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ANTIBIOTIQUE, ET PROCEDES POUR SA PREPARATION.
L'invention est relative à un nouveau composé chimique ayant des propriétés antibiotiques remarquables et à des procédés pour sa,prépa- ration. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un nouvel antibio- tique auquel on a donné le nom de sistomycosine, et à sa préparation par
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des procédés mierobiologiques.
La sistomycosine est un composé organique neutre ne contenant que les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. C'est un corps so- lide chamois ou jaune clair qui apparaît, au microscope polarisant, comme étant microcristallin. Par chauffage,le composé commence à virer au brun à environ 130 C mais il ne fond pas en dessous d'environ 230 C. La sisto- mycosine est très soluble dans l'eau et le méthanol, un peu moins soluble dans l'acétone humide et des mélanges aqueux des alcools aliphatiques su- périeurs,et pratiquement insoluble dans les solvants davantage non-polai- res tels que le chloroforme, l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle, le benzène, l'éther de pétrole,,
etc.. On l'extrait de solutions aqueuses ayant une gamme de-pH de 2 à 9 par du n-butanol et des alcools aliphatiques ana- logues plus élevés.
La sistomycosine réduit rapidement une solution aqueuse froide de permanganate de potassium et une solution de Benedict bouillante, elle donne un essai de Molisch positif sur hydrates de carbone, un essai de Beilstein négatif sur les halogènes et un essai négatif au chlorure ferri- que. L'addition d'une très petite quantité, 1-2 mgr. de l'antibiotique, à de l'acide sulfurique concentré chaud, donne à la solution une colora- tion rouge cerise foncé à chocolat. L'addition d'une petite quantité de l'antibiotique à de l'acide nitrique ou à de l'acide chlorhydrique concen- trés chauds saturés de thymol ne produit aucune modification de couleur.
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L'antibiotique de la présente invention est en outre caracté- risé par ses spectres ultraviolet et infrarouge remarquables. Le spectre d'absorption ultraviolet (Figure I) présente un maximum au voisinage de 300 millimicrons et un autre à 218 millimicrons. Le maximum au voisinage de 300 millimicrons est composé de trois pointes d'absorption distinctes à 292,5, 306 et 320,5 millimicrons, et deux minima entre ces pointes à 298 et 314 millimicrons. Le minimum principal dans le spectre d'absorption ultraviolet est situé à 253 millimicrons.
La courbe d'absorption représen- téè sur la Figure I est celle obtenue dans de l'eau mais la sistomycosine est remarquable en ce que ce spectre n'est pas modifié de fagon apprécia- ble par des variations modérées de l'acidité ou de la basicité de la so- lution;, c'est-à-dire depuis la neutralité jusqu'à une normalité d'environ 0,05 N d'acide ou de base.
La Figure 2 représente la région dite à "empreintes digitales" du spectre d'absorption infrarouge de la sistomycosine dans -un véhicule d'huile minérale neutre. Les pointes à ou au voisinage de 6,88 et 7930 mi- crons sont attribuables au véhicule d'huile minérale. Les bandes d'absorp- tion les plus intenses caractéristiques de la sistomycosine sont celles qui sont localisées à ou voisines de 6,34 et 9,44 microns. Des bandes d'in- tensité faible ou modérée sont situées à ou au voisinage de 7,70; 7,86; 8,55; 11916; Il,85 et 12,4 microns avec d'autres apparaissant comme épau- lement des bandes précédentes à ou au voisinage de 7,08; 7,16; 8,95; 9,89; 10,25 et 10,6 microns.
Une autre bande caractéristique de la sistomycosine qui se trouve en dehors de la région à empreintes digitales est située à ou au voisinage de 2,96 microns.
La sistomycosine, particulièrement en solutions, subit une dé- composition photochimique par exposition à la lumière. Elle est décomposée par des acides et alcalis, mais est plus stable en solutions neutres ou légèrement basiques, c'est-à-dire au pH 7-9 que dans des solutions à réac- tion acide. Elle est entièrement stable dans l'eau en dessous de 25 C et ses solutions aqueuses peuvent même être chauffées à 50 C pendant-une heu- re sans perte de leur activité antibiotique. Dans une solution aqueuse à 100 C, elle conserve plus de 50 % de l'activité antibiotique après une heu- re.
Contrairement aux antibiotiques connus, la sistomycosine pos- sède un haut degré d'activité contre différentes levures et moisissures, mais est, pratiquement parlant, exempte d'activité contre des bactéries gramme-négatives et gramme-positives. Par exemple, le produit de l'inven- tion ne montre aucune activité contre des bactéries telles que Escherichia coli, Salmonella schottnuelleri,Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus pvogenes var. aureus, et Streptoeoceus haemolyticus, mais il est extrêmement actif et de grande valeur dans le traitement d'infections fongi-formes causées par les Blastomyces dermatitidis Candida albicans, Histoplasma capsulatum, Microsporum canis Sporotrichum.
cschenckli, Tricho- phyton interdigitale et Trichophyton rubrum, Le tableau ci=après représen- te de façon plus frappante le spectre antibiotique remarquable de la sis- tomycosine comparé aux spectres des antibiotiques connus produits par des actinomycetes et comprenant ceux caractérisés par une activité antifonga- le.
