BRPI0513438A2

BRPI0513438A2 - método enzimático para degomagem de óleo

Info

Publication number: BRPI0513438A2
Application number: BRPI0513438-2A
Authority: BR
Inventors: Soe Jorn Borch; Mark Turner
Original assignee: Danisco
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2011-01-04
Also published as: CN101052702B; WO2006008508A1; EP2275522A2; PL1776455T3; EP2275522A3; US20110086131A1; CN102876739A; EP1791933B1; AU2005263954A1; PT1791933E; US8535900B2; CN102533440A; JP5604032B2; CN102154391B; CN102533440B; AU2010214721B2; US20080131936A1; US8927036B2; JP2008506381A; MX2007000626A

Abstract

MéTODO ENZIMáTICO PARA DEGOMAQEM DE óLEO. Um processo de degomagem enzimática de óleos comestíveis compreendendo tratar o óleo comestível com uma lipídio aciltransferase a fim de transferir um grupo acil de uma parte principal do fosfolipídio para um ou mais aceptores de acil, em que o aceptor de acil pode ser qualquer composto compreendendo um grupo hidroxi. Preferivelmente, em uma modalidade, o aceptor de acil é água e preferivelmente em outra modalidade o aceptor de acil é um ou mais esteróis e/ou estanóia. Quando o aceptor de acil é um estanol e/ou esterol são produzidos um ou mais ésteres de esterol e/ou ésteres de estanol. A lipídio aciltransferase para uso no processo da presente invenção pode compreender uma ou mais das seguintes seqüências de aminoácidos: SEQ ID N<0>. 1, SEQ ID N<0>. 3, SEQ ID N<0>. 4, SEQ ID N<0>. 5, SEQ ID N<0>. 6, SEQ ID N<0>. 7, SEO ID N<0>. 8, SEQ ID N<0>. 9, SEQ ID N<0>. 10, SEQ ID N<0>. 11, SEQ ID N<0>. 12, SEQ ID N<0>. 13, SEQ ID N<0>. 14, ou SEQ ID N<0>. 15, SEQ ID N<0>. 16, SEQ ID N<0>. 17, SEQ ID N<0>. 18, SEQ ID N<0>. 36, SEQ ID N<0>. 38, SEQ ID N<0>. 40, SEQ ID N<0>. 41, SEQ ID N<0> 45, SEQ ID N<0>. 47, SEQ ID N<0> 50 ou uma seqüência de aminoácidos que tem 75 % ou mais de identidade com essas. Uma lipídio aciltransferase nova compreendendo um seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID N<0>16 é também ensinado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "MÉTODOENZIMÁTICO PARA DEGOMAGEM DE ÓLEO".

REFERÊNCIA A DEPÓSITOS RELACIONADOS

É feita referência aos seguintes depósitosrelacionados: Número de Série do Depósito nos Estadosunidos 09/750,990 depositado no dia 20 de julho de 1999,Número de Série do Depósito nos Estados unidos 10/409,391,W02 004/064 537, W02004/064987, PCT/IB2004/004378 ePCT/IB2004/004374. Cada um destes depósitos e cada dosdocumentos citados em cada um destes depósitos ("documentoscitados nos depósitos"), e cada documento referido oumencionado nos documentos citados nos depósitos, ou notexto ou durante o prosseguimento desses depósitos, comotambém todos os argumentos em defesa de patenteabilidadelevado adiante durante tal prosseguimento, está por estemeio incorporado aqui através de referência. Também sãocitados vários documentos neste texto ("documentos aquicitados") . Cada um dos documentos aqui citados, e cadadocumento citado ou referido nos documentos aqui citados,estão por este meio incorporados aqui através de referência

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método paradegomagem enzimática óleos comestíveis usando uma lipídioaciltransferase.A presente invenção se refere adicionalmente a um oumais lipidio aciltransferase.

A presente invenção ainda adicionalmente se refere aouso de uma lipidio aciltransferase para a degomagem deóleos comestíveis.

ANTECENDENTES TÉCNICOS

Tradicionalmente, dois processos têm sido usados paradegomagem de óleo, que são os processos de degomagem físicae de degomagem química. Nos anos 90, o processo dedegomagem enzimática foi desenvolvido baseado no uso defosfolipase pancreática. Porque esta enzima era não limpa,que o fosfolipase foi substituído eventualmente por umafosfolipase microbiana o Al (Lecitase Ultra™ - Novozymes,Dinamarca). 0 processo enzimático tem várias vantagens emrelação ao processo de degomagem químico ou ao processo dedegomagem física incluindo menor custo, rendimento maisalto e um processo mais amigável ambientalmente.

ASPECTOS SUMÁRIOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção provê um métodopara a degomagem enzimática de óleos vegetais ou óleoscomestíveis usando uma lipidio aciltransferase comodefinido aqui.

A presente invenção também provê um processo dedegomagem enzimática de óleos vegetais ou comestíveis,incluindo tratar o óleo comestível ou vegetal com uma aciltransferase de lipídio de acordo com a presente invençãopara remover a maior parte de fosfolipídio.

A presente invenção também provê um processo dedegomagem enzimática de óleos comestíveis ou vegetais,compreendendo o tratamento do óleo comestível ou vegetalcom uma acil transferase de lipídio de acordo com apresente invenção para transferir um grupo acil de umaparte principal do fosfolipídio para um ou mais aceptoresde acil, por exemplo, para um ou mais esteróis e/ouestanóis.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um ou maislipídio aciltransferase.

Em um aspecto, a presente invenção provê uma lipídioaciltransferase compreendendo a seqüência de aminoácidosmostrado como SEQ ID No. 16.

Em outro aspecto, a presente invenção provê umalipídio aciltransferase compreendendo a seqüência deaminoácidos mostrado como SEQ ID No. 16, ou uma seqüênciade aminoácidos que tem 75 % ou mais, preferivelmente 85 %ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais, até mesmo maispreferivelmente 95 % ou mais, até mesmo maispref erivelmente 98 % ou mais, ou até mesmo maispreferivelmente 99 % ou mais de identidade à SEQ ID No. 16.Em um aspecto ainda adicional, a presente invençãoprovê o uso de uma lipídio aciltransferase na degomagem deóleos comestíveis (i) para remover fosfolipídio (comofosfatidilcolina) e/ou (ii) para aumentar a formação deéster de esterol e/ou éster de estanol no óleo e/ou (iii)para remover fosfolipídio (como fosfatidilcolina) e/ou paraaumentar a formação de éster de esterol e/ou éster deestanol no óleo sem aumentar significativamente os ácidosgraxos livres no óleo.

ASPECTOS PREFERÍVEIS

A lipídio aciltransferase para uso na presenteinvenção podem ser uma lipídio aciltransferase natural oupodem ser uma lipídio aciltransferase variante.

Por exemplo, a lipídio aciltransferase para uso nométodo e usos da presente invenção podem ser uma comodescrita em W02004/064537 ou W02004/064987, ouPCT/IB2 004/0043 78 ou GB0513859.9, por exemplo.

O termo "lipídio aciltransferase" como usado aquisignifica uma enzima que tem atividade de aciltransferase(geralmente classificada como E.C. 2.3.1.x), por meio deque a enzima é capaz de transferir um grupo acil de umlipídio para um ou mais substratos aceptores, como um oumais do seguinte: um esterol; um estanol; um carboidrato;uma proteína; uma subunidade de proteína; glicerolpreferivelmente um esterol e/ou um estanol.

Preferivelmente, a lipídio aciltransferase de acordocom a presente invenção ou para uso nos métodos e/ou usosda presente invenção são capazes de transferir um grupoacil de um lipídio (como definido aqui) para um ou mais dossubstratos aceptores de acil seguintes: um esterol ou umestanol, preferivelmente um esterol.

Para alguns aspectos o "aceptor de acil" de acordo coma presente invenção pode ser qualquer composto quecompreende um grupo de hidroxi (-OH), como por exemplo,ãlcoóis polivalentes, incluindo glicerol; esteróis;estanóis; carboidratos; ácidos hidroxi incluindo ácidos defruta, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico eácido ascórbico; proteínas ou uma subunidade das mesmas,como aminoácidos, hidrosilados de proteína e peptídeos (emproteína parcialmente hidrosilada) , por exemplo; e misturase derivativo dos mesmos. Preferivelmente, o "aceptor deacil" de acordo com a presente invenção não é água.

O aceptor de acil não é pref erivelmente ummonoglicerídeo.

Em um aspecto, a lipídio aciltransferase de acordo coma presente invenção ou para uso nos métodos e/ou usos dapresente invenção podem, contanto que também sejam capazesde transferir um grupo acil de um lipídio para um esterole/ou um estanol, adicionalmente ser capazes de transferir ogrupo acil de um lipídio a um ou mais dos seguintes: umcarboidrato, uma proteína, uma subunidade de proteína,glicerol.

Preferivelmente, o substrato de lipídio no qual alipídio aciltransferase de acordo com os atos da presenteinvenção é um ou mais dos lipídios seguintes: umfosfolipídio, como uma lecitina, por exemplo,fosfatidilcolina.

Este substrato de lipídio pode se referir aqui como o"doador de lipídio acil". 0 termo lecitina como usado aquiabrange fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,fosfatidilinositol, fosfatidilserina e fosfatidilglicerol.

Para alguns aspectos, preferivelmente o substrato delipídio no qual a lipídio aciltransferase de acordo com apresente invenção ou para uso no método e/ou usos dapresente invenção atuam como um fosfolipídio, tal comolecitina, por exemplo, fosfatidilcolina.

Para alguns aspectos, preferivelmente a lipídioaciltransferase de acordo com a presente invenção ou parauso no método e/ou usos da presente invenção é incapaz, ousubstancialmente incapaz, de agir em um triglicerídeo e/ouum 1-monoglicerídeo e/ou 2-monoglicerídeo.

Adequadamente, a lipídio aciltransferase de acordo coma presente invenção ou para uso no método e/ou usos dapresente invenção podem exibir um ou mais das atividades defosfolipase seguintes: atividade de fosfolipase A2 (E.C.3.1.1.4) ou atividade de fosfolipase Al (E.C. 3.1.1.32).

Adequadamente, para alguns aspectos a lipídioaciltransferase de acordo com a presente invenção ou parauso no método e/ou usos da presente invenção podem sercapazes de transferir um grupo acil de um fosfolipídio paraum esterol e/ou um estanol.

Para alguns aspectos, preferivelmente a lipídioaciltransferase de acordo com a presente invenção ou parauso em métodos e/ou usos da presente invenção são capazesde transferir um grupo acil de um fosfolipídio para umesterol e/ou um estanol para formar pelo menos um éster deesterol e/ou um éster de estanol.

Para alguns aspectos, preferivelmente a lipídioaciltransferase de acordo com a presente invenção ou parauso no método e/ou usos da presente invenção não exibeatividade de lipase de triacilglicerol (E.C. 3.1.1.3) ounão exibe atividade de lipase de triacilglicerolsignificante (E.C. 3.1.1.3).

A lipídio aciltransferase de acordo com a presenteinvenção ou para uso no método e/ou usos da presenteinvenção pode ser capaz de transferir um grupo acil de umlipídio para um esterol e/ou um estanol. Desta forma, emuma modalidade o "aceptor de acil" de acordo com a presenteinvenção pode ser ou um esterol ou um estanol ou umacombinação de um esterol e um estanol.

Preferivelmente, a enzima de lipídio aciltransferasede acordo com a presente invenção ou para uso em métodos eusos da presente invenção pode ser caracterizado usando oscritérios seguintes:

(i) a enzima possui atividade de acil transferaseque pode ser definida como atividade detransferência de éster por meio de que aparte acil de uma ligação do éster originalde um doador de lipídio acil é transferido aum aceptor de acil para formar um éster novo;e

(ii) a enzima compreende o motivo de seqüência deaminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dosresíduos de aminoácidos seguintes L, A, V, I,F, Υ, H, Q, Τ, Ν, M OU S.

Preferivelmente, X do motivo GDSX é L ou Y. Maispref erivelmente, X do motivo GDSX é o L. Desta forma,preferivelmente a enzima de acordo com a presente invençãocompreende o motivo de seqüência de aminoácidos GDSL.

0 motivo GDSX é compreendido de quatro aminoácidosconservados. Preferivelmente, a serina dentro do motivo éuma serina catalitica da enzima de lipídio aciltransferase.Adequadamente, a serina do motivo GDSX pode estar em umaposição que corresponde a Ser-16 em enzima lipolítica deAeromonas hydrophila mostrada em Brumlik & Buckley (Journalof Bacteriology, abril 1996, Vol. 178, No. 7, ρ 2060-2064).

Para determinar se uma proteína tem o motivo GDSX deacordo com a presente invenção, a seqüência é comparadapreferivelmente com os perfis de modelo de markovescondidos (perfil HMM - do inglês Hidden Markov Model) dobanco de dados de pfam de acordo com os procedimentosensinados em W02004/064537 ou W02004/064987.

Pfam é um banco de dados de famílias de domínio deproteína. Pfam contém múltiplas seqüências de alinhamentocuradas para cada família como também perfis de modelo demarkov escondidos (perfil HMM) para identificar estesdomínios em seqüências novas. Uma introdução para Pfam podeser achada em Bateman A et al (2002) Nucleic Acids Res. 30;276-280. Modelos de Markov escondidos são usados em váriosbancos de dados que objetivam a classificar proteínas, pararevisão veja Bateman A e Haft DH (2002) Brief Bioinform 3;236-245.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =12230032& dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids = 11752314& dopt=Abstract

Para uma explicação detalhada de modelos de Markovescondido e como eles são aplicados no banco de dados dePfam veja Durbin R, Eddy S, e Krogh A (1998) Biologicalsequence analysis; probabilistic models of proteins andnucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. 0 pacote de software Hammer pode ser obtido daUniversidade de Washington, St Louis, USA.

Alternativamente, o motivo GDSX usando o pacote desoftware de Hammer pode ser identificado, as instruções sãoprovidas em Durbin R, Eddy S, e Krogh A (1998) Biologicalsequence analysis; probabilistic models of proteins andnucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521 -62 041-4 e as referências nesta, e o perfil HMMER2 providodentro deste relatório.

O banco de dados de PFAM pode ser acessado, porexemplo, por vários servidores que ficam atualmentesituados nos seguintes sites da Web.http://www.sanger.ac-uk/Software/Pfam/index.shtmlhttp://pfam.wustl.edu/http://pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.cgb.ki.se/

O banco de dados oferece uma facilidade de procuraonde a pessoa pode entrar em uma seqüência de proteína.Usando os parâmetros padrões do banco de dados a seqüênciade proteína será analisado então para a presença dedomínios de Pfam. 0 domínio GDSX é um domínio estabelecidono banco de dados e como tal sua presença em qualquerseqüência de questão será reconhecida. 0 banco de dadosdevolverá o alinhamento da seqüência consenso PfamO0657 àseqüência de questão.

Preferivelmente, a enzima lipídio aciltransferase parauso em métodos e usos da invenção pode ser alinhada usandoa seqüência consenso Pfam00657 (para uma explicaçãocompleta veja W02004/064537 ou W02004/064987).

Preferivelmente, uma combinação positiva com o perfilde modelo de markov escondido (perfil HMM) da família dedomínio de pfam00657 indica a presença do domínio GDSL ouGDSX de acordo com a presente invenção.

Preferivelmente, quando alinhado com a seqüênciaconsenso Pfam00657 a lipídio aciltransferase para uso nosmétodos ou usos da invenção podem ter um, preferivelmentemais que um, pelo menos pref erivelmente mais que dois, doseguinte, um bloco de GDSx, um bloco GANDY, um bloco de HPTAdequadamente, a lipídio aciltransferase podem ter um blocoGDSx e um bloco GANDY. Alternativamente, a enzima pode terum bloco de GDSx e um bloco HPT. Pref erivelmente, a enzimacompreende um bloco de GDSx pelo menos.

Preferivelmente, são selecionados resíduos do motivoGANDY, GGNDA, GGNDL, preferivelmente GANDY.

Preferivelmente, quando alinhado com a seqüênciaconsenso Pfam00657 a enzima para uso nos métodos ou usos dainvenção tem um pelo menos, pref erivelmente mais que um,preferivelmente mais que dois, preferivelmente mais quetrês, preferivelmente mais que quatro, preferivelmente maisque cinco, preferivelmente mais que seis, preferivelmentemais que sete, pref erivelmente mais que oito,preferivelmente mais que nove, preferivelmente mais que dez,preferivelmente mais que onze, preferivelmente mais quedoze, preferivelmente mais que treze, preferivelmente maisque quatorze, dos resíduos de aminoácidos seguintes quandocomparado â referência seqüência de polipeptídeo de A.hydroph i lia, isto é SEQ ID No. 1: 28hid, 29hid, 30hid,31hid, 32gly, 33 Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131GIy, 132Hid,133Asn, 134Asp, 135hid, 309HÍS.

O domínio GDSX de pfam00657 é um identificador semigual que distingue proteínas que possuem este domínio deoutras enzimas.

A seqüência consenso de pfam00657 é apresentada naFigura 12 como SEQ ID No. 2. Isto é derivado daidentificação da família pfam 00657, banco de dados versão6 que também pode ser aqui referido como pfam00657.6.

A seqüência consenso pode ser atualizada usandolançamentos adicionais do banco de dados de pfam (porexemplo, veja W02004/064537 ou W02004/064987).

A presença dos blocos GDSx, GANDY e HPT são achados nopfam família 00657 de ambos os lançamentos do banco dedados. Podem ser usados lançamentos futuros do banco dedados de pfam para identificar o pfam família 00657.

Em uma modalidade, a enzima de lipídio aciltransferasepara uso em métodos e usos da presente invenção pode sercaracterizada usando os critérios seguintes:

(i) a enzima possui atividade de acil transferase quepode ser definida como atividade de transferênciade és ter por meio de que a parte acil de umaligação de éster original de um doador de lipídioacil é transferido a aceptor de acil para formarum éster novo;

(ii) a enzima compreende o motivo de seqüência deaminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dosresíduos de aminoácidos seguintes L, A, V, I, F,Υ, H, Q, Τ, Ν, M OU S. ;

(iii) a enzima compreende His-309 ou compreende umresíduo de histidina a uma posição quecorresponde His-309 na enzima lipídioaciltransferase de Aeromonas hydrophila mostradanas Figuras 11 e 13 (SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No.3).

Preferivelmente, o resíduo de aminoácido do motivoGDSX é o L.

Em SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1 os primeiros 18resíduos de aminoácidos formam uma seqüência sinal. His-309da seqüência de comprimento completa que é a proteínaincluindo a seqüência sinal compara His-291 da parte madurada proteína, isto é, a seqüência sem a seqüência sinal.

Em uma modalidade, a enzima de lipídio aciltransferasepara uso em métodos e usos da presente invenção compreendea tríade catalítica seguinte: Ser-34, Asp-134 e o His-309ou compreende um resíduo de serina, um resíduo de ácidoaspártico e um resíduo de histidina, respectivamente, aposições que correspondem a Ser-34, Asp-134 e His-309 naenzima lipídio aciltransferase de Aeromonas hydrophilamostrada na Figura 13 (SEQ ID No. 3) ou Figura 11 (SEQ IDNo. 1). Como declarado acima, na seqüência mostrada em SEQID No. 3 ou SEQ ID No. 1 os primeiros 18 resíduos deaminoácidos formam uma seqüência sinal. Ser-34, Asp-134 eHis-309 da seqüência de comprimento completa que é aproteína incluindo a seqüência sinal comparada a Ser-16,Asp-116 e His-291 da parte madura da proteína, isto é aseqüência sem a seqüência sinal. Na seqüência de consensosde pfam00657, como determinado na Figura 12 (SEQ ID No. 2)os resíduos de local ativos correspondem a Ser-7, Asp-157 eHis-348.

(i) a enzima possui atividade de acil transferase quepode ser definida como atividade de transferênciade éster por meio de que a parte acil de umaligação de éster original de um primeiro doadorde lipídio acil é transferido a aceptor de acilpara formar um éster novo; e

(ii) a enzima compreende pelo menos Gly-32, Asp-33,Ser-34, Asp-134 e His-309 ou compreende glicina,ácido aspártico, serina, ácido aspártico eresíduos de histidina a posições que correspondema Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 e His-309,respectivamente, na enzima lipídioaciltransferase de Aeromonas hydrophila mostradana Figura 13 (SEQ ID No. 3) ou Figura 11 (SEQ IDNo.1).

Adequadamente, a enzima de lipídio aciltransferasepara uso em métodos e usos de presente invenção compreendeuma ou mais das seguintes seqüências de aminoácidos:

(i) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.3(veja Figura 13)

(ii) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 4 (veja Figura 14)

(iii) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.5 (veja Figura 15)

(iv) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.6 (veja Figura 16)

(v) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.7 (veja Figura 17)

(vi) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.8 (veja Figura 18)

(vii) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.9 (Figura 19)

(viii) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.10(Figura 20)

(ix) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 11 (Figura 21)

(x) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.12 (Figura 22)

(xi) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.13 (Figura 23)

(xii) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.14 (Figura 24)

(xiii) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.1 (Figura 11)

(xiv) a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No.15 (Figura 25) ou uma seqüência de aminoácidos quetem 7 5 % ou mais de identidade com qualquer umadas seqüências mostrada como SEQ ID No. 1, SEQ IDNo. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ IDNo. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No.13, SEQ ID No. 14, OU SEQ ID No. 15.

Adequadamente, a enzima de lipídio aciltransferasepara uso em métodos e usos da presente invenção oucompreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ IDNo. 3 OU como SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 1 OU SEQ ID No. 15ou compreende uma seqüência de aminoácidos que tem 75 % oumais, preferivelmente 80 % ou mais, preferivelmente 85 % oumais, preferivelmente 90 % ou mais, preferivelmente 95 % oumais, de identidade com a seqüência de aminoácidos mostradacomo SEQ ID No. 3 ou a seqüência de aminoácidos mostradacomo SEQ ID No. 4 ou a seqüência de aminoácidos mostradacomo SEQ ID No. 1 ou a seqüência de aminoácidos mostradacomo SEQ ID No. 15.

Adequadamente a enzima de lipídio aciltransferase parauso em métodos e usos da presente invenção compreende umaseqüência de aminoácidos que tem 8 0 % ou mais,preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % oumais e até mesmo mais preferivelmente 95 % ou mais deidentidade com qualquer uma das seqüências mostrado comoSEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ IDNo. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ IDNO. 1, OU SEQ ID No. 15.

Adequadamente, a enzima de lipídio aciltransferasepara uso em métodos e usos da presente invenção compreendeuma ou mais das seguintes seqüências de aminoácidos:

(a) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácido resíduos 1-100 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1;

(b) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácidos resíduos 101-200 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No.1;

(c) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácido resíduos 201-300 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No.1; ou

(d) uma seqüência de aminoácidos que tem 75 % ou mais,preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % oumais, até mesmo mais preferivelmente 95 % ou mais deidentidade para qualquer uma das seqüências de aminoácidosdefinido dentro (a) - (c) acima.

(a) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácido resíduos 28-39 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1;

(b) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácidos resíduos 77-88 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 1;

(c) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácido resíduos 126-136 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No.1;

(d) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácido resíduos 163-175 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No.1;

(e) uma seqüência de aminoácidos mostrada comoaminoácido resíduos 304-311 de SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No.1; ou

(f) uma seqüência de aminoácidos que tem 75 % ou mais,preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % oumais, até mesmo mais preferivelmente 95 % ou mais deidentidade para qualquer uma das seqüências de aminoácidosdefinido dentro (a) - (e) acima.

Em um aspecto, a lipídio aciltransf erase para uso nométodo e usos da presente invenção pode ser a lipídioaciltransferase de Cândida parapsilosis como ensinado em EP1 275 711. Desta forma, em um aspecto a lipídioaciltransf erase para uso no método e usos da presenteinvenção pode ser uma lipídio aciltransferase quecompreendem uma das seqüências de aminoácidos ensinados emSEQ ID No. 17 (Figura 28) ou SEQ ID No. 18 (Figura 29).

Muito de preferência, a lipídio aciltransferase parauso no método e usos da presente invenção pode ser umalipídio aciltransferase que compreende a seqüência deaminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16 (Figura 10), ou umaseqüência de aminoácidos que tem 75 % ou mais,preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % oumais, até mesmo mais pref erivelmente 95 % ou mais, atémesmo mais preferivelmente 98 % ou mais, ou até mesmo maispreferivelmente 99 % ou mais de identidade para SEQ ID No.16. Esta enzima poderia ser considerada uma enzima variante

Em um aspecto, a lipídio aciltransferase para uso nosmétodos e usos da presente invenção podem ser umlecitina:aciltransferase de colesterol (LCAT) ou varianteda mesma (por exemplo, uma variante feita por evoluçãomolecular).

LCATs satisfatórios são conhecidos na arte e podem seralcançáveis de um ou mais dos organismos seguintes porexemplo: mamíferos, rato, camundongos, galinhas, Drosophilamelanogaster, plantas, incluindo Arabidopsis e Oryza sativa,nematódeos, fungos e levedura.

