorna površina je regenerisana pomoću 3M MgCl2. Rezultati su analizirani softverom Bia Evaluation, verzija 2.0 (GE Healthcare). Krive referentne ćelije protoka (protočne ćelije 1) i prazne injekcije tekućeg pufera su oduzimane sa krivih protočne ćelije sa uhvaćenim antitelima.
Kao što je prikazano na Slici 7, sva tri C5 mutanta su mogla da se vezuju za ekulizumab sličnim profilom vezivanja u poređenju sa divljim tipom C5. Za 305LO5, sva tri mutanta su pokazala niži odgovor vezivanja za 305LO5 u poređenju sa divljim tipom C5. Mutanti D51A i K109A su smanjivali vezivanje C5 za 305LO5 do početnog nivoa.
4.7. Identifikacija His ostatka na C5 koji doprinose pH-zavisnim interakcijama između anti-C5 antitela i C5
Analiza kristalne strukture je otkrila da su 3 histidinska ostatka na humanom C5 locirana na interfejsu (dodirnoj površini) antitelo/antigen. Poznato je da jedan histidinski ostatak sa tipičnim pKa od približno 6,0 doprinosi pH- zavisnim interakcijama protein-protein (Igawa et al., Biochim Biophys Acta 1844(11):1943-1950 (2014)). Kako bi se ispitalo koji od ovih His ostataka na interfejsu antitelo/antigen doprinosi pH-zavisnim interakcijama između anti-C5 antitela i C5, obavljena je analiza vezivanja BIACORE (registrovani žig). Pripremljena su tri humana C5 mutanta sa samo jednom His mutacijom (H70Y, H72Y i H110Y) i jedan mutant sa dvostrukom His mutacijom (H70Y H110Y) kako sledi: eksprimirani su pojedinačni His mutanti, u kojima je ma koji od H70, H72 i H110 supstituisan tirozinom, i jedan dvostruki His mutant u kome su oba, i
12
H70 i H110, supstituisani tirozinom, u ćelijama FS293 lipofekcijom. Određena su svojstva vezivanja antigena C5 His mutanta za 305LO5, pH-zavisno anti-C5 antitelo, modifikovanim testom BIACORE (registrovani žig) kako je opisano u Primeru 4.6. Ukratko, dodatna faza disocijacije na pH 5,8 je integrisana u test BIACORE (registrovani žig) odmah posle faze disocijacije na pH 7,4 kako bi se procenila pH-zavisna disocijacija između antitela i antigena iz kompleksa stvorenih na pH 7,4. Konstanta brzine disocijacije na pH 5,8 je određena obradom i uklapanjem podataka korišćenjem softvera za uklapanje krivih Scrubber 2.0 (BioLogic Software).
Kao što je prikazano na Slici 8, C5 pojedinačna His mutacija na H70 ili H110 i dvostruka His mutacija (H70 H110) nisu uticale na vezivanje C5 za 305LO5 u neutralnoj pH sredini. U međuvremenu, pojedinačna His mutacija na H72 je ispoljila značajno smanjivanje vezivanja C5 za 305LO5. Konstante brzine disocijacije na pH 5,8 za C5 His mutante i C5-wt protein su prikazane u Tabeli 6. Kao što je prikazano u Tabeli 6, C5-wt je pokazao najbržu disocijaciju od 305LO5 na pH 5,8 među testiranim C5 antigenima. Pojedinačna His mutacija na H70 je ispoljila konstantu skoro dvostruko sporije disocijacije na pH 5,8, a jedna His mutacija na H110 je dovela do konstante nešto manje brzine disocijacije na pH 5,8 u poređenju sa C5-wt. Dvostruka His mutacija i na H70 i na H110 je dovela do većeg dejstva na pH-zavisno vezivanje sa konstantom brzine disocijacije na pH 5,8 skoro trostruko sporijom nego C5-wt.
12
[PRIMER 5]
Inhibitorna aktivnost anti-C5 antitela na aktivaciju C5
5.1. Inhibicija komplementom aktivirane lize lipozoma pomoću anti-C5 mAt
Anti-C5 mAt su testirana na inhibiciju klasične aktivnosti komplementa testom liziranja lipozoma. Pomešano je trideset mikrolitara normalnog humanog seruma (6,7%) (Biopredic, SER018) sa 20 mikro L razblaženog mAt na ploči za mikrotitraciju sa 96 udubljenja i inkubirano na šejkeru 30 min. na 25 stepeni C. U svako udubljenje su preneti lipozomi sensitizovani antitelima protiv dinitrofenila (Autokit CH50, Wako, 995-40801) i ploča je stavljena na šejker 2 min. na 25 stepeni C. Dodato je pedeset mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) u svako udubljenje i mešano na šejkeru 2 min. na 25 stepeni C. Završna mešavina je inkubirana na 37 stepeni C 40 minuta, i potom je merena OD na 340 nm mešavine. Procenat liziranja lipozoma definisan je kao 100 x [(ODmAt– ODpozadina koju čine
serum i lipozom)]/ [(ODbez mAt- ODpozadina koju čine serum i lipozom)]. Slika 9A prikazuje da su anti-C5 mAt: CFA0305, 0307, 0366, 0501, 0538,0599, 0666, 0672 i 0675, inhibirali liziranje lipozoma. Dva antitela koja nisu pH-zavisna: CFA0330 i 0341, takođe su inhibirali ovo liziranje (Slika 9B).
12
5.2. Inhibicija generisanja C5a pomoću anti-C5 mAt
Anti-C5 mAt su testirana na generisanje C5a tokom liziranja lipozoma da bi se potvrdilo da anti-C5 mAt inhibiraju cepanje C5 u C5a i C5b. Nivo C5a u supernatantima iz testa liziranja lipozoma je kvantifikovan korišćenjem C5a ELISA kompleta (R&D systems, DY2037). Sva mAt su inhibirala generisanje C5a u supernatantima na dozno-zavisan način (Slike 10A i 10B).
5.3. Inhibicija komplementom aktivirane hemolize pomoću anti-C5 mAt
Anti-C5 mAt su testirana na inhibiciju klasične aktivnosti komplementa u testu hemolize. Oprani su eritrociti kokošaka (cRBC) (Innovative research, IC05-0810) želatin/veronal-puferovanim slanim rastvorom koji je sadržao 0,5 mM MgCl2i 0,15 mM CaCl2(GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X), a potom sensitizovani antitelom protiv eritrocita (RBC) kokošaka (Rockland 103-4139) u koncentraciji od 1 mikro g/ml 15 minuta na 4 stepena C. Ove ćelije su potom oprane sa GVB++ i suspendovane u istom puferu u koncentraciji od 5 x 10<7>ćelija/ml. U posebnoj ploči za mikrotitraciju sa zaokrugljenim dnom i 96 udubljenja, pomešano je 50 mikro 1 normalnog humanog seruma (20%) (Biopredic, SER019) sa 50 mikro 1 razblaženog mAt i inkubirano na šejkeru na 37 stepeni C 30 minuta. Potom je dodato šezdeset mikrolitara senzitizovane suspenzije cRBC u ova udubljenja koja sadrže serum, i ova mešavina antitela je inkubirana na 37 stepeni C 30 minuta. Nakon inkubacije, ova ploča je centrifugirana na 1000 x g tokom 2 minuta na 4 stepena C. Supernatanti (100 mikro 1) su preneti u udubljenja na ploču za mikrotitraciju sa ravnim dnom i 96 udubljenja radi merenja OD na 415 nm sa referentnom talasnom dužinom na 630 nm. Procenat hemolize je definisan
1
kao 100 x [(ODmAt- ODserum i eritrociti cRBC)]/[(ODbez mAt- ODpozadina koju čine serum i
eritrociti cRBC)]. Slika 11 pokazuje da su anti-C5 mAt: CFA0305 i 305LO5, inhibirali hemolizu eritrocita cRBC.
5.4. Inhibicija alternativnog puta komplementa pomoću anti-C5 mAt
Test hemolize za alternativni put je rađen na način sličan testu hemolize za klasičan put. Krv je uzeta od novozelandskog belog zeca (InVivos) i mešana sa istom zapreminom Alseverovog rastvora (Sigma, A3551), pa je ta mešavina korišćena kao eritrociti zeca (rRBC). Eritrociti rRBC su oprani pomoću GVB uz dodatak 2 mM MgCl2i 10 mM EGTA i suspendovani u istom puferu u koncentraciji od 7 x 10<8>ćelija/ml. U ploči za mikrotitraciju sa ravnim dnom i 96 udubljenja, pomešano je 40 mikro 1 normalnog humanog seruma (25%) (Biopredic, SER019) sa 40 mikro 1 razblaženog mAt i inkubirano na šejkeru na 37 stepeni C tokom 30 minuta. Potom je dodato dvadeset mikrolitara suspenzije eritrocita rRBC u udubljenja koja sadrže serum, pa je mešavina antitela inkubirana na 37 stepeni C 60 minuta. Posle inkubacije, ploča je centrifugirana na 1000 x g 2 minuta na 4 stepena C. Supernatanti (70 mikro 1) su preneti u udubljenja na ploči za mikrotitraciju sa ravnim dnom i 96 udubljenja radi merenja OD na 415 nm sa referentnom talasnom dužinom na 630 nm. Slika 12 pokazuje da su anti-C5 mAt: CFA0305 i CFA0672, inhibirali hemolizu eritrocita rRBC, što govori da ova antitela inhibiraju alternativne puteve komplementa.
