BRPI0408157B1 - ácido nucléico recombinante, polipeptídeo recombinante com atividade lipase, célula transformada, métodos empregando os mesmos e composição - Google Patents

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Uwe T. Bornscheuer
David Paul Weiner
Tim Hitchman
Jonathan Lyon
Sirirung Wongsakul
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Abstract

hidrolases, ácidos nucléicos e métodos empregando. a invenção refere-se a hidrolases, polinucleotídeos e métodos de empregar estes polinucleotídeos e polipeptídeos. em um aspecto, a invenção é direcionada a polipeptídeos, por exemplo, enzimas, tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma esterase, acilase, lipase, fosfolipase (por exemplo, atividade de fosfolipase a, b, c e d, atividade de patatina, atividade de hidrolase de acila de lipídeo (lah)) ou atividade de protease, incluindo atividade de hidrolase termotolerante e termoestável, e polinucleotídeos codificando estas enzimas, e preparar e empregar estes polinucleotídeos e polipeptídeos. as atividades de hidrolase dos polipeptídeos e peptídeos da invenção incluem atividade de esterase, atividade de lipase (hidrólise de lipídeos), reações de acidólise (para substituir um ácido graxo esterificado com um ácido graxo livre), reações de transesterificação (permuta de ácidos graxos entre triglicerídeos), síntese de éster, reações de intercâmbio de éster, atividade de fosfolipase e atividade de protease (hidrólise de ligações de peptídeo). os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em uma variedade de contextos industriais, agrícolas e farmacêuticos, incluindo a fabricação de cosméticos e nutracêuticos. em outro aspecto, os polipeptídeos da invenção são empregados para sintetizarem produtos quirais enantiomericamente puros.

Description

CAMPO TÉCNICO
Esta invenção refere-se à bioquímica e biologia molecular e celular. Em um aspecto, a invenção fornece hidroxilases, polinucleotí- deos codificando-as, e métodos para preparar e empregar estes po- linucleotídeos e polipeptídeos. Em um aspecto, a invenção é direcionada a polipeptídeos, por exemplo, enzimas, tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de estearase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, incluindo atividade de hidrolase ter- moestável termotolerante e termoestável, e polipeptídeos codificando estas enzimas, e preparo e emprego destes polinucleotídeos e polipeptídeos. As atividades de hidrolase dos polipeptídeos e peptí- deos da invenção incluem atividade de estearase, atividade de lipase (hidrólise de lipídeos), reações de acidólise (substituir um ácido graxo esterificado por um ácido graxo livre), reações de transes- terificação (permuta de ácidos graxos entre triglicerídeos), síntese de éster, reações de intercâmbio de éster, atividade de fosfolipase (por exemplo, atividade de fosfolipase A, B, C e D, atividade de pa- tatina, atividade de lipídeo acil hidrosilase (LAH)) e atividade de protease (hidrólise de ligações de peptídeo). Os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em uma variedade de contextos farmacêuticos, agrícolas e industriais, incluindo a fabricação de cosméticos e nutracêuticos. Em outro aspecto, os polipeptídeos da invenção são empregados para sintetizar produtos quirais enantio- mericamente puros.
Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção são empregados na síntese biocatalítica de lipídeos estruturados (lipídeos que contêm um grupo definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida na cadeia principal de glicerol), incluindo alternativas de manteiga de cacau (CBA), lipídeos contendo ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), diacilglice- rídeos, por exemplo, 1,3-diacilglicerídeos (DAGs), monoglicerídeos, por exemplo, 2-monoglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs). Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção são empregados para modificar óleos, tais como óleos de peixe, animal e vegetais, e lipídios, tais como ácidos gra- xo poli-insaturados. As hidrolases da invenção que têm atividade de lipase podem modificar óleos através de hidrólise, alcoólise, esterificação, transes- terificação e/ou interesterificação. Os métodos da invenção podem empregar lipases com regio-especificidade definida ou quimioseletividade definida em reações sintéticas biocatalíticas.
Adicionalmente, os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em processamento de comida, fermentação, aditivos de banho, produção de álcool, síntese de peptídeo, enantioseletividade, preparação de pele de animal na indústria de couro, administração dos resíduos e degradação animal, recuperação de prata na indústria fotográfica, tratamento médico, desengomadura de seda, degradação de biopelícula, conversão de biomassa para etanol, biodefesa, agentes antimicrobianos e desinfetantes, cuidado pessoal e cosméticos, reagentes de biotech, em aumento de produção de amido de moagem úmida de milho e farmacêuticos tais como ajudas digestivas e agentes antiinflamatórios (anti-flogísticos).
ANTECEDENTES
As principais aplicações industriais para hidrolases, por exemplo, esterases, lipases, fosfolipases e proteases, incluem a indústria de detergente, onde elas são empregadas para decompor materiais gordurosos em manchas de roupa suja em substâncias hidrofílicas facilmente removíveis; a indústria de comida e bebida onde elas são usadas na fabricação de queijo, o amadurecimento e condimento de queijo, como agentes de anti-azeda- mento para produtos de padaria, e na produção de margarina e outras pas- tas com aromas de manteiga naturais; em sistemas de resíduo; e na indús-triafarmacêutica onde elas são usadas como ajudas digestivas.
Óleos e gorduras são matérias-primas renováveis importantes para a indústria química. Eles estão disponíveis em quantidades grandes do processo de sementes oleaginosas de plantas como óleo de farelo de arroz, semente de colza (óleo de colza), girassol, azeitona, palma ou soja. Outras fontes de valiosos óleos e gorduras incluem peixe, sobras de restaurante, e gorduras animais rendidas. Estas gorduras e óleos são uma mistura de trigli- cerídeos ou lipídios, isto é, ácidos graxo (FAs) esterificados em um andaime de glicerol. Cada óleo ou gordura contém uma variedade ampla de diferentes estruturas de lipídio, definidas pelo conteúdo de FA e a sua distribuição regioquímica na cadeia principal de glicerol. Estas propriedades dos lipídios individuais determinam as propriedades físicas do triglicerídeo puro. Conse- qüentemente, o conteúdo de triglicerídeo de uma gordura ou óleo para uma extensão grande determina as propriedades físicas, químicas e biológicas do óleo. O valor de lipídios aumenta grandemente como uma função da sua pureza. Pureza alta pode ser alcançada por cromatografia fracionária ou destilação, separando o triglicerídeo desejado do meio misturado da fonte de gordura ou óleo. Entretanto, isto é caro e os produtos são freqüentemente limitados pelos baixos níveis nos quais o triglicerídeo se encontra natural-mente.Além disso, a pureza do produto é freqüentemente comprometida pela presença de muitos triglicerídeos estruturalmente e fisicamente ou quimicamente similares no óleo.
Uma alternativa para purificar triglicerídeos ou outros lipídios a partir de uma fonte natural é sintetizar os lipídios. Os produtos de tais processossão chamados lipídios estruturados porque eles contêm um grupo definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida na cadeia principal de glicerol. O valor de lipídios também aumenta grandemente através do controle do conteúdo de ácido graxo e distribuição dentro do lipídio. Lipases podem ser empregadas para afetar tal controle.
Fosfolipases são enzimas que hidrolisam as ligações de éster de fosfolipídeos. Correspondendo a sua importância no metabolismo de fosfoli- pídeos, estas enzimas são muito difundidas entre procariotas e eucariotas. As fosfolipases afetam o metabolismo, construção e reorganização de mem-branasbiológicas e estão envolvidas em cascatas de sinal. Vários tipos de fosfolipases são conhecidas, as quais diferem-se em sua especificidade de acordo com a posição da ligação atacada na molécula de fosfolipídeo. Fos- folipase A1 (PLA1) remove o ácido graxo da posição 1 para produzir ácido graxo livre e 1-liso-2-acilfosfolipídio. Fosfolipase A2 (PLA2) remove o ácido graxo da posição 2 para produzir ácido graxo livre e 1-acil-2-lisofosfolipídio. Enzimas PLA1 e PLA2 podem ser intra- ou extra-celulares, ligadas à membrana ou solúveis. PLA2 intracelular é encontrada em quase toda célula mamífero. Fosfolipase C (PLC) remove a porção de fosfato para produzir 1,2 diacilglicerol e base de fosfo. Fosfolipase D (PLD) produz 1,2- diacilglicerofosfato e grupo de base. PLC e PLD são importantes em sinalização de função de célula. Patatinas são outro tipo de fosfolipase que acredita-se que trabalhem como uma PLA.
Em geral, enzimas, incluindo hidrolases tais como esterases, lipases e proteases, são ativas durante uma faixa estrita de condições ambientais (temperatura, pH, etc.), e muitas são altamente específicas para substratos particulares. A faixa estrita de atividade para uma determinado enzima limita sua aplicabilidade e cria uma necessidade de uma seleção de enzimas que (a) têm atividades similares mas são ativas sob condições diferentes ou (b) têm substratos diferentes. Por exemplo, uma enzima capaz de catalisar uma reação a 50°C pode ser tão ineficiente a 35°C, que seu emprego na mais baixa temperatura não será possível. Por isso, detergentes de lavanderia geralmente contêm uma seleção de enzimas de proteolíticas, permitindo que o detergente seja empregado durante uma ampla faixa de temperatura de lavagem e pH. Devido à especificidade de enzimas e o emprego crescente de hidrolases na indústria, pesquisa, e medicina, há uma necessidade contínua na técnica por enzimas novas e inibidores de enzima novos. SUMÁRIO
A invenção fornece polipeptídeos, por exemplo, enzimas e anticorpos catalíticos, que têm uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de estearase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, que inclui atividades de hidrolase termotolerantes e termoestáveis, e atividades enanti- oespecíficas, e polinucleotídeos codificando estes polipeptídeos, incluindo vetores, células hospedeiras, plantas transgênicas e animais não-humanos, e métodos para a preparação e emprego destes polinucleotídeos e polipep- tídeos.
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados que compreendem uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) a um ácido nucléico exemplar da invenção sobre uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais, resíduos, em que o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de estearase, acila- se, lipase, fosfolipase ou protease. As identidades de seqüência podem ser determinadas através de análise com um algoritmo de comparação de se- qüência ou através uma inspeção visual. Ácidos nucléicos exemplares da invenção incluem ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico como mencionado nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 415, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 485, SEQ ID 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SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 643, SEQ ID NO: 645, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 663, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 699,SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 773, SEQ ID NO: 775, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 781, SEQ ID NO: 783, SEQ ID NO: 785, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 791, SEQ ID NO: 793, SEQ ID NO: 795, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 799,SEQ ID NO: 801, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 805, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 813, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 821, SEQ ID NO: 823, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 845, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 851, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 865, SEQ ID NO: 867, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 873, SEQ ID NO: 875, SEQ ID NO: 877, SEQ ID NO: 879, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 883, SEQ ID NO: 885, SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO: 889, SEQ ID NO: 891, SEQ ID NO: 893, SEQ ID NO: 895, SEQ ID NO: 897, SEQ ID NO: 899,SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 951 ou SEQ ID NO: 953, e subseqüências destas, por exemplo, pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 ou mais resíduos em comprimento, ou no tamanho natural de um gene ou transcrição. Ácidos nucléicos exemplares da invenção também incluem áci-dosnucléicos recombinantes ou isolados codificando um polipeptídeo tendo uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 634, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 644, SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 694, SEQ ID NO: 696, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 774, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 780, SEQ ID NO: 782, SEQ ID NO: 784, SEQ ID NO: 786, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 790, SEQ ID NO: 792, SEQ ID NO: 794, SEQ ID NO: 796, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 800, SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 820, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 952 ou SEQ ID NO: 954, e subseqüências destas e variantes destas. Em um aspecto, o po- lipeptídeo tem uma atividade de amilase, por exemplo, uma atividadea de estearase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease. Em um aspecto, a atividade de hidrolase é uma atividade quimioseletiva e/ou regioseletiva.
Em um aspecto, a invenção da mesma forma fornece ácidos nucléico de codificação de hidrolase com uma novidade comum em que eles são derivados de culturas misturadas. A invenção fornece ácidos nucléicos de codificação de hidrolase isolados de culturas misturadas compreendendo um ácido nucléico da invenção, por exemplo, um ácido nucléico tendo uma seqüência de pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) a um ácido nucléico exemplar da invenção em uma região de pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais, resíduos, em que o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de amilase, e as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual. Em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléico de codificação de amilase isolados de culturas misturadas compreendendo um ácido nucléico da invenção.
Em um aspecto, a invenção também fornece ácidos nucléicos de codificação de hidrolase com uma novidade comum em que eles são derivados de fontes ambientais, por exemplo, fontes ambientais misturadas. Em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos de codificação de hidrolase de fontes ambientais, por exemplo, fontes ambientais misturadas, compreendendo uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identi- dade de seqüência completa (100%) a um ácido nucléico exemplar da invenção em uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais, resíduos, em que o ácido nucléico codifica pelo menos um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, e as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por uma inspeção visual. Em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos de codificação de ami- lase isolados de fontes ambientais, por exemplo, fontes ambientais misturadas, compreendendo um ácido nucléico da invenção.
Em um aspecto, o algoritmo de comparação de seqüência é um algoritmo BLAST versão 2.2.2 onde uma configuração de filtração é fixada em blastall -p blast -d "nr pataa" -F F, e todas as outras opções são fixadas no parâmetro básico.
Outro aspecto da invenção é um ácido nucléico recombinante ou isolado incluindo pelo menos 10 bases sucessivas de uma seqüência de ácido nucléico da invenção, seqüências substancialmente idênticas a isso, e as seqüências complementares a isso.
Em um aspecto, a atividade de lipase compreende hidrolisação de um triacilglicerol (TAG), um diacilglicerol (DAG) ou um monoacilglicerol (MAG). A atividade de lipase pode compreender hidrolisação de um triacilgli- cerol para um diacilglicerol e um ácido graxo livre, ou, hidrolisação de um triacilglicerol para um monoacilglicerol e ácidos graxos livres, ou, hidrolisa- ção de um diacilglicerol para um monoacilglicerol e ácidos graxos livres, ou, hidrolisação de um monoacilglicerol para um ácido graxo livre e um glicerol. A atividade de lipase pode compreender sintetização de um triacilglicerol a partir de um diacilglicerol ou um monoacilglicerol e ácidos graxos livres. A atividade de lipase pode compreender sintetização de 1,3-dipalmitoil-2- oleoilglicerol (POP), 1,3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1-palmitoil-2-oleoil- 3-estearoilglicerol (POS) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM), ácidos gra- xos poliinsaturados de cadeia longa, ácido araquidônico, ácido docosaexae- nóico (DHA) ou ácido eicosapentaenóico (EPA). A atividade de lipase pode ser específica de posição de triacilglicerol (TAG), diacilglicerol (DAG) ou mo- noacilglicerol (MAG). A atividade de lipase pode ser específica de Sn2, específica de Sn1 ou Sn3. A atividade de lipase pode ser ácido graxo específico. A atividade de lipase pode compreender modificação de óleos por hidrólise,alcoólise, esterificação, transesterificação ou interesterificação. A atividade de lipase pode ser regio-específica ou quimioseletiva. A atividade de lipase pode compreender síntese de produtos quirais enantiomericamente puros. A atividade de lipase pode compreender síntese de ésteres de ácido graxo de umbeliferila (FA).
Em um aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, que é termos- tável. O polipeptídeo pode reter atividade sob condições compreendendo uma faixa de temperatura entre cerca de 37°C a cerca de 95°C, entre cerca de 55°C a cerca de 85°C, entre cerca de 70°C a cerca de 95°C, ou, entre cerca de 90°C a cerca de 95°C.
Em outro aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, que é termo- tolerante. O polipeptídeo pode reter atividade depois da exposição a uma temperatura na faixa de mais de 37°C a cerca de 95°C ou em qualquer lugar na faixa de mais de 55°C a cerca de 85°C. Em um aspecto, o polipeptídeo retém atividade depois da exposição a uma temperatura na faixa de mais de 90°C a cerca de 95°C em pH 4,5.
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados compreendendo uma seqüência que hibridiza sob condições severas para um ácido nucléico da invenção, por exemplo, um ácido nucléico exemplar da invenção compreendendo uma seqüência como mencionado em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, 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NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 415, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, 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NO: 599, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 643, SEQ ID NO: 645, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 663, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 695, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 699,SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 723, 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NO: 849, SEQ ID NO: 851, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 865, SEQ ID NO: 867, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 873, SEQ ID NO: 875, SEQ ID NO: 877, SEQ ID NO: 879, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 883, SEQ ID NO: 885, SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO: 889, SEQ ID NO: 891, SEQ ID NO: 893, SEQ ID NO: 895, SEQ ID NO: 897, SEQ ID NO: 899,SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 951 ou SEQ ID NO: 953, ou fragmentos ou subseqüências destas. Em um aspecto, o ácido nucléico codifica um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease. O ácido nucléico pode ser pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 ou mais resíduos em comprimento ou o tamanho natural do gene ou transcrição. Em um aspecto, as condições severas incluem uma etapa de lavagem compreendendo uma lavagem em 0,2X SSC a uma temperatura de cerca de 65°C durante cerca de 15 minutos.
A invenção fornece uma sonda de ácido nucléico, por exemplo, uma sonda para identificação de um ácido nucléico codificando um polipep- tídeo tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, em que a sonda compreende pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ou mais, bases consecutivas de uma seqüência da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destas, em que a sonda identifica o ácido nucléico por ligação ou hibridação. A sonda pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, ou cerca de 60 a 100 bases consecutivas de uma seqüência compreendendo uma seqüência da invenção, ou fragmentos ou subseqüências destas. A sonda pode compreender um oligonucleotídeo que compreende pelo menos cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, ou cerca de 60 a 100 bases consecutivas de uma seqüência de ácido nucléico da invenção, ou um subseqüência desta.
A invenção fornece métodos de amplificação de um ácido nu- cléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, compreendendo amplificação de um ácido nucléico padrão com um par de seqüência de iniciador de amplificação capaz de amplificar uma seqüência de ácido nucléico da invenção, ou fragmentos ou subseqüências desta.
A invenção fornece cassetes de expressão compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um subseqüência desta. Em um aspecto, o cassete de expressão pode compreender o ácido nucléico que é operavel- mente ligado a um promotor. O promotor pode ser um promotor viral, bacte- riano, de mamífero ou de planta. Em um aspecto, o promotor de planta pode ser um promotor de batata, arroz, milho, trigo, tabaco ou cevada. O promotor pode ser um promotor constitutivo. O promotor constitutivo pode compreender CaMV35S. Em outro aspecto, o promotor pode ser um promotor induzí- vel. Em um aspecto, o promotor pode ser um promotor específico de tecido ou um promotor ambientalmente regulado ou um desenvolvidamente regulado. Desta maneira, o promotor pode ser, por exemplo, um promotor específico de semente, um específico de folha, um específico de raiz, um específico de caule ou um induzido por abscisão. Em um aspecto, o cassete de expressão pode também compreender uma planta ou vetor de expressão de vírus de planta.
A invenção fornece veículos de clonagem compreendendo um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção ou um ácido nu- cléico da invenção. O veículo de clonagem pode ser um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídio, um fosmídio, um bacterió- fago ou um cromossomo artificial. O vetor viral pode compreender um vetor de adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno-associado. O veículo de clonagem pode compreender um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um plasmídeo, um vetor derivado de bacteriófago P1 (PAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC) ou um cromossomo artificial de mamífero (MAC).
A invenção fornece célula transformada compreendendo um áci-donucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção, ou um veículo de clonagem da invenção. Em um aspecto, a célula transformada pode ser uma célula bacteriana, uma célula de mamífero, uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula de planta. Em um aspecto, a célula de planta pode ser uma célula de batata, trigo, arroz, milho, tabaco ou cevada.
A invenção fornece animais não humanos transgênicos compre-endendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. Em um aspecto, o animal é um camundongo.
A invenção fornece plantas transgênicas compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. A planta transgênica pode ser uma planta de milho, uma planta de batata, uma planta de tomate, uma planta de trigo, uma planta de semente oleaginosa, uma planta de colza, uma planta de soja, uma planta de arroz, uma planta de cevada ou uma planta de tabaco.
A invenção fornece sementes transgênicas compreendendo um ácido nucléico da invenção ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) da invenção. A semente transgênica pode ser arroz, uma semente de milho, um grão de trigo, uma semente oleaginosa, uma semente de colza, uma semente de soja, um caroço de palma, uma semente de girassol, uma semente de gergelim, um amendoim ou uma semente de planta de tabaco.
A invenção fornece um oligonucleotídeo de anti-sentido compre-endendo uma seqüência de ácido nucléico complementar a ou capaz de hi- bridizar sob condições severas para um ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos de inibição da translação de uma mensagem de hidrolase em uma célula compreendendo administrar à célula ou expressar na célula um oligonucleotídeo de anti-sentido compreendendo uma seqüên- cia de ácido nucléico complementar a ou capaz de hibridizar sob condições severas para um ácido nucléico da invenção.
A invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) a um peptídeo ou polipeptídeo exemplar da invenção em uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais resíduos, ou no tamanho natural do polipeptídeo, e as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüên- cia ou por uma inspeção visual. As seqüências de peptídeo ou polipeptídeo exemplares da invenção incluem SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 634, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 644, SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 694, SEQ ID NO: 696, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 774, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 780, SEQ ID NO: 782, SEQ ID NO: 784, SEQ ID NO: 786, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 790, SEQ ID NO: 792, SEQ ID NO: 794, SEQ ID NO: 796, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 800, SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 820, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 952 e SEQ ID NO: 954, e subseqüências destas e variantes destas, por exemplo, pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 ou mais resíduos em comprimento, ou no tamanho natural de uma enzima. Seqüências de peptídeo ou poli- peptídeo exemplares da invenção incluem seqüência codificada por um ácidonucléico da invenção. Seqüências de peptídeo ou polipeptídeo exemplares da invenção incluem polipeptídeos ou peptídeos especificamente ligados por um anticorpo da invenção. Em um aspecto, um polipeptídeo da invenção tem pelo menos uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease. Em um aspecto, a atividadeé uma atividade regioseletiva e/ou quimioseletiva.
Outro aspecto da invenção é um peptídeo ou polipeptídeo re- combinante ou isolado incluindo pelo menos 10 bases sucessivas de uma seqüência de peptídeo ou polipeptídeo da invenção, seqüências substanci-almenteidênticas a isto, e as seqüências complementares a isto.
A atividade de lipase pode também compreender hidrolisar um triacilglicerol (TAG), um diacilglicerol (DAG), um monoacilglicerol (MAG). A atividade de lipase pode compreender hidrolisar um triacilglicerol para um diacilglicerol e um ácido graxo livre, ou, hidrolisar um triacilglicerol para um monoacilglicerol e ácidos graxos livres, ou, hidrolisar um diacilglicerol para um monoacilglicerol e ácidos graxos livres, ou, hidrolisar um monoacilglicerol para um ácido graxo livre e um glicerol. A atividade de lipase pode compreender sintetisar um triacilglicerol de um diacilglicerol ou um monoacilglicerol e ácidos graxos livres. A atividade de lipase pode compreender sintetisar 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-disteroil-2-oleoilglicerol (SOS), 1- palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM), ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, ácido araquidônico, ácido docossaexaenóico (DHA) ou ácido eicosapentaenóico (EPA).
A atividade de lipase pode ser posição de triacilglicerol (TAG), diacilglicerol (DAG) ou monoacilglicerol (MAG) - específica. A atividade de lipase pode ser específica de Sn2, específica de Sn1 ou Sn3. A atividade de lipase pode ser específica de ácido graxo. A atividade de lipase pode compreender modificar óleos por hidrólise, alcoólise, esterificação, transesterifi- cação ou interesterificação. A atividade de lipase pode ser regio-específica ou quimioseletiva. A atividade de lipase pode compreender síntese de produtos quirais enantioméricos puros. A atividade de lipase pode compreender a síntese de ésteres de ácido graxo umbeliferila.
Em um aspecto, a atividade de hidrolase pode ser termoestável. O polipeptídeo pode reter uma atividade de hidrolase sob condições compreendendo uma faixa de temperatura dentre cerca de 37oC a cerca de 95oC, entre 55oC a cerca de 85oC, entre cerca de 70oC a cerca de 95oC ou entre cerca de 90oC a cerca de 95oC. Em outro aspecto, a atividade de hi- drolase pode ser termotolerante. O polipeptídeo podem reter uma atividade de hidrolase depois da exposição a uma temperatura na faixa de maior do que 37oC a cerca de 95oC ou na faixa de maior do que 55oC a cerca de 85oC. Em um aspecto, o polipeptídeo podem reter uma atividade de hidro- lase depois da exposição a uma temperatura na faixa de maior do que 90oC a cerca de 95oC em pH 4,5.
Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado pode compreender o polipeptídeo da invenção que necessita de uma seqüência de sinal. Em um aspecto, o polipeptídeo recombinante ou isolado pode compreender o polipeptídeo da invenção compreendendo uma seqüência de sinalheteróloga, tal como uma seqüência de sinal de não hidrolase ou hidro- lase heteróloga. Em um aspecto, a invenção fornece proteínas quiméricas compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma seqüência de sinal da invenção e pelo menos um segundo domínio. A proteína pode ser uma proteína de fusão. O segundo domínio pode compreender uma enzima. A enzima pode ser uma hidrolase (por exemplo, um hidrolase da invenção, ou, outra hidrolase).
Em um aspecto, a atividade de hidrolase compreende uma ativi-dadeespecífica a cerca de 37oC na faixa de cerca de 100 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a atividade de hidro- lase compreende uma atividade específica de cerca de 500 a cerca de 750 unidades por miligrama de proteína. Alternativamente, a atividade de hidro- lase compreende uma atividade específica a 37oC na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a atividade de hidrolase compreende uma atividade específico a 37oC na faixa de cerca de 750 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, o termotolerância compreende retenção de pelo menos metade da atividade específica da hidrolase a 37oC depois de ser aquecida à temperatura elevada. Alternativamente, a termotolerância podem compreenderretenção de atividade específica a 37oC na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína depois de ser aquecida à temperatura elevada.
A invenção fornece polipeptídeos recombinantes ou isolados da invenção, em que o polipeptídeo compreende pelo menos um sítio de glico- silação. Em um aspecto, glicosilação podem ser uma glicosilação ligada por N. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosilado depois de ser expresso em um P. pastoris ou um S. pombe.
Em um aspecto, o polipeptídeo pode reter uma atividade de hi- drolase sob condições compreendendo cerca de pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 ou pH 4. Em outro aspecto, o polipeptídeo pode reter uma atividade de hidrolase sob condições compreendendo cerca de pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5 ou pH 11.
A invenção fornece preparações de proteína compreendendo um polipeptídeo da invenção, em que a preparação de proteína compreende um líquido, um sólido ou um gel.
A invenção fornece heterodímeros compreendendo um polipep- tídeo da invenção e um segundo domínio. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um polipeptídeo e o heterodímero pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um epítopo ou um rótu-
Em um aspecto, a invenção fornece homodímeros compreendendo um polipeptídeo da invenção.
A invenção fornece polipeptídeos imobilizado tendo uma atividade de hidrolase, em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo da invenção, um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, ou um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo da invenção e um segundo domínio. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser imobilizado em uma célula, um metal, uma resina, um polímero, um cerâmico, um vidro, um mi- croeletrodo, uma partícula grafítica, uma conta, um gel, uma placa, uma disposição ou um tubo capilar.
A invenção fornece disposições compreendendo um ácido nu- cléico imobilizado da invenção. A invenção fornece disposições compreendendo um anticorpo da invenção.
A invenção fornece anticorpos recombinantes ou isolados que especificamente ligam-se a um polipeptídeo da invenção ou a um polipeptí- deo codificado por um ácido nucléico da invenção. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um policlonal. A invenção fornece hibridomas compreendendo um anticorpo da invenção, por exemplo, um anticorpo que especificamente liga-se a um polipeptídeo da invenção ou a um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção.
A invenção fornece suplementos de produtos alimentícios a um animal compreendendo um polipeptídeo da invenção, por exemplo, um poli- peptídeo codificado pelo ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, o poli- peptídeo no suplemento de produtos alimentícios pode ser glicosilado. A invenção fornece matrizes de liberação de enzima comestíveis compreendendo um polipeptídeo da invenção, por exemplo, um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico da invenção. Em um aspecto, a matriz de liberação compreende uma pelota. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosilado. Em um aspecto, a atividade de hidrolase é termotolerante. Em outro aspecto, a atividade de hidrolase é termoestável.
A invenção fornece método de isolar ou identificar um polipeptí- deo tendo uma atividade de hidrolase compreendendo as etapas de: (a) for- necer um anticorpo da invenção; (b) fornecer uma amostra compreendendo polipeptídeos; e (c) contatar a amostra da etapa (b) com o anticorpo da etapa (a) sob condições em que o anticorpo especificamente pode ligar-se ao polipeptídeo, desse modo isolando ou identificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase.
A invenção fornece métodos de preparar uma anticorpo anti- hidrolase compreendendo administrar a um animal não humano um ácido nucléico da invenção ou um polipeptídeo da invenção ou subseqüências destes em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune humoral, desse modo preparando um anticorpo anti-hidrolase. A invenção fornece métodos de preparar um imune anti-hidrolase compreendendo administrar a um animal não humano um ácido nucléico da invenção ou um polipeptídeo da invenção ou subseqüências destes em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune.
A invenção fornece métodos de produzir um polipeptídeo re- combinante compreendendo as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção operavelmente ligado a um promotor, e (b) expressar o ácido nu- cléico da etapa (a) sob condições que permitam a expressão do polipeptí- deo, desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante. Em um aspecto, o método pode também compreender transformar uma célula hospedeira com o ácido nucléico de etapa (a) seguido por expressão do ácido nucléico da etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante em uma célula transformada.
A invenção fornece métodos para identificar um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção; ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um substrato de hidrolase; e (c) contatar o polipeptídeo ou um fragmento ou variante deste da etapa (a) com o substrato da etapa (b) e detectar uma diminuição na quantidade de substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação, em que uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação detecta um polipeptídeo tendo uma atividade de hidro- lase. Em um aspecto, o substrato pode ser um ácido graxo poli-insaturado (PUFA), um diaglicerídeo, por exemplo, um 1,3-diacilglicerídeo (DAG), um monoglicerídeo (MAG), ou um triacilglicerídeo (TAG).
A invenção fornece métodos para identificar um substrato de hidrolase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção; ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um substrato teste; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com o substrato teste da etapa (b) e detectar uma diminuição na quantidade de substrato ou um aumento na quantidade de produto de reação, em que uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação identifica o substrato teste como um substrato de hidrolase.
A invenção fornece métodos de determinar se um composto teste especificamente liga-se a um polipeptídeo compreendendo as seguintes etapas: (a) expressar um ácido nucléico ou um vetor compreendendo o ácidonucléico sob condições permissivas para translação do ácido nucléico em um polipeptídeo, em que o ácido nucléico compreende um ácido nucléico da invenção, ou, fornecer um polipeptídeo da invenção; (b) fornecer um composto teste; (c) contatar o polipeptídeo com o composto teste; e (d) determinar se o composto teste da etapa (b) especificamente liga-se ao polipeptí- deo.
A invenção fornece métodos para identificar um modulador de uma atividade de hidrolase compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado para um ácidonucléico da invenção; (b) fornecer um composto teste; (c) contatar o poli- peptídeo da etapa (a) com o composto teste da etapa (b) e medir uma atividade da hidrolase, em que uma alteração na atividade de hidrolase medida na presença do composto teste comparada à atividade na ausência do composto teste, fornece uma determinação que o composto teste modula a atividade de hidrolase. Em um aspecto, a atividade de hidrolase pode ser medida fornecendo-se um substrato de hidrolase e detectando uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação, ou, um aumento na quantidade do substrato ou uma diminuição na quantidade de um produto de reação. Uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação com o composto teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um ativador de atividade de hidrolase. Um aumento na quantidade do substrato ou uma diminuição na quantidade do produto de reação com o composto teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto teste identifica o composto teste como um inibidor da atividade de hidrolase.
A invenção fornece sistemas de computador compreendendo um processador e um dispositivo de armazenagem de dados em que o referido dispositivo de armazenagem de dados armazenou nele uma seqüência de polipeptídeo ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção (por exemplo, um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção). Em um aspecto, o sistema de computador pode também compreender um algoritmo de comparação de seqüência e um dispositivo de armazenagem de dados tendo pelo menos uma seqüência de referência armazenada nele. Em outro aspecto, o algoritmo de comparação de seqüência compreende um programa de computação que indica polimorfismos. Em um aspecto, o sistema de computador pode também compreender um identificador que identifica uma ou mais características na referida seqüência. A invenção fornece meios legíveis de computador tendo armazenado neles uma seqüência de polipeptí- deo ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção. A invenção fornece métodos para identificar uma característica em uma seqüência compreendendo as etapas de: (a) ler a seqüência empregando-se um programa de computador que identifica uma ou mais características em uma seqüência, em que a seqüência compreende uma seqüência de polipeptídeo ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção; e (b) identificar uma ou mais características na seqüência com o programa de computador. A invenção fornecemétodos para comparar uma primeira seqüência a uma segunda se- qüência compreendendo as etapas de: (a) ler a primeira seqüência e a segundaseqüência através do uso de um programa de computador que com- para seqüências, em que a primeira seqüência compreende uma seqüência de polipeptídeo ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção; e (b) de-terminardiferenças entre a primeira seqüência e a segunda seqüência com o programa de computador. A etapa de determinar diferenças entre a primei-raseqüência e a segunda seqüência pode também compreender a etapa de identificar polimorfismos. Em um aspecto, o método pode também compreender um identificador que identifica uma ou mais características em uma seqüência. Em outro aspecto, o método pode compreender ler a primeira seqüência empregando-se um programa de computação e identificando-se uma ou mais características na seqüência.
A invenção fornece métodos para isolar ou recuperar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase de uma amostra ambiental compreendendo as etapas de: (a) fornecer um par de seqüência de iniciador de amplificação para amplificar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, em que o par de iniciador é capaz de amplificar um ácido nucléico da invenção; (b) isolar um ácido nucléico da amostra ambiental ou tratar a amostra ambiental tal que o ácido nucléico na amostra é acessível para hibridação para o par de iniciador de amplificação; e (c) combinar o ácido nucléico da etapa (b) com o par de iniciador de amplificação da etapa (a) e amplificar ácido nucléico da amostra ambiental, desse modo isolando ou recuperando um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase de uma amostra ambiental. Um ou cada membro do par de seqüência de iniciador de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas de uma seqüência da invenção.
A invenção fornece métodos para isolar ou recuperar um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase de uma amostra ambiental compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma sonda de polinucleotídeo compreendendo um ácido nucléico da invenção ou uma subseqüência deste; (b) isolar um ácido nucléico da amostra ambiental ou tratar a amostra ambiental tal que o ácido nucléico na amostra é acessí- vel para hibridação para uma sonda de polinucleotídeo da etapa (a); (c) combinar o ácido nucléico isolado ou a amostra ambiental tratada da etapa (b) com a sonda de polinucleotídeo da etapa (a); e (d) isolar um ácido nu- cléico que especificamente hibridiza com a sonda de polinucleotídeo da etapa (a), desse modo isolando ou recuperando um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase de uma amostra ambiental. A amostra ambiental pode compreender uma amostra de água, uma amostra de líquido, uma amostra de solo, uma amostra de ar ou uma amostrabiológica. Em um aspecto, a amostra biológica pode ser derivada de uma célula bacteriana, uma célula de protozoário, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula fúngica ou uma célula de mamífero.
A invenção fornece métodos de gerar uma variante de um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase com-preendendo as etapas de: (a) fornecer um ácido nucléico padrão compreendendo um ácido nucléico da invenção; e (b) modificar, deletar ou adicionar um ou mais nucleotídeos na seqüência padrão ou uma combinação destes, para gerar uma variante do ácido nucléico padrão. Em um aspecto, o método pode também compreender expressar o ácido nucléico variante para gerar um polipeptídeo de hidrolase variante. As modificações, adições ou dele- ções podem ser introduzidas por um método compreendendo PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR em conjunto, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, muta- gênese de cassete, mutagênese em conjunto recursiva, mutagênese em conjunto exponencial, mutagênese específica de sítio, reagrupamento de gene, mutagênese saturada de sítio de gene (GSSM), reagrupamento de ligação sintético (SLR) ou uma combinação destes. Em outro aspecto, as modificações, adições ou deleções são introduzidas por um método compreendendorecombinação, recombinação de seqüência recursiva, mutagênese de DNA modificado por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese dúplex espaçada, mutagênese de reparo de ligação imperfeita pontual, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de restrição-seleção, mutagênese de restrição-purificação, síntese de gene artificial, mutagênese em conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quiméricoe uma combinação destes.
Em um aspecto, o método pode ser iterativamente repetido até que um hidrolase tendo um atividade diferente ou alterada ou um estabilidade alterada ou diferente daquela de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico padrão seja produzida. Em um aspecto, o polipeptídeo de hidrolase variante é termotolerante, e retém alguma atividade depois de ser exposto a uma temperatura elevada. Em outro aspecto, o polipeptídeo de hidrolase variante tem glicosilação aumentada quando comparado à hidrolase codificada por um ácido nucléico padrão. Alternativamente, o polipeptídeo de hi- drolase variante tem uma atividade de hidrolase sob uma temperatura alta, em que a hidrolase codificada pelo ácido nucléico padrão não é ativa sob a temperatura alta. Em um aspecto, o método pode ser iterativamente repetido até que uma seqüência de codificação de hidrolase tendo um uso de códon alterado daquela do ácido nucléico padrão seja produzida. Em outro aspecto, o método pode ser iterativamente repetido até que um gene de hidrolase tendo nível mais alto ou mais baixo de estabilidade ou expressão de mensagem daquele do ácido nucléico padrão seja produzido.
A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase; e, (b) identificar um códon não preferido ou menos preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo com um códon neutralmente empregado ou preferido codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, em que um códon preferido é um códon super-representado nas seqüências de codificação em genes na célula hospedeira e um códon menos preferido ou não preferido é um códon sub-representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para aumentar sua expres- são em uma célula hospedeira.
A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase; o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção; e, (b) identificar um códon no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo com um códon diferente codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, desse modo modificando códons em um ácido nucléico codificando uma hidrolase.
A invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção codificando um polipeptídeo de hidrolase; e, (b) identificar um códon menos preferido ou um não preferido no ácido nucléico da etapa (a) e substituí-lo com um códon neutralmente empregado ou preferido codificando o mesmo ami- noácido como o códon substituído, em que um códon preferido é um códon super-representado nas seqüências de codificação em genes na célula hospedeira e um códon menos preferido ou não preferido é um códon sub- representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira.
A invenção fornece métodos para modificar um códon em um ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase para diminuir sua expressão em uma célula hospedeira, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um ácido nucléico da invenção; e (b) identificar pelo menos um códon preferido no ácido nucléico da etapa (a) substituí-lo com um códon menos preferido ou não preferido codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído, em que um códon preferido é um códon super-representado nas seqüências de codificação em genes em uma célula hospedeira e um códon menos preferido ou não preferido é um códon sub-representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira, desse modo modificando o ácido nucléico para diminuir sua ex- pressão em uma célula hospedeira. Em um aspecto, a célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta ou uma célula de mamífero.
A invenção fornece métodos para produzir uma biblioteca de ácidos nucléicos codificando uma pluralidade de sítios ativos de hidrolase modificados ou sítios de ligação de substrato, em que os sítios ativos modificados ou sítios de ligação de substrato são derivados de um primeiro ácido nucléico compreendendo uma seqüência codificando um primeiro sítio ativo ou um primeiro sítio de ligação de substrato, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer um primeiro ácido nucléico codificando um primeiro sítio ativo ou primeiro sítio de ligação de substrato, em que a primeiraseqüência de ácido nucléico compreende uma seqüência que hibridiza sob condições severas para um ácido nucléico da invenção, e o ácido nu- cléico codifica um sítio ativo de hidrolase ou um sítio de ligação de substrato de hidrolase; (b) fornecer um grupo de oligonucleotídeos mutagênicos que codifica variantes de aminoácido de ocorrência natural em uma pluralidade de códons alvejados no primeiro ácido nucléico; e, (c) empregar o grupo de oligonucleotídeos mutagênicos para gerar um grupo de ácidos nucléicos variantes de codificação de sítio de ligação de substrato ou de codificação de sítio ativo codificando uma faixa de variações de aminoácido em cada códon de aminoácido que foi mutagenizado, desse modo produzindo uma biblioteca de ácidos nucléicos codificando uma pluralidade de sítios ativos de hidro- lase modificados ou sítios de ligação de substrato. Em um aspecto, o método compreende mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) por um método compreendendo um sistema de evolução direcionado otimizado, mu- tagênese de saturação de sítio de gene (GSSM) ou reagrupamento de ligação sintética (SLR), PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR em conjunto, mutagênese de PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese em conjunto recursiva, mutagênese em conjunto exponencial, mutagênese específica de sítio, reagrupamento de gene, mutagênese saturada de sítio de gene (GSSM), reagrupamento de ligação sintética (SLR) e uma combinação des- tes. Em outro aspecto, o método compreende mutagenizar o primeiro ácido nucléico da etapa (a) ou variantes por um método compreendendo recombi- nação, recombinação de seqüência recursiva, mutagênese de DNA modificada por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese dú- plex espaçada, mutagênese de reparo de ligação imperfeita pontual, muta- gênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mu- tagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de restrição- seleção, mutagênese de restrição-purificação, síntese de gene artificial, mu- tagênese em conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico e uma combinação destes.
A invenção fornece métodos para preparar uma molécula pequena compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma pluralidade de enzimas biossintéticas capazes de sintetizar ou modificar uma molécula pequena, em que um das enzimas compreende uma enzima hidrolase codificada por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um substrato para pelo menos uma das enzimas da etapa (a); e (c) reagir o substrato da etapa (b) com as enzimas sob condições que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas para gerar uma molécula pequena por uma série de reações biocatalíticas. A invenção fornece métodos para modificar uma molécula pequena compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma enzima hidro- lase, em que a enzima compreende um polipeptídeo da invenção, ou, um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, ou um subse- qüência destes; (b) fornecer uma molécula pequena; e (c) reagir a enzima da etapa (a) com a molécula pequena da etapa (b) sob condições que facilitam uma reação enzimática catalisada pela enzima hidrolase, desse modo modificando uma molécula pequena por uma reação enzimática de hidrolase. Em um aspecto, o método pode compreender uma pluralidade de substratos de molécula pequena pela enzima da etapa (a), desse modo gerando uma biblioteca de moléculas pequenas modificadas produzida por pelo menos uma reação enzimática catalisada pela enzima hidrolase. Em um aspecto, o mé-todo pode compreender uma pluralidade de enzimas adicionais sob condições que facilitam uma pluralidade de reações biocatalíticas pelas enzimas para formar uma biblioteca de moléculas pequenas modificadas produzidas pela pluralidade de reações enzimáticas. Em outro aspecto, o método pode também compreender a etapa de testar a biblioteca para determinar se uma molécula pequena modificada particular que exibe uma atividade desejada está presente dentro da biblioteca. A etapa de testar a biblioteca pode também compreender as etapas de sistematicamente eliminar todas menos uma das reações biocatalíticas empregadas para produzir uma porção da pluralidade das moléculas pequenas modificadas dentro da biblioteca testando-se a porção da molécula pequena modificada quanto a presença ou ausência da molécula pequena modificada particular com uma atividade desejada, e identificar pelo menos uma reação biocatalítica específica que produz a molécula pequena modificada particular da atividade desejada.
A invenção fornece métodos para determinar um fragmento funcional de uma enzima hidrolase compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma enzima hidrolase, em que a enzima compreende um polipeptídeo da invenção, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, ou um subseqüência destes; e (b) deletar uma pluralidade de resíduos de aminoácido da seqüência da etapa (a) e testar a subseqüência restante quanto a uma atividade de hidrolase, desse modo determinando um fragmento funcional de uma enzima hidrolase. Em um aspecto, a atividade de hidrolase é medida fornecendo-se um substrato de hidrolase e detectandose uma diminuição na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação.
A invenção fornece métodos para construção de célula inteira de fenótipos modificados ou novos empregando-se análise de fluxo metabólico em tempo real, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) preparar uma célula modificada modificando-se a composição genética de uma célula, em que a composição genética é modificada por adição à célula de um ácido nucléico da invenção; (b) cultivar a célula modificada para gerar uma pluralidade de células modificadas; (c) medir pelo menos um parâmetro metabólicoda célula monitorando-se a cultura de célula da etapa (b) em tempo real; e, (d) analisar os dados da etapa (c) para determinar se o parâmetro medido difere-se de uma medida comparável em uma célula inalterada sob condições similares, desse modo identificando um fenótipo construído na célula empregando-se análise de fluxo metabólico em tempo real. Em um aspecto, a composição genética da célula pode ser modificada por um método compreendendo deleção de uma seqüência ou modificação de uma seqüência na célula, ou, eliminar a expressão de um gene. Em um aspecto, o método pode também compreender selecionar uma célula compreendendo um fenótipo recentemente construído. Em outro aspecto, o método pode compreender cultivar a célula selecionada, desse modo gerando uma nova cepa de célula compreendendo um fenótipo recentemente construído.
A invenção fornece métodos de aumentar a termotolerância ou termoestabilidade de um polipeptídeo de hidrolase, o método compreendendo glicosilar um polipeptídeo de hidrolase, em que o polipeptídeo compreende trinta aminoácidos contíguos de um polipeptídeo da invenção; ou um po- lipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, desse modo aumentando a termotolerância ou termoestabilidade do polipeptídeo de hidro- lase. Em um aspecto, a atividade específica de hidrolase pode ser termoes- tável ou termotolerante a uma temperatura na faixa de maior do que cerca de 37oC a cerca de 95oC.
A invenção fornece métodos para superexpressar um polipeptí- deo de hidrolase recombinante em um célula compreendendo expressar um vetor compreendendo um ácido nucléico compreendendo um ácido nucléico da invenção ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção, em que as identidades de seqüência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual, em que a superex- pressão é realizada por uso de um promotor de alta atividade, um vetor di- cistrônico ou por amplificação de gene do vetor.
A invenção fornece composições detergentes compreendendo um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção, em que o polipeptídeo compreende uma atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease. Em um aspecto, a hidrolase pode ser uma hidrolase não tensoati- va. Em outro aspecto, a hidrolase pode ser um hidrolase tensoativa.
A invenção fornece métodos para lavar um objeto compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo um polipeptídeo tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, em que o polipeptídeo compreende: um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção; (b) fornecer um objeto; e (c) contatar o poli- peptídeo da etapa (a) e o objeto da etapa (b) sob condições em que a composição pode lavar o objeto.
A invenção fornece métodos de preparar uma planta transgênica compreendendo as seguintes etapas: (a) introduzir uma seqüência de ácido nucléico heteróloga na célula, em que a seqüência nucléica heteróloga com-preende uma seqüência de ácido nucléico da invenção, desse modo produzindo uma célula de planta transformada; e (b) produzindo uma planta trans- gênica da célula transformada. Em um aspecto, a etapa (a) pode também compreender, introduzir a seqüência de ácido nucléico heteróloga por ele- troporação ou microinjeção de protoplastos de célula de planta. Em outro aspecto, a etapa (a) pode também compreender, introduzir a seqüência de ácido nucléico heteróloga diretamente ao tecido da planta por bombardeio de partícula de DNA. Alternativamente, a etapa (a) pode também compreender, introduzir a seqüência de ácido nucléico heteróloga no DNA da célula de planta empregando-se um hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens. Em um aspecto, a célula de planta pode ser uma célula de batata, milho, arroz, trigo, tabaco ou cevada.
A invenção fornece métodos de expressar uma seqüência de ácido nucléico heteróloga em uma célula de planta compreendendo as seguintes etapas: (a) transformar a célula de planta com uma seqüência de ácido nucléico heteróloga operavelmente ligada a um promotor, em que a seqüência nucléica heteróloga compreende um ácido nucléico da invenção; (b) cultivar a planta sob condições em que a seqüência de ácido nucléico heteróloga é expressa na célula de planta.
A invenção fornece seqüências de sinal compreendendo ou con- sistindo de um peptídeo tendo uma sub-seqüência de um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece uma proteína quimérica compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma seqüência de sinal da invenção e pelo menos um segundo domínio. A proteína pode ser uma proteína de fusão. O segundo domínio pode compreender uma enzima. A enzima pode ser uma hidrolase.
A invenção fornece método para síntese biológica de um lipídio estruturado compreendendo as etapas seguintes: (a) fornecer uma hidrolase da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um triacilglicerí- deo (TAG); (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo hidrolisa um resíduo de acila na posição de Sn2 do triacilglicerídeo (TAG), desse modo produzindo um 1,3- diacilglicerídeo (DAG); (d) fornecer um éster de R1; (e) fornecer uma hidro- lase específica de R1 e (f) contatar 1,3-DAG da etapa (c) com o éster de R1 da etapa (d) e a hidrolase específica de R1 da etapa (e) sob condições em que a hidrolase específica de R1 catalisa a esterificação da posição de Sn2, desse modo produzindo o lipídio estruturado. A hidrolase pode ser uma lipase específica de Sn2. O lipídio estruturado pode compreender um alternativo de manteiga de cacau (CBA), uma manteiga de cacau sintética, uma manteiga de cacau natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-dies- tearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM).
A invenção fornece um método para síntese biocatalítica de um lipídio estruturado compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidrolase da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um triacilglicerídeo (TAG); (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições em que o polipeptídeo hidrolisa um resíduo de acila na posição Sn1 ou Sn3 do triacilglicerídeo (TAG), desse modo produzindo um 1,2-DAG ou 2,3-DAG; e (d) promover a migração de acila no 1,2-DAG ou 2,3-DAG da etapa (c) sob condições cineticamente controladas, desse modo produzindo um 1,3-DAG. O método pode da mesma forma compreender fornecer um éster de R1 e lipase específica de R1 e contatar o 1,3-DAG da etapa (d) com o éster de R1 e a lipase específica de R1 sob condições em que a lipase específica de R1 catalisa a esterificação da posição de Sn2, desse modo produzindo um lipídio estruturado. A lipase pode ser uma lipase específica de Sn1 ou Sn3. O lipídio estruturado pode compreender um alternativo de manteiga de cacau (CBA), uma manteiga de cacausintética, uma manteiga de cacau natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-diestearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoil- glicerol (POS) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM). Em um aspecto do método, a etapa (d) também compreende empregar resinas de permuta de íon. As condições cineticamente controladas podem compreender condições de não equilíbrio resultando na produção de um produto final tendo uma relação maior do que 2: 1 de 1,3-DAG para 2,3-DAG. A composição da etapa (b) pode compreender um ácido graxo fluorogênico (FA). A composição da etapa (b) pode compreender um éster de umbeliferila FA. O produto final pode ser enantiomericamente puro.
A invenção fornece um método para preparação de um isômero óptico de um ácido propiônico de um éster racêmico do ácido propiônico compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidrolase da invenção, em que a hidrolase é estereosseletiva para um isômero óptico do ácido propiônico; (b) fornecer ésteres racêmicos; (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com os ésteres racêmicos da etapa (b) em que o polipeptídeo pode seletivamente catalisar a hidrólise dos ésteres da etapa (b), desse modo produzindo o isômero óptico do ácido propiônico. O isômero óptico do ácido propiônico pode compreender um S(+) de ácido 2-(6-metóxi-2-naftil) propiô- nico e os ésteres racêmicos compreendem ésteres de (R,S) racêmicos de ácido 2-(6-metóxi-2-naftil) propiônico.
A invenção fornece um método para estereosseletivamente hi- drolisar misturas racêmicas de ésteres de ácidos 2-substituídos compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidrolase da invenção, em que a hidrolase é estereosseletiva; (b) fornecer uma composição compreendendo uma mistura racêmica de ésteres de ácidos 2-substituídos; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições em que o polipeptídeo da etapa (b) pode seletivamente hidrolisar os ésteres. A hidrolase pode ser imobilizada. O ácido 2-substituído pode compreender um ácido substituído por 2-arilóxi, um ácido R-2-(4-hidroxifenóxi)propiônico ou um ácido 2-arilpropiônico. O ácido 2-substituído pode compreender um cetoprofeno.
A invenção fornece um método para modificação de gordura ou óleo compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidrolase da invenção; (b) fornecer um óleo ou gordura e (c) contatar a hidrolase da etapa (a) com o óleo ou gordura da etapa (b) sob condições em que a hidrolase pode modificar o óleo ou gordura. A modificação pode compreender uma hidrólise catalise por hidrolase da gordura ou óleo. A hidrólise pode ser uma hidrólise completa ou uma parcial da gordura ou óleo. O óleo pode compreender um éster de glicerol de um óleo vegetal, animal ou peixe ou um ácido graxo poliinsaturado. O óleo vegetal pode compreender um óleo de farelo de arroz, óleo de soja ou láurico, palma, girassol, canola ou azeite de oliva.
A invenão fornece um método para hidrólise de ésteres de ácido graxo poliinsaturado (PUFA) compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidrolase da invenção; (b) fornecer a composição compreendendo um éster de ácido graxo poliinsaturado e (c) contatar a hidrolase com a composição da etapa (b) sob condições em que a hidrolase pode hidrolisar o éster de ácido graxo poliinsaturado (PUFA). A invenção fornece um método de hidrólise seletiva de ésteres de ácidos graxos poliinsaturados em ésteres de ácidos graxos saturados compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidrolase da invenção, em que a hidrolase tem uma atividade de lipase e seletivamente hidrolisa os ésteres de ácido graxo poliinsaturado (PUFA); (b) fornecer uma composição compreendendo uma mistura de ésteres saturados e poliinsaturados; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições em que o polipeptídeo pode seletivamente catalisar a hidrólise de ésteres de ácidos graxos poliinsatura- dos.
A invenção fornece um método para preparar um produto alimentício ou um aditivo de alimento compreendendo ácidos graxos poliinsatu- rados (PUFA) compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidro- lase da invenção, em que a hidrolase seletivamente hidrólise os ésteres de ácido graxo poliinsaturados (PUFA); (b) fornecer uma composição compreendendo um éster de PUFA; e (c) contatar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições em que o polipeptídeo pode seletivamente catalisar a hidrólise de ésteres de ácido graxo poliinsaturado desse modo produzindo o aditivo de alimento ou produto alimentício contendo PU- FA..
A invenção fornece um método para o tratamento de látex com-preendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma hidrolase da invenção, em que o polipeptídeo tem seletividade para um éster saturado sobre um éster insaturado, desse modo convertendo o éster saturado ao seu ácido correspondente e álcool; (b) fornecer uma composição de látex compreendendoésteres saturados e insaturados; (c) contatar a hidrolase da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições em que o polipeptídeo pode seletivamente hidrolisar ésteres saturados, desse modo tratando o látex. O propionato de etila pode ser hidrolizado seletivamente em acrilato de etila. A composição de látex da etapa (b) pode compreender polímeros contendo monômeros de ácido insaturado, vinila e acrílicos, monômeros de acrilato de alquila, acrilato de metila, acrilato de etila, acrilato de propila e acrilato e buti- la, ácidos de acrilato, ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido crotônico, ácido itacônico e misturas destes. A composição de látex pode ser um fixador de cabelo. As condições da etapa (c) pode compreender um pH na faixa de cerca de pH 4 ao pH 8 e uma temperatura na faixa de cerca de 20o a cerca 50o.
A invenção fornece um método para refinar um lubrificante com-preendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo uma hidrolase da invenção; (b) fornecer um lubrificante; e (c) tratar o lubrificante com a hidrolase sob condições em que a hidrolase pode seletivamente hidrolisar óleos no lubrificante, desse modo refinando-os. O lubrificante pode ser um óleo hidráulico.
A invenção fornece um método de tratar um tecido compreen- dendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo uma hidrolase da invenção, em que a hidrolase pode seletivamente hidroli- sar os ésteres carboxílicos; (b) fornecer um tecido; e (c) tratar um tecido com a hidrolase sob condição em que a hidrolase pode seletivamente hidrolisar ésteres carboxílicos desse modo tratando o tecido. O tratamento do tecido pode compreender melhoria do talhe e caimento do tecido final, tintura, obtendo atraso da chama, obtendo repelência de água, obtendo brilho óptico ou obtendo acabamento de resina. O tecido pode compreender algodão, viscose, raiom, lyocell, fibra do linho, linho, rami, todas as combinações destes ou combinações destes com poliésteres, lã, poliacrílicos ou acrílicos de poliamidas. A invenção fornece um tecido, fio ou fibra compreendendo uma hidrolase da invenção, que pode ser adsorvida, absorvida ou imobilizada sobre a superfície do tecido, fio ou fibra.
A invenção fornece um método para remover ou diminuir a quan-tidade de um corante de óleo ou alimentício compreendendo contatar uma hidrolase da invenção com o corante de óleo ou alimentício sob condições em que a hidrolase pode hidrolisar óleo ou gordura no corante. A hidrolase pode ter uma estabilidade realçada para desnaturação por tensoativos e para desativação de calor. A hidrolase pode ter uma solução de detergente ou uma de lavanderia.
A invenção fornece uma composição dietética compreendendo uma hidrolase da invenção. A composição dietética pode também compreender uma base nutricional compreendendo uma gordura. A hidrolase pode ser ativada por um sal de bílis. A composição dietética pode também compreender uma fórmula infantil com base em leite de vaca. A hidrolase pode hidrolisar ácidos graxos de cadeia longa. A invenção fornece um método de reduzir o teor de gordura contendo em composições dietéticas com base em vegetal ou leite compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo uma hidrolase da invenção; (b) fornecer uma composição compreendendo um óleo vegetal ou leite e (c) tratar a composição da etapa (b) com a hidrolase sob condições em que a hidrolase pode hidroli- sar o óleo ou gordura na composição, desse modo reduzindo seu teor de gordura. A invenção fornece uma composição dietética para animais não ruminantes ou humanos compreendendo uma base nutricional, em que a base compreende uma gordura e nenhuma ou pouca hidrolase e uma quantidade eficaz de uma hidrolase como mencionada na reivindicação 56 para aumentar a absorção de gordura e crescimento de animal humano ou não ruminante.
A invenção fornece um método de catalisar uma reação de inter- esterificação para produzir novos glicerídeos compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo uma hidrolase da invenção, em que a hidrolase pode catalisar uma reação de inter-esterificação; (b) fornecer uma mistura de triglicerídeos e ácidos graxos livres; (c) tratar a composição da etapa (b) com a hidrolase sob condições em que a hidrolase pode catalisar a permuta de ácidos graxos livres com os grupos de acila de triglicerídeos, desse modo produzindo novos triglicerídeos enriquecidos nos ácidos graxos adicionados. A hidrolase pode ser uma lipase Sn1,3- específica. A invenção fornece um método de trans-esterificação para preparar um óleo de margarina tendo um teor de ácido graxo de cadeia intermediária baixo e um trans- ácido baixo, compreendendo as seguintes etapas: (a) fornecer uma mistura de reação de trans-esterificação compreendendo um material de fonte de ácido esteárico selecionado do grupo consistindo em ácido esteárico, monoésteres de ácido esteárico de álcoois monoídricos de baixo peso molecular e misturas destes, (b) fornecer um óleo vegetal líquido; (c) fornecer uma hidrolase da invenção, em que o polipeptídeo compreende uma atividade de lipase 1,3-específica; (d) trans-esterificar o material de fonte de ácido esteárico e o triglicerídeo de óleo vegetal, para substancialmente equilibrar os grupos de éster nas posições 1, 3 do componente de glicerídeo com os componentes de ácido graxo de não glicerídeo da mistura de reação, (e) separar os componentes de ácido graxo livre trans-esterificados dos componentes de glicerídeo da mistura de trans-esterificação para fornecer um produto de óleo de margarina trans-esterificado e uma mistura de ácido graxo compreendendo ácidos graxos, monoésteres de ácido graxo ou mistu-ras destes liberados do óleo vegetal e (f) hidrogenar a mistura de ácido gra-
A invenção fornece um método para preparar uma composição compreendendo 1-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína (POSt) e 1,3-diestearoil- 2-monoleína (StOSt) compreendendo fornecer uma lipase como mencionada na reivindicação 56, em que a lipase é capaz de esterificação catalisada por lipase 1,3-específica de 1,3-dipalmitoil-2-monoleína (POP) com ácido esteárico ou triestearina, para preparar um produto enriquecido no 1-palmitoil-3- estearoil-2-monoleína (POSt) ou 1,3-diestearoil-2-monoleína (StOSt).
A invenção fornece um método para melhorar ou prevenir toxicidade mediada por lipopolissacarídeo (LPS) compreendendo administrar a um paciente uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece um método para destoxificar uma endotoxi- na compreendendo contatar a endotoxina com um polipeptídeo da invenção. A invenção fornece um método para desacilar uma cadeia de ácido graxo em 2’ ou 3’ de um lipídio A compreendendo contatar o lipídio A com um poli- peptídeo da invenção.
Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são mencionados nos desenhos acompanhantes e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão aparentes a partir da descrição e desenhos, e das reivindicações.
Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, seqüências de GenBank e depósitos de ATCC, aqui citados, são por meio deste expressamente incorporados por referência para todos os propósitos.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Os seguintes desenhos são ilustrativos de modalidades da invenção e não são pretendidos limitar o escopo da invenção como abrangido pelas reivindicações.
O arquivo de pedido ou patente contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta publicação de pedido de petente ou patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidos em solicitação e pagamento da remuneração necessária.
A figura 1 é um diagrama de bloco de um sistema de computa- dor.
A figura 2 é um diagrama de fluxo que ilustra um aspecto de um processo para comparar uma nova seqüência de proteína ou nucleotídeo com uma base de dados de seqüências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova seqüência e as seqüências no base de dados.
A figura 3 é um diagrama de fluxo que ilustra um aspecto de um processo em um computador para determinar se duas seqüências são homólogas.
A figura 4 é um diagrama de fluxo que ilustra um aspecto de um processo identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma seqüência.
A figura 5 ilustra um método exemplar da invenção para testar quanto a atividade de lipase, um ensaio de lipase colorimétrco, como descrito no Exemplo 1 abaixo.
A figura 6 ilustra um método exemplar da invenção empregando- se uma lipase específica de região Sn2 na síntese de lipídios estruturados.
A figura 7 ilustra um método exemplar da invenção, uma "Forced Migration Methodology" para a síntese estruturada de lipídios, como descrito em detalhes no Exemplo 2, abaixo.
A figura 8 ilustra um método exemplar compreendendo o uso de lipases da invenção para sintetizar alternativos de manteiga de cacau, como descrito em detalhe abaixo.
A figura 9A e figura 9B ilustram métodos exemplares da invenção compreendendo sintetizar sTAGs contendo PUFA (figura 9A, topo) e sMAGs de 2-PUFA e PUFAs purificados (figura 9B, base).
A figura 10 ilustra um método exemplar compreendendo um ensaio de enzima acoplado, como discutido em detalhe, abaixo.
A figura 11 ilustra um ensaio de crescimento-morte exemplar, como discutido no Exemplo 6, abaixo.
A figura 12 ilustra dados de várias reações de esterificação na síntese de 1,3-DCy, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 13 resume dados mostrando o efeito de relação de substrato sobre a esterificação entre glicerol e ácido caprílico, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 14 resume dados de várias sínteses de 1,3-dilaurina, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 15 resume o efeito de reação de substrato sobre a este- rificação de glicerol e ácido láurico em n-hexano, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 16 resume a síntese de 1,3-dipalmitina, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 17 resume dados para a esterificação de glicerol e ácido palmítico (C 16: O) ou esteárico (C18: O), como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 18 mostra dados de reação de alcoólise, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 19 ilustra dados da hidrólise de trilaurina, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 20 mostra o efeito de relação de trilaurina: água sobre hidrólise de trilaurina, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 21 resume dados mostrando o efeito de solventes orgânicos sobre a hidrólise de trilaurina, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 22 ilustra dados da alcoólise e hidrólise de óleo de coco em solvente orgânico, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 23 mostra o efeito de ácido oléico sobre migração de acila de 1,2-dipalmitina em n-hexano em temperatura ambiente, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 24 mostra o efeito da quantidade de permutador de ânion ou migração de acila de 1,2-dipalmitina em n-hexano, como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 25 mostra dados da esterificação de 1,3-dicaprilina e éster de vinila de ácido oléico em n-hexano por uma lipase imobilizada de um Pseudomonas sp. (Amano PS-D, Amano Enzyme USA, Elgin, IL), como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 26 mostra dados da esterificação de 1,3-DG e ácido oléico ou éster de vinila de ácido oléico em n-hexano por uma lipase imobilizada de um Pseudomonas sp. (Amano PS-D, Amano Enzyme USA, Elgin, IL), como discutido no Exemplo 7, abaixo.
A figura 27 ilustra uma reação de migração forçada exemplar da invenção, como discutido abaixo.
A figura 28 ilustra uma síntese exemplar de uma mistura de tri- glicerídeo composta de POS (Palmítico-Oléico-Esteárico), POR (Palmítico- Oléico-Palmítico), e SOS (Esteárico-Oléico-Esteárico) de glicerol, como discutido abaixo.
A figura 29 ilustra uma síntese exemplar onde o estearato e palmitato são misturados juntos para gerar misturas de DAGs que são sub- seqüentemente acilados com oleato para produzir componentes de equivalentes de manteiga de cacau, como discutido abaixo.
A figura 30 é um diagrama descrevendo características selecionadas de polipeptídeos e ácidos nucléicos exemplares da invenção, como descrito em mais detalhes, abaixo.
A figura 31 esquematicamente ilustra dados de um sistema de duas enzimas da invenção, como descrito no Exemplo 10, abaixo.
Símbolos de referência similares nos vários desenhos indicam elementos similares.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Em um aspecto, a invenção fornece hidrolases, polinucleotídeos codificando-as e métodos de preparar e empregar estes polinucleotídeos e polipeptídeos. Em uma modalidade, a invenção é direcionada a polipeptí- deos, por exemplo, enzimas, tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, incluindo atividade de hidrolase termoestável e termotolerante e polinucleotídeos codificando estas enzimas e preparando e empregando estes polinucleotídeos e polipeptídeos. As atividades de hidrolase dos polipeptídeos e peptídeos da invenção incluem atividade de esterase, atividade de lipase (hidrólise de lipídios), reações de acidólise (para substituir um ácido graxo esterificado com ácido graxo livre), reações de transesterificação (permuta de ácidos graxos entre triglicerídeos), síntese de éster, reações de intermudança de éster, atividade de fofolipase (por exemplo, atividade de fofolipase A, B, C e D, atividade de patatina, atividade de lipídio acila hidrolase (LAH) e atividade de protease (hidrólise de ligações de peptídeo). Os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em uma variedade de contextos farmacêuticos, agrícolas e industriais, incluindo a fabricação de cosméticos e nutracêuticos. Em outro aspecto, os polipeptídeos da invenção são empregados para sintetizar os produtos quirais enantiomericamente puros. Os polipeptídeos da invenção podem ser empregados em uma variedade de contextos farmacêuticos,agrícolas e industriais, incluindo a fabricação de cosméticos e nutracêu- ticos.
Enzimas da invenção podem ser catalisadores altamente seletivos. Elas podem ter a capacidade de catalisar reações com estero-, regio- e quimio seletividades não possíveis na química sintética convencional. Enzimas da invenção podem ser versáteis. Em vários aspectos, elas podem funcionar em solventes orgânicos, operar em pHs extremos (por exemplo, pHs altos e pHs baixos), temperaturas extremas (por exemplo, temperaturas altas e temperaturas baixas), níveis de salinidade extremos (por exemplo, alta salinidade e baixa salinidade), e catalisar reações com compostos que são estruturalmente não relacionados ao seus substratos fisiológicos naturais.
Hidrolase da invenção tendo atividade de lipase
Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção têm atividade de lipase e podem ser empregados como lipases, por exemplo, na síntese bio- catalítica de lipídios estruturados (lipídios que contêm um grupo definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida na cadeia principal de glicerol), incluindo alternativos de manteiga de cacau, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs), 1,3-diacil glicerídeos (DAGs). 2-monoglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs), tal como 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilgli- cerol (POS) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM), ácidos graxos poliinsa- turados de cadeia longa tal como ácido araquidônico, ácido docosaexaenói- co (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA).
Em um aspecto, a invenção fornece uma síntese exemplar (em-pregando lipases da invenção) de uma mistura de triglicerídeo composta de POS (Palmítico-Oléico-Esteárico), POP (Palmítico-Oléico- Palmítico) e SOS (Esteárico-Oléico-Esteárico) de glicerol, como ilustrado na figura 28. Esta síntese exemplar usa ácidos graxos livres versus ésteres de ácido graxo. Em um aspecto, esta reação pode ser realizada em um pote com adição se- qüencial de ácidos graxos empregando glicerol cru e ácidos graxos livres e ésteres de ácido graxo. Em um aspecto, estearato e palmitato são misturados juntos para gerar misturas de DAGs. Em um aspecto, os diacilglicerí- deos são subsequencialmente acilados com oleato para produzir componentes de equivalentes de manteiga de cacau, como ilustrado na figura 29. Em aspectos alternativos, as proporções de POS, POP e SOS podem ser variadas de acordo com: relação de estearato para palmitato; seletividade de enzima para palmitato versus estearato; ou enantiosseletividade de enzima (poderia alterar níveis de POS/SOS). Síntese de um pote de equivalentes de manteiga de cacau ou outros alternativos de manteiga de cacau é possível empregar este aspecto da invenção.