Em uma modalidade, a enzima de lipidio aciltransferasepara uso nos métodos e usos da presente invenção pode ser alipidio aciltransferase obtenível, preferivelmente obtida,da cepa de E. coli TOP 10 harbouring pPetl2aAhydro epPetl2aASalmo depositado por Danisco A/S de Langebrogade 1,DK- 1001 Copenhagen K, Dinamarca sob o Tratado de Budapesteno Reconhecimento Internacional do Depósito deMicrorganismos com a finalidade de Procedimento Patente àColeção Nacional de Industrial, Marinho e Bactérias deComida (NCIMB - do inglês National Collection of Industrial,Marine and Food Bactéria) 23 St. Machar Street, AberdeenScotland, GB no dia 22 de dezembro de 2003 sob os númerosde acesso NICMB 41204 e NCMB 41205, respectivamente.

As lipidio aciltransferase altamente preferidas parauso nos métodos da invenção compreende aquelas isoladss deAeromonas spp., preferivelmente Aeromonas hydrophila ou A.salmonicida, mais preferível A. salmonicida. A lipidioaciltransferase mais preferida para uso na presenteinvenção é codificado pela SEQ ID No.s 1, 3, 4, 15, 16.Será reconhecido pela pessoa qualificada que é preferívelque os peptídeos sinais da aciltransferase foram clivadosdurante expressão da transferase. 0 peptídeo sinal de SEQID 1, 3, 4, 15 e 16 são aminoácidos 1 - 18. Então asregiões mais prefaridas são aminoácidos 19-335 para a SEQID No. Ie SEQ ID No. 3 (A. hydrophilia) e aminoácidos 19-33 6 para SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 15 e SEQ ID No. 16. {A.salmonicida). Quando usado para determinar a homologia deidentidade das seqüências de aminoácidos, é preferido queos alinhamentos como aqui descritos usam a seqüência maduraEntão as regiões mais preferidas para determinar ahomologia (identidade) são os aminoácidos 19-335 para SEQID No. 1 e 3 (A. hydrophilia) e aminoácidos 19-336 para SEQID No. s 4, 15 e 16. (A. salmonicida). SEQ ID 34 e 35 sãoseqüências de proteína maduras das altamente preferidaslipídio acil transferase de A. hydrophilia e A. salmonicidarespectivamente.

Uma lipídio acil transferase para uso na invençãotambém pode ser isolado de Thermobifida, preferivelmente T.fusca, mais preferivelmente aquela codificada por SEQ ID No28.

Uma lipídio acil transferase para uso na invençãotambém pode ser isolada de Streptomyces, preferívelmente S.avermitis, mais preferívelmente aquela codificada por SEQID No. 32. Outras possíveis enzimas para uso na presenteinvenção de Streptomyces incluem aquelas codificadas porSEQ ID No.S 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 31, 33. Osexemplos mostram que a enzima codificada por SEQ ID No. 33é altamente efetiva em degomagem enzimática.

Uma enzima para uso na invenção também pode serisolada de Corynebacterium, preferivelmente o C. efficiens,mais preferivelmente aquela codificada por SEQ ID No. 29.

Adequadamente, a lipídio aciltransferase para uso nosmétodos e usos de acordo com a presente invenção podem seruma lipídio aciltransferase que compreendem qualquer umadas seqüências de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 37,38, 40, 41, 43, 45, ou 47 ou uma seqüência de aminoácidosque têm 70 % pelo menos, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %,97 % ou 98 % de identidade com as mesmas, ou codificadaantes de qualquer uma das seqüências de nucleotídeosmostradas como SEQ ID No.s 36, 39, 42, 44, 46, ou 4 8 ou umaseqüência de nucleotídeos que têm pelo menos 70 %, 75 %,80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidadecom as mesmas.

Preferivelmente, a lipídio aciltransferase para usonos métodos e usos de acordo com a presente invenção é pelomenos uma lipídio aciltransferase capaz de hidrolisargalactolipideos e/ou capaz de transferir um grupo acil depelo menos um galactolipideo para um ou mais substratosaceptores de acil, em que a enzima é obtenível,preferivelmente obtida, de espécies de Streptomyces.Em uma modalidade, a lipídio aciltransferase para usonos métodos e usos de acordo com a presente invenção épreferivelmente pelo menos uma lipídio aciltransferasecapaz de hidrolisar galactolipídios e/ou capaz detransferir um grupo acil de pelo menos um galactolipídiopara um ou mais substratos aceptores de acil, em que aenzima é codificada por um ácido nucléico selecionado dogrupo que consiste de:

a) um ácido nucléico que compreende uma seqüênciade nucleotídeos mostrada em SEQ ID No. 36;

b) um ácido nucléico que é relativa à seqüênciade nucleotídeos de SEQ ID No. 3 6 pela degeneração docódigo genético; e

c) um ácido nucléico que compreende uma seqüênciade nucleotídeos que tem pelo menos 70 % de identidadecom a seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID No.36.

Em uma modalidade, a lipídio aciltransferase para usonos métodos e usos de acordo com a presente invenção épreferivelmente uma lipídio aciltransferase que compreendeuma seqüência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID No. 37ou uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 60 % deidentidade com a mesma.

Em outra modalidade, a lipídio aciltransferase parauso nos métodos e usos de acordo com a presente invenção épreferivelmente uma lipídio aciltransferase capaz dehidrolisar pelo menos um galactolipídio e/ou capaz detransferir um grupo acil de pelo menos um galactolipídiopara um ou mais substratos aceptores de acil, em que aenzima compreende uma seqüência de aminoácidos comomostrado em SEQ ID No. 3 7 ou uma seqüência de aminoácidosque tem pelo menos 60 % de identidade com a mesma.

Preferivelmente, a lipídio aciltransferase para usonos métodos e usos de acordo com a presente invenção é umalipídio aciltransferase capaz de hidrolisar pelo menosgalactolipídios e/ou capaz de transferir um grupo acil depelo menos um galactolipídio para um ou mais substratosaceptores de acil, em que a enzima é obtenível,preferivelmente obtida, de espécies de Thermobi fida,preferivelmente Thermobifida fusca.

Preferivelmente, a lipídio aciltransferase para usonos métodos e usos de acordo com a presente invenção é umaenzima lipolítica capaz de hidrolisar pelo menosgalactolipídios e/ou capaz de transferir um grupo acil depelo menos um galactolipídio para um ou mais substratosaceptores de acil, em que a enzima é obtenível,preferivelmente obtida, de espécies de Corynebacterium,preferivelmente Corynebacterium efficiens.Em uma modalidade, adicional, a lipídioaciltransferase para uso nos métodos e usos de acordo com apresente invenção pode ser uma lipidio aciltransferase quecompreende qualquer uma das seqüências de aminoácidosmostradas como SEQ ID No. 37, 38, 40, 41, 43, 45 ou 47 ouuma seqüência de aminoácidos que têm pelo menos 70 %, 75 %,80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidadecom a mesma, ou codificada por qualquer uma das seqüênciasde nucleotídeos mostradas como SEQ ID No. 39, 42, 44, 4 6 ou48 ou uma seqüência de nucleotídeos que têm pelo menos 70 %,75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % deidentidade com a mesma.

Em uma modalidade, adicional a lipídio aciltransferasepara uso nos métodos e usos de acordo com a presenteinvenção pode ser uma lipídio aciltransf erase quecompreende qualquer uma das seqüências de aminoácidosmostradas como SEQ ID No. 38, 40, 41, 4 5 ou 4 7 ou umaseqüência de aminoácidos que têm pelo menos 70 %, 75 %,80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidadecom a mesma para os usos descritos aqui.

Em uma modalidade, adicional, a lipídioaciltransferase para uso nos métodos e usos de acordo com apresente invenção pode ser uma lipídio aciltransferase quecompreende qualquer uma das seqüências de aminoácidosmostradas como SEQ ID No. 38, 40, ou 4 7 ou uma seqüência deaminoácidos que têm pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %,95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com a mesma para osusos descritos aqui.

Mais preferivelmente, em uma modalidade, a lipídioaciltransferase para uso nos métodos e usos de acordo com apresente invenção pode ser uma lipídio aciltransferase quecompreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ IDNo. 4 7 ou uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % deidentidade com a mesma.

Em outra modalidade, a lipídio aciltransferase parauso nos métodos e usos de acordo com a presente invençãopode ser uma lipídio aciltransferase que compreende aseqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 43 ou 44ou uma seqüência de aminoácidos que têm pelo menos 8 0 %,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidade com amesma. Em outra modalidade, a lipídio aciltransferase parauso nos métodos e usos de acordo com a presente invençãopode ser uma lipídio aciltransferase que compreende aseqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 41 ou umaseqüência de aminoácidos que tem pelo menos 70 %, 75 %,80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % de identidadecom a mesma.Em uma modalidade, a lipldio aciltransferase para usonos métodos e usos de acordo com a presente invenção podeser uma lipldio aciltransferase capaz de hidrolisar pelomenos galactolipídios e/ou capaz de transferir um grupoacil de pelo menos um galactolipídio para um ou maissubstratos aceptores de acil, em que a enzima é codificadapor um ácido nucléico selecionado do grupo que consiste de:

b) um ácido nucléico que é relativo à seqüênciade nucleotídeos de SEQ ID No. 36 pela degeneração docódigo genético; e

c) um ácido nucléico que compreende uma seqüênciade nucleotídeos que tem pelo menos 7 0 % de identidadecom a seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID No.36.

Em uma modalidade, a lipídio aciltransferase de acordocom a presente invenção pode ser uma lipídioaciltransferase obtenível, preferivelmente obtida, de cepasStreptomyces L130 ou L131 depositadas por Danisco A/S deLangebrogade 1, DK-1001 Copenhague K, Dinamarca sob oTratado de Budapeste sobre Reconhecimento Internacional deDepósito de Microrganismos com a finalidade de Procedimentode Patente na Coleção Nacional de Bactérias Industriais,Marinhas e Alimentícias (NCIMB) 23 St. Machar Street,Aberdeen, Escócia, GB em 25 de junho de 2004 sob o númerode acesso NCIMB 4122 6 e NCIMB 41227, respectivamente.

Lipídio aciltransferases satisfatórias para uso deacordo com a presente invenção e/ou nos métodos da presenteinvenção pode incluir qualquer uma das seguintes seqüênciasde aminoácidos e/ou pode codificar as seguintes seqüênciasde nucleotídeos:

um polinucleotídeo que codifica uma lipídio aciltransferasede acordo com a presente invenção (SEQ ID No. 16);

uma seqüência de aminoácidos de uma lipídio aciltransferasede acordo com a presente invenção (SEQ ID No. 17).

Uma enzima de lipídio acil-transferase satisfatóriapara uso nos métodos da invenção também pode seridentificada por alinhamento a seqüência L131 (SEQ ID No.37) usando o algoritmo de alinhamento em pares Align X,Clustal W de VectorNTI usando ajustes padrão.

Um alinhamento do L131 e homólogos de S. avermitilis eT. fusca ilustra que a conservação do motivo GDSx (GDSY emL131 e S. avermitilis e T. fusca), o GANDY box que é GGNDAou GGNDL e o bloco HPT (considerada a histadina catalíticaconservada). Estes três blocos conservados são realçados naFigura 61.

Quando alinhado ou a seqüência consenso pfam Pfam00657(como descrito em W004/064987) e/ou a seqüência de L131descrita aqui (SEQ ID No 37) é possível identificar trêsregiões conservadas, o bloco GDSx, o bloco GANDY e o blocoHTP (veja W004/064987 para detalhes adicionais) .

Quando alinhado ou a seqüência consenso pfam Pfam0065 7(como descrito em W004/064987) e/ou a seqüência L131descrita aqui (SEQ ID No 37).

i) A enzima lipídio acil-transferase da invenção,ou para uso em métodos da invenção, tempreferivelmente um motivo GDSx, mais preferivelmenteum motivo GDSx selecionado de motivo GDSL ou GDSY,e/ou

ii) A enzima lipídio acil-transferase da invenção,ou para uso em métodos da invenção, tempreferivelmente um bloco GANDY, mais preferivelmente,

um bloco GANDY que compreende GGNDx amino, maispreferivelmente GGNDA ou GGNDL.e/ou

iii) A enzima da invenção, ou para uso em métodosda invenção, tem preferível um bloco http.e preferivelmente

iv) A enzima galactolipase/lipídio acil-transferase da invenção, ou para uso em métodos dainvenção, tem preferivelmente um motivo GDSx ou GDSY,e um bloco GANDY que compreende GGNDx amino,preferivelmente GGNDA ou GGNDL, e um bloco HTP(histadina conservado).

Adequadamente, quando a lipídio aciltransferase parauso nos métodos ou usos da presente invenção, pode ser umalipídio aciltransferase variante, nesse caso a enzima podeser caracterizada em que a enzima compreende a seqüência deaminoácidos do motivo GDSX, em que X é um ou mais dosseguintes resíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Υ, H, Q, T,Ν, M ou S, e em que a enzima variante compreende uma oumais modificações de aminoácidos comparadas com umaseqüência parental a qualquer um ou mais dos resíduos deaminoácidos definidos no conjunto 2 ou conjunto 4 ouconjunto 6 ou conjunto 7 (aqui abaixo definido).

Por exemplo, a enzima lipídio aciltransferase variantepara uso nos métodos ou usos da presente invenção pode sercaracterizada pelo fato de que a enzima compreende aseqüência de aminoácidos do motivo GDSX, em que X tem umanos ou mais dos resíduos de aminoácidos seguintes L, A, V,I, F, Υ, H, Q, Τ, N, MouS, eem que a enzima variantecompreende uma ou mais modificações de aminoácidoscomparadas com uma seqüência parental a qualquer um ou maisdos resíduos de aminoácidos detalhado no conjunto 2 ouconjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7 (aqui abaixodefinido) identificados pela dita seqüência parental que éestruturalmente alinhada com o modelo estrutural de P104 8 0definido aqui que é obtido preferivelmente por alinhamentoestrutural de estrutura cristalina da P10480 coordenada comIIVN.PDB e/ou IDEO.PDB como ensinado aqui.

Em uma modalidade, adicional, a enzima lipídioaciltransferase variante para uso nos métodos ou usos dapresente invenção pode ser caracterizada pelo fato de que aenzima compreende a seqüência de aminoácidos do motivo GDSX,em que X tem um ou mais dos resíduos de aminoácidosseguintes L, A, V, I, F, Υ, H, Q, Τ, Ν, M ou S, e em que aenzima variante compreende uma ou mais modificações deaminoácidos comparadas com uma seqüência parental aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos ensinadosno conjunto 2 identificado quando a dita seqüência parentalé alinhada à seqüência consenso pfam (SEQ ID No. 2 - Figura12) e modificada de acordo com um modelo estrutural deP10480 para assegurar melhor ajuste de sobreposição (vejaFigura 30) como ensinado aqui.

Adequadamente, a enzima lipídio aciltransferasevariante pode compreender uma seqüência de aminoácidos cujaseqüência de aminoácidos é mostrada como SEQ ID No. 34, SEQID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ IDNo. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ IDNo. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ IDNO. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ IDNo. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, , SEQID No. 32, ou SEQ ID No. 33 com exceção de uma ou maismodificações de aminoácidos a qualquer um ou mais dosresíduos de aminoácidos definidos no conjunto 2 ou conjunto4 ou conjunto 6 ou conjunto 7 (em seguida definido)identificados por alinhamento de seqüência com SEQ ID No. 34.

Alternativamente, a enzima lipídio aciltransferasevariante pode ser uma enzima variante que compreende umaseqüência de aminoácidos cuja seqüência de aminoácidos émostrada como SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, OU SEQ ID No. 33com exceção de uma ou mais modificações de aminoácidos aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidosno conjunto 2 ou conjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7identificados pela dita seqüência parental que éestruturalmente alinhada com o modelo estrutural de P10480definido aqui que é obtido preferivelmente por alinhamentoestrutural da estrutura cristalina da P104 8 0 coordenada comIIVN.PDB e/ou IDEO.PDB como ensinado aqui.

Alternativamente, a enzima lipídio aciltransferasevariante pode ser uma enzima variante que compreende umaseqüência de aminoácidos cuja seqüência de aminoácidos émostrada como SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4,SEQ ID NO. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, OU SEQ ID No. 33com exceção de uma ou mais modificações de aminoácidos aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos ensinadosno conjunto 2 identificado quando a dita seqüência parentalé alinhada à seqüência consenso pfam (SEQ ID No. 2) emodificada de acordo com um modelo estrutural de P10480para assegurar melhor ajuste de sobreposição (veja Figura30) como aqui abaixo ensinado.

O termo "modificar" como usado aqui significaadicionar, substituir e/ou deletar. Preferivelmente, otermo "modificar" significa "substituir".

Para evitar dúvidas, quando um aminoácido ésubstituído na enzima parental, é preferivelmentesubstituído com um aminoácido que é diferente daquelaoriginalmente encontrada naquela posição na enzima parental,deste modo, para produzir uma enzima variante. Em outraspalavras, não é pretendido que o termo "substituição" cubraa substituição de um aminoácido com o mesmo aminoácido.

Preferivelmente, a enzima parental é uma enzima quecompreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ IDNo. 34 e/ou SEQ ID No. 15 e/ou SEQ ID No. 35.

Preferivelmente, a enzima variante é uma enzima quecompreende uma seqüência de aminoácidos cuja seqüência deaminoácidos é mostrada como SEQ ID No. 34 ou SEQ ID No. 3 5com exceção de uma ou mais modificações de aminoácidos aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidosno conjunto 2 ou conjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7.

Preferivelmente, em uma modalidade, a enzima variantecompreende uma ou mais modificações de aminoácidoscomparadas com a seqüência parental em pelo menos um dosresíduos de aminoácidos definidos no conjunto 4.

Adequadamente, a enzima variante compreende uma oumais das seguintes modificações de aminoácidos comparadascom a enzima parental:

S3E, A, G, Κ, Μ, Y, R, Ρ, Ν, T ou GE3 0 9Q, R ou A, preferivelmente Q ou R-318Y, H, S ou Y, preferivelmente, Y.

Preferivelmente, X do motivo GDSX é L. Desta forma,preferivelmente a enzima parental compreende o aminoácidomotivo GDSL.

Preferivelmente, o método de produção de uma enzimalipídio aciltransferase variante adicionalmente compreendeuma ou mais das seguintes etapas:

1) mapeamento de homologia estrutural ou

2) alinhamento de homologia de seqüência.

Adequadamente, o mapeamento de homologia estruturalpode compreender uma ou mais das seguintes etapas:

i) alinhar uma seqüência parental com um modeloestrutural (11VN.PDB) mostrada na Figura 46;

ii) selecionar um ou mais resíduos de aminoácidosdentro de uma esfera de 10Á centrada no átomo de carbonocentral da molécula de glicerol no sítio ativo (veja Figura47) (tal como um ou mais dos resíduos de aminoácidosdefinidos no conjunto 1 ou conjunto 2); e

iii) modificar um ou mais aminoácidos selecionados deacordo com a etapa (ii) na dita seqüência parental.

Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido selecionadopode residir dentro de uma esfera de 9, preferivelmentedentro de uma de 8, 7, 6, 5, 4, ou 3 Á centrada no átomo docarbono central da molécula de glicerol no sítio ativo(veja Figura 47).

i) alinhar uma seqüência parental com um modeloestrutural (1IVN.PDB) mostrada na Figura 46;

ii) selecionar um ou mais aminoácidos dentro de umaesfera de 10Â centrada no átomo de carbono central damolécula de glicerol no sítio ativo (veja Figura 47) (talcomo um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidos noconjunto 1 ou conjunto 2);

iii) determinar se um ou mais resíduos de aminoácidosselecionados de acordo com a etapa (ii) são altamenteconservados (particularmente, são resíduos de sítio ativose/ou parte do motivo GDSx e/ou parte do motivo GANDY); e

iv) modificar um ou mais aminoácidos selecionados deacordo com a etapa (ii), excluindo regiões conservadasidentificadas de acordo com a etapa (iii) na dita seqüênciaparental.

Alternativamente a, ou em combinação com, o mapeamentode homologia estrutural descrito acima, o mapeamento dehomologia estrutural pode ser executado pela seleção deregiões de volta específicas (LRs - do inglês Ioop regions)ou regiões intervenientes (IVRs) derivadas do alinhamentopfam (Alinhamento 2, Figura 48) revestido com o modeloP10480 e HVN. As regiões de volta (LRs) ou regiõesintervenientes (IVRs) estão definidas na Tabela abaixo:

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Em algumas modalidades da presente invenção a enzimaaciltransf erase variante para uso nos métodos e usos dapresente invenção compreende não só umas modificações deaminoácidos a uma ou mais dos aminoácidos definidos emqualquer um de conjuntos 1 - 4 e 6 - 7, mas tambémcompreende uma modificação de aminoácido pelo menos em umou mais das regiões intervenientes definidas acima (IVR1 -6) (preferivelmente em um ou mais do IVRs 3, 5 e 6, maispreferivelmente em IVR 5 ou IVR 6,) e/ou em um ou mais dasregiões de volta acima definidas (LRl - 5) (preferivelmenteem um ou mais de LRl, LR2 ou LR5, mais preferivelmente emLR5).

Em uma modalidade, a aciltransferase variante para usonos métodos e usos da presente invenção podem incluir umaou mais modificações de aminoácido que não só estãodefinidos antes de um ou mais de conjunto 2, 4, 6 e 7, mastambém está dentro de um ou mais do IVRs 1-6(preferivelmente dentro de IVR 3, 5 ou 6, maispreferivelmente dentro em IVR 5 ou IVR 6) ou dentro de umou mais do LRs 1-5 (preferivelmente dentro de LRl, LR2 ouLR5, mais preferivelmente dentro de LR5).

Adequadamente, a aciltransferase variante para uso nosmétodos e usos da presente invenção pode incluir uma oumais modificações de aminoácido que não só estão noconjunto 1 ou 2, mas também estão dentro de IVR 3.

Adequadamente, a aciltransferase variante para uso nosmétodos e usos da presente invenção pode incluir uma oumais modificações de aminoácido que não só estão noconjunto 1 ou 2, mas também estão dentro de IVR 5.Adequadamente, a aciltransferase variante para uso nosmétodos e usos da presente invenção pode incluir uma oumais modificações de aminoácido que não só estão noconjunto 1 ou 2, mas também estão dentro de IVR 6.

Adequadamente, a aciltransferase variante para uso nosmétodos e usos da presente invenção pode incluir uma oumais modificações de aminoácido que não só estão noconjunto 1 ou 2, mas também estão dentro de LR 1.

Adequadamente, a aciltransferase variante para uso nosmétodos e usos da presente invenção pode incluir uma oumais modificações de aminoácido que não só estão noconjunto 1 ou 2, mas também estão dentro de LR2.

Igualmente, em algumas modalidades da presenteinvenção a enzima de aciltransferase variante para uso nosmétodos e usos da presente invenção compreende não só umamodificação de aminoácido a um ou mais resíduos deaminoácidos que residem dentro de 10, preferivelmentedentro de 9, 8, 7, 6, 5, 4, ou 3, Â esfera centrada noátomo de carbono central da molécula de glicerol no sítioativo (veja Figura 47) , mas também compreende pelo menosuma modificação de aminoácido em um ou mais das anterioresregiões intervenientes definidas (IVR1 -6) (preferivelmenteem um ou mais de IVRs 3, 5 e 6, mais preferivelmente em IVR5 ou IVR 6,) e/ou em um ou mais das regiões de volta acimadefinidas (LRl-5) (preferivelmente em um ou mais de LRl,LR2 ou LR5, mais preferivelmente em LR5).

Preferivelmente, em uma modalidade, a modificação deaminoácido está a um ou mais resíduos de aminoácidos queresidem dentro de uma esfera de 10À e também dentro de LR5.

Desta forma, o mapeamento de homologia estrutural podecompreender uma ou mais das seguintes etapas:

i) alinhar uma seqüência parental com um modeloestrutural (1IVN.PDB) mostrado na Figura 46;

ii) selecionar um ou mais resíduos de aminoácidosdentro de uma esfera centrada 10Á no átomo decarbono central da molécula de glicerol no sítioativo (veja Figura 47) (tal como um ou mais dosresíduos de aminoácidos definidos no conjunto 1 ouconjunto 2); e/ou selecionar um ou mais resíduos deaminoácidos dentro de IVRl - 6) (preferivelmentedentro de IVR 3, 5 ou 6, mais preferivelmentedentro em IVR 5 ou FVR 6) ; e/ou selecionar um oumais resíduos de aminoácidos dentro de. LRl -5(preferivelmente dentro de LRl, LR2 ou LR5, maispreferivelmente dentro de LR5); e

iii) modificar um ou mais aminoácidos selecionadosde acordo com a etapa (ii) na dita seqüênciaparental.Em uma modalidade, o resíduo de aminoácido selecionadopode residir dentro de una esfera 9 Ã, preferivelmentedentro de uns 8, 7, 6, 5, 4, ou3Ã esfera centrada noátomo de carbono central da molécula de glicerol no sítioativo (veja Figura 47).

ii) selecionar um ou mais aminoácidos dentro de umaesfera centrada 10Á no átomo de carbono central damolécula de glicerol no sítio ativo (veja Figura47) (tal como um ou mais dos resíduos deaminoácidos definidos no conjunto 1 ou conjunto 2),e/ou selecionar um ou mais resíduos de aminoácidosdentro de IVRl - 6) (preferivelmente dentro de IVR3, 5 ou 6, mais preferivelmente dentro em IVR 5 ouIVR 6) ; e/ou selecionando um ou mais resíduos deaminoácidos dentro de LRl - 5 (preferivelmentedentro de LRl, LR2 ou LR5, mais preferivelmentedentro de LR5);

iii) determinar se um ou mais resíduos de aminoácidosselecionados de acordo com a etapa (ii) é altamenteconservado (particularmente é resíduos de sítioativos e/ou parte do motivo GDSx e/ou parte domotivo GANDY); e modificar um ou mais aminoácidosselecionados de acordo com a etapa (ii), excluindoregiões conservadas identificadas de acordo com aetapa (iii) na dita seqüência parental.

