ES2790837T3 - Derivados insaturados de polisacáridos, método de preparación y uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Derivados insaturados de polisacáridos que comprenden, en su estructura, al menos un heterociclo que tiene un doble enlace en las posiciones 4 y 5 según la fórmula estructural X, donde R representa -NH-CO-CH3 o -OH.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados insaturados de polisacáridos, método de preparación y uso de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere a derivados de polisacáridos que comprenden, en su estructura, un heterociclo que tiene un doble enlace en las posiciones 4 y 5 según la fórmula estructural X,
Figure imgf000002_0001
donde R representa -NH-CO-CH3 o -OH.
Además, la invención se refiere a la preparación de los derivados de la fórmula X a partir de un polisacárido de partida que comprende el fragmento estructural Y, donde la modificación en sí misma puede simplificarse en el siguiente esquema:
Figure imgf000002_0002
donde R representa -NH-CO-CH3 o -OH, y R1 representa -SO2-ONa, -SO2-OH o -H, mientras que la configuración absoluta en el carbono 4 puede ser R o S.
Además, la invención se refiere al uso de estos derivados insaturados que, en contraste con los polisacáridos nativos, muestran propiedades antioxidantes mejoradas, y algunos de ellos inhiben selectivamente la proliferación de células cancerosas.
Antecedentes de la invención
Polisacáridos de fórmula general. Y
Los polisacáridos tienen una amplia gama de funciones en los organismos, como la construcción, el almacenamiento o la función reguladora. Los polisacáridos de la fórmula general Y También pertenecen a los polímeros que ocurren naturalmente en los organismos.
Figure imgf000002_0003
donde R representa CH3-CO-NH- u -OH, y R1 representa -SO2-ONa, -SO2-OH o -H. Esto comprende, por ejemplo, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, carragenano, sulfato de queratán o ácido hialurónico.
Sulfato de condroitina es un glicosaminoglicano lineal, sulfatado y cargado negativamente compuesto de unidades monoméricas repetitivas de W-acetil-D-galactosamina y ácido D-glucurónico, unidos entre sí por enlaces O-glucosídicos p (1 ^ 3) y P(1 ^■4) (véase más abajo la fórmula estructural del sulfato de condroitina),
Figure imgf000003_0001
donde
R1 es -H o -Na,
R2 es -H, -SO2-ONa o -SO2-OH.
Sulfato de condroitina se deriva de los tejidos conectivos animales donde se une a las proteínas y, por lo tanto, forma parte de los proteoglicanos. La sulfatación de la condroitina se realiza por medio de sulfotransferasas en varias posiciones y por varios tipos. El patrón único de sulfatación en posiciones particulares en la cadena polimérica codifica la actividad biológica específica del sulfato de condroitina. El sulfato de condroitina es un importante bloque estructural del cartílago en las articulaciones, proporcionándoles resistencia a la compresión y renovando el equilibrio de la composición del fluido lubricante de las articulaciones (Baeurle S. A. a kol. Polímero 50, 1805, 2009).
Sulfato de dermatán es un glicosaminoglicano lineal, sulfatado y cargado negativamente compuesto de unidades monoméricas repetitivas de W-acetil-D-galactosamina y ácido L-idurónico, unidos entre sí por enlaces O-glucosídicos P(1 —— 3) y P(1 —4) (véase más abajo la fórmula estructural del dermatán sulfato),
Figure imgf000003_0002
donde
R1 es -H o -Na,
R2 es -H, -SO2-OH o -SO2-ONa.
El sulfato de dermatán difiere del sulfato de condroitina por la presencia de ácido L-idurónico, que es el epímero C-5 del ácido D-glucurónico. La configuración inversa del ácido idurónico confiere una mayor flexibilidad a las cadenas de sulfato de dermatán y garantiza su interacción específica de glicosaminoglicanos y proteínas en el área circundante. Estas interacciones contribuyen a la regulación de varios procesos celulares, como la migración, la proliferación, la diferenciación o la angiogénesis. La conversión de sulfato de condroitina en sulfato de dermatán se garantiza mediante tres enzimas, denominadas, dermatán sulfato epimerasa 1 (DS-epi1), dermatán sulfato epimerasa 2 (DS-epi2) y el dermatán 4-O-sulfotransferasa (D4ST1) (Thelin M. y col. FEBS Journal 280, 2431,2013).
Sulfato de Keratan pertenece al grupo de polisacáridos sulfatados lineales que comprenden D-galactosa, N-acetilglucosamina y galactosa-6-sulfato unidos con enlaces p (1 — 3) y P (1 — 4), que tienen la estructura y enlaces similares al sulfato de condroitina. Se puede encontrar en la córnea, los cartílagos, los huesos y el tejido conectivo (véase más abajo la fórmula estructural del sulfato de queratán),
Figure imgf000003_0003
Los carragenanos pertenecen al grupo de los polisacáridos sulfatados lineales que se obtienen mediante la extracción de algas del mar rojo. La galactosa y su derivado 3,6-anhidro son sus unidades estructurales básicas, unidas entre sí por enlaces O-glucosídicos p(1 — 3) y P(1 —4) . Existen tres grupos principales de carragenanos que difieren en el grado de sulfatación y solubilidad en agua. Kappa-carragenano tiene un grupo sulfato en dímero y forma geles rígidos en ambiente acuoso. El Iota-carragenano contiene dos sulfatos y forma geles blandos, mientras que el lambdacarragenano que tiene tres sulfatos no presenta propiedades gelificantes.
Ácido hilaurónico es un glicosaminoglicano no sulfatado compuesto por dos unidades repetitivas de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina.