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- <SEP> Activité <SEP> antibiotique
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<tb> Gramme-négatives
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<tb> Résistant <SEP> aux,acides
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<tb> (la <SEP> plupart)
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<tb> Actinomycetes
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<tb> Nocardia
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+ indique que la croissance est arrêtée par moins de 25 micro- grammes d'antibiotique par ml. de bouillon ou d'agar.
- indique que la croissance n'est pas arrêtée par 100 micro- grammes d'antibiotique par ml. de bouillon ou d'agar.
Il ressort du tableau ci-dessus que seul l'antibiotique acti- dione ressemble à la sistomycosine dans son inactivité contre des bacté- ries et son activité contre des eumycetes. Toutefois, l'actidione est ac- tive contre le Cryptococcus neoformans alors que la sistomycosine ne l'est pas,et la sistomycosine est active contre les eumycetes restants cités ci-dessus alors que l'actidione ne l'est pas. Il apparaît ainsi que les deux sont des substances nettement différentes.
La toxicité de la sistomycosine est à peu près négligeable.
Chez les souris, la LD50 intraveineuse est de 90 mg/Kg et le M.T.D. de 80 mg/Kg.
Conformément à la présente invention,on produit la sistomy- cosine par la culture aérobique de cultures d'un nouvel actinomycète du genre Streptomyces auquel on a donné le nom de Streptomyces viridosporus.
Ce microorganisme existe entre autres dans la terre. On peut en obtenir des cultures par mélange de cultures des eumycetes spécifiques inhibés par la sistomycosine avec de l'agar aqueux et addition de terre contenant le Streptomyces viridosporus désiré. Après incubation du mélange pendant
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un à dix jours, apparaissent des colonies de l'actinomycète désiré et d'autres antagonistes. Les cultures de Streptomyces viridosporus sont sélectionnées, transférées dans un milieu de nutrition frais,et sont isolées ultérieurement sous forme de cultures pures conformément aux procédés usuels. Une culture vivante de ce microorganisme a été déposée dans le bureau de culture de Parke, Davis & Company à Détroit, Michigan, sous le n 04889.
Microscopiquement, le mycélium primaire humide de Stre tom - ces viridosporus est vitreux et ramifié à profusion, les parties extre- mes étant recourbées ou légèrement ondulées. Le mycélium secondaire aé- rien est également ramifié à profusion. Il y a aussi des embranchements primaires, secondaires et tertiaires, qui peuvent être alternés,opposés et occasionnellement verticillés. Les parties extrêmes du mycélium aé- rien se subdivisent en chaînes de conidia. Les chaînes conidiales se pré- sentent sous forme de courtes spirales ouvertes ayant une longueur axiale d'environ 10 à 20 microns. Les conidia sont vitreux, sphéroïdes à ovoïdes et ont 1,3 à 1,9 microns de diamètre, mais en moyenne approximativement 1,5 à 1,6 microns.
Quand ils croissent sur un milieu de glucose-tryptone- agar, le jeune mycélium primaire humide de Streptomyces viridosporus ap- parait incolore;,et vire ultérieurement au jaune tan terne. Le mycélium secondaire aérien est blanc et porte des spores qui, en masse, sont vert olive foncé. Il n'apparaît que peu ou pas de pigment dans l'agar. Les colonies de surface sont circulaires, dressées, plissées ou ridées radia- lement,avec une marge pleine à ondulée. Le tableau ci-après illustre les différences caractéristiques entre ce nouvel actinomycète et d'autres ac- tinomycètes producteurs d'antibiotiques quand on les cultive sur un milieu de glucose-tryptone-agar.
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L'organisme liquéfie la gélatine sans former de pigments'et peptonise le lait de tournesol avec peu de changement du pH.
En milieu synthétique (de Gottlieb), l'organisme utilise aisément de nombreuses sources de carbone comprenant l'arabinose, le fructose, le galactose, l'inositol, le lactose, le maltose, le mannitol, le rhamnose, le xylose; il utilise moins aisément l'acétate de sodium, le citrate de sodium, le succinate de sodium et le sucrose ; il n'utilise pas le dulcitol, l'i- nuline, le raffinose et le sorbitol.
En milieu synthétique, l'organisme utilise des sources d'azote comprenant des sels ammoniques et nitrates; de l'azote organique tel que l'urée, la glycine, l'alanine,.la bêta-ala- nine, la valine, la leucine, la serine, la thréonine, la phénylalanine, la tyrosine, le tryptophane, la cystine, l'acide glutamique, l'acide as- partique, l'asparagine, la lysine, l'arginine, l'histidine et le sulfate d'adénine.