Adequadamente, o um ou mais aminoácidos selecionadosnos métodos detalhados acima não só estão dentro de umaesfera centrada 10Ã no átomo de carbono central da moléculade glicerol no sítio ativo (veja Figura 47) (como um oumais dos resíduos de aminoácidos definidos no conjunto 1 ouconjunto 2), mas também estão dentro de um ou mais do IVRs1-6 (pref erivelmente dentro de IVR 3, 5 ou 6, maispreferivelmente dentro em IVR 5 ou IVR 6) ou dentro de umou mais do LRs 1-5 (preferivelmente dentro de LRl, LR2 ouLR5, mais preferivelmente dentro de LR5).

Pref erivelmente, em uma modalidade, a uma ou maismodificações de aminoácidos estão dentro de LR5. Quando é ocaso que a modificação está dentro de LR5, a modificaçãonão é nenhuma que está definido no conjunto 5.

Adequadamente, a uma ou mais modificações de aminoácidosnão só caem com a região definida por LR5, mas tambémconstituem um aminoácido dentro de um ou mais de conjunto 2,conjunto 4, conjunto 6 ou conjunto 7.

Adequadamente, o alinhamento de homologia de seqüênciapode compreender uma ou mais das seguintes etapas:

i) selecionar um primeiro lipidio aciltransferaseparental;

ii) identificar um segundo lipidio aciltransferaserelacionado que tem uma atividade desejável;

iii) alinhar o dito primeiro lipidio aciltransferaseparental e o segundo lipidio aciltransferaserelacionado;

iv) identificar resíduos de aminoácidos que diferementre as duas seqüências; e

v) modificar um ou mais dos resíduos de aminoácidosidentificados de acordo com a etapa (iv) no ditolipidio aciltransferase parental.

i) selecionar um primeiro lipidio aciltransferaseparental;

iv) identificar resíduos de aminoácidos que diferementre as duas seqüências;ν) determinar se um ou mais resíduos de aminoácidosselecionados de acordo com a etapa (iv) éaltamente conservado (particularmente é resíduosde sítio ativos e/ou parte do motivo GDSx e/ouparte do motivo GANDY); e

vi) modificar um ou mais dos resíduos de aminoácidosidentificou de acordo com a etapa (iv) que excluiregiões conservadas identificado de acordo com aetapa (v) na dita seqüência parental.

Adequadamente, o dito primeiro lipídio aciltransferaseparental pode compreender qualquer uma das seguintesseqüências de aminoácidos: SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ IDNo. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ IDNo. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ IDNo. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ IDNO. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 OU SEQID NO. 33.

Adequadamente, o dito segundo lipídio aciltransferaserelacionadopodem compreender qualquer uma das seguintesseqüências de aminoácidos: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 34, SEQID NO. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ IDNo. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ IDNO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 1, SEQ IDNo. 15, SEQ ID NO. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ IDNo. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32 OU SEQID No. 33.

A enzima variante tem que compreender pelo menos umamodificação de aminoácido comparada com a enzima parental.

Em algumas modalidades, a enzima variante pode compreender2 pelo menos, preferivelmente pelo menos 3, preferivelmentepelo menos 4, preferivelmente pelo menos 5, preferivelmentepelo menos 6, preferivelmente pelo menos 7, preferivelmentepelo menos 8, preferivelmente pelo menos 9, preferivelmentepelo menos 10 modificações de aminoácidos comparados com aenzima parental.

Quando referindo aqui a resíduos de aminoácidosespecíficos o numerando é isso obtido de alinhamento daseqüência variante com a seqüência de referência mostradacomo SEQ ID No. 34 OU SEQ ID No. 35.

Preferivelmente, em um aspecto a enzima variantecompreende um ou mais das substituições de aminoácidoseguintes:

S3A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, Τ, V, W,ou Y; e/ou

L17A, C, D, E, F, G, Η, I, Κ, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, OU Y; e/ou

S18A, C, D, E, F, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, T, W, OUY; e/ou

Κ22Α, C, D, Ε, F, G, Η, I, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

M23A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Ν, P, Q, R( S, Τ, V,W, OU Y; e/ou

Y30A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S1 T, ViOU W; e/ou

G40A, C, D, E, F, Η, I, K7 L, Μ, Nf P, Q, R, S, T, V7W, OU Y; e/ou

N80A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

P81A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, Q, R, S, Τ, V,W, OU Y; e/ou

K82A, C, D, E, Fi G, Η, I, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

N87A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

N88A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V,W, OU Y; e/ou

W111A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, T,V, W ou Y; e/ou

V112A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, Sf T,W, ou Y; e/ou

A114C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

Y117A, C7 D, Ε, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S7 T,V7 OU W; e/ou

L118A, C, D, E, F, G7 Η, I, Κ, Μ, Ν, P, Q, R, S7 Τ, V,W, ou Y; e/ou

P156A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L7 Μ, N, Q, R, S, Τ, VW5 ou Y; e/ou

G159A, C, D, E, F, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R7 S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

Q160A, C, D, E, F, G7 Η, I, K, L7 Μ, Ν, P, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

N161A, C, D, E, F, G, Η, I7 K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V,W, OU Y; e/ou

P162A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L7 Μ, N, Q7 R7 S7 Τ, V,W, ou Y; e/ou

S163A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L7 Μ, N, Pi Q7 R, T7 V,W7 ou Y; e/ou

A164C, D, E, F, G, Η, I, K7 L7 Μ, Ν, P, Q7 R( S7 T7 V,W7 ou Y; e/ou

R165A, C, D7 E7 F7 G7 H7 I7 K7 L7 M7 N7 P7 Q7 S7 T7 V7W7 OU Y; e/ou

S166A5 C, D7 E7 F7 G7 H7 I7 K7 L7 M7 N7 P7 Q7 R7 T7 V7W7 OU Y; e/ou

Q167A, C7 D7 E7 F7 G7 H7 I7 K7 L7 M7 N7 P7 R7 S7 T7 V7W, ou Y; e/ou

K168A, C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

V169A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, T,W, ou Y; e/ou

V170A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, T,W, OU Y; e/ou

E171A, C, D, F1 G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, OU Y; e/ou

A172C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S1 Τ, V,W, ou Y; e/ou

Y179A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, T,V, OU W; e/ou

H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V, W,OU Y; e/ou

Nl 8 IA, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, Τ, V,Wf ou Y; e/ou

Q182A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, R, S, Τ, V,W, ou Y, preferably K; e/ou

M2 09A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

L210A, C, D, E, F, G, Η, I, Κ, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W, ou Y; e/ou

R211A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, T,V, W, ou Y; e/ou

N215A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Mf Nf Pf Qf Rf S, TfV, Wf OU Y; e/ou

Y226A, C, Df Ef Gf Hf I, Kf L, M, Nf Pf Qf Rf Sf Tf VfOU W; e/ou

Y230A, Cf Df Ef Gf Hf If K, Lf M, Nf Pf Qf Rf Sf Τ, Vou W; e/ou

K284A, Cf Df Ef Ff Gf Hf If Lf Mf Nf Pf Q, Rf Sf Tf VfW, OU Y; e/ou

M285A, Cf Df Ef Ff Gf Hf If Kf Lf Nf Pf Q, Rf Sf Tf VfW, ou Y; e/ou

Q289A, Cf Df Ef Ff Gf Hf If Kf Lf Mf Nf Pf Rf Sf Tf VfWf OU Y; e/ou

V290A, Cf Df Ef Ff Gf Hf If Kf Lf Mf Nf Pf Qf Rf Sf TfWf OU Y; e/ou

E309A, Cf D, Ff Gf Hf If Kf Lf Mf Nf Pf Q, Rf Sf Tf VfWf ou Y; e/ou

S310A, Cf Df Ef Ff Gf Hf If Kf Lf Mf Nf P, Qf Rf Tf VfW, OU Y.

Além disso, ou alternativamente a estas, pode haveruma ou extensões mais C-terminais. Preferivelmente, aextensão C-terminal adicional é compreendida de um ou maisaminoácidos alifáticos, preferivelmente um aminoácido nãopolar, mais pref erivelmente de I, L, V ou G., Desta forma,a presente invenção prove adicionalmente para uma enzimavariante que compreende um ou mais das extensões C-terminais seguintes: 3181, 318L, 318V, 318G.

Quando é o caso que os resíduos na espinha dorsalparental diferem desses em P10480 (SEQ ID No. 2) , comodeterminado por alinhamento de homologia e/ou alinhamentoestrutural a P10480 e/ou 1IVN5 pode ser desejável parasubstituir os resíduos que alinham a qualquer um ou maisdos resíduos de aminoácidos seguintes em P10480 (SEQ ID No.2): Ser3, Leul7, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82,Asn87, Asn88, Trplll, Valll2, Alall4, Tyrll7, Leull8,Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61, Prol62, Serl63, Alal64,Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68, Vall69, Vall70, Glul71,Alal72, Tyrl7 9, Hisl80, Asnl81, Glnl82, Met209, Leu210,Arg211, Asn215, Lys284, Met2855 Gln289, Val290, Glu309 ouSer310, com o resíduo achado respectivamente em P10480.

Enzimas variantes que têm uma atividade hidrolíticadiminuída contra um fosfolipídio, tal como fosfatidilcolina(PC) , também podem ter uma atividade de transferaseaumentada de um fosfolipídio.

Enzimas de variantes que têm uma atividade detransferase aumentada de um fosfolipídio, tal comofosfatidilcolina (PC) , também podem ter uma atividadehidrolítica aumentada contra um fosfolipídio.Adequadamente, um ou mais dos locais seguintes podeestar envolvido em ligação de substrato: Leul7; Alall4;Tyrl7 9; Hisl80; Asnl81; Met209; Leu210; Arg211; Asn215;Lys2 84; Met285; Gln289; Val290.

1. Modificação de um ou mais dos seguintes resíduospode resultar em uma enzima variante que tem uma atividadede transferase absoluta aumentada contra fosfolipídio:

S3, D157, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23, H180,M209, L210, R211, P81, V112, N80, L82, N88; N87

Modificações específicas que podem prover uma enzimavariante que tem uma atividade de transferase melhorada deum fosfolipídio podem ser selecionadas de um ou mais doseguinte:

S3A, C, D, E, F, G, Η, 1, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, Τ, V, Wou Y; pref erivelmente Ν, Ε, K, R, A, P ou M,preferivelmente S3A

D157A, C, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W ou Y; preferivelmente D157S, R, Ε, N, G, Τ, V, Q, K ou CS310A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Nf P, Q, R, Τ, V,W ou Y; preferivelmente S310T - 318 E

E309A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, Τ, V,W ou Y; preferivelmente E3 09R, E, L, R ou A

Y179A, C, D, E, F, Gi Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, T,V ou W; preferivelmente Y179 D, Tf E, R, Ν, V, K, Q ou S,mais preferivelmente E, R, Ν, Vf K ou Q

N215A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Lf Μ, P, Qf R, Sf Τ, V,W ou Y; preferivelmente N215 S, L, R ou Y

K22A, C, D, E, Fi G, Η, I, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W ou Y; preferivelmente K22 E, R, C ou A

Q289A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Lf Μ, Ν, P, R, S, Τ, V,W ou Y; preferivelmente Q289 R, E, G, P ou N

M23A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Ν, P, Q, R, S, Τ, VfW ou Y; preferivelmente M23 K, Q, L, G, T ou S

H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, Μ, P, Qf R, S, Τ, Vf Wou Y; preferivelmente H180 Qf R ou K

M2 09 A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Ν, P, Q, R, S, Τ, V,W ou Y; preferivelmente M209Q, S, R, A, Ν, Υ, Ε, V ou L

L210A, Cf D, E, F, G, Η, I, Κ, Μ, Ν, P, R, S, Τ, V, Wou Y; preferivelmente L210 R, A, Vf Sf Τ, I, W ou M.

R211A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Lf Μ, Ν, P, Q, S, Τ, V,W ou Y; preferivelmente R211T

P81A, C, D, E, F, G, Η, I, K, Lf Μ, N, Q, R, Sf Τ, V,W ou Y; preferivelmente P81G

V112A, Cf D, Ef F, Gf Η, I, K, Lf Mf Ν, P, Qf Rf Sf TfW ou Y; preferivelmente V112C

N80A, Cf Df Ef Ff Gf Hf I, Kf Lf M, Pf Qf Rf Sf Tf VfW ou Y; preferivelmente N80 Rf Gf Nf Df Ρ, Tf Ef Vf A ou GL82A, Cf Df Ef Ff Gf Hf If Mf Nf Qf Rf Sf Tf Vf W OUY; preferivelmente L82N, S ou E

N88A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, Q, R, S, Τ, V,W ou Y; preferivelmente N88C

N87A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, Q, R, S, Τ, V,W ou Y; preferivelmente N8 7M ou G

Modificação de um ou mais dos seguintes resíduosresulta em uma enzima variante que tem uma atividade detransferase absoluta aumentada contra fosfolipídio:

S3 N, R, A, GM23 K, Q, L, G, T, SH180 RL82 GY179 E, R, Ν, V, K ou QE309 R, S, L ou A

Uma modificação preferida é N80D. Este éparticularmente o caso ao usar a seqüência de referênciaSEQ ID No. 35. Então em uma modalidade preferida dapresente invenção a lipídio aciltransferase de acordo com apresente invenção compreende SEQ ID No. 35.

Como notável acima, quando referente a resíduos deaminoácidos específicos aqui o numerando é aquele obtido doalinhamento da seqüência variante com a seqüência dereferência mostrada como SEQ ID No. 34 ou SEQ ID No. 35

Muito de preferência, a lipídio aciltransferase parauso no método e usos da presente invenção pode ser umalipídio aciltransferase que compreende a seqüência deaminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16 (Figura 10), ou umaseqüência de aminoácidos que tem 7 5 % ou mais,preferivelmente 85 % ou mais, mais preferivelmente 90 % oumais, até mesmo mais pref erivelmente 95 % ou mais, atémesmo mais preferivelmente 98 % ou mais, ou até mesmo maispreferivelmente 99 % ou mais de identidade para SEQ ID No.16. Esta enzima pode ser considerada uma enzima variante.

Para evitar dúvida, quando um aminoácido particular éensinado em um local específico, L118, por exemplo, isto serefere ao aminoácido específico a resíduo número 118 em SEQID No. 34 a menos que caso contrário declarado. No entanto,o resíduo de aminoácido em local 118 em uma enzima parentaldiferente pode ser diferente de leucina.

Desta forma, quando ensinado substituir um aminoácidoao resíduo 118, embora referência pode ser feita a L118 queseria entendido prontamente pela pessoa qualificada quequando a enzima parental é diferente de aquele mostrado emSEQ ID No. 34, o aminoácido que é substituído pode não serleucina. Então, é possível que quando substituindo umaseqüência de aminoácidos em uma enzima parental que não é aenzima que tem a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQID No. 34, o aminoácido novo (substituindo) pode estarigual a aquele ensinado em SEQ ID No. 34. Por exemplo, estepode ser o caso onde o aminoácido ao dito resíduo 118 não énenhuma leucina e é, então diferente do aminoácido aresíduo 118 em SEQ ID No. 34. Em outras palavras, o resíduo118, por exemplo, se a enzima parental tiver àquela posiçãoum aminoácido diferente de leucina, este aminoácido podeser substituído com leucina de acordo com a presenteinvenção.

Com a finalidade da presente invenção, o grau deidentidade está baseado no número de elementos de seqüênciaque são o mesmo. O grau de identidade de acordo com apresente invenção pode ser determinado Adequadamente, pormeio de programas de computação conhecidos na arte, talcomo GAP provida no pacote de programa GCG (Manual dePrograma para o Pacote de Wisconsin, Versão 8, agosto de1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,Wisconsin, US53711,) (Needleman & Wunsch (1970), J. ofMolecular Biology 48, 443-45) usando as colocaçõesseguintes para comparação de seqüência de polipeptídeo: GAPpenalidade de criação de 3,0 e penalidade de extensão deGAP de 0,1. Adequadamente, o grau de identidade comrespeito a uma seqüência de aminoácidos é determinado maisde pelo menos 2 0 aminoácidos contíguos, preferivelmentemais de pelo menos 3 0 aminoácidos contíguos,preferivelmente mais de pelo menos 4 0 aminoácidos contíguos,preferivelmente em mais de pelo menos 50 aminoácidoscontíguos, preferivelmente mais de pelo menos 60aminoácidos contíguos.

Adequadamente, a enzima lipídio aciltransferase deacordo com a presente invenção pode ser obtenível,preferivelmente obtida, de organismos de um ou mais dosgêneros seguintes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces,Lactococcus, Myeobaeterium, Streptoeoeeus, Laetobaeillus,Desulfitobaeterium, Baeillus, Campylobaeter, Vibrionaeeae,Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaecharomyees,Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas,Candida, Thermobifida e Corynebacterium.

Adequadamente, a enzima lipídio aciltransferase deacordo com a presente invenção pode ser obtenível,preferivelmente obtida, de um ou mais dos organismosseguintes: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonieida,Streptomyees eoelieolor, Streptomyees rimosus,Myeobaeterium, Streptoeoeeus pyogenes, Lactoeoceus laetis,Streptoeoeeus pyogenes, Streptoeoeeus thermophilus,Streptomyees thermosaeehari, Streptomyees avermitilisLaetobaeillus helvetieus, Desulfitobacterium dehalogenans,Baeillus sp. , Campylobaeter jejuni, Vibrionaeeae, Xylellafastidiosa, Sulfolobus solfatarieus, Saccharomyeescerevisiae, Aspergillus terreus, SchizoSaccharomyces pombe,Listeria innocua, histeria monocytogenes, Neisseriameningitidis, Mesorhizobium Ioti, Ralstonia solanacearum,Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Candidaparapsilosis Thermobifida fusca e Corynebacterium efficiens.

Preferivelmente, em um aspecto, a enzima lipídioaciltransferase de acordo com a presente invenção éobtenível, preferivelmente obtida, de um ou mais deAeromonas hydrophila ou Aeromonas salmonicida.

Adequadamente, em uma modalidade o esterol e/ouestanol podem compreender um ou mais das característicasestruturais seguintes:

i) um grupo hidroxi de 3-beta ou um grupo de hidroxide 3-alfa; e/ou

ii) anéis A:B na posição eis e ou anéis A:B na posiçãotrans ou C5-C6 é insaturado.

Aceptores de acil de esterol satisfatórios compreendemcolesterol e fitoesteróis, por exemplo, alfa-sitosterol,beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, campesterol,5,6-dihidrosterol, brassicasterol, alfa-spinasterol, beta-spinasterol, gama-spinasterol, deltaspinasterol, fucosterol,dimosterol, ascosterol, serebisterol, episterol, anasterol,hyposterol, condrilasterol, desmosterol, chalinosterol,poriferasterol, clionasterol, glicosídeo de esterol,tocoferol, tocotrienol e outras formas isômeras naturais ousintéticas e derivados.

Vantajosamente, em uma modalidade, o aceptor de acilde esterol é tocoferol. Adequadamente, o tocoferol podemser um ou mais de gama, delta, beta ou d-alfa tocoferol-incluindo d-alfa tocoferol de succinato ácido, por exemplo.Preferivelmente, em uma modalidade, o aceptor de acil deestero é alfa-tocoferol.

Preferivelmente, em uma modalidade, o método de acordocom a presente invenção compreende a etapa de adicionartocoferol, preferivelmente alfa-tocoferol, ao óleo.

Preferivelmente, em um aspecto, o aceptor de acil deesterol é colesterol.

Em um aspecto, preferivelmente o esterol e/ou oaceptor de acil de estanol é um esterol e/ou um estanoldiferente de colesterol.

Em um aspecto da presente invenção apropriadamentemais que um esterol e/ou estanol podem agir como o aceptorde acil, apropriadamente mais que dois esteróis e/ouestanóis podem agir como o aceptor de acil. Em outraspalavras, em um aspecto da presente invenção,apropriadamente mais que um éster de esterol e/ou éster deestanol podem ser produzidos. Adequadamente, quandocolesterol é o acil que aceptor um ou mais esteróisadicionais ou um ou mais estanóis também podem agir como oaceptor de acil. Desta forma, em um aspecto, a presenteinvenção provê um método para a produção in situ de uméster de tocoferol e pelo menos um outro éster de esterolou de estanol em combinação. Em outras palavras, a lipidioaciltransferase para alguns aspectos da presente invençãopode transferir um grupo acil de um lipidio para tocoferole pelo menos um esterol adicional e/ou pelo menos umestanol.

Em alguns aspectos, o óleo preparado de acordo com apresente invenção pode ser usado para reduzir o risco dedoenças cardiovasculares.

Em um aspecto, o óleo preparado de acordo com apresente invenção pode ser usado para reduzir colesterol desoro de sangue e/ou reduzir lipoproteinas de baixadensidade. Colesterol de soro de sangue e lipoproteinas debaixa densidade ambos foram associados com certas doençasem humanos, como aterosclerose e/ou doença de coração, porexemplo. Desta forma, é considerado que os óleos preparadosde acordo com a presente invenção podem ser usados parareduzir o risco de tais doenças.

Em outro aspecto, a presente invenção provê o uso deum óleo comestível de acordo com a presente invenção parauso no tratamento e/ou prevenção de doençascardiovasculares.

Desta forma, em um aspecto a presente invenção prove ouso de um óleo comestível de acordo com a presente invençãopara uso no tratamento e/ou prevenção de aterosclerose e/oudoença de coração.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê ummedicamento que compreende um óleo comestível de acordo coma presente invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê ummétodo de tratar e/ou prevenir uma doença em um pacientehumano ou animal cujo método compreende a administração aopaciente de uma quantia efetiva de um óleo comestível deacordo com a presente invenção.

Adequadamente, o aceptor de acil de esterol pode serum que é achado naturalmente em óleos comestíveis ouvegetais.

Alternativamente, ou, além disso, o aceptor de acil deesterol pode ser um que pode ser acrescentado ao óleocomestível ou vegetal.

Quando é o caso que um esterol e/ou um estanol éacrescentado ao óleo comestível, o esterol e/ou estanolpodem ser adicionado antes, simultaneamente com, e/oudepois da adição da lipídio aciltransferase de acordo com apresente invenção. Adequadamente, a presente invenção podecercar a adição de esteróis/estanóis exógenos,particularmente fitosteróis/fitoestanóis, a um óleocomestível ou vegetal antes de ou simultaneamente com aadição da enzima de acordo com a presente invenção.

Para alguns aspectos, um ou mais esteróis presentes noóleo comestível pode ser convertido a um ou mais estanóisantes de ou ao mesmo tempo que a lipídio aciltransferase éadicionada de acordo com a presente invenção. Qualquermétodo satisfatório para converter esteróis a estanóispodem ser empregados. Por exemplo, a conversão pode serlevada a cabo, por exemplo, através de hidrogenação químicaA conversão pode ser conduzida antes da adição da lipídioaciltransferase de acordo com a presente invenção ousimultaneamente com a adição da lipídio aciltransferase deacordo com a presente invenção. Adequadamente, enzimas paraa conversão de esteróis para estanóis são ensinadas emWOO0/061771.

Adequadamente, a presente invenção pode ser empregadapara produzir ésteres de fitoestanol in situ em um óleocomestível. Ésteres de Fitoestanol aumentaram solubilidadepor membranas de lipídio, biodisponibilidade e aumentoubenefícios de saúde (veja W092/99640, por exemplo).

Uma vantagem da presente invenção é que os ésteres deesterol e/ou de estanol são produzidos no óleo comestíveldurante a degomagem do mesmo. Uma vantagem adicional é quea enzima é degomada sem um aumento, ou um significativoaumento, no conteúdo de ácido graxo livre do óleocomestível. A produção de ácidos graxos livres pode serprejudicial no óleo comestível. Preferivelmente, o métodode acordo com a presente invenção resulta na degomagem deum óleo comestível em que a acumulação de ácidos graxoslivres é reduzida e/ou eliminada. Sem desejar estar atadopor teoria, de acordo com a presente invenção o ácido graxoque é removido do lipídio é transferido pela lipídioaciltransferase a um aceptor de acil, por exemplo umesterol e/ou um estanol,. Desta forma, o nível global deácidos graxos livres comestíveis não aumenta ou só aumentaa um grau insignificante. Isto está em clara contradição àsituação quando fosfolipases, tal como Lecitase Ultra™ éusado em degomagem enzimática de óleos comestíveis. Emparticular, o uso de tal fosfolipases pode resultar em umaquantidade aumentada de ácido graxo livre no óleocomestível que pode ser prejudicial. De acordo com apresente invenção, a acumulação de ácidos graxos livres éreduzida e/ou eliminada quando comparada com a quantidadede ácidos graxos livres que teriam sido acumulados tendouma enzima fosfolipase A, como Lecitase Ultra™, sido usadaem lugar da lipídio aciltransferase de acordo com apresente invenção.

Uma lipídio acil transferase de acordo com a presenteinvenção pode ser satisfatória para uso na degomagemenzimática de óleos comestíveis ou vegetais. Noprocessamento de óleo de vegetal ou comestível o óleocomestível ou vegetal é tratado com uma lipídio aciltransferase de acordo com a presente invenção a fim dehidrolisar uma parte principal do fosfolipídio.