Figure imgf000004_0001
donde
R1 es H o Na
El peso molecular del ácido hialurónico nativo está en el intervalo de 5.104 a 5.106 g.mol-1. Este polisacárido muy hidrofílico es parte de los tejidos conectivos, la piel, el líquido sinovial de las articulaciones; desempeña un papel importante en muchos procesos biológicos, como la organización de los proteoglicanos, la hidratación y diferenciación celular. Como este polímero se produce naturalmente en el cuerpo y, por lo tanto, es biodegradable, es útil como un sustrato en el campo de la ingeniería de tejidos o como portador de sustancias biológicamente activas.
Polisacáridos que contienen enlaces múltiples
Los polisacáridos que tienen un enlace múltiple -C=C- que forma parte del ciclo de sacárido y no está situado al final de la cadena, son muy raros. Como ejemplo de polisacáridos comunes, se describen derivados de celulosa 5,6-insaturados, conocidos como celulosos (Vigo T. L. et al. Polymers for Advanced Technologies, 10, 6, 311-320, 1999) o sus análogos 2,3-insaturados. El método de la preparación de derivados 5,6-insaturados se basa en la reacción de eliminación del grupo saliente en la posición 6 y el hidrógeno en la posición 5 bajo condiciones básicas para producir enol éter (el enlace múltiple -C=C- se conjuga con oxígeno heterocíclico). La preparación de derivados 2,3-insaturados de celulosa, amilosa o xilano (D. Horton y col. Carbohydrate Research, 40, 2, 345-352, 1975) requiere, además de la presencia de grupos salientes, un agente reductor, normalmente zinc, para producir un alqueno estándar (sin la conjugación de enlaces múltiples y oxígeno).
Utilización de polisacáridos que contienen enlaces múltiples.
Las aplicaciones están dirigidas principalmente a la modificación del enlace múltiple -C = C- que no es una parte directa del ciclo del sacárido. Estos métodos se basan en unir una nueva sustancia al esqueleto del polímero, donde la estructura se cambia de manera importante, es decir, se pierde el carácter nativo del polisacárido. En tales casos, el enlace múltiple se usa normalmente en la polimerización (Bellini D. WO96/37519), adición (Khetan S. et al. Soft Matter, 5, 1601-1606, 2009) o reacciones de cicloadición (Nimmo Ch. M. y col. Biomacromolecules, 12, 824-830, 2011; Bobula, T. y col. Carbohydrate. Polymers, 125, 153-160, 2015) Estos métodos pueden conducir a la reticulación efectiva de polisacáridos (Collins M. N. y col. Carbohydrate Polymers, 92, 1262-1279, 2013; Hacker M. C. y col., Inter. J. ofMol. Sc., 16, 27677-706, 2015), y la unión selectiva de sustancias activas al polímero (Mero A. y col. Polymers, 6, 346-369, 2014) El enlace múltiple del grupo metacrilato también se usa muy comúnmente para realizar una reacción de polimerización (Granstrom M. a kol. EP2899214).
Solo hay unos pocos métodos para introducir el enlace múltiple -C=C- directamente en el ciclo de sacárido en una cadena de polímero. Uno de ellos es una escisión enzimática de polímeros por liasa, donde el doble enlace se forma en el extremo no reductor del polímero (Kelly S. J. a kol. Glycobiology, 11,4, 294-304, 2001), que es, en este caso, ácido hialurónico (ver el esquema a continuación).
Figure imgf000004_0002
Significa que la aparición de esta modificación depende en gran medida del peso molecular; por ejemplo, para el peso molecular de 4.104 g.mol-1 solo se modifica uno de los cien disacáridos, si el peso molecular es 4.105 g.mol-1, se modifica uno de los mil disacáridos. Por lo tanto, es obvio que, a excepción de los oligómeros de polisacáridos, este tipo de modificación es menor y en realidad no hay diferencia entre el polímero de alto peso molecular inicial y el resultante.
El segundo método permite incorporar el doble enlace en la estructura del polisacárido en las posiciones 4 y 5 a lo largo de toda la longitud de la cadena, por lo que los polímeros que tienen un peso molecular más alto pueden modificarse eficientemente (Buffa R. et al. WO2014/023272, Bobula T. y col. Carbohydrate Polymers, 136, 1002-1009, 2016) Sin embargo, en este método, se forma un enlace múltiple -C=C, y este enlace se conjuga directamente con un grupo aldehído aceptor de electrones fuerte. Esta modificación cambia significativamente las propiedades químicas del polisacárido, porque permite la unión covalente de una amplia gama de nucleófilos, normalmente aminas. El hecho mencionado anteriormente también implica que el polímero modificado de esta manera tiene una característica electrófila significativamente más alta y, por lo tanto, difiere químicamente del polímero nativo. También se puede considerar como un antioxidante menos activo en comparación con el polímero no modificado.
La solución descrita en esta invención puede eliminar estos inconvenientes; no hay un grupo electrófilo reactivo en el polímero modificado, en comparación con el polímero no modificado. Por el contrario, el doble enlace conjugado con oxígeno heterocíclico puede considerarse como un grupo que tiene propiedades nucleófilas (antioxidantes).
Sumario de la invención
El objeto de la invención son los derivados de polisacáridos que comprenden, en su estructura, el heterociclo que tiene el doble enlace en las posiciones 4 y 5 de acuerdo según estructural X,
Figure imgf000005_0001
donde R es -NH-CO-CH3 o -OH.
El peso molecular de los derivados está en el intervalo de 5.103 a 5.105 g.mol-1, y los polisacáridos de partida para la preparación de los derivados segúnla invención se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende sulfato de condroitina, carragenano, sulfato de dermatán, ácido hialurónico o sulfato de queratán.
