JP3142848B2 - グルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性を有する遺伝子操作により得られた植物細胞及び植物、前記細胞及び植物を産生するために使用するdnaフラグメント及び組換え体 - Google Patents
グルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性を有する遺伝子操作により得られた植物細胞及び植物、前記細胞及び植物を産生するために使用するdnaフラグメント及び組換え体Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグルタミン合成酵素阻害剤の作用に対して植
物細胞及び植物を保護する方法に関する。 本発明はこのような方法を特に所与の植物での除草剤
耐性を発達させるために応用することにも関する。 本発明はさらにグルタミン合成酵素阻害剤に対する耐
性をコードするヌクレオチド配列を含有する適切なDNA
フラグメント及び組換え体、並びにグルタミン合成酵素
阻害剤に対する耐性を示す非生物学的に形質転換した植
物細胞及び植物にも関する。 グルタミン合成酵素(本明細書中以下では簡単にGSと
記す)はほとんどの植物中で植物細胞の発育と生存に必
須な酵素の1つを構成している。GSがグルタミン酸塩
(glutamate)をグルタミンに変換することは公知であ
る。GSはほとんどの植物中で、硝酸塩の還元、アミノ酸
の分解又は光呼吸により放出されたアンモニアを解毒す
るための有効な経路(現在知られている唯一のもの)に
関与している。従って、GSに対して効力を有する阻害剤
は植物細胞にとって非常に毒性が高い。植物中でのGSの
阻害による毒性作用に基いてある種の除草剤が開発され
てきた。 これらの除草剤は活性成分としてGS阻害剤を含む。 グルタミン合成酵素の作用の阻害剤に対して植物を耐
性にし得る少なくとも2つの可能な方法がある。すなわ
ち、(1)標的を変化させることによる。GS酵素内の変
異により除草剤に対する感受性をなくし得ると考えられ
る。(2)除草剤を不活化することによる。植物中で除
草剤を破壊又は修飾することにより耐性とし得るであろ
う。 ビアラホス(Bialaphos)及びホスフィノトリシン(p
hosphinothricin,本明細書中以下では簡単にPPTと記
す)はGSの作用に対する2つのこの種の阻害剤であり
(文献16,17)、優れた除草特性を有することが示され
ている(Bialaphosに関する詳細は文献2を参照のこ
と)。 Bialaphosは次の式(I): を有している。 PPTは次の式(II): を有している。 このように、PPTとBialaphosの差はPPTには2つのア
ラニンアミノ酸がないということである。 これら2つの除草剤は非選択的である。これらは土壌
上に存在する全てのいろいろな種の植物の成長を阻害
し、従ってそれら全体を破壊する。 Bialaphosは最初抗生物質特性をもつものとして開示
され、この特性により殺虫剤又は殺菌剤としての使用が
可能であった。Bialaphosは明治製菓(MEIJI SEIKA KAI
SHA LTD.)による米国特許第3 832 394号明細書に開示
の方法で製造することができる。この特許は言及によっ
て本明細書中に取り入れられるものとする。この方法
は、例えばAmerican Type Culture CollectionからATCC
No.21,705として入手しうる株のような、Streptomyces
hygroscopicusを培養し、その培地からBialaphosを回
収することからなる。しかしながら、Streptomyces vir
idochromogenesのような他の株もこの化合物を産生する
(文献1)。 例えばホサラシン(phosalacin、文献15)のような、
PPT核を含有する他のトリペプチド抗生物質も自然界で
発見されるか又はされるかもしれない。 PPTも又化学合成により得られ、工業会社HCECHSTから
市販されている。 原核細胞機能即ち酵素を不活化することが知られてい
る活性の高い抗生物質を産生する多くのストレプトミセ
ス(Streptomyces)種が開示されてきている。これらの
抗生物質を生産するストレプトミセス種は、もしこれら
の抗生物質に対する自己防御機能を有していなければそ
れ自身が破壊されてしまうだろう。この自己防御機構に
はいくつかの場合、抗生物質の作用を阻害しえ、従っ
て、当該ストレプトマイセス種の自家中毒を回避しうる
酵素を含まれることが発見されている。この修飾は一般
に分子が細胞から排出されたときには取り消されてしま
う。 宿主に対する抗生物質の作用を阻害するように抗生物
質を修飾しうる酵素をコードする遺伝子が存在すること
は抗生物質を産生するいくつかのストレプトミセス、例
えば各々ネオマイシン,チオストレプトン,バイオマイ
シン及びMLS(マクロライド リンコサミド ストレプ
トグラミン)という抗生物質を産生するS.fradiae,S.az
ureus,S.vinaceus,S.erythreusで示されてきた(文献
4),(文献5),(文献6),CHATER他(1982年)の
文献14はこれらの作用を明らかにするのに使用し得る標
準的技術を記している。) 本発明によって、Streptomyces hygroscopicus ATCC
21,705もBialaphosの抗生物質特性を不活化する能力の
ある酵素をコードする遺伝子を有することが発見され
た。本出願人が実施した実験によりこのような遺伝子が
単離され、PPT又は誘導生成物に基づいてGS阻害剤の作
用を制御する過程でその遺伝子を使用することができ
た。 本発明の目的は植物細胞及び植物内でGS阻害剤の作用
を調節する新しい方法を提供することである。 本発明のもう1つの目的は、植物細胞及び植物内に取
り込まれたときにGS阻害剤の作用に対してそれらを保護
し得るヌクレオチド配列を含有するDNAフラグメント
(断片)及びDNA組換え体、並びに前記DNAフラグメント
を含有する特別に修飾したベクターを提供することであ
る。 本発明のさらに別の目的はGS阻害剤を中和即ち不活化
し得る非生物学的に形質転換した植物細胞及び植物を提
供することである。 本発明のもう1つの目的はGS阻害剤型の除草剤に対し
植物種を選択的に保護する方法を提供することである。 さらに特定的には、本発明のひとつの目的はBialapho
s及び構造的に類似した除草剤の除草作用に対し植物細
胞及び植物全体を保護しうる、植物細胞及び植物全体に
伝達しうるDNAフラグメントを提供することである。 本発明の目的は構造中にPPT単位を有する。例えばBia
laphosのような種類の生成物に耐性な植物細胞を提供す
ることである。 GS阻害剤と接触したときに植物細胞及び植物中でGS阻
害剤の作用を調節するための本発明方法は、世代を通じ
て植物の細胞内に安定して異種DNAフラグメントを組込
むような条件下で、植物細胞及び植物中で蛋白質の形で
発現しうる外来性ヌクレオチド配列を含有する異種DNA
フラグメントを植物に提供することからなり、ここで前
記蛋白質は前記グルタミン合成酵素阻害剤を不活化又は
中和させ得る酵素活性を有している。 好ましいDNAフラグメントは抗生物質産生ストレプト
ミセス株由来のもの(又は同じ活性をコードするヌクレ
オチド配列を含む配列)であり、前記GS阻害剤耐性をコ
ードするものである。 本発明に使用する好ましいヌクレオチド配列は前記GS
阻害剤に関しアセチルトランスフェラーゼ活性を有する
蛋白質をコードする。 本発明の最も好ましいDNAフラグメントはPPTアセチル
トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列からなる。 植物細胞の以後の形質転換のための本発明の特定のDN
Aフラグメントは次の配列: [式中、XはMET又はVALを表わす]を有するポリペプチ
ドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列から
なり、前記ポリペプチドの一部とは、遺伝的に取り込ま
れ、植物細胞中で発現するときに植物細胞にBialaphos
に対する保護(すなわち、以後Bialaphosに対する「植
物保護能」と記す)を付与するに十分な長さである。 好ましいDNAフラグメントは次のヌクレオチド配列: 又はその一部分でBialaphosに対する植物保護能を有す
るポリペプチドを発現する部分からなる。 本発明は又、そのヌクレオチドのいずれかを他のもの
で置換することにより上記の好適なものとは異なるが上
記の好適なDNA配列の遺伝情報(通常一般的な遺伝子コ
ードの意味において)を変えない任意のDNAフラグメン
トにも関し、さらに、同じ特性、特にBialaphos耐性活
性を有するポリペプチドをコードする任意の等価なDNA
配列にも関する。 例えば、本発明のDNAフラグメントのどちらかの側の
末端部分をエキソヌクレオリティックな酵素、例えばBa
l 31で除去し、適当なプラスミド内で残りのフラグメン
トを再クローニングし、後記に開示するように、適当な
細胞を形質転換しBialaphos抗生物質又は除草剤に対し
保護する前記修飾プラスミドの能力をアッセイすること
により、本発明の任意のDNAフラグメントのいずれかの
側から除去し得るヌクレオチド配列部分は当業者により
容易に評価されうることは理解されよう。ここで、前記
のアッセイはどんなものでも適当である。 表記を簡単にするために、これらのDNAフラグメント
を以後「Bialaphos−耐性DNA」と言う。同様に、対応の
ポリペプチドを「Bialaphos−耐性酵素」と呼ぶ。 前記考察中で、植物細胞及び植物中に導入されたとき
にBialaphos又はPPTに対しそれらを保護しうるDNAフラ
グメントを特に強調したが、本発明はそれに限定される
ものとみなされるべきではないことを理解すべきであ
る。 同様に、本発明は、このような植物細胞内に導入され
たときに他のGS阻害剤、例えばホスフィノトリシンの天
然の生合成に関与する中間産物、例えば式: の略号MP 101(III),MP 102(IV)で表わされる化合物
に対しこのような植物細胞を保護するDNAフラグメント
にも関する。 より一般的には、本発明は、植物細胞及び植物に適当
に導入されると、GS阻害剤との接触に際し、GS阻害剤に
対してそれらを保護しうるDNAフラグメント製造への道
を開いたものである。これに関し、後記実施例中ではBi
alaphos及びPPTに関して詳細に示す。 このことが確立されると、GS阻害剤を不活化すること
によってこれに対し植物細胞及び植物を保護する酵素活
性をコードする任意のフラグメントは上記に開示された
好ましいフラグメントの均等物として見られるべきであ
るということは理解されよう。これは、構造的に異なっ
ていても、Bialaphos又はPPT又は更に他のGS阻害剤に関
し同様の活性をコードする遺伝子を有すると思われる
株、特に抗生物質産生株のゲノムDNAの遺伝子をスクリ
ーニングすることにより得られる任意のDNAフラグメン
トについて特にあてはまることであろう。また、PPT誘
導体を産生する他の株の遺伝子についてもあてはまるで
あろう。 従って、簡便のために以後使用する「Bialaphos−耐
性DNA」又は「Bialaphos−耐性酵素」という言葉はPPT
又は最も直接的に関係する誘導体に対する耐性に特異的
に関係するDNA及び酵素にのみ関することを意図するの
ではなく、より一般的に、同じ条件下で植物中でGS阻害
剤の作用を不活化しうる他のDNA及び酵素にも関すると
意図していることを理解すべきである。 本発明は又、異種DNAと組換えた上記定義のBialaphos
−耐性DNAフラグメントを含有するDNA組換え体にも関
し、該異種DANは調節要素を含有し、前記Bialaphos耐性
DNAは該調節要素と適合し得る外来の細胞環境内で発現
し得るように該調節要素の制御下にある。特に、前記DN
A組換え体が含有している上記Bialaphos−耐性DNAフラ
グメントは、このBialaphos−耐性DNAフラグメントがBi
alaphos産生株から創作されている場合、Bialaphosの生
合成に関与するDNA領域を全然もっていない。 「異種DNA」前記Bialaphos−耐性DANの起源とは異な
る、例えばStreptomyces hygroscopicus又はStreptomyc
es viridochromogenesのものとは異なる起源のDNAを、
更により好ましくはストレプトミセスのDNAとは異なるD
NAを意味している。特に、前記調節要素は通常それらに
関連(結合)しているDNA配列の転写及び翻訳を前記外
来環境でコントロールしうるものである。「細胞」とは
微生物と細胞培養物の両者を意味する。 特に、増幅のような目的で組換えDNAを大量に製造す
ることを望むときには、この異種DNAは細菌性DNAであり
うる。この点に関して、好ましい異種DNA大腸菌(E.col
i)のDNA又は大腸菌(E.coli)と適合性のDNAからな
る。例えば、関与する細胞内で複製しうることが知られ
ているウィルス性又はプラスミドDNAのような、関与す
る細胞のDNAと別の起源のDNA又は同じ起源のDNAであり
得る。 好ましい組換えDNAは植物細胞と適合性の異種DNA、特
にTi−プラスミドDNAを含んでいる。 特に好ましい組換え体は、植物細胞、特にGS阻害剤の
不活化が付与されるべき植物細胞により認識されるプロ
モーターのコントロール下でGS阻害剤を不活化するDNA
を含有するものである。 本発明の好適な組換え体は、さらに、特にプロモータ
ー要素を含む調節要素に関して、異種DNAと適合性の細
胞環境下で前記GS−阻害剤−不活化DNAが転写及び翻訳
されるように配置された前記GS阻害剤−不活化DNAを含
有している改変ベクター、特にプラスミドに関する。有
利なベクターは、外来細胞中、特にそのゲノムDNA中に
安定的に前記GS阻害剤−不活化DNAを取り込むように遺
伝子操作されたものである。好ましい改変ベクターは、
植物細胞を安定に形質転換しえ、対応の細胞にGS阻害剤
不活化能を付与するものである。 後述するように、本発明で使用するStreptomyces hyg
roscopicus株のBialaphos−耐性−遺伝子の開始コドン
はGTGコドンであると思われる。しかし、好ましい組換
えDNA又はベクター中では、その開始コドンGTGをATG開
始コドンで置換することによりBialaphos−耐性遺伝子
が改変されている。このATGは植物細胞内で翻訳を開始
させることができる。 後述の実施例で使用した植物のプロモーター配列は35
Sカリフラワーモザイクウィルスのプロモーターで構成
した。関与する植物種との関係でより適切であるときに
は、当業者は他の植物プロモーターを選択しうることは
言うまでもない。 本発明のもう1つの別の好ましい実施態様によると、
特にBialaphos−耐性DNAがコードする酵素を葉緑体内に
運搬することを所望するときには、異種DNAフラグメン
トを、トランジットペプチドをコードする遺伝子又はDN
Aフラグメントに融合し、次にこの後者のフラグメント
をGS阻害剤不活化遺伝子と選択した植物プロモーターと
の間に挿入する。 このような構築を達成しうる方法については次のもの
を参照しえ、これらはすべて引用によって本明細書に取
り入れる:英国特許出願第8432757号(1984年12月28日
出願)及び第85 00336号(1985年1月7日願)、並びに
米国(NO.755,173、1985年7月15日出願)、欧州特許庁
(No.85 402596.2、1985年12月20日出願)、日本(No.2
99730、1985年12月27日出願)、イスラエル(No.7746
6、1985年12月27日出願)及びオーストラリア(No.5 16
5 485、1985年12月24日出願)に出願した関連出願。 科学文献、特に次の論文: −VAN DEN BROECK他、1985,Nature,313,358−363; −SCHREIER他、Embo.J.,Vol.4,n゜1,25−32.も参照しう
る。 これらの論文も引用によって本明細書に取り入れる。 記録するために、「トランジット(運搬)ペプチド」
という表現は、植物細胞の核DNAがコードする前駆体蛋
白質中で葉緑体蛋白質サブユニット又は葉緑体蛋白質と
通常結合しているポリペプチドフラグメントを指すこと
をここで思い出そう。次に、葉緑体蛋白質を葉緑体内に
輸送する過程で、トランジットペプチドは葉緑体蛋白質
から分離され、又は蛋白質加水分解によって除去され
る。好適なトランジットペプチドの例はリブロース−1,
5−二リン酸(RuBP)カルボキシラーゼの小さなサブユ
ニットと結合したもの又はクロロフィルa/b結合蛋白質
と結合したものである。 従って、後記定義の方法に使用するに適したDNAフラ
グメントやDNA組換え体が提供される。 より特定的は、本発明は植物及び該植物の生殖物質中
に安定に組込まれ、かつ該植物又は生殖物質中でグルタ
ミン合成酵素阻害剤の作用を不活化又は中和しうる蛋白
質の形で発現され得る異種遺伝物質を含む該植物及び該
植物の生殖物質を製造する方法として一般的に定義され
うる方法にも関し、この方法は前記阻害又は中和活性を
発現しえない植物細胞又は植物組織の出発物質から前記
異種遺伝物質を含有する植物細胞又は植物組織を製造す
る非生物学的ステップと、前記遺伝物質を含む前記植物
細胞又は植物組織から植物又は該植物の生殖物質又はそ
の両者を再生させ、適宜、前記植物又は生殖物質又はそ
の両者を生物学的に複製することからなり、前記異種遺
伝物質を含有する前記植物細胞又は植物組織を製造する
非生物学的方法は、前記蛋白質をコードするヌクレオチ
ド配列と、前記植物細胞又は植物組織内で前記ヌクレオ
チド配列を発現させうるものの中から選択した調節要素
とを含有するDNA組換え体で前記出発物質の植物細胞又
は植物組織を形質転換し、前記植物細胞及び組織並びに
植物及び世代を通してそこから得られる生殖物質中に前
記ヌクレオチド配列を安定に組込ませることにより成
る。 本発明はBialaphos−耐性DNA、又はより一般的にはGS
−阻害剤−不活化DNAを含有する細胞培養物にも関し、
この細胞培養物は、非形質転換細胞を破壊するような量
でGS阻害剤含有組成物を含有する培地中で培養するとき
にこのような組成物に対して耐性であるという特性を有
している。 本発明はより特定的にBialaphos−耐性DNAが安定的に
組込まれ、植物細胞の連続する世代に亘り存続する植物
細胞又は細胞培養物に係る。従って、GS阻害剤、より特
定的にはBialaphos又はPPTに対する耐性は本発明の植物
細胞を特性化する一つの手段とも考えられる。 適宜、前記植物細胞から得たゲノムDNAと、GS阻害剤
不活化DNA配列を含有するプローブとの間のハイブリダ
イゼーション実験を利用することもできる。 より一般的には、本発明はその各々のゲノムDNAに安
定的に組込まれた外来性又は異種DNAフラグメントを含
有する植物と同様に植物細胞、生殖物質、特に種子に関
し、ここで、前記フラグメントはこのような植物細胞、
生殖物質、種子及び植物の世代を通して伝達され、前記
DNAフラグメントはGS阻害剤、特にBialaphos及びPPTを
不活性又は中和しうる非種特異的酵素活性を誘導する蛋
白質をコードしており、より特定的には前記植物細胞、
生殖物質、種子及び植物にGS阻害剤耐性という対応の非
種特異的表現型を付与する。 「非種特異的(non−variety−specific)」酵素活性
又は表現型は、後述の実施例で非限定的に例示されるよ
うにそれらが特定の植物遺伝子又は種に特徴的なもので
はないという事実に関連している。それらは、通常は互
いに関係のない種に属する植物に適応でき、前記植物材
料に異種DNA、例えば細菌性DNA又は化学合成したDNAを
取り込ませることからなる本質的に非生物学的な方法に
より前記植物材料内で誘導される。この異種DNAは前記
植物材料内には通常はなく又は天然の繁殖・生殖過程で
はそれらに取り込まれ得ないものであり、それにもかか
わらずそれらに対し共通の表現型(例えば除草剤耐性)
を付与するものである。 本発明は畑で栽培する植物種を雑草から保護する方法
に使用するのに特に有利であり、この方法は雑草を撲滅
するのに有効な量の例えばBialaphos又はPPTのような除
草剤で土地を処理するステップからなり、ここで、栽培
する植物種は前記GS阻害剤を中和又は不活化しうる酵素
活性を有する蛋白質をコードするDNAフラグメントをそ
のゲノム内に含有している。 例示のためだけであるが、上記の方法に使用する有効
量は約0.4〜約1.6kg/haのBialaphos又はPPTである。 次に、例示のためだけに、American Type Culture Co
llectionから寄託番号ATCC 21705として入手しうるStre
ptomyces hygroscopicus株から上記の好ましいDNAフラ
グメントをどのようにして単離したのかを開示する。 以下の開示はPPT核を有する化合物を酸生する他の菌
株に適用しうる手法も提供する。 最後に、形質転換した細胞へのBialaphos及びPPTを不
活性化する能力を付与する好ましいDNAフラグメントの
挿入について記載する。従って、上記の手法で単離し
た、以後Bialaphos−耐性遺伝子又は「sfr」遺伝子と表
わすBialaphos不活性DNA−フラグメントをプラスミドに
挿入し、それを用いて、植物細胞を形質転換し、それら
にBialaphos耐性を付与しうるということも非限定的に
説明するための例示として単に示したものである。 次の開示は図面を参照して行う。 図中、 第1図は、Bialaphos耐性をコードするStreptomyces
hygroscopicus DNAフラグメントを含有するプラスミド
の制限地図であり、このプラスミドは以下pBG1と表わす
がこれは以下の開示に従って構築した。 第2図は、pBG1から得、他のプラスミド(pBG39)内
でサブクローニングした、耐性遺伝子を含有する小さな
方のフラグメントのヌクレオチド配列を示す。 第3図は、例として示した一連のプラスミドの構築を
示す。これらのプラスミドはそこにBialaphos−耐性遺
伝子すなわち「sfr」遺伝子を挿入する適切な適応手段
を提供することを目的とする。 第4A図及び第4B図は例として示した一連のプラスミド
の構築を示す。これらのプラスミドはそれらの制御下に
プラスミド内に挿入された外来遺伝子の転写及び発現を
開始しうる適切な植物細胞プロモーター配列を含有して
いる。 第5A図は第3図で得たプラスミドのヌクレオチド配列
の決定したフラグメントを示す。 第5B図は、pBG39からたFok I/Bgl IIフラグメントか
らのBialaphos−耐性遺伝子の最初のコドンの再構築
と、天然の「sfr」遺伝子のGTG開始コドンのATG開始コ
ドンでの置換絵を示す。 第5C図は完全な「sfr」遺伝子すなわちその最後のコ
ドンの再構築と、第4A図及び第4B図で得たプラスミド内
へのその挿入を示す。 第6A図は植物細胞プロモーターの制御下に置かれた
「sfr」遺伝子含有発現ベクターを示す。 第6B図は、いくつかのヌクレオチドを置換することに
よって、第6A図に示したものから得た他の発現ベクター
を示す。 第7図はプロモーター領域の制御下でかつトランジッ
トペプチド配列の下流に「sfr」遺伝子を挿入するため
の、所与の植物細胞遺伝子のトランジットペプチド配列
とプロモーター領域を含有するプラスミドを最終的に製
造するための、例として示した一連のプラスミドの構築
を示す。 第8図〜第11図については後述する。 次の実験はStreptomycesへのクローニングの標準手法
により、S.hygroscopicusからBialaphos耐性遺伝子を単
離するために行った。 文献6に記載の方法に従い、2.5μgのS.hygroscopic
usのゲノムDNAと0.5μgのStreptomycesベクターpIJ61
をPst Iで開裂した。ベクターフラグメントとゲノムフ
ラグメントを混合し、全DNA濃度40μg ml-1でT4DNAリガ
ーゼにより連結した(66mMのTris−HCl(pH7.5),1mMの
EDTA,10mMのMgCl2,10mMの2−メルカプトエタノール及
び0.1mMのATPを含有する連結塩中で10℃で4時間、次
に、4℃で72時間)。下記のように、ポリエチレングリ
コール(PEG)を介した形質転換操作により3×109のS.