Preferivelmente, os grupos graxos de acil são transferidosdos lipídios polares a um aceptor de acil. 0 processo dedegomagem tipicamente resulta na redução do conteúdo doslipídios polares, particularmente de fosfolipídio, em umóleo comestível devido a hidrólise de uma maior principal(isto é, mais que 50 %) do fosf olipídio. Tipicamente, afase aquosa que contém o fosfolipídio hidrolisado estáseparada do óleo. Adequadamente, o óleo comestível ouvegetal pode ter um conteúdo de fósforo de 50 - 250 ppminicialmente (pré-tratamento com a enzima de acordo com apresente invenção).

Como a pessoa qualificada está atenta, o termo"degomagem" como usado aqui significa o refinamento de óleopela conversão de fosfatídeo (tal como lecitina,fosfolipídio e óleo ocluído) em fosfatídeo de hidratável.Óleo que foi degomado é mais fluido e desta forma tempropriedades de manipulação melhores que óleo que não foidegomado.

0 termo "transferase" como usado aqui é trocável com otermo "lipidio aciltransferase".

Adequadamente, a lipidio aciltransferase como definidoaqui catalisa uma ou mais das seguintes reações:interesterificação, transesterificação, alcoolise,hidrólise.

O termo "interesterificação" se refere à transferênciaenzimática catalisada de grupos de acil entre um doador delipidio e aceptor de lipidio, em que o doador de lipidionão é um grupo acil livre.

0 termo "transesterificação" como usado significa queque a transferência enzimática catalisada de um grupo acilde um doador de lipidio (diferente de um ácido graxo livre)para um aceptor de acil (diferente de água).

Como usado aqui, o termo "alcoólise" se refere àdivisão enzimática de uma ligação covalente de umderivativo ácido através de reação com um álcool ROH deforma que uma das associações de produtos com o H do álcoole o outro produto combina com o grupo OR do álcool.

Como usado aqui, o termo "álcool" se refere a umcomposto de alquil que contém um grupo de hidroxila.

Como usado aqui, o termo "hidrólise" se refere àtransferência enzimática catalisada de um grupo acil de umlipídio para o OH grupo de uma molécula de água.

O termo "sem aumentar ou sem aumentar substancialmenteos ácidos graxos livres" como usado aqui significa quepreferivelmente a lipídio acil transferase dé acordo com apresente invenção tem 100 % atividade de transferase (istoé transfere 100 % dos grupos de acil de um doador de acilsobre o aceptor de acil, sem atividade hidrolítica); noentanto, a enzima pode transferir menos que 100 % dosgrupos de acil presente no doador de lipídio acil para oaceptor de acil. Em cujo caso, preferivelmente a atividadede aciltransferase responde por pelo menos 5 %, maispreferivelmente pelo menos 10 %, mais preferivelmente pelomenos 20 %, mais pref erivelmente pelo menos 30 %, maispreferivelmente pelo menos 40 %, mais preferivelmente 50 %,mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmentepelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, maispreferivelmente pelo menos 90 % e mais preferivelmente pelomenos 98 % da atividade de enzima total. A % de atividadede transferase (isto é a atividade de transferase como umaporcentagem da atividade enzimática total) pode serdeterminado pelo protocolo seguinte:

Enzima satisfatória para uso nos métodos da invençãopreferivelmente tem atividade de fosfolipase em um ensaiode atividade de fosfolipase padrão ensinado aqui abaixo.

Determinação de atividade de fosfolipase (ensaio deatividade de fosfolipase (PLU-7)):

Substrato

0,6 % L -a Fosfatidilcolina 95 % Planta (Avanti#441601), 0,4 % Triton-X 100 (Sigma X-100) e 5 mM CaCl2 foidisperso em 0,05 M HEPES tampão pH 7.

Procedimento dp ensaio:

400 μΐ, de substrato foi acrescentado a um tuboEppendorf de 1,5 mL e colocado em um Eppendorf Thermomixerà 370C durante 5 minutos. Ao tempo t = 0 min, 50 μ!> desolução de enzima foi adicionada. Também um branco com águaem vez de enzima foi analisado. A amostra foi misturada a10x100 rpm em um Eppendorf Thermomixer às 370C durante 10minutos. Ao tempo de t=10 min o tubo de Eppendorf foicolocado em outro termomixer a 990C durante 10 minutos paraparar a reação.

0 ácido graxo livre nas amostras foi analisado usandoo kit NEFA C de WAKO GmbH.

Atividade de enzima PLU-7 a pH 7 foi calculado comomicromole de ácido graxo produzido por minuto debaixo decondições de ensaio.

Mais preferivelmente o lipídio acil-transferase tambémterá atividade de transferase como definido pelo protocoloabaixo:

Protocolo para a determinação de % atividade deaciltransferase:

Um óleo comestível ao qual uma lipídio aciltransferasede acordo com a presente invenção foi acrescentada pode serextraído seguindo a reação enzimática com CHCl3: CH3OH 2:1 ea fase orgânica que contêm o material de lipídio é isoladae analisada por GLC e HPLC de acordo com o procedimentodetalhado aqui abaixo. Da análise GLC e HPLC a quantidadede ácidos graxos livres e um ou mais de éster de esterol /estanol; é determinado. Um óleo comestível controle ao qualnenhuma enzima de acordo com a presente invenção foiacrescentada, é analisado da mesma maneira.

Cálculo:

Dos resultados das análises GLC e HPLC o aumento emácidos graxos livres e éster de esterol / estanol pode sercalculado:

Δ % ácido graxo = % ácido graxo (enzima) - % ácidograxo (controle) ; Ácido graxo de Mv = peso molecular médiodos ácidos graxo; A = Δ % éster de esterol/ Mv éster deesterol (onde Δ % éster de esterol = % éster de esterol /estanol (enzima) de éster - % éster de esterol / estanol(controle) e Mv esterol éster = peso molecular médio doséster de esterol / estanol);A atividade de transferase é calculada como umaporcentagem da atividade enzimática total:

<formula>formula see original document page 70</formula>

Se os ácidos graxos livres são aumentados no óleocomestível eles preferivelmente não são aumentadossubstancialmente, isto é, a um grau significante. Por isto,nós queremos dizer que o aumento em ácido graxo livre nãoafeta a qualidade do óleo comestível adversamente.

0 óleo comestível usado para o ensaio de atividade deaciltransf erase é pref erivelmente o óleo de grão de sojacompletado com esterol de planta (1 %) e óleo defosfatidilcolina (2 %) usando o método no Exemplo 3. Para oensaio a dosagem de enzima usada é preferivelmente 0,2 PLU-7/g de óleo, mais preferivelmente 0,08 PLU-7/g de óleo. Onível de fosfolipídio presente no óleo e/ou a % deconversão de esterol é preferivelmente determinada depoisde 4 horas, mais preferivelmente depois de 20 horas.

Em alguns aspectos da presente invenção, o termo "semsubstancialmente aumentar ácidos graxos livres" como usadoaqui significa que que a qtd de ácido graxo livre em umóleo comestível tratado com uma lipídio aciltransferase deacordo com a presente invenção é menos que a quantidade deácido graxo livre produzido no óleo comestível quando umaenzima diferente de uma lipidio aciltransferase de acordocom a presente invenção tenha sido usada, como por exemplocomo comparado com a quantidade de ácido graxo livreproduzida quando uma enzima de fosfolipase convencional,por exemplo Lecitase Ultra™ (Novozymes A/S, Dinamarca),tinha sido usada.

Além de, ou em vez de, avaliando a % atividade detransferase em um óleo (acima), para identificar as enzimaslipidio acil transferase mais preferíveis para uso nosmétodos da invenção o ensaio seguinte entitulado "Protocolopara identificar lipidio aciltransferase para uso napresente invenção" pode ser empregado.

Protocolo para identificar lipidio aciltransferase

Uma lipidio aciltransferase de acordo com a presenteinvenção é em qual resulta em:

i) a remoção do fosfolipídio presente em um óleo degrão de soja completado com esterol de planta(1 %) e óleo de fosf atidilcolina (2 %) usando ométodo ensinado no Exemplo 3. e/ou

ii) a conversão (% de conversão) do esterol adicionadopara esterol-éster ao usar o método ensinado em

Exemplo 3. O método de GLC para determinar o nívelde esterol e éster de esterol como ensinado emExemplo 5 pode ser usado.

Para o ensaio a dosagem de enzima usada pode ser 0,2PLU-7/g de óleo, preferivelmente 0,08 PLU - 7/g de óleo. Onível de fosfolipídio presente no óleo e/ou a conversão (%de conversão) de esterol é preferivelmente determinadadepois de 4 horas, mais preferivelmente depois de 20 horas.

No protocolo por identificar lipídio acil transferase,depois de tratamento enzimático, 5 % de água épreferivelmente adicionada e completamente misturada com oóleo. 0 óleo é então separado em uma fase óleo e água pormeio de centrifugação (veja Enzyme-catalyzed degumming ofvegetable oils" by Buchold, H. e Laurgi A.-G., FettWissenschaft Technologie (1993), 95(8), 300-4, ISSN: 0931-5985), e a fase de óleo pode ser analisada então paraconteúdo de fósforo usando o protocolo seguinte ("Ensaiopara Conteúdo de Fósforo"):

Ensaio para Conteúdo de Fósforo

0 nível de fosfolipídio presente em um óleo depois quedegomagem é determinado por primeiro preparar a amostra deóleo de acordo com a preparação de amostra ensinado no AOACOfficial Method 999.10 (>Lead, Cadmium, Zinc, Copper, andIron in Foods Atomic Absorption Spectrophotometry afterMicrowave Digestion, First Action 1999 NMKL- AOAC Method).

A quantidade de fosfolipídio no óleo é então medidaanalisando o conteúdo de fósforo na amostra de óleo depoisde degomagem de acordo com o AOAC Official Method 985,01(>Metals and Other Elements in Plants and Pet FoodsInductively Coupled Plasma Spectroscopic Method FirstAction 1985 Final Action 1988).

A quantidade de fósforo presente no óleo depois quedegomagem é preferivelmente menos de 50 ppm,preferivelmente menos que 40 ppm, preferivelmente menos que30 ppm, preferivelmente menos que 20 ppm, preferivelmentemenos de 10 ppm, pref erivelmente menos que 5 ppm. 0 óleodepois de degomagem, como ilustrado nos exemplos pode estarsubstancialmente livre de fosfolipídio, isto é, contemmenos que 1 ppm de fosfolipídio.

A % de conversão do esterol presente no óleo é pelomenos 1 %, preferivelmente pelo menos 5 %, preferivelmentepelo menos 10 %, pref erivelmente pelo menos 2 0 %,preferivelmente pelo menos 3 0 %, preferivelmente pelo menos40 %, preferivelmente pelo menos 50 %, preferivelmente pelomenos 60 %, pref erivelmente pelo menos 70 %,preferivelmente pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos90 %, preferivelmente pelo menos 95 %.

Em uma modalidade, a % de conversão do esterolpresente no óleo é pelo menos 5 %, pref erivelmente pelomenos 20 %.Degomagem com pouca água

Descobriu-se surpreendentemente que quando uma lipídioacil transferase for usada em um processo de degomagemenzimática de um óleo comestível, a degomagem enzimáticapode ser executada em um ambiente com muito pouca água. Umpouco de água ainda pode ser requerida, por exemplo, quandoacrescentando a enzima ao óleo a enzima pode ser adicionadoem quantidade pequena de água, como menos que 1 %,preferivelmente 0,5 %, mais preferivelmente menos que 0,2 %,mais preferivelmente menos que 0,1 %.

Preferivelmente, o conteúdo de água do óleo comestívelnos processos e usos de acordo com a presente invenção émenos que 1 %, pref erivelmente menos que 0,5 %, maispreferivelmente menos que 0,2 %, mais preferivelmente menosque 0,1 %.

Desta forma, uma vantagem da presente invenção é quequando só uma quantidade pequena de água (isto é <5 %,preferivelmente <1 %, preferivelmente & <0,5 %,preferivelmente <0,2 %) é usado durante a degomagemenzimática as gomas (isto é, a porção que contém fósforo)separa do óleo, por exemplo, na forma de um precipitadosólido. O precipitado sólido pode ser removido prontamentedo óleo degomado através de métodos tal como simplesmentedecantar o óleo ou remover a goma através de filtração, porexemplo.

Isto contrasta nitidamente com o processo de degomagemenzimática convencional no qual uma quantidade significantede água é adicionada ao óleo. Isto é porque na degomagemenzimática convencional processa pós-degomagem por causa doalto conteúdo de água, obtém uma camada de água quecompreende a porção que contém fósforo (por exemplo, aquelaporção que compreende losofosfolipidios). Esta camada deágua deve ser removida e pode ser removida, por exemplo,através de centrifugação. No entanto, a remoção da camadade água é significativamente mais difícil que a remoção doprecipitado sólido obtido ao usar o processo da presenteinvenção.

Então o processo de degomagem enzimática de acordo coma presente invenção poderia ser considerado como um"processo de degomagem de pouca água".

Em uma modalidade, da presente invenção, a goma podeser removida ajustando o óleo a 5 % de água seguido porcentrifugação do óleo. (veja "Enzyme-catalyzed degumming ofvegetable oils" by Buchold, H. e Laurgi A.-G., FettWissenschaft Technologie (1993), 95(8), 300-4).

Então, a invenção provê um processo para a degomagemde um óleo comestível, tal como um óleo comestível cru (porexemplo, um óleo de soja cru) , sem a necessidade de umaetapa de pré-lavagem antes de degomagem e/ou uma etapa deremoção da água adicionada durante degomagem, o que érequerido ao usar fosfolipases convencionais tal comofosfolipase pancreática e Lecitase Ultra™.

Preferivelmente, o óleo comestível tem menos que um4,5 % de conteúdo de água, mais preferivelmente menos que4 %, menos que 3 %, menos que 2 %, menos que 1 %, menos que0,5 %.

Adequadamente, o óleo comestível pode conter 0,1 %água, como pelo menos 0,3 %, pelo menos 0,4 % ou 0,5 %.

Lipídio aciltransferase preferidos para uso napresente invenção são identificados como esses que têm umaatividade alta, tal como alta atividade hidrolítica defosfolipídio ou alta atividade de transferase defosfolipídio em fosfolipídio em um ambiente de óleo,preferivelmente lipídio acil transferase para uso nadegomagem enzimática têm uma alta atividade transferase defosfolipídio a esterol.

Como detalhado anteriormente, outros acil-transferasesatisfatórios para uso nos métodos da invenção pode seridentificado pela identificação da presença de blocos GDSx,GANDY e HPT por alinhamento da seqüência consenso pfam00657(SEQ ID No 1), e/ou alinhamento para uma aciltransferase deGDSx, por exemplo SEQ ID No 28. Para avaliar a suaconveniência para degomagem, isto é identificar essasenzimas que têm uma atividade de transferase de pelo menos5 %, mais pref erivelmente pelo menos 10 %, maispreferivelmente pelo menos 2 0 %, mais preferivelmente pelomenos 3 0 %, mais pref erivelmente pelo menos 4 0 %, maispreferivelmente 50 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %,mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmentepelo menos 8 0 %, mais pref erivelmente pelo menos 90 % emais preferivelmente pelo menos 98 % da atividade de enzimatotal, tais aciltransferases são testadas usando o"Protocolo para a determinação de % de atividade deaciltransferase", ensaio detalhado anteriormente.

A presente invenção se refere ao uso de uma lipidioacil transferase de acordo com a presente invenção emdegomagem de óleos vegetais comestíveis e/ou óleoscomestíveis e para métodos para degomagem de óleoscomestíveis ou vegetais.

Em um aspecto, a presente invenção pode prover ummétodo compreendendo usar uma lipidio acil transferase pararemover o conteúdo de fósforo não hidratável (NHP - doinglês non-hydratable phosphorus) em óleo que compreendeuma quantidade relativamente alta de NHP.

O termo "óleo comestível" como usado aqui podeenglobar óleos vegetais.Preferivelmente, ο óleo comestível antes de tratamentode acordo com a presente invenção compreende um conteúdo defósforo de não hidratável de 50 - 250 ppm, preferivelmentepelo menos 60 ppm, mais preferivelmente pelo menos 100 ppm,e até mesmo mais pref erivelmente pelo menos 200 ppm, atémesmo mais preferivelmente acima de 250 ppm.

Mais preferivelmente, o óleo comestível antes detratamento de acordo com a presente invenção compreende umconteúdo de fosforoso não hidratável na faixa de 60 - 500ppm, mais preferivelmente na gama de 100 - 500 ppm, e atémesmo mais preferivelmente na gama de 200 - 500 ppm.

Um óleo comestível como referido aqui pode serqualquer óleo que tem uma quantidade relativamente alta deum fósforo não hidratável, isto pode incluiróleo degomadopor água, ou mais preferivelmente estes é um óleo cru ou umóleo semi-cru.

Em um aspecto, o óleo comestível cru tem antes deexecutar o método da invenção, um conteúdo fosforoso acimade 350 ppm, mais preferivelmente acima de 400 ppm, atémesmo mais preferivelmente acima de 500 ppm, epreferivelmente acima de 600 ppm.

Óleos englobados pelo método de acordo com a presenteinvenção podem incluir, mas não são limitados a, um ou maisde óleo de grão de soja, óleo de canola, óleo de milho,óleo de semente de algodão, óleo de palma, óleo de coco,óleo de amendoim, azeite de oliva, óleo de açafrão, óleo denúcleo de palma, óleo de semente de colza e óleo degirassol. Preferivelmente, o óleo é um ou mais de óleo degrão de soja, óleo de girassol e óleo de semente de colza(às vezes chamado de óleo de canola).

Mais preferivelmente, o óleo é um ou mais de óleo degrão de soja, óleo de girassol ou óleo de semente de colza.

Preferivelmente, o óleo é óleo de grão de soja.

Estes óleos podem ser na forma de um óleo cru, um óleode semi-cru, ou um óleo degomado em água.

Como usado aqui, "óleo cru" (também se referido aquipara como um óleo de não degomado) pode ser um óleoprensado ou extraído ou uma mistura do mesmo, por exemplo,semente de colza, feijão de soja, ou girassol. O conteúdode fosfatídeo em um óleo cru pode variar de 0,5 - 3 % p/pque correspondem a um conteúdo de fósforo na gama de 2 00 -1200 ppm, mais pref erivelmente na gama de 250 - 12 00 ppm.Além dos fosfatídeos, o óleo cru contém tambémconcentrações pequenas de carboidrato, compostos de açúcare complexos ácidos metal/fosfatídeo de Ca, Mg e Fe.

Como usado aqui, "óleo semi-cru" se refere a qualqueróleo que não é um óleo cru, mas que tem um conteúdo defosfatídeo acima de 250 ppm, mais preferivelmente acima de500 ppm. Tal óleo pode, por exemplo, ser obtido sujeitandoum óleo cru a um processo semelhante ao processo descritoabaixo "degomagem em água".

Como usado aqui, "óleo degomado em água" pode serobtido tipicamente por um "processo de degomagem em água"compreendendo misturar 1 - 3 % p/p de água quente com óleocru morno (60 - 90°C). Períodos de tratamento habituais são30 - 60 minutos. A etapa de degomagem em água remove osfosfatídeos e as gomas mucilaginosas que se torna insolúvelno óleo quando hidratado. Os fosfatídeos e as gomasmucilaginosas podem ser separados do óleo por deposição,filtração ou centrifugação - centrifugação sendo a práticamais prevalecente. O objeto essencial no dito processo dedegomagem em água é separar os fosfatídeo hidratados doóleo. A mistura de água quente no óleo, descrito acima,deveria ser entendido aqui amplamente como a mistura de umasolução aquosa no óleo de acordo com procedimentos padrãode degomagem em água na técnica.

Vantajosamente, o método e usos da presente invençãohabilitam degomagem de óleos comestíveis em ambientes depouca água (<5 %, pref erivelmente menos que 2 %, maispreferivelmente menos que 1 %). Então a degomagem pode serexecutada com a adição de menos água que ao usar enzimasconvencionais. Uma vantagem adicional da presente invençãoé a produção de éster de esterol (em particular éster detocoferol) no óleo. Uma vantagem adicional ainda dapresente invenção é a remoção (preferivelmente remoçãocompleta) de fosfolipídio. Uma vantagem adicional dapresente invenção é a remoção (preferivelmente remoçãocompleta) de fosfolipídio sem a remoção de fitosterol, e emparticular tocoferol. É preferido que, devido aoesterificação do fitosterol, não haja remoção significantede fitosteróis tal como tocoferol do óleo, ao invés disso,eles simplesmente são esterifiçado. No entanto, em umamodalidade a quantidade de fitosterol tal como tocoferolpode ser reduzida. Em tais modalidades os níveis absolutosde fitosterol talcomo tocoferol podem ser reduzidospreferivelmente por não mais que 10 %, alternativamente nãomais que 25 %, alternativamente não mais que 50 %,alternativamente não mais que 75 %. Uma vantagem adicionalainda da presente invenção é a remoção (preferivelmente aremoção completa) de fosfolipídio sem a hidrólise detriglicerídeos.

Para a facilidade de referência, estes e aspectosadicionais da presente invenção são discutidos agora sobtítulos de seção apropriados. No entanto, necessariamentenão são limitados os ensinos debaixo de cada seção a cadaseção particular.DEFINIÇÃO DOS CONJUNTOS

Conjunto de aminoácidos 1:Conjunto de aminoácidos 1

Gly8, Asp9, SerlO, Leull, Serl2, Tyrl5, Gly44, Asp45,Thr4 6, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75,Leu7 6, Glnl06, Ilel07, Argl08, Leul09, ProllO, Tyrll3,Phel21, Phel3 9, Phel40, Metl41, Tyrl45, Metl51, Aspl54,Hisl57, Glyl55, Ilel56, Prol58

Os motivos altamente conservados, tal como GDSx eresíduos catalíticos, eram deselecionados do conjunto 1(resíduos sublinhados). Para evitar dúvida, o conjunto 1define os resíduos de aminoácidos dentro de 10Á do átomo decarbono central de um glicerol no sítio ativo do modelo deIIVN.

Conjunto de aminoácidos 2:

Conjunto de aminoácidos 2 (note que a numeração dosaminoácidos se refere aos aminoácidos na seqüência maduraP10480)

Leul7, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro8l, Lys82, Asn87,Asn88, Trplll, VaI112, Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol56,Glyl59, Glnl60, Asnl61, Prol62, Serl63, Alal64, Argl65,Serl66, Glnl67, Lysl68, Vall69, Vall70, Glul71, Alal72,Tyrl7 9, Hisl80, Asnl81, Met209, Leu210, Arg211, Asn215,Lys284, Met285, Gln289 e Val290.Tabela de resíduos selecionados no conjunto 1comparado com Conj unto 2:

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

Conjunto de aminoácidos 3:

Conjunto de aminoácidos 3 é idêntico ao conjunto 2,mas se refere a seqüência de codificação de Aeromonassalmonicida (SEQ ID No. 28) , isto é, os números de resíduode aminoácido são 18 mais alto no conjunto 3 como istoreflete a diferença entre a numeração de aminoácidos naproteína madura (SEQ ID No. 2) comparado com a proteínaincluindo uma seqüência sinal (SEQ ID No. 28).As proteínas maduras de Aeromonas salmonicida GDSX(SEQ ID No. 28) e Aeromonas hydrophila GDSX (SEQ ID No. 26)difirem em cinco aminoácidos. Estes são Thr3Ser, Glnl82Lys,Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-, onde o resíduo desalmonicida é listado primeiro e o resíduo de hydrophila êlistado por último (FIGURA 59) . A proteína de hydrophila ésó 317 aminoácidos mais longa e carece de um resíduo naposição 318. O Aeromonas salmonicidae GDSX tem atividadeconsideravelmente alta em lipídios polares como substratosde galactolipídio que a proteína de Aeromonas hydrophila.Escaneamento local foi executado em todas as cinco posiçõesde aminoácidos.

Conjunto de aminoácidos 4:

Conjunto de aminoácidos 4 é S3, Q182, E309, S310, e -318.

Conjunto de aminoácidos 5:

F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157 N,Y226F, D228N, Y230F.

Conjunto de aminoácidos 6:

Conjunto de aminoácidos 6 é Ser3, Leul7, Lys22, Met23,Gly4 0, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trplll, Valll2,Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61,Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68,Vall69, Vall70, Glul71, AM72, Tyrl79, Hisl80, Asnl81,Glnl82, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285,Gln28 9, Val290, Glu309, Ser310, -318.

A numeração dos aminoácidos no conjunto 6 se refereaos resíduos de aminoácidos em P104 8 0 (SEQ ID No. 2)aminoácidos correspondentes em outras cadeias principais deseqüência podem ser determinadas por alinhamento dehomologia e/ou alinhamento estrutural a P104 8 0 e/ou IIVN.

Conjunto de aminoácidos 7:

Conjunto de aminoácidos 7 é Ser3, Leul7, Lys22, Met23,Gly4 0, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trplll, Valll2,

Alall4, Tyrll7, Leull8, Prol56, Glyl59, Glnl60, Asnl61,Prol62, Serl63, Alal64, Argl65, Serl66, Glnl67, Lysl68,Vall69, Vall70, Glul71, Alal72, Tyr179, Hisl80, Asnl81,Glnl82, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285,Gln2 8 9, Val2905 Glu3 09, Ser310, -318, Y3 0X (onde X é selecionado de A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S,Τ, V, ou W) , Y226X (onde X é selecionado de A, C, D, E, G,Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q1 Rr S, Τ, V, ou W) , Y230X (onde X éselecionado de A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S,Τ, V, ou W) , S18X (onde X é selecionado de A, C, D, E, F, H,K, L, Μ, Ν, P, Q, R, T, W ou Υ) , D157X (onde X éselecionado de A, C, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, T,V, W ou Y).

