CH294897A - Procédé pour la préparation de l'acide 5,6,7, 8-tétrahydro-10-formyl-ptéroyl-glutamique. - Google Patents

Description

  Procédé pour la préparation de l'acide 5,6,7,     8-tétrahydro-10-formyl-ptéroyl-glutamique.       La présente invention a     pour    objet un  procédé de préparation de l'acide     5,6,7,8-tétra-          hydro-10-fox-myl-ptéroyl-glutaniique    qui est un  composé nouveau destiné à être utilisé en mé  decine.  



  En 1918,     Sauberlich    et     Baumann    (Journal  of     Biological        Chemistry,    176, p.165, 1948)  reconnurent l'existence d'une substance stimu  lant la croissance du     Leuconostoc        citrovorum.     On trouva que cette substance inconnue était  présente dans les extraits de foie industriels  et également dans le foie et dans une grande  variété de matières naturelles. Des travaux    ultérieurs ont montré que le facteur de crois  sance n'est pas l'acide     ptéroylglutamique,    ni  la vitamine 1312, ni aucune des vitamines déjà  reconnues que l'on rencontre dans le foie et  d'autres produits naturels.

   On a également  trouvé par la suite que la substance inconnue  petit satisfaire aux besoins d'acide folique des  micro-organismes et des poussins. On a de  plus trouvé que ce facteur de puissance in  verse l'action des antagonistes de l'acide     pté-          roy1glutamique    et, chose surprenante, inverse  les effets toxiques de     l'aminoptérine,        c'est-          à-dire    de l'acide         N-[4-1[        (\?,4-d        iamino-6-pyrimido-    [ 4, 5-b ] -     pyr        azyl)

          méthyl    ]     -amino    }     benzoS#1    ] - glutamique,    sur les souris et les bactéries, dans des condi  tions dans lesquelles l'acide     ptéroylglutamique     est inefficace.  



  lie facteur     citrovorunî,    existe dans les pro  duits naturels en quantité extrêmement faible,  de sorte que sa récupération de ces produits  naturels est excessivement difficile et prati  quement impossible du point de vue indus  triel. On a cependant découvert qu'il est pos  sible de préparer un composé ayant une acti  vité biologique identique ou voisine par un  procédé rendant possible industriellement. la  fabrication de quantités convenables de cet  agent actif, de sorte qu'on peut utiliser celui-ci  en médecine.

   Comme on n'a pas encore aujour  d'hui élucidé la structure chimique du     facteur     de croissance du     Leuconostoc        cit-rovorum    dé  crit par     Sauberlich    et d'autres, il n'est pas    possible de dire actuellement si le produit  obtenu par le procédé décrit ci-après est le  même ou pas, bien qu'il ait la même     activité     biologique. Pour autant qu'on le sache, cepen  dant, le produit obtenu par le procédé selon  la présente invention est nouveau.  



  Selon la présente invention, on prépare  l'acide     5,6,7,8-tétrahydro-10-formyl-ptéroyl-          glutamique    par hydrogénation de l'acide 10  formyl-ptéroyl-glutamiqne avec environ 2 moles  d'hydrogène par mole d'acide.  



  L'acide     10-formyl-ptéroyl-gltttamique    uti  lisé comme produit de départ petit être pré  paré par divers procédés y compris celui dé  crit par Gordon et d'autres dans Journal of the       American        Chemical    Society, 70, p. 878, 1918.  Selon ce procédé, on prépare l'acide formyl-           ptéroylglutamique    en chauffant de l'acide for  mique à     981/o    et de l'anhydride acétique avec  de l'acide folique (acide     ptéroylglutamique    )  pendant une heure à 100  C. On élimine sous  vide les réactifs volatils et un produit jaune    clair précipite d'une solution alcaline par  addition d'acide acétique.  



  Le composé obtenu par le procédé suivant  la présente invention répond à. la formule sui  vante  
EMI0002.0004     
    dans laquelle R représente le radical de l'acide  glutamique.  



  On peut réaliser la réduction de l'acide       10-formy        1-ptéroyl-glutamique    avec ou sans  l'aide de catalyseurs. Quand on utilise une  réduction     catalytique,    on peut utiliser une       ;nnde    variété de solvants comprenant l'eau,  l'acide formique, l'alcool, le glycol, l'acide acé  tique, le     diméthylformamide    et d'autres, selon  naturellement la nature de l'agent catalytique.  La température de la réduction peut être  située dans un grand intervalle allant de 0  C  à 150  C. Le pH peut varier dans un intervalle  (en milieu aqueux) de 3 à 12.  