Le tableau suivant donne une comparaison des aptitudes de Streptohyces viridosporus et autres actinomyces produisant des antibioti- ques, d'utiliser différentes sources de carbone quand ils croissent dans un milieu comprenant de l'agar, des sels inorganiques et la source de car- bone essayée.
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0 = Pas de croissance ou croissance très faible + = Bonne croissance
1,2 = La différence entre les exigences nutritives est due à'une différence entre les cultures.
Comme on l'a dit plus haut, on produit la sistomycosine par la culture aérobique de Streptomyces viridosporus. Cette opération s'effectue d'ha- bitude en inoculant à un milieu nutritif approprié du Streptomyces viridosporus et incubation du mélange dans des conditions aérobiques à environ 20 à 35 C pen- dant environ un à huit jours. Dans le cas de milieux nutritifs aqueux, la.ma- tière solide présente dans le milieu de culture est séparée et on isole l'anti-
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biotique désiré du liquide de culture par les procédés décrits ci après, Quand on utilise un milieu nutritif solide, on lave convenablement le mélan- ge de culture avec un solvant de l'antibiotique tel que l'eau ou le méthanol et on sépare la sistomycosine désirée de l'extrait.
Pendant la phase d'incu- bation, on maintient de préférence la température au voisinage de 25 à 28 C.
Quand on utilise des milieux nutritifs aqueux, le pH initial doit être com- pris entre 6 et 8,2 et de préférence du côté alcalin entre.environ 7,3 et 7,7. Dans le but d'obtenir les productions maxima de sistomycine, la lumiè- re doit être exclue aussi complètement que possible pendant l'incubation du mélange de culture et la séparation de l'antibiotique. Lors de l'inocula- tion du milieu nutritif, on peut utiliser des suspensions, des sous-cultures ou des milieux de culture de Streptomyces viridosporus.
On peut effectuer la culture du microorganisme dans le milieu nutritif aqueux de plusieurs façons différentes. Par exemple, on peut cul- tiver le microorganisme dans des conditions aérobiques à la surface du mi- lieu ou bien on peut le cultiver en dessous de la surface du milieu, c'est- à-dire à l'état submergé, si on lui fournit en même temps de.l'oxygène. Le procédé préféré pour la production de sistomycine à grande échelle comprend l'utilisation de cultures submergées ou profondes de Streptomves viridospo- rus.
Suivant cette réalisation de l'invention, on inocule du Streptomyces viridosporus à un milieu nutritif aqueux stérile et on soumet celui-ci à l'incubation avec agitation et aération à une température comprise entre 20 et 35 C, de préférence au voisinage de 25 à 28 C pendant environ un à quatre jours. Dans ces conditions, l'organisme se développe sous forme de nombreuses particules plus ou moins séparées dispersées dans la masse du milieu, par contraste avec la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu dans le procédé de culture en surface. En raison-de cette distribution de l'organisme dans la masse du milieu, on peut cultiver en une fois de grands volumes du milieu nutritif inoculé, dans les grandes cuves ou tonneaux habituellement utilisés dans l'industrie de la fermenta- tion.
On a trouvé que des appareils de fermentation à cuve fixe munis de dispositifs appropriés d'agitation et d'aération ainsi que des appareils de fermentation à tambour rotatif horizontal conviennent particulièrement bien sous ce rapport. Toutefois, pour la préparation de quantités plus pe- tites de l'antibiotique ou de cultures du microorganisme, ce procédé de culture submergé peut s'effectuer dans de petits flacons qui sont secoués ou agités par des moyens mécaniques appropriés.
On peut réaliser l'agitation et l'aération du mélange de cultu- re de différentes façons. On peut produire l'agitation par un propulseur ou un dispositif mécanique semblable, en faisant tourner ou en secouant l'appa- reil de fermentation lui-même, par différents appareils de pompage, ou en faisant passer dans le milieu de l'air ou d'autres gaz contenant de l'oxy- gène. On peut effectuer l'aération en injectant de l'air ou d'autres gaz contenant de l'oxygène dans le mélange de fermentation, par des tubes ou- verts, des tubes perforés, des milieux de diffusion poreux tels que des bâ- tons de carbone, de carborundum, de verre aggloméré ou l'équivalent, ou bien on peut l'effectuer en pulvérisant, projetant ou versant le moût dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Le gaz contenant de l'oxygène doit être exempt de spores, bactéries et autres contaminants a- vant d'être introduit dans le mélange de culture. On peut arriver à ce ré- sultat de fagon très avantageuse par filtration à travers un lit de char- bon de bois activé. Le degré d'aération aboutissant à une production opti- mum de sistomycosine dépend évidemment quelque peu du genre d'appareil uti- lisé, de la vitesse et du mode d'agitation, du pH, de la température et des autres conditions du milieuo Dans tous les cas, le gaz contenant de l'oxygè- ne doit être fourni à un débit suffisant pour maintenir une légère pression positive dans l'appareil de fermentation et éviter ainsi la possibilité de contamination de la culture par l'air extérieur.
