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PROCEDE POUR LA PRODUCTION D'ANTIBIOTIQUES.
La présente invention se rapporte aux agents antibiotiques, plus spécialement un antibiotique utilisable en thérapie topique, et porte notamment sur un procédé pour sa production et sa purification.
Les conditions auxquelles doit répondre un agent qui doit être uti- lisable en thérapie topique sont nombreuses et rigoureuseso L'agent doit agir contre la grande variété d'organismes intervenant dans les infections locales; il doit être stable à l'emmagasinage et compatible avec les produits de base employés habituellement dans les préparations pharmaceutiques; il doit agir en présence des exsudations des tissus; il ne peut pas provoquer de réactions allergiques et finalement il ne peut pas irriter les tissus, ni produire des effets toxiques locaux ou systématiques de l'organisme de l'individu auquel le produit est appliqué,
Lorsque les nouveaux et puissants agents antibiotiques ont été dé- couverts, il était naturel de s'attendre à ce qu'ils envahissent le domaine de la thérapie topique.
Ces substances présentent davantage d'une faible toxicité pour le système, combiné avec une grande puissance inhérente, qui n'est pas di- minuée par la présence de sérum ou d'exsudations des tissus. Les antibiotiques utilisables déjà connus, bien qu'ils soient extrêmement efficaces en thérapie générale. du système, présentent toutefois un certain nombre de défauts qui les rendent moins parfaits si l'on se place au point de vue des propriétés d'un agent topique.
Les antibiotiques que l'on peut obtenir dans le commerce manquent tous l'une ou l'autre des qualités désirables dont question ci-dessus. En outre, aucun d'eux ne possède une activité appréciable contre les levures et les fungi.
De plus, beaucoup d'entre eux ne possèdent pas une solubilité suffisante dans l'eau.
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Il, résulte de ces considérations qu'il existe un besoin indéniable d'un agent stable et soluble, possédant une forte activité antibactérienne et antifongueuse, et qui ne provoque pas de symptômes toxiques ou allergiques lors- qu'il est appliqué localement. Pour ces raisons, l'antibiotique selon la pré- sente invention, dont il a été constaté qu'il possède dans une large mesure tou- tes les propriétés désirables dont question ci-dessus, constitue une contribu- tion appréciable à la chimiothérapie antibiotique.
L'antibiotique selon la présente invention a été dérivé d'un strep- tomyces isolé d'un échantillon de terre prélevé dans la ferme "Grubbs Farm" à Berks County en Pensylvanie. Le streptomyces a été identifié comme streptomyces lavendulae 272. L'organisme producteur possède les caractéristiques suivantes :
Colonie sur agar-agar de Bennett-blanc, tenace, plat, bord irré- gulier avec striures irrégulières. Pas de spores en trois jours. En quatre jours, poudre blanche empreinte de rose. Pas de pigment soluble.
Au microscopie - véritable mycélium - non cloisonné - à longues ramifications avec quelques hyphes tordus et en spirale, ayant un diamètre de 1,1 microns. Conidies produites en chaînes; courtes, épaisses, à extrémités carrées, semblables à des bacilles. 1 x 1,6 microns, devenant ensuite ovales à rondes d'un diamètre de 1 micron.
Plaque de gélatine -gélatine assombrie-pas de liquéfaction en trois, ni quatre jours. Légère en six jours ; liquéfiée en sept jours.
Liquéfaction de gélatine - pigment aérobie sombre non liquéfié en trois, quatre, cinq ou six jours; liquéfaction partielle en sept jours
Lait de tournesol - couleur blanche en haut - pas de changement.
Alcaline en cinq jours, peptinisation en six jours, sans cailler.
Bouillon de nitrate - réduit à nitrite.
Bouillon Tryptone (Indol) - Indol formé.
Solution de Czapeck - petites colonies rondes et blanches à la sur- face, teinte rosâtre.
Agar-agar de Kligler au citrate ferrique d'ammonium - pigment pour- pre foncé, pas de sulfure d'hydrogène.
Milieu d'oeuf - petites colonies rosâtres sporulées en trois jours - milieu d'oeuf virait au gris.
Tampon de pommes de terre et glycérine - petites colonies rondes et blanches aux jointures de la glycérine sur le tampon - le tampon virait au noir.
Tampon de pommes de terre-colonies rondes étincelantes - le tam- pon virait au noir autour d'elles.
Milieu de Leuffler - colonies rondes et étincelantes en relief - le milieu devenait plus foncé.