lividans株66のプロトプラストに上記連結産物を導入し
た。これらのプロトプラストは、0.5%のDifco酵母抽出
物を含有するR2観点(R2 YE)の20枚のプレート上で再
生させると、5×107個のコロニーと4×104個のポック
を生じた。本明細書中に開示する実験で使用した種々の
培地やバッファの製法及び組成は下記に示す。これらの
ローン(lawn)を50μg ml-1のBialaphosを含有する最
少培地プレート上でレプリカ培養すると、形質転換体10
4個当り1つの頻度で薬剤耐性コロニーが出現した。薬
剤耐性コロニーを精製した後、これらのプラスミドDNA
を単離し、S.lividansプロトプラストを再度形質転換す
るために使用した。非選択的に再生した後Bialaphos含
有培地にレプリカ培養するとポックとBialaphos耐性の
成長との間は100%の相関を示した。数個の耐性クロー
ンの組換えプラスミドは全て1.7KbのPst I挿入物を含有
していた(第1図参照)。 除草剤耐性遺伝子のサブクローニング 次に、プラスミドpBG 20を生成させるために高いコピ
ー数のstreptomyceteベクターpIJ 385に1.7KbのPst I挿
入物をサブクローンした。pBG 20を含有するS.lividans
株はBialaphosに対する耐性が500倍以上高かった。S.li
vidansの増殖は通常Bialaphosを1μg/ml含有する最少
培地で阻害されるが、pGB 20を含有する形質転換体の増
殖はBialaphosを500μg/ml含有する培地中でも顕著には
阻害されなかった。また、Pst Iフラグメントをプラス
ミドpBR322のPst I部位に両方の配向でサブクローン
し、その配向に応じてプラスミドpBG 1及びpBG 2を生成
した。最少M9培地上でのテストではpBG 1又はpBG 2を含
有する大腸菌(E.coli)E8767は、Bialaphosに対し耐性
であった。 ±1.65Kb Pst I−BamH IフラグメントをpBG1からプラ
スミドpUC 19にサブクローンしてプラスミドpBG 39を製
造し、E.coli W3110,C600及びJM83をBialaphos耐性と
した。 S.lividans抽出物由来のin vitroの結合(coupled)
転写−翻訳システム(文献5)使用し、pBG 39内の1.65
Kb Pst I−BamH Iフラグメントは22Kd蛋白質の合成を指
令することが示された。この1.65Kb挿入物は22Kd蛋白質
をコードするフラグメントを含有しており、以降「sf
r」遺伝子と呼ぶ。 遺伝子の微細な地図及び配列の決定 625bp Sau 3AフラグメントをpBG 39からpUC 19にサ
ブクローンし、E.coli W3110宿主をBialaphos耐性にし
た。得られたクローンは配向によりpBG 93とpBG 94であ
った。 Sua 3Aフラグメント中の遺伝子の配向は、pBG 93中の
pUC 19 lacプロモーターからIPTGによりBialaphos耐性
が誘導されえたことを示す実験により示された。IPTG
(0.5mM)が存在すると、Bialaphos含有M9培地上でのpB
G93/W3110の耐性は5から50μg/mlへと増加した。pBG 9
3のないW3110宿主はBialaphos 5μg/mlを含有するM9培
地上では増殖しなかった。これらの実験は、Sau 3Aフラ
グメントは活性を失うことなくサブクローンされうるこ
とを示した。これらの実験は、添付第2図に示すように
適当な配向も提供した。これらのクローンがコードする
蛋白質は、S.lividansの抽出物由来の結合転写−翻訳シ
ステム(文献7)を使用して検出した。Sau 3Aフラグメ
ントの配向に応じ、異なる大きさの翻訳産物、すなわち
pBG 94については22Kd,pBG 93については±28Kdが観察
された。このことは、Sau 3Aフラグメントは完全な耐性
遺伝子を含有しないことと、pUC 19配列の翻訳の結果と
してのポリペプチド配列を含む融合蛋白質が形成される
ことを示した。 大量の蛋白質を得るため、pBG 1からの1.7Kb Pst Iフ
ラグメントを高いコピー数のStreptomyceteレプリコンp
IJ 385にクローン化した。得られたプラスミドpBG 20を
使用してS.hygroscopicus形質転換した。このプラスミ
ドを含む形質転換体は5倍以上のPPIアセチル化活性を
有し、又、ドデシル硫酸ナトリウムゲル(SDSゲル)上
で大量の22Kd蛋白質を有していた。さらに、Bialaphos
の産生が始まったときに、アセチルトランスフェラーゼ
と22Kd蛋白質の両者が出現した。in vitroのデータ、合
成速度(kinetics)、及びpBG 20形質転換体に伴う増幅
された発現の相関は、この22Kdバンドが遺伝子産物であ
ることを強く示唆した。 625bpのSau 3Aフラグメントの完全ヌクレオチド配列
をそのフランキング(flanking)配列と共に決定した。
コンピューターでの分解により、Sau 3Aフラグメントの
全長に亘り読み取り枠(open reading frame)が存在す
ることが明らかになった。 sfr遺伝子産物の特性化 「sfr」遺伝子の読み取り枠が実際にBialaphos耐性酵
素をコードしていることを決定するために一連の実験を
実施した。耐性遺伝子の5′末端を決定するために外酵
素のNH2末端配列を決定した。前記の配列を決定するた
めに使用した手法の詳細に関しては、J.VANDEKERCKHOVE
(Eur.J.Bioc.152,p9〜19,1985)が開発した方法と、18
85年10月1日出願の仏国特許出願No.85 14579及び1985
年9月2日出願の仏国特許出願No.85 13046を引用する
が、これら全ては引用によって本明細書に含まれる。 この手法により、登録商標POLYBRENEとして市販のポ
リ四級アミンでコートしたグラスファイバーシート上
に、ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアクリルア
ミドゲルで予め分離した核酸と蛋白質を固定化できる。
本質的にニトロセルロース膜上への蛋白質ブロッティン
グによって移す(文献8)。このことによりアミノ酸組
成と、固定化した蛋白質の部分配列が決定される。S.hy
groscopicus pBG 20により産生された固定化した22Kd蛋
白質を含有するシートの部分を切り取り、このディスク
をガス相シーケンサー(sequenator)の反応室に載置
し、グラスファイバーに結合した22Kd蛋白質をEdman分
解操作にかけて、次のアミノ酸配列:Pro−Glu−Arg−Ar
g−Pro−Ala−Asp−Ile−Arg−Argを得た。 この配列は、625bpのSau 3Aフラグメントの読み取り
枠から推定されたアミノ酸配列と一致した。これはコド
ン3から12までの範囲に対応した。 従って、22Kd蛋白質のNH2−末端はこの配列の上流に
あった。実際の蛋白質の翻訳はアミノ酸2個分前のGTG
開始コドンで開始されるようであった。GTGはストレプ
トミセスで開始コドンとしてしばしば使用され、メチオ
ニンとして翻訳される。GTG開始コドンから翻訳される
蛋白質は、183個のアミノ酸長であり、分子量20550を有
するであろう。これは観察された約22000の分子量と良
く一致した。 さらに、終結コドンTGAはSau 3A部位のすぐ下流に位
置した。BamH I部位で消火したpUC 19への625bp Sau 3A
フラグメントのクローニングでは終結コドンは再構築さ
れなかった。このことにより、in vitroの転写−翻訳
分析で観察された融合蛋白質が説明された。 PPT−耐性の機構 耐性遺伝子そしてその遺伝子産物の最初の表現型と物
理的特性のいくつかを定義した後、耐性を付与する機構
を理解するために一連の実験を行った。上述のように、
PPTはグルタミン合成酵素(GS)を阻害するBialaphosの
部分であり、N−アセチルPPTは阻害剤ではない。標準
アッセイ(文献9)を使用すると、S.hygroscopicus AT
CC 21705誘導体はS.lividnas内に見られないPPTアセチ
ルトランスフェラーゼを含有することが示された。活性
はBialaphosトリペプチドをアセチル化しない。pBG 20
又はpBG16(もう1つのstreptomyceteベクターpIJ 680
内でクローン化した625 bp Sau 3Aフラグメントを含有
するプラスミド)内にクローン化した耐性遺伝子を有す
るS.lividansも、PPTをアセチル化しBialaphosをアセチ
ル化しえない活性を有していた。pBG 20/S.lividansの
抽出物により製造されたPPT由来の反応産物を単離し
て、それが実際アセチル−PPTであることを確認した。
質量分光分析により、分子量はPPTに対して1つのアセ
チル基と等しい分だけ増加していることが示された。従
って、625bpのSau 3AフラグメントはPPTアセチルトラン
スフェラーゼをコードする配列を含有すると結論した。 上記開示の手法に使用した実験条件及び試薬は次の通
りであった: 上記で使用した培地及びバッファの製法及び組成 1゜P培地:庶糖10.3g,K2SO40.025g,MgCl2・6H2O0.20
3g及び微量元素溶液0.2mlを80mlの蒸留水に溶解し、オ
ートクレーブにかける。次いで、1mlのKH2PO4(0.5
%),10mlのCaCl2・2H2O(3.68%)及び10mlのTESバッ
ファ(0.25M,pH7.2)を順次加える。微量元素溶液(1
当り):ZnCl2,40mg;FeCl3・6H2O,200mg;CuCl2・2H2O,
10mg;MnCl2・4H2O,10mg;Na2B4O7・10H2O,10mg;(NH4)6
Mo7O24・4H2O,10mg。 2゜R2YE:庶糖10.3g,K2SO40.025g,MgCl2・6H2O1.012g,
グルコース1g,Difcoカザミノ酸0.01g及びDifco寒天2.2g
を80mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブにかける。微
量元素溶液0.2ml,KH2PO4(0.5%)1ml,CaCl2・2H2O(3.
68%)8.02ml,L−プロリン(20%)1.5ml,TESバッファ
(0.25M,pH7.2)10ml,NaOH(1M)0.5ml,酵母抽出物(10
%)5mlを順次加える。 3゜TE:10mM TRIS HCl,1mM EDTA,pH8.0 4゜YEME:Difco酵母抽出液(0.3%),Difcoペプトン
(0.5%),オキソイドモルト抽出物(0.3%),グルコ
ース(1%)。 S.lividansプロトプラストの形質転換 1. 250mlのバッフル付きのフラスコ中で、YEME25ml,34
%庶糖,0.005H MgCl2,0.5%グリシンからなる培養物を3
0〜36時間遠心する。 2. ペレットを10.3%庶糖中に懸濁し、遠心する。この
洗浄をもう1回繰り返す。 3. 菌糸体を4mlのリゾチーム溶液(MgCl2及びCaCl2の
濃度を0.0025Mに減少させたP培地中1mg/ml)に懸濁
し、30℃で15〜60分間インキュベートする。 4. 5mlのピペットで3回ピペッティッングすることに
より溶液を混合し、さらに15分間インキュベートする。 5.P培地(5ml)を加え、ステップ4と同様にピペッティ
ングして混合する。 6. 綿ウールを通して溶液を過し、ベンチ遠心(800
×G)7分間でゆっくりとプロトプラストを沈澱させ
る。 7. プロトプラストを4mlのP培地に懸濁し、再度遠心
する。 8. ステップ7を繰り返し、上清を捨てた後に残ったP
培地の滴にプロトプラストを懸濁する(形質転換用)。 9. 20μ未満のTE中のDNAを加える。 10. 直ちに0.5mlのPEG1000溶液(2.5gPEGを、2.5%庶
糖7.5ml,0.0014 K2SO4,0.1H CaCl2,0.05M TRIS−マレイ
ン酸,pH8.0に溶解し、微量元素を加えたもの)を加え、
成分を混合するために1回ピペッティングする。 11. 60秒後に、5mlのP培地を加え、ゆっくり遠心して
プロトプラストを沈降させる。 12. ペレットをP培地(1ml)に懸濁させる。 13. 0.1mlをR2YEプレート(例えば層流キャビネット中
で新鮮重量の85%まで乾燥した形質転換用プレート)に
載せる。 14. 30℃でインキュベートする。 A−「sfr」遺伝子カセットの構築 植物の発現ベクター内でクローニングさせるために
「sfr」遺伝子カセットを構築した。 「sfr」遺伝子フラグメントを含有するプラスミドpGB
39からFok I−Bgl IIフラグメントを単離すると、開始
コドンを含む最初の数コドンと終結コドンを含む最後の
数コドンが消失した。 「sfr」遺伝子のこのフラグメントは適当なアミノ酸
をコードする合成オリゴヌクレオチドによりin vitrod
で再構築することができた。 相補的な合成オリゴヌクレオチドは5′−CATGAGCCCA
GAAC及び3′−TCGGGTCTTGCTGCであった。 このような合成オリゴヌクレオチドを使用することに
より、「sfr」遺伝子の5′末端を再形成でき、GTG開始
コドンは、植物細胞によって良く翻訳されるコドン、特
にATGコドンで置換され得た。 次に、「sfr」遺伝子と結合したオリゴヌクレオチド
を含有するDNAフラグメントを適当なプラスミドに挿入
した。このプラスミドは所与のヌクレオチド配列を含有
しており、以後「アダプター」フラグメントで示す。 このアダプターフラグメントは: −「sfr」遺伝子の最後の数コドンを再形成しうるTGA終
結コドン; −合成オリゴヌクレオチドで部分的に再形成した「sf
r」遺伝子を含むヌクレオチド配列のフラグメントを挿
入させうる適当な制限部位、この挿入により完全な(in
fact)「sfr」遺伝子を再構築した; −「sfr」遺伝子全体を単離するための適当な制限部位
からなっていた。 次に、適当な植物のプロモーター配列を有するもう1
つのプラスミドに「sfr」遺伝子を挿入した。植物のプ
ロモーター配列はカリフラワーモザイクウィルスのプロ
モーター配列(p35S)からなった。もちろん本発明はこ
の特定のプロモーターの使用に限定されるものではな
い。他の配列、例えば後記するTR1′−2′プロモータ
ー領域及びArabidopsis thalianaからのRubisco小サブ
ユニット遺伝子のプロモーターフラグメントも植物に適
するプロモーターとして選択し得た。 1゜プラスミドpLK 56.2の構築(第3図) プラスミドpLK 56.2の構築は次の一連の制限部位:Sma
I,BamH I,Nco I,Kpn I,Bol II,Mlu I,BamH I,Hind III
及びXba Iを含む好適なアダプターを得ることを目的と
した。 この構築に使用した出発プラスミドpLK 56,pJB 64及
びpLK 33はBOTTERMAN(文献11)が開示したものであっ
た。 本明細書中以下に記載のDNAフラグメントを単離し、
低融点アガロース(LGA)から分離した。 酵素BamH I及びNde IでプラスミドpLK 56を開裂し
た。プラスミドpJB 64から得たNco I−Nde Iフラグメン
ト(図面中、破線の弧「a」で示した)でpLK 56中の
「b」で示すBamH I−Nde Iフラグメントを置換した。
E.coliのDNAポリメラーゼI(クレノーフラグメント)
デBamH IとNco Iのはみ出した末端を充填(fill in)し
た後、連結できた。 T4DNAリガーゼにより特に再環化を行った。新しいプ
ラスミドpLK 56.3が得られた。 このプラスミドを酵素Xba IとPst Iで開裂した。 pLK 33(c)のBamH I−Pst Iフラグメント(第3
図)の各々の末端をクレノー(Klenow)フラグメントで
補修してから、pLK 56.3のXba I−Pst Iフラグメント
(d)と置換した。 T4DNAリガーゼで再環化した後、得られたプラスミドp
LK 56.2は以後の「sfr」遺伝子の挿入のために必要な制
限部位を含むヌクレオチド配列を含有した。 2゜プラスミドpGSH 150(第4A図)の構築 最後に述べた構築と平行して、植物細胞のポリメラー
ゼが識別するプロモーター配列を含有し、転写方向でこ
のプロモーター配列の下流に好適な制限部位を含むプラ
スミドが製造された。この制限部位は、次にpLK 56.2か
ら得られる「sfr」遺伝子を植物プロモーターの制御下
で挿入し得るようにするためのものである。 プラスミドpGV 825はBEBLAERE他(文献10)に記載さ
れている。プラスミドpJB 63はBOTTERMAN(文献11)か
らのものである。 pGV 825をPvu IIで直線化し、T4DNAリガーゼで再環化
させると、(e)で示す内部Pvu IIフラグメントが欠落
した(プラスミドpGV 956)。 次にBamH I及びBgl IIでpGV 956を開裂した。 pJB 63から得たBamH I−Bgl IIフラグメント(f)を
子牛小腸ホスファターゼ(CIP)で脱リン酸化し、pGV 9
56のBamH I−Bgl IIフラグメンノに代えて挿入した。 T4DNAリガーゼで再環化させ、プラスミドpGV 1500を
得た。 プラスミドpGSH 50から得たEcoR −Hind IIIフラグメ
ントを精製した。プラスミドpGSH 50はVELTEN他(文献1
3)に記載の2重のTR1′−2′プロモーターフラグメン
トを有していた。このフラグメントをpGV 1500に挿入
し、Hpa I及びHind IIIで消化するとpGSH 150が得られ
た。 このプラスミドはT−DNA転写体7の3′末端の前の
プロモーターフラグメント及びクローニング用のBamH I
−Cla I部位を含有している。 3゜プラスミドpGSJ 260の構築(第4B図) CP3はpBR 322由来のプラスミドであり、BamH Iフラグ
メント内にカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモ
ーター領域を含んでいる。 pGSH 150をBamH IとBgl IIで切った。 p35Sプロモーターのヌクレオチド配列を含有するCP3
のBamH I−Bgl IIフラグメント(h)でpGSH 150のBamH
I−Bgl IIフラグメント(i)を置換してプラスミドpG
SJ 250を形成した。次にBgl II制限部位でpGSJ 250を開
環した。 mGV2(文献12)から得たBamH IフラグメントをpGSJ 2
50のBgl II部位に挿入してプラスミドpGSJ 260を形成し
た。 しかしながら、pLK 56.2から得られる「sfr」遺伝子
をプラスミドpGSJ 260に挿入する前に、より実際的な方
法で挿入させるためにpLK 56.2更に改変することが依然
望ましかった。従って、pLK 56.2はpGSR1を得るために
下記のようにさらに改変した。 プラスミドpGSJ 260から出発して、植物細胞の形質転
換のために2つのプラスミドが構築された: −植物細胞の細胞質内で「sfr」遺伝子を発現させる第
1のプラスミド, −植物細胞の葉緑体にBialaphos−耐性酵素を運搬する
よう改変した第2のプラスミド。 第1の場合:植物細胞の細胞質内で「sfr」遺伝子を発
現しうるプラスミド 植物の発現ベクター(pGSR2)内のsfr遺伝子カセットの
クローニング(第5図) 第5A図に、pLK 56.2のアダプターのヌクレオチド配列
を示す。特にBamH I,Nco I,Bol II制限部位の位置を示
す。 このアダプターフラグメントを酵素Nco IとBgl IIに
よって開裂した。 第5B図はFok I−Bgl IIフラグメント(j)を示して
いる。これはpBG 39より得られた。これら2つの制限部
位の位置は第2図に示す。 合成オリゴヌクレオチドを使用して、「sfr」遺伝子
の最初の数コドン、特に遺伝子の5′末端を再形成し
た。この5′末端では最初のGTGコドンがATG開始コドン
に置換されていた。 次に合成オリゴヌクレオチドで完結したこのFok I−B
gl IIフラグメントをpLK 56.2中のアダプターのNco I−
Bgl IIフラグメントと置換した。T4DNAリガーゼによる
再環化後に、遺伝子の3′末端もこのようにして再形成
した。得られたプラスミドpGSR1はこのようにそのアダ
プター内に挿入された完全な「sfr」遺伝子を含有して
いた。 次にプラスミドpGSJ 260をBamH Iで開裂し(第5C
図)、全「sfr」遺伝子を含有するpGSR1から得たBamH I
フラグメントをpGSJ 260に挿入した。 得られたプラスミドpGR 2(第6A図参照)はpBR 322レ
プリコン、細菌のストレプトマイシン耐性遺伝子(SDM
−SP−AD−トランスフェラーゼ)及び, −T−DNAの境界(border)フラグメント: −植物細胞内で優性選択可能なマーカーを提供するキメ
ラカナマイシン遺伝子;及び −キメラ「sfr」遺伝子 からなる遺伝子工学で処理したT−DNAを含有してい
た。 キメラ「sfr」遺伝子は −カリフラワーモザイクウィルスのプロモーター領域
(p35S); −第5図に記載の「sfr」遺伝子カセット; −T−DNA転写体7のポリアデニル化信号を含む3′の
未翻訳領域 からなっていた。 DEBLAERE他(文献10)が記載した手順に従ってpGSR 2
をAgrobacterium tumefaciens受容体C58ClRifR(pGV226
0)に導入した。 N.tabacum SR1植物にキメラ「sfr」遺伝子を導入する
ためにこの株を使用した。 pGSR 2由来の2つの変異プラスミド、すなわちpGSFR
280とpGSFR 281とを構築した。それらは転写開始部位に
続く非翻訳配列が異なっている。pGSR 2ではこのフラグ
メントは次の配列:GAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCGGATCCA
TGからなり、一方、pGRS 280ではGAGGACACGCTGAAATCACC
AGTCTCTCTACAAATCGATCCATGからなり、pGSFR 281ではGAG
GACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTACAAATCGATGからなるが、
ここでATGコドンは「sfr」遺伝子の開始コドンである。
「sfr」遺伝子は又プラスミドpGSH 150のTR1′−2′プ
ロモーターに融合すると(第4A図)、pGSFR 160とpGSFR
161となる(第6B図)。これらのプラスミドはpTR 2「s
fr」遺伝子配座で少し差があり、pGSFR 161(配列につ
いては文献13参照)では「sfr」遺伝子は内因性遺伝子
2′ATGに正確に融合し、一方、pGSFR 160では4つの過
剰な塩基対(ATCC)がATGの直前に存在する。この他の
点では、p65FR 161とp65FR 160は完全に同じである。 共組込み(cointegration)により全てのプラスミド
をAgrobateriumのアクセプタ−プラスミドpGV 2260に導
入すると、各々プラスミドpGSFR 1280,pGSFR 1281,pGSF
R 1160及びpGSFR 1161が得られる。 第2の場合:トランジッドペプチトをコードするDNA配
列の下流に「sfr」遺伝子を含有し、「sfr」遺伝子発現
産物を次いで植物細胞の葉緑体内に輸送させるに適する
プラスミドの構築 もう1組の実験では、「sfr」遺伝子を含有するヌク
レオチド配列を、トランジットペプチドをコードするDN
A配列に融合し、それを葉緑体へ運搬させ得るようにし
た。 「sfr」遺伝子のフラグメントは上記のアダプターフ
ラグメントから単離し、トランジットペプチドに融合し
た。合成オリゴヌクレオチドを使用し、完全な「sfr」
遺伝子を再構築し、トランジットペプチドに融合した。 トランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含有するプラスミド(下記のプラスミドpATS3)はそ
のプロモーター配列も含んでいた。 トランジットペプチドをコードするDNA配列に融合した
「sfr」遺伝子を含有するプラスミドpGSR4の構築(第7
図) プラスミドpLK57はBOTTERMAN(文献11)からのもので
ある。プラスミドpATS3は、遺伝子のトランジットペプ
チドヌクレオチド配列とプロモーター領域を含むArabid
opsis thalianaからの2Kb EcoR IゲノムDNAフラグメン
トを含んでいるpUC19クローンであり、その発現はリブ
ロース二リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニット
(ssu)である。A.thalianaの小さいサブユニットを150
0bp EocR I−Sph Iフラグメントとして単離した。Sph I
開裂部位は、成熟ssu蛋白質のコード領域が正に始まる
部位にある。 プラスミドpLK57とpATS3をEcoR IとSph Iで開環し
た。T4DNAリガーゼで再環化したのち、トランジットペ
プチド(Tp)をコードする配列とそのプロモーター領域
(Pssu)を含有する組換えプラスミドpLKAB1を得た。 シグナルペプチドの開裂部位に「sfr」遺伝子を正確
に融合するために、先ずN−末端遺伝子配列を改変し
た。「sfr」遺伝子とN−末端遺伝子の融合体はその酵
素活性を保持することが観察されたので、第2コドン
(AGC)をGACに改変し、ATG開始部位と重なっているNco
I部位を得た。新しいプラスミドpGSSFR2を得た。これ
は、上記の変異の点だけがpGSR1と異なる(第5B図)。p
GSFR2から得たNco I−BamH Iフラグメントをトランジッ
トペプチド配列のSph I末端に融合した。同時に、「sf
r」遺伝子フラグメントをssu遺伝子のATGイニシエータ
ーに正確に融合した(図示せず)。 「sfr」遺伝子の種々の植物種への導入 キメラ遺伝子を含有する適当なベクターで植物を形質
転換したときにそのキメラ遺伝子の発現により植物中で
誘導されたBialaphos耐性を次のように示した。DEBLAER
Eら、Nucl.Acid.Res.,13,p1477,1985に記載の手順に従
って、Agrobacterium株のC58C1RifR(pGV2260)内に動
態化(mobilization)により「sfr」遺伝子を含有する
組換えプラスミドを別々に導入した。ハイブリッドTiプ
ラスミドを含有する組換え株を形成した。本質的にHORS
Hら,Science,vol.227,1985に記載の方法により、これら
の株を用いて種々の植物種の葉に感染させそれを形質転
換した。1例として種々の植物種の形質転換操作を下記
に示す。 1.Nicotiana tabacumの葉のデイスクの形質転換 使用培地を次に示す: A1MS塩/2 +1%庶糖 0.8%寒天 pH 5.7 A10B5−B培地 +250mg/ NH4NO3 750mg/ CaCl22H2O 0.5g/ 2−(N−モルホリノ)エタ ンスルホン酸(MES) pH 5.7 30g/庶糖 A11B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 2%グルコース 0.8%寒天 40mg/アデニン +1mg/ 6−ベンジルアミノプリ ン(BAP) 0.1mg/インドール−3−酢酸(IA A) 500mg/クラホラン(Claforan) A12B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 2%グルコース 0.8%寒天 40mg/アデニン +1mg/ BAP 200mg/クラホラン A13MS塩/2 +3%庶糖 0.5g/ MES pH 5.7 0.7%寒天 200mg/クラホラン 細菌培地=min A:(Miller 1972)60mM K2HPO4,3H2O, 33mM KH2PO4: 7.5mM(NH4)2SO4 1.7Mクエン酸3ナトリウム; 1mM MgSO4; 2g/グルコース; 50mg/ビタミンB1 −植物材料: Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1 培地A1で6〜8週継代培養後に植物を使用する。 −感染: −葉から中央脈と端を除去する。 −残りの部分を約0.25cm2の切片に切り、感染培地A10内
に置く(10mlA10を含有する9cmのペトリ皿に約12切
片)。 −次にmin A培地中で増殖させたAgrobacterium株の後期
対数(late log)培養物(25μ/ペトリ皿当り)で切
片を感染させる。 −低い光度で2〜3日間ペトリ皿をインキュベートす
る。 −2〜3日後に培地を除去し、クラロファン(clarofa
n)500mg/を含有する20mlの培地A10で置き換える。 −選択と発芽の誘導 −選択試薬: 100mg/のカナマイシン及び 10〜100mg/のホスフィノトリシン を含有する培地A11上に葉のディスクを置く。 −毎週、葉のディスクを新しい培地に移す。 −3〜4週後に再生カルスが生ずる。それらを分離し、
選択に使用したと同じ濃度の選択試薬を含有する培地A
12上に置く。 −発根(rooting) −2〜3週後にカルスは芽でおおわれ、これは単離して
発根培地A13に移すことができる(選択なし)。 −発根に1〜2週間かかる −さらに2〜3週後に、これらの植物を培地A1上で増殖
する。 2.Solanum tuberosum(じゃかいも)の塊茎ディスクの
感染 使用培地を下記に示す: C1B5−培地 +250mg/ NH4NO3 300mg/ (CaCH2PO4)2 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ポリビニルピロリドン(PVP) 40g/マンニトール(=0.22M) 0.8%寒天 40mg/アデニン C2B5−培地 +250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH5.7 0.5g/ PVP 40g/マンニトール 40mg/アデニン 0.8%寒天 +0.5mg/トランスゼアチン(trans zeatine) 0.1mg/ IAA 500mg/クラファン C5MS塩/2 +3%庶糖 0.7%寒天 pH 5.7 C7B5−培地 250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 20g/マンニトール 20g/グルコース 40mg/アデニン 0.6%アガロース +0.5mg/トランスゼアチン 0.1mg/ IAA 500mg/クラロファン C8B5−培地 +250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 20g/マンニトール 20g/グルコース 40mg/アデニン 0.6%アガロース +200mg/クラロファン 1mg/トランスゼアチン C9B5−培地 +250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 20g/マンニトール 20g/グルコース 40mg/アデニン 0.6%アガロース +1mg/トランスゼアチン 0.01mg/ ギベレリン酸 A3(GA3) 100mg/クラロファン C11MS塩/2 +6%庶糖 0.7%寒天 細菌培地:min A:(Miller 1972)60mM K2HPO4,3H2O; 33mM KH2PO4; 7.5mM(NH4)2SO4; 1.7Mクエン酸3ナトリウム; 1mM MgSO4; 2g/グルコース; 50mg/ビタミンB1 −植物材料 Solanum tuberosum c.v Berolina c.v Dsireの塊茎 −感染 −じゃがいもの皮をむき、水で洗う。 −次に、市販の濃い漂白剤で20分間洗い、そして −滅菌水で3〜5回すすぐ。 −外側の層を除去する(1〜1.5cm) −中心部を約1cm2、厚さ2〜3mmのディスクに切る。 −ディスクを培地C1上に置く(9cmのペトリ皿に4
片)。 −min A培地中で増殖したAgrobacteriumの後期対数培養
物10μを各ディスクに加える。 −低い光度で2日間ディスクをインキュベートする。 −選択と発芽誘導 −ディスクを濾紙上で乾燥させ、100mg/のカナマイシ
ンを含有する培地C2に移す。 −1ケ月後にディスクから小さいカルスを除去し、カナ
マイシン50mg/含有する培地C7にカルスを移す。 −さらに2〜3週後に、カナマイシンを50mg/含有す
る培地C8にカルスを移す。 −小さい芽が発育しはじめたら、カナマイシンを50mg/
含有する伸長培地C9にカルスを移す。 −発根 −伸びた芽を分離して、発根培地C11に移す。 −発根した芽を培地C5上で増殖させる。 3.Lycopersicum esculentum(トマト)の葉のディスク
の感染使用培地は次の通りである: A1MS塩/2 +1%庶糖 0.8%寒天 pH 5.7 B1B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 300mg/ Ca(H2PO4)2 2%グルコース 40mg/アデニン 40g/マンニトール B2B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 40g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラホラン B3B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 30g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラロファン B4B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 20g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラロファン B5B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 10g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラロファン B6B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 200mg/クラロファン B7B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン +1mg/トランスゼアチン 200mg/クラロファン B8MS塩/2 +2%庶糖 0.5g/ MES pH 5.7 0.7%寒天 B9B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン +1mg/トランスゼアチン 0.01mg/ GA3 細菌培地=min A:(Miller 1972)60mM K2HPO4,3H2O; 33mM KH2PO4; 7.5mM(NH4)2SO4; 1.7Mクエン酸3ナトリウム; 1mM MgSO4; 2g/グルコース; 50mg/ビタミンB1 −植物材料 Lycopersicum esculentum cv.Lucullus. 培地A1で6週継代培養後に植物を使用する。 −感染 −中央脈を葉から除去する。 −葉を約0.25〜1cm2の切片に切る(葉の端は傷つけない
ようにして、最大限葉片の3つの側のみが傷つく)。 −切片を感染培地B1に(上下返して)置く。9cmのペト
リ皿中約10個の切片である。 −次にmin A培地中で増殖したAgrobacterium株の後期対
数培養物20μ/ペトリ皿を使って切片を感染させる。 −ペトリ皿を低光度で2日間インキュベートする。 −2日後に培地を除去し、クラロファン500mg/を含有
する培地B1(20ml)で置き換える。 −選択と発芽誘導 −培地B2+50又は100mg/のカナマイシンの中に葉のデ
ィスクを置く。 −マンニトールの濃度を低くすることにより、5日毎に
培地の浸透圧を下げ、培地B3,B4,B5及びB6に連続的に移
す。 −1ケ月後に分裂組織を有するカルスを葉のディスクか
ら分離し、50又は500mg/のカナマイシンを含む培地B7
上に置く。 −小さい芽が形成されたら、50〜100mg/のカナマイシ
ンを含有する伸長培地B9にカルスを移す。 −発 根 −伸長した芽を分離し、発根用培地B8に移す。 −植物を培地A1上で成長させる。 除草剤耐性に関する温室試験 材料と方法 この実験では、活性成分としてホスフィノトリシンを
含む2つの除草剤を使用する。 これらの化合物は登録商標BASTARとMEIJI HERBIACER
として市販されている。 これらの化合物を蛇口からの水で2%まで希釈する。
4角から1m2の場合にスプレーする。温度の温度は、タ
バコとトマトについては約22℃、じゃがいもについては
10℃より高く15℃までである。 結果 −タバコのスプレーテスト a)pGSFR1161又はpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」
遺伝子で形質転換したNicotiana tabacum cv.Petit Hav
ana SR1植物及び形質転換していない対照植物(10〜50c
mの高さ)を20/haのBASTARで処理する。対照SR1植物
は6日後に枯れたが形質転換した植物は20/hanoBASTA
Rに十分耐性であり、未処理植物と区別できない程の成
長を続ける。2週毎に処理を繰り換しても目で判断でき
る程の損傷は検出されない。その後の開花に対しても該
処理の影響はない。農業におけるBASTAR除草剤の推奨使
用量は2.5〜7.5/haである。 b)8/haのMEIJI HERBIACERを使用して同様の実験を
実施する。(上記と同じ)形質転換植物は十分に耐性で
あり、未処理植物とは区別できない程の成長を続ける。
目で判断できる程の損傷は検出されえない。 −じゃがいものスプレーテスト pGSFR1161又はpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」遺
伝子で形質転換した及び形質転換していないじゃがいも
(Solanum tuberosum cv.Berolina)(高さ20cm)をBAS
TAR20/haで処理する。対照植物は6日後に枯れるのに
対し、形質転換した植物では目で判断できる程の損傷は
全く見られず、未処理植物と区別できない程成長する。 −トマトのスプレーテスト pGSFR1161又はpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」遺
伝子で形質転換した及び形質転換していないトマト植物
(Lycopersium esculentum c.v.Iuculus)(高さ25cm)
を20/haのBASTARで処理する。対照植物は6日後に枯
れるのに対し、形質転換した植物は十分耐性である。そ
れらは目で判断できる程の損傷を全く示さず、未処理植
物と区別できない程成長している。 −形質転換植物による植物病原菌の増殖の制御 もう1組の実験で、pGSFR1161又はpGSFR1281に存在す
るキメラ「sfr」遺伝子を発現するじゃがいも植物を高
湿度、20℃の温度の部屋の中で成長させる。1ml当り106
個のPhytophtora infestansの懸濁液1mlをスプレーして
植物に接種する。成長室(20℃,湿度95%,4000ルック
ス)内で、菌病の症候が見られるまで(1週間)植物を
成長させる。この時に1組の植物にBialaphosを8/ha
スプレーする。2週間後末処理植物は真菌に完全に汚染
される。真菌の増殖はBialaphos処理した植物では止
り、それ以上疾患の症候群は表わされない。植物はBial
aphosの殺真菌作用により有効に保護される。 −種子を介するPPT耐性の伝達 pGSFR1161及びpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」遺
伝子を発現する形質転換したタバコ植物を室温内で開花
させる。これらは正常の生殖能を有している。 各植物の約500個のF1種子を土壌にまく。F1とは第一
世代の種子すなわち最初に形質転換した植物から直接得
る種子を表わす。実生の植物が2〜3cmの高さになった
ときに8/haのBASTARをスプレーする。7日後に、健
常な植物と損傷と損傷を受けた植物とは約3:1の比で識
別される。このことから、PPT耐性は単一の遺伝子座に
よりコードされる優性マーカーとして受け継がれること
が示される。 10個の耐性F1実生殖物を成熟するまで成長させ、種子
を収穫する。F2の実生植物を上述のように成長させ、8
/haのBASTARをスプレーすることによりPPT−耐性につ
いてのテストをする。F1植物のいくらかは全部がPPTP耐
性のF2の実生植物を産み出し、このことはこれらの植物
が耐性遺伝子について同型接合性であることを示してい
る。本発明は、本発明のGS−阻害剤不活化遺伝子で本質
的に非生物学的に形質転換した植物細胞及び植物にも関
する。 本発明の好ましい実施態様では、植物細胞及び植物は
上記の「sfr」遺伝子で非生物学的に形質転換する。 これらの植物細胞及び植物はそれらのゲノム内に安定
に組込まれ、検出しうる量のホスフィノトリシン−アセ
チルトランスフェラーゼを産生しうるようにする非種特
異的な特性を有する。 この特性は形質転換した植物細胞及び植物に、Bialap
hosやPPTのようなGS阻害剤を不活化又は中和しうる非種
特異的な酵素活性を付与する。 従って、本発明により形質転換した植物細胞及び植物
はBialaphosや関連化合物の除草作用に対して耐性とな
る。 Bialaphosは最初に殺真菌剤として記載されたもの
で、形質転換した植物は化合物を数回スプレーすること
により真菌疾患に対しても保護されうる。 好ましい実施態様では、Bialaphos又は関連化合物を
特に約20〜100日間隔で数回施用する。 本発明は、畑を除草剤で処理するステップからなる、
植物種を真菌疾患に対し選択的に保護し、畑の雑草を選
択的に撲滅する新しい方法にも関連する。ここで植物種
はそのゲノム内にGS阻害剤を中和又は不活化しうる酵素
活性を有する蛋白質をコードするDNAフラグメントを含
有しており、使用する除草剤は活性成分としてGS阻害剤
を含んでいる。 本発明による方法は、植物が真菌に感染していなけれ
ば土地の雑草を撲滅するためのみに、あるいは雑草を撲
滅した後に真菌が出現したときには真菌の成長を停止さ
せるためだけにも同じ有効性で使用することができるこ
とは言うまでもない。 本発明方法の好ましい実施態様では、上記のような
「sfr」遺伝子を含むDNAフラグメントで植物種を形質転
換し、使用する除草剤はPPT又は関連化合物である。 従って、早く時期及び遅い時期に発芽する雑草を撲滅
するまで、栽培すべき植物種が出現した後に数回、例え
ばスプレーによりPPT又は関連化合物の溶液を畑に施用
する。 栽培すべき植物種の出現前に畑を除草剤組成物で処理
して雑草を撲滅することができるのは全く明らかであ
る。 同様に、栽培すべき植物種の種子をまく前にさえ畑を
処理することができる。 所望の植物種が出現する前に、Bialaphos型の除草剤
を含めた任意の入手しうる除草剤で畑を処理することが
できる。 所望の植物種が出現した後に、Bialaphos又は関連化
合物を数回施用する。 好ましい実施態様では、約20〜100日間隔で除草剤を
施用する。 Bialaphos−型の除草剤の除草作用に耐性を有するよ
うに栽培すべき植物を形質転換するので、栽培した植物
の出現後でさえ畑を処理することができる。 このことは、生産すべき植物に何ら作用することなく
早期に及び遅期に発芽する雑草を全体的に撲滅するのに
特に有用である。 好ましくは、Bialaphos又は関連化合物は約0.4〜約1.