Dans des-appareils de fer- mentation à cuve, de 30 litres, un débit d'air de 10-15 litres par minute donne de bons résultats quand on l'utilise avec un impulseur mécanique à six palettes du genre turbine ayant dix centimètres (quatre pouces) de dia- mètre et tournant à raison de. 100 à 200 tours par minute contre quatre
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chicanes verticales périphériques de 25 sur 400 mm. (1 pouce sur 16 pouces).
@ On peut utiliser une grande variété de milieux de culture au stade de croissance du,procédé. Ces milieux doivent contenir une source de carbone assimilable, une matière protéinique, des sels minéraux et des tra- ces de différentes matières nutritives,vitamines et autres stimulants de la croissance habituellement présentes comme impuretés dans les autres constituants du milieu. Pour obtenir la production optimum de sistomycosi- ne, le milieu de culture doit également renfermer une source de graisse.
Une source de carbone assimilable comprend ici des alcools polyhydriques et des mono-, di- et polysaccharides, tandis que le terme matière protéi- nique comprend des protéines non-modifiées et des produits de dégradation de protéines, particulièrement des produits tels qu'il s'en forme'par l'hy- drolyse de protéineso Ces produits de dégradation de protéines comprennent -des protéases, peptones, polypeptides, peptides et acides aminés.
Comme sources de carbone assimilable, on peut utiliser de l'a- rabinose, fructose, galactose, maltose, rhamnose, xylose, glycérine, manni- tol, rhamnitol, etc.. On peut également utiliser des matières complexes à base d'hydrates de carbone telles que des amidonsdextrines, eaux résidu- aires de fermentation et de distillation, corps solides de trempage de grain, liqueur de trempage de grain, résidus de fermentation séchés¯, etc..
Parmi les matières protéiniques qu'on peut utiliser dans les différents milieux, se trouvent l'extrait de boeuf, la caséine hydrolysée en milieu acide, la peptone de boeuf, la farine de soya oléagineuse,des résidus de fermentation séchés, de la farine de soya soluble dans l'eau, dégraissée et partiellement hydrolysée, des mélanges d'aminoacides de sour- ces naturelles ou synthétiques, de l'urée, des purines, etc.. L'utilisa- tion d'un dérivé de farine de soya oléagineuse ou d'un dérivé de protéine de soya comme constituant du milieu est désirable parce qu'elle fournit une petite quantité de graisse à utiliser par le microorganisme.
Les principales exigences minérales du milieu peuvent être sa- tisfaites en ajoutant 0,1 à 0,5 % d'un ou de plusieurs sels inorganiques tels que du chlorure de sodium, du carbonate de calcium, du phosphate bi- potassique, du phosphate monopotassique, etc.. Les autres constituants du milieu nutritif, c'est-à-dire les vitamines, stimulants de croissance etc.. sont d'habitude présents en quantités suffisantes dans les sources de car- bone assimilables et/ou matières protéiniques les plus impures.
On peut séparer la sistomycosine du mélange de culture brut par un certain nombre de procédés différents. Quand on utilise un milieu de cul- ture solide dans la phase de croissance, on extrait le mycélium par un sol- vant de la sistomycosine, tel que l'eau, et on isole le produit de l'ex- trait comme on décrit ci-après. Dans le cas de cultures liquides, on sépare le mycélium, on le lave convenablement à l'eau et on utilise le filtrat et les eaux de lavage dans les phases de séparation ultérieures.
Un procédé pour séparer la sistomycosine du liquide de culture brut ou d'extraits de cultures comprend l'extraction de la solution au moyen d'un alcool non mis- cible à l'eau, tel que le n-butanol, l'élimination du solvant par distilla- tion, l'extraction du résidu par un solvant des graisses tel que le chlo- roforme, le rejet de l'extrait, l'extraction du solide insoluble dans le . chloroforme par du'chloroforme- contenant environ 10 % d'un alcool aliphati- que inférieur tel que le méthanol, l'extrait obtenu étant versé dans un é- changeur d'ions du genre silicates inorganiques (Permutite).
On lave d'a- bord l'échangeur d'ions avec du chloroforme contenant des concentrations graduellement croissantes d'un alcool aliphatique inférieur tel que le mé- thanol, puis on élutrie l'antibiotique au moyen de cet alcool. On évapore les élutriats d'alcool à siccité et on extrait le résidu à l'eau. On filtre l'extrait aqueux, on congèle le filtrat et on sépare la'glace du produit par sublimation dans le vide pour obtenir l'antibiotique désiré.
L'invention est illustrée par les'exemples suivants.
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EXEMPLE 1.
Un mélange consistant en 180 gr. de glucose industriel, 180 gr. d'une protéine partiellement hydrolysée dérivée de fèves de soya, 90 gr. de liqueur de trempage de grain, 90 gr. de chlorure de sodium, 18 gr. de carbo- nate de calcium et une quantité suffisante d'eau chaude pour porter le volu- me à 18 litres, dans un appareil de fermentation du genre à cuve'fixe en verre de 30 litres, muni d'un chapeau en acier inoxydable, d'un' agitateur du genre à hélice, de quatre chicanes intérieures de 25 sur 400 mm (1 pouce sur 6 pouces) et d'une rampe de diffusion d'air circulaire perforée.