Agar-agar d'amidon - hydrolysé.
Agar-agar de caséinate de sodium-bord intérieur gris à blanc - avec spores roses - pas de pigment soluble.
Plaque d'agar-agab de Czapeck -bord irrégulier gris à blanc; colo- nies avec spores roses. Pas de pigment soluble. Revers brun avec lisière blan- che.
Après neuf jours, il ne s'était pas produit d'acide ni gaz en uti- lisant : dextrose, maltose, mannite, lactose, saccharose, scylose et galactose.
La croissance de l'organisme producteur peut être obtenue avec suc- cès et avec des rendements élevés au moyen du milieu nutritif suivant :
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EMI3.1
<tb> H20 <SEP> par <SEP> ex. <SEP> 100 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (Na4)2HPO4 <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,2 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4.7H20 <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 0,002 <SEP> (20 <SEP> mg/1)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ZnSO <SEP> .7H <SEP> O <SEP> 0,001 <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cérélose <SEP> 1,
0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 6.5-6.8
<tb>
De bons résultats sont également obtenus si 1-'on ajoute au susdit milieu 2% de manières solubles séchées par distillationo Des rendements de 1,4 grammes par litre de bière de culture ont été obtenus par fermentation en uti- lisant le susdit milieu. Un autre milieu de culture qui convient pour la crois- sance de 1-1-organisme est indiqué dans l'exemple qui se trouve décrit ci-après.
Un processus adéquat pour effectuer la culture de streptomyces la- vendulae 272 est décrit dans cet exemple, et le processus pour obtenir l'anti- biotique à l'état relativement purifié s'y trouve également indiqué. La matière antibiotique obtenue est une base organique, soluble dans Peau, le méthanol ou l'éthanol, tant comme base libre que comme sel (chlorure, sulfate, etc..).
La dite matière est stable pendant des mois à la température de la chambre.
Des précipités insolubles sont obtenus avec l'hélianthate de sodium (méthyle orange), le sulfonate d'alizarine sodique., le phosphomolybdate de sodium et d'au- tres réactifs dont on sait qu'ils provoquent la précipitation de bases organi- ques. Ladite matière est fortement adsorbée par le charbon actif à partir d'une solution neutre et peut être séparée de cet adsorbant par le méthanol acidifié.
Elle est également fortement adsorbée à partir d'une solution à pH approprié, par le produit connu sous l'appellation Amberlite IRC - 50. Il peut être séparé dé celui-ci au moyen diacides dilués.
Le nouvel antibiotique n'affecte pas la motilité ciliaire en solu- tion à 1%, ce qui est une condition rigoureuse et importante pour une substance qui peut être employée en thérapie nasale. Au point de vue parentéral, le mé- dicament ne présente qu'approximativement 1/10 de la toxicité de la tyrothricine (DL50 intrapéritonal = 10-15 mg/kg dans le cas de souris, DL50étant la dose né- cessaire pour tuer 50% des souris).Au point de vue de la thérapie topique, toutefois, il possède la caractéristique importante d'une adsorption négligea- ble, grâce à laquelle la tyrothricine est également devenue un m'dicament très utile. Le DL50 dans le cas de souris, par administration buccale, est approxi- mativement 400 mg/kg, ce qui indique que seulement une quarantième de la dose administrée est adsorbée.
L'activité de l'antibiotique selon la présente invention contre la croissance de divers micro-organismes résulte du tableau suivant. Celui-ci donne les microgrammes par mlo qu'il faut utiliser de 1'antibiotique pour juste inhiber la croissance des micro-organismes.
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TABLEAU I.
EMI4.1
<tb>
Inhibition <SEP> par <SEP> ug/ml <SEP> dans <SEP> bouillon
<tb>
<tb> Dilution <SEP> dans <SEP> tube.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> avec <SEP> 10% <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> sans <SEP> sérum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 24 <SEP> hr. <SEP> 48 <SEP> hr. <SEP> 72 <SEP> hr. <SEP> 24 <SEP> hr. <SEP> 48 <SEP> hr. <SEP> 72 <SEP> hr.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ( <SEP> 0,487
<tb>
EMI4.2
i3 6633 0,975 l, 95 l, 95 ( 0, 975 0,1,.g7 0,487 Microcpccus pyopenes varo aureus N 209 7,8 15,6 15,6 1.,95 1556 15,6
EMI4.3
<tb> Mycobacterium
<tb>
<tb>
<tb> tuberculosis <SEP> N <SEP> 607 <SEP> 0,975 <SEP> 1,95 <SEP> 1,95 <SEP> 1,95 <SEP> 1,95 <SEP> 3,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> (31,25 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25 <SEP> (15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 8739 <SEP> (62,5 <SEP> (62,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 20171
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 261
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> sp.