Además, la invención se refiere al método de preparación, basado en tres etapas (ver el esquema a continuación):
Figure imgf000005_0002
1. Oxidación: introducción de un grupo aldehído en la posición 6 del ciclo de sacárido. Oxidación del grupo hidroxilo primario en la posición 6 a un aldehído. La reacción se puede realizar, por ejemplo, mediante un sistema de oxidación de TEMPO/NaClO del radical 2,2,6,6-tetrametil-1 -piperidiniloxilo en agua. Esta etapa se realiza preferiblemente en agua a la temperatura de 0 a 10 °C, con NaClO en una cantidad molar de 0,03 a 0,8 eq. y cantidad molar de TEMPO en el intervalo de 0,005 a 0,2 eq. con respecto a la unidad repetitiva del polisacárido. El polisacárido de partida puede tener un peso molecular en el intervalo de 5.103 a 5.105 g.mol-1 y se usa preferiblemente una solución acuosa del 0,1 al 8% en peso de polisacárido. Finalmente, se puede añadir etanol, tiosulfato de sodio, etc. a la mezcla de reacción para finalizar la reacción y eliminar los residuos del agente sin reaccionar (hipoclorito). Alternativamente, la oxidación se puede realizar por medio del sistema 1,1,1-triacetoxi-1,1-dihidro-1,2-benziodoxol-3 (1H) -ona (DMP) a la temperatura de 10 °C a 50 °C en DMSO, donde la cantidad de DMP está en el intervalo de 0,05 a 2 eq. con respecto a la unidad repetitiva del polisacárido.
2. Eliminación
2a. si R12= -H, se realiza la eliminación de agua (deshidratación).
Se puede realizar preferiblemente en medios acuosos-orgánicos, donde el disolvente orgánico es miscible en agua y la relación en volumen de disolvente/agua está en el intervalo de 3/1 a 1/2. Preferiblemente, la base tal como piridina, trietilamina o W,W-diisopropiletilamina, o una base inorgánica, p. ej. Ca (OH)2 , se puede usar en esta etapa. La cantidad de la base en la reacción es de 0,01 a 20 eq., preferiblemente de 5 a 10 eq., en base a la unidad repetitiva del polisacárido. Como disolventes orgánicos, se pueden usar disolventes polares apróticos miscibles en agua, preferiblemente DMSO o sulfolano. La oxidación se realiza durante 0,1 a 12 horas, preferiblemente de 1 a 4 horas; la segunda etapa de la reacción se realiza durante 12 a 150 horas, preferiblemente 20 a 40 horas, a la temperatura de 30 a 80 °C, preferiblemente 50 a 60 °C.
2b. si R1 = -SO2-ONa o SO2-OH, se realiza la eliminación de NaO-SO2-ONa o HO-SO2-ONa respectivamente. Si el grupo -OR1 en la posición 4 en el ciclo está en la posición antiperiplanar con respecto al hidrógeno en la posición 5, la eliminación continúa espontáneamente sin la necesidad de añadir bases y sin la necesidad de aumentar la temperatura de reacción. La duración de la reacción de las etapas 1 2b es de 0,1 a 12 h, preferiblemente de 1 a 4 h. Si el grupo -OR1 en la posición 4 del ciclo de sacárido no está en la posición antiperiplanar con respecto al hidrógeno en la posición 5, el método descrito en la parte 2a también se puede usar para una eliminación efectiva.
3. Reducción - el grupo aldehído se reduce selectivamente con borohidruros, preferiblemente con NaBH4, para formar un alcohol primario -CH2-OH mientras se mantiene el enlace múltiple en la posición 4 y 5 del ciclo de sacárido.
Aunque una persona experta en la técnica esperaría una reducción del enlace -C=C- además de la reducción del grupo aldehído -CHO (o diol geminal -CH(OH)2), sorprendentemente, la reducción del doble enlace -C=C- no ocurre en el método según la invención. La cantidad del agente reductor puede variar de 0,1 a 10 equivalentes, den base a la unidad repetitiva del polisacárido, preferiblemente de 0,3 a 2 equivalentes. La reacción se puede realizar en agua a la temperatura de 5 - 40 °C, pH 5 - 10, preferiblemente a la temperatura de 15 - 25 °C y pH 6 - 8 durante 1 -24 h. La concentración de la solución de aldehído de partida es preferiblemente del 0,1 al 8% en peso.
Los hechos mencionados anteriormente implican que el método de preparación de derivados de polisacáridos según esta invención requiere que el polisacárido de partida incluya la estructura Y
Figure imgf000006_0001
que comprende ciclo de sacárido unido en (1 ^ 3) , grupo -CH2-OH primario en la posición 6, y un grupo -OH, -SO2-Oh o -SO2-ONa en la posición 4. El grupo en la posición 2 no es crucial para el desempeño exitoso de la modificación dada; para la mayoría de los polisacáridos R es - OH o NH-CO-CH3.
Además, la invención se refiere al uso de derivados de polisacáridos de fórmula general X. Como se mencionó anteriormente, la solución descrita en esta invención ofrece nuevos tipos de derivados de polisacáridos que tienen una nucleofilicidad mejorada (propiedades antioxidantes) y al mismo tiempo solo un cambio menor de la estructura primaria de polisacárido causada por la eliminación de hidrógeno de la posición 5 y los grupos -OH, -O-SO2-OH o -O-SO2-ONa desde la posición 4. Las propiedades antioxidantes de estos nuevos derivados se demostraron mediante determinación estándar con radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo, donde se observaron que existen diferencias significativas entre los derivados insaturados de polisacárido preparados según la invención y análogos saturados (no modificados) . Es por eso que los derivados según invención se pueden usar, por ejemplo, para la preparación de materiales con un efecto antioxidante.
