DD280786B5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae - Google Patents
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae Download PDFInfo
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Description
Anwendungsgebiut der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung rnuriner nioncklonaler Antikörper gegen das in der Zellwand des Streptococcus agalactiae lokalisierte B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid, das als B-Streptokokken-spezifisches Antigen Ausgangspunkt der Typisierung des Streptococcus agalactiae nach dem LANCEFIELD-Scheina ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die human- und veterinärmedizinische Diagnostik.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die Herstellung monoklonaler Antikörper wurde erstmals von KÖHLER line1 MILSTEIN (Nature 1975, 256,495) Mitte der 70er Jahre beschrieben. Die genannten Autoren beschrieben ein Verfahren zur somatischen Fusion von murinen antikörperbiidenden Zellen mit permanent wachsenden Plasmozytomzellinien für die Herstellung von Hybridcmen, die nach entsprechenden Klonierur jsschritten monoklonale Antikörper der Maus gegen gewünschte Antigenspezifitäten produzieren. Mit dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind bereits Antikörper gegen B-Streptokokken hergestellt worden (WANGER, A. R. u. G. M.DUNNY, Infection 3nd Immunity 1987, 55,1170; POLIN, R. A. u. R. KENNETT, J. Clin. Microbiology 1980,11,332; RENCH, M.Α.,T.G.METZGER υ. C.J.BAKER, J. Clin. Microbiology 1984,20,852; RUCH, F.E. u. L.SMITH, J. Clin. Microbiology 1982,16,145).
Bisher sind allerdings keine Hygridomlinien bekannt, deren Charakterisierungsgrad hohe Antikörperausbeuten, überpriifter Spezifität des Typs H-CB-GBS-G1, -G 2, -G 3 und -G 4 garantiert.
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht in der Hersteilung muriner Hybridome, die monoklonale Antikörper sezernieren, die zum Aufbau von Testsystemen für den Nachweis von B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae innerhalb der humanmedizinischen und veterinärmedizinischen Diagnostik dienen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in darauf folgenden Verfahrensschritten Zellklone isoliert werden, die Antikörper gegen das Gruppenpolysaccharid der B-Streptokokken (Streptococcus agalactiae) sezernieren. Die Hybridomzeilen sollen ökonomisch gunstig in vitro und in vivo kultivierbar sein und für darauf/o.gende Reinigungsschritte ausreichende Mengen an morioklonalen Antikörpern sezeniieren. Die monoklonalen Antikörper soilen bezüglich ihrer Spezifität im ELISA gegenüber verschiedenen anderen bakteriellen Antigenen charakterisiert sein.
Die Aufgabe wurde dadurch gelös*, daß zunächst Mäuse vom Stamm BalL'c mit formalinabgetöteten Bakteriensuspensionen eines B-Streptokokkenstamrnes (090R) der Optischen Dichte 1,0 mit lOOpljelmmunisierunrjsdosis nach einem bestimmten erfinderischen Schema immunisiert wurden. Die Immunisierung erfolgte über einen Zeitraum von 8 Wochen bei zweimaliger intravenöser Applikation dor genannten Immunisierungsdosis pro Woche. Als vorteilhaft erwies sich die Immunisierung bei 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen.
Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wurden 4 Tage nach der letzten Immunisierung nach einem beschriebenen Verfahren Zellsuspensionen hergestellt.
Als Fusionspartner für diese Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P3 χ 63 Ag 8/653 (Kearney et al., J. Immunol., 1979,123, 1548) verwendet. Die Kultivierung dieser Zellen erfolgte in einem Zellzuchimeciium RPM11640, Jas mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) supplementiert wurde.
Die Zellfusion wurde nach Vermischen beider Fusionspaitner im Verhältnis 1:5 (Myelomzeiliniezu Milizellen) und ihrer Sedimentation unter Verwendung von Polyethylenglykol durchgeführt. Anschließend erfolgte die Verteilung der fusionierten Zellen in eine Vielzahl von separaten 200μΙ Kulturen. Zur Selektion der fusionierten von den nichifusionierten Myelomzeilen wurde ein Zellkulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthielt (LITTLEHEID, Sc'eroe 1964,145,709), verwandt. Damit erfolg te erfindungsgemäß die Abtrennung jener Klone, die Antikörper der gewünschte r» Spezifität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgte durch den Nachweis sezerniertor Antikörper in den Zellkulturüberständer, wachsender Hybridome mittels eines spezifischen Enzymimmunoassay, der <iuf der Festphasenbindung von Phenol/War ser-extrahiertf r; B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid beruht.
