CH332663A - Procédé de préparation d'un nouveau dérivé de la sérine, l'O-carbamyl-D-sérine - Google Patents

Description

  Procédé de préparation d'un nouveau dérivé de la     sérine,          PO-carbamyl-D-sérine       La présente invention a pour objet un  procédé de préparation d'un produit industriel  nouveau, c'est-à-dire de     1'0-carbamyl-D-sérine     de formule  
EMI0001.0004     
    qui agit contre les infections à virus des ani  maux et de l'homme et semble avoir également  une action favorable sur la défense de l'orga  nisme contre les infections, notamment contre  les infections à virus filtrants.  



  Le nouveau produit se présente sous forme  d'aiguilles incolores, F. (lente)     226-234o    C  (décomposition), F. (instantanée) 238  C (avec  effervescence) ;     [a120    =     -19,6 < 1    (c = 2  acide chlorhydrique     N)    ;

       [a120    =     4-2o    (c=1    Après chromatographie dans l'un quelconque de ces solvants, diverses réactions colorées  spécifiques de certains groupements chimiques ont été essayées et fournissent les résultats  suivants       Ninhydrine    . . . . . . . . . . . . . . . coloration violette  Complexe cuivrique selon Wieland . . réaction positive  Réaction de     Barrenschen-Weltman    . . réaction positive  Réaction de     Sakaguchi    . . . . . . . . . . . . réaction négative  Réaction de     Pauly    . . . . . . . . . . . . . . . . réaction négative  Réaction à la benzidine<B>...</B> . . . . . . . . . réaction négative    eau).

   L'absorption de la lumière ultraviolette  au-dessus de 200     m#t    est     négligeable.    Il est  très soluble dans l'acide chlorhydrique dilué  et l'eau chaude, soluble à 2     O/o    dans l'eau à       22o    C, très peu soluble dans le méthanol et  l'éthanol, insoluble dans la plupart des autres  solvants.    Le nouveau composé a été     soumis    à la  chromatographie sur papier.

   Dans les solvants  suivants, il fournit une tache que l'on révèle  à la     ninhydrine.       10 phénol tampon borate<I>pH</I> 9,3 . .     Rf    0,41  20 phénol tampon borate<I>pH</I> 11,2 0,27  30     pyridine    80 - alcool     isoamylique     40 - eau 70 . . . . . . . . . . . .

   .<B>---</B> 0,33       4o        butanol    75 - acide formique 15   eau 10<B>--- ................</B> 0,08      La détermination de l'azote aminé par  l'acide nitreux selon la méthode de Van     Slyke     fournit les résultats suivants       10        minutes        de        réaction        9,6%     60 minutes de réaction 18     fl/o       L'hydrolyse chlorhydrique en tube scellé à  1000     -C    conduit à un hydrolysai qui ne fournit  qu'une seule tache par chromatographie sur  papier dans les solvants cités plus haut. Il  s'agit de la     sérine.     



  Cet     hydrolysat,        alcalinisé    par le carbonate  de soude et soumis à un entraînement à la  vapeur, permet de doser de l'ammoniaque  représentant     501)/o    de l'azote total.  



  La     formol-titration    effectuée au<I>pH</I> mètre  sur 30 mg de substance     indique    un poids molé  culaire de 144.  



       L'O-carbamyl-D-sérine    donne un complexe  cuivrique. Par chauffage au bain-marie de  100 mg de composé et de 200 mg de carbo  nate de cuivre fraîchement précipité, il se  forme immédiatement une coloration bleue  intense. On filtre et laisse refroidir la solution  qui laisse déposer de petits cristaux bleus.

    Après filtration et séchage, ces cristaux se  décomposent à<B>2570C.</B>    Par réaction avec le     2,4-dinitro-fluoro-          benzène,        l'O-carbamyl-D-sérine    fournit par       monosubstitution    un dérivé     dinitrophénylé    en       aiguilles,    F. 1660 C, dont l'analyse correspond  à la formule brute     CI0HI0008N4    prévue.

   L'hy  drolyse chlorhydrique de ce dérivé fournit un  composé qui, après chromatographie sur pa  pier, peut être identifié avec la     2,4-dinitro-          phényl-sérine    synthétique, tandis que le dérivé       dinitrophénylé    de départ en est distinct. Ceci  montre que le groupe     (x-aminé    du nouveau  composé est libre et que le substituant est porté  par l'hydroxyle.