<SEP> N <SEP> 7829 <SEP> 7,8 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25 <SEP> 3,9 <SEP> 3le25 <SEP> 31,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 8076
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 9072
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> tvphi <SEP> N <SEP> 167 <SEP> 0,975 <SEP> 3,9 <SEP> 7,8 <SEP> 0,975 <SEP> 3,9 <SEP> 3,9
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 2044 <SEP> 31,25 <SEP> 62,5 <SEP> 62,5 <SEP> 31,25 <SEP> 125 <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 548
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 18721
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 8051 <SEP> 1,95 <SEP> 3,9 <SEP> 3,9 <SEP> 1,95 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cerevisiae <SEP> N <SEP> 4123 <SEP> 0,975 <SEP> 0,975 <SEP> 0,975 <SEP> 0,975 <SEP> 0,975 <SEP> 0,
975
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Torula <SEP> Sp. <SEP> N <SEP> 2512.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Aspergillus <SEP> niger <SEP> 3,9 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 3,9 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Alternaria <SEP> mali
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 6659 <SEP> 0,975 <SEP> 7,8 <SEP> 15,6 <SEP> 1,95 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
Inhibition par ug/ml dans agaragaro ¯ ¯¯¯¯¯¯¯ Essai de plaque.
EMI5.2
<tb> avec <SEP> 10% <SEP> de <SEP> sérum <SEP> humain <SEP> sans <SEP> sérum
<tb>
EMI5.3
24 hr. h hr. 72 hr. 24 hr. 48 hr. 72 hr.
EMI5.4
<tb>
Bacillus <SEP> subtilis
<tb>
<tb> N <SEP> 6633 <SEP> 0,487 <SEP> 0,975 <SEP> 0,975 <SEP> 1,95 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes
<tb>
<tb> var. <SEP> aureus <SEP> ? <SEP> 209 <SEP> 15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25 <SEP> 0,2435 <SEP> 1,95 <SEP> 1,95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobactérium
<tb>
EMI5.5
tuberculosis N 607 7,8 .596 .5a6 7,$ 15,6 15,6
EMI5.6
<tb> Escherichia <SEP> coli
<tb>
<tb> N <SEP> 8739 <SEP> 15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 62,5 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25' <SEP> 31,25
<tb>
<tb> N <SEP> 2017 <SEP> .15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 62,5 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25
<tb>
<tb> N <SEP> 26 <SEP> 15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25
<tb>
EMI5.7
Proteus 2±.
e N 7829 15, 6 31,25 31,25 15,6 31,25 31,25
EMI5.8
<tb> N <SEP> 8076 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25 <SEP> 62,5
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 9072 <SEP> 3,9 <SEP> 3,9 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 31,25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> typhi <SEP> N <SEP> 167 <SEP> 1,95 <SEP> 1,95 <SEP> 3,9 <SEP> 3,9 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 2044 <SEP> 125 <SEP> 125 <SEP> 250 <SEP> 125 <SEP> 250 <SEP> 125
<tb>
EMI5.9
N 548 >500 >50o >500 >500 >500 >500
EMI5.10
<tb> N <SEP> 1872 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6 <SEP> 15,6
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae
<tb>
EMI5.11
NO 8051 7,8 7,$ 15,6 15,6 15,6 .
15,6
EMI5.12
<tb> Saccharomyces
<tb>
<tb> cérevisiae <SEP> N <SEP> 4123 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8 <SEP> 7,8
<tb>
EMI5.13
iorula. 8a N 2512 3,9 3,9 3,9 7,8 7,8 15,6 Aspersillus nier 13,25 31,25 31,25 15,6 31,25 31,25
EMI5.14
<tb> Alternaria <SEP> mali
<tb>
<tb> N <SEP> 6659 <SEP> 15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 62,5 <SEP> 15,6 <SEP> 31,25 <SEP> 31,25
<tb>
Il est maintenant connu que les antibiotiques peuvent être identi- fiés comme étant différents 1-'un de l'autre par ce qu'on appelle les rapports d'activité différentielle.