Además, se encontró que si el ácido hialurónico es el polisacárido, el derivado insaturado se puede usar para la preparación de un material con un efecto anticancerígeno. Las propiedades biológicas de los derivados preparados se ensayaron en varias líneas celulares de carcinoma, y en todos los casos se observó una viabilidad reducida, mientras que el crecimiento de fibroblastos estándar no se suprimió dentro del intervalo completo de las concentraciones ensayadas.
El término "polisacárido" se refiere a un polisacárido que contiene una unidad estructural Y, tal como p. ej. ácido hialurónico, carragenano, sulfato de dermatán, sulfato de queratán o sulfato de condroitina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales que son seguras y eficaces para el uso in vivo y tener una actividad biológica deseada. Las sales farmacéuticamente aceptables comprenden preferiblemente iones de metales alcalinos o iones de metales alcalinotérreos, más preferiblemente Na+, K+, Mg+ o Li+.
La realización de la solución descrita en esta invención no es tecnológicamente complicada y no requiere el uso de productos químicos caros, disolventes o procedimientos de aislamiento.
Descripción detallada de los dibujos
Fig. 1 - Efecto de AHA preparado según el Ejemplo 25 sobre la viabilidad celular El esquema muestra el desarrollo de la inhibición del crecimiento de las células cancerosas MDA-MB-231 - adenocarcinoma de mama, A-549 -adenocarcinoma de pulmón, HEP-G2 - carcinoma hepatocelular, en comparación con la inhibición de NHDF -fibroblastos dérmicos humanos primarios.
El procedimiento se describe en el Ejemplo 27.
Fig. 2 - propiedades antioxidantes de los materiales AHA y ACS en comparación con los polisacáridos no modificados HA, CS y con el estándar - Trolox - ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico
HA - ácido hialurónico
AHA - ácido hialurónico deshidratado en las posiciones 4 y 5 (Ejemplo 22)
CS - sulfato de condroitina
ACS - sulfato de condroitina deshidratado en las posiciones 4 y 5 (Ejemplo 2)
ensayado por medio de 2,2-difenil-1 -picrylhydrazyl (DTTH) por el procedimiento descrito en el Ejemplo 23
Prueba estadística de significancia t - * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 Realizaciones preferidas de la invención
DS = grado de sustitución = 100%* = (cantidad molar de la unidad de sacárido modificado) / (cantidad molar de la unidad de polisacárido repetitiva)
El término equivalente (eq.) como se usa en el presente documento se refiere a la unidad repetitiva de un polisacárido particular, si no se indica lo contrario. El porcentaje se especifica como porcentaje en peso si no se indica lo contrario. El peso molecular de los polisacáridos de partida es el peso molecular promedio en peso determinado por el método SECMALLS.
Ejemplo 1
Oxidación y eliminación de sulfato de condroitina (CS) = Preparación de aldehido CS a,p-insaturado
Se añadió gradualmente una solución de hipoclorito de sodio (0,8 eq., 11% de cloro activo) en una solución acuosa de CS al 2% (200 mg, Mw = 4.104 g.mol-1) se enfrió a 5 °°C y contenía dodecahidrato de hidrógeno fosfato disódico (2,2 eq.), bromuro de sodio (0,8 eq.) y 4-AcNH-TEMPO (0,01 eq.). La mezcla se agitó durante 2 horas a la temperatura de 5 °C. Después se añadió etanol (10 eq.) a la reacción, y la reacción se agitó durante otra hora a temperatura ambiente. El producto se aisló por precipitación con IPA y se analizó mediante RMN.
DS = 23% (determinado por RMN)
Ejemplo 2
Reducción del aldehído a,p-insaturado de CS = Preparación de ACS
Se preparó una solución de aldehído a,p-insaturado de CS al 2% p/v (200 mg, 0,5 mmol) en agua destilada, la solución se enfrió a 5 °C y después se añadieron 2 equivalentes de borohidruro de sodio. La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas a 5 °°C. El producto se aisló por precipitación con isopropanol y se analizó mediante RMN.
DS = 25% (determinado por RMN), Mw = 2.104 g.mol-1 (determinado por SECMALLS)
Análisis espectral de ACS: RMN 1H (500 MHz, D2O, 5 ppm): 2.02 y 2.04 (3H; Ac-NH-; bs); 4,03 (2H; H6; bs); 4,22 (1H; H2; bs); 4,26 (1H; H3; bs); 5,06 (1H; H1; bs); 5,18 (1H; H4; bs); RMN 1H-1H COSY (D2O); picos cruzados; \ delta ppm: 4.22-5.06; 4.26-5.18; RMN 1H-13C HSQC (D2O); picos cruzados; \ delta ppm: 4.03-61.0; 4.22-50.5; 4.26-73.4; 5.06­ 98.3; 5.18-98.9; NMR DOSY (D2O); log D ((2.02 y 2.04; Ac-NH-); (4.03; H6); (4.22; H2); (4.26; H3); (5.06; H4); (5.18; H1)) ~ -10.4 m2s-1; log D (4.72; H2O) ~ -8; 6 m2s-1; IR (KBr; cm-1): 1660 (v -C = C- st);
Ejemplo 3
Oxidación y eliminación de dermatán sulfato (DeS) = Preparación de aldehído DeS a, p-insaturado
Se añadió gradualmente una solución acuosa de hipoclorito de sodio (0,8 eq., 11% de cloro activo) a una solución acuosa de DeS al 2% (200 mg, 0,42 mmol) enfriada a 5 °C y que contenía dodecahidrato de fosfato de hidrógeno disódico (2,2 eq.), bromuro de sodio (0,8 eq.) y 4-AcNH-TEMPO (0,01 eq.), la mezcla se agitó durante 2 horas a 5 °C.
