DD296964A5

DD296964A5 - Neuartige il-2-rezeptor-spezifische human-immunoglobuline

Info

Publication number: DD296964A5
Application number: DD90337159A
Authority: DD
Inventors: Cary L Queen; Harold E Selick
Original assignee: ��@��@��k��Kk��
Priority date: 1988-12-28
Filing date: 1990-01-17
Publication date: 1991-12-19
Also published as: NO2007006I2; NO2005026I1; YU48700B; NO2001025I2; HK1014718A1; IL92904A0; JP2007145863A; DE122009000071I1; NL300005I2; NO2006009I2; ES2523810T1; NO912385L; AU647383B2; NO2009026I1; NL300173I1; NL990020I1; DE19975047I2; EP0451216B9; NL300023I2; DE122005000057I2

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige IL-2-Rezeptor-spezifische Human-Immunoglobuline. Es werden humanartige Immunoglobuline, die speziell mit Human-IL-2-Rezeptoren reagieren koennen, unter Anwendung von Rekombinant-DNA-Technologie erzeugt, die fuer den Gebrauch z. B. bei der Behandlung von auf T-Zellen zurueckzufuehrende Stoerungen vorgesehen sind.{Human-Immunoglobuline; Human-IL-2-Rezeptoren; Rekombinant-DNA-Technologie; Anwendung}

Description

Hierzu 8 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf neuartige IL-2-Rezeptor-spezifische Human-Immunoglobuline. Sie betrifft allgemein die Kombination von Technologien für rekombinante DNA und monoklonale Antikörper zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Mittel, und genauer gesagt, die Produktion von nicht-immunisierenden, für den lnterleukin-2-Rezeptor des Menschen spezifischen Antikörpern und deren Anwendung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bei Säugetieren wird die Immunreaktion durch zwei Arten von Zellen vermittelt, die spezifisch mit fremden Stoffen, d.h. Antigenen, zusammenwirken. Ein dieser Zelltypen, B-Zellen, ist für die Produktion von Antikörpern verantwortlich. Die zweite Zellklasse, T-Zellen, umfaßt eine große Anzahl von zellularen Untergruppen, die die In-vivo-Funktion von B-Zellen und einer weiten Vielzahl anderer hämatopoetischer Zellen, einschließlich T-Zellen, steuern.

Ein Weg, auf dem die T-Zellen diese Kontrolle ausüben, geht über die Produktion eines als lnterleukin-2 (IL-2) bekannten Lymphokins, das ursprünglich T-Zellen-Wachstumsfaktor genannt wurde. Die Hauptfunktion von IL-2 scheint in der Stimulierung und Erhaltung von T-Zellen zu bestehen. Tatsächlich sind einige Immunologen der Meinung, daß sich IL-2 im Zentrum der gesamten Immunreaktion befinden könnte (siehe Farrar, J., u.a., Immunol. Rev. 63: 129-166 [1982] hier unter Bezugnahme einbezogen).

Um seine biologischen Einflüsse auszuüben, wirkt IL-2 mit einem spezifischen Membran-Rezeptor hoher Affinität zusammen (Greene, W., u.a., Progress in Hematology XIV, E. Brown, Herausg. Grüne and Statton, New York, [1986], S.283ff.). Der IL-2-Rezeptor des Menschen ist ein kompliziertes Mehrketten-Glycoprotein, wobei eine Kette, die als dasTac-Peptid bekannt ist, eine Größe von etwa 55 kD hat (siehe Leonard, W., u.a., J. Biol. Chem. 260:1872 [1985] hier unter Bezugnahme einbezogen). Ein Gen, das dieses Protein kodiert, ist isoliert worden und sagt ein Peptid mit 272 Aminosäuren, einschließlich ein Signalpeptid mit 21 Aminosäuren, voraus (siehe Leonard, W., u.a.. Nature 311: 626 [1984]). Die NH₂-terminalen 219 Aminosäuren des p55-Tac-Proteins besitzen offensichtlich eine extrazelluläre Domäne (siehe Leonard, W., u.a., Science 230: 633-639 [1985], hierunter Bezugnahme einbezogen).

Ein großer Teil der Erklärung der Struktur des IL-2-Rezeptors des Menschen und dessen Funktion beruht auf der Entwicklung von spezifischen reaktionsfähigen monoklonalen Antikörpern. Insbesondere hat ein monoklonaler Mäuse-Antikörper, bekannt als Anti-Tac (Uchiyama, u.a., J. Immunol. 126:1393 [1981]) gezeigt, daß IL-2-Rezeptoren auf T-Zellen nachgewiesen werden können, aber auch auf Zellen der Monozyten-Makrophagen-Familie, Kupfer-Zellen der Leber, Langerhansschen Zellen der Haut und natürlich aktivierten T-Zellen. Wichtig ist, daß ruhende T-Zellen, B-Zellen oder zirkulierende Makrophagen bezeichnenderweise den IL-2-Rezeptor nicht zeigen (Herrmann, u.a., J. Exp. Med. 162: 1111 [1985]).

Der monoklonale Anti-Tac-Antikörper ist ebenfalls zur Definition von Lymphozytenfunktionen, die IL-2 Wechselwirkung erfordern, eingesetzt worden, und es zeigte sich, daß er verschiedene T-Zellenfunktionen, die die Erzeugung von zytotoxischen und Suppressor-T-Lymphozyten in Zellkultur einschließen, inhibiert. Aufgrund von Untersuchungen mit Anti-Tac- und anderen Antikörpern ist eine Vielzahl von Störungen jetzt auf falsche Expression von IL-2-Rezeptor durch T-Zellen zurückzuführen, vor allem Leukämie durch ausgewachsene T-Zellen.

Kürzlich wurde gezeigt, daß der IL-2-Rezeptor eine ideale Möglichkeit für neuartige therapeutische Maßnahmen bei auf T-Zellen zurückzuführenden Krankheiten bietet. Es ist vorgeschlagen worden, daß für den IL-2-Rezeptor spezifische Antikörper, wie der monoklonale Anti-Tac-Antikörper, entweder allein oder als ein Immunokonjugat (z.B. mit Ricin A, Isotropen und dergleichen) verwendet werden können, um Zellen, die den IL-2-Rezeptor tragen, wirksam zu entfernen. Diese Mittel können theoretisch beispielsweise IL-2-Rezeptor-exprimierende Leukämiezellen, bestimmte B-Zellen oder aktivierte T-Zellen, die bei einem Krankheitszustand zu finden sind, eliminieren, gestatten jedoch die Retention von vollentwickelten normalen T-Zellen und deren Vorläuferin, um die Fähigkeit zu gewährleisten, daß eine normale T-Zellen-Immunreaktion nach Bedarf angebracht wird. Im allgemeinen können die meisten anderen, für T-Zellen spezifischen Mittel im wesentlichen alle peripherischen T-Zellen zerstören, wodurch die therapeutische Wirksamkeit der Mittel eingeschränkt wird. Insgesamt kann die Anwendung entsprechender monoklonaler Antikörper, die für den IL-2-Rezeptor spezifisch sind, bei autoimmunen Erkrankungen, Organtransplantationen und irgendwelchen unerwünschten Reaktionen durch aktivierte T-Zellen therapeutisch von Nutzen sein. Tatsächlich sind klinische Versuche unter Verwendung von z. B. Anti-Tac-Antikörpern in Angriff genommen worden (siehe allgemein Waldman, T., u. a.. Cancer Res. 45: 625 [1985] und Waldman, T., Science 232: 727-732 [1986], beide hier unter Bezugnahme einbezogen).

Leider hat die Anwendung von Anti-Tac und anderen nichthumanen monoklonalen Antikörpern verschiedene Nachteile, vor allem in wiederholten therapeutischen Systemen, wie unten beschrieben wird. Monoklonale Mäuse-Antikörper zum Beispiel befestigen die Human-Ergänzung nicht gut und es fehlen ihnen andere wichtige funktionell Immunoglobulin-Charakteristika, wenn sie für Menschen eingesetzt werden.

Wichtiger ist wahrscheinlich, daß Anti-Tac- und andere nicht-humane monoklonale Antikörper erhebliche Strecken von Amminosäuresequenzen enthalten, die bei der Injektion in einen Menschen immunigenisierend sein werden. Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, daß die von einem Patienten gegen einen Antikörper erzeugte Immunreaktion nach der Injektion eines fremden Antikörpers ziemlich stark sei η kann, wodurch die therapeutische Nützlichkeit des Antikörpers nach einer anfänglichen Behandlung im wesentlichen eliminiert wird. Da wahrscheinlich verschiedene Mäuse-oder andere (bei Menschen) antigenisierende monoklonale Antikörper in zunehmender Anzahl für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten entwickelt werden, können sich nach einer ersten und zweiten Behandlung mit irgendwelchen unterschiedlichen, nicht-humanen Antikörpern anschließende Behandlungen selbst bei nichtverwandten Therapien als unwirksam oder an sich sogar als gefährlich erweisen. Obwohl die Produktion von sogenannten „schimärischen Antikörpern" (z. B. variable Mäuse-Regionen vereinigt mit konstanten-Human-Regionen) ziemlich erfolgreich war, bleibt ein wichtiges Immunigenisierungsproblem bestehen. Im allgemeinen war die Produktion von Immunoglobulinen, die mit dem IL-2-Rezeptor des Menschen sowie mit vielen Human-Antigenen reaktionsfähig sind, bei der Anwendung von für monoklonale Human-Antikörper typischen Produktionstechniken äußerst schwierig. Auch die Anwendung von Rekombinant-DNA-Technologie zur Erzeugung sogenannter „humanisierter" Antikörper (siehe z. B. EPO Veröffentlichung Nr. 0239400) führt zu zweifelhaften Ergebnissen, zum Teil wegen der nichtvoraussagbaren Bindungsaffinitäten.

Es besteht also ein Bedarf an verbesserten Formen von humanartigen, für den Human-IL-2-Rezeptor spezifischen Immunoglobulinen, die im Menschen im wesentlichen nichtimmunigenisierend sind und doch leicht und wirtschaftlich in einer für therapeutische Formulierung und andere Anwendungsfälle geeigneten Art und Weise erzeugt werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Erfüllung dieser und anderer Aufgaben.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen, die beispielsweise zur Behandlung von auf T-Zellen beruhenden Krankheiten bei Menschen geeignet sind, wobei die Zusammensetzungen humanartige Immunoglobuline enthalten, die speziell in der Lage sind, die Bindung von Human IL-2 an seinen Rezeptor zu blockieren und/oder fähig sind, das p55-Tac-Protein an Human-IL-2-Rezeptoren zu binden. Die Immunoglobuline können zwei Paare von Leichtketten-ZSchwerkettenkomplexen haben, wobei mindestens ein Paar im typischen Fall Ketten hat, die Komplementärität bestimmende Mäuse-Regionen aufweisen, die funktionell mit Human-Rasterregionsegmenten verbunden sind. Zum Beispiel können Komplementärität bestimmende Mäuse-Regionen mit oder ohne zusätzliche natürlich-assoziierte Mäuse-Aminosäurereste verwendet werden, um humanartige Antikörper zu erzeugen, die in der Lage sind, sich an den Human IL-2-Rezeptor bei Affinitätsgraden zu binden, die stärker als etwa 10⁸M"¹ sind.