A numeração dos aminoácidos no conjunto 7 se refereaos resíduos de aminoácidos em P10480 (SEQ ID No. 2)aminoácidos correspondentes em outras cadeias principais deseqüência podem ser determinadas por alinhamento dehomologia e/ou alinhamento estrutural a P104 8 0 e/ou 1IVN).

ISOLADO

Preferivelmente, em um aspecto, o polipeptídeo ouproteína para uso na presente invenção está em uma formaisolada. O termo "isolado" significa que a seqüência é pelomenos substancialmente livre de pelo menos um outrocomponente com que a seqüência é naturalmente associada emnatureza e como achada na natureza.

PURIFICADO

Preferivelmente, em um aspecto, o polipeptídeo ouproteína para uso na presente invenção está em uma formapurificada. O termo "purificado" significa que a seqüênciaestá em um estado relativamente puro - por exemplo, pelomenos aproximadamente 51 % puro, ou pelo menosaproximadamente 7 5 %, ou pelo menos aproximadamente 8 0 %,ou pelo menos aproximadamente 90 % puro, ou pelo menosaproximadamente 95 % puro ou pelo menos aproximadamente98 % puro.

CLONANDO UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICA UMPOLIPEPTÍDEO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

Uma seqüência de nucleotídeos que codifica ou umpolipeptídeo que tem as propriedades específicas definidasaqui ou um polipeptídeo que é satisfatório para modificaçãopode ser isolada de qualquer célula ou organismo produzindoo dito polipeptídeo. Vários métodos são bem conhecidosdentro da técnica para o isolamento de seqüências denucleotídeos. Por exemplo, um DNA genômico e/ou bibliotecade cDNA podem ser construídas usando DNA cromossômico ouRNA mensageiro do organismo que produz o polipeptídeo. Se aseqüência de aminoácidos do polipeptídeo for conhecida,sondas de oligonucleotídeo marcadas podem ser sintetizadase usadas para identificar clones codificadores depolipeptídeos da biblioteca genômica preparada do organismo

Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeo marcada quecontém seqüências homólogas para outro gene de polipeptídeoconhecido poderia ser usada para identificar clonescodificadores de polipeptídeos. No último caso, condiçõesde hibridização e lavagem de baixa estringência são usadas.

Alternativamente, clones codificadores depolipeptídeos poderiam ser identificados inserindofragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, comoum plasmídeo, transformando bactérias enzima - negativascom a biblioteca de DNA genômico resultante, e entãocolocando em placas as bactérias transformadas sobre ágarque contém uma enzima inibida pelo polipeptídeo, dessaforma permitindo clones que expressam o polipeptídeo a seridentificados.

Em ainda uma alternativa adicional, a seqüência denucleotídeos que codifica o polipeptídeo pode sersinteticamente preparada através de métodos padrãoestabelecidos, por exemplo, o método fosforoamiditadescrito por Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters22, ρ 1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al(1984) EMBO J. 3, ρ 801-805. No método de fosforoamidita,são sintetizados oligonucleotídeos, por exemplo, em umsintetizador de DNA automático, purificados, recozidos,ligados e clonados em vetores apropriados.

A seqüência de nucleotídeos pode ser de origemgenômica e sintética misturada, origem sintética e de cDNAmisturada, ou origem genômica e de cDNA misturada,preparada através de fragmentos de ligação de origemsintética, genômica ou de cDNA (como apropriado) de acordocom técnicas padrão. Cada fragmento ligado corresponde avárias partes da seqüência de nucleotídeos inteira. Aseqüência de DNA também pode ser preparada através dereação em cadeia de polimerase (PCR) usando primersespecíficos, por exemplo, como descrito na US 4,683,202 ouem Saiki R K et al (Science (1988) 239, pp 487-491).

SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOSA presente invenção também abrange seqüências denucleotídeos que codificam polipeptideos que tem aspropriedades específicas como definidas aqui. O termo"seqüência de nucleotídeo" como usado aqui se refere a umaseqüência de oligonucleotídeo ou seqüência depolinucleotídeo, e variante, homólogos, fragmentos ederivados dos mesmos (como porções dos mesmos). A seqüênciade nucleotídeos pode ser de origem genômica ou sintética ourecombinante que pode ser de fita dupla ou fita simples serepresentando a fita senso ou antisenso.

O termo "seqüência de nucleotídeo" em relação àpresente invenção compreende DNA genômico, cDNA, DNAsintético, e RNA. Preferivelmente, significa DNA, maispreferivelmente cDNA para a seqüência de codificação.

Em uma modalidade preferida, a seqüência denucleotídeos per se que codifica um polipeptídeo que tem aspropriedades específicas como definidas aqui não cobre aseqüência de nucleotídeos nativa em seu ambiente naturalquando é unido a sua seqüência(s) naturalmente associada(s)que também está/estão em seu/seus ambiente(s) natural(is).

Para facilidade de referência, nós chamaremos estamodalidade preferida de a "seqüência de nucleotídeos nãonativa" Nesta consideração, o termo "seqüência denucleotídeos nativa" significa uma seqüência denucleotídeos inteira que está em seu ambiente nativo equando operativamente unida a um promotor inteiro com oqual é naturalmente associado, cujo promotor também está emseu ambiente nativo. Desta forma, o polipeptídeo dapresente invenção pode ser expresso por uma seqüência denucleotídeos em seu organismo nativo, mas em que aseqüência de nucleotídeos não está sob o controle dopromotor com que é naturalmente associado dentro daqueleorganismo.

Preferivelmente, o polipeptídeo não é um polipeptídeonativo. Nesta consideração, o termo "polipeptídeo nativo"significa um polipeptídeo inteiro que está em seu ambientenativo e quando foi expresso por sua seqüência denucleotídeos nativa.

Tipicamente, a seqüência de nucleotídeos que codificapolipeptídeos que tem as propriedades específicas comodefinida aqui é preparado usando técnicas de DNArecombinante (isto é, recombinante DNA). No entanto, em umamodalidade alternativa da invenção, a seqüência denucleotídeo poderia ser sintetizada, em todo ou em parte,usando métodos químicos bem conhecidos na técnica (vejaCaruthers'MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 eHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

EVOLUÇÃO MOLECULARUma vez que uma seqüência de nucleotídeos decodificação de enzima tenha sido isolada, ou uma seqüênciade nucleotídeos de codificação de enzima putativa tenhasido identificada, pode ser desejável modificar a seqüênciade nucleotídeos selecionada, por exemplo, pode serdesejável transformar a seqüência para preparar uma enzimade acordo com a presente invenção.

Mutações podem ser introduzidas usandooligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeo contêmseqüências de nucleotídeos que flanqueiam os locais demutação desejados.

Um método satisfatório é revelado em Morinaga et al(Biotechnology (1984) 2, p646-649). Outro método deintroduzir mutações em seqüências de nucleotídeos decodificação de enzima é descrito em Nelson e Long(Analytical Biochemistry (1989), 180, ρ 147-151).

Em vez de mutagênese sítio dirigida, como descritoacima, a pessoa pode introduzir mutações aleatoriamenteusando, por exemplo, um kit comercial como o GeneMorph PCRkit de mutagênese de Stratagene, ou o Diversify PCR kit demutagênese fortuito de Clontech. A EP 0 583 265 se refere amétodos de otimização de PCR baseado em mutagênese quetambém pode ser combinado com o uso de análogos de DNAmutagênicos como aqueles descritos em EP 0 866 796.Tecnologias de PCR propensas a erro são satisfatórias paraa produção de variantes de lipídio acil transferase comcaracterísticas preferidas. W00206457 se refere a evoluçãomolecular de lipases.

Um terceiro método para obter seqüências novas éfragmentar seqüências de nucleotídeos não idênticas, ouusando qualquer número de enzimas de restrição ou umaenzima tal como Dnase I, e reunindo as seqüências denucleotídeos completa que codificam para proteínasfuncionais. Alternativamente, a pessoa pode usar uma oumúltiplas seqüências de nucleotídeos não idênticas e podeintroduzir mutações durante a reunião da seqüência denucleotídeos completa. Tecnologias de embaralhamento de DNAe de embaralhamento de família são satisfatórias para aprodução de variantes de lipídio acil transferase comcaracterísticas preferidas. Métodos satisfatórios paraexecutar o 'embaralhamento1 pode ser encontrado em EPO 752008, EPl 138 763, EPl 103 606. O embaralhamento também podeser combinado com outras formas de mutagênese de DNA comodescrito na US 6,180,406 e WO 01/34835.

Desta forma, é possível produzir numerosas mutaçõessítio dirigido ou aleatórias em uma seqüência denucleotídeo, ou in vivo ou in vitro, e subseqüentementeavaliar para funcionalidade melhorada do polipeptídeocodificado através de vários meios. Usando em métodos derecombinação mediadi por silico e exo (veja WO 00/58517, US6,344,328, US 6,361,974), por exemplo, a evolução molecularpode ser executada onde a variante produzida retém muitobaixa homologia a enzimas conhecidas ou proteínas. Taisvariantes desta forma obtidas podem ter analogia estruturalsignificante a enzimas de transferase conhecidas, mas têmmuito baixa homologia de seqüência de aminoácido.

Como um exemplo não limitativo, além disso, mutaçõesou variantes naturais de uma seqüência de polinucleotídeopodem ser recombinadas com o tipo selvagem ou outrasmutações ou variantes naturais para produzir variantesnovas. Também podem ser escondidas tais variantes novaspara funcionalidade melhorada do polipeptídeo codificado.

A aplicação dos supracitados e semelhantes métodos deevolução moleculares permite a identificação e seleção devariantes das enzimas da presente invenção que temcaracterísticas preferidas sem qualquer conhecimentoanterior de estrutura de proteína ou função, e permite aprodução de mutações ou variantes não previsíveis, masbenéficas. Há numerosos exemplos da aplicação de evoluçãomolecular na técnica pela otimização ou alteração deatividade de enzima, tais exemplos incluem, mas não sãolimitados a um ou mais dos seguintes: expressãoaperfeiçoada e/ou atividade em uma célula hospedeira ou invitro, atividade enzimática aumentada, substrato e/ouespecificidade de produto alterado, estabilidade enzimáticaou estrutural aumentada ou diminuída,atividade/especificidade enzimática alterada em condiçõesambientais preferidas, por exemplo, temperatura, pH, e/ousubstrato.

Como será aparente a uma pessoa qualificado na técnica,usando ferramentas de evolução moleculares uma enzima podeser alterado para melhorar a funcionalidade da enzima.

Adequadamente, a lipídio aciltransferase usada nainvenção pode ser uma variante, isto é pode conter pelomenos uma substituição de aminoácido, apagamento ou adição,quando comparada a uma enzima parental. Enzimas variantesretêm 1 %, 2 %, 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %,50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % de homologiacom a enzima parental, pelo menos. Enzimas parentaissatisfatórias podem compreender qualquer enzima comesterase ou atividade de lipase. Preferivelmente, enzimaparental de taxa alinha à seqüência consenso pfam00657.

Em uma modalidade preferível, uma enzima lipídioaciltransferase variante retém ou incorpora pelo menos umou mais dos resíduos de aminoácido da seqüência consensospfam00657 achada nos blocos GDSx5 GANDY e de HPT.Enzimas, tais como lipase sem ou baixa atividade delipidio aciltransferase em um ambiente aquoso pode sertransformada usando ferramentas de evolução molecularespara introduzir ou aumentar a atividade de transferase,produzindo uma enzima lipidio aciltransferase desta formacom atividade de transferase significante satisfatório parauso nas composições e métodos da presente invenção.

Adequadamente, a lipidio aciltransferase para uso nainvenção podem ser uma variante com fosfolipídio deatividade de enzima aumentados quando comparada à enzimaparental. Preferivelmente, tais variantes também têm baixaou nenhuma atividade em lipidios polares liso. A atividadeaumentada em fosfolipídio pode ser o resultado de hidrólisee/ou atividade de transferase ou uma combinação de ambos.

Variantes de lipidio aciltransferase para uso nainvenção podem ter atividade diminuída em triglicerídeos,e/ou monoglicerídeos e/ou diglicerídeos comparados com aenzima parental.

Adequadamente, a enzima variante pode não ter nenhumaatividade em triglicerídeos e/ou monoglicerídeos e/oudiglicerídeos.

Alternativamente, a enzima variante para uso nainvenção pode ter atividade aumentada em triglicerídeos,e/ou também pode ter atividade aumentada em um ou mais dosseguintes, lipídios polares, fosfolipídios, lecitina,fosfatidilcolina.

Variantes de lipídio aciltransferase são conhecidas, euma ou mais de tais variantes pode ser satisfatórias parauso nos métodos e usos de acordo com a presente invençãoe/ou nas composições de enzima de acordo com a presenteinvenção. Por via de exemplo somente, são descritasvariantes de lipídio aciltransferase nas referênciasseguintes e podem ser usadas de acordo com a presenteinvenção: Hilton & Buckley J Biol. Chem., janeiro de 1991Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. ,janeiro de 1994 21; 269(3): 2146-50; Brumlik et al J.Bacteriol, abril de 1996; 178 (7): 2060-4; Peelman et alProtein Sci., março de 1998; 7(3):587-99.

SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

A presente invenção também abrange seqüências deaminoácidos de polipeptídeos que tem as propriedadesespecíficas como definidas aqui.

Como usado aqui, o termo "seqüência de aminoácido" ésinônima com o termo "polipeptídeo" e/ou a termo"proteína." Em alguns exemplos, o termo "seqüência deaminoácido" é sinônimo com o termo "peptídeo".

A seqüência de aminoácidos pode ser preparada/isoladade uma fonte satisfatória, ou pode ser feita sinteticamenteou pode ser preparada por uso de técnicas de DNArecombinante.

Adequadamente, as seqüências de aminoácidos podem serobtidas do polipeptídeos isolados ensinado aqui portécnicas padrão.

Um método satisfatório para determinar as seqüênciasde aminoácidos de polipeptídeos isolados é como segue: Opolipeptídeo purificado pode ser liofilizado e 100 μg domaterial liofilizado pode ser dissolvido em 50 μΐ de umamistura de 8 M de uréia e 0,4 M de carbonato de amôniohidrogênio, pH 8,4. A proteína dissolvida pode serdesnaturada e reduzida por 15 minutos a 50°C seguida decobertura com nitrogênio e adição de 5 μΐ de ditiotreitolde 45 mM. Depois de esfriar a temperatura ambiente, 5 μΐ deiodoacetamida 10 0 de mM pode ser adicionado para osresíduos de cisteína serem derivatizados durante 15 minutosa temperatura ambiente na escuridão debaixo de nitrogênio.5 μΐ de água e 5 ng de endoproteinase Lys-C em 5 μΐde água pode ser acrescentado à anterior mistura de reação20 e a digestão pode ser executada à 370C debaixo denitrogênio durante 24 horas.

Os peptídeos resultantes podem ser separados atravésde HPLC de fase reversa em uma coluna VYDAC C18 (0,46x15cm; 10 μτη; The Separation Group, Califórnia, USA) usandosolvente A: 0,1 % de TFA em água e solvente B: 0,1 % de TFAem acetonitrila. Os peptídeos selecionados podem ser re-cromatografados em uma coluna Develosil C18 usando o mesmosistema solvente, antes do seqüenciamento N-terminal. 0seqüenciamento pode ser feito usando seqüenciador AppliedBiosystems 476A usando ciclos rápidos de líquidos pulsadosde acordo com as instruções do fabricante (AppliedBiosystems, Califórnia, USA).

IDENTIDADE DE SEQÜÊNCIA OU H0M0L0GIA DE SEQÜÊNCIA

A presente invenção também abrange o uso de seqüênciasque têm um grau de identidade de seqüência ou homologia deseqüência com seqüência(s) de aminoácidos de umpolipeptídeo que tem as propriedades específicas definidasaqui ou de qualquer seqüência de nucleotídeos que codificatal um polipeptídeo (em seguida chamado uma "seqüência(s)homóloga(s)"). Aqui, o termo "homólogo" significa umaentidade que tem certa homologia com as seqüências deaminoácidos de objeto e as seqüências de nucleotídeos deobjeto. Aqui, o termo "homologia" pode ser comparado com"identidade".

A seqüência de aminoácidos homóloga e/ou seqüência denucleotídeos deveriam prover e/ou deveriam codificar umpolipeptídeo que retém a atividade funcional e/ou aumenta aatividade da enzima.No contexto presente, uma seqüência homóloga é tomadapara incluir uma seqüência de aminoácidos que pode ser pelomenos 75, 85 ou 90 % idêntica, preferivelmente pelo menos95 ou 98 % idêntica à seqüência obeto. Tipicamente, oshomólogos compreenderão os mesmos locais ativos etc. como aseqüência de aminoácidos objeto. Embora a homologia tambémpossa ser considerada em termos de semelhança (isto é,resíduos de aminoácidos que têm propriedades/funçõesquímicas semelhantes), no contexto da presente invençãoprefere-se expressar homologia em termos de identidade deseqüência.

No contexto presente, uma seqüência homóloga é tomadapara compreender uma seqüência de nucleotídeos que pode serpelo menos 75, 8 5 ou 90 % idêntico, pref erivelmente pelomenos 95 ou 98 % idêntica a uma seqüência de nucleotídeosque codifica um polipeptídeo da presente invenção (aseqüência objeto). Tipicamente, os homólogos compreenderãoas mesmas seqüências que codificam para os locais ativosetc. como a seqüência objeto. Embora a homologia tambémpossa ser considerada em termos de semelhança (isto éresíduos de aminoácidos que têm propriedades/funçõesquímicas semelhantes), no contexto da presente invençãoprefere-se expressar homologia em termos de identidade deseqüência.Comparações de homologia podem ser conduzidas atravésde olho, ou mais normalmente, com o auxílio de programas decomparação de seqüência prontamente disponíveis. Estesprogramas de computação comercialmente disponíveis podemcalcular a % de homologia entre dois ou mais seqüências.

A % de homologia pode ser calculada em cima deseqüências contíguas, isto é, uma seqüência está alinhadacom a outra seqüência e cada aminoácido em uma seqüência écomparado diretamente com o aminoácido correspondente naoutra seqüência, um resíduo de cada vez. Isto é chamado umalinhamento "sem espaço". Tipicamente, só são executadostais alinhamentos sem espaço em cima de um númerorelativamente curto de resíduos.

Embora este seja um método muito simples e consistente,não leva em conta que, por exemplo, em um caso par idênticocontrário de seqüências, uma inserção ou apagamento causaráaos resíduos de aminoácidos seguintes serem postos fora dealinhamento, resultando potencialmente desta forma em umaredução grande na % de homologia quando um alinhamentoglobal é executado. Por conseguinte, a maioria dos métodosde comparação de seqüência são projetados para produzirótimos alinhamentos que levam em conta possíveis inserçõese apagamentos sem penalisar a contagem de homologia global.

Isto é alcançado inserindo "espaços" no alinhamento deseqüência para tentar maximizar homologia local.

No entanto, estes métodos mais complexos designam"penalidades de espaço" a cada espaço que acontece noalinhamento de forma que, para o mesmo número deaminoácidos idênticos, um alinhamento de seqüência com tãopoucas espaços quanto possível - refletindo uma correlaçãomais alta entre as duas seqüências comparadas - alcançaráuma contagem mais alta que uma com muitos espaços. "Custosde espaços afins" são tipicamente usados de modo quecarregam uma alta relatividade para a existência de umespaço e uma penalidade menor para cada resíduo subseqüenteno espaço. Isto é o mais comumente sistema de contagem deespaço usado. Penalidades de espaço altas produzirãoalinhamentos evidentes aperfeiçoados com menos espaços. Amaioria dos programas de alinhamento permite modificar aspenalidades de espaço. No entanto, era preferido usar osvalores padrão ao usar tal software para comparações deseqüência. Por exemplo, quando usar o pacote GCG WisconsinBestfit a penalidade de espaço padrão para seqüências deaminoácidos é -12 para um espaço e -4 para cada extensão.

O cálculo de máxima % de homologia então primeiramenterequer a produção de um ótimo alinhamento, levando emconsideração penalidades de espaço. Um programa decomputação satisfatório por executar tal alinhamento é opacote GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12 p387). Exemplos de outros softwares quepodem executar comparações de seqüência compreendem, masnão são limitados, o pacote de BLAST (veja Ausubel et al1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4<th> Ed -Chapter 18), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) e o conjunto de ferramentas de comparação de GENEWORKS.Tanto BLAST quanto FASTA estão disponíveis para procuraoffline e on-line (veja Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a7-60). No entanto, para algumas aplicações, prefere-se usaro programa GCG Bestfit. Uma ferramenta nova, chamada BLAST2 Sequences também estão disponíveis para comparar proteínae seqüência de nucleotídeos (veja FEMS Microbiol Lett 1999174 (2) : 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1) : 187-8 etatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Embora a % de homologia final possa ser medida emtermos de identidade, o próprio processo de alinhamento nãoé tipicamente baseado em uma comparação de par tudo ou nada.

Ao invés, uma matriz de contagem de semelhança escalonada égeralmente usada de modo que designa contagens a cadacomparação de pares baseado em semelhança química oudistância evolutiva. Um exemplo de tal matriz geralmenteusado é a matriz de BLOSUM62 - a matriz padrão para oconjunto de programas BLAST. Os programas GCG Wisconsingeralmente usam os valores padrão públicos ou uma tabela decomparação de símbolo de praxe se provida (veja o manual deusuário para detalhes adicionais). Para algumas aplicações,é preferido usar os valores padrão públicos para o pacoteGCG, ou no caso de outro software, a matriz padrão, comoBLOSUM62.

Alternativamente, podem ser calculada porcentagem dehomologias usando a característica de alinhamento múltiplaem DNASIS™ (Software de Hitachi), baseado em um algoritmo,análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1),237-244).

Uma vez que o software tenha produzido um ótimoalinhamento, é possível calcular a % de homologia,preferivelmente a % de identidade de seqüência. 0 softwarefaz isto tipicamente como parte da comparação de seqüênciae gera um resultado numérico.

Em um aspecto preferível da presente invenção oseguinte software e colocações para calcular a porcentagemde homologia/identidade são usadas. Para a porcentagem deseqüências de aminoácidos de identidades (homologia) ou"positivos" é calculado pelo AlignX VectorNTI (Vetor NTIadvance 9.1 de Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia,USA.) , para cada possível par de de seqüências deaminoácidos. Colocações são parâmetros padrão (penalidadede abertura de Espaço - 10, penalidade extensão de Espaço0,1).

As seqüências também podem ter deleções, inserções ousubstituições de resíduos de aminoácidos que produzem umamudança silenciosa e resultam em uma substânciafuncionalmente equivalente. Podem ser feitas substituiçõesde aminoácido deliberadas em base de semelhança empolaridade, custo, solubilidade, hidrofobicidade,hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduoscontanto que a atividade de ligação secundária dasubstância seja retida. Por exemplo, aminoácidosnegativamente carregados incluem ácido aspártico e ácidoglutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluemlisina e arginina,· e aminoácidos com grupos principaispolares não carregados que têm valores de hidrofilicidadesemelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina,alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina,fenilalanina e tirosina.

Podem ser feitas substituições conservadoras, porexemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Aminoácidos nomesmo bloco na segunda coluna e preferivelmente na mesmalinha na terceira coluna podem ser substituídos um pelooutro:<table>table see original document page 107</column></row><table>

A presente invenção também abrange substituiçãohomóloga (substituição e recolocação são ambos usados aquisignificando o intercâmbio de um resíduo de aminoácidoexistente, com um resíduo alternativo) que pode aconteceristo é substituição comparáveis tal como básico para básico,ácido para ácido, polar para polar etc. Substituição nãohomóloga também pode acontecer, isto é, de uma classe deresíduo para outro ou envolvendo a inclusão de aminoácidosantinaturais alternativamente como ornitina (em seguidachamado Ζ), ornitina ácido diaminobutírico (em seguidachamado Β), ornitina de norleucina (em seguida chamado O),piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

Substituições também podem ser feitas através deaminoácidos antinaturais.

Seqüências de aminoácidos variantes podem incluirgrupos mais espacçados satisfatórios que podem serinseridos entre qualquer dois resíduos de aminoácido daseqüência incluindo grupos de alquil como grupos metila,etil ou propil além de espaçadores de aminoácido comoresíduos de glicina ou de β-alanina. Uma forma adicional devariação envolve a presença de um ou mais resíduos deaminoácidos em forma peptóide, será bem entendido poraquele qualificado na técnica. Para evitar dúvida, "a formade peptóide" é usada para se referir a resíduos deaminoácidos variantes em que o grupo de substituinte de a-carbono está no resíduo do átomo de nitrogênio em lugar deo α-carbono. Processos para preparar peptídeos na forma depeptoides são conhecidos na técnica, por exemplo, Simon RJet al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 e Horwell DC, TrendsBiotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.

As seqüências de nucleotídeos para uso na presenteinvenção ou codificando um polipeptídeo que tem aspropriedades específicas definido aqui pode incluir dentrodeles nucleotídeos sintéticos ou modificados. Vários tiposdiferentes de modificação para oligonucleotídeo sãoconhecidos na técnica. Estes compreendem cadeias principaismetilfosfonato e de fosforotioato e/ou a adição de cadeiasde acridina ou polilisina às terminações 3' e/ou 5' damolécula. Para a finalidade da presente invenção, seráentendido que as seqüências de nucleotídeos descritas aquipode ser modificado por qualquer método disponível natécnica. Tais modificações podem ser levadas a cabo paraaumentar a atividade in vivo ou o período de vida deseqüências de nucleotídeos.

