DK175656B1 - Gensplejsede planteceller og planter, som udviser resistens mod glutamin-syntetase-inhibitorer, DNA-fragmenter og rekombinanter til anvendelse ved fremstillingen af disse celler og planter - Google Patents

Description

DK 175656 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til beskyttelse af planteceller og planter mod virkningen af glutamin-syntetase-inhibi-torer.

Den vedrører ligeledes anvendelser af en sådan fremgangsmåde, især 5 til udvikling af herbicid-resistens i udvalgte planter.

Den angår endvidere non-biologisk transformerede planteceller og planter, der udviser resistens mod glutaminsyntetase-inhibitorer samt passende DNA-fragmenter og -rekombinanter indeholdende nukleotidsekven-ser, der koder for resistens mod glutamin-syntetase-inhibitorer.

10 Glutamin-syntetase (herefter kort betegnet GS) udgør i de fleste planter et af de essentielle enzymer for udviklingen og levedygtigheden af planteceller. Det er kendt at GS omdanner glutamat til glutamin. GS er involveret i en effektiv rute (den eneste i dag kendte) i de fleste planter til detoksificering af ammoniak frigjort ved nitratreduktion, 15 aminosyrenedbrydning eller fotorespiration. Virkningsfulde inhibitorer for GS er derfor meget toksiske for planteceller. Der er blevet udviklet en særlig gruppe af herbicider, baseret på den toksiske virkning som følge af inhiberingen af GS i planter.

Disse herbicider omfatter som aktiv bestanddel en GS-inhibitor.

20 Der findes mindst to mulige måder, som kan føre til planters re sistens mod inhibitorerne af glutamin-syntetasens virkning. (1) Ændring af målet. Det kan forstås, at mutationer i GS-enzymet kan føre til in-sensitivitet mod herbicidet. (2) Inaktivering af herbicidet. Nedbrydning eller modifikation af herbicidet inde i planten kunne føre til resi-25 stens.

Bialaphos og phosphinothricin (herefter kort betegnet PPT) er to sådanne inhibitorer for virkningen af GS (ref. 16, 17), og de er blevet påvist at besidde fremragende herbicide egenskaber (se mere specielt ref. 2 med hensyn til Bialaphos).