Em um aspecto, lipases que exibem regiosseletividade e/ou qui- miosseletividade são empregadas na síntese de estrutura de lipídios ou no processamento de lipídios. Desse modo, os métodos da invenção usa lipase com regio-especificidade definida ou quimiosseletividade definida (por exemplo, uma especificidade de ácido graxo) em uma reação sintética bioca- talítica. Por exemplo, os métodos da invenção podem empregar lipases com regio-especificidade de SN1, SN2 e/ou SN3, ou combinações destes. Em um aspecto, os métodos da invenção emprega lipases que exibem regiosseleti- vidade para a posição 2 de um triacilglicerídeo (TAG). Esta regiosseletivida- de de SN2 pode ser empregada na síntese de uma variedade de lipídios estruturados, por exemplo, triacilglicerídeos (TAGs), incluindo 1,3-DAGs e componentes de manteiga de cacau, como ilustrado na figura 6.
Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados na síntese biocatalítica de lipídios de estrutura, e a produção de nutracêuticos (por exemplo, ácidos graxos poliinsaturados e óleos), vários produtos alimentícios e aditivos de produtos alimentícios (por exemplo, emulsificadores, repositores de gordura, margarinas e pastas), cosméticos (por exemplo, emulsificadores, cremes), farmacêuticos e agentes de libera- 5 ção de droga (por exemplo, lipossomas, comprimidos, formulações), e aditivos de alimento animal (por exemplo, ácidos graxos poliinsaturados, tal como ácidos linoléicos) compreendendo lipídios feitos pelos métodos de síntese estruturada da invenção ou processados pelos métodos da invenção.
Em um aspecto, lipases da invenção podem agir sobre ésteres de ácido graxo fluorogênico (FA), por exemplo, ésteres de umbeliberila FA. Em um aspecto, perfis de especificidades de FA de lipases feitos ou modificados pelos métodos da invenção podem ser obtidos avaliando-se suas atividades relativas em uma série de ésteres de umbeliferila FA, tal como pal- mitato, estearato, oleato, laurato, PUFA, butirato. A seguinte tabela 1 indica a atividade para algumas lipases exemplares da invenção. A atividade foi testada em butirato e oleato. Tabela 1: Atividade para lipases exemplares com ésteres de umberiferila FA
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Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para enantiomericamente sintetizar produtos quirais puros. Em um aspecto, os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para preparar um D-amino ácido e ésteres correspondentes de uma mistura racêmica. Por exemplo, ácido D-aspártico pode ser preparado de ácido aspártico racêmico. Em um aspecto, D-homofenilalamina opcional-mente ativa e/ou seu ésteres são preparados. A D-homofenilalamina enanti- osseletivamente sintetizada pode ser materiais de partida para muitas dro-gas, tal como Enalapril, Lisinopril e Quinapril, empregados no tratamento de hipertensão e insuficiência cardíaca congestiva. O ácido D-aspártico e seus derivados feitos pelos métodos e composições da invenção podem ser em-pregados em farmacêuticos, por exemplo, para a inibição de arginiossucina- to sintetase para prevenir ou tratar sepse ou hipotensão sistêmica induzida por citocina ou como agentes imunossupressivos. O ácido D-aspártico e seus derivados feitos pelos métodos e composições da invenção podem ser empregados como composições de modificação de sabor para produtos ali-mentícios, por exemplo, como adoçantes (por exemplo, ALITAMETM). Por exemplo, os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser em-pregados para sintetizar um isômero ótico S(+) de ácido 2-(6-metóxi-2-naftil) propiônico de um éster (R,S) racêmico de ácido 2-(6-metóxi-2-naftil) propiô- nico (observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.229.280).
Em um aspecto, os métodos e composições (lipases) da inven-ção podem ser empregados para estereosseletivamente hidrolisar misturas racêmicas de ésteres de ácidos 2-substituídos, por exemplo, ácidos substitu-ídos por 2-arilóxi, tal como ácido R-2-(4-hidroxifenóxi)propiônico, ácido 2- arilpropiônico, cetoprofeno para enantiomericamente sintetizar produtos qui- rais puros. Observe, Patente dos Estados Unidos N° 5.108.916.
Em um aspecto, a lipase da invenção para estas reações é imo- bilizada, por exemplo, como descrito abaixo. Em aspectos alternativos, os métodos da invenção não requerem um solvente orgânico, podem ser prosseguidos com taxas de reação relativamente rápidas; e não requerem um grupo protetor para o aminoácido. Observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos nos 5.552.317 e 5.834.259.
Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para hidrolisar óleos, tal como óleos vegetais, animais e de pei-xe, e lipídios, tal como ácidos graxos poli-insaturados. Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção são empregados para preparar ácidos graxos (tal como ácidos graxos poli-insaturados), por exemplo, ácidos graxos de óleo de peixe, para uso em ou como um aditivo de alimento. A adição de ácidos graxos poli-insaturados PUFAs ao alimento para gado de leiteria demonstrou resultar em rendimentos de leite e fertilidades melhorados. O óleo de peixe contém um alto nível de PUFAs (observe a Tabela 2, abaixo) e portanto é uma fonte potencialmente econômica para PUFAs como um material de par-tida para os métodos da invenção. Os métodos biocatalíticos da invenção podem preparar óleo de peixe sob condições amenas, desta maneira evitan-docondições severas utilizadas em algum processo. As condições severas pode promover isomerização, polimerização e oxidação indesejáveis dos PUFAs. Em um aspecto, os métodos da invenção compreendem hidrólise total catalisada por lipase de óleo de peixe ou hidrólise seletiva de PUFAs de óleo de peixe para promover uma suave alternativa que deixaria os PUFAs de valor elevado intactos. Em um aspecto, os métodos também compreen-demhidrólise de lipídios por divisão química ou física da gordura. Tabela 2: Composição de ácido graxo de uma variedade de gorduras e óleos Teor de ácido graxo de gorduras (%):
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Em um aspecto, as lipases e métodos da invenção são empre-gados para a hidrólise total de óleo de peixe. As lipases podem ser avaliadas quanto capacidade de catalisar a hidrólise total de óleo de peixe sob condi-ções diferentes empregando-se, por exemplo, a método compreendendo um ensaio de enzima acoplada, como ilustrado na figura 10, para detectar a libe-ração de glicerol de lipídios. Este ensaio foi validado na presença de emul-sões de lipídio e foi retém sensibilidade sob estas condições. Em aspectos alternativos, uma única ou múltiplas lipases são empregadas para catalisar a divisão total do óleo de peixe. Várias lipases da invenção podem precisar ser empregadas, devido à presença dos PUFAs. Em um aspecto, uma lipase específica de PUFA da invenção é combinada com uma lipase geral para alcançar o efeito desejado.
Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para catalisar a hidrólise parcial ou total de outros óleos, por exemplo azeite de oliva, que não contém PUFAs.
Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para catalisar a hidrólise de ésteres de glicerol de PUFA. Estes métodos podem ser empregados para preparar aditivos de alimento. Em um aspecto, lipases da invenção catalisam a liberação de PUFAs de ésteres simples e óleo de peixe. Os ensaios padrões e métodos analíticos podem ser utilizados.
Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para seletivamente hidrolisar ésteres saturados em ésteres in- saturados em ácidos ou álcoois. Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para tratar látexes para uma variedade de propósitos, por exemplo, para tratar látexes empregados em composições fixadoras de cabelo para remover odores desagradáveis. Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados no tratamento de uma deficiência de lipase em um animal, por exemplo, um mamífero, tal co-mo um humano. Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados para preparar lubrificantes, tais como óleos hidráulicos. Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregados na preparação e uso de detergentes. Os métodos e composições (lipases) da invenção podem ser empregado em processos para o acabamento químico de tecidos, fibras ou fios. Em um aspecto, os métodos e composições (lipa-ses) da invenção podem ser empregados por obter retardo de chama um tecido empregando-se, por exemplo, um ácido carboxílico substituído por halogênio ou um éster deste, isto é, um ácido carboxílico fluorado, clorado ou bromado ou um éster deste. Em um aspecto, a invenção fornece métodos de gerar lipases de bibliotecas ambientais.
Hidrolases da invenção tendo atividade de acilase ou esterase
Em um aspecto, a atividade de hidrolase da invenção compre-ende uma atividade de acilase ou uma de esterase. Em um aspecto, a ativi-dade de hidrólise compreende hidrolisar um anel de lactona ou acilar uma lactona de acila ou uma lactona de diol. Em um aspecto, a atividade de hi-drólisecompreende uma atividade de esterase. Em um aspecto, a atividade de esterase compreende hidrólise de grupos de éster em álcoois e ácidos orgânicos. Em um aspecto, a atividade de esterase compreende atividade de esterase de feruloíla. Em um aspecto, a atividade de esterase compreende uma atividade de lipase. Em aspectos alternativos, as atividades de esterase das enzimas da invenção incluem atividade de lipase (na hidrólise de lipí- dios), reações de acidólise (para substituir um ácido graxo de esterificado com um ácido graxo livre), reações de transesterificação (permuta de ácidos graxo entre triglicerídeos), reações de intercâmbio de éster e síntese de éster. As enzimas da invenção podem da mesma forma ser utilizadas em reações de síntese orgânicas na fabricação de medicamentos, pesticidas ou intermediários destes.
Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção têm atividade de acilase ou esterase e podem ser empregados, por exemplo, para hidrolisar um anel de lactona ou acilar uma lactona de acila ou uma lactona de diol. Em um aspecto, a atividade de hidrólise de um polipeptídeo da invenção compreende uma atividade de esterase. Em um aspecto, a atividade de es-terase compreende hidrólise de grupos de éster em álcoóis e ácidos orgâni-cos. Em um aspecto, a atividade de esterase compreende atividade de este-rase de feruloíla. Em um aspecto, a atividade de esterase compreende uma atividade de lipase. Em aspectos alternativos, as atividades de esterase das enzimas da invenção incluem atividade de lipase (na hidrólise de lipídios), reações de acidólise (para substituir um ácido graxo esterificado com um ácido graxo livre), reações de transesterificação (permuta de ácidos graxo entre triglicerídeos), reações de intercâmbio de éster e síntese de éster. As enzimas da invenção podem da mesma forma ser utilizadas em reações de síntese orgânicas na fabricação de medicamentos, pesticidas ou intermediá-rios destes. As atividades de esterase dos polipeptídeos e peptídeos da in-venção incluem atividade de lipase (na hidrólise de lipídios), reações de aci- dólise (para substituir um ácido graxo esterificado com um ácido graxo livre), reações de transesterificação (permuta de ácidos graxos entre triglicerí- deos), reações de intercâmbio de éster e síntese de éster. Os polipeptídeos e peptídeos da invenção podem da mesma forma ser utilizados em reações de síntese orgânicas na fabricação de medicamentos, praguicidas ou inter-mediários destes.
Hidrolases da invenção tendo atividade de protease
Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos tendo uma atividade de protease, polinucleotídeos codificando os polipeptídeos, e mé- todos para preparar e empregar estes polinucleotídeo e polipeptídeos. Em um aspecto, as proteases da invenção são empregadas para catalisar a hi-drólisede ligações de peptídeo. As proteases da invenção podem ser em-pregadas para fazer e/ou preparar produtos alimentícios e alimentos, tecidos, detergentes e similares. As proteases da invenção podem ser empregadas em composições farmacêuticas e auxiliares dietéticos.
As preparações de protease da invenção (incluindo aquelas para tratar ou preparar produtos alimentícios e alimentos, tratar fibras e tecidos, tratamentos residuais, tratamentos de planta, e similares) podem compreender uma ou mais enzimas, por exemplo, pectato liases, celulases (endo- beta-1,4-glicanases), beta-glicanases (endo-beta-1,3(4)-glicanases), lipases, cutinases, peroxidases, lacases, amilases, glicoamilases, pectinases, reductases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, arabinanases, hemi- celulases, mananases, xiloglucanases, xilanases, pectina acetil esterases, ramnogalacturonan acetil esterases, poligalacturonases, ramnogalacturona- ses, galactanases, pectina liases, pectina metilesterases, celobioidrolases, transglutaminases; ou misturas destes.
Um polipeptídeo pode ser analisado habitualmente quanto a ati-vidade de protease (por exemplo, testado para ver se a proteína inclui-se no escopo da invenção) por qualquer método, por exemplo, a atividade de pro-tease pode ser analisada pela hidrólise de caseína em zimogramas, a libera-ção de fluorescência de gelatina, ou a liberação de p-nitroanalida de vários substratos de peptídeo pequenos (estes e outros ensaios de protease exemplares são mencionados nos Exemplos, abaixo).
Hidrolases da invenção tendo atividade de fosfolipase
Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos tendo uma atividade de fosfolipase. As fosfolipases da invenção podem ter fosfolipase A, B, C, D, um lipídio acil hidrolase (LAH), ou atividade de enzima de patati- na. As fosfolipases da invenção podem eficientemente clivar a ligação de éster de glicerolfosfato em óleos, tal como óleos vegetais, por exemplo, fos- folipídeos de semente oleaginosa, para gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo. Em aspectos alternativos, as fosfolipases da in- venção podem clivar as ligações de éster de glicerolfosfato em fosfatidilcoli- na, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e esfingomielina.
Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são empregadas em várias etapas de processamento de óleo vegetal, tal como em extração de óleo vegetal, particularmente, na remoção de "gomas de fosfolipídeo"em um processo chamado "desengomadura de óleo", como descrito aqui. A produção de óleos vegetais de várias fontes, tais como farelo de arroz, soja, semente de colza, amendoim, gergelim, girassol e milho. As enzimas de fos- folipase da invenção podem ser empregadas no lugar de PLA, por exemplo, fosfolipase A2, em qualquer etapa de processamento de óleo vegetal. Uma fosfolipase da invenção (por exemplo, fosfolipase A, B, C, D, enzimas de patatina) pode ser empregada para desengomadura enzimática de óleos vegetais porque a porção de fosfato é solúvel em água e fácil de remover. O produto de diglicerídeo permanecerá no óleo e portanto reduzirá as perdas. Os PLCs da invenção podem ser empregados além de ou no lugar de PLA1s e PLA2s na desengomadura de óleo comercial, tal como no processo ENZYMAX® onde os fosfolipídeos são hidrolisados por PLA1 e PLA2.
Em aspectos alternativos, as enzimas da invenção têm atividade de fosfolipase C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC), atividade de fosfoli- pase C específica de fosfatidilcolina, atividade de ácido fosfatídico fosfatase, atividade de fosfolipase A e/ou atividade de fosfolipase relacionada a patati- na. Estas enzimas podem ser empregadas sozinhas ou em combinação umas com as outras ou com outras enzimas da invenção, ou outras enzi-mas. Em um aspecto, a invenção fornece métodos em que estas enzimas (incluindo fosfolipase C específica de fosfatidilinositol, fosfolipase C específica de fosfatidilcolina, ácido fosfatídico fosfatase, fosfolipase A e/ou fosfolipa- ses relacionadas com patatina da invenção) são empergadas sozinhas ou em combinação na desengomadura de óleos, por exemplo, óleo de farelo de arroz, óleos vegetais, por exemplo, óleos com alto teor de fósforo, tais como óleos de soja, milho, canola e girassol.
Estas enzimas e processos da invenção podem ser empregados para obter uma desengomadura mais completa de óleos com alto teor de fósforo, em particular, óleos de farelo de arroz, soja, milho, canola e girassol. Na clivagem por PI-PLC, fosfatidilinositol é convertido em diacilglicerol e fos- foinositol. As divisões de diacilglicerol para a fase aquosa (melhoria no ren-dimento de óleo) e as divisões de fosfoinositol para a fase aquosa onde são removidas como um componente da fase pesada durante a centrifugação. Uma enzima da invenção, por exemplo, uma PI-PLC da invenção, pode ser incorporada em um processo de refinamento de óleo físico ou químico.
Em um aspecto, hidrolases, por exemplo, PLC fosfolipases, da invenção utilizam uma variedade de substratos de fosfolipídio incluindo fos- fatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, e ácido fosfatídico. Além disso, estas enzimas podem ter graus variantes de ativida-de nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídios. Em vários aspectos, enzimas PLC da invenção podem mostrar uma preferência para fosfatidilco- lina e fosfatidiletanolamina como substratos.
Em um aspecto, hidrolases, por exemplo, fosfatidilinositol PLC fosfolipases, da invenção utilizam uma variedade de substratos de fosfolipí- dio incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidili- nositol, e ácido fosfatídico. Além disso, estas enzimas podem ter graus variados de atividade nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídeos. Em vários aspectos, enzimas fosfatidilinositol PLC da invenção podem mostrar uma preferência para fosfatidilinositol como um substrato.
Em um aspecto, hidrolases, por exemplo, enzimas de patatina, da invenção utilizam uma variedade de substratos de fosfolipídio incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e ácido fosfatídico. Além disso, estas enzimas podem ter graus variados de atividade nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídios. Em vários aspectos, pata- tinas da invenção são com base em uma conservação de similaridade de seqüência de aminoácido. Em vários aspectos, estas enzimas exibem um grupo diverso de propriedades bioquímicas e podem realizar características de reações das classes de enzima PLA1, PLA2, PLC, ou PLD.
Em um aspecto, hidrolases, por exemplo, PLD fosfolipases, da invenção utilizam uma variedade de substratos de fosfolipídio incluindo fos- fatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e ácido fosfatídico. Além disso, estas enzimas podem ter graus variados de atividade nas formas de lisofosfolipídio destes fosfolipídios. Em um aspecto, estas en-zimassão úteis para realizar as reações de trans-esterificação para produzir fosfolipídios estruturados.
Definições
Como empregado aqui, o termo "hidrolase" abrange polipeptí- deos (por exemplo, anticorpos, enzimas) e peptídeos (por exemplo, "sítios ativos") tendo qualquer atividade de hidrolase, isto é, os polipeptídeos da invenção podem ter qualquer atividade de hidrolase, incluindo atividade de lipase, esterase, fosfolipase e/ou protease.
O termo "lipase" inclui todos os polipeptídeos tendo qualquer atividade de lipase, incluindo a síntese de lipídeo ou atividade de hidrólise de lipídeo, isto é, os polipeptídeos da invenção podem ter qualquer atividade de lipase. As lipases da invenção incluem enzimas ativas na bioconversão de lipídeos através da catálise de reações de hidrólise, alcoólise, acidólise, es- terificação e aminólise. Em um aspecto, as lipases da invenção podem hidro- lisar as emulsões de lipídeo. Em um aspecto, as enzimas da invenção podem agir preferencialmente em ligações de sn-1 e/ou sn-3 de triglicerídeos para liberar os ácidos graxos da cadeia principal de glicerol. Por exemplo, a atividade de lipase dos polipeptídeos da invenção incluem síntese de man-teiga de cacau, ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs), glicerídeos de 1,3- diacila (DAGs), 2-monoglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs). O termo da mesma forma inclui lipases capazes de isomerisar ligações em al-tas temperaturas, baixas temperaturas, pHs alcalinos e em pHs acídicos.
O termo "fosfolipase" abrange enzimas tendo qualquer atividade de fosfolipase, isto é, os polipeptídeos da invenção podem ter qualquer ativi-dade de fosfolipase. Por exemplo, uma atividade de fosfolipase da invenção pode compreender clivar uma ligação de éster de glicerolfosfato (hidrólise de catalisação de uma ligação de éster de glicerolfosfato), por exemplo, em um óleo, tal como um óleo vegetal. Uma atividade de fosfolipase da invenção pode gerar uma base fosforilada extraível de água e um diglicerídeo. Uma atividade de fosfolipase da invenção da mesma forma inclui hidrólise de ligações de éster de glicerolfosfato em altas temperaturas, baixas temperaturas e em pHs acídicos. O termo, "atividade de fosfolipase" da mesma forma inclui clivar um éster de glicerolfosfato para gerar uma base fosforilada extraí- vel e um diglicerídeo. O termo "uma atividade de fosfolipase" da mesma forma inclui cortar ligações de éster de glicerina e ácido fosfórico em fosfolipí- deos. O termo "uma atividade de fosfolipase" da mesma forma inclui outras atividades, tal como a capacidade de ligar a um substrato, tal como um óleo, por exemplo, um óleo vegetal, substrato da mesma forma incluindo fosfatidil- colinas de animal e planta, fosfatidil-etanolaminas, fosfatidilserinas e esfin- gomielinas. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de fosfolipase C (PLC), uma atividade de fosfolipase A (PLA), tal como uma atividade de fosfolipase A1 ou fosfolipase A2, uma atividade de fosfolipase B (PLB), tal como uma atividade de fosfolipase B1 ou fosfolipase B2, uma atividade de fosfolipase D (PLD), tal como uma atividade de fosfolipase D1 ou uma de fosfolipase D2. A atividade de fosfolipase pode compreender hidrólise de uma glicoproteína, por exemplo, como uma glicoproteína encontrada em um tubérculo de batata ou qualquer planta do gênero Solanum, por exemplo, Solanum tuberosum. A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade enzimática de patatina, tal como uma atividade de patatina esterase (observe, por exemplo, Jimenez (2002) Biotechnol. Prog. 18: 635-640). A atividade de fosfolipase pode compreender uma atividade de lipídio acil hidrolase (LAH).
O termo "protease" inclui todos os polipeptídeos tendo uma ativi-dade de protease, incluindo uma atividade de peptidase e/ou proteinase; isto é, os polipeptídeos da invenção podem ter qualquer atividade de protease. A atividade de protease da invenção pode compreender catálise da hidrólise de ligações de peptídeo. As proteases da invenção pode catalisar reações de hidrólise de peptídeo em ambas as direções. A direção da reação pode ser determinada, por exemplo, manipulando-se as concentrações de produto e/ou substrato, temperatura, seleção de protease e similares. A atividade de protease pode compreender uma atividade de endoprotease e/ou uma ativi- dade de exoprotease. A atividade de protease pode compreender uma ativi-dade de protease, por exemplo, uma atividade de carboxipeptidase, uma dipeptidilpeptidase ou uma atividade de aminopeptídase, uma atividade de serina protease, uma atividade de metaloproteinase, uma atividade de ciste- ína protease e/ou uma atividade de aspártico protease. Em um aspecto, a atividade de protease pode compreender a mesma atividade ou similar a uma quimotripsina, uma tripsina, uma elastase, uma calicreína e/ou uma ati-vidade de subtilisina.
O termo esterase inclui todos os polipeptídeos tendo uma ativi-dade de esterase, isto é, os polipeptídeos da invenção pode ter qualquer atividade de esterase. Por exemplo, a invenção fornece polipeptídeos capa-zes de hidrolisar grupos de éster em ácidos orgânicos e álcoois. O termo "esterase" da mesma forma abrange polipeptídeos tendo atividade de lipase (na hidrólise de lipídeos), reações de acidólise (para substituir um ácido gra- xo esterificado com um ácido graxo livre), reações de trans-esterificação (permuta de ácidos graxos entre triglicerídeos), síntese de éster e reações de intercambio de éster. Em um aspecto, as hidrolases da invenção podem hidrolisar um anel de lactona ou acilato uma lactona de acila ou um alactona de diol. Os polipeptídeos da invenção podem ser enantioespecíficoss, por exemplo, como quando empregado em reações quimioenzimáticas na sínte-se de medicamentos e inseticidas. Os polinucleotídeos da invenção codifi-cam os polipeptídeos tendo atividade de esterase.
Uma variante de hidrolase (por exemplo, "variante de lipase", "variante de esterase", "variante de protease""variante de fosfolipase") pode ter uma seqüência de aminoácido que é derivada da seqüência de aminoá- cido de um "precursor". O precursor pode incluir hidrolase recombinante e/ou hidrolase de ocorrência natural. A seqüência de aminoácido da variante de hidrolase é "derivada" da seqüência de aminoácido de hidrolase precursora pela substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos da se- qüência de aminoácido precursora. Tal modificação é da "seqüência de DNA precursora" que codifica a seqüência de aminoácido da lipase precursora em lugar da manipulação da enzima de hidrolase precursora por si própria. Mé- todos adequados para tal manipulação da seqüência de DNA precursora incluem métodos aqui descritos, bem como métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.
O termo "anticorpo" inclui um peptídeo ou polipeptídeo derivado de, modelado após ou substancialmente codificado por um gene de imuno- globulina ou genes de imunoglobulina, ou fragmentos destes, capazes de especificamente ligar um antígeno ou epítopo, veja, por exemplo Fundamen-tal Immunology, Terceira Edição, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267-273; Yarmush (1992) J. Bio- chem. Biophys. Methods 25: 85-97. O termo anticorpo inclui porções de liga-ção de antígeno, isto é, "sítios de ligação de antígeno"(por exemplo, frag-mentos,subseqüências, regiões complementarmente determinantes (CDRs)) que retém a capacidade de ligar antígeno, incluindo (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward e outros, (1989) Nature 341: 544-546) que con-siste em um domínio VH; e (vi) região complementarmente determinante isolada (CDR). Os anticorpos de cadeia simples são da mesma forma incluí-dos por referência no termo "anticorpo". Desse modo, a invenção fornece anticorpos, incluindo sítios de ligação de antígeno e anticorpos de cadeia simples que especificamente ligam a uma hidrolase da invenção. Na prática dos métodos da invenção, polipeptídeos tendo uma atividade de hidrolase podem da mesma forma ser empregados.
Os termos "disposição"ou "microdisposição"ou "biochip" ou "chip" quando aqui empregados, é uma pluralidade de elementos alvos, ca-da elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de um ou mais polipeptídeos (incluindo anticorpos) ou ácidos nucléico imobilizados em uma área definida de uma superfície de substrato, como discutido em mais detalhes, abaixo.
Quando aqui empregado, os termos "computador", "programa de computador" e "processador"são empregados em seus contextos gerais mais amplos e incorporam todos os tais dispositivos, como descrito em detalhes, abaixo.
Uma "seqüência de codificação de" ou uma "seqüência codifica" uma proteína ou polipeptídeo particular, é uma seqüência de ácido nucléico que é transcrita e transladada em um polipeptídeo ou proteína quando colocada sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas.
O termo "cassete de expressão", quando aqui empregado, refe-re-se a uma seqüência de nucleotídeo que é capaz de afetar a expressão de um gene estrutural (isto é, uma seqüência de codificação de proteína, tal como uma hidrolase da invenção) em um hospedeiro compatível com tais seqüências. Os cassetes de expressão incluem pelo menos um promotor operavelmente ligado com a seqüência de codificação de polipeptídeo; e, opcionalmente, com outras seqüências, por exemplo, sinais de terminação de transcrição. Fatores adicionais necessário ou úteis na realização da ex-pressão, podem da mesma forma ser empregados, por exemplo, realçado- res. "Operavelmente ligado" como empregado aqui refere-se a ligação de um promotor a montante de uma seqüência de DNA tal que o promotor media a transcrição da seqüência de DNA. Desta maneira, os cassetes de expressão da mesma forma incluem plasmídeos, vetores de expressão, vírus recombinantes, qualquer forma de vetor de "DNA nu", e similares. Um "vetor" compreende um ácido nucléico que pode infetar, transfectar, transitoria-mente ou permanentemente transduzir uma célula. Será reconhecido que um vetor pode ser um ácido nucléico nu ou um ácido nucléico complexado com proteína ou lipídio. O vetor opcionalmente compreende membranas e/ou proteínas e/ou ácidos nucléicos virais ou bacterianos (por exemplo, uma membrana de célula, um invólucro de lipídio viral, etc.). Os Vetores in-cluem,porém não são limitados a, réplicons (por exemplo, réplicons de RNA, bacteriófagos) aos quais fragmentos de DNA podem ser ligados e virem a ser reproduzidos. Os vetores desse modo incluem, porém não são limitados ao RNA, RNA ou DNA linear ou circular de auto-replicação autônomo (por exemplo, plasmídeos, vírus, e similares, veja, por exemplo, Patente dos Es-tados Unidos N° 5.217.879), e inclui igualmente os plasmídeos de não ex-pressão e expressão. Onde um microorganismo recombinante ou cultura de célula é descrito como hospedando um "vetor de expressão", este inclui igualmente DNA e DNA linear e circular extra-cromossômico que foram in-corporados no(s) cromossoma(s) hospedeiro(s). Onde um vetor está sendo mantido por uma célula hospedeira, o vetor ou pode ser estavelmente repli-cado pelas células durante a mitose como uma estrutura autônoma, ou ser incorporado dentro do genoma hospedeiro.
O termo "gene" pode incluir uma seqüência de ácido nucléico compreendendo um segmento de DNA envolvido na produção de um produ-to de transcrição (por exemplo, uma mensagem), que sucessivamente é transladado para produzir uma cadeia de polipeptídeo, ou regular a transcri-ção, reprodução ou estabilidade de gene. Os genes podem incluir, inter alia, regiões precedendo e seguindo a região de codificação, tais como condutor e trailer, promotores e realçadores, bem como, onde aplicáveis, seqüências de intervenção (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (exons).
As frases "ácido nucléico"ou "seqüência de ácido nucléico" po-dem incluir um oligonucleotídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo, ou em um fra-gmento de quaisquer destes, em DNA ou RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, RNAi) de origem genômica ou sintética que pode ser de filamento simples ou de filamento duplo e pode representar um filamento de sentido ou anti-sentido, em ácido nucléico de peptídeo (PNA), ou em qualquer material tipo DNA ou tipo RNA, natural ou sintético em origem, incluindo, por exemplo, RNAi (RNA "interferente" de filamento duplo), ribonucleoproteínas (por exemplo, iRNPs). O termo abrange ácidos nucléicos, isto é, oligonucleotí- deos, contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais. O termo da mesma forma abrange estruturas tipo ácido nucléico com cadeias principais sintéticas, veja por exemplo; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drog Dev 6: 153-156.
Quando aqui empregado, o termo "promotor" inclui todas as se- qüências capazes de direcionar a transcrição de uma seqüência de codificação em uma célula, por exemplo, uma célula de planta. Desta maneira, os promotores empregados nas construções da invenção incluem elementos de controle transcricionais cis-atuante e seqüências reguladoras que são envolvidas na regulagem ou modulagem da cronometragem e/ou taxa de transcrição de um gene. Por exemplo, um promotor pode ser um elemento de controle transcricional cis-atuante, incluindo um realçador, um promotor, um terminator de transcrição, uma origem de replicação, uma seqüência de in-tegração cromossômica, regiões não transladadas 5’ e 3’ ou uma seqüência intrônica, que são envolvidas em regulamento transcricional. Estas seqüên- cias cis-atuantes tipicamente interagem com proteínas ou outras biomolécu- las para realizar (ligar/desligar, regular, modular, etc.) a transcrição. Promo-tores"constitutivos"são aqueles que direcionam a expressão continuamente sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação de célula. Os promotores "induzíveis"ou "reguláveis" direcionam a expressão do ácido nucléico da invenção sob a influência de condições ambientais ou condições desenvolventes. Os exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluemcondições anaeróbias, temperatura elevada, de seca, ou a presença de luz.
Os promotores "específicos de tecido são elementos de controle transcricionais que são apenas ativos em células ou tecidos ou órgãos parti-culares, por exemplo, em plantas ou animais. O regulamento específico de tecido pode ser obtido por certos fatores intrínsecos que asseguram que os genes codificando proteínas específicas em um determinado tecido são ex-pressos. Tais fatores são conhecidos por existirem em mamíferos e plantas a fim de permitir os tecidos específicos desenvolverem-se.
O termo "planta" inclui plantas inteiras, partes de planta (por exemplo, folhas, talos, flores, raízes, etc.), protoplastos de planta, sementes e células de planta e descendências das mesmas. A classe de plantas que podem ser empregadas no método da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores tratáveis por técnicas de transforma- ção, incluindo angioespermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), bem como gimnoespermas. Inclui plantas de uma variedade de níveis de ploidia, incluindo estados poliplóides, diplóides, haplóides e de hemizigoto. Quando aqui empregado, o termo "planta transgênica"inclui plantas ou célu-las de planta nas quais uma seqüência de ácido nucléico heteróloga foi inserida, por exemplo, os ácidos nucléico e várias construções recombinantes (por exemplo, cassetes de expressão) da invenção.
"Aminoácido"ou "seqüência de aminoácido"inclui um oligopep- tídeo, peptídeo, polipeptídeo ou seqüência de proteína, ou em um fragmen-to,porção, ou subunidade de quaisquer destes, e em moléculas sintéticas ou de ocorrência natural.
Os termos "polipeptídeo"e "proteína"podem incluir aminoácidos unidos um ao outro por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modifi-cado, isto é, isoésteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos modifica-dos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por gene. O termo "polipeptí- deo" da mesma forma inclui fragmentos de polipeptídeo e peptídeos e frag-menta,motifs e similares. O termo da mesma forma inclui polipeptídeos gli- cosilados. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção da mesma forma inclu-em todas as formas "miméticas"e "peptidomiméticas", como descrito em mais detalhes, abaixo.
O termo "isolado" pode significar que um material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência na-tural presente em um animal vivo não é isolado, porém o mesmo polinucleo- tídeo ou polipeptídeo, separado de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição, e ainda serem isolados naquele tal vetor ou composição não faz parte de seu ambiente natural. Quando aqui empregado, uma composi-ção ou material isolado pode da mesma forma ser uma composição "purifi-cada", isto é, não requer pureza absoluta; de preferência, é pretendida como uma definição relativa. Os ácidos nucléicos individuais obtidos de uma biblio- teca podem ser convencionalmente purificados para homogeneidade ele- troforética. Em aspectos alternativos, a invenção fornece ácidos nucléicos que foram purificados a partir de DNA genômico ou de outras seqüências em uma biblioteca ou outro ambiente por pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou mais ordens de magnitude.
O termo "recombinante" pode significar que o ácido nucléico é adjacente a um ácido nucléico de "cadeia principal" ao qual não é adjacente em seu ambiente natural. Em um aspecto, ácidos nucléico representam 5% ou mais do número de inserções de ácido nucléico em uma população de "moléculas de cadeia principal" de ácido nucléico. As "moléculas de ácido nucléico"de acordo com a invenção incluem ácidos nucléicos tais como ve-tores de expressão, ácidos nucléicos de auto-replicação, vírus, ácidos nu- cléico de integração e outros vetores ou ácidos nucléicos empregados para manter ou manipular uma inserção de ácido nucléico de interesse. Em um aspecto, os ácidos nucléico enriquecidos representam 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do número de inserções de ácido nucléico na população de moléculas de cadeia principal recombinantes. Po- lipeptídeos ou proteínas "recombinantes" refere-sem a polipeptídeos ou pro-teínas produzidas por técnicas de DNA recombinante; por exemplo, produzi-dos de células transformadas por uma construção de DNA exógeno codifi-cando o polipeptídeo ou proteína desejada. Os polipeptídeos ou proteína "sintéticos" são aqueles preparados por síntese química, como descrito em mais detalhes, abaixo.
Uma seqüência promotora pode ser "operavelmente ligada a" uma seqüência de codificação quando a RNA polimerase que inicia a trans-crição no promotor, transcreverá a seqüência de codificação em mRNA, co-mo também discutido, abaixo.
"Oligonucleotídeo"pode incluir um polidesoxinucleotídeo de fila-mento simples ou dois filamentos de polidesoxinucleotídeo complementares que podem ser quimicamente sintetizados. Tais oligonucleotídeos sintéticos não têm fosfato em 5’ e desse modo não se ligarão a outro oligonucleotídeo sem adicionar um fosfato com um ATP na presença de uma cinase. Um oli- gonucleotídeo sintético pode ligar-se a um fragmento que não foi desfosfori- lado.
A frase "substancialmente idêntico"no contexto de dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos, pode se referir a duas ou mais seqüências que têm, por exemplo, pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais nucleotídeo ou identidade de resíduo de aminoácido (seqüência), quando comparado e alinhado para correspon-dência máxima, como medido empregando-se qualquer um algoritmo de comparação de seqüência conhecido, como discutido em detalhes abaixo, ou por inspeção visual. Em aspectos alternativos, a invenção fornece se- qüências de polipeptídeo e ácido nucléico tendo identidade substancial em um ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma seqüência exemplar da invenção em uma região de pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ou resíduos, ou uma região variando dentre cerca de 50 re-síduos para o tamanho natural do ácido nucléico ou polipeptídeo. As se- qüências de ácido nucléico da invenção podem ser substancialmente idênti-cas no comprimento integral de uma região de codificação de polipeptídeo.
Adicionalmente uma seqüência de aminoácido "substancialmenteidêntica" é uma seqüência que difere de uma seqüência de referência por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido conservadoras ou não conservadoras, particularmente quando uma tal substituição ocorre em um sítio que não é o sítio ativo da molécula, e contanto que o po- lipeptídeo essencialmente retenha suas propriedades funcionais. Uma substituição de aminoácido conservadora, por exemplo, substitui um aminoácido por outro da mesma classe (por exemplo, substituição de um aminoácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina, por outro, ou substituição de um aminoácido polar por outro, tal como substituição de ar- ginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por aspa- ragina). Um ou mais aminoácidos podem ser deletados, por exemplo, de uma hidrolase, resultando na modificação da estrutura do polipeptídeo, sem significativamente alterar sua atividade biológica. Por exemplo, aminoácidos de terminal carboxila ou amino que não são requeridos para atividade de hidrolase podem ser removidos.
"Hibridização"refere-se ao processo pelo qual um filamento de ácido nucléico une-se com um filamento complementar através de empare- lhamento de base. As reações de hibridação podem ser sensíveis e seletivas de forma que uma seqüência particular de interesse pode ser identificada até mesmo em amostras nas quais está presente em baixas concentrações. Condições severas podem ser definidas, por exemplo, pelas concentrações de sal ou formamida nas soluções de hibridação e pré-hibridização, ou pela temperatura de hibridização, e são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a severidade pode ser aumentada reduzindo-se a concentração de sal, au-mentando-se a concentração de formamida ou elevando-se a temperatura de hibridização, alterando o tempo de hibridização, como descrito em deta-lhes, abaixo. Em aspectos alternativos, os ácidos nucléico da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob várias condições de severi-dade (por exemplo, alta, média e baixa), como aqui mencionado.
O termo "variante" pode incluir polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção modificados em um ou mais pares de base, códons, íntrons, exons ou resíduos de aminoácido (respectivamente) contudo ainda retém a atividade biológica de uma hidrolase da invenção. As variantes podem ser produzidas por qualquer número de meios, incluídos métodos tais como, por exemplo, PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo, PCR em conjunto, mutagênese de PCR sexual, muta- gênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese em conjunto recursiva, mutagênese em conjunto exponencial, mutagênese específica de sítio, rea- grupamento de gene, GSSM e qualquer combinação destes. Técnicas para produzir hidrolases variantes tendo atividade em um pH ou temperatura, por exemplo, que é diferente de uma hidrolase tipo silvestre, são aqui incluídas.
O termo "mutagênese por saturação"ou "GSSM" inclui um mé- todo que usa iniciadores de oligonucleotídeo degenerados para introduzir mutações pontuais em um polinucleotídeo, como descrito em detalhes, abaixo. O termo "sistema de evolução direcionado otimizado" ou "evolução direcionada otimizada" inclui um método para reagrupar fragmentos de seqüên- cias de ácido nucléico relacionadas, por exemplo, genes relacionados, e explicados em detalhes, abaixo. O termo "reagrupamento de ligação sintética"ou "SLR" inclui um método de ligação de fragmentos de oligonucleotídeo em um modelo não estocástico e explicado em detalhes, abaixo.
O termo "xarope" pode ser definido como uma suspensão ou solução aquosa compreendendo carboidratos tal como mono-, oligo- ou po- lissacarídeos.
Geração e Manipulação de Ácidos Nucléicos
A invenção fornece ácidos nucléicos, incluindo cassetes de ex-pressão tal como vetores de expressão, codificando os polipeptídeos (por exemplo, hidrolases, anticorpos) da invenção. A invenção da mesma forma inclui métodos para descobrir novas seqüências de hidrolase empregando os ácidos nucléicos da invenção. Da mesma fornecidos são os métodos para modificar os ácidos nucléicos da invenção por, por exemplo, reagrupamento de ligação sintética, sistema de evolução direcionado otimizado e/ou muta- gênese por saturação.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser feitos, isolados e/ou manipulados, por exemplo, por clonagem e expressão de bibliotecas de cDNA, amplificação de mensagem ou DNA genômico por PCR, e similares. Na prática dos métodos da invenção, os genes homólogos podem ser modi-ficados manipulando-se um ácido nucléico modelo, como descrito aqui. A invenção pode ser praticada em conjunto com qualquer método ou protocolo ou dispositivo conhecido na técnica, que são bem descritos na literatura de patente e científica.
Técnicas Gerais
Os ácidos nucléicos empregados para prática desta invenção, ou RNA, iRNA, ácido nucléico de anti-sentido, cDNA, DNA genômico, veto-res, vírus ou híbridos destes, podem ser isolados de uma variedade de fon- tes, geneticamente construídos, amplificados e/ou expressados/ gerados recombinantemente. Os polipeptídeos recombinantes gerados desses ácidos nucléicos podem ser individualmente isolados ou clonados e testados quanto a uma atividade desejada. Qualquer sistema de expressão recombinante pode ser empregado, incluindo sistemas de expressão de célula bacteriana, mamífero, levedura, inseto ou planta.
Alternativamente, esses ácidos nucléicos podem ser sintetizados in vitro por técnicas bem conhecidas de síntese química, como descrito, por exemplo, Adams (1983) o J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nu-cleic Acids Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra Lett. 22: 1859; Patente dos Estados Unidos N° 4.458.066.
As técnicas para a manipulação de ácidos nucléicos, tal como, por exemplo, subclonagem, sondas de rotulação (por exemplo, rotulação de iniciador aleatório empregando Klenow polimerase, amplificação, translação de corte), seqüenciamento, hibridização e similares são bem descritos na literatura de patente e científica, observe, por exemplo, Sambrook, ed., MO-LECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a edição), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLOS IN MO-LECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECU-LAR BIOLOGY: HIBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993).
Outro meio útil de obter e manipular os ácidos nucléicos empre-gados para praticar os métodos da invenção é clonar de amostras genômi- cas, e, se desejado, analisar e reclonar as inserções isoladas ou amplifica-das de, por exemplo, clones genômicos ou clones de cDNA. As fontes de ácido nucléico empregadas nos métodos da invenção incluem bibliotecas genômicas ou de cDNA contidas em, por exemplo, cromossomas artificiais de mamíferos (MACs), observe, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos 5.721.118; 6.025.155; cromossomas artificiais de humano, observe, por exemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333-335; cromossomas artificiais de levedura (YAC); cromossomas artificiais bacterianos (BAC); cromossomas artificiais P1, observe por exemplo, Woon (1998) Genomics 50: 306316; vetores derivados de P1 (PACs), observe, por exemplo, Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; cosmídeos, vírus recombinantes, fagos e plas- mídeos.
Em um aspecto, um ácido nucléico codificando um polipeptídeo da invenção é agrupado na fase apropriada com uma seqüência condutora capaz de direcionar a segregação do polipeptídeo transladado ou fragmento deste.
A invenção fornece proteínas de fusão e ácidos nucléicos codifi-cando-os. Um polipeptídeo da invenção pode ser fundido a um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo, tal como peptídeos de identificação N-terminal que transmitem as características desejadas, tal como estabilidade aumentada ou purificação simplificada. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção po-demtambém ser sintetizados e expressados como proteínas de fusão com um ou mais domínios adicionais ligados a elas para, por exemplo, produzin-do um peptídeo mais imunogênico, para mais facilmente isolar um peptídeo recombinantemente sintetizado, para identificar e isolar os anticorpos e célu-las B de expressão de anticorpos, e similares. Os domínios de facilitação de purificação e detecção incluem, por exemplo, peptídeos de quelação de me-tal tal como traços de poliistidina e módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de purificação de afinidade/ extensão FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). A inclusão de uma seqüência ligadora clivável tal como enteroci- nase ou Fator Xa (Invitrogen, San Diego CA) entre um domínio de purificação e o peptídeo ou polipeptídeo compreendendo motif, para facilitar a purificação. Por exemplo, um vetor de expressão pode incluir uma seqüência de ácido nucléico de codificação de epítopo ligada a seis resíduos de histidina seguida por uma tioredoxina e um sítio de clivagem de enterocinase (observe, por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404-414). Os resíduos de histidina facilitam a detec-ção e purificação ao mesmo tempo em que o sítio de clivagem de enteroci- nase fornece um meio de purificar o epítopo do restante da proteína de fu-são. A tecnologia pertencente a vetores codificando proteínas de fusão e aplicação de proteínas de fusão, são bem descritas na literatura de patente e científica, observe, por exemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53. Seqüências de
Controle Transcricional e Translacional
A invenção fornece seqüências de ácido nucléico (por exemplo, DNA, iRNA) da invenção operativamente ligada à seqüência(s) de controle de expressão (por exemplo, transcricional ou translacional), por exemplo, promotores ou realçadores, para direcionar ou modular a síntese/ expressão de RNA. A seqüência de controle de expressão pode estar em um vetor de expressão. Os promotores bacterianos exemplares incluem lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lâmbda PR, PL e trp. Os promotores eucarióticos exemplares incluem precoce imediato CMV, timidina cinase de HSV, SV40 posterior e precoce, LTRs de retrovírus, e metalotioneína I de camundongo.
Os promotores adequados para expressão de um polipeptídeo em bactérias incluem os promotores E. coli lac ou trp, o promotor lacI, o promotor lacZ, o promotor T3, o promotor T7, o promotor gpt, o promotor PR lâmbda, o promotor PL lâmbda, promotores de opérons codificando enzimas glicolíticas tal como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), e o promotor de fosfatase de ácido. Os promotores eucarióticos incluem o promotor precoce imediato CMV, o promotor de timidina cinase HSV, os promotores de choque térmico, o promotor SV40 precoce e posterior, LTRs de retrovírus, e o promotor de metalotioneína-I de camundongo. Outros promotores conhecidos por contro-lar a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus podem também ser empregados.
Promotores de Planta Específicos de Tecido
A invenção fornece os cassetes de expressão que podem ser expressos de uma maneira específica de tecido, por exemplo, que pode ex-pressar uma hidrolase da invenção de uma maneira específica de tecido. A invenção também fornece plantas ou sementes que expressam uma hidro- lase da invenção de uma maneira específica de tecido. A especificidade de tecido pode ser específica de semente, específica de tronco, específica de folha, específica de raiz, específica de fruta e similares.
Em um aspecto, um promotor constitutivo tal como o promotor CaMV 35S pode ser empregado para expressão em partes específicas da planta ou semente por toda a planta. Por exemplo, para a superexpressão de uma hidrolase da invenção, um fragmento de promotor de planta pode ser empregado o qual direcionará a expressão de um ácido nucléico em algum ou todo tecido de uma planta, por exemplo, uma planta regenerada. Tais promotores "constitutivos"são ativos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação de célula. Os exemplos de promotores constitutivos incluem a região de iniciação de transcrição 35S do vírus mosaico de couve-flor (CaMV), o promotor 1’- ou 2’- derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefacis, e outras regiões de iniciação de transcrição de vários genes de plantas conhecidos por aqueles de experiência. Tais genes incluem, por exemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33: 125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank no U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251: 196-203); o gene codificando proteína desaturase portadora de estearoil-acila de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol 104: 1167-1176); GPcl de milho (GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol. 208: 551-565); o Gpc2 de milho (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33: 97112); promotores de planta descritos nas Patentes dos Estados Unidos nos 4.962.028; 5.633.440.
A invenção emprega os promotores constitutivos ou específicos de tecido derivados de vírus que podem incluir, por exemplo, o promotor sub-genômico de tobamovírus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1679-1683); o vírus baciloforme tungro de arroz (RTBV), que replica somente em células de floema em plantas de arroz infectadas, com seu promotor que direciona a expressão de gene repórter específica de floema forte; o promotor de vírus mosaico de nervuras da mandioca (CVMV), com atividade superior em elementos vasculares, em células de mesófilo de folha, e em pontas de raiz (Verdaguer (1996) Palnt Mol. Biol. 31: 1129-1139).
Alternativamente, o promotor de planta pode direcionar a ex-pressão de ácido nucléico de expressão de hidrolase em um tecido, órgão ou tipo de célula específico (isto é, promotores específicos de tecido) ou po-de estar de outro modo sob controle ambiental ou de desenvolvimento mais preciso ou sob o controle de um promotor indutor. Os exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição incluem condições anaeró- bicas, temperatura elevada, a presença de luz, ou pulverizados com produ-tosquímicos/ hormônios. Por exemplo, a invenção incorpora o promotor in-dutor de seca de milho (Busk (1997) supra); o promotor indutor de frio, seca, sal elevado de batata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 3897 909).
Os promotores específicos de tecido podem promover a trans-crição somente em uma certa estrutura de tempo de estágio de desenvolvi-mento naquele tecido. Observe, por exemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10: 791-800, caracterizando o promotor de gene Arabdopsis LEAFY. Observe também Cardon (1997) Plant J 12: 367-77, descrevendo o fator de transcri-ção SPL3, que reconhece um motif de seqüência conservada na região promotora do gene de identidade de meristema floral A. thaliana AP1; e Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp 995-1004, descrevendo o promotor de meristema eIF4. Os promotores específicos de tecido que são ativos por todo o ciclo de vida de um tecido particular podem ser emprega-dos. Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção estão operavelmente ligados a um promotor ativo principalmente somente em células de fibra de algodão. Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção estão operavel- mente ligados a um promotor ativo principalmente durante os estágios de alongamento da célula de fibra de algodão, por exemplo, como descrito por Rinehart (1996) supra. Os ácidos nucléicos podem estar operavelmente li-gados ao promotor de gene Fbl2A para ser preferencialmente expressado em células de fibra de algodão (Ibid). Observe também, John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5769-5773; John, e outros, Patentes dos Estados Unidos Nos 5.608.148 e 5.602.321, descrevendo os promotores específicos de fibra de algodão e métodos para a construção de plantas de algodão transgênicas. Os promotores específicos de raiz podem também ser empre-gados para expressar os ácidos nucléicos da invenção. Os exemplos de promotores específicos de raiz incluem o promotor do gene de álcool desi- drogenase (DeLisle (1990) Int. Ver. Cytol. 123: 39-60). Outros promotores que podem ser empregados para expressar os ácidos nucléicos da invenção incluem, por exemplo, promotores específicos de óvulo, específico de em-brião, específico de endosperma, específico de integumento, especifico de casca de semente, ou algumas combinações destes; um promotor específico de folha (observe, por exemplo, Busk (1997) Plant J. 11: 1285-1295, descre-vendo um promotor específico de folha no milho); o promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que exibe atividade elevada em raízes, observe, por exemplo, Hansen (1997) supra); um promotor específico do pólen do milho (observe, por exemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 161 168); um promotor de tomate ativo durante o amadurecimento da fruta, se- nescência e abscissão de folhas e, a uma extensão menor, de flores pode ser empregado (observe, por exemplo, Blume (1997) Plant J. 12: 731 746); um promotor específico de pistilo do gene SK2 da batata (observe, por exemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425-431); o gene Blec4 de ervilha, que é ativo no tecido epidérmico dos ápices de broto vegetativo e floral de alfafa transgênica a tornando um instrumento útil para alvejar a expressão de genes estranhos para a camada epidérmica de fibras ou brotos ati-vamente crescentes; o gene BEL1 específico de óvulo (observe, por exem-plo, Reiser (1995) Cell 83: 735-742, GenBank No. U39944); e/ou, o promotor em Klee, Patente dos Estados Unidos No 5.589.583, descrevendo uma regi-ão promotora de planta é capaz de conferir níveis elevados de transcrição em tecido meristemático e/ou célula de divisão rápida.
Alternativamente, os promotores de planta que são indutores sob exposição aos hormônios da planta, tal como auxinas, são empregados para expressar os ácidos nucléicos da invenção. Por exemplo, a invenção pode utilizar o fragmento de promotor de elementos E1 de resposta à auxina (AuxREs) na soja (Glycine max. L) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407); o promotor GST6 Arabidopsis responsivo à auxina (também responsivo ao ácido salicílico e peróxido de hidrogênio) (Chen (1996) Plant J. 10: 955 - 966); o promotor parC induzível por auxina de tabaco (Sakai (1996) 37: 906-913); um elemento de resposta de biotina de planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937); e, o promotor responsivo ao ácido abscísico de hormônio de estresse (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).
Os ácidos nucléicos da invenção podem também estar opera- velmente ligados aos promotores de planta que são indutores sob exposição a reagentes químicos que podem ser aplicados à planta, tal como herbicidas ou antibióticos. Por exemplo, o promotor In2-2 de milho, ativado por proteto-res herbicidas de benzenossulfonamida, pode ser empregado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); a aplicação de diferentes protetores herbicidas induz a padrões de expressão de gene distintos, incluindo ex-pressão na raiz, hidatodos, e o meristema apical do broto. A seqüência de codificação pode estar sob o controle de, por exemplo, um promotor induzí- vel por tetraciclina, por exemplo, como descrito com plantas de tabaco transgênicas contendo o gene de argina descarboxilase (aveia) Avena sativa L (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); ou, um elemento responsivo ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). Empregando promo-tores quimicamente (por exemplo, hormônio ou pesticida) induzidos, isto é, promotores responsivos a um produto químico que pode ser aplicado à plan-ta transgênica no campo, a expressão de um polipeptídeo da invenção pode ser induzida em um estágio particular de desenvolvimento da planta. Desse modo, a invenção também fornece plantas transgênicas contendo um gene induzível codificando para polipeptídeos da invenção cuja faixa de hospedeiroé limitada a espécies de planta alvo, tal como milho, arroz, cevada, trigo, batata, ou outras safras, induzíveis em qualquer estágio de desenvolvimento da safra.
Promotores de planta específicos de tecido podem direcionar a expressão de seqüências operavelmente ligadas em tecidos exceto no teci-do alvo. Desse modo, um promotor específico de tecido é um que direciona a expressão preferencialmente no tipo de célula ou tecido alvo, porém pode da mesma forma induzir a algumas expressões em outros tecidos também.
Os ácidos nucléicos da invenção podem da mesma forma estar operavelmente ligados aos promotores de planta que são induzíveis sob ex-posição a reagentes químicos. Esses reagentes incluem, por exemplo, her-bicidas, auxinas sintéticas, ou antibióticos que podem ser aplicados, por exemplo, pulverizados, sobre as plantas transgênicas. A expressão induzível dos ácidos nucléicos de produção de hidrolase da invenção permitirá o culti-vador selecionar as plantas com a relação de amido/ açúcar ideal. O desen-volvimento de partes da planta pode desse modo ser controlado. Desse mo-do, a invenção fornece os meios para facilitar a colheita de plantas e partes de planta. Por exemplo, em várias modalidades, o promotor In2-2 de milho, ativado por protetores herbicidas de benzenossulfonamida, é empregado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); a aplicação de diferen-tes protetores herbicidas induz a padrões de expressão de gene distintos, incluindo a expressão na raiz, hidatodos, e no meristema apical do broto. As seqüências de codificação da invenção estão também sob o controle de um promotor induzível por tetraciclina, por exemplo, como descrito com plantas de tabaco transgênicas contendo o gene de arginina descarboxilase (aveia) Avena sativa L. (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); ou, um elemento responsivo ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324).
Se a expressão de polipeptídeo apropriada é desejada, uma re-gião de poliadenilação na terminação 3’ da região de codificação deve ser incluída. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta, ou de genes no T-DNA Agrobac- terial.
Vetores de Expressão e Veículos de Clonagem
A invenção fornece vetores de expressão e veículos de clona-gem compreendendo os ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, se- qüências codificando as hidrolases e anticorpos da invenção. Os vetores de expressão e veículos de clonagem da invenção podem compreender partícu-las virais, baculovírus, fago, plasmídeos, fagemideos, cosmídios, fosmídios, cromossomas artificiais bacterianos, DNA viral (por exemplo, vacínia, ade- novírus, vírus do epitelioma contagioso, pseudo-raiva e derivados de SV40), cromossomas artificiais com base em P1, plasmídeos de levedura, cromos-somos artificiais de levedura, e qualquer outro vetor específico para hospe-deirosespecíficos de interesse (tal como bacilo, Aspergilos e levedura). Os vetores da invenção podem incluir seqüências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas. Grandes números de vetores adequados são conhecidos por aqueles de experiência na técnica, e estão comercialmente disponíveis. Os vetores exemplares incluem: bacterianos: vetores pQE (Qia-gen), plasmídeos pBluescript, vetores pNH (vetores lâmbda-ZAP (Stratage- ne)); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucarióticos: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Entre-tanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser empregado contanto que eles sejam replicáveis e viáveis no hospedeiro. Os vetores com número de cópia baixo ou número de cópia elevado podem ser empregados com a presente invenção.
O vetor de expressão pode compreender um promotor, um sítio de ligação de ribossoma para iniciação da translação e um terminador de transcrição. O vetor pode também incluir seqüências apropriadas para ampli-ficação da expressão. Os vetores de expressão de mamífero podem com-preender uma origem de replicação, qualquer sítio de ligação de ribossoma necessário, um sítio de poliadenilação, sítios aceitadores e doadores de jun-ção, seqüências de terminação transcricional, e seqüências não transcritas de flanqueamento 5’. Em alguns aspectos, as seqüências de DNA, derivadas da junção de SV40, e sítios de poliadenilação podem ser empregados para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.
Em um aspecto, os vetores de expressão contêm um ou mais genes marcadores selecionáveis para permitir a seleção de células hospe-deiras contendo o vetor. Tais marcadores selecionáveis incluem genes codi-ficando diidrofolato redutase ou genes conferindo resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, genes conferindo resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli, e o gene TRP1 S. cerevisiae. As regiões promotoras podem ser selecionadas de qualquer gene desejado empregando vetores de cloranfenicol transferase (CAT) ou outros vetores com marcadores selecionáveis.
Os vetores para expressão do polipeptídeo ou fragmento deste em células eucarióticas podem também conter realçadores para aumentar os níveis de expressão. Os realçadores são elementos cis-atuantes de DNA, geralmente de cerca de 10 a cerca de 300 pares de base em comprimento que atuam em um promotor para aumentar sua transcrição. Os exemplos incluem o realçador SV40 no último lado dos pares de base 100 a 270 da origem de replicação, o realçador de promotor precoce de citomegalovírus, o realçador de polioma no último lado da origem de replicação, e os realçado- res de adenovírus.
Uma seqüência de ácido nucléico pode ser inserida em um vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, a seqüência de DNA está ligada à posição desejada no vetor seguindo a digestão da inserção e do vetor com endonucleases de restrição apropriadas. Alternativamente, as ex-tremidades embotadas igualmente na inserção e no vetor podem ser ligadas. Uma variedade de técnicas de clonagem é conhecida na técnica, por exem-plo, como descrito em Ausubel e Sambrook. Tais procedimentos e outros são julgados estarem no escopo daqueles versados na técnica.
O vetor pode estar na forma de um plasmídeo, uma partícula vi-ral, ou um fago. Outros vetores incluem seqüências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas, derivadas de SV40; plasmídeos bacteria- nos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tal como vacínia, adenovírus, vírus do epitelioma contagioso, e pseudo-raiva. Uma variedade de vetores de clonagem e expressão para uso com hospedeiros procarióti- cos e eucarióticos é descrita por, por exemplo, Sambrook.
Os vetores bacterianos particulares que podem ser empregados incluem os plasmídeos comercialmente disponíveis compreendendo os ele-mentosgenéticos do vetor de clonagem bem conhecido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stra- tagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 e pCM7. Os vetores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharma- cia). Entretanto, qualquer outro vetor pode ser empregado contanto que seja replicável e viável na célula hospedeira.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser expressados em cassetes de expressão, vetores ou vírus e transitoriamente ou estavelmente expressados em sementes e células de planta. Um sistema de expressão transitório exemplar emprega os sistemas expressão epissômica, por exem-plo, RNA viral do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) gerado no núcleo por transcrição de um DNA superespiralado contendo mini-cromossoma epis- sômico, observe, por exemplo, Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1633-1637. Alternativamente, as seqüências de codificação, isto é, todo ou sub-fragmentos de seqüências da invenção, podem ser inseridas em um genoma de célula hospedeira de planta tornando-se uma parte integral do DNA cromossômico de hospedeiro. As transcrições de sentido ou anti- sentido podem ser expressadas desse modo. Um vetor compreendendo as seqüências (por exemplo, promotores ou regiões de codificação) de ácidos nucléicos da invenção pode compreender um gene marcador que confere um fenótipo selecionável em uma semente ou célula de planta. Por exemplo, o marcador pode codificar a resistência a biocida, particularmente resistência ao antibiótico, tal como resistência à canamicina, G418, resistência à bleo- micina, higromicina ou herbicida, tal como resistência a clorossulfuron ou Basta.
Os vetores de expressão capazes de expressar os ácidos nu- cléicos e proteínas em plantas são bem conhecidos na técnica, e podem incluir, por exemplo, vetores de Agrobacterium spp., vírus X da batata (ob-serve, por exemplo, Angell (1997) EMBO J. 16: 3675-3684), vírus mosaico do tabaco (observe, por exemplo, Casper (1996) Gene 173: 69-73), vírus do atrofiamento cerrado do tomate (observe, por exemplo, Hillman (1989) Viro-logy 169: 42-50), vírus de cauterização de tabaco (observe, por exemplo, Dolja (1997) Virology 234: 243-252), vírus mosaico dourado da vagem (ob serve, por exemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37: 471-476), vírus mosaico da couve-flor (observe, por exemplo, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 1094-1101), elemento transponível Ac/Ds de milho (ob-serve, por exemplo Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17: 6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 161-194), e o elemento transponí- vel supressor-mutador de milho (Spm) (observe, por exemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32: 717-725); e derivados destes.
Em um aspecto, o vetor de expressão pode ter dois sistemas de replicação para permiti-lo ser mantido em dois organismos, por exemplo, em células de mamíferos e insetos para expressão e em um hospedeiro proca- riótico para clonagem e amplificação. Além disso, para vetores de expressão de integração, o vetor de expressão pode conter pelo menos uma seqüência homóloga ao genoma da célula hospedeira. Pode conter duas seqüências homologas que flanqueiam a construção da expressão. O vetor de integra-ção pode estar direcionado a um loco especifico na célula hospedeira sele-cionando-se a seqüência homóloga apropriada para inclusão no vetor. As construções para os vetores de integração são bem conhecidas na técnica.
Os vetores de expressão da invenção podem também incluir um gene marcador selecionável para levar em conta a seleção de cepas bacte- rianas que foram transformadas, por exemplo, genes que tornam as bacté-rias resistentes a drogas tal como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, ca- namicina, neomicina e tetraciclina. Os marcadores selecionáveis podem também incluir os genes biossintéticos, tal como aqueles nas trilhas biossin- téticas de histidina, triptofano e leucina.
Células Hospedeiras e Células Transformadas
A invenção também fornece uma célula transformada compre-endendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma seqüência codificando uma hidrolase ou um anticorpo da invenção. A célula hospedeira pode ser qualquer das células hospedeiras familiares àqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarióticas, tal como células bacterianas, células fúngicas, células de levedura, células de mamífero, células de inseto ou células de planta. As enzimas da invenção podem ser expressas em qualquer célula hospedeira, por exemplo, qualquer célula bacteriana, qualquer célula de levedura, por exemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevidiae ou Schizosaccharomyces pombe. Células bacte- rianas exemplares incluem E. coli, Lactococcus lactis, Streptomyces, Bacillus subtilis, Basillus cereus, Salmonella typhimurium ou quaisquer espécies nos gêneros Bacillus, Streptomyces, e Staphylococcus. As células de inseto exemplares incluem Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. As células animais exemplares incluem CHO, COS ou melanoma Bowes ou qualquer linhagem de célula de camundongo ou humano. A seleção de um hospedeiro apropri-adoestá dentro das capacidades daqueles versados na técnica. As técnicas para transformar uma ampla variedade de espécies de planta superior são bem conhecidas e descritas na literatura científica e técnica. Observe, por exemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477, Patente dos Estados Unidos n° 5.750.870.
O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras empregan-do qualquer de uma variedade de técnicas, incluindo transformação, trans- fecção, transdução, infecção viral, disparos de gene, ou transferência de ge-ne mediada por Ti. Os métodos particulares incluem transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextran, lipofecção, ou eletropo- ração (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Onde apropriado, as células hospedeiras construídas podem ser cultivadas em meios de nutriente convencionais modificados quando apro-priado, para ativação dos promotores, seleção dos transformantes ou ampli-ficação dos genes da invenção. Seguindo a transformação de uma cepa hospedeira adequada e crescimento da cepa hospedeira para uma densida-de de célula apropriada, o promotor selecionado pode ser induzido por meio apropriado (por exemplo, mudança da temperatura ou indução química) e as células podem ser cultivadas durante um período adicional para permitir que elas produzam o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
Em um aspecto, os ácidos nucléicos ou vetores da invenção são introduzidos nas células para avaliar, desse modo, os ácidos nucléicos en tram nas células de uma maneira adequada para expressão subseqüente do ácido nucléico. O método de introdução é grandemente ditado pelo tipo de célula alvejada. Os métodos exemplares incluem, precipitação de CaPO4, fusão de lipossoma, lipofecção (por exemplo, LIPOFECTINTM), eletropora- ção, infecção viral, etc. Os ácidos nucléicos candidatos podem estavelmente integrar no genoma da célula hospedeira (por exemplo, com introdução re-troviral) ou podem existir transitoriamente ou estavelmente no citoplasma (isto é, através do uso de plasmídeos tradicionais, utilizando as seqüências reguladoras, marcadores de seleção padrão, etc.). Como muitas avaliações farmaceuticamente importantes requerem os alvos de célula de mamífero modelo ou humano, os vetores retrovirais capazes de transfectar tais alvos são preferidos.
As células podem ser colhidas por centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos, e o extrato bruto resultante é retido para outra purificação. As células microbianas empregadas para a expressão das prote-ínas podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo cicla- gem de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico, ou o uso de agentes de lise de célula. Tais métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. O polipeptídeo expressado ou fragmento deste pode ser recuperado e purificado de culturas de célula recombinante por mé-todos incluindo precipitação de etanol ou sulfato de amônio, extração de áci-do, cromatografia de permuta de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelu- lose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lecitina. As etapas de reduplicagem de proteína podem ser empregadas, quando necessário, na conclusão da configuração do polipeptídeo. Se desejado, a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser empregada para as etapas de purificação finais.
Vários sistemas de cultura de célula de mamífero podem da mesma forma também ser empregados para expressar a proteína recombi- nante. Os exemplos de sistemas de expressão de mamíferos incluem as linhagens COS-7 de fibroblastos do rim do macaco e outras linhagens de células capazes de expressar proteínas de um vetor compatível, tal como as linhagens de célula C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK.
As construções em células hospedeiras podem ser empregadas de uma maneira convencional para produzir o produto de gene codificado pela seqüência recombinante. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos produzidos pelas células hospedeiras contendo o vetor podem ser glicosilados ou po-demnão ser glicosilados. Os polipeptídeos da invenção podem ou não po-dem da mesma forma incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial.
Os sistemas de translação livres de célula podem da mesma forma ser empregados para produzir um polipeptídeo da invenção. Os sis-temas de translação livres de célula podem empregar mRNAs transcritos de uma construção de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico codificando o polipeptídeo ou fragmento deste. Em al-guns aspectos, a construção de DNA pode ser linearizada antes da condu-ção de uma reação de transcrição in vitro. O mRNA transcrito é em seguida incubado com um extrato de translação livre de célula apropriado, tal como extrato de reticulócito de coelho, para produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.
Os vetores de expressão podem conter um ou mais genes mar-cadoresselecionáveis para fornecer um traço fenotípico para seleção de células hospedeiras transformadas tal como resistência à neomicina ou dii- drofolato redutase para cultura de célula eucariótica, ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli.
Amplificação de Ácidos Nucléicos
Na prática da invenção, os ácidos nucléicos codificando os poli- peptídeos da invenção, ou ácidos nucléicos modificados, podem ser repro-duzidos por, por exemplo, amplificação. A invenção fornece pares de se- qüência de iniciador de amplificação para amplificar ácidos nucleícos codifi-cando uma hidrolase, por exemplo, uma esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou protease, onde os pares de iniciador são capazes de amplificar as se- qüências de ácido nucléico incluindo as exemplares SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 415, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 591, SEQ ID 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SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 773, SEQ ID NO: 775, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 781, SEQ ID NO: 783, SEQ ID NO: 785, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 791, SEQ ID NO: 793, SEQ ID NO: 795, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 799,SEQ ID NO: 801, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 805, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 813, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 821, SEQ ID NO: 823, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 841, SEQ ID 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Alguém de experiência na técnica pode projetar pares de seqüência de iniciador de amplificação de qualquer parte de ou o tamanho natural destas seqüências.