6Kg/haの投与量で施用し、それを約2〜約8/haの割
合で畑に施用しうるような濃度に液体キャリアで希釈す
る。 次に、例示のために種々の植物種での本方法のいくつ
かの実施態様を示す実施例を挙げる。 −てんさい 北欧のてんさいは気候条件、より正確には雨量及び平
均温度により3月15日から4月15日にまく。雑草の問題
は多かれ少なかれ各国で同じであり、穀物が7月半ばに
そのキャノピー(canopy)を閉じるまでは面倒を引き起
こしうる。 雑草の問題を3つの場合に分けることができる: −草のような雑草(grassy weeds)の早期の発芽、 −広葉の雑草の早期発芽、 −広葉の雑草の遅い発芽。 現在までは、出現(出芽)前の除草剤が使用され成功
してきた。このような化合物は例えば登録商標:PYRAMIN
R,GOLTIXR及びVENZARRとして市販のものである。しかし
ながら、これらの化合物の乾燥した気候条件に対する感
受性と、遅く発芽した雑草をコントロールし得る残留活
性がないことから、濃民は出現前のものに加え出現後の
製品も使用するようになった。 下記第(I)表に次の実施例で記載する除草剤組成物
に含まれる活性成分を示す。 本発明によると、出現後の除草剤はBialaphos又は関
連化合物からなり、それらは一年生の草(Bromus,Avena
spp.,Alopecurus,POA)及び広葉(Galium,Polygonum,S
enecio,Solanum,Mercurialis)の成長のコントロールを
良好に行う。 てんさいの生育の種々の時点、即ち子葉期,2葉期又は
4葉期に出現後の除草剤を施用しうる。 第(II)表は例示のための可能な畑の処理方法を表わ
す。 それらの例では、種々の出現前得の除草剤と通に使用
するBialaphos類の出現後の除草剤はBASTARである。濃
度は/ha又はKg/haで示す。 −じゃがいも じゃがいもはヨーロッパでは約8×106haで栽培され
ている。雑草のコントロールに使用される主要な製品は
リヌロン(Linuron)/モノリヌロン又は商品名METRABU
ZINとして市販の化合物である。 これらの製品はほとんどの雑草の種に対し良好に作用
する。 しかしながら、Galium及びSolanumのような雑草や発
芽の遅いChenopodium及びPolygonumは常に有効にコント
ロールされるのではなく、一年草のコンオロールも時々
失敗する。 さらに、遅く発芽する広葉の雑草は、BASTARのような
除草剤を発芽後に施用することによってのみコントロー
ルしうる。 次の第(III)表はじゃがいもの場合の畑の処理のい
くつかの例を例示として示している。 第(III)表 じゃがいもをBASTAR耐性とする、BASTARの使用に基くじ
ゃがいもの雑草コントロールシステム リヌロン+モノリヌロン(375g+375g/ha) 発芽前 BASTAR3〜4/ha 発芽後(5〜15cm) BASTAR/ブチルフルアジホップ 発芽後(5〜15cm) (fluazifop−butyl)3〜4/ha+2/ha リヌロン(Linuron) WP 50%(AFALONR) モノリヌロン WP 47.5%(ARESSINR) ブチルフルアジホップ EL 250g/(FUSILADEDER) 上記で使用するpGSJ260及びpGB39株はドイツ、ゲッテ
ィングゲンの「German Collection of Micro−organism
s」(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)に1985
年12月12日に寄託し、各々の寄託番号はDSM 3 606及びD
SM 3 607であった。 本発明の別の態様を図面を参照して以下に説明する。
図中、第8図はもうひとつのBialaphos耐性遺伝子を含
有するプラスミドpJS1の制限地図を示し、 第9図は耐性遺伝子を含有する「sfrsv」遺伝子のヌク
レオチド配列を示し、 第10図は「sfrsv」遺伝子と「sfr」遺伝子のアミノ酸同
族体を示し、 第11図は1例として「sfrsv」遺伝子を含有し植物細胞
の形質転換に適したプラスミドの構築を示す。 もうひとつ別のBialaphos耐性遺伝子は別のBialaphos
産生株、すなわちstreptomyces viridochromogenesから
単離した。この第2の耐性遺伝子は以後「sfrsv」遺伝
子とよぶ。 後に植物細胞を形質転換するための、この第2の好ま
しい本発明のDNAフラグメントは、下記配列を有するボ
リペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド
配列から成る。 このポリペプチドの上記部分は、植物細胞内に遺伝学
的に取入れられて発現されたときにこの植物細胞に、Bi
alaphosに対する保護、すなわち「植物保護能」を付与
するのに充分な長さである。以後、上記ヌクレオチド配
列のBialaphosに対する「植物保護能」についても言及
する。 アミノ酸の一文字表記の意味を次に挙げる。 アラニン A ロイシン L アルギニン R リシン K アスパラギン N メチオニン M アスパラギン酸 D フェニルアラニン F システイン C プロリン P シスチン C セリン S グリシン G スレオニン T グルタミン酸 E トリプトファン W グルタミン Q チロシン Y ヒスチジン H バリン V イソロイシン I この第2の好ましいDNAフラグメントは次のヌクレオ
チド配列:またはその一部であってBialaphosに対する植物保護能
を有するポリペプチドを発現する部分から成る。 以下の説明は、「sfrsv」耐性遺伝子の単離と、この
耐性遺伝子を含有し、植物細胞をGS阻害剤に耐性とする
ために後に植物細胞を形質転換できる発現ベクターの構
築とに関するものである。 Streptomyces viridochromogenes由来のbialaphos耐性
「sfrsv」遺伝子のクローニング Streptomyces viridochromogenesDSM 40736株(文献
1)を増殖させ、標準法に従ってこの株の全DNAを調整
した。DNAのサンプルを、3回の別々の反応でそれぞれP
st I、Sma IおよびSau3A Iによって消化してアガロース
ゲル上で分離すると共に、pGSR1(第5B図)由来のプラ
スミドDNAをBamH Iで消火した。このDNAをSouthern解析
においてニトロセルロースフィルター上にブロットし、
「sfr」遺伝子を含有する。pGSR1由来の標準BamH Iフラ
グメントとハイブリダイズした。ゲルの4筒のレーン全
てで制限フラグメントはプローブとの強いホモロジーを
示していた。約3kbのPst Iフラグメント、約1.2kbのSma
Iフラグメント、および0.5kbのSau3A Iフラグメント。
この遺伝子をクローニングするために、Pst I制限フラ
グメントをEscherichia coliベクターpUC8に直接クロー
ニングした。形質転換後得られた3000個のコロニーをニ
トロセルロースフィルターに移し、「sfr」プローブと
ハイブリダイズした。陽性のものを選んで、300μg/ml
のPPTを含有する最少培地プレート上で増殖するかどう
かをさらに試験した。PPT含有培地で増殖する形質転換
体1個をさらに解析した。このプラスミドpJS1のプラス
ミドマップと関連の深い制限部位を第8図に示す。MC10
61(pJS1)は、1987年3月6日Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen(DSM)に寄託番号DSM4023で寄託され
ている。クローンの制限フラグメントをHaxam−Gilbert
の方法に従って配列決定し、この遺伝子のコード領域は
ホモロジーに基づいて同定できた。「sfrsv」遺伝子の
配列を第9図に示し、ヌクレオチドとアミノ酸の配列レ
ベルにおける「sfr」遺伝子とのホモロジーを第10図に
示す。 「sfrsv」遺伝子の発現 後の植物発現ベクター内でのクローニングを可能にす
るために「sfrsv遺伝子カセット」も構築した。GTG開始
コドンを次いた「sfrsv」コード領域を含有するBan II
−Bgl IIフラグメントをpJS1から単離した。このフラグ
メントを、「sfr」遺伝子について記載し第5図に示し
たものと類似の合成オリゴヌクレオチド5′−CATGAGCC
−3′と共に、Nco IおよびBgl IIで消化したベクターp
LK56−2中に連結した。pGSR1SVの構築の概略を第11図
に示す。pGSR1とpGSR1SVにはそれぞれ両遺伝子の類似の
カセットが存在するので、植物中での「sfr」遺伝子の
発現に関して既に記載した構築を繰り返すことができ
る。 プラスミドpGSR1SVを有するE.coli株の粗抽出物を酵
素解析した結果、PPTをアセチル化できるアセチラーゼ
の合成が確認された。これは反応生成物の薄層クロマト
グラフィーによって示された。 次い「sfrsv」遺伝子を、プラスミドベクターpGSJ260
(第4B図)中にCaMV35Sプロモーターの制御課で挿入し
てプラスミドpGS2SVを得た。このプラスミドはpGSR2
(第6A図)に似ているが「sfr」遺伝子が「sfrsv」遺伝
子で置換されている。 上述のタイプの除草剤耐性遺伝子がPPTまたはPPT誘導
体を生産する他の多くの微生物から得ることができると
いうことは明らかである。除草剤耐性遺伝子は次に、グ
ルタミン合成酵素阻害剤の作用に対して植物細胞を保護
するために植物細胞中に組込むことができる。たとえ
ば、Kitasotosporia(文献15)からBialaphos耐性遺伝
子が得られる。 いろいろな植物種を「sfr」遺伝子で形質転換する場
合について上述したのと同じAgrobacterium媒介形質転
換系を用いて、プラスミドpGSR2SVから、「sfrsv」耐性
遺伝子を含有する形質転換された植物細胞および植物を
得ることができる。 植物は再生されて、上述したのと類似のスプレー試験
によってその耐性を試験される。全ての植物が同様な挙
動を示し、グルタミン合成酵素阻害剤から成る除草剤に
対する耐性を示す。 最後に、本発明者はまた、上記定義の如きグルタミン
合成酵素の阻害剤に対する植物の耐性と、雑草のない前
記植物の栽培物の生産用の相当するグルタミン合成酵素
の阻害剤との組合せにも関する。 文献 1.BAYER et al.,HELVETICA CHEMICA ACTA,1972 2.WAKABAYASHI K.and MATSUNAKA S.,Proc.1982,British
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2,1986
物細胞及び植物を保護する方法に関する。 本発明はこのような方法を特に所与の植物での除草剤
耐性を発達させるために応用することにも関する。 本発明はさらにグルタミン合成酵素阻害剤に対する耐
性をコードするヌクレオチド配列を含有する適切なDNA
フラグメント及び組換え体、並びにグルタミン合成酵素
阻害剤に対する耐性を示す非生物学的に形質転換した植
物細胞及び植物にも関する。 グルタミン合成酵素(本明細書中以下では簡単にGSと
記す)はほとんどの植物中で植物細胞の発育と生存に必
須な酵素の1つを構成している。GSがグルタミン酸塩
(glutamate)をグルタミンに変換することは公知であ
る。GSはほとんどの植物中で、硝酸塩の還元、アミノ酸
の分解又は光呼吸により放出されたアンモニアを解毒す
るための有効な経路(現在知られている唯一のもの)に
関与している。従って、GSに対して効力を有する阻害剤
は植物細胞にとって非常に毒性が高い。植物中でのGSの
阻害による毒性作用に基いてある種の除草剤が開発され
てきた。 これらの除草剤は活性成分としてGS阻害剤を含む。 グルタミン合成酵素の作用の阻害剤に対して植物を耐
性にし得る少なくとも2つの可能な方法がある。すなわ
ち、(1)標的を変化させることによる。GS酵素内の変
異により除草剤に対する感受性をなくし得ると考えられ
る。(2)除草剤を不活化することによる。植物中で除
草剤を破壊又は修飾することにより耐性とし得るであろ
う。 ビアラホス(Bialaphos)及びホスフィノトリシン(p
hosphinothricin,本明細書中以下では簡単にPPTと記
す)はGSの作用に対する2つのこの種の阻害剤であり
(文献16,17)、優れた除草特性を有することが示され
ている(Bialaphosに関する詳細は文献2を参照のこ
と)。 Bialaphosは次の式(I): を有している。 PPTは次の式(II): を有している。 このように、PPTとBialaphosの差はPPTには2つのア
ラニンアミノ酸がないということである。 これら2つの除草剤は非選択的である。これらは土壌
上に存在する全てのいろいろな種の植物の成長を阻害
し、従ってそれら全体を破壊する。 Bialaphosは最初抗生物質特性をもつものとして開示
され、この特性により殺虫剤又は殺菌剤としての使用が
可能であった。Bialaphosは明治製菓(MEIJI SEIKA KAI
SHA LTD.)による米国特許第3 832 394号明細書に開示
の方法で製造することができる。この特許は言及によっ
て本明細書中に取り入れられるものとする。この方法
は、例えばAmerican Type Culture CollectionからATCC
No.21,705として入手しうる株のような、Streptomyces
hygroscopicusを培養し、その培地からBialaphosを回
収することからなる。しかしながら、Streptomyces vir
idochromogenesのような他の株もこの化合物を産生する
(文献1)。 例えばホサラシン(phosalacin、文献15)のような、
PPT核を含有する他のトリペプチド抗生物質も自然界で
発見されるか又はされるかもしれない。 PPTも又化学合成により得られ、工業会社HCECHSTから
市販されている。 原核細胞機能即ち酵素を不活化することが知られてい
る活性の高い抗生物質を産生する多くのストレプトミセ
ス(Streptomyces)種が開示されてきている。これらの
抗生物質を生産するストレプトミセス種は、もしこれら
の抗生物質に対する自己防御機能を有していなければそ
れ自身が破壊されてしまうだろう。この自己防御機構に
はいくつかの場合、抗生物質の作用を阻害しえ、従っ
て、当該ストレプトマイセス種の自家中毒を回避しうる
酵素を含まれることが発見されている。この修飾は一般
に分子が細胞から排出されたときには取り消されてしま
う。 宿主に対する抗生物質の作用を阻害するように抗生物
質を修飾しうる酵素をコードする遺伝子が存在すること
は抗生物質を産生するいくつかのストレプトミセス、例
えば各々ネオマイシン,チオストレプトン,バイオマイ
シン及びMLS(マクロライド リンコサミド ストレプ
トグラミン)という抗生物質を産生するS.fradiae,S.az
ureus,S.vinaceus,S.erythreusで示されてきた(文献
4),(文献5),(文献6),CHATER他(1982年)の
文献14はこれらの作用を明らかにするのに使用し得る標
準的技術を記している。) 本発明によって、Streptomyces hygroscopicus ATCC
21,705もBialaphosの抗生物質特性を不活化する能力の
ある酵素をコードする遺伝子を有することが発見され
た。本出願人が実施した実験によりこのような遺伝子が
単離され、PPT又は誘導生成物に基づいてGS阻害剤の作
用を制御する過程でその遺伝子を使用することができ
た。 本発明の目的は植物細胞及び植物内でGS阻害剤の作用
を調節する新しい方法を提供することである。 本発明のもう1つの目的は、植物細胞及び植物内に取
り込まれたときにGS阻害剤の作用に対してそれらを保護
し得るヌクレオチド配列を含有するDNAフラグメント
(断片)及びDNA組換え体、並びに前記DNAフラグメント
を含有する特別に修飾したベクターを提供することであ
る。 本発明のさらに別の目的はGS阻害剤を中和即ち不活化
し得る非生物学的に形質転換した植物細胞及び植物を提
供することである。 本発明のもう1つの目的はGS阻害剤型の除草剤に対し
植物種を選択的に保護する方法を提供することである。 さらに特定的には、本発明のひとつの目的はBialapho
s及び構造的に類似した除草剤の除草作用に対し植物細
胞及び植物全体を保護しうる、植物細胞及び植物全体に
伝達しうるDNAフラグメントを提供することである。 本発明の目的は構造中にPPT単位を有する。例えばBia
laphosのような種類の生成物に耐性な植物細胞を提供す
ることである。 GS阻害剤と接触したときに植物細胞及び植物中でGS阻
害剤の作用を調節するための本発明方法は、世代を通じ
て植物の細胞内に安定して異種DNAフラグメントを組込
むような条件下で、植物細胞及び植物中で蛋白質の形で
発現しうる外来性ヌクレオチド配列を含有する異種DNA
フラグメントを植物に提供することからなり、ここで前
記蛋白質は前記グルタミン合成酵素阻害剤を不活化又は
中和させ得る酵素活性を有している。 好ましいDNAフラグメントは抗生物質産生ストレプト
ミセス株由来のもの(又は同じ活性をコードするヌクレ
オチド配列を含む配列)であり、前記GS阻害剤耐性をコ
ードするものである。 本発明に使用する好ましいヌクレオチド配列は前記GS
阻害剤に関しアセチルトランスフェラーゼ活性を有する
蛋白質をコードする。 本発明の最も好ましいDNAフラグメントはPPTアセチル
トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列からなる。 植物細胞の以後の形質転換のための本発明の特定のDN
Aフラグメントは次の配列: [式中、XはMET又はVALを表わす]を有するポリペプチ
ドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列から
なり、前記ポリペプチドの一部とは、遺伝的に取り込ま
れ、植物細胞中で発現するときに植物細胞にBialaphos
に対する保護(すなわち、以後Bialaphosに対する「植
物保護能」と記す)を付与するに十分な長さである。 好ましいDNAフラグメントは次のヌクレオチド配列: 又はその一部分でBialaphosに対する植物保護能を有す
るポリペプチドを発現する部分からなる。 本発明は又、そのヌクレオチドのいずれかを他のもの
で置換することにより上記の好適なものとは異なるが上
記の好適なDNA配列の遺伝情報(通常一般的な遺伝子コ
ードの意味において)を変えない任意のDNAフラグメン
トにも関し、さらに、同じ特性、特にBialaphos耐性活
性を有するポリペプチドをコードする任意の等価なDNA
配列にも関する。 例えば、本発明のDNAフラグメントのどちらかの側の
末端部分をエキソヌクレオリティックな酵素、例えばBa
l 31で除去し、適当なプラスミド内で残りのフラグメン
トを再クローニングし、後記に開示するように、適当な
細胞を形質転換しBialaphos抗生物質又は除草剤に対し
保護する前記修飾プラスミドの能力をアッセイすること
により、本発明の任意のDNAフラグメントのいずれかの
側から除去し得るヌクレオチド配列部分は当業者により
容易に評価されうることは理解されよう。ここで、前記
のアッセイはどんなものでも適当である。 表記を簡単にするために、これらのDNAフラグメント
を以後「Bialaphos−耐性DNA」と言う。同様に、対応の
ポリペプチドを「Bialaphos−耐性酵素」と呼ぶ。 前記考察中で、植物細胞及び植物中に導入されたとき
にBialaphos又はPPTに対しそれらを保護しうるDNAフラ
グメントを特に強調したが、本発明はそれに限定される
ものとみなされるべきではないことを理解すべきであ
る。 同様に、本発明は、このような植物細胞内に導入され
たときに他のGS阻害剤、例えばホスフィノトリシンの天
然の生合成に関与する中間産物、例えば式: の略号MP 101(III),MP 102(IV)で表わされる化合物
に対しこのような植物細胞を保護するDNAフラグメント
にも関する。 より一般的には、本発明は、植物細胞及び植物に適当
に導入されると、GS阻害剤との接触に際し、GS阻害剤に
対してそれらを保護しうるDNAフラグメント製造への道
を開いたものである。これに関し、後記実施例中ではBi
alaphos及びPPTに関して詳細に示す。 このことが確立されると、GS阻害剤を不活化すること
によってこれに対し植物細胞及び植物を保護する酵素活
性をコードする任意のフラグメントは上記に開示された
好ましいフラグメントの均等物として見られるべきであ
るということは理解されよう。これは、構造的に異なっ
ていても、Bialaphos又はPPT又は更に他のGS阻害剤に関
し同様の活性をコードする遺伝子を有すると思われる
株、特に抗生物質産生株のゲノムDNAの遺伝子をスクリ
ーニングすることにより得られる任意のDNAフラグメン
トについて特にあてはまることであろう。また、PPT誘
導体を産生する他の株の遺伝子についてもあてはまるで
あろう。 従って、簡便のために以後使用する「Bialaphos−耐
性DNA」又は「Bialaphos−耐性酵素」という言葉はPPT
又は最も直接的に関係する誘導体に対する耐性に特異的
に関係するDNA及び酵素にのみ関することを意図するの
ではなく、より一般的に、同じ条件下で植物中でGS阻害
剤の作用を不活化しうる他のDNA及び酵素にも関すると
意図していることを理解すべきである。 本発明は又、異種DNAと組換えた上記定義のBialaphos
−耐性DNAフラグメントを含有するDNA組換え体にも関
し、該異種DANは調節要素を含有し、前記Bialaphos耐性
DNAは該調節要素と適合し得る外来の細胞環境内で発現
し得るように該調節要素の制御下にある。特に、前記DN
A組換え体が含有している上記Bialaphos−耐性DNAフラ
グメントは、このBialaphos−耐性DNAフラグメントがBi
alaphos産生株から創作されている場合、Bialaphosの生
合成に関与するDNA領域を全然もっていない。 「異種DNA」前記Bialaphos−耐性DANの起源とは異な
る、例えばStreptomyces hygroscopicus又はStreptomyc