  On peut utiliser de nombreux catalyseurs  de réduction différents, comme on le verra  clans les exemples qui suivent.  



  D'une faon générale, la     réaction    se pro  duit très rapidement et on peut obtenir des  rendements appréciables du produit désiré en  un temps aussi court que 10 minutes à la tem  pérature ambiante en utilisant par exemple,  comme catalyseur, du platine dans l'acide for  mique. Ordinairement, on réalise la réduction  dans une période de 30 minutes à 2 heures.  



  La réaction est réalisée de préférence de  la manière suivante: La matière de départ.  est obtenue à partir de l'acide     ptéroylgluta-          mique,    par     formylation    en le chauffant dans       20        parties        d'acide        formique    à     90-100        %        pen-          dant    30 minutes à 1 heure à 80-95  C; elle  est isolée, si on désire effectuer la réduction  dans un solvant différent..

   Il est cependant  généralement plus commode de continuer la    réaction en refroidissant la solution et en ajou  tant le catalyseur à la solution, après quoi on  peut faire passer de l'hydrogène dans le mé  lange réactionnel en secouant ou en agitant.  Dans certains cas, il peut être avantageux  d'activer le catalyseur par l'hydrogène avant  de le mélanger à l'acide     ptéroylglutamique          formylé    bien que ce processus ne soit pas né  cessaire. La pression d'hydrogène dans le réci  pient de réaction peut être de 1 à 100 atm. on  davantage, mais ordinairement une pression  de 1 à. 3 atm. est. suffisante pour obtenir un  bon rendement.

   Après la réduction, on peut  opérer de la     faeon    suivante: On élimine le  catalyseur par filtration, on tamponne la solu  tion par du bicarbonate de sodium aqueux,  la     substance    désirée se trouvant dans la solu  tion résultante. Quand il est désirable d'élimi  ner l'excès     d'acidë    formique de la solution de  réduction après élimination du catalyseur, on  peut verser la solution dans l'éther et isoler  le produit désiré, insoluble, par filtration du  mélange.  



  Quand on utilise, pour la, réduction par  l'hydrogène, des métaux ou des     combinaisons     métalliques telles que l'amalgame de     sodium,     le zinc, l'amalgame     d'aluminium,    le     bor-          hydrure    de sodium,     l'amalgame    de     magnésium.     le magnésium, etc., le solvant est ordinaire  ment l'eau ou de nature essentiellement  aqueuse dans lequel de l'alcool, du benzène  ou d'autres solvants organiques peuvent être  présents.

   Le pH de la solution peut être situé  dans l'intervalle de 3 à 12, les conditions pré-           férées    variant avec les     agents    réducteurs par  ticuliers utilisés. La température peut varier  de 0 à 150  C, et le temps nécessaire peut  varier depuis approximativement 10 minutes  jusqu'à. 1 heures ou davantage.  



  On comprendra mieux l'invention en se  référant aux exemples suivants.         Exemple   <I>1:</I>  On ajoute, à une solution d'acide     10-formyl-          ptéroyl-glutamique    obtenue en chauffant  15 minutes au bain-marie 20 g d'acide     ptéroyl-          glutamique        (90%)        avec        200        cm3        d'acide        for-          mique    à     90%,

      1     g        d'acide        ascorbique        et        0,5        Z     d'oxyde de platine, et on hydrogène le     mé-          lan;ze    dans un appareil à secousses sous  15,9     atni.    de pression d'hydrogène jusqu'à ce       chie    '1 moles     d'hydrogène    par mole d'acide       l0-forniyl-ptéroyl-glutainique    soient, approxi  mativement consommés. Après la réduction,  on     sépare    le catalyseur par filtration et. on  conserve le filtrat en atmosphère d'azote pen  dant 40 heures.

    



  On chauffe le     filtrat    pendant une heure  au bain-marie, puis on le refroidit et. on le  verse     dans    environ 2500     cin3    d'eau contenant.  340 g de bicarbonate de sodium. On ajoute de  la soude pour ajuster le     pH    à environ 12 et.  on chauffe la solution pendant une demi-heure  au     bain-marie,    on la refroidit et on la neutra  lise à environ pH 7.

   Le volume à ce moment est  d'environ 2900     em3.    On ajoute 300 g de sili  cate (le     magnésium        ( 1lagnésol )    pulvérisé à  la solution pour absorber la plus grande partie  des impuretés. on agite à la température am  biante pendant 15 minutes, puis on     fltre.    Le  filtrat. a une couleur jaune clair et un volume  de 3100     cm3.    On ajuste son     hH    à 1 par addi  tion d'acide chlorhydrique et d'acide acétique.  On ajoute 150 g de charbon de bois activé  pour absorber la plus grande partie de la subs  tance désirée et on agite le mélange pendant  15 minutes à la température ambiante.