As reações de amplificação podem da mesma ser empregadas para quantificar a quantidade de ácido nucléico em uma amostra (tal como a quantidade de mensagem em uma amostra de célula), rotular o ácido nucléi- co (por exemplo, aplicá-lo a uma disposição ou uma mancha), detectar o ácido nucléico, ou qualificar a quantidade de um ácido nucléico específica em uma amostra. Em um aspecto da invenção, a mensagem isolada de uma célula ou uma biblioteca de cDNA são amplificados. O técnico versado pode selecionar e projetar os iniciadores de amplificação de oligonucleotídeo ade-quados. Os métodos de amplificação são da mesma forma bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, reação em cadeia da polimerase, PCR (observe, por exemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y. (1990) e PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reação em ca-deia de ligase (LCR) (observe, por exemplo, Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117); am-plificação por transcrição (observe, por exemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173); e, replicação de seqüência auto-prolongada (ob-serve, por exemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874); amplificação de Q Beta replicase (observe, por exemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol 35: 1477-1491), ensaio de amplificação de Q-beta replicase automatizado (observe, por exemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271) e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (por exemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); observe também Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307-316; Sambrook; Ausubel; Patente dos Estados Unidos No 4.683.195 e 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564.
A invenção da mesma forma fornece pares de iniciador de ampli-ficação compreendendo seqüências da invenção, por exemplo, em que o par de iniciador compreende um primeiro membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca da primeira (a 5’) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou mais resíduos de um ácido nucléico da invenção, e um segundo membro tendo uma seqüência como mencionada por cerca da primeira (a 5’) 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou mais resíduos do filamento complementar do primeiro membro.
Determinação do Grau de Identidade de Seqüência
A invenção fornece ácidos nucléicos tendo pelo menos ácido nucléico, ou identidade de seqüência completa (100%) para um ácido nu- cléico da invenção, por exemplo, um ácido nucléico exemplar da invenção (por exemplo, tendo uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, etc.); e polipeptídeos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para um polipeptídeo da invenção, por exemplo, um poli- peptídeo exemplar tendo uma seqüência como mencionada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, etc. Em aspectos alternativos, a identidade de seqüência pode estar em uma região de pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, ou mais resíduos consecutivos ou o tamanho natural do polipeptídeo ou ácido nucléico. A extensão da identidade de seqüência (homologia) pode ser determinada empregando qualquer programa de computador e parâme-tros associados, incluindo aqueles descritos aqui, tal como BLAST 2.2.2 ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros default.
A figura 30 é um diagrama descrevendo as características sele-cionadas dos ácidos nucléicos exemplares e polipeptídeos da invenção, in-cluindo a comparação da identidade de seqüência das seqüências exempla-res com o banco de dados público. Todas as seqüências descritas na figura 30 foram submetidas a uma pesquisa de BLAST (como descrito em detalhes, abaixo) contra dois grupos da base de dados. O primeiro grupo da base de dados está disponível através de NCBI (National Center for Biotechnology Information). Todos os resultados das pesquisas contra esses bancos dados são encontrados nas colunas intituladas "Descrição de NR", "Código de Acessão de NR", "E-valor de NR" ou "Organismo de NR". "NR" refere-se aa base de dados de nucleotídeo Não Redundante mantido por NCBI. Este banco de dados é um composto de GenBank, atualizações de GenBank, e atualizações de EMBL. As entradas na coluna, "Descrição de NR", refere- sem à linha de definição em qualquer registro de NCBI determinado, que inclui uma descrição da seqüência, tal como o organismo fonte, nome do gene/ nome da proteína, ou alguma descrição da função da seqüência. As entradas na coluna, "Código de Acessão de NR", refere-sem ao único identi-ficador determinado para um registro da seqüência. As entradas na coluna, "E-valor de NR", refere-sem ao valor Esperado (E-valor), que representa a probabilidade de que uma classificação de alinhamento tão boa quanto àquela encontrada entre a seqüência em questão, (as seqüências da inven- ção) e uma seqüência da base de dados seria encontrada no mesmo núme-ro de comparações entre as seqüências aleatórias, como foi feito na pesqui-sa BLAST presente. As entradas na coluna, "Organismo de NR", refere-sem ao organismo fonte da seqüência identificada como o acerto BLAST mais próximo. O segundo grupo da base de dados é coletivamente conhecido como a base de dados GeneseqTM, que está disponível através de Thomson Derwent (Philadelphia, PA). Todos os resultados das pesquisas contra este banco de dados são encontrados nas colunas intituladas "Descrição da Pro-teína de Geneseq", "Código de Acessão da Proteína de Geneseq", "E-valor da Proteína de Geneseq", Descrição de DNA de Geneseq", Código de Aces-sãodo DNA de Geneseq" ou "E-valor de DNA de Geneseq". A informação encontrada nessas colunas é comparável com a informação encontrada nas colunas de NR descritas acima, exceto que foi derivado de pesquisas de BLAST contra a base de dados de GeneseqTM ao invés das bases de dados de NCBI. Além disso, esta tabela inclui a coluna, "No. de EC Indicado". Um número de EC é o número designado para um tipo de enzima de acordo com um esquema de nomenclatura de enzima padronizado desenvolvido pela Comissão de Enzima do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB). Os resultados na coluna de "No. de EC Indicado"são determinados por uma pesquisa BLAST contra a base de dados de Kegg (Enciclopédia Kyoto de Genes e Genomas). Se a comparação de BLAST de topo tem um E-valor igual ou menor do que e-6, o número de EC designado para a comparação de topo é registrado na tabela. O número de EC do acerto de topo é empregado como um guia no qual o número de EC da seqüência da invenção pode estar. As colunas "Compri-mento de DNA em Questão"e "Comprimento de Proteína em Questão"refe- re-sem ao número de nucleotídeos ou o número de aminoácidos, respecti-vamente, na seqüência da invenção que foi pesquisada ou questionada contra os bancos de dados ou de NCBI ou Geneseq. As colunas "Comprimento de DNA de NR ou Geneseq" e "Comprimento de Proteína de NR ou Ge- neseq" refere-sem ao número de nucleotídeos ou número de aminoácidos, respectivamente, na seqüência da comparação de topo da pesquisa BLAST.
Os resultados fornecidos nessas colunas são da pesquisa que retornou o E-valor inferior, das bases de dados de NCBI ou das bases de dados Ge- neseq. As colunas "% de Proteína ID de NR ou Geneseq" e "% de DNA ID de NR ou Geneseq" refere-sem à identidade de seqüência percentual entre a seqüência da invenção e a seqüência da comparação BLAST de topo. Os resultados fornecidos nessas colunas são da pesquisa que retornou o E-valor inferior, das bases de dados de NCBI ou das bases de dados de Ge- neseq.
As seqüências homólogas da mesma forma incluem as seqüên- cias de RNA nas quais as uridinas substituem as timinas nas seqüências de ácido nucléico. As seqüências homólogas podem ser obtidas empregando- se qualquer dos procedimentos descritos aqui ou podem resultar da correção de um erro de sequenciamento. Será apreciado que as seqüências de ácido nucléico como mencionadas aqui podem ser representadas no formato de caráter único tradicional (observe, por exemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a edição, W. H. Freeman & Co., Nova York) ou em qualquer outro formato que registre a identidade dos nucleotídeos em uma seqüência.
Vários programas de comparação de seqüência identificados aqui são empregados neste aspecto da invenção. As identidades de se- qüência de ácido nucléico e/ou proteína (homologias) podem ser avaliadas empregando-se qualquer da variedade de programas e algoritmos de com-paração de seqüência conhecidos na técnica. Tais algoritmos e programas incluem, porém não estão limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFAS- TA, e CLUSTALW (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8): 2444-2448, 1988; Altschuk e outros, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Thompson e outros, Nucleic Acids Res. 22(2): 4673-4680, 1994; Higgins e outros, Methods Enzymol. 266: 383-402, 1996; Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Altschul e outros, Nature Genetics 3: 266-272, 1993).
A homologia ou identidade pode ser medida empregando sof-tware de análise de seqüência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Bio-technology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal softwa- re compara as seqüências similares designando-se os graus de homologia para várias deleções, substituições e outras modificações. Os termos "homo- logia" e "identidade" no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou se- qüências de polipeptídeo, refere-sem a duas ou mais seqüências ou subse- qüências que são as mesmas ou têm um percentual especificado de resí-duos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos quando compara-dos e alinhados para correspondência máxima em uma janela de compara-ção ou região designada quando medida empregando qualquer número de algoritmos de comparação de seqüência ou por alinhamento manual e ins-peção visual. Para comparação de seqüência, uma seqüência pode atuar como uma seqüência de referência (por exemplo, uma seqüência de poli- peptídeo ou ácido nucléico exemplar da invenção) a qual as seqüências tes-tes são comparadas. Quando empregando um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de teste e de referência são registradas em um computador, as coordenadas da subseqüência são designadas, se necessá-rio, e os parâmetros do programa de algoritmo de seqüência são designados. Os parâmetros de default do programa podem ser empregados, ou os parâmetros alternativos podem ser projetados. O algoritmo de comparação de seqüência em seguida calcula a identidade de seqüência percentual para as seqüências de teste relativo à seqüência de referência, com base nos parâmetros do programa.
Uma "janela de comparação", como empregado aqui, inclui refe-rência a um segmento de qualquer um dos números de resíduos contíguos. Por exemplo, nos aspectos alternativos da invenção, os resíduos contíguos variando em qualquer parte de 20 ao tamanho natural de uma seqüência de ácido nucléico ou polinucleotídeo exemplar da invenção, são comparados com uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas. Se a seqüência de referência tem a identidade de seqüência de requisito para uma seqüência de ácido nucléico ou polipeptídeo exemplar da invenção, por exemplo em aspectos alternativos, 50%,51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de seqüência completa (100%) para uma seqüência de ácido nucléico ou polipeptídeo exemplar da invenção, aquela seqüência está dentro do escopo da invenção. Em modalidades alternativas, as subseqüências variando de cerca de 20 a 600, cerca de 50 a 200, e cerca de 100 a 150 são comparadas com uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem idealmente alinhadas.
Métodos de alinhamento de seqüência para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482,1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443,1970, pela pesquisa para método de similaridade de person & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444,1988, por implementações computado-rizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual. Outros algorit-mos para determinação de homologia ou identidade incluem, por exemplo, além de um programa BLAST (Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Lo-cal Básico no Centro Nacional para Informação Biológica), ALIGN, AMAS (Análise de Seqüências Alinhadas por Multiplicidade), AMPS (Alinhamento de Seqüência Múltipla de Proteína), ASSET (Ferramenta de Avaliação Esta-tística de Segmento Alinhado), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Nodo de Análise Comparativa de Seqüência Biológica), BLIMPS (Pesquisador Melho-rado de Blocos), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman algo-rithm, DARWIN, Las Vegas algorithm, FNAT (Ferramenta de Alinhamento de Nucleotídeo Forçado), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Pacote de Análise de Seqüência Fristensky), GAP (Programa de Alinha-mento Global), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Comparação de Seqüên- cia Sensível), LALIGN (Alinhamento de Seqüência Local), LCP (Programa de Conteúdo Local), MACAW (Bancada de Análise &Construção de Alinha-mentoMúltiplo), MAP (Programa de Alinhamento Múltiplo), MBLKP, MBLKN, PIMA (Alinhamento de Multi-Seqüência de Padrão Induzido), SAGA (Ali-nhamento de Seqüência por Algoritmo Genético) WHAT-IF. Tais programas de alinhamento podem da mesma forma ser empregados para analisar os bancos de dados do genoma para identificar as seqüências de polinucleotí- deo tendo as seqüências substancialmente idênticas. Vários bancos de da-dos de genomas estão disponíveis, por exemplo, uma porção substancial do genoma humano está disponível como parte do Projeto de Seqüenciamento de Genoma Humano (Gibbs, 1995). Vários genomas têm sido seqüenciados, por exemplo, M. Genitalium. (Fraser e outros, 1995), M. jannaschii (Bult e outros, 996), H. influenzae (Fleischmann e outros, 1995), E. coli (Blattner e outros, 1997), e levedura (S. cerevisiae) (Mewes e outros, 1997), e D. mela- nogaster (Adams e outros, 2000). Progresso significante da mesma forma tem sido feito no sequenciamento de genomas de organismo modelo, tal como camundongo, C. elegans, e Arabadopsis sp. Os bancos de dados con-tendoinformação genômica anotada com alguma informação funcional são mantidos por diferentes organizações, e são acessíveis através da INTER-NET.
Os algoritmos de BLAST, BLAST 2.0 e BLAST 2.2.2 são da mesma forma empregados para prática da invenção. Eles são descritos, por exemplo, em Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. O software para realização da análise de BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia. Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de se- qüência de classificação elevada (HSPs) identificando-se as senhas de comprimento W na seqüência em questão, que compara ou satisfaz alguma classificação T limiar de valor positivo quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência da base de dados. T é referido co-mo a limiar de classificação da palavra vizinha (Altschul (1990) supra). Esses acertos de palavra vizinha iniciais atuam como sementes para iniciação das pesquisas para encontrar os HSPs mais longos contendo-as. Os acertos de palavra são prolongados em ambas as direções ao longo de cada seqüência até que a classificação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As classificações cumulativas são calculadas empregando, para seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (classificação prêmio para um par de resíduos de comparação; quase >0). Para seqüências de aminoácido, uma matriz de classificação é empregada para calcular a classificação cumulativa. A exten-são do acerto de palavra em cada direção é parada quando: a classificação de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo obti-do; a classificação cumulativa sai de zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou a termi-nação de qualquer das seqüências é alcançada. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeo) utiliza como defaults uma extensão de palavra (W) de 11, uma expectação (E) de 10, M=5, N= -4 e uma comparação de ambos filamentos. Para as seqüências de aminoáci- dos, o programa BLAST utiliza como defaults uma extensão de palavra de 3, e expectações (E) de 10, e os alinhamentos da matriz de classificação BLO- SUM62 (observe Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) (B) de 50, expectação (E) de 10, M= 5, N= -4, e uma comparação de ambos filamentos. O algoritmo de BLAST da mesma forma realiza uma aná-liseestatística da similaridade entre as duas seqüências (observe, por exemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a menor proba-bilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade por qual uma comparação entre as duas seqüências de nucleotídeo e aminoáci- do ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado simi-lar a uma seqüência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucléico teste com o ácido nucléico de referência for menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001. Em um aspecto, as homologias da seqüência de proteína e ácido nucléico são avaliadas em- pregando a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico ("BLAST"). Por exemplo, cinco programas BLAST específicos podem ser empregados para realizar a seguinte tarefa: (1) BLASTP e BLAST3 compa-ram uma seqüência em questão de aminoácido contra uma base de dados da seqüência de proteína; (2) BLASTN compara uma seqüência em questão de nucleotídeo contra uma base de dados da seqüência de nucleotídeo; (3) BLASTX compara os produtos de translação conceituais de seis estruturas de uma seqüência de nucleotídeo em questão (ambos filamentos) contra uma base de dados da seqüência de proteína; (4) TBLASTN compara uma seqüência de proteína em questão contra uma base de dados de seqüência de nucleotídeo transladado em todas as seis estruturas de leitura (ambos filamentos); e (5) TBLASTX compara as translações das seis estruturas de uma seqüência em questão de nucleotídeo contra as translações de seis estruturas de uma base de dados de seqüência de nucleotídeo. Os progra-mas BLAST identificam as seqüências homologas identificando-se os seg-mentos similares, que são referidos aqui como "pares de segmento de clas-sificação elevada", entre uma seqüência de aminoácido ou ácido nucléico em questão e uma seqüência de teste que é preferivelmente obtida de uma base de dados de seqüência de ácido nucléico ou proteína. Os pares de segmento de classificação elevada são preferivelmente identificados (isto é, alinhados) através de uma matriz de classificação, muitas das quais são co-nhecidas na técnica. Preferivelmente, a matriz de classificação empregada é a matriz BLOSUM62 (Gonne e outros, Science 256: 1443-1445, 1992; Heni- koff e Henikoff, Proteins 17: 49-61, 1993). Menos preferivelmente, as matri-zes PAM ou PAM250 podem também ser empregadas (observe, por exemplo, Schwartz e Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Rela-tionships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: Natioanal Biomedical Research Foundation).
Em um aspecto da invenção, para determinar se um ácido nu- cléico tem a identidade de seqüência requisitada para estar no escopo da invenção, o programa BLAST 2.2.2 de NCBI é empregado, as opções default para blastp. Existem cerca de 38 opções de ajuste no programa BLAST 2.2.2. Neste aspecto exemplar da invenção, todos os valores defaultsão empregados exceto para o ajuste de filtração default (isto é, todos os parâ-metros se ajustam para default exceto a filtração que é ajustada para OFF); em seu lugar um ajuste "-F F"é empregado, que incapacita a filtração. O uso de filtração default muitas vezes resulta nas violações de Karlin-Altschuk devido ao comprimento curto da seqüência.
Os valores default empregados neste aspecto exemplar da in-venção, e para determinar os valores na figura 30, como discutido acima, incluem: "Filtro para complexidade baixa: ON Tamanho da Palavra: 3 Matriz: Blosum62 Custos de intervalo: Existência: 11 Extensão: 1"
Outros ajustes defaultsão: filtro para complexidade baixa OFF, tamanho de palavra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalidade de existência de intervalo de -11 e uma penalidade de extensão de intervalo de -1. Um ajuste do programa BLAST 22.2. de NCBI exemplar é mencionado no Exemplo 1, abaixo. Nota-se que a opção "-W"default para 0. Isto significa que, se não ajustado, o tamanho da palavra defaults em 3 para proteínas e 11 para nucleotídeos.
Sistemas de Computador e Produtos de Programa de Computador
Para determinar e identificar as identidades de seqüência, homo- logias estruturais, motifs e outros em sílico, a seqüência da invenção pode ser armazenada, registrada, e manipulada em qualquer meio que possa ser lido e acessado por um computador. Conseqüentemente, a invenção fornece computadores, sistemas de computador, meios legíveis de computador, produtos de programa de computador e outros, registrados ou armazenados nestes, as seqüências de ácido nucléico e polipeptídeo da invenção. Como empregado aqui, as palavras "registrado" e "armazenado" refere-sem a um processo para armazenar informação em um meio de computador. Um técnico versado pode facilmente adotar qualquer método conhecido para regis- trar informações em um meio legível de computador para gerar preparações compreendendo uma ou mais das seqüências de ácido nucléico e/ou poli- peptídeo da invenção.
Outro aspecto da invenção é um meio legível de computador tendo registrado nele pelo menos uma seqüência de ácido nucléico e/ou po- lipeptídeo da invenção. Os meios legíveis de computador incluem meios magneticamente legíveis, meios opticamente legíveis, meios eletronicamen-telegíveis e meios magnéticos/ópticos. Por exemplo, os meios legíveis de computador podem ser um disco rígido, um disco flexível, uma fita magnéti-ca, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD), Memória de Acesso Aleatório (RAM), ou Memória de Leitura (ROM) bem como outros tipos de outros meios conhecidos por aqueles versados na técnica.
Os aspectos da invenção incluem sistemas (por exemplo, siste-mas com base em Internet), particularmente sistemas de computador, que armazenam e manipulam as seqüências e informação das seqüências des-critas aqui. Um exemplo de um sistema de computador 100 é ilustrado na forma de diagrama em bloco na figura 1. Como empregado aqui, "um siste-ma de computador" refere-se aos componentes de hardware, os componen-tes de software, e os componentes de armazenamento de dados empregados para analisar uma seqüência de nucleotídeo ou polipeptídeo da invenção. O sistema de computador 100 pode incluir um processador para processar, acessar e manipular os dados da seqüência. O processador 105 pode ser qualquer tipo bem conhecido de unidade de processamento central, tal como, por exemplo, o Pentium III de Intel Corporation, ou processadores similares de Sun, Motorola, Compaq, AMD ou International Business Machi-nes. O sistema de computador 100 é um sistema de propósito geral que compreende o processador 105 e um ou mais componentes de armazena-mento de dados internos 110 para armazenar os dados, e um ou mais dis-positivos de reparação de dados para reparar os dados armazenados nos componentes de armazenamento de dados. Um técnico versado pode facil-mente apreciar que qualquer um dos sistemas de computador atualmente disponível é adequado.
Em um aspecto, o sistema de computador 100 inclui um proces-sador 105 conectado a um barramento que é conectado a uma memória principal 115 (preferivelmente implementada como RAM) e um ou mais dis-positivos de armazenamento de dados internos 110, tal como um drive de disco rígido e/ou outros meios legíveis do computador tendo os dados regis-trados nele. O sistema de computador 100 pode ainda incluir um ou mais dispositivos de reparação de dados 118 para leitura dos dados armazenados nos dispositivos de armazenamento de dados interno 110. O dispositivo de reparação de dados 118 pode representar, por exemplo, um drive de disco flexível, um drive de disco compacto, um drive de fita magnética, ou um mo-dem capaz de conexão com um sistema de armazenamento de dados à dis-tância (por exemplo, através da Internet) etc. Em algumas modalidades, o dispositivo de armazenamento de dados interno 110 é um meio legível de computador removível tal como um disco flexível, um disco compacto, uma fita magnética, etc., contendo lógica de controle e/ou dados registrados nele. O sistema de computador 100 pode vantajosamente incluir ou ser progra-mado por software apropriado para ler à lógica de controle e/ou os dados do componente de armazenamento de dados uma vez que inseridos no dispositivo de reparação de dados. O sistema de computador 100 inclui uma exibição 120 que é empregada para exibir a saída para um usuário de computador. Deve da mesma forma ser observado que o sistema de computador 100 pode estar ligado a outros sistemas de computador 125a-c em uma rede ou rede de área ampla para fornecer acesso centralizado ao sistema de computador 100. O software para acessar e processar as seqüências de aminoáci- do ou nucleotídeo da invenção pode residir na memória principal 115 durante a execução. Em alguns aspectos, o sistema de computador 100 pode também compreender um algoritmo de comparação de seqüência para comparar uma seqüência de ácido nucléico da invenção. O algoritmo e seqüên- cia(s) podem ser armazenados em um meio legível de computador. Um "algoritmo de comparação de seqüência"refere-se a um ou mais programas que são implantados (localmente ou à distância) no sistema de computador 100 para comparar uma seqüência de nucleotídeo com outras seqüências de nucleotídeo e/ou compostos armazenados em um meio de armazena-mento de dados. Por exemplo, o algoritmo de comparação de seqüência pode comparar as seqüências de nucleotídeo da invenção armazenadas em um meio legível de computador com as seqüências de referência armazena-das em um meio legível de computador para identificar as homologias ou motifs estruturais.
Os parâmetros empregados com os algoritmos acima podem ser adaptados dependendo do comprimento da seqüência e grau de homologia estudado. Em alguns aspectos, os parâmetros podem ser parâmetros default empregados pelos algoritmos na ausência de instruções do usuário. A figura 2 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo 200 para comparar uma nova seqüência de proteína ou nucleotídeo com uma base de dados das seqüências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova seqüência e as seqüências na base de dados. A base de dados das seqüências pode ser uma base de dados privado armazenado no sistema de computador 100, ou uma base de dados pública tal como GENBANK que está disponível através da Internet. O processo 200 começa em um estado de partida 201 e em seguida move-se para um estado 202 em que a nova seqüência a ser comparada é armazenada em uma memória em um sistema de computador 100. Como descrito acima, a memória pode ser qualquer tipo de memória, incluindo RAM ou um dispositivo de armazenamento interno. O processo 200 em seguida move-se para um estado 204 em que uma base de dados de seqüências é aberto para análise e comparação. O processo 200 em seguida move-se para um estado 206 em que a primeira seqüência armazenada na base de dados é lida em uma memória no computador. Uma comparação é em seguida realizada em um estado 210 para determinar se a primeira seqüência é igual à segunda seqüência. É importante observar que esta etapa não está limitada a realizar uma comparação exata entre a nova seqüência e a primeira seqüência na base de dados. Os métodos bem co-nhecidossão conhecidos por aqueles de experiência na técnica para compa-rar duas seqüências de nucleotídeo ou proteína, mesmo que elas não sejam idênticas. Por exemplo, os intervalos podem ser introduzidos em uma se- qüência a fim de aumentar o nível de homologia entre as duas seqüências testadas. Os parâmetros que controlam se os intervalos, ou outras caracte-rísticas, são introduzidos em uma seqüência durante a comparação são normalmente introduzidos pelo usuário do sistema de computador. Uma vez que uma comparação das duas seqüências tenha sido realizada no estado 210, uma determinação é feita em um estado de decisão 210 se as duas seqüências são iguais. Certamente, o termo "igual"não está limitado a se- qüências que sejam absolutamente idênticas. As seqüências que estão den-tro dos parâmetros de homologia introduzidos pelo usuário serão marcadas como "iguais" no processo 200. Se uma determinação é feita que as duas seqüências são iguais, o processo 200 move-se para um estado 214 em que o nome da seqüência da base de dados é exibido para o usuário. Este esta-do notifica o usuário, de que a seqüência com o nome exibido, completa os obstáculos de homologia que foram introduzidos. Uma vez que o nome da seqüência armazenada é exibido para o usuário, o processo 200 move-se para um estado de decisão 218 em que uma determinação é feita se mais seqüências existem na base de dados. Se mais nenhuma seqüência existe na base de dados, em seguida o processo 200 termina em um estado final 220. Entretanto, se mais seqüências existem na base de dados, em seguida o processo 200 move-se para um estado 224 em que um ponteiro é movido para a próxima seqüência na base de dados de modo que ela possa ser comparada com a nova seqüência. Deste modo, a nova seqüência é alinha-da e comparada com cada seqüência na base de dados. Deve ser observado que se uma determinação foi feita no estado de decisão 212 que as se- qüências não foram homólogas, em seguida o processo 200 se moveria imediatamente para o estado de decisão 218 a fim de determinar se qualquer outra seqüência estava disponível na base de dados para comparação. Conseqüentemente, um aspecto da invenção é um sistema de computador compreendendo um processador, um dispositivo de armazenamento de da-dos tendo armazenado nele uma seqüência de ácido nucléico da invenção e um comparador de seqüência para conduzir a comparação. O comparador de seqüência pode indicar um nível de homologia entre as seqüências com- paradas ou identificar os motifs estruturais, ou pode identificar os motifses-truturais nas seqüências que são comparadas com esses códigos de ácido nucléico e códigos de polipeptídeo. A figura 3 é um diagrama de fluxo ilus-trando uma modalidade de um processo 250 em um computador para de-terminar se duas seqüências são homólogas. O processo 250 começa em um estado de partida 252 e em seguida move-se para um estado 254 em que uma primeira seqüência a ser comparada é armazenada por uma memória. A segunda seqüência a ser comparada é em seguida armazenada por uma memória em um estado 256. O processo 250 em seguida se move para um estado 260 em que o primeiro caráter na primeira seqüência é lido e em seguida se move para um estado 262 em que o primeiro caráter da se-gundaseqüência é lido. Deve ser entendido que se a seqüência é uma se- qüência de nucleotídeo, em seguida o caráter normalmente seria A, T, C, G ou U. Se a seqüência é uma seqüência de proteína, em seguida pode ser um código de aminoácido de letra única de modo que a primeira e a segun-daseqüência possam ser facilmente comparadas. Uma determinação é em seguida feita em um estado de decisão 264 se os dois caracteres são iguais. Se eles são iguais, em seguida o processo 250 se move para um estado 268 em que os próximos caracteres na primeira e segunda seqüência são lidos. Uma determinação é em seguida feita se os próximos caracteres são iguais. Se eles são, em seguida o processo 250 continua esta volta até que dois caracteres não sejam iguais. Se uma determinação é feita que os dois pró-ximos caracteres não são iguais, o processo 250 se move para um estado de decisão 274 para determinar se há ainda mais caracteres de qualquer das duas seqüências a serem lidos. Se não houver ainda mais caracteres a serem lidos, em seguida o processo 250 se move para um estado 276 onde o nível de homologia entre a primeira e a segunda seqüência é exibido para o usuário. O nível de homologia é determinado calculando-se a proporção de caracteres entre as seqüências que foram iguais do número total de seqüên- cias na primeira seqüência. Desse modo, se cada caráter em uma primeira seqüência de nucleotídeo 100 se alinhou com cada caráter em uma segunda seqüência, o nível de homologia seria 100%.
Alternativamente, o programa de computador pode comparar uma seqüência de referência com uma seqüência da invenção para determi-nar se as seqüências diferem em uma ou mais posições. O programa pode registrar o comprimento e identidade de resíduos de aminoácido ou nucleo- tídeos inseridos, deletados ou substituídos com respeito à seqüência de re-ferência ou da invenção. O programa de computador pode ser um programa que determina se uma seqüência de referencia contém um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) com respeito a uma seqüência da invenção, ou, se uma seqüência da invenção compreende um SNP de uma seqüência conhecida. Desse modo, em alguns aspectos, o programa de computador é um programa que identifica SNPs. O método pode ser implementado pelos sistemas de computador descritos acima e o método ilustrado na figura 3. O método pode ser realizado lendo-se uma seqüência da invenção e as se- qüências de referência através do uso do programa de computador e identi-ficando-se as diferenças com o programa de computador.
Em outros aspectos o sistema com base em computador com-preende um identificador para identificar as características em um ácido nu- cléico ou polipeptídeo da invenção. Um "identificador" refere-se a um ou mais programas que identificam certas características em uma seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um identificador pode compreender um pro-grama que identifica uma estrutura de leitura aberta (ORF) em uma seqüên- cia de ácido nucléico. A figura 4 é um diagrama de fluxo ilustrando um as-pecto de um processo identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma seqüência. O processo 300 começa em um estado de partida 302 e em seguida se move para um estado 304 em que uma primeira seqüência que está para ser verificada quanto às características é armaze-nada por uma memória 115 no sistema de computador 100. O processo 300 em seguida se move para um estado 306 em que uma base de dados de características de seqüência é aberta. Uma tal base de dados incluiria uma lista de cada atributo da característica junto com o nome da característica. Por exemplo, um nome de característica pode ser "Código de Iniciação"e o atributo seria "ATG". Outro exemplo seria o nome de característica "Caixa TAATAA" e o atributo da característica seria ‘TAATAA". Um exemplo de uma tal base de dados é produzida pela Universidade de Wisconsin Genetics Computer Group. Alternativamente, as características podem ser motifs de polipeptídeo estruturais tal como hélices alfa, folhas beta, ou motifs de poli- peptídeos funcionais tal como sítios ativos enzimáticos, motifs de hélice- volta-hélice ou outros motifs conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma vez que a base de dados da característica é aberto no estado 306, o processo 300 se move para um estado 308 em que a primeira característica é lida da base de dados. Uma comparação do atributo da primeira caracte-rística com a primeira seqüência é em seguida feita em um estado 310. Uma determinação é em seguida feita em um estado de decisão 316 em que o atributo da característica foi encontrado na primeira seqüência. Se o atributo foi encontrado, em seguida o processo 300 se move para um estado 318 em que o nome da característica encontrada, é exibido para o usuário. O pro-cesso 300 em seguida se move para um estado de decisão 320 em que uma determinação é feita se as características em movimento existem na base de dados. Se nenhuma característica existe, em seguida o processo 300 termi-na em um estado final 324. Entretanto, se mais características existem na base de dados, em seguida o processo 300 ler a próxima característica de seqüência em um estado 326 e retorna para o estado 310 em que o atributo da próxima característica é comparado contra a primeira seqüência. Se o atributo da característica não é encontrado na primeira seqüência no estado de decisão 316, o processo 300 se move diretamente para o estado de deci-são 320 a fim de determinar se mais características existem na base de da-dos. Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece um programa de computador que identifica as estruturas de leitura aberta (ORFs).
Uma seqüência de polipeptídeo ou ácido nucléico da invenção pode ser armazenada e manipulada em uma variedade de programas pro-cessadores de dados em uma variedade de formatos. Por exemplo, uma seqüência pode ser armazenada como texto em um campo de processa-mento de palavra, tal como MicrosoftWORD ou WORDPERFECT ou como um campo ASCII em uma variedade de programas de base de dados famili- ares àqueles de experiência na técnica, tal como DB2, SYBASE ou ORA-CLE. Além disso, muitos programas de computador e bancos de dados po-dem ser empregados como algoritmos de comparação de seqüência, identi-ficadores ou fontes de seqüências de nucleotídeo ou seqüências de polipep- tídeo de referência a serem comparadas com a seqüência de ácido nucléico da invenção. Os programas e bancos de dados empregados para prática da invenção incluem, porém não estão limitados a: MacPattern(EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST e BLAST2 (NCBI), BLASTN e BLASTX (Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag e outros, Comp. App. Biosci. 6: 237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Ceri- us2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations In.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), a base de dados MDL Available Chemicals Directory, a base de dados MDL Drug Data Report, a base de dados Comprehensive Medicinal Chemistry, base de dados Derwent’s World Drug Index, a base de dados BioByteMasterFile, a base de dados GenBank, e a base de dados Genseqn. Muitos outros programas e bancos de dados seriam evidentes àquele de experiência na técnica, determinada a presente descrição.
Os motifs que podem ser detectados empregando os programas acima incluem seqüências de codificação de zíper de leucina, motifs de he- lix-volta-helix, sítios de glicosilação, sítios de ubiquinação, hélices alfa, e fo-lhas beta, seqüências de sinal codificando os peptídeos de sinal que direcio- nam a secreção das proteínas codificadas, seqüências envolvidas na regu-lação da transcrição tal como homeobox, estiramento ácido, sítios ativos en- zimáticos, sítios de ligação de substrato, e sítios de clivagem enzimáticos.
Hibridização de Ácidos Nucléicos
A invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes ou isolados que hibridizam sob condições rigorosas para ácido nucléico da invenção, por exemplo, uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, uma seqüên- cia como relatada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, etc., e subseqüências destes, ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção. As condições rigorosas podem ser condições altamente rigorosas, condições meio rigorosas, condições pouco rigorosas, incluindo as condições de rigorosidade reduzida e elevada descritas aqui.
Em modalidades alternativas, os ácidos nucléicos da invenção quando definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições rigorosas podem ser entre cerca de cinco resíduos e o tamanho natural do ácido nu- cléico da invenção; por exemplo, eles podem ser pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, ou mais, resíduos no comprimento. Os ácidos nucléicos mais curtos do que o tama-nho natural são da mesma forma incluídos. Esses ácidos nucléicos podem ser úteis como, por exemplo, sondas de hibridização, sondas de rotulação, sondas de oligonucleotídeo de PCR, iRNA, anti-sentido ou seqüências codi-ficando peptídeos de ligação de anticorpo (epítopos), motifs, sítios ativos e similares.
Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições que compreendem rigorosi-dade elevada de cerca de 50% de formamida em cerca de 37oC a 42oC. Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capaci-dade de hibridizar sob condições compreendendo rigorosidade reduzida em cerca de 35% a 25% de formamida em cerca de 30oC a 35oC.
Alternativamente, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições compreendendo rigorosidade elevada em 42oC em 50% de formamida, 5X de SSPE, 0,3% de SDS, e um ácido nucléico de bloqueio de seqüência repetitiva, tal como cot-1 ou DNA de esperma de salmão (por exemplo, 200 n/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado). Em um aspecto, os ácidos nucléicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições de rigorosidade reduzida compreendendo 35% de formamida em uma temperatura reduzida de 35oC.
Seguindo a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, 0,5% de SDS em 50oC. Essas condições são consideradas serem condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condição de hibri- dização "moderada"é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização de "rigoro-sidade baixa"é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de for- mamida.
A faixa de temperatura correspondendo a um nível particular de rigorosidade pode ser também reduzida calculando-se a relação de purina para pirimidina do ácido nucléico de interesse e ajustando a temperatura conseqüentemente. Os ácidos nucléicos da invenção são da mesma forma definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições de rigorosidade elevada, média e baixa como apresentado em Ausubel e Sambrook. As vari-ações nas faixas e condições acima são bem conhecidas na técnica. As condições de hibridização são descritas também, abaixo.
O procedimento acima pode ser modificado para identificar os ácidos nucléicos tendo níveis decrescentes de homologia para a seqüência de sonda. Por exemplo, para obter os ácidos nucléicos de homologia de-crescente para a sonda detectável, condições menos rigorosas podem ser empregadas. Por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser diminuída em incrementos de 5oC de 68oC para 42oC em um tampão de hibridiza- ção tendo uma concentração de Na+ de aproximadamente 1M. Seguindo a hibridização, o filtro pode ser lavado com 2X de SSC, 0,5% de SDS na tem- peratura de hibridização. Essas condições são consideradas serem condi-ções "moderadas" acima de 50oC e condições "baixas" abaixo de 50oC. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas"é quando a hibridização acima é conduzida em 55oC. Um exemplo específico de condi-ções de hibridização de "rigorosidade baixa"é quando a hibridização acima é conduzida em 45oC.
Alternativamente, a hibridização pode ser realizada em tampões, tal como 6X de SSC, contendo formamida em uma temperatura de 42oC. Neste caso, a concentração de formamida no tampão de hibridização pode ser reduzida em 5% de incrementos de 50% a 0% para identificar os clones tendo níveis decrescentes de homologia para a sonda. Seguindo a hibridiza- ção, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, 0,5% de SDS em 50oC. Essas condições são consideradas serem condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas"é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo especí-fico de condições de hibridização de "rigorosidade baixa"é quando a hibridi- zação acima é conduzida em 10% de formamida.
Entretanto, a seleção de um formato de hibridização não é crítica - é a rigorosidade das condições de lavagem que apresenta as condições que determinam se um ácido nucléico está no escopo da invenção. As con-dições de lavagem empregadas para identificar os ácidos nucléicos no es-copo da invenção incluem, por exemplo, uma concentração de sal de cerca de 0,02 molar em pH 7 e uma temperatura de pelo menos cerca de 50oC ou cerca de 55oC a cerca de 60oC; ou, uma concentração de sal de cerca de 0,15 M de NaCl em 72oC durante cerca de 15 minutos; ou uma concentração de sal de cerca de 0,2 X de SSC em uma temperatura de pelo menos cerca de 50oC ou cerca de 55oC a cerca de 60oC durante cerca de 15 a cerca de 20 minutos; ou, o complexo de hibridização é lavado duas vezes com uma solução com uma concentração de sal de cerca de 2X de SSC contendo 0,1% de SDS em temperatura ambiente durante 15 minutos e em seguida lavado duas vezes por 0,1X de SSC contendo 0,1% de SDS em 68oC duran- te 15 minutos; ou, condições equivalentes. Observe Sambrook, Tijssen e Ausubel para uma descrição de tampão de SSC e condições equivalentes.
Esses métodos podem ser empregados para isolar os ácidos nucléicos da invenção.
Sondas de Oligonucleotídeo e Métodos para Empregá-las
A invenção da mesma forma fornece as sondas de ácido nucléi- co para identificar os ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo com uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma estearase, acilase, lipase, fosfoli- pase ou atividade de protease. Em um aspecto, a sonda compreende pelo menos 10 bases consecutivas de um ácido nucléico da invenção. Alternati-vamente, uma sonda da invenção pode ser pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais, ou cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, bases consecutivas de uma seqüência como apresentado em um ácido nucléico da invenção. As sondas identificam um ácido nucléico por ligação e/ou hibridização. As sondas podem ser empregadas em disposições da invenção, observe a discussão abaixo, incluindo, por exemplo, disposi-ções capilares. As sondas da invenção podem da mesma forma ser empre-gadas para isolar outros ácidos nucléicos ou polipeptídeos.
As sondas da invenção podem ser empregadas para determinar se uma amostra biológica, tal como uma amostra de solo, contém um orga-nismo tendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção (por exemplo, um ácido nucléico codificando hidrolase ou um organismo do qual o ácido nu- cléico foi obtido. Em tais procedimentos, uma amostra biológica potencialmente acolhendo o organismo do qual o ácido nucléico foi isolado, é obtida e os ácidos nucléicos são obtidos da amostra. Os ácidos nucléicos são contatados com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para qualquer seqüência complementar presente na amostra. Onde necessário, as condições que permitem a sonda especificamente hibridi- zar para seqüências complementares, podem ser determinadas colocando- se a sonda em contato com as seqüências complementares de amostras conhecidas por conter a seqüência complementar, bem como seqüências de controle que não contêm a seqüência complementar. As condições de hibri- dização, tal como a concentração de sal do tampão de hibridização, a con-centração de formamida do tampão de hibridização, ou a temperatura de hibridização, podem ser variadas para identificar as condições que permitem a sonda hibridizar especificamente para ácidos nucléicos complementares (observe, a discussão em condições de hibridização específica).
Se a amostra contém o organismo do qual o ácido nucléico foi isolado, a hibridização específica da sonda é em seguida detectada. A hibri- dização pode ser detectada rotulando-se a sonda com um agente detectável tal como um isótopo radioativo, uma tinta fluorescente ou uma enzima capaz de catalisar a formação de um produto detectável. Muitos métodos para uso de sondas rotuladas para detectar a presença de ácidos nucléicos comple-mentares em uma amostra são familiares àqueles versados na técnica. Es-ses incluem Manchamento do Sul, Manchamento do Norte, procedimentos de hibridização de colônia, e manchas-pontos. Os protocolos para cada des-ses procedimentos são fornecidos em Ausubel e Sambrook.
Alternativamente, mais do que uma sonda (pelo menos uma da qual é capaz de especificamente hibridizar para qualquer seqüência com-plementar que esteja presente na amostra de ácido nucléico), pode ser em-pregada em uma reação de amplificação para determinar se a amostra con-tém um organismo contendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção (por exemplo, um organismo do qual o ácido nucléico foi isolado). Em um aspecto, as sondas compreendem oligonucleotídeos. Em um aspecto, a rea-ção de amplificação pode compreender reação de PCR. Os protocolos de PCR são descritos em Ausubel e Sambrook (observe a discussão em rea-ções de amplificação). Em tais procedimentos, os ácidos nucléicos na amos-trasão contatados com as sondas, a reação de amplificação é realizada, e qualquer produto de amplificação resultante é detectado. O produto de am-plificação pode ser detectado realizando-se eletroforese em gel nos produtos de reação e manchando o gel com um intercalador tal como brometo de etí- dio. Alternativamente, uma ou mais das sondas podem ser rotuladas com um isótopo radioativo e a presença de um produto de amplificação radioativo pode ser detectada por autoradiografia após a eletroforese em gel.
As sondas derivadas das seqüências próximas das terminações 3’ ou 5’ de uma seqüência de ácido nucléico da invenção podem da mesma forma ser empregadas em procedimentos de encaminhamento de cromos-soma para identificar os clones contendo adicionais, por exemplo, seqüên- cias genômicas. Tais métodos permitem o isolamento de genes que codifi-cam as proteínas adicionais de interesse do organismo hospedeiro.
Em um aspecto, as seqüências de ácido nucléico da invenção são empregadas como sondas para identificar e isolar os ácidos nucléicos relacionados. Em alguns aspectos, os ácidos nucléicos relacionados então identificados podem ser cDNAs ou DNAs genômicos de organismos exceto um do qual o ácido nucléico da invenção tenha sido primeiro isolado. Em tais procedimentos, uma amostra de ácido nucléico é contatada com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar para se- qüências relacionadas. A hibridização da sonda para ácidos nucléicos do organismo relacionado é em seguida detectada empregando qualquer dos métodos descritos acima.
Em reações de hibridização de ácido nucléico, as condições empregadas para obter um nível particular de rigorosidade variarão, depen-dendo da natureza dos ácidos nucléicos sendo hibridizados. Por exemplo, o comprimento, grau de complementariedade, composição da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, teor de GC v. AT), e tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA) das regiões de hibridização dos ácidos nucléicos po-dem ser consideradas na seleção das condições de hibridização. Uma con-sideração adicional é se um dos ácidos nucléicos é imobilizado, por exem-plo, em um filtro. A hibridização pode ser realizada sob condições de rigoro-sidade baixa, rigorosidade moderada ou rigorosidade elevada. Como um exemplo de hibridização de ácido nucléico, uma membrana de polímero con-tendo os ácidos nucléicos desnaturados imobilizados é primeiro pré- hibridizada durante 30 minutos em 45oC em uma solução consistindo em 0,9 M de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, pH 7,0, 5,0 mM de Na2EDTA, 0,5% de SDS, 10X de Denhardt’s, e 0,5 mg/ml de ácido poliriboadenílico. Aproxima- damente 2X de 107 cpm (atividade específica 4-9X de 108 cpm/ ug) de son-da de oligonucleotídeo rotulada por 32P final são em seguida adicionados à solução. Após 12-16 horas de incubação, a membrana é lavada durante 30 minutos em temperatura ambiente (RT) em 1X de SET (150 mM de NaCl, 20 mM de Tris cloridrato, pH 7,8, 1 mM de Na2EDTA) contendo 0,5% de SDS, seguido por uma lavagem de 30 minutos em 1X de SET fresco em Tm-10oC para a sonda de oligonucleotídeo. A membrana é em seguida exposta à pe-lícula auto-radiográfica para detecção de sinais de hibridização.
Variando-se a rigorosidade das condições de hibridização em-pregadas para identificar os ácidos nucléicos, tal como cDNAs ou DNAs ge- nômicos, que hibridizam para a sonda detectável, os ácidos nucléicos tendo níveis diferentes de homologia para a sonda podem ser identificados e isola-dos. A rigorosidade pode ser variada conduzindo-se a hibridização em tem-peraturas variantes abaixo das temperaturas de fusão das sondas. A tempe-ratura de fusão, Tm, é a temperatura (sob pH e força iônica definida) na qual 50% da seqüência alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente complemen-tar. As condições muito rigorosas são selecionadas para serem iguais ou cerca de 5oC mais baixo do que a Tm para uma sonda particular. A tempera-tura de fusão da sonda pode ser calculada empregando as seguintes fórmu-las exemplares. Para sondas entre 14 e 70 nucleotídeos em comprimento a temperatura de fusão (Tm) é calculada empregando a fórmula: Tm= 81,5 + 16,6 (log [Na+]) + 0,41 (fração G+C)- (600/N) onde N é o comprimento da sonda. Se a hibridização é realizada em uma solução contendo formamida, a temperatura de fusão pode ser calculada empregando a equação: Tm = 81,5 + 16,6 (log [Na+]) + 0,41 (fração G+C)-(0,63% de formamida)-(600/N) onde N é o comprimento da sonda. A pré-hibridização pode ser realizada em 6X de SSC, 5X de reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 μg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado ou 6X de SSC, 5X de reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 μg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, 50% de formamida. As fórmulas para SSC e Denhardt e outras soluções estão listadas, por exemplo, em Sambrook.
Em um aspecto, a hibridização é conduzida adicionando-se a sonda detectável às soluções de pré-hibridização listadas acima. Onde a sonda compreende DNA de filamento duplo, ela é desnaturada antes da adição à solução de hibridização. O filtro é contatado com a solução de hibridi- zação durante um período suficiente de tempo para permitir a sonda hibridi- zar para cDNAs ou DNAs genômicos contendo seqüências complementares a esta ou homólogas a ela. Para sondas em 200 nucleotídeos em comprimento, a hibridização pode ser realizada em 15-25oC abaixo da Tm. Para sondas mais curtas, tal como sondas de oligonucleotídeo, a hibridização pode ser conduzida em 5-10oC abaixo da Tm. Em um aspecto, as hibridizações em 6X de SSC são conduzidas em aproximadamente 68oC. Em um aspecto, as hibridizações em 50% de formamida contendo soluções são conduzidas em aproximadamente 42oC. Todas as hibridizações anteriores seriam consideradas estarem sob condições de alta rigorosidade.
Em um aspecto, seguindo a hibridização, o filtro é lavado para remover qualquer sonda detectável não especificamente ligada. A rigorosi-dade empregada para lavar os filtros pode da mesma forma ser variada de-pendendo da natureza dos ácidos nucléicos sendo hibridizado, do compri-mento dos ácidos nucléicos sendo hibridizados, do grau de complementarie- dade, da composição da seqüência de nucleotídeo (por exemplo, teor de GC v. AT), e do tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA). Os exemplos de lavagens de condição de rigorosidade progressivamente mais elevada são como segue: 2X de SSC, 0,1% de SDS em temperatura ambiente du-rante 15 minutos (rigorosidade baixa); 0,1X de SSC, 0,5% de SDS em tem-peratura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (rigorosidade moderada); 0,1X de SSC, 0,5% de SDS durante 15 a 30 minutos entre a temperatura de hibridização e 68oC (rigorosidade elevada); e 0,15M de NaCl durante 15 mi-nutos em 72oC (rigorosidade muito elevada). Uma lavagem de rigorosidade baixa final pode ser conduzida em 0,1X de SSC em temperatura ambiente. Os exemplos acima são meramente ilustrativos de um grupo de condições que possa ser empregado para lavar os filtros. Alguém de experiência na técnica saberia que existem numerosas receitas para diferentes lavagens rigorosas.
Os ácidos nucléicos que têm hibridizado para a sonda podem ser identificados por autoradiografia ou outras técnicas conhecidas. O pro-cedimento acima pode ser modificado para identificar os ácidos nucléicos tendo níveis decrescentes de homologia para a seqüência de sonda. Por exemplo, para obter os ácidos nucléicos de homologia decrescente para a sonda detectável, condições menos rigorosas podem ser empregadas. Por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser diminuída em incrementos de 5oC de 86oC a 42oC em um tampão de hibridização tendo uma concen-tração de Na+ de aproximadamente 1M. Seguindo a hibridização, o filtro po-de ser lavado com 2X de SSC, 0,5% de SDS em temperatura de hibridiza- ção. Essas condições são consideradas serem condições "moderadas"acima de 50oC e condições "baixas" abaixo de 50oC.
Um exemplo de condições de hibridização "moderada"é quando a hibridização acima é conduzida em 55oC. Um exemplo de condições de hibridização de "rigorosidade baixa"é quando a hibridização acima é condu-zida em 45oC.
Alternativamente, a hibridização pode ser realizada em tampões, tal como 6X de SSC, contendo formamida em uma temperatura de 42oC. Neste caso, a concentração de formamida no tampão de hibridização pode ser reduzida em 5% de incrementos de 50% a 0% para identificar os clones tendo níveis decrescentes de homologia para a sonda. Seguindo a hibridiza- ção, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, 0,5% de SDS em 50oC. Essas condições são consideradas serem condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderada"é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo especí-fico de condições de hibridização de "rigorosidade baixa"é quando a hibridi- zação acima é conduzida em 10% de formamida.
Essas sondas e métodos da invenção podem ser empregados para isolar, ou identificar (por exemplo, empregando uma disposição), ácidos nucléicos tendo uma seqüência com pelo menos cerca de 950%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,61%, 62%,63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade de se- qüência para uma seqüência de ácido nucléico da invenção compreendendo pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, ou mais bases consecutivas deste, e as seqüências complementares neles. Homologia pode ser medida empregando um algoritmo de alinhamento, como descrito aqui. Por exemplo, os polinucleotídeos homólogos podem ter uma seqüência de codificação que é uma variante alélica de ocorrência natural de uma das seqüências de codificação descritas aqui. Tais variantes alélicas podem ter uma substituição, deleção ou adição de um ou mais nu- cleotídeos quando comparados com um ácido nucléico da invenção.
Adicionalmente, as sondas e métodos da invenção podem ser empregados para isolar ou identificar (por exemplo, empregando uma dispo-sição), ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de seqüência (homologia) para um polipeptídeo da invenção compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 ou mais aminoácidos consecutivos destes, como determinado empregando um algoritmo de alinhamento de seqüência, por exemplo, tal como o algoritmo FASTA versão 3.0t78 com os parâmetros default, ou um programa BLAST 2.2.2 com ajustes exemplares como apresentado aqui.
Expressão de Inibição de Hidrolase
A invenção também fornece para ácidos nucléicos complemen-tares para (por exemplo, seqüências de antisentido) as seqüências de ácido nucléico da invenção, por exemplo, seqüências codificando hidrolase. As se- qüências de anti-sentido são capazes de inibir o transporte, união ou transcrição de genes codificando hidrolase. A inibição pode ser efetuada através do alvejamento do DNA genômico ou RNA mensageiro. A inibição pode ser executada empregando DNA, por exemplo, uma ribozima inibitória, ou um RNA, por exemplo, um iRNA de filamento duplo, compreendendo a seqüên- cia da invenção. A transcrição ou função de ácido nucléico alvejado pode ser inibida, por exemplo, por hibridização ou clivagem. A invenção fornece um grupo de inibidores compreendendo oligonucleotídeos que são capazes ou de ligar o gene de hidrolase e/ou mensagem, no caso de prevenir ou inibir a produção ou função de hidrolase. A associação pode ser através da hibridi- zação específica de seqüência. Outra classe útil de inibidores inclui os oligo- nucleotídeos que causam a inativação ou clivagem da mensagem de hidro- lase. O oligonucleotídeo pode ter atividade de enzima que causa tal clivagem, tal como ribozimas. O oligonucleotídeo pode ser quimicamente modificado ou conjugado para uma enzima ou composição capaz de clivar o ácido nucléico complementar. Alguém pode avaliar um lago de muitos diferentes tais oligonucleotídeos quanto aqueles com a atividade desejada.
Oligonucleotídeos de Anti-Sentido
A invenção fornece os oligonucleotídeos de anti-sentido capazes de ligar a mensagem de hidrolase que pode inibir a atividade de hidrolase alvejando-se mRNA ou DNA genômico. As estratégias para designar os oli- gonucleotídeos de anti-sentido são bem descritas na literatura de patente e científica, e o técnico versado pode designar tais oligonucleotídeos de hidro- lase empregando os novos reagentes da invenção. Por exemplo, os protocolos de mapeamento de RNA/encaminhamento de gene para avaliar quanto aos oligonucleotídeos de anti-sentido eficazes são bem conhecidos na técnica, observe, por exemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314: 168-183, descrevendo um ensaio de mapeamento de RNA, que é com base nas técnicas moleculares padrão para fornecer um método fácil e legível para seleção de seqüência de anti-sentido potente. Observe também Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191-198.
Em um aspecto, os ácidos nucléicos de ocorrência natural isola-dos ou recombinantemente gerados são empregados como oligonucleotí- deos de anti-sentido. Os oligonucleotídeos de anti-sentido podem ser de qualquer comprimento; por exemplo, em aspectos alternativos, os oligonu- cleotídeos de anti-sentido são entre cerca de 5 a 100, cerca de 10 a 80, cerca de 15 a 60, cerca de 18 a 40. Os oligonucleotídeos de anti-sentido podem ser DNA ou RNA de filamento duplo ou filamento simples. O comprimento ideal pode ser determinado por avaliação de rotina. Os oligonucleotídeos de anti-sentido podem estar presentes em qualquer concentração. A concentração ideal pode ser determinada por avaliação de rotina. Uma ampla variedade de análogos de ácido nucléico e nucleotídeo não de ocorrência natural, sintéticos, é conhecida os quais podem direcionar este problema potencial. Por exemplo, os ácidos nucléicos de peptídeo (PNAs) contendo cadeias principais não iônicas, tal como as unidades de glicina de N-(2-aminoetil), podem ser empregadas. Os oligonucleotídeos de anti-sentido tendo ligações de fosforotioato podem da mesma forma ser empregados, como descrito em WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144: 189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Os oligonucleotídeos de anti-sentido tendo análogos de cadeia princi-pal de DNA sintético fornecidos pela invenção podem da mesma forma incluirfósforo-ditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alquila, sulfamato, 3’-tioacetal, metileno(metilimino), 3’-N-carbamato, e ácidos nucléicos de carbamato morfolino, como descrito acima.
A metodologia química combinatória pode ser empregada para criar vastos números de oligonucleotídeos que possam ser rapidamente ava-liados quanto aos oligonucleotídeos específicos que têm especificidades e afinidades de ligação apropriadas e voltadas a qualquer alvo, tal como as seqüências de hidrolase de sentido e anti-sentido da invenção (observe, por exemplo, Gold (1995) J. de Biol. Chem. 270: 13581-13584).
Ribozimas Inibidoras
A invenção fornece ribozimas capazes de ligar a mensagem de hidrolase que podem inibir atividade de hidrolase alvejando-se mRNA. As estratégias para designar as ribozimas e selecionar a seqüência de anti- sentido específica de hidrolase para alvejamento são bem descritas na litera-tura de patente e científica, e o técnico versado pode designar tais ribozimas empregando os novos reagentes da invenção. As ribozimas atuam se ligan-do a um RNA alvo através da porção de ligação de RBA alvo de uma ribozi- ma que é mantida em proximidade imediata a uma porção enzimática do RNA que cliva o RNA alvo. Desse modo, a ribozima reconhece e se liga a um RNA alvo através de pareamento de bases complementares, e uma vez ligada ao sítio correto, atua enzimaticamente para clivar e inativar o RNA alvo. A clivagem de um RNA alvo de uma tal maneira destruirá sua capaci-dade de direcionar a síntese de uma proteína codificada se a clivagem ocor-rer na seqüência de codificação. Após uma ribozima ter se ligado e clivado seu RNA alvo, ela é tipicamente liberada daquele RNA e desse modo pode ligar e clivar novos alvos repetidamente.
Em algumas circunstâncias, a natureza enzimática de uma ribo- zima pode ser vantajosa sobre outras tecnologias, tal como tecnologia de anti-sentido (onde uma molécula de ácido nucléico simplesmente se liga a um ácido nucléico alvo para bloquear sua transcrição, translação ou associ-ação com outra molécula) quando a concentração eficaz de ribozima neces-sária para efetuar um tratamento terapêutico pode ser menor do que aquela de um oligonucleotídeo de anti-sentido. Esta vantagem potencial reflete a capacidade da ribozima atuar enzimaticamente. Desse modo, uma única molécula de ribozima é capaz de clivar muitas moléculas de RNA alvo. Além disso, uma ribozima é tipicamente um inibidor altamente específico, com a especificidade de inibição dependendo não somente do mecanismo de pa- reamento de base de ligação, porém da mesma forma do mecanismo pelo qual a molécula inibe a expressão do RNA ao qual ele se liga. Isto é, a inibi-ção é causada pela clivagem do RNA alvo e então a especificidade é defini-da como a relação da taxa de clivagem do RNA alvo sobre a taxa de cliva-gem do RNA não alvo. Este mecanismo de clivagem é dependente de fato-res adicionais àqueles envolvidos no pareamento de base. Desse modo, a especificidade de ação de uma ribozima pode ser maior do que aquela do oligonucleotídeo de anti-sentido ligando o mesmo sítio de RNA.
A molécula de RNA de ribozima enzimática, pode ser formado em um motifcabeça de martelo, porém da mesma forma pode ser formada no motif de um grampo de cabelo, vírus da hepatite delta, íntron de grupo I ou um RNA tipo RnaseP (em associação com uma seqüência guia de RNA). Os exemplos de tais motifscabeça de martelo são descritos por Rossi (1992) Aids Research and Human Retriviruses 8: 183; motifs grampo de cabelo por Hampel (1989) Biochemistry 28: 4929, e Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18: 299; o motif do vírus da hepatite delta por Perrota (1992) Biochemistry 31: 16; o motif RNaseP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35: 849; e o íntron do Grupo I por Cech Patente dos Estados Unidos N° 4.987.071. A recitação desses motifsespecíficos não é pretendida ser limitante; Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma molécula de RNA enzimática desta invenção tem um sítio de ligação de substrato específico complementar a uma ou mais das regiões de RNA de gene alvo e tem seqüência de nucleotídeo dentro ou nos arredores daquele sítio de ligação de substrato que transmite uma atividade de clivagem de RNA para a molécula.
Interferência de RNA (RNAi)
Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula inibidora de RNA, uma então chamada molécula de "RNAi", compreendendo uma se- qüência de hidrolase da invenção. A molécula de RNAi compreende uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA). O RNAi pode inibir a expres-são de um gene de hidrolase. Em um aspecto, o RNAi é cerca de 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos dúplex em compri-mento. Ao mesmo tempo em que não está limitado por qualquer mecanismo particular de ação, o RNAi pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de filamento único (ssRNA) de seqüências idênticas ou simi-lares, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta a RNA de filamento duplo (dsRNA), o mRNA do gene homólogo é seletivamente de-gradado por um processo chamado interferência de RNA (RNAi). Um meca-nismo básico possível além do RNAi é a quebra de um RNA de filamento duplo (dsRNA) em comparação com uma seqüência de gene específico em pedaços pequenos chamado RNA de interferência pequena, que ativa a de-gradação de mRNA que compara sua seqüência. Em um aspecto, os RNAi’s da invenção são empregados em terapêuticos de silenciamento de gene, observe, por exemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7: 1040-1046. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para seletivamente degradar o RNA empregando os RNAi’s da invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAi da invenção podem ser empregadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos para preparar e empregar as moléculas de RNAi para seletivamente degradar o RNA são bem conhe-cidas na técnica, observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.
Modificação dos Ácidos Nucléicos
A invenção fornece métodos de geração de variantes dos ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, aqueles codificando uma hidrolase ou um anticorpo da invenção. Esses métodos podem ser repetidos ou empre-gados em várias combinações para gerar hidrolase ou anticorpos tendo uma atividade alterada ou diferente ou uma estabilidade alterada ou diferente da-quela de uma hidrolase ou anti-copo codificada pelo ácido nucléico modelo. Esses métodos da mesma forma podem ser repetidos ou empregados em várias combinações, por exemplo, para gerar variações em expressão de gene/ mensagem, translação de mensagem ou estabilidade de mensagem. Em outro aspecto, a composição genética de uma célula é alterada, por exemplo, por modificação de um gene homólogo ex vivo, seguido por sua re- inserção dentro da célula.
Um ácido nucléico da invenção pode ser alterado por qualquer meio. Por exemplo, os métodos estocásticos ou aleatórios, ou, não estocás- ticos, ou métodos de "evolução direcionada", observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 6.361.974. Os métodos para a mutação aleatória de genes são bem conhecidos na técnica, observe Patente dos Estados Unidos n° 5.830.696. Por exemplo, as mutagêneses podem ser empregadas para aleatoriamente mutar um gene. A mutagênese inclui, por exemplo, luz ultra-violeta ou radiação gama ou um mutágeno químico, por exemplo, mitomici- na, ácido nitroso, psoralenos fotoativados, sozinhos ou em combinação, para induzir quebras de DNA receptivo para reparo por recombinação. Outros mutágenos químicos incluem, por exemplo, bissulfito de sódio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina ou ácido fórmico. Outros mutágenos são análogos de precursores de nucleotídeo, por exemplo, nitrosoguanidina, 5-bromoura- cil, 2-aminopurina ou acridina. Esses agentes podem ser adicionados a uma reação de PCR no lugar do precursor de nucleotídeo por meio do qual mu- tando a seqüência. Os agentes alternantes tal como, proflavina, acriflavina, quinacrina e similares podem da mesma forma ser empregados.
Qualquer técnica na biologia molecular pode ser empregada, por exemplo, mutagênese de PCR aleatório, observe, por exemplo, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5467-5471; ou, mutagênese de cassete múl-tiplocombinatório, observe, por exemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18: 194-196. Alternativamente, os ácidos nucléicos, por exemplo, genes, podem ser remontados depois da fragmentação "estocástica"ou aleatória, observe, por exemplo, As Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.291.242, 6.287.862, 6.287.861, 5.955.358, 5.830.721, 5.824.514, 5.811.238, 5.605.793. Em as-pectos alternativos, as modificações, adições ou deleções são introduzidas por PCR propenso a erro, embaralhamento, mutagênese direcionada ao oli- gonucleotídeo, PCR por agrupamento, mutagênese de PCR sexual, muta- gênese in vivo, mutagênese de cassete, mutagênese de conjunto recursivo, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese de sítio específico, rea- grupamento de gene, mutagênese saturada de sítio de gene (GSSM), rea- grupamento de ligação sintética (SLR), recombinação, recombinação de se- qüência recursiva, mutagênese de DNA modificado por fosfotioato, mutagê- nese modelo contendo uracila, mutagênese dúplex aberta, mutagênese de reparo mal combinado de ponto, mutagênese de cepa de hospedeiro de re-paro deficiente, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de seleção por restrição, mutagênese de purifica-ção por restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de multímero de ácido nucléico quimérico, e/ou uma combinação desses e outros métodos.
As seguintes publicações descrevem uma variedade de métodos e/ou procedimentos de recombinação recursiva que podem ser incorporados nos métodos da invenção: Stemmer (1999) "Molecular Breeding of viruses for targeting and other clinical properties" (Tumor Targeting 4: 1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17: 893-896; Chang (1990) "Evolution of a cy-tokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17: 793-797;
Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3: 284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17: 259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391: 288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA Shuffling" Nature Biotechnology 15: 436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Pattern e outros, (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines "Current Opnion in Biotechnology 8: 724-733; Crameri e outros (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2: 100-103; Gates e outros (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide librarie through display on a lac repressor ‘headpiece dimer’ "Journal of Molecular Biology 255: 373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York, pp. 447-457; Cramer e Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18: 194-195; Stemmer e outros (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides "Gene, 164: 49-53; Stemmer (1995) "The Evolu-tion of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Search-ing Sequence Space" Bio/Technology 13: 549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370: 389-391; e Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.
Os métodos mutacionais de geração de diversidade incluem, por exemplo, mutagênese de sítio direcionado (Ling e outros (1997) "Approa-ches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem 254(2): 157-178; Dale e outros (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the fos- forothionate method" Methods Mol. Biol. 57: 369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Ver. Genet. 19: 423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229: 11931201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237: 1-7; e Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" em Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. e Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagênese empregando modelos contendo ura- cila (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel e out-ros (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; e Bass e outros (1988) "Mu-tante Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242: 240-245); mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vec-tors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100: 468-500; e Zoller & Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonu-cleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154: 329-350); mutagênese de DNA modificado por fosforotiotato (Taylor e outros (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction en-zyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor e outros (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mu-tations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Say ers e outros (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonu- cleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16: 791-802; e Sayers e out-ros (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonuclease in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagênese empregando DNA dúplex aberto (Kramer e outros, (1984) "The gapped dúplex DNA approach to oligonucleo- tide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA" 154: 350-367; Kramer e outros (1988) "Improve enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; e Fritz e outros (1988) "Oligonucleotide-directed construction of muta-tions: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).
Os protocolos adicionais empregados nos métodos da invenção incluem reparos mal combinados pontuais (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38: 879-887), mutagênese empregando cepas hospedeiras defi-ciente reparo (Carter e outos, (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; e Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagênese de deleção (Eghtedarza- deh (1986) "Use of oligonucleotides to generate larges deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), restrição-seleção e seleção-restrição e restrição-purificação (Wells e outros (1986) "Importance of hidrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagênese por síntese de gene total (Nambiar e outros (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar e Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide- binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells e outros (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene: 34: 315-323; e Grundstron e outros (1985)
"Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene syn-thesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparo de quebra de filamento du-plo (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual envi-ronments" Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455. "Oligonucleotide- directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181). Os detalhes adicionais em muitos dos métodos acima podem ser encontrados em Methods in Enzymology Volume 154, que também descrevem controles úteis para problemas de ativação difícil com vários métodos de mutagênese.
Os protocolos empregados nos métodos da invenção incluem aqueles discutidos na Patente dos Estados Unidos N° 5.605.793 por Stem- mer (25 de fevereiro, de 1997), "Methods for In Vitro Recombination;"Patente dos Estados Unidos n° 5.811.238 por Stemmer e outros (22 de Setembro de 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characte-ristics by Iterative Selection and Recombination;" Patente dos Estados Uni-dos n° 5.830.721 por Stemmer e outros (3 de novembro de 1998), "DNA Mu-tagenesis bya Random Fragmentation and Reassembly;" Patente dos Esta-dos Unidos N° 5.834.252 por Stemmer, e outros (10 de novembro de 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction;" Patente dos Estados Unidos n° 5.837.458 por Minshull, e outros (17 de novembro, de 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" WO 95/22625, Stem- mer e Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" WO 96/33207 por Stemmer e Lipschutz "End Complementary polymerase Chain Reaction;" WO 97/20078 por Stemmer e Crameri "Methods for Gene-rating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" WO 97/35966 por Minshull e Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" WO 99/41402 por Punnonen e outros "Targeting of Genetic Vaccine Vectors;" WO 99/41383 por Punnonen e outros "Antigen Library Immunization;" WO 99/41369 por Punnonen e outros "Genetic Vaccine Vector Engineering;" WO 99/41368 por Punnonen e outros "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines;" EP 752008 por Stemmer e Crameri, "DNA Mutagenesis by Ran dom Fragmentation and Reassembly;" EP 0932670 por Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;". WO 99/23107 por Stemmer e outros, "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;" WO 99/21979 por Apt e outros, "Human Papillomavirus Vectors;" WO 98/31837 por del Cardayre e outros "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination;" WO 98/27230 por Patten e Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering;" WO 98/27230 por Stemmer e outros, "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection", WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries", WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences", WO 98/42832 por Arnold e outros, "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random ou Defined Primers", WO 99/29902 por Arnold e outros, "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences", WO 98/41653 por Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library", WO 98/41622 por Borchert e outros, "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling", e WO 98/42727 por Pati e Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination".