   Un     hydrolysat    du dérivé     di-          nitrophénylé,    alcalinisé et soumis à un entraî  nement à la vapeur, permet à nouveau de titrer  un équivalent de base volatile pour 310 de  dérivé     dinitrophénylé,    ce qui montre que le       substituant    n'a pas été éliminé au cours de  la formation du dérivé     dinitrophénylé.     



  Mis en solution aqueuse, le dérivé     dinitro-          phénylé    est nettement acide, ce qui montre  que le groupe carboxyle est libre dans la  molécule. Cette acidité titrée au     pt,    mètre  conduit à un poids moléculaire de 310.    L'oxydation périodique de la     sérine    libère  une molécule d'ammoniac selon  
EMI0002.0037     
    Le nouveau composé soumis à cette oxy  dation ne fournit pas d'ammoniac.

   Par contre,  après hydrolyse préalable et entraînement à la  vapeur d'eau des constituants volatils basiques       formés,        l'oxydation        périodique        fournit        50        %     de l'azote primitivement présent sous forme  d'ammoniac. Le dérivé     dinitrophénylé    .précé  demment décrit s'étant formé à l'azote, le subs  tituant de la     sérine    du nouveau composé qui  empêche l'oxydation périodique ne peut se  trouver que sur l'hydroxyle de la     sérine.     



  Le dosage du     gaz    carbonique dans le nou  veau composé effectué après hydrolyse sulfu  rique donne un chiffre correspondant à 0,97  molécule de gaz carbonique par molécule de  composé, tandis que la     DL-sérine    traitée dans    les mêmes conditions ne libère pas de gaz  carbonique.  



  L'ensemble de ces résultats, confirmé par  les chiffres fournis par la combustion du  composé montre qu'on se trouve en présence  d'un dérivé     O-substitué    de la     sérine    dans  lequel le substituant facilement hydrolysable  et d'un poids d'environ 40 renferme 1 atome  d'azote, donne à l'hydrolyse 1 molécule de gaz  carbonique, ne confère pas de propriétés ba  siques à la molécule et ne donne pas de frag  ment d'hydrolyse décelable par chromatogra  phie sur papier.    Le seul groupe répondant à ces différents  points est le groupe     carbamyle    confirmé, en      outre, par la réaction de     Barrenschen        Weltman     qui est positive.  



  Pour déterminer sa configuration optique,  le nouveau composé a été soumis à l'hydrolyse  chlorhydrique et la détermination du pouvoir  rotatoire sur le produit hydrolysé conduit à       [a]2 =-13         (c=l'%,        acide        chlorhydrique        N).     La purification du produit hydrolysé donne  la     D-sérine    identique à tous points de vue avec  un échantillon de     D-sérine    préparé par dédou  blement de la     DL-sérine    confirmant le pouvoir  rotatoire de -130 indiqué dans la littérature  pour la     D-sérine.     



  Le procédé de préparation de     l'O-carba-          myl-D-sérine    faisant l'objet de la présente  invention est caractérisé en ce qu'on ense  mence un milieu aqueux nutritif stérile à un       pll    compris entre 6 et 8,5 contenant des pro  téines, des hydrates de carbone et des sels  minéraux au moyen de   Streptomyces     poly-          chromogenus      ou d'un mutant de celui-ci, on  fait incuber le mélange en aérobiose, on sépare  les produits solides de la fermentation et ad  sorbe     l'O-carbamyl-D-sérine.,    formée sur une  résine     échangeuse    d'ions     sulfonique,    forme  acide,

   qu'on lave à l'eau et d'où l'on élue       1'0-carbamyl-D-sérine    à l'aide d'une solution  aqueuse d'une base faible qui, par concentra  tion, fournit le produit cherché qu'on purifie  par recristallisation dans un solvant.  



  Il s'agit donc d'une synthèse     microbiolo-          gique    consistant à cultiver un microorganisme  de l'ordre des '     actinomycétales,    de la famille  des     streptomycetaceae    dénommé       Strepomyces          polychromogenus      au sein d'un milieu nutri  tif convenable. La fermentation est provoquée  de préférence par agitation de la liqueur de  fermentation à une température comprise entre       20     et 320 C.