Die so delektierten Antikörper sind spezifisch für das B-StreptokokkenGruppenpolysaccharid das Strepiococcus agaiactiae. Ermittelte Primärzellkulturen wurden bis zur Monoklonalität klcniert und rekloniert, bis gesichert monoklonal Subklone mit stabiler Antikörperproduktion in hoher Qualität und Quantität etabliert waren. Diese Hybridome bezeichneten wir als H-CB-GBS. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-CE-GBS-G 1, -G 2, -G3 und -G4.
Die aufgeführten Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdVV, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert:
H-CB-GBS G4 als ZIM-0298 H-CB-GBS-G 3 als ZIM-0299 H-CB-GBS-G 2 als ZIM-0300 H-CB-GBS-G 1 alsZIM-0301
Die aufgeführten Hybridomzellkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern In-vivo und in vitro.
Beide^ln-vitro-Kultivierung der genannten Hybridome lassen sich bei Aussaat von 5 106 Zollen in herkömmliche 6-well-Zellkulturplatten bis zu 25pg/lgG pro ml Zellkulturüberstand und 30|ig IgM ml Zellkulturüberstand nachweisen.
Die Invivo-Produkten monoklonaler Antikörper erfolgte durch intra-peritoneale Applikation von 2-10 χ 10" Zellen/ml in mit Pristan vorbehandelter Mäusenach bekanntem Verfahren. Nach etwa 8-24 Tagen lassen sich durch Punktion bis zu 10ml Ascitesflüssigkeit konnten bis zu 20mg spezifischer Antikörper nachgewiesen werden. Auf diese Weise konnten aus den genannten Hybridcmen dia monoklonalen Antikörper GB-GBS-G1, -G2, -G3 und -G4 gewonnen werden. Durch verschiedene biochemische und immunochemische Verfahren lassen sich die Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren lassen sich die Antikörper mit Partikeln bzw. mit Enzymen koppeln. Sie können außerdem biotiniliert bzw. für Reinigungsverfahren an Trägermaterialien gekoppelt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper (mAK) weisen einen hohen Grad an Spezifitätscharakterisierung gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigene;) auf, die als kreuzreagierende Komponenten einen Einsatz der bisher beschriebenen mAK einschränken würden. Die neuen mAK zeichnen sich ferner durch eine nach Produktions- und Wachstumscharakteristik ausgewiesene hohe Produktion an spezifischen Antikörpern unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen
Anwendungsbelspielo
Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden 3 weibliche Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen (Balb/c-Mäuse) 2x wöchentlich mit 100μΙ einer formalinabgetöteten B-Streptokokken-Vollkeimsuspension (optische Dichte 1,0 in der 1-cm-Küvette bei 650nm) intravenös immunisiert. 4 Tage nacli der letzten Immunisierung werden 2 x 108 Milzzellen isoliert. Diese werden durch Poiyethylenglykol 1500 mit 2 x 107 Myelomzeilen der Linie P3X63Ag8/653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-well-Zellkulturplatten mit 105 Zellen/weil in 100μΙ ausplattiert. Das Standardzellkulturmedium besteht aus RPM11640 mit 10% FKS. Am folgenden Tag werden 100μΙ eines doppelt konzentrierten HAT-Mediums zugesetzt. Nach einer Woche werden 50μΙ HAT-Medium pro well zugegeben. Nach etwa 14 Tagen erfolgt die Prüfung der Primärkulturan mittels eines hochspezifischen EIA auf die Produktion B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid-spezifischer Antikörper der Mauslmmunglobulinklasse G. Nach dem genannten Verfahren können bis zu 15%-spez. IgG-Antikörper-produzierende Primärkulturen erzeugt v/erden.
Die positiven Primärkulturen werden auf Peritonealmakrophagen der Maus (104/well) nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert und rekloniert. Auf diese Weise kann eine hohe Zahl monoklonaler Zellinien mit spezifischer Anti-Gruppe-B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid-Antikörperproduktion gewonnen werden.