Os protocolos que podem ser empregado para praticar a inven-ção (fornecer detalhes quanto as várias diversidades de métodos de gera-ção) são descritos, por exemplo, na Pedido de Patente dos Estados Unidos N° serial. (USSN) 09/407.800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" por Patten e outros depositado em 28 de Setembro, 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" por del Cardayre e outros, Patente dos Estados Unidos N° 6.379.964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOM-BINATION" por Crameri e outros, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.319.714; 6.368.861; 6.376.246; 6.423.542; 6.426.224 e PCT/US00/01203; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" por Welch e outros, Patente dos Estados Unidos N° 6.436.675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTE RISTICS" por Selifonov e outros, depositado em 18 de Janeiro, 2000, (PCT/US00/01202) e, por exemplo, "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov e outros, depositado em 18 de Julho de 2000 (U.S. No. Ser. 09/618.579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" por Selifonov e Stemmer, depositado em 18 de Janeiro, 2000 (PCT/US00/01138); e "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE- MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLA-TION" por Affholter, depositado em 6 de Setembro, 2000 (U.S. No. Ser. 09/656.549); e Patente dos Estados Unidos Nos. 6.177.263, 6.153.410.
Os métodos de "evolução direcionada" ou não estocástica, por exemplo, mutagênese de saturação (GSSM), reagrupamento de ligação sin-tética (SLR), ou uma combinação destes são empregados para modificar os ácidos nucléico da invenção para gerar hidrolases com propriedades novas ou alteradas (por exemplo, atividade sob condições altamente acídicas ou alcalinas, altas temperaturas, e similares). Os polipeptídeos codificados pe-losácidos nucléico modificados podem ser avaliados quanto a uma atividade antes de testar quanto a proteolítica ou outra atividade. Qualquer protocolo ou modalidade de teste pode ser empregado, por exemplo, empregando-se uma plataforma de disposição capilar. Veja, por exemplo, Patentes dos Es-tados Unidos Nos. 6.361.974; 6.280.926; 5.939.250.
Mutagênese por saturação, ou, GSSM
Em um aspecto da invenção, modificação de gene não estocás- tico, um "processo de evolução direcionada", é empregada para gerar hidro- lase e anticorpos com propriedades novas e alteradas. As variações deste método foram denominadas "mutagênese por saturação de sítio de gene", mutagênese por saturação de sítio", "mutagênese por saturação" ou sim-plesmente "GSSM". Elas podem ser empregadas em combinação com outros processos de mutagenização. Observe, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.171.820; 6.238.884. Em um aspecto, GSSM compreende fornecer um polinucleotídeo padrão e uma pluralidade de oligonucleotí- deos, em que cada oligonucleotídeo compreende uma seqüência heteróloga ao polinucleotídeo padrão, desse modo alvejando uma seqüência específica do polinucleotídeo padrão e a seqüência que é uma variante do gene homó-logo; gerando polinucleotídeos de descendência compreendendo variações de seqüência não estocástica replicando-se os polinucleotídeos padrões com os oligonucleotídeos, desse modo gerando polinucleotídeos compreen-dendovariações de seqüência de gene homóloga.
Em um aspecto, os iniciadores de códon contendo uma seqüên- cia N,N,G/T são empregados para introduzir mutações pontuais em um poli- nucleotídeo, a fim de gerar um grupo de polipeptídeos de descendência em que uma faixa completa de substituições de aminoácido simples está repre-sentada em cada posição de aminoácido, por exemplo, um resíduo de ami- noácido em um sítio ativo de enzima ou sítio de ligação de ligando alvejado a ser modificado. Estes oligonucleotídeos podem compreender uma primeira seqüência homóloga contígua, uma seqüência N,N,G/T degenerada, e, op-cionalmente, uma segunda seqüência homóloga. Os produtos translacionais de descendência a jusante do uso de tais oligonucleotídeos incluem todas as alterações de aminoácido possíveis em cada sítio de aminoácido ao longo do polipeptídeo, porque a degeneração da seqüência N,N,G/T inclui códons para todos os 20 aminoácidos. Em um aspecto, um tal oligonucleotídeo degenerado (compreendido de, por exemplo, um cassete de N,NG/T degenerado)é empregado para submeter cada códon original em um padrão de polinucleotídeo parental a uma faixa completa de substituições de códon. Em outro aspecto, pelo menos dois cassetes degenerados são empregados - no mesmo oligonucleotídeo ou não, para submeter pelo menos dois códons originais em um padrão de polinucleotídeo parental a uma faixa completa de substituições de códon. Por exemplo, mais do que uma seqüência N,N,G/T pode estar contida em um oligonucleotídeo para introduzir mutações de ami- noácido em mais do que um sítio. Esta pluralidade de seqüências N,N,G/T pode ser diretamente contígua, ou separada por uma ou mais seqüências de nucleotídeo mais adicionais. Em outro aspecto, os oligonucleotídeos úteis para introduzir adições e deleções podem ser empregados sozinhos ou em combinação com os códons contendo uma seqüência N,N,G/T, para introdu-zir qualquer combinação ou permutação de substituições, deleções e/ou adi-ções de aminoácido.
Em um aspecto, a mutagênese simultânea de duas ou mais po-sições de aminoácido contíguas é feita empregando-se um oligonucleotídeo que contém tripletos N,N,G/T contíguos, isto é, uma seqüência (N,N,G/T)n degenerada. Em outro aspecto, os cassetes degenerados tendo menos de-generaçãodo que a seqüência N,N,G/T são empregados. Por exemplo, pode ser desejável em alguns exemplos empregar (por exemplo, em um oligo- nucleotídeo) uma seqüência de tripleto degenerada compreendida de ape-nas um N onde o referido N pode estar na primeira, segunda ou terceira po-sição do tripleto. Quaisquer outras base incluindo quaisquer combinações e permutações destas podem ser empregadas nas duas posições resultantes do tripleto. Alternativamente, pode ser desejável em alguns exemplos em-pregar (por exemplo, em um oligo) uma seqüência de tripleto N,N,N.
Em um aspecto, o uso de tripletos degenerados (por exemplo, tripletos N,N,G/T) permite a geração sistemática e fácil de uma faixa completa de possíveis aminoácidos naturais (para um total de 20 aminoácidos) em cada e toda posição de aminoácido em um polipeptídeo (em aspectos alter-nativos, os métodos da mesma forma incluem geração de menos do que todas as possíveis substituições por resíduo de aminoácido, ou códon, posi-ção). Por exemplo, para um polipeptídeo de 100 aminoácidos, 2000 espécies distintas (isto é, 20 possíveis aminoácidos por posição X 100 posições de aminoácido) podem ser geradas. Pelo uso de um oligonucleotídeo ou grupo de oligonucleotídeos contendo um tripleto N,N,G/T degenerado, 32 seqüências individuais podem codificar para todos os 20 possíveis aminoá- cidos naturais. Desta maneira, em um vaso de reação no qual uma seqüên- cia de polinucleotídeo parental é submetida a mutagênese por saturação empregando-se pelo menos um tal oligonucleotídeo são gerados 32 polinu- cleotídeos de descendência distintos codificando 20 polipeptídeos distintos. Em contraste, o uso de um oligonucleotídeo não degenerado em mutagêne- se direcionada ao sítio leva a apenas um produto de polipeptídeo de des- cendência por vaso de reação. Os oligonucleotídeos não degenerados po-dem opcionalmente ser empregados em combinação com iniciadores dege-nerados descritos: por exemplo, oligonucleotídeos não degenerados podem ser empregados para gerar mutações pontuais específicas em um polinucle- otídeo de trabalho. Isto fornece um meio para gerar mutações pontuais si-lenciosasespecíficas, mutações pontuais levando a alterações de aminoáci- do correspondentes, e mutações pontuais que causam a geração de códons de interrupção e a expressão correspondente de fragmentos de polipeptídeo.
Em um aspecto, cada vaso de reação de mutagênese por satu-ração contém polinucleotídeos codificando pelo menos 20 moléculas de po- lipeptídeo de descendência (por exemplo, hidrolases, por exemplo, estera-ses, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases) tal que todos os 20 amino- ácidos naturais são representados em uma posição de aminoácido específi-ca correspondente à posição de códon mutageneizada no polinucleotídeo parental (outros aspectos usam menos do que todas as 20 combinações naturais). Os polipeptídeos de descendência degenerados 32 vezes gerados a partir de cada vaso de reação de mutagênese por saturação podem ser submetidos a amplificação clonal (por exemplo, clonado em um hospedeiro adequado, por exemplo, hospedeiro de E. coli, empregando-se, por exemplo, um vetor de expressão) e submetidos avaliação de expressão. Quando um polipeptídeo de descendência individual é identificado por avaliação para exibir uma alteração favorável na propriedade (quando comparado ao poli- peptídeo parental, tal como atividade proteolítica aumentada sob condições alcalinas ou acídicas), ele pode ser seqüenciado para identificar a substitui-ção de aminoácido correspondentemente favorável contida nesse.
Em um aspecto, na mutagenização cada e toda posição de ami- noácido em um polipeptídeo parental empregando mutagênese por satura-ção como aqui descrito, alterações de aminoácido favoráveis podem ser identificadas em mais do que uma posição de aminoácido. Uma ou mais mo-léculas de descendência novas podem ser geradas, as quais contém uma combinação de todas ou parte destas substituições de aminoácido favorá-veis. Por exemplo, se 2 alterações de aminoácido favoráveis específicas são identificadas em cada uma das 3 posições de aminoácido em um polipeptí- deo, as permutações incluem 3 possibilidades a cada posição (nenhuma alteração do aminoácido original, e cada uma das duas mudanças favorá-veis) e 3 posições. Desta maneira, existem 3 x 3 x 3 ou 27 possibilidades totais, incluindo 7 que foram previamente examinadas - 6 mutações pontuais simples (isto é, em cada uma das três posições) e nenhuma alteração em qualquer posição.
Em outro aspecto, mutagênese por saturação de sítio pode ser empregada junto com outros meios estocásticos ou não estocásticos para variar a seqüência, por exemplo, reagrupamento de ligação sintética (veja abaixo), embaralhamento, quimerização, recombinação e outros processos de mutagenização e agentes de mutagenização. Esta invenção fornece o uso de qualquer(quaisquer) processo(s) de mutagenização, incluindo muta- gênese por saturação, de uma maneira iterativa.
Reagrupamento de Ligação Sintético (SLR)
A invenção fornece um sistema de modificação de gene não es- tocástico denominado "reagrupamento de ligação sintética", ou simplesmen-te"SLR", um "processo de evolução direta," para gerar hidrolases ou anti-corpos com propriedades novas ou alteradas. SLR é um método de ligar fra-gmentos de oligonucleotídeo juntos não estocasticamente. Este método dife-re-se do embaralhamento de oligonucleotídeo estocástico em que os blocos de construção de ácido nucléico não são embaralhados, concatenados ou quimerizados aleatoriamente, porém de preferência são reagrupados não estocasticamente. Observe, por exemplo, Pedido de Patente dos Estados Unidos N° Serial (USSN) 09/332.835 intitulado "Synthetic Ligation Reassem-bly in Directed Evolution" e depositado em 14 de Junho de 1999 ("USSN 09/332.835"). Em um aspecto, SLR compreende as seguintes etapas: (a) fornecer um polipeptídeo padrão, em que o polipeptídeo padrão compreende seqüência codificando um gene homólogo; (b) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeo de bloco de construção, em que os polinucleotídeos de blo-cos de construção são projetados para reagrupamento de cruzamento com o polinucleotídeo padrão em uma seqüência pré-determinada, e um polinucle- otídeo de bloco de construção compreende uma seqüência que é uma vari-ante do gene homólogo e uma seqüência homóloga ao polinucleotídeo pa-drão flanqueando a seqüência variante; (c) combinar um polinucleotídeo de bloco de construção com um polinucleotídeo padrão tal que o cruzamento de polinucleotídeo de bloco de construção reagrupa-se com o polinucleotídeo padrão para gerar polinucleotídeos compreendendo variações de seqüência de gene homóloga. SLR não depende da presença de níveis altos de homologia en-tre os polinucleotídeos a serem redispostos. Desse modo, este método pode ser empregado para não estocasticamente gerar bibliotecas (ou grupos) de moléculas de descendência compreendidas em mais de 10100 quimeras diferentes. SLR pode ser empregada para gerar bibliotecas compreendidas em mais de 101000 quimeras de descendência diferentes. Desse modo, as-pectos da presente invenção incluem métodos não estocáticos de produzir um grupo de molécula de ácido nucléico quimérica finalizada raspando uma ordem de agrupamento total que é escolhida por projeto. Este método inclui as etapas de gerar por projeto uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucléico específicos tendo extremidades ligáveis mutuamente compa-tíveis úteis e agrupar estes blocos de construção de ácido nucléico, tal que uma ordem de agrupamento total designada é obtida.
As extremidades ligáveis mutuamente compatíveis dos blocos de construção de ácido nucléico a serem reunidas são consideradas "úteis"para este tipo de agrupamento ordenado se elas permitem os blocos de construção serem acoplados em ordens predeterminadas. Desse modo, a ordem de agrupamento total em que os blocos de construção de ácido nu- cléico podem ser acoplados é especificada pelo projeto das extremidades ligáveis. Se mais do que uma etapa de agrupamento deve ser empregada, em seguida a ordem de agrupamento total em que os blocos de construção de ácido nucléico podem ser acoplados é da mesma forma especificada pela ordem seqüencial da(s) etapa(s) de agrupamento. Em um aspecto, as partes de construção recozidas são tratadas com uma enzima, tal como uma ligase (por exemplo, T4 DNA ligase), para obter a ligação covalente das partes de construção.
Em um aspecto, o projeto dos blocos de construção de oligonu- cleotídeo é obtido analisando-se um grupo de padrões de seqüência de áci-donucléico de progenitor que serve como uma base para produzir um grupo de descendência de polinucleotídeos quiméricos finalizados. Estes padrões de oligonucleotídeo parentais desse modo servem como uma fonte de infor-mação de seqüência que ajuda no projeto dos blocos de construção de áci-donucléico que devem ser mutagenizados, por exemplo, quimerizados ou embaralhados. Em um aspecto deste método, as seqüências de uma plurali-dade de padrões de ácido nucléico parenteral são alinhados a fim de seleci-onar um ou mais pontos de demarcação. Os pontos de demarcação podem estar localizados em uma área de homologia e são compreendidos de um ou mais nucleotídeos. Estes pontos de demarcação são preferivelmente com-partilhados por pelo menos dois dos padrões de progenitor. Os pontos de demarcação podem desse modo ser empregados para delinear os limites de blocos de construção de oligonucleotídeo a serem gerados a fim de redispor os polinucleotídeos parentais. Os pontos de demarcação identificados e se-lecionados nas moléculas progenitoras servem como pontos de quimeriza- ção potenciais no agrupamento das moléculas de descendência quiméricas finais. O ponto de demarcação pode ser uma área de homologia (compreen-dida de pelo menos uma base de nucleotídeo homóloga) compartilhada por pelo menos duas seqüências de polinucleotídeo parentais. Alternativamente, um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos metade das seqüências de polinucleotídeo parentais, ou, pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos dois terços das seqüências de polinucleotídeo parentais. Ainda mais preferivelmente um ponto de demarcação útil é uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos três quartos das seqüências de polinucleotí- deo parental, ou, pode ser compartilhada por quase todas as seqüências de polinucleotídeo parentais. Em um aspecto, um ponto de demarcação é uma área de homologia que é compartilhada por todas as seqüências de polinu- cleotídeo parentais.
Em um aspecto, um processo de reagrupamento de ligação é realizado exaustivamente a fim de gerar uma biblioteca exaustiva de polinu- cleotídeos quiméricos de descendência. Em outras palavras, todas as com-binações ordenadas possíveis dos blocos de construção de ácido nucléico, são representadas no grupo de moléculas de ácido nucléico quimérico finalizadas. Ao mesmo tempo, em outro aspecto, a ordem de agrupamento (isto é, a ordem de agrupamento de cada bloco de construção na seqüência 5’ a 3 de cada ácido nucléico quimérico finalizado) em cada combinação é por projeto (ou não estocástico) como descrito anteriormente. Por causa da naturezanão estocástica desta invenção, a possibilidade de produtos laterais indesejáveis é grandemente reduzida.
Em outro aspecto, o método de reagrupamento de ligação é rea-lizado sistematicamente. Por exemplo, o método é realizado a fim de gerar uma biblioteca sistemicamente em compartimento de moléculas de descen-dência, com compartimentos que podem ser sistemicamente avaliados, por exemplo, um por um. Em outras palavras esta invenção fornece que, através do uso seletivo e judicioso de blocos de construção de ácido nucléico espe-cíficos, acoplados com o uso seletivo e judicioso de reações de reagrupa- mento seqüencialmente maceradas, um projeto pode ser obtido onde os grupos específicos de produtos de descendência são feitos em cada um dentre vários vasos de reação. Isto permite um exame sistemático e proce-dimento de avaliação a ser realizado. Dessa maneira, estes métodos permi-tem um número potencialmente muito grande de moléculas de descendência a serem sistematicamente examinadas em grupos menores. Por causa de sua capacidade de realizar quimerizações de uma maneira que seja altamenteflexível no entanto exaustiva e sistemática também, particularmente quando há um baixo nível de homologia entre as moléculas progenitoras, estes métodos fornecem a geração de uma biblioteca (ou grupo) compreendido de um número grande de moléculas de descendência. Por causa da natureza não estocástica da presente invenção de reagrupamento de ligação, as moléculas de descendência geradas preferivelmente compreendem uma biblioteca de moléculas de ácido nucléico quimérico finalizadas tendo uma ordem de agrupamento total que é escolhida por projeto. A mutagênese por saturação e métodos de evolução direcionados otimizados da mesma forma podem ser empregados para gerar espécies moleculares de descen-dência diferentes. É apreciado que a invenção forneça liberdade de escolha e controle quanto à seleção de pontos de demarcação, o tamanho e número dos blocos de construção de ácido nucléico, e o tamanho e projeto dos aco-plamentos.Além disso, é apreciado que a exigência quanto a homologia in- termolecular seja altamente relaxada para a operabilidade desta invenção. Na realidade, pontos de demarcação podem ainda ser escolhidos em áreas de pouca ou nenhuma homologia intermolecular. Por exemplo, por causa da oscilação do códon, isto é, a degeneração de códons, substituições de nu- cleotídeo podem ser introduzidas em blocos de construção de ácido nucléico sem alterar o aminoácido originalmente codificado no padrão de progenitor correspondente. Alternativamente, um códon pode ser alterado tal que a co-dificação para um aminoácido originalmente é alterado. Esta invenção forne-ce que tais substituições podem ser introduzidas no bloco de construção de ácido nucléico a fim de aumentar a incidência de pontos de demarcação homólogos intermoleculares e dessa maneira permitir um número aumenta-do de acoplamentos ser obtido entre os blocos de construção, que sucessi-vamente permitem um número maior de moléculas quiméricas de descen-dência ser gerado.
Em outro aspecto, a natureza sintética da etapa em que os blo-cos de construção são gerados, permite o projeto e introdução de nucleotí- deos (por exemplo, um ou mais nucleotídeos, que podem ser, por exemplo, códons ou íntrons ou seqüências reguladoras) que podem mais tarde opcio-nalmente ser removidos em um processo in vitro (por exemplo, por mutagê- nese) ou em um processo in vivo (por exemplo, utilizando-se a capacidade de união de gene de um organismo hospedeiro). É apreciado que em muitos exemplos a introdução destes nucleotídeos possa da mesma forma ser de-sejável para muitas outras razões além do benefício potencial de criar um ponto de demarcação útil.
Em um aspecto, um bloco de construção de ácido nucléico é empregado para introduzir um íntron. Dessa maneira, íntrons funcionais são introduzidos em um gene artificial fabricado de acordo com os métodos descritos aqui. O(s) íntron(s) artificialmente introduzido(s) pode(m) ser funcio- nal(is) em uma célula hospedeira para união de gene aproximadamente da maneira que os íntrons de ocorrência natural servem funcionalmente na união de gene.
Sistema de Evolução Direcionado Otimizado
A invenção fornece um sistema de modificação de gene não es- tocástico denominado "sistema de evolução direcionado otimizado" para ge-rar hidrolases e anticorpos com propriedades novas ou alteradas. Evolução direcionada otimizada é direcionada ao uso de ciclos repetidos de reclassifi- cação redutora, recombinação e seleção que permitem a evolução molecular direcionada de ácidos nucléicos através de recombinação. Evolução direcio-nada otimizada permite a geração de uma população grande de seqüências quiméricas evoluídas, em que a população gerada é significantemente enri-quecida para seqüências que têm um número predeterminado de eventos de cruzamento.
Um evento de cruzamento é um ponto em uma seqüência qui-mérica onde uma mudança em seqüência ocorre de uma variante parental para outra variante parental. Uma tal ponto é normalmente na junção de on-de oligonucleotídeos de duas origens são ligados um ao outro para formar uma seqüência simples. Este método permite cálculo das concentrações corretas de seqüências de oligonucleotídeo a fim de que a população quimérica final de seqüências seja enriquecida para o número escolhido de eventos de cruzamento. Isto fornece mais controle sobre a escolha das variantes quiméricas tendo um número predeterminado de eventos de cruzamento.
Além disso, este método fornece um meio conveniente para ex-plorar uma quantidade extraordinária do espaço variante de proteína possí-vel em comparação a outros sistemas. Previamente, se alguém gerou, por exemplo, 1013 de moléculas quiméricas durante uma reação, seria extrema-mente difícil testar um tal número alto de variantes quiméricas para uma ati-vidade particular. Além disso, uma porção significante da população de des- cendência teria um número muito alto de eventos de cruzamento que resul-taram em proteínas que foram menos prováveis de ter níveis aumentados de uma atividade particular. Empregando-se estes métodos, a população de moléculas quiméricas pode ser enriquecida para aquelas variantes que têm um número particular de eventos de cruzamento. Dessa maneira, embora alguém ainda possa gerar 1013 de moléculas quiméricas durante uma rea-ção, cada uma das moléculas escolhidas para outra análise mais provavel-mente tem, por exemplo, somente três eventos de cruzamento. Por que a população de descendência resultante pode ser inclinada a ter um número predeterminado de eventos de cruzamento, os limites na variedade funcional entre as moléculas quiméricas são reduzidos. Isto fornece um número mais manejável de variáveis ao calcular que o oligonucleotídeo dos polinucleotí- deos parentais originais pôde ser responsável por afetar uma característica particular.
Um método para criar uma seqüência de polinucleotídeo de des-cendência quimérica é criar oligonucleotídeos correspondentes aos fragmentos ou porções de cada seqüência parental. Cada oligonucleotídeo preferivelmente inclui uma única região de sobreposição de modo que misturar os oligonucleotídeos juntos resulta em uma nova variante que tem cada fragmento de oligonucleotídeo reunido na ordem correta. A Informação adicional pode da mesma forma ser encontrada, por exemplo, na USSN 09/332.835; Patente dos Estados Unidos N° 6.361.974.
O número de oligonucleotídeos gerados para cada variante pa-rental suporta uma relação ao número total de cruzamentos resultantes na molécula quimérica que é ultimamente criada. Por exemplo, três variantes de seqüência de nucleotídeo parental puderam ser fornecidas para passar por uma reação de ligação a fim de constatar uma variante quimérica tendo, por exemplo, maior atividade em alta temperatura. Como um exemplo, um grupo de 50 seqüências de oligonucleotídeo pode ser gerado correspondendo a cada porção de cada variante parental. Desta maneira, durante o processo de reagrupamento de ligação pode haver até 50 eventos de cruzamento dentro de cada uma das seqüências quiméricas. A probabilidade que cada um dos polinucleotídeos quiméricos gerados conterá oligonucleotídeos de cada variante parental em ordem alternante é muito baixa. Se cada fragmen-to de oligonucleotídeo está presente na reação de ligação na mesma quanti-dade molar, é provável que, em algumas posições, os oligonucleotídeos do mesmo polinucleotídeo parental se liguem próximos uns aos outros e desse modo não resulte em um evento de cruzamento. Se a concentração de cada oligonucleotídeo de cada origem é mantida constante durante qualquer eta-pa de ligação neste exemplo, há uma mudança de 1/3 (assumindo 3 origens) que um oligonucleotídeo da mesma variante parental se ligará dentro da se- qüência quimérica e não produzirá cruzamento.
Conseqüentemente, uma função de densidade de probabilidade (PDF) pode ser determinada para predizer a população de eventos de cru-zamento que são prováveis de ocorrer durante cada etapa em uma reação de ligação dado um número fixo de variantes parentais, vários oligonucleotí- deos correspondentes a cada variante, e as concentrações de cada variante durante cada etapa na reação de ligação. As estatísticas e matemáticas atrás da determinação da PDF são descritas abaixo. Utilizando-se estes mé-todos,alguém pode calcular uma tal função da densidade de probabilidade, e desse modo enriquecer a população de descendência quimérica para um número predeterminado de eventos de cruzamento resultante de uma rea-ção de ligação particular. Além disso, um número alvo de eventos de cruza-mento pode ser predeterminado, e o sistema em seguida programado para calcular as quantidades de partida de cada oligonucleotídeo parental durante cada etapa na reação de ligação para resultar em uma função de densidade de probabilidade que centra sobre o número predeterminado de eventos cruzamento. Estes métodos estão direcionados ao uso de ciclos repetidos de reclassificação redutiva, recombinação e seleção que permitem a evolução molecular direcionada de um ácido nucléico codificando um polipeptídeo através da recombinação. Este sistema permite a geração de uma população grande de seqüências quiméricas evoluídas, em que a população geradaé enriquecida significativamente para seqüências que têm um número predeterminado de eventos cruzamento. Um evento cruzamento é um ponto em uma seqüência quimérica onde uma mudança na seqüência ocorre de uma variante parental para outra variante parental. Um tal ponto está nor-malmente na junção de onde os oligonucleotídeos de duas origens estão ligados juntos para formar uma única seqüência. O método permite o cálculo das concentrações corretas de seqüências de oligonucleotídeo de modo que a população quimérica final das seqüências seja enriquecida para o número escolhido de eventos cruzamento. Isto fornece mais controle sobre a escolha de variantes quiméricas tendo um número predeterminado de eventos cru-zamento.
Determinação de Eventos de Cruzamento
Os aspectos da invenção incluem um sistema e software que recebem uma função de densidade de probabilidade de cruzamento deseja-da (PDF), o número de genes de origem a ser reagrupado, e o número de fragmentos no reagrupamento como entradas. A produção deste programa é um PDF de fragmento que pode ser empregado para determinar uma receita para produzir genes reagrupados e a PDF de cruzamento calculada daque-les genes. O processo descrito aqui é preferivelmente realizado em MA- TLABTM (The Mathworks, Natick, Massachusetts) uma linguagem de progra-mação e ambiente de desenvolvimento para computação técnica.
Processos Iterativos
Na prática da invenção, estes processos podem ser iterativa-mente repetidos. Por exemplo, um ácido nucléico (ou, o ácido nucléico) res-ponsável por uma hidrolase alterada ou fenótipo de anticorpo é identificado, reisolado novamente modificado, retestado quanto a atividade. Este proces-so pode ser iterativamente repetido até que um fenótipo desejado seja cons-truído. Por exemplo, uma trilha anabólica ou catabólica bioquímica completa pode ser construída em uma célula, incluindo atividade proteolítica.
Similarmente, se for determinado que um oligonucleotídeo parti-cular não tenha efeito de modo algum sobre a característica desejada (por exemplo, um novo fenótipo de hidrolase), ele pode ser removido como uma variável sintetizando-se oligonucleotídeos parentais maiores que incluem a seqüência a ser removida. Desde que a incorporação da seqüência dentro de uma seqüência maior previna quaisquer eventos cruzamento, não haverá mais qualquer variação desta seqüência nos polinucleotídeos de descendência. Esta prática iterativa de determinar quais oligonucleotídeos estão mais relacionados à característica desejada, e quais não estão relacionados, permite a exploração mais eficiente de todas as possíveis variantes de proteína que puderam fornecer uma atividade ou característica particular.
Embaralhamento In vivo
O embaralhamento in vivo de moléculas é empregado em méto-dos da invenção que fornecem variantes de polipeptídeos da invenção, por exemplo, anticorpos, hidrolases e similares. O embaralhamento in vivo pode ser realizado utilizando-se a propriedade natural de células para recombinar os multímeros. Ao mesmo tempo que a recombinação in vivo tem fornecido a rotina natural principal para diversidade molecular, a recombinação genética permanece um processo relativamente complexo que envolve 1) o reco-nhecimento de homologias; 2) clivagem de filamento, invasão de filamento e etapas metabólicas levando à produção de quiasma recombinante; e final-mente 3) a resolução de quiasma em moléculas recombinadas discretas. A formação do quiasma requer o reconhecimento de seqüências homólogas.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para produzir um polinucleotídeo híbrido de pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo. A invenção pode ser empregada para produzir um polinucleotídeo híbrido introduzindo-se pelo menos um primeiro polinucleotí- deo e um segundo polinucleotídeo que compartilha pelo menos uma região de homologia de seqüência parcial em uma célula hospedeira adequada. As regiões de homologia de seqüência parcial promovem os processos que re-sultam na reorganização de seqüência produzindo um polinucleotídeo híbri-do. O termo "polinucleotídeo híbrido", como empregado aqui, é qualquer se- qüência de nucleotídeo que resulta do método da presente invenção e con-témseqüência de pelo menos duas seqüências de polinucleotídeo originais. Tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de eventos de recombinação intermolecular que promovem a integração de seqüência entre as moléculas de DNA. Além disso, tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de pro- cessos de reclassificação redutiva intramolecular que utilizam seqüências repetidas para alterar uma seqüência de nucleotídeo dentro de uma molécu-la de DNA.
Produção de variantes de seqüência
A invenção da mesma fornece métodos para preparar variantes de seqüência do ácido nucléico e hidrolase e seqüências de anticorpo da invenção ou isolar hidrolases empregando-se os ácidos nucléicos e polipep- tídeos da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece variantes de um gene de hidrolase da invenção, que podem ser alterados por quaisquer mei-os, incluindo, por exemplo, métodos estocásticos ou aleatórios, ou, métodos não estocásticos, ou, de "evolução direcionada", como descrito anteriormen-te.
As variantes isoladas podem ser de ocorrência natural. A varian-te pode da mesma forma ser criada in vitro. As variantes podem ser criadas empregando-se técnicas de engenharia genética tais como mutagênese di-recionada ao sítio, mutagênese química aleatória, procedimentos de deleção de Exonuclease III e técnicas de clonagem padrão. Alternativamente, tais variantes, fragmentos, análogos ou derivados empregando-se sínteses quí-micas ou procedimentos de modificação. Outros métodos de preparar vari-antes são da mesma forma familiarizados por aqueles versados na técnica. Estes incluem procedimentos em que as seqüências de ácido nucléico obti-dos de isolados naturais são modificados para gerar ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos tendo características que realçam seu valor nas aplicações industrial ou de laboratório. Em tais procedimentos, um grande número de seqüências variantes tendo uma ou mais diferenças de nucleotí- deo com respeito à seqüência obtida do isolado natural é gerado e caracteri-zado. Estas diferenças de nucleotídeo podem resultar em mudanças de aminoácido com respeito aos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléi- cos dos isolados naturais.
Por exemplo, as variantes podem ser criadas empregando PCR propensa ao erro. Em PCR propensa ao erro, PCR é realizada sob condi-ções onde a fidelidade de cópia do DNA polimerase é baixa, tal que uma taxa alta de mutações pontuais é obtida ao longo do comprimento inteiro do produto de PCR. PCR propensa ao erro é descrita, por exemplo, em Leung, D.W., e outros, Technique, 1: 11 - 15, 1989) e Caldwell, R. C. & Joyce G. F., PCR Methods Applic., 2: 28 - 33, 1992. Brevemente, em tais procedimentos, ácidos nucléicos a serem mutagenizados são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCl2, MnCl2, Taq polimerase e uma concentração apropriada de dNTPs para obter uma alta taxa de mutação pontual ao longo do comprimento inteiro do produto de PCR. Por exemplo, a reação pode ser realizada empregando-se 20 fmols de ácido nucléico a ser mutagenizado, 30 pmol de cada iniciador de PCR, um tampão de reação compreendendo 50 mM de KCl, 10mM de Tris HCl (pH 8,3) e 0,01% de gelatina, 7 mM de MgCl2, 0,5 mM de MnCl2, 5 unidades de Taq polimerase, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dATP, 1 mM de dCTP e 1 mM de dTTP. A PCR pode ser realizada durante 30 ciclos de 94oC durante 1 minuto, 45oC durante 1 minuto e 72oC durante 1 minuto. Entretanto, será apreciado que estes parâmetros podem ser variados quando apropriados. Os ácidos nucléicos mutageniza- dos são clonados em um vetor apropriado e as atividades dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos mutagenizados são avaliadas.
As variantes podem da mesma forma ser criadas empregando- se mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo para gerar mutações espe-cíficas de sítio em qualquer DNA clonado de interesse. A mutagênese de oligonucleotídeo é descrita, por exemplo, em Reidhaar-Olson (1988) Science 241: 53 - 57. Brevemente, em tais procedimentos, uma pluralidade de oligo- nucleotídeos de filamento duplo suportando uma ou mais mutações a serem introduzidas no DNA clonado é sintetizada e inserida no DNA clonado a ser mutagenizado. Os clones contendo o DNA mutagenizado são recuperados e as atividades dos polipeptídeos que eles codificam são avaliadas.
Outro método para gerar variantes é PCR em grupo. PCR em grupo envolve o grupo de um produto de PCR de uma mistura de fragmen-tos de DNA pequenos. Um número grande de reações PCR diferentes ocor-re em paralelo no mesmo frasconete, com os produtos de uma reação inici-ando os produtos de outra reação. PCR em grupo é descrita em, por exem- plo, Patente dos Estados Unidos n° 5.965.408.
Ainda outro método de gerar variantes é mutagênese de PCR sexual. Em mutagênese de PCR sexual, a recombinação homóloga forçada ocorre entre as moléculas de DNA de diferente porém seqüência de DNA altamente relacionada in vitro, como um resultado de fragmentação aleatória da molécula de DNA com base na homologia de seqüência, seguido por fi-xação do cruzamento por extensão de iniciador em uma reação PCR. Muta- gênese de PCR sexual é descrita, por exemplo, em Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747 - 10751. Brevemente, em tais procedimentos uma pluralidade de ácidos nucléicos a ser recombinada é digerida com DNase para gerar fragmentos tendo um tamanho médio de 50 - 200 nucleo- tídeos. Os fragmentos do tamanho médio desejado são purificados e res- suspensos em uma mistura de PCR. PCR é conduzida sob condições que facilitam a recombinação entre os fragmentos de ácido nucléico. Por exem-plo, PCR pode ser realizada ressuspendendo-se os fragmentos purificados em uma concentração de 10 - 30 ng/: 1 em uma solução de 0,2 mM de cada dNTP, 2,2 mM de MgCl2, 50 mM de KCL, 10 mM de Tris HCl, pH 9,0 e 0,1% de Triton X-100. 2,5 unidades de Taq polimerase por 100 : 1 de mistura de reação são adicionadas e PCR é realizada empregando-se o seguinte regi-me: 94oC durante 60 segundos, 94oC durante 30 segundos, 50 - 55oC durante 30 segundos, 72oC durante 30 segundos (30 - 45 vezes) e 72oC durante 5 minutos. Entretanto, será apreciado que estes parâmetros podem ser variados como apropriado. Em alguns aspectos, os oligonucleotídeos podem ser incluídos nas reações de PCR. Em outros aspectos, o fragmento Klenow de DNA polimerase I pode ser empregado em um primeiro grupo de reações PCR e Taq polimerase pode ser empregada em um grupo subseqüente de reações PCR. As seqüências recombinantes são isoladas e as atividades dos polipeptídeos que eles codificam são avaliadas.
As variantes podem da mesma forma ser criadas por mutagêne- se in vivo. Em alguns aspectos, as mutações aleatórias em uma seqüência de interesse são geradas propagando-se a seqüência de interesse em uma cepa bacteriana, tal como uma cepa de E. coli, que transporta mutações em uma ou mais dentre as trilhas de reparo de DNA. Tais cepas "mutadoras"têm uma taxa de mutação aleatória mais alta do que aquela de uma origem tipo silvestre. Propagar o DNA em uma destas cepas gerará eventualmente mutações aleatórias dentro do DNA. As cepas mutadoras adequadas para uso para mutagênese in vivosão descritas, por exemplo, em Publicação PCT No. WO 91/16427.
As variantes podem da mesma forma ser geradas empregando- se mutagênese de cassete. Em mutagênese de cassete uma região peque-na de uma molécula de DNA de filamento duplo é substituída com um "cas-sete" de oligonucleotídeo sintético que difere-se da seqüência nativa. O oli- gonucleotídeo contém freqüentemente seqüência nativa completamente e/ou parcialmente aleatorizada.
Mutagênese em conjunto recursiva pode da mesma forma ser empregada para gerar variantes. Mutagênese em conjunto recursiva é um algoritmo para construção de proteína (mutagênese de proteína) desenvolvi-da para produzir populações diversas de mutantes fenotipicamente relacio-nados cujos membros diferem-se em seqüência de aminoácido. Este método emprega um mecanismo de realimentação para controlar ciclos sucessivos de mutagênese de cassete combinatorial. Mutagênese em conjunto recursi-vaé descrita, por exemplo, em Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815.
Em alguns aspectos, as variantes são criadas empregando a mutagênese em conjunto exponencial. Mutagênese em conjunto exponencial é um processo para gerar bibliotecas combinatoriais com uma alta porcentagem de mutantes únicos e funcionais, em que os grupos pequenos de resíduossão aleatorizados em paralelo para identificar, a cada posição alterada, aminoácidos que levam às proteínas funcionais. Mutagênese em conjunto exponencial é descrita, por exemplo, em Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11: 1548 - 1552. Mutagênese direcionada ao sítio e aleatória são descritas, por exemplo, em Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4: 450 - 455.
Em alguns aspectos, as variantes são criadas empregando-se procedimentos de embaralhamento em que as porções de uma pluralidade de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos distintos são fundidos juntos para criar seqüências de ácido nucléico quiméricas que codificam polipeptí- deos quiméricos como descritos em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.965.408, 5.939.250.
A invenção da mesma forma fornece variantes de polipeptídeos da invenção compreendendo seqüências em que um ou mais dos resíduos de aminoácido (por exemplo, de um polipeptídeo exemplar, tais como, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, etc.) são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (por exemplo, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoáci- do substituído pode ou não ser codificado pelo código genético. As substitui-ções conservadoras são aquelas que substituem um dado aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido de características similares. Desse modo, os polipeptídeos da invenção incluem aqueles com substituições con-servadoras de seqüências da invenção, por exemplo, as seqüências exem-plares da invenção, tais como, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, etc, incluindo porém não limitadas às substituições seguintes: substituições de um aminoácido alifático tal como Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina com outro aminoácido alifático; substituição de uma Serina com uma Treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo acídico tal como ácido Aspártico e ácido Glutâmico com outro resíduo acídico; substituição de um resíduo transportando um grupo de amida, tal como Asparagina e Glu- tamina, com outro resíduo transportando um grupo de amida; permuta de um resíduo básico tal como Lisina e Arginina com outro resíduo básico; e substi-tuição de um resíduo aromático tal como Fenilalanina, Tirosina com outro resíduo aromático. Outras variantes são aquelas em que um ou mais dos resíduos de aminoácido dos polipeptídeos da invenção incluem um grupo de substituinte.
Outras variantes dentro do escopo da invenção são aquelas em que o polipeptídeo está associado com outro composto, tal como um com-posto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo, por exemplo, polietileno glicol. Variantes adicionais dentro do escopo da invenção são aquelas em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo, tal como uma seqüência líder, uma seqüência segregadora, uma seqüência de pró- proteína ou uma seqüência que facilita a purificação, enriquecimento ou es-tabilização do polipeptídeo. Em alguns aspectos, as variantes, fragmentos, derivados e análogos dos polipeptídeos da invenção mantêm a mesma fun-ção biológica ou atividade como os polipeptídeos exemplares, por exemplo, atividade proteolítica, como descrita nisto. Em outros aspectos, a variante, fragmento, derivado, ou análogo inclui um pró-proteína, tal que a variante, fragmento, derivado ou análogo pode ser ativado por clivagem da porção de pró-proteína para produzir um polipeptídeo ativo.
Otimização de códons para obter níveis altos de expressão de proteína em células hospedeiras
A invenção fornece métodos para modificar ácidos nucléicos de codificação de hidrolase para modificar o uso de códon. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para modificar códons em um ácido nucléico codificando uma hidrolase para aumentar ou diminuir sua expressão em uma célula hospedeira, por exemplo, célula bacteriana, de inseto, de mamífero, de levedura ou planta. A invenção da mesma forma fornece ácidos nucléicos codificando uma hidrolase modificada para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, hidrolase desse modo modificada, e métodos de preparar as hidrolases modificadas. O método compreende identificar um códon "não preferido" ou um "menos preferido" no ácido nucléico codificando hidrolase e substituindo um ou mais destes códons não preferidos ou menos preferidos com um "códon preferido" codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído e pelo menos um códon não preferido ou menos preferido no ácido nucléico foi substituído por um códon preferido codificando o mesmo aminoácido. Um códon preferido é um códon super-representado em se- qüências de codificação em genes na célula hospedeira e um códon não preferido ou menos preferido é um códon sub-representado em seqüências de codificação em genes na célula hospedeira.
Células hospedeiras para expressar os ácidos nucléicos, casse- tes de expressão e vetores da invenção incluem bactérias, levedura, fungos, células de planta, células de inseto e células de mamífero. Desse modo, a invenção fornece métodos para otimizar o uso de códon em todas estas células,ácidos nucléicos alterados por códon e polipeptídeos feitos pelos ácidosnucléicos alterados por códon. Células hospedeiras exemplares incluem bactérias gram negativas, tais como Escherichia coli; bactérias gram positivas, tais como qualquer Bacillus (por exemplo, B. cereus ou B.subtilis) ou Streptomyces, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremo- ris. Células hospedeiras exemplares da mesma forma incluem organismos eucarióticos, por exemplo, várias leveduras, tais como Saccharomyces sp., incluindo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris e Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Aspergillus niger e células de mamífero e linhagens celulares e células de inseto e linhagens celulares. Desse modo, a invenção da mesma forma inclui ácidos nucléicos e polipeptídeos otimizados para a expressão nestes organismos e espécies.
Por exemplo, os códons de um ácido nucléico codificando uma hidrolase isolada de uma célula bacteriana são modificados tal que o ácido nucléico é expressado de melhor forma em uma célula bacteriana diferente das bactérias das quais a hidrolase foi derivada, uma levedura, fungos, uma célula de planta, uma célula de inseto ou uma célula de mamífero. Métodos para otimizar os códons são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30: 113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12: 185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253. Veja da mesma forma Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253, descrevendo códons de otimização em sistemas de camun-dongo; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24: 18 - 24, descrevendo có- dons de otimização em levedura; Feng (2000) Biochemistry 39: 15399 15409, descrevendo códons de otimização em E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20: 252 - 264, descrevendo o uso de códon de otimização que afeta a segregação em E. coli.
Animais não humanos transgênicos
A invenção fornece animais não humanos transgênicos compre- endendo um ácido nucléico, um polipeptídeo (por exemplo, uma hidrolase ou um anticorpo da invenção), um cassete de expressão, um vetor ou uma célula transformada ou transfectada da invenção.
Os animais não humanos transgênicos podem ser, por exemplo, cabras, coelhos, ovelhas, porcos, vacas, ratos e camundongos, compreen-dendo os ácidos nucléicos da invenção. Estes animais podem ser emprega-dos, por exemplo, como em modelos in vivo para estudar atividade de hidro- lase, ou, como modelos para avaliar quanto aos agentes que mudam a ativi-dade de hidrolase in vivo. As seqüências de codificação para os polipeptí- deos a serem expressos nos animais não humanos transgênicos podem ser projetadas para ser constitutivas, ou, sob o controle de fatores reguladores transcricionais induzíveis, específicos de desenvolvimento ou específicos de tecido. Animais não humanos transgênicos podem ser projetados e gerados empregando-se qualquer método conhecido na técnica; veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.211.428, 6.187.992, 6.156.952, 6.118.044, 6.111.166, 6.107.541, 5.959.171, 5.922.854, 5.892.070, 5.880.327, 5.891.698, 5.639.940, 5.573.933, 5.387.742, 5.087.571, descre-vendo a preparação e uso de ovos e células transformadas e camundongos, ratos, coelhos, ovelhas, porcos e vacas transgênicos. Veja da mesma forma, por exemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157, descrevendo a produção de proteínas recombinantes no leite de animais de leiteria transgênicos; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17: 456-461, demonstrando a produção de cabras transgênicas. A Patente dos Estados Unidos n° 6.211.428, descreve a preparação e uso de mamíferos não humanos trans- gênicos que expressam em seus cérebros uma construção de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de DNA. A Patente dos Estados Unidos n° 5.387.742, descreve a injeção de seqüências de DNA sintéticas ou recombi- nantes clonadas em ovos de camundongo fertilizados, implantando os ovos injetados em fêmeas pseudo-prenhes e o crescimento para denominar camundongostransgênicos cujas células expressam proteínas relacionadas à patologia da doença de Alzheimer. Patente dos Estados Unidos n° 6.187.992, descreve a preparação e uso de um camundongo transgênico cujo genoma compreende um rompimento do gene codificando proteína pre-cursoraamilóide (APP).
"Animais nocauteados" podem da mesma forma ser empregados para praticar os métodos da invenção. Por exemplo, em um aspecto, os animais modificados ou transgênicos da invenção compreendem um "animal nocauteado", por exemplo, um "camundongo nocauteado", construído para não expressar um gene endógeno, que é substituído com um gene expressando uma hidrolase da invenção, ou, uma proteína de fusão compreendendo uma hidrolase da invenção. Como anteriormente notado, os nocautes funcionais podem da mesma forma ser gerados empregando-se seqüências anti-sentido da invenção, por exemplo, moléculas de RNAi de filamento duplo.
Sementes e Plantas Transgênicas
A invenção fornece sementes e plantas transgênicas compreen-dendo um ácido nucléico, um polipeptídeo (por exemplo, uma hidrolase ou um anticorpo da invenção), um vetor ou cassete de expressão ou uma célula transformada ou transfectada da invenção. A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). A invenção da mesma forma fornece métodos de preparar e empregar estas sementes e plantas transgênicas. A célula de planta ou planta transgênica expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Observe, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6.309.872.
Ácidos nucléicos e construções de expressão da invenção po-dem ser introduzidos em uma célula de planta por quaisquer meios. Por exemplo, ácidos nucléicos ou construções de expressão podem ser introdu-zidos no genoma de um hospedeiro de planta desejado, ou, os ácidos nu- cléico ou construções de expressão podem ser epissomas. A introdução no genoma de uma planta desejada pode ser tal que a produção de hidrolase de hospedeiro é regulada por elementos de controle transcricional ou trans- lacional endógeno. A invenção da mesma forma fornece "plantas nocautea- das" onde a inserção de seqüência de gene por, por exemplo, recombinação homóloga, tem rompido a expressão do gene endógeno. Meios para gerar as plantas "nocauteadas"são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci. USA 95: 4368-4373; Miao (1995) Plant J 7: 359-365. Veja discussão sobre plantas transgênicas, abaixo.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser empregados para conferir características desejadas essencialmente em qualquer planta, por exemplo, em plantas de produção de sementes oleaginosas, incluindo farelo de arroz, semente de colza (canola), girassol, azeitona, palma ou soja, e si-milares, ou em plantas de produção de amido ou glicose tais como milho, batata, trigo, arroz, cevada e similares. Ácidos nucléicos da invenção podem ser empregados para manipular trilhas metabólicas de uma planta a fim de otimizar ou alterar a expressão do hospedeiro de uma hidrolase ou um subs-trato ou produto de uma hidrolase, por exemplo, um óleo, um lipídio, tal como mono-, di- ou tri-acilglicerídeo e similares. Eles podem alterar as relações de lipídios, renovação e conversão de lipídio em uma planta. Isto pode facilitar o processo industrial de uma planta. Alternativamente, hidrolases da invenção podem ser empregadas na produção de uma planta transgênica para produzir um composto não naturalmente produzido por essa planta. Isto po-de diminuir os custos de produção ou criar um novo produto.
Em um aspecto, a primeira etapa na produção de uma planta transgênica envolve preparar uma construção de expressão para expressão em uma célula de planta. Estas técnicas são bem conhecidas na técnica. Elas podem incluir a seleção e clonagem de um promotor, uma seqüência de codificação para facilitar a ligação eficiente de ribossomas em mRNA e selecionar as seqüências terminadoras de gene apropriadas. Um promotor constitutivo exemplar é CaMV35S, do vírus mosaico da couve-flor, que geralmente resulta em um alto grau de expressão em plantas. Outros promotores são mais específicos e respondem a sugestões no ambiente interno ou externo da planta. Um promotor induzível por luz exemplar é o promotor do gene cab, codificando a proteína de ligação a/b de clorofila principal.
Em um aspecto, o ácido nucléico é modificado para obter maior expressão em uma célula de planta. Por exemplo, uma seqüência da inven- ção é provável de ter uma porcentagem mais alta de pares de nucleotídeo AT comparados aqueles vistos em uma planta, alguns dos quais preferem pares de nucleotídeo G-C. Portanto, nucleotídeos A-T na seqüência de codificação podem ser substituídos com nucleotídeos G-C sem significativamente mudar a seqüência de aminoácido para realçar a produção do produto de gene em células de planta.
O gene marcador selecionável pode ser adicionado á construção de gene a fim de identificar tecidos ou células de planta que têm sucessiva-mente integrado o transgene. Isto pode ser necessário porque obter a incor-poração e expressão de genes em células de planta é um evento raro, ocor-rendo em apenas alguns por cento das células ou tecidos alvejados. Os ge-nes marcadores selecionáveis codificam as proteínas que fornecem resis-tência aos agentes que são normalmente tóxicos a plantas, tal como antibió-ticos ou herbicidas. Apenas as células de planta que têm integrado o gene marcador selecionável sobreviverão quando crescidas em um meio conten-do o herbicida ou antibiótico apropriado. Como para outros genes inseridos, os genes marcadores da mesma forma requerem promotor e seqüências de terminação para própria função.
Em um aspecto, preparar sementes ou plantas transgênicas compreende incorporar as seqüências da invenção e, opcionalmente, genes marcadores em uma construção de expressão alvo (por exemplo, um plas- mídeo, um fago), juntamente com o posicionamento do promotor e as se- qüências terminadoras. Isto pode envolver transferir o gene modificado na planta através de um método adequado. Por exemplo, uma construção pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula de planta empre-gando-setécnicas tal como eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula de planta, ou as construções podem ser introduzidas diretamente ao tecido de planta empregando-se métodos balísticos, tais como bombardeio de partícula de DNA. Por exemplo, veja, por exemplo, Christou (1997) Planta Mol. Biol. 35: 197 - 203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6: 17 - 30; Klein (1987) Nature 327: 70 - 73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72: 63 - 69, discutindo o uso de bombardeio de partícula para introduzir transgenes em trigo; e Adam (1997) supra, para uso de bombardeio de partícula para intro-duzir YACs em células de planta. Por exemplo, Rinehart (1997) supra, em-pregou o bombardeio de partícula para gerar plantas de algodão transgêni- cas. Mecanismos para acelerar as partículas são descritos na Patente dos Estados Unidos N° 5.015.580; e, o instrumento de aceleração de partícula PDS-2000 de BioRad (Biolistics) comercialmente disponível; veja da mesma forma, John, Patente dos Estados Unidos N° 5.608.148; e Ellis, Patente dos Estados Unidos N° 5.681.730, descrevendo a transformação mediada de partícula de gymnosperms.
Em um aspecto, os protoplastos podem ser imobilizados e inje-tados com um ácido nucléico, por exemplo, uma construção de expressão. Embora a regeneração de planta de protoplastos não seja fácil com cereais, a regeneração de planta é possível em legumes empregando a embriogêne- se somática de calo derivado de protoplasto. Os tecidos organizados podem ser transformados com DNA nu empregando-se técnica de pistola de gene, onde o DNA é revestido em microprojéteis de tungsténio, tiro 1/100° o tama-nho de células, que transportam a profundida de DNA em células e organe- las. O tecido transformado é em seguida induzido para regenerar, normal-mente por embriogênese somática. Esta técnica foi sucessiva em várias es-pécies de cereal incluindo milho e arroz.
Ácidos nucléicos, por exemplo, construções de expressão, po-dem ser introduzidos em células de planta empregando-se vírus recombi- nantes. As células de planta podem ser transformadas empregando-se veto-res virais, tais como, por exemplo, vetores derivados do vírus mosaico do tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33: 989 - 999), veja Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol. 5: 209 - 221.
Alternativamente, os ácidos nucléicos, por exemplo, uma cons-trução de expressão, podem ser combinados com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzidos em um vetor hospedeiro de Agrobacte-rium tumefaciens convencional. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens direcionará a inserção da construção e marcador adjacente no DNA de célula de planta quando a célula é infectada pelas bactérias. As técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaci- ens, incluindo o desarmamento e uso de vetores binários, são bem descritos na literatura científico. Veja, por exemplo, Horsch (1984) Science 233: 496498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995). O DNA em uma célula de A. tumefaciensestá contido no cromossoma bacteriano bem como em outra estrutura conhecida como um plasmídeo de Ti (indução de tumor). O plasmídeo de Ti contém uma extensão de DNA denominada T-DNA (~20 kb longo) que é transferido para a célula de planta no processo de infecção e uma série de genes de vir (virulência) que direcionam o processo de infecção. A. tumefaciens pode apenas infectar uma planta através de ferimentos: quando um talo ou raiz de planta é ferido ele produz certos sinais químicos, em resposta para que, os genes de vir de A. tumefaciens tornem-se ativados e direcionem uma série de eventos necessários para a transferência do T- DNA do plasmídeo de Ti para o cromossoma da planta. O T-DNA em seguida entra na célula da planta através do ferimento. Uma especulação é que o T-DNA espera até que o DNA da planta seja replicado ou transcrito, em seguida se insere no DNA da planta exposto. A fim de usar A. tumefaciens como um vetor de transgene, a seção de indução de tumor de T-DNA tem que ser removida, ao mesmo tempo que mantendo as regiões da borda do T- DNA e os genes vir. O transgene é em seguida inserido entre as regiões da borda do T-DNA, onde é transferido à célula de planta e torna-se integrado nos cromossomos da planta.
A invenção fornece a transformação de plantas monocotiledô- neas empregando-se os ácidos nucléicos da invenção, incluindo os cereais importantes, veja Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35: 205 - 218. Veja da mesma forma, por exemplo, Horsch, Science (1984) 233: 496; Fraley (1983) Proc. Natl Acad. Sci USA 80: 4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1135 - 1148, discutindo a integração de T-DNA em DNA genômico. Veja da mesma forma D’Halluin, Patente dos Estados Unidos N° 5.712.135, descrevendo um processo para a integração estável de um DNA compreen- dendo um gene que é funcional em uma célula de um cereal, ou outra planta monocotiledônea.
Em um aspecto, a terceira etapa pode envolver a seleção e re-generação de plantas inteiras capazes de transmitir o gene alvo incorporado à próxima geração. Tais técnicas de regeneração confiam na manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente confiando em um marcador de biocida e/ou herbicida que foi introduzido juntamente com as seqüências de nucleotídeo desejadas. A re-generação da planta de protoplastos cultivados é descrita em Evans e out-ros,Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124 - 176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Re-generation of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21 - 73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração pode da mesma forma ser obtida do calo da planta, explantes, órgãos, ou partes desta. Tais técnicas de regeneração são descri-tas geralmente em Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467 - 486. Para obter plantas inteiras de tecidos transgênicos tais como embriões imaturos, elas podem ser cultivadas sob condições ambientais controladas em umas séries de meios contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura de tecido. Logo que as plantas são geradas e produzem se-mente, a avaliação da descendência começa.
Depois que o cassete de expressão é estavelmente incorporado em plantas transgênicas, ele pode ser introduzido em outras plantas por cru-zamento sexual. Quaisquer das várias técnicas de reprodução padrão po-dem ser empregadas, dependendo a espécie a ser cruzada. Desde que a expressão transgênica dos ácidos nucléico da invenção leve as mudanças fenotípicas, as plantas compreendendo os ácidos nucléicos recombinantes da invenção podem ser sexualmente cruzadas com uma segunda planta pa-ra obter um produto final. Desse modo, a semente da invenção pode ser de-rivada de uma cruzamento entre as duas plantas transgênicas da invenção, ou um cruzamento entre uma planta da invenção e outra planta. Os efeitos desejados (por exemplo, expressão dos polipeptídeos da invenção para pro-duzir uma planta com teor de óleo ou lipídio alterado, aumentado e/ou dimi- nuído) podem ser realçados quando ambas as plantas parentais expressa-rem os polipeptídeos da invenção. Os efeitos desejados podem ser passados para gerações de planta futuras por meios de propagação padrão.
Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção são expressos em ou inseridos em qualquer planta ou semente. Plantas transgênicas da invenção podem ser dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Exemplos de plantas transgênicas monocot da invenção são gramas, tal como grama de prado (grama azul, Poa), grama de forragem tal como grama festuca, lólio, grama temperada tal como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveia, cen-teio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão). Exemplos de plantas transgênicas dicot da invenção são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterra-baaçucareira, ervilha, feijão e soja, e plantas cruciferosas (família Brassica- ceae), tal como couve-flor, semente de colza e o organismo modelo intima-mente relacionado Arabidopsis thaliana. Desse modo, as sementes e plantas transgênicas da invenção incluem uma ampla faixa de plantas, incluindo, porém não limitadas a, espécies dos gêneros Anacardium, Arachis, Aspara-gus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycina, Gos- sypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicoti- ana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pi- sum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna e Zea.
Em modalidades alternativas, os ácidos nucléicos da invenção são expressos em plantas que contêm células de fibra, incluindo, por exem-plo,algodão, árvore de algodão de seda (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro de deserto, arbusto de creosoto, winterfat, pau-de-balsa, rami, kenaf, câ-nhamo,roselle, juta, sisal, abacá e linho. Em modalidades alternativas, as plantas transgênicas da invenção podem ser membros do gênero Gos- sypium, incluindo membros de qualquer espécies de Gossypium, tal como G. arboreum; G. herbaceum, G. barbadense e G. hirsutum.
A invenção também fornece plantas transgênicas a ser empre- gadas para produzir quantidades grandes dos polipeptídeos (por exemplo, uma amilase, tal como uma alfa amilase) da invenção. Por exemplo, veja Palmgren (1997) Trends Genet. 13: 348; Chong (1997) Transgenic Res. 6: 289-296 (produzindo beta-caseína de proteína do leite humana em plantas de batata empregando um promotor de manopina sintase bidirecional, indu- zível por auxina (mas1’, 2’) com métodos de transformação de disco de folha mediados por Agrobacterium tumefaciens).
Empregando os procedimentos conhecidos, alguém experiente pode avaliar quanto às plantas da invenção detectando-se o aumento ou decréscimo de proteína ou mRNA de transgene em plantas transgênicas. Meios para detecção e quantificação de mRNAs ou proteínas são bem co-nhecidos na técnica.
Em um aspecto, a invenção produz ácidos graxos ou derivados de ácido graxo de plantas transgênicas da invenção, por exemplo, plantas oleaginosas transgênicas. Em um aspecto, plantas oleaginosas transgênicas compreendendo pelo menos uma hidrolase da invenção são produzidas. Em um aspecto, a planta transgênica compreende um gene de hidrolase opera- velmente ligado a um promotor, permitindo uma expressão do gene ou em compartimentos celulares, extracelulasres ou de tecido exceto aqueles nos quais os lipídeos de planta acumulam-se, ou permitindo a indução exógena da hidrolase. Em um aspecto, as sementes e/ou frutos contendo os lipídeos das plantas são coletados, as sementes e/ou frutos são amassados (se necessário após o tratamento por indução de gene de hidrolase (por exemplo, lipase) ) de modo a trazer em contato os lipídeos e hidrolase da invenção contidos nas sementes e/ou frutos. A mistura pode ser permitida incubar para permitir hidrólise enzimática dos lipídeos do material de terra por ação catalítica da lipase da invenção contido no material amassado. Em um aspecto, os ácidos graxos formados pela hidrólise são extraídos e/ou são convertidos a fim de obter os derivados de ácido graxo desejados.
Este processo de hidrólise enzimática da invenção emprega condições de operação brandas e pode ser de pequena escala e emprega instalações baratas. Neste aspecto a planta da invenção é induzida para produzir hidrolase para transformação de lipídeos de planta. Empregando-se esta estratégia, a enzima é prevenida de vir em contato com os lipídeos de planta armazenados a fim de evitar qualquer risco de hidrólise prematura ("auto-degradação da planta") após a colheita. O amassamento e incubação de unidades pode ser leve e de pequena escala; muitos são conhecidos na indústria agrícola e podem ser realizados nos sítios onde as plantas são co-lhidas.
Em um aspecto, as plantas transgênicas da invenção são produ-zidas por transformação de plantas oleaginosas naturais. As plantas geneti-camente transformadas da invenção são então reproduzidas sexualmente a fim de produzir sementes transgênicas da invenção. Estas sementes podem ser empregadas para obter progênie de planta transgênica.
Em um aspecto, o gene de hidrolase é operavelmente ligado a um promotor induzível para prevenir qualquer contato prematuro de hidro- lase e lipídeo de planta. Este promotor pode direcionar a expressão do gene em compartimentos exceto aqueles onde os lipídeos acumulam-se ou o promotor pode iniciar a expressão da hidrolase em um tempo desejado por uma indução exógena.
Polipeptídeos e peptídeos
Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos recombinan- tes ou isolados tendo a identidade de seqüência (por exemplo, pelo menos cerca de 50% de identidade de seqüência) para uma seqüência exemplar da invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 634, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 644, SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 694, SEQ ID NO: 696, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 774, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 780, SEQ ID NO: 782, SEQ ID NO: 784, SEQ ID NO: 786, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 790, SEQ ID NO: 792, SEQ ID NO: 794, SEQ ID NO: 796, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 800, SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 820, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 952 ou SEQ ID NO: 954. Como acima descrito, a identidade pode ser acima do tamanho natural do polipep- tídeo, ou, a identidade pode ser acima de uma região de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos. Os polipeptídeos da invenção podem ser da mesma forma mais curtos do que o tamanho natural dos polipeptídeos exemplares. Em aspectos alternativos, a invenção fornece polipeptídeos (peptídeos, fragmentos) variando no tamanho entre cerca de 5 e o tamanho natural de um polipeptídeo, por exemplo, uma enzima, tal como um amilase; tamanhos exemplares sendo de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650,700, ou mais resíduos. Os peptídeos da invenção podem também ser mais curtos do que o tamanho natural de polipeptí- deos exemplares. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo compreendendo apenas uma subseqüência de uma seqüência da invenção, subseqüências exemplares podem ser em torno de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, ou mais resíduos. Em aspectos alternativos, a invenção fornece polipeptídeos (peptídeos, fragmentos) variando em tamanho entre aproximadamente 5 e o tamanho natural de um poli- peptídeo, por exemplo, uma enzima, tal como uma hidrolase, incluindo uma esterase, uma acilase, uma lipase, uma fosfolipase ou uma protease; tama-nhos exemplares sendo de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, ou mais resíduos, por exemplo, resíduos contíguos de uma hidrolase exemplar da invenção. Peptídeos da invenção podem ser úteis como, por exemplo, sondas de rotulagem, antígenos, tole- rágenos, motifs, sítios ativos de hidrolase. Os peptídeos da invenção também incluem anticorpos capazes de ligação a uma hidrolase da invenção.
Os polipeptídeos da invenção incluem hidrolases em uma forma ativa ou inativa. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção incluem pro- proteínas antes da "maturação"ou processamento de prepro seqüências, por exemplo, por uma enzima de processamento de pro-proteína, tal como uma pro-proteína convertase para gerar uma proteína madura "ativa". Os polipeptídeos da invenção incluem hidrolases inativas por outras razões, por exemplo, antes da "ativação"por um evento de processamento pós- translacional, por exemplo, uma ação de endo- ou exo-peptidase ou protei-nase, um evento de fosforilação, uma amidação, uma glicosilação ou uma sulfação, um evento de dimerização, e outros. Os métodos para identificar seqüências de domínio "prepro" e seqüências sinal são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Van de Vem (1993) Crit. Ver. Oncog. 4(2): 115136. Por exemplo, para identificar uma seqüência prepro, a proteína é purificada do espaço extracelular e a seqüência de proteína de terminal N é de-terminada e comparada à forma não processada.
Os polipeptídeos da invenção incluem todas as formas ativas, incluindo subseqüências ativas, por exemplo, domínio catalíticos ou sítios ativos, de uma enzima da invenção. Em um aspecto a invenção fornece do-mínios catalíticos ou sítios ativos como mencionado abaixo. Em um aspecto, a invenção fornece um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo ou consis-tindo em um domínio de sítio ativo como predito através do uso de uma base de dados tal como Pfam (que é uma grande coleção de alinhamentos de seqüência múltiplos e modelos Markov ocultos abrangendo muitas famílias de proteína comuns, The Pfam protein families database, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S. R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K. L. Howe, M. Marshall, e E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30(1): 276-280, 2002) ou equivalente.
A invenção inclui polipeptídeos com ou sem uma seqüência sinal e/ou uma seqüência prepro. A invenção inclui polipeptídeos com seqüências sinal heterólogas e/ou seqüências prepro. A seqüência prepro (incluindo uma seqüência da invenção empregada como um domínio prepro heterólo- go) como ser localizada sobre a extremidade de terminal amino ou terminal carbóxi da proteína. A invenção também inclui seqüências sinal recombinan- tes ou isoladas, seqüências prepro e domínios catalíticos (por exemplo, "sítios ativos") compreendendo seqüências da invenção.
Os polipeptídeos e peptídeos da invenção podem ser isolados de fontes naturais, ser sintéticos, ou ser polipeptídeos recombinantemente gerados. Os peptídeos e proteínas podem ser recombinantemente expres-sosin vitro ou in vivo. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser feitos e isolados empregando qualquer método conhecido na técnica. O poli- peptídeo e peptídeos da invenção podem também ser sintetizados, inteiros ou em parte, empregando-se métodos químicos bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215 - 223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Sistems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por exemplo, a síntese de peptídeo pode ser realizada empregando-se várias técnicas de fase sólida (veja, por exemplo, Roberge (1995) Science 269: 202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289: 3-13) e síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, empregando o Sintetizador de Peptídeo ABI 431A (Perkin Elmer) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser também glicosilados. A glicosilação pode ser adicionada pós-translacionalmente qui-micamente ou por mecanismos biossintético celulares, em que o último in-corpora o uso de motifs de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos à seqüência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionados na seqüência de codificação de ácido nucléico. A glicosilação pode ser ligada por O ou ligada por N.
Os peptídeos e polipeptídeos da invenção, como definidos aci-ma, incluem todas as formas "miméticas"e "peptidomiméticas". Os termos "mimético"e peptidomimético refere-sem a um composto químico sintético que tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funci- onais dos polipeptídeos da invenção. O mimético pode ser completamente composto de análogos não-naturais, sintéticos de aminoácidos, ou, ser uma molécula quimérica de aminoácidos de peptídeo parcialmente natural e aná-logos parcialmente não-naturais de aminoácidos. O mimético pode também incorporar qualquer quantidade de substituições conservadoras de aminoá- cido natural contanto que tais substituições também não alterem substanci-almente a atividade e/ou estrutura do mimético. Como com polipeptídeos da invenção que são variantes conservadoras, a experimentação rotina deter-minará se um mimético está dentro do escopo da invenção, isto é, que sua estrutura e função não é substancialmente alterada. Desse modo, em um aspecto, uma composição mimética está dentro do escopo da invenção se tiver uma atividade de amilase.
As composições miméticas de polipeptídeo da invenção podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não naturais. Em aspecto alternativo, as composições miméticas da invenção incluem um ou todos os seguinte três grupos estruturais: a) grupos de ligação de resíduo exceto as uniões de ligação ("ligação de peptídeo") de amida naturais; b) resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência na-tural; ou c) resíduos que induzem a imitação estrutural secundária, isto é, induzir ou estabilizar uma estrutura secundária, por exemplo, uma rotação beta, rotação gama, lâmina beta, conformação de hélice alfa, e similares. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser caracterizado como um mimético quando todos ou alguns de seus resíduos são unidos por meios químicos exceto ligações de peptídeo naturais. Os resíduos peptidomiméti- cos individuais podem ser unidos por ligações de peptídeo, outras ligações químicas ou meios de acoplamento, tais como, por exemplo, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisucinimida, maleimidas bifuncionais, N,N’-dicicloexil- carbodiimida (DCC) ou N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Grupos de liga-ções que podem ser uma alternativa para as uniões de ligação de amida tradicional ("ligação de peptídeo), por exemplo, cetometileno (por exemplo, - C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tiomida ou éster (veja, por exemplo, Spatola (1983) em Chemistry and Bio-chemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Pepti-de Backbone Modifications", Marcell Dekker, NY).