es viridochromogenesのものとは異なる起源のDNAを、
更により好ましくはストレプトミセスのDNAとは異なるD
NAを意味している。特に、前記調節要素は通常それらに
関連(結合)しているDNA配列の転写及び翻訳を前記外
来環境でコントロールしうるものである。「細胞」とは
微生物と細胞培養物の両者を意味する。 特に、増幅のような目的で組換えDNAを大量に製造す
ることを望むときには、この異種DNAは細菌性DNAであり
うる。この点に関して、好ましい異種DNA大腸菌(E.col
i)のDNA又は大腸菌(E.coli)と適合性のDNAからな
る。例えば、関与する細胞内で複製しうることが知られ
ているウィルス性又はプラスミドDNAのような、関与す
る細胞のDNAと別の起源のDNA又は同じ起源のDNAであり
得る。 好ましい組換えDNAは植物細胞と適合性の異種DNA、特
にTi−プラスミドDNAを含んでいる。 特に好ましい組換え体は、植物細胞、特にGS阻害剤の
不活化が付与されるべき植物細胞により認識されるプロ
モーターのコントロール下でGS阻害剤を不活化するDNA
を含有するものである。 本発明の好適な組換え体は、さらに、特にプロモータ
ー要素を含む調節要素に関して、異種DNAと適合性の細
胞環境下で前記GS−阻害剤−不活化DNAが転写及び翻訳
されるように配置された前記GS阻害剤−不活化DNAを含
有している改変ベクター、特にプラスミドに関する。有
利なベクターは、外来細胞中、特にそのゲノムDNA中に
安定的に前記GS阻害剤−不活化DNAを取り込むように遺
伝子操作されたものである。好ましい改変ベクターは、
植物細胞を安定に形質転換しえ、対応の細胞にGS阻害剤
不活化能を付与するものである。 後述するように、本発明で使用するStreptomyces hyg
roscopicus株のBialaphos−耐性−遺伝子の開始コドン
はGTGコドンであると思われる。しかし、好ましい組換
えDNA又はベクター中では、その開始コドンGTGをATG開
始コドンで置換することによりBialaphos−耐性遺伝子
が改変されている。このATGは植物細胞内で翻訳を開始
させることができる。 後述の実施例で使用した植物のプロモーター配列は35
Sカリフラワーモザイクウィルスのプロモーターで構成
した。関与する植物種との関係でより適切であるときに
は、当業者は他の植物プロモーターを選択しうることは
言うまでもない。 本発明のもう1つの別の好ましい実施態様によると、
特にBialaphos−耐性DNAがコードする酵素を葉緑体内に
運搬することを所望するときには、異種DNAフラグメン
トを、トランジットペプチドをコードする遺伝子又はDN
Aフラグメントに融合し、次にこの後者のフラグメント
をGS阻害剤不活化遺伝子と選択した植物プロモーターと
の間に挿入する。 このような構築を達成しうる方法については次のもの
を参照しえ、これらはすべて引用によって本明細書に取
り入れる:英国特許出願第8432757号(1984年12月28日
出願)及び第85 00336号(1985年1月7日願)、並びに
米国(NO.755,173、1985年7月15日出願)、欧州特許庁
(No.85 402596.2、1985年12月20日出願)、日本(No.2
99730、1985年12月27日出願)、イスラエル(No.7746
6、1985年12月27日出願)及びオーストラリア(No.5 16
5 485、1985年12月24日出願)に出願した関連出願。 科学文献、特に次の論文: −VAN DEN BROECK他、1985,Nature,313,358−363; −SCHREIER他、Embo.J.,Vol.4,n゜1,25−32.も参照しう
る。 これらの論文も引用によって本明細書に取り入れる。 記録するために、「トランジット(運搬)ペプチド」
という表現は、植物細胞の核DNAがコードする前駆体蛋
白質中で葉緑体蛋白質サブユニット又は葉緑体蛋白質と
通常結合しているポリペプチドフラグメントを指すこと
をここで思い出そう。次に、葉緑体蛋白質を葉緑体内に
輸送する過程で、トランジットペプチドは葉緑体蛋白質
から分離され、又は蛋白質加水分解によって除去され
る。好適なトランジットペプチドの例はリブロース−1,
5−二リン酸(RuBP)カルボキシラーゼの小さなサブユ
ニットと結合したもの又はクロロフィルa/b結合蛋白質
と結合したものである。 従って、後記定義の方法に使用するに適したDNAフラ
グメントやDNA組換え体が提供される。 より特定的は、本発明は植物及び該植物の生殖物質中
に安定に組込まれ、かつ該植物又は生殖物質中でグルタ
ミン合成酵素阻害剤の作用を不活化又は中和しうる蛋白
質の形で発現され得る異種遺伝物質を含む該植物及び該
植物の生殖物質を製造する方法として一般的に定義され
うる方法にも関し、この方法は前記阻害又は中和活性を
発現しえない植物細胞又は植物組織の出発物質から前記
異種遺伝物質を含有する植物細胞又は植物組織を製造す
る非生物学的ステップと、前記遺伝物質を含む前記植物
細胞又は植物組織から植物又は該植物の生殖物質又はそ
の両者を再生させ、適宜、前記植物又は生殖物質又はそ
の両者を生物学的に複製することからなり、前記異種遺
伝物質を含有する前記植物細胞又は植物組織を製造する
非生物学的方法は、前記蛋白質をコードするヌクレオチ
ド配列と、前記植物細胞又は植物組織内で前記ヌクレオ
チド配列を発現させうるものの中から選択した調節要素
とを含有するDNA組換え体で前記出発物質の植物細胞又
は植物組織を形質転換し、前記植物細胞及び組織並びに
植物及び世代を通してそこから得られる生殖物質中に前
記ヌクレオチド配列を安定に組込ませることにより成
る。 本発明はBialaphos−耐性DNA、又はより一般的にはGS
−阻害剤−不活化DNAを含有する細胞培養物にも関し、
この細胞培養物は、非形質転換細胞を破壊するような量
でGS阻害剤含有組成物を含有する培地中で培養するとき
にこのような組成物に対して耐性であるという特性を有
している。 本発明はより特定的にBialaphos−耐性DNAが安定的に
組込まれ、植物細胞の連続する世代に亘り存続する植物
細胞又は細胞培養物に係る。従って、GS阻害剤、より特
定的にはBialaphos又はPPTに対する耐性は本発明の植物
細胞を特性化する一つの手段とも考えられる。 適宜、前記植物細胞から得たゲノムDNAと、GS阻害剤
不活化DNA配列を含有するプローブとの間のハイブリダ
イゼーション実験を利用することもできる。 より一般的には、本発明はその各々のゲノムDNAに安
定的に組込まれた外来性又は異種DNAフラグメントを含
有する植物と同様に植物細胞、生殖物質、特に種子に関
し、ここで、前記フラグメントはこのような植物細胞、
生殖物質、種子及び植物の世代を通して伝達され、前記
DNAフラグメントはGS阻害剤、特にBialaphos及びPPTを
不活性又は中和しうる非種特異的酵素活性を誘導する蛋
白質をコードしており、より特定的には前記植物細胞、
生殖物質、種子及び植物にGS阻害剤耐性という対応の非
種特異的表現型を付与する。 「非種特異的(non−variety−specific)」酵素活性
又は表現型は、後述の実施例で非限定的に例示されるよ
うにそれらが特定の植物遺伝子又は種に特徴的なもので
はないという事実に関連している。それらは、通常は互
いに関係のない種に属する植物に適応でき、前記植物材
料に異種DNA、例えば細菌性DNA又は化学合成したDNAを
取り込ませることからなる本質的に非生物学的な方法に
より前記植物材料内で誘導される。この異種DNAは前記
植物材料内には通常はなく又は天然の繁殖・生殖過程で
はそれらに取り込まれ得ないものであり、それにもかか
わらずそれらに対し共通の表現型(例えば除草剤耐性)
を付与するものである。 本発明は畑で栽培する植物種を雑草から保護する方法
に使用するのに特に有利であり、この方法は雑草を撲滅
するのに有効な量の例えばBialaphos又はPPTのような除
草剤で土地を処理するステップからなり、ここで、栽培
する植物種は前記GS阻害剤を中和又は不活化しうる酵素
活性を有する蛋白質をコードするDNAフラグメントをそ
のゲノム内に含有している。 例示のためだけであるが、上記の方法に使用する有効
量は約0.4〜約1.6kg/haのBialaphos又はPPTである。 次に、例示のためだけに、American Type Culture Co
llectionから寄託番号ATCC 21705として入手しうるStre
ptomyces hygroscopicus株から上記の好ましいDNAフラ
グメントをどのようにして単離したのかを開示する。 以下の開示はPPT核を有する化合物を酸生する他の菌
株に適用しうる手法も提供する。 最後に、形質転換した細胞へのBialaphos及びPPTを不
活性化する能力を付与する好ましいDNAフラグメントの
挿入について記載する。従って、上記の手法で単離し
た、以後Bialaphos−耐性遺伝子又は「sfr」遺伝子と表
わすBialaphos不活性DNA−フラグメントをプラスミドに
挿入し、それを用いて、植物細胞を形質転換し、それら
にBialaphos耐性を付与しうるということも非限定的に
説明するための例示として単に示したものである。 次の開示は図面を参照して行う。 図中、 第1図は、Bialaphos耐性をコードするStreptomyces
hygroscopicus DNAフラグメントを含有するプラスミド
の制限地図であり、このプラスミドは以下pBG1と表わす
がこれは以下の開示に従って構築した。 第2図は、pBG1から得、他のプラスミド(pBG39)内
でサブクローニングした、耐性遺伝子を含有する小さな
方のフラグメントのヌクレオチド配列を示す。 第3図は、例として示した一連のプラスミドの構築を
示す。これらのプラスミドはそこにBialaphos−耐性遺
伝子すなわち「sfr」遺伝子を挿入する適切な適応手段
を提供することを目的とする。 第4A図及び第4B図は例として示した一連のプラスミド
の構築を示す。これらのプラスミドはそれらの制御下に
プラスミド内に挿入された外来遺伝子の転写及び発現を
開始しうる適切な植物細胞プロモーター配列を含有して
いる。 第5A図は第3図で得たプラスミドのヌクレオチド配列
の決定したフラグメントを示す。 第5B図は、pBG39からたFok I/Bgl IIフラグメントか
らのBialaphos−耐性遺伝子の最初のコドンの再構築
と、天然の「sfr」遺伝子のGTG開始コドンのATG開始コ
ドンでの置換絵を示す。 第5C図は完全な「sfr」遺伝子すなわちその最後のコ
ドンの再構築と、第4A図及び第4B図で得たプラスミド内
へのその挿入を示す。 第6A図は植物細胞プロモーターの制御下に置かれた
「sfr」遺伝子含有発現ベクターを示す。 第6B図は、いくつかのヌクレオチドを置換することに
よって、第6A図に示したものから得た他の発現ベクター
を示す。 第7図はプロモーター領域の制御下でかつトランジッ
トペプチド配列の下流に「sfr」遺伝子を挿入するため
の、所与の植物細胞遺伝子のトランジットペプチド配列
とプロモーター領域を含有するプラスミドを最終的に製
造するための、例として示した一連のプラスミドの構築
を示す。 第8図〜第11図については後述する。 次の実験はStreptomycesへのクローニングの標準手法
により、S.hygroscopicusからBialaphos耐性遺伝子を単
離するために行った。 文献6に記載の方法に従い、2.5μgのS.hygroscopic
usのゲノムDNAと0.5μgのStreptomycesベクターpIJ61
をPst Iで開裂した。ベクターフラグメントとゲノムフ
ラグメントを混合し、全DNA濃度40μg ml-1でT4DNAリガ
ーゼにより連結した(66mMのTris−HCl(pH7.5),1mMの
EDTA,10mMのMgCl2,10mMの2−メルカプトエタノール及
び0.1mMのATPを含有する連結塩中で10℃で4時間、次
に、4℃で72時間)。下記のように、ポリエチレングリ
コール(PEG)を介した形質転換操作により3×109のS.
lividans株66のプロトプラストに上記連結産物を導入し
た。これらのプロトプラストは、0.5%のDifco酵母抽出
物を含有するR2観点(R2 YE)の20枚のプレート上で再
生させると、5×107個のコロニーと4×104個のポック
を生じた。本明細書中に開示する実験で使用した種々の
培地やバッファの製法及び組成は下記に示す。これらの
ローン(lawn)を50μg ml-1のBialaphosを含有する最
少培地プレート上でレプリカ培養すると、形質転換体10
4個当り1つの頻度で薬剤耐性コロニーが出現した。薬
剤耐性コロニーを精製した後、これらのプラスミドDNA
を単離し、S.lividansプロトプラストを再度形質転換す
るために使用した。非選択的に再生した後Bialaphos含
有培地にレプリカ培養するとポックとBialaphos耐性の
成長との間は100%の相関を示した。数個の耐性クロー
ンの組換えプラスミドは全て1.7KbのPst I挿入物を含有
していた(第1図参照)。 除草剤耐性遺伝子のサブクローニング 次に、プラスミドpBG 20を生成させるために高いコピ
ー数のstreptomyceteベクターpIJ 385に1.7KbのPst I挿
入物をサブクローンした。pBG 20を含有するS.lividans
株はBialaphosに対する耐性が500倍以上高かった。S.li
vidansの増殖は通常Bialaphosを1μg/ml含有する最少
培地で阻害されるが、pGB 20を含有する形質転換体の増
殖はBialaphosを500μg/ml含有する培地中でも顕著には
阻害されなかった。また、Pst Iフラグメントをプラス
ミドpBR322のPst I部位に両方の配向でサブクローン
し、その配向に応じてプラスミドpBG 1及びpBG 2を生成
した。最少M9培地上でのテストではpBG 1又はpBG 2を含
有する大腸菌(E.coli)E8767は、Bialaphosに対し耐性
であった。 ±1.65Kb Pst I−BamH IフラグメントをpBG1からプラ
スミドpUC 19にサブクローンしてプラスミドpBG 39を製
造し、E.coli W3110,C600及びJM83をBialaphos耐性と
した。 S.lividans抽出物由来のin vitroの結合(coupled)
転写−翻訳システム(文献5)使用し、pBG 39内の1.65
Kb Pst I−BamH Iフラグメントは22Kd蛋白質の合成を指
令することが示された。この1.65Kb挿入物は22Kd蛋白質
をコードするフラグメントを含有しており、以降「sf
r」遺伝子と呼ぶ。 遺伝子の微細な地図及び配列の決定 625bp Sau 3AフラグメントをpBG 39からpUC 19にサ
ブクローンし、E.coli W3110宿主をBialaphos耐性にし
た。得られたクローンは配向によりpBG 93とpBG 94であ
った。 Sua 3Aフラグメント中の遺伝子の配向は、pBG 93中の
pUC 19 lacプロモーターからIPTGによりBialaphos耐性
が誘導されえたことを示す実験により示された。IPTG
(0.5mM)が存在すると、Bialaphos含有M9培地上でのpB
G93/W3110の耐性は5から50μg/mlへと増加した。pBG 9
3のないW3110宿主はBialaphos 5μg/mlを含有するM9培
地上では増殖しなかった。これらの実験は、Sau 3Aフラ
グメントは活性を失うことなくサブクローンされうるこ
とを示した。これらの実験は、添付第2図に示すように
適当な配向も提供した。これらのクローンがコードする
蛋白質は、S.lividansの抽出物由来の結合転写−翻訳シ
ステム(文献7)を使用して検出した。Sau 3Aフラグメ
ントの配向に応じ、異なる大きさの翻訳産物、すなわち
pBG 94については22Kd,pBG 93については±28Kdが観察
された。このことは、Sau 3Aフラグメントは完全な耐性
遺伝子を含有しないことと、pUC 19配列の翻訳の結果と
してのポリペプチド配列を含む融合蛋白質が形成される
ことを示した。 大量の蛋白質を得るため、pBG 1からの1.7Kb Pst Iフ
ラグメントを高いコピー数のStreptomyceteレプリコンp
IJ 385にクローン化した。得られたプラスミドpBG 20を
使用してS.hygroscopicus形質転換した。このプラスミ
ドを含む形質転換体は5倍以上のPPIアセチル化活性を
有し、又、ドデシル硫酸ナトリウムゲル(SDSゲル)上
で大量の22Kd蛋白質を有していた。さらに、Bialaphos
の産生が始まったときに、アセチルトランスフェラーゼ
と22Kd蛋白質の両者が出現した。in vitroのデータ、合
成速度(kinetics)、及びpBG 20形質転換体に伴う増幅
された発現の相関は、この22Kdバンドが遺伝子産物であ
ることを強く示唆した。 625bpのSau 3Aフラグメントの完全ヌクレオチド配列
をそのフランキング(flanking)配列と共に決定した。
コンピューターでの分解により、Sau 3Aフラグメントの
全長に亘り読み取り枠(open reading frame)が存在す
ることが明らかになった。 sfr遺伝子産物の特性化 「sfr」遺伝子の読み取り枠が実際にBialaphos耐性酵
素をコードしていることを決定するために一連の実験を
実施した。耐性遺伝子の5′末端を決定するために外酵
素のNH2末端配列を決定した。前記の配列を決定するた
めに使用した手法の詳細に関しては、J.VANDEKERCKHOVE
(Eur.J.Bioc.152,p9〜19,1985)が開発した方法と、18
85年10月1日出願の仏国特許出願No.85 14579及び1985
年9月2日出願の仏国特許出願No.85 13046を引用する
が、これら全ては引用によって本明細書に含まれる。 この手法により、登録商標POLYBRENEとして市販のポ
リ四級アミンでコートしたグラスファイバーシート上
に、ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアクリルア
ミドゲルで予め分離した核酸と蛋白質を固定化できる。
本質的にニトロセルロース膜上への蛋白質ブロッティン
グによって移す(文献8)。このことによりアミノ酸組
成と、固定化した蛋白質の部分配列が決定される。S.hy
groscopicus pBG 20により産生された固定化した22Kd蛋
白質を含有するシートの部分を切り取り、このディスク
をガス相シーケンサー(sequenator)の反応室に載置
し、グラスファイバーに結合した22Kd蛋白質をEdman分
解操作にかけて、次のアミノ酸配列:Pro−Glu−Arg−Ar
g−Pro−Ala−Asp−Ile−Arg−Argを得た。 この配列は、625bpのSau 3Aフラグメントの読み取り
枠から推定されたアミノ酸配列と一致した。これはコド
ン3から12までの範囲に対応した。 従って、22Kd蛋白質のNH2−末端はこの配列の上流に
あった。実際の蛋白質の翻訳はアミノ酸2個分前のGTG
開始コドンで開始されるようであった。GTGはストレプ
トミセスで開始コドンとしてしばしば使用され、メチオ
ニンとして翻訳される。GTG開始コドンから翻訳される
蛋白質は、183個のアミノ酸長であり、分子量20550を有
するであろう。これは観察された約22000の分子量と良
く一致した。 さらに、終結コドンTGAはSau 3A部位のすぐ下流に位
置した。BamH I部位で消火したpUC 19への625bp Sau 3A
フラグメントのクローニングでは終結コドンは再構築さ
れなかった。このことにより、in vitroの転写−翻訳
分析で観察された融合蛋白質が説明された。 PPT−耐性の機構 耐性遺伝子そしてその遺伝子産物の最初の表現型と物
理的特性のいくつかを定義した後、耐性を付与する機構
を理解するために一連の実験を行った。上述のように、
PPTはグルタミン合成酵素(GS)を阻害するBialaphosの
部分であり、N−アセチルPPTは阻害剤ではない。標準
アッセイ(文献9)を使用すると、S.hygroscopicus AT
CC 21705誘導体はS.lividnas内に見られないPPTアセチ
ルトランスフェラーゼを含有することが示された。活性
はBialaphosトリペプチドをアセチル化しない。pBG 20
又はpBG16(もう1つのstreptomyceteベクターpIJ 680
内でクローン化した625 bp Sau 3Aフラグメントを含有
するプラスミド)内にクローン化した耐性遺伝子を有す
るS.lividansも、PPTをアセチル化しBialaphosをアセチ
ル化しえない活性を有していた。pBG 20/S.lividansの
抽出物により製造されたPPT由来の反応産物を単離し
て、それが実際アセチル−PPTであることを確認した。
質量分光分析により、分子量はPPTに対して1つのアセ
チル基と等しい分だけ増加していることが示された。従
って、625bpのSau 3AフラグメントはPPTアセチルトラン
スフェラーゼをコードする配列を含有すると結論した。 上記開示の手法に使用した実験条件及び試薬は次の通
りであった: 上記で使用した培地及びバッファの製法及び組成 1゜P培地:庶糖10.3g,K2SO40.025g,MgCl2・6H2O0.20
3g及び微量元素溶液0.2mlを80mlの蒸留水に溶解し、オ
ートクレーブにかける。次いで、1mlのKH2PO4(0.5
%),10mlのCaCl2・2H2O(3.68%)及び10mlのTESバッ
ファ(0.25M,pH7.2)を順次加える。微量元素溶液(1
当り):ZnCl2,40mg;FeCl3・6H2O,200mg;CuCl2・2H2O,
10mg;MnCl2・4H2O,10mg;Na2B4O7・10H2O,10mg;(NH4)6
Mo7O24・4H2O,10mg。 2゜R2YE:庶糖10.3g,K2SO40.025g,MgCl2・6H2O1.012g,
グルコース1g,Difcoカザミノ酸0.01g及びDifco寒天2.2g
を80mlの蒸留水に溶解し、オートクレーブにかける。微
量元素溶液0.2ml,KH2PO4(0.5%)1ml,CaCl2・2H2O(3.