30 Bialaphos har følgende formel (I): ch3 nh2 ch3 ch3

HO - P - CH, - CH, - C - CONH - C - CONH - C - COOH

il 2 2 i i j

0 Η Η H

PPT har følgende formel (II): 35

I DK 175656 B1 I

I I

I CH, NH, I

I 3 i 2

HO - P - CH, - CH, - CH - I

2 2 i I

O COOH

5 Den strukturelle forskel mellem PPT og Bialaphos ligger således i I

fraværet af to alanin-aminosyrer i tilfælde af PPT. I

Disse to herbicider er non-selektive. De inhibirer vækst af alle I

de forskellige plantearter, som er til stede på jorden og bevirker såle- I

des deres totale destruktion. I

10 Bialaphos blev først beskrevet som i besiddelse af antibiotiske I

egenskaber, hvilket muliggjorde, at forbindelsen kunne anvendes som et I

I pesticid eller et fungicid. Bialaphos kan fremstilles i henhold til den I

I i US patent nr. 3.832.394, overdraget til Meiji Seika Kaisha Ltd., be- I

skrevne.fremgangsmåde, hvilket patentskrift herved inkorporeres med hele I

I 15 sit indhold. Fremgangsmåden omfatter dyrkning af Streptomvces hvorosco- I

I picus. såsom den stamme, der er tilgængelig fra American Type Culture I

I Collection under ATCC nr. 21.705, og Bialaphos udvindes fra dens dyrk- I

I ningsmedium. Andre stammer, såsom Stretomvces viridochromooenes produce- I

I rer imidlertid også denne forbindelse (ref. 1). I

I 20 Andre tripeptid-antibiotika, som indeholder en PPT-del, findes I

I ligeledes eller kunne blive opdaget i naturen, fx phosalasin (ref. 15). I

I PPT opnås også ved kemisk syntese og distribueres kommercielt af I

firmaet Hoechst. I

I Der er blevet beskrevet et antal Streptomyces-arter, som produce- I

I 25 rer stærkt aktive antibiotika, der vides at inhabilitere procaryotiske I

cellefunktioner eller enzymer. Streptomycesarterne, der producerer disse I

I antistoffer, ville i sig selv blive ødelagt, hvis ikke de havde en selv- I

I forsvarsmekanisme mod disse antibiotika. Denne selvforsvarsmekanisme er I

i adskillige tilfælde blevet fundet at omfatte et enzym, der er i stand - I

30 til at inhibere den antibiotiske virkning og således undgå autotoksici- I

tet for den pågældende Streptomyces-art. Denne modifikation reverseres c I

generelt, når molekylet eksporteres fra cellen. I

Eksistensen af et gen, som koder for et enzym, der er i stand til I

at modificere antibiotiket, således at det inhiberer den antibiotiske I

35 virkning mod værten, er blevet påvist i adskillige Streptomyces, der I

producerer antibiotika, fx i S. fradi ae. S. azureus. $. vinaceus. $. I

ervthreus. der producerer hhv. neomycin- thiostrepton-, viomycin- og I

MLS- (Macrolid Lincosamid Streptogramin) antibiotika (ref. 4), (ref. 5), I

3 DK 175656 B1 (ref. 6), (ref. 14 af Chater et al, 1982, beskriver standardteknikker, som kan anvendes til at fremkalde disse virkninger).

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at Streptomyces hygroscooicus ATCC 21.705 også besidder et gen, der 5 koder for et enzym, som er ansvarligt for inaktiveringen af de antibiotiske egenskaber af Bialaphos. Forsøg udført af ansøgerne har ført til isolering af et sådant gen og dets anvendelse i en fremgangsmåde til kontrol af virkningen af GS-inhibitorer, baseret på PPT eller afledte produkter.

10 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt frem gangsmåde til kontrol af virkningen i planteceller og planter af GS-inhibitorer.

Opfindelsen tilvejebringer ligeledes DNA-fragmenter og DNA-rekom-binanter, især modificerede vektorer indeholdende disse DNA-fragmenter, 15 hvilke DNA-fragmenter indeholder nukleotidsekvenser, der ved inkorporering i planteceller og planter er i stand til at beskytte disse mod virkningen af GS-inhibitorer.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere non-biologisk transformerede planteceller og planter, der er i stand til at neutralisere eller inak-20 tivere GS-inhibitorer.

Opfindelsen tilvejebringer yderligere en fremgangsmåde til selektiv beskyttelse af plantearter mod herbicider af en GS-inhibitortype.

Mere specielt tilvejebringer opfindelsen et DNA-fragment, der kan overføres til planteceller og til hele planter, og som er i stand til at 25 beskytte disse mod de herbicide virkninger af Bialaphos samt af strukturelt analoge herbicider.

Yderligere tilvejebringer opfindelsen planteceller, der er resistente mod produkterne af den klasse, der eksemplificeres af Bialaphos, hvilke produkter har PPT-enheden i deres struktur.

30 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til kontrol af virkningen i planteceller og planter af GS-i nhi bi tor, når de kontaktes dermed, omfatter, at planterne forsynes med et heterologt DNA-fragment med en fremmed nukleotid sekvens, der er i stand til at kunne udtrykkes i form af et protein i disse planteceller og planter, under sådan betingelse, at det 35 heterologe DNA-fragment bringes til at blive stabilt integreret gennem generationer i planternes celler, og hvor proteinet har en enzymatisk aktivitet, der er i stand til at inaktivere eller neutralisere glutamin-syntetase-inhibitoren.

I DK 175656 B1 I

I I

Et foretrukket DNA-fragment er et, som afledes af en antibiotika I

producerende Streptomyces stamme (eller en sekvens omfattende en nukleo- I

tidsekvens, der koder for den samme aktivitet), og som koder for resi- I

stens mod disse GS-inhibitorer. I

5 foretrukne nukleotidsekvenser til anvendelse i forbindelse med den I

foreliggende opfindelse koder for et protein, der har acetyl-transfera- I

se-aktivitet med hensyn til GS-i nhi bi torerne. I

Et særligt foretrukket DNA-fragment ifølge opfindelsen omfatter en I

nukleotid sekvens, der koder for et polypeptid med en PPT-acetyl-trans- I

10 ferase-aktivitet. I

Et særligt DNA-fragment ifølge den foreliggende opfindelse til den I

I efterfølgende transformering af planteceller, består af en nukleotid I

I sekvens, der koder for i det mindste en del af et polypeptid med følgen- I de sekvens:

I I

I X SER PRO GLU I

I 183 I

I ' ARG ARG PRO ALA ASP ILE ARG ARG ALA THR GLU ALA ASP MET PRO I

I 20 228 I

I ALA VAL CYS THR ILE VAL ASN HIS TYR ILE GLU THR SER THR VAL I

I I

I ASN PHE ARG THR GLU PRO GLN GLU PRO GLN GLU TRP THR ASP ASP I

I I

25 LEU VAL ARG LEU ARG GLU ARG TYR PRO TRP LEU VAL ALA GLU VAL I

I 363 I

I ASP GLY GLU VAL ALA GLY ILE ALA TYR ALA GLY PRO TRP LYS ALA I

I I

I ARG ASN ALA TYR ASP TRP THR ALA GLU SER THR VAL TYR VAL SER -I

30 453 I

PRO ARG HIS GLN ARG THR GLY LEU GLY SER THR LEU TYR THR HIS I

498 I

LEU LEU LYS SER LEU GLU ALA GLN GLY PHE LYS SER VAL VAL ALA I

543 I

35 VAL ILE GLY LEU PRO ASN ASP PRO SER VAL ARG MET HIS GLU ALA I

588 I

LEU GLY TYR ALA PRO ARG GLY MET LEU ARG ALA ALA GLY PHE LYS I

633 I

I DK 175656 B1 I

HIS GLY ASN TRP HIS ASP VAL GLY PHE TRP GLN LEU ASP PHE SER I

678 I

LEU PRO VAL PRO PRO ARG PRO VAL LEU PRO VAL THR GLU ILE I

723 I

hvori X betegner MET eller VAL, hvilken del af polypeptidet er af til- I

strækkel ig længde til at bevirke beskyttelse mod Bialaphos hos plante- I

celler ved genetisk inkorporering og ekspression deri, dvs. med - som i I

det følgende kaldet - "plantebeskyttende evne" mod Bialaphos. I

10 Et foretrukket DNA-fragment består af følgende nukleotid sekvens: I

GTG AGC CCA GAA I

183 I

CGA CGC CCG GCC GAC ATC CGC CGT BCC ACC GAB GCB GAC ATB CCB I

15 228 I

GCG QTC TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACB GTC I

273 I

AAC TTC CGT ACC GAG CCG CAG GAA CCG CAG GAG TGG ACG GAC GAC I

318 I

20 CTC GTC CGT CTG CGG GAG CGC TAT CCC TGG CTC GTC GCC GAG GTB I

363 I

GAC GGC GAG GTC GCC GGC ATC GCC TAC GCG GGC CCC TGG AAG GCA I

408 I

CGC AAC GCC TAC GAC TGG ACG GCC GAG TCG ACC GTG TAC GTC TCC I

25 453 I

CCC CGC CAC CAG CGG ACG GGA CTG GGC TCC ACG CTC TAC ACC CAC I

498 CTG CTG AAG TCC CTG GAG GCA CAG GGC TTC AAG AGC GTG GTC GCT 543 30 GTC ATC GGG CTG CCC AAC GAC CCG AGC GTG CGC ATG CAC GAG GCG 588 CTC GGA TAT GCC CCC CGC GGC ATG CTG CGG GCG GCC GGC TTC AAG 633 CAC GGG AAC TGG CAT GAC GTG GGT TTC TGG CAG CTG GAC TTC AGC 35 678 . CTG CCG GTA CCG CCC CGT CCG GTC CTG CCC GTC ACC GAG ATC 723