Um polipeptídeo da invenção pode também ser caracterizado da mesma forma como um mimético contendo-se todos ou alguns resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência natural. Resíduos não naturais são bem descritos na literatura de patente e científica; algumas composições não naturais exemplares úteis como miméticos de resíduos de aminoácido naturais e diretrizes são descritas abaixo. Os miméticos de ami- noácidos aromáticos podem ser gerados substituindo-se por, por exemplo, D- ou L-nafilalanina; D- ou L-fenilglicina; D- ou L-2 tieneilalanina; D- ou L-1, - 2, 3 -, ou 4-pirenoilalanina; D- ou L-3 tienoilalanina; D- ou L-(2-piridinil)- alanina; D- ou L-(2-piridinil)-alanina; D- ou L-(2-pirazinil)-alanina; D- ou L-(4- isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalani- na; D-p-fluoro-fenilalanina; D- ou L-p- bifenilfenilalanina; D- ou L-p-metóxi- bifenilfenilalanina; D- ou L-2-indol (alquil)alaninas; e, D- ou L-alquilaininas, onde alquila pode ser etila, propila, hexila, butila, pentila, isopropila, iso-buti- la, sec-isotila, iso-pentila substituídas ou não substituídas, ou aminoácidos não acídicos. Anéis aromáticos de um aminoácido não natural incluem, por exemplo, anéis aromáticos de tiazolila, tiofenila, pirazolila, benzimidazolila, naftila, furanila, pirrolila e piridila. Miméticos de aminoácidos acídicos podem ser gerados por substituição por, por exemplo, aminoácidos de não carboxilato ao mesmo tempo que mantendo uma carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Grupos laterais de carboxila (por exemplo, aspartila ou glutamila) podem também ser seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R’-N- C-N-R’) tal como, por exemplo, cicloexil-3(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil) carbodiimida. Aspartila ou glutamila podemtambém ser convertidos em resíduos de asparaginila e glutaminila por reação com íons de amônio. Os miméticos de aminoácidos básicos podem ser gerados por substituição com, por exemplo, (além de lisina e arginina) os aminoácidos ornitina, citrulina, ou ácido (guanidino)-acético ou ácido (guani- dino)alquil-acético, onde a alquila é definida anteriormente. O derivado de nitrilo (por exemplo, contendo a porção de CN no lugar de COOH) pode ser substituído por asparagina ou glutamina. Resíduos de asparaginila e gluta- minila podem ser desaminados aos resíduos de aspartila ou glutamila cor-respondentes. Os miméticos de resíduo de arginina podem ser gerados rea-gindo-se arginila com, por exemplo, um ou mais reagentes convencionais, incluindo, por exemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona, ou ninidrina, preferivelmente sob condições alcalinas. Os miméticos de resí-duo de tirosina podem ser gerados reagindo-se tirosila com, por exemplo, compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. N-acetilimidazol e tetranitrometano podem ser empregados para formar espécies de acetil tiro- sila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os miméticos de resíduo de cisteína podem ser gerados reagindo-se resíduos de cisteinila com, por exemplo, alfa-haloacetatos tais como ácido 2-cloroacético ou cloroacetamida e aminas correspondentes; para produzir derivados de carboximetila ou car- boxiamidometila. Os miméticos de resíduo de cisteína podem também ser gerados reagindo-se resíduos de cisteinila com, por exemplo, bromo- trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propiônico; fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila; dissulfeto de 2-piridila de metila; p-cloromercuribenzoato; nitrofenol de 2-cloromercuri-4; ou, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Os miméticos de lisina podem ser ge-rados (e resíduos de terminal de amino podem ser alterados) reagindo-se lisinila com, por exemplo, sucínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. Lisina e outros miméticos de resíduo contendo alfa-amino podem ser gera-dos da mesma forma por reação com imidoésteres, tais como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroboroidreto, ácido trinitro- benzenossulfônico, O-metilisouréia, 2,4,pentanodiona e reações catalisadas por transamidase com glioxilato. Os miméticos de metionina podem ser ge-rados por reação com, por exemplo, sulfóxido de metionina. Os miméticos de prolina incluem, por exemplo, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazo- lidina, 3- ou 4-hidróxi prolina, desidroprolina, 3- ou 4-metilprolina, ou 3,3- dimetilprolina. Os miméticos de resíduo de histidina podem ser gerados rea- gindo-se histidila com, por exemplo, dietilprocarbonato ou brometo de para- bromofenacila. Outros miméticos incluem, por exemplo, aqueles gerados por hidroxilação de prolina e lisina; fosforilação dos grupos de hidroxila de resí-duos de serila ou treonila; metilação dos grupos de alfa-amino de lisina, ar- ginina e histidina; acetilação da amina de terminal N; metilação de resíduos de amida de cadeia principal ou substituição com aminoácidos de N-metila; ou amidação de grupos de carboxila de terminal C.
Um resíduo, por exemplo, um aminoácido, de um polipeptídeo da invenção pode ser substituído da mesma forma por um aminoácido (ou resíduo peptidomimético) da quiralidade oposta. Desse modo, qualquer ami- noácido de ocorrência natural na configuração de L (que pode ser da mesma forma referido como o R ou S, dependendo da estrutura da entidade química) pode ser substituído com o aminoácido do mesmo tipo estrutural químico ou um peptidomimético, porém a quiralidade oposta, referida como o D- aminoácido, porém da mesma forma pode ser referido como a forma de R- ou S-.
A invenção também fornece métodos para modificar os polipep- tídeos da invenção por processos naturais, tal como processo pós- translacional (por exemplo, fosforilação, acilação, etc), ou por técnicas de modificação química, e os polipeptídeos modificados resultantes. As modifi-cações podem ocorre em qualquer lugar no polipeptídeo, incluindo a cadeia principal de peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e os terminais de amino ou carboxila. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente nos mesmos ou variados graus em vários sítios em um de-terminadopolipeptídeo. Da mesma forma, um determinado polipeptídeo pode ter muitos tipos de modificações. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção de heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado de lipí-dio,ligação covalente de um fosfatidilinositol, ciclização de reticulação, for-mação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações co-valentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, ga- ma-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, io- dação, metilação, miristoliação, oxidação, peguilação, processo proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfationa, adição medi-ada por transferência de RNA de aminoácidos a proteína tal como arginila- ção. Veja, por exemplo, Creighton, T. E., Proteins-Structure and Molecular Properties 2a Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Post- translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12(1983).
Métodos de síntese de peptídeo química de fase sólida podem da mesma forma ser empregados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmen-tos da invenção. Tal método foi conhecido na técnica desde os primórdios de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154, 1963) (Veja, da mesma forma, Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthe-sis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III., pp.11-12)) e foram recente-mente empregados em projeto de peptídeo de laboratório comercialmente disponível e kits de síntese (Cambridge Research Biochemicals). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis têm geralmente utilizado os ensina-mentos de H. M. Geysen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3998 (1984) e fornecem peptídeos sintetizadores nas pontas de uma multidão de "bastões"ou "pinos" todos dos quais são conectados em uma única placa. Quando um tal sistema é utilizado, uma placa de bastões ou pinos é inverti-da e inserida em uma segunda placa de reservatórios ou cavidades corres-pondentes, que contêm soluções para ligar ou ancorar um aminoácido apro-priadoàs pontas do bastão ou pino. Repetindo-se uma tal etapa de processo, isto é, inverter e inserir as pontas do bastão ou pino nas soluções apro-priadas, os aminoácidos são construídos em peptídeos desejados. Além dis-so,vários sistemas de síntese de peptídeo FMOC disponíveis estão disponí-veis. Por exemplo, a montagem de um polipeptídeo ou fragmento pode ser realizada sobre um suporte sólido empregando um sintetizador automático Modelo 431ATM Applied Biosystems, Inc. Tal equipamento forence pronto acesso aos peptídeos da invenção, por síntese direta ou por síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados empregando outras técnicas conhecidas.
Enzimas da invenção
A invenção fornece novas hidrolases incluindo esterases, acila- ses, lipases, fosfolipases ou proteases, por exemplo, proteínas compreen-dendo pelo menos cerca de 50% de identidade de seqüência para um poli- peptídeo exemplar da invenção, por exemplo, uma proteína tendo uma se- qüência como mencionado na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, etc., anticorpos que os ligam, e métodos para preparar e em-pregá-los. Os polipeptídeos da invenção podem ter qualquer atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfoli- pase ou protease. Em aspectos alternativos, uma atividade de uma enzima da invenção compreende hidrólise ou síntese de lipídeos ou óleos. As hidro- lases da invenção podem modificar óleos por hidrólise, alcoólise, esterifica- ção, transesterificação e/ou interesterificação, incluindo reações de "migra-ção forçada".
Em aspectos alternativos, as hidrolases da invenção podem ter atividades modificadas ou novas quando comparadas às hidrolases exem-plares ou às atividades aqui descritas. Por exemplo, a invenção inclui hidro- lases com ou sem seqüências sinal e as próprias seqüências sinal. A inven-ção inclui hidrolases imobilizadas, anticorpos anti-hidrolase e fragmentos destes. A invenção fornece proteínas para inibir a atividade de hidrolase, por exemplo, anticorpos que ligam-se ao sítio ativo de hidrolase. invenção inclui homodímeros e heterocomplexos, por exemplo, proteínas de fusão, hetero- dímeros, etc., compreendendo as hidrolases da invenção. A invenção inclui hidrolases tendo atividade em uma ampla faixa de temperaturas e pH's ele-vados e baixos (por exemplo, condições aquosas acídicas e básicas).
Em um aspecto, uma ou mais hidrolases (por exemplo, lipases) da invenção são empregadas para a síntese biocatalítica de lipídeos estrutu-rados, isto é, lipídeos que contêm um grupo definido de ácidos graxos distri-buídos de uma maneira definida sobre a cadeia principal de glicerol, incluin-do alternativas de manteiga de cacau, ácidos graxos poliinsaturados (PU- FAs), glicerídeos de 1,3-diacila (DAGs), 2-monoglicerídeos (MAGs) e triacil- glicerídeos (TAGs).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos de gerar enzimas tendo Kcat/Km alterado (mais elevado ou menor). Em um aspecto, as muta- gênese direcionada ao sítio é empregada para criar enzimas de hidrolase adicionais com especificidades de substrato alternativas. O que pode ser feito, por exemplo, por replanejamento da região de ligação de substrato ou do sítio ativo da enzima. Em um aspecto, as hidrolases da invenção são mais estáveis em temperaturas elevadas, tais como 80°C a 85°C a 90°C a 95°C, quando comparado às hidrolases de organismos convencionais ou moderados.
Várias proteínas da invenção têm uma atividade de hidrolase, por exemplo, uma atividade de esterase, acilase, lipase, fosfolipase ou pro-tease, sob várias condições. A invenção fornece métodos de preparar hidro- lases com diferentes eficiência catalítica e estabilidades com respeito à tem-peratura, agentes de oxidação e condições de pH. Estes métodos podem empregar, por exemplo, as técnicas de mutagênese direcionada ao sítio e/ou mutagênese aleatória. Em um aspecto, a evolução direta pode ser emprega-da para produzir hidrolases com especificidades e estabilidade alternativas.
As proteínas da invenção são empregadas em métodos da in-venção que podem identificar moduladores de hidrolase, por exemplo, ativa- dores ou inibidores. Em síntese, amostras de teste (por exemplo, compostos, tais como membros de peptídeo ou bibliotecas combinatoriais, caldos, extratos, e similares) são adicionadas a ensaios de hidrolase para determinar sua capacidade de modular, por exemplo, inibir ou ativar, clivagem de substrato. Estes inibidores podem ser empregados em indústria e pesquisa para reduzir ou prevenir isomerização indesejada. Os moduladores encon-trados empregando-se os métodos da invenção podem ser empregados para alterar (por exemplo, diminuir ou aumentar) o espectro de atividade de um hidrolase.
A invenção também fornece métodos de descobrir hidrolases empregando os ácidos nucléicos, polipeptídeos e anticorpos da invenção. Em um aspecto, bibliotecas de fago de lambda são avaliadas quanto a des- coberta com base na expressão de hidrolases. Em um aspecto, a invenção emprega bibliotecas de fago de lambda na avaliação para permitir a detecção de clones tóxicos; acesso melhorado ao substrato; necessidade reduzida para construir um hospedeiro, desviando-se o potencial para qualquer tendência resultante de excisão de massa da biblioteca; e, crescimento mais rápido em baixas densidades de clone. A avaliação de bibliotecas de fago lambda pode estar em fase líquida ou em fase sólida. Em um aspecto, a in-venção fornece avaliação em fase líquida. Isto produz uma flexibilidade mai-or em condições de ensaio; flexibilidade de substrato adicional; sensibilidade mais alta para clones fracos; e facilidade de automatização sobre a avaliação de fase sólida.
A invenção fornece métodos de avaliação empregando as prote-ínas e ácidos nucléicos da invenção e automatização robótica para permitir a execução de muitos milhares de reações biocatalíticas e ensaios de avalia-ção em um período curto de tempo, por exemplo, por dia, bem como garan-tindo um alto nível precisão e capacidade de reprodução (veja discussão de disposições, abaixo). Como um resultado, uma biblioteca de compostos de-rivados pode ser produzida em uma questão de semanas.
A presente invenção inclui enzimas de hidrolase que são variantes de carbonila hidrolase de ocorrência não natural tendo uma atividade hidrolase diferente, estabilidade, especificidade de substrato, perfil de pH e/ou característica de desempenho quando comparados à hidrolase de ocorrência não natural. Estas hidrolkases têm uma seqüência de aminoácido não encontrada em natura. Elas podem ser derivadas pela substituição de uma pluralidade de resídus de aminoácido de uma hidrolase precursora com diferentesaminoácidos. A hidrolase precursora pode ser uma hidrolase de ocorrência natural ou uma hidrolase recombinante. Em um aspecto, as variantes de hidrolase abrange a substituição de quaisquer dos aL-ainoácidos de ocorrências natural nas posições de resíduo de aminoácido designadas.
Seqüências de Sinal de Hidrolase, domínios prepro e catalíticos
A invenção fornece seqüências sinal (por exemplo, peptídeos sinal (SPs)), domínios prepro e domínios catalíticos (CDs). Os SPs, domí- nios prepro e/ou CDs da invenção podem ser peptídeos recombinantes ou isolados ou podem ser parte de uma proteína de fusão, por exemplo, como um domínio heterólogo em uma proteína quimérica. A invenção fornece áci-dosnucléicos codificando estes domínios catalíticos (CDs), domínios prepro e seqüências sinal (SPs, por exemplo, um peptídeo tendo uma seqüência compreendendo/consistindo em resíduos de terminal amino de um polipeptí- deo da invenção). Em um aspecto, a invenção fornece uma seqüência sinal compreendendo um peptídeo compreendendo/consistindo em uma seqüên- cia como mencionado nos resíduos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30 ou 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, ou 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44 (ou um peptídeo mais longo) de um polipeptídeo da invenção.
As seqüências de sinal de hidrolase (SPs), CDs, e/ou seqüên- cias prepro da invenção podem ser peptídos isolados, ou, seqüências unidas à outra hidrolase ou um polipeptídeo de não-hidrolase, por exemplo, como uma proteína de fusão (quimérica). Em um aspecto, a invenção fornece poli- peptídeos compreendendo seqüências sinal de hidrolase da invenção. Em um aspecto, os polipeptídeos compreendendo seqüências sinal de hidrolase SPs, CDs, e/ou prepro da invenção compreendem seqüências heterólogas às hidrolases da invenção (por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo um SP, CD, e/ou prepro da invenção e seqüências de outra hidrolase ou uma proteína de não hidrolase). Em um aspecto, a invenção fornece hi- drolases da invenção com seqüências SPs heterólogos, CDs, e/ou prepro, por exemplo, seqüências com uma seqüência sinal de levedura. A hidrolase da invenção pode compreender um SP heterólogo e/ou prepro em um vetor, por exemplo, um vetor da série pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Em um aspecto, seqüências SPs, CDs, e/ou prepro da invenção são identificadas seguindo a identificação de novos polipeptídeos de hidro- lase. As trilhas pelas quais as proteínas são classificadas e transportadas para sua localização apropriada são freqüentemente referidas como trilhas de alvejamento de proteína. Um dos mais importantes elementos em todos estes sistemas de alvejamento é uma seqüência de aminoácido curta na terminal amino de um polipeptídeo recentemente sintetizado chamado a se- qüência sinal. Esta seqüência sinal direciona uma proteína para sua locali-zação apropriada n célula e é removida durante o transporte ou quando a proteína alcança sua destinação final. A maior parte das proteínas lisossô- micas, membrana, ou secretadas tem uma seqüência sinal de terminal ami-no que as marca para translocação no lúmen do retículo endoplásmico. As seqüências sinal podem variar em comprimento de 13 a 45 ou mais resíduos de aminoácido. Por exemplo, em um aspecto, os novos peptídeos sinal de hidrolase são identificados por um método referido como SinalP. O SinalP emprega uma rede neural que reconhece igualmente os peptídeos sinal e seus sítios de clivagem. (Nielsen, e outros, "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavagem sites.""Protein Engineering, vol. 10, no. 1, p. 1 - 6 (1997).
Deve ser entendido que em alguns aspectos as hidrolases da invenção não podem ter seqüências SPs e/ou prepro, e/ou domínios catalíti-cos (CDs). Em um aspecto, a invenção fornece polipeptídeos (por exemplo, hidrolases) necessitando de toda ou parte de um SP, um CD e/ou um domí-nio prepro. Em um aspecto, a invenção fornece uma seqüência de ácido nu- cléico codificando uma seqüência sinal (SP), um CD, e/ou prepro de uma hidrolase operavelmente ligada a uma seqüência de ácido nucléico de uma hidrolase diferente ou, opcionalmente, uma seqüência sinal (SPs) e/ou do-mínio prepro de uma proteína de não hidrolase pode ser desejada.
A invenção também fornece polipeptídeos isolados ou recombi- nantes compreendendo seqüências sinal (SPs), domínio prepro e/ou domí-nioscatalíticos (CDs) da invenção e seqüências heterólogas. As seqüências heterólogas são seqüências não naturalmente associadas (por exemplo, a uma hidrolase) com um SP, domínio prepro e/ou CD. A seqüência a qual o SP, domínio prepro e/ou CD não está associada naturalmente pode estar na extremidade de terminal amino de CD, domínio prepro e/ou SP, extremida-des de terminal carbóxi e/ou ambas as extremidades de SP e/ou CD. Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou isolado com- preendendo (ou consistindo em) um polipeptídeo compreendendo uma se- qüência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da inven-ção com a condição de que não esteja associado com qualquer seqüência a qual está naturalmente associado (por exemplo, seqüência de hidrolase). Similarmente em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos recombi- nantes ou isolados codificando estes polipeptídeos. Desse modo, em um aspecto, o ácido nucléico recombinante ou isolado da invenção compreende codificar a seqüência para uma seqüência sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção e uma seqüência heterológa (isto é, uma seqüência não naturalmente associada com uma seqüência sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) da invenção). A seqüência heteró- loga pode estar na extremidade de terminal 3’, extremidade de terminal 5’ e/ou em ambas as extremidades do SP, domínio prepro e/ou seqüência de codificação CD.
A invenção provê a fusão de subsequencias de terminal N ou terminal C de enzimas da invenção (por exemplo, seqüências sinal, seqüên- cias prepro) com outros polipeptídeos, proteínas ativas ou fragmentos de proteína. A produção de uma enzima da invenção (por exemplo, uma hidro- lase, por exemplo, uma lipase tal como uma fosfolipase) pode também ser realizada expressando-se a enzima como uma proteína de fusão inativa que é posteriormente ativada ou um evento de clivagem proteolítica (empregan-do-se uma atividade de protease endógena ou exógena, por exemplo, tripsi- na) que resulta na separação do parceiro de proteína de fusão e a enzima- madura, por exemplo, hidrolase da invenção. Em um aspecto, a proteína de fusão da invenção é expressa de uma construção de nucleotídeo híbrido que codifica uma única estrutura de leitura aberta contendo os seguintes elementos: a seqüência de nucleotídeo para a proteína de fusão, uma seqüência ligadora (definida como uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma se- qüência de aminoácido flexível que une dois domínios de proteína menos flexível), sítio de reconhecimento de clivagem de protease, e a seqüência de enzima madura (por exemplo, qualquer enzima da invenção, por exemplo, uma hidrolase). Em aspectos alternativos, a proteína de fusão pode compre- ender uma seqüência de liase de pectato, uma seqüência de xilanase, uma seqüência de fosfatase de ácido fosfatídico, ou outra seqüência, por exem-plo, uma seqüência que foi previamente mostrada ser superexpressa em um sistema hospedeiro de interesse. Qualquer sistema hospedeiro pode ser empregado (veja descrição, acima), por exemplo, E. coli ou Pichia pastoris. A disposição das seqüências de nucleotídeo na construção de nucleotídeo quimérico pode ser determinada com base nos níveis de expressão de pro-teína obtidos com cada construção de fusão. Prosseguindo da extremidade 5' da construção de nucleotídeo para a extremidade principal 3' da constru-ção, em um aspecto, a seqüência de nucleotídeo é agrupada como segue: seqüência sinal/proteína de fusão/seqüência ligadora/ sítio de reconheci-mento de clivagem de protease/ enzima madura (por exemplo, qualquer en-zima da invenção, por exemplo, uma hidrolase) ou seqüência Si- nal/seqüência pro/ enzima madura/ seqüência ligadora/ proteína de fusão. A expressão de enzima (por exemplo, qualquer enzima da invenção, por exemplo, uma hidrolase) como uma proteína de fusão inativa pode melhorar a expressão total da seqüência de enzima, pode reduzir qualquer toxidade potencial associada com a super produção de enzima ativa e/ou pode au-mentar a vida de prateleira de enzima antes do uso por que a enzima seria inativa até a proteína de fusão, por exemplo, liase de pectato ser separada da enzima, por exemplo, hidrolase da invenção.
Em vários aspectos, a invenção fornece formulações específicas para a ativação de uma hidrolase da invenção expressas como uma proteína de fusão. Em um aspecto, as ativação da atividade de hidrolase inicialmente expressa como uma proteína de fusão inativa é realizada empregando-se uma atividade proteolítica ou potencialmente uma atividade proteolítica em combinação com uma peptidase de terminal amino ou terminal carboxila (a peptidase pode ser uma enzima da invenção, ou, outra enzima. Este evento de ativação pode ser realizado de uma variedade de maneiras e em varie-dade de pontos no processo de fabricação/armazenagem antes da aplica- çãso em desengomadura de óleo. Os processos exemplares das invenção incluem: Clivagem por uma atividade endógena expressa pelo hospedeiro de fabricação na secreção da construção de fusão nos meios de fermentação; Clivagem por uma atividade de protease endógena (que pode ser uma pro-tease da invenção) que é ativada ou vem em contato com construção de fusão intracelularmente expressa na ruptura das células hospedeiras; Pas-sagem da construção de fusão crua ou purificada em uma coluna de ativida-de de protease imobilizada (que pode ser uma protease da invenção) para realizar a ativação de clivagem e enzima (por exemplo, hidrolase da inven-ção, por exemplo, protease, lipase, esterase ou fosfolipase)antes da formu-lação de enzima; Tratamento da construção de fusão crua ou purificada com uma fonte de atividade proteolítica; Ativação de uma hidrolase (por exemplo, uma hidrolase da invenção) na refinaria de óleo empregando-se uma fonte solúvel ou insolúvel de atividade proteolítica imediatamente antes do uso no processo; e/ou, Ativação da atividade de hidrolase (por exemplo, uma hidro- lase da invenção) continuamente circulando a formulação de construção de fusão através de uma coluna de atividade de protease imobilizada em tem-peratura reduzida (por exemplo, qualquer entre cerca de 4°C e 20°C). Este evento de ativação pode ser realizado antes da liberação para o sítio de uso ou pode ocorrer no local na refinaria de óleo.
Glicosilação
Os peptídeos e polipeptídeos da invenção (por exemplo, hidrola- ses, anticorpos) podem também ser glicosilados, por exemplo, em um as-pecto, compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação, por exemplo, uma glicosilação ligada por N ou ligada por O. Em um aspecto, o polipeptí- deo pode ser glicosilado após ser expresso em um P. pastoris ou um S. pombe. A glicosilação pode ser adicionada pós-translacionalmente ou quimicamente ou por mecanismos biossintéticos celulares, onde o último incorpora o uso de motifs de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos para a seqüência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionados na seqüência de codificação de ácido nucléico.
Ensaios para atividade de fosfolipase
A invenção fornece polipeptídeos isolados ou recombinantes tendo uma atividade de fosfolipase e ácidos nucléicos codificando-os.
Quaisquer dos muitos ensaios de atividade de fosfolipase conhecidos na técnica podem ser empregados para determinar se um polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase e inclui-se no escopo da invenção. Os protocolos de rotina para determinar as atividades de fosfolipase A, B, D e C, patatina e lipídeo acil hidrolase são bem conhecidas na técnica.
Os ensaios de atividade exemplar incluem ensaios de turbidez, ensaios de fosfocolina de metil umbeliferila, ensaios de cromatografia de camada fina (TLC), ensaios citolíticos e ensaios de p-nitrofenilfosforilcolina. Empregando-se estes ensaios os polipeptídeos podem ser rapidamente ana-lisados quanto à atividade de fosfolipase.
A atividade de fosfolipasse pode compreender uma atividade de lipídeo acil hidrolase. Veja, por exemplo, Jimenez (2001) Lipids 36: 1169-1174, descrevendo um ensaio micelar misto com base em éter de monodo-decila de octaetileno glicol para determinar a atividade de lipídeo acil hidro- lase de uma patatina. Pinsirodom (2000) J. Agric. Food Chem. 48: 155-160, descreve uma atividade de patatina de de lipídeo acil hidrolase exemplar (LAH).
Os ensaios de turbidez para determinar a atividade de fosfoli- pase são descritos, por exemplo, em Kauffmann (2001) "Conversão de Baci-llus thermocatenulatus lipase em uma fosfolipase eficiente com atividade aumentada com respeito aos substratos de acila graxa de cadeia longa por evolução direcionada e planejamento racional", Protein Engineering 14: 919928; Ibrahim (1995) "Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of Candida albicans", Infect. Immun. 63: 1993-1998.
Os ensaios de fosfocolinade metilumbeliferila (fluorescente) para determinar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Goode (1997) "Evidence for cell surface and internal phospholipase activity in ascidian eggs", Develop. Growth Differ. 39: 655-660; Diaz (1999) "Direct fluorescence-based lipase activity assay", BioTechniques 27: 696-700.
Ensaios de Vermelho Amplex Fosfolipase (fluorescente) para determinar a atividade de fosfolipase estão disponíveis como Kits, por exemplo, a detecção de fosfolipase específica de fosfastidilcolina empregan- do-se um kit de ensaio de fosfolipase específico de Amplex Red fosfatidilco- lina de Molecular Probes Inc. (Eugene, OR), de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência é avaliada em uma leitora de microplaca de fluo-rescência empregando-se excitação a 560 + 10 nm e detecção de fluores-cência a 590 + 10 nm. O ensaio é sensível em concentrações de enzima muito baixas.
Os ensaios de cromatografias de camada fina (TLC) para deter-minar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197: 3-13; Taguchi (1975) "Phospholipase from Clostridium novyi type A.I", Biochim. Biophys. Acta 409: 75-85. Cromatogra- fia de camada fina (TLC) é uma técnica amplamente empregada para detec-ção de atividade de fosfolipase. Várias modificações deste método foram empregadas para extrair os fosfolipídeos das misturas de ensaio aquoso. Em alguns ensaios de PLC a hidrólise é interrompida pela adição de cloro- fórmio/metanol (2: 1) à mistura de reação. O material de partida não reagido e o diacilglicerol são extraídos na fase orgânica e pode ser fracionado por TLC, enquanto que o produto de grupo de cabeça permanece na fase aquosa. Para avaliação mais precisa da digestão de fosfolipídeo, substratos ra- diorotulados podem ser empregados (veja, por exemplo, Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197: 3-13). As relações de produtos e reagentes podem ser empregadas para calcular o número real de moles de substrato hi- drolizado por tempo de unidade. Se todos os componentes são igualmente extraídos, quaisquer perdas na extração afetarão todos os componentes igualmente. A separação de produtos de digestão de fosfolipídeo pode ser obtida por TLC de sílica gel com clorofórmio/metanol/água (65: 25: 4) em-pregado como um sistema solvente (veja, por exemplo, Taguchi (1975) Bio- chim. Biophys. Acta 409: 75-85).
Os ensaios de p-Nitrofenilfosforilcolina para determinar a ativi-dade de fosfolipase são descritos, por exemplo, em Korbsrisate (1999) J. Clin. Microbiol. 37: 3742-3745; Berka (1981) Infect. Immun. 34: 1071-1074. Este ensaio é baseado na hidrólise enzimática do análogo de substrato p- nitrofenilfosforilcolina para liberar um composto cromogênico amarelo p- nitrofenol, detectável a 405 nm. Este substrato é conveniente para avaliação de produtividade elevada.
Um ensaio citolítico pode detectar as fosfolipases com atividade citolítica com base em lise de eritrócitos. As fosfolipases tóxicas podem inte-ragir com membranas de célula eucariótica e hidrolizam fosfastidilcolina e esfingomielina, induzindo à lise celular. Veja, por exemplo, Titball (1993) Mi-crobiol. Ver. 57: 347-366.
Hidrolases híbridas e bibliotecas de peptídeo
Em um aspecto, a invenção fornece hidrolases híbridas e proteí-nas de fusão, incluindo bibliotecas de peptídeo, compreendendo seqüências da invenção. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser empregadas para isolar os moduladores de peptídeo (por exemplo, ativadores ou inibidores) de alvos. As bibliotecas de peptídeo da invenção podem ser empregadas para identificar parceiros de ligação formais de alvos, tais como ligan- dos, por exemplo, citocinas, hormônios e similares.
Em um aspecto, as proteínas de fusão da invenção (por exem-plo, a porção de peptídeo) são conformacionalmente estabilizadas (relativas a peptídeos lineares) para permitir uma afinidade de ligação mais elevada para alvos. A invenção fornece fusões de hidrolases da invenção e outros peptídeos, incluindo peptídeos aleatórios e conhecidos. Eles podem ser fun-didos de uma tal maneira que a estrutura das hidrolases não é perturbada significativamente e o peptídeo é metabolicamente ou estruturalmente con- formacionalmente estabilizado. Isto permite a criação de uma biblioteca de peptídeo que é facilmente monitorada igualmente quanto sua presença den-tro das células e sua quantidade.
Variantes de seqüência de aminoácido da invenção podem ser caracterizadas por uma natureza predeterminada da variação, uma caracte-rística que as fixa aparte de uma forma de ocorrência natural, por exemplo, uma variação interespécie ou alélica de uma seqüência de hidrolase. Em um aspecto, as variantes da invenção exibem a mesma atividade biológica qualitativa como o análogo de ocorrência natural. Alternativamente, as variantes podem ser selecionadas por ter características modificadas. Em um aspecto, enquanto o sítio ou região para introduzir uma variação de seqüência de aminoácido é predeterminado, a mutação per se não necessita ser prede-terminada. Por exemplo, a fim de otimizar o desempenho de uma mutação em um determinado sítio, mutagênese aleatória pode ser conduzida na regi-ão ou códon alvo e as variantes de hidrolase expressas avaliadas quanto à combinação ideal da atividade desejada. As técnicas para preparar mutações de substituição em sítios predeterminados em DNA tendo uma seqüên- cia conhecida são bem conhecidas, como descritas aqui por exemplo, muta- gênese de iniciador M13 e mutagênese de PCR. A avaliação dos mutantes pode ser feita empregando ensaios de atividades proteolíticas. Em aspectos alternativos, substituições de aminoácido podem ser resíduos únicos; inser-ções podem estar na ordem de cerca de 1 a 20 aminoácidos, embora inser-ções consideravelmente maiores podem ser feitas. As deleções podem variar de cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70 resíduos ou mais. Para obter um derivado final com as propriedades ideais, substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação destas podem ser empregadas. Geralmente, estas mudanças são feitas em alguns aminoácidos para minimizar a alteração da molécula. Entretanto, mudanças maiores podem ser toleradas em certas circunstâncias.
A invenção fornece hidrolases onde a estrutura da cadeia princi-pal do polipeptídeo, a estrutura secundária ou a terciária, por exemplo, uma estrutura de lâmina beta ou alfa-helicoidal foi modificada. Em um aspecto, a carga ou hidrofobicidade foi modificada. Em um aspecto, o volume de uma cadeia lateral foi modificado. As mudanças substanciais na função ou identidadeimunológica são feitas selecionando-se as substituições que são menos conservadoras. Por exemplo, as substituições podem ser feitas as quais mais significativamente afetam: a estrutura da cadeia principal de polipeptí- deo na área da alteração, por exemplo de uma estrutura alfa-helicoidal ou uma lâmina beta; uma carga ou um sítio hidrofóbico da molécula, que pode estar em um sítio ativo; ou uma cadeia lateral. A invenção fornece substituições no polipeptídeo da invenção onde (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, serila ou treonila, é substitui pelo (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucila, isoleucila, fenilalanila, valila ou alanila; (b) uma cisteína ou prolina é substituída pelo (ou por) qualquer outro resíduo; (c) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila, ou histi- dila, é substituído pelo (ou por) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glu- tamila ou aspartila; ou (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído pelo (ou por) um não tendo uma cadeia lateral, por exemplo, glicina. As variantes podem exibir a mesma ativi-dadebiológica qualitativa (isto é, atividade de hidrolase) embora as variantes possam ser selecionadas para modificar as características das hidrolases quando necessárias.
Em um aspecto, as hidrolases da invenção compreendem epíto- pos ou rótulos de purificação, seqüências sinal ou outras seqüências de fu-são, etc. Em um aspecto, as hidrolases da invenção podem ser fundidas pa-ra um peptídeo aleatório para formar um polipeptídeo de fusão. Por "fundido" ou "operativamente ligado" aqui é entendido que o peptídeo aleatório e a hidrolase são ligados juntos, de uma tal maneira como para minimizar o rompimento à estabilidade da estrutura de hidrolase, por exemplo, mantém a atividade de hidrolase. O polipeptídeo de fusão (ou polinucleotídeo de fusão codificando o polipeptídeo de fusão) pode compreender outros componentes também, incluindo peptídeos múltiplos em alças múltiplas.
Em um aspecto, os peptídeos (por exemplo, subseqüências de hidrolase) e ácidos nucléicos codificando-os são aleatorizados ou são total-mente aleatorizados ou eles são enviesados em sua aleatorização, por exemplo, em freqüência de nucleotídeo/resíduo geralmente ou por posição. "Aleatorizado" significa que cada ácido nucléico e peptídeo consiste em nu- cleotídeos e aminoácidos essencialmente aleatórios, respectivamente. Em um aspecto, os ácidos nucléicos que dão origem aos peptídeos podem ser quimicamente sintetizados e desse modo podem incorporar qualquer nucleo- tídeo em qualquer posição. Desse modo, quando os ácidos nucléico são expressos para formar peptídeos, qualquer resíduo de aminoácido pode ser incorporado em qualquer posição. O processo sintético pode ser projetado para gerar ácidos nucléicos aleatorizados, para permitir a formação de todas ou a maioria das possíveis combinações sobre o comprimento do ácido nu- cléico, desse modo formando uma biblioteca de ácidos nucléicos aleatoriza- dos. A biblioteca pode fornecer uma população suficientemente estrutural-mente diversa de produtos de expressão aleatorizados para afetar uma faixa probabilisticamente suficiente de respostas celulares para fornecer uma ou mais células exibindo uma resposta desejada. Desse modo, a invenção for-nece uma biblioteca de interação grande o suficiente de forma que pelo me-nos um de seus membros terá uma estrutura que dá a ela afinidade por al-gumamolécula, proteína, ou outro fator.
Metodologias de Avaliação e Dispositivos de Monitoramento "On-line"
Na prática dos métodos da invenção, uma variedade de meca-nismos e metodologias pode ser empregada junto com os polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção, por exemplo, para avaliar os polipeptídeos quanto a atividade de hidrolase, para avaliar os compostos como ativadores potenciais ou inibidores de uma atividade de hidrolase (por exemplo, para avaliar droga potencial), para anticorpos que ligam-se a um polipeptídeo da invenção, para ácidos nucléicos que hibridizam para um ácido nucléico da invenção, para avaliar células expressando um polipeptídeo da invenção e similares. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6.337.187.
Disposições Capilares
Disposições capilares, tais como GIGAMATRIXTM, Diversa Cor-poration, San Diego, CA, podem ser empregados nos métodos da invenção. Ácidos Nucléicos ou polipeptídeos da invenção podem ser imobilizados a ou aplicados a uma disposição, incluindo disposições capilares. Disposições podem ser empregadas para avaliar ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo, moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléicos, etc.) quanto a sua capacidade de ligar-se a ou modular a atividade de um ácido nucléico ou um polipeptídeo da invenção. Disposições capilares fornecem outro sistema para reter e avaliar as amostras. Por exemplo, um mecanismo de avaliação de amostra pode incluir uma pluralidade de vasos capilares formados em uma disposição de capilares adjacentes, em que cada vaso capilar compreende pelo menos uma parede definindo um lúmen para reter uma amostra. O mecanismo pode também incluir material intersticial disposto entre vasos capilares adjacentes na disposição, e um ou mais indícios de referência formados dentro do material intersticial. Um vaso capilar para ava-liar uma amostra, em que o vaso capilar é adaptado por ser ligado em uma disposição de vasos capilares, pode incluir uma primeira parede definindo um lúmen para reter a amostra, e uma segunda parede formada de um ma-terial filtrante, para filtrar a energia de excitação fornecida ao lúmen para ex-citar a amostra.
Um polipeptídeo ou ácido nucléico, por exemplo, um ligando, pode ser introduzido em um primeiro componente em pelo menos uma por-ção de um vaso capilar de uma disposição capilar. Cada vaso capilar da dis-posição capilar pode compreender pelo menos uma parede definindo um lúmen para manter o primeiro componente. Uma bolha de ar pode ser intro-duzida no vaso capilar atrás do primeiro componente. Um segundo compo-nente pode ser introduzido no vaso capilar, em que o segundo componente é separado do primeiro componente pela bolha de ar. Uma amostra de inte-resse pode ser introduzida como um primeiro líquido rotulado com uma par-tícula detectável em um vaso capilar de uma disposição capilar, em que cada vaso capilar da disposição capilar compreende pelo menos uma parede definindo um lúmen para manter o primeiro líquido e a partícula detectável, e em que a pelo menos uma parede é revestida com um material de ligação para ligar a partícula detectável à pelo menos uma parede. O método pode da mesma forma incluir remover o primeiro líquido do tubo capilar, em que a partícula detectável ligada é mantida dentro do vaso capilar, e introduzindo um segundo líquido no tubo capilar.
A disposição capilar pode incluir uma pluralidade de vasos capi-lares individuais compreendendo pelo menos uma parede exterior definindo um lúmen. A parede exterior do vaso capilar pode ser um ou mais paredes fundidas juntas. Similarmente, a parede pode definir um lúmen que é cilíndrico, quadrado, hexagonal ou qualquer outra forma geométrica contanto que as paredes formem um lúmen para retenção de um líquido ou amostra. Os vasos capilares da disposição capilar podem ser mantidos juntos em proxi- midade íntima para formar uma estrutura planar. Os vasos capilares podem ser ligados juntos, sendo fundidos (por exemplo, onde os vasos capilares são feitos de vidro), colados, ligados ou presos lado a lado. A disposição capilar pode ser formada de qualquer número de vasos capilares individuais, por exemplo, uma faixa de 100 a 4.000.000 vasos capilares. Uma disposição capilar pode formar uma placa de micro título tendo cerca de 100.000 ou mais vasos capilares individuais ligados juntos.
Disposições e "Biochips"
Ácidos Nucléicos ou polipeptídeos da invenção podem ser imobilizados em ou aplicado em uma disposição. As disposições podem ser empregadas para avaliar ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo,moléculas pequenas, anticorpos, ácidos nucléico, etc.) quanto à sua capacidade de ligar-se a ou modular a atividade de um ácido nucléico ou um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, em um aspecto da invenção, um parâmetro monitorado é expressão de transcrição de um gene de amilase. Uma ou mais, ou, todas as transcrições de uma célula podem ser medidas por hibridação de uma amostra compreendendo transcrições da célula, ou, ácidos nucléicos representativos de ou complementar as transcrições de uma célula, por hibridização para ácidos nucléicos imobilizados em uma disposição,ou "biochip". Empregando-se uma "disposição"de ácidos nucléicos em um microchip, algumas ou todas dentre as transcrições de uma célula podem ser simultaneamente quantificadas. Alternativamente, as disposições compreendendo ácido nucléico genômico podem da mesma forma ser empregadas para determinar o genótipo de uma cepa recentemente construída feita pelos métodos da invenção. As disposições"de polipeptídeo podem da mesma forma ser empregadas para simultaneamente quantificar uma pluralidade de proteínas. A presente invenção pode ser praticada com qualquer "disposição"conhecida, da mesma forma referida como uma "microdisposi- ção"ou "disposição de ácido nucléico"ou "disposição de polipeptídeo"ou "disposição de anticorpo" ou "biochip", ou uma variação destes. As disposições são genericamente uma pluralidade de "pontos" ou "elementos alvos", cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de uma ou mais moléculas biológicas, por exemplo, oligonucleotídeos, imobilizados so-bre uma área definida de uma superfície de substrato para ligação específica em uma molécula de amostra, por exemplo, transcrições de mRNA.
Em um aspecto, as hidrolases são empregadas como formas imobilizadas. Qualquer método de imobilização pode ser empregado, por exemplo, imobilização sobre um suporte inerte tal como dietilaminoetil- celulose, vidro poroso, quitina ou células. As células que expressam hidrola- ses da invenção podem ser imobilizadas por ligação cruzada, por exemplo, com glutaraldeído a uma superfície do substrato. Na prática dos métodos da invenção, qualquer método e/ou dis-posição conhecidos de preparar e empregar disposições podem ser incorpo-rados no todo ou em parte, ou variações destes, como descrito, por exemplo, em Patentes dos Estados Unidos nos 6.277.628, 6.277.489, 6.261.776, 6.258.606, 6.054.270, 6.048.695, 6.045.996, 6.022.963, 6.013.440, 5.965.452, 5.959.098, 5.856.174, 5.830.645, 5.770.456, 5.632.957, 5.556.752, 5.143.854, 5.807.522, 5.800.992, 5.744.305, 5.700.637, 5.556.752, 5.434.049, veja também, por exemplo, WO 99/51773, WO 99/09217, WO 97/46313, WO 96/17958, veja também, por exemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171 - R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087 - 1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120 - 124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genet-ics Supl. 21: 25 - 32. Veja também os pedidos de patente dos Estados Unidos publicados nos 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
Anticorpos e métodos de avaliação com base em Anticorpo
A invenção fornece anticorpos recombinantes ou isolados que especificamente ligam-se a uma hidrolase da invenção. Estes anticorpos podem ser empregados para isolar, identificar ou quantificar a hidrolase da invenção ou polipeptídeos relacionados. Estes anticorpos podem ser usados para isolar outros polipeptídeos dentro do escopo da invenção ou outras hi- drolases relacionadas.
Os anticorpos podem ser empregados em colunas de imunopre- cipitação, manchamento, imunoafinidade, e similares. Se desejado, seqüên- cias de ácido nucléico codificando para antígenos específicos podem ser geradas por imunização seguida por isolamento de polipeptídeo ou ácido nucléico, amplificação ou clonagem e imobilização de polipeptídeo sobre uma disposição da invenção. Alternativamente, os métodos da invenção po-dem ser empregados para modificar a estrutura de um anticorpo produzido por uma célula a ser modificada, por exemplo, uma afinidade de anticorpo pode ser aumentada ou diminuída. Além disso, a capacidade de preparar ou modificar anticorpos pode ser um fenótipo construído em uma célula pelos métodos da invenção. Métodos de imunização, produzindo e isolando anticorpos (poli- clonais e monoclonais) são conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos na biblioteca de patente e científica, veja, por exemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Sti-tes (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRATICE (2aed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256: 495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORA-TORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York. Os anticorpos da mesma forma podem ser gerados in vitro, por exemplo, empregando sítio de ligação de anticorpo recombinante expressando bibliotecas de exibição de fago, além dos métodos in vivo tradicionais empregando animais. Veja, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27 - 45.
Os polipeptídeos ou peptídeos podem ser empregados para gerar anticorpos que especificamente ligam-se aos polipeptídeos, por exemplo, as amilases, da invenção. Os anticorpos resultantes podem ser empregados em procedimentos de cromatografia de imunoafinidade para isolar ou purificar o polipeptídeo ou para determinar se o polipeptídeo está presente em uma amostra biológica. Em tais procedimentos, uma preparação de proteína, tal como um extrato, ou uma amostra biológica é contatada com um anticorpo capaz de especificamente ligar-se a um dos polipeptídeos da invenção.
Em procedimentos de imunoafinidade, o anticorpo é ligado a um suporte sólido, tal como uma conta ou outra matriz de coluna. A preparação de proteína é colocada em contato com o anticorpo sob condições nas quais o anticorpo especificamente liga-se a um dos polipeptídeos da invenção. Depois de uma lavagem para remover proteínas não especificamente liga-das, os polipeptídeos especificamente ligados são eluídos.
A capacidade das proteínas em uma amostra biológica para li-gar-se ao anticorpo pode ser determinada empregando qualquer dentre uma variedade de procedimentos familiares aqueles versados na técnica. Por exemplo, a ligação pode ser determinada rotulando-se o anticorpo com um rótulo detectável tal como um agente fluorescente, um rótulo enzimático, ou um radioisótopo. Alternativamente, a ligação do anticorpo à amostra pode ser detectada empregando um anticorpo secundário tendo um tal rótulo de- tectável nele. Ensaios particulares incluem ensaios ELISA, ensaios sanduí-che, radioimunoensaios, Manchas do Oeste.
Anticorpos policlonais gerados contra os polipeptídeos da inven-ção podem ser obtidos por injeção direta dos polipeptídeos em um animal ou administrando os polipeptídeos em um animal não humano. O anticorpo desse modo obtido então ligará o polipeptídeo propriamente dito. Desta maneira, mesmo uma seqüência codificando apenas um fragmento do polipeptídeo pode ser empregada para gerar anticorpos que podem ligar-se ao polipeptí- deo nativo inteiro. Tais anticorpos podem então ser empregados para isolar o polipeptídeo de células expressando aquele polipeptídeo.
Para preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que fornece anticorpos produzida por culturas de linhagem de célula contí-nuas pode ser empregada. Exemplos incluem a técnica de hibridoma, a téc-nica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana e a técnica de hibridoma de EBV (veja, por exemplo, Coule (1985) em Monoclonal Antibo-dies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77 - 96).
As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples aos polipeptídeos da invenção. Alternativamente, camundongos transgênicos podem ser em-pregados para expressar anticorpos humanizados a estes polipeptídeos ou fragmentos destes.
Anticorpos gerados contra os polipeptídeos da invenção (incluin-do anticorpos anti-idiotipo) podem ser empregados na avaliação para poli- peptídeos similares de outros organismos e amostras. Em tais técnicas, os polipeptídeos do organismo são contatados com o anticorpo e aqueles poli- peptídeos que especificamente ligam o anticorpo são detectados. Quaisquer dos procedimentos descrito acima podem ser empregados para detectar a ligação de anticorpo.
Hidrolases Imobilizadas
Em um aspecto, a hidrolase da invenção, por exemplo, estera-ses, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases, são empregadas como formas imobilizadas, por exemplo, para processar lipídeos, na síntese estru-turada de lipídeos, para digerir proteínas e similares. As lipases imobilizadas da invenção podem ser empregadas, por exemplo, para hidrólise de triglice- rídeos, diglicerídeos ou ésteres ou para a esterificação ou transesterificação de ácidos graxos, diglicerídeos ou triglicerídeos, ou nas interesterificação de gorduras. Em um aspecto, a lipase é específica para esterificação de ácidos graxos com álcool, 1,3-especifíco ou aleatorizando lipase de transesterifica- ção ou lipase específica para a hidrólise de glicerídeos parciais, ésteres ou triglicerídeos. A lipase imobilizada da invenção pode ser empregada em um leito embalado para contínua transesterificação de gorduras livres de solven-te. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos nos 4.818.695, 5.569.594.
Qualquer método de imobilização ou forma de suporte pode ser empregada, por exemplo, disposições, contas, suportes capilares, e outros, como acima descrito. Em um aspecto, a imobilização de hidrolase pode ocorrer sobre um suporte inerte tal como dietilaminoetil-celulose, vidro poro-so, quitina ou células. As células que expressam hidrolases da invenção po-dem ser imobilizadas por ligação cruzada, por exemplo, com glutaraldeído a uma superfície de substrato. As hidrolases imobilizadas da invenção podem ser preparadas contendo hidrolases ligadas a um suporte hidrofóbico parti- culado poroso, seco, com um tensoativo, tal como um éster de ácido graxo de sorbitano de polioxietileno ou um éster de ácido graxo de poliglicerol. O suporte pode ser um polímero olefínico alifático, tal como um polietileno ou um polipropileno, um homo- ou copolímero de estireno ou uma mistura des-tes ou um suporte inorgânico pré-tratado. Estes suportes podem ser selecio-nados de polímeros olefínicos alifáticos, polímeros de oxidação, misturas destes polímeros ou suportes inorgânicos pré-tratados a fim de tornar estes suportes hidrofóbicos. Este pré-tratamento pode compreender silanização com um composto de silício orgânico. O material inorgânico pode ser uma sílica, uma alumina, um vidro ou uma cerâmica. Os suportes podem ser fei-tos de poliestireno, copolímeros de estireno, polietileno, polipropileno ou de copolímeros derivados de (met)acrilatos. Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n°5.773.266.
Kits
A invenção fornece kits compreendendo as composições, por exemplo, ácidos nucléicos, cassetes de expressão, vetores, células, plantas ou sementes transgênicas ou partes de planta, polipeptídeos (por exemplo, hidrolases) e/ou anticorpos da invenção. Os kits podem da mesma forma conter material instrutivo que ensina as metodologias e usos industriais da invenção, como descrito aqui.
Parâmetros Metabólicos de Avaliação
Os métodos da invenção fornecem a evolução da célula inteira ou construção de célula inteira, de uma célula para desenvolver uma nova cepa de célula tendo um novo fenótipo, modificando-se a composição gené-tica da célula, onde a composição genética é modificada pela adição à célula de um ácido nucléico da invenção, por exemplo, um ácido nucléico codificando hidrolase. Para detectar o novo fenótipo, pelo menos um parâmetro metabólico de uma célula modificada é monitorado na célula em uma estrutura de tempo "on-line" ou "tempo real". Em um aspecto, uma pluralidade de células, tal como uma cultura de célula, é monitorada em "tempo real" ou "on-line". Em um aspecto, uma pluralidade de parâmetros metabólicos é monitorada em "tempo real" ou "on-line". Parâmetros metabólicos podem ser monitorados empregando-se os polipeptídeos fluorescentes da invenção (por exemplo, hidrolases da invenção compreendendo uma porção fluores-cente).
Análise de fluxo metabólica (MFA) é com base em uma estrutura bioquímica conhecida. Uma matriz metabólica linearmente independente é construída com base na lei de conservação de massa e na hipótese de es-tadopseudo-estável (PSSH) nos metabólitos intracelulares. Na prática dos métodos da invenção, as redes metabólicas são estabilizadas, incluindo a: • identidade de todos os substratos de trilha, produtos e metabó- litos intermediários • identidade de todas as reações químicas interconvertendo os metabólitos de trilha, a estequiometria das reações de trilha, • identidade de todas as enzimas catalisando as reações, cinéti-cas de reação de enzima, • as interações reguladoras entre os componentes de trilha, por exemplo, interações alostéricas, interações de enzima-enzima etc, • compartimentalização intracelular de enzimas ou qualquer ou-traorganização supramolecular das enzimas, e, • a presença de quaisquer gradientes de concentração de meta- bólitos, enzimas ou moléculas efetoras ou barreiras de difusão em seu mo-vimento.
Uma vez que a rede metabólica para uma determinada cepa é construída, apresentação matemática por noção de matriz pode ser introdu-zida para avaliar os fluxos metabólicos intracelulares se os dados de meta- bolome on-line estiverem disponíveis. Fenótipo metabólico conta com as mudanças da rede metabólica inteira dentro de uma célula. Fenótipo meta-bólicoconta com a mudança da utilização da rede com respeito às condições ambientais, regulamento genético, estado desenvolvente e o genótipo, etc. Em um aspecto dos métodos da invenção, depois do cálculo de MFA on-line, o comportamento dinâmico das células, seu fenótipo e outras propri-edadessão analisadas investigando-se a utilização de trilha. Por exemplo, se o fornecimento de glicose é aumentado e o oxigênio diminuído durante a fermentação de levedura, a utilização de trilhas respiratórias será reduzida e/ou interrompida e a utilização das trilhas fermentativas dominará. O contro-le de estado fisiológico de culturas de célula tornará possível depois da aná-lise de trilha. Os métodos da invenção podem ajudar a determine como ma-nipular a fermentação determinando-se como mudar o fornecimento de substrato, temperatura, uso de indutores, etc. para controlar o estado fisioló-gico de células para moverem-se ao longo da direção desejável. Na prática dos métodos da invenção, os resultados de MFA podem da mesma forma ser comparados com os dados de transcriptome e proteome para projetar experiências e protocolos para construção metabólica ou embaralhamento de gene, etc.
Na prática dos métodos da invenção, qualquer fenótipo novo ou modificado pode ser conferido e detectado, incluindo características novas ou melhoradas na célula. Qualquer aspecto de metabolismo ou crescimento pode ser monitorado.
Expressão de monitoramento de uma transcrição de mRNA
Em um aspecto da invenção, o fenótipo construído compreende aumentar ou diminuir a expressão de uma transcrição de mRNA ou gerar novas transcrições em uma célula. Esta expressão aumentada ou diminuída pode ser traçada pelo uso de um ácido nucléico codificando hidrolase da invenção. As transcrições de mRNA, ou mensagens, também podem ser detectadas e quantificadas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, manchas do Norte, reações de amplificação quantitativas, hibridizações para disposições, e similares. Reações de amplificação quantitativas incluem, por exemplo, PCR quantitativa, incluindo, por exemplo, reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa, ou RT- PCR; RT-PCR em tempo real quantitativa, ou "RT-PCR cinética em tempo real" (veja, por exemplo, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114: 313-318; Xia (2001) Transplantation 72: 907-914).
Em um aspecto da invenção, o fenótipo construído é gerado no- cauteando-se a expressão de um gene homólogo. A seqüência de codifica ção do gene ou um ou mais elementos de controle transcricionais podem ser nocauteados, por exemplo, promotores ou realçadores. Desse modo, a ex-pressão de uma transcrição pode ser completamente retirada ou apenas diminuída.
Em um aspecto da invenção, o fenótipo construído compreende aumentar a expressão de um gene homólogo. Isto pode ser realizado nocau- teando-se um elemento de controle negativo, incluindo um elemento regula-dor transcriptional agindo cis- ou trans-, ou, mutagenizando um elemento de controle positivo. Uma ou mais, ou, todas as transcrições de uma célula po-dem ser avaliadas por hibridização de uma amostra compreendendo trans-crições da célula, ou, ácidos nucléicos representativos de ou complementa-res as transcrições de uma célula, por hibridização para ácidos nucléicos imobilizados em uma disposição.
Expressão de monitoramento de polipeptídeos, peptídeos e aminoácidos
Em um aspecto da invenção, o fenótipo construído compreende aumentar ou diminuir a expressão de um polipeptídeo ou gerar novos poli- peptídeos em uma célula. Esta expressão aumentada ou diminuída pode ser traçada determinando-se a quantidade de amilase presente ou por ensaios de atividade de amilase. Os polipeptídeos, peptídeos e aminoácidos também podem ser detectados e quantificados por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, ressonância magnética nuclear (NMR), es- pectrofotometria, radiografia (radiorrotulagem de proteína), eletroforese, ele-troforese capilar, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), croma- tografia de camada fina (TLC), cromatografia de hiperdifusão, vários métodos imunológicos, por exemplo, imunoprecipitação, imunodifusão, imuno- eletroforese, radioimunoensaios (RIAs), ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios imuno-fluorescentes, eletroforese em gel (por exemplo, SDS-PAGE), manchamento com anticorpos, separador celular ati-vado por fluorescência (FACS), espectrometria de massa de pirólise, Espec- trometria de Infravermelho de Transformação de Fourier, espectrometria de Raman, GC-MS, e LC-Eletrovaporização e espectrometrias de massa de cap-LC-tandem- eletrovaporização e similares. Novas bioatividades podem também ser avaliadas empregando-se métodos ou variações destes, descri-tos em Patente dos Estados Unidos n° 6.057.103. Além disso, como discuti-do abaixo em detalhes, um ou mais, ou, todos os polinucleotídeos de uma célula podem ser avaliados empregando uma disposição de proteína.
Aplicações Industriais e Médicas
A invenção fornece muitos empregos industriais e aplicações médicas para as hidrolases (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, proteases) da invenção, e alguns empregos exemplares e composições da invenção são descritos abaixo. Os processos da invenção compreendem converter um fosfolipídeo não hidratável em uma forma hidratável, desen- gomamento de óleo, processamento de alimento, processamento de óleos de plantas, peixe, algas e similares, para nomear exatamente algumas apli-cações.
Fosfolipases
A invenção fornece muitos empregos industriais e aplicações médicas para as hidrolases, por exemplo, lipases e fosfolipases das inven-ção, por exemplo, fosfolipases A, B, C e D. Métodos de empregar enzimas de fosfolipase em aplicações industriais são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as fosfolipases e métodos da invenção podem ser empregadas para o processamento de gorduras e óleos como descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente JP H6-306386, descrevendo conversão de fosfolipídeos presentes nos óleos e gorduras nas substâncias solúveis em água contendo grupos de ácido fosfórico.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para pro-cessar óleos de planta e fosfolipídeos tais como aqueles derivados de ou isolados de farelo de arroz, soja, canola, palma, semente de algodão, milho, semente de palma, coco, amendoim, gergelim, girassol. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar óleos essenciais, por exemplo, aqueles de óleos de semente de fruta, por exemplo, semente de uva, damasco, borragem, etc. As fosfolipases da invenção podem ser em-pregadas para processar óleos e fosfolipases de diferentes formas, incluindo formas cruas, desengomadas, gomas, água de lavagem, argila, sílica, esto- que de sabão, e similares. Os fosfolipídeos da invenção da invenção podem ser empregados para processar óleos fosforosos elevados, óleos de peixe, óleos animais, óleos de planta, óleos de algas e similares. Em qualquer as-pecto da invenção, a qualquer hora uma fosfolipase C pode ser empregada, uma alternativa compreende o emprego de uma fosfolipase D da invenção e uma fosfatase (por exemplo, empregando-se uma combinaçãso de PLD/fosfastase para melhorar a produção em um óleo fosforoso elevado, tal como um óleo de feijão soja).
Em um aspecto, a invenção fornece composições e métodos (que podem compreender o uso de fosfolipases da invenção)para desengo- mar óleo compreendendo empregar quantidades variáveis de ácido e base sem fazer estoque de sabão. Empregando-se este aspecto da invenção para desengomar óleo, o ácido (incluindo fosfórico e/ou cítrico) pode ser empre-gado para hidratar fosfolipídeos não hidratáveis em óleos fosforosos eleva-dos (incluindo, por exemplo, farelo de arroz, feijão soja, canola, e girassol). Assim que os fosfolipídeos são hidratados, o pH da fase aquosa pode ser elevado empregando-se adição cáustica: a quantidade de cáustico adiciona-da pode criar um pH favorável para atividade de enzima, porém não resultará na formação de uma significante fração de estoque de sabão no óleo. Porque um estoque de sabão não é formado, os ácidos graxos livres no óleo podem ser removidos a jusante, seguindo a etapa de desengomadura, du-rante o branqueamento e desodorização.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para pro-cessar e fabricar óleos comestíveis, óleos biodieseis, lipossomas para far-macêuticos e cosméticos, e fosfolipídeos estruturados e lipídeos estrutura-dos. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas na extração de óleo. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para processar e fabricar vários sabões.
As fosfolipases da invenção podem também ser empregadas para estudar o sistema de sinalização de fosfoinositídeo (PI); na diagnose, prognose e desenvolvimento de tratamentos para distúrbios bipolares (veja, por exemplo, Pandey (2002) Neuropsychopharmacology 26: 216-228); como antioxidantes; como fosfolipídeos modificados; como agentes de espumação e gelação; para gerar lipídeos angiogênicos para tecidos de vasculasrização; para identificar fosfolipases, por exemplo, PLA, PLB, PLC, PLD e/ou modu- ladores de patatina (agonistas ou antagonistas), por exemplo, inibidores para uso como anti-neoplásicos, antiinflamatórios e como agentes analgésicos. Eles podem ser empregados para gerar fosfolipídeos acídicos para controlar o sabor amargo no alimento e farmacêuticos. Eles podem ser empregados na purificação de gordura. Eles podem ser empregados para identificar inibi-dores de peptídeos para o tratamento de doenças virais, inflamatórias, alér-gicas e cardiovasculares. Eles podem ser empregados para fabricar vacinas. Eles podem ser empregados para fabricar glicerídeos de ácido graxo poliin- saturados e fosfatidilgliceróis.
As fosfolipases da invenção, por exemplo, enzimas PLA e PLC, são empregadas para gerar imunotoxinas e vários terapêuticos para trata-mentosanti-câncer.
As fosfolipases da invenção podem ser empregadas em conjun-to com outras enzimas para descolorar (isto é, remoção de clorofila) e em detergentes (veja acima), por exemplo, em conjunto com outras enzimas (por exemplo, lipases, proteases, esterases, fosfatases). Por exemplo, em qualquer momento onde uma PLC é empregada, uma PLD e uma fosfatase pode ser empregadas em combinação, para produzir o mesmo resultado como uma PLC sozinha.
Detoxificação
As hidrolases (por exemplo, lipases, esterase, protease e/ou fos- folipases da invenção) podem ser empregadas em processos de destoxifica- ção, por exemplo, para a destoxificação de endotoxinas, por exemplo, com-posições compreendendo lipopolissacarídeos (LPS), e, a invenção fornece processos de destoxificação empregando pelo menos uma enzima da inven-ção, por exemplo, uma hidrolase tendo uma seqüência como mencionado na SEQ ID NO: 962 (codificada por SEQ ID NO: 961), ou SEQ ID NO: 966 (codificada por SEQ ID NO: 965). Em um aspecto, uma lipase e/ou uma esterase da invenção é empregada para destoxificar um lipopolissacarídeo (LPS).
Em um aspecto, esta destoxificação é por desacilação de cadeias de ácido graxo 2' e/ou 3' de lipídeo A. Em um aspecto, a hidrolase (por exemplo, uma lipase e/ou uma esterase) da invenção é empregada para hidrolisar uma ca-deia de 2'-lauroíla e/ou 3'-miristoíla de um lipídeo, por exemplo, um lipídeo A (por exemplo, de uma endotoxina bacteriana). Em um aspecto, o processo da invenção é empregado para destruir uma endotoxina, por exemplo, um toxina de uma bactéria gram negativa, como de E. coli. Em um aspecto, uma hidrolase (por exemplo, uma lipase e/ou uma esterase) da invenção é em-pregada para melhorar os efeitos de envenenamento de toxin (por exemplo, de uma infecção gram negativa em progresso), ou para profilaticamente pre-venir os efeitos de endotoxina durante uma infecção (por exemplo, uma in-fecção em um animal ou um humano). Conseqüentemente, a invenção for-nece uma composição farmacêutica compreendendo uma hidrolase (por exemplo, uma lipase e/ou uma esterase) da invenção, e método empregando uma hidrolase da invenção, para a melhora ou prevenção de efeitos tóxicos do lipopolissacarídeo (LPS), por exemplo, durante sepse.
Processando alimentos
As hidrolases, por exemplo, lipases, esterases, proteases e/ou fosfolipases da invenção, ou uma combinação destas, podem ser emprega-das para processar alimentos, por exemplo, para alterar sua estabilidade, vida de prateleira, sabor, textura e similares. Por exemplo, em um aspecto, fosfolipases da invenção são empregadas para gerar fosfolipídeos acídicos para controlar o sabor amargo em alimentos.
Em um aspecto, a invenção fornece processo de fabricação de queijo empregando-se hidrolases (por exemplo, lipases, esterases, protea-ses, fosfolipases) da invenção (e, desse modo, a invenção também fornece queijos compreendendo hidrolases da invenção). Em um aspecto, as enzi-mas da invenção (por exemplo, lipases, esterases, proteases, fosfolipases, por exemplo, fosfolipase A, lisofosfolipase ou uma combinação destes) são empregadas para processar queijos para realce do sabor, para aumentar a produção e/ou para "estabilizar" queijos, por exemplo, reduzindo a tendência para "perda de óleo", ou em um aspecto, as enzimas da invenção são em- pregadas para produzir queijo de leite de queijo. Estes processos da inven-ção podem incorporar qualquer método ou protocolo, por exemplo, como descrito, por exemplo, nas As Patentes dos Estados Unidos nos 6.551.635, e 6.399.121, WO 03/070013, WO 00/054601. Por exemplo, em um aspecto, as hidrolases (por exemplo, lipases, esterases, proteases e/ou fosfolipases) da invenção são empregadas para estabilizar emulsão de gordura em leite ou composições compreendendo leite, por exemplo, creme, e são empregadas para estabilizar as composições de leite, por exemplo, para a fabricação de cremes ou licores de creme. Em um aspecto, as invenção fornece um pro-cesso para realçar o sabor de um queijo empregando pelo menos uma en-zima da invenção, o processo compreendendo incubar uma proteína, uma gordura e uma protease (por exemplo, da invenção) e uma lipase (por exemplo, da invenção) em um meio aquoso sob condições que produzem um sabor de queijo realçado (por exemplo, amargor reduzido), por exemplo, como descrito na WO 99/66805. Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são empregadas para realçar o sabor em um queijo (por exemplo, um coágulo) misturando com água, uma protease (por exemplo, da invenção), e uma lipase (por exemplo, da invenção) em uma temperatura elevada, por exemplo, entre cerca de 75°C a 95°C, como descrito, por exemplo, na Pa-tente dos Estados Unidos n° 4.752.483. Em um aspecto, as fosfolipases da invenção são empregadas para acelerar o envelhecimento de queijo adicio-nando-se uma enzima da invenção a um queijo (por exemplo, um leite de queijo) antes de adicionar um coagulante ao leite, ou, adicionando-se uma enzima (por exemplo, uma lipase ou uma fosfolipase) da invenção a um co-águlo com sal antes de pressionar, por exemplo, como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 4.707.364. Em um aspecto, uma lipase da invenção é empregada para degradar um triglicerídeo em gordura de leite para liberar ácidos graxos livres, resultando em realce de sabor. Uma protease da invenção também pode ser empregada em quaisquer destes processos da invenção, veja, por exemplo, Brindisi (2001) J. of Food Sci. 66: 1100-1107.
Em um aspecto, uma hidrolase (por exemplo, lipases, esterase, protease e/ou fosfolipase da invenção) é empregada para reduzir o conteúdo de componentes de fósforo em um alimento, por exemplo, um óleo, tal como um óleo vegetal tendo um conteúdo de fósforo não hidratável elevado, por exemplo, como descrito na WO 98/26057.
Refinamento Cáustico
Em um aspecto, enzimas da invenção, por exemplo, fosfolipa- ses, lipases, esterases, proteases, são empregadas como auxiliares de refi-namento cáustico. Em um aspecto, uma PLC ou PLD da invenção e um fos- fatase são empregadas nos processos como um gotejamento, ou antes, du-rante, ou após um processo de refinamento de neutralização cáustica (ou refinamento contínuo ou por batelada. A quantidade de enzima adicionada pode variar de acordo com o processo. O nível de água empregado no pro-cesso deve ser baixo, por exemplo, cerca de 0,5 a 5%. Alternativamente, cáustico deve ser adicionado ao processo múltiplas vezes. Além disso, o processo pode ser realizado em diferentes temperaturas (25°C a 70°C), com diferentes ácidos ou cáusticos, e em pH variáveis (4 a 12). Os ácidos que podem ser empregados em um processo de refinamento cáustico incluem, porém não estão limitados a, ácidos fosfórico, cítrico, ascórbico, sulfúrico, fumárico, maléico, hidroclórico e/ou acético. Os ácidos são empregados para hidratar fosfolipídeos não hidratáveis. Os cáusticos que podem ser empre-gados incluem, porém não estão limitados a, KOH e NaOH. Os cáusticos são empregados para neutralizar ácidos graxos livres. Alternativamente, as fosfolipases da invenção, ou mais particularmente uma PLC ou PLD da in-venção e uma fosfatase, são empregadas ara purificação de fitosteróis do estoque de sabão/goma.
Uma modalidade alternada da invenção para adicionar uma fos- folipase da invenção antes do refinamento cáustico, por exemplo, expres-sando a fosfolipase em uma planta. Em outra modalidade, a fosfolipase da invenção é adicionada durante esmagamento da planta, sementes ou outra parte da planta. Alternativamente, a fosfolipase da invenção é adicionada seguindo o amassamento, porém antes do refinamento (isto é, em vasos de contenção). Além disso, a fosfolipase é adicionada como um pré-tratamento de refinamento, ou com ou sem ácido.