[PRIMER 6]
Optimizacija anti-C5 monoklonskih antitela (varijante 305)
1 1
Jedan broj mutacija je uveden u optimizovani promenljivi region anti-C5 antitela 305LO5 da dodatno poboljša njegova svojstva, pa su generisani optimizovani promenljivi regioni 305LO15, 305LO16, 305LO18, 305LO19, 305LO20, 305LO22 i 305LO23. Aminokiselinske sekvence VH i VL varijanti 305 su navedene u Tabelama 7 odnosno 8. Geni koji kodiraju humanizovani VH su kombinovani sa modifikovanom humanom IgG1 CH varijantom SG115 (SEQ ID NO: 114), i modifikovanim humanim IgG4 CH varijantama SG422 (SEQ ID NO: 115) ili SG429 (SEQ ID NO: 116). Geni koji kodiraju humanizovani VL su kombinovani sa humanim CL (SKI, SEQ ID NO: 38). Odvojeno su sintetizovani geni teških i lakih lanaca koji kodiraju humanizovano anti-C5 antitelo, BNJ441 (BNJ441H, SEQ ID NO: 149; BNJ441L, SEQ ID NO: 150) i svaki je kloniran u vektor ekspresije.
Antitela su eksprimirana u HEK293 ćelijama ko-transfektovanim kombinacijom vektora ekspresije teških i lakih lanaca, i prečišćeni proteinom A.
[Tabela 7]
1 2
[Tabela 8]
[PRIMER 7]
Karakterizacija vezivanja anti-C5 antitela (varijante 305)
Kinetički parametri anti-C5 antitela protiv rekombinantnog humanog C5 su procenjeni na 37 stepeni C korišćenjem instrumenta BIACORE (registrovani žig) T200 (GE Healthcare) u tri različita uslova; (1) i asocijacija i disocijacija su bili na pH 7,4, (2) i asocijacija i disocijacija su bili na pH 5,8, i (3) asocijacija je bila na pH 7,4, ali je disocijacija bila na pH 5,8. ProA/G (Pierce) je imobilizovan na CM1 senzorski čip korišćenjem kompleta za aminsko kupliranje (GE Healthcare) prema podešavanjima koje preporučuje GE Healthcare. Antitela i analiti za uslove (1) i (3) su razblaženi u puferu ACES pH 7,4 (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20, 0,005% NaN3), a za uslov (2) su razblaženi u puferu ACES pH 5,8 (20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20, 0,005% NaN3). Svako antitelo je uhvaćeno na senzorsku površinu pomoću ProA/G. Nivoi hvatanja antitela su bili tipično 60-90 rezonantnih jedinica (RU). Onda je ubrizgan rekombinantni humani C5 na 3 do 27 nM ili 13,3 do 120 nM pripremljen trostrukom serijskom
1
dilucijom, posle čega je usledila disocijacija. Površina je regenerisana korišćenjem 25 mM NaOH. Kinetički parametri u uslovima (1) i (2) su određeni fitovanjem senzorigrama sa modelom vezivanja 1:1, a konstanta brzine disocijacije za uslov (3) je određena fitovanjem senzorigrama sa disocijacijom 1:1 za MCK model korišćenjem softvera za evaluaciju BIACORE (registrovani žig) T200, verzija 2.0 (GE Healthcare). Zavisnost od pH svih antitela je prikazana kao odnos konstanti brzine disocijacije uslova (2) i (1).
Konstanta brzine asocijacije (ka), konstanta brzine disocijacije (kd), afinitet vezivanja (KD) i pH zavisnost su navedeni u Tabeli 9. Sva antitela su pokazala konstantu brže disocijacije na pH 5,8 nego na pH 7,4, a njihova pH zavisnost je bila otprilike 20-ostruka.
[Tabela 9]
Kinetički parametri varijanti anti-C5 antitela u uslovima pH 7,4 i pH 5,8
1 4
Afiniteti vezivanja anti-C5 antitela (BNJ441, ekulizumab i jedna varijanta 305) za rekombinantni humani C5 na pH 7,4 i pH 5,8 su određivani na 37 stepeni C korišćenjem instrumenta BIACORE (registrovani žig) T200 (GE Healthcare) da se proceni dejstvo pH na vezivanje antigena. Kozje anti-humano IgG (Fc) poliklonsko antitelo (KPL #01-10-20) je imobilizovano na CM4 senzorski čip korišćenjem kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare) prema podešavanjima koje preporučuje proizvođač. Antitela i analiti su razblaženi ili u ACES pH 7,4 puferu ili ACES pH 5,8 puferu koji sadrži 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1,2 mM CaCl, 0,05% Tween 20 i 0,005% NaN3. Antitela su hvatana na senzorskoj površini primenom metode anti-Fc, a nivoi hvatanja su bili tipično 50-80 rezonantnih jedinica (RU). Rekombinantni humani C5 je pripremljen trostrukim serijskim razblaživanjem serije počevši od 27 nM za uslove testiranja na pH 7,4, ili 135 nM za uslove testiranja na pH 5,8. Površina je regenerisana korišćenjem 20 mM HCl, 0,01% Tween 20. Podaci su obrađeni i fituju sa modelom vezivanja 1:1 korišćenjem softvera BiaEvaluation 2.0 (GE Healthcare).
Afinitet vezivanja (KD) BNJ441, ekulizumaba i varijante 305 za rekombinantni humani C5 na pH 7,4 i pH 5,8 je prikazan u Tabeli 10. Varijanta 305 je pokazala odnos (KD na pH 5,8)/(KD na pH 7,4) od skoro 800, 8 puta viši nego BNJ441 koji je pokazao odnos (KD na pH 5,8)/(KD na pH 7,4) od samo 93.
1
[Tabela 10]
[PRIMER 8]
Inhibitorna aktivnost anti-C5 antitela (varijanti 305) po aktivaciji C5
8.1. Inhibicija komplementom aktiviranog liziranja lipozoma pomoću anti-C5 mAt
Anti-C5 mAt su testirani na inhibiciju aktivnosti komplementa testom liziranja lipozoma. Pomešano je trideset mikrolitara normalnog humanog seruma (6,7%) (Biopredic, SER019) sa 20mikro L razblaženog mAt na mikrotitracijskoj ploči sa 96 udubljenja i inkubirano na šejkeru 30 min na sobnoj temperaturi. Prenet je rastvor lipozoma senzitizovan antitelima protiv dinitrofenila (Autokit CH50, Wako, 995-40801) u svako udubljenje i ostavljeno na šejkeru 2 min na 37 stepeni C. Dodato je pedeset mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) u svako udubljenje i mešano na šejkeru 2 min. na 37 stepeni C. Završna mešavina je inkubirana na 37 stepeni C 40 minuta, pa je posle toga merena OD na 340 nm. Procenat liziranja lipozoma je definisan kao 100 x [(ODmAt- ODpozadina koju čine serum i lipozomi)]/[(ODbez mAt-ODpozadina koju čine serum i lipozomi)]. Slika 13 pokazuje da su anti-C5 mAt: 305LO15-SG422, 305LO16-SG422, 305LO18- SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422 i 305LO20-SG115, inhibirali liziranje lipozoma. Dva antitela sa Fc varijantama: 305LO15-SG115 i 305LO23-SG429, takođe su inhibirala liziranje lipozoma (Slika 14).
1
Ova anti-C5 mAt su testirana na inhibiciju rekombinantnog humanog C5 (SEQ ID NO: 39). Deset mikrolitara C5-deficijentnog humanog seruma (Sigma, C1163) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog mAt i 20 mikro L rekombinantnog C5 (0.1 mikro g/mL) na mikrotitracijskoj ploči sa 96 udubljenja i inkubirano na šejkeru 1 sat na 37 stepeni C. Lipozomi (Autokit CH50) su preneti u svako udubljenje i ostavljeni na šejkeru 2 min. na 37 stepeni C. Pedeset mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) je dodato u svako udubljenje i mešano na šejkeru 2 min. na 37 stepeni C. Završna mešavina je inkubirana na 37 stepeni C 180 minuta, pa je posle toga merena OD na 340 nm. Procenat liziranja lipozoma je definisan kako je napred navedeno. Slika 15 pokazuje da su anti-C5 mAt: 305LO22-SG115, 305LO22-SG422, 305LO23-SG115 i 305LO23- SG422, inhibirali liziranje lipozoma.
8.2. Inhibicija generisanja C5a pomoću anti-C5 mAt
Anti-C5 mAt su testirani na generisanje C5a tokom liziranja lipozoma da bi se potvrdilo da anti-C5 mAt inhibiraju cepanje C5 u C5a i C5b. Nivoi C5a u supernatantima iz testa liziranja lipozoma su kvantifikovani primenom kompleta ELISA za određivanje C5a (R&D systems, DY2037). Sva mAt su inhibirala generisanje C5a u supernatantima na dozno-zavisan način (Slike 16 i 17).