A presente invenção também abrange o uso de seqüênciasde nucleotídeos que são complementares às seqüênciasdiscutidas aqui, ou qualquer derivativo, fragmento ouderivados dos mesmos. Se a seqüência é complementar a umfragmento da mesma então aquela seqüência pode ser usadacomo uma sonda para identificar seqüências de codificaçãosemelhantes em outros organismos etc.

Polinucleotídeos que não são 100 % homólogos àsseqüências da presente invenção, mas que caem dentro daextensão da invenção podem ser obtido de vários modos.

Outras variantes das seqüências descritas aqui podemser obtidas, por exemplo, sondando bibliotecas de DNAfeitas de uma gama de indivíduos, por exemplo, osindivíduos de populações diferentes. Além disso, outroshomólogos virais/bacterianos ou celulares particularmentehomólogos celular acharam em células mamífero (por exemplo,rato, camundongo, bovino e células de primata), podem serobtido e tais homólogos e fragmentos dos mesmos em geralserão capazes de hibridizar seletivamente às seqüênciasmostradas na seqüência que lista aqui. Tais seqüênciaspodem ser obtidas sondando bibliotecas de cDNA feitas de oubibliotecas de DNA genômicas de outras espécies animais, esondando tais bibliotecas com sondas que compreendem o todoou parte de qualquer uma das seqüências nas inscrições deseqüência fixas debaixo de condições de médio paraseveridade alta. Considerações semelhantes aplicadas aobter homólogos de espécies e variantes alélicas dopolipeptideo ou seqüências de nucleotídeos da invenção.

Variantes e homólogos de cepa/espécies podem serobtidos também usando PCR degenerado que usará primersprojetados para mirar seqüências dentro das variantes ehomólogos que codificam seqüências de aminoácidosconservadas dentro das seqüências da presente invenção. Porexemplo, seqüências conservadas podem ser preditasalinhando as seqüências de aminoácidos de váriasvariantes/homólogos. Podem ser executados alinhamentos deseqüência usando software de computador conhecido natécnica. Por exemplo, o programa GCG Wisconsin PileUp éextensamente usado.

Os primers usados em PCR degenerado conterão uma ouposições mais degeneradas e serão usados a condições deseveridade mais baixar que aquelas usadas para clonarseqüências com primers de seqüência simples contraseqüências conhecidas.Alternativamente, tais polinucleotídeospodem serobtidos por mutagênese sítio dirigida de seqüênciascaracterizadas. Isto pode ser útil onde, por exemplo,mudanças de seqüência de codon silenciosas são exigidaspara aperfeiçoar preferências de codon para uma célulahospedeira particular na qual as seqüências depolinucleotídeo estão sendo expressas. Outras mudanças deseqüência podem ser desejadas para introduzir locais dereconhecimento de restrição de polipeptídeo, ou paraalterar a propriedade ou função do polipeptídeoscodificadas pelo polinucleotídeos.

Polinucleotideos (seqüências de nucleotídeos) dainvenção podem ser usados para produzir um primer, porexemplo, um primer de PCR, um primer para uma reação deamplificação alternativa, uma sonda, por exemplo, marcadacom um rótulo revelador por meios convencionais usandorótulos radioativos ou não radioativos, ou opolinucleotídeos podem ser clonados de em vetores. Taisprimers, sondas e outros fragmentos serão pelo menos 15,preferivelmente pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 25,30 ou 40 nucleotídeos em comprimento, e também é abrangidopelo termo polinucleotídeos da invenção como usado aqui.

Polinucleotídeos como polinucleotídeos de DNA e sondasde acordo com a invenção podem ser produzidosrecombinantemente, sinteticamente, ou por quaisquer meiosdisponíveis a auqeles com habilidade na técnica. Elestambém podem ser clonados de através de técnicas padrão.

Em geral, os primers serão produzidos através de meiossintéticos, envolvendo uma etapa de manufatura da seqüênciade ácido nucléico desejado um nucleotídeo de cada vez.Técnicas para realizar isto usando técnicas automatizadasestão prontamente disponíveis na técnica.

Polinucleotídeos mais longos serão produzidosgeralmente usando meios recombinantes, usando uma técnicade clonagem de PCR (polymerase chain reaction - do iglêsreação da polimenrase em cadeia), por exemplo. Istoenvolverá a fabricação de um par de primers (por exemplo,de cerca de 15 a 3 0 nucleotídeos) flanqueando uma região dolipídio que objetiva a seqüência que era desejado clonar,trazendo os primers em contato com mRNA ou cDNA obteve deuma célula animal ou humana, executando uma reação depolimerase em cadeia debaixo de condições que provocamamplificação da região desejada, isolando o fragmentoampliado (por exemplo, purificando a mistura de reação emum gel de agarose) e recuperando o DNA ampliado. Os primerspodem ser projetados para conter enzimas de restrição dereconhecimento de locais satisfatórios de forma que o DNAamplificado pode ser clonado em um vetor de clonagemsatisfatório.

HIBRIDIZAÇÃO

A presente invenção também abrange as seqüências quesão complementares às seqüências da presente invenção ouseqüências que ou são capazes de hibridizar as seqüênciasda presente invenção ou as seqüências que são a estascomplementares.

0 termo "hibridização" como usado aqui compreenderá "oprocesso pelo qual uma fita de ácido nucléico se une comprocesso de amplificação como executado em tecnologias dereação de polimerase em cadeia (PCR).

A presente invenção também abrange o uso de seqüênciasde nucleotídeos que são capazes de hibridizar as seqüênciasque são complementarer às seqüências objeto discutidas aqui,ou qualquer derivativo, fragmento ou derivados das mesmas.

A presente invenção também abrange seqüências que sãocomplementares a seqüências que são capazes de hibridizaras seqüências de nucleotídeos discutidas aqui.

As condições de hibridização estão baseadas natemperatura de fusão (Tm - do inlgês melting temperature)do complexo de ligação de nucleotídeo, como ensinado emBerger and Kimmel (1987, Guide to Molecular CloningTechniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press,San Diego CA), e confere uma "rigidez" definida comoexplicado abaixo.

A rigidez máxima acontece tipicamente a cerca de Tm-50C (50C abaixo da Tm da sonda) ; rigidez alta aaproximadamente 5°C a IO0C abaixo de Tm; rigidezintermediária a aproximadamente IO0C a 20°C abaixo de Tm; ebaixa rigidez a aproximadamente 20°C a 250C abaixo de Tm.Como será entendido por aqueles com habilidade na técnica,uma rigidez de hibridização máxima podem ser usadas paraidentificar ou descobrir seqüências de nucleotídeosidênticas enquanto uma rigidez de hibridizaçãointermediária (ou baixa) podem ser usadas para identificarou descobrir seqüências de polinucleotídeo semelhantes ourelacionadas.

Preferivelmente, a presente invenção abrangeseqüências que são complementares a seqüências que sãocapazes de hibridizar sob condições de alta rigidez oucondições de rigidez intermediárias para seqüências denucleotídeos que codificam polipeptídeos que tem aspropriedades específicas como definidas aqui.

Mais preferivelmente, a presente invenção abrangeseqüências que são complementares a seqüências que sãocapazes de hibridizar debaixo de condições de rigidez altas(por exemplo, 65°C e OiIxSSC {lxSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 MNa-citrato e pH 7,0}) para seqüências de nucleotídeos quecodificam polipeptídeos que tem as propriedades específicascomo definidas aqui.

A presente invenção também se refere às seqüências denucleotídeos que podem se hibridizar com as seqüências denucleotídeos discutidas aqui (incluindo seqüênciascomplementares a essas discutidas aqui).

A presente invenção também se refere às seqüências denucleotídeos que são complementares às seqüências que podemse hibridizar com as seqüências de nucleotídeos discutidasaqui (incluindo seqüências complementares a essasdiscutidas aqui).

Também incluído dentro do escopo da presente invençãoestão seqüências de polinucleotídeo que são capazes dehibridizar as seqüências de nucleotídeos discutidas aquidebaixo de condições de rigidez intermediária a máxima.

Em um aspecto preferido, a presente invenção cobreseqüências de nucleotídeos que podem hibridizar com asseqüências de nucleotídeos discutidas aqui, ou ocomplemento das mesmas, debaixo de condições de rigidez(por exemplo, 50°C e 0,2xSSC).

Em um aspecto mais preferido, a presente invençãocobre seqüências de nucleotídeos que podem hibridizar comas seqüências de nucleotídeos discutidas aqui, ou ocomplemento das mesmas, debaixo de condições de rigidezaltas (por exemplo, 650C e 0,lxSSC).

EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS

Uma seqüência de nucleotídeos para uso na presenteinvenção ou para codificar um polipeptídeo que tem aspropriedades específicas como definido aqui pode serincorporado em um vetor recombinante replicável. 0 vetorpode ser usado para reproduzir e expressar a seqüência denucleotídeo, na forma de polipeptídeo, em e/ou de umacélula hospedeira compatível. A expressão pode sercontrolada usando seqüências de controle que incluem ospromotores/realçadores e outros sinais de regulação deexpressão. Os promotores procarióticos e promotoresfuncionais em células eucarióticas podem ser usados.Promotores tecido específico ou estímulos específicos quepodem ser usados. Promotores quiméricos também podem serusados compreendendo elementos de seqüência de dois ou maispromotores diferentes descritos acima.

O polipeptídeo produzido por uma célula hospedeirarecombinante por expressão da seqüência de nucleotídeospodem ser secretados ou podem ser intracelularmente contidodependendo da seqüência e/ou do vetor usado. As seqüênciasde codificação podem ser projetadas com seqüências de sinalque direcionam a secreção da substância que codificaseqüências por um procariótico particular ou membrana decélula de eucariótico.

VETOR DE EXPRESSÃO

0 termo "vetor de expressão" significa um constructocapaz de expressão in vivo ou in vitro.

Preferivelmente, o vetor de expressão está incorporadono genoma do organismo. 0 termo "incorporado" abrangepreferivelmente modalidade estável no genoma.

A seqüência de nucleotídeos da presente invenção oupara codificação de um polipeptídeo que tem as propriedadesespecíficas como definido aqui pode estar presente em umvetor no qual a seqüência de nucleotídeos é operavelmenteunida a seqüências reguladoras tal que as seqüênciasreguladoras são capazes de prover a expressão da seqüênciade nucleotídeos por um organismo hospedeiro satisfatório,isto é, o vetor é um vetor de expressão.

Os vetores da presente invenção podem sertransformados em uma célula hospedeira satisfatória comodescrito abaixo para prover a expressão de um polipeptídeoque tem as propriedades específicas como definido aqui.

A escolha de vetor, por exemplo, plasmídeo, cosmídeo,vírus ou vetor de fago, dependerão freqüentemente da célulahospedeira na qual será introduzido.

Os vetores podem conter um ou mais genes de marcadorselecionávéis - como um gene que confere resistência aantibiótico, por exemplo, resistência a ampicilina,canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Alternativamente,a seleção pode ser realizada através de co-transformação(como descrito em W091/17243).

Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo,para a produção de RNA ou usado para transf eccionar outransformar uma célula hospedeira.

Desta forma, em uma modalidade adicional, a invençãoprovê um método de fazer seqüências de nucleotídeos dapresente invenção ou seqüências de nucleotídeos quecodificam polipeptídeos que tem as propriedades específicascomo definido aqui introduzindo uma seqüência denucleotídeos em um vetor de replicável, introduzindo ovetor em uma célula hospedeira compatível, e cultivando acélula hospedeira debaixo de condições que provocamreplicação do vetor.

O vetor pode adicionalmente compreender uma seqüênciade nucleotídeos que permite o vetor se reproduzir na célulahospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são asorigens de replicação de pUC19 de plasmídeos, pACYC177,pUB110, pE194, ρAMBl e pIJ702.

SEQÜÊNCIAS REGULADORAS

Em algumas aplicações, uma seqüência de nucleotídeospara uso na presente invenção ou uma seqüência denucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem aspropriedades especificas como definida aqui pode seroperavelmente unida a uma seqüência reguladora que é capazde prover a expressão da seqüência de nucleotídeo, comopela célula hospedeira escolhida. Por via de exemplo, apresente invenção cobre um vetor que compreende a seqüênciade nucleotideos da presente invenção operavelmente unido atal uma seqüência reguladora, isto é o vetor é um vetor deexpressão.

O termo que "operavelmente unido" se refere a umajustaposição em que os componentes descritos estão em umarelação que lhes permite funcionar da sua maneira planejadaUma seqüência reguladora "operavelmente unida" a umaseqüência de codificação é ligada de tal um modo que aexpressão da seqüência de codificação é alcançada debaixode condições compatíveis com as seqüências de controle.

O termo "seqüências reguladoras" inclui os promotorese realçadores e outros sinais de regulação de expressão.

O termo "promotor" é usado no senso normal da técnica,por exemplo, um sítio de ligação de polimerase de RNA.

A expressão aumentada da seqüência de nucleotxdeos quecodifica a enzima que tem as propriedades específicas comodefinida aqui também pode ser alcançada pela seleção deregiões reguladoras heterológas, por exemplo, o promotor,líder de secreção e regiões de terminação.

Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos dapresente invenção pode ser operavelmente unida a pelo menosum promotor.

Exemplos de promotores satisfatórios para dirigir atranscrição da seqüência de nucleotídeos dentro umhospedeiro bacteriano, fúngico ou de levedura é bemconhecido na técnica.

CONSTRUCTOS

O termo "constructo" - que é sinônimo com termos como"conjugado", "cassete" e "híbrido" - inclui uma seqüênciade nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem aspropriedades específicas como definida aqui para uso deacordo com a presente invenção diretamente ou indiretamentepreso a um promotor. Um exemplo de um anexo indireto é aprovisão de um grupo mais espacial satisfatório como umaseqüência de intron, tal como o Shl-intron ou o intron deADH, intermediado o promotor e a seqüência de nucleotídeosda presente invenção. O mesmo é verdade para o termo"fundido" em relação à presente invenção que compreendeligação direta ou indireta. Em alguns casos, as condiçõesnão cobrem a combinação natural da seqüência denucleotídeos que ordinariamente codifica para a proteínaassociada com o promotor de gene de tipo selvagem e quandoeles estão ambos em seu ambiente natural.

O constructo pode conter até mesmo ou pode expressarum marcador do qual permite a seleção do constructogenético.

Para algumas aplicações, preferivelmente o constructocompreende pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dapresente invenção ou uma seqüência de nucleotídeos quecodificam um polipeptídeo que tem as propriedadesespecíficas como aqui definida operavelmente unido a umpromotor.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

O termo "célula hospedeira" - em relação à presenteinvenção compreende qualquer célula que ou compreende umaseqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo quetem as propriedades específicas como definida aqui ou umvetor de expressão como descrito acima e que é usado naprodução recombinante de um polipeptídeo que tem aspropriedades específicas como definida aqui.

Desta forma, uma modalidade adicional da presenteinvenção provê células hospedeiras transformadas outransfeccionadas com uma seqüência de nucleotídeos dapresente invenção ou uma seqüência de nucleotídeos queexpressam um polipeptídeo que tem as propriedadesespecíficas como definida aqui. As células serão escolhidaspara ser compatível com o dito vetor e podem ser, porexemplo, células procarióticas (por exemplo, bacteriana),fúngica, levedura ou de planta. Preferivelmente, as célulashospedeiras não são células humanas.

Exemplos de organismos hospedeiros bacterianossatisfatórios são bactérias gram negativas ou bactériasgram positivas.

Dependendo da natureza da seqüência de nucleotídeosque codifica um polipeptídeo que tem as propriedadesespecíficas como definido aqui, e/ou o desejo paraaprocessamento adicional da proteína expressa, hospedeiroseucarióticos tal como leveduras ou outros fungos pode serpreferidos. Em general, são preferidas células de leveduraem cima de células fúngicas porque elas são mais fáceis demanipular. No entanto, algumas proteínas ou são secretadaspobremente da célula de levedura, ou em alguns casos não éprocessado corretamente (por exemplo, hiperglicosilação emlevedura). Nestes exemplos, deveria ser selecionado umorganismo de anfitrião fúngico diferente.

0 uso de células hospedeiras satisfatórias, comocélulas hospedeiras de levedura, fúngicas e de planta -pode prover para modificações pós-traducional (por exemplo,miristoilação, glocosilação, mutilação, lapidação efosforilação de tirosina, serina ou treonina) como pode sernecessário para conferir conferir atividade biológica ótimaem produtos de expressão recombinante da presente invenção.

A célula hospedeira pode ser uma cepa proteasedeficiente ou sem protease.

ORGANISMO

0 termo "organismo" em relação à presente invençãocompreende qualquer organismo que poderia compreender umaseqüência de nucleotídeos de acordo com a presente invençãoou uma seqüência de nucleotídeos que codifica para umpolipeptídeo que tem as propriedades específicas comodefinida aqui e/ou produtos obtidos do mesmo.

Organismos satisfatórios podem compreender umprokariota, fungo, levedura ou uma planta.

O termo "organismo transgênico" em relação a presenteinvenção compreende qualquer organismo que compreende umaseqüência de nucleotídeos que codifica para um polipeptídeoque tem as propriedades específicas como definido aqui e/ouos produtos obtidos do mesmo, e/ou em que um promotor podepermitir expressão da seqüência de nucleotídeos quecodifica para um polipeptídeo que tem as propriedadesespecíficas como definida aqui dentro do organismo.

Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos estáincorporada no genoma do organismo.O termo "organismo transgênico" não cobre seqüênciasque codificam nucleotideo nativo no seu ambiente naturalquando eles estiverem sob o controle do seu promotor nativoque também está em seu ambiente natural. Então, o organismotransgênico da presente invenção compreende um organismoque compreende qualquer um de, ou combinações de, umaseqüência de nucleotídeos que codifica para um polipeptídeoque tem as propriedades específicas como definida aqui,constructo como definido aqui, vetores como definido aqui,plasmídeos como definido aqui, células como definido aqui,ou os produtos dos mesmos. Por exemplo, o organismotransgênico também pode compreender uma seqüência denucleotídeos que codifica para um polipeptídeo que tem aspropriedades específicas como definida aqui sob o controlede um promotor de heterólogo.

TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS / ORGANISMOComo indicado anteriormente, o organismo hospedeiropode ser um procariótico ou um organismo de eucariótico.

Exemplos de hospedeiros de procarióticos satisfatórioscompreendem o E. coli e Bacillus subtilis.

Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma bactéria,preferivelmente uma bactéria gram-positiva, preferivelmenteuma célula hospedeira selecionado de Actinobacteria, comoBifidobacteria e Aeromonas, particularmente preferivelmenteAeromonas salmonicida. Ainda mais preferido éActinomicetales como Corynebacteria, em particular deCorynebacterium glutamicum e Nocardia. Particularmentepreferido é Streptomycetaceae, como Streptomyces,especialmente o S. Iividans.

Um hospedeiro microbiano pode ser usado para expressãodo gene de galactolipase, por exemplo, Eubaeteria, Areheaou Fungi, incluindo levedura. São preferidos Eubactéria,por exemplo, Firmieutes (bactérias gram positivas de baixoGC), tal como Baeillus subtilis e outras espécies deBaeillus, bactérias de ácido láctico como espécies degêneros Laetobaeillus e Lactoeoceus.

Também preferido é Proteobaeteria Gram-negativo, emparticular Gammaproteobaeteria, como espécies de hospedeiroque pertencem aos gêneros Pseudomonas, XanthomonasrCitrobaeter e Eseheriehia, especialmente de Eseheriehiaeoli.

Preferivelmente, as espécies de hospedeiro são umhospedeiro de expressão Gram positiva como Aeromonassalmonicida, de Streptomyees lividans ou de Corynebaeteriumglutamicum como detalhado na GB número de depósito0513859.9.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é do mesmogênero que as espécies de hospedeiro nativas, isto é, ogene recombinante é re-introduzido e expresso em espéciesdo mesmo gênero como as espécies das quais o generecombinante foi isolado.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é dasespécies de hospedeiro nativas, isto é, o gene recombinanteé re-introduzido e expresso nas mesmas espécies das quais ogene recombinante foi isolado.

Ensinamentos na transformação de hospedeirosprocarióticos são bem documentados na técnica, por exemplo,veja Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2a edição, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Seum hospedeiro procariótico é usado então a seqüência denucleotídeos pode precisar ser modificada adequadamente,antes de transformação - como por remoção de introns.

Em outra modalidade o organismo transgênico pode seruma levedura.

Células de fungos filamentosos podem ser transformadasusando vários métodos conhecidos na técnica - tal como umprocesso que envolve a formação de protoplasto e atransformação dos protoplastos seguido por regeneração daparede de célula em uma maneira conhecida. O uso deAspergillus como um microrganismo hospedeiro é descrito emEP 0238 023.

Outro organismo hospedeiro pode ser uma planta. Umarevisão das técnicas gerais usadas por transformar plantaspode ser achada em artigos por Potrykus (Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) e Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech março/abril 1994 17-27).

Adicionalmente ensinos em transformação de planta podem serachados dentro EP-A-0449375.

Ensinos gerais na transformação de fungos, leveduras eplantas são apresentados em seções seguintes.

FUNGO TRANSFORMADO

Um organismo hospedeiro pode ser um fungo - tal comoum fungo filamentoso. Exemplos de tais hospedeirossatisfatórios compreendem qualquer membro que pertence aosgêneros Thermomyces, Acremoniumf Aspergillus, Penicillium,Mucor, Neurospora, Trichoderma e assemelhados.

Ensinos em transformar fungos filamentosos sãorevisados em US-A-5741665 o qual relata técnicas padrãopara transformação de fungos filamentosos e cultivo dosfungos que são bem conhecidos na técnica. Uma revisãoextensa de técnicas como aplicado a N. crassa é achado, porexemplo, no Davis e de Serres, Methods Enzymol (1971) 17 A:79-143.

Ensinos adicionais em transformar fungos filamentosossão revisados em US-A-5674707.

Em um aspecto, o organismo hospedeiro pode ser dogênero Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

Um Aspergillus transgênico de acordo com a presenteinvenção também pode ser preparado seguindo, por exemplo,os ensinos de Turner G. 1994 (Vectors for geneticmanipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors)Aspergillus: 50 years on. Progress in industrialmicrobiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666).

A expressão de gene em fungos filamentosos foirevisada em Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 maio;20(5): 200-6, Archer & Peberdy Grit Rev Biotechnol (1997)17 (4) : 273-306.

LEVEDURA TRANSFORMADA

Em outra modalidade, o organismo transgênico pode seruma levedura.

Uma revisão dos princípios de expressão de geneheterólogo em levedura é provida em, por exemplo, MethodsMol Biol (1995), 49: 341-54, e Curr Opin Biotechnol (1997)outubro; 8(5): 554-60.

Nesta consideração, levedura - tal como as espéciesSaccharomyces cerevisi ou de Pichia pastoris (veja EMSMicrobiol Rev (2000 24(1): 45-66), pode ser usado como umveículo para expressão de gene heterólogo.

Uma revisão dos princípios de expressão de gene deheterólogo em Saccharomyees eerevisiae e a secreção deprodutos de gene é determinada por E Hinchcliffe E Kenny(1993, "Yeast as a vehicle for the expression ofheterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose e JStuart Harrison, eds, 2a edição, Aeademic Press Ltd.).

Para a transformação de levedura, foram desenvolvidosvários protocolos de transformação. Por exemplo, umSaccharomyces transgênico de acordo com a presente invençãopode ser preparado seguindo os ensinos de Hinnen et al,(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe USA 75, 1929) ; Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275,104); e Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

As células de levedura transformadas usando váriosmarcadores seletivos podem ser selecionadas - tal comomarcadores auxotróficos, marcadores de resistênciaantibióticos dominantes.

Um organismo hospedeiro de levedura satisfatório podeser selecionado de espécies de levedurasbiotecnologicamente pertinentes tal como, mas não limitadoa, espécies de levedura selecionadas de Pichia spp., Spp deHansenula spp., Kluyveromyces spp., Yarrowinia spp., Spp deSaccharomyees spp., incluindo S. eerevisiae, ou deSchizosaccharomyce spp., incluindo Schizosaceharomyee pombeUma cepa das espécies de levedura de metilotróficasPichia pastoris pode ser usada como o organismo hospedeiro.Em uma modalidade, o organismo hospedeiro pode ser umaespécie de Hansenula, como H. polymorpha (como descrito emWOOl/3 9544).

CÉLULAS DE PLANTAS / PLANTA TRANSFORMADA

Um organismo hospedeiro satisfatório para a presenteinvenção pode ser uma planta. Uma revisão das técnicasgerais pode ser achada em artigos por Potrykus {Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) e Christou(Agro-Food-Industiy Hi-Tech março/abril 1994 17-27), ou naWOOl/163 08.

SECREÇÃO

Geralmente, é desejável que o polipeptídeo sejasecretado do hospedeiro de expressão no meio de cultura deonde a enzima pode ser mais facilmente recuperada. Deacordo com a presente invenção, a seqüência líder desecreção pode ser selecionada com base no hospedeiro deexpressão desejado. Seqüências de sinal híbridas tambémpodem ser usadas no contexto da presente invenção.