Outra modalidade da invenção compreende adicionar uma fosfo- lipase da invenção durante um processo de refinamento cáustico. Os níveis de ácido e cáustico podem ser variados dependendo do nível de fósforo e o nível de ácidos graxos livres. As faixas de pH temperatura amplas podem ser empregadas no processo dependendo do tipo de enzima empregada.
Em outra modalidade da invenção, a fosfolipase da invenção é adicionada após o refinamento cáustico. Em um aspecto, a fosfolipase é adi-cionada em um misturador intenso ou em um misturador de retenção, antes da separação. Alternativamente, a fosfolipase é adicionada seguindo a etapa de aquecimento. Em outra modalidade, as fosfolipase da invenção é adicionada na etapa de centrifugação. Em uma modalidade adicional, a fosfolipase é adicionada ao estoque de sabão. Alternativamente, a fosfolipase é adicionadaà água de lavagem. Em outro caso, a fosfolipase da invenção é adicionada durante as etapas de branqueamento e/ou desodorização.
Síntese estruturada e processamento de óleos
A invenção fornece métodos para a síntese estruturada de óleos, lipídeos e similares empregando-se hidrolases (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, proteases) da invenção. Os métodos da invenção compreendem um síntese biocatalítica de lipídeos estruturados, isto é, lipí-deos que contêm um grupo definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida sobre uma cadeia principal, por exemplo, uma cadeia prin-cipal de glicerol. Os produtos gerados empregando-se as hidrolases da in-venção e praticando os métodos da invenção incluem alternativas de man-teiga de cacau, lipídeos contendo ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs), glicerídeos de 1,3-diacila (DAGs), 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilgli- cerídeos (TAGs). Os métodos da invenção possibilitam a síntese de lipídeos ou ácidos graxos com regioespecificidades definidas e estereoseletividades.
A invenção fornece métodos para processar (modificar) óleos, lipídeos e similares empregando-se hidrolases da invenção. Os métodos da invenção podem ser empregados para processar óleos de plantas, animais, microorganismos. Os métodos da invenção podem ser empregados na sín- tese estruturada de óleos similares àqueles encontrados em plantas, ani-mais, microorganismos. Lipídeos e óleos podem ser processados para ter uma característica desejada. Lipídeos e óleos que podem ser processados pelos métodos da invenção (empregando-se as hidrolases da invenção) in-cluem alternativas de manteiga de cacau, lipídeos contendo ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs), glicerídeos de 1,3-diacila (DAGs), 2-monoacil- glicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs). Em um aspecto, os óleos e gorduras processados e sintéticos da invenção (por exemplo, alternativas de manteigas de cacau e óleos vegetais) podem ser empregados em uma vari-edade de aplicações, por exemplo, na produção de alimentos (por exemplo, confeitarias e pastelarias) e na formulação de farmacêuticos, nutracêuticos e cosméticos. Em um aspecto, a invenção fornece métodos de processar gor-duras e óleos, por exemplo, sementes oleosas, de plantas, incluindo, por exemplo, farelo de arroz, canola, girassol, azeitona, palma, soja ou óleos tipo láurico empregando-se uma hidrolase, por exemplo, uma lipase, esterase ou fosfolipase, da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para a síntese es-truturada de óleos similares àqueles encontrados em animais, por exemplo, peixe e mamíferos e microorganismos, empregando-se as hidrolases da in-venção. Em um aspecto, estes óleos sintéticos ou processados são empre-gados como aditivos de alimentação, alimentos, como ingredientes em for-mulações farmacêuticas, nutracêuticos ou em cosméticos. Por exemplo, em um aspecto as hidrolases da invenção são empregadas para fabricar ácidos graxos de óleo de peixe como um aditivo de alimentação. Em um aspecto, as hidrolases da invenção podem ser empregadas para processar óleo de lixo de restaurante e gorduras animais convertidas.
Em um aspecto, as hidrolases da invenção são biocatalisadores versáteis em síntese orgânica, por exemplo, na síntese estruturada de óleos, lipídeos e similares. Enzimas da invenção (incluindo, por exemplo, esterases tais como lipases e esterases de carboxila) podem aceitar uma ampla faixa de substratos, incluindo álcoois secundários e terciários, por exemplo, de um produto natural tal como alfa-terpineol, linalool e similares. Em alguns aspec- tos, as hidrolases da invenção têm boa à excelente enantioespecificidade (por exemplo, estereoespecificidade).
Em um aspecto, a hidrolase da invenção compreende um motif de GGGX. Como acima descrito, em um aspecto, a invenção fornece um fragmento ou subsequência de uma enzima da invenção compreendendo um domínio catalítico ("CD") ou "sítio ativo". Em um aspecto, um domínio catalítico ("CD") ou "sítio ativo" compreendendo peptídeo, anticorpo catalítico ou polipeptídeo da invenção compreende um motif de GGGX. Em um aspec-to, este motifé localizado sobre uma alça de proteína próximo ao sítio de ligação do grupo carboxílico do éster de substrato. Em um aspecto, o motif de GGGX está envolvido na formação de um "orifício oxiânion"que estabiliza o oxigênio de carbonila aniônica de um intermediário tetraédrico durante o ciclo catalítico de hidrólise de éster. Em um aspecto, a invenção fornece uma esterase ou uma lipase compreendendo um motif de GGGX para a hidrólise de um éster de álcool terciário. Em um aspecto, a invenção fornece uma es-terase ou uma lipase para a hidrólise de um terpinil-, linalil, 2-fenil-3-butin-2- il-acetato e/ou um 3-metil-1-pentin-3-il-acetato, onde a enzima da invenção compreende um motif de GGGX.
Em um aspecto, a invenção fornece um processo de conversão de óleo (por exemplo, óleos vegetais, manteigas de cacau, e similares) com-preendendo pelo menos uma enzima (por exemplo, uma lipase) da inven-ção. Em um aspecto, um processo de conversão de óleo compreende uma hidrólise e acilação controladas, por exemplo, uma acilação de glicerol, que pode resultar em pureza elevada e uma extremidade ampla de produtos. Em um aspecto, as hidrolases (por exemplo, lipases) da invenção são emprega-das para produzir óleos de diacilglicerol e óleos nutricionais estruturados. Em um aspecto, a invenção fornece processos para a esterificação de propi- leno glicol empregando-se uma enzima da invenção, por exemplo, uma li-pase regio- e/ou quimio-seletiva para esterificação mono-substituída na po-sição sn-1. Em um aspecto, a invenção fornece processos para a síntese estruturada de óleos com perfis de ácido graxo saturado ou insaturado alve-jado empregando-se uma enzima da invenção, por exemplo, uma lipase re gio- e/ou quimio-seletiva para a remoção de um ácido graxo saturado, ou, para a adição alvejada de um ácido graxo de uma cadeia principal de glice- rol. Em um aspecto, a invenção fornece processos para modificar ácidos graxos saturados empregando-se uma enzima da invenção, por exemplo, adicionando-se ligações duplas empregando-se uma enzima com atividade de dessaturase (em um aspecto, este processo é feito em sistemas de célula inteira). Em um aspecto, a invenção fornece processos para modificar ácidos graxos saturados empregando-se uma enzima da invenção, por exemplo, pela remoção de ligações duplas empregando-se enzimas com atividade de hidrogenação e/ou desidrogenação (em um aspecto, este processo é feito em sistemas de célula inteira). Em um aspecto, a invenção fornece proces-sos para a hidrólise total de triglicerídeos sem formação de trans-isômero empregando-se uma enzima da invenção, por exemplo, uma lipase não sele-tiva da invenção para hidrólise total sem a formação de trans-isômeros. Em um aspecto, a invenção fornece processos para a monoesterificação catali-sada de enzima de um glicol, por exemplo, um propileno glicol, empregando- se uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, uma esterase) da invenção. Em um aspecto, os ácidos oléico, linoléico, ou alfa-linolênico são empregados na monoesterificação catalisada por enzima. Qualquer óleo, por exemplo, óleo vegetal tal como soja, algodão, milho, farelo de arroz e girassol pode ser empregado neste processo. A enzima pode ser quimioseletiva e/ou enanti- oseletiva. Por exemplo, em um aspecto, a enzimaquimioseletiva da invenção pode ser seletiva para um ácido simples, por exemplo, ácido oléico ou li- noléico apenas, ou, linoléico ou alfa-linolênico apenas, etc. Alternativamente, uma enzima da invenção pode ser enantioseletivo (em esterificação ou hidrólise).Por exemplo, uma enzima pode ser seletiva para apenas uma única posição, ou, seletiva para apenas duas posições, por exemplo, apenas 1,2 esterificação, ou, apenas 1,3 esterificação, ou, apenas 2,3 esterificação (ou, na reação reversa, hidrólise).
Em um aspecto, a invenção fornece processos para a remoção seletiva de ácidos graxos (por exemplo, ácidos graxos indesejáveis) de óleos, por exemplo, seaparando ácidos graxos saturados e/ou insaturados de óleos, empregando-se uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, uma es-terase) da invenção. O processo da invenção pode separar ácidos graxos saturados e/ou insaturados de qualquer óleo, por exemplo, um óleo de soja. A enzima pode ser quimioseletiva e/ou enantioseletiva. O processo pode compreender acilação seletiva com isômeros cis,esterificação de Sn-2, hi- drogenação enzimática. Em um aspecto, estes processos geram óleos e gorduras de estabilidade elevada, por exemplo, óleos de fritura "saudáveis". O processo da invenção pode ser empregado para gerar óleos com menos súlfur, por exemplo, empregando-se um processo compreendendo remoção de súlfur de óleo cru. As enzimas da invenção podem também ser emprega-das em processos de interesterificação para estes e outros propósitos.
Em um aspecto, uma enzima da invenção é empregada para gerar um óleo de gordura "não-trans". Em um aspecto, um óleo "não-trans" é gerado de um óleo parcialmente hidrogenado para produzir um óleo cis- apenas. A enzima pode ser quimioseletiva e/ou enantioseletiva.
Em um aspecto, a invenção fornece processos para modificar manteigas de cacau empregando-se uma enzima da invenção. Cerca de 80% de manteigas de cacau compreendem triglicerídeos POP, SOS e POS (P é ácido graxo palmítico, O é ácido graxo oléico, S é ácido graxo esteárico). A estrutura de ácido graxo saturado-insaturado-saturado de manteigas de cacau conferem seus perfis de fusão característicos, por exemplo, em chocolates. Em um aspecto, os processos de síntese estruturada e direta da invenção são empregados em manteigas de cacau para reduzir variações de manteiga de cacau ou para produzir manteigas de cacau sintéticas (alterna-tivas de manteiga de cacau"). Em um aspecto, uma hidrolase quimioseletiva e/ou enantioseletiva (por exemplo, uma regio-seletiva) (por exemplo, lipase ou esterase) da invenção é empregada para fabricar uma alternativa de manteiga de cacau, por exemplo, um substituto de manteiga de cacau, um substituto de manteiga de cacau e/ou um equivalente de manteiga de cacau. Desse modo, a invenção também fornece alternativas de manteiga de cacau, incluindo substitutos de manteiga de cacau, substituintes de manteiga de cacau e equivalentes de manteiga de cacau e seus intermediários de fa- bricação compreendendo uma enzima da invenção. Um processo da inven-ção (empregando uma enzima da invenção) para fabricar alternativas de manteiga de cacau pode compreender misturar um óleo vegetal, por exem-plo, um óleo de palma, com cisalhamento ou equivalente, illipe ou equivalente e esterinas de Sal ou equivalente. Em um aspecto, o processo da invenção compreende emprego de interesterificação. O processo da invenção pode gerar formas composicionais ou cristalinas que imitam a manteiga de cacau "natural".
Em um aspecto, a invenção fornece processos (empregando-se uma enzima da invenção) para produzir um diacilglicerol (DAG), por exem-plo, 1,3 diacilglicerol, empregando-se um óleo vegetal, por exemplo, um óleo de baixo custo. A enzima pode ser quimioseletiva e/ou enantioseletiva. O processo da invenção pode resultar em uma composição compreendendo DASG tendo boa estabilidade, vida de prateleira longa e desempenho em alta temperatura.
Processamento enzimático de sementes oleosas
A invenção fornece composições (por exemplo, enzimas de hi- drolase hidrolase da invenção, tal como lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) e métodos para processamento enzimático de sementes oleosas, incluindo feijão soja, canola, coco, abacate e pasta de azeitona. Em um as-pecto, estes processos da invenção podem aumentar a produção de óleo e melhorar a qualidade nutricional das farinhas obtidas. Em alguns aspectos, o processamento enzimático de sementes oleosas empregando composições e métodos da invenção fornecerão benefícios econômicos e ambientais, bem como tecnologias alternativas para extração de óleo e processamento de alimento para consumo humano e animal. Em aspectos alternativos, os processos da invenção compreendem o uso de qualquer hidrolase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase da invenção (ou outra fosfolipase), uma protease da invenção (ou outra protease), fosfastases, fitases, xilanases, uma amilase, por exemplo, a-amilases, uma glicanase, por exemplo, β- glicanases, uma poligalacturonase, alactolipases, uma celulase, uma hemi- celulase, uma pectinase e/ou outras enzimas de degradação da parede de célula de planta, bem como preparações de enzima mistas e lisados celula-res, ou preparações de enzima para fontes recombinantes, por exemplo, células hospedeiras ou plantas transgênicas.
Em aspectos alternativos, os processos da invenção podem ser praticados em conjunto com outros processos, por exemplo, tratamentos enzimáticos, por exemplo, com carboidrases, incluindo celulase, hemicelu- lase e outras atividades de degradação laterais, ou, processos químicos, por exemplo, extração de hexano de óleo de soja. O tratamento enzimático pode aumentar a extractabilidade de óleo em 8 a 10% quando o tratamento enzi- mático é realizado antes das extração de solvente.
Em aspectos alternativos, os processos das invenção podem ser praticados com processos de extração aquosos. Os métodos de extração aquosa pode ser tecnologias alternativas ambientalmente mais limpas para extração de óleo. Produções de baixa extração de processo aquoso podem ser superadas empregando-se enzimas que hidrolizam os polissacarídeos estruturais formando a parede celular de sementes de óleo, ou que hidroli- zam as proteínas que formam as membranas de corpo de célula e lipídeo, por exemplo, utilizando digestões compreendendo celulase, hemicelulase, e/ou protopectinase para extração de óleo de células de soja. Em um aspec-to, os métodos são praticados com uma enzima da invenção como descrito por Kasai (2003) J. Agric. Food Chem. 51: 6217-6222, que reportou a enzima mais eficaz para digerir a parede celular foi a celulase.
Em um aspecto, proteases da ivnenção ou outras proteases são empregadas em combinação com os métodos da invenção. O efeito combi-nado de variáveis operacionais e atividade de enzima de uma protease e celulase em óleo e produções de extração de proteína combinadas com ou-trosparâmetros de processo, tal como concentração de enzima, tempo de hidrólise, tamanho de partícula e relação de sólido-para-líquido foi bem ava-liado. Em um aspecto, os métodos são praticados com uma enzima da in-venção como descrito por Rosenthal (2001) Enzyme and Microb. Tech. 28: 499-509, que reportou que o uso de protease pode resultar em produções significantemente mais elevadas de óleo e proteína durante o controle quan- do a farinha tratada por calor é empregada.
Em um aspecto, completa extração de proteína, pectina, e hemi- celulose é empregada em combinação com os métodos da invenção. A célu-la de planta consiste em uma série de polissacarídeos freqüentemente asso-ciados com ou substituídos por proteínas ou compostos fenólicos. A maioria destes carboidratos é apenas parcialmente digerida ou pouco utilizada pelas enzimas digestivas. A ruptura destas estruturas através de processamento ou degradação de enzimas pode melhorar sua disponibilidade nutriente. Em um aspecto, métodos são praticados com uma enzima da invenção como descrito por Ouhida (2002) J. Agric. Food Chem. 50: 1933-1938, que reportou que uma degradação significante da celulose de parede de célula de so-ja(até 20%) foi obtida após completa extração de proteína, pectina e hemi- celulose.
Em um aspecto, os métodos da invenção também compreendem incorporação de vários tratamentos enzimáticos no tratamento de sementes, por exemplo, sementes de canola, estes tratamentos compreendendo o uso de proteases da invenção (ou outras proteases), celulases, e hemicelulases (em várias combinações entre si e com uma ou mais enzimas da invenção). Por exemplo, os métodos podem compreender tratamentos enzimáticos de sementes de canola, estes tratamentos compreendendo o uso de proteases da invenção (ou outras proteases), celulases e hemicelulaes (em várias combinações entre si e com uma ou mais enzimas da invenção.). Por exem-plo, os métodos podem compreender tratamentos enzimáticos de sementes de canola em 20 a 40 umidade durante a incubação com enzimas antes de um processo convencional; como descrito, por exemplo, por Sosulski (1990) Proc. Can. Inst. Food Sci. Technol. 3: 656. Os métodos da invenção podem também compreender incorporação de proteases da invenção (ou outras proteases), α-amilases, poligalacturonases (em várias combinações entre si e com uma ou mais enzimas da invenção) para hidrolisar material celular em farinha de coco e liberar o óleo de coco, que pode ser recuperado por centri-fugação,como descrito, por exemplo, por McGlone (1986) J. of Food Sci. 51: 695-697. Os métodos da invenção podem também compreender incorpora- ção de pectinases, α-amilases, proteases da invenção (ou outras proteases), celulases em diferentes combinações (de uma com a outra e com uma ou mais enzimas da invenção) para resultar em significante melhora de produ-ção (~ 70% no melhor caso) durante extração enzimática de óleo de abacate, como descrito, por exemplo, por Buenrostro (1986) Biotech. Letters 8(7): 505-506. Em processos da invenção para extração de óleo de oliva, pasta de oliva é tratada com celulase, hemicelulase, poligalacturonase, pectin- metiltransferase, protease da invenção (ou outras proteases) e suas combi-nações (uma com a outra e com uma ou mais enzimas da invenção), como descrito, por exemplo, por Montedoro (1976) Acta Vitamin. Enzymol. (Milano) 30: 13.
Desengomadura de óleo e processamento de óleo vegetal
As enzimas da invenção (por exemplo, lipases, fosfolipases, es-terases, proteases da invenção) podem ser empregadas em várias etapas de processamento de óleo vegetal, tal como em extração de óleo vegetal, particularmente, na remoção de "gomas de fosfolipídeo"em um processo chamado "desengomadura de óleo".
Em um aspecto, a invenção fornece processos de desengoma- dura de óleo compreendendo uso de uma hidrolase da invenção tendo uma atividade de fosfolipase C (PLC). Em um aspecto, o processo também com-preende a adição de um PLA da invenção e/ou uma fosfolipase tipo patatina da invenção. Em um aspecto, todas as enzimas são adicionadas juntas, ou alternativamente, a adição de PLC é seguida por adição de PLA e/ou patati- na. Em um aspecto, este processo fornece uma melhora de produção como um resultado do tratamento de PLC. E um aspecto, este processo fornece um decréscimo adicional do conteúdo de fósforo do óleo como um resultado do tratamento de PLA.
A invenção fornece métodos para processar óleos vegetais de várias fontes, tais como farelo de arroz, sojas, semente de colza, amendoim e outras nozes, gergelim, girassol, palma e milho. Os métodos podem ser empregados em conjunto com processos com base na extração como hexa-no, com subseqüente refinamento dos extratos crus em óleos comestíveis, incluindo o uso dos métodos e enzimas da invenção. A primeira etapa na seqüência de refinamento é o assim chamado processo de "desengomadu- ra", que serve para separar fosfatídeos pela adição de água. O material pre-cipitado por desengomadura é separado e outra vez processado para mistu-ras de lecitinas. As lecitinas comerciais, tais como lecitina de soja e lecitina de girassol, são materiais semi-sólido ou muito viscoso. Elas consistem em uma mistura de lipídeos polares, principalmente fosfolipídeos, e óleo, princi-palmentetriglicerídeos.
As enzimas (por exemplo, fosfolipases) da invenção podem ser empregadas em qualquer procedimento de "desengomadura", incluindo de- sengomadura de água, desengomadura de óleo ALCON (por exemplo, para sojas), desengomadura de safinco, "super desengomadura", desengomadu- ra de UF, desengomadura de TOP, uni-desengomadura, desengomadura seca e desengomadura de ENZYMAX™. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos nos 6.355.693, 6.162.623, 6.103.505, 6.001.640, 5.558.781; r.264.367. Vários procedimentos de "desengomadura"incorpora-dos pelos métodos da invenção são descritos em Bockisch, M. (1998) In Fats and Oils Handbook, The extraction of Vegetable Oils (Capítulo 5), 345 - 445, AOCS Press, Champaign, Illinois. As enzimas (por exemplo, fosfolipa- ses) da invenção podem ser empregadas na aplicação industrial de desen- gomadura enzimática de óleos de triglicerídeo como descrito, por exemplo, na EP 513 709.
Em um aspecto, as hidrolases (por exemplo,fosfolipases) da in-venção são empregadas para tratar óleos vegetais, por exemplo, óleos crus, tais como farelo de arroz, soja, canola, girassol, e similares. Em um aspecto, isto melhora a eficiência do processo de desengomadura. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para desengomadura enzimática sob condições de pouca água, por exemplo, na faixa entre cerca de 0,1% a 20% de água, ou, 0,5% a 10% de água. Em um aspecto, Isto resulta na separação melho-rada de uma fase pesada da fase de óleo durante centrifugação. A separa-ção melhorada destas fases pode resultar em remoção mais eficiente de fosfolipídeos do óleo, incluindo tanto óleos hidratáveis quanto não hidratá- veis. Em um aspecto, isto pode produzir uma fração de goma que contenhas menos óleo neutro carreado, desse modo melhorando a produção total de óleo durante o processo de desengomadura.
As hidrolases (por exemplo, fosfolipases) da invenção podem ser empregadas na aplicação industrial de desengomadura enzimática como descrito, por exemplo, em CA 1102795, que descreve um método de isolar lipídeos polares de lipídeos de cereais pela adição de pelo menos 50% em peso de água. Este método é uma desengomadura modificada no sentido de que ele utiliza o princípio de adicionar água a uma mistura de óleo cru.
Em um aspecto, a invenção fornece processos enzimáticos compreendendo emprego de fosfolipases da invenção (por exemplo, um PLC) compreendendo hidrólise de fosfolipídeos hidratados em óleo em uma temperatura de cerca de 20°C a 40°C, em um pH alcalino, por exemplo, um pH de cerca de pH 8 a pH 10, empregando-se um tempo de reação de cerca de 3 a 20 minutos. Isto pode resultar em menos do que 10 ppm de níveis de fósforo de óleo final. A invenção também fornece processos enzimáticos compreendendo o uso de fosfolipases da invenção (por exemplo, uma PLC) compreendendo hidrólise de fosfolipídeos hidratáveis e não-hidratáveis em óleo em uma temperatura de cerca de 50°C a 60°C, em um pH ligeiramente abaixo do neutro, por exemplo, de cerca de pH 5 a pH 6,5, empregando-se um tempo de reação de cerca de 30 a 60 minutos. Isto pode resultar em me-nos do que 10 ppm de níveis de fósforo de óleo final.
Em um aspecto, a invenção fornece processos enzimáticos que utilizam uma enzima de fosfolipase C para hidrolisar uma ligação de fosfoés- ter de glicerila e desse modo possibilitar o retorno da porção de diacilglicerí- deo de fosfolipídeos novamente para o óleo, por exemplo, um óleo de vege-tal, peixe ou alga (um "auxiliar de refinamento cáustico de fosfolipase C (PLC)"); e, reduz o conteúdo de fosfolipídeo em uma etapa de desengoma- dura para níveis baixos o suficiente para óleos de elevado conteúdo de fós-foro serem fisicamente refinados (um "auxiliar de desengomadura de fosfoli- pase C (PLC) ). Os dois métodos podem gerar diferentes valores e ter dife-rentesaplicações alvo.
Em vários processos exemplares da invenção, um número de etapas distintas compõe o processo de desengomadura precedendo o bran-queamento de núcleo e processos de refinamento por desodorização. Estas etapas incluem aquecimento, mistura, retenção, separação e secagem. Se-guindo a etapa de aquecimento, a água e freqüentemente o ácido são adici-onados e misturados para permitir a "goma" de fosfolipídeo insolúvel aglo-merar-se em partículas que podem ser separadas. Ao mesmo tempo que a água separa muitos dos fosfatídeos em desengomadura, porções dos fosfo- lipídeos são fosfatídeos não hidratáveis (NHPs) presente como sais de cálcio ou magnésio. Os processos de desengomadura controla estes NHPs ela adição de ácido. Seguindo a hidratação de fosfolipídeos, o óleo é misturado, mantido e separado por centrifugação. Finalmente, o óleo é secado e arma-zenado, expedido ou refinado. As gomas resultantes são ou processadas ou para produtos de lecitina ou adicionados novamente na refeição.
Em vários processos exemplares da invenção os níveis de fósfo-rosão reduzidos, baixos o suficiente para refinamento físico. O processo de separação pode resultar em perdas de produção potencialmente maiores do que o refinamento cáustico. Adicionalmente, processos de desengomadura podem gerar produtos de excreção que não podem ser vendidos como leci-tina comercial. Portanto, estes processos não conseguiram uma significante compartilhação do mercado e os processos de refinamento cáustico conti-nuam a dominar a indústria quanto ao farelo de arroz, soja, canola, e giras-sol. Observe entretanto, que uma enzima de fosfolipase C empregada em um processo de desengomadura especial diminui a formação de goma e retornam a porção de diglicerídeo do fosfolipídeo novamente para o óleo.
Em um aspecto, uma enzima de fosfolipase C da invenção hidro- lisa um fosfatídeo em uma ligação de fosfoéster de glicerila para gerar um diglicerídeo e composto de fosfato solúvel em água. O fosfatídeo hidrolizado move-se para a fase aquosa, deixando o diglicerídeo na fase de óleo. Um objetivo do "Auxiliar de Refinamento Cáustico"de PLC. Um objetivo do "Au-xiliar de Refinamento Cáustico"de PLC é converter as gomas de fosfolipídeo formadas durante a neutralização em um diacilglicerídeo que migrará nova- mente para dentro da fase de óleo. Ao contrário, um objetivo do "Auxiliar de Desengomadura de PLC"é reduzir os fosfolipídeos em óleo cru em um equi-valente de fósforo de menos do que 10 partes por milhão.
Em um aspecto, a enzima de fosfolipase C da invenção hidroli- sará o fosfatídeo de ambos fosfolipídeos hidratáveis e não hidratáveis em óleos desengomados e crus neutralizados antes do branqueamento e deso- dorização. A enzima alvo pode ser aplicada como um produto de gotejamen- to no processo de neutralização cáustica existente. Com respeito a isto, a enzima não será requerida para sustentar os níveis de pH extremos se ela for adicionada após a adição de cáustico.
Em um aspecto, a fosfolipase da invenção possibiliza o fósforo ser removido para os níveis baixos aceitáveis em refinamento físico. Em um aspecto, uma PLC da invenção hidrolisará o fosfatídeo de ambos os fosfoli- pídeos hidratáveis e não hidratáveis em óleos cruz antes do branqueamento e desodorização. A enzima alvo pode ser aplicada como um produto de go- tejamento na operação de desengomamento existente. Devido à mistura sub-ideal em equipamento comercial, é provável que o ácido seja requerido para trazer os fosfolipídeos hidratáveis em contato com a enzima na interface óleo/água. Portanto, em um aspecto, um PLC estável em ácido da invenção é empregado.
Em um aspecto, um processo Auxiliar de Desengomdura de PLC da invenção pode eliminar as perdas em uma, ou todas as três áreas: 1) Perda de óleo em formação &separação de goma; 2) Óleo saponificado em adição cáustica; 3) Óleo apreendido em argila em branqueamento. Perdas associadas em um processo de PLC podem ser estimadas serem em torno de 0,8% versus 5,2% em uma base de massa devido à remoção do fosfatí- deo. Os benefícios potenciais adicionais deste processo da invenção inclu-em os seguintes: • Adsorventes reduzidos - menos adsorventes requeridos com menos fósforo (<5 ppm); • Uso químico menor - menos custos químicos e processamento associados com a hidratação de fosfolipídeos não hidratáveis. • Menor geração de lixo - menos água requerida para remover o fósforo de óleo.
Os óleos processados (por exemplo, "desengomado) pelos mé-todos da invenção incluem sementes oleosas de planta, por exemplo, farelo de arroz, óleo de soja, óleo de semente de colza e óleo de girassol. Em um aspecto, o "Auxiliar de Refinamento Cáustico de PLC" da invenção pode sal-var 1,2% de processos de refinamento cáustico existente. A aplicação de auxiliar de refinamento controla o óleo de soja que foi desengomado para lecitina e estes são também excluídos dos cálculos de valor/carga.
Outros processos que podem ser empregados com uma fosfoli- pase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase A1 da invenção podem con-verter fosfolipídeos nativos não hidratáveis em uma forma hidratável. Em um aspecto, a enzima é sensível ao calor. Isto pode ser desejável, uma vez que o aquecimento do óleo pode destruir a enzima. Entretanto, a reação de de- sengomadura deve ser ajustada ara pH 4 a 5 e 60°C para acomodar esta enzima. Em 300 Unidades/Kg de dosagem de saturação de óleo, este pro-cesso exemplar é bem sucedido na tomada de conteúdo de fósforo de óleo previamente desengomado em água abaixo de < 10 ppm P. Vantagens po-dem ser diminuídas, conteúdo de H2O e economias resultantes em uso, ma-nipulação e lixo.
Em adição a estes vários processos de "desengomadura", as enzimas da invenção podem ser empregadas em qualquer etapa de proces-samento de óleo vegetal. Por exemplo, as enzimas de fosfolipase da inven-ção podem ser empregadas em lugar de PLA, por exemplo, fosfolipase A2, em qualquer etapa de processamento de óleo vegetal. Os óleos que são "processados" ou "desengomados" nos métodos da invenção incluem óleos de soja, óleos de semente de colza, óleos de milho, óleo de farelo de arroz, sementes de palma, óleo de canola, óleos de girassol, óleos de gergelim, óleos de amendoim, e similares. Os principais produtos deste processo in-cluem triglicerídeos.
Em um processo exemplar, quando a enzima é adicionada a e reagida com um óleo cru, a quantidade de fosfolipase empregada é em torno de 10 a 10.000 unidades, ou, alternativamente, cerca de 100 a 2.000 unida-des, por 1 Kg de óleo cru. O tratamento de enzima é conduzido durante 5 minutos a 10 horas em uma temperatura de 30°C a 90°C, ou, alternativa-mente, cerca de 40°C a 70°C. As condições podem variar dependendo da temperatura ideal da enzima. A quantidade de água adicionada para dissol-ver a enzima é de 5-1.000 partes em peso por 100 partes em peso de óleo cru, ou, alternativamente, cerca de 10 a 200 partes em peso por 100 partes em peso de óleo cru.
Na conclusão de tal tratamento de enzima, a enzima líquida é separada com um método apropriado tal como um separador centrífugo e o óleo processado é obtido. Os compostos contendo fósforo produzidos por decomposição de enzima de substâncias gomosas em um tal processo são praticamente todos transferidos para dentro da fase aquosa e removidos da fase oleosa. Na conclusão do tratamento de enzima, se necessário, o óleo processado pode ser adicionalmente lavado com água ou ácido orgânico ou inorgânico tal como, por exemplo, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sucí- nico, e similares, ou com soluções de sal.
Em um processo exemplar para desengomadura de ultra-filtra-gem, a enzima é ligada a um filtro ou a enzima é adicionada a um óleo antes da filtração ou a enzima é empregada para periodicamente limpar filtros.
Em um aspecto, a invenção fornece processos empregando-se uma hidrolase da invenção, por exemplo, uma fosfolipase da invenção, tal como uma fosfoidrolase específica de fosfolipase da invenção, ou outra fos- folipase, em um "processo de refinamento orgânico", que pode compreender a adição da enzima (por exemplo, uma hidrolase, tal como uma PLC) em um tanque de retenção de ácido cítrico.
Enzimas da invenção são empregadas para melhorar a extração de óleo e desengomadura de óleo (por exemplo, óleos vegetais). Em um aspecto, uma hidrolase (por exemplo, fosfolipase, tal como uma PLC) da invenção e pelo menos um degradante de parede de célula de planta (por exemplo, uma celulase, uma hemicelulase ou similares, para amaciar pare-des e aumentar a produção em extração) são empregados em um processo da invenção. Neste método exemplar para empregar enzimas da invenção para melhorar a extração de óleo e desengomadura de óleo, uma hidrolase (por exemplo, fosfolipase C) da invenção bem como outras hidrolases (por exemplo, uma celulase, uma hemicelulase, uma esterase da invenção ou outra esterase, uma protease da invenção ou outra protease e/ou uma fosfa- tase) são empregadas durante as etapas de esmagamento associadas com a produção de óleo (incluindo porém não limitadas ao óleo de soja, canola, farelo de arroz e girassol). Empregando-se enzimas antes de ou em lugar de extração de solventes, é possível aumentar a produção de óleo e reduzir a quantidade de fosfolipídeos hidratáveis e não hidratáveis no óleo cru. A re-dução em fosfolipídeos não hidratáveis pode resultar de conversão de fosfo- lipídeos potencialmente não hidratáveis em diacilglicerol e correspondente éster de fosfato antes da complexação com cálcio ou magnésio. A redução total de fosfolipídeos no óleo cru resultará em produções melhoradas duran-te o refinamento com o potencial para eliminar o requisito para uma etapa de desengomadura separada antes do branqueamento e desodorização.
Em um processo exemplar para um auxiliar de refinamento físico mediado por fosfolipase, água e enzima são adicionadas ao óleo cru. Em um aspecto, uma PLC ou PLD e uma fosfatase são empregadas no processo. No refinamento físico mediado por fosfolipase, o nível de água pode ser bai-xo, isto é 0,5 a 5% e o tempo de processo deve ser curto (menor do que 2 horas, ou, menor do que 60 minutos, ou menor do que 30 minutos, ou, me-nor do que 15 minutos, ou menor do que 5 minutos). O processo pode ser executado em diferentes temperaturas (25°C a 70°C), empregando-se dife-rentesácidos e/ou cáusticos, em diferentes pHs (por exemplo, 3 a 10 ).
Em aspectos alternados, o desengomamento de água é realiza-do primeiro para coletar lecitina por centrifugação e em seguida PLC ou PLC e PLA são adicionados para remover fosfolipídeos não hidratáveis (o pro-cesso deve ser realizado sob baixa concentração de água). Em outro aspec-to, o desengomamento de água de óleo cru a menos do que 10 ppm (óleos comestíveis) e subseqüente refinamento físico (menos do que 50 ppm para biodíesel) é realizado. Em um aspecto, um emulsificante é adicionado e/ou o óleo cru é submetido a um misturador intenso para promover a mistura. Al-ternativamente, um quebrador de emulsão é adicionado e/ou o óleo cru é aquecido para promover a separação da fase aquosa. Em outro aspecto, um ácido é adicionado para promover hidratação de fosfolipídeos não hidratá-veis. Adicionalmente, as fosfolipases podem ser empregadas para mediar a purificação de fitoesteróis da goma/estoque de sabão.
As enzimas da invenção podem ser empregadas em qualquer método de processamento de óleo, por exemplo, desengomamento ou pro-cessos equivalentes. Por exemplo, as enzimas da invenção podem ser em-pregadas em processos como descrito nas As Patentes dos Estados Unidos nos 5.558.781, 5.264.367, 6.001.640. O processo descrito na USPN 5.558.781 emprega ou fosfolipase A1, A2 ou B, essencialmente rompendo lecitina no óleo que comporta-se como um emulsificante.
As enzimas e métodos da invenção podem ser empregdas em processos para a redução de componentes contendo fósforo em óleos co-mestíveis compreendendo uma quantidade elevada de fósforo não hidratável empregando-se um fosfolipase da invenção, por exemplo, um polipeptídeo tendo uma atividade de fosfolipase A e/ou B, como descrito, por exemplo, na Patente EP Número: EP 0869167. Em um aspecto, o óleo comerstível é um óleo cru, um assim chamado "óleo não desengomado". Em um aspecto, o método trata um óleo não desengomado, incluindo óleos prensados ou óleos extraídos, ou uma mistura destes, de, por exemplo, farelo de arroz, semente de colza, soja, gergelim, amendoim, milho ou girassol. O conteúdo de fosfa- tídeo em um óleo cru pode variar de 0,5 a 3% peso/peso correspondendo a um conteúdo de fósforo na faixa de 200 a 1200 ppm, ou, na faixa de 250 a 1200 pm. A parte dos fosfatídeos, o óleo cru pode também conter pequenas concentrações de carboidratos, compostos de açúcar e complexos de ácido de fosfatídeo/metal de Ca, Mg e Fe. Em um aspecto, o processo compreende tratamento de um fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo com a fosfolipase da invenção a fim de hidrolisar os grupos de acila graxo. Em um aspecto, o fos- folipídeo ou lisofosfolipídeo compreende lecitina ou lisolecitina. Em um aspecto do processo o óleo comestível tem um conteúdo de fósforo entre cerca de 50 a 250 ppm, e o processo compreende tratar o óleo com uma fosfoli- pase da invenção a fim de hidrolisar a maior parte do fosfolipídeo e separar uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado do óleo. Em um aspec-to. antes do processo de desengomadura enzimática o óleo é desengomado em água. Em um aspecto, os métodos provêm a produção de uma alimenta-ção animal compreendendo misturar a fosfolipase da invenção com substân-cias alimentares e pelo menos um fosfolipídeo.
As enzimas e métodos da invenção podem ser empregadas em processos de desengomadura de óleo como descrito, por exemplo, na WO 08/18912. As fosfolipases da invenção podem ser empregadas para reduzir o conteúdo de fosfolipídeo em um óleo comestível. O processo pode com-preender tratar o óleo com uma fosfolipase da invenção para hidrolisar uma maior parte do fosfolipídeo e separar uma fase aquosa contendo o fosfolipí- deo hidrolizado do óleo. Este processo é aplicável à purificação de qualquer óleo comestível, que contém um fosfolipídeo, por exemplo, óleos vegetais, tal como farelo de arroz, óleo de soja, óleo de semente de colza e óleo de girassol, óleos de peixe, óleos de alga e animal e similares. Antes do trata-mentoenzimático, o óleo vegetal é preferivelmente pretratado para remover limo (mucilagem), por exemplo, por refinamento úmido. O óleo pode conter 50 a 250 ppm de fósforo como fosfolipídeo no início do tratamento com fos- folipse, e o processo da invenção pode reduzir este valor para abaixo de 5 a 10 ppm.
As enzimas da invenção podem ser empregadas em processos como descrito no Pedido JP n° H5-132283, depositado em 25 de abril de 1993, que compreende um processo para a purificação de óleos e gorduras compreendendo uma etapa de conversão dos fosfolipídeos presentes nos óleos e gorduras em substâncias solúveis em água contendo grupos de áci-dofosfórico e removendo-as como substâncias solúveis em água. Uma ação de enzima é empregada para a conversão em substâncias solúveis em água. Uma enzima tendo uma atividade de fosfolipase C é preferivelmente empregada como a enzima.
As enzimas da invenção podem ser empregadas em processos como descrito como o "Processo de Refinamento Orgânico", (ORP) (IPH, Omaha, NE) que é um método de refinar óleos de semente. O ORP pode ter vantagens sobre o refinamento químico tradicional, incluindo produção de óleo refinado melhorada, valor adicionado de co-produtos, custos de capital reduzidos e menores custos ambientais.
As enzimas da invenção podem ser empregadas em processos para o tratamento de um óleo ou gordura, animal ou vegetal, cru, semi- processado ou refinado, compreendendo adicionar a tal óleo ou gordura pelo menos uma enzima da invenção que permite hidrolisar e/ou despolimerisar os compostos não glicerídicos contidos no óleo, como descrito, por exemplo, no Pedido EP n° 82870032.8. Métodos exemplares da invenção para hidrólise e/ou despolimerização de compostos não glicerídicos em óleos são: 1) adição e mistura em óleos e gorduras de uma enzima da in-venção ou complexos de enzima previamente dissolvidos em uma pequena quantidade de solvente apropriado (por exemplo água). Um certo número de solventes é possível, porém um solvente não tóxico e adequado para a en-zimaé escolhido. Esta adição pode ser feita em processos com cargas su-cessivas, bem como em processos contínuos. A quantidade de enzima(s) necessárias a ser adicionada a óleos e gorduras, de acordo com este pro-cesso, pode variar, dependendo das enzimas e dos produtos a serem pro-cessados, de 20 a 400 ppm, isto é, de 0,02 kg a 0,4 kg de enzima para 1000 kg de óleo ou gordura, e preferivelmente de 20 a 100 ppm, isto é, de 0,02 a 0,1 kg de enzima para 1000 kg de óleo, esses valores sendo entendido ser para enzimas concentradas, isto é, sem diluente ou solvente. 2) Passagem do óleo ou gordura através de um leito fixo ou in-solúvel de filtragem de enzima(s) da invenção em suportes sólidos ou semi- sólidos, preferivelmente apresentando uma estrutura porosa ou fibrosa. Nes-tatécnica, as enzimas são capturadas nas micro-cavidades da estrutura po-rosa ou fibrosa dos suportes. Essas consistem, por exemplo, de resinas ou polímeros sintéticos, carbonatos de celulose, géis tal como, agarose, fila-mentos de polímeros ou copolímeros com estrutura porosa, captura de pe-quenasgotículas de enzima na solução em suas cavidades. Com referência a concentração de enzima, é possível aumentar a saturação dos suportes. 3) Dispersão dos óleos e gorduras na forma de gotículas finas, em uma solução enzimática diluída, preferivelmente contendo 0,2 a 4% em volume de uma enzima da invenção. Esta técnica é descrita, por exemplo, na Patente Belga No. 595.219. Uma coluna cilíndrica com uma altura de vários metros, com tampa cônica, é carregada com uma solução enzimática diluída. Para este propósito, um solvente que seja não tóxico e não miscível no óleo ou gordura a ser processado, preferivelmente água, é escolhido. A base da coluna é equipada com um sistema de distribuição no qual o óleo ou gordura é continuamente injetado em uma forma extremamente dividida (aproximadamente 10.000 fluxos por m2). Desse modo, um número infinito de gotículas de óleo ou gordura é formado, o qual lentamente aumenta na solução de enzimas e se reúne na superfície, para ser evacuado continua-mente no topo da tampa cônica do reator.
O óleo de palma pode ser pré-tratado antes do tratamento com uma enzima da invenção. Por exemplo, cerca de 30 kg de óleo de palma bruto são aquecidos em +50oC. 1% das soluções foi preparado em água destilada com celulase e pectinase. 600 g de cada desses foram adiciona-dosàs soluções aquosas do óleo sob agitação forte durante alguns minutos. O óleo é então mantido em +50oC sob agitação moderada, durante um tempo de reação total de duas horas. Em seguida, a temperatura é aumentada para +90oC para desativar as enzimas e preparar a mistura para filtração e outro processamento. O óleo é secado sob vácuo e filtrado com um auxiliar de filtração.
As enzimas da invenção podem ser empregadas nos processos como descrito na patente EP 0 513 709 B2. Por exemplo, a invenção fornece um processo para a redução do conteúdo dos componentes contendo fósfo-ro, em óleos animais e vegetais por decomposição enzimática empregando uma fosfolipase da invenção. Um óleo vegetal e animal pré- desmucilagenados, com um conteúdo de fósforo de 50 a 250 ppm, é agitado com um ácido carboxílico orgânico e o valor do pH da mistura resultante é ajustado para pH 4 a pH 6, uma solução de enzima que contém fosfolipase A1, A2, ou B da invenção é adicionada à mistura em um recipiente de mistura sob agitação turbulenta e com a formação de gotículas finas, onde uma emulsão com 0,5 a 5% em peso relativo ao óleo, é formada, a referida emul-são sendo conduzida através de pelo menos um recipiente de reação sub- seqüente sob movimento turbulento durante um tempo de reação de 0,1 a 10 horas em temperaturas na faixa de 20 a 80oC e onde o óleo tratado, após a separação da solução aquosa, tem um conteúdo de fósforo sob 5ppm.
O processo de refinamento orgânico é aplicável a ambos óleo desengomado e bruto. O processo usa a adição em linha de um ácido orgâ-nico sob condições controladas de processo, em conjunto com a separação centrifuga convencional. A água separada naturalmente dos fosfolipídeos de óleo vegetal ("VOP") é reciclada e re-utilizada. O uso da água total pode ser substancialmente reduzido como um resultado do Processo de Refinamento Orgânico.
A fosfolipase e métodos da invenção podem ser também empre-gados no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.162.623. Nestes métodos exemplares, a invenção fornece uma enzima anfifílica. Ela pode ser imobilizada, por exem-plo, preparando-se uma emulsão contendo uma fase hidrofóbica contínua e uma fase aquosa dispersa contendo a enzima e um portador para a enzima e removendo a água da fase dispersa até que esta fase se transforme em partículas revestidas de enzima sólida. A enzima pode ser uma lipase. A li-pase imobilizada pode ser empregada para reações catalisadas por lipase tal como interesterificação de mono-, di- ou triglicerídeos, desacidificação de um óleo de triglicerídeo, ou remoção de fosfolipídeos de um óleo de triglice- rídeo onde a lipase é uma fosfolipase. A fase aquosa pode conter um líquido de fermentação, um óleo de triglicerídeo comestível pode ser a fase hidrofó- bica, e os portadores incluem açúcares, amido, dextrano, derivados de celu-losesolúveis em água e resíduos de fermentação. Este método exemplar pode ser empregado para processar os triglicerídeos, diglicerídeos, monogli- cerídeos, glicerol, fosfolipídeos ou ácidos graxo, que podem estar na fase hidrofóbica. Em um aspecto, o processo para a remoção de fosfolipídeos de óleo de triglicerídeo compreende misturar um óleo de triglicerídeo contendo os fosfolipídeos com uma preparação contendo uma fosfolipase da inven-ção; hidrolisar os fosfolipídeos para lisofosfolipídeo; separar os fosfolipídeos hidrolisados do óleo, onde a fosfolipase é uma fosfolipase imobilizada.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.127.137. Um método exemplar hidrolisa ambos grupos de acila graxa no fosfolipídeo intacto. Uma fosfolipase da invenção em-pregada neste método pode não ter nenhuma atividade de lipase e pode ser ativa em pH muito baixo. Essas propriedades a tornam muito adequada para uso na desengomadura de óleo, uma vez que a hidrólise enzimática e alcali-na(saponificação) do óleo pode igualmente ser suprimida.
Em um aspecto, a invenção fornece um processo para hidrolisar os grupos de acila graxa em um fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo compreen-dendo tratar o fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo com a fosfolipase que hidrolisa ambos os grupos de acila graxa em um fosfolipídeo e é essencialmente livre da atividade de lipase. Em um aspecto, a fosfolipase da invenção tem uma temperatura ideal em cerca de 50oC, medida em pH 3 a pH 4 durante 10 minutos, e um pH ideal de cerca de pH 3, medido em 40oC durante cerca de 10 minutos. Em um aspecto, o fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo compreende lecitina ou lisolecitina. Em um aspecto, após hidrolisar uma maior parte do fosfolipídeo, uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado é separa-da do óleo. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para a remoção de fosfolipídeo de um óleo comestível, compreendendo tratar o óleo em pH 1,5 a 3 com uma dispersão de uma solução aquosa da fosfolipase da invenção, e separar uma fase aquosa contendo o fosfolipídeo hidrolisado do óleo. Em um aspecto, o óleo é tratado para remover a mucilagem antes do tratamento com a fosfolipase. Em um aspecto, o óleo antes do tratamento com a fosfolipase contém o fosfolipídeo em uma quantidade correspondendo de 50 a 250 ppm de fósforo. Em um aspecto, o tratamento com fosfolipase é feito de 30oC a 45oC durante 1 a 12 horas em uma dosagem de fosfolipase de 0,1 a 10 mg/l na presença de 0,5 a 5% de água.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.025.171. Neste método exemplar, as enzimas da in-venção são imobilizadas preparando-se uma emulsão contendo uma fase hidrofóbica contínua, tal como um óleo de triglicerídeo, e uma fase aquosa dispersa contendo uma enzima anfifílica, tal como lipase ou uma fosfolipase da invenção, e o material portador que é separadamente dissolvido e sepa-radamentenão dissolvido na fase aquosa; e removendo-se a água da fase aquosa até que a fase se transforme em partículas portadoras revestidas de enzima sólida. A parte não dissolvida do material portador pode ser um ma-terial que seja insolúvel em água e óleo, ou um material solúvel em água na forma não dissolvida por que a fase aquosa já está saturada com o material solúvel em água. A fase aquosa pode ser formada com um líquido de fer-mentação de lipase bruto contendo resíduos de fermentação e biomassa que podem servir como materiais portadores. A lipase imobilizada é útil para re-disposição de éster e des-acidificação em óleos. Após uma reação, a enzima imobilizada pode ser regenerada para uma reação subseqüente adicio-nando-seágua para obter a dissolução parcial do portador, e com a enzima resultante e fase aquosa contendo o portador dispersa em uma fase hidrofó- bica, evaporando a água para novamente formar as partículas portadoras revestidas de enzima.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.143.545. Este método exemplar é empregado para reduzir o conteúdo de componentes contendo fósforo em um óleo comestível compreendendo uma quantidade elevada de conteúdo de fósforo não hidra- tável empregando uma fosfolipase da invenção. Em um aspecto, o método é empregado para reduzir o conteúdo de componentes contendo fósforo em um óleo comestível tendo um conteúdo de fósforo não hidratável de pelo menos 50 ppm medido por pré-tratamento do óleo comestível, em 60oC, por adição de uma solução compreendendo o monoidrato de ácido cítrico em água (água vs. óleo adicionado igual a 4,8% peso/peso; (ácido cítrico) na fase de água = 106 mM, na emulsão de água/ óleo = 4,6 mM) durante 30 minutos; transferindo-se 10 ml da água pré-tratada em emulsão de óleo para um tubo; aquecendo-se a emulsão em um banho de água fervente durante 30 minutos; centrifugando-se em 5000 rpm durante 10 minutos, transferindo-se cerca de 8 ml da fase superior (óleo) para um novo tubo e deixando-a se assentar durante 24 horas; e retirando-se 2 g da fase clara superior para medição do conteúdo de fósforo não hidratável (ppm) no óleo comestível. O método também pode compreender contatar um óleo em um pH de cerca de pH 5 a 8 com uma solução aquosa de uma fosfolipase A ou B da invenção (por exemplo PLA1, PAL2 ou um PLB), cuja solução é emulsificada no óleo até que o conteúdo de fósforo do óleo seja reduzido para menos do que 11 ppm, e em seguida separando a fase aquosa do óleo tratado.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado no tratamento enzimático dos óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No 5.532.163. A invenção fornece, processos para o refinamento de óleo e gordura pelo qual os fosfolipídeos no óleo e gordura a serem tratados podem ser decompostos e removidos eficientemente. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para o refinamento de óleo e gor-dura que compreende reagir, em uma emulsão, o óleo e a gordura com uma enzima da invenção, por exemplo, uma enzima tendo uma atividade de de-composição de ligações de éster de ácido graxo-glicerol em glicerofosfolipí- deos (por exemplo, uma PLA2 da invenção); e outro processo no qual o óleo e gordura tratados pela enzima são lavados com água ou com uma solução aquosa ácida. Em um aspecto, a solução aquosa ácida a ser empregada na etapa de lavagem é uma solução de pelo menos um ácido, por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido fosfórico e sais destes. Em um aspecto, a condição emulsificada é formada empregando 30 partes em peso ou mais de água por 100 partes em peso do óleo e gordura. Uma vez que o óleo e gor- dura podem ser purificados sem empregar a etapa de refinamento por álcali convencional, a geração de água industrial e água de excreção da lavagem, pode ser reduzida. Além disso, a produção de recuperação de óleo é melho-rada por que a perda de óleo e gordura neutro devido a sua inclusão nessas excreções não ocorre no processo inventivo. Em um aspecto, a invenção fornece um processo para refinamento de óleo e gordura contendo cerca de 100 a 10.000 ppm de fosfolipídeos que compreende: reagir, em uma condi-ção emulsificada, o referido óleo e gordura com uma enzima da invenção tendo atividade para decompor as ligações de éster de ácido graxo-glicerol em glicerofosfolipídeos. Em um aspecto, a invenção fornece processos para o refinamento de óleo e gordura contendo cerca de 100 a 10.000 ppm de fosfolipídeos que compreende reagir, em uma condição emulsificada, o óleo e gordura com uma enzima da invenção tendo atividade para decompor as ligações de éster de ácido graxo-glicerol em glicerofosfolipídeos; e subse- qüentemente lavar o óleo e gordura, tratados com uma água de lavagem.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado no tratamento enzimático de óleos comestíveis, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No 5.264.367. O conteúdo dos componentes contendo fósfo-ro e o conteúdo de ferro de um óleo animal ou vegetal comestível, tal como um óleo, por exemplo, óleo de soja, que tenha sido refinado a líquido para remover a mucilagem, são reduzidos por decomposição enzimática conta-tando-se o óleo com uma solução aquosa de uma enzima da invenção, por exemplo, uma fosfolipase A1, A2 ou B, e em seguida separando a fase aquosa do óleo tratado. Em um aspecto, a invenção fornece um método en- zimático para diminuir o conteúdo de componentes contendo fósforo e ferro em óleos, que tenham sido refinados para remover a mucilagem. Um óleo, que tenha sido refinado para remover a mucilagem, pode ser tratado com uma enzima da invenção, por exemplo, fosfolipase C, A1, A2 ou B. Os con-teúdos de fósforo abaixo de 5 ppm e conteúdos de ferro abaixo de 1 ppm podem ser obtidos. O conteúdo de ferro baixo pode ser vantajoso para a es-tabilidade do óleo.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado para preparar os óleos transesterificados, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.288.619. A invenção fornece métodos para a transesteri- ficação enzimática, para a preparação de um óleo de margarina tendo ambos conteúdos de ácido graxo baixo de cadeia intermediária e trans-ácido baixo. O método inclui as etapas de fornecer uma mistura de reação de tran- sesterificação contendo um material de fonte de ácido esteárico e um óleo vegetal líquido comestível, transesterificação do material de fonte de ácido esteárico e o óleo vegetal empregando uma lipase 1-, 3-posicionalmente específica, e em seguida finalmente hidrogenando a mistura de ácido graxo para fornecer um material de fonte de ácido esteárico de reciclo para uma reação recíclica com o óleo vegetal. A invenção também fornece um método contra-corrente para preparar um óleo transesterificado. O método inclui as etapas de fornecer uma zona de reação de transesterificação contendo uma lipase 1-, 3-posicionalmente específica, introduzindo um óleo vegetal dentro da zona de transesterificação, introduzindo um material de fonte de ácido esteárico, conduzindo um fluido contracorrente de gás liquefeito subcrítico ou gás supercrítico, realizando uma reação de transesterificação da corrente de triglicerídeo com o ácido esteárico ou corrente de monoéster de ácido esteárico na zona de reação, retirando uma corrente de óleo de margarina de triglicerídeo transesterificado, retirando uma fase de fluido contracorrente, hidrogenando o monoéster de ácido esteárico ou ácido esteárico transesteri- ficado para fornecer um material de fonte de ácido esteárico de reciclo hi- drogenado, e introduzindo o material de fonte de ácido esteárico de reciclo hidrogenado dentro da zona de reação.
Em um aspecto, o composto de fosfolipídeo altamente não satu-rado pode ser convertido em um triglicerídeo por uso apropriado de uma fos- folipase C da invenção para remover o grupo de fosfato na posição sn-3, seguido por síntese de éster de acila de lipase 1,3. O fosfolipídeo 2- substituído pode ser empregado como um ingrediente de alimento funcional diretamente, ou pode ser subseqüentemente seletivamente hidrolisado no reator 160 empregando uma fosfolipase C imobilizada da invenção para pro-duzir um 1-diglicerídeo, seguido por esterificação enzimática como descrito aqui para produzir um produto de triglicerídeo tendo um componente de áci-do graxo poliinsaturado 2-substituído.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado em um processo de desengomadura enzimática de óleo vegetal como des-crito, por exemplo na Patente U.S. No. 6.001.640. Este método da invenção compreende uma etapa de desengomadura na produção de óleos comestí-veis. Os óleos vegetais dos quais os fosfátidos hidratáveis tenham sido eli-minados por um processo de desengomadura aquosa prévio são liberados dos fosfátidos não hidratados por tratamento enzimático empregando uma fosfolipase da invenção. O processo pode ser suave, econômico e conveni-ente ao ambiente. As fosfolipases que somente hidrolisam a lisolecitina, po-rém não as lecitinas, são empregadas neste processo de desengomadura.
Em um aspecto, para permitir que a enzima da invenção atue, ambas fases, a fase de óleo e a fase aquosa que contêm a enzima, devem ser intimamente misturadas. Pode não ser suficiente meramente agitá-las. A boa dispersão da enzima no óleo é auxiliada se for dissolvida em uma pe-quena quantidade de água, por exemplo, 0,5-5% em peso (relativo ao óleo), e emulsificada no óleo desta forma, para formar gotículas menores do que 10 micrometros em diâmetro (peso médio). As gotículas podem ser menores do que 1 micrômetro. A agitação turbulenta pode ser feita com velocidades radiais acima de 100 cm/ segundo. O óleo pode ser circulado no reator em-pregando uma bomba giratória externa. A fase aquosa contendo a enzima pode também ser perfeitamente dispersada através de ação de ultra-som. Um aparelho para dispersão pode ser empregado.
A reação enzimática provavelmente ocorre na superfície limite entre a fase de óleo e a fase aquosa. É o objetivo de todas essas medidas para mistura, criar a maior superfície possível para a fase aquosa que con-tém a enzima. A adição de tensoativos aumenta a microdispersão da fase aquosa. Em alguns casos, portanto, os tensoativos com valores de HLB acima de 9, tal como sulfato de Na-dodecila, são adicionados à solução de enzima, como descrito, por exemplo, em EP-A 0 513 709. Um método eficaz similar para melhorar a emulsificação é a adição de lisolecitina. As quantida-des adicionadas podem estar na faixa de 0,001% a 1%, com referência ao óleo. A temperatura durante o tratamento da enzima não é crítica. As tempe-raturas entre 20oC e 80oC podem ser empregadas, porém a última pode so-mente ser aplicada durante um tempo curto. Neste aspecto, uma fosfolipase da invenção tendo uma boa temperatura e/ou tolerância ao pH baixa é em-pregada. As temperaturas de aplicação dentre 30oC e 50oC são ideais. O período de tratamento depende da temperatura, e pode ser mantido mais breve com um aumento da temperatura. Os tempos de 0,1 a 10 horas, ou, 1 a 5 horas são geralmente suficientes. A reação ocorre em um reator de de- sengomadura, que pode ser dividido em estágios, como descrito, por exem-plo, na DE-A- 43 39 556. Portanto, a operação contínua é possível, junto com a operação em batelada. A reação pode ser realizada em estágios de temperatura diferentes. Por exemplo, a incubação pode ocorrer durante 3 horas em 40oC, em seguida durante 1 hora em 60oC. Se a reação procede em estágios, isto também abre a possibilidade de ajustar os valores de pH diferentes nos estágios individuais. Por exemplo, no primeiro estágio o pH da solução pode ser ajustado para 7, por exemplo, e em um segundo estágio para 2,5, adicionando-se ácido crítico. Em pelo menos um estágio, entretan-to, o pH da solução de enzima deve estar abaixo de 4, ou, abaixo de 3. Se o pH foi subseqüentemente ajustado abaixo deste nível, uma deterioração do efeito pode ser constatada. Portanto o ácido cítrico pode ser adicionado à solução de enzima antes do último ser misturado no óleo.
Após a conclusão do tratamento de enzima, a solução de enzi-ma, junto com os produtos de decomposição do NHP contido nela, podem ser separados da fase de óleo, em bateladas ou continuamente, por exem-plo,através de centrifugação. Uma vez que as enzimas são caracterizadas por um nível elevado de estabilidade e a quantidade dos produtos de de-composição contida na solução é insignificante (eles podem precipitar como lama), a mesma fase de enzima aquosa pode ser empregada muitas vezes. Há também a possibilidade de liberar a enzima da lama, observe, por exem-plo, DE-A 43 39 556, de modo que uma solução de enzima que esteja es-sencialmente livre da lama possa ser empregada novamente. Em um aspec-to deste processo de desengomadura, os óleos que contêm menos do que 15 ppm de fósforo são obtidos. Um objetivo é os conteúdos de fósforo meno-res do que 10 ppm; menores do que 5 ppm. Com os conteúdos de fósforo abaixo de 10 ppm, outro processamento do óleo de acordo com o processo de des-acidificação destilativa é facilmente possível. Vários outros íons, tal como magnésio, cálcio, zinco, bem como ferro, podem ser removidos do óleo, por exemplo, abaixo de 0,1 ppm. Desse modo, este produto possui pré- requisitos ideais para boa resistência à oxidação durante outro processa-mento e armazenamento.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção, também podem ser empregado para reduzir a quantidade de componentes contendo fósforo em óleos ani-mais e vegetais como descrito, por exemplo, na patente EP 0513709. Neste método, o conteúdo de componentes contendo fósforo, especialmente fosfá- tidos, tal como lecitina, e o conteúdo de ferro em óleos vegetais e animais, que tenham sido anteriormente des-iodados, por exemplo, óleo de soja, são reduzidos por quebra enzimática empregando uma fosfolipase A1, A2 ou B da invenção.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado para o refinamento da gordura ou óleo como descrito, por exemplo, na JP 06306386. A invenção fornece processos para o refinamento de gordura ou óleo compreendendo uma etapa de converter um fosfolipídeo em uma gor-dura ou em um óleo dentro de uma substância contendo o grupo fosfórico solúvel em água, e remover esta substância. A ação de uma enzima da in-venção (por exemplo, uma PLC) é utilizada para converter o fosfolipídeo na substância. Desse modo, é possível refinar uma gordura ou óleo sem realizar uma etapa de refinamento de álcali da qual as excreções industriais con-tendoágua de excreção alcalina e uma grande quantidade de óleo, são pro- duzidas. A melhora das produções pode ser concluída por que a perda do óleo ou gordura neutra da saída com as excreções pode ser reduzida a zero. Em um aspecto, as substâncias viscosas são convertidas em substâncias solúveis em água e removidas como substâncias solúveis em água adicio-nando-se uma enzima da invenção tendo uma atividade de fosfolipase C no estágio de desengomadura do óleo bruto e conduzindo o tratamento enzimá- tico. Em um aspecto, a fosfolipase C da invenção tem uma atividade que corta as ligações de éster de glicerina e ácido fosfórico nos fosfolipídeos. Se necessário, o método pode compreender lavar o óleo tratado por enzima com água ou uma solução aquosa ácida. Em um aspecto, a enzima da invenção é adicionada e reagida com o óleo bruto. A quantidade de fosfolipase C empregada pode ser 10 a 10.000 unidades, ou, cerca de 100 a 2.000 uni-dades, por 1 kg de óleo bruto.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e os métodos da invenção podem ser também empre-gados para processos de desengomadura com água como descrito, por exemplo, por Dijkstra, Albert J., e outros, Oleagineux, Corps Gras, Lipides (1998), 5(5), 367-370. Neste método exemplar, o processo de desengoma- dura com água é empregado para a produção de lecitina e para o os proces-sos de desengomadura a seco empregando um ácido de desengomadura e terra de branqueamento. Este método pode ser economicamente praticável somente para óleos com um conteúdo de fosfátido baixo, por exemplo, óleo de palma, óleos láuricos, etc. Para óleos de semente tendo um conteúdo de NHP elevado, o processo de refinamento por ácido é empregado, por meio do qual este processo é realizado na prensa de extrair óleo para permitir que a goma de disponha através da farinha. Em um aspecto, este óleo refinado por ácido é uma possível operação de "polimento" a ser realizada antes do refinamento físico.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado para o processo de desengomadura como descrito, por exemplo, por Dijkstral, e outros, Res. Dev. Dep., N.V. Vandemoortele Coord. Cent., Ize- gem, Belg. JAOCS, J. Am. Oil Chem. Soc. (1989), 66: 1002-1009. Neste mé-todo exemplar, o processo de desengomadura total envolve dispersar um ácido tal como H3PO4 ou ácido cítrico no óleo de soja, permitindo um tempo de contato, e em seguida misturar uma base tal como soda cáustica ou sili- cato de Na na emulsão de ácido em óleo. Isto mantém o grau de neutraliza-ção baixo o suficiente para evitar a formação de sabão, por que isto levaria ao aumento da perda de óleo. Subseqüentemente, o óleo é passado por um separador centrífugo onde, a maior parte das gomas são removidas da cor-rente de óleo para produzir uma fase de goma com conteúdo de óleo míni-mo. A corrente de óleo é então passada por um segundo separador centrífu-go para remover todas as gomas restantes para produzir uma fase de goma diluída, que seja reciclada. A lavagem e secagem ou refinamento de álcali em linha, completa o processo. Após a adoção do processo de desengoma- dura total, em comparação com o processo de refinamento de álcali clássico, um melhora na produção total de cerca de 0,5% é realizada. O óleo total-mente desengomado pode ser subseqüentemente refinado por álcali, bran-queado e desodorizado, ou fisicamente refinado e branqueado.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção, podem também ser empregado para a remoção de fosfolpídeos não hidratáveis de um óleo de planta, por exemplo, óleo de soja, como descrito, por exemplo, por Hvolby, e outros, Sojakagefabr., Copenhagen, Den., J. Amer. Oil Chem. Soc. (1971) 48: 503-509. Neste método exemplar, o óleo desengomado por água é misturado em valores de pH fixos diferentes com soluções de tampão com e sem Ca++, reagentes de ligação de Mg/Ca, e tensoativos. Os fosfolipídeos não hidratá-veis podem ser removidos em um estado não convertido como um compo-nente de micelas ou de emulsificadores misturados. Além disso, os fosfolipí- deos não hidratáveis são removíveis por conversão na forma dissociada, por exemplo, por remoção de Mg e Ca dos fosfatidatos, que pode ser concluída por acidulação ou por tratamento com reagentes de complexação de Mg/Ca ou de precipitação de Mg/Ca. A remoção ou conversão química dos fosfoli- pídeos não hidratáveis pode resultar na formação da emulsão reduzida e na separação melhorada do óleo des-acidificado da camada de emulsão e do estoque de sabão.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção, podem também ser empregado para a desengomadura de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por Buchold, e outros. Frankfurt/Main, Germany.Fett Wissenschaft Technologie (1993), 95(8), 300-304. Neste processo exemplar da invenção para a desen- gomadura de óleos vegetais comestíveis, as suspensões aquosas de uma enzima da invenção, por exemplo, fosfolipase A2, são empregadas para hi- drolisar a ligação de ácido graxo na posição sn2 do fosfolipídeo, resultando em 1-acil-lisofosfolipídeos que são insolúveis em óleo e desse modo mais tratáveis para separação física. Igualmente, a adição de pequenas quantida-des correspondendo a cerca de 700 unidades de lecitase/kg de óleo resulta em uma concentração residual P menor do que 10 ppm, de modo que o refi-namentoquímico seja substituível por refinamento físico, eliminando a ne-cessidade de neutralização, divisão de estoque de sabão, e tratamento de água de excreção.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção, podem também ser empregado para a desengomadura de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por EnzyMax, Dahlke, Klaus. Dept. G-PDO, Lurgi Ol-Gas, Chemie, GmbH, Frankfurt, Germany; Oleagineux, Corps Gras, Lipides (19997), 4(1), 55-57. Este processo exemplar é um processo de desengomadura para o refina-mentofísico de todo e qualquer tipo de óleo. Por uma hidrólise catalisada enzimática, os fosfátidos são convertidos para lisofosfátidos solúveis em água que são separados do óleo por centrifugação. O conteúdo de fósforo residual no óleo enzimaticamente desengomado pode ser tão baixo quanto 2 ppm de P.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção, podem também ser empregado para a desengomadura de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por Cleenewerck, e outros, N.V. Vamo Mills, Izegem, Belg, Fett Wissenschaft Technologie (1992), 94: 317-22; e, Clausen, Kim; Nielsen, M., Novozymes A/S, Den. Dansk Kemi (2002) 83(2): 24-27. As fosfolipases e métodos da invenção podem incorporar o pré-refinamento de óleos vegetais com ácidos como descrito, por exemplo, por Nilsson-Johansson, e outros, Fats Oils Div., Alfa-Laval Food Eng. AB, Tumba, Swed. Fett Wissenschaft Technologie (1988), 90(11), 447-51; e, Munch, Ernst W. Cereol Deutschland GmbH, Mannheim, Germany.Editor(s): Wilson, Richard F., Proceedings of the World Conference on Oilseed Processing Utilization, Cancun, México, 12-17, 2000 (2001), Meeting Date 2000, 17-20.