   La partie insoluble (mycélium,  etc.) peut être éliminée, soit par filtration, soit  par centrifugation;     1'0-carbamyl-D-sérine    peut  alors être extraite du liquide clair obtenu avec  ou sans concentration préalable en l'adsorbant  sur un échangeur d'ions     sulfonique,    forme  acide, tel     1'         Amberlite    IR 120  , la       Per-          mutite    Q   ou le       Dowex    50  .

   Pour     éluer          1'0-carbamyl-D-sérine,    on emploiera, comme  base volatile faible, par exemple, l'ammo-         niaque,    la     pyridine,    la     triéthylamine,    etc. Bien  entendu, la culture du microorganisme peut  être effectuée, soit en surface sur des milieux       nutritifs    appropriés, soit en profondeur dans  des conditions stériles avec agitation et dispo  sitif     permettant    une insufflation d'air stérile à  l'instar des fermenteurs utilisés dans l'industrie  des antibiotiques. Les conditions de culture  (température et milieu nutritif) peuvent varier  dans de larges limites.  



  Le   Streptomyces     polychromogenus      est  un microorganisme non décrit jusqu'à présent,  isolé d'un prélèvement de sol de Venezuela  et dont les cultures, obtenues par dissociations  sur des plaques nutritives     gélosées    présentent  les caractères suivants  En culture pure, à une température de       280        C,        sur        un        milieu        renfermant    1     %        de        glu-          cose        anhydre,        0,

  05        %        de        phosphate        dipotas-          sique,        0,05        %        d'asparagine        et    2     %        d'agar-          agar,    le développement est luxuriant, le my  célium végétatif est brun clair à jaune pâle, le  mycélium aérien d'abord blanc vire au vert  bleu     vif    puis, en vieillissant, au vert pâle ; la  colonie présente des contours arborisés ; le  pigment soluble, discret, est brun jaune très       pâle    ;

   les filaments aériens, plus ou moins  ramifiés sont fragmentés en     chaînes    de spores  ovoïdes, leur partie apicale ne présente pas  de spirales.  



  Le  Streptomyces     polychromogenus      ne  réduit pas les nitrates ; il coagule et     peptonise     le lait ; sur milieu à base de fécule de pomme  de terre, il sécrète des amylases. Dans un  substrat qui renferme :     sulfate        diammonique     0,25 0/0, phosphate     monopotassique    0,25 0/0,       phosphate        dipotassique        0,5        %,        sulfate        de        ma-          gnésium        heptahydraté    0,1     'o/o,

          sulfate    de cuivre       pentahydraté    0,0006 0/0, sulfate ferreux     hepta-          hydraté    0,00010/0, chlorure de manganèse       tétrahydraté    0,0008 0/0, sulfate de zinc     hepta-          hydraté        0,00015%,        agar-agar        24%,        le          Strep-          tomyces        polychromogenus      se développe fa  cilement en présence de saccharose, glucose,  lévulose, et     d-xylose,

          difficilement    en présence  de     d-galactose    et     rhamnose    ; quant au lactose,  il n'est pas assimilé.      Le   Streptomyces     polychromogenus      est  sensible  - à la température<B>:</B> l'optimum est     28,1    C, la  température de 370 C est     dysgénésique     elle ne permet pas la production de mycé  lium aérien ;    - au     pA   <I>:</I> les substrats acides ne permettent  pas de cultures vigoureuses ; par exemple,  la culture sur pommes de terre n'est pos  sible qu'à la condition d'imprégner     celles-          ci    de tampon à     p,7    7.  



  Dans un     milieu    qui renferme 1 % de glu  cose pur, 0,5 0/0 de peptone de soja, 0,5 0/0       d'extrait        de        coeur        aqueux,        0,5        %        de        chlorure          de        sodium,        0,1        %        de        carbonate        de        calcium,     2     %        d'agar-agar,

          la        résistance        du        streptomyces     est totale en présence de 1     microgramme    par       cm3    de chlorhydrate     d'oxytétracycline,        chlor-          hydrate    de     chlorotétracycline,    pénicilline G  et     chloramphénicol,    partielle en présence de  1     microgramme    par     cm3    de sulfate de strepto  mycine et sulfate de     framycétine,

      nulle avec  1     microgramme    par     cm3        d'érythromycine.       Le   Streptomyces     polychromogenus      est  caractérisé par les variations de la pigmenta  tion tant     endocellulaire        qu'exocellulaire.    Ainsi,  le mycélium aérien peut être de couleur rose  vif à rose pâle, sans- que les autres caractères  morphologiques et physiologiques soient modi  fiés, en particulier la synthèse de     l'O-carbamyl-          D-sérine.    En culture submergée, il peut y avoir  sécrétion d'un pigment, le plus souvent brun,  mais aussi vert olive ou violet foncé.  