Después se añadió etanol (10 eq.) a la reacción, y la reacción se agitó durante otra hora a temperatura ambiente. El producto se aisló por precipitación con IPA y se analizó mediante RMN.
DS = 20% (determinado por RMN)
Ejemplo 4
Reducción del aldehido o,p-insaturado de dermatán sulfato = Preparación de ADeS
Se preparó una solución de aldehído a,p-insaturado de DeS al 2% p/v (200 mg, 0,5 mmol) en agua destilada. La solución se enfrió a 5 °C y después se añadió borohidruro de sodio (2 equivalentes por disacárido de DeS). La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas a 5 °C. El producto se aisló por precipitación con isopropanol y se analizó mediante RMN.
DS = 23% (determinado por RMN)
Análisis de espectros de ADeS: RMN 1H (500 MHz, D2O, 5 ppm): 2.01 (3H, Ac-NH-, bs), 5.05 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H1, bs).
Ejemplo 5
Oxidación y eliminación de carragenano (KA) = Preparación de aldehído o,p-insaturado de KA
Se añadió gradualmente una solución acuosa de hipoclorito de sodio (0,8 eq., 11% de cloro activo) a una solución acuosa de KA al 1% (200 mg, 0,31 mmol) enfriada a 10 °C, que contenía dodecahidrato de fosfato de hidrógeno y sodio (2,2 eq.), bromuro de sodio (0,8 eq.) y 4-AcNH-TEMPO (0,01 eq.). La mezcla se agitó durante 2 horas a 10 °C. Después se añadió etanol (10 eq.) a la reacción, y la reacción se agitó durante otra hora a temperatura ambiente. El producto se aisló por precipitación con IPA y se analizó mediante RMN.
DS = 10% (determinado por RMN)
Ejemplo 6
Reducción de aldehído o,p-insaturado de carragenano = Preparación de AKA
Se preparó una solución de aldehído a,p-insaturado de KA al 2% p/v (200 mg, 0,5 mmol) en agua destilada. La solución se enfrió a 5 °C y después se añadió borohidruro de sodio (2 equivalentes por disacárido de KA). La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas a 5 °C. El producto se aisló por precipitación con isopropanol y se analizó mediante RMN.
DS = 13% (determinado por RMN)
RMN 1H (500 MHz, D2O, 5 ppm): 5.07 (1H, H1, bs), 5.18 (1H, H1, bs),
Ejemplo 7
Oxidación de queratán sulfato (KS) = Preparación de KS-aldehído
Se añadió gradualmente una solución acuosa de NaClO (0,3 eq.), bajo nitrógeno, en una solución acuosa de KS al 1% (1 g, 2.104 g.mol-1) que contiene NaCl al 1%, KBr al 1%, Te MpO (0,01 eq.) y NaHCO3 (20 eq.). La mezcla se agitó durante 24h a 0 °C, luego se añadieron 0,1 g de tiosulfato de sodio y la mezcla se agitó durante 10 minutos más. La solución resultante se diluyó con agua destilada al 0,2% y se dializó contra la mezcla de 5 litros (NaCl al 0,1%, NaHCO3 al 0,1%) 3 veces (una vez al día), y contra agua destilada, 5 litros 7 veces (2 veces al día). La solución resultante se evaporó y analizó.
DS 3% (determinado por RMN)
Ejemplo 8
Eliminación de KS-aldehído = Preparación del aldehído o,p-insaturado de KS
Se añadieron 6,7 ml de DMSO y base de DIPEA (5 eq.) a una solución de KS-aldehído al 3% (0,1 g, grado de oxidación de DS = 3%, ejemplo 7) en agua. La mezcla se agitó durante 72 horas a la temperatura de 60 °C. Después, la solución resultante se precipitó mediante una mezcla de isopropanol/hexano y la parte sólida se secó al vacío.
DS 2% (determinado por RMN),
1H RMN (D2O) \ delta 9,22 (s, 1H, -CH=O), 6.32 (m, 1H, -CH=C-CH=O)
Ejemplo 9
Reducción de aldehido o,p-insaturado de KS = Preparación de AKS
Se añadió borohidruro de sodio (2 eq.)a una solución de aldehido a,p-insaturado de KS al 2% (200 mg, Ejemplo 8) en agua destilada. La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas a 5 °C, después se precipitó con isopropanol y se analizó por RMN.
DS = 2% (determinado por RMN)
1H RMN (D2O) 5.05 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H4, bs)
Ejemplo 10
Oxidación de ácido hialurónico (HA) = Preparación de HA-aldehído
Se añadió gradualmente una solución acuosa de NaClO (0,5 eq.), bajo nitrógeno, en una solución acuosa de HA al 1% (1 g, 2.105 g.mol-1) que contiene NaCl al 1%, KBr al 1%, TEMPO (0,01 eq.) y NaHCO3 (20 eq.). La mezcla se agitó durante 12h a 0 °C, después se añadieron 0,5 ml de etanol y la mezcla se agitó durante otra hora. La solución resultante se diluyó con agua destilada al 0,2% y se dializó contra la mezcla de 5 litros (NaCl al 0,1%, NaHCO3 al 0,1%), 3 veces (una vez al día), y contra agua destilada, 5 litros 7 veces (2 veces al día). Después, la solución resultante se evaporó y analizó.