68%)8.02ml,L−プロリン(20%)1.5ml,TESバッファ
(0.25M,pH7.2)10ml,NaOH(1M)0.5ml,酵母抽出物(10
%)5mlを順次加える。 3゜TE:10mM TRIS HCl,1mM EDTA,pH8.0 4゜YEME:Difco酵母抽出液(0.3%),Difcoペプトン
(0.5%),オキソイドモルト抽出物(0.3%),グルコ
ース(1%)。 S.lividansプロトプラストの形質転換 1. 250mlのバッフル付きのフラスコ中で、YEME25ml,34
%庶糖,0.005H MgCl2,0.5%グリシンからなる培養物を3
0〜36時間遠心する。 2. ペレットを10.3%庶糖中に懸濁し、遠心する。この
洗浄をもう1回繰り返す。 3. 菌糸体を4mlのリゾチーム溶液(MgCl2及びCaCl2の
濃度を0.0025Mに減少させたP培地中1mg/ml)に懸濁
し、30℃で15〜60分間インキュベートする。 4. 5mlのピペットで3回ピペッティッングすることに
より溶液を混合し、さらに15分間インキュベートする。 5.P培地(5ml)を加え、ステップ4と同様にピペッティ
ングして混合する。 6. 綿ウールを通して溶液を過し、ベンチ遠心(800
×G)7分間でゆっくりとプロトプラストを沈澱させ
る。 7. プロトプラストを4mlのP培地に懸濁し、再度遠心
する。 8. ステップ7を繰り返し、上清を捨てた後に残ったP
培地の滴にプロトプラストを懸濁する(形質転換用)。 9. 20μ未満のTE中のDNAを加える。 10. 直ちに0.5mlのPEG1000溶液(2.5gPEGを、2.5%庶
糖7.5ml,0.0014 K2SO4,0.1H CaCl2,0.05M TRIS−マレイ
ン酸,pH8.0に溶解し、微量元素を加えたもの)を加え、
成分を混合するために1回ピペッティングする。 11. 60秒後に、5mlのP培地を加え、ゆっくり遠心して
プロトプラストを沈降させる。 12. ペレットをP培地(1ml)に懸濁させる。 13. 0.1mlをR2YEプレート(例えば層流キャビネット中
で新鮮重量の85%まで乾燥した形質転換用プレート)に
載せる。 14. 30℃でインキュベートする。 A−「sfr」遺伝子カセットの構築 植物の発現ベクター内でクローニングさせるために
「sfr」遺伝子カセットを構築した。 「sfr」遺伝子フラグメントを含有するプラスミドpGB
39からFok I−Bgl IIフラグメントを単離すると、開始
コドンを含む最初の数コドンと終結コドンを含む最後の
数コドンが消失した。 「sfr」遺伝子のこのフラグメントは適当なアミノ酸
をコードする合成オリゴヌクレオチドによりin vitrod
で再構築することができた。 相補的な合成オリゴヌクレオチドは5′−CATGAGCCCA
GAAC及び3′−TCGGGTCTTGCTGCであった。 このような合成オリゴヌクレオチドを使用することに
より、「sfr」遺伝子の5′末端を再形成でき、GTG開始
コドンは、植物細胞によって良く翻訳されるコドン、特
にATGコドンで置換され得た。 次に、「sfr」遺伝子と結合したオリゴヌクレオチド
を含有するDNAフラグメントを適当なプラスミドに挿入
した。このプラスミドは所与のヌクレオチド配列を含有
しており、以後「アダプター」フラグメントで示す。 このアダプターフラグメントは: −「sfr」遺伝子の最後の数コドンを再形成しうるTGA終
結コドン; −合成オリゴヌクレオチドで部分的に再形成した「sf
r」遺伝子を含むヌクレオチド配列のフラグメントを挿
入させうる適当な制限部位、この挿入により完全な(in
fact)「sfr」遺伝子を再構築した; −「sfr」遺伝子全体を単離するための適当な制限部位
からなっていた。 次に、適当な植物のプロモーター配列を有するもう1
つのプラスミドに「sfr」遺伝子を挿入した。植物のプ
ロモーター配列はカリフラワーモザイクウィルスのプロ
モーター配列(p35S)からなった。もちろん本発明はこ
の特定のプロモーターの使用に限定されるものではな
い。他の配列、例えば後記するTR1′−2′プロモータ
ー領域及びArabidopsis thalianaからのRubisco小サブ
ユニット遺伝子のプロモーターフラグメントも植物に適
するプロモーターとして選択し得た。 1゜プラスミドpLK 56.2の構築(第3図) プラスミドpLK 56.2の構築は次の一連の制限部位:Sma
I,BamH I,Nco I,Kpn I,Bol II,Mlu I,BamH I,Hind III
及びXba Iを含む好適なアダプターを得ることを目的と
した。 この構築に使用した出発プラスミドpLK 56,pJB 64及
びpLK 33はBOTTERMAN(文献11)が開示したものであっ
た。 本明細書中以下に記載のDNAフラグメントを単離し、
低融点アガロース(LGA)から分離した。 酵素BamH I及びNde IでプラスミドpLK 56を開裂し
た。プラスミドpJB 64から得たNco I−Nde Iフラグメン
ト(図面中、破線の弧「a」で示した)でpLK 56中の
「b」で示すBamH I−Nde Iフラグメントを置換した。
E.coliのDNAポリメラーゼI(クレノーフラグメント)
デBamH IとNco Iのはみ出した末端を充填(fill in)し
た後、連結できた。 T4DNAリガーゼにより特に再環化を行った。新しいプ
ラスミドpLK 56.3が得られた。 このプラスミドを酵素Xba IとPst Iで開裂した。 pLK 33(c)のBamH I−Pst Iフラグメント(第3
図)の各々の末端をクレノー(Klenow)フラグメントで
補修してから、pLK 56.3のXba I−Pst Iフラグメント
(d)と置換した。 T4DNAリガーゼで再環化した後、得られたプラスミドp
LK 56.2は以後の「sfr」遺伝子の挿入のために必要な制
限部位を含むヌクレオチド配列を含有した。 2゜プラスミドpGSH 150(第4A図)の構築 最後に述べた構築と平行して、植物細胞のポリメラー
ゼが識別するプロモーター配列を含有し、転写方向でこ
のプロモーター配列の下流に好適な制限部位を含むプラ
スミドが製造された。この制限部位は、次にpLK 56.2か
ら得られる「sfr」遺伝子を植物プロモーターの制御下
で挿入し得るようにするためのものである。 プラスミドpGV 825はBEBLAERE他(文献10)に記載さ
れている。プラスミドpJB 63はBOTTERMAN(文献11)か
らのものである。 pGV 825をPvu IIで直線化し、T4DNAリガーゼで再環化
させると、(e)で示す内部Pvu IIフラグメントが欠落
した(プラスミドpGV 956)。 次にBamH I及びBgl IIでpGV 956を開裂した。 pJB 63から得たBamH I−Bgl IIフラグメント(f)を
子牛小腸ホスファターゼ(CIP)で脱リン酸化し、pGV 9
56のBamH I−Bgl IIフラグメンノに代えて挿入した。 T4DNAリガーゼで再環化させ、プラスミドpGV 1500を
得た。 プラスミドpGSH 50から得たEcoR −Hind IIIフラグメ
ントを精製した。プラスミドpGSH 50はVELTEN他(文献1
3)に記載の2重のTR1′−2′プロモーターフラグメン
トを有していた。このフラグメントをpGV 1500に挿入
し、Hpa I及びHind IIIで消化するとpGSH 150が得られ
た。 このプラスミドはT−DNA転写体7の3′末端の前の
プロモーターフラグメント及びクローニング用のBamH I
−Cla I部位を含有している。 3゜プラスミドpGSJ 260の構築(第4B図) CP3はpBR 322由来のプラスミドであり、BamH Iフラグ
メント内にカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモ
ーター領域を含んでいる。 pGSH 150をBamH IとBgl IIで切った。 p35Sプロモーターのヌクレオチド配列を含有するCP3
のBamH I−Bgl IIフラグメント(h)でpGSH 150のBamH
I−Bgl IIフラグメント(i)を置換してプラスミドpG
SJ 250を形成した。次にBgl II制限部位でpGSJ 250を開
環した。 mGV2(文献12)から得たBamH IフラグメントをpGSJ 2
50のBgl II部位に挿入してプラスミドpGSJ 260を形成し
た。 しかしながら、pLK 56.2から得られる「sfr」遺伝子
をプラスミドpGSJ 260に挿入する前に、より実際的な方
法で挿入させるためにpLK 56.2更に改変することが依然
望ましかった。従って、pLK 56.2はpGSR1を得るために
下記のようにさらに改変した。 プラスミドpGSJ 260から出発して、植物細胞の形質転
換のために2つのプラスミドが構築された: −植物細胞の細胞質内で「sfr」遺伝子を発現させる第
1のプラスミド, −植物細胞の葉緑体にBialaphos−耐性酵素を運搬する
よう改変した第2のプラスミド。 第1の場合:植物細胞の細胞質内で「sfr」遺伝子を発
現しうるプラスミド 植物の発現ベクター(pGSR2)内のsfr遺伝子カセットの
クローニング(第5図) 第5A図に、pLK 56.2のアダプターのヌクレオチド配列
を示す。特にBamH I,Nco I,Bol II制限部位の位置を示
す。 このアダプターフラグメントを酵素Nco IとBgl IIに
よって開裂した。 第5B図はFok I−Bgl IIフラグメント(j)を示して
いる。これはpBG 39より得られた。これら2つの制限部
位の位置は第2図に示す。 合成オリゴヌクレオチドを使用して、「sfr」遺伝子
の最初の数コドン、特に遺伝子の5′末端を再形成し
た。この5′末端では最初のGTGコドンがATG開始コドン
に置換されていた。 次に合成オリゴヌクレオチドで完結したこのFok I−B
gl IIフラグメントをpLK 56.2中のアダプターのNco I−
Bgl IIフラグメントと置換した。T4DNAリガーゼによる
再環化後に、遺伝子の3′末端もこのようにして再形成
した。得られたプラスミドpGSR1はこのようにそのアダ
プター内に挿入された完全な「sfr」遺伝子を含有して
いた。 次にプラスミドpGSJ 260をBamH Iで開裂し(第5C
図)、全「sfr」遺伝子を含有するpGSR1から得たBamH I
フラグメントをpGSJ 260に挿入した。 得られたプラスミドpGR 2(第6A図参照)はpBR 322レ
プリコン、細菌のストレプトマイシン耐性遺伝子(SDM
−SP−AD−トランスフェラーゼ)及び, −T−DNAの境界(border)フラグメント: −植物細胞内で優性選択可能なマーカーを提供するキメ
ラカナマイシン遺伝子;及び −キメラ「sfr」遺伝子 からなる遺伝子工学で処理したT−DNAを含有してい
た。 キメラ「sfr」遺伝子は −カリフラワーモザイクウィルスのプロモーター領域
(p35S); −第5図に記載の「sfr」遺伝子カセット; −T−DNA転写体7のポリアデニル化信号を含む3′の
未翻訳領域 からなっていた。 DEBLAERE他(文献10)が記載した手順に従ってpGSR 2
をAgrobacterium tumefaciens受容体C58ClRifR(pGV226
0)に導入した。 N.tabacum SR1植物にキメラ「sfr」遺伝子を導入する
ためにこの株を使用した。 pGSR 2由来の2つの変異プラスミド、すなわちpGSFR
280とpGSFR 281とを構築した。それらは転写開始部位に
続く非翻訳配列が異なっている。pGSR 2ではこのフラグ
メントは次の配列:GAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCGGATCCA
TGからなり、一方、pGRS 280ではGAGGACACGCTGAAATCACC
AGTCTCTCTACAAATCGATCCATGからなり、pGSFR 281ではGAG
GACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTACAAATCGATGからなるが、
ここでATGコドンは「sfr」遺伝子の開始コドンである。
「sfr」遺伝子は又プラスミドpGSH 150のTR1′−2′プ
ロモーターに融合すると(第4A図)、pGSFR 160とpGSFR
161となる(第6B図)。これらのプラスミドはpTR 2「s
fr」遺伝子配座で少し差があり、pGSFR 161(配列につ
いては文献13参照)では「sfr」遺伝子は内因性遺伝子
2′ATGに正確に融合し、一方、pGSFR 160では4つの過
剰な塩基対(ATCC)がATGの直前に存在する。この他の
点では、p65FR 161とp65FR 160は完全に同じである。 共組込み(cointegration)により全てのプラスミド
をAgrobateriumのアクセプタ−プラスミドpGV 2260に導
入すると、各々プラスミドpGSFR 1280,pGSFR 1281,pGSF
R 1160及びpGSFR 1161が得られる。 第2の場合:トランジッドペプチトをコードするDNA配
列の下流に「sfr」遺伝子を含有し、「sfr」遺伝子発現
産物を次いで植物細胞の葉緑体内に輸送させるに適する
プラスミドの構築 もう1組の実験では、「sfr」遺伝子を含有するヌク
レオチド配列を、トランジットペプチドをコードするDN
A配列に融合し、それを葉緑体へ運搬させ得るようにし
た。 「sfr」遺伝子のフラグメントは上記のアダプターフ
ラグメントから単離し、トランジットペプチドに融合し
た。合成オリゴヌクレオチドを使用し、完全な「sfr」
遺伝子を再構築し、トランジットペプチドに融合した。 トランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含有するプラスミド(下記のプラスミドpATS3)はそ
のプロモーター配列も含んでいた。 トランジットペプチドをコードするDNA配列に融合した
「sfr」遺伝子を含有するプラスミドpGSR4の構築(第7
図) プラスミドpLK57はBOTTERMAN(文献11)からのもので
ある。プラスミドpATS3は、遺伝子のトランジットペプ
チドヌクレオチド配列とプロモーター領域を含むArabid
opsis thalianaからの2Kb EcoR IゲノムDNAフラグメン
トを含んでいるpUC19クローンであり、その発現はリブ
ロース二リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニット
(ssu)である。A.thalianaの小さいサブユニットを150
0bp EocR I−Sph Iフラグメントとして単離した。Sph I
開裂部位は、成熟ssu蛋白質のコード領域が正に始まる
部位にある。 プラスミドpLK57とpATS3をEcoR IとSph Iで開環し
た。T4DNAリガーゼで再環化したのち、トランジットペ
プチド(Tp)をコードする配列とそのプロモーター領域
(Pssu)を含有する組換えプラスミドpLKAB1を得た。 シグナルペプチドの開裂部位に「sfr」遺伝子を正確
に融合するために、先ずN−末端遺伝子配列を改変し
た。「sfr」遺伝子とN−末端遺伝子の融合体はその酵
素活性を保持することが観察されたので、第2コドン
(AGC)をGACに改変し、ATG開始部位と重なっているNco
I部位を得た。新しいプラスミドpGSSFR2を得た。これ
は、上記の変異の点だけがpGSR1と異なる(第5B図)。p
GSFR2から得たNco I−BamH Iフラグメントをトランジッ
トペプチド配列のSph I末端に融合した。同時に、「sf
r」遺伝子フラグメントをssu遺伝子のATGイニシエータ
ーに正確に融合した(図示せず)。 「sfr」遺伝子の種々の植物種への導入 キメラ遺伝子を含有する適当なベクターで植物を形質
転換したときにそのキメラ遺伝子の発現により植物中で
誘導されたBialaphos耐性を次のように示した。DEBLAER
Eら、Nucl.Acid.Res.,13,p1477,1985に記載の手順に従
って、Agrobacterium株のC58C1RifR(pGV2260)内に動
態化(mobilization)により「sfr」遺伝子を含有する
組換えプラスミドを別々に導入した。ハイブリッドTiプ
ラスミドを含有する組換え株を形成した。本質的にHORS
Hら,Science,vol.227,1985に記載の方法により、これら
の株を用いて種々の植物種の葉に感染させそれを形質転
換した。1例として種々の植物種の形質転換操作を下記
に示す。 1.Nicotiana tabacumの葉のデイスクの形質転換 使用培地を次に示す: A1MS塩/2 +1%庶糖 0.8%寒天 pH 5.7 A10B5−B培地 +250mg/ NH4NO3 750mg/ CaCl22H2O 0.5g/ 2−(N−モルホリノ)エタ ンスルホン酸(MES) pH 5.7 30g/庶糖 A11B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 2%グルコース 0.8%寒天 40mg/アデニン +1mg/ 6−ベンジルアミノプリ ン(BAP) 0.1mg/インドール−3−酢酸(IA A) 500mg/クラホラン(Claforan) A12B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 2%グルコース 0.8%寒天 40mg/アデニン +1mg/ BAP 200mg/クラホラン A13MS塩/2 +3%庶糖 0.5g/ MES pH 5.7 0.7%寒天 200mg/クラホラン 細菌培地=min A:(Miller 1972)60mM K2HPO4,3H2O, 33mM KH2PO4: 7.5mM(NH4)2SO4 1.7Mクエン酸3ナトリウム; 1mM MgSO4; 2g/グルコース; 50mg/ビタミンB1 −植物材料: Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1 培地A1で6〜8週継代培養後に植物を使用する。 −感染: −葉から中央脈と端を除去する。 −残りの部分を約0.25cm2の切片に切り、感染培地A10内
に置く(10mlA10を含有する9cmのペトリ皿に約12切
片)。 −次にmin A培地中で増殖させたAgrobacterium株の後期
対数(late log)培養物(25μ/ペトリ皿当り)で切
片を感染させる。 −低い光度で2〜3日間ペトリ皿をインキュベートす
る。 −2〜3日後に培地を除去し、クラロファン(clarofa
n)500mg/を含有する20mlの培地A10で置き換える。 −選択と発芽の誘導 −選択試薬: 100mg/のカナマイシン及び 10〜100mg/のホスフィノトリシン を含有する培地A11上に葉のディスクを置く。 −毎週、葉のディスクを新しい培地に移す。 −3〜4週後に再生カルスが生ずる。それらを分離し、
選択に使用したと同じ濃度の選択試薬を含有する培地A
12上に置く。 −発根(rooting) −2〜3週後にカルスは芽でおおわれ、これは単離して
発根培地A13に移すことができる(選択なし)。 −発根に1〜2週間かかる −さらに2〜3週後に、これらの植物を培地A1上で増殖
する。 2.Solanum tuberosum(じゃかいも)の塊茎ディスクの
感染 使用培地を下記に示す: C1B5−培地 +250mg/ NH4NO3 300mg/ (CaCH2PO4)2 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ポリビニルピロリドン(PVP) 40g/マンニトール(=0.22M) 0.8%寒天 40mg/アデニン C2B5−培地 +250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH5.7 0.5g/ PVP 40g/マンニトール 40mg/アデニン 0.8%寒天 +0.5mg/トランスゼアチン(trans zeatine) 0.1mg/ IAA 500mg/クラファン C5MS塩/2 +3%庶糖 0.7%寒天 pH 5.7 C7B5−培地 250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 20g/マンニトール 20g/グルコース 40mg/アデニン 0.6%アガロース +0.5mg/トランスゼアチン 0.1mg/ IAA 500mg/クラロファン C8B5−培地 +250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 20g/マンニトール 20g/グルコース 40mg/アデニン 0.6%アガロース +200mg/クラロファン 1mg/トランスゼアチン C9B5−培地 +250mg/ NH4NO3 400mg/グルタミン 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 20g/マンニトール 20g/グルコース 40mg/アデニン 0.6%アガロース +1mg/トランスゼアチン 0.01mg/ ギベレリン酸 A3(GA3) 100mg/クラロファン C11MS塩/2 +6%庶糖 0.7%寒天 細菌培地:min A:(Miller 1972)60mM K2HPO4,3H2O; 33mM KH2PO4; 7.5mM(NH4)2SO4; 1.7Mクエン酸3ナトリウム; 1mM MgSO4; 2g/グルコース; 50mg/ビタミンB1 −植物材料 Solanum tuberosum c.v Berolina c.v Dsireの塊茎 −感染 −じゃがいもの皮をむき、水で洗う。 −次に、市販の濃い漂白剤で20分間洗い、そして −滅菌水で3〜5回すすぐ。 −外側の層を除去する(1〜1.5cm) −中心部を約1cm2、厚さ2〜3mmのディスクに切る。 −ディスクを培地C1上に置く(9cmのペトリ皿に4