  Dans la collection des souches de la Société  Française de la Pénicilline (Romainville, Seine),  le   Streptomyces     polychromogenus      est con  servé sous la référence   T 4473  .  



  Les besoins nutritifs du   Streptomyces       polychromogenus      ne sont pas encore connus  avec exactitude, mais de nombreuses recher  ches, portant sur les sources de carbone et  d'azote, ont montré qu'il est possible d'utiliser  dans les     milieux    de culture en profondeur : la       farine    de soja, les vinasses, la levure de pani  fication, les     hydrolysats        enzymatiques    de ca-         séine,    le glucose massé, le saccharose, la     dex-          trine.     



  L'exemple suivant illustre l'invention. On  peut également produire     1'0-carbamyl-D-sérine     par synthèse biologique à partir de souches  de streptomyces     polychromogenus    issues de  mutations par des agents tels que rayons X,  radiations ultraviolettes, ypérite azotée, etc.

      Exemple    a)     L'inoculum    nécessaire à la culture  dans des conditions de stérilité convenables,  en aérobiose et à une température voisine de       28-30,1    C est constitué, soit directement par  des spores de streptomyces     polychromogenus,     mises en suspension, soit en particulier pour  ensemencer des     fermentateurs    de production,  par des cultures submergées du streptomyces  incubé quarante-huit heures à 280 C sur un  appareil à secousses, dans un milieu renfer  mant:

   glucose 1     'o/o,    extrait de malt sec 0,5 0/0,       farine        de        soja        1%,        chlorure        de        sodium        0,5        0/0,          corn-steep    sec 0,5 0/0, carbonate de calcium  0,1 0/0.

      Dans un fermenteur de 500 litres, on intro  duit 300 litres d'un milieu de culture renfer  mant         farine        de        soja        déshuilée        ....        ...        2,6%     dextrine . . . . - . . . . . - . . . . . . . . . 1 0/0  glucose massé<B>.....</B> . . . - - . . . - . .

   1 0/0       sulfate        de        magnésium        heptahydraté        0,3        %          carbonate        de        calcium        ----------        0,2%       Après avoir stérilisé par chauffage à     120,)    C  pendant quarante minutes, on ensemence avec  la culture de streptomyces     polychromogenus     préparée comme indiqué précédemment et  maintient cinquante heures à     28,

  1    C sous agi  tation et avec insufflation d'air dans les condi  tions usuelles dans l'industrie des antibiotiques.  On centrifuge et le jus clair obtenu est prêt à  être employé pour l'extraction de     l'O-carbamyl-          D-sérine.       b) On ensemence avec des spores stériles  un milieu de culture identique à celui ayant  servi en fermenteur dans l'exemple 1, mais      cette fois en fioles     d'erlenmeyer    agitées par  un appareil à secousses dans une chambre à  280 C et arrête la fermentation après cinq  jours. On centrifuge comme dans l'exemple 1.  



  c) 1 litre de solution centrifugée claire  provenant de a) ou b) est passé goutte à goutte  sur une colonne de 300 g     d'         Amberlite     IR 120  , forme acide (pesée humide), dont  le diamètre est de 25 mm. On lave ensuite  par 500     cm3    d'eau et élue enfin par 1000     cm3          d'une        solution        aqueuse    à     12,%        de        pyridine.     



  On concentre cet     éluat    sous pression ré  duite à 400 C jusqu'au volume de 30     cm3     environ. Pendant les derniers stades de la  concentration, le produit se dépose, amorphe  et faiblement coloré sur les parois du ballon.  A ce moment, on ajoute, en agitant bien,  15     cm3    de méthanol et laisse la précipitation  s'achever à 00 C pendant vingt-quatre heures.  On filtre sur verre fritté et lave par 25 cm'  de méthanol froid à 50%.  