8.3. Merenje aktivnosti komplementa u plazmi cinomolgus majmuna
Anti-C5 mAt su testirani na inhibiciju aktivnosti komplementa u plazmi cinomolgus majmuna. Anti-C5 mAt su ubrizgani majmunima (20mg/kg), a uzorci plazme su uzimani periodično sve do 56. dana. Eritrociti kokošaka (cRBC) (Innovative research, IC05-0810) su oprani
1
slanim želatin/veronal-puferovanim rastvorom koji je sadržao 0,5 mM MgCl2i 0,15 mM CaCl2(GVB++) (Boston BioProducts, IBB-300X), a potom senzitizovani anti-cRBC antitelom (Rockland 103-4139) u koncentraciji od 1 mikro g/ml 15 minuta na 4 stepena C. Ove ćelije su onda oprane pomoću GVB++ i suspendovane u istom puferu u koncentraciji od 1 x 10<8>ćelija/ml. Na posebnoj ploči za mikrotitraciju sa zaokrugljenim dnom i 96 udubljenja, plazma majmuna je inkubirana sensitizovanim cRBCs na 37 stepeni C 20 minuta. Nakon inkubacije, ova ploča je centrifugirana na 1000 x g 2 minuta na 4 stepena C. Supernatanti su preneti u udubljenja na ploče za mikrotitraciju sa ravnim dnom i 96 udubljenja da bi se izmerila OD na 415 nm referentnom talasnom dužinom od 630 nm. Procenat hemolize je definisan kao 100 x [(ODposle primene- ODpozadina koju čine plazma i cRBC)]/[(ODpre
primene- ODpozadina koju čine plazma i cRBC)]. Slika 18 pokazuje da su anti-C5 mAt: 305LO15-SG422, 305LO15-SG115, 305LO16-SG422, 305LO18-SG422, 305LO19-SG422, 305LO20-SG422, 305LO20-SG115 i 305LO23-SG115, inhibirala aktivnost komplementa u plazmi.
8.4. Inhibicija biološke aktivnosti C5 varijanti pomoću anti-C5 mAt
Anti-C5 mAt su testirana na inhibiciju rekombinantnih varijanti humanog C5: V145I, R449G, V802I, R885H, R928Q, D966Y, S1310N i E1437D. Objavljeno je da pacijenti sa PNH koji imaju R885H mutaciju u C5 pokazuju slab odgovor na ekulizumab (videti, npr. Nishimura et al., New Engl. J. Med. 370:632-639 (2014)). Svaka od humanih C5 varijanti je eksprimirana u FS293 ćelijama, a supernatanti su korišćeni za sledeće ispitivanje. Deset mikrolitara C5-deficijentnog humanog seruma (Sigma, C1163) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog mAt i 20 mikro L podloge ćelijske kulture koja je sadržala rekombinantnu varijantu C5 (2-3 mikro g/mL) u ploči za mikrotitraciju sa 96 udubljenja i inkubirano na šejkeru pola
1
sata na 37 stepeni C. Lipozomi (Autokit CH50) su preneti u svako udubljenje i stavljeni na šejker 2 min. na 37 stepeni C. Dodato je pedeset mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) u svako udubljenje i mešano na šejkeru 2 min. na 37 stepeni C. Završna mešavina je inkubirana na 37 stepeni C 90 minuta, a potom je merena OD na 340 nm. Procenat liziranja lipozoma je definisan isto kao što je napred navedeno. Slika 19 pokazuje da anti-C5 mAt (ekulizumab) nije inhibiralo R885H C5 varijantu, ali jeste inhibiralo ostale testirane varijante. Slika 20 pokazuje da je anti-C5 mAt (jedna 305 varijanta) inhibiralo sve testirane varijante C5.
8.5. Inhibicija komplementom aktiviranog liziranja lipozoma pomoću anti-C5 mAt
Anti-C5 mAt su testirani na inhibiciju aktivnosti komplementa testom liziranja lipozoma. Trideset mikrolitara normalnog humanog seruma (6,7%) (Biopredic, SER019) je pomešano sa 20 mikro L razblaženog mAt na mikrotitracijskoj ploči sa 96 udubljenja i inkubirano na šejkeru 30 min. na sobnoj temperaturi. Rastvor lipozoma senzitizovan antitelima protiv dinitrofenila (Autokit CH50, Wako, 995-40801) je prenet u svako udubljenje i ostavljen na šejkeru 2 min. na 25 stepeni C. Dodato je pedeset mikrolitara rastvora supstrata (Autokit CH50) u svako udubljenje i mešano na šejkeru 2 min. na 25 stepeni C. Završna mešavina je inkubirana na 37 stepeni C 45 minuta, a posle toga je merena OD na 340 nm. Procenat inhibicije liziranja lipozoma definisan je kao 100 x [(ODmAt- ODpozadina koju
čine serum i lipozomi)]/[(ODbez mAt- ODpozadina koju čine serum i lipozomi)]. Slika 21 pokazuje da su anti-C5 mAt, BNJ441 i varijanta 305 inhibirala liziranje lipozoma, a da varijanta 305 ima jaču inhibitornu aktivnost od BNJ441.
1
[PRIMER 9]
Analiza kristalne strukture x zracima kompleksa 305 varijante Fab i domena humanog C5-MG1
9.1. Ekspresija i prečišćavanje domena MG1 (20-124) humanog C5
Domen MG1 (aminokiselinski ostaci 20-124 SEQ ID NO:39) fuzijom spojeni sa GST-tag preko linkera koji se može cepati trombinom (GST-MG1) je eksprimiran u soju E. coli BL21 DE3 pLysS (Promega) korišćenjem pGEX-4T-1 vektora (GE healthcare). Indukovana je ekspresija proteina primenom 0,1 mM Izopropil beta-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) na 25 stepeni C tokom 5 sati. Pelet bakterijskih ćelija je liziran primenom Bugbuster-a (Merck) kome su dodati lizonaza (Merck) i kompletni koktel inhibitora proteaze (Roche), posle čega je usledilo prečišćavanje GST-MG1 iz rastvorljive frakcije korišćenjem GSTrap kolone (GE healthcare) u skladu sa uputstvima proizvođača. GST tag je cepan trombinom (Sigma), a dobijeni domen MG1 je dalje prečišćen pomoću Superdex 75 gel filtracione kolone (GE healthcare). Frakcije koje sadrže MG1 domen su objedinjene i čuvane na -80 stepeni C.
9.2. Priprema Fab fragmenta varijante 305
Fab fragmenti jedne od optimizovanih varijanti iz 305 su pripremljeni konvencionalnim postupkom korišćenjem ograničene digestije papainom (Roche Diagnostics, Kataloški br. 1047825), posle čega je usledilo punjenje u protein A kolonu (mAt Slect SuRe, GE Healthcare) da bi se uklonili Fc fragmenti, kolonu za katjonsku izmenu (HiTrap SP HP, GE Healthcare) i kolonu za gel filtraciju (Superdex200 16/60, GE Healthcare). Frakcije koje
14
sadrže Fab fragment su objedinjene i čuvane na -80 stepeni C.
9.3. Priprema kompleksa 305 varijante Fab i domena MG1 humanog C5
Prečišćeni rekombinantni humani C5-MG1 domen je pomešan sa prečišćenom varijantom 305 Fab fragmenta u molarnom odnosu od 1:1. Ovaj kompleks je prečišćen hromatografijom sa gel filtracijom (Superdex200 10/300 povećanje, GE Healthcare) korišćenjem kolone uravnotežene sa 25 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl.
9.4. Kristalizacija
Prečišćeni kompleksi su koncentrisani na otprilike 10 mg/mL, a kristalizacija je obavljena postupkom difuzije pare sedeće kapi u kombinaciji sa postupkom zasejavanja na 4 stepena C. Rastvor u rezervoaru se sastojao od 0,2 M magnezijum format dehidrata, 15,0% w/v polietilen glikola 3350. Ovim su uspešno dobijeni pločasti kristali u roku od nekoliko dana. Ovaj kristal je potopljen u rastvor 0,2 M magnezijum format dehidrata, 25,0% w/v polietilen glikola 3350, i 20% glicerola.
9.5. Prikupljanje podataka i određivanje strukture
Podaci difrakcije x zracima mereni su pomoću BL32XU na SPring-8. Tokom merenja, ovaj kristal je konstantno stavljan u struju azota na -178 stepeni C da bi se održalo zamrznuto stanje, i prikupljeno je ukupno 180 snimaka difrakcije X zraka korišćenjem detektora MX-225HS CCD (RAYONIX) pričvršćenog za liniju snopa zraka dok je kristal rotiran za po 1,0 stepen po snimku. Određivanje ćelijskih parametara, indeksiranje tačaka difrakcije i obrada podataka o difrakciji dobijenih iz slika difrakcije je obavljeno korišćenjem programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 43:186-190 (2010), paket XDS (Acta. Cryst. D66:125-132 (2010)) i Scala (Acta. Cryst. D62:72-82 (2006)), i na kraju su dobijeni podaci o intenzitetu difrakcije sve do rezolucije od 2,11 angstroma. Statistički podaci o kristalografiji prikazani su u Tabeli 11.