   On sé  pare le charbon de bois par filtration et on le  lave soigneusement sur le filtre à l'eau dis  tillée. On obtient un filtrat incolore.  



  On soumet le     charbon    de bois à une     élu-          tion    en l'agitant pendant 15 minutes dans un    mélange de 500     em3    d'alcool, 100     cms    d'ammo  niaque à 28% et 400     ema    d'eau. On sépare le  charbon de bois par filtration et on le lave soi  gneusement à l'ammoniaque alcoolique aqueux.  Le volume du filtrat jaune est de 1120 cm-.  On l'évapore à sec sous pression réduite et en  atmosphère d'azote pour obtenir un résidu  sirupeux brun. On triture ce dernier avec de  l'éthanol absolu, de sorte qu'il se forme un  solide jaune clair.

   On le sépare par filtration,  on le lave à l'éthanol puis à l'éther, on le  sèche 10 minutes à 50  C puis dans un     dessic-          ca.t.eur    sous vide. Le     rendement    est de 2,9 g.  



  Le produit est très soluble dans l'eau à un       pH    de 3,5 à 4 et les solutions aqueuses ont  une     fluorescence    bleu pâle. On dissout un  échantillon de 0,2 g dans 1     cm-'    de soude     N/10     et on ajuste le pH à 12 par addition de quel  ques gouttes de soude 5N. On chauffe la solu  tion pendant     -15    minutes au bain-marie. La  fluorescence persiste.

   Dans ces conditions, la       matière    de départ, elle, est.     hydrolysée    en un  composé non     fluorescent.    On refroidit la solu  tion et on la sépare par centrifugation d'une  petite quantité de matière insoluble puis on  l'acidifie à 0  C à pH 3,8.     Z    n produit. jaune  clair précipite, que l'on filtre, lave à l'acétone  et à l'éthanol et sèche pour obtenir 0,062 g de  produit. En abaissant, le     pH    du filtrat à. 3,3 à.  0  C, on obtient 0,015     g    de plus.

   Le     dernier     produit obtenu, soumis à l'essai     microbiologi-          que    sur l'organisme     Lel(.conostoc        citroL'orim1     <B>8081</B> a une activité de 3-5 millions d'unités  par     ing.     



  On détermine l'activité en     -unités    par l'essai       microbiologique    en utilisant le milieu synthé  tique décrit par H. E     Sauberlich    et     Baumann          (Biological        Chemistry    176, p. 165,     19-18)    et.  l'organisme     Leuconostoc        citro-z-orum    8081, cha  que unité d'activité étant, prise arbitrairement  comme équivalente de 16,6     inillimierogrammes     d'une préparation     standard    initiale.

   Cette acti  vité, déterminée de cette façon, est.     approxima-          tivement    égale à, deux fois l'activité définie  par     Sauberlich    et     Baumann,    dont l'unité est  la quantité de matière par     ems    de milieu de  culture nécessaire pour provoquer la demi  croissance maximum de l'organisme d'essai.      <I>Exemple 2:</I>  A une solution d'acide     10-formyl-ptéroyl-          glutamique,    obtenue en chauffant pendant.

    une heure au bain-marie 100 g d'acide     ptéroyl-          glutamique    dans 600     cm3    d'acide formique à       90        %,        on        ajoute,        après        refroidissement,        4,4        g     d'oxyde de platine comme catalyseur et on  hydrogène le mélange à la température am  biante jusqu'à ce que deux moles d'hydrogène  soient absorbées (deux heures) pour un mole  d'acide à réduire. On sépare le catalyseur  par filtration et on laisse reposer la solution  jusqu'au lendemain à la température am  biante.

   Puis on la chauffe pendant une heure  au bain-marie, on la refroidit et on la verse  graduellement dans 9 litres d'eau contenant  1300 g de bicarbonate de sodium. On ajoute       alors        de        la        soude        (50        %)        jusqu'à        une        concen-          tration    d'environ 0,1 N et on chauffe la solu  tion     pendant    30 minutes au bain-marie.

   Après  refroidissement, on acidifie le mélange avec  de l'acide acétique jusqu'à pH 6,6, on ajoute  900 g de      Magnésol     (silicate de magnésium),  on agite le mélange pendant 15 minutes et on  le filtre, ce qui donne un filtrat jaune rete  nant la plus grande partie de l'activité de la  solution initiale. On acidifie celle-ci à pH 4 et  on l'agite pendant 20 minutes avec 450 g de        Darco-G60     (charbon de bois activé), puis  on la filtre.