On place l'appareil de fermentation dans un autoclave et on sté- rilise le contenu par là vapeur d'eau à 121 C pendant une heure. On refroi- dit l'appareil de fermentation et son contenu, puis on l'enlève de l'auto- clave. A ce milieu, on inocule de fagon aseptique 900 cm3 d'une sous-cultu- re en flacon secoué de sptante deux heures de Streptomves viridosporus cultivé sur le même milieu que celui décrit plus haut et ensemencée à par- tir d'un milieu de culture sporulé glucose-tryptone-agar de Streptomyces viridosporus.
Après inoculation, on soumet le milieu de culture à une incu- bation à 23-27 C pendant quatre vingt huit heures. Pendant cette incuba- tion, on introduit de l'air stérilisé par la rampe de diffusion à un débit de 15,6 à 17,8 litres par minute, et on fait tourner l'agitateur à la vi- tess-e d'environ 150 tours à la minute.
La production d'antibiotique pendant l'incubation est suivie en prélevant des échantillons de temps en'temps et en.les essayant contre le Candida albicans par le procédé dit "cylinder-plate agar-diffusion me- thod". La production d'antibiotique est indiquée par le' diamètre en milli- mètres de la zone d'inhibition. Le tableau ci-après illustre la production d'antibiotique obtenue par le procédé décrit ci-dessus.
EMI10.1
<tb>
Périodes <SEP> d'incubation <SEP> Inhibition <SEP> du <SEP> Candida <SEP> albicans
<tb>
<tb> en <SEP> heures <SEP> Diamètre <SEP> de <SEP> la <SEP> zone <SEP> en <SEP> mm.
<tb>
<tb>
<tb>
40 <SEP> 16,6
<tb>
<tb>
<tb> 47 <SEP> " <SEP> '19,2 <SEP> , <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> 64 <SEP> 22,1
<tb>
<tb> 71 <SEP> 21,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 88 <SEP> 23,4
<tb>
A la fin de la période d'incubation, on ajoute 25 gr. par li- 'tre d'un auxiliaire de filtration à base de cilicate et on filtre le mélan- ge de culture. On lave le tourteau au moyen de deux portions de 25 cm3 d'eau par litre de mélange de culture, et on ajoute les eaux.de lavage au filtrat principal...
On extrait deux fois au moyen de 10 litres de n-butanol, 31,64 litres de filtrat ou "bière"'préparé comme décrit plus haut et don- nant 18,5 mm. à l'essai contre le Candida albicans à une dilution de 1 à 2. On rejette la solution aqueuse et on concentre les extraits dans l'obscu- rité et sous vide en dessous de 45 C à peu près jusqu'à siccité. bn extrait le résidu au moyen de quatre portions de 50' cm3 et une portion de 100 ém3 de chloroforme à 40 C et on rejette les extraits. On secoue le résidu in- soluble dans le chloroforme avec 300 cm3 d'eau et on filtre pour obtenir 3,39 gr. de solide (Solide A) et un filtrat (Filtrat A).
On congèle le fil- trat A et on en élimine la glace par sublimation dans le vide pour obtenir 3,725 gr. de sistomycosine. 500 gammas de cette substance dans 1 cm3 d'eau produisent des zones d'inhibition contre le Candida albicans de 16,8 et 11,5 mm. à des dilutions respectives de 1:1 et de 1:2. ,
On extrait le solide A (3,39 gr.) au moyen de deux portions de 100 cm3 et six portions de 150 cm3 d'eau. On filtre les extraits, on les
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soumet à des essais séparés, on combine ceux ayant des titres semblables et on les congèle. On sépare'la glace des extraits congelés par sublimation
EMI11.1
:dans le vide pour obtenir un total de 3 95 gr, de sistornycosine- brute.
Les productions et la pureté de chacune des fractions brutes sont données dans le tableau suivant.
EMI11.2
<tb> Poids <SEP> de <SEP> Concentra- <SEP> Résultats <SEP> d'essais <SEP> contre <SEP> le
<tb> Solide <SEP> produit <SEP> tion <SEP> de <SEP> pro- <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP>
<tb>
EMI11.3
'. ' . brut (mg) dui t brut en
EMI11.4
<tb> 'solution <SEP> de <SEP> Dilution <SEP> 1:1 <SEP> 1:2 <SEP> Il:4 <SEP> 1:8
<tb>
EMI11.5
stock gamma/ Diamètre mm. inm. nm. nrni.
EMI11.6
<tb> cm3 <SEP> ' <SEP> de <SEP> la <SEP> zone
<tb> d'inhibi-
<tb>
EMI11.7
tion en mm..