[Tabela 11]
Struktura je određivana molekularnom zamenom korišćenjem programa Phaser (J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007)). Model pretraživanja domena Fab je izveden iz objavljene kristalne strukture humanog IgG4 Fab (PDB code:1BBJ), a model pretraživanja domena MG1 je bio iz objavljene kristalne strukture humanog C5 (PDB code: 3CU7, Nat.Immunol. 9:753-760 (2008)). Urađen je model u Coot programu (Acta Cryst. D66:486-501 (2010)) i rafiniran programom Refmac5 (Acta Cryst. D67:355-367 (2011)). Faktor kristalografske pouzdanosti (R) za podatke o intenzitetu difrakcije od 25-2,11 angstroma je bio 20,42%, uz vrednost Free R od 26,44%.
Statistički podaci o rafiniranju strukture su prikazani u Tabeli 11.
9.6. Sveukupna struktura kompleksa varijante 305Fab i C5-MG1 domena
Fab fragment optimizovane varijante od 305 ("305 Fab") vezan za humani C5-MG1 domen ("MG1") u odnosu 1:1, i asimetrična jedinica kristalne strukture su sadržali dva kompleksa, Molekule 1 i 2, kao što je opisano na Slici 22A. Molekuli 1 i 2 mogu da se dobro usklade na 0,717 angstroma RMSD sa položajem C-alfa atoma u svim ostacima, kao što je pokazano na Slici 22B. Slike o kojima se niže diskutuje su dobijene korišćenjem Molekula 1.
Na Slikama 23A i 23B, mapiran je epitop kontaktnog regiona 305 Fab u MG1 aminokiselinskoj sekvenci odnosno u kristalnoj strukturi. Ovaj epitop uključuje aminokiselinske ostatke MG1 koji sadrže jedan ili više atoma lociranih unutar udaljenosti od 4,5 angstroma od bilo kog dela 305 Fab u ovoj kristalnoj strukturi. Pored toga, epitop unutar 3,0 angstroma je istaknut na Slici 23A.
9.7. Interakcije E48, D51 i K109
Kao što je opisano u Primerima 4.5 i 4.6, anti-C5 mAt koja uključuju antitelo serije 305 su testirani na vezivanje za 3 humana C5 tačkasta mutanta, E48A, D51A i K109A, korišćenjem analiza vezivanja Western blot i BIACORE (registrovani žig). Dok su varijante 305 snažno vezane za WT C5, oni su vrlo slabo vezani za mutant E48A C5, a uopšte nisu vezani za mutante D51A i K109A. Kristalna struktura kompleksa 305 Fab i MG1 je otkrila da se sve ove tri aminokiseline E48, D51 i K109 nalaze unutar udaljenosti od 3,0 angstroma od 305 Fab, formirajući jedan broj vodoničnih
14
veza sa Fab, kao što je prikazano na Slici 24A. Kada se ovo detaljnije ispita, ostatak K109 od MG1 je ukopan u udubljenju formiranom na dodirnoj površini teškog lanca Fab i u tesnoj je interakciji sa Fab preko tri vodonične veze sa H-CDR3_G97, H-CDR3_Y100 i H-CDR3_T100b, i preko mosta soli H-CDR3_D95 (Slika 24D). D51 se nalazi između MG1 i teškog lanca 305 Fab i pravi dve vodonične veze sa H-CDR1_Ser32 i H-CDR2_Ser54 da bi ispunio ovaj prostor (Slika 24C). Ovo govori da su i K109 i D51 sa C5 kritični ostaci za vezivanje serije 305 antitela. S druge strane, E48 se nalazi bliže površini i formira samo jednu vodoničnu vezu sa Fab, što govori da bi njegov doprinos vezivanju antitela bio manji od doprinosa K109 i E51 (Slika 24B). Ovi odnosi su konzistentni sa rezultatima analiza vezivanja Western blot i BIACORE (registrovani žig) za humane C5 mutante (Primeri 4.5 i 4.6). Dopunska napomena: numerisanje ostataka za Fab aminokiseline se bazira na Kabatovom sistemu numerisanja. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).
9.8. Interakcije H70, H72 i H110 serije humanog C5 i antitela 305
Analiza kristalne strukture je otkrila da su tri histidinska ostatka na humanom C5, poimenično: H70, H72 i H110, uključena u epitop varijante 305 Fab, kao što je prikazano na Slici 23A i Slici 25A. Obavljena je analiza vezivanja BIACORE (registrovani žig) da bi se ispitao doprinos ovih histidinskih ostataka pH-zavisnoj interakciji protein-protein između humanog C5 i varijante 305 Fab korišćenjem humanih C5 mutanata H70Y, H72Y, H110Y i H70Y+H110Y (Primer 4.7). H72Y je doveo do potpunog gubitka vezivanja varijante 305 Fab za C5. Ovaj ostatak C5 se nalazi u džepu koji formiraju CDR2 petlja teškog lanca 305 Fab i petlja MG1 (L73, S74 i E76) i čvrsto ispunjava ovaj prostor, kao što je prikazano na Slici 25C.
Pored toga, H72 ostatak C5 pravi vodoničnu vezu sa H-CDR2_Y58. Ne bi se očekivalo da se toleriše H72Y mutacija pošto nema dovoljno prostora da se smesti glomaznija strana tirozinskog lanca. Takođe, vodonična veza sa H-CDR2_Y58 ne može da se održi. Što se tiče doprinosa H70 i H110 pH zavisnosti, mutacije H70Y i H110Y su dovodile do sporije disocijacije varijante 305 Fab od C5 na pH 5,8. H70 formira intra-molekularnu vodoničnu vezu sa T53 od MG1, za koju se veruje da se remeti na pH 5,8 kada protonacija H70 iz C5 uzrokuje konformacijsku promenu na odgovarajućem delu interakcijskog interfejsa MG1 (Slika 25B). Za H110, očekivalo bi se da protonacija ovog ostatka C5 izazove odbijanje 305 Fab izazvano nabojem, koje se može pojačati protonacijom susednog histidinskog ostatka, H-CDR3_H100c (Slika 25D).
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
�
�
1
1
1
1
11
12
�
14
�
1
1
1
1
�
11
��
�
��
�
�
1
�
�
�
21
22
2
��
2
�
�
�
�
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
��
��
��
��
��
�
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
�
24
�
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
�
�
2
�

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje se vezuje za C5, naznačen time što se antitelo vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 19 do 180 MG1 lanca (SEQ ID NO: 40) C5 sa višim afinitetom u neutralnoj pH sredini nego u kiseloj pH sredini, naznačen time što His70 i His110 doprinose pH zavisnosti, i naznačen time što se antitelo takmiči za vezivanje C5, sa antitelom koje sadrži par VH i VL izabran između:
(a) VH iz SEQ ID NO: 1 i VL iz SEQ ID NO: 11;
(b) VH iz SEQ ID NO: 5 i VL iz SEQ ID NO: 15;
(c) VH iz SEQ ID NO: 4 i VL iz SEQ ID NO: 14;
(d) VH iz SEQ ID NO: 6 i VL iz SEQ ID NO: 16;
(e) VH iz SEQ ID NO: 2 i VL iz SEQ ID NO: 12;
(f) VH iz SEQ ID NO: 3 i VL iz SEQ ID NO: 13;
(g) VH iz SEQ ID NO: 9 i VL iz SEQ ID NO: 19;
(h) VH iz SEQ ID NO: 7 i VL iz SEQ ID NO: 17;
(i) VH iz SEQ ID NO: 8 i VL iz SEQ ID NO: 18; i
(j) VH iz SEQ ID NO: 10 i VL iz SEQ ID NO: 20.
2. Antitelo iz zahteva 1, naznačen time što se antitelo vezuje za C5 sa višim afinitetom pri pH 7,4 nego pri pH 5,8.
3. Antitelo iz zahteva 1 ili zahteva 2, naznačen time što se antitelo vezuje za epitop unutar fragmenta koji se sastoji od aminokiselina 33 do 124 beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5.
2
4. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 3, naznačen time što se antitelo vezuje za epitop unutar beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jedan fragment izabran iz grupe koju čine 47 do 57, 70 do 76 i 107 do 110.
5. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 4, naznačen time što se antitelo vezuje za epitop unutar beta lanca (SEQ ID NO: 40) C5 koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine Glu48, Asp51, His70, His72, Lys109 i His110.
6. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 5, koje inhibira aktivaciju C5 i/ili aktivaciju C5 varijante R885H.
7. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 6, koje je
(a) monoklonsko antitelo;
(b) humano, humanizovano ili himerično antitelo; i/ili (c) fragment antitela koji se vezuje za C5.
8. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 7, koje je IgG1 ili IgG4 antitelo pune dužine.
9. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8.
10. Ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 9.
11. Postupak za proizvodnju antitela iz bilo kog od zahteva 1 do 8, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina iz zahteva 10 tako da se proizvodi antitelo.