Die erfindungsgemäßen Immunoglobuline, einschließlich von Bindungsfragmenten und anderen Derivaten, können ohne Schwierigkeiten mit Hilfe zahlreicher Rekombinant-DNA-Techniken mit endgültiger Expression in transfizierten Zellen, vorzugsweise immortalisierten eukaryotischen Zellen wie Myeloma- oder Hybridomazellen, erzeugt werden. Polynucleotide, die eine erste Sequenz, die für humanartige Immunoglobulin-Rasterregionen kodiert, und einen zweiten Sequenzsatz aufweisen, der für die Regionen kodiert, die die verlangte Immunoglobulin-Komplementärität bestimmen, können synthetisch erzeugt werden oder durch Vereinigen von entsprechenden cDNA- und genomischen DNA-Segmenten. Die humanartigen Immunoglobuline können alleine in im wesentlichen reiner Form eingesetzt werden oder mit einem zytotoxischen Mittel wie einem Radionucleotid, einem ribisomal-inhibierenden Protein oder einem auf Zelloberflächen aktiven zytotoxischen Mittel zusammengebracht werden. Alle diese Verbindungen werden besonders bei der Behandlung von durch

T-Zellen verursachten Störungen nützlich sein. Die humanartigen Immunoglobuline oder deren Komplexe können in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosisform hergestellt werden, die je nach der Verarbeitung variieren wird. Die Erfindung betrifft auch neuartige Methoden für die Gestaltung von humanartigen Immunoglobulinketten, die eine oder mehrere, die Komplementärität bestimmende Regionen (CDRs) von einem Donator-lmmunoglobulin und eine Rasterregion von einem Human-Immunoglobulin aufweisen, wobei die bevorzugten Methoden darin bestehen, daß zuerst die Raster- oder Aminosäuresequenz der variablen Region des Donator-Immunoglobulins mit den entsprechenden Sequenzen in einer Kollektion von Human-Immunoglobulinketten verglichen wird und eine oder mehrere homologe Sequenzen aus der Kollektion als das Human-Immunoglobulin ausgewählt werden. Die Human-Immunoglobulin- oder Akzeptor-Immunoglobulinsequenz wird bezeichnenderweise aus einer Kollektion von mindestens 10 bis 20 Immunoglobuliri-Kettensequenzen ausgewählt und wird normalerweise die höchste Homologie zu der Donator-Immunoglobulinsequenz von jeder Sequenz in der Kollektion haben. Die Hu man-lmmunoglobulin-Rastersequenz wird praktisch etwa 65 bis 70% Homologie oder mehr für die Donator-lmmunoglobulin-Rastersequenz aufweisen. Das Donator-lmmunoglobulin wird entweder einer schwere Kette oder eine leichte Kette (oder beides) sein, und die Human-Kollektion wird die gleiche Art von Kette enthalten. Es kann eine humanisierte leichte und schwere Kette zur Bildung eines kompletten humanisierten Immunoglobulins oder Antikörpers verwendet werden, die zwei Leicht-/ Schwerkettenpaare mit oder ohne partielle oder konstante Humanregion voller Länge und andere Proteine aufweist. Bei einem anderen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel können, entweder in Verbindung mit dem obigen Vergleichsschritt oder getrennt, zusätzliche Aminosäuren in einer Akzeptor-Immunoglobulinkette durch Aminosäuren von der CDR-Donator-Immunoglobulinkette ersetzt werden. Genauer gesagt, es werden weitere wahlweise Substitutionen einer Human-Raster-Aminosäure des Akzeptor-Immunoglobulins durch eine entsprechende Aminosäure von einem Donator-lmmunoglobulin an Stellen in den Immunoglobulinen vorgenommen werden, an denen:

(a) die Aminosäure in der Human-Rasterregion eines Akzeptor-Immunoglobulins an dieser Position selten ist und die entsprechende Aminosäure in dem Donator-lmmunoglobulin an dieser Position in Human-Immunoglobulin-Sequenzen häufig ist; oder

(b) sich die Aminosäure unmittelbar neben der der CDRs befindet; oder

(c) sich die Aminosäure voraussichtlich innerhalb von etwa 3Ä der CDRs in einem dreidimensionalen Immunoglobulinmodell befindet und in der Lage ist, mit dem Antigen oder mit den CDRs des humanisierten Immunoglobulins zusammenzuwirken.

Die humanisierte Immunoglobulinkette wird praktisch mindestens etwa 3 Aminosäuren von dem Donator-lmmunoglobulin zusätzlich zu den CDRs aufweisen, von denen sich gewöhnlich wenigstens eine unmittelbar neben einer CDR in dem Donatorlmmunoglobulin befindet. Die schwere und die leichte Kette können jeweils unter Anwendung irgendeines oder aller drei der Positionskriterien entwickelt werden.

Bei der Kombination zu einem intakten Antikörper werden die erfindungsgemäßen humanisierten leichten und schweren Ketten im wesentlichen bei Menschen nicht immunigenisierend wirken und im wesentlichen die gleiche Affinität wie das Donatorlmmunoglobulin zu dem Antigen beibehalten (wie ein Protein oder eine andere, ein Epitop enthaltende Verbindung). Diese Affinitätsgrade können von etwa 10⁸M"¹ oder mehr variieren und können innerhalb etwa des Vierfachen der ursprünglichen Affinität des Donator-Immunoglobulins zu dem Antigen liegen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1: Vergleich von Sequenzen von schwerer anti-Tac-Kette (obere Zeilen) und schwerer Eu-Kette (untere Zeilen). Es wird der 1 -Buchstaben-Code für Aminosäuren angewandt. Die erste Aminosäure in jeder Zeile wird an der linken Seite numeriert. Identische Aminosäuren in den beiden Sequenzen sind durch Linien verbunden. Die 3CDRs sind unterstrichen. Andere Aminosäurepositionen, für die die Anti-Tac-Aminosäure anstelle der Eu-Aminosäure in der humanisierten schweren Anti-Tac-Kette verwendet wurde, werden durch einen * bezeichnet.

Figur 2: Vergleich von Sequenzen von leichter Anti-Tac-Kette (obere Zeilen) und leichter Eu-Kette (untere Zeilen). Es wird der Einzel-Buchstaben-Code für Aminosäuren angewandt. Die erste Aminosäure in jeder Zeile wird an der linken Seite numerisiert. Identische Aminosäuren in den beiden Sequenzen sind durch Linien verbunden. Die 3 CDRs sind unterstrichen. Andere Aminosäurepositionen, für die die Anti-Tac-Aminosäure anstelle der Eu-Aminosäure in der humanisierten schweren Anti-Tac-Kette verwendet wurde, sind durch einen * gekennzeichnet.

Figur 3: Nucleotidsequenz des Gens für das humanisierte Anti-Tac-Schwerketten-Gen variabler Region. Die übertragene Aminosäuresequenz für den Teil des Protein kodierenden Gens wird unter der Nucleotidsequenz gezeigt. Die Nucleotide TCTAGA am Anfang und am Ende des Gens sind Xba-I-Stellen. Die vollentwickelte Schwerkettensequenz beginnt mit Aminosäure #20Q.

Figur 4: Nucleotidsequenz des Gens für das humanisierte Anti-Tac-Leichtketten-Gen variabler Region. Die übertragene Aminosäuresequenz für den Teil des Protein kodierenden Gens wird unter der Nucleotidsequenz gezeigt. Die Nucleotide TCTAGA am Anfang und am Ende des Gens sind Xba-I-Stellen. Die vollentwickelte Leichtketten-Sequenz beginnt mit Aminosäure #21 D.

Figur 5: A. Sequenzen der vier Oligonucleotide, die zum Synthetisieren des humanisierten Anti-Tac-Schwerketten-Gens verwandt wurden, gedruckt 5' bis 3'. B. Relative Positionen der Oligonucleotide. Die Pfeile zeigen in die З'-Richtung für jedes Oligonucleotid.

Figur 6: (A) Sequenzen der vier Oligonucleotide, die für die Synthetisierung des humanisierten Gens der leichten Anti-Tac-Kette verwendet wurden, gedruckt 5' bis 3'. (B) Relative Positionen der Oligonucleotide. Der Pfeil zeigt in die З'-Richtung für jedes Oligonucleotid. Es wird die Position einer Hind Ml Stelle in der Überlappung von JFD 2 und JFD 3 gezeigt.

Figur 7: Schematisches Diagramm desPlasmids pHuGTAC1,daszur Exprimierung der humanisierten leichten Anti-Tac-Kette verwandt wurde. Es werden relative Restriktionsstellen gezeigt, und Kodierungsregionen der schweren Kette werden als Kästchen widergegeben. Die Richtung der Transcription von dem Immunoglobulin(lg)-Promotor wird durch einen Pfeil dargestellt. E_H = Schwerkettenverstärker, Hyg = Hygromycin-Resistenz-Gen.

Figur 8: Schematisches Diagramm des Plamsids pHuLTAC, das zur Exprimierung der humanisierten leichten Anti-Tac-Kette verwandt wurde. Es werden relative Restruktionsstellen gezeigt, und Kodierungsregionen der leichten Kette werden als Kästchen wiedergegeben. Die Richtung der Transcription von dem Ig-Promotor wird durch einen Pfeil.dargestellt.

Figur 9: Fluorozytometrie von HUT-102 und Jurkatzellen, gefärbt mit Anti-Tac-Antikörper oder humanisiertem Anti-Tac-Antikörper, gefolgt jeweils von fluorescein-konjugiertem Anti-Mäuse-Ig-Antikörper von Ziegen oder Anti-Human-Ig-Antikörper von Ziegen, wie gekennzeichnet. In jedem Feld zeigt die gestrichelte Kurve die Ergebnisse, wenn der erste Antikörper weggelassen wurde, und die ausgezogene Kurve die Ergebnisse, wenn der erste und zweite (konjugierte) Antikörper nach der Beschreibung einbezogen wurde.

Figur 10: (A) Fluorozytometrie von HUT-102 Zellen, gefärbt mit 0 bis40ng Anti-Tac wie angegeben, dann mit biotinyliertem Anti-Tacund danach mit phycoerythrinkonjugiertem Avidin. (B) Fluorozytometrie von HUT-102 Zellen, gefärbt mit dem angegebenen Antikörper, danach mit biotinyliertem Anti-Tac und schließlich mit phycoerythrin-konjugiertem Avidin.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß werden humanartige Immunoglobuline zur Verfügung gestellt, die spezifisch mit dem IL-2-Rezeptor auf Human-T-Zellen reaktionsfähig sind. Diese Immunoglobuline, die Bindungsaffinitäten von mindestens etwa 10⁸ M"¹, und vorzugsweise von 10⁹M"¹ bis 10¹⁰M"¹ oder stärker haben, sind in der Lage, z.B. die Bindung von IL-2 an Human-IL-2-Rezeptoren zu blockieren. Die humanartigen Immunoglobuline werden ein humanartiges Raster haben und können Komplementärität bestimmende Regionen (CDRs) von einem Immunoglobulin, praktisch einem Mäuse-Immunoglobulin, haben, das speziell mit einem Epitop an p55-Tac-Protein reaktionsfähig ist. Die erfindungsgemäßen Immunoglobuline, die wirtschaftlich in großen Mengen produziert werden können, finden beispielsweise bei der Behandlung von durch T-Zellen ausgelösten Störungen bei Menschen mit Hilfe der verschiedensten Techniken Anwendung.