Exemplos típicos de seqüências líder de secreçãoheterólogas são aquelas que se originam do gene daamiloglicosidase (AG) fúngica (glaA - ambas as versões de18 e 24 aminoácidos, por exemplo, de Aspergillus) , o genedo fator "a" (leveduras, por exemplo Saccharomyces,Kluyveromyces e Hansenula) ou o gene da a-amilase(Bacillus).

DETECÇÃO

Uma variedade de protocolos para detectar e medir aexpressão da seqüência de aminoácidos é conhecida natécnica. Exemplos incluem o ensaio de imunossorvente ligadoà enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e a escolha decélulas ativadas fluorescentes (FACS).

Uma ampla variedade de marcadores e técnicas deconjugação é conhecida pelos indivíduos versados na técnicae podem ser usadas em vários ensaios de aminoácidos eácidos nucléicos.

Uma variedade de companhias, tais como a PharmaciaBiotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) e USBiochemical Corp (Cleveland, OH) fornecem kits comerciais eprotocolos para esses procedimentos.

Moléculas repórteres adequadas ou marcadores incluemaqueles radionuclídeos, enzimas, agentes de fluorescência,quimiluminescência ou cromogênicos assim como substratos,cofatores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes.Patentes ensinando o uso de tais marcadores incluem a US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345;US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 e US-A-4,366,241.

Também imunoglobulinas recombinantes podem serproduzidas conforme mostrado na US-A-4,816,567.PROTEÍNAS DE FUSÃO

Um polipeptídeo que tem as propriedades específicascomo definido aqui pode ser produzido como uma proteína defusão, por exemplo, para ajudar na extração e purificaçãodos mesmos. Exemplos de parceiros de proteína de fusãoincluem a glutationa-S-transferase (GST), 6xHis, GAL4(ligação de DNA e/ou domínios de ativação de transcrição) e(β-galactosidase). Também pode ser conveniente incluir umsítio de clivagem proteolítica entre o parceiro da proteínade fusão e a seqüência da proteína de interesse parapermitir a remoção ou a fusão das seqüências de proteína.

Preferivelmente, a proteína de fusão não irá impedir aatividade da seqüência protéica.

Sistemas de expressão de gene de fusão na E. coliforam revisados na Curr Opin Biotechnol (1995) 6 (5): 501-6.

Em outra modalidade da invenção, a seqüência deaminoácidos de um polipeptídeo que tem as propriedadesespecíficas como definido aqui pode estar ligada a umaseqüência heteróloga para codificar uma proteína de fusão.

Por exemplo, para fazer a triagem de bibliotecas depeptídeos para agentes capazes de afetar a atividade dasubstância, pode ser útil para codificar uma substânciaquimérica expressando um epítopo heterólogo que sejareconhecido por um anticorpo comercialmente disponível.A invenção será descrita agora, por via de exemplosomente, com referência para as seguintes figuras eexemplos.

Figura 1 mostra o perfil da atividade de lipídioaciltransferase (ensaio PNP-caprilato) obtido apóscromatografia de troca aniônica (IEC);

Figura 2 mostra os resultados de análises de SDS-PAGEde frações purificadas de lipídio aciltransferase (4-12 %Mes, + DTT, 40/10 μΐ da amostra foram aplicadas ao gel):

Pista 1. Amostra de lipídio aciltransferase apósdessalinização, 40 μΐ foram aplicados ao gel.

Pista 2. Amostra de lipídio aciltransferase apósdessalinização, 10 μΐ foram aplicados ao gel.

Pista 3. Lipase de lipídio aciltransferasepurificada após IEC (grupo 27-39) , 40 μΐ foramaplicados ao gel.

Pista 4. Lipase de lipídio aciltransferasepurificada após IEC (grupo 27-39, 10 μΐ foramaplicados ao gel;

Figura 3 mostra um TLC (Solvente 4) de produtos dereação do tratamento de lipídio aciltransferase de amostrasde óleo de grão de soja de acordo com a Tabela 2. Comoreferência, foi analisado também uma fosfatidilcolina (PC);Figura 4 mostra um TLC (Solvente 1) de produtos dereação do tratamento de lipídio aciltransferase de amostrasde óleo de grão de soja de acordo com a Tabela 2. Comoreferência, foram analisados também ácido graxo livre (FFA)e Mono-di-triglicerídeo (TRI / DI / MONO);

Figura 5 mostra um TLC (Solvente 5) de produtos dereação do tratamento de lipídio aciltransferase de amostrasde óleo de grão de soja de acordo com a Tabela 2. Comoreferência, também foram analisados o Colesterol (CHL) e oEster de colesterol (CHL-éster);

Figura 6 mostra um TLC (Solvente 4) de produtos dereação do tratamento de lipídio aciltransferase ou LecitaseUltra™ de amostras de óleo de grão de soja de acordo com aTabela 3 durante 20 horas;

Figura 7 mostra um TLC (Solvente 5) de produtos dereação do tratamento de lipídio aciltransferase ou LecitaseUltra™ de amostras de óleo de grão de soja de acordo com aTabela 3 durante 2 0 horas. Também foram analisados Ester decolesterol (éster de CHL); Mono-di-Triglicerídeo (MONO / DI/ TRI) e esterol de planta como referências. Identificaçãode ácido graxo livre (FFA) também é indicada;

Figura 8 mostra um TLC (Solvente 4) de produtos dereação do tratamento de lipídio aciltransferase ou LecitaseUltra™ de amostras de óleo de grão de soja de acordo com aTabela 3 durante 4 horas;Figura 9 mostra um TLC (Solvente 5) de produtos dereação do tratamento de lipídio aciltransferase ou LecitaseUltra™ de amostras de óleo de grão de soja de acordo com aTabela 3 durante 4 horas. Também foram analisados Ester decolesterol (éster de CHL); Mono-di-Triglicerídeo (MONO / DI/ TRI) e esterol de planta como referências. Identificaçãode ácido graxo livre (FFA) também é indicada;

Figura 10 mostra a seqüência de aminoácidos de umalipídio aciltransferase madura mutante de Aeromonassalmonicida (GCAT) com uma mutação de Asn80Asp(notavelmente, aminoácido 80 está na seqüência madura);

Figura 11 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 1) um lipídio acil transferase de Aeromonas hydrophila(ATCC #7 965);

Figura 12 mostra uma seqüência consenso pfam00657 debanco de dados versão 6 (SEQ ID No. 2);

Figura 13 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 3) obtido do organismo Aeromonas hydrophila (P10480;GI:121051);

Figura 14 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 4) obtido do organismo Aeromonas salmonicida(AAG0984 04; GL9964017);

Figura 15 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 5) obtido do organismo Streptomyces coelicolor A3 (2)(número de acesso do Genbank NP_631558);

Figura 16 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 6) obtido do organismo Streptomyces coelicolor A3 (2)(número de acesso do Genbank: CAC42140);

Figura 17 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 7) obtido do organismo Saccharomyces cerevisiae (númerode acesso do Genbank P41734);

Figura 18 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 8) obtido do organismo Ralstonia (número de acesso doGenbank: AL64 6 052);

Figura 19 mostra SEQ ID No. 9. Scoel código de acessode proteína do NCBI CAB39707fl GL4539178 proteínahipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3 (2)];

Figura 2 0 mostra uma seqüência de aminoácidos mostradacomo SEQ ID No. 10. Scoe2 código de acesso de proteína doNCBI CACO1477,1 GL9716139 proteína hipotética conservada[Streptomyces coelicolor A3 (2)] ;

Figura 21 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 11) Scoe3 código de acesso de proteína do NCBICAB88833,1 GL7635996 proteína secretada putativa.[Streptomyces coelicolor A3 (2)];

Figura 22 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 12) Scoe4 código de acesso de proteína do NCBICAB8 94 50,1 GL7672261 proteína secretada putativa.[Streptomyces coelicolor Α3 (2)];

Figura 2 3 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 13) ScoE, código de acesso de proteína do NCBICAB62724,1 GI:6562793 lipoproteína putativa [Streptomycescoelicolor A3 (2)];

Figura 24 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 14) Sriml código de acesso de proteína do NCBIAAK84 028,1 GL15082088 GDSL-Iipase [Streptomyces rimosus];

Figura 2 5 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 15) de uma lipídio aciltransf erase de Aeromonassalmonicida subsp. Salmonicida (ATCC#14174);

Figura 26 mostra um TLC (solvente 4) de amostra 1 a 10de óleo de soja cru tratado por 2 0 horas com enzimas deacordo com a Tabela 4. PC é fosfatidilcolina adicionado em5 concentrações diferentes (material de referência).

Figura 27 mostra um TLC (Solvente 5) de produtos dereação de tratamento de lipídio acil transferase ouLecitase Ultra™ de amostras de óleo de soja cruas de acordocom a Tabela 4 (20 horas). Também foram analisados éster decolesterol (CHL-éster), Mono-di-Triglicerídeo (MONO / DI /TRI), e esterol de planta como referências. Identificaçãode ácido graxo livre também é indicada.

Figura 28 mostra a SEQ ID No 17 que é a seqüência deaminoácidos de uma lipídio aciltransferase de Cândidaparapsilosis;

Figura 29 mostra a SEQ ID No 18 que é a seqüência deaminoácidos de uma lipídio aciltransferase de Cândidaparapsilosis;

Figura 30 mostra o alinhamento 1;

Figura 31 mostra a SEQ ID No. 19. Scoel código deacesso de proteína do NCBI CAB39707.1 GL4539178 proteínahipotética conservada [Streptomyces coelicolor A3 (2)];

Figura 32 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 25) de constructo de fusão usado para mutagênese dogene da lipídio aciltransferase de Aeromonas hydrophila. Osaminoácidos sublinhados são um peptídeo sinal xilanase;

Figura 33 mostra uma seqüência de polipeptídeo de umaenzima lipídio aciltransferase de Streptomyces (SEQ ID No.26) ;

Figura 34 mostra uma seqüência de polipeptídeo de umaenzima lipídio aciltransferase de Thermobifida (SEQ ID No.27);

Figura 35 mostra uma seqüência de polipeptídeo de umaenzima lipídio aciltransferase de Thermobifida (SEQ ID No.28);

Figura 36 mostra um polipeptídeo de uma enzima lipídioaciltransferase de aminoácido GDSx 300 de Corynebacteriumefficiens (SEQ ID No. 29);Figura 37 mostra um polipeptídeo de uma enzima lipídioaciltransferase de aminoácido GDSx 2 84 de Novosphingobiumaromaticivorans (SEQ ID No. 30);

Figura 3 8 mostra um polipeptídeo de uma enzima lipídioaciltransferase de aminoácido GDSx 269 de Streptomycescoelicolor (SEQ ID No. 31)

Figura 3 9 mostra um polipeptídeo de uma enzima lipídioaciltransferase de aminoácido GDSx 269 de Streptomycesavermitilis (SEQ ID No. 32);

Figura 4 0 mostra um polipeptídeo de uma enzima lipídioaciltransferase de Streptomyces (SEQ ID No. 33);

Figura 41 mostra uma representação de tira daestrutura cristalina 1FVN.PDB que tem glicerol no sítioativo. A Figura foi feita usando o visualizador Deep ViewSwiss-PDB;

Figura 42 mostra a Estrutura de Cristal 1IVN.PDB -Vista Lateral usando o visualizador Deep View Swiss-PDB,com glicerol em sítio ativo - resíduos dentro de 10Á desítio ativo de glicerol são coloridos de preto;

Figura 43 mostra o alinhamento 2;

Figura 44 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 34) obtido do organismo Aeromonas hydrophila (P10480;GI:121051) (notavelmente, esta é a seqüência madura).

Figura 45 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID No.35) de um mutante de lipídio aciltransferase madura deAeromonas salmonicida (GCAT) (notavelmente, esta é aseqüência madura).

Figura 4 6 mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNo. 36) de Streptomyces thermosacchari.

Figura 4 7 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 37) de Streptomyces thermosacchari.

Figura 4 8 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 38) de Thermobifida fusca / aminoácido GDSx 548.

Figura 4 9 mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNo. 39) de Thermobifida fusca.

Figura 50 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 40) de Thermobifida fusca / GDSx.

Figura 51 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 41) de Corynebacterium efficiens / aminoácido GDSx 300.

Figura 52 mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNo. 42) de Corynebacterium efficiens.

Figura 53 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 43) de S. coelicolor / aminoácido GDSx 268.

Figura 54 mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNo. 44) de S. coelicolor.

Figura 55 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 45) de S. avermitilis.

Figura 56 mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNo. 46) de S. avermitilis.

Figura 57 mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ IDNo. 47) de Thermobifida fusca / GDSx.

Figura 58 mostra uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDNo. 48) de Thermobifida fusca / GDSx.

Figura 59 mostra TLC (Solvente 4) de produtos dereação de tratamento de enzima de amostras de óleo de sojacruas de acordo com a Tabela 6. Como referência, foianalisado também fosfatidilcolina (PC) . Também sãoindicados PE (fosfatidiletanolamina (PE) elisofosfatidilcolina (LPC).

Figura 60 mostra TLC (Solvente 5) de produtos dereação de tratamento de enzima de amostras de óleo de sojacruas de acordo com a Tabela 6. Referências: Ester decolesterol, mono-di - triglicerídeo e esterol de planta.Ácido graxo livre (FFA) também é indicado.

Figura 61 mostra um alinhamento do L131 e homólogos deS. avermitilis e T. fusca ilustra que a conservação domotivo GDSx (GDSY em L131 e S. avermitilis e T. fusca) , oGANDY box que é GGNDA ou GGNDL e o bloco de HPT(considerado como sendo a histadina catalítica conservada).

Estes três blocos conservados são realçados.

EXEMPLOS

O propósito deste estudo foi investigar o possível usode uma lipídio aciltransferase (às vezes referido aqui comoum Acil-transferase de Colesterol de glicerofosfolipídio(GCAT)) para degomagem de óleo vegetal como óleo de grão desoja, óleo de girassol e óleo de semente de canola.

Um propósito deste estudo foi investigar se emparticular um mutante de lipídio aciltransferase (N80D) éuma enzima mais satisfatória para degomagem. De estudosanteriores é conhecido que a lipídio aciltransferase(particularmente GCATs) catalisa a acil-transferase deácido graxo de fosfolipídio a esteróis para formarlisolecitina e éster de esterol.

0 estudo presente foi conduzido em um modelo baseadoem óleo de grão de soja refinado onde foram somadosfosfatidilcolina e esteróis de planta. Este modelo foiselecionado porque é mais fácil de analisar o produto dereação em um sistema modelo em vez de usar óleo de soja cru.

0 processo de degomagem enzimática de óleos de plantaincluindo óleo de soja e óleo de semente de canola está seexpandindo em anos recentes porque este processo é umprocesso mais barato e melhor para remover lecitina de óleo.

A enzima usada para degomagem de óleo é um fosfolipase Al(Lecitase Ultra™ ou fosfolipase pancreático A2 - NovozymesA/S, Dinamarca).

Uma vantagem da enzima da presente invenção quandousado em degomagem comparado com fosfolipase Alde técnicaanterior é que a enzima de acordo com a presente invençãofacilita a formação de éster de esterol durante o processode degomagem e contribui à acumulação de éster de esterolcom os quais não são alcançados o fosfolipase atualmenteusado Al (Lecitase Ultra™).

Materiais e métodos.

Enzimas.

- Lipidio aciltransferase de acordo com a presenteinvenção: enzima de Aeromonas salmonicidae com uma mutaçãoAsn80Asp (aminoácido 8 0 da enzima madura) (SEQ ID No. 16(veja Figura 10));

- Lecitase Ultra (#3108) de Novozymes, DinamarcaÓleo de grão de soja: Óleo de soja IP (Artigo No.005018/ nr de grupo T -618-4)

Lecitina: L -a Fosfatidilcolina 95 % de planta (Avanti#441601)

Esterol de planta: Generol 122 N de Henkel, Alemanha.

Tocoferol: Alfa-tocoferol (Artigo no. .050908/lot.nr4010140554)

Atividade de Fosfolipase

Substrato

0,6 % L -a Fosfatidilcolina 95 % de Planta (Avanti#441601), 0,4 % Triton-X 100 (Sigma X-100) e 5 mM que CaCl2foi dissolvido em 0,05M HEPES tampão pH 7.

Procedimento de análise:

400 μΐ de substrato foram acrescentados a um tuboEppendorf de 1,5 ml e colocados em um Eppendorf Thermomixera 37°C durante 5 minutos. Ao tempo T = O min, 50 μΐ desolução de enzima foi adicionada. Também um branco com águaem vez de enzima foi analisado. A amostra foi misturada a10*100 rpmin um Eppendorf Thermomixer a 370C durante 10minutos. Ao tempo T = 10 min o tubo de Eppendorf foicolocado em outro thermomixer a 990C durante 10 minutospara parar a reação.

O ácido graxo livre nas amostras foi analisado usandoo kit NEFA C de WAKO GmbH.

A atividade de enzima PLU-NEFA pH 7 foi calculada comomicromole de ácido graxo produzido por minuto debaixo decondições de ensaio.

HPTLC

Aplicador: TLC automático Classificador 4, CAMAG

Placa HPTLC: 20 χ 10 cm, Merck no. 1.05641. Ativado 30min. a 160°C antes de uso.

Aplicação: 1 μΐ de uma solução a 8 % de óleo em tampãoé aplicado à placa de HPTLC usando aplicador de TLCAutomático.

Corrida do tampão 1: P-éter: Metila-tert-butil-éter:Ácido acético 60:40:1

Corrida do tampão 4: clorofórmio.Metanol: água 75:25:4

Corrida do tampão 5: P-éter: Metila-tert-butileter:

Ácido acético 70:30:1

Tempo de aplicação / Eluição:

Corrida do Tampão 1: 12 min

Corrida do tampão 4: 20 min

Corrida do Tampão 5: 10 min

Desenvolvimento

A placa é seca em um forno a 160°C durante 10 minutos,é esfriado, e é imerso em 6 % de acetato de cobre em 16 %H3PO4. Seca adicionalmente por 10 minutos a 160°C eavaliado diretamente.

EXEMPLO 1: Purificação de enzima

Amostra: a amostra de lipídio aciltransferase(AsnSOAsp) (SEQ ID No. 16) foi filtrada por filtro de0,8/0,22 μηι. 510 ml do filtrado foi coletado.

Etapa 1. Dessalinização, Sephadex 25 G, 3,21 gel (10cm id)

A coluna de Sephadex foi preparada como descrito pelofabricante (Amersham biosciences). A coluna foi equilibradacom 2 0 mM de tampão Na-P, pH 8,0. A amostra (510 ml) foiaplicada à coluna a uma taxa de fluxo de 25 ml/min. 815 mlde amostra dessalinizada foi coletada e mantida s +4°C.Etapa 2. Cromatografia de troca aniônica, Q-SepharoseFF 300 ml de gel (XK 50). A coluna Q-Sefharose FF foipreparada como descrito pelo fabricante (Amershambiosciences). A coluna foi equilibrada com 20 mM de tampãoNa-P, pH 8,0. A amostra dessalinizada foi aplicada à colunaa uma taxa de fluxo de 15 ml/min. A coluna foi lavada entãocom tampão A. A lipase foi eluída com um gradiente linearde 0-0,4 M NaCl em 20 mM de tampão Na-P (pH 8,0, tampão B).Foram coletadas frações de 15 ml durante a corrida inteira.

A lipase foi eluída a aprox. 0,2 M de NaCl, e nenhumaatividade de lipase foi detectada corrida pelas frações.

Ensaio de enzima baseado em PNP-caprilato

0 ensaio foi executado usando PNP-caprilato comosubstrato como segue:

10 mg de substrato foi dissolvido em 1 ml de etanol efoi misturado com 9 ml de 50 mM Tris - tampão de HCL (pH7,3) que contém 0,4 % TXlOO.

240 μΐ de substrato foi pré-incubado a 3 5 graus C. Areação foi iniciada pela adição de 25 μΐ de amostra/branco.

A mistura foi incubada às 35 0C por 5 min com agitação.

Usando um espestrofotômetro, a formação de PNP foicontinuamente medida a 410 nm. A corrida em branco contémtodos os componentes com tampão em vez de amostra. Umaunidade de atividade de lipase foi definida como aquantidade de enzima que libera 1 μΐ de ácido caprílicolivre por minuto a 35°C.

Determinação de peso de molécula e pureza.

SDS-PAGE foi levado a cabo em um 4 - 12 % de gel deNu- PAGE (+ DTT) e clorante Coomassie de acordo com asinstruções de fabricantes (Novex, USA). O marcador padrãoera SEE Blue Plus2 e foi obtido de Novex, USA.

Resultados

O crotatograma da purificação da Cromatografia deTroca Iônico (IEC - do inglês Ion Exchange Chromatography)do mutante de lipídio aciltransferase N80D é mostrado emFig. 1. As frações coletadas foram analisadas paraatividade de lipase (baseado em ensaio de PNP-Caprilato). Aatividade das frações é ilustrada em Figura 1-a.

As frações que contêm atividade de lipídioaciltransferase (27 - 39, 195 ml) foram agrupadas. Arecuperação final da lipídio aciltransferase em partepurificado era aprox. 80 % (baseado em pNP-Caprilatoanalise).

As frações da lipídio aciltransferase purificado foramsubmetidas a eletroforese de gel SDS-PAGE.

0 gel de SDS-PAGE revelou proteína de lipídioaciltransf erase com um peso molecular de aprox. 28 KDa. Alipídio aciltransferase purificada em parte continham umaimpureza secundária a aprox 10 KDa (veja Figura 2).

O grupo lipídio aciltransferase 27 - 39 depois da IECfoi analisado para atividade de fosfolipase com o resultadode 20,4 PLU-7 /ml.

O esquema de purificação global é apresentado naTabela 1 na qual o lipídio a aciltransferase foi purificadaem parte com uma recuperação de 8 0 %.

Tabela 1. Purificação da lipídio aciltransferase

<table>table see original document page 148</column></row><table>

EXEMPLO 2: Experimento de Degomagem

A amostra de lipídio aciltransferase do Exemplo 1 foiusado para estudos de degomagem em formulações mostradas naTabela 2.

Esterol de planta, alfa-tocoferol e fosfatidilcolinaforam dissolvidos em óleo de grão de soja aquecendo o óleoa 90°C. 0 óleo foi esfriado então a aprox 400C e a enzimaforam adicionadas. A amostra foi colocada a 40°C durante 17horas durante agitação e então uma amostra foi tirada paraa análise de HPTLC dissolvendo a amostra emClorofórmio:Metanol 2:1.

Tabela 2. Modelos de óleo de grão de soja com alfa-tocoferol e esterol de planta, usado por testar da lipídioaciltransferase.

<table>table see original document page 149</column></row><table>

Os resultados da análise de HPTLC são mostrados naFigura 3 e Figura 4.

Os resultados de TLC mostrados na Figura 3 claramentemostram que a fosfatidilcolina é quase 100 % removidaacrescentando a lipídio aciltransferase ao óleo. Só aamostra no. 10 contêm uma quantidade pequena defosfatidilcolina. A amostra no. 10 tem a quantidade maisalta de água que indica que para degomagem a enzima podetrabalhar melhor em formulações com quantidade baixa deágua, ou poderia ser explicado pelo fato que porque amostrano. 10 contém 5 % de água um sistema bifásico é formado oque poderia causar menos contato entre os reagentes e aenzima.

Dos resultados mostrados na Figura 4 foi observado queuma quantidade pequena de ácidos graxos é formada, masquando esterol ou alfa-tocoferol também está disponível noóleo a quantidade de ácidos graxos livres é mais baixa,porque os ácidos graxos de fosfatidilcolina transferidos aoesterol ou tocoferol para formar éster de esterol e ésterde tocoferol.

A formação de éster de esterol é vista claramente dosresultados de TLC mostrados na Figura 5. Deveria ser notadoque o material de referência usado, éster de colesterol,tem o mesmo tempo de retenção como éster de esterol deplanta.

EXEMPLO 3: experimento de degomagem (2)

Em outra experiência a grupo de lipídioaciltransferase 27 - 39 de cromatografia de IEC, foitestado a diferentes dosagens de enzima e concentrações deágua em óleo de grão de soja com fosfatidilcolina e esterolde planta. Nesta experiência uma fosfolipase comercial, aLecitase Ultra™, também foi testado em uma concentraçãorecomendada pelo provedor para degomagem. A composição dasamostras para esta experiência é mostrada na Tabela 3.Tabela 3. Modelo de óleo de grão de soja com esterolde planta usado por testar da lipídio aciltransferase, eLecitase Ultra™

<table>table see original document page 151</column></row><table>

Esterol de planta e fosfatidilcolina foram dissolvidosem óleo de grão de soja por aquecimento a 95°C duranteagitação. O óleo foi esfriado então a 400C e as enzimas foisomada. A amostra foi mantida a 400C com agitadoresmagnéticos e as amostras foram tiradas após 4 e 20 horas eanalisadas por TLC. São mostrados os resultados da análisede HPTLC de amostras tirada após 4 e 2 0 horas nas deFiguras 6 a 9.

Os resultados de HPTLC indicam que a mais baixadosagem da lipídio aciltransferase (0,4 % que correspondema 0,08 PLU-7/g de óleo) é suficiente para removerfosfatidilcolina em óleo de grão de soja após 20 h de tempode reação. Também é observado que a dosagem mais alta deágua (5 %) parece ter um efeito prejudicial na lipídioaciltransferase para a hidrólise de fosfatidilcolina noóleo. É esperado então que o mais baixo grau de hidrólisena amostra com dosagem mais alta da conversão de lipídioaciltransferase seja explicado por aquele fato que maiságua também é acrescentada à amostra. Ao contrário disto, éobservado que a Lecitase Ultra™ tem um mais baixo grau dehidrólise de fosfatidilcolina na mais baixa dosagem de água(1 %) , considerando que a Lecitase Ultra™ quasecompletamente remove fosfatidilcolina na amostra com 5 %água.