DK 175656 B1 I

I

eller af en. del deraf, der udtrykker et polypeptid med plantebeskyttende I

evne mod Bialaphos. I

Opfindelsen angår endvidere et vilkårligt ONA-fragment, som afvi- I

ger fra den ovenfor angivne foretrukne ved erstatning af enhver af dets I

5 nukleotider med andre, dog uden at modificere den genetiske information I

af den ovenfor omtalte foretrukne DNA-sekvens (normalt inden for betyd- I

ningen af den universelle genetiske kode) og yderligere enhver ækviva- I

H lent DNA-sekvens, som ville kode for et polypeptid med de samme egenska- I

ber, især en Bialaphos-resistens-aktivitet. I

10 Det vil kunne forstås, at fagmanden let vil være i stand til at I

fastlægge de dele af nukleotidsekvenserne, som vil kunne fjernes fra en I

vilkårlig side af ethvert af DNA-fragmenterne ifølge opfindelsen, fx ved I

at fjerne terminale dele på enhver side af DNA-fragmentet, såsom ved I

I hjælp af et exonukleolytisk enzym, fx Bal31, ved rekloning af det til- I

15 bageblevne fragment i et passende plasmid og ved at undersøge det modi- I

I - ficerede plasmids evne til at transformere passende celler og til at I

I beskytte det mod Bialaphos-antibiotiket eller -herbicidet som senere I

I forklaret, uanset hvilken prøve, der er passende. I

I Af sproglige nemhedsgrunde vil disse DNA-fragmenter herefter blive I

20 betegnet som "Bialaphos-resistens DNA". På tilsvarende måde vil det I

I tilsvarende polypeptid blive betegnet som "Bialaphos-resistens enzym". I

I Selv om der i den foregående diskussion er blevet lagt særlig vægt I

på DNA-fragmenter, der ved indføring i planteceller og planter er i I

stand til at bibringe disse beskyttelse mod Bialaphos eller PPT, skal I

25 det forstås, at opfindelsen på ingen måde er begrænset dertil. I

I På samme måde angår opfindelsen DNA-fragmenter, der ved indføring I

I i sådanne planteceller også vil bibringe disse en beskyttelse mod andre I

I GS-inhibitorer, fx af mellemprodukter, der er involveret i den naturlige I

biosyntese af phosphinotricin, såsom de forbindelser, der betegnes ved I

30 forkortelserne MP101 (II), MP102 (IV), hvis formler er angivet nedenfor: I

0 NH, I

li i 2 I

HO - P - CH2 - CH2 - CH - C00H (III) I

Η I

35 I

7 DK 175656 B1 O NH, i| i 2 HO - P - CH, - CH, - CH -CO-Ala-Ala (IV) h 2

Mere alment har opfindelsen åbnet vejen for fremstillingen af DNA-5 fragmenter, der ved passende inkorporering i planteceller og planter kan I beskytte disse mod GS-inhibitorer, når de bringes i kontakt dermed, så ledes som dette vil blive vist på detaljeret måde i relation til Bialaphos og PPT i efterfølgende eksempler.

Når dette er fastslået, vil det kunne indses, at ethvert fragment, 10 der koder for en enzymatisk aktivitet, der vil beskytte planteceller og planter mod GS-inhibitorerne, ved inaktivering, bør betragtes som ækvivalent til de foretrukne fragmenter, der er omtalt ovenfor. Dette vil især gælde ethvert DNA-fragment, der vil fremkomme som følge af genetisk screening af de genome DNA'er af stammer, især af antibiotika produce-15 rende stammer, der kan formodes at besidde gener, der, uanset strukturel forskellighed, vil kode for lignende aktivitet med hensyn til Bialaphos eller PPT, eller endog med hensyn til andre GS-inhibitorer. Dette gælder for ethvert gen i andre stammer, der producerer et PPT derivat.

Det skal derfor forstås, at udtrykkene "Bialaphos-resistens DNA" 20 eller "Bialaphos-resistens enzym", som anvendt af bekvemmeligheds grunde i det følgende, har til hensigt ikke blot at vedrøre DNA'erne og enzymerne som specifikt har at gøre med resistens mod PPT eller mest direkte beslægtede derivater, men mere generelt med andre DNA'er og enzymer, der vil være i stand til under samme omstændigheder at inaktivere virkningen 25 i planter af GS-inhibitorer.

Opfindelsen angår endvidere DNA rekombinanter indeholdende de ovenfor definerede Bialaphos resistens DNA-fragmenter, rekombineret med heterolog DNA, hvilken heterolog DNA indeholder reguleringselementer, og hvor Bialaphos resistens DNA'en er under kontrol af disse regule-30 ringselementer på en sådan måde, at den kan udtrykkes i fremmede cellulære omgivelser, der er forenelige med disse reguleringselementer.

Med udtrykket "heterolog DNA" menes en DNA af en anden oprindelse end den, hvorfra Bialaphos resistens ONA'en hidrørte, fx forskellig fra den fra en Streotomvces hvoroscopicus eller Streptomvces viridochro^