Es ist bekannt, daß die grundlegende Antikörper-Struktureinheit ein Tetramer aufweist. Jedes Tetramer ist aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten zusammengesetzt, wobei jedes Paar eine „leichte" (etwa 25 kD) und eine „schwere" Kette (etwa 50 bis 7OkD) hat. Der NH₂-Terminus jeder Kette führt eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren an, die hauptsächlich für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Der COOH-Terminus jeder Kette bestimmt eine konstante Region, die hauptsächlich für die Effektorfunktion verantwortlich ist.

Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert (oder subklassifiziert) und bestimmen den Isotyp des Antikörpers als IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE. Innerhalb leichter und schwerer Ketten sind die variablen und konstanten Regionen durch eine „J"-Region von etwa 12 oder mehr Aminosäuren verbunden, wobei die schwere Kette auch eine „D"-Region von etwa 12 weiteren Aminosäuren einschließt. (Siehe allgemein Fundamental Immunology, Paul, W., Herausgeb., Kapitel 7, S. 131-166, Raven Press, N.Y. [1984], hierunter Bezugnahme einbezogen).

Die variablen Regionen jedes Leicht/Schwerkettenpaares bilden die Antikörper-Bindungsstelle. Die Ketten zeigen alle die gleiche allgemeine Struktur von verhältnismäßig erhalten gebliebenen Rasterregionen, die durch drei hypervariable Regionen, ebenfalls CDRs genannt, verbunden sind (siehe „Sequences of Proteins of Immunological Interest" [Sequenzen von Proteinen von immunologischem Interesse], Kabat, E., u.a., U.S.Department of Helath and Human Services, [1983]; und Colthia und Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 [1987], hier unter Bezugnahme einbezogen). Die CDRs von den beiden Ketten jedes Paares sind durch die Rasterregionen ausgerichtet, so daß die Bindung an ein spezifisches Epitop möglich ist.

In der hier gebrauchten Bedeutung bezieht sich der Begriff „Immunoglobulin" auf ein Protein, das aus einem oder mehreren Polypeptiden besteht, die im wesentlichen durch Immunoglobulingene kodiert werden. Die erkannten Immunoglobulingene umfassen die Kappa-, Lambda-, Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und Mu-Gene der konstanten Region sowie die Unzahl von Immunoglobulingenen der variablen Region. Die Immunoglobuline können in einer Vielzahl von Formen neben Antikörpern bestehen, einschließlich zum Beispiel Fv, Fab und F(ab)₂, sowie in Einzelketten (z. B. Huston, u.a., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S. A„ 85: 5879-5883 [1988] und Bird, u.a., Science, 242: 423-426 [1988], hier unter Bezugnahme einbezogen). (Siehe allgemein, Hood, u.a., „Immunology", Benjamin, N.Y., 2.Aufl. 11984] und Hunkapiller und Hood, Nature,323:15-16 Π 986], hier unter Bezugnahme einbezogen).

Schimärische Antikörper sind Antikörper, deren Leicht- und Schwerkettengene praktisch durch gentische Techniken aus Immunoglobulin-Gensegmenten, die zu verschiedenen Spezies gehören, konstruiert worden sind. Zum Beispiel können die variablen (V) Segmente der Gene von einem monoklonalen Mäuse-Antikörper mit konstanten (C) Human-Segmenten wie γ, und Y₃ vereinigt werden. Ein typischer therapeutischer schimärer Antikörper ist somit ein Hybridprotein, das aus der V oder Antigen-Bindungsdomäne von einem Mäuse-Antikörper und der C oder Effektor-Domäne von einem Human-Antikörper besteht (z. B. A.T.C.C. Zugriffsnummer CRL9688 scheidet einen Schimären Anti-Tac-Antikörper aus) obwohl andere Säugetierspezies herangezogen werden können.

In der hier gebrauchten Bedeutung bezieht sich der Begriff „Rasterregion" auf diejenigen Abschnitte von variablen Immunoglobulin-Leicht- und -Schwerketten-Regionen (d. h. andere als die CDRs), die unter den verschiedenen Immunoglobulinen in einer einzigen Spezies relativ gut erhalten geblieben sind, wie von Kabat, u.a., oben definiert wird. Im hier vorgesehenen Sinn bezieht sich der Begriff „humanartige Rasterregion" auf eine Rasterregion, die in jeder bestehenden Kette mindestens etwa 70 oder mehr Aminosäurereste aufweist, im allgemeinen 75 bis 85 oder mehr Reste, die mit denen in Human-Immunoglobulinen identisch sind.

Im hier gebrauchten Sinn bezieht sich der Begriff „humanartiges Immunoglobulin" auf ein Immunoglobulin, das ein humanartiges Raster aufweist und in dem jede vorhandene konstante Region im wesentlichen mit einer konstanten Human-Immunoglobulin-Region homolog ist, d. h. mindestens zu etwa 85 bis 90%, vorzugsweise zu etwa 95%, identisch ist. Somit sind im wesentlichen alle Teile eines humanartigen Immunoglobulins, außer möglicherweise den CDR's, mit entsprechenden Teilen von einer oder mehreren natürlichen Human-Immunoglobulin-Sequenzen homolog. Zum Beispiel würde ein humanartiges Immunoglobulin keinen schimärischen Mäuse-Antikörper variabler Region/Human-Antikörper konstanter Region umfassen.

Die Erfindung enthält auch Kriterien, mit deren Hilfe eine begrenzte Anzahl von Aminosäuren in dem Raster einer humanartigen oder humanisierten Immunoglobulinkette so gewählt werden, daß sie die gleichen sind wie die Aminosäuren an solchen Positionen in dem Donator und nicht im Akzeptor, um die Affinität eines die humanisierte Immunoglobulinkette enthaltenden Antikörpers zu erhöhen.

Die Erfindung basiert zum Teil auf dem Modell, daß zwei Ursachen zum Verlust an Affinität in dem dem bisherigen Stand der Technik entsprechenden Verfahren zur Produktion humanisierter Antikörper beitragen (wobei als Beispiele Mäuse-Antikörper als Quelle für die CDRs verwendet werden), und zwar:

1. Wenn die Mäuse-CDRs mit dem Human-Raster kombiniert werden, dann werden die in dem Raster dicht an den CDRs liegenden Aminosäuren zu Human-Aminosäuren anstelle von Mäuse-Aminosäuren werden. Ohne sich der Theorie verpflichtet zu fühlen, ist man der Ansicht, daß diese veränderten Aminosäuren die CDRs leicht verformen können, weil sie andere elektrostatische oder hydrophobe Kräfte erzeugen als in dem Donator-Antikörper der Mäuse, und die verformten CDRs keine so wirksamen Kontakte mit dem Antigen bilden können, wie es bei den CDRs in dem Donator-Antikörper der Fall war;

2. Auch Aminosäuren in dem ursprünglichen Mäuse-Antikörper, die dicht bei den CDRs liegen, aber nicht Teil derselben sind (d.h. noch Teil des Rasters sind) können Kontakte mit dem zur Affinität beitragenden Antigen herstellen. Diese Aminosäuren gehen verloren, wenn der Antikörper humanisiert wird, weil alle Raster-Aminosäuren human geworden sind.

Um diese Probleme zu vermeiden und humanisierte Antikörper zu erzeugen, die eine sehr starke Affinität für ein erwünschtes Antigen haben, werden in der Erfindung die folgenden vier Kriterien zur Entwicklung von humanisierten Immunoglobulinen angewandt. Diese Kriterien können einzeln oder erforderlichenfalls in Kombination angewandt werden, um die verlangte Affinität oder andere Charakteristika zu erzielen.

Kriterium I: Als Akzeptor ist ein Raster von einem bestimmten Human-Immunoglobulin, das selten mit dem zu humanisierenden Donator-Immunoglobulin homolog ist, zu verwenden, oder es ist ein Konsensus-Raster von vielen Human-Antikörpern einzusetzen. Zum Beispiel zeigt der Vergleich der Sequenz von einer variablen Schwer- (oder Leicht-) Kettenregion von Mäusen mit variablen Schwer- (Leicht-) Kettenregionen des Menschen in einer Datenbank (zum Beispiel der National Biomedical Research Foundation Protein Identification Resource), daß das Ausmaß der Homologie bei verschiedenen Human-Regionen stark variiert, praktisch von etwa 40% bis etwa 60 bis 70%. Durch die Wahl einer der variablen Human-Schwer-(bzw. Leicht-) Kettenregionen als das Akzeptor-Immunoglobulin, das am stärksten homolog mit der variablen Schwer- (bzw. Leicht-) Kettenregion des Donator-Immunoglobulinsist, werden weniger Aminosäuren beim Übergang von dem Donator-Immunoglobulin zu dem humanisierten Immunoglobulin verändert. Ohne sich wieder an die Theorie gebunden zu fühlen, wird daher angenommen, daß eine geringere Chance für den Austausch einer Aminosäure nahe der CDRs besteht, die deren Übereinstimmung zerstört. Darüber hinaus kann die genaue Gesamtgestalt eines die humanisierte Immunoglobulinkette enthaltenden humanisierten Antikörpers viel mehr als Gestalt des Donator-Antikörpers ähneln, wodurch auch die Chance der Zerstörung der CDRs reduziert wird.

Praktisch wird eine der 3 bis 5 homologsten Schwerkettensequenzen variabler Region in einer repräsentativen Kollektion von mindestens etwa 10 bis 20 ausgeprägten schweren Humanketten als Akzeptor gewählt, um das Raster der schweren Ketten zu schaffen, und in ähnlicher Weise fur die leichte Kette. Vorzugsweise wird eine der 1 bis 3 homologsten variablen Regionen verwendet. Die gewählte Akzeptor-Immunoglobulinkette wird am vorteilhaftesten mindestens 65% Homologie in der Rasterregion zu dem Donator-Immunoglobulin aufweisen.