   On lave soigneusement le gâteau  de charbon de bois avec de l'eau, puis on le  met en suspension dans un mélange de  1500     cms    d'éthanol, 300     ems    d'ammoniaque à       28        %        et        1200        em3        d'eau.        On        chauffe        ce        mé-          lange    pendant 30 minutes au bain-marie en  agitant tout en y faisant barboter de l'azote.  On filtre le mélange chaud et on le lave à  l'ammoniaque alcoolique dilué.

   Le filtrat     con-          tient        70        %        de        l'acivité        initiale.        On        le        concentre     à sec sous pression réduite, ce qui donne un  résidu de 37 g de matière avec un essai bio  chimique de 1,6 million d'unités par milli  gramme. On peut purifier cette matière encore  davantage.  



  <I>Exemple 3:</I>  On ajoute, à une solution d'acide     10-for-          myl-ptéroyl-glutamique    obtenue en chauffant  5 g d'acide     ptéroylglutamique    (900/0) pen-         dant    45 minutes au bain-marie avec 100     cm3          d'acide        formique    à     90        %,        et        après        avoir        re-          froidi    la solution à la température ambiante,  1,0 g d'oxyde de platine, et on réduit le mé  lange par l'hydrogène dans un autoclave à.

    secousses jusqu'à ce que 2,0 moles d'hydrogène  approximativement soient absorbées par mole  d'acide     10-formyl-ptéroyl-ghitamique.    A ce  moment, on sépare le catalyseur par filtration  et on divise le filtrat réactionnel en trois  fractions.    <I>Fraction</I>    On verse cette fraction dans environ  250     cm3    d'eau contenant du bicarbonate de  sodium en quantité telle que la solution résul  tante présente un pH de 7-8.

   La solution ré  sultante selon l'essai     microbiologique    contient  880 000 unités d'activité par     cm3.            Fraction        B:       On laisse reposer la seconde fraction pen  dant 19 heures dans la solution d'acide for  mique, puis on la traite de façon similaire à  la façon A avec une solution de bicarbonate  de sodium. La solution résultante à l'essai       microbiologique    contient 1100000 unités d'ac  tivité par     cm3.            Fraction.   <I>C:</I>    On laisse reposer la troisième fraction pen  dant 91 heures en solution d'acide formique,  puis on la traite de façon analogue à la frac  tion 4 par une solution de bicarbonate de  sodium.

   La solution résultante à l'essai     micro-          biologique    contient<B>1530000</B> unités d'activité  par     em3.     



  Le composé obtenu par le procédé suivant.  la présente invention est un solide cristallin  jaune clair qui est stable dans la soude caus  tique 0,1 N, même chauffée pendant 30 mi  nutes à 100  C. En solution aqueuse à pH 2 à  la température ambiante, il est instable et  rapidement transformé en une matière ayant  la même activité biologique que l'acide     ptéroy        1-          glutamique    avec la perte correspondante d'ac  tivité envers l'organisme     Leuconostoc        citro-          vorum.    La nouvelle substance est. absorbée sur  divers agents absorbants tels que le charbon      de bois à pH acide et un silicate de magnésium  alcalin activé à pH faiblement.

   alcalin et on  peut utiliser ces derniers pour purifier les  produits de réaction bruts par des procédés  d'absorption     chromatographique.    En solution  dans la soude     caustique    0,1 N, elle présente  une absorption     maximum    à 275-285 mu. Elle  est très soluble dans l'eau à pH 3,5 à 4,0. Elle  forme un sel de baryum insoluble dans l'alcool       aqueux    dilué. Elle est partiellement précipitée  sous forme de sel de zinc à pH 6,8 à 7,0.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de l'acide 5,6,7,8- tétrahydro-10-formyl-ptéroyl-glutamique, ca ractérisé en ce qu'on hydrogène l'acide 10- formyl-ptéroyl-glutamique avec environ deux moles d'hydrogène par mole d'acide. Le produit obtenu est. un solide cristallin jaune clair qui est facilement soluble dans l'eau à un pH de 3,5 à 4,0 et présente un maximum d'absorption, en solution de soude caustique 0,1 N, à 275-285 mu. Ce produit est utilisable en médecine. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on réalise la réaction d'hydro génation en solution aqueuse en présence d'un catalyseur de réduction. 2.

   Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on réalise la réaction à une température comprise entre 0 et 150 C.