I DK 175656 B1 I

I I

I i i

H i moaenes eller endog mere foretrukket en fra Streptomvces ONA fremmed I

H ONA. Oe nævnte reguleringselementer er især sådanne, der er i stand til I

H kontrollere transkriptionen og oversættelsen af DNA sekvenser, som nor- I

H malt er associeret dermed i de fremmede omgivelser. "Cellulær" refererer I

5 både til mikroorganismer og cellekulturer. I

Denne heterologe DNA kan være en bakteriel DNA, især når det I

H ønskes at fremstille en stor mængde af rekombinant-DNA'en, såsom til I

forøgel sesformål. I denne henseende består en foretrukket heterolog DNA I

af DNA af E. Coli eller af med E. coli forenelig DNA. Det kan være DNA I

10 af samme oprindelse som de pågældende cellers eller anden DNA, fx viral I

eller plasmid DNA, som vides at være i stand til at replikere i de I

betragtede celler. I

Foretrukket rekombinant DNA indeholder heterolog DNA, som er I

forenelig med planteceller, især Ti-plasmid DNA. I

15 Særligt foretrukne rekombinanter er sådanne, der indeholder GS· I

inhibitor-inaktiverende DNA under kontrol af en promotor, som genkendes I

af planteceller, især de planteceller, som bibringes inaktivering af GS- I

inhibitorer. I

I Foretrukne rekombinanter ifølge den foreliggende opfindelse vedrø- I

20 rer endvidere modificerede vektorer, især plasmider indeholdende den GS- I

inhibitor-inaktiverende DNA, således placeret med hensyn til regule- I

ringselementer, herunder især promotor elementer, at de muliggør, at den I

GS-inhibitor inaktiverende DNA kan transkriberes og oversættes i det I

cellulære miljø, der er foreneligt med den heterologe DNA. Fordelagtige

25 vektorer er sådanne, der er opbygget således at de er i stand til at I

bevirke stabil inkorporering af den GS-inhibitor-inaktiverende DNA i I

fremmede celler, især i deres genome DNA. Foretrukne modificerede I

vektorer er sådanne, der er i stand til stabil transformering af plante- I

celler, og som bibringer de tilsvarende celler evnen til inaktivering af. - I

30 GS-inhibitorer. I

Som beskrevet nedenfor ser det ud til, at initieringskodonen for I

Bialaphos-resistens-genet i den her anvendte Streptomvces hygroscopicus I

stamme er en GTG-kodon. I foretrukne rekombinant-DNA'er eller -vektorer I

er Bialaphos resistensgenet dog modificeret ved at substituere en ATG I

35 initieringskodon for initieringskodonen GTG, hvilken ATG muliggør I

oversættelsesinitiering i planteceller. I

I det følgende eksempel udgjordes den anvendte plantepromotor- I

sekvens af en promotor af 35 S blomkålsmosaikvirus. Det skulle være I

9 DK 175656 B1 unødvendigt at bemærke, at fagmanden vil være i stand til at udvælge andre piantepromotorer, når sådanne vil være mere passende i relation til de betragtede plantearter.

Ifølge en anden foretrukket udførelsesform af opfindelsen, især 5 når det ønskes at opnå transport af enzymet, som kodes af Bialaphos-resistens DNA'en til chloroplasterne, fusioneres det heterologe DNA fragment til et gen eller DNA-fragment, som koder for et transit-peptid, hvilket sidstnævnte fragment dernæst indføres mellem det GS-inhibitor-inaktiverende gen og den valgte plantepromotor.

10 Med hensyn til midler, der gør det muligt at opnå sådanne konstruktioner, kan henvises til GB patentansøgninger nr. 8432757 indleveret 28. december 1984 og 8500336 indleveret 7. januar 1985 samt de beslægtede ansøgninger indleveret i USA (nr. 755.173 indleveret 15. juli 1985) ved den europæiske patentmyndighed (nr. 85402596.2 indleveret 20.

15 december 1985), i Japan (nr. 299.730, indleveret 27. december 1985), i Israel (nr. 77.466 indleveret 27. december 1985) og i Australien (nr. 5.165.485, indleveret 24. december 1985), der alle herved inkorporeres med hele deres indhold.

Der kan endvidere henvises til den videnskabelige litteratur, især 20 følgende artikler:

Van den Brock et al, 1985, Nature, 313, 358-363;

Schreier et al., Embo. J., bind 4, nr. 1, 25-32.

Disse artikler inkorporeres ligeledes her med hele deres indhold.

For en ordens skyld skal der her erindres om, at der med udtrykket 25 "transitpeptid" henvises til et polypeptid-fragment, der normalt er associeret med et chloroplast-protein eller en chloroplast-protein-subenhed i et prækursor-protein kodet ved hjælp af planteceller nukleær DNA. Transitpeptidet skiller dernæst fra chloroplast-peptidet eller fjernes proteolitisk under translokationsprocessen for det sidstnævnte 30 protein i chloroplasterne. Eksempler på egnede transitpeptider er sådanne, der er associerede med den lille subenhed af ribulose-l,5-bisphoshat (RuBP) carboxylase eller som er associeret med de chlorophyl a/b bindende proteiner.

Der tilvejebringes således DNA-fragmenter og DNA rekombinanter, 35 der er egnede til anvendelse ved den herefter definerede fremgangsmåde.

Mere specielt angår opfindelsen også en fremgangsmåde, der kan defineres generelt som en fremgangsmåde til fremstilling af planter og reproduktionsmateriale for sådanne planter, herunder et heterologt gene- . ------ — —