B. 1623 200 17,1 14,1 10,6 C 1613 ' 400 20el 17,5 14,4, 12.,o D 114 200 7:5,9 - 11,3 - +
EMI11.8
<tb> E <SEP> 100 <SEP> 330 <SEP> 16,0 <SEP> 13,5 <SEP> 11,6 <SEP> , <SEP> ++
<tb>
<tb> F <SEP> 60 <SEP> 550 <SEP> - <SEP> 13,9 <SEP> 11,9 <SEP> ++ <SEP> +
<tb>
+ Inhibition à l'intérieur du cylindre.
++ Légère inhibition immédiatement autour.du cylindre.
On extrait 995 mg. de solide B pendant 1/2 heure à l'aide de
199 cm3 de chloroforme contenant 10 % de méthanol en volume et on filtre le,mélange.*Le résidu insoluble pèse 770,5 mg. On verse l'extrait sur une colonne chromatographique contenant 21,1 gr. d'une matière d'échange à ba- 'se de silicate déonommée "Florisil", préalablement lavé e à fond au moyen 'de chloroforme contenant 10 % de méthanol en volume. On laisse percoler à travers la colonne, dans l'ordre donné, des solvants mixtes qui.consistent . en chloroforme contenant 10, 20, 30 et 50 % de méthanol en volume. On re- jette les élutriats et on verse sur la colonne 50 cm3 de méthanol. On re- jette le premier élutriat de méthanol et on verse 2050 cm3 de méthanol par petites portions sur la colonne.
On recueille un total de huit fractions, 'dont on évapore les cinq premières à sec dans le vide. On extrait le ré- sidu jaune par un total de 35 cm3 d'eau, on congèle l'extrait et on en . sublime la glace pour obtenir 85,4 mgr. de sistomycosine sous forme de so- lide jaune pale. 400 gammas'de ce solide, dissous dans un cm3 d'eau don- nent une zone d'inhibition de 22 mm. de diamètre à une 'dilution de 1:1 à ¯l'essai contre le Candida albicanso , On combine les trois autres fractions et on les évapore à sec pour obtenir 131,1 mg. de sistomycosine sous forme de substance solide jau- ne clair. 400 gammas de cette substance dans 1 cm3 d'eau,,produisent une zone d'inhibition de 16 mm. à une dilution de 1:
1 dans l'essai contre le
Candida albicans. Par le procédé d'essai turbidimétrique, '7,14 gammas/cm3
EMI11.9
produisent une inhibition à 50 % de la.croissance de Garidida'albicans.
On extrait 1,435 gr. de matière solide C à l'aide'de 207 cm3 de chloroforme contenant 10 % de méthanol en volume, pendant une demi-heu- re. Le résidu insoluble (Solide G) pèse 1,084 gr. On -verse l'extrait dans une colonne d'absorption contenant 32 gr. d'une matière d'échanger d'ions à base de silicate dénommée "Decalso" préalablement lavée à fond par du chlo- roforme contenant 10 % de méthanol en volume. On fait percoler à travers la colonne les solvants mixtes suivants, par portions de 700 cm3, dans l'ordre donné chloroforme contenant 10, 20, 30, 40 et 50 % de méthanol en volume.
On rejette les percolats. On élutrie la colonne au moyen de.840 cm3 de mé- thanol divisé en six portions et on combine les élutriats. On évapore la
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solution à siccité dans le vide et on extrait le résidu par une quantité totale de 30 cm3 d'eau. On congèle l'extrait aqueux et on en sublime la glace sous pression réduite pour obtenir 107 mg. de sistomycosine sous for- me d'un solide de couleur chamois. Cette substance donne une zone d'inhibi- tion de 23,6 mm. à une concentration de 400 gammas/cm3 dans l'essai contre le Candida albicans.
On élutrie la colonne au moyen de cinq portions supplémentai- res de 700 cm3 de méthanol et on évapore les extraits combinés à siccité dans le vide. On extrait le résidu à l'eau,on congèle l'extrait et on sè- che à partir de l'état congelé pour obtenir 85 mgr. de sistomycosine sous forme de corps solide jaune clair donnant à l'essai contre le Candida al- bicans une zone d'inhibition de 20,3 mm. à une concentration de 400 gammas/ cm3. A l'essai au turbidimètre, 3,47 gammas/cm3 du produit donnent une inhibition de 50 % de la croissance de Candida albicans.
,, 0n extrait le solide G par du chloroforme contenant 10 % de méthanol,.en volume et on verse l'extrait sur une colonne chromatographi- que'contenant la substance d'échange d'ions dénommée "Decalso". On lave la colonné au moyen de portions de chloroforme contenant 10, 20, 30, 40 'et 50 %de méthanol.en volume et on rejette les eaux de lavage. On élutrie la colonne au moyen de 600 cm3 de méthanol divisés en six portions égales.