Os resultados da Figura 7 também indicam que a parteprincipal do esterol de planta é convertida a éster deesterol de planta em amostras tratadas com a lipídioaciltransferase considerando que nenhum éster de esterol éformado nas amostras tratadas com Lecitase Ultra™. Figura 7indica que a Lecitase Ultra™ produz mais ácidos graxoslivres (FFA) que a lipídio aciltransferase.

Conclusão

Experimentos de degomagem com um modelo de óleo defeijão de soja contendo fosfatidilcolina, esterol de plantae tocoferol mostraram que uma enzima lipídioaciltransferase parcialmente purificada pode remover toda afosfatidilcolina concomitante com a formação de éster deesterol de planta, e somente em uma pequena parte sãoformados ácidos graxos livres.

Uma vantagem adicional da lipídio aciltransferase é aformação de ésteres de esterol, e em particular éster detocoferol, porque ésteres de esteróis (incluindo éster detocoferol) provêem propriedades benéficas de saúde. Emprocessamento de óleo comestível convencional, degomagemseguinte a fase aquosa que contém o lipídio polarhidrolizado (por exemplo, fosfolipídio e/ou glicolipídio) éseparado do óleo. Convencionalmente, esteróis são removidosdo óleo comestível durante o processo de refinamento deóleo (isto às vezes é chamado de desodorização). No entanto,os ésteres de esterol (e éster de tocoferol) resistem adesodorização e desta forma permanecem no óleo. Acumulaçãode ésteres de esterol no óleo é atraente porque para istofoi mostrado que a entrada mais alta de ésteres de esterolde planta reduz o risco para doenças cardiovasculares emhumanos.

0 experimento também indica que a lipídioaciltransferase pode fazer ésteres de tocoferol que tambémacumularão no óleo.

Isto contribuirá para a estabilidade oxidativamelhorada do óleo e desta forma será um benefício adicionalusar a lipídio aciltransferase de acordo com a presenteinvenção para degomagem.

EXEMPLO 4: Experimento de degomagem em óleo cru

Em outro experimento, os grupos lipídioaciltransferase 27-3 9 da cromatografia de IEC foi testado adosagens de enzima diferentes e concentrações de água emóleo de soja cru (antes da degomagem) obtido de The SolaeCompany, Aarhus, Dinamarca. Neste experimento, umafosfolipase comercial, a Lecitase Ultra™ também foi testadaem uma concentração recomendada para degomagem pelofornecedor. A composição das amostras para este experimentoé mostrada na Tabela 4.

As amostras foram colocadas em um bloco de aquecimentoa 400C durante agitação com um agitador magnético. Amostrasforam tiradas após 20 horas para análise.

Tabela 4

<table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table>

As amostras de óleo foram analisadas por HPTLC com osresultados mostrados nas Figuras 26 e 27.

A análise de TLC na Figura 26 indica que a lipxdioaciltransferase remove os fosfolipídios eficazmente em óleode soja cru sem deixar qualquer lisolecitina na amostra(amostras 3, 4, 6 e 7) . Lecitase Ultra™ também remove ofosfolipídio (PC), mas algumas faixas estão permanecendo nocromatograma que é esperado que seja a lisolecitina. Tambémé observado que a lipídio aciltransferase trabalha emambiente muito baixo de água, mas Lecitase Ultra™ precisade 1 % a 5 % de água para funcionar.

Os resultados na Figura 27 confirmam que a lipídioacil transferase converte o esterol livre a ésteres deesterol e Lecitase Ultra™ não tem nenhum efeito em esteróisFigura 27 também indica que alguns ácidos graxos livres sãoformados ambos em amostras com lipídio acil transferase eLecitase Ultra™ A razão para a formação de ácido graxolivre com lipídio acil transferase é explicada pelo fatoque não há bastante acil-doador (esterol) disponível, eentão alguma hidrólise também acontece.

Amostras 1, 2, 3, 6, 8 e 10 da tabela 4 foramanalisadas por GLC e a quantidade de esterol e éster deesterol foi quantificada. Os resultados são mostrados naTabela 5.

Tabela 5. Análise de GLC de esterol e ésteres deesterol

Em óleo de soja cru tratado com enzima (Tabela 4)Amostra Enzima Esterol Éster deesterol

<table>table see original document page 156</column></row><table>de solução

0,3 % de Lecitase Ultra™ 1 % 0,27 0,05de solução + 5 % de água

Os resultados na Tabela 5 confirmam a habilidade dalipídio acil transferase da presente invenção paraconverter todo o esterol em óleo de soja cru para éster deesterol, e uma fosfolipase comercial a Lecitase Ultra™ nãomostrou nenhum efeito em esterol.

CONCLUSÃO

O efeito do lipídio acil transferase da presenteinvenção em óleo de soja cru confirma que a lipídio aciltransferase da presente invenção remove fosfolipídioefetivamente em óleo de soja cru concomitante com aformação de ésteres de esterol.

Exemplo 5

Em outro experimento, a fosfolipase de Streptomycesthermosacchari L131 foi testada em óleo de soja cru.

Os resultados confirmam que a fosfolipase Streptomycesthermosacchari L131 efetivamente hidrolisa os fosfolipídiosem óleo de soja cru e é uma enzima alternativa satisfatóriapara degomagem de óleos de planta.

Processos de degomagem enzimática de óleos de plantaincluindo óleo de soja e óleo de semente de canola estão seexpandindo atualmente porque este processo é um processomenos caro e melhor para remover lecitinas de óleos deplanta. A enzima comercialmente usada para degomagem deóleo é uma fosfolipase microbiana Al ou uma fosfolipase A2derivada de animal.

Uma (fosfo)lipídio acil transferase de Streptomycesthermosacchari L131 é outra enzima que pode ser usada paradegomagem.

Introdução

O propósito deste estudo foi investigar o possível usode uma lipídio aciltransferase de Streptomycesthermosacchari L131 para degomagem de óleo vegetal comoóleo de soja, óleo de girassol, e óleo de semente de canolaTradicionalmente, dois processos foram usados paradegomagem de óleos, isto é, a degomagem física e adegomagem química. Nos idos da década de 90, o processo dedegomagem enzimática foi desenvolvido, baseado no uso defosfolipase pancreáticao. Porque esta enzima não era limpa,a fosfolipase foi substituída pela fosfolipase microbianaAl. O processo enzimático tem várias vantagens sobre oprocesso de degomagem químico ou físico incluindo economiade custo, alto rendimento, e um processo ambientalmentemais desejável.

O propósito deste estudo foi investigar se a lipídioaciltransferase de Streptomyces thermosacchari L131 seriauma enzima satisfatória para degomagem. Dos estudosdescritos sobre Streptomyces thermosacchari L131 éconhecido que possuam propriedades hidrolíticas contragalactolipídios e fosfolipídios sem mostrar qualqueratividade em triglicerídeos, e é esperado que esta enzimatambém facilite reações de transferase em certos ambientescom baixo conteúdo de água. Este estudo foi conduzido emóleo de soja cru com o conteúdo natural de fosfolipídios.

Materiais e métodos

Enzima

K3 71 (jour 2390-30): Streptomyces thermosacchari L131/S. Iividans seca por atomização em amido.(Atividade: 108 PLU-7/g).

Lecitase Ultra (#3108) de Novozymes, Dinamarca

Ester de colesterol, Fluka 26950

Esterol de planta: Generol 122 N de Henkel, AlemanhaÓleo de soja cru de The Solae Company, AarhusDinamarca

Lecitina: L -a Fosfatidilcolina 95 % de planta (Avanti#441601)

Atividade de FosfolipaseSubstrato:

0,6 % L -a Fosfatidilcolina 95 % de Planta (Avanti#441601), 0,4 % de Triton-X 100 (Sigma X-100) , e 5 mM deCaCl2 foram dissolvidos em 0,05 M de tampão HEPES pH 7.

Procedimento de ensaio:

400 μl de substrato foram adicionados a um tuboEppendorf de 1,5 ml e colocados em um Eppendorf Thermomixerà 37°C durante 5 minutos. No tempo T = O min, 50 μΐ desolução de enzima foram adicionados. Também um branco comágua em vez de enzima foi analisado. A amostra foimisturada a 10*100 rpm em um Eppendorf Thermomixer à 37°Cdurante 10 minutos. No tempo T=IO min, a reação foiinterrompida colocando o tubo Eppendorf em outrotermomisturador â 99°C durante 10 minutos.

0 conteúdo de ácido graxo livre de amostras foianalisado usando o kit NEFA C de WAKO GmbH.

Atividade de enzima PLU-NEFA pH 7 foi calculado comomicromole de ácido graxo produzido por minuto debaixo decondições de ensaio.

GLC (Cromatografia à gás)

Cromatografia à gás capilar Perkin Elmer 8420 equipadocom coluna de sílica fundida WCOT 12,5 m χ 0,25 mm ID χ 0,1μm 5 % de fenil-metila-silicone (CP Sil 8 CB de Crompack) .

Carreador: Hélio.

Injeção: 1,5 μL com divisão.

Detector: FID. 385°C.<table>table see original document page 161</column></row><table>

Preparação da amostra: Lipídio extraído de 0,2 gramade amostra foi dissolvido em 2 mL de heptano :piridina 2:1contendo um heptadecano padrão interno, 2 mg/mL. 50 0 /xL daamostra foram transferidas um frasco plissado. 100 μL deMSTFA (N-metila-N-trimetilsilil-trifluoracetamida) foramadicionados e a reação incubada durante 15 minutos à 90°C.

HPTLC

Aplicador: Classificador TLC automático 4, CAMAG

Placa HPTLC: 20 χ 10 cm, Merck n. 1,05641. Ativado 30minutos à 160°C antes do uso.

Aplicação: 1 μΐ de 8 % de solução de óleo em tampãofoi aplicada a placa de HPTLC usando aplicador TLCAutomático.

Tampão de corrida 4: Clorofórmio:Metanol:Água 75:25:4Tampão de corrida 5: P-éter: Metila-tert-butil-éter:

Ácido acético 70:30:1

Aplicação / Tempo de Eluição:

Tampão de corrida 4: 20 minTampão de corrida 5: 10 min

DesenvolvimentoA placa foi seca em um forno durante 10 minutos à160°C, esfriada, e imersa em 6 % acetato de cobre em 16 %H3PO4. Seca adicionalmente por 10 minutos à 1600C eavaliada diretamente.

Resultados.

Experimento de degomagem.

Streptomyces thermosacchari L131 foi usado paraestudos de degomagem nas formulações mostradas na tabela 6.

As amostras foram colocadas à 400C durante 18 horascom agitação após esse tempo uma amostra foi coletada paraanálise de HPTLC dissolvendo a amostra em Clorofórmio:

Metanol 2:1.

Tabela 6. Degomagem de óleo de soja cru comStreptomyces thermosacchari L131 e Lecitase Ultra™

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São mostrados os resultados da análise de HPTLC nasfigs. 59 e 60.

Figura 59 TLC (Solvente 4) de produtos de reação detratamento de enzima de amostras de óleo de soja cru deacordo com a Tabela 6. Como referência, foi analisadotambém fosfatidilcolina (PC). Também são indicados PE(fosfatidiletanolamina (PE) e lisofosfatidilcolina (LPC).

Figura 60 TLC (Solvente 5) de produtos de reação detratamento de enzima de amostras de óleo de soja cru deacordo com a Tabela 6. Referências: Ester de colesterol,monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo e esterol deplanta. Ácido graxo livre (FFA) também é indicado.

Os resultados de TLC na Figura 59 claramente mostramque a fosfatidilcolina foi completamente removidaacrescentando Streptomyces thermosacchari L131 ao óleo. Sóa mais baixa dosagem (amostra 2) não hidrolisoucompletamente os fosfolipídios. Lecitase Ultra™ tambémhidrolisou os f osfolipídios no óleo quando 5 % de águaestava disponível (amostra 6), mas sem adicionar água extra(amostra 5) só parte dos fosfolipídios foram hidrolisados.

Os resultados mostrados na fig. 60 indicam que ahidrólise de fosfolipídios é coincidente com a formação deácido graxo livre.

Conclusão.

A lipídio aciltransferase de Streptomycesthermosacchari L131 efetivamente hidrolisa fosfolipídios emóleo de soja cru durante a formação de ácidos graxos livres

Todas as publicações mencionadas no relatório acimaestão aqui incorporadas através de referência. Váriasmodificações e variações dos métodos descritos e sistema dapresente invenção serão aparentes para aqueles qualificadosna técnica sem partir do escopo da presente invenção.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com relaçãoa modalidades preferidas específicas, deveria ser entendidoque a invenção como reivindicada não deveria ser limitadaindevidamente a tais modalidades específicas. Realmente,várias modificações das modalidades descritas para realizara invenção que são óbvias àqueles qualificados embioquímica e biotecnologia ou campos relacionados épretendido que estejam dentro do escopo das reivindicaçõesseguintes.

Claims

1. Processo de degomagem enzimática de óleoscomestíveis, que compreende tratar o óleo comestível comuma lipídio aciltransferase a fim de transferir um grupoacil de uma parte principal do fosfolipídio para um ou maisaceptores de acil, em que o aceptor acil é um ou maisesterol e/ou estanol e em que a lipídio aciltransferase écaracterizada pelo fato de que:(a) a lipídio aciltransferase possui atividade deaciltransferase que é definida como atividade detranferência de éster por meio do qual a parte acil de umaligação de éster original de um doador de acil lipídio étransferido a um aceptor de acil para formar um novo éster;e(b) a enzima compreende o motivo de seqüência deaminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos sequintesresíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Υ, H, Q, Τ, Ν, M ouS e em que quando alinhadas a ou a seqüência consensopfam00657 e/ou SEQ ID No. 37 a lipídio aciltransf erase temum bloco GANDY.

2. Processo, de acordo com reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que um éster de esterol e/ou uméster de estanol é formado.

3. Processo, de acordo com reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o aceptor de acil é umesterol.

4. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de queo fosfolipídio é uma lecitina.

5. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quea lipídio acil transferase, como também sendo capaz detransferir um grupo acil de um lipídio para um esterol e/ouum estanol, adicionalmente transfere o grupo acil de umlipídio a um ou mais de um carboidrato, uma proteína, umasubunidade de proteína e glicerol.

6. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quea lipídio aciltransferase é uma lipídio aciltransferasenatural.

7. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quea lipídio aciltransferase é uma lipídio aciltransferasevariante.

8. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quea dita lipídio aciltransferase é obtenível de um organismode um ou mais dos gêneros seguintes: Aeromonas,Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobaeterium,Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobaeterium, Bacillus,Campylobaeter, Vibrionaeeae, Xylella, Sulfolobus,Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria,Mesorhizobiuml Ralstonia, Xanthomonas, Candida,Thermobifida e Corynebaeterium.

9. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quea dita lipídio aciltransferase é obtenível de um ou mais deAeromonas hydrophila, Aeromonas salmonieida, Streptomyeeseoelieolor, Streptomyees rimosus, Streptomyeesthermosaeehari, Streptomyees avermitilis, Myeobaeterium,Streptoeoeeus pyogenes, Lactoeoceus laetis, Streptoeoeeuspyogenes, Streptoeoeeus thermophilus, Laetobaeillushelvetieus, Desulfitobaeterium dehalogenans, Baeillus sp. ,Campylobaeter jejuni, Vibrionaeeae, Xylella fastidiosa,Sulfolobus solfatarieus, Saccharomyees eerevisiae,Aspergillus terreus, Schizosaceharomyees pombe, Listeriainnoeua, Listeria monoeytogenes, Neisseria meningitidis,Mesorhizobium loti, Ralstonia solanaeearum, Xanthomonaseampestris, Xanthomonas axonopodis, Candida parapsilosis,Thermobifida fusca e Corynebaeterium efficiens.

10. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de queο X do motivo GDSX é L.

11. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quea lipídio aciltransferase compreende uma ou mais dasseguintes seqüências de aminoácidos: SEQ ID No. 1, SEQ IDNo. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No.-7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11,SEQ ID NO. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, OU SEQ ID No.-15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No.-36, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 41, SEQ ID No-45, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50 ou uma seqüência deaminoácidos que tem 75 % ou mais de identidade com asmesmas.

12. Processo, de acordo com reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a lipídio aciltransferasecompreende uma ou mais das seguintes seqüências deaminoácidos: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 1 ouSEQ ID No. 15 ou SEQ ID No. 15, ou uma seqüência deaminoácidos que tem 75 % ou mais de identidade com asmesmas.

13. Processo, de acordo com reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a lipídio aciltransferasecompreende uma ou mais das seguintes seqüências deaminoácidos: SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 40,SEQ ID No. 41, SEQ ID No 45, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50,ou uma seqüência de aminoácidos cora pelo menos 7 0 % deidentidade com as mesmas.

14. Processo de acordo com reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a lipídio aciltransferasecompreende um ou mais de SEQ ID No. 17 ou SEQ ID No. 18, ouuma seqüência de aminoácidos com 70 % ou mais de horaologiacom as mesmas.

15. Processo, de acordo com reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a lipídio aciltransferasecompreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ IDNo. 16, ou uma seqüência de aminoácidos que tem 75 % oumais de homologia com a mesma.

16. Processo, de acordo com reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a lipídio aciltransferasecompreende a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ IDNo. 16.

17. Processo, de acordo com reivindicação 7, em que alipídio aciltransferase é caracterizado pelo fato de que aenzima compreende a seqüência de aminoácidos do motivo GDSX,em que X é um ou mais dos resíduos de aminoácidos seguintesL, A, V, I, F, Υ, H, Q, Τ, Ν, M ou S, e em que a enzimavariante compreende uma ou mais modificações de aminoácidoscomparadas com uma seqüência parental a qualquer um ou maisdos resíduos de aminoácidos definidos no conjunto 2 ouconjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7.

18. Processo, de acordo com reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a lipidio aciltransferasecompreende uma seqüência de aminoácidos mostrada como SEQID No. 34, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ IDNO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No.-10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No.-14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No.-26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.-30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32, ou SEQ ID No. 33 comexceção de uma ou mais modificações de aminoácidos aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidosno conjunto 2 ou conjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7identificados por alinhamento de seqüência com SEQ ID No.34.

19. Processo, de acordo com reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a lipidio aciltransferasecompreende a seqüência mostrada como SEQ ID No. 34 ou SEQID No. 35 com exceção de uma ou mais modificações deaminoácidos a qualquer um ou mais dos resíduos deaminoácidos definidos no conjunto 2 ou conjunto 4 ouconjunto 6 ou conjunto 7.

20. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 7, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de quea lipidio aciltransferase compreende a seqüência deaminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16 ou uma seqüência deaminoácidos com 75 % ou mais de homologia com a mesma.

21. Processo, de acordo com qualquer um dereivindicações 7, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de quea lipidio aciltransferase compreende a seqüência deaminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16.

22. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de quehá menos de 1 % de água no óleo comestível durante otratamento.

23. Processo, de acordo com reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que há menos de 0,5 % de água.

24. Processo, de acordo com reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que há menos de 0,1 % de água.

25. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de queo processo compreende a remoção dos lisofosfolipideosproduzidos pela ação da lipidio aciltransferase através defiltração.

26. Uso de uma lipidio aciltransferase caracterizadopelo fato de que:(a) a lipidio aciltransferase possui atividade deaciltransferase que é definida como atividade detranferência de éster por meio do qual a parte acil de umaligação de éster original de um doador de acil lipidio étransferida a um aceptor de acil para formar um novo éster;e(b) a enzima compreende o motivo de seqüência deaminoácidos GDSX, em que X é um ou mais dos sequintesresíduos de aminoácidos L, A, V, I, F, Υ, H, Q, Τ, Ν, M ouS e em que quando alinhadas a ou a seqüência consensopf am00657 e/ou SEQ ID No. 37 a lipidio aciltransf erase temum bloco GANDY na degomagem de óleos comestíveis pararemover fosfolipídios e aumentar a formação de ésteres deesterol e/ou ésteres de estanol no óleo.

27. Uso, de acordo com reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que não há nenhum aumento significante nosácidos graxos livres no óleo seguinte ao tratamento.

28. Uso, de acordo com reivindicação 26 ou areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que ofosfolipídio é uma lecitina.

29. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-28, caracterizado pelo fato de que a lipidioaciltransferase é uma lipidio aciltransferase natural.

30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-29, caracterizado pelo fato de que a lipidioaciltransferase é uma variante de lipídio aciltransferase.

31. Uso7 de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-30, caracterizado pelo fato de que a dita lipídioaciltransferase é obtenível de organismos de um ou mais dosseguintes gêneros: Aeromonas, Streptomyces, SaccharomyceslLactococcus, Myeobaeterium, Streptoeoceus, Laetobaeillus,Desulfitobaeterium, Baeillus, Campylobaeter, Vibrionaeeae,Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaeeharomyces,Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas,Cândida, Thermobifida e Corynebaeterium.

32. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-31, caracterizado pelo fato de que a lipídioaciltransferase é obtenível de um ou mais de Aeromonashydrophila, Aeromonas salmonieida, Streptomyees eoelieolor,Streptomyees rimosus, Streptomyees thermosaeehari,Streptomyees avermitilis, Myeobaeterium, Streptoeoceuspyogenes, Lactoeoceus laetis, Streptoeoceus pyogenes,Streptoeoceus thermophilus, Lactobacillus helveticus,Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp.,Campylobacter jejuni, Vibrionaeeae, Xylella fastidiosa,Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae,Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeriainnocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis,Mesorhizobium Ioti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonascampestris, Xanthomonas axonopodis, Cândida parapsilosis,Thermobifida fusca e Corynebacterium efficiens.

33. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-32, caracterizado pelo fato de que o X do motivo GDSX é L.

34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-33, caracterizado pelo fato de que a lipidioaciltransferase compreende uma ou mais das seguintesseqüências de aminoãcidos: SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 3, SEQID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ IDNo. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ IDNo. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, ou SEQ ID No. 15, SEQID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 36, SEQID NO. 38, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 45, SEQID No. 47, SEQ ID No. 50 ou uma seqüência de aminoácidosque tem 75 % ou mais de identidade com as mesmas.

35. Uso, de acordo com reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a lipidio aciltransferase compreende umaou mais das seguintes seqüências de aminoácidos: SEQ ID No.-3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 1 OU SEQ ID No. 15 OU SEQ ID No.-5, ou uma seqüência de aminoácidos que tem 75 % ou deidentidade com as mesmas.

36. Uso, de acordo com reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a lipidio aciltransferase compreende umaou mais das seguintes seqüências de aminoácidos: SEQ ID No.-36, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 41, SEQ ID No-45, SEQ ID No. 47, SEQ ID No. 50, ou uma seqüência deaminoácidos com pelo menos 70 % de identidade com as mesmas.

37. Uso, de acordo com reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a lipxdio aciltransferase compreende umaou mais de SEQ ID No. 17 ou SEQ ID No. 18, ou uma seqüênciade aminoácidos com 70 % ou mais de homologia com as mesmas.

38. Uso, de acordo com reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a lipídio aciltransferase compreende aseqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16, ouuma seqüência de aminoácidos que tem 75 % ou mais dehomologia com a mesma.

39. Uso, de acordo com reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que a lipidio aciltransferase compreende aseqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16.

40. Uso, de acordo com reivindicação 30, em que alipídio aciltransferase é caracterizada pelo fato de que aenzima compreende a seqüência de aminoácidos do motivo GDSX,em que X tem um ou mais dos resíduos de aminoácidosseguintes L, A, V, I, F, Υ, H, Q, Τ, Ν, M ou S, e em que aenzima variante compreende uma ou mais modificações deaminoácidos comparadas com uma seqüência parental aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidosno conjunto 2 ou conjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7.

41. Uso, de acordo com reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a lipidio aciltransferase compreende umaseqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 34, SEQID No. 35, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ IDNo. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 19, SEQ ID No.-10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No.-14, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No.-26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.-30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32, ou SEQ ID No. 33 comexceção de uma ou mais modificações de aminoácidos aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidosno conjunto 2 ou conjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7identificados por alinhamento de seqüência com SEQ ID No.34 .

42. Uso, de acordo com reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que a lipidio aciltransferase compreende aseqüência mostrada como SEQ ID No. 34 ou SEQ ID No. 35 comexceção de uma ou mais modificações de aminoácidos aqualquer um ou mais dos resíduos de aminoácidos definidosno conjunto 2 ou conjunto 4 ou conjunto 6 ou conjunto 7.

43. Uso, de acordo com reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a lipidio aciltransferase compreende aseqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16 ou umaseqüência de aminoácidos com 75 % ou mais de homologia coma mesma.

44. Uso, de acordo com reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a lipídio aciltransferase compreende aseqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 16.

45. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações-26 a 44, caracterizado pelo fato de que há menos de 1 % deágua no óleo comestível durante o tratamento.

46. Uso, de acordo com reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que há menos de 0,5 % de água.

47. Uso, de acordo com reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que há menos de 0,1 % de água.

48. Método caracterizado pelo fato de que é comodescrito anteriormente aqui com referência à descriçãoacompanhante e as figuras.

49. Uso caracterizado pelo fato de que é como descritoanteriormente aqui com referência à descrição acompanhantee as figuras.