片)。 −min A培地中で増殖したAgrobacteriumの後期対数培養
物10μを各ディスクに加える。 −低い光度で2日間ディスクをインキュベートする。 −選択と発芽誘導 −ディスクを濾紙上で乾燥させ、100mg/のカナマイシ
ンを含有する培地C2に移す。 −1ケ月後にディスクから小さいカルスを除去し、カナ
マイシン50mg/含有する培地C7にカルスを移す。 −さらに2〜3週後に、カナマイシンを50mg/含有す
る培地C8にカルスを移す。 −小さい芽が発育しはじめたら、カナマイシンを50mg/
含有する伸長培地C9にカルスを移す。 −発根 −伸びた芽を分離して、発根培地C11に移す。 −発根した芽を培地C5上で増殖させる。 3.Lycopersicum esculentum(トマト)の葉のディスク
の感染使用培地は次の通りである: A1MS塩/2 +1%庶糖 0.8%寒天 pH 5.7 B1B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 300mg/ Ca(H2PO4)2 2%グルコース 40mg/アデニン 40g/マンニトール B2B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 40g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラホラン B3B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 30g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラロファン B4B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 20g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラロファン B5B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン 10g/マンニトール +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 500mg/クラロファン B6B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン +0.5mg/トランスゼアチン 0.01mg/ IAA 200mg/クラロファン B7B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 400mg/グルタミン 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン +1mg/トランスゼアチン 200mg/クラロファン B8MS塩/2 +2%庶糖 0.5g/ MES pH 5.7 0.7%寒天 B9B5−培地 +250mg/ NH4NO3 0.5g/ MES pH 5.7 0.5g/ PVP 2%グルコース 0.6%アガロース 40mg/アデニン +1mg/トランスゼアチン 0.01mg/ GA3 細菌培地=min A:(Miller 1972)60mM K2HPO4,3H2O; 33mM KH2PO4; 7.5mM(NH4)2SO4; 1.7Mクエン酸3ナトリウム; 1mM MgSO4; 2g/グルコース; 50mg/ビタミンB1 −植物材料 Lycopersicum esculentum cv.Lucullus. 培地A1で6週継代培養後に植物を使用する。 −感染 −中央脈を葉から除去する。 −葉を約0.25〜1cm2の切片に切る(葉の端は傷つけない
ようにして、最大限葉片の3つの側のみが傷つく)。 −切片を感染培地B1に(上下返して)置く。9cmのペト
リ皿中約10個の切片である。 −次にmin A培地中で増殖したAgrobacterium株の後期対
数培養物20μ/ペトリ皿を使って切片を感染させる。 −ペトリ皿を低光度で2日間インキュベートする。 −2日後に培地を除去し、クラロファン500mg/を含有
する培地B1(20ml)で置き換える。 −選択と発芽誘導 −培地B2+50又は100mg/のカナマイシンの中に葉のデ
ィスクを置く。 −マンニトールの濃度を低くすることにより、5日毎に
培地の浸透圧を下げ、培地B3,B4,B5及びB6に連続的に移
す。 −1ケ月後に分裂組織を有するカルスを葉のディスクか
ら分離し、50又は500mg/のカナマイシンを含む培地B7
上に置く。 −小さい芽が形成されたら、50〜100mg/のカナマイシ
ンを含有する伸長培地B9にカルスを移す。 −発 根 −伸長した芽を分離し、発根用培地B8に移す。 −植物を培地A1上で成長させる。 除草剤耐性に関する温室試験 材料と方法 この実験では、活性成分としてホスフィノトリシンを
含む2つの除草剤を使用する。 これらの化合物は登録商標BASTARとMEIJI HERBIACER
として市販されている。 これらの化合物を蛇口からの水で2%まで希釈する。
4角から1m2の場合にスプレーする。温度の温度は、タ
バコとトマトについては約22℃、じゃがいもについては
10℃より高く15℃までである。 結果 −タバコのスプレーテスト a)pGSFR1161又はpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」
遺伝子で形質転換したNicotiana tabacum cv.Petit Hav
ana SR1植物及び形質転換していない対照植物(10〜50c
mの高さ)を20/haのBASTARで処理する。対照SR1植物
は6日後に枯れたが形質転換した植物は20/hanoBASTA
Rに十分耐性であり、未処理植物と区別できない程の成
長を続ける。2週毎に処理を繰り換しても目で判断でき
る程の損傷は検出されない。その後の開花に対しても該
処理の影響はない。農業におけるBASTAR除草剤の推奨使
用量は2.5〜7.5/haである。 b)8/haのMEIJI HERBIACERを使用して同様の実験を
実施する。(上記と同じ)形質転換植物は十分に耐性で
あり、未処理植物とは区別できない程の成長を続ける。
目で判断できる程の損傷は検出されえない。 −じゃがいものスプレーテスト pGSFR1161又はpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」遺
伝子で形質転換した及び形質転換していないじゃがいも
(Solanum tuberosum cv.Berolina)(高さ20cm)をBAS
TAR20/haで処理する。対照植物は6日後に枯れるのに
対し、形質転換した植物では目で判断できる程の損傷は
全く見られず、未処理植物と区別できない程成長する。 −トマトのスプレーテスト pGSFR1161又はpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」遺
伝子で形質転換した及び形質転換していないトマト植物
(Lycopersium esculentum c.v.Iuculus)(高さ25cm)
を20/haのBASTARで処理する。対照植物は6日後に枯
れるのに対し、形質転換した植物は十分耐性である。そ
れらは目で判断できる程の損傷を全く示さず、未処理植
物と区別できない程成長している。 −形質転換植物による植物病原菌の増殖の制御 もう1組の実験で、pGSFR1161又はpGSFR1281に存在す
るキメラ「sfr」遺伝子を発現するじゃがいも植物を高
湿度、20℃の温度の部屋の中で成長させる。1ml当り106
個のPhytophtora infestansの懸濁液1mlをスプレーして
植物に接種する。成長室(20℃,湿度95%,4000ルック
ス)内で、菌病の症候が見られるまで(1週間)植物を
成長させる。この時に1組の植物にBialaphosを8/ha
スプレーする。2週間後末処理植物は真菌に完全に汚染
される。真菌の増殖はBialaphos処理した植物では止
り、それ以上疾患の症候群は表わされない。植物はBial
aphosの殺真菌作用により有効に保護される。 −種子を介するPPT耐性の伝達 pGSFR1161及びpGSFR1281に存在するキメラ「sfr」遺
伝子を発現する形質転換したタバコ植物を室温内で開花
させる。これらは正常の生殖能を有している。 各植物の約500個のF1種子を土壌にまく。F1とは第一
世代の種子すなわち最初に形質転換した植物から直接得
る種子を表わす。実生の植物が2〜3cmの高さになった
ときに8/haのBASTARをスプレーする。7日後に、健
常な植物と損傷と損傷を受けた植物とは約3:1の比で識
別される。このことから、PPT耐性は単一の遺伝子座に
よりコードされる優性マーカーとして受け継がれること
が示される。 10個の耐性F1実生殖物を成熟するまで成長させ、種子
を収穫する。F2の実生植物を上述のように成長させ、8
/haのBASTARをスプレーすることによりPPT−耐性につ
いてのテストをする。F1植物のいくらかは全部がPPTP耐
性のF2の実生植物を産み出し、このことはこれらの植物
が耐性遺伝子について同型接合性であることを示してい
る。本発明は、本発明のGS−阻害剤不活化遺伝子で本質
的に非生物学的に形質転換した植物細胞及び植物にも関
する。 本発明の好ましい実施態様では、植物細胞及び植物は
上記の「sfr」遺伝子で非生物学的に形質転換する。 これらの植物細胞及び植物はそれらのゲノム内に安定
に組込まれ、検出しうる量のホスフィノトリシン−アセ
チルトランスフェラーゼを産生しうるようにする非種特
異的な特性を有する。 この特性は形質転換した植物細胞及び植物に、Bialap
hosやPPTのようなGS阻害剤を不活化又は中和しうる非種
特異的な酵素活性を付与する。 従って、本発明により形質転換した植物細胞及び植物
はBialaphosや関連化合物の除草作用に対して耐性とな
る。 Bialaphosは最初に殺真菌剤として記載されたもの
で、形質転換した植物は化合物を数回スプレーすること
により真菌疾患に対しても保護されうる。 好ましい実施態様では、Bialaphos又は関連化合物を
特に約20〜100日間隔で数回施用する。 本発明は、畑を除草剤で処理するステップからなる、
植物種を真菌疾患に対し選択的に保護し、畑の雑草を選
択的に撲滅する新しい方法にも関連する。ここで植物種
はそのゲノム内にGS阻害剤を中和又は不活化しうる酵素
活性を有する蛋白質をコードするDNAフラグメントを含
有しており、使用する除草剤は活性成分としてGS阻害剤
を含んでいる。 本発明による方法は、植物が真菌に感染していなけれ
ば土地の雑草を撲滅するためのみに、あるいは雑草を撲
滅した後に真菌が出現したときには真菌の成長を停止さ
せるためだけにも同じ有効性で使用することができるこ
とは言うまでもない。 本発明方法の好ましい実施態様では、上記のような
「sfr」遺伝子を含むDNAフラグメントで植物種を形質転
換し、使用する除草剤はPPT又は関連化合物である。 従って、早く時期及び遅い時期に発芽する雑草を撲滅
するまで、栽培すべき植物種が出現した後に数回、例え
ばスプレーによりPPT又は関連化合物の溶液を畑に施用
する。 栽培すべき植物種の出現前に畑を除草剤組成物で処理
して雑草を撲滅することができるのは全く明らかであ
る。 同様に、栽培すべき植物種の種子をまく前にさえ畑を
処理することができる。 所望の植物種が出現する前に、Bialaphos型の除草剤
を含めた任意の入手しうる除草剤で畑を処理することが
できる。 所望の植物種が出現した後に、Bialaphos又は関連化
合物を数回施用する。 好ましい実施態様では、約20〜100日間隔で除草剤を
施用する。 Bialaphos−型の除草剤の除草作用に耐性を有するよ
うに栽培すべき植物を形質転換するので、栽培した植物
の出現後でさえ畑を処理することができる。 このことは、生産すべき植物に何ら作用することなく
早期に及び遅期に発芽する雑草を全体的に撲滅するのに
特に有用である。 好ましくは、Bialaphos又は関連化合物は約0.4〜約1.
6Kg/haの投与量で施用し、それを約2〜約8/haの割
合で畑に施用しうるような濃度に液体キャリアで希釈す
る。 次に、例示のために種々の植物種での本方法のいくつ
かの実施態様を示す実施例を挙げる。 −てんさい 北欧のてんさいは気候条件、より正確には雨量及び平
均温度により3月15日から4月15日にまく。雑草の問題
は多かれ少なかれ各国で同じであり、穀物が7月半ばに
そのキャノピー(canopy)を閉じるまでは面倒を引き起
こしうる。 雑草の問題を3つの場合に分けることができる: −草のような雑草(grassy weeds)の早期の発芽、 −広葉の雑草の早期発芽、 −広葉の雑草の遅い発芽。 現在までは、出現(出芽)前の除草剤が使用され成功
してきた。このような化合物は例えば登録商標:PYRAMIN
R,GOLTIXR及びVENZARRとして市販のものである。しかし
ながら、これらの化合物の乾燥した気候条件に対する感
受性と、遅く発芽した雑草をコントロールし得る残留活
性がないことから、濃民は出現前のものに加え出現後の
製品も使用するようになった。 下記第(I)表に次の実施例で記載する除草剤組成物
に含まれる活性成分を示す。 本発明によると、出現後の除草剤はBialaphos又は関
連化合物からなり、それらは一年生の草(Bromus,Avena
spp.,Alopecurus,POA)及び広葉(Galium,Polygonum,S
enecio,Solanum,Mercurialis)の成長のコントロールを
良好に行う。 てんさいの生育の種々の時点、即ち子葉期,2葉期又は
4葉期に出現後の除草剤を施用しうる。 第(II)表は例示のための可能な畑の処理方法を表わ
す。 それらの例では、種々の出現前得の除草剤と通に使用
するBialaphos類の出現後の除草剤はBASTARである。濃
度は/ha又はKg/haで示す。 −じゃがいも じゃがいもはヨーロッパでは約8×106haで栽培され
ている。雑草のコントロールに使用される主要な製品は
リヌロン(Linuron)/モノリヌロン又は商品名METRABU
ZINとして市販の化合物である。 これらの製品はほとんどの雑草の種に対し良好に作用
する。 しかしながら、Galium及びSolanumのような雑草や発
芽の遅いChenopodium及びPolygonumは常に有効にコント
ロールされるのではなく、一年草のコンオロールも時々
失敗する。 さらに、遅く発芽する広葉の雑草は、BASTARのような
除草剤を発芽後に施用することによってのみコントロー
ルしうる。 次の第(III)表はじゃがいもの場合の畑の処理のい
くつかの例を例示として示している。 第(III)表 じゃがいもをBASTAR耐性とする、BASTARの使用に基くじ
ゃがいもの雑草コントロールシステム リヌロン+モノリヌロン(375g+375g/ha) 発芽前 BASTAR3〜4/ha 発芽後(5〜15cm) BASTAR/ブチルフルアジホップ 発芽後(5〜15cm) (fluazifop−butyl)3〜4/ha+2/ha リヌロン(Linuron) WP 50%(AFALONR) モノリヌロン WP 47.5%(ARESSINR) ブチルフルアジホップ EL 250g/(FUSILADEDER) 上記で使用するpGSJ260及びpGB39株はドイツ、ゲッテ
ィングゲンの「German Collection of Micro−organism
s」(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)に1985
年12月12日に寄託し、各々の寄託番号はDSM 3 606及びD
SM 3 607であった。 本発明の別の態様を図面を参照して以下に説明する。
図中、第8図はもうひとつのBialaphos耐性遺伝子を含
有するプラスミドpJS1の制限地図を示し、 第9図は耐性遺伝子を含有する「sfrsv」遺伝子のヌク
レオチド配列を示し、 第10図は「sfrsv」遺伝子と「sfr」遺伝子のアミノ酸同
族体を示し、 第11図は1例として「sfrsv」遺伝子を含有し植物細胞
の形質転換に適したプラスミドの構築を示す。 もうひとつ別のBialaphos耐性遺伝子は別のBialaphos
産生株、すなわちstreptomyces viridochromogenesから
単離した。この第2の耐性遺伝子は以後「sfrsv」遺伝
子とよぶ。 後に植物細胞を形質転換するための、この第2の好ま
しい本発明のDNAフラグメントは、下記配列を有するボ
リペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド
配列から成る。 このポリペプチドの上記部分は、植物細胞内に遺伝学
的に取入れられて発現されたときにこの植物細胞に、Bi
alaphosに対する保護、すなわち「植物保護能」を付与
するのに充分な長さである。以後、上記ヌクレオチド配
列のBialaphosに対する「植物保護能」についても言及
する。 アミノ酸の一文字表記の意味を次に挙げる。 アラニン A ロイシン L アルギニン R リシン K アスパラギン N メチオニン M アスパラギン酸 D フェニルアラニン F システイン C プロリン P シスチン C セリン S グリシン G スレオニン T グルタミン酸 E トリプトファン W グルタミン Q チロシン Y ヒスチジン H バリン V イソロイシン I この第2の好ましいDNAフラグメントは次のヌクレオ
チド配列:またはその一部であってBialaphosに対する植物保護能
を有するポリペプチドを発現する部分から成る。 以下の説明は、「sfrsv」耐性遺伝子の単離と、この
耐性遺伝子を含有し、植物細胞をGS阻害剤に耐性とする
ために後に植物細胞を形質転換できる発現ベクターの構
築とに関するものである。 Streptomyces viridochromogenes由来のbialaphos耐性
「sfrsv」遺伝子のクローニング Streptomyces viridochromogenesDSM 40736株(文献
1)を増殖させ、標準法に従ってこの株の全DNAを調整
した。DNAのサンプルを、3回の別々の反応でそれぞれP
st I、Sma IおよびSau3A Iによって消化してアガロース
ゲル上で分離すると共に、pGSR1(第5B図)由来のプラ
スミドDNAをBamH Iで消火した。このDNAをSouthern解析
においてニトロセルロースフィルター上にブロットし、
「sfr」遺伝子を含有する。pGSR1由来の標準BamH Iフラ
グメントとハイブリダイズした。ゲルの4筒のレーン全
てで制限フラグメントはプローブとの強いホモロジーを
示していた。約3kbのPst Iフラグメント、約1.2kbのSma
Iフラグメント、および0.5kbのSau3A Iフラグメント。
この遺伝子をクローニングするために、Pst I制限フラ
グメントをEscherichia coliベクターpUC8に直接クロー
ニングした。形質転換後得られた3000個のコロニーをニ
トロセルロースフィルターに移し、「sfr」プローブと
ハイブリダイズした。陽性のものを選んで、300μg/ml
のPPTを含有する最少培地プレート上で増殖するかどう
かをさらに試験した。PPT含有培地で増殖する形質転換
体1個をさらに解析した。このプラスミドpJS1のプラス
ミドマップと関連の深い制限部位を第8図に示す。MC10
61(pJS1)は、1987年3月6日Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen(DSM)に寄託番号DSM4023で寄託され
ている。クローンの制限フラグメントをHaxam−Gilbert
の方法に従って配列決定し、この遺伝子のコード領域は
ホモロジーに基づいて同定できた。「sfrsv」遺伝子の
配列を第9図に示し、ヌクレオチドとアミノ酸の配列レ
ベルにおける「sfr」遺伝子とのホモロジーを第10図に
示す。 「sfrsv」遺伝子の発現 後の植物発現ベクター内でのクローニングを可能にす
るために「sfrsv遺伝子カセット」も構築した。GTG開始
コドンを次いた「sfrsv」コード領域を含有するBan II
−Bgl IIフラグメントをpJS1から単離した。このフラグ
メントを、「sfr」遺伝子について記載し第5図に示し
たものと類似の合成オリゴヌクレオチド5′−CATGAGCC
−3′と共に、Nco IおよびBgl IIで消化したベクターp
LK56−2中に連結した。pGSR1SVの構築の概略を第11図
に示す。pGSR1とpGSR1SVにはそれぞれ両遺伝子の類似の
カセットが存在するので、植物中での「sfr」遺伝子の
発現に関して既に記載した構築を繰り返すことができ
る。 プラスミドpGSR1SVを有するE.coli株の粗抽出物を酵
素解析した結果、PPTをアセチル化できるアセチラーゼ
の合成が確認された。これは反応生成物の薄層クロマト
グラフィーによって示された。 次い「sfrsv」遺伝子を、プラスミドベクターpGSJ260
(第4B図)中にCaMV35Sプロモーターの制御課で挿入し
てプラスミドpGS2SVを得た。このプラスミドはpGSR2
(第6A図)に似ているが「sfr」遺伝子が「sfrsv」遺伝
子で置換されている。 上述のタイプの除草剤耐性遺伝子がPPTまたはPPT誘導
体を生産する他の多くの微生物から得ることができると
いうことは明らかである。除草剤耐性遺伝子は次に、グ
ルタミン合成酵素阻害剤の作用に対して植物細胞を保護
するために植物細胞中に組込むことができる。たとえ
ば、Kitasotosporia(文献15)からBialaphos耐性遺伝
子が得られる。 いろいろな植物種を「sfr」遺伝子で形質転換する場
合について上述したのと同じAgrobacterium媒介形質転
換系を用いて、プラスミドpGSR2SVから、「sfrsv」耐性
遺伝子を含有する形質転換された植物細胞および植物を
得ることができる。 植物は再生されて、上述したのと類似のスプレー試験