12. Farmaceutska formula koja sadrži antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
13. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 za upotrebu u postupku lečenja bolesti izabranih iz grupe koju čine reumatoidni artritis (RA); lupusni nefritis; ishemijsko-reperfuziono oštećenje; paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH); atipični hemolitički uremijski sindrom (aHUS); bolest gustog depozita (DDD); makularna degeneracija; hemoliza, povišeni enzimi jetre i sindrom niskog broja trombocita (HELLP); trombotična trombocitopenična purpura (TTP); spontani gubitak fetusa; Pauci-imuni vaskulitis; bulozna epidermoliza; rekurentni-ponavljajući gubitak fetusa; multipla skleroza (MS); traumatska povreda mozga; oštećenje nastalo usled infarkta miokarda, kardiopulmonalnog bajpasa i hemodijalize.
2 2
RS20211548A 2014-12-19 2015-12-18 Anti-c5 antitela i načini njihove upotrebe RS62749B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014257647 2014-12-19
PCT/JP2015/006321 WO2016098356A1 (en) 2014-12-19 2015-12-18 Anti-c5 antibodies and methods of use
EP15869565.0A EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2015-12-18 Anti-c5 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62749B1 true RS62749B1 (sr) 2022-01-31

Family

ID=56126263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211548A RS62749B1 (sr) 2014-12-19 2015-12-18 Anti-c5 antitela i načini njihove upotrebe

Country Status (30)

Country Link
US (5) US9765135B2 (sr)
EP (2) EP3981794A1 (sr)
JP (2) JP6174782B2 (sr)
KR (3) KR101838645B1 (sr)
CN (2) CN113045650A (sr)
AR (1) AR103162A1 (sr)
AU (1) AU2015365167B2 (sr)
BR (1) BR112017011235A2 (sr)
CA (1) CA2967554A1 (sr)
CL (2) CL2017001585A1 (sr)
CO (1) CO2017006651A2 (sr)
CR (1) CR20170251A (sr)
EA (1) EA201791366A1 (sr)
ES (1) ES2899894T3 (sr)
HR (1) HRP20211934T1 (sr)
HU (1) HUE056489T2 (sr)
LT (1) LT3233921T (sr)
MX (1) MX384138B (sr)
MY (1) MY183415A (sr)
PH (1) PH12017501114B1 (sr)
PL (1) PL3233921T3 (sr)
PT (1) PT3233921T (sr)
RS (1) RS62749B1 (sr)
RU (1) RU2746356C2 (sr)
SG (2) SG10201710322VA (sr)
SI (1) SI3233921T1 (sr)
TW (3) TWI617580B (sr)
UA (1) UA128712C2 (sr)
WO (1) WO2016098356A1 (sr)
ZA (1) ZA201703241B (sr)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4793360A2 (en) 2006-03-31 2026-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
TW201920257A (zh) 2008-04-11 2019-06-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗原結合分子
TWI654203B (zh) 2010-11-30 2019-03-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
SG10201609665PA (en) 2011-02-25 2017-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd FcɣRIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) * 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
KR102366029B1 (ko) 2011-09-30 2022-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
KR20210074395A (ko) 2011-11-30 2021-06-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
EP4624490A3 (en) 2012-02-09 2025-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified fc region of antibody
CA2865158C (en) 2012-02-24 2022-11-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for promoting disappearance of antigen via fc.gamma.riib
WO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
TWI855488B (zh) 2012-08-24 2024-09-11 日商中外製藥股份有限公司 FcγRIIb特異性Fc區域變異體
SG11201508170TA (en) 2013-04-02 2015-11-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fc REGION VARIANT
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EA201791366A1 (ru) 2014-12-19 2018-02-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к c5 и способы их применения
MX2017005774A (es) 2014-12-19 2017-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos antimiostatina, polipeptidos que contienen regiones fc variantes, y metodos de uso.
CN114773469B (zh) 2015-02-05 2025-12-19 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
TW201718014A (zh) 2015-10-12 2017-06-01 諾華公司 C5抑制劑於移植相關微血管病之用途
CN108401431B (zh) * 2015-12-18 2022-01-25 中外制药株式会社 抗-c5抗体及使用方法
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHOD OF USE
US20190023775A1 (en) 2016-01-11 2019-01-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment
BR112018073133A2 (pt) 2016-05-10 2019-04-30 Genentech Inc métodos de diminuição das ligações trissulfeto durante a produção recombinante de polipeptídeos
CA3024618A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis
IL263481B2 (en) 2016-06-14 2024-06-01 Regeneron Pharma Anti-c5 antibodies and uses thereof
SG10201800265UA (en) * 2016-06-17 2018-02-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
CN116271014A (zh) 2016-08-05 2023-06-23 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
US20190328854A1 (en) * 2016-08-29 2019-10-31 The Cleveland Clinic Foundation C5 immunization for autologous anti-c5 antibody production
AU2017376884B2 (en) * 2016-12-16 2024-10-03 Samsung Bioepis Co., Ltd Stable aqueous anti-C5 antibody composition
WO2018139623A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
TWI828672B (zh) 2017-01-31 2024-01-11 日商中外製藥股份有限公司 用於治療或預防c5相關疾病的醫藥組合物以及治療或預防c5相關疾病的方法
EP3592386A4 (en) 2017-03-06 2021-01-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania ANTI-C5 ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP7194698B2 (ja) 2017-05-22 2022-12-22 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者においてタンパク質漏出性腸症を処置するための抗ｃ５抗体の投薬量および投与
ES2965486T3 (es) * 2017-07-27 2024-04-15 Alexion Pharma Inc Formulaciones de anticuerpos anti-C5 de alta concentración
JP7518764B2 (ja) 2017-10-26 2024-07-18 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）および非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の処置のための抗Ｃ５抗体の投薬量および投与
EP4640703A3 (en) 2017-11-14 2026-04-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibodies and methods of use
AU2018383751B2 (en) 2017-12-13 2025-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5 antibody combinations and uses thereof
JP2021519073A (ja) 2018-03-29 2021-08-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 哺乳動物細胞におけるラクトジェニック活性の制御
US12292448B2 (en) * 2018-05-24 2025-05-06 Sigma-Aldrich Co. Llc Quantitative analysis of proteins
EP3802593B1 (en) 2018-05-31 2024-09-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) in pediatric patients
EP3802603A1 (en) 2018-06-04 2021-04-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of atypical hemolytic uremic syndrome (ahus) in pediatric patients
JP7538723B2 (ja) 2018-06-28 2024-08-22 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 抗ｃ５抗体の産生方法
MX2021000516A (es) 2018-08-01 2021-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para usarse en el tratamiento o prevencion de una enfermedad relacionada con c5 y metodo para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con c5.
CN113038967B (zh) 2018-09-06 2026-07-14 宾夕法尼亚大学理事会 人源化抗c5抗体及其用途
EP3852874A1 (en) * 2018-09-17 2021-07-28 Kyoto University Administration of an anti-c5 agent for treatment of hepatic injury or failure
US20200095307A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica
US12240893B2 (en) 2018-10-30 2025-03-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Subcutaneous dosage and administration of anti-C5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)
WO2020092546A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions
JP7511566B2 (ja) 2019-01-25 2024-07-05 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の処置のための抗Ｃ５抗体の投薬量及び投与
MX2021009789A (es) 2019-02-14 2021-11-17 Alexion Pharma Inc Dosificacion y administracion de anticuerpos anti-c5 para el tratamiento de miastenia gravis generalizada.