As enzimas (por exemplo, lipases, fosfolipases, esterases, pro-teases) da invenção e métodos da invenção podem também ser empregado para a desengomadura de óleos vegetais como descrito, por exemplo, por Jerzewska, e outros, Inst. Przemyslu Miesnego i Tluszczowego, Warsaw, Pol., Tluszcze Jadalne (2001), 36(3/4), 97-110. Neste processo da invenção, a desengomadura enzimática do óleo de semente de colza de ácido erúcico baixo é pelo uso de uma fosfolipase A2 da invenção. A enzima pode catali-sar a hidrólise das ligações de éster de ácido graxo com o átomo de carbono central da porção de glicerol em fosfolipídeos. Ele pode hidrolisar os fosfoli- pídeos não hidratáveis para seu liso-compostos hidratáveis correspondentes. Com uma preparação de enzima não purificada, melhores resultados podem ser obtidos com a adição de 2% de preparação durante 4 horas (87% de remoção P).
Em outro processo exemplar da invenção para desengomadura de óleo (ou um processo de desengomadura de óleo empregando uma en-zima da invenção), um polímero ácido, por exemplo, um alginato ou pectina, é adicionado. Neste processo de desengomadura de óleo da invenção, um polímero ácido (por exemplo, ácido algínico ou pectina ou uma forma de sal mais solúvel) é adicionado ao óleo bruto com uma quantidade baixa de água (por exemplo, em uma faixa dentre cerca de 0,5 a 5%). Neste aspecto, os polímeros ácidos podem reduzir e/ou romper os complexos de fosfolipídeo- metal ligando-se cálcio e/ou magnésio no produto bruto, por meio do qual melhorando a solubilidade de fosfolipídeos não hidratáveis. Em um aspecto, esses fosfolipídeos entrarão na fase aquosa e ou serão convertidos para diacilglicerol e a cadeia lateral correspondente ou o fosfolipídeo intacto será removido por centrifugação subseqüente como um componente da fase pe-sada. A presença do polímero ácido na fase aquosa pode também aumentar a densidade da fase aquosa e resulta em uma separação melhorada da fase pesada da fase de óleo (leve).
Um processo exemplar da invenção para desengomadura de óleo (ou um processo de desengomadura de óleo empregando uma enzima da invenção) altera o procedimento de desodorização para obter uma fração de diacilglicerol (DAG). Em aspecto alternativo, se necessário ou desejado, seguindo a desengomadura auxiliada por enzima, as condições de desodori- zação (temperatura, pressão, configuração do aparelho de destilação) podem ser modificadas com o objetivo de melhorar a separação dos ácidos graxos livres (FFA) da fração de diacilglicerol/ triacilglicerol, ou ainda modificadas para separar o diacilglicerol da fração de triacilglicerol. Como um resultado dessas modificações, empregando este método da invenção, é possível obter bom grau de FFA e diacilglicerol se uma hidrolase da invenção (por exemplo, uma fosfatase, ou, uma PLC ou uma combinação de PLC e fosfatase) são empregadas para desengomar o óleo comestível em um pro-cesso de refinamento físico.
Em vários aspectos, a prática dos métodos da invenção como descrito aqui (ou empregando as enzimas da invenção), tem vantagens tal como: diminuir ou eliminar o solvente ou recuperação de solvente; reduzir os custos de capital; diminuir os custos do refinamento a jusante; diminuir o uso de produtos químicos, equipamento, tempo do processo, energia (aqueci-mento) e uso de água/ geração de água de excreção; produzir óleo de quali-dade mais elevada; expelir o óleo prensado que pode ser empregado sem refinamento em algumas aplicações de cozimento e saltéing(este óleo pren-sado pode ter estabilidade superior, cor e odor característicos e conteúdo de tocoferol elevado); produzir farinha de qualidade mais elevada; produzir um teor de gordura reduzido na farinha (atualmente, a farinha resultante de prensas mecânicas causa problemas de digestão em ruminantes); produzir atributos nutricionais melhorados - níveis reduzidos de glicosinolatos, tani- nos, sinapina, ácido fítico (como descrito, por exemplo, em Technology and Solvents for Extracting Oilseeds and Nonpetroleum Oils, AOCS 1997).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para refinar óleos vegetais (por exemplo, óleo de soja, óleo de milho, óleo de caroço de algo-dão, óleo de palma, óleo de amendoim, óleo de semente de colza, óleo de açafroa, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo, óleo de farelo de arroz, óleo de coco ou óleo de canola) e seus subprodutos, e pro-cessos para a desodorização de lecitina, por exemplo, como descrito nas Patentes dos Estados Unidos nos 6.172.248 ou 6.172.247, onde os métodos compreendem o uso de pelo menos uma hidrolase da invenção, por exem-plo, fosfolipase, tal como uma fosfolipase C da invenção. Desse modo, a invenção fornece lecitina e óleos vegetais compreendendo pelo menos uma enzima da invenção. Em um processo de refinamento de ácido orgânico exemplar, o óleo vegetal é combinado com uma solução de ácido orgânico aquosa diluída e submetido a cisalhar elevado para perfeitamente dispersar a solução de ácido no óleo. A mistura de ácido e óleo resultante é misturada em cisalhar baixo durante um tempo suficiente para seqüestrar os contami- nantes para dentro de uma fase de impurezas hidratadas, produzindo uma fase de óleo vegetal purificado. Nesses processos exemplares, um mistura-dor ou sistema de reciclo (por exemplo, tanque de água de reciclo) e/ou um tanque de armazenamento de fosfátido ou lecitina pode ser empregado, por exemplo, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.240.972, 4.049.686, 6.172.247 ou 6.172.248. Esses processos podem ser conduzidos como um processo contínuo ou em batelada. O óleo vegetal desengomado ou bruto pode ser fornecido de um tanque de armazenamento (por exemplo, através de uma bomba) e pode ser aquecido. O óleo vegetal para ser purificado pode ser ou óleo bruto ou "desengomado".
Em um aspecto, as enzimas de hidrolase tal como as enzimas de fosfatidilinositol-PLC (PI-PLC) da invenção são empregadas para desen- gomadura de óleo vegetal. As enzimas de hidrolase da invenção tendo ativi-dade de PI-PLC podem ser empregadas sozinhas ou em combinação com outras enzimas (por exemplo, PLC, PLD, enzimas de fosfatase da invenção) para melhorar a produção de óleo durante a desengomadura de óleos vege-tais (incluindo, soja, canola e girassol). As enzimas de PI-PLC da invenção podem preferencialmente converter fosfatidilinositol para 1,2-diacilglicerol (DAG) e fosfoinositol porém podem também demonstrar atividade em outros fosfolipídeos incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, ou ácido fosfatídico. A melhora na produção será realizada como um au-mento na quantidade de DAG no óleo vegetal tratado por enzima e um au-mento no óleo neutro, devido a uma diminuição na quantidade de óleo leva-do consigo na fração de goma menor que resulta do tratamento de enzima do óleo vegetal.
Purificação de Fitosteróis de Óleos Vegetais
A invenção fornece métodos para a purificação de fitosteróis e triterpenos, ou esteróis de planta, de óleos vegetais empregando as enzimas da invenção. Os fitosteróis que podem ser purificados empregando as enzi-mas (por exemplo, fosfolipases) e métodos da invenção incluem β-sitosterol, campesterol, estigmasterol, estigmastanol, β-sitostanol, sitostanol, desmos- terol, calinasterol, poriferasterol, clionasterol e brassicasterol. Os esteróis de planta são importantes produtos agrícolas para produtos nutricionais e saú-de. Desse modo, as enzimas e métodos da invenção são empregados para preparar emulsificadores para fabricantes de cosméticos e precursores e intermediários de esteróides para a produção de farmacêuticos de hormônio. As enzimas e métodos da invenção são empregados para preparar (por exemplo, purificar) análogos de fitosteróis e seus ésteres para uso como agentes de redução de colesterol com benefícios cardiológicos à saúde. As enzimas e métodos da invenção são empregados para purificar os esteróis de planta para reduzir os níveis de colesterol do soro inibindo-se a absorção de colesterol no lúmen intestinal. As enzimas e métodos da invenção são empregados para purificar os esteróis de planta que têm propriedades imu- nomoduladoras em concentrações extremamente baixas, incluindo resposta celular realçada de linfócitos T e capacidade citotóxica de células extermi- nadoras naturais contra uma linhagem de célula de câncer. As enzimas e métodos da invenção são empregados para purificar os esteróis de planta para o tratamento de tuberculose pulmonar, artrite reumatóide, controle dos pacientes infestados por HIV e inibição de força imune, por exemplo, em cor-redores de maratona.
As enzimas e métodos da invenção são empregados para purifi-car os componentes de esterol presentes nas frações de esterol de óleos vegetais de utilidade (por exemplo, óleos de coco, canola, manteiga de ca-cau, milho, caroço de algodão, linhaça, oliva, palma, amendoim, farelo de arroz, açafroa, sésamo, soja, girassol), tal como sitosterol (40,2-92,3%), campesterol (2,6-38,6%), estigmasterol (0-31%) e 5-avenasterol (1,5-29%).
Os métodos da invenção podem incorporar o isolamento de es- teróis derivados de planta em sementes de óleo por extração de solvente com clorofórmio-metanol, hexano, cloreto de metileno ou acetona, seguido por saponificação e purificação cromatográfica para obter os esteróis totais enriquecidos. Alternativamente, as amostras de plantas podem ser extraídas por extração de fluido supercrítico com dióxido de carbono supercrítico para obter extratos de lipídeo totais dos quais os esteróis possam ser enriquecidos e isolados. Para quantificação e caracterização subseqüente dos compostos de esterol, o isolado bruto pode ser purificado e separado por uma ampla variedade de técnicas cromatográficas incluindo cromatografia de coluna (CC), cromatografia de gás, cromatografia em camada fina (TLC), cro- matografia líquida de alto desempenho de fase normal (HPLC), HPLC de fase reversa e eletrocromatografia capilar. De todas as técnicas de separação e isolação cromatográfica, os procedimentos de CC e TLC empregam os mais acessíveis, disponíveis e adequados para limpeza da amostra, purifica-ção, ensaios qualitativos e estimativas preliminares dos esteróis nas amos-tras de teste.
Os fitosteróis são perdidos nas perdas de óleos vegetais como subprodutos durante os processos de refinamento de óleo comestível. As fosfolipases e métodos da invenção usam fitosteróis isolados de tais subpro-dutos para preparar os produtos enriquecidos por fitosterol isolados de tais subprodutos. Os métodos de isolação e purificação de fitosterol da invenção podem incorporar subprodutos da indústria de processamento de óleo e po-dem compreender operações tal como destilação molecular, extração de líquido-líquido e cristalização.
Os métodos da invenção podem incorporar processos para a extração de lipídeos para extrair fitosteróis. Por exemplo, os métodos da in-venção podem usar solventes não polares como hexano (comumente em-pregado para extrair a maioria dos tipos de óleos vegetais) quantitativamente extrair fitosteróis livres de extrato e ésteres de ácido graxo de fitosterila. Os glicosídeos de esterila e glicosídeos de esterila acilados-graxos são somente parcialmente extraídos com hexano, e o aumento da polaridade do solvente determinou o percentual mais elevado de extração. Um procedimento que pode ser empregado é o método de clorofórmio-metanol Bligh and Dyer para extração de todas as classes de lipídeo de esterol, incluindo fosfolipídeos. Um método exemplar para igualmente qualitativamente separar e quantitati-vamente analisar as classes de lipídeo de fitosterol compreende injeção do extrato de lipídeo no sistema de HPLC.
As enzimas e métodos da invenção podem ser empregados para remover os esteróis de gorduras e óleos, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.303.803. Este é um método para reduzir o conteúdo de esterol de óleos e gorduras contendo esterol. É um processo econômico e eficiente com base na afinidade de colesterol e outros esteróis com molécu-lasanfipáticas que formam bicamadas de fluido hidrofóbicas, tal como bica- madas de fosfolipídeo. Os agregados de fosfolipídeo são contatados com, por exemplo, uma gordura ou óleo contendo esterol em um ambiente aquo-so, e em seguida misturados. A estrutura molecular desta mistura de fosfoli- pídeo agregado tem uma afinidade elevada com colesterol e outros esteróis, e pode seletivamente remover tais moléculas das gorduras e óleos. A mistura da separação aquosa é misturada durante um tempo suficiente para sele-tivamente reduzir o conteúdo de esterol do produto de gordura/ óleo através da divisão do esterol na porção de agregados de fosfolipídeos. O óleo ou gordura reduzida por esterol é separado da mistura de separação aquosa. Alternativamente, a fração correspondentemente enriquecida por esterol po- de também ser isolada da mistura de separação aquosa. Essas etapas po-dem ser realizadas em temperaturas ambientes, custos envolvidos no aque-cimentosão minimizados, quando há a possibilidade de degradação térmica do produto. Adicionalmente, uma quantidade mínima de equipamento é re-querida, e uma vez que todos os materiais requeridos são de grau alimentí-cio os métodos não requerem nenhuma precaução especial com respeito ao manuseio, disposição residual ou contaminação do(s) produto(s) finais.
Enzimas e métodos da invenção podem ser empregados para remover esteróis de gorduras e óleos, como descrito, por exemplo, em Pa-tente dos Estados Unidos N° 5.880.300. Os agregados de fosfolipídeo são contatados com, por exemplo, um óleo ou gordura contendo esterol em um ambiente aquoso e em seguida mistutado. Seguindo a mistura adequada, o óleo ou gordura reduzida de esterol é separado da mistura de separação aquosa. Alternativamente, o fosfolipídeo enriquecido com esterol correspon-dentemente da mesma forma pode ser isolado da mistura de separação aquosa. Óleos de planta (por exemplo, vegetais) contêm esteróis de planta (fitosteróis) que da mesma forma podem ser removidos empregando os mé-todos da presente invenção. Este método é aplicável a um produto de gordu- ra/óleo em qualquer estágio de um ciclo de processamento comercial. Por exemplo, o processo da invenção pode ser aplicado aos óleos desodoriza-dos, descolorados e refinados ("óleos de RBD") ou a qualquer estágio de processamento antes da obtenção de RBD. Embora o óleo de RBD possa ter uma densidade alterada comparada ao óleo de pré-RBD, os processos são facilmente adaptados a óleos de RBD ou pré-RBD, ou a vários outros produtos de gordura/óleo, por variação do teor de fosfolipídeo, composição de fosfolipídeo, relações de fosfolipídeo: água, temperatura, pressão, condi-ções de mistura e condições de separação como descritas abaixo.
Alternativamente, as enzimas e métodos da invenção podem ser empregadas para isolar os fitosteróis ou outros esteróis em etapas interme-diárias em processamento de óleo. Por exemplo, é conhecido que os fitoste- róis estão perdidos durante a desodorização de óleos de planta. Uma fração destilada contendo esterol de, por exemplo, um estágio intermediário do pro- cessamento pode ser submetido aos procedimentos de extração de esterol descritos abaixo. Isto fornece uma lecitina enriquecida com esterol ou outro material de fosfolipídeo que pode ser da mesma forma processado a fim de recuperar os esteróis extraídos.
Nutracêuticos
Em um aspecto, as composições e métodos da invenção podem ser empregados para preparar nutracêuticos processando-se ou sintetizan-do-se os lipídeos e óleos empregando as enzimas da invenção, por exemplo, esterases, lipases, fosfolipases ou proteases da invenção. Em um aspecto, os óleos ou lipídeos sintetizados ou processados incluem ácidos gra- xos poli-insaturados (PUFAs), diacilglicerídeos, por exemplo, 1,3-diacil glice- rídeos (DAGs), monoacilglicerídeos, por exemplo, 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs). Em um aspecto, os nutracêuticos é feito processando-se diacilglicerídeos, por exemplo, 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), monoacilglicerídeos, por exemplo, 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e/ou tria- cilglicerídeos (TAGs) de fontes de planta (por exemplo, semente oleaginosa) ou de fontes de animal (por exemplo, óleo de peixe).
Em um aspecto, as composições e métodos da invenção podem ser empregados para fortificar as composições dietéticas, especialmente produtos com base em leite de vaca, por exemplo, fórmulas infantis com ba-se em leite de vaca, com hidrolases ativadas com sal de bílis. As composi-ções feitas pelos métodos e composições da invenção podem ser emprega-dos para alimentar bebês pré-maturos e recém-nascidos, incluindo a admi-nistração de uma hidrolase ativada por sal de bílis da invenção para aumen-tar a digestão de gordura e portanto a taxa de crescimento. Similarmente, a invenção fornece composições e métodos para tratar indivíduos quanto a produção por administração de hidrolase ativada por sal de bílis junto com a ingestão de gorduras; veja da mesma forma a discussão, abaixo.
Em um aspecto, a invenção fornece uma composição dietética compreendendo uma hidrolase da invenção, por exemplo, hidrolase ativada por sal de bílis da invenção. Em uma aspecto, a invenção fornece uma com-posição dietética compreendendo uma base nutricional compreendendo uma gordura e uma quantidade eficaz da hidrolase ativada por sal de bílis da in-venção. Em um aspecto, a invenção fornece uma fórmula infantil com base em leite de vaca compreendendo uma hidrolase da invenção, por exemplo, hidrolase ativada por sal de bílis da invenção. Em um aspecto, a hidrolase da invenção é ativa na digestão de ácidos graxos de cadeia longa, por exemplo, C12 a C22, que preparar uma porcentagem muito alta de muitos leites, por exemplo, 99% de leite de peite humano. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.000.975.
Em um aspecto, a invenção fornece uma composição dietética compreendendo uma gordura de óleo vegetal e uma hidrolase da invenção. A invenção fornece métodos de processar produtos com base em leite e/ou composições compreendendo óleo vegetal para preparar composições dieté-ticas. Em um aspecto, as composições processadas compreendem um óleo de ácido láurico, um óleo de ácido oléico, um óleo de ácido palmítico e/ou um óleo de ácido linoléico. Em um aspecto, um óleo de farelo de arroz, óleo oléico de girassol e/ou óleo de canola podem ser empregados como óleo de ácidos oléicos. Em um aspecto, gorduras e óleos, por exemplo, sementes oleaginosas, de plantas, incluindo, por exemplo, óleos tipo arroz, canola, girassol, azeite de oliva, palma, soja e láurico para uso nos nutracêuticos e composições dietéticas são processados ou feitos empregando uma hidro- lase da invenção. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 4.944.944.
Em um aspecto, as enzimas da invenção são fornecidas em uma forma que é estável para armazenagem na fórmula e/ou no estômago, porém ativas quando a formulação alcança a porção do trato gastrointestinal onde a fórmula normalmente será digerida. As formulações (por exemplo, microcápsulas) para liberação no intestino são bem conhecidas na técnica, por exemplo, polímeros biodegradáveis tal como polilactídeo e poliglicolídeo, como descrito, por exemplo, em Patente dos Estados Unidos Nos. 4.767.628; 4.897.268; 4.925.673; 5.902.617.
Confeitos, manteiga de cacau e alimentos
Em um aspecto, as composições e métodos da invenção podem ser empregados para preparar e processar manteigas duras, tal como ma- neiga de cacau (manteiga e cacau). As composições e métodos da invenção podem ser empregados para preparar alternativos de manteiga de cacau por técnicas sintéticas "estrututadas" empregando as enzimas da invenção, por exemplo, esterases, acrilases, lipases, fosfolipases ou proteases da invenção. Por exemplo, em um aspecto, os métodos da invenção processam ou sintetizam os triacilglicerídeos, diacilglicerídos e/ou monoacilglicerídeos para uso como, por exemplo, alternativos de manteiga de cacau. Em um aspecto, os métodos da invenção geram uma manteiga dura com uma "região plástica" definida para manter a dureza suficiente abaixo ou em temperatura ambiente. Em um aspecto, lipídeo sintetizado ou processado é projetado para ter uma "região plástica"muito estreito, por exemplo, em um aspecto, onde rapidamente funde-se em torno da temperatura do corpo. A manteiga de cacau natural inicia para amaciar em aproximadamente 30oC a 32oC e completamente funde-se em aproximadamente 36oC. A manteiga de cacau natural pode conter 70% em peso ou mais de três gliceróis de 1,3-dissaturado-2- oleíla, que são 1,3-dipalmitoil-2-oleil glicerol (POP), 1-palmitoil-2-oleil glicerol (POSt) e 1,3-diestearoil-2-oleil glicerol (StOSt). Estes três gliceróis mostram um comportamento de fusão similar mutuamente e são responsáveis para fundir as propriedades da manteiga de cacau, exibindo uma região plástica muito estreita. A invenção fornece manteigas de cacau sintéticas ou manteigas de cacau processadas (sintetizadas ou processadas empregando uma hidrolase da invenção, todas as composições possíveis são referidas como alternativos de manteiga de cacau) com porcentagens variantes de 1,3- dipalmitoil-2-oleil glicerol (POP), 1-palmitoil-2-oleil glicerol (POSt) e 1,3- diestearoil-2-oleil glicerol (StOSt), dependendo das propriedades desejadas da manteiga de cacau sintética e manteigas de cacau sintéticas com mais ou manos do que 70% em peso dos três 1,2-dissaturado-2-oleil gliceróis. As manteigas de cacau sintéticas da invenção podem parcialmente ou completamente substituir manteigas de cacau não processadas ou naturais e podem manter ou melhorar as propriedades de manteiga de cacau essenciais.
A invenção fornece manteigas de cacau sintéticas ou manteigas de cacau processadas (sintetizadas ou processadas empregandouma hidro- lase da invenção) com as propriedades desejadas para uso em produtos farmacêuticos, padaria e confeitaria. Em um aspecto, a invenção fornece produtos farmacêuticos, padaria e confeitaria compreendendo uma hidrolase da invenção. Em uma aspecto, os métodos da invenção preparam ou processam um lipídeo (uma gordura) de uma confecção (por exemplo, um chocolate) ou para ser empregado em uma confecção. Em um aspecto, um lipídeoé preparado ou processado tal que o chocolate mostra menos impressão no dedo do que o chocolate feito de manteiga de cacau, enquanto ainda tendo as características de dissolução nítidas na boca. Em um aspecto, um lipídeo é preparado ou processado tal que um confeito (por exemplo, feito em uma temperatura ambiente comparativamente alta, ou, ser feito empregando uma água fresca em uma temperatura fresca em uma temperatura comparativamente alta. Em um aspecto, o lipídio é preparado ou processado tal que uma confeito (por exemplo, chocolate) pode ser armazenado sob condições relativamente mais quentes, por exemplo, condições tropicais ou semi-tropicais ou em construções centralmente aquecidas. Em um aspecto, os lipídios são feitos ou processados tal que um confeito (por exemplo, chocolate) terão um teor de lipídio (gordura) de qualidade e composição consistente. As enzimas da invenção podem ser empregadas para fornecer uma composição substituta para manteiga de cacau que pode significativamente melhorar sua estabilidade térmica e substituí-la em uma ampla faixa de aplicações.
Produção de gordura e margarina
A invenção fornece gorduras processadas ou sintéticas, por exemplo, margarina e gordura sintetizada ou processada empregando uma hidrolase da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece gorduras proces-sadas compreendendo um óleo vegetal, tal como óleo de soja, óleo de milho, óleo de semente de colza, óleo de palma ou óleo tipo láurico sintetizados ou processados empregando uma hidrolase da invenção. As gorduras processadas ou sintéticas, por exemplo, margarina e gordura, são projetados para ter uma "plasticidade" desejada. Muitos dos produtos de gordura plásticos, tal como margarina e gordura, são produzidos de matérias-primas duras e óleos líquidos como materiais crus. Por exemplo, os óleos líquidos tais como óleo de soja, óleo de milho, óleo de palma e óleo de semente de colza, são misturados com seus óleos endurecidos (matérias-primas duras) e a mistura é ajustada para ter uma consistência apropriada (plasticidade). Os produtos de gordura plásticos tais como margarina e gordura desse modo produzidos tendem causar a formação de cristalinos relativamente não refinados porque as gorduras e óleos empregados como os materiais crus são compostos de ácidos graxos tendo quase o mesmo comprimento de ca-deia de carbono. Em outras palavras, eles têm uma composição altamente unificados de ácidos graxos. Por esta razão, a plasticidade destes produtos pode ser mantida em um grau apropriado apenas dentro de uma faixa de temperatura rigorosa, de modo que os óleos líquidos contidos nesse tenham uma tendência a exsudar. Em um aspecto, a invenção fornece métodos de preparar ou processar as gorduras projetadas tal que tenham uma composi-ção variada de ácidos graxos. O óleo resultante, por exemplo, margarina ou gordura, pode ter uma faixa mais ampla de plasticidade.
Em um aspecto, os métodos e composições da invenção são empregados para preparar ou processar óleos vegetais, tais como óleo de soja, óleo de milho, óleo de semente de colza, óleo de palma ou óleos tipo láurico empregando as hidrolases da invenção, incluindo inter-esterificação e trans-esterificação enzimática, veja, por exemplo, Patente dos Estados Uni-dos N° 5.288.619. Os métodos e composições da invenção podem ser em- pregadas no ligar de inter-esterificação alatória como descrito em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N°. 3.949.105. Em um aspecto, os métodos e composições da invenção são empregados em trans-esterifica- ção enzimática para preparar um óleo, por exemplo, um óleo de margarina, tendo igualmente teor de ácido graxo de cadeia intermediária baixo e trans ácido baixo.
Em um aspecto, a estrutura simétrica de um óleo, por exemplo, um óleo tipo láurico ou palma é modificado, por exemplo, em uma estrutura aleatória. Desse modo, os métodos da invenção podem ser empregados para modificar as propriedades de produtos de gordura plásticos. Em um aspecto, a modificação de óleos pelos métodos da invenção pode ser projetada para prevenir ou retardar gradualmente o endurecimento do óleo com o tempo, particularmente quando os produtos estão sendo armazenados.
Em um aspecto, os métodos e composições da invenção em uma mistura de reação de trans-esterificação compreendendo um material de fonte de ácido esteárico e um óleo vegetal líquido comestível, trans- esterificando o material de fonte de ácido esteárico e o óleo vegetal empre-gando uma lipase 1-, 3-posicionalmente específica da invenção e em segui-da hidrogenando a mistura de ácido graxo para fornecer um material de fon-te de ácido esteárico de reciclo para uma reação recíclica com o óleo vegetal. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.288.619.
Em um aspecto, uma reação de trans-esterificação é conduzida com uma lipase da invenção. Em um aspecto, a lipase da invenção tem uma seletividade para as posições 1- e 3- de triglicerídeos para retardar ou inibir um aumento na quantidade de triglicerídeos tri-saturados. Nesta reação da invenção, as deficiências de inter-esterificação aleatórias convencionais e a dificuldade de inter-estrificação com uma lipase não específica pode ser su-peradas porque a inter-esterificação é conduzida por uma enzima da inven-ção tendo uma especificidade das posições 1- e 3- de triglicerídeos. Em um aspecto, a exsudação de óleos líquidos contidos nos produtos é retardada ou prevenida com um aumento de temperatura na reação para inibir uma elevação no ponto de fusão causada por um aumento na quantidade de tri- glicerídeos tri-saturados. Isto chama a atenção para o problema do endure-cimento de produtos durante armazenagem a longo prazo.
Processamento de látex
Os métodos e composições (por exemplo, enzimas da invenção, por exemplo, esterases, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases da in-venção) da invenção podem ser empregados para seletivamente hidrolisar ésteres saturados em ésteres insaturados em ácidos ou álcoois. Em um as-pecto, a invenção fornece a hidrólise seletiva de propionato de etila em acri- lato de etila. Em um aspecto, estes métodos são empregados para remover ésteres indesejados de alimentos de monômero empregados na polimeriza- ção de látex e dos látexes depois da polimerização. Os métodos e composi-ções (hidrolases) da invenção podem ser empregados para tratar látexes para uma variedade de propósitos, por exemplo, para tratar látexes empre-gados em composições fixadoras de cabelo para remover odores desagra-dáveis. Os látexes tratados pelos métodos e composições da invenção in-cluem, por exemplo, polímeros contendo monômeros de ácido insaturado, vinila e acrílico, incluindo monômeros de acrilato de alquila tais como acrilato de metila, acrilato de etila, acrilato de propila e acrilato de butila e ácidos de acrilato tais como ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido crotônico, ácido ita- cônico e misturas destes. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.856.150.
Tratando deficiências de hidrolase
Os métodos e composições (enzima da invenção, por exemplo, esterases, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases da invenção) da in-venção podem ser empregados no tratamento de uma deficiência de hidro- lase em um animal, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um mamífero, tal como um humano. Por exemplo, em um aspecto, os métodos e composi-ções da invenção são empregados para tratar os pacientes sofrendo de uma deficiência de uma lipase pancreática. Em um aspecto, a lipase é adminis-trada oralmente. Uma enzima da invenção pode ser liberada no lugar de ou com uma preparação de enzima de pâncreas de porco.
Em um aspecto, as composições da invenção empregadas para estes tratamentos são ativas sob condições acídicas. Em um aspecto, as composições da invenção são administradas oralmente em formulações (por exemplo, comprimidos) que passam através das regiões de ácido do estômago e descarrega a enzima apenas no ambiente relativamente alcalino do jejuno. Em um aspecto, uma hidrolase da invenção é formulada com um portador tal como lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, derivados de celulose ou gelatina ou qualquer outro excipiente. Um lubrificante tal como estea- rato de magnésio, estearato de cálcio ou cera de polietileno glicol da mesma forma pode ser adicionado. Uma solução de açúcar concentrada, que pode conter aditivos tais como talco, dióxido de titãnio, gelatina ou goma Arábica, pode ser adicionada como um revestimento. Cápsulas duras e macias podem ser empregadas para encapsular uma hidrolase como um líquido ou com uma preparação sólida. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Uni-dos N° 5.691.181 e 5.858.755.
Detergentes
O método e composições (enzimas da invenção, por exemplo, esterases, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases da invenção) da in-venção podem ser empregadas na preparação e uso de detergentes. Uma hidrolase da invenção pode ser adicionada, por exemplo, para ser misturada com, qualquer composição de detergente conhecido, sólido ou líquido, com ou sem mudar a composição da composição de detergente. Por exemplo, uma hidrolase da invenção pode ser adicionada a qualquer sabão, por exemplo, sulfatos tais como sulfatos de alquenila ou alquila de cadeia reta ou ramificada, sulfatos de amida, sulfatos de éter de alquenila ou alquila ten-do um grupo de alquenila ou alquila de cadeia reta ou ramificada ao qual um ou mais de óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno adiciona-dos, sulfonatos alifáticos tais como sulfonatos de alquila, sulfonatos de ami- da, sulfossucinatos de dialquila, sulfonatos de alfa-olefinas, de olefinas tipo vinilideno e de olefinas internas, sulfonatos aromáticos tais como alquilben- zenossulfonatos de cadeia reta ou ramificada, amidas ou carbonatos de éter de alquenila ou alquila tendo um grupo de alquenila ou alquila de cadeia reta ou ramificada ao qual um ou mais dentre óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno adicionados, ou amidas, ésteres ou sais de ácido alfa- sulfo-graxo, tensoativos tipo aminoácido, tensoativos de fosfato tais como fosfatos acídicos de aquenila ou alquila, e fosfatos de alquenila ou alquila, tensoativos anfotéricos tipo ácido sulfônico, tensoativos anfotéricos tipo beta- ína, álcoois ou éteres de alquenila ou alquila tendo um grupo de alquenila ou alquila de cadeia reta ou ramificada ao qual um ou mais dentre óxido de eti- leno, óxido de propileno e óxido de butileno adicionados, éteres de fenila de polioxi-etilenoalquila tendo um grupo de alquila de cadeia reta ou ramificada ao qual um ou mais dentre óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno adicionados, aduzidos de óxido de alquileno ou alcanolamidas de ácido graxo superiores destes, ésteres de ácido graxo de sacarose, monoés- teres de glicerol de ácido graxo, óxidos de alquil- ou alquenil-amina, tensoa- tivos catiônicos tipo sal de tetraalquil-amônio, ou uma combinação destes. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.827.718.
A invenção fornece composições de detergentes compreenden-do um ou mais polipeptídeos (hidrolases) da invenção. Formas tensoativas e/ou não tensoativas podem ser empregadas. Em um aspecto, a quantidade de hidrolase total, tensoativo e/ou não tensoativo, empregada da invenção pode ser de cerca de 0,0001% a cerca de 1,0%, ou de cerca de 0,0002% a cerca de 0,5% em peso, da composição de detergente. Em um aspecto, da composição de detergente, a hidrolase de tensoativo é de cerca de 5% a cerca de 67% e a hidrolase de não tensoativo é de cerca de 33% a cerca de 95% da atividade de hidrolase total na mistura enzimática. Em um aspecto, o pH ideal da mistura enzimática total está entre cerca de 5 a cerca de 10,5.
Em um aspecto, as composições de detergentes da invenção incluem hidrolases alcalinas da invenção que funcionam em valores de pH alcalino, desde que o pH de uma solução de lavagem possa estar em uma faixa de pH alcalino sob condições de lavagem ordinárias. Veja, por exem-plo, Patente dos Estados Unidos N° 5.454.971.
Os polipeptídeos da invenção (enzimas da invenção, por exem-plo, esterases, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases da invenção) po-dem ser empregados em qualquer composição de detergente, que são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.069.810; 6.322.595; 6.313.081. Por exemplo, em um aspecto, uma com-posição de detergente de lavanderia é fornecida. Pode compreender 0,8 ppm a 80 ppm de uma lipase da invenção.
A invenção incorpora todos os métodos de preparar e empregar as composições de detergente, veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nos 6.413.928, 6.399.561, 6.365.561, 6.380.147.
A invenção incorpora todos os métodos de preparar e empregar as composições de detergente, veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos nos 6.413.928, 6.399.561, 6.365.561, 6.380.147. As composições de detergente podem ser uma composição aquosa de uma e duas partes, uma composição líquida não aquosa, um sólido de fusão, uma forma granular, uma forma particulada, um comprimido prensado, um gel e/ou uma pasta e uma forma de suspensão. As hidrolases da invenção podem da mesma for-ma ser empregadas como um produto aditivo de detergente em uma forma sólida ou uma líquida. Tais produtos aditivos são destinados a suplementar ou elevar o desempenho de composições de detergente convencionais e podem ser adicionadas em qualquer estágio do processo de limpeza.
A invenção da mesma forma fornece métodos capazes de remo-ver sujeiras de alimento grossas, películas de resíduo de alimento e outras composições de alimento menores empregando estas composições de de-tergente. As hidrolases da invenção podem facilitar a remoção de manchas por meio de hidrólise catalítica de proteínas. As hidrolases da invenção po-dem ser empregadas em detergentes de lavagem de louça em detergentes de lavagem de tecido.
O conteúdo da enzima ativa atual depende do método de fabri-cação de uma composição de detergente e não é crítico, assumindo que a solução de detergente tem a atividade enzimática desejada. Em um aspecto, a quantidade de hidrolases presente na solução final varia de cerca de 0,001 mg a 0,5 mg por grama da composição detergente. A enzima particular es-colhida para uso no processo e produtos desta invenção depende das con-dições de utilidade final, incluindo a forma de produto físico, pH de uso, tem- peratura de uso, e tipos de sujeira a ser degradada ou alterada. A enzima pode ser escolhida para fornecer atividade e estabilidade ideais para qual-quer grupo dado de condições de utilidade. Em um aspecto, as hidrolases da presente invenção são ativas nas faixas de pH de cerca de 4 a cerca de 12 e na faixa de temperatura de cerca de 20°C a cerca de 95°C. Os detergentes da invenção podem compreender tensoativos catiônicos, não iônicos semi- polares ou híbridos; ou misturas destes.
Enzimas da invenção podem ser formuladas em detergentes em pó e líquidos tendo pH entre 4,0 e 12,0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (preferivelmente 0,1% a 0,5%) em peso. Estas composições detergentes podem também incluir outras enzimas tais como proteases, celula- ses, lipases ou endoglicosidases, endo-beta.0-1,4-glicanases, beta-glican- ses, endo-beta-1,3(4)-glicanases, cutinases, peroxidases, lacases, amilases, glicoamilases, pectinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, arabinanases, hemicelulases, mananases, xiloglicanses, xilana- ses, pectin acetil esterases, ramnogalacturonan acetil esterases, poligalactu- ronases, ramnogalacturonases, galactanases, pectin liases, pectin metileste- rases, celobioidrolases e/ou transglutaminases. Estas composições de detergente podem também incluir reforçadores e estabilizantes.
A adição de hidrolases da invenção à composições de limpeza convencionais não cria qualquer limitação de uso especial. Em outras pala-vras, qualquer temperatura e pH adequado para o detergente é também adequado para as composições da invenção contanto que a enzima seja ativa em ou tolerante do pH e/ou temperatura do uso pretendido. Além disso, as proteases da invenção podem ser empregadas em uma composição de limpeza sem detergentes, novamente ou sozinhas ou em combinação com reforçadores e estabilizantes.
A presente invenção fornece composições de limpeza incluindo composições detergente para a limpeza de superfícies duras, composições detergente para limpar tecidos, composições de lavagem de pratos, compo-sições de limpeza oral, composições de limpeza de dentadura, e soluções de limpeza de lente de contato.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para lavar um objeto compreendendo contatar o objeto com um polipeptídeo da invenção sob condições suficientes para a lavagem. Uma hidrolase da invenção pode ser incluída como um aditivo detergente. A composição detergente da inven-ção pode, por exemplo, ser formulada como uma composição detergente de lavanderia a mão ou à máquina compreendendo um polipeptídeo da inven-ção. Um aditivo de lavanderia adequado para o pré-tratamento de tecidos manchados pode compreender um polipeptídeo da invenção. Uma composi-ção amaciante de tecido pode compreender uma hidrolase da invenção. Al-ternativamente, uma hidrolase da invenção pode ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfície dura doméstica geral. Em aspectos alternativos, aditivos detergente e com-posições detergente da invenção podem compreender um ou mais outras enzimas tais como uma protease, uma lipase, uma cutinase, outra protease, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabi- nase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lac-tase e/ou um peroxidase (veja também acima). As propriedades da(s) enzi- ma(s) da invenção são escolhidas para serem compatíveis com o detergente selecionado (isto é, pH-ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzi- máticos e não enzimáticos, etc.) e a(s) enzima(s) está(ão) presente(s) em quantidades eficazes. Em um aspecto, enzimas da invenção são emprega-das para remover materiais malcheirosos de tecidos. Várias composições detergente e métodos para prepará-las que podem ser empregados na práti-ca da invenção são descritos, por exemplo, nas As Patentes dos Estados Unidos nos 6.333.301, 6.329.333, 6.326.341, 6.297.038, 6.309.871, 6.204.232, 6.197.070, 5.856.164.
Quando formuladas como composições adequadas para uso em um método de lavagem em máquina de lavanderia, as hidrolases da inven-ção podem compreender tanto um tensoativo quanto um composto reforça- dor. Elas podem adicionalmente compreender um ou mais componentes de-tergente, por exemplo, compostos poliméricos orgânicos, agentes de bran-queamento, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersantes, dis- persantes de sabão de cal, suspensão para sujeira e agentes anti-redeposi- ção e inibidores de corrosão. As composições de lavanderia da invenção po-demtambém conter agentes amaciantes, como componentes detergentes adicionais. As composições contendo hidrolases da invenção podem prover limpeza de tecido, remoção de mancha, manutenção de brancura, amacia- mento, aparência da cor, inibição de transferência de tinta e sanitização quando formuladas como composições detergentes de lavanderia.
A densidade das composições detergente de lavanderia da in-venção pode variar de cerca de 200 a 1500 g/litro, ou cerca de 400 a 1200 g/litro, ou cerca de 500 a 950 g/litro, ou 600 a 800 g/litro, de composição; isto pode ser avaliado em torno de 20°C.
A forma "compacta" de composições detergentes de lavanderia da invenção é melhor refletida por densidade e, em termos de composição, pela quantidade de sal de carga inorgânico. Os sais de carga inorgânicos são ingredientes convencionais de composições detergente em forma de pó. Em composições detergente convencionais, os sais de carga estão presente em quantidades substanciais, tipicamente 17% a 35% em peso da composi-ção total. Em um aspecto das composições compactas, o sal de carga está presente em quantidades não excedendo a 15% da composição total, ou, não excedendo a 10%, ou, não excedendo a 5% em peso da composição. Os sais de carga inorgânicos podem ser selecionados dos sais de metal de álcali e alcalino terrosos de sulfatos e cloretos, por exemplo, sulfato de sódio.
As composições detergente líquidas da invenção podem também estar em uma "forma concentrada". Em um aspecto, s composições detergente líquidas podem conter uma quantidade menor de água, compa-rado aos detergentes líquidos convencionais. Em aspectos alternativos, o conteúdo de água do detergente líquido concentrado é menor do que 40%, ou, menos do que 30%, ou, menos do que 20% em peso da composição de-tergente. Os compostos detergente da invenção podem compreender formu-lações como descrito na WO 97/01629.
As hidrolases da invenção podem ser úteis na formulação de vá- rias composições de limpeza. Diversos compostos conhecidos são tensoati- vos adequados incluindo detergentes não iônicos, aniônicos, catiônicos, ou híbridos, podem ser empregados, por exemplo, como descrito nas As Patentes dos Estados Unidos nos 4.404.128, 4.261.868, 5.204.015. Além disso, as enzimas da invenção podem ser empregadas, por exemplo, em aplicações de sabão em barra ou líquido, formulações de cuidados com louças, soluções ou produtos de limpeza de lente de contato, hidrólise de peptídeo, tratamento de lixo, aplicações têxteis, como enzimas de clivagem-fusão em produção de proteína, e similares. As hidrolases da invenção podem fornecer desempenho realçado em uma composição detergente quando comparadoà outra protease detergente, isto é, o grupo de enzima pode aumentar a limpeza de certas manchas sensíveis à enzima tais como grama ou sangue, como determinado por avaliação usual após um ciclo de lavagem padrão. As hidrolases da invenção podem ser formuladas em detergentes líquidos e em pó conhecidos tendo pH entre 6,5 e 12,0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (por exemplo, cerca de 0,1% a 0,5%) em peso. Estas composições de limpeza detergente podem também incluir outras enzimas tais como outras conhecidas esterases, fosfolipases, proteases, amilases, celulases, lipases ou endoglicosidases, bem como reforçadores e estabilizantes.
Processos para revestimento e acabamento de tecidos.
Os métodos e composições (enzimas da invenção, por exemplo, esterases, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases da invenção) da in-venção podem ser empregados em processos para revestir e acabar tecidos, fibras ou fios. Em um aspecto, polímeros celulósicos insolúveis são reagidos com ácidos carboxílicos ou ésteres destes na presença de uma hidro- lase da invenção. O polímero celulósico pode ser algodão, viscose, raiom, lyocell, linho, pano de linho, rami, e todas as misturas destes; e misturas destes com poliésteres, lã, poliamidas, acrílicos e poliacrílicos. Em aspectos alternativos, os métodos e composições (hidrolases) da invenção podem ser empregados em um processo de acabamento amaciante, isto é, melhoramento do talhe e caimento do tecidofinal, para tingir um material polimérico, para obter retardância de chama, para obter repelência de água, para obter brilho, por exemplo, brilho ótico, de um material polimérico, e para obter aca-bamento de resina ("prensa permanente"). Em um aspecto, os métodos e composições (hidrolases) da invenção podem ser empregados para obter a retardância de chama em um tecido empregando-se, por exemplo, um ácido carboxílico substituído por halogênio ou um éster deste, isto é, um ácido carboxílico fluorado, clorado ou bromado ou um éster destes. Em um aspec-to, os processos são realizados sob as condições (por exemplo, temperatura, pH, solvente) que favorecem o processo de esterificação sobre a cliva-gemhidrolítica de uma mistura de éster. Em um aspecto, o processo de es- terificação é realizado empregando-se água como um solvente, ou, o pro-cesso pode ser realizado sem um solvente, ou, a reação pode ocorrer em uma microemulsão formada adicionando-se um ácido carboxílico ou um és-ter deste a uma mistura de água e um tensoativo adequado. Veja, por exem-plo, a Patente dos Estados Unidos n° 5.733.750.
Em um aspecto, uma hidrolase da invenção é absorvida ou ad- sorvida ou de outro modo imobilizada sobre uma superfície, tal como um tecido, fibra ou fio. Em um aspecto, um complexo de tecido-hidrolase é for-mado, por exemplo, por remoção de lipídeo, por exemplo, remoção de man-cha de alimento ou óleo. A hidrolase pode ser sorvidas sobre o tecido, fibra ou fio antes ou após o manchamento. A hidrolase ativa pode hidrolisar a mancha sobre o tecido seco, fibra ou fio, ou tecido, fibra ou fio em soluções de lavanderia. Em um aspecto, umas hidrolase da invenção tem estabilidade realçada em desnaturação por tensoativos e em desativação por aquecimen-to. De certo modo, a hidrolase pode ser resistente à remoção do tecido, fibra ou fio durante a lavanderia, pode reter atividade substancial após a secagem em uma temperatura elevada, e pode reter atividade durante a armazenagem ou uso do tecido. A redeposição de sub-produtos de alimento, óleo e hidrólise de óleo durante a lavanderia de tecido também pode ser retardada por uma hidrolase da invenção. Os sub-produtos de hidrólise de óleo podem ser removidos durante a lavanderia do tecido, por exemplo, em um pH básico ou na presença de um tensoativo. Em um aspecto, uma hidrolase da in-venção é absorvida ou adsorvidas ou de outro modo imobilizada sobre um gel, vidro, plástico ou sólido de metal bem como um tecido, fibra ou fio.
Em aspectos alternativos, as hidrolases da invenção são úteis para tratar uma ampla variedade de tecidos naturais, sintéticos ou metálicos, incluindo têxteis ou tecidos trançados ou não trançados, incluindo náilon, polialgodão, poliéster, poliéster trançado, poliéster de malha dupla, ceda, vinila, flanela de algodão, veludo de raiom, feltro acrílico, mistura de lã (poli- éster/lã), mistura sintética (poliéster/poliuretano), látexes. Outras superfícies que podem ser tratadas com uma hidrolase da invenção incluem cozinha ou aparelhos e utensílios de cozimento, por exemplo, materiais limpadores de pote tais como esponja de celulose, náilon e esfregões de aço inoxidável e tecidos de cobre, lavadoras de louça, aparelhos de armazenagem de alimen-to, por exemplo, refrigeradores, congeladores, e similares.
As superfícies que foram tratadas de acordo com a invenção podem ainda ser manchadas por (ou transportando) óleo antes de um com-plexo enzima-tecido ser formado ou o complexo pode ser formado antes de tal exposição. Exemplos de modalidades úteis para as primeiras aplicações incluem composições em gel ou líquidas de pré-lavagem que podem ser va-porizadas ou aplicadas diretamente à áreas específicas de manchas oleo-sas. As peças de rompa ou tecidos de linho podem então ser armazenados em um cesto com tampa de lavanderia, por exemplo, e lavados no curso normal de uma rotina doméstica por que a degradação da mancha oleosa em sub-produtos de hidrólise ocorrerá durante a armazenagem. Alternativa-mente, o tecido pode ser pré-tratado antes do uso para transmitir proprieda-des de remoção de mancha de óleo melhoradas. Em um aspecto, uma hi- drolase é imobilizada sobre superfícies para facilitar a remoção de óleo das superfícies e para alterar a umectabilidade das superfícies. Em um aspecto, uma hidrolase é adsorvida sobre um tecido antes ou após uma mancha de óleo, e a hidrólise é ativa para hidrolisar uma mancha de óleo sobre tecido seco ou tecido em soluções de lavanderia. Em um aspecto, a hidrolase sor-vidas tem estabilidade realçada em desnaturação por tensoativos e em de-sativação por aquecimento, é resistente à remoção de tecido durante a la-vanderia,retém atividade substancial após secar o tecido em uma tempera- tura elevada, e/ou retém atividade durante a armazenagem ou uso do tecido. Em um aspecto, a redeposição de óleo e sub-produtos de hidrólise de óleo durante lavanderia de tecido é retardada pela hidrolase. Em um aspecto, os sub-produtos de hidrólise de óleo são removíveis durante a lavanderia de tecido em um pH básico ou na presença de um tensoativo. Veja, por exem-plo, a Patente dos Estados Unidos n° 6.265.191.
Tramento de fibras e têxteis
A invenção fornece métodos de tratar fibras e tecidos empre-gando-se uma ou mais hidrolases da invenção. As hidrolases podem ser empregadas em qualquer método de tratamento de fibra ou tecido, que é conhecido na técnica, veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 6.261.828, 6.077.316, 6.024.766, 6.021.536, 6.017.751, 5.980.581; Publica-ção de Patente dos Estados Unidos n° 20020142438 A1. Por exemplo, as hidrolases da invenção podem ser empregadas em desengomadura de fibra e/ou tecido. Em um aspecto, a sensação e aparência de um tecido são me-lhoradas por um método compreendendo contatar o tecido com uma hidro- lase da invenção em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão. Por exemplo, as hidrolases da invenção podem ser empregadas na remoção de manchas.
Em um aspecto, as hidrolases da invenção são aplicadas duran-te ou após a tecedura de têxteis, ou durante o estágio de desengomadura, ou uma ou mis etapas de processamento de tecido adicionais. Durante a tecedura de têxteis, os fios são expostos tensão mecânica considerável. An-tes da tecedura em tecelagens mecânicas, fios de urdidura são freqüente- mente revestidos com amido de engomaduras ou derivados de amido a fim de aumentar sua resistência à tração e prevenir rompimento. As hidrolases da invenção podem ser aplicadas para remover este amido ou derivados de amido de engomadura. Após os têxteis serem trançados, um tecido pode prosseguir para um estágio de desengomadura. Isto pode ser seguido por uma ou mais etapas de processamento de tecido adicionais. A desengoma- dura é a ação de remoção de "goma" de têxteis. Após a tecedura, a goma o revestimento deve ser removido antes de outro processamento do tecido a fim de assegurar um resultado homogêneo e à prova de lavagem. A inven-ção fornece um método de desengomadura compreendendo tratamento en- zimático da "goma" pela ação de hidrolases da invenção.
As enzimas da invenção podem ser empregadas para desengo- mar tecidos, incluindo tecidos contendo algodão, como aditivos de detergen-te, por exemplo, em composições aquosas. A invenção fornece métodos para produzir uma aparência de pedra lavada sobre o tecido de zuarte ou peças de roupa tingidos de índigo. Para a fabricação de panos, o tecido pode ser cortado e costurado em panos ou peças de roupa. Estes podem ser acabados antes ou após o tratamento. Em particular, para a fabricação de jeans de zuarte, diferentes métodos de acabamento enzimático foram de-senvolvidos. O acabamento de peças de roupa de zuarte normalmente é ini-ciado com uma etapa de desengomadura enzimática, durante a qual as pe-ças de roupa são submetidas à ação de enzimas amilolíticas a fim de forne-cer maciez o tecido e tornar o algodão mais acessível às etapas subseqüen- tes de acabamento enzimático. A invenção fornece métodos de acabamento de peças de roupa de zuarte (por exemplo, um "processamento de bio-reti- ficação à pedra"), desengomadura enzimática e fornecendo maciez a tecidos empregando-se as hidrolases da invenção. A invenção fornece métodos pa-ra rapidamente amaciar as peças de roupa de zuarte em um processo de desengomadura e/ou acabamento.
Outras enzimas podem ser também empregadas nestes proces-sos de desengomadura. Por exemplo, uma hidrolase e amilase alcalina e termoestável podem ser combinadas em um único banho para desengoma- dura e biodesengorduramento. Entre as vantagens de combinar desengo- madura e desengorduramento em uma etapa estão a redução de custo e menor impacto ambiental devido às economias em energia e emprego de água e menor produção de lixo. As condições de aplicação exemplares para desengomadura e biodesengorduramento são aproximadamente pH 8,5 a 10,0 e as temperaturas de cerca de 40°C e superiores. Empregando-se uma hidrolase da invenção, baixas dosagens de enzima, por exemplo, cerca de 100 gramas (g) por uma tonelada de algodão, e tempos de reação curtos, por exemplo, cerca de 15 minutos, podem ser empregados para obter efici-ente desengomadura e desengorduramento sem a adição de cálcio.
Em um aspecto, uma hidrolase e amilase alcalina e termoestável são combinadas em um único banho de desengomadura e biodesengordu- ramento. Entre as vantagens de combinar a desengomadura e desengordu- ramento em um etapa estão a redução de custo e menor impacto ambiental devido às economias em energia e emprego de água e menor produção de lixo. As condições de aplicação para desengomadura e biodesengordura- mento podem estar entre aproximadamente pH 8,5 a pH 10,0 e as tempera-turas de aproximadamente 40°C e superiores. Baixas dosagens de enzima (por exemplo, cerca de 100 g por uma tonelada de algodão) e curtos tempos de reação (por exemplo 15 minutos) podem ser empregados para obter efi-ciente desengomadura e desengorduramento sem a adição de cálcio.
As hidrolases da invenção podem ser empregadas em combina-ção com outras enzimas de degradação de carboidrato, por exemplo, celu- lase, arabinanase, xiloglicanase, pectinase, e similares, para a preparação de fibras ou para a limpeza de fibras. Estas podem ser empregadas em combinação com detergentes. Em um aspecto, as hidrolases da invenção podem ser empregadas em tratamentos para prevenir o acinzentamento de um têxtil.
As hidrolases da invenção podem ser empregadas para tratar qualquer material celulósico, incluindo fibras (por exemplo, fibras de algodão, cânhamo, linho ou pano de linho), tecidos costurados ou descosturados, por exemplo, tricotados, trançados, fios, e pano para toalha, feitos de algodão, misturas algodão ou celulósicos naturais ou feitos a mão (por exemplo originados de fibras de celulose contendo xilana tal como polpa de madeira) ou misturas destes. Exemplos de misturas são misturas de algodão ou raiom/- viscose com um ou mais material de companhia tal como lã, fibras xintéticas (por exemplo fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de álcool de polivinila, fibras de cloreto de polivinila, fibras de cloreto de poli- vinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliuréia, fibras de aramid), e fibras contendo celulose (por exemplo, raiom/viscose, rami, cânhamo, linho/pano de linho, juta, fibras de acetato de celulose, lyocell).
Os processos de tratamento de têxtil da invenção (empregando- se hidrolases da invenção) podem ser empregados em conjunto com outros tratamentos têxteis, por exemplo, desengorduramento e branqueamento. O desengorduramento é a remoção de material não celulósico da fibra de al-godão, por exemplo, a cutícula (principalmente consistindo de ceras) e pri-mariamente parede celular (principalmente consistindo em pectina, proteína e xilogicano). Uma remoção de cera apropriada é necessária para obtenção de uma elevada umectabilidade. Isto é necessário para tingimento. A remo-ção das paredes celulares primárias pelos processos da invenção melhora a remoção de cera e assegura um tingimento mais uniforme. O tratamento dos têxteis com os processos da invenção podem melhorar a brancura no pro-cesso de branqueamento. A principal química empregada em desengordu- ramento é o sódio, hidróxido em concentrações elevadas e em temperaturas elevadas. O branqueamento compreende oxidar o têxtil. O branqueamento tipicamente envolve o uso de peróxido de hidrogênio como o agente de oxi-daçãoa fim de obter ou um tecido totalmente branqueado (branco) ou para assegurar uma tonalidade clara da tinta.
A invenção também fornece hidrolases alcalinas (hidrolases ati-vas sob condições alcalinas). Estas têm aplicações amplamente variáveis em processamento de têxtil, desengomadura de fibras de planta (por exemplo, fibras de floema de planta), tratamento de águas servidas pécticas, fa-bricação de papel, e fermentações de café e chá. Veja, por exemplo, Hoon- dal (2002) Applied Microbiology and Biotechnology 59: 409-418.
Tratamento de alimentos e processamento de alimento.
As hidrolases da invenção têm numerosas aplicações em indús-tria de processamento de alimento. Por exemplo, em um aspecto, as hidro- lases da invenção são empregadas para melhorar a extração de óleo de ma-terial de planta rico em óleo, por exemplo, sementes rica em óleo, por exem-plo, óleo de soja de sojas, azeite de azeitonas, óleo de semente de colza de sementes de colza, e/ou óleo de girassol de sementes de girassol ou óleo de farelo de arroz.
As hidrolases da invenção podem ser empregadas para a sepa-ração de componentes de materiais de célula de planta. Por exemplo, as hidrolases da invenção podem ser empregadas na separação de material rico em proteína (por exemplo, células de planta) em componentes, por exemplo, sacarose de beterraba açucareira ou amido ou açúcares de batata, frações de polpa ou casca. Em um aspecto, as hidrolases da invenção po-dem ser empregadas para separar colheitas ricas em proteína ou ricas em óleo separadas em proteína valiosa e frações de óleo e casca. O processo de separação pode ser realizado pelo uso de métodos conhecidos na técnica.
As hidrolases da invenção podem ser empregadas na prepara-ção de sucos, xaropes, extratos e similares de fruta ou vegetais para aumen-tar o rendimento. As hidrolases da invenção podem ser empregadas no tra-tamentoenzimático (por exemplo, hidrólise de proteínas) de vários materiais derivados de parede de célula de planta ou materiais de lixo, por exemplo, de produção de vinho ou suco, ou resíduos agrícolas tais como cascas de vegetal, cascas de vagem, polpa de beterraba açucareira, polpa de azeitona, polpa de batata, e similares. As hidrolases da invenção podem ser emprega-das para modificar a consistência e aparência de frutas ou vegetais proces-sados. As hidrolases da invenção podem ser empregadas para tratar material de planta para facilitar o processamento de material de planta, incluindo alimentos, facilitar a purificação ou extração de componentes de planta. As hidrolases da invenção podem ser empregadas para melhorar o valor da alimentação, diminuir a capacidade de ligação de água, melhorar a degrada- bilidade em plantas de água de excreção e/ou melhorar a conversão de ma-terial de planta em ensilagem, e similares.
Alimentações e alimento ou aditivos de alimentação animais.
A invenção fornece métodos para tratar alimentações e alimen-tos animais e alimento ou aditivos alimentícios empregando-se hidrolases da invenção, animais incluindo mamíferos (por exemplo, humanos), pássaros, peixe e similares. A invenção fornece alimentações, alimentos e aditivos animais compreendendo hidrolases da invenção. Em um aspecto, alimenta- ções, alimentos e aditivos animais de tratamento empregando-se hidrolases da invenção podem ajudar na disponibilidade de nutrientes, por exemplo, amido, na alimentação ou aditivo animal. Por rompimento difícil para digerir proteínas ou indiretamente ou diretamente revelando amido (ou outros nutri-entes), a hidrolase torna os nutrientes mais acessíveis a outras enzimas en-dógenasou exógenas. A hidrolase pode também simplesmente causar a liberação de nutrientes e açúcares facilmente digeríveis e facilmente absor-vidos.
As hidrolases da presente invenção, na modificação de alimen-tação ou um alimento animal, pode processar o alimento ou alimentação in vitro (modificando componentes da alimentação ou alimento) ou in vivo. As hidrolases podem ser adicionadas às composições de alimentação e alimen-to contendo quantidades de arabinogalactans ou galactans, por exemplo alimentação ou alimento contendo material de planta de soja, semente de colza, tremoços e outros. Quando adicionada à alimentação ou alimento a hidrolase significantemente melhora o rompimento in vivo de material de pa-rede de célula de planta, desse modo uma melhor utilização dos nutrientes da planta pelo animal (por exemplo, humano) é obtida. Em um aspecto, a ta-xa de crescimento e/ou relação de conversão de alimentação (isto é, o peso da alimentação ingerida com relação ao ganho de peso) do animal é melho-rada. Por exemplo, uma proteína compreendendo galactan parcialmente di-gerível ou indigerível é totalmente ou parcialmente degradada por uma hidro- lase da invenção, por exemplo, em combinação com outra enzima, por exemplo, beta-galactosidase, em peptídeos e oligômeros de galacto e/ou ga-lactose. Estes produtos de digestão de enzima são mais digeríveis pelo ani-mal. Desse modo, as hidrolases da invenção podem contribuir para a ener-gia disponível da alimentação ou alimento. Além disso, contribuindo para a degradação de proteínas compreendendo galactan, uma hidrolase da inven-ção pode melhorar a digestibilidade e captação de componentes de comida ou alimento de carboidrato e não-carboidrato tais como proteína, gordura e minerais.
Em outro aspecto, a hidrolase da invenção pode ser fornecida através de expressão das enzimas diretamente em safras de alimento trans- gênico (como, por exemplo, plantas transgênicas, sementes e outros mais), tais como milho, feijão de soja, semente de colza, tremoço e outros mais. Como discutido acima, a invenção fornece plantas transgênicas, partes de planta e células de planta que compreendem uma seqüência de ácido nu- cléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Em um aspecto, o ácido nucléico é expressado tal que a hidrolase da invenção é produzido em quantidadesrecuperáveis. A hidrolase pode ser recuperada de qualquer planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta que contém o polipeptídeo recombinante pode ser empregada como tal para melhorar a qualidade de uma comida ou alimento, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou destruir um fator de anti- nutritivo.
Tratamento de polpa ou papel
As hidrolases da invenção podem estar em tratamento de polpa ou papel ou destinturação de papel. Por exemplo, em um aspecto, a inven-ção fornece um processo de tratamento de papel que emprega hidrolases da invenção. Em outro aspecto, componentes de papel de papel fotocopiado reciclado durante processos de destinturação enzimáticos e químicos. Em um aspecto, hidrolases da invenção podem ser empregadas em combinação com celulases, pectato liases ou outras enzimas. O papel pode ser tratado pelos três processos seguintes: 1) desintegração na presença de hidrolases da invenção, 2) desintegração com uma destinturação química e hidrolases da invenção, e/ou 3) desintegração após embeber com hidrolases da inven-ção. O papel reciclado tratado com hidrolases pode ter um brilho mais ele-vado devido à remoção de partículas de toner como comparado ao papel tratado com apenas celulase. Enquanto a invenção não é limitada por qual-quer mecanismo particular, o efeito de hidrolases da invenção pode ser de-vido a seu comportamento como agentes tensoativos em suspensão de pol-pa.
A invenção fornece métodos de tratamento de papel e polpa de papel que empregam uma ou mais hidrolases da invenção. As hidrolases da invenção podem ser empregadas em qualquer método de tratamento de pa-pel ou polpa, que são bem conhecidas na técnica, ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 6.241.849; 6.066.233; 5.582.681. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um método para destinturação e descolo- ramento de um papel impresso contendo uma tintura, compreendendo amassar um papel impresso para obter uma suspensão de polpa, e desalojar de uma tinta da suspensão de polpa na presença de hidrolases da invenção (outras enzimas também podem ser adicionadas). Em outro aspecto, a invenção fornece um método para acentuar a liberdade de polpa, por exem-plo, polpa feita a partir de fibra secundária, por adição de uma mistura enzi- mática que compreende hidrolases da invenção (também pode incluir outras enzimas, por exemplo, enzimas pectato liase, celulase, amilase ou glucoami- lase) à polpa e tratamento sob condições para causar uma reação para pro-duzir uma polpa enzimaticamente tratada. A liberdade da polpa enzimatica- mente tratada é aumentada da liberdade inicial da polpa de fibra secundária sem uma perda em brilho.
Tratamento de resíduo
As hidrolases da invenção podem ser empregadas em uma vari-edade de outras aplicações industriais, por exemplo, em tratamento de resí-duo. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um processo de di-gestão de resíduo sólido que emprega hidrolases da invenção. Os métodos podem compreender redução da massa e volume de resíduo sólido substan-cialmente não tratado. Resíduo sólido pode ser tratado com um processo digestivo enzimático na presença de uma solução enzimática (incluindo hi- drolases da invenção) a uma temperatura controlada. Isto resulta em uma reação sem fermentação bacteriana apreciável de microorganismos adicio-nados. O resíduo sólido é convertido em um resíduo liquefeito e qualquer resíduo sólido restante. O resíduo liquefeito resultante pode ser separado de qualquer resíduo solidificado restante referido. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.709.796.
Além disso, as hidrolases (por exemplo, proteases) da invenção podem ser empregadas na indústria de restituição animal para, por exemplo, livrar-se de plumagem, por exemplo, como descrito por Yamamura (2002) Biochem. Biophys. Res. Com. 294 : 1138 - 1143. Proteases alcalinas da invenção também podem ser empregadas na produção de forragem protei- nácea de plumagem residual ou materiais contendo queratina, por exemplo, como descrito por Gupta (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:15-32.
Óleos hidráulicos e lubrificantes
Os métodos e composições (enzimas da invenção, por exemplo, esterases, acilases, lipases, fosfolipases ou hidrolases da invenção) da in-venção podem ser empregados para preparar lubrificantes, tais como óleos hidráulicos. Deste modo, a invenção também fornece lubrificantes e óleos hidráulicos que compreendem uma hidrolase da invenção. O propósito de um lubrificante da invenção é minimizar a fricção e desgaste de metais. Lu-brificantes podem também compreender aditivos e fluidos básicos que me-lhoram as propriedades lubricativas. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.747.434.
Interesterificação
Em um aspecto, os métodos e composições da presente inven-ção podem ser empregados para modificar as propriedades de misturas de triglicerídeo, e, em um aspecto, a sua consistência. Em um aspecto, uma enzima da invenção pode ser empregada na presença de um catalisador tal como metal de sódio ou metóxido de sódio para promover migração de acila entre moléculas de glicerídeo tal que os produtos consistem em misturas de glicerídeo nas quais os resíduos de acila graxos são distribuídos aleatoria-mente entre as moléculas de glicerídeo.
Em um aspecto, as enzimas da invenção podem ser empregadas para produzir produtos de interesterificação na reação onde hidrólise de gordura é minimizada de forma que interesterificação catalisada por lipase torna-se a reação dominante. Estas condições podem incluir, por exemplo, restrição da quantidade de água no sistema.
Em um aspecto, enzimas da invenção podem ser empregadas para catalisar a reação de interesterificação que emprega misturas de trigli- cerídeos e ácidos graxos livres, como descrito, por exemplo, em EP 0 093 602 B2. Nestes casos, ácido graxo livre pode ser permutado com os grupos de acila dos triglicerídeos para produzir novos triglicerídeos enriquecidos no ácido graxo adicionado. Em um aspecto, lipases 1,3-específicas da invenção podem ser empregadas para confinar a reação nas posições 1 e 3 dos glice- rídeos, que permitem obter uma mistura de triglicerídeos não obteníveis por interesterificação química ou reação com uma lipase não-específica. Em um aspecto, lipases não-específicas são empregadas para atingir resultados similares à interesterificação química.
A capacidade de produzir novas misturas de triglicerídeo empre-gando lipases posicionalmente específicas da invenção é útil para a indústria de óleos e gorduras porque algumas destas misturas têm valiosas propriedades. Por exemplo, interesterificação catalisada por lipase 1,3-específica de 1,3-dipalmitoil-2-monoleína (POP), que é o triglicerídeo principal da fração média de óleo de palma, com ácido esteárico ou tristearina produz produtos enriquecidos no 1-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína valiosa (POSt) e 1,3-distearoil-2-monoleína (StOSt). POSt e StOSt são os componentes importantes de manteiga de cacau. Deste modo, um aspecto da invenção fornece uma reação de interesterificação para produzir equivalentes de manteiga de cacau a partir de materiais de partida baratos.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de produção de um substituto de gordura pesada que emprega as lipases 1,3-específicas da invenção. Em um aspecto, um substituto de gordura pesada compreende uma mistura de fração média de palma e StOSt, POSt ou StOSt/POSt de pelo menos 85% de pureza.
Produtos de cuidado oral
A invenção fornece produto de cuidado oral que compreende hidrolases da invenção. Produtos de cuidado oral exemplares incluem pas-tas de dentes, cremes dentais, géis ou pós de dente, odônticos, loções de boca, formulações de lavagem pré- ou pós-escovação, gomas de mascar, pastilhas, ou doce. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n°6.264.925.
Mistura e fermentação
A invenção fornece métodos de mistura (por exemplo, fermenta-ção) de cerveja que compreende hidrolases da invenção. Em um processo exemplar, matérias-primas contendo amido são desintegradas e processadas para formar um malte. Uma hidrolase da invenção é empregada em qualquer ponto no processo de fermentação. Por exemplo, hidrolases (por exemplo, proteases) da invenção podem ser empregadas no processo de malte de cevada. A matéria-prima principal de mistura de cerveja é malte de cevada. Isso pode ser um processo de três estágios. Primeiro, o grão de cevada pode ser empapado para aumentar o conteúdo de água, por exemplo, por volta de cerca de 40%. Em segundo lugar, o grão pode ser germinado através de incubação a 15 a 25°C durante 3 a 6 dias quando síntese de enzima é estimulada sob o controle de giberelinas. Em um aspecto, hidrolases da invenção são adicionadas neste (ou qualquer outro) estágio do processo. A ação de hidrolases resulta em um aumento em açúcares de redução fer-mentáveis. Isso pode ser expressado como o pó diastático, DP, que pode aumentar por volta de 80 a 190 em 5 dias a 12°C. Hidrolases (por exemplo, proteases) da invenção podem ser empregadas em qualquer processo de produção de cerveja ou bebida alcoólica, como descrito, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos nos 5.762.991; 5.536.650; 5.405.624; 5.021.246; 4.788.066.