Unabhängig davon, wie das Akzeptor-Immunoglobulin gewählt wird, kann höhere Affinität dadurch erzielt werden, daß eine kleine Anzahl von Aminosäuren in dem Raster der humanisierten Immunoglobulinkette so gewählt wird, daß sie den Aminosäuren an denjenigen Positionen in dem Donator und nicht in dem Akzeptor gleich sind. Die folgenden Kriterien definieren, welche Aminosäuren so gewählt werden können. Vorzugsweise wird an den meisten oder allen Aminosäurepositionen, die einem dieser Kriterien entsprechen, die Donator-Aminosäure tatsächlich gewählt werden. Kriterium II: Wenn eine Aminosäure in dem Raster des Human-Akzeptor-Immunoglobulins ungewöhnlich ist (d. h. „selten", was im hier vorgesehenen Sinne eine Aminosäure bezeichnet, die an dieser Stelle in nicht mehr als etwa 10% der Human-Schwer-[bzw. Leicht-] Ketten V Regionsequenzen in einer repräsentativen Datenbank vorkommt), und wenn die Donator-Aminosäure an dieser Stelle typisch für Human-Sequenzen ist (d.h. „häufig", was im hier gebrauchten Sinne eine Aminosäure bezeichnet, die in mindestens etwa 25% der Sequenzen in einer repräsentativen Datenbank vorkommt), dann kann die Donatoraminosäure anstelle der Akzeptoraminosäure gewählt werden. Dieses Kriterium hilft zu gewährleisten, daß eine atypische Aminosäure in dem Human-Raster nicht die Antikörperstruktur unterbricht. Darüber hinaus kann der humanisierte Antikörper durch das Ersetzen einer ungewöhnlichen Aminosäure durch eine Aminosäure von dem Donatorantikörper, der zufällig typisch für menschliche Antikörper ist, weniger immunisierend gemacht werden.

Kriterium III: In den unmittelbar den 3 CDRs in der humanisierten Immunoglobulinkette benachbarten Positionen kann eher die Donatoraminosäure als die Akzeptoraminosäure gewählt werden. Diese Aminosäuren werden höchstwahrscheinlich mit den Aminosäuren in den CDRs zusammenwirken, und, wenn sie von dem Akzeptor gewählt wurden, die Donator-CDRs verformen und die Affinität reduzieren. Darüber hinaus können die benachbarten Aminosäuren direkt mit dem Antigen zusammenwirken (Amit, u.a., Science, 233,747-753 [1986] hier unter Bezugnahme einbezogen), und die Wahl dieser Aminosäuren von dem Donator mag empfehlenswert sein, um alle die Antigenkontakte, die Affinität in dem ursprünglichen Antikörper schaffen, zu erhalten.

Kriterium IV: Ein für den ursprünglichen Donatorantikörper typisches dreidimensionales Modell zeigt, daß bestimmte Aminosäuren außerhalb der CDRs nahe den CDRs liegen und aller Wahrscheinlichkeit nach mit Aminosäuren in den CDRs durch Wasserstoffbindung, Van derWaalssche Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen usw. zusammenwirken. An solchen Aminosäurepositionen kann eher die Donatoraminosäure als die Akzeptor-Immunoglobulin-Aminosäure gewählt werden. Diesem Kriterium entsprechende Aminosäuren werden im allgemeinen ein Seitenkettenatom innerhalb etwa 3 Angstömeinheiten von irgendeiner Seite in den CDRs haben und müssen Atome enthalten, die aufgrund bekannter chemischer Kräfte, wie sie oben genannt wurden, mit den CDR-Atomen zusammenwirken könnten. Computerprogramme zur Bildung von Modellen von Proteinen, wie Antikörpern, stehen im allgemeinen zur Verfügung und sind den Fachleuten gut bekannt (siehe Loew,u.a.lnt.J. Quant. Chem.,Quant. Biol.Symp., 15: 55-66 [1988]; Bruccoleri, u.a. Nature,335,564-568 [1988]; Chothia, u.a., Science, 233: 755-758 [1986] alle hier unter Bezugnahme einbezogen). Diese bilden keinen Teil der Erfindung. Weil

alle Antikörper ähnliche Strukturen besitzen, können tatsächlich die bekannten Antikörperstrukturen, die von der Brookhaven Protein Data Bank zur Verfügung stehen, wenn erforderlich als grobe Modelle anderer Antikörper benutzt werden. Kommerziell verfügbare Computerprogramme können zur Darstellung dieser Modelle auf einem Computermonitor verwendet werden, um

beurteilen (siehe Ferrin, u.a., J. Mol. Graphics, 6: 13-27 [1988]).

Humanisierte Antikörper haben für die Anwendung in der Humantherapie im allgemeinen mindestens drei potentielle Vorteile gegenüber Mäuse- oder in einigen Fällen schimärischen Antikörpern:

1) Weil der Effektorabschnitt human ist, kann er besser mit den anderen Teilen des menschlichen Immunsystems zusammenwirken (z.B. die Targetzellen wirksamer durch komplement-abhängigeZytotoxizität [CDCl oder antikörperabhängige zellulare Zytotoxizität [ADCC] zerstören).

2) Das menschliche Immunsystem sollte die Raster- oder konstante Region des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen, und daher sollte die Antikörperreaktion gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer sein als gegenüber einem vollkommen fremden Mäuse-Antikörper oder einem teilweise fremden schimärischen Antikörper.

3) Nach Berichten haben injizierte Mäuse-Antikörper eine viel kürzere Halbwertzeit in der menschlichen Zirkulation als die Halbwertzeit normaler Antikörper beträgt (D.Shaw, u.a. J. Immunol., 138: 4534-4538 [1987]). Injizierte humanisierte Antikörper werden vermutlich eine Halbwertzeit haben, die der von natürlich vorkommenden Human-Antikörpern ähnlicher ist, so daß geringere und weniger häufige Dosismengen gegeben werden können.

Humanartige Antikörper haben bei der Anwendung in der Humantherapie mindestens drei potentielle Vorteile gegenüber Mäuse- und in einigen Fällen schimärischen Antikörpern."

1) Weil der Effektorabschnitt human ist, kann er besser mit den anderen Teilen des menschlichen Immunsystems zusammenwirken (z. B. die Targetzellen durch komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) oder antikörper-abhängige Zytotoxizität (ADCC) wirksamer zerstören.

2) Das menschliche Humansystem brauchte die Raster- oder C-Region des humanartigen Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher müßte die Antikörperreaktion gegenüber einem derartigen injizierten Antikörper geringer sein als gegenüber einem vollkommen fremden Mäuse-Antikörper oder einem teilweise fremden schimärischen Antikörper.

3) Nach Berichten sollen injizierte Mäuse-Antikörper in der menschlichen Zirkulation eine viel kürzere Halbwertzeit haben als die Halbwertzeit normaler Antikörper beträgt (Shaw, D., u.a., J. Immunol. 138: 4534-4538(1987]). Injizierte humanartige Antikörper werden vermutlich eine Halbwertzeit haben, die im wesentlichen mit der von natürlich vorkommenden Human-Antikörpern identisch ist, so daß geringere und weniger häufige Dosismengen gegeben werden können.

In einem Aspekt ist die Erfindung auf rekombinante DNA-Segmente gerichtet, die die Schwer- und/oder Leichtketten-CDRs von einem Immunoglobulin kodieren, das sich an ein verlangtes Epitop am Human-IL-2-Rezeptor, wie den monoklonalen Anti-Tac-Antikörper, binden kann. Die diese Regionen kodierenden DNA-Segmente werden praktisch an DNA-Segmente gebunden sein, die passene humanartige Rasterregionen kodieren. Die bevorzugten DNA-Sequenzen, die bei Expression für die Polypeptidketten kodieren, die die hypervariablen Anti-Tac-Schwer- und Leichtkettenregionen umfassen (mit humanartigen Rasterregionen), werden in Fig. 1 bzw. 2 gezeigt. Infolge Codon-Degenerierung und nicht-kritischer Aminosäure-Substitutionen können andere DNA-Sequenzen ohne weiteres für solche Sequenzen substituiert werden, wie unten ausführlich erläutert wird. Die DNA-Segmente werden praktisch weiterhin eine Expressions-Kontroll-DNA-Sequenz enthalten, die operativ mit den humanartige Antikörper kodierenden Sequenzen verbunden sind, die natürlich-assoziierte oder heterologe Promotorregionen einschließen. Vorzugsweise werden die Expressionskontrollsequenzen eukaryotische Promotorsysteme in Vektoren sein, die eukaryotische Wirtszellen transformieren oder beeinträchtigen können, es können aber auch Kontrollsequenzen für prokary otische Wirte verwandt werden. Sobald der Vektor in den entsprechenden Wirt eingebaut worden ist, wird der Wirt unter Bedingungen gehalten, die für die hochgradige Expression der Nucleotidsequenzen geeignet sind, und auf Wunsch können die Sammlung und Reinigung der Leichtketten-, Schwerketten-, Leicht-ZSchwerketten-Dimere oder intakten Antikörper, Bindungsfragmente oder anderen Immunoglobulinformen folgen.

Human-DNA-Sequenzen konstanter Region können nach allgemein bekannten Verfahrensweisen von einer Vielzahl von Humanzellen, vorzugsweise aber immortalisierten B-Zellen, isoliert werden (siehe Kabat, oben zitiert und WP87/02671). Die CDRs zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Immunoglobuline werden entsprechend von monoklonalen Antikörpern abgeleitet, die sich an den Human-IL-2-Rezeptor binden können und in jeder beliebigen Säugetierquelle erzeugt werden können, beispielsweise Mäusen, Ratten, Kaninchen oder anderen Wirbeltieren, die Antikörper durch allgemein bekannte Methoden erzeugen können. Geeignete Quellenzellen für die DNA-Sequenzen und Wirtszellen für die Immunoglobulinexpression und -Sekretion können von einer Reihe von Quellen bezogen werden, wie der American Type Culture Collection („Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", fünfte Auflage [1985] Rockville, Maryland, U.S.A., hier unter Bezugnahme einbezogen). Außer den speziell hier beschriebenen humanartigen Immunoglobulinen können andere „im wesentlichen homologe" modifizierte Immunoglobuline ohne weiteres unter Anwendung von verschiedenen, den Fachleuten allgemein bekannten Rekombinant-DNA-Techniken entwickelt und hergestellt werden. Zum Beispiel können die Rasterregionen von den in den Figuren 3 und 4 gezeigten Sequenzen im primären Strukturgrad um mehrere Aminosäuresubstitutionen, terminale und dazwischenliegende Additionen und Deletionen und dergleichen abweichen. Außerdem kann eine Vielzahl verschiedener Human-Rasterregionen einzeln oder in Kombination als Grundlage für die humanartigen erfindungsgemäßen Immunoglobuline verwendet werden. Im allgemeinen lassen sich Modifikationen der Gene durch die verschiedensten, allgemein bekannten Techniken, wie seitengerichtete Mutagenese, zustande bringen (siehe Gillman und Smith, Gene 8:81-97 [1979] und Roberts, S., u. a., Nature 328: 731-734 [1987], beide hier unter Bezugnahme einbezogen.) Alternativ können Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der primären Antikörperstruktur aufweisen, erzeugt werden, wobei diese Fragmente eine oder mehrere Immunoglobulinaktivitäten aufweisen (z.B. Komplement-Fixierungs-Aktivität). Weil die dem Immunoglobulin verwandten Gene, wie viele Gene getrennte funktioneile Regionen enthalten, von denen jede eine oder mehrere deutliche biologische Aktivitäten besitzt, können die Gene mit funktioneilen Regionen von anderen Genen verschmolzen werden (z.B. Enzymen, siehe gemeinsam zedierte U. S. S. N. 132.387, eingereicht 15. Dezember 1987, hierunter Bezugnahme einbezogen) um Fusionsproteine (z.B. Immunotoxine) mit neuartigen Eigenschaften zu erzeugen.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, die in der Lage sind, die erwünschten humanartigen Antikörper endgültig zu exprimieren, können von einer Vielzahl unterschiedlicher Polynucleotide (genomischen oder cDNA, RNA, synthetischen Oligonucleotiden usw.) und Komponenten (z. B. V-, J-, D- und C-Regionen) sowie mit Hilfe zahlreicher unterschiedlicher Techniken gebildet werden. Das Vereinigen entsprechender genomischer Sequenzen ist gegenwärtig die üblichste Produktionsmethode, aber es können auch cDNA-Sequenzen herangezogen werden (siehe Europäische Patentveröffentlichung Nr.0239400 und Reichmann, L., u.a.. Nature 332: 323-327 [1988], beide hier unter Bezugnahme einbezogen). Wie bereits gesagt wurde, werden die DNA-Sequenzen in Wirten exprimiert, nachdem die Sequenzen operativ an eine Expressions-Kontroll-Sequenz gebunden wurden (d.h. so positioniert wurden, daß sie die Funktion dieser sichert). Diese Expressionsvektoren sind in den Wirtsorganismen entweder als Episome oder als integraler Teil der Wirts-Chromosomen-DNA praktisch replizierbar. Gewöhnlich werden Expressionsvektoren Selektionsmarkierer, z. B. Tetracyclin oder Neomycin, enthalten, um den Nachweis derjenigen Zellen zu ermöglichen, die mit den verlangten DNA-Sequenzen transformiert wurden (siehe z. B. US-PS4.704.362, hier unter Bezugnahme einbezogen).