Die bis zur Monoklonalität gezüchteten Zellinien mit spez. Antikörperproduktion gegen B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid werden in feuchter Atmosphäre mil einem 5%igen COj-Anteil in einem Standardkulturmedium gezüchtet. Schrittweise Adaptierung erlaubt die Verringerung des FKS-Anteils auf 2-5%.Durch Verdünnung im Verhältnis 1:10 wird das Zellkulturvolumen schrittweise vergrößert. Nach Erreichen der Massenkultur in Rollerflaschen von 500ml Fassungsvermögen ist die Passage in den 50I Bioreaktor möglich.
In 6-wciil-Kulturplatten werden die monoklonalen Hybridome bis auf Zellzahlen von 1 χ 106ml gezüchtet. Die Zellen werden 2x in isotonischer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer Konzentration von 5 χ 106Hybridomzellen/m!in dergleichen Losung aufgenommen. Je 1 ml dieser Zellsuspension wird in Balb/c-Mäuse, die 8 Tage vorher mit 1 ml Pristan i. p. behandelt wurden, i. p. appüziert. Die Ascitesproduktion läßt sich nach 8-14 Tagen an der Bauchschwellung der Mäuse feststellen. 2-15ml Ascites mit einem Antikörpergehalt von bis zu 20mg spezifischem Antikörper konnten pro Maus gewonnen werden. Die Reinigung der Antikörper erfolgte nach bekannten Verfahren.
Nach dem beschriebenen Schema wurden Hybridonizellinien mit monoklon-jler Antikörperproduktion gegen B-St reptokokkengruppenpolysacch arid gewonnen, die mit H-CB-GBS-G1, -G 2, -G 3, und -G 4 bezeichnet wurden. Diese Zellinien wurden bezüglich ihrer Spezifität getestet (Tabelle 1) und fur die Optiinierung des Verfahrens der Herstellung entsprechender Antikörper charakterisiert (Tabelle 2).
Tabelle 1: Spezifiiätstestung monokionaler Antikörper gegen das B-StreptokokkenGruppenpolysaccharid des Sc. agalactiae
Extinktion 460nm (Entwicklung, Peroxidase markierter Anti-Species-Antikörper, Substrat 0[3D) Testung ZKÜ, Festphasenbeladung mit LANCEFIELD-Antigenen aus
| Antikörper | ScA | ScC | ScG | ScB |
| CB-GBS-G 1 | 0,096 | 0,122 | 0,103 | 2,0 |
| CB-GBS-G 2 | 0,085 | 0,112 | 0,076 | 2,000 |
| CB-GBS-G 3 | 0,180 | 0,180 | 0,168 | 2,000 |
| CB-GBS-G4 | Q1OQA | 0,096 | 0,102 | 2,000 |
Tabelle 2: Charakterisierung der Hybridomzellinisn mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen Gruppe B-Streptokokken-Gruppenpoiysaccharid
| Klon | Vercoppe- | IgG- | Ig-Klasse | Isoelektr |
| lungszeit | Produktion | Punkt | ||
| (h) | (MgBx 105 | |||
| Zellen/ml) | ||||
| H-CB-GBS-G 1 | 19 | 10,1 | G | >8,0 |
| H-CB-GBS-G 2 | 21 | 12,0 | G | >8,0 |
| H-CB-GBS-G 3 | 27 | 24,0 | G | >8,0 |
| H-CB-GBS-G 4 | 21 | 14,0 | G | >8,0 |
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung rnonoklonaler Antikörper, die Strukturen des 8-Streptokokken-Gruppenpolysaccharides des Streptococcus agalactiae erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit B-Streptokokken und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzeliinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzeilen H-CB-GBS-G 1 (ΖΙΜ-030Ί), H-CB-GBS-G2 (ZIM-0300) selektiert,zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die monoklonalen Antikörper CB-GBS-G1, CB-GBS-G2 isoliert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum von 8 Wochen zweimal wöchentlich intravenös appliziert wurde.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Partixel, Enzyme bzw. an Trägermaterialien gekoppelt werden.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B5 | Patent specification, 2nd publ. accord. to extension act | ||
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