Aplicações de pesquisa e médicas
Hidrolases, (por exemplo, proteases) da invenção podem ser empregadas para isolamento de célula de tecido para terapias celulares da mesma maneira que colagenases. Por exemplo, metalo-endoproteinases e outras enzimas da invenção que podem clivar colágeno em fragmentos de peptídeo menores, podem ser empregados como "enzimas de liberase" para dissociação de tecido e melhorar a saúde de células isoladas. "Enzimas de liberase" podem substituir colagenase tradicional. Proteases da invenção que tem colagenase I, colagenase II, clostripaína e/ou atividade de protease neutra podem ser empregadas para dissociação de tecido. Em um aspecto, para dissociação de tecido, isoformas de colagenase da invenção são mistu- radas entre si, e, opcionalmente, com uma protease neutra. Em um aspecto, a protease neutra é um protease dispase neutra e/ou o protease termolisina neutra.
Adicionalmente, proteases da invenção podem ser empregadas como agentes anti-microbianos, devido a suas propriedades bacteriolíticas, como descrito, por exemplo, em Li, S. e outros, Bacteriolytic and Activity and Specificity of Achromobacter b-Lytic Protease, J. Biochem. 124, 332 - 339 (1998).
Proteases da invenção também podem ser empregadas terapeu- ticamente para clivar e destruir proteínas específicas. Alvos potenciais inclu-emproteínas de toxina, tais como, Antraz, Clostridium botulinum, Ricina, e proteínas de célula de câncer e virais essenciais.
Proteases da invenção também podem ser empregadas em de-sinfetantes, como descrito, por exemplo, em J. Gen Microbiol (1991) 137(5): 1145 - 1153; Science (2001) 249 : 2170 - 2172.
Empregos médicos adicionais das proteases da invenção inclu-em remoção de lipoma, debridamento de ferida e prevenção de cicatriz (co- lagenases), debridação de úlceras dérmicas crônicas e áreas severamente queimadas.
Enzimas da invenção (por exemplo, esterases, proteases, etc., da invenção) podem ser empregadas em composições de debridação enzi- máticas estéreis, por exemplo, pomadas, em um aspecto, contendo cerca de 250 unidades de colagenase por grama. Petrolato branco USP pode ser um portador. Em um aspecto, enzimas (por exemplo, proteases) da invenção podem ser empregadas em indicações similares a Pomada Santyl® (BTC, Lynbrook, NY). Proteases da invenção também podem ser empregadas em adornos de alginato, adornos de barreira antimicrobiana, adornos de quei-madura, bandagens de compressão, ferramentas de diagnóstico, adornos de gel, adornos hidro-seletivos, adornos hidrocelulares (espuma), adornos de hidrocolóide, adornos de I.V, cortinas de corte, adornos aderentes inferiores, adornos de absorção de odor, bandagens de pasta, adornos pós operativos, administração de cicatriz, cuidado de pele, adornos de película transparen- tes e/ou fechamento de ferida. Proteases da invenção podem ser emprega-das em limpeza de ferida, preparação de leito de ferida, para tratar úlceras de pressão, úlceras de perna, queimaduras, úlceras de pé diabético, cicatrizes, fixação de IV, feridas cirúrgicas e feridas secundárias.
Adicionalmente, enzimas da invenção podem ser empregadas em proteômicos e trabalho de laboratório em geral. Por exemplo, proteases podem ser empregadas da mesma maneira como enzimas de restrição de DNA.
Outras aplicações industriais
A invenção também inclui um método de aumento do fluxo de fluidos de produção de uma formação subterrânea por remoção de um fluido prejudicial viscoso contendo proteína formado durante as operações de pro-dução e encontrado dentro da formação subterrânea que circunda uma per-furação de cavidade completa compreendendo permitir que fluidos de pro-dução fluam da perfuração de cavidade; reduzir o fluxo de fluidos de produ-ção das taxas de fluxo esperadas abaixo de formação; formular um trata-mento de enzima (compreendendo uma enzima da invenção) por combina-ção junta de um fluido aquoso e um polipeptídeo da invenção; bombear o tratamento de enzima para um local desejado dentro da perfuração de cavi-dade; permitir que o tratamento de enzima degrade o fluido prejudicial visco-so contendo proteína, por meio do que o fluido pode ser removido da forma-ção subterrânea para a superfície da cavidade; e em que o tratamento de enzima é efetivo para atacar a proteína nas paredes da célula.
As hidrolases da invenção podem ser empregadas para a síntese de peptídeo, na indústria de couro, por exemplo, para processo de pele de animal, por exemplo, em diminuição e/ou oremoção de pêlo, para admi-nistração de resíduo, por exemplo, remoção de pêlo de drenagens, na indús-tria de fotografia, por exemplo, para recuperação de prata de película, na indústria médica, por exemplo, como discutido acima, por exemplo, para tra-tamento de queimaduras, feridas, carbúnculos, furúnculos e abscessos pro-fundos ou para dissolver coágulos sanguíneos por dissolução de fibrina, pa-ra desengomação de seda.
Em outros aspectos, enzimas da invenção podem ser emprega-das como realçadores de aroma em, por exemplo, queijo e comida de animal de estimação, como descrito, por exemplo, em Pommer, K., Investigating the impact of enzymes on pet food palatability, Petfood Industry, maio de 2002, 10-11.
Ainda em outra modalidade da invenção, enzimas da invenção podem ser empregadas para aumentar produção de amido de moagem úmi-da de milho, como descrito, por exemplo, em Johnston, D.B., and Singh, V. Use of proteases to Reduce Steep Time and SO2 requirements in a corn wet-milling process, Cereal Chem. 78(4) : 405 - 411.
Em outros aspectos, enzimas da invenção podem ser emprega-das em biodefesa (por exemplo, destruição de esporos ou bactérias). Em-prego de enzimas em aplicações de biodefesa oferece um benefício signifi- cante, pelo fato de que elas podem ser muito rapidamente desenvolvidas contra quaisquer agentes de guerra biológicos do futuro atualmente desco-nhecidos.Além disso, proteases da invenção podem ser empregadas para a descontaminação de ambientes afetados.
Adicionalmente, enzimas da invenção podem ser empregadas em degradação de biopelícula, em conversão de biomassa para etanol, e/ou no cuidado pessoal e indústria de cosméticos.
Enzimas da invenção também podem ser empregadas para re-alçar a enantioseletividade, como descrito, por exemplo, em Arisawa, A. e outros, Streptomyces Serine Protease (DHP-A) as a New Biocatalyst Capable of Forming Chiral Intermediates of 1,4-Diohydropyridine Calcium Antago-nists. Appl Environ Mircrobiol 2002 Jun; 68(6) : 2716 - 2725; Haring, D. e outros, Semisynthetic Enzymes in Asymmetric Synthesis : Enantioselective Reduction of Racemic Hydroperoxides Catalyzed by Seleno-Subtilisin. J. Org. Chem. 1999, 64:832-835.
EXEMPLOS Exemplo 1: Ensaios de lipase exemplares
O seguinte exemplo descreve ensaios exemplares para avalia-ção quanto a atividade de lipase. Em um aspecto, estes ensaios exemplares podem ser empregados como avaliações de rotina para determinar se um polipeptídeo está dentro do escopo da invenção. Tais ensaios incluem em-prego de compostos indicadores de pH para detectar clivagem de ácidos graxo de triglicerídeos, métodos espectrofotométricos, HPLC, GC, MS, TLC e outros. Jaeger (1994) FEMS Microbiol. Rev. 15 : 29 - 63; Ader (1997) Methods Enzymol. 286 : 351 - 386; Vorderwülbecke (1992) Enzyme Microb. Technol. 14 : 631 - 639; Renard (1987) Lipids 22 : 539 - 541.
Em um aspecto, os métodos da invenção avaliam lipases regio- seletivas, por exemplo, lipases de Sn-1, Sn-3 e/ou Sn-3 regio-seletivas. Em um aspecto, os análogos de TAG de 1,3-diamida e 1,3-diéter de substratos são empregados para alvejar, ou selecionar para, lipases seletivas de Sn-2. Em um aspecto, os métodos da invenção avaliam lipases que exibem regi- oseletividade para a posição 2 de lipídios, por exemplo, TAGs. Síntese estru-turada de lipídios que empregam lipases seletivas de Sn-2 pode ser útil para a síntese de uma variedade de TAGs, incluindo 1,3-diacilglicerídeos (1,3- DAGs) e componentes de manteiga de cacau.
Em um aspecto, lipases regio-seletivas, incluindo lipases seleti-vas de Sn-2, são caracterizadas por regioseletividade empregando métodos analíticos rigorosos. Isto pode eliminar falsos resultados devido à migração de acila. Em um aspecto, lipases são testadas quanto à especificidade de Sn2 empregando métodos analíticos tais como espectroscopia de NMR. Além disso, um triacilglicerídeo estruturado do tipo ABA (onde A e B deno-tamácidos graxos distribuídos ao longo da cadeia principal de glicerol) pode ser submetido a hidrólise ou alcoólise empregando lipases (por exemplo, da invenção) seguida por análise dos glicerídeos parciais e ácido graxo (éste-res) formados. Condições de alcoólise em atividade de água controlada, por exemplo, empregando-se álcoois primários tais como metanol ou etanol, são preferidas quando migração de acila indesejada pode ser evitada. Seletivi-dade de Sn-2 de lipases foi relatada, entretanto, a extensão de seletividade de sn-2 foi muito baixa (Briand (1995) Eur. J. Biochem. 228: 169 - 175; Ro- galska (1993) Chirality 5, 24 - 30.
Em um aspecto, lipases regio-seletivas são analisadas quanto a sua regio-especificidade (Sn2 versus Sn1/Sn3 versus Sn1,3) em lipídios apropriados, tais como tripalmitina, tristearina, trioleína, tricaprilina, e trilauri- na, e também quanto à sua especificidade de ácido graxo.
Avaliação para Atividade de Lipase/Esterase
Colônias são selecionadas com palitos de dente e empregadas para inocular isoladamente cada uma das cavidades das placas de microtítu- lo de 96 cavidades. As cavidades continham 250 μL de meios de LB com 100 μg/mL de ampicilina, 80 μg/mL de meticilina, e 10% v/v de glicerol (LB Amp/Meth, glicerol). As células foram desenvolvidas durante a noite a 37°C sem sacudir. Isto constituiu geração do "Source GenBank". Cada cavidade do Source GenBank desse modo continha uma cultura de matéria-prima de células de E. coli, cada uma das quais continham um pBluescript com um suplemento de DNA único.
Placas da fonte GenBank foram empregadas para multiplamente inocular uma placa única (a "placa condensada") contendo em cada cavida-de 200 μL de LB Amp/Meth, glicerol. Esta etapa foi executada empregando a High Density Replicating Tool (HDRT) do Beckman Biomek com um ciclo de esterilização seco de ar, isopropanol, água, alvejante a 1% entre cada inocu-lação. Cada cavidade da placa condensada, deste modo, continha 10 a 12 clones pBluescript diferentes de cada uma das placas de biblioteca de fonte. A placa condensada foi desenvolvida durante 16 horas a 37°C e então em-pregada para inocular duas placas filhas de microtítulo Polyfiltronics de 96 cavidades contendo em cada cavidade 250 μL de LB Amp/Meth (nenhum gli- cerol). A placa condensada original foi posta em armazenamento a -80°C. As duas placas filhas condensadas foram incubadas a 37°C durante 18 horas.
A 'solução de matéria-prima de substrato a 600 μM'de esterase de cadeia curta foi preparada como segue: 25 mg de cada um dos seguintes compostos foram dissolvidos no volume apropriado de DMSO para produzir uma solução de 25,2 mM. Os compostos empregados foram proprionoato 4- metilumbeliferila, butirato de 4-metilumbeliferila, e heptanoato de 4-metilum- beliferila. Duzentos e cinqüenta microlitros de cada solução de DMSO foram adicionados ca a 9 mL de 50 mM, tampão de HEPES a pH 7,5 que continha 0,6% de Triton X-100 e 0,6 mg por mL de maltosida de dodecila (Anatrace, Maumee, OH). O volume foi retirado para 10,5 mL com o tampão de HEPES acima para produzir uma suspensão ligeiramente turva.
A 'solução de matéria-prima de substrato a 600 μM' de cadeia longa foi preparada como segue: 25 mg de cada um dos compostos seguin-tes foram dissolvidos em DMSO a 25,2 mM como acima. Os compostos em-pregados foram elaidato de 4-metilumbeliferila, palmitato de 4-metilumbeli- ferila, oleato de 4-metilumbeliferila, e estearato de 4-metilumbeliferila. Todo aquecimento breve requerido em um banho de 70°C para alcançar dissolu-ção. Duzentos e cinqüenta microlitros de cada solução de DMSO foram adi-cionados ao tampão de HEPES e diluídos a 10,5 mL como acima. Todas as sete umbeliferonas foram obtidas de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Cinqüenta μL da 'solução de matéria-prima de substrato a 600 μM'de esterase de cadeia longa ou esterase de cadeia curta foram adicio-nados a cada uma das cavidades de uma placa condensada branca empre-gando o Biomek para produzir uma concentração final de substrato de cerca de 100 μM. Os valores de fluorescência foram registrados (excitação = 326 nm, emissão = 450 nm) em um fluorômetro de leitura de placa imediatamente após a adição do substrato. A placa foi incubada a 70°C durante 60 minutos no caso dos substratos de cadeia longa, e 30 minutos em RT no caso dos substratos de cadeia curta. Os valores de fluorescência foram registrados de novo. Os valores de fluorescência iniciais e finais foram comparados para determinar se um clone ativo estava presente.
Para isolar o clone individual que transportava a atividade, as placas de Source GenBank foram descongeladas e as cavidades individuais empregadas para isoladamente inocular uma nova placa contendo LB Amp/Meth. Como acima, a placa foi incubada a 37°C para desenvolver as células, 50 μL de 600 μM de solução de matéria-prima de substrato foram adicionados empregando o Biomek e a fluorescência foi determinada. Uma vez que a cavidade ativa da placa de origem foi identificada, células desta cavidade ativa foram listradas em ágar com LB/Amp/Meth e desenvolvidas durante a noite a 37°C para obter colônias únicas. Oito colônias únicas fo- ram escolhidas com um palito de dente estéril e empregadas para isolada-mente inocular as cavidades de uma placa de microtítulo de 96 cavidades. As cavidades continham 250 μL de LB Amp/Meth. As células foram desen-volvidas durante a noite a 37°C sem sacudir. Uma alíquota de 200 μL foi re-movida de cada cavidade e analisada com os substratos de cadeia curta ou longa apropriados como acima. O clone mais ativo foi identificado e os 50 μL restantes de cultura foi empregado para riscar uma placa de ágar com LB/Amp/Meth. Oito colônias únicas foram escolhidas, desenvolvidas e anali-sadas como acima. O clone mais ativo foi empregado para inocular 3 mL de culturas de LB/Amp/Meth, que foram desenvolvidos durante a noite. O DNA de plasmídeo foi isolado das culturas e utilizado para seqüenciamento.
Exemplo 2: Métodos de síntese de lipídio estruturada exemplar
O exemplo seguinte descreve métodos de síntese de lipídio es-truturada exemplar da invenção que emprega lipases da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece uma "Metodologia de Migra-ção Forçada" para a síntese estruturada de lipídios empregando as lipases da invenção. Este método fornece a síntese eficiente de uma variedade de lipídios estruturados, incluindo 1,3-DAGs e componentes de manteiga de cacau, como ilustrado na figura 7. Em um aspecto, o método para produção de lipídios estruturados, neste exemplo um triacilglicerídeo estruturado (sTAG), compreende três etapas principais: 1. Alcoólise ou hidrólise regio-específica (por exemplo, etanólise) de uma TAG empregando lipases específicas de Sn1 ou específicas de Sn3 para produzir um 2,3 ou 1,2-DAG, respectivamente; 2. Promoção de migração de acila em um DAG purificado ou não-purificado sob condições cineticamente controladas que empregam re-sinas de permuta de íon ou outro(s) método(s), resultando no 1,3-DAG estru-turado; e 3. Adição catalisada de lipase específica de ácido graxo de um ácido graxo ou um derivado de ácido graxo, tal como um éster de etila de ácido graxo ou éster de vinila, na posição de Sn2, produzindo o sTAG.
Esta rota pode fornecer acesso a dois grupos de alvo de lipídios, 1,3-DAGs e sTAGS com o mesmo grupo de enzimas e metodologia. O mé-todo pode empregar lipases que têm regio-especificidade de Sn1 e/ou Sn3; tais enzimas estão comercialmente disponíveis (Rhizopus delemar (Amano, Japão) e Rhizomucor miehei (Novozymes, Dinamarca)
Em um aspecto, lipases de Rhizopus sp e lipases de Rhizomu- cor mieheisão empregadas. Estas lipases são conhecidas por exibir especi-ficidade mais alta para hidrólise de ácidos graxos na posição de Sn1 compa-rada com a posição de Sn3. Em um aspecto, os métodos também compre-endem emprego destas lipases de Rhizopus e Rhizomucor meihei para con-firmar a Etapa 1, da figura 7, isto é, a alcoólise ou hidrólise regioespecífica (por exemplo, etanólise) de um TAG empregando uma lipase específica de Sn1 ou específica de Sn3 para produzir um 2,3 ou 1,2-DAG, respectivamen-te.
Em um aspecto, a invenção fornece um método de migração forçada suplementado com glicerol. Adição de glicerol à reação de enzima antes do tratamento com resina de permuta de ânion (ou outros catalisado-res de migração) pode ser um modo para aumentar produções de 1,3 DAGs em reações de migração forçada, como ilustrado na figura 27.
Em um aspecto, os métodos também compreendem a confirma-ção da Etapa 2, figura 7, através de tratamento de 1,2-DAG ou 2,3-DAG pu-rificados ou não-purificados com uma resina de permuta de íon, por exem-plo, uma coluna de permuta de íon, sob uma variedade de condições. Variá-veis principais incluem a natureza da resina de permuta de íon, pH, taxas de fluxo, tipo de tampão e forças iônicas. Métodos alternativos de promover mi-gração de acila podem ser empregados. Em um aspecto, a migração de aci- la pode ser executada sob condições de não-equilíbrio, por exemplo, tal que o produto final contém maiores relações de um produto sobre outro, por exemplo, tal que o produto final contém uma relação 2 : 1 de 1,3-DAG para 2,3-DAG. Substratos para os estudos de validação da Etapa 2 estão comer-cialmentedisponíveis.
Em um aspecto, migração de acila em 2,3-DAGs (ou 1,2-DAGs) é promovida sob condições cinéticas tais que o produto final seja um 1,3- DAG purificado em produção maior que cerca de 70%.
Em um aspecto, a Etapa 3, figura 7, emprega uma lipase que é específica de ácido graxo, mas não há exigências regioespecíficas produzi-ram um 1,3-DAG puro como substrato. A lipase de Geotrichium candidum exibe uma especificidade muito alta para ácidos graxos que têm insaturação Δ9. Esta enzima está facilmente disponível e pode ser utilizada para confir-mar a Etapa 3.
Exemplo 3: Síntese estruturada exemplar de alternativas de manteiga de cacau (CBAs)
O exemplo seguinte descreve métodos de síntese de lipídio es-truturada exemplar da invenção empregando as lipases da invenção. Este exemplo descreve a síntese estruturada de triacilglicerídeos (sTAGs) como alternativas de manteiga de cacau (CBAs).
Manteiga de cacau natural consiste principalmente em três TAG: 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS) e 1- palmitoil-2-oleoil-3-stearoilglicerol (POS). As proporções relativas destes três TAGs diferem-se um pouco dependendo da fonte de manteiga de cacau, mas são aproximadamente 21 : 31 : 48 (POP : SOS : POS). Os métodos da invenção fornecem a síntese estruturada de alternativas de manteiga de ca-cau tendo qualquer proporção de POP : SOS : POS, incluindo a natural 21 : 31 : 48 de POP : SOS : POS. Os métodos da invenção fornecem os TAGs relacionados a síntese estruturada, por exemplo, 1-oleoil-2,3-dimiristoilglice- rol (OMM). Os métodos da invenção também fornecem o processo seletivo de manteiga de cacau natural empregando as lipases da invenção.
Em um aspecto, igualmente, a lipase de Sn2 e os métodos deli-neados acima (incluindo o Exemplo 2) são empregados na síntese de lipí-dios estruturados chaves de CBAs. Lipases podem ser analisadas quanto a sua regioespecificidade (Sn2 versus Sn1/Sn3 versus Sn1,3) em lipídios apropriados, tais como tripalmitina, tristearina, trioleína, tricaproleína, e trilau- reína. Lipases também podem ser analisadas quanto a sua especificidade de ácido graxo.
Exemplo 4: Síntese estruturada exemplar de nutracêuticos
O exemplo seguinte descreve métodos de síntese de lipídio es-truturada exemplar da invenção para preparação de nutracêuticos que em-pregam as lipases da invenção.
Em um aspecto, 1,3-DAGs são sintetizados para emprego em nutracêuticos. 1,3-DAGs são os produtos da primeira etapa da síntese de lipase de Sn2 de sTAGs mostrados na figura 6 e as primeiras duas etapas da síntese de lipídios estruturados como mostrado na figura 7 e figura 8. En-saios de rotina de lipases para especificidade de Sn2 versus Sn1 ou Sn3 podem fornecer os dados para determinar as lipases ótimas e metodologia para aplicações de síntese de nutracêutico e 1,3-DAG diferente.
Em um aspecto, ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) são feitos empregando os métodos e lipases da invenção, por exemplo, empre-gando um protocolo como apresentado na figura 9, parte inferior. PUFAs são artigos valiosos por si só e podem ser extraídas de fontes de gordura con-tendo PUFA, tais como óleo de peixe, empregando lipases específicas de PUFA da invenção. Em um aspecto, a invenção emprega enzimas que po-dem distinguir-se entre ésteres de PUFAs diferentes, por exemplo, ácido docosaexaenóico (DHA) versus ácido eicosapentaenóico (EPA), facilitando o desenvolvimento de produtos altamente purificados (S. Wongsakul e outros, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105 (2003) 68 - 73). Lipases podem ser testadas quanto a suas especificidades em uma variedade de ésteres de PUFA e ésteres de glicerol.
Exemplo 5: Síntese estruturada exemplar de lipídios contendo ácidos graxos poli-insaturados.
O exemplo seguinte descreve métodos de síntese de lipídio es-truturada exemplar da invenção para a preparação de lipídios que contêm ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) empregando as lipases da invenção. Estes lipídios contendo PUFA podem ser empregados em comidas, alimen-tos, cosméticos, farmacêuticos e agentes de liberação de droga, nutracêuti- cos e outros mais.
Em um aspecto, óleo de peixe é um material de partida, uma vez que em óleo de peixe a maioria dos ácidos graxos na posição 2 são PUFAs.
Em um aspecto, os métodos compreendem uma interesterificação catalisada por 1,3-lipase de óleo de peixe com ésteres de ácido graxo de cadeia média para formar lipídios de tipo MLM (triacilgliceróis (TAG) pode ser dos tipos MML, MLM, MLL, e LML (M, ácido graxo de cadeia média; L, ácido graxo de cadeia longa, ver, por exemplo, Kurvinen (2001) Lipids 36 : 1377 - 1382)).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos para preparação de sTAGs contendo PUFA, como ilustrado no topo da figura 9 (figura 9A), e sMAGs de 2-PUFA e PUFAs purificados, como ilustrado na parte inferior da figura 9 (figura 9B). Qualquer óleo de partida apropriado pode ser emprega-do. Em um aspecto, se é mais econômico empregar ácidos graxos de óleo de peixe em vez de PUFAs purificados, lipases com especificidade para ácido graxo B (na figura 9A, topo) e PUFAs podem ser empregados. Lipases podem ser analisadas quanto a especificidade de ácido graxo em ésteres simples e ésteres de glicerol. Em um aspecto, MAGs de 2-PUFA são sinteti-zados a partir de óleo de peixe empregando uma Sn1,3-lipase (veja figura 9B) ou uma lipase não-regioespecífica que não cliva ésteres de PUFA.
Exemplo 6: Ensaio Growth-Kill Exemplar
O exemplo seguinte descreve um ensaio Growth-Kill exemplar para testar a atividade das lipases da invenção. Ver, por exemplo, Chem. Communication (2002) 1428 - 1429.
O ensaio Growth-Kill fornece um método para seleção in vivo de enzimas, por exemplo, lipases, ou mutantes destas, com propriedades dese-jáveis. O ensaio combina dois componentes, um componente de desenvol-vimento e um componente de matança. O primeiro destes é um substrato do qual a enzima, por exemplo, lipase, libera um elemento que permite que os organismos hospedeiros se desenvolvam, por exemplo, uma fonte de carbo-no. O segundo destes é um substrato a partir de qual a enzima, por exemplo, lipase, libera um elemento que previne que o organismo hospedeiro se desenvolva ou mate o organismo hospedeiro, por exemplo, um antibiótico.
A invenção fornece métodos de modificação de um ácido nucléi- co que codifica uma lipase para gerar uma enzima com propriedades modifi-cadas. Um ensaio Growth-Kill pode ser empregado para fazer a distinção entre dois ácidos graxos, determinar se uma lipase tem especificidade de enzima alterada, determinar se uma lipase está dentro do escopo da inven-ção, e outros mais. Um ensaio Growth-Kill exemplar é esboçado na figura 11, onde R1 é um substrate de desenvolvimento para a análise do hospedeiro e R2 é uma substância que é tóxica à célula e mata o hospedeiro se liberada do éster. Em um aspecto, substratos de desenvolvimento (ésteres de glicerol de 1-acila) e substratos de matança (ésteres de cloranfenicol de 3- acila) são usados.
Exemplo 7: Protocolo para a síntese de 1,3-diglicerídeo
O exemplo seguinte descreve um protocolo exemplar empregado para praticar as composições (as lipases) e os métodos da invenção. Estes protocolos exemplares também podem ser empregados para determinar se uma lipase está dentro do escopo da invenção. Em um aspecto, um pro-tocolo exemplar para a síntese de 1,3-diglicerídeo (1,3-DG) e lipídios estrutu-rados que empregam lipases da invenção é descrito.
Em um aspecto, glicerol e ácido graxo livre (FFA) ou éster de vinila de ácido graxo (FAVE) são glicerol imobilizado esterificado (ver, por exemplo, J. Am. Oil Chem. Soc., 1992, 69: 955 - 960). O glicerol imobilizado pode estar em uma sílica gel. Em um ensaio exemplar, Lipozyme RM IM™ (uma lipase 1,3-específica imobilizada, Novozymes, Dinamarca), com MTBE, em temperatura ambiente foi usado. Isto tem a vantagem de produção ele-vada e pureza de 1,3-DG, e reação rápida. Entretanto, MTBE não é permitido em emprego de comida e há dificuldade em separação de enzima imobi-lizada e sílica gel.
Em um aspecto, a esterificação é feita empregando glicerol não- imobilizado. Em um ensaio exemplar, esterificação de glicerol e ácido graxo (FFA) ou éster de vinila de ácido graxo (FAVE) está em um livre de solven- te/solvente orgânico com uma lipase imobilizada de Candida antarctica tipo B (CAL-B), uma lipase de Rhizopus delemar imobilizada em EP100 (DEP100), e Lipozyme RM IM™ (Novozymes, Dinamarca), a 0°C ou temperatura ambiente (RT). Uma vantagem deste protocolo exemplar é a condição livre de solvente; isso permite facilidade de separação de enzima imobilizada e com uma etapa de purificação adicional, uma produção moderada - eleva-da.
Em um aspecto, alcoólise e hidrólise de triglicerídeos (TG) é executada empregando lipases 1,3-regioespecíficas, D-EP100 e Lipozyme RM IM™ (Novozymes, Dinamarca), solventes orgânicos, preferencialmente a atividade de água controlada. Nesta reação, os substratos (óleo natural) são baratos e a reação fornece uma produção aceitável. A maioria dos DAG formados é 1,2(2,3)-DAG.
Em um aspecto, uma reação exemplar envolveu indução de mi-gração de acila de 1,2(2,3)-DAG. A maioria dos DAG obtidos de alcoólise e hidrólise de TAG é 1,2(2,3)-DaG. Deste modo, é necessário induzir a migra-ção de acila de 1,2(2,3)-DAG para 1,3-DAG. Vários fatores foram estudados, incluindo permutadores de íon, ácido ou base, calor, portador, atividade de água. Uma reação exemplar envolveu a esterificação entre 1,3-DAG e FFA ou FAVE empregando uma enzima específica de sn2 ou um lipase não- regioespecífica mas específica para tamanho de mudança de ácido graxo ou ácido graxo específico.
Esterificação empregando glicerol imobilizado 1,3-DAG foi sintetizado a partir de glicerol, 1 mmol, imobilizado em 4 g de sílica gel e laurato de vinila (2 mmoles) em 8 ml de éter de metil- terc-butila (MTBE) em temperatura ambiente empregando Lipozyme RM IM™ (Novozymes, Dinamarca) (10% baseado em peso de glicerol) como catalisador (Matthias e outros 1992???). A reação foi realizada em um frasco de 10 ml e a mistura de reação foi misturada através de agitador magnético (500 rpm). Após 24 horas (h), enzima foi separada da mistura de reação através de filtração para interromper a reação. O filtrado foi evaporado sob vácuo. 1,3-DAG em resíduo oleoso foi recuperado e purificado através de cristalização em metanol seco a 4°C seguida por filtração. Ver, por exemplo, J. Am. Oil Chem. Soc., 1992, 69: 955 - 960).
Esterificação empregando glicerol não-imobilizado
1,3-DAG foi sintetizado por esterificação de glicerol (1 mmol) e FFA ou FAVE (2 mmol) em uma condição livre de solvente ou em solvente orgânico a 0°C empregando CAL-B (10% baseado em peso de glicerol) como catalisador. A reação foi realizada em um frasco de 4 ml e a mistura de reação foi misturada através de agitador magnético (400 rpm). Peneira mole-cular ativada foi adicionada em uma reação com FFA para remover água produzida da mistura de reação. Em algumas reações, solvente orgânico (2 ml) foi adicionado à mistura de reação para dissolver um FFA sólido. A rea-ção foi interrompida através de dissolução da mistura de reação em n-hexa- no (no caso de uma condição de reação livre de solvente) e centrifugada pa-ra separar enzima imobilizada da mistura de reação. O 1,3-DAG foi recupe-rado e purificado através de cristalização a -20°C. Se conteúdos elevados de MAG estavam presentes, uma recristalização em metanol seco a -20°C pro-porcionou 1,3-DAG puro. Amostras (10 μl) foram periodicamente retiradas durante a reação para determinar a composição de acilglicerol. Amostras foram pré-tratadas antes de análise por adição de 0,3 ml de solução de Folsh (clorofórmio : metanol, 2: 1 em vol) e 0,3 ml de água destilada, misturadas durante 30 segundos, seguido por centrifugação (10000 rpm, 2 min). Camada orgânica foi empregada para análise por IATROSCAN™ (Shell-usa, Fredericksburg VA).
Alcoólise e hidrólise de TAG
TAG (3 mmoles) foi dissolvido em solvente orgânico (2 ml) e pré- equilibrado sobre uma solução de sal saturada a aW 0,11 durante 48 h (so-mente para reação de alcoólise). Etanol seco ou água (3 mmol) foram adici-onados e a mistura de reação foi incubada a 40°C durante 15 min. Lipase imobilizada (10% baseado em peso de TAG) foi adicionada para iniciar a reação. A reação foi realizada em um frasco com tampa de rosca de 4 ml e a mistura de reação foi misturada através de agitador magnético (400 rpm). Uma alíquota da mistura de reação foi periodicamente retirada e diluída com clorofórmio para diluição apropriada, seguido por análise com IATROS- CAN™ (Shell-usa, Fredericksburg VA) para determinar composição de acil- glicerol. Lipase imobilizada foi separada da mistura de reação após 48 h através de centrifugação para interromper a reação. Indução de migração de acila
Efeito de temperatura, FFA (ácido oléico), portador (celita) e per- mutador de íon em migração de acila de 1,2-dipalmitina (1,2-DP, isto também inclui o estereoisômero 2,3-DP) foram estudados. 1,2-DP foi dissolvido em n-hexano (8 mg/ml). Ácido oléico (2-4 mmoles) ou celita (8 mg) ou per- mutador de íon (10 - 100 mg) foi adicionado diretamente à mistura de reação. Todas as reações foram realizadas em um frasco de reação de Eppen- dorf de 1,5 ml com sacudidela (1400 rpm) em temperatura ambiente (25°C), exceto ao testar o efeito de temperatura, nesse caso a reação foi realizada a 40 ou 60°C.
Síntese de triglicerídeos estruturada (ST) de 1,3-diglicerídeos (1,3-DAG) e ácido graxo livre ou éster de vinila de ácido graxo
Triglicerídeos estruturados (ST) foram sintetizados através de esterificação de 1,3-DAG e ácido oléico (OA) ou éster de vinila de ácido oléi- co (OAVE) em n-hexano a 60°C empregando lipase imobilizada de Pseudo-monas sp. (Amano PS-D, Amano Enzyme USA, Elgin, IL) como biocatalisa- dor. 0,1 mmol de 1,3-DG (45,7 mg de 1,3-dilaurina ou 34,4 mg de 1,3-dica- prilina) e 0,2 mmol de OA (28,2 mg) ou OAVE (60,2 mg) foram dissolvidos em 1 ml de n-hexano em um frasco com tampa de rosca de 2 ml. Peneira molecular ativada foi adicionada quando OA foi usado como doador de acila. A reação foi iniciada por adição de PS-D (10% de peso de 1,3-DG). Os fras-cos foram sacudidos a 1400 rpm a 60°C. Uma alíquota de misturas de reação foi retirada para análise com IATROSCAN™ (Shell-usa, Fredericksburg VA). ST obtido deste modo foi purificado em placa de TLC e a faixa de TAG foi jogada fora e metilada seguida por análise de GC.
Composição de acilglicerol foi determinada por análise (TLC- FID) de IATROSCAN™ (Shell-usa, Fredericksburg VA). A composição de ácido graxo total de ABA-ST foi determinada por análise de GC de metiléste- res correspondentes. Pureza de 1,3-DAG foi confirmada através de espec- troscopia de 1H-NMR.
Determinação de composição de ácido graxo por análise de GC 10 mg de 1,3-DG foram metilados com 0,5% de NaOH em me-tanol (500 μl) e então incubados durante 10 min a 60°C. Os metilésteres fo- ram extraídos com n-hexano (400 μl) durante 1 min. A camada de n-hexano foi lavada com 200 μl de água destilada e secada sobre sulfato de sódio ani- droso. A análise foi realizada com um cromatógrafo de gás (GS) Hewlett- Packard 5890 (série II) (Hewlett-Packard, EUA) em uma coluna de FFAP (Permabond FFAP-DF-0,25, 25 m x 0,25 mm i.d., Macherey-Nagel GmbH, Düren, Alemanha). Hidrogênio foi usado como o gás portador. O programa de temperatura empregado foi 150°C (4°C/min, 0,50 min), 170°C (5°C/min), 195°C (10°C/min) e 215°C (9,50 min). Temperaturas do injetor e detector foram 250°C. Os fatores de resposta foram determinados empregando uma mistura padrão de metilésteres de ácido graxo.
Determinação de composição de glicerídeo por análise de TLC/FID
As mudanças na composição de glicerídeo durante a reação foram quantitativamente determinadas empregando método analítico Iatros- can. Antes da análise, um espaço em branco do chromarod foi examinado. Após tratar o chromarod com ácido bórico (3%) e secagem durante 5 min, 1 μl do meio de reação (diluído em clorofórmio em diluição apropriada) é man-chado sobre o chromarod e a amostra manchada foi desenvolvida durante 10 cm em uma mistura de benzeno : clorofórmio : ácido acético (50 : 30 : 0,5, em vol). Após secagem, o chromarod em um forno a 110°C durante 5 min, varredura é executada a uma taxa de fluxo de hidrogênio de 160 ml/min e uma taxa de fluxo de ar de 2,0 l/min para produzir um cromatograma.
Separação de HPLC de triacilgliceróis
A composição do triacilgliceróis formada durante a esterificação enzimática foi caracterizada por HPLC empregando uma coluna de C18 de nucleosila, (5 μm, 250 x 4 mm, Sykam, Gilching, Alemanha) e um detector de dispersão de luz evaporativa (ELSD) (Polymer labs) a uma taxa de fluxo de 1,5 ml/min. O propósito de ELSD é complementar a detecção de ultravioleta (UV) de solutos, e detectar solutos que não absorvem luz de UV tal como triglicerídeos de cadeia média. O princípio de ELSD aplica-se a todos os solutos que têm uma volatilidade mais baixa que a fase móvel. Eluição foi executada empregando um sistema de eluição de gradiente de acetonitrilo e diclorometano (70% a 55% de acetonitrilo durante 10 min, seguido por 55% a 70% de acetonitrilo durante 8 minutos).
Análise de regioespecífica de triglicerídeos
A análise regioespecífica de óleo foi conduzida através de de-gradação de Grignard com brometo de alilmagnésio seguida por análise de cromatógrafo de gás (GS). 20 mg de TG foram dissolvidos em éter de dietila seco (2 ml). 800 μl de solução de brometo de magnésio de alila (1 M) foram adicionados, e a mistura foi sacudida durante 30 segundos, e então 300 μl de ácido acético glacial foram adicionados, seguido por 5 ml de ácido bórico 0,4 M para interromper a reação. Uma mistura de produtos desacilados foi extraída com éter de dietila. Este extrato foi lavado com 5 ml de solução de ácido bórico aquoso (0,4 M)/NaHCO3 aquoso (2%), 50 : 50 (vol/vol). A ca-mada de éter foi submetida diretamente à placa de TLC, que foi impregnada com ácido bórico, para isolar cada fração de produtos desacilados. A placa foi desenvolvida com um clorofórmio/acetona/solução de ácido acético (85 : 15 : 1, em vol) como sistema de desenvolvimento. As faixas de 1-MG foram jogadas fora e metilada para determinar sua composição de ácido graxo empregando o mesmo método descrito acima. A porcentagem molar de composição de ácido graxo nas posições de sn 1(3) e sn 2 do TG produzido. Equação para% de FA na posição de sn2 é mostrada abaixo: [% de FAsn2-posição] = 3 [% de FATG] - 2 [% de FA1-MG] onde [% de FA1-MG] e [% de FATG] indicaram para cada ácido graxo, sua porcentagem encontrada em 1-monoglicerídeo e em triglicerí- deos, respectivamente.
Dicaprilina (1,3-DCy)
1,3DCy foi purificado através de cristalização a partir de n- hexano a -20°C várias vezes. Quando quantidade elevada de MG foi apre-sentada, a segunda cristalização em metanol seco tem que ser feita para obter 1,3-DCy em pureza elevada (> 98%). A produção mais elevada de 1,3- DCy (93%) obtida a partir de esterificação entre caprilato de vinila (CyVE) e glicerol a 0°C em uma condição livre de solvente catalisada por CAL-B. A produção deste modo obtida foi maior que a produção obtida (75%) na litera-tura (ver, por exemplo, J. Am. Oil Chem. Soc., 1992, 69: 955 - 960), ver a figura 12. A figura 12 ilustra os dados de várias reações de esterificação na síntese de 1,3-DCy. O Método 1 é a esterificação de glicerol e ácido caprílico em uma condição livre de solvente a 0°C catalisado por CAL-B. O Método 2 é a esterificação de glicerol e éster de vinila de ácido caprílico em uma con-dição livre de solvente a 0°C catalisado por CAL-B. O Método 3, ver, por exemplo, J. Am. Oil Chem. Soc., 1992, 69: 955 - 960) é a esterificação de glicerol imobilizado em sílica gel e éster de vinila de ácido caprílico em MTBE em temperatura ambiente catalisado por Lipozyme RM IM™ (No- vozymes, Dinamarca). DG = 1,3-dicaprilina, MG = 1-monocaprilina.
Esterificação entre ácido caprílico (Cy) e glicerol gerou produção moderada (55%) em taxas de reação mais baixas e quantidade elevada de MAG foi produzida durante a reação. A produção poderia ser aumentada até 65% por aumento da temperatura de reação de 0°C para a temperatura am-biente. CAL-B gerou produção maior e menos MAG e permitiu taxa de reação mais rápida que Lipozyme RM IM™ (Novozymes, Dinamarca) em esteri- ficação de glicerol e Cy ou CyVE, ambos em solvente orgânico e uma condi-ção livre de solvente.
Estudos em efeito de relação de glicerol : ácido caprílico em rea-ção de esterificação mostraram que taxa de reação inicial diminuiu e a pro-dução de 1,3-DCy aumentou ligeiramente com aumento de relação de 1 : 2 para 1 : 6, como ilustrado na (figura 13). A figura 13 resume os dados mos-trando o efeito de relação de substrato em esterificação entre glicerol e ácido caprílico em n-hexano a 0°C catalisado por CAL-B (DG = 1,3-dicaprilina, MG = 1-monocaprilina).
1,3-Dilaurina (1,3-DLa)
1,3DLa foi facilmente purificado e recuperado através de cristali-zação em metanol seco em temperatura ambiente (RT) ou em hexano a - 20°C (pureza > 98%). Quando ácido láurico (La) foi usado como um doador de acila, solvente foi adicionado para dissolver o FFA. Contudo, o método como descrito em J. Am. Oil Chem. Soc., 1992, 69: 955 - 960, permitiu taxa de reação mais rápida com produção elevada de 1,3-DLa (65%), a produção mais elevada (78%) de 1,3-DLa obtida a partir de esterificação entre glicerol e éster de vinila de ácido láurico (LaVE) a 0°C em uma condição livre de sol-vente catalisada por CAL-B após 24 h, como ilustrado na figura 14. A figura 14 resume os dados de várias sínteses de 1,3-dilaurina. O Método 1 = este- rificação de glicerol e ácido láurico em n-hexano a 0°C catalisado por CAL-B; Método 2 = esterificação de glicerol e éster de vinila de ácido láurico em uma condição livre de solvente a 0°C catalisado por CAL-B; O Método 3 (método de Schneider) = esterificação de glicerol (imobilizada em sílica gel) e éster de vinila de ácido láurico em MTBE em temperatura ambiente catalisado por Lipozyme RM IM™ (Eurzyme, Dublin, Irlanda). (DG = 1,3-dilaurina, MG = 1- monolaurina). LaVE, como doador de acila, permitiu produção mais elevada e reação mais rápida com menor quantidade de MG que La. CAL-B gerou produção mais elevada e taxa de reação mais rá-pida de esterificação de LaVE e glicerol a 0°C, enquanto Lipozyme RM IM™ gerou produção moderada de 1,3-DLa com quantidade elevada de MG e Lipozyme TL™ mostrou atividade muito baixa na mesma condição de reação. Quando aumentar a temperatura de reação para 25°C, Lipozyme RM IM™ mostrou atividade mais elevada, enquanto CAL-B foi menos ativo. Na reação de esterificação entre glicerol e ácido láurico em n-hexano catalisado por CAL-B, taxa de reação e a produção de 1,3-DLa reduziram com o aumento da quantidade de La, como mostrado na figura 15. A figura 15 resume o efeito de ração de substrato em esterificação de glicerol e ácido láurico em n-hexano em temperatura ambiente catalisado por CAL-B (DG = 1,3-dilauri- na, MG = 1-monolaurina).
1,3-Dipalmitina (1,3-DP) e 1,3-distearina (1,3-DS)
As reações foram realizadas em solvente orgânico e em tempe-ratura mais elevada (25°C a 40°C) devido a uma baixa solubilidade de ácido palmítico (PA) e ácido esteárico (SA). A produção de DG foi mais baixa que a produção da reação com La ou Cy. Produção mais elevada (80%) e taxa de reação mais rápida foi obtida a partir de esterificação de glicerol e éster de vinila de ácido palmítico (PAVE) em MTBE a 40°C catalisado por DEP100. A reação alcançou o equilíbrio dentro de 6 - 8 h com baixa quantidade de MG. Esterificação de PA e glicerol imobilizado gerou produção mais elevada e reação mais rápida que esterificação com glicerol livre, como mos-trado na figura 16. A figura 16 resume a síntese de 1,3-dipalmitina. Método 1 = esterificação de glicerol e ácido palmítico em MTBE a 40°C catalisado por D-EP100; Método 2 = esterificação de glicerol e éster de vinila de ácido pal- mítico em MTBE a 40°C catalisado por D-EP100; Método 3 (método de Schneider) = esterificação de glicerol (imobilizado em sílica gel) e éster de vinila de ácido palmítico em MTBE em temperatura ambiente catalisada por Lipozyme RM IM™. (DG = 1,3-dipalmitina, MG = 1-monopalmitina).
D-EP100 gerou atividade e produção mais elevada que Li- pozyme RM IM™ em todos os casos de síntese de 1,3-DP. Além disso, Li- pozyme RM IM™ não mostrou atividade em esterificação de PA ou PAVE quando a reação foi executada em MTBE e baixa atividade em n-hexano. D-EP100 preferiu a esterificação de PA que SA, enquanto atividade não muito diferente em PA e SA foi observada com Lipozyme RM IM™, como ilustrado na figura 17. A figura 17 resume os dados para a esterificação de glicerol e ácido palmítico (C16: O) ou esteárico (C18: 0) em n-hexano a 40°C (RM = Lipozyme RM IM™, DEP = D-EP100, DG = 1,3-diglicerídeos, MG = 1- monoglicerídeos).
Alcoólise de triglicerídeos
Alcoólise de triglicerídeos puros (TGs), incluindo trilaurina, tri- palmitina e tristearina, foi realizada. A maioria dos diglicerídeos (DG) obtidos a partir de reação de alcoólise foi 1,2-DG. Uma quantidade elevada de TG não-reagido permaneceu na mistura de reação. Migração de acila foi obser-vada durante a reação, especialmente em reação de hidrólise, como ilustra-do na figura 18. A Figure 18 mostra os dados da reação de alcoólise apre-sentando a relação de 1,3-DS/1,2-DS durante alcoólise e hidrólise de tristea- rina. DEP = D-EP100, RM = Lipozyme RM IM, Hx = n-hexano, HYD = hidró-lise, ALC = alcoólise.
A reação catalisada por Lipozyme RM IM™, contudo, gerou pro-dução mais baixa, apresentou migração de acila mais elevada que a reação catalisada por D-EP100. Migração de acila baixa foi observada em alcoólise empregando CAL-B após 6 h. Isto poderia ser porque 1,2-DG e 1,3-DG fo- ram produzidos ao mesmo tempo de acordo com a não-especificidade de CAL-B. D-EP100 apresentou atividade mais elevada que CAL-B e Li- pozyme RM, respectivamente, em alcoólise de tripalmitina e tristearina. Efeito de aW: Produção mais elevada e menos MG foram obtidos a partir de al- coólise a aW 0,11 que 0,43. Foi descoberto que MG foi aumentado com o aumento de aW. Efeito de solventes (em produção e migração de acila): pro-dução mais elevada foi obtida com MTBE. Alcoólise em n-hexano e isoocta-no gerou produção moderada, enquanto acetona foi um solvente pobre para Lipozyme RM. A reação executada em n-hexano apresentou migração de acila mais rápida que em MTBE, como ilustrado nas figuras 18 e 19. A figura 19 ilustra dados da hidrólise de trilaurina a 60°C por Lipozyme RM IM™ (DG = dilaurina).
Hidrólise de triglicerídeos
Hidrólise de triglicerídeos puros (TGs), incluindo trilaurina, tri- palmitina e tristearina, foi realizada. Uma quantidade elevada de FFA foi produzida durante a reação e quantidade elevada de TG não-reagido per-maneceu na mistura de reação. A maioria dos DG foram 1,2-DG. Reação de hidrólise mostrou migração de acila mais elevada que reação de alcoólise.
Efeito de quantidade de água: produção mais elevada foi obtida empregando relação de TG : water de 1 : 1, como ilustrado na figura 20. A Figure 20 mostra o efeito de relação de trilaurina : água em hidrólise de tri- laurina em MTBE a 60°C por Lipozyme RM IM™ (DG = 1,2-dilaurina + 1,3- dilaurina, MG = monolaurina). A quantidade de MG foi aumentada com au-mento da relação de TG : água, especialmente em MTBE.
Efeito de solventes: o resultado foi correspondente ao resultado obtido a partir da reação de alcoólise. Hidrólise em MTBE permitiu produção mais elevada que em n-hexano, isooctano e acetona, respectivamente, como ilustrado na figura 21. A figura 21 resume os dados que mostram o efeito de solventes orgânicos em hidrólise de trilaurina a 60°C empregando Li- pozyme RM IM™ (DG = 1,2-dilaurina + 1,3-dilaurina, MG = 1-monolaurina + 2-monolaurina). Contudo, reação em MTBE gerou produção mais elevada, quantidade elevada de FFA foi produzida e migração de acila mais baixa que em n-hexano foi descoberta. A separação de TG, DG, MG e FFA pode ser um problema.
Alcoólise e Hidrólise de óleos naturais
Alcoólise e hidrólise de óleos naturais, incluindo óleos de semente de palma e coco, foram realizadas. A produção de 1,3-DG de reação com óleos naturais foi ligeiramente menor que a produção de alcoólise e hidrólise de TG puro. A produção de DG mais elevada (45 - 50%) e taxa de reação mais rápida foram obtidas a partir de alcoólise em MTBE a 40°C por DEP100, como ilustrado na figura 22. A figura 22 mostra os resultados de al- coólise e hidrólise de óleo de coco em solvente orgânico a 40°C (TG : etanol = 1: 1 mol/mol, TG : water = 1: 2 mol/mol). Lipozyme RM IM™ gerou produção mais elevada e menos MG que Lipozyme TL™. Reação executada em MTBE gerou produção mais elevada e taxa de reação mais rápida que em n- hexano e acetona, respectivamente.
Indução de Migração de acila
Migração de acila foi realizada em óleos naturais, incluindo óleos de núcleo de palma e coco. O efeito de temperatura e portador não foi claro. Quase nenhuma migração de acila foi observada após 72 h. Adição de ácido oléico à mistura de reação ligeiramente induziu migração de acila, como ilustrado na figura 23. A figura 23 mostra o efeito de ácido oléico em migração de acila de 1,2-dipalmitina em n-hexano em temperatura ambiente. A taxa de migração de acila foi aumentada com aumento da relação de ácido oléico : 1,2-DP.
Os permutadores de ânion apresentaram indução elevada de migração de acila, enquanto permutação de cátion não apresentou efeito. A taxa de migração de acila foi aumentada com aumento de quantidade de permutador de ânion, como ilustrado na figura 24. A figura 24 mostra o efeito da quantidade de permutador de ânion em migração de acila de 1,2- dipalmitina (5 mg/ml) em n-hexano em temperatura ambiente. Uma quanti-dade grande de permutador de ânion foi exigida para induzir uma migração de acila rápida.
Esterificação de 1,3-DG e FFA/FAVE
Esterificação de 1,3-DLa e OA em n-hexano foi realizada com lipase imobilizada de Pseudomonas sp. (Amano PS-D), Candida antarctica tipo A (CAL-A), e Penicillium cyclopium (Lipase G). Peneira molecular foi adicionada às misturas de reação para remover a água produzida. Foi des-coberto que só PS-D foi capaz de catalisar a reação de esterificação de 1,3- DG e ácido oléico (OA) ou oleato de vinila (OAVE). A reação foi rápida. Qua-se todo o 1,3-DG foi consumido após 2 h para 1,3-DCy e 8 h para 1,3-DLa. A Tabela 1 mostra as composições de ácido graxo dos produtos de ST obtidos deste modo. Subprodutos de CyOO e OOO estavam presentes devido à não-especificidade de PS-D, como ilustrado na figura 25. Tabela 1 - Composição de ácido graxo de produtos de triglicerídeos estrutu-rados
Figure img0004
A figura 25 mostra os dados da esterificação em maior escala de 1,3-dicaprilina e éster de vinila de ácido oléico em n-hexano a 60°C pela li-pase imobilizada de um Pseudomonas sp. (PS-D). Composição de acilglice- rol foi analisada por HPLC.
Oleato de vinila (OAVE) permitiu reação muito mais rápida que OA e 1,3-DCy permitiu reação mais rápida que 1,3-DLa, como ilustrado na figura 26. A Figure 26 apresenta os dados da esterificação de 1,3-DG e ácido oléico (C18: 1) ou éster de vinila de ácido oléico (OAVE) em n-hexano a 60°C empregando PS-D. Composição de acilglicerol foi determinada por TLC/FID (Cy = reação com 1,3-dicaprilina, La = reação com 1,3-dilaurina, TG = triglicerídeos, DG = 1,3-diglicerídeos, VE = éster de vinila).
EXEMPLO 8: Ensaios de atividade de protease
O exemplo seguinte descreve ensaios de atividade de protease exemplar para determinar a atividade catalítica de uma protease (por exem-plo, uma enzima da invenção). Estes ensaios exemplares podem ser empre-gados para determinar se um polipeptídeo (por exemplo, uma protease) está dentro do escopo da invenção.
Os ensaios de atividade empregados para proteinases (ativas em proteínas) incluem zimogramas e ensaios de enzima de substrato líqui-do.Três tipos diferentes de zimogramas foram empregados para medir a atividade: caseína, gelatina e zeína. Para os ensaios de enzima de substrato líquido, três tipos principais foram usados: eletroforese de gel, O-ptaldial- deído (OPA), e ensaios de ponto de extremidade fluorescente. Para ambos os ensaios de OPA e eletroforese de gel, quatro substratos diferentes foram usados: zeína, Inibidor de Tripsina de Feijão-soja (SBTI, SIGMA-Aldrich, T6522), lectina de germe de trigo e lectina de feijão-soja. O substrato para o ensaio de ponto de extremidade fluorescente foi gelatina.
Os ensaios de atividade empregados para proteinases e pepti-dases (ativos em peptídeos) empregaram substratos de peptídeo pequeno ligados a pNA. Os ensaios incluíram ensaio de ponto de extremidade de es-pecificidade, ensaios cinéticos de definição unitária e ensaios de pH.
O exemplo seguinte descreve os ensaios de atividade de pro-tease exemplares acima mencionados. Estes ensaios exemplares podem ser empregados para determinar se um polipeptídeo está dentro do escopo da invenção.
Proteína (atividade de proteinase) Ensaios de gel de zimograma de caseína
Géis de zimograma de caseína foram empregados para avaliar a atividade de proteinase. Os ensaios de atividade de protease foram avaliados empregando géis de gradiente a 4 - 16% (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) contendo caseína conjugada a uma tintura azul e embutida dentro da matriz de gel. Todos os géis de zimograma foram processados de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, cada amostra foi misturada com um volume igual de 2x tintura de carregamento e incubada sem aquecimento durante dez minutos antes do carregamento. Após a eletrofo- rese, géis foram incubados em um tampão de renaturação para remover o SDS e permitir que as proteínas recuperem sua forma nativa. Géis foram então transferidos para uma solução de desenvolvimento e incubados a 37°C durante 4 a 24 horas. Se uma protease digerir a caseína no gel, uma zona clara é produzida contra o fundo azul de outra maneira que correspon-de ao local do protease no gel. Os controles negativos (indicados com NC em imagens de gel) foram processados junto com as amostras experimentais em cada experimento e eletroforesados nos zimogramas de caseína próximos a sua(s) protease(s) correspondente(s).
Ao contrário de SDS-PAGE tradicional, amostras não são desna-turadas por calor antes de eletroforese de zimogramas de caseína. Como resultado, às vezes é difícil avaliar com precisão o peso molecular das pro-teases. Por exemplo, Subtilisina A (Sigma, P5380, indicado com Subt.A nas imagens de gel), que foi empregado como um controle positivo nestes expe-rimentos,é predito ser aproximadamente 27 kDa em tamanho. Entretanto, quando eletroforesado por zimogramas de caseína empregando as condi-ções descritas, Subtilisina A apenas migra no gel e só é visível acima de 183 kDa. Por esse motivo, os zimogramas não definem o MW das proteases in-dicadas, mas, de preferência, empregadoa como um indicador de atividade.
Ensaios de zimograma de gelatina
Zimogramas de gelatina, Géis de Zimograma Novex®, foram executados de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Ao contrário dos zimogramas de caseína, zimogramas de gelatina foram pós-manchados seguindo desenvolvimento empregando um Kit de Manchamento Azul Coloidal ou o SIMPLYBLUE™ Safestain, (ambos de Invitrogen). As áreas da atividade de protease surgiram como faixas claras contra um fundo escuro.
Ensaios de Zeína de Milho
Zeína de milho foi usada como substrato para ensaios de ativi-dade de protease, empregando pó, Z-3625 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), e Aquazeína, solução a 10% (Freeman Industries, Tuckahoe, NY). Quando fracionada por um gel de SDS-PAGE, zeína de ambos os fornece- dores produziu faixas de 24 e 22 kDa. As duas faixas de zeína correspon-dem em peso molecular àquelas previamente descritas para alfa-zeína, a subclasse mais abundante de zeínas, que são estimadas para compreender 71 - 84% de zeína total em milho (ver, por exemplo, Consoli (2001) Elec-trophoresis 22 : 2983 - 2989).
Sobrenadantes de cultura liofilizados contendo protease ativa foram re-suspensos, dialisados, e incubados com zeína em 50 mM de KPO4, pH 7,5. Reações foram desempenhadas em um formato de microtítulo de 96 cavidades. Controles de "substrato somente" e "preparação de enzima so-mente" foram processados assim como amostras experimentais. Após 24 horas a 30°C, alíquotas foram removidas e submetidas a OPA, SDS-PAGE, ou análise de Zimograma. Em alguns casos, alíquotas frescas foram removi-das e analisadas após 48 ou 72 horas a 30°C.
Zimograma de zeína: Aquazeína foi adicionada a uma concen-tração final de 0,075% em um gel de poliacrilamida a 10%. Alíquotas de amostras de protease dialisadas foram eletroforesadas através do zimogra- ma de zeína empregando condições padrões. Seguindo a eletroforese, o gel de zimograma foi lavado, incubado em um tampão de renaturação, incubado durante a noite em um tampão de desenvolvimento aperfeiçoado para ativi-dade de protease (contém NaCl, CaCl2, e Brij 35, em tampão Tris pH 8), e manchado com mancha azul Coomassie. SDS-PAGE: Alíquotas de volume igual foram removidas de cada amostra e submetidas a análise de SDS-PAGE. Seguindo a eletroforese, proteínas nos géis foram manchadas com SYPRO Laranja (Molecular Pro-bes) e visualizadas empregando transiluminação de UV. OPA: Na presença de Beta-mercaptoetanol (BME), OPA reage com extremidades de amino livres para produzir um imidazol fluorescente que pode ser detectado empregando um leitor de placa de fluorescência pa-drão. Neste ensaio, alíquotas de volume igual foram removidas de cada amostra e colocadas em uma placa de fluorescência preta. Amostras foram diluídas e então diluídas 1: 10 em reagentes de OPA. Fluorescência (Ex = 340 nm, Em = 450 nm) foi determinada após uma incubação de 5 minutos.
Ensaios de Inibidor de Tripsina de Feijão-soja
Inibidor de Tripsina de Feijão-soja (SBTI, SIGMA-Aldrich, T6522) foi usado como um substrato para atividade de protease. Sobrenadantes de cultura liofilizados que contêm protease ativa foram re-suspendidos, dialisa- dos, e incubados com SBTI (1 mg/ml de conc. final) a 37°C em 50 mM de KPO4, pH 7,5. Controles de preparação de enzima somente e substrato so-mente foram processados junto com amostras experimentais. Após 24 horas, alíquotas foram removidas e submetidas a OPA e análise de SDS- PAGE. SDS-PAGE: para SBTI, seguindo a eletroforese, proteínas nos géis foram manchadas com azul Coomassie.
Ensaios de Lectina de Germe de Trigo
Lectina de germe de trigo (WGA, EY Laboratories, L-2101, Puro) foi usada como um substrato para atividade de protease. Sobrenadantes de cultura liofilizados que contêm protease ativa foram re-suspendidos, dialisa- dos, e incubados com WGA (1 mg/ml de concentração final) a 37°C em 50 mM de KPO4, pH 7,5. Controles de preparação de enzima somente e subs-trato somente foram processados junto com amostras experimentais. Após 24 horas, alíquotas foram removidas e submetidas a análise de SDS-PAGE e OPA. SDS-PAGE: para WGA, seguindo eletroforese, proteínas nos géis fo-ram manchadas com Coomassie azul.
Ensaios de lectina de feijão-soja
Lectina de feijão-soja (SBA, EY Laboratories, L-1300, Cru) foi usada como um substrato para atividade de protease. Sobrenadantes de cultura liofilizados que contêm protease ativa foram re-suspendidos, dialisa- dos, e incubados com SBA (concentração final de 1 mg/ml) a 37°C em 50 mM de KPO4, pH 7,5. Controles de preparação de enzima somente e subs-trato somente foram processados junto com amostras experimentais. Após 24 horas, alíquotas foram removidas e submetidas a análise de SDS-PAGE e OPA. SDS-PAGE: para SBA, seguindo eletroforese, proteínas nos géis foram manchadas com Coomassie azul.
Gelatina em ensaio de ponto de extremidade líquida fluorescente
Gelatina de DQ (Molecular Probes, conjugado de fluoresceína, D-12054) foi empregada para avaliar a atividade proteolítica das proteases da invenção. Gelatina de DQ é uma proteína que é assim etiquetada pesa-damente com um fluoroforo que sua fluorescência é dissipada quando a mo-lécula está intacta. Proteases que clivam o substrato liberarão os fluoroforos de dissipação interna e fluorescência aumentará em proporção à atividade de protease. Gelatina de DQ foi diluída a uma concentração final de 25 ug/ml em 100 ul de reações contendo um tampão adequado tal como tampão de desenvolvimento de zimograma (Invitrogen) e quantidades variadas de pre-parações de protease. As reações foram incubadas em uma placa de micro- título de fundo plano clara de 384 cavidades a 37°C durante vários períodos de tempo de 1 h até toda uma noite. Fluorescência foi monitorada empre-gando um leitor de placa de fluorescência após incubação a 37°C durante vários tempos.
EXEMPLO 9: Simulação de Desengomação mediada por PLC
Este exemplo descreve um emprego exemplar de uma hidrolase da invenção, uma fosfolipase da invenção, compreendendo a simulação de desengomação mediada por fosfolipase C (PLC).
Devido a sua solubilidade pobre em água, fosfatidilcolina (PC) foi dissolvida originalmente em etanol (100 mg/ml). Para teste inicial, uma solução de matéria-prima de PC em 50 mM de ácido 3-morfolinopropanosulfólico ou 60 mM de ácido cítrico/NaOH a pH 6 foi preparada. A solução de matéria- prima de PC (10 μl, 1 μg/μl) foi adicionada a 500 μl de óleo de feijão-soja refinado (2% de água) em um tubo de Eppendorf. Para gerar uma emulsão, o conteúdo do tubo foi misturado durante 3 min através de vortexação. A fase de óleo e a de água foram separadas através de centrifugação durante 1 min a 13.000 rpm. Os tubos de reação foram pré-incubados à temperatura desejada (37°C, 50°C, ou 60°C) e 3 μl de PLC de Bacillus cereus (0,9 U/μl) foram adicionados à fase de água. O desaparecimento de PC foi analisado por TLC empregando clorofórmio/metanol/água (65: 25: 4) como um sistema de solvente (ver, por exemplo, Taguchi (1975) supra) e foi visualizado após exposição a vapor de I2. As fases de óleo e água são separadas após a cen-trifugaçãoe PLC é adicionado à fase de água, que contém os fosfatídeos precipitados ("gomas"). A hidrólise de PLC ocorre na fase de água. O curso de tempo da reação é monitorado retirando-se alíquotas da fase de água e analisando-as por TLC.
EXEMPLO 10: Expressão de Hidrolases (por exemplo, Fosfolipases) da Invenção
Este exemplo descreve a construção de um grupo de produção comercial da invenção que pode expressar múltiplas hidrolases da invenção, por exemplo, enzimas de fosfolipase da invenção. A fim de produzir uma formulação de multi-enzima adequada para emprego na desengomação de óleos vegetais de grau de comida (incluindo feijão-soja, canola, e girassol), um grupo de expressão recombinante pode ser gerado para que expresse duas hidrolases diferentes da invenção, por exemplo, enzimas de fosfolipase da invenção, no mesmo hospedeiro de expressão. Por exemplo, este grupo pode ser construído para conter uma ou mais cópias de um gene de hidro- lase (por exemplo, um PLC) e uma ou mais cópias de outro gene de hidro- lase (por exemplo, um gene de fosfatidilinositol-PLC). Estes genes podem existir em um plasmídeo, múltiplos plasmídeos, ou os genes podem ser inseridos no genoma do hospedeiro de expressão através de recombinação homóloga. Quando os genes são introduzidos através de recombinação homóloga, os genes podem ser introduzidos em um sítio único no genoma do hospedeiro como um cassete de expressão de DNA que contém uma ou mais cópias de ambos os genes. Alternativamente, uma ou mais cópias de cada gene podem ser introduzidas em sítios distintos no cromossomo do hospedeiro. A expressão destas duas seqüências de gene poderia ser dirigida por um tipo de promotor ou cada seqüência de gene pode ser dirigida por um promotor independente. Dependendo do número de cópias de cada gene e o tipo de promotor, o grupo final expressará relações variadas de cada tipo de enzima ativa. Os grupos de expressão podem ser construídos empregando qualquer Streptomyces ou Bacillus, Bacillus cereus, E. coli, S. pombe, P. pastoris, ou outros sistemas gram-negativos, gram-positivos, ou de expres- são de levedura.
Em um aspecto, a invenção fornece um sistema de duas enzi-mas para desengomação de óleo de feijão-soja, em que pelo menos uma enzima é uma enzima de hidrolase da invenção. PLC mais PI-PLC produz 5 mais DAG que qualquer enzima sozinha. Entretanto, ambas as enzimas produzem mais DAG que uma amostra de controle de não enzima. Em um aspecto,condições de reação compreendem 1 mililitro de óleo de feijão-soja, ~0,4% de umidade inicial, 50°C, ácido cítrico a 0,2% neutralizado com 2,75 M de NaOH, 10U de PLC, 15μL de PI-PLC (0,45 mg de proteína total), tem- po de reação total de 1 hora. A figura 31 ilustra uma tabela que resume os dados deste sistema de desengomação de duas enzimas da invenção.
Em outro aspecto, uma enzima PI-PLC da invenção pode ser empregada sob as mesmas condições descritas para PLC. Estas incluem refinamento químico de óleos vegetais e desengomação de água de óleos 15 vegetais.
Várias modalidades da invenção foram descritas. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem afastamento do espírito e escopo da invenção. Desta maneira, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims (8)

1. Ácido nucléico recombinante caracterizadopelo fato de que consiste em uma sequência de ácido nucléico tal como estabelecida na SEQ ID NO: 923, onde o ácido nucléico codifica pelo menos 1 polipeptídeo tendo uma atividade de lipase, em que o referido polipeptídeo tem uma sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 924.
2. Célula transformada caracterizadapelo fato de que compreende um ácido nucléico compreendendo uma sequência como definida na reivindicação 1, em que a célula é uma célula bacteriana, uma célula fúngica ou uma célula de levedura.
3. Polipeptídeo recombinante caracterizadopelo fato de que tem uma atividade lipase e tem a sequência tal como estabelecida na SEQ ID NO: 924.
4. Método de modificação de gordura ou óleo, caracterizadopelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer uma lipase como definida na reivindicação 3; (b) fornecer um óleo ou gordura, e (c) contactar a lipase da etapa (a) com o óleo ou gordura da etapa (b) sob condições onde a lipase possa modificar o óleo ou gordura.
5. Método de hidrólise de ésteres de ácido graxo poliinsaturado (PUFA), caracteri zadopelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer uma lipase como definida na reivindicação 3; (b) fornecer uma composição compreendendo um éster de ácido graxo poliinsaturado; e (c) contactar a lipase com a composição da etapa (b) sob condições onde a lipase possa hidrolisar o éster de ácido graxo poliinsaturado (PUFA).
6. Composição caracterizadapelo fato de que compreende um polipeptídeo como definido na reivindicação 3, ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico como definido na reivindicação 1, em que a composição é uma matriz de liberação de enzima comestível, uma composição detergente, um produto alimentício ou alimento, um suplemento alimentar, uma composição dietética, uma composição farmacêutica, um tecido, fio ou fibra, ou um óleo.
7. Método de preparação de aditivo para alimento ou para produto alimentício compreendendo ácidos graxos poliinsaturados (PUFA), caracterizadopelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) fornecer uma lipase como definida na reivindicação 3, onde a lipase hidrolisa ésteres de ácido graxo poliinsaturado (PUFA); (b) fornecer uma composição compreendendo um éster de PUFA; e (c) contactar o polipeptídeo da etapa (a) com a composição da etapa (b) sob condições onde o polipeptídeo possa seletivamente catalisar a hidrólise de ésteres de ácido graxo poliinsaturado desse modo produzindo aditivo para produto alimentício ou alimento contendo PUFA.
8. Método de redução do teor de gordura em composições de dieta com base em vegetais ou leite caracterizadopelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) fornecer uma composição compreendendo uma lipase como definida na reivindicação 3; (b) fornecer uma composição compreendendo leite ou óleo vegetal, e (c) tratar a composição da etapa (b) com a lipase sob condições onde a lipase possa hidrolisar o óleo ou gordura na composição, desse modo reduzindo seu teor de gordura.
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