E. coli ist ein prokaryotischer Wirt, der besonders für die Klonierung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen nützlich ist. Andere für die Verwendung geeignete mikrobische Wirte umfassen Bazillen, wie Bacillus subtilis und andere Enterobakterienstämme wie Salmonella, Serratis und verschiedene Pseudomonas Spezies. In diesen prokaryotischen Wirten können auch Expressionsvektoren erzeugt werden, die praktisch Expressionskontrollsequenzen enthalten, die mit den Wirtszellen verträglich sind (z.B. einen Replikationsursprung). Außerdem wird eine beliebige Anzahl der verschiedensten allgemein bekannten Promotoren vorhanden sein, wie das Lactose-Promotorsystem, ein Tryptophan(trp)-Promotorsystem, ein Beta-Lactamase-Promotorsystem oder ein Promotorsystem von Phage Lambda. Die Promotoren werden praktisch die Expression kontrollieren, wahlweise mit einer Operatorsequenz, und Ribosombindungsstellen-Sequenzen und dergleichen haben, um die Transcription und Translation zu initiieren und abzuschließen.

Andere Mikroben wie Hefe können gleichfalls für die Expression verwandt werden. Saccharomyces ist ein bevorzugter Wirt, wobei geeignete Vektoren Expressionskontrollsequenzen, wie Promotoren, beispielspeise 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, und einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen und dergleichen, je nach Bedarf, haben. Außer Mikroorganismen können zur Expression und Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide auch Gewebezellkulturen von Säugetieren eingesetzt werden (siehe Winnacker, „From Genes to Clones" (Von Genen bis Klonen), VCH Publishers, N. Y., N.Y. [1987], hierunter Bezugnahme einbezogen). Eukaryotische Zellen werden tatsächlich bevorzugt, weil eine Anzahl geeigneter Wirtszellenreihen, die intakte Immunoglobuline ausscheiden, im Fachgebiet entwickelt worden sind und die CHO-Zellreihen, verschiedene COS-Zellreihen, HeLa-Zellen, Myelom-Zellreihen usw. umfassen, aber vorzugsweise transformierte B-Zellen oder Hybridomas. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen, wie einen Ursprung der Replikation, einen Promotor, einen Verstärker (Queen, C, u.a., Immunol.Rev.89: 49—68 [1986] hier unter Bezugnahme ei η bezogen) und notwendige Verarbeitungsinformationsstellen, wie Ribosombindungsstellen, RN A-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und transcriptionelle Terminatorsequenzen aufweisen. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind vom Immunoglobulingenen, SV40, Adenovirus, Rinder-Papilloma-Virus und dergleichen abgeleitete Promotoren. Die Vektoren, die die DNA-Segmente von Interesse (z.B. die schwere und leichte Kette kodierende Sequenzen und Expressionskontrollsequenzen) enthalten, können mit Hilfe allgemein bekannter Methoden, die je nach dem Typ des zellularen Wirts variieren, in Wirtszellen transferiert werden. Zum Beispiel wird Calciumchlorid-Transfektion normalerweise für prokaryotische Zellen angewandt, während Calciumphosphatbehandlung oder Elektroporation für andere zellulare Wirte eingesetzt werden kann. (Siehe allgemein Maniatis, u.a.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press [1982] hier unter Bezugnahme einbezogen).

Sobald sie exprimiert sind, können die gesamten Antikörper, ihre Dimere, individuelle leichte und schwere Ketten oder andere erfindungsgemäße Immunoglobulinformen mit Hilfe von Standardverfahren des Fachgebietes, die Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen umfassen, gereinigt werden (siehe allgemein Scopes, R., Protein Purification (Eiweißreinigung) Springer-Verlag, N. Y. [1982]). Im wesentlichen reine Immunoglobuline mit mindestens etwa 90 bis 95% Homogenität werden bevorzugt, und 98 bis 99% oder höhere Homogenität werden für pharmazeutische Zwecke am meisten bevorzugt. Sobald die Polypeptide teilweise oder bis zu der erwünschten Homogenität gereinigt sind, können sie therapeutisch (einschließlich extracorporal) oder für die Entwicklung und die Durchführung von Analyseverfahren, Immunofluoreszenzfärbungen und dergleichen verwendet werden (Siehe allgemein Immunological Methods, Bd. I und II, Lefkovits and Pernis, Herausg. Academic Press, New York, N. Y. [1979 und 1981 ]). Die erfindungsgemäßen Antikörper werden normalerweise individuell zur Behandlung eines auf T-Zellen zurückzuführenden Krankheitszustandes Anwendung finden. Im allgemeinen werden, wenn die mit einer Krankheit in Verbindung stehende Zelle als IL-2-Rezeptor tragend identifiziert wurde, die humanartigen Antikörper, die die Bindung von IL-2 an den Human-IL-2-Rezeptor blockieren können, geeignet sein (siehe U. S. S. N. 085.707 mit dem Titel „Treating Human Malignancies and Disorders (Behandlung von Bösartigkeit und Störungen bei Menschen), hier unter Bezugnahme einbezogen). Typische Krankheitszustände, die für die Behandlung geeignet sind, umfassen beispielsweise Transplantat- gegenüber Wirtskrankheit, und Transplantatabweisung bei Patienten mit einer Organtransplantation, wie Herz, Lungen, Nieren, Leber usw. Andere Krankheiten umfassen autoimmune Krankheiten, wie Diabetes Typ I, Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis, systemische Lupuserythematose und Myasthenie gravis.

Die erfindungsgemäßen humanartigen Antikörper können auch in Kombination mit anderen Antikörpern verwendet werden, vor allem monoklonalen Human-Antikörpern, die mit anderen Markierern auf Zellen, die für die Krankheit verantwortlich sind, reaktionsfähig sind. Beispielsweise können geeignete T-Zellen-Markierer diejenigen umfassen, die in den sogenannten „Clusters of Differentiation" (Bündel der Differenzierung) zusammengefaßt sind, wie sie vom First International Leukocyte Differentiation Workshop (Erstes Internationales Leukocyten-Differenzierungs-Seminar) bezeichnet wurden, Leukocyte Typing, Bernard, u. a., Herausg., Springer Verlag, N.Y. [19841, hier unter Bezugnahme einbezogen).

Die Antikörper können auch als getrennt verabreichte Zusammensetzungen angewandt werden, die in Verbindung mit chemotherapeutischen oder immunosuppressiven Mitteln verabreicht werden. Praktisch werden die Mittel Cyclosporin A oder ein Purinanaloga (z.B. Methotrexat, 6-Mercaptopurin oder dergleichen) umfassen, aber zahlreiche zusätzliche Mittel (z.B. Cyclophosamid, Prednison usw.), die dem Fachmann gut bekannt sind, können gleichfalls eingesetzt werden.

Eine bevorzugte erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung betrifft die Anwendung der betreffenden Antikörper in Immunotoxinen. Immunotoxine sind durch zwei Komponenten gekennzeichnet und sind besonders nützlich für die Abtötung ausgewählter Zellen in vitro oder in vivo. Eine Komponente ist ein zytotoxisches Mittel, das gewöhnlich tödlich für eine Zelle wirkt, wenn es damit verbunden oder absorbiert wird. Die zweite Komponente, bekannt als das „Abgabevehikel" bietet eine Möglichkeit zur Abgabe des toxischen Mittels an einen bestimmten Zelltyp, wie ein Karzinom enthaltende Zellen. Die beiden Komponenten sind gewöhnlich mit Hilfe einer Vielzahl allgemein bekannter chemischer Verfahren chemisch miteinander verbunden. Wenn das zytotoxische Mittel beispielsweise ein Protein ist und die zweite Komponente ein intaktes Immunoglobulin ist, kann die Verknüpfung mit Hilfe eines heterobifunktionellen Vernetzers erfolgt sein, z.B. SPDP, Carbodiimid, Glutaraldehyd oder dergleichen. Die Produktion verschiedener Immunotoxine ist im Fachgebiet allgemein bekannt und ist beispielsweise zu finden in „Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet" (Monoklonale Antikörper-Toxin-Konjugate: Ziel die Zauberkugel) Thorpe, u.a., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, S. 168-190 (1982), hierunter Bezugnahme einbezogen.

Die verschiedensten zytotoxischen Mittl sind für die Anwendung in Immunotoxinen geeignet. Zytotoxische Mittel können umfassen Radionucleotide, wie Jod-131, Yttrium-90, Rhenium-188 und Wismut-212; eine Anzahl chemotherapeutischer Medikamente, wie Vindesin, Methotrexat, Adriamycin und Cisplatinm; sowie zytotoxische Proteine, z. B. Ribosomeninhibierende Proteine wie „Pokeweed" Antivirus-Protein, Pseudomonas Exotoxin A, Ricin, Diphtherie-Toxin, Ricin-A-Kette usw., oder ein auf der Zelloberfläche aktives Mittel, wie die Phospholipase-Enzyme (z. B. Phospholipase C) (Siehe allgemein, gemeinsam zedierte U. S. S. N.07/290.968, eingereicht am 28. Dezember 1988), „Chimeric Toxins" (Schimärische Toxine), Olsness und Phil, Pharmac.Ther.,25: 355-381 (1982), und „Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy" (Monoklonale Antikörper zum Nachweis von Krebs und zur Therapie), Herausg. Baldwin und Byers, S. 1 59—179, 244—266, Academic Press (1985), alle hier unter Bezugnahme einbezogen.