JP7738480B2 (ja) 2019-04-19 2025-09-12 中外製薬株式会社 試料中のポリペプチドの検出または捕捉において使用するための抗体、および組成物、ならびに試料中のポリペプチドの検出または捕捉のための方法
JPWO2020213724A1 (sr) 2019-04-19 2020-10-22
CA3137649A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha An antigen-binding molecule, a pharmaceutical composition, and a method
WO2020242849A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating vitiligo using an anti-c5 antibody
CN114466660A (zh) 2019-07-31 2022-05-10 豪夫迈·罗氏有限公司 通过使用抗c5抗体可伐利单抗来治疗或预防c5相关疾病的剂量和施用方案
EP4003409A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Dosage and administration regimen for the treatment or prevention of c5-related diseases by the use of the anti-c5 antibody crovalimab
US20220356234A1 (en) 2019-10-02 2022-11-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Complement inhibitors for treating drug-induced complement-mediated response
CA3161271A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibody for the treatment of neuromyelitis optica spectrum disorder
US20230043576A1 (en) 2019-12-23 2023-02-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating pregnancy-associated atypical hemolytic uremic syndrome using an anti-c5 antibody
CN111234016B (zh) * 2020-02-23 2021-09-07 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体及应用
US12098365B2 (en) 2020-03-26 2024-09-24 Genentech, Inc. Modified mammalian cells
JP7736688B2 (ja) 2020-03-31 2025-09-09 中外製薬株式会社 多重特異性抗原結合分子を製造するための方法
CN113563467A (zh) * 2020-04-28 2021-10-29 上海普铭生物科技有限公司 针对人补体蛋白c5的抗体及其应用
KR20230009431A (ko) 2020-05-12 2023-01-17 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 발작성 야간 혈색소뇨증의 치료를 위한 보체 인자 d 저해제를 단독으로 또는 항-c5 항체와 조합한 용도
CN115667925A (zh) 2020-05-15 2023-01-31 阿雷克森制药公司 使用细胞外囊泡来检测补体激活的方法以及其用于评估和/或监测补体介导的疾病的治疗的用途
CA3183934A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Amgen Inc. Antibody formulations and uses thereof
CN116194478A (zh) 2020-06-24 2023-05-30 阿雷克森制药公司 皮下（sc）施用抗c5抗体治疗补体相关病症
EP4172192A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
AU2021294687C1 (en) 2020-06-24 2025-07-17 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing C5A and uses thereof
WO2022011086A1 (en) * 2020-07-09 2022-01-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) in pediatric patients
JP7821160B2 (ja) 2020-08-13 2026-02-26 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 造血幹細胞移植関連血栓性微小血管症（ｈｓｃｔ－ｔｍａ）を処置するための抗ｃ５抗体の用量及び投与
JP2023539201A (ja) 2020-08-28 2023-09-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 宿主細胞タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マルチプレックスノックアウト
IL301350A (en) 2020-09-21 2023-05-01 Alexion Pharma Inc Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating c5-mediated glomerular nephritis (gn), including lupus nephritis (ln) and/or iga nephropathy (igan)
EP4232473A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating patients having complement disorders using anti-c5 antibodies
CA3173016A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 Gin-Fu CHEN Methods of treating complement mediated thrombotic microangiopathy using an anti-c5 antibody
JP2024514222A (ja) 2021-04-19 2024-03-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変された哺乳動物細胞
CN117396599A (zh) 2021-05-21 2024-01-12 基因泰克公司 用于生产目的重组产物的经修饰的细胞
JP2024520261A (ja) 2021-06-04 2024-05-24 中外製薬株式会社 抗ｄｄｒ２抗体およびその使用
MX2023015073A (es) 2021-06-14 2024-01-18 Alexion Pharma Inc Dosificacion y administracion de anticuerpos anti-c5 para el tratamiento de la dermatomiositis (dm).
CN117616123B (zh) * 2021-06-25 2024-11-08 中外制药株式会社 抗ctla-4抗体
US12448451B2 (en) 2021-06-25 2025-10-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
EP4370547A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of myasthenia gravis
WO2023023220A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating sickle cell disease or beta thalassemia using a complement alternative pathway inhibitor
TW202346339A (zh) 2022-04-04 2023-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 藉由使用抗ｃ５抗體克羅伐單抗之治療或預防格林－巴利症候群之劑量及投予方案
TW202404632A (zh) 2022-04-04 2024-02-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於藉由使用抗ｃ５抗體克羅伐單抗治療或預防格林－巴利症候群之劑量及投予方案
US20260022164A1 (en) * 2022-05-04 2026-01-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica spectrum disorder
TW202426048A (zh) 2022-09-06 2024-07-01 美商阿雷希昂製藥公司 用於治療造血幹細胞移植相關血栓性（ｈｓｃｔ－ｔｍａ）的抗ｃ５抗體的補充劑量和投與
CA3266977A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. DIAGNOSTIC AND PROGNOSIS BIOMARKER PROFILES IN PATIENTS WITH HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANT-ASSOCIATED THROMBOTIC MICROANGIOPATHY (HSCT-TMA)
TW202423479A (zh) 2022-09-28 2024-06-16 美商阿雷希昂製藥公司 用於預防或最小化患有慢性腎病的患者中的心臟手術相關急性腎損傷（csa-aki）和/或隨後的主要不良腎事件（make）的抗c5抗體之劑量及投與
WO2024238421A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of biomarkers for the identification and treatment of complement-mediated disorders
WO2024238422A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of a panel of lectins for detection of complement biomarkers in urine extracellular vesicles
WO2025006898A1 (en) * 2023-06-29 2025-01-02 Beam Therapeutics Inc. Anti-idiotypic antibodies to cluster of differentiation 7-targeted binding domains and related compositions and methods
CN122003435A (zh) 2023-09-03 2026-05-08 科越医药(美国)有限责任公司 包含抗因子d部分的多特异性构建体
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
IL327001A (en) 2024-02-02 2026-05-01 Alexion Pharma Inc Dosage and administration of anti-C5 antibodies for the treatment of IGA nephropathy (IGAN)
WO2025221479A1 (en) 2024-04-16 2025-10-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for monitoring effective treatment of neuromyelitis optica spectrum disorder (nmosd) with complement component c5 inhibitors
WO2026101219A1 (ko) * 2024-11-06 2026-05-15 주식회사 이뮨앱스 보체 c5 결합 단백질

Family Cites Families (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5144499B1 (sr) 1970-08-29 1976-11-29
JPS5824836B2 (ja) 1974-10-14 1983-05-24 ノウミボウサイコウギヨウ カブシキガイシヤ カサイナドノツウホウソウチ
US4769320A (en) 1982-07-27 1988-09-06 New England Medical Center Hospitals, Inc. Immunoassay means and methods useful in human native prothrombin and human abnormal prothorombin determinations
CA1209907A (en) 1982-04-12 1986-08-19 Richard M. Bartholomew Method of affinity purification employing monoclonal antibodies
US4689299A (en) 1982-09-30 1987-08-25 University Of Rochester Human monoclonal antibodies against bacterial toxins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
JPS6350741A (ja) 1986-08-20 1988-03-03 Nippon Tectron Co Ltd 蛍光偏光分析装置
JPH06104071B2 (ja) 1986-08-24 1994-12-21 財団法人化学及血清療法研究所 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5322678A (en) 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
FI903489A7 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Yhden osan sisältävät ligandit, näitä ligandeja sisältävät reseptorit, menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä ligandien ja reseptorien käytt ö
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5202253A (en) 1988-12-30 1993-04-13 Oklahoma Medical Research Foundation Monoclonal antibody specific for protein C and antibody purification method
CA2006684C (en) 1988-12-30 1996-12-17 Charles T. Esmon Monoclonal antibody against protein c
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
JPH0636741B2 (ja) 1989-11-08 1994-05-18 帝人株式会社 ヒト・プロテインｃの分離方法
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2075927A1 (en) 1990-02-16 1991-08-17 Victor A. Raso Hybrid reagents capable of selectively releasing molecules into cells
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU668349B2 (en) 1991-04-25 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994029471A1 (en) 1993-06-10 1994-12-22 Genetic Therapy, Inc. Adenoviral vectors for treatment of hemophilia
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
IL107742A0 (en) 1993-11-24 1994-02-27 Yeda Res & Dev Chemically-modified binding proteins
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US6309636B1 (en) 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
AU700819B2 (en) 1994-10-07 1999-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Rheumatoid arthritis remedy containing IL-6 antagonist as effective component
DE4436561C1 (de) 1994-10-13 1996-03-14 Deutsche Spezialglas Ag Verfahren zur Veränderung der Durchbiegung von anodisch gebondeten flächigen Verbundkörpern aus Glas und Metall oder Halbleitermaterialien
PL182089B1 (en) 1994-10-21 2001-11-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Pharmaceutic compositions for treating diseases caused by production of il-6
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6485943B2 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The University Of Chicago Method for altering antibody light chain interactions
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5830478A (en) 1995-06-07 1998-11-03 Boston Biomedical Research Institute Method for delivering functional domains of diphtheria toxin to a cellular target
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
NZ333650A (en) 1996-07-19 2000-02-28 Amgen Inc Analogs of cationic proteins like NT-3 (neurotrophin-3) and BDNF (brain derived neurotrophic factor) that are circulated more readily due to a lower isoelectric point and a lower protein charge relative to the native protein
US5990286A (en) 1996-12-18 1999-11-23 Techniclone, Inc. Antibodies with reduced net positive charge
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
IL132380A0 (en) 1997-04-17 2001-03-19 Amgen Inc Compositions comprising conjugates of stable active human ob protein with antibody fc chain and methods
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU750453B2 (en) 1997-10-03 2002-07-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Natural human antibody
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
SK14812000A3 (sk) 1998-04-03 2001-08-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chimérny reťazec protilátky, chimérna protilátka, v oblasť, humanizovaný reťazec protilátky, humanizovaná protilátka, dna, expresný vektor, hostiteľ, spôsob prípravy a liečivo
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
JP2002522063A (ja) 1998-08-17 2002-07-23 アブジェニックス インコーポレイテッド 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成
US6475718B2 (en) 1998-09-08 2002-11-05 Schering Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating the interaction between the APJ receptor and the HIV virus
WO2000032634A1 (en) 1998-12-01 2000-06-08 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies to gamma-interferon
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6972125B2 (en) 1999-02-12 2005-12-06 Genetics Institute, Llc Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
SE9903895D0 (sv) 1999-10-28 1999-10-28 Active Biotech Ab Novel compounds
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
JP2004511426A (ja) 2000-05-03 2004-04-15 ミュンヘン　バイオテク　アーゲー 活性化血管部位に関連する陽イオン性の診断薬、画像化剤、および治療薬
AU2001268427B2 (en) 2000-06-16 2007-03-29 Glaxosmithkline Intellectual Property Limited Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
ATE449791T1 (de) 2000-10-10 2009-12-15 Genentech Inc Inhibierung von c5 komplement-aktivierung für die behandlung und vorbeugung von xeno-transplantat oder akute vaskuläre abstossung
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
EP1423431B1 (en) 2001-04-13 2010-06-16 Biogen Idec MA Inc. Antibodies to vla-1
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
EP1411118B1 (en) 2001-06-22 2008-09-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitors containing anti-glypican-3 antibody
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
MXPA04001301A (es) 2001-08-17 2004-07-08 Tanox Inc Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a c5 y c5a son evitar la formacion de c5b.