DS 10% (determinado por RMN)
Ejemplo 11
Oxidación de HA = Preparación de HA-aldehído
Se añadió gradualmente una solución acuosa de NaClO (0,5 eq.), bajo nitrógeno, en una solución acuosa de HA al 1% (1 g, 2.105 g.mol-1) que contiene NaCl al 1%, KBr al 1%, N-acetilamino-TEMPO (0,01 eq.) y NaHCO3 (20 eq.). La mezcla se agitó durante 12h a 10 °C, luego se añadieron 0,1 ml de etanol y la mezcla se agitó durante otra hora. La solución resultante se diluyó con agua destilada al 0,2% y se dializó contra la mezcla de 5 litros (NaCl al 0,1%, NaHCO3 al 0,1%), 3 veces (una vez al día), y contra agua destilada, 5 litros 7 veces (2 veces al día). Después, la solución resultante se evaporó y analizó.
DS 9% (determinado por RMN)
Ejemplo 12
Oxidación de HA = Preparación de HA-aldehído
Se añadió gradualmente una solución acuosa de NaClO (0,3 eq.), bajo nitrógeno, en una solución acuosa de HA al 1% (1 g, 2.105 g.mol-1) que contiene NaCl al 1%, KBr al 1%, TEm Po (0,2 eq.) y NaHCO3 (20 eq.). La mezcla se agitó durante 48h a 5 °C, después se añadieron 0,1 ml de etanol y la mezcla se agitó durante otra hora. La solución resultante se diluyó con agua destilada al 0,2% y se dializó contra la mezcla de 5 litros (NaCl 0,1%, NaHCO3 al 0,1%), 3 veces (una vez al día), y contra agua destilada, 5 litros 7 veces (2 veces al día). Después, la solución resultante se evaporó y analizó.
DS 5% (determinado por RMN)
Ejemplo 13
Oxidación de ácido hialurónico (HA) = Preparación de HA-aldehído
Se añadió gradualmente una solución acuosa de NaClO (0,7 eq.), bajo nitrógeno, en una solución acuosa de HA al 1% (1 g, 2.105 g.mol-1) que contiene NaCl al 1%, KBr al 1%, Te MpO (0,01 eq.) y NaHCO3 (20 eq.). La mezcla se agitó durante 0,5h a 0 °C, después se añadieron 0,1 ml de etanol y la mezcla se agitó durante otra 1 hora. La solución resultante se diluyó con agua destilada al 0.2% y se dializó contra la mezcla de 5 litros (NaCl al 0,1%, NaHCO3 al 0,1%), 3 veces (una vez al día), y contra agua destilada, 5 litros 7 veces (2 veces al día). Después, la solución resultante se evaporó y analizó.
DS 9% (determinado por RMN)
Ejemplo 14
Oxidación de ácido hialurónico (HA) = Preparación de HA-aldehído
Se añadió gradualmente una solución acuosa de NaClO (0,5 eq.), bajo nitrógeno, a una solución acuosa de HA al 1% (1 g, 2.105 g.mol-1) que contiene NaCl al 1%, KBr al 1%, TEMpO (0,01 eq.) y NaHCO3 (20 eq.). La mezcla se agitó durante 12h a 0°C, después se añadieron 0,1 ml de etanol y la mezcla se agitó durante otra 1 hora. La solución resultante se diluyó con agua destilada al 0,2% y se dializó contra la mezcla de 5 litros (NaCl al 0,1%, NaHCO3 al 0,1%), 3 veces (una vez al día), y contra agua destilada, 5 litros 7 veces (2 veces al día). Después, la solución resultante se evaporó y analizó.
DS 10% (determinado por RMN)
Ejemplo 15
Oxidación de ácido hialurónico (HA) = Preparación de HA-aldehído
Se añadieron 1,2 eq. de 1,1,1-triacetoxi-1,1-dihidro-1,2-benziodoxol-3 (1H) -ona (Dess-Martin Periodinan) a una solución de forma ácida de hialuronano al 1% (1 g, 1 .105 g.mol-1) en DMSO no acuoso, y la mezcla se agitó durante 5h a 20 °C. La solución resultante se diluyó después con agua destilada al 0,2% y se dializó contra la mezcla de 5 litros (NaCl al 0,1%, NaHCO3 al 0,1%), 3 veces (una vez al día), y contra agua destilada, 5 litros 7 veces (2 veces al día). Después, la solución resultante se evaporó y analizó.
DS 40% (determinado por RMN)
Ejemplo 16
Eliminación de HA-aldehído = Preparación del aldehído o,p-insaturado de HA
Se añadieron 6,7 ml de DMSO y base de DIPEA (5 eq.) a una solución de HA-aldehído al 3% (0,1 g, grado de oxidación DS = 40%, Ejemplo 15) en agua. La mezcla se agitó durante 72 horas a 60 °C. La solución resultante después se precipitó con una mezcla de isopropanol/hexano y la parte sólida se secó al vacío.
DS 20% (determinado por RMN),
1H RMN (D2O) \ delta 9,24 (s, 1H, -CH=O), 6.32 (m, 1H, -CH=C-CH=O)
UV-Vis (D2O) 252 nm, n -n * transición a, aldehído p-insaturado
Ejemplo 17
Eliminación de HA-aldehído = Preparación del aldehído o,p-insaturado de HA
Se añadieron 6,7 ml de DMSO y base de trietilamina (20 eq.) a una solución de HA-aldehído al 3% (0,1 g, grado de oxidación DS = 10%, Ejemplo 10) en agua. La mezcla se agitó durante 150 horas a 30 °C. La solución resultante se precipitó después con una mezcla de isopropanol/hexano y la parte sólida se secó al vacío.