Die Abgabekomponente des Immunotoxins wird die erfindungsgemäßen humanartigen Immunoglobuline enthalten. Intakte Immunoglobuline oder deren Bindungsfragmente, wie Fab, werden vorzugsweise benutzt. Normalerweise werden die Antikörper in den Immunotoxinen vom Human IgM- oder IgG-lsotyp sein, es können aber auf Wunsch andere konstante Säugetierregionen genutzt werden.

Die erfindungsgemäßen humanartigen Antikörper und deren pharmazeutische Zusammensetzungen sind besonders für die parenterale Verabreichung geeignet, d.h. subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden normalerweise aus einer Lösung des Antikörpers oder einem Gemisch davon, gelöst in einem geeigneten Trägermittel, vorzugsweise einem wäßrigen Trägermittel, bestehen. Es können die verschiedensten wäßrigen Trägermittel verwendet werden, г. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycerin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von Partikelstoffen. Diese Zusammensetzungen können mit Hilfe herkömmlicher, allgemein bekannter Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare zusätzliche Substanzen enthalten, wie sie zur Angleichung der physiologischen Bedingungen erforderlich sein können, wie pH-Wert-Einstellungs- und Pufferungsmittel, Toxizitätseinstellmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat usw. Die Konzentration des Antikörpers in dessen Formulierungen kann stark variieren, d.h. von weniger als etwa 0,5%, gewöhnlich von oder mindestens etwa 1 % bis auf sogar 15 oder 20Ma.-%, und wird hauptsächlich auf der Grundlage von Flüssigkeitsvolumen, Viskositäten usw. in Übereinstimmung mit der vorgesehenen betreffenden Verabreichungsart gewählt.

So könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intramuskuläre Injektion so zubereitet werden, daß sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg Antikörper enthält. Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion könnte so zubereitet werden, daß sie 250ml sterile Ringersche Lösung und 150mg Antikörper enthält. Tatsächliche Methoden für die Zubereitung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen werdenden Fachleuten bekannt sein und werden ausführlicher beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) beschrieben, hier unter Bezugnahme einbezogen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Lagerung lyophilisiert und vor Gebrauch in einem geeigneten Trägermittel rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich bei herkömmlichen Immunglobulinen als wirksam erwiesen, und es können fachspezifische Lyophilisierungs- und Rekonstituierungstechniken angewandt werden. Fachleuten dürfte klar sein, daß Lyophilisierung und Rekonstituierung zu unterschiedlichen Graden von Verlust an Antikörperaktivität führen können (z. B. bei herkömmlichen Immunglobulinen, IgM-Antikörper neigen zu einem größeren Aktivitätsverlust als IgG-Antikörper), und daß derartige Anwendungsschwankungen durch Ausgleich eingestellt werden müssen.

Die die erfindungsgemäßen humanartigen Antikörper oder ein Gemisch daraus enthaltenden Zusammensetzungen können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden die Zusammensetzungen einem bereits an einer Krankheit leidenden Patienten in einer Menge verabreicht, die für eine Heilung oder zumindest einen teilweisen Stillstand der Krankheit und deren Komplikationen ausreicht. Eine für die Erreichung dieses Zieles adäquate Menge wird als eine „therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Für diese Anwendungsfälle wirksame Mengen werden von der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des Patienten sowie seinem eigenen Immunsystem abhängen, werden aber im allgemeinen bei etwa 1 bis etwa 200mg Antikörper je Dosis liegen, wobei Dosismengen von 5 bis 25mg pro Patient häufiger angewandt werden. Es sei daran erinnert, daß die erfindungsgemäßen Stoffe im allgemeinen in schweren Krankheitsfällen angewandt werden, das heißt in lebensbedrohenden oder potentiell lebensbedrohenden Situationen. In derartigen Fällen wird es durch die Minimisierung von fremden Substanzen und die geringere Wahrscheinlichkeit von Abweisungen von „Fremdsubstanz", die durch die vorliegenden erfindungsgemäßen humanartigen Antikörper erreicht werden, möglich werden und von dem behandelnden Arzt als wünschenswert angesehen werden, daß erhebliche Übermengen dieser Antikörper verabreicht werden können.

Für prophylaktische Anwendungsfälle werden die die erfindungsgemäßen Antikörper oder eine Mischung davon enthaltenden Zusammensetzungen einem Patienten verabreicht, der nicht bereits erkrankt ist, um die Widerstandsfähigkeit des Patienten zu unterstützen. Eine solche Menge wird als eine „prophylaktisch wirksame Menge" bezeichnet. In diesem Fall hängen die genauen Mengen wieder vom Gesundheitszustand des Patienten und dem allgemeinen Immunitätsgrad ab, liegen aber im allgemeinen zwischen 0,1 und 25 mg je Dosis, speziell zwischen 0,5 und 2,5 mg je Patient. Eine bevorzugte Anwendung dient dazu, die Abstoßung eines Nierentransplantats zu verhindern.

Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosismengen und Systemen vorgenommen werden, deren Wahl der behandelnde Arzt trifft. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine solche Menge des (der) erfindungsgemäßen Antikörper (s) zur Verfügung stellen, die für die wirksame Behandlung des Patienten ausreichend ist.

Erfindungsgemäß humanartige Antikörper können darüber hinaus in den verschiedensten Fällen in vitro eingesetzt werden. Zum Beispiel können die Antikörper für die T-Zellen-Typisierung, zur Isolierung spezifischer IL-2-Rezeptoren oder Fragmente des Rezeptors tragender Zellen, zur Impfstoffherstellung oder dergleichen herangezogen werden.

Für diagnostische Zwecke können die Antikörper entweder markiert oder unmarkiert sein. Unmarkierte Antikörper können in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (zweiten Antikörpern) eingesetzt werden, die mit dem humanartigen Antikörper reagieren, wie Antikörper, die für konstante Human-Immunoglobulin-Regionen spezifisch sind. Alternativ können die Antikörper direkt markiert werden. Es können die verschiedensten Markierungen angewandt werden, so Radionuclide, Fluore, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymkofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (vor allem Haptene), usw. Zahlreiche Arten von Immunoanalysen stehen zur Verfügung und sind den Fachleuten allgemein bekannt. Ausrüstungspackungen für die Anwendung mit den betreffenden Antikörpern zum Schutz gegen eine Zellaktivität oder deren Nachweis oder für das Vorhandensein eines ausgewählten Antigens können gleichfalls geliefert werden. So kann die betreffende erfindungsgemäße Antikörperzusammensetzung in einer lyophilisierten Form in einem Behälterl, entweder alleine oder in Verbindung mit zusätzlichen, für den erwünschten Zelltyp spezifischen Antikörpern zur Verfügung gestellt werden. Die Antikörper, die mit einer Markierung oder einem Toxin konjugiert sein können, oder unkonjugiert sind, sind in den Ausrüstungspackungen mit Puffern, wie Tris, Phosphat, Carbonat usw., Stabilisierungsmitteln, Bioziden, inerten Proteinen, z. B. Serumalbumin, oder dergleichen, und mit einem gebrauchsfertigen Satz von Instrumenten vorhanden. Im allgemeinen werden diese Materialien in weniger als etwa 5 Ma.-% in bezug auf die Menge in aktivem Antikörper vorhanden sein, und normalerweise werden sie in einer Gesamtmenge von mindestens etwa 0,001 Ma.-% wieder in bezug auf die Antikörperkonzentration enthalten sein. Häufig kann es ratsam sein, ein inertes Streckmittel oder einen Arzneimittelträger zur Verdünnung der Wirkstoffe einzubeziehen, wobei der Arzneimittelträger in etwa 1 bis 99Ma.-% der gesamten Zusammensetzung vorhanden sein kann. Wenn ein zweiter Antikörper, der sich an den schimärischen Antikörper binden kann, für eine Analyse herangezogen wird, so wird dieser gewöhnlich in einem gesonderten Fläschchen enthalten sein. Der zweite Antikörper ist normalerweise mit einer Markierung konjugiert und in einer Weise formuliert, die mit den oben beschriebenen Antikörperformulierungen analog ist. Die folgenden Beispiele sollen zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung dienen.

Ausführungsbeispiele

Entwicklung von Genen für humanartige leichte und schwere Ketten

Die Sequenz des Human-Antikörpers Eu (Sequences of Proteins of Immunological Interest), (Sequenzen von Proteinen von Immunologischem Interesse), (Kabat, E., u. a., U. S. Dept. of Health and Human Services, 1983) wurde zur Bildung des Rasters rif humanisierten Antikörpers verwandt, weil die Aminosäuresequenz der schweren Kette von Anti-Tac mit der schweren Kette dieses Antikörpers homologer war als irgendeine andere Schwerkettensequenz in der National Biomedical Foundation Protein Identification Resource.

Zur Wahl der Sequenz der humanisierten schweren Kette wurde die schwere Anti-Tac-Kettensequenz (siehe gemeinsam zedierte U. S. S. N. 186.862 und 223.037, hier unter Bezugnahme einbezogen) mit der Sequenz der schweren Eu-Kette ausgerichtet (Fig. 1). An jeder Position wurde die Eu-Aminosäure für die humanisierte Sequenz gewählt, wenn die Position nicht in eine der folgenden Kategorien fiel, so daß in diesem Fall die Anti-Tac-Aminosäure gewählt wurde.

(1) Die Position lag innerhalb einer die Komplementärität bestimmenden Region (CDR), wie von Kabat, u.a., oben zitiert, definiert wurde (Aminosäuren 31-35,50-66,99-106);

(2) Die Eu-Aminosäure war bei schweren Human-Ketten an dieser Position selten, wogegen die Anti-Tac-Aminosäure typisch für schwere Human-Ketten an dieser Position war (Aminosäuren 27,93,95,98,107-109,111);

(3) Die Position befand sich unmittelbar neben einer CDR in der Aminosäuresequenz der schweren Anti-Tac-Kette (Aminosäuren 30 und 67);

(4) Das dreidimensionale Modell des Anti-Tac-Antikörpers führte zu der Vermutung, daß sich die Aminosäure physikalisch nahe der Antigen-Bindungsregion befindet (Aminosäuren 48 und 68).

Einige Aminosäuren fielen in mehr als eine dieser Kategorien, werden aber nur in einer aufgeführt.

Zur Wahl der Sequenz der humanisierten leichten Kette wurde die leichte Anti-Tac-Kettensequenz mit der Sequenz der leichten Eu-Kette ausgerichtet (Fig. 2). Die Eu-Aminosäure wurde an jeder Position gewählt, wenn die Position nicht wieder in eine der Kategorien (1) bis (4) fiel (wobei leichte Kette schwere Kette in den Kategoriedefinitionen ersetzt):

(1) CDRs (Aminosäuren 24-34,50-56,89-97).

(2) Anti-Tac-Aminosäure typischer als Eu (Aminosäuren 48 und 63).