I DK 175656 B1 I

I I

tisk materiale, som er stabilt integreret deri og i stand til at kunne I

udtrykkes i planterne eller reproduktionsmaterialet i form af et I

protein, der er i stand til at inaktivere eller neutralisere aktiviteten I

af en glutaminsyntetase-inhibitor, hvilken fremgangsmåde omfatter de I

5 non-biologiske trin til frembringelse af planteceller eller plantevæv, I

herunder det heterologe genetiske materiale fra udgangsplanteceller I

eller -plantevæv, som ikke er i stand til at udtrykke den pågældende I

inhiberende eller neutraliserende aktivitet, regenerering af planter.. I

eller reproduktionsmateriale for disse planter eller begge dele fra I

10 disse planteceller eller plantevæv indeholdende det genetiske materiale I

og eventuelt biologisk replikering af de sidstnævnte planter eller I

reproduktionsmateriale eller begge dele, hvorved de non-biologiske trin I

I til frembringelse af plantecellerne eller plantevævet, herunder det I

I heterologe genetiske materiale, omfatter, at man transformerer udgangs- I

I 15 plantecellerne eller -plantevævet med en DNA-rekombinant indeholdende en I

nukleotid sekvens, som koder for proteinet, samt de regulerende I

elementer udvalgt blandt sådanne, der er i stand til at muliggøre I

I ekspressionen af nukleotidsekvensen i plantecellerne eller plantevævet, I

og bevirke den stabile integrering af nukleotidsekvensen i planteceller- I

I 20 ne og -vævet, samt i planten og reproduktionsmaterialet frembragt deraf I

I gennem generationer. I

I Opfindelsen angår ligeledes cellekulturerne indeholdende I

I Bialaphos-resistens ONA eller mere alment den GS-inhibitor inaktiverende I

I DNA, hvilke cellekulturer har den egenskab, at de er resistente mod en I

I 25 komposition indeholdende en GS-inhibitor, når de dyrkes i et medium I

I indeholdende en sådan komposition i doser, der ville være destruktive I

I for non-transformerede celler. I

I Opfindelsen angår mere specielt sådanne planteceller eller celle- I

I kulturer, hvori Bialaphos-resistens DNA'en er stabilt integreret, og som I

I 30 forbliver til stede over successive generationer af plantecellerne. Re- I

I sistensen mod en GS-inhibitor, mere specielt Bialaphos eller PPT, kan I

I således også betragtes som en måde, hvorpå man kan karakterisere plante- I

I cellerne ifølge opfindelsen. I

I Eventuelt kan man gribe til hybridiseringsforsøg mellem den genome

I 35 ONA opnået fra plantecellerne med en probe indeholdende en GS-inhibitor I

I inaktiverende DNA-sekvens. I

I Mere alment vedrører opfindelsen planteceller, reproduktionsmate- I

I ri ale, især frø, samt planter indeholdende et fremmed eller heterologt I

t DK 175656 B1 11 DNA-fragment stabilt integreret i deres respektive genome DNA'er, hvilke fragmenter overføres gennem generationer af sådanne planteceller, reproduktionsmateriale, frø og planter, og hvori DNA-fragmentet koder for et protein, som inducerer en non-varietetsspecifik enzymatisk aktivitet, 5 som er i stand til at inaktivere eller neutralisere GS-inhibitorer især Bialaphos og PPT, mere specielt at bibringe sådanne planteceller, reproduktionsmaterialer, frø og planter, en tilsvarende non-varietetsspecifik phenotype resistens mod GS-inhibitorer.

"Non-varietetsspecifik" enzymatisk aktivitet eller phenotype skal 10 referere til det forhold, at de ikke er karakteristiske for specifikke plantegener eller arter, således som det på en ikke begrænsende måde vil blive nærmere belyst i de følgende eksempler. De induceres i plantematerialerne ved i det væsentlige non-biologi ske processer, der kan anvendes på planter hørende til arter, der normalt er ubeslægtede med hinanden og 15 omfatter inkorporeringen i plantemateriale af heterolog DNA, fx bakteriel DNA eller kemisk syntetiseret DNA, som ikke normalt optræder i plantematerialet, eller som ikke normalt kan inkorporeres deri ved naturlige forædlingsprocesser, og som alligevel bibringer disse en fælles phenotype (fx herbicid resistens).

20 Opfindelsen har særlig fordelagtig anvendelse ved fremgangsmåder til beskyttelse af markkultiverede plantearter mod ukrudt, hvilke fremgangsmåder omfatter det trin, at marken behandles med et herbicid, fx Bialaphos eller PPT i en dosis, der er effektiv til dræbe ukrudtet, og hvor de dyrkede plantearter i deres genom indeholder et DNA-fragment, 25 som koder for et protein med en, enzymatisk aktivitet, der er i stand til at neutralisere eller inaktivere GS-inhibitoren. ΐ Til udelukkende illustration varierer effektive doser til anven delse i den ovennævnte fremgangsmåde fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/hektar Bialaphos eller PPT.

30 I det følgende beskrives, hvorledes det ovenfor beskrevne foretrukne DNA-fragment i soleredes ud fra den Streotomvces hyqroscopicus stamme, der er tilgængelig fra American Type Culture Collection under deponeringsnr. ATCC 21 705, hvilket udelukkende skal tjene til eksemplificering.

35 Den følgende beskrivelse viser også den teknik, som kan anvendes på andre stammer, der producerer forbindelser med en PPT-del.