によってその耐性を試験される。全ての植物が同様な挙
動を示し、グルタミン合成酵素阻害剤から成る除草剤に
対する耐性を示す。 最後に、本発明者はまた、上記定義の如きグルタミン
合成酵素の阻害剤に対する植物の耐性と、雑草のない前
記植物の栽培物の生産用の相当するグルタミン合成酵素
の阻害剤との組合せにも関する。 文献 1.BAYER et al.,HELVETICA CHEMICA ACTA,1972 2.WAKABAYASHI K.and MATSUNAKA S.,Proc.1982,British
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2,1986
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
C12N 9/10 C12N 5/00 C
(72)発明者 レーマンス,ヤン
ベルギー国、9210・ヘオースデン、エレ
ボクテン・38
(72)発明者 ボツテルマン,ヨハン
ベルギー国、9710・ツウエインアール
デ、イートストラート・37
(72)発明者 デ・ブロツク,マルク
ベルギー国、9219・ヘントブルツゲ、フ
オヘルホフウクストラート・32
(72)発明者 トンプソン,シヤルル
スイス国、1212・グラン・ランシ‐/ジ
ユネーブ、シユマン・デ・パレツト・19
(72)発明者 ムーバ,ラオ
スイス国、1202・ジユネーブ、アブニ
ユ・セシユロン、10
(56)参考文献 特開 昭63−71183(JP,A)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.(a)植物細胞のポリメラーゼによって認識される
プロモーターを含むプロモーター領域及び(b)アミノ
酸配列:(ここで、XはMet又はValである。)を含む蛋白質、又
はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性
をもつのに十分な長さの前記蛋白質の一部、をコードす
るDNA断片を含むコーディング領域を順に含むが、但し
前記プロモーターは前記DNA断片とは異種である、キメ
ラ遺伝子。 2.前記DNA断片がストレプトミセス(Streptomyces)
種由来であることを特徴とする請求の範囲第1項に記載
のキメラ遺伝子。 3.前記DNA断片が、ストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス(Streptomyces hygroscopicus)又はストレプト
ミセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochr
omogenes)由来であることを特徴とする請求の範囲第2
項に記載のキメラ遺伝子。 4.前記DNA断片が、ヌクレオチド配列: (ここで、NはA又はGである。)、又はホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ活性をもつのに十
分な長さの蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列の
一部、を含むことを特徴とする請求の範囲第1項に記載
のキメラ遺伝子。 5.前記プロモーターが、植物細胞のポリメラーゼによ
って認識されることを特徴とする請求の範囲第1〜4項
のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。 6.前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイル
スの35Sプロモーター、TR1′プロモーター、TR2′プロ
モーター、及びRubisco小サブユニットをコードする遺
伝子のプロモーターからなる群から選択されることを特
徴とする請求の範囲第5項に記載のキメラ遺伝子。 7.前記プロモーター領域と前記DNA断片との間に、葉
緑体トランジットペプチドをコードする第1DNAを更に含
むことを特徴とする請求の範囲第5項又は第6項に記載
のキメラ遺伝子。 8.前記1DNAが、Rubisco小サブユニットをコードする
遺伝子由来であることを特徴とする請求の範囲第7項に
記載のキメラ遺伝子。 9.ポリアデニル化シグナルを含有する3′非翻訳末端
を更に含むことを特徴とする請求の範囲第5〜8項のい
ずれか一項に記載のキメラ遺伝子。 10.前記非翻訳末端が、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のT−DNA遺
伝子由来であることを特徴とする請求の範囲第9項に記
載のキメラ遺伝子。 11.(a)植物細胞のポリメラーゼによって認識され
るプロモーターを含むプロモーター領域及び(b)アミ
ノ酸配列: (ここで、XはMet又はValである。)を含む蛋白質、又
はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性
をもつのに十分な長さの前記蛋白質の一部、をコードす
るDNA断片を含むコーディング領域を順に含むが、但し
前記プロモーターは前記DNA断片とは異種である、キメ
ラ遺伝子を含有するプラスミド。 12.前記DNA断片がストレプトミセス(Streptomyce
s)種由来であることを特徴とする請求の範囲第11項に
記載のプラスミド。 13.前記DNA断片が、ストレプトミセス・ハイグロス
コピカス(Streptomyces hygroscopicus)、又はストレ
プトミセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces virid
ochromogenes)由来であることを特徴とする請求の範囲
第12項に記載のプラスミド。 14.前記DNA断片が、ヌクレオチド配列:(ここで、NはA又はGである。)、又はホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ活性をもつのに十
分な長さの蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列の
一部、を含むことを特徴とする請求の範囲第11項に記載
のプラスミド。 15.前記プロモーターが、植物細胞のポリメラーゼに
よって認識されることを特徴とする請求の範囲第11〜14
項のいずれか一項に記載のプラスミド。 16.前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイ
ルスの35Sプロモーター、TR1′プロモーター、TR2′プ
ロモーター、及びRubisco小サブユニットをコードする
遺伝子のプロモーターからなる群から選択されることを
特徴とする請求の範囲第15項に記載のプラスミド。 17.前記キメラ遺伝子が、前記プロモーター領域と前
記DNA断片との間に、葉緑体トランジットペプチドをコ
ードする第1DNAを更に含むことを特徴とする請求の範囲
第15項又は第16項に記載のプラスミド。 18.前記第1DNAが、Rubisco小サブユニットをコード
する遺伝子由来であることを特徴とする請求の範囲第17
項に記載のプラスミド。 19.前記キメラ遺伝子が、ポリアデニル化シグナルを
含有する3′非翻訳末端を更に含むことを特徴とする請
求の範囲第15〜18項のいずれか一項に記載のプラスミ
ド。 20.前記非翻訳末端が、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシンス(Agrobacterium tumefaciens)のT−DNA遺伝
子由来であることを特徴とする請求の範囲第19項に記載
のプラスミド。 21.(a)植物細胞のポリメラーゼによって認識され
るプロモーターを含むプロモーター領域及び(b)アミ
ノ酸配列:(ここで、XはMet又はValである。)を含む蛋白質、又
はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性
をもつのに十分な長さの前記蛋白質の一部、をコードす
るDNA断片を含むコーディング領域を順に含むが、但し
前記プロモーターは前記DNA断片とは異種である、キメ
ラ遺伝子を含有する細菌。 22.前記DNA断片がストレプトミセス(Streptomyce
s)種由来であることを特徴とする請求の範囲第21項に
記載の細菌。 23.前記DNA断片が、ストレプトミセス・ハイグロス
コピカス(Streptomyces hygroscopicus)又はストレプ
トミセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridoc
hromogenes)由来であることを特徴とする請求の範囲第
22項に記載の細菌。 24.前記DNA断片が、ヌクレオチド配列: (ここで、NはA又はGである。)、又はホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ活性をもつのに十
分な長さの蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列の
一部、を含むことを特徴とする請求の範囲第21項に記載
の細菌。 25.前記プロモーターが、植物細胞のポリメラーゼに
よって認識されることを特徴とする請求の範囲第21〜24
項のいずれか一項に記載の細菌。 26.前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイ
ルスの35Sプロモーター、TR1′プロモーター、TR2′プ
ロモーター、及びRubisco小サブユニットをコードする
遺伝子のプロモーターからなる群から選択されることを
特徴とする請求の範囲第25項に記載の細菌。 27.前記キメラ遺伝子が、前記プロモーター領域と前
記DNA断片との間に、葉緑体トランジットペプチドをコ
ードする第1DNAを更に含むことを特徴とする請求の範囲
第25項又は第26項に記載の細菌。 28.前記1DNAが、Rubisco小サブユニットをコードす
る遺伝子由来であることを特徴とする請求の範囲第27項
に記載の細菌。 29.前記キメラ遺伝子が、ポリアデニル化シグナルを
含有する3′非翻訳末端を更に含むことを特徴とする請
求の範囲第25〜28項のいずれか一項に記載の細菌。 30.前記非翻訳末端が、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシンス(Agrobacterium tumefaciens)のT−DNA遺伝
子由来であることを特徴とする請求の範囲第29項に記載
の細菌。 31.大腸菌(E.coli)であることを特徴とする請求の
範囲第21〜30項のいずれか一項に記載の細菌。 32.アグロバクテリウム・ツメファシエンスであるこ
とを特徴とする請求の範囲第21〜30項のいずれか一項に
記載の細菌。 33.(a)植物細胞のポリメラーゼによって認識され
るプロモーターを含むプロモーター領域及び(b)アミ
ノ酸配列: (ここで、XはMet又はValである。)を含む蛋白質、又
はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性
をもつのに十分な長さの前記蛋白質の一部、をコードす
るDNA断片を含むコーディング領域を順に含むが、但し
前記プロモーターは前記DNA断片とは異種である、キメ
ラ遺伝子を含有する植物細胞。 34.前記DNA断片がストレプトミセス(Streptomyce
s)種由来であることを特徴とする請求の範囲第33項に
記載の植物細胞。 35.前記DNA断片が、ストレプトミセス・ハイグロス
コピカス(Streptomyces hygroscopicus)又はストレプ
トミセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridoc
hromogenes)由来であることを特徴とする請求の範囲第
34項に記載の植物細胞。 36.前記DNA断片が、ヌクレオチド配列:(ここで、NはA又はGである。)、又はホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ活性をもつのに十
分な長さの蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列の
一部、を含むことを特徴とする請求の範囲第33項に記載
の植物細胞。 37.前記プロモーターが、植物細胞のポリメラーゼに
よって認識されることを特徴とする請求の範囲第33〜36
項のいずれか一項に記載の植物細胞。 38.前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイ
ルスの35Sプロモーター、TR1′プロモーター、TR2′プ
ロモーター、及びRubisco小サブユニットをコードする
遺伝子のプロモーターからなる群から選択されることを
特徴とする請求の範囲第37項に記載の植物細胞。 39.前記キメラ遺伝子が、前記プロモーター領域と前
記DNA断片との間に、葉緑体トランジットペプチドをコ
ードする第1DNAを更に含むことを特徴とする請求の範囲
第37項又は第38項に記載の植物細胞。 40.前記1DNAが、Rubisco小サブユニットをコードす
る遺伝子由来であることを特徴とする請求の範囲第39項
に記載の植物細胞。 41.前記キメラ遺伝子が、ポリアデニル化シグナルを
含有する3′非翻訳末端を更に含むことを特徴とする請
求の範囲第37〜40項のいずれか一項に記載の植物細胞。 42.前記非翻訳末端が、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシンス(Agrobacterium tumefaciens)のT−DNA遺伝
子由来であることを特徴とする請求の範囲第41項に記載
の植物細胞。 43.アグロバクテリウム(Agrobacterium)で形質転
換可能な植物由来であることを特徴とする請求の範囲第
33〜42項のいずれか一項に記載の植物細胞。 44.テンサイ、イネ、ジャガイモ、トマト、トウモロ
コシ及びタバコからなる群から選択される植物由来であ
ることを特徴とする請求の範囲第33〜42項のいずれか一
項に記載の植物細胞。 45.植物中に含まれることを特徴とする請求の範囲第
33〜42項のいずれか一項に記載の植物細胞。 46.ホスフィノトリシン、又はホスフィノトリシン残
基を有する化合物、を含むグルタミン合成酵素阻害剤の
除草活性に耐性又は抵抗性である植物細胞の生産法であ
って、 (a)植物細胞のポリメラーゼによって認識されるプロ
モーターを含むプロモーター領域及び(b)アミノ酸配
列:(ここで、XはMet又はValである。)を含む蛋白質、又
はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性
をもつのに十分な長さの前記蛋白質の一部、をコードす
るDNA断片を含むコーディング領域を順に含むが、但し
前記プロモーターは前記DNA断片とは異種である、キメ
ラ遺伝子を、出発植物細胞の核ゲノム中に取り込ませる
段階を包含する、前記方法。 47.前記DNA断片がストレプトミセス(Streptomyce
s)種由来であることを特徴とする請求の範囲第46項に
記載の方法。 48.前記DNA断片が、ストレプトミセス・ハイグロス
コピカス(Streptomyces hygroscopicus)又はストレプ
トミセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridoc
hromogenes)由来であることを特徴とする請求の範囲第
47項に記載の方法。 49.前記DNA断片が、ヌクレオチド配列: (ここで、NはA又はGである。)、又はホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ活性をもつのに十
分な長さの蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列の
一部、を含むことを特徴とする請求の範囲第46項に記載
の方法。 50.前記プロモーターが、植物細胞のポリメラーゼに
よって認識されることを特徴とする請求の範囲第46項〜
49項のいずれか一項に記載の方法。 51.前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイ
ルスの35Sプロモーター、TR1′プロモーター、TR2′プ
ロモーター、及びRubisco小サブユニットをコードする
遺伝子のプロモーターからなる群から選択されることを
特徴とする請求の範囲第50項に記載の方法。 52.前記キメラ遺伝子が、前記プロモーター領域と前
記DNA断片との間に、葉緑体トランジットペプチドをコ
ードする第1DNAを更に含むことを特徴とする請求の範囲
第50項又は第51項に記載の方法。 53.前記1DNAが、Rubisco小サブユニットをコードす
る遺伝子由来であることを特徴とする請求の範囲第52項
に記載の方法。 54.前記キメラ遺伝子が、ポリアデニル化シグナルを
含有する3′非翻訳末端を更に含むことを特徴とする請
求の範囲第50項〜53項のいずれか一項に記載の方法。 55.前記非翻訳末端が、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシンス(Agrobacterium tumefaciens)のT−DNA遺伝
子由来であることを特徴とする請求の範囲第54項に記載
の方法。 56.前記植細胞が、アグロバクテリウム(Agrobacter
ium)で形質転換可能な植物由来であることを特徴とす
る請求の範囲第46〜55項のいずれか一項に記載の方法。 57.前記植物細胞が、テンサイ、イネ、ジャガイモ、
トマト、トウモロコシ及びタバコからなる群から選択さ
れる植物由来であることを特徴とする請求の範囲第46〜
55項のいずれか一項に記載の方法。 58.前記キメラ遺伝子が、アグロバクテリウム(Agro
bacterium)によって仲介される形質転換によって前記
細胞のゲノム中に取り込まれることを特徴とする請求の
範囲第46〜55項のいずれか一項に記載の方法。 59.外来DNAが植物細胞の核ゲノム中に取り込まれた
形質転換植物細胞の純粋培養物の生産法であって、 (a)(i)植物細胞のポリメラーゼによって認識され
るプロモーターを含むプロモーター領域及び(ii)アミ
ノ酸配列: (ここで、XはMet又はValである。)を含む蛋白質、又
はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性
をもつのに十分な長さの前記蛋白質の一部、をコードす
るDNA断片を含むコーディング領域を順に含むが、但し
前記プロモーターは前記DNA断片とは異種である、キメ
ラ遺伝子を含む外来DNAで植物細胞培養中の出発植物細
胞を形質転換する段階、並びに (b)非形質転換植物細胞を死滅させるのに十分な濃度
の前記ホスフィノトリシン又はビアラホスのようなホス
フィノトリシン残基を有する化合物を培養植物細胞に施
用することで形質転換植物細胞を選別する段階、を包含
する前記方法。 60.前記DNA断片がストレプトミセス(Streptomyce
s)種由来であることを特徴とする請求の範囲第59項に
記載の方法。 61.前記DNA断片が、ストレプトミセス・ハイグロス
コピカス(Streptomyces hygroscopicus)又はストレプ
トミセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridoc
hromogenes)由来であることを特徴とする請求の範囲第
60項に記載の方法。 62.前記DNA断片が、ヌクレオチド配列: (ここで、NはA又はGである。)、又はホスフィノト
リシン アセチルトランスフェラーゼ活性をもつのに十
分な長さの蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列の
一部、を含むことを特徴とする請求の範囲第59項に記載
の方法。 63.前記プロモーターが、植物細胞のポリメラーゼに
よって認識されることを特徴とする請求の範囲第59項〜
62項のいずれか一項に記載の方法。 64.前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイ
ルスの35Sプロモーター、TR1′プロモーター、TR2′プ
ロモーター、及びRubisco小サブユニットをコードする
遺伝子のプロモーターからなる群から選択されることを
特徴とする請求の範囲第63項に記載の方法。 65.前記キメラ遺伝子が、前記プロモーター領域と前
記DNA断片との間に、葉緑体トランジットペプチドをコ
ードする第1DNAを更に含むことを特徴とする請求の範囲
第63項又は第64項に記載の方法。 66.前記第1DNAが、Rubisco小サブユニットをコード
する遺伝子由来であることを特徴とする請求の範囲第65
項に記載の方法。 67.前記キメラ遺伝子が、ポリアデニル化シグナルを
含有する3′非翻訳末端を更に含むことを特徴とする請
求の範囲第63〜66項のいずれか一項に記載の方法。 68.前記非翻訳末端が、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシンス(Agrobacterium tumefaciens)のT−DNA遺伝
子由来であることを特徴とする請求の範囲第67項に記載
の方法。 69.前記植物細胞が、アグロバクテリウム(Agrobact
erium)で形質転換可能な植物由来であることを特徴と
する請求の範囲第59〜68項のいずれか一項に記載の方
法。 70.前記植物細胞が、テンサイ、イネ、ジャガイモ、
トマト、トウモロコシ及びタバコからなる群から選択さ
れる植物由来であることを特徴とする請求の範囲第59〜
69項のいずれか一項に記載の方法。
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