(3) Neben den CDRs (keine Aminosäuren, Eu- und Anti-Tac waren an allen diesen Positionen bereits die gleichen).

(4) Mögliche dreidimensionale Nähe zur Bindungsregion (Aminosäure 60).

Die tatsächliche Nucleotidsequenz der Gene schwerer (Figur 3) und leichter Kette (Figur 4) wurde wie folgt gewählt:

(1) die Nucleotidsequenzen kodieren für die nach obiger Beschreibung gewählten Aminosäuresequenzen.

(2) 5' von diesen Kodierungssequenzen, die Nucleotidsequenzen kodieren für eine Führer- (Signal-) Sequenz, und zwar den Führer der leichten Kette des Antikörpers MOPC63 und den Führer der schweren Kette des Antikörpers PCH108A (Kabat, u.a., oben zitiert). Diese Führersequenzen wurden als typisch für Antikörper gewählt.

(3) 3'von den Kodierungssequenzen, die Nucleotidsequenzen sind die Sequenzen, die dem Mäuse-Leichtkettensegment J 5 und dem Mäuse-Schwerkettensegment J 2 folgen, die Teil der Anti-Tac-Sequenz sind. Diese Sequenzen werden einbezogen, weil sie Spleißdonatorsignale enthalten.

(4) An jedem Ende der Sequenz ist eine Xba-I-Stelle, um den Abbruch an den Xba-I-Stellen und die Klonierung in die Xba-I-Stelle eines Vektors zu erlauben.

Konstruktion von humanisierten Leicht- und Schwerketten-Genen

Zur Synthetisierung der schweren Kette würden vier Oligonucleotide HES12, HES13, HES14, HES15 (Figur 5A) unter Anwendung von Applied Biosystems 380 B DNA Synthesizer synthetisiert. Zwei der Oligonucleotide sind ein Teil jedes Stranges der schweren Kette, und jedes Oligonucleotid überlappt das nächste um etwa 20 Nucleotide, um Hybridisierung zu ermöglichen (Figur 5B). Zusammen bedecken die Oligonucleotide die gesamte humanisierte schwere Kette (Figur 3), wobei einige extra Nucleotide an jedem Ende den Abbruch an den Xba-I-Stellen erlauben. Die Oligonucleotide wurden aus Polyacrylamidgelen reindargestellt.

Jedes Oligonucleotid wurde mit Hilfe von Standardverfahren (siehe Miniatis, oben zitiert) unter Verwendung von ATP- und T4-Polynucleotidkinasephosphoryliert. Zur Hybridisierung der phosphorylierten Oligonucleotide wurden sie zusammen in 40 μΙ TA (33mMTris-acetat, pH7,9 66mM Kaliumacetat, 1OmM Magnesiumacetat) bei einer Konzentration von jeweils etwa 3,75 μΜ suspendiert, 4 Minuten lang auf 95°C erhitzt und langsam auf 4°C gekühlt. Zur Synthetisierung des vollständigen Gens von den Oligonucleotiden durch Synthetisieren des gegenüberliegenden Stranges jedes Oligonucleotids (Figur 5 8) wurden die folgenden Bestandteile in einem endgültigen Volumen von 100μΙ zugesetzt:

10 μΙ	hybridisierte Oligonucleotide
0,16mM jeweils	Desoxyribonucleotid
0,5 mM	ATP
0,5 mM	DTT
ΙΟΟμρ,/ΐηΙ	BSA
3,5μg/ml	T4g43 Protein (DNA Polymerase)
25μg/ml	T4g44/62 Protein (Polymerase-Begleit-Protein)
25μg/ml	45 Protein (Polymerase-Begleit-Protein)

Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden 10μ von T4-DNA-Ligase zugesetzt und die Inkubation 30 Minuten lang bei 37°C fortgesetzt. Die Polymerase und Ligase wurden durch 15 Minuten Inkubieren des Reaktionsgemisches bei70°C inaktiviert. Zur Digerierung des Gens mit Xba-I wurden dem Reaktionsgemisch 50μΙ 2x TA, das BSA zu 200μ9/ηιΙ und DTT zu 1 mM enthielt, 43 μΙ Wasser und 50 μ Xba-I in 5μΙ zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h lang bei 37⁰C inkubiert und auf einem Gel laufengelassen. Das 431 bp Xba-I-Fragment wurde aus einem Gel reindargestellt und in die Xba-I-Stelle des Plasmids pUC 19 mit Hilfe von Standardverfahren kloniert. Vier Plasmidisolate wurden reindargestellt und unter Anwendung der Didesoxy-Methode sequenziert. Eines davon hatte die richtige Sequenz (Figur 3).

Zur Synthetisierung der leichten Kette wurden vier Oligonucleotide JFD1, JFD2, JFD3, JFD4 (Figur 6A) synthetisiert. Zwei der Oligonucleotide sind Teil jedes Stranges der leichten Kette, und jedes Oligonucleotid überlappt das nächste um etwa 20 Nucleotide, um die Hybridisierung zu ermöglichen (Figur 6B). Zusammen bedecken die Oligonucleotide die gesamte humanisierte leichte Kette (Figur 4), wobei einige extra Nucleotide an jedem Ende vorhanden sind, um den Abbruch an den Xba-I-Stellen zu ermöglichen. Die Oligonucleotide wurden aus Polyacrylamidgelen reindargestellt.

Das Leichtkettengen wurde von diesen Oligonucleotiden in zwei Teilen synthetisiert. 0,5μg von jeweils JFD1 und JFD2 wurden in 20μΙ Sequenasepuffer (4OmM Tris-HCI, pH7,5,2OmM Magnesiumchlorid, 5OmM Natriumchlorid) kombiniert, 3 Minuten lang auf70°C erhitzt und langsam auf 23°C abkühlen gelassen, um die Hybridisierung der Oligonucleotide zu ermöglichen. JFD3 und JFD4 wurden in der gleichen Weise behandelt. Jedes Reaktionsgemisch wurde auf 1OmM in DTTundO,5mM in jedem Desoxyribonucleotid gebracht, und 6,5μ Sequenase (US Biochemical) wurden in einem endgültigen Volumen von 24μΙ zugegeben, und die Inkubation erfolgte 1 h lang bei 37 ⁰C zur Synthetisierung der gegenüberliegenden Stränge der Oligonucleotide. Xba-I und Hind-Ill wurden zu jeder Reaktion gegeben, um die DNA zu digerieren (es ist eine Hind-Ill-Stelle in der Region vorhanden, in der sich JFD2 und JFD3 überlappen, und daher in jeder der synthetisierten DNAs; Figur 6B). Die Reaktionsgemische wurden auf Polyacrylamidgelen laufengelassen, und die Xba-I- Hind-Ill-Fragmente wurden reindargestellt und mit Hilfe von Standardverfahren in pUC 18 kloniert. Verschiedene Plasmidisolate wurden für jedes Fragment durch die Didesoxymethode sequenziert, und die richtigen wurden gewählt.

Konstruktion von Plasmiden zur Expression humanisierter leichter und schwerer Ketten

Das Xba-I-Fragment der schweren Kette wurde von dem pUC 19-Plasmid isoliert, in das es eingefügt worden war, und dann in die Xba-I-Stelle des Vektors pV_k1 (siehe gemeinsam zedierte U.S.S. N.223.037) durch Standardmethoden in der richtigen Orientierung eingefügt, um das Plasmid pHuGTAC 1 (Figur 7) zu erzeugen. Dieses Plasmid wird große Mengen einer kompletten schweren Kette exprimieren, wenn es in eine passende Wirtszelle übertragen wird.

Die beiden Fragmente Xba-I- Hind-Ill der leichten Kette wurden von den pUCie-Plasmiden, in die sie eingefügt worden waren, isoliert. Das Vektor-Plasmid pV_k 1 (siehe gemeinsam zedierte U. S. S. N.223.037) wurde mit Xba-I abgebrochen, dephosphoryliert und nach Standardverfahren mit den beiden Fragmenten ligiert. Das verlangte Reaktionsprodukt hat die runde Form: Vektor-Xba-I-Fragment I-Hind-Ill-Fragment 2-Xba-l-Vektor. Es wurden verschiedene Plasmidisolate durch Restriktionskartierung und Sequenzierung analysiert, und eines mit dieser Form wurde gewählt. Dieses Plasmid pHuLTAC (Figur 8) enthält daher die komplette humanisierte leichte Kette (Figur 4) und wird große Mengen der leichten Kette exprimieren, wenn es in eine passende Wirtszelle übertragen wird.

Synthese und Affinität von humanisiertem Antikörper

Die Plasmide pHuGTAC 1 und HuLTAC wurden in Sp2/0-Zeilen von Mäusen übertragen, und die Zellen, die die Plasmide integrierten, wurden auf der Grundlage des Widerstandes gegen Mykophenolsäure und/oder Hygromycin B, übertragen durch die gpt- und hyg-Gene auf die Plasmide (Figur 7, 8) mit Hilfe von Standardverfahren ausgewählt. Um zu bestätigen, daß diese Zellen einen Antikörper, der sich an den IL-2-Rezeptor bindet, ausscheiden, wurde überstehende Flüssigkeit von den Zellen mit HUT-102-Zellen inkubiert, von denen bekannt war, daß sie den IL-2-Rezeptor exprimieren. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit fluorescein-konjugiertem Antihuman-Antikörper der Ziege inkubiert, gewaschen und auf einem FACSCAN-Zytofluorometer auf Fluoreszenz hin analysiert. Die Ergebnisse (Figur 9 A) zeigen deutlich, daß sich der humanisierte Antikörper an diese Zellen bindet, aber nicht an Jurkat-T-Zellen, die den IL-2-Rezeptor nicht exprimieren (Figur 9D). Als Kontrolle wurde auch der ursprüngliche Anti-Tac-Antikörper von Mäusen zum Färben dieser Zellen verwendet (Figur 9 B, C), was ähnliche Ergebnisse brachte.

Für weitere Experimente wurden den humanisierten Antikörper erzeugende Zellen in Mäuse injiziert, und die resultierenden Ascites wurden gesammelt. Humanisierter Antikörper wurde von den Ascites bis zu im wesentlichen Homogenität durch Hindurch leiten durch eine Affinitätssäule von Anti hu man-lmm u nog lobu I in-Anti körper der Ziege, hergestellt auf einem Äff igel-10 Support (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA) nach Standardtechniken reindargestellt. Zur Bestimmung der Affinität des humanisierten Antikörpers im Verhältnis zu dem ursprünglichen Anti-Tac-Antikörper wurde ein Konkurrenzbindeexperiment durchgeführt. Etwa 5x 10⁵ HUT-102-Zellen wurden mit bekannten Mengen (10 bis 40ng) des Anti-Tac-Antikörpers und des humanisierten Anti-Tac-Antikörpers 10 Minuten lang bei4°C inkubiert. Danach wurden 100 nm biotinyliertes Anti-Taczu den Zellen gegeben und 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Diese Menge des Anti-Tac war vorher als ausreichend ermittelt worden, um die Bindungsstellen auf den Zellen zu sättigen, aber es war nicht als großer Überschuß vorhanden. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 2 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die 0,1 % Natriumazid enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden danach 30 Minuten lang bei 4°Cmit 250ng Phycoerythrin-konjugiertem Avidin, das sich an das bereits an die Zellen gebundene Anti-Tac gebunden hatte, inkubiert. Die Zellen wurden wieder wie oben gewaschen, in 1 % Paraformaldehyd enthaltendem PBS fixiert und auf einem FACSCAN-Zytofluorometer auf Fluoreszenz hin analysiert.