US20030049203A1 (en) 2001-08-31 2003-03-13 Elmaleh David R. Targeted nucleic acid constructs and uses related thereto
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
BRPI0214168B8 (pt) 2001-11-14 2021-05-25 Centocor Inc anticorpos anti-il-6, moléculas de ácido nucleico codificando os mesmos, vetores compreendendo as referidas moléculas, composições e formulações compreendendo os referidos anticorpos, bem como métodos de produção dos mesmos
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US6684637B2 (en) 2002-01-25 2004-02-03 Sunpower, Inc. Parallel slot heat exchanger
MXPA04007583A (es) 2002-02-11 2005-04-25 Genentech Inc Variantes de anticuerpo con tasas mas rapidas de asociacion a antigeno.
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
AU2003217912A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
ATE426815T1 (de) 2002-06-12 2009-04-15 Genencor Int Verfahren zur verbesserung einer bindungseigenschaft eines molekuls
AU2003256266A1 (en) 2002-06-12 2003-12-31 Genencor International, Inc. Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
ITMI20021527A1 (it) 2002-07-11 2004-01-12 Consiglio Nazionale Ricerche Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso
AU2003264009A1 (en) 2002-08-15 2004-03-03 Epitomics, Inc. Humanized rabbit antibodies
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7223393B2 (en) 2003-02-07 2007-05-29 Pdl Biopharma, Inc Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis
AU2004268497A1 (en) 2003-02-28 2005-03-10 Antigenics Inc. Use of lectins to promote oligomerization of glycoproteins and antigenic molecules
WO2004076485A1 (en) 2003-02-28 2004-09-10 Lonza Biologics Plc. Antibody purification by protein a and ion exchange chromatography
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
ES2537738T3 (es) 2003-06-05 2015-06-11 Genentech, Inc. Terapia de combinación para trastornos de células B
AU2004273791A1 (en) 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
ES2285543T3 (es) 2003-11-05 2007-11-16 Ares Trading S.A. Procedimiento para la purificacion de la proteina de union a il-18.
HUE038955T2 (hu) 2003-11-05 2018-12-28 Roche Glycart Ag Antigén-kötõ molekulák fokozott Fc receptor-kötõ affinitással és effektor funkcióval
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
PT2418220T (pt) 2003-12-10 2017-10-04 Squibb & Sons Llc Anticorpos contra interferão alfa e suas utilizações
DOP2005000002A (es) 2004-01-09 2005-08-15 Pfizer "anticuerpos contra madcam"
US20070116710A1 (en) 2004-02-03 2007-05-24 Leonard Bell Methods of treating hemolytic anemia
US20050169921A1 (en) 2004-02-03 2005-08-04 Leonard Bell Method of treating hemolytic disease
CA2555688C (en) 2004-02-11 2011-11-08 Warner-Lambert Company Llc Methods of treating osteoarthritis with anti-il-6 or anti-il6 receptor antibodies
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
WO2005112564A2 (en) 2004-04-15 2005-12-01 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Germline and sequence variants of humanized antibodies and methods of making and using them
KR100620554B1 (ko) 2004-06-05 2006-09-06 한국생명공학연구원 Ｔａｇ-72에 대한 인간화 항체
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
EP1771205B1 (en) 2004-06-18 2016-10-26 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
EP1773391A4 (en) 2004-06-25 2009-01-21 Medimmune Inc INCREASING THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ANTIBODIES IN MAMMALIAN CELLS BY MUTAGENESIS ON THE SITE
EP3342782B1 (en) 2004-07-15 2022-08-17 Xencor, Inc. Optimized fc variants
BRPI0514068B8 (pt) 2004-08-04 2021-05-25 Applied Molecular Evolution Inc anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica
WO2006031825A2 (en) 2004-09-13 2006-03-23 Macrogenics, Inc. Humanized antibodies against west nile virus and therapeutic and prophylactic uses thereof
EP1799718A1 (en) 2004-09-14 2007-06-27 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) Vaccine
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US7462697B2 (en) 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
US20070135620A1 (en) 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
JPWO2006067847A1 (ja) 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
ES2343426T3 (es) 2004-12-23 2010-07-30 Novo Nordisk A/S Ligandos de afinidad de union a anticuerpos.
GB0502358D0 (en) 2005-02-04 2005-03-16 Novartis Ag Organic compounds
US20060263357A1 (en) 2005-05-05 2006-11-23 Tedder Thomas F Anti-CD19 antibody therapy for autoimmune disease
KR101374454B1 (ko) 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
EP2824183B1 (en) 2005-04-08 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing bispecific antibodies
US7888486B2 (en) 2005-08-19 2011-02-15 Wyeth Llc Antagonist antibodies against GDF-8
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007060411A1 (en) 2005-11-24 2007-05-31 Ucb Pharma S.A. Anti-tnf alpha antibodies which selectively inhibit tnf alpha signalling through the p55r
US20080311122A1 (en) 2005-11-28 2008-12-18 Medimmune, Llc Antagonists of Hmgb1 and/or Rage and Methods of Use Thereof
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2633399C (en) 2005-12-12 2016-01-26 Ac Immune S.A. Therapeutic vaccine
SI3219328T1 (sl) 2005-12-29 2020-10-30 Janssen Biotech, Inc. Človeška protitelesa proti-IL-23, sestavki, postopki in uporabe
BRPI0708424A2 (pt) 2006-03-02 2011-05-31 Alexion Pharma Inc prolongamento da sobreviência de uma aloenxerto por inibição da atividade do complemento
DK1991275T3 (en) 2006-03-08 2014-12-08 Archemix Llc Complement aptamers AND ANTI-C5 AGENTS FOR USE IN THE TREATMENT OF EYE DISEASES
HUE066795T2 (hu) 2006-03-15 2024-09-28 Alexion Pharma Inc Paroxysmalis nocturnalis haemoglobinuriában szenvedõ betegek kezelése egy komplement inhibitorral
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP4793360A2 (en) 2006-03-31 2026-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
CN102391358B (zh) 2006-04-05 2016-08-10 艾伯维生物技术有限公司 抗体纯化
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
ES2544888T3 (es) 2006-06-08 2015-09-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Prevención o remedio para enfermedades inflamatorias
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US8236313B2 (en) 2006-10-06 2012-08-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Prevention of tissue ischemia, related methods and compositions
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008113834A2 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Novartis Ag C5 antigens and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
CN104076100A (zh) 2007-06-29 2014-10-01 奎斯特诊断投资公司 用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
RU2505603C2 (ru) 2007-09-26 2014-01-27 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против рецептора il-6
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
KR20150126724A (ko) 2007-09-28 2015-11-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체
WO2009085200A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
TW201920257A (zh) 2008-04-11 2019-06-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗原結合分子
WO2009139822A1 (en) 2008-05-01 2009-11-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
US20090312673A1 (en) 2008-06-14 2009-12-17 Vytronus, Inc. System and method for delivering energy to tissue
PY09026846A (es) 2008-08-05 2015-09-01 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos que se dirigen a la proteína de complemento c5
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
JP6223659B2 (ja) 2008-11-10 2017-11-01 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体関連障害を処置するための方法および組成物
EP2400981A4 (en) 2009-02-26 2013-02-27 Lpath Inc DESGIN FOR HUMANIZED THROMBOZYTE ACTIVATION FACTOR ANTIBODIES BY ANTI-LIPID ANTIBODY TEMPLATES
NZ597259A (en) 2009-06-23 2014-04-30 Alexion Pharma Inc Bispecific antibodies that bind to complement proteins
CN101875696B (zh) * 2009-11-11 2012-02-08 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗体及其制备方法与应用
EP2327725A1 (en) 2009-11-26 2011-06-01 InflaRx GmbH Anti-C5a binding moieties with high blocking activity
JP6101489B2 (ja) 2010-01-28 2017-03-22 アブ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 親和性が低下した抗体およびそれを作製する方法
WO2011109338A1 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 Alexion Pharmaceuticals Inc. Methods and compositions for treating degos' disease
TW201206466A (en) * 2010-03-11 2012-02-16 Rinat Neuroscience Corp Antibodies with pH dependent antigen binding