Beskrivelsen vil dernæst blive kompletteret med beskrivelsen af indføringen af et foretrukket DNA-fragment, der bibringer de transforme-

I DK 175656 B1 I

I 12 I

rede celler evnen til at inaktivere Bialaphos og PPT. Det Bialaphos I

inaktiverende DNA-fragment, der herefter betegnes Bialaphos-resistens I

H gen eller "sfr"-gen, isoleret ved hjælp af den foran beskrevne teknik i I

pi asmider, som kan anvendes til transformering af planteceller og I

H 5 bibringe disse en resistens mod Bialaphos, gives således også alene som I

eksempel til ikke-begrænsende illustrationsformål. I

I det følgende henvises til tegningen, hvor I

figur 1 viser et restriktionskort for et plasmid indeholdende et I

Streptomvces hvaroscopicus DNA-fragment, der koder for Bialaphos-resi- I

10 stens, hvilket plasmid, der herefter kaldes pBGl, er blevet konstrueret I

I i overensstemmelse med den følgende beskrivelse, I

figur 2 viser nukleotid sekvensen af et mindre fragment opnået fra I

pBGl, subklonet til et andet plasmid (pBG39) og indeholdende resistens- I

I genet, I

15 figur 3 viser konstruktionen af en serie af pi asmider givet som I

I eksempler, hvilke plasmider skal tilvejebringe passende adaptionsmidler I

til indføringen deri af Bialaphos .resistensgenet eller "sfr"-genet, I

I figur 4A og 4B viser konstruktionen af en serie af plasmider givet I

I som eksempler, hvilke plasmider indeholder passende plantecelle-promo- I

I 20 tor-sekvenser, der er i stand til at initiere transkription og ekspres- I

s i on af det fremmede gen, som er indført under deres kontrol i pi asmi- I

derne, I

figur 5A viser et bestemt fragment af nukleotid sekvensen af plas- I

midet opnået i figur 3, I

25 figur 5B viser rekonstruktionen af de første kodoner af et I

Bialaphos resistens-gen fra et fokl/Bqlll fragment opnået fra pBG39 og I

substitueringen af en ATG-initieringskodon for GTG initieringskodonen i I

det naturlige “sfr"-gen, I

figur 5C viser rekonstruktionen af hele “sfr"-genet, nemlig de I

30 sidste kodoner deraf og dets indføring i et plasmid opnået i figur 4A og I

4B, I

figur 6A viser en ekspressi onsvektor indeholdende ”sfr"-genet pi a-

ceret under kontrol af en plantecellepromotor, I

figur 6B viser en anden ekspressionsvektor afledt fra den i figur I

35 6A viste ved substituering af nogle nukleotider, I

figur 7 viser konstruktionen af en serie af plasmider givet som I

eksempler til den endelige fremstilling af plasmider indeholdende promo- I

torregionen og transitpeptidsekvensen for et bestemt plantecellegen, for I

DK 175656 B1 13 indføringen af "sfr"-genet under kontrol af promotorregionen og downstream for transitpeptidsekvensen.

Det følgende forsøg udformedes med henblik på at isolere et 5 Bialaphos-resistens gen fra S. hvaroscopicus i henhold til standardteknik for kloning i Streptomvces.

2, 5 øg S. hvoroscopicus genomisk DNA og 0,5 øg Streptomvces vektor pIJ61 spaltedes med £stl i henhold til den i ref. 6 beskrevne fremgangsmide. Vektorfragmenterne og de genome fragmenter blandedes og 10 splejsedes (4 timer ved I0°C fulgt af 72 timer ved 4°C i splejsningssalte, der indeholder 66 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1 niM EDTA, 10 mM MgCl,, 10 mM 2-mercaptoethanol og 0,1 mM ATP) ved en total DMA koncen- t p] tration på 40 μg ml med T4 DNA-ligase. Splejsningsproduktet indførtes g i 3 x 10 S. lividans stamme 66 protoplaster ved en transformationspro-15 cedure, der medieredes af polyethylen-glycol (PEG) som beskrevet i det følgende. Disse protoplaster gav anledning til 5 x 107 kolonier og 4 x 104 pocks efter regenerering på 20 plader af R2 agar indeholdende 0,5%

Difco gærekstrakt (R2 YE). Fremstilling og sammensætning af de forskellige medier og puffere, som anvendtes i de beskrevne forsøg, omtales 20 nærmere i det følgende. Når disse vækster replika-planteredes på minimal mediumpladér indeholdende 50 øg ml’7 Bialaphos, fremkom stofresistente kolonier med en frekvens på 1 pr. 10 transformanter. Efter rensning af de stofresi stente kolonier isoleredes deres plasmide DNA og anvendtes til retransforraering af S. lividans protoplaster. Non-selektiv regenere-25 ring efterfulgt af replikation til Bialaphos-holdigt medium viste en 100% korrelation mellem pocks og Bialaphos-resistens vækst. Rekombi-nantplasmiderne af adskillige resistente kloner indeholdt alle en 1,7 Kb PstI indføring (se figur I).