Durch die Verwendung von steigenden Mengen (10—40ng) des Anti-Tac-Antikörpers als Konkurrent in dem ersten Schritt verringerte sich die Menge des biotinylierten Anti-Tac, die sich im zweiten Schritt an die Zellen binden konnte, und damit die Menge von Phycoerythrin konjugiertem Avidin, das sich im letzten Schritt gebunden hatte, wodurch die Fluoreszenz abnahm (Figur 10A). Äquivalente Mengen (20ng) von Anti-Tac und humanisiertem Anti-Tac, das als Konkurrent verwendet wurde, senkten die Fluoreszenz annähernd um den gleichen Grad (Figur 10B). Das zeigt, daß diese Antikörper annähernd die gleiche Affinität besitzen, weil, wenn einer eine höhere Affinität besitzen würde, dann würde er wirksamer mit dem biotinylierten Anti-Tac konkurriert haben und somit die Fluoreszenz stärker vermindert haben.

Biologische Eigenschaften des humanisierten Antikörpers

Für eine optimale Anwendung zur Behandlung einer Krankheit bei Menschen müßte der humanisierte Antikörper in der Lage sein, T-Zellen in dem Körper zu zerstören, die den IL-2-Rezeptor exprimieren. Ein Mechanismus, durch den Antikörper Targetzellen zerstören können, ist antikörper-abhängigezell-vermittelte Zytotoxizität, abgekürzt ADCC (Fundamental Immunology, Paul, W., Herausg., Raven Press, New York [1984], S. 681), worin der Antikörper eine Brücke zwischen der Targetzelle und einer Effektorzelle, wie einer Makrophage, die das Target lysieren kann, bildet. Zur Bestimmung, ob der humanisierte Antikörper und der ursprüngliche Anti-Tac-Antikörper von Mäusen ADCC vermitteln können, wurde eine Chromfreisetzungsanalyse nach Standardmethoden vorgenommen. Es wurden speziell Leukämie HUT-102-Zellen des Menschen, die den IL-2-Rezeptor exprimieren, mit ⁵¹Cr inkubiert, damit sie dieses Radionuclid absorbieren konnten. Die HUT-102-Zellen wurden anschließend mit einem Überschuß von entweder Anti-Tac oder humanisiertem Anti-Tac-Antikörper inkubiert. Die HUT-102-Zellen wurden anschließend 4 Stunden lang mit entweder einem 30:1- oder 100:1-Verhältnis von Effektorzellen inkubiert, bei denen es sich um normale gereinigte peripherische mononucleare Blutzellen des Menschen handelte, die durch etwa 20stündige Inkubation mit rekombinantem Human-IL-2 aktiviert worden waren. Die Freisetzung von ⁶¹Cr, die die Lysis der HUT-102-Target-Zellen anzeigte, wurde gemessen und der Hintergrund subtrahiert (Tabelle 1). Die Ergebnisse zeigen, daß bei jedem Verhältnis von Effektorzellen Anti-Tac keine signifikante Anzahl von Target-Zellen (weniger als 5%) lysierte, während es bei dem humanisierten Antikörper der Fall war (mehr als 20%). Daher scheint der humanisierte Antikörper für die Behandlung von T-Zellen-Leukämie oder andere auf T-Zellen zurückzuführende Krankheiten wirksamer zu sein als der ursprüngliche Mäuse-Antikörper.

Tabelle 1

Prozentuale ⁵¹Cr-Freisetzung nach ADCC

Verhältnis EffektonTarget

30:1 100:1 Antikörper

Anti-Tac 4% <1%

Humanisierter Anti-Tac 24% 23%

Aus dem Vorstehenden wird verständlich, daß die erfindungsgemäßen humanartigen Immunoglobuline zahlreiche Vorteile von anderen Human-IL-2-Rezeptor-spezifischen Antikörpern bieten. Beim Vergleich mit monoklonalen Anti-Tac-Antikörpern von Mäusen kann das erfindungsgemäße humanartige Immunoglobulin wirtschaftlicher erzeugt werden und braucht erheblich weniger fremde Aminosäuresequenzen zu enthalten. Diese reduzierte Wahrscheinlichkeit, daß Antigenizität nach der Injektion in einen Menschen zu verzeichnen ist, stellt eine signifikante therapeutische Verbesserung dar.

Obwohl die Erfindung ausführlich erläutert und mit Hilfe von Beispielen zum Zwecke von Klarheit und Verständnis beschrieben wurde, dürfte offensichtlich sein, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen, die im Geltungsbereich der angefügten Ansprüche liegen, vorgenommen werden können.

Claims

1. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein im wesentlichen reines humanartiges Immunoglobulin handelt, das speziell mit p55-Tac-Protein reagieren kann.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin zwei Paare von Leicht-ZSchwerketten-Dimeren aufweist, wobei jede Kette eine variable Region und eine konstante Region besitzt.

3. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein im wesentlichen reines humanartiges Immunoglobulin handelt, das in der Lage ist, die Bindung von Human-lnterleukin-2 (IL-2) an Huma-IL-2-Rezeptorzu inhibieren.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin eine Bindungsaffinität zu einem Human-IL-2-Rezeptorvon etwa 10⁸IVI"¹ oder mehr aufweist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin Komplementärität bestimmende Regionen von einem Immunoglobulin und Rasterregionen von mindestens einem anderen Immunoglobulin umfaßt.

6. Rekombinante Immunoglobulinzusammensetzung, bestehend aus einem humanartigen Raster und einer oder mehreren fremden Komplementärität bestimmenden Regionen, die von Natur aus nicht mit dem Raster assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin in der Lage ist, sich an einen Human-lnterleukin-2-Rezeptorzu binden.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Immunoglobulin um einen IgGrlmmunoglobulin-lsotyp handelt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die vollentwickelten leichten und schweren Proteinsequenzen variabler Region im wesentlichen mit den Sequenzen in den Figuren 3 und 4 homolog sind.

9. Humanartiges Immunoglobulin, das zwei Paare von Leichtketten/Schwerketten-Dimeren hat und in der Lage ist, spezifisch mit einem Epitop auf einem Human-lnterleukin-2-Rezeptor mit einer Affinität von mindestens etwa 10⁸IVI"¹ zu reagieren, wobei die leichten und schweren Ketten Komplementärität bestimmende Regionen (CDRs) und humanartige Rasterregionen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß die CDRs aus anderen Immunoglobulin-Molekülen als die Rasterregionen sind.

10. Immunoglobulin nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die Bindung von lnterleukin-2 (!L-2) an Human IL-2-Rezeptoren blockieren kann.

11. Humanisiertes Immunoglobulin, das sich an Human-lnterleukin-2-Rezeptoren binden kann, wobei das Immunoglobulin eine oder mehrere Komplementärität bestimmende Regionen (CDRs) von Anti-Tac-Antikörper in einem humanartigen Raster aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die humanartige Rasterregion mindestens eine von dem Anti-Tac-Antikörper gewählte Aminosäure aufweist.

12. Humanisiertes Immunoglobulin nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es eine vollentwickelte variable Schwerkettensequenz, wie in Figur 3 gezeigt, und eine vollentwickelte Leichtkettensequenz, wie in Figur 4 gezeigt, aufweist.

13. Humanisiertes Immunoglobulin nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sich eine zusätzliche Aminosäure von dem Anti-Tac-Antikörper unmittelbar neben einer CDR befindet.

14. Zusammensetzung zur Behandlung von durch T-Zellen hervorgerufenen Störungen bei einem Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine therapeutisch wirksame Dosis eines Immunoglobulins nach Anspruch 1 enthält.

15. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von durch T-Zellen hervorgerufenen Störungen bei einem Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß eine therapeutisch wirksame Dosis eines Immunoglobulins nach Anspruch 1 verwendet wird.

16. Immunoglobulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Myeloma- oder Hybridomazelle erzeugt wurde.

17. Polynucleotidmolekül, das eine erste für humanartige Immunoglobulin-Rasterregionen kodierende Sequenz und eine zweite Sequenz aufweist, die für eine oder mehrere Komplementärität bestimmende Immunoglobulin-Regionen von Mäusen kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynucleotid nach Expression ein Immunoglobulin kodiert, das speziell mit p55-Tac-Protein reaktionsfähig ist und die Bindung von lnterleukin-2 (IL-2) an den IL-2-Rezeptor auf Human-T-Zellen blockieren kann.

18. Mit einem Polynucleotid nach Anspruch 16 übertragene Zellreihe.

19. Verfahren zur Entwicklung einer humanisierten Immunoglobulin(lg)-Kette mit einer oder mehreren Komplementärität bestimmenden Regionen (CDRs) von einem Donator-Ig und einer Rasterregion von einem Human-Ig, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren das Vergleichen der Raster- oder Aminosäuresequenz variabler Region des Donator-Ig mit entsprechenden Sequenzen in einer Kollektion von Human-Ig-Ketten und das Auswählen, um dasHuman-lg-Raster als eines von den etwa drei homologsten Sequenzen von der Kollektion zur Verfügung zu stellen, umfaßt.

20. Verfahren zur Entwicklung einer humanisierten Immunoglobulinkette, die eine Rasterregin von einem Human-Akzeptor-Immunoglobulin und Komplementärität bestimmende Regionen (CDRs) von einem Donator-Immunoglobulin, das sich an ein Antigen binden kann, aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Schritte der Substituierung von mindestens einer Human-Rasteraminosäure des Akzeptor-Immunoglobulins mit einer entsprechenden Aminosäure von dem Donator-Immunoglobulin an einer Stelle in dem Immunoglobulin umfaßt, an der

(a) die Aminosäure in der Human-Rasterregion des Akzeptor-Immunoglobulins an dieser Position selten ist und die entsprechende Aminosäure in dem Donator-Immunoglobulin an dieser Position in Human-Immunoglobulin-Sequenzen häufig ist; oder

(b) die Aminosäure sich unmittelbar neben einer der CDRs befindet; oder

(c) von der Aminosäure vorausgesagt wird, daß sie ein Seitenkettenatom innerhalb von etwa 3Ä der CDRs in einem dreidimensionalen Immunoglobulin modell hat und in der Lage ist, mit dem Antigen oder mit den CDRs des humanisierten Immunoglobulins zusammenzuwirken.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die humanisierte Immunoglobulinkette außer den CDRs mindestens drei Aminosäuren von dem Donator-Immunoglobulin, gewählt durch die Kriterien (a), (b) oder (c), enthält.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sich mindestens eine der von dem Donator substituierten Aminosäuren unmittelbar neben einer CDR befinden.