Cela se fait en mesurant leur activité contre une variété dorganismes et en établissant les rapports entre leurs activités res- pectives. Cette manière de procéder est décrite dans l'article : "Activities
EMI5.15
of Twenty-two Antibacterial Substances Against Nine Species of Bacteriall, Frederick Kavanagh, Jo Bacta ±é, 761 (1947)o (IlActivités de vingt-deux substan- ces antibactériennes contre neuf espèces de bactéries Il
Lorsqu'on établit de tels rapports d'activité différentielle pour l'antibiotique obtenu à partir du micro-organisme producteur selon la présente invention, avec l'antibiotique connu sous le nom de streptothricine, on obtient les résultats suivants :
Antibiotique selon la présente invention.
EMI5.16
Escherichia Coli 62,5 Xlml rapport E. coli 64 Bacillus subtilis 0,98 r/J1Ù. Ba subtilis Str eptothric ine Esclierichia coli 62,5 'y/ml rapport E. coli Bacillus subtilis 15,6 r/J1Ù. B. subtilis
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Il est évident que le susdit rapport est constant et est caracté- ristique pour un antibiotique donnée Une différence entre les rapporte, qui est aussi grande que celle obtenue dans le cas ci-dessus, est directement suf- fisante pour différencier les deux substances.
Une autre caractéristique qui distingue les deux antibiotiques est la plus grande diffusibilité de la streptothrycine. On déduira des données ci- dessus que l'antibiotique selon la présente invention est quinze fois plus actif contre B: subtilis que la streptothricine. Cependant, lorsque des disques de papier-filtre sont saturés avec des solutions des deux substances à la même con- centration et sont placés sur des plaques ensemencées avec le même genre de B. subtilis que celui utilisé ci-dessus, la zone d'inhibition formée autour de cha- cun des disques est plus grande pour la streptothricine que pour l'antibiotique selon la présente invention.
C'est la technique bien connue des disques de papier filtre. "Assay of Antibiotics", Henry Welch, Methods in Medical Research, 1, 1, (1948). ('!Essai des antibiotiques", Henry Welch, Méthode de recherche médicale).
Diamètre de la zone d'inhibition
EMI6.1
<tb> Le <SEP> présent <SEP> antibiotique <SEP> 200 <SEP> #/ml <SEP> 19,5 <SEP> mm.
<tb>
<tb> Streptothricine <SEP> 200 <SEP> #/ml <SEP> 21,4 <SEP> mmo
<tb>
Finalement, une différence toxicologique nette (et très importante au point de vue de la thérapie) entre les deux produits pharmaceutiques est il- lustrée par les résultats obtenus après installation dans l'oeil d'un lapin.1000 unités (environ 1 mg. ) de streptothricine provoquent une forte hyperémie et la formation d'une mince membrane blanche sur la cornée (Molitor : Annals of the N.Y.
Academy of Sciences, XLVIII, 2, P.P. 103 et 11.). Au contraire, l'antibio- tique selon la présente invention ne provoque pas de réaction perceptible, même s'il est utilisé à des concentrations dix fois plus forteso
Le spectre ultraviolet de cet antibiotique est sans signification, en ce sens qu'il n'indique pas de pointes d'absorption, tel que c'est le cas pour d'autres antibiotiques. Cela résulte du tableau suivant qui représente le spectre ultravioleto
TABLEAU II.
Spectre ultraviolet de l'antibiotique selon # la présente invention.
EMI6.2
<tb>
(mu) <SEP> T <SEP> (%) <SEP> E
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 320 <SEP> 94,8 <SEP> 0,029
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 310 <SEP> 93,5 <SEP> 0,029
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 300 <SEP> 91,2 <SEP> 0,040
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 290 <SEP> 87,1 <SEP> 0,060
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 280 <SEP> 81,3 <SEP> 0,090
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 270 <SEP> 77,1 <SEP> 0,113
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 260 <SEP> 73,9 <SEP> 0,131
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 250 <SEP> 71,8 <SEP> 0,144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 240 <SEP> 67,2 <SEP> 0,173
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 230 <SEP> 38, <SEP> 2 <SEP> 0,418
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 220 <SEP> 2,2 <SEP> 1,658
<tb>
# = longueur d'onde en mu
T = % de transmission E = densité optique
L'invention sera illustrée par l'exemple décrit ci-après.
EXEMPLE.