DS 5% (determinado por RMN)
Ejemplo 18
Eliminación de HA-aldehído = Preparación del aldehído o,p-insaturado de HA
Se añadieron 6,7 ml de DMSO y base de piridina (0,01 eq.) a una solución de HA-aldehído al 3% (0,1 g, grado de oxidación DS = 10%, Ejemplo 10) en agua. La mezcla se agitó durante 12 horas a 80 °C. La solución resultante se precipitó después con una mezcla de isopropanol/hexano y la parte sólida se secó al vacío.
DS 3% (determinado por RMN)
Ejemplo 19
Eliminación de HA-aldehído = Preparación del aldehído o,p-insaturado de HA
Se añadieron 1,7 ml de DMSO y base de piridina (10 eq.) a una solución de HA-aldehído al 3% (0,1 g, grado de oxidación DS = 10%, Ejemplo 10) en agua. La mezcla se agitó durante 48 horas a 60 °C. La solución resultante se precipitó después con una mezcla de isopropanol/hexano y la parte sólida se secó al vacío.
DS 4% (determinado por RMN)
Ejemplo 20
Eliminación de HA-aldehído = Preparación del aldehído o,p-insaturado de HA
Se añadieron 10 ml de DMSO y base de DIPEA (5 eq.) a una solución de HA-aldehído al 3% (0,1 g, grado de oxidación DS = 10%, Ejemplo 10) en agua. La mezcla se agitó durante 48 horas a 60 °C. La solución resultante se precipitó después con una mezcla de isopropanol/hexano y la parte sólida se secó al vacío.
DS 5% (determinado por RMN)
Ejemplo 21
Eliminación de HA-aldehído = Preparación del aldehido o,p-insaturado de HA
Se añadieron 6,7 ml de sulfonano y base de DIPEA (5 eq.) a una solución de HA-aldehído al 3% (0,1 g, grado de oxidación DS = 10%, Ejemplo 10) en agua. La mezcla se agitó durante 72 horas a 50 °C. La solución resultante se precipitó después con una mezcla de isopropanol/hexano y la porción sólida se secó al vacío.
DS 5% (determinado por RMN)
Ejemplo 22
Reducción del aldehído o,p-insaturado de HA = Preparación de AHA
Se añadió borohidruro de sodio (10 eq.) a una solución de aldehído a,p-insaturado de HA al 2% (200 mg, Ejemplo 16) en agua destilada, a 5 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a 5 °C, después se precipitó con isopropanol y se analizó por RMN.
DS 20% (determinado por RMN)
1H RMN (D2O) 5.06 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H1, bs)
Ejemplo 23
Reducción del aldehído o,p-insaturado de HA = Preparación de AHA
Se añadió borohidruro de sodio (0,1 eq.) en una solución de aldehído a,p-insaturado de HA al 2% (200 mg, Ejemplo 17) en agua destilada, a 5 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 20h a 5 °C, después se precipitó con isopropanol y se analizó por RMN.
DS = 4% (determinado por RMN)
Ejemplo 24
Reducción del aldehído o,p-insaturado de HA = Preparación de AHA
Se añadió borohidruro de sodio (1 eq.) a una solución de aldehído a,p-insaturado de HA al 2% (200 mg, Ejemplo 17) en agua destilada, a 40 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a 40 °C, después se precipitó con isopropanol y se analizó por RMN.
DS = 5% (determinado por RMN)
Ejemplo 25
Reducción de aldehído o,p-insaturado de HA = Preparación de AHA
Se añadió borohidruro de sodio (2 eq.) en una solución de aldehído a,p-insaturado de HA al 2% (200 mg, Ejemplo 17) en agua destilada, a 20 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 4 ha 20 °C, después se precipitó con isopropanol y se analizó por RMN.
DS = 5% (determinado por RMN)
Ejemplo 26
Determinación de la actividad de oxidación (Figura 2)
La actividad antioxidante de los polisacáridos de AHA preparados según el Ejemplo 22 y ACS preparado según el Ejemplo 2, se determinó por medio de un radical libre estable 2,2-difenil-1 -picrilhidrazilo (DPPH). Esta determinación se realizó según la descripción en (Brand-Williams W. et al., LWT - Food Science and Technology, 28, 1,25-30, 1995), con una modificación menor. Brevemente, se añadieron 100 gl de solución DPPH al 0,01% en metanol a 100 gl de la sustancia ensayada disuelta en 50 mM de Tris pH 7,1. La disminución de la absorbancia se midió después de 15 minutos a 515 nm. Se utilizó Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico) como control positivo. Los datos se midieron en tres experimentos independientes. Se usó el ensayo T para la evaluación de la significancia estadística *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Figura 2).