  Le précipité est     redissous    dans 20     cm-2     d'eau chaude, traité par 0,5 g de noir végétal  pendant     quinze    minutes à     70()    C. On centri  fuge et décante, ajoute un volume égal de  méthanol et laisse cristalliser vingt-quatre heu  res à     0()    C. On refait une deuxième cristalli  sation identique et obtient cette fois de petites  aiguilles incolores que l'on filtre; lave au mé  thanol et sèche sous vide. Rendement : 1 g,  F. (sur bloc)     238o    C, effervescence.

      <B><I>A</I></B><I>nalyse<B>:</B></I>     C404N@Hq    = 148    Calculé       C        32,43        %        H        5,44        0/0        N        18,92        %       Trouvé         C        32,4        %        H        5,5        %        N        18,

  8        %       <I>Formation</I>  <I>du dérivé</I>     monodinitrophénylé       <B>100</B> mg     d'O-carbamyl-D-sérine    et 200 mg  de carbonate de soude sont dissous dans  10 cm' d'eau. On ajoute 1250 mg de     2,4-di-          nitro-fluoro-benzène    dissous dans 50     cm3     d'éthanol et laisse réagir à la température  ordinaire en agitant de temps en temps pen-         dant    deux heures. On évapore l'alcool sous  pression réduite, lave la solution aqueuse à  l'éther, puis acidifie par quelques gouttes  d'acide chlorhydrique concentré. Le dérivé       dinitrophénylé    précipite aussitôt.

   On     recris-          tallise    dans l'éthanol aqueux. Aiguilles F. (sur  bloc)     166o    C.    <I>Analyse:</I>     C1aHlo08N4    = 314    Calculé       C        38,2        %        H        3,2        %        N        17,8        %       Trouvé       C        38,0        %        H        3,

  4        %        N        17,6'%       20 mg de ce dérivé sont hydrolysés par  3     cm3    d'acide chlorhydrique 6 N en tube scellé  pendant quatre heures à 1000 C.     L'hydrolysat     est extrait trois fois à l'éther et la couche  éthérée jaune est évaporée. Le résidu, soumis  à la chromatographie, peut être identifié avec  la     dinitrophényl-sérine    synthétique.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de l'O-carbamyl- D-sérine de formule EMI0005.0073 caractérisé en ce qu'on ensemence un milieu aqueux nutritif stérile à un<I>pH</I> compris entre 6 et 8,5, contenant des protéines, des hydrates de carbone et des sels minéraux au moyen de Streptomyces polychromogenus ou d'un mutant de ceui-ci, on fait incuber le mélange en aérobiose, on sépare les produits solides de la fermentation et adsorbe l'O-carbamyl- D-sérine formée sur une résine échangeuse d'ions sulfonique,

   forme acide, qu'on lave à l'eau et d'où l'on élue 1'0-carbamyl-D-sérine à l'aide d'une solution aqueuse d'une base faible qui, par concentration, fournit le produit cherché qu'on purifie par recristallisation dans un solvant. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on effectue la fermentation en profondeur dans des fermenteurs comportant des dispositifs d'aération et d'agitation. 2. Procédé..suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on effectue la fermentation en surface. 3.

   Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'incubation du mélange sous agitation à une température comprise entre 20o et 32o C. 4. Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'on sépare les produits solides de la fer mentation par filtration. 5. Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'on sépare les produits solides de la fer mentation par centrifugation. 6.

   Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce que le milieu aqueux pour la synthèse micro- biologique renferme farine de soja déshuilée . . . . . . . . 2,6% dextrine .................... 1 % glucose massé . . . . . . . . . . . . . . . .

   1 % sulfate de magnésium heptahydraté 0,3% carbonate de calcium . . . . . . . . . . 0,2% 7. Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'on élue 1'0-carbamyl-D-sérine à l'aide d'une solution aqueuse de pyridine. 8. Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce que l'agent d'élution est l'ammoniaque. 9.

   Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce que l'agent d'élution est la triéthylamine. 10. Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce que l'agent d'élution est la tributylamine. 11. Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1 et 3, caractérisé en ce que, après avoir concentré l'éluat jusqu'à un faible volume, on précipite par addition d'un alcool inférieur, on redissout dans l'eau et fait cristalliser par addition d'un solvant miscible à l'eau facilitant la cristallisation. 12.

   Procédé suivant la revendication et les sous-revendications 1, 3 et 11, caractérisé en ce qu'on emploie, comme alcool inférieur ainsi que comme solvant miscible à l'eau, le métha nol.