On rejette les premiers 50 em3, on combine les fractions restantes et on évapore à sec dans le vide. On extrait le résidu à l'eau, on le congèle, et on en sublime la glace sous pression réduite pour obtenir 92 mg. de sistomycosine pure. A l'essai contre le Candida albicans, 400 gammas/cm3 de cette substance solide jaune clair produisent une zone d'inhibition de
23,8 mm. à une dilution de 1:1. On peut produire 60 mgr. additionnels de . sistomycosine en lavant la colonne d'absorption avec une plus grande quan- tité de'méthanol' et en traitant l'éluat comme décrit plus haut.
La sistomycosine pure est un composé organique neutre qui ne contient qué les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. Elle ne , fond pas'en dessous d'environ 230 C mais elle vire au brun à environ 130 C.
;Elle rédùit rapidement une solution froide aqueuse de permanganate de po- tassium 'et la solution de Benedict bouillante. Elle donne un essai de Mo- lisch positif aux hydrates de carbone, un essai de Beilstein négatif aux halogènes et un essai négatif au chlorure ferrique. L'addition d'une très petite quantité de l'antibiotique (1 à 2 mgr. ) à de l'acide sulfurique con- centré chaud confère à la solution une couleur rouge-cerise foncé à choco- lat. Aucune modification de couleur ne se produit quand on ajoute une peti- te quantité de l'antibiotique à de l'acide nitrique ou à de l'acide chlor- hydrique chauds saturés de thymol.
La sistomycosine, particulièrement en solutions, subit une dé- :composition photochimique par exposition à la lumière. Elle est décomposée par des.acides ou alcalis mais est plus stable dans des solutions neutres ou légèrement basiques, c'est-à-dire ayant un pH de 7-9, que dans des solu- tions à réaction acide. Elle est entièrement stable dans l'eau en dessous de 25 C et on peut même chauffer ses solutions aqueuses à 50 C pendant une heure Sans perte de son activité antibiotique. En solution aqueuse à 100 C, 'elle conserve plus de 50% de son activité antibiotique après une heure.
. Le spectre d'absorption ultraviolet (Figure I) a un maximum au voisinage de 300 millimicrons et un autre à 218 millimicrons avec un
E1% de 215. Le maximum au voisinage de 300 millimicrons se compose de
1 cm trois pointes d'absorption distinctes à 292,5, 306 et 320,5 millimicrons avec des valeurs de rpt respectivement.de 257, 340 et.295, et deux micm 1 % nima situés entre ces pointes à 298 et 314 millimicrons avec des E1% res- 1 cm pectivement de 230 et 217. Le minimum principal dans les spectres d'absorp- tion ultraviolets est situé à 253 millimicrons avec un E 1 1% de 102.
La
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courbe d'absorption représentée sur la Figure 1 est celle obtenue dans de l'eau, mais la sistomycosine est remarquable en ce que ce spectre n'est pas modifié de façon appréciable par des variations modérées de l'acidité ou de la basiéité de la solution, c'est-à-dire depuis la neutralité jusqu'à une acidité ou basicité d'environ 0,05 N.
La Figure 2 représente la région dite "à empreintes digitales" du spectre d'absorption infrarouge de la sistomycosine dans un véhicule d'huile minérale neutre. Les pointes à ou au voisinage de 6,88 et 7,30 microns sont attribuables au véhicule d'huile minérale. Les bandes d'ab- sorption les plus intenses caractéristiques de la sistomycosine sont cel- les situées à ou au voisinage de 6,34 et 9,44 microns. Des bandes d'in- tensité faible ou modérée sont situées à ou au voisinage de 7,70; 7,86;
8,55; 11,16; Il,85 et 12,4 microns avec d'autres apparaissant comme é- paulements aux bandes précédentes à ou au voisinage de-7,08, 7,16; 8,95;
9.89; 10,25 et-10,6 microns.
Une autre bande caractéristique de la sistomy- cosine située en dehors de la région à "empreintes digitales" se trouve à où au voisinage de 2,96 microns.
EXEMPLE 2.
Un milieu nutritif qui consiste en 5 gr. de glucose industriel, 2,5 gr. d'extrait de boeuf, 2,5 gr. de peptone, 2,5 gr. de chlorure de so- dium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume à 500 cm3 est rendue alcaline au pH 7,7 par une solution 10 N d'hydroxyde de sodium. On place le milieu dans un flacon de Fernbach bouché par un bouchon d'ouate et stérilisé sous une pression de vapeur d'eau de 1,26 Kgr/cm2 (18 livres) pen- dant vingt minutes. On inocule au milieu 1 cm3 d'une suspension de spores de Streptomyces viridosporus provenant d'un milieu de culture glucose-tryp- tone-agar vieux de dix jours. On soumet le mélange résultant à une incuba- tion à 24 C pendant huit jours.
Au bout de ce temps, le liquide de culture en dessous du mycélium de la surface a un pH de 6,8 et produit une zone d'inhibition de 22 mm. de diamètre quand on le soumet à un essai sistomy- cosine .contre Candida albicans par le procédé dit "disc-plate". On peut séparer la sistomycosine présente dans le liquide de culture par le procédé décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 3.