NZ602220A (en) * 2010-03-11 2014-10-31 Rinat Neuroscience Corp Antibodies with ph dependent antigen binding
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
CA2798120A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Paul P. Tamburini Antibodies having reduced immunogenicity in a human
TWI654203B (zh) 2010-11-30 2019-03-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
WO2012088247A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Medimmune, Llc Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments
SG10201609665PA (en) 2011-02-25 2017-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd FcɣRIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
WO2012162067A2 (en) 2011-05-21 2012-11-29 Macrogenics, Inc. Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
US8961981B2 (en) * 2011-06-20 2015-02-24 Saint Louis University Targeting the neuromuscular junction for treatment
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
EP2765192A4 (en) 2011-10-05 2015-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIGENBINDING MOLECULE FOR PREPARING A SPACE BETWEEN A PLASMA AND AN ANTIGEN WITH A SACCHARIDE CHAIN RECEPTOR BINDING DOMAIN
KR20210074395A (ko) 2011-11-30 2021-06-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
CA2865158C (en) 2012-02-24 2022-11-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for promoting disappearance of antigen via fc.gamma.riib
HUE037659T2 (hu) 2012-03-16 2018-09-28 Regeneron Pharma Hisztidinmódosított könnyûlánc antitestek és genetikailag módosított rágcsálók ennek az elõállítására
US9801362B2 (en) 2012-03-16 2017-10-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing pH-sensitive immunoglobulin sequences
HUE037613T2 (hu) * 2012-03-29 2018-09-28 Novimmune Sa Anti-TLR4 antitestek és azok felhasználása
TWI619729B (zh) * 2012-04-02 2018-04-01 再生元醫藥公司 抗－ｈｌａ－ｂ*２７抗體及其用途
JPWO2013180201A1 (ja) 2012-05-30 2016-01-21 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
NZ704771A (en) * 2012-08-13 2018-02-23 Regeneron Pharma Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
US9133269B2 (en) 2012-08-24 2015-09-15 Anaptysbio, Inc. Humanized antibodies directed against complement protein C5
TW201418707A (zh) 2012-09-21 2014-05-16 Alexion Pharma Inc 補體組分ｃ５拮抗劑之篩選分析
BR112015018438A2 (pt) * 2013-01-31 2017-07-18 Seoul Nat Univ R&Db Foundation anticorpo contra c5 e método para prevenir e tratar doenças relacionadas a complemento
US9321686B2 (en) 2013-03-15 2016-04-26 Forta Corporation Reinforcement fiber coating compositions, methods of making and treating, and uses for improved adhesion to asphalt and portland cement concrete
US20160032014A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
JP6505079B2 (ja) 2013-03-29 2019-04-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体ｃ５を標的とする治療薬の血清半減期を増加させるための組成物及び方法
SG11201508170TA (en) 2013-04-02 2015-11-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fc REGION VARIANT
EP3033093A1 (en) 2013-08-16 2016-06-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of graft rejection by administering a complement inhibitor to an organ prior to transplant
JP6382641B2 (ja) 2013-09-11 2018-08-29 株式会社東芝 非水電解質電池及び非水電解質電池の製造方法
CA3177696A1 (en) 2014-02-20 2015-08-27 Allergan, Inc. Complement component c5 antibodies
NZ711451A (en) 2014-03-07 2016-05-27 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
JP2016024424A (ja) 2014-07-24 2016-02-08 株式会社リコー 情報処理システム、情報処理装置、情報処理方法、及びプログラム
EA201791366A1 (ru) 2014-12-19 2018-02-28 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к c5 и способы их применения
US20180016327A1 (en) 2015-01-22 2018-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A Combination of Two or More Anti-C5 Antibodies and Methods of Use
CN114773469B (zh) 2015-02-05 2025-12-19 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
TWI759261B (zh) 2015-02-27 2022-04-01 日商中外製藥股份有限公司 Ｉｌ－６受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
WO2016160756A2 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Alexion Pharmaceuticlas, Inc. Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patents
US20180311299A1 (en) 2015-05-01 2018-11-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of a kidney transplant
WO2016209956A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for treating a patient in compliance with vaccination with eculizumab or an eculizumab variant
TW201718014A (zh) 2015-10-12 2017-06-01 諾華公司 C5抑制劑於移植相關微血管病之用途
CN108401431B (zh) 2015-12-18 2022-01-25 中外制药株式会社 抗-c5抗体及使用方法
US10233252B2 (en) 2015-12-21 2019-03-19 Wisconsin Alumni Research Foundation pH-dependent antibodies targeting the transferrin receptor and methods of use thereof to deliver a therapeutic agent
US20190023775A1 (en) 2016-01-11 2019-01-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment
MA53248A (fr) 2016-01-25 2022-02-16 Takeda Pharmaceuticals Co Anticorps anti-c5 à commutation ph améliorée
IL263481B2 (en) 2016-06-14 2024-06-01 Regeneron Pharma Anti-c5 antibodies and uses thereof
SG10201800265UA (en) 2016-06-17 2018-02-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
TWI828672B (zh) 2017-01-31 2024-01-11 日商中外製藥股份有限公司 用於治療或預防c5相關疾病的醫藥組合物以及治療或預防c5相關疾病的方法
PE20250933A1 (es) 2017-03-14 2025-04-02 Five Prime Therapeutics Inc Anticuerpos de union a vista a ph acido
MA49886A (fr) 2017-03-16 2020-06-24 Medimmune Ltd Anticorps anti-par2 et leurs utilisations
DK3411400T3 (da) 2017-04-03 2021-10-11 Inflarx Gmbh Behandling af inflammatoriske sygdomme med hæmmere af c5a-aktivitet
JP7518764B2 (ja) 2017-10-26 2024-07-18 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）および非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の処置のための抗Ｃ５抗体の投薬量および投与
BR112020010916A2 (pt) 2017-12-04 2020-11-17 Ra Pharmaceuticals, Inc moduladores da atividade do complemento
MX2021000516A (es) 2018-08-01 2021-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para usarse en el tratamiento o prevencion de una enfermedad relacionada con c5 y metodo para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con c5.

Also Published As

Publication number Publication date
CN107207607B (zh) 2021-05-04
WO2016098356A1 (en) 2016-06-23
RU2017125758A (ru) 2019-01-22
MX384138B (es) 2025-03-14
KR20170092449A (ko) 2017-08-11
ZA201703241B (en) 2025-12-17
TW201632557A (zh) 2016-09-16
CN113045650A (zh) 2021-06-29
US20240052021A1 (en) 2024-02-15
CL2017001585A1 (es) 2018-12-21
TW202031897A (zh) 2020-09-01
KR20180029267A (ko) 2018-03-20
JP6174782B2 (ja) 2017-08-02
US20200031913A1 (en) 2020-01-30
RU2017125758A3 (sr) 2019-10-25
ES2899894T3 (es) 2022-03-15
CR20170251A (es) 2017-07-19
KR102515796B1 (ko) 2023-03-30
PH12017501114B1 (en) 2023-12-06
JP6755217B2 (ja) 2020-09-16
MY183415A (en) 2021-02-18
KR101838645B1 (ko) 2018-03-14
TW201809008A (zh) 2018-03-16
AU2015365167A1 (en) 2017-06-01
JP2017200489A (ja) 2017-11-09
US10385122B2 (en) 2019-08-20
SG11201607165YA (en) 2016-09-29
CO2017006651A2 (es) 2017-09-29
MX2017007616A (es) 2017-09-18
RU2746356C2 (ru) 2021-04-12
EP3233921A1 (en) 2017-10-25
CL2021000630A1 (es) 2021-07-30
EP3233921B1 (en) 2021-09-29
HUE056489T2 (hu) 2022-02-28
SG10201710322VA (en) 2018-02-27
PT3233921T (pt) 2021-12-09
LT3233921T (lt) 2021-12-10
BR112017011235A2 (pt) 2018-02-06
US10023630B2 (en) 2018-07-17
AU2015365167B2 (en) 2021-07-29
AR103162A1 (es) 2017-04-19
EP3981794A1 (en) 2022-04-13
US20180002415A1 (en) 2018-01-04
PL3233921T3 (pl) 2022-01-10
HRP20211934T1 (hr) 2022-03-18
TWI617580B (zh) 2018-03-11
TWI725847B (zh) 2021-04-21
SI3233921T1 (sl) 2022-01-31
KR20230044338A (ko) 2023-04-03
EP3233921A4 (en) 2018-07-11
UA128712C2 (uk) 2024-10-09
US20190062413A1 (en) 2019-02-28
JP2017509312A (ja) 2017-04-06
US11597760B2 (en) 2023-03-07
EA201791366A1 (ru) 2018-02-28
US9765135B2 (en) 2017-09-19
CA2967554A1 (en) 2016-06-23
CN107207607A (zh) 2017-09-26
PH12017501114A1 (en) 2017-11-27
US20160176954A1 (en) 2016-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6174782B2 (ja) 抗ｃ５抗体および使用方法
JP6202774B1 (ja) 抗ｃ５抗体および使用方法
JP6088703B1 (ja) 抗ｃ５抗体および使用方法
HK40085591A (en) Anti-c5 antibodies and methods of use
HK40084339A (en) Anti-c5 antibodies and methods of use
HK40051356A (en) Anti-c5 antibodies and methods of use
HK1236962B (en) Anti-c5 antibodies and methods of use
EA041304B1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИ-C5 АНТИТЕЛА С БОЛЕЕ ВЫСОКОЙ АФФИННОСТЬЮ ПРИ pH 7,4, ЧЕМ ПРИ pH 5,8 (ВАРИАНТЫ)