Ejemplo 27
Ensayo de citotoxicidad de los derivados preparados según el Ejemplo 25 (Figura 1)
Se comparó un efecto de citotoxicidad del derivado de HA para células no cancerosas: fibroblastos dérmicos humanos primarios y para líneas celulares de carcinoma de mama (MDA-MB-231), líneas celulares de carcinoma de pulmón (A-549) y líneas celulares de carcinoma hepatocelular (HEP-G2). Para el propósito de los experimentos, las células se cultivaron bajo condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2) en un medio adecuado (10% de FBS - suero bovino fetal). Después de lograr una confluencia del 80%, las células se pasaron, se contaron mediante un contador automático CASY TT, Roche, y se colocaron en paneles de 96 pocillos a una densidad de 5,000 células por pocillo en 200 pl de medio. Después de 24 horas, el medio se reemplazó con las soluciones de las sustancias ensayadas de concentraciones de 1.000; 500; 100; y 10 pg/ml de medio al 10%. La viabilidad celular se midió 24, 48 y 72 horas después del tratamiento mediante el ensayo MTT - se añadieron 20 pL de solución MTT (5 mg/ml) en cada pocillo, seguido de una incubación durante 2,5 horas y lisis celular con solubilización. solución (IPA: DMSO 1:1 s 10% Triton X-100 y 9,9% HCl al 37%) durante 30 minutos. Después se midió la absorbancia mediante el lector de microplacas VERSAmax a 570 nm y 690 nm (corrección de fondo). La viabilidad de las células tratadas se evaluó por correlación con el control no tratado que corresponde a cero en la Figura 1. Los valores por encima de cero se refieren a una activación celular (sin efecto citotóxico de los derivados) y los valores por debajo de cero indican una viabilidad celular reducida, es decir, el efecto citotóxico de los derivados. En el caso de NHDF, es obvio, en la Figura 1, que el derivado ensayo no tuvo efecto citotóxico. En el caso de las líneas de carcinoma (MDA-MB-231, A-549, HEP-G2) se observó un efecto citotóxico de los derivados. Basado en los resultados de las pruebas presentadas, se puede deducir un posible efecto anticancerígeno del derivado (Figura 1).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Derivados insaturados de polisacáridos que comprenden, en su estructura, al menos un heterociclo que tiene un doble enlace en las posiciones 4 y 5 según la fórmula estructural X,
Figure imgf000013_0001
donde R representa -NH-CO-CH3 o -OH.
2. Derivados de polisacáridos según la reivindicación 1 caracterizado por que su peso molecular está en el intervalo de 5.103 a 5.105 g.mol-1 y que los polisacáridos se seleccionan del grupo que comprende sulfato de condroitina, carragenano, sulfato de dermatán, ácido hialurónico o sulfato de queratán.
3. Un método de preparación de los derivados de polisacáridos definidos en la reivindicación 1 o 2. caracterizado por que el polisacárido de partida, que comprende el fragmento Y
Figure imgf000013_0002
donde R es -NH-CO-CH3 o -OH, y R1 es -SO2-ONa, -SO2-OH o -H, en la primera etapa se oxida a un aldehído en la posición 6, en la segunda etapa se elimina en las posiciones 4 y 5 del ciclo para formar un doble enlace, y en la tercera etapa el grupo aldehído se reduce selectivamente.
4. El método de preparación según la reivindicación 3 caracterizado por que el polisacárido de partida es condroitín sulfato, carragenano, dermatán sulfato, ácido hialurónico o queratán sulfato.
5. El método de preparación según las reivindicaciones 3 o 4. caracterizado por que en la primera etapa, la oxidación en la posición C-6 se produce mediante el sistema R3-TEMPO/NaClO, donde R3 es hidrógeno o grupo N-acetilo, en agua a la temperatura de 0 °C a 10 °C, en donde la cantidad molar de NaClO está dentro del intervalo de 0,3 a 0,8 eq. y la cantidad molar de R3-TEMPO está dentro del intervalo de 0,005 a 0,2 eq., con respecto a la unidad repetitiva del polisacárido, o mediante 1,1,1 -triacetoxi-1,1-dihidro-1,2-benziodoxol-3(1 H) -ona (DMP) en DMSO a la temperatura de 10 °C a 50 °C, en donde la cantidad de DMP está dentro del intervalo de 0,05 a 2 eq., con respecto a la unidad repetitiva del polisacárido.
6. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. caracterizado por que el polisacárido de partida es ácido hialurónico o sulfato de queratán, y que, en la segunda etapa, el polisacárido oxidado sufre la reacción de eliminación en una mezcla de agua/disolvente aprótico polar en presencia de una base a la temperatura de 30 a 80 °C, preferiblemente a la temperatura de 50 a 60 °C.
7. El método de preparación según la reivindicación 6 caracterizado por que la cantidad de la base es de 0,01 a 20 eq., preferiblemente de 5 a 10 eq., con respecto a la unidad de polisacárido repetitiva, en la que la base se selecciona del grupo que comprende bases orgánicas, por ejemplo piridina, trietilamina o N, N-diisopropiletilamina, o bases inorgánicas, por ejemplo Ca(OH)2.
8. El método de preparación según las reivindicaciones 6 o 7. caracterizado por que el disolvente aprótico es miscible en agua y comprende, por ejemplo, DMSO o sulfolano, y la relación en volumen de disolvente/agua está en el intervalo de 3/1 a 1/2.
9. Método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8. caracterizado por que la segunda etapa de reacción continúa durante 12 a 150 horas.
10. Método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. caracterizado por que el polisacárido de partida es sulfato de condroitina, carragenano o sulfato de dermatán, y que el polisacárido oxidado se elimina espontáneamente en la segunda etapa directamente en la mezcla de reacción para formar un aldehído a, p-insaturado, y la eliminación espontánea continúa sin la necesidad de añadir cualquier base, disolvente orgánico, y sin aumentar la temperatura de reacción.
11. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10 caracterizado por que el peso molecular del polisacárido de partida está en el intervalo de 5.103 a 5.105 g.mol-1.
12. El método de preparación según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11 caracterizado por que se añade borohidruro de sodio en la tercera etapa en la cantidad de 0,1 a 10 equivalentes, preferiblemente 0,3 a 2 equivalentes, calculados con respecto a la unidad de polisacárido repetitiva, en agua, a la temperatura de 5 - 40 °C, preferiblemente a la temperatura de 15-25 °C, a un pH en el intervalo de 5 a 10, preferiblemente de 6 a 8.
13. Uso de los derivados como se define en la reivindicación 1 o 2 para la preparación de materiales que tienen un efecto antioxidante mejorado.
14. Uso de los derivados como se define en la reivindicación 2, donde el polisacárido es ácido hialurónico, para la preparación de materiales que tienen un efecto anticancerígeno.
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