Un mélange consistant en 180 gr. de maltose de qualité industriel- le, 180 gr. de liqueur de trempage de grain, 90 gr. de chlorure de sodium,
36 gr. de phosphate bipotassique et une quantité suffisante d'eau pour for- mer un volume de 18 litres, est placé dans un appareil de fermentation de
30 gallons du genre décrit dans l'exemple 1. On règle le pH de la solution à 7,5 par une solution 10 N d'hydroxyde de sodium, on ajoute 18 gr. de car- bonate de calcium et on stérilise l'appareil de fermentation et le milieu à 250 C pendant deux heures.
On refroidit le milieu nutritif et on-lui ino- cule de façon aseptique 10 cm3 d'une suspension de spores de Streptomyces viridosporus préparée en remuant un milieu de culture glucose-tryptone-agar de Streptomyces viridosporus, vieux de sept jours, avec 10 cm3 de solution aqueuse de savon fin à 0,01 %.
On soumet le mélange de culture à l'incubation à 28-29 C pen- dant 136 heures et pendant ce temps, on fait tourner l'agitateur.à une vi- tesse de 150 tours par minute et on fait passer de l'air, stérile dans le . mélange à la vitesse de 7,2 à 18 litres par minute. A la fin de la période d'incubation, on sépare le -mycélium du mélange et on soumet la "bière" de culture claire à un essai de détermination de sa teneur en sistomycosine 'par -le procédé turbidimétrique contre le Candida albicans. Dans l'expérien- ce 'décrite, la bière de culture produit une inhibition à 50 % de la crois- sance du Candida albicans, à une dilution de 1 à 135.
On peut séparer la sistomycosine présente dans la bière de culture sous forme pure en utilisant le procédé de séparation décrit dans l'exemple 1.
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EXEMPLE 4.
On introduit dans chaque flacon d'une série de flacons Erlen- meyer 125 cm3 d'un milieu de culture composé de 0,5 % de glucose industriel, 0,5 % de glycérine, 0,3 % de caséine hydrolysée, 0,25 % de peptone, 0,1 % de levure de brasserie, 0,25 % de matières solides d'eau de trempage de . grain, 0,25 % de farine de soya, 0,25 % de résidu de fermentation du buta- nol-acétone, 0,25% de chlorure de sodium, 0,1 % de carbonate de calcium et de l'eau pour compléter à 100 %.
On recouvre les flacons d'ouate recouverte de gaze et on stérilise sous une pression de vapeur d'eau de 1,26 Kgr/cm2 (18 livres) pendant vingt-cinq minutes, puis on inocule à chaque flacon; de façon aseptique, 1 cm3 d'une suspension de spores de Streptomyces viridos- porus préparée à partir d'un milieu de culture glucose-tryptone-agar, vieux de sept jours. Les flacons sont secoués sur une machine à secouer du type rotatif tournant à 150 tours par minute, pendant quatre jours. On maintient la température à 22-4 C pendant l'incubation. A la fin de la période d'in- "cubation, la bière de culture a un pH de 6,4 environ.
A l'essai turbidimé- 'trique entre le Candida albicans, la bière de culture contient une quantité suffisante de sistomycosine pour produire une inhibition à 50 % de la crois- sance de l'organisme d'essai, à une dilution de 1 à 1350
Si on le désire, on peut combiner et filtrer le mélange de cul- ture dans les flacons et séparer la sistomycosine par le procédé décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 5.
On introduit dans chaque flacon d'une série de flacons d'Erlen- meyer 125 cm3 d'un milieu de culture composé de 1 % de maltose, 1 % de li- queur de trempage de grain, 0,2 % de phosphate bipotassique, 0,5 % de chlo- rure de sodium et de l'eau pour compléter à 100 % (réglée au pH de 7,5 par une solution d'hydroxyde de sodium 10 N) et on bouche les flacons avec de l'ouate recouverte de gaze. On stérilise les flacons contenant le milieu de culture, on inocule et on soumet à l'incubation comme décrit dans l'exemple 4. A la fin de la période d'incubation, on sépare le mycélium par filtra- tion et on combine les liquides ou bières de culture.
La bière de culture a un pH de 6,35 environ et en appliquant le procédé turbidimétrique, on trouvé qu'elle contient une quantité suffisante de sistomycosine pour pro- duire une inhibition à 50 % de la croissance de Candida albicans, à une dilution de 1 à 320. On peut séparer la sistomycosine pure de la bière de culture par le procédé décrit dans l'exemple 1.
EMI14.1
R E iT E N D I C¯A TI 0 N S.. l.- Procédé de production de l'antibiotique sistomycosine ca- ractérisé en ce qu'on inocule à un milieu de culture du Streptomyces viri- dosporus, on soumet le milieu inoculé à l'incubation dans des conditions aérobiques à une température de 20 à 35 C pendant environ un à huit jours, et on' sépare la sistomycosine ainsi produite du mélange de culture.