La, culture d'ensemencement est préparée dans des flacons agitateurs qui sont ouverts à l'air, mais sont protégés contre la contamination au moyen de tampons d'ouate, La culture est maintenue comme une suspension de spôres séchée sur de la terre stérile. Pour obtenir une croissance végétative, un petit prélèvement de la suspension de spores sur de la terre est ajouté asepti- quement à un Erlenmeyer de 250 ml contenant 40 ml. du milieu indiqué ci-après.
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Avant 1?inoculation du milieu, ce dernier a été stérilisé à 120 C pendant trente minutes.
EMI7.1
<tb>
Glucose <SEP> 0,80 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> glutamique <SEP> 0,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacto <SEP> tryptone <SEP> 0,28
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Phytone <SEP> 0,05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Na <SEP> Cl <SEP> 0,083
<tb>
EMI7.2
K2HPO 4 0,041 Keo 4 -- 05041
EMI7.3
Eau au robinet, \.o::>o Tamponner après ajustement du pH à 6,5 - 6,8., avec 2go de K2HP04 ' et 2 g. de KH2P04 par litre.
Les flacons ont été placés sur un agitateur rotatif travaillant à 200 tours par minute et une poussée de 2 pouces (51 mm). L'opération est
EMI7.4
poursuivie pendant 24 heures à 30 C. Après ce temps, on a,constaté que le flacon avait un aspect trouble.
5 - 7 mlo de la culture végétative obtenue du petit Erlenmeyer de 250 mlo décrit ci-dessus, ont été utilisés pour inoculer un Erlenmeyer de 2 litres contenant 400 mlo du milieu décrit ci-dessus. Les vases de 2 litres ont
EMI7.5
été placés pendant 48 heures sur l'agitatéur rotatif décrit ci-dessus. La cul- ture végétative ainsi obtenue a été utilisée pour inoculer une bouteille de 20 litres contenant 11 litres du milieu décrit ci-dessus. La bouteille a été agi- tée au moyen d'un agitateur du type à pale, tournant à 2000 tours par minute, et elle a été aérée avec de l'air stérile à raison de 1/4 volume d'air / volume de milieu / minute, pendant 18 heures à une température de 30 C.
Pour la production de l'antibiotique, on a utilisé un réservoir dune capacité de 378,54 litres, dans lequel on a introduit 200 litres du milieu suivant. Le milieu a été stérilisé à 120 C pendant 45 minutes.
EMI7.6
<tb>
Substances <SEP> solubles <SEP> séchées <SEP> par <SEP> distillation <SEP> 2,0 <SEP> % <SEP>
<tb>
EMI7.7
(NH4)2HP04 0,4
EMI7.8
<tb> NaCl <SEP> 0,5
<tb>
<tb> K2HPO4
<tb>
EMI7.9
lltIgSO o'H20 0,1 Fe so 4'7H20 0002 L'hS0407H20 0,001
EMI7.10
<tb> Cérélose <SEP> 1,0
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> Q.S.
<tb>
Le contenu de la bouteille de 20 litres a été ajouté aseptiquement aux 200 litres du milieu après stérilisation.
Le réservoir a été agité avec un agitateur du type à pale, tournant à 180 tours/mino et il a été aéré avec de l'air stérile à raison de 1/4 volume d'air / volume de milieu/ minute, à 30 C, pendant 22 heureso Le bouillon de fermentation a été centrifugé et le bouillon clarifié a été ajusté à un pH 8,0.
180 litres du bouillon clarifié , à pH 7,5 - 8,5 ont été agités pendant une,heure avec 2 kg. de résine Amberlite de forme hydrogénée IRC-50.
89% de l'antibiotique ont été adsorbés. La résine a été placée dans une colonne
EMI7.11
et lavée à Peau6 L'antibiotique a été éliminé de leadsorbant au moyen d'acide chlorhydrique aqueux à 10% jusqu'à ce que le liquide d'élimination ne donnait plus de précipité avec 1?acide picrique. Ce liquide a été débarrassé de l'excès
EMI7.12
d'acide chlorhydrique au moyen d'Amberlite IR ,89 dont une quantité suffisante a été employée pour donner un pH final de 5,5. La matière a ensuite été lyophi- lisée pour donner 108 g. de substance active représentant 60 % de l'activité dans le bouillon original.
A toutes fins utiles, il est signalé que l'Amberlite IRC-50 est une résine copolymère de vinyle polyacrylique polycarboxylique, dont l'activité ré- sulte essentiellement du groupe carboxylique. Par ailleurs, Amberlite IR4B est
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une résine d'échange cationique formée par un condensat de phénol formaldéhyde polyamine modifiée.
REVENDICATIONS.