Subkloning af herbicid-resistens oenet 30 1,7 Kb PstI indføringen subklonedes dernæst i højkopi-antal strep- tomycet-vektor PiJ385 til generering af plasmid pBG20. S. lividans stammer, der indeholdt pBG20, var mere end 500 gange mere resistente mod Bialaphos. S.lividans vækst inhiberes normalt i minimalt medium indeholdende 1 øg/ml Bialaphos, mens vækst af transformanter indeholdende pG20 35 ikke inhiberedes bemærkelsesværdigt i et medium indeholdende 500 mg/ml Bialaphos. PstI fragmentet subklonedes også i vilkårlig orientering i PstΓ-positionen for plasmid pBR322 til frembringelse af plasmider pBGl og pBG2 i henhold til deres orientering. En test på minimal M9 medium Η

I DK 175656 B1 I

I 14 I

viste, at E. coli E8767 indeholdende pBGl eller pBG2 var resistent mod I

Bialaphos. I

Et ± 1,65 Kb PstI - BamHI fragment subklonedes fra pBGl til pi as- I

mid pUC19 til dannelse af plasmid pBG39 og bibragte Bialaphos resistens I

5 til E. coli. W3110, C600 og JM83. I

Under anvendelse af et in vitro koblet transskriptions-oversættel- I

sessystem (ref. 5) fra S. lividans ekstrakter vistes det, at 1,65 Kb I

PstI - BamHI fragmentet i pBG39 styrer syntesen af et 22 Kd protein. I . I

det følgende indeholder denne 1,65 Kd indføring et fragment, der koder I

10 for et 22 Kd protein, og som vil blive kaldt "sfr" gen. I

Finbestemmelse oa sekventerina af genet. I

I Et 625 bp Sau3A fragment subklonedes fra pBG39 til pUC19 og I

bibragtes stadig Bialaphos resistens til en E. coli W 3110 vært. De I

resulterende kloner var pBG93 og pBG94 i henhold til orienteringen. I

I 15 Genets orientering i Sau3A fragmentet blev angivet ved forsøg, som I

har vist, at Bialaphos resistens kunne induceres med IPTG fra pUC19 lac I

I promotor i pBG93. I nærvær af IPTG (0,5 mM) øgedes resistensen af I

I pBG93/W3110 fra 5 til 50 pg/ml på et M9 medium indeholdende Bialaphos. I

W3110 værten fri for pBG93 voksede ikke på M9 medium indeholdende 5 I

I 20 Ag/ml Bialaphos. Disse forsøg viste, at Sau3A fragmentet kunne subklones I

I uden tab af aktivitet. De tilvejebragte også den korrekte orientering I

I som vist i vedlagte figur 2. Proteinet, som disse kloner kodede for, I

blev detekteret ved anvendelse af koblede transkripti onsoversættelses- I

systemer, afledt af ekstrakter fra 5. lividans (ref. 7). Afhængig af I

25 orienteringen af Sau3A fragmentet observeredes forskellige størrelser af I

oversættelsesprodukter; 22 Kd for pBG94 og ± 28 Kd for pBG93. Dette I

viste, at Sau3A fragmentet ikke indeholdt det fuldstændige resistensgen, I

og at et fusionsprotein blev dannet, som inkluderede en polypeptidse-* I

kvens, der resulterede fra oversættelsen af en pUC19 sekvens. I

30 For at opnå store mængder protein blev et 1,7 Kb PstI fragment fra I

pBGl klonet i det høje kopiantal Streptomycet replikon pIJ385. Det opnå- I

ede plasmid, pBG20, anvendtes til at omdanne S. hvoroscopicus. Trans- I

formanter, som indeholdt dette plasmid, havde mere end 5 gange så meget I

PPT acetyleringsaktivitet og havde også øgede mængder af et 22 kd . I

35 protein på natrium-dodecylsul fat geler (SDS geler). Endvidere fremkom I

både acetyl transferasen og 22 kd proteinet, da produktionen af Bialaphos I

begyndte. Korrelationen af in vitro data, syntesekinetik og forstærket I

ekspression associeret med pBG20 transformanter antydede kraftigt, at I

15 I

DK 175656 B1 I

dette 22 kD bånd var genproduktet. I

Oen fuldstændige nukleotide sekvens af 625 bp Sau3A fragmentet I

bestemtes såvel som sidesekvenser. Computeranalyse afslørede tilstedevæ- I

reisen af en åben læseramme over hele længden af Sau3A fragmentet. I

5 Karakterisering af "sfr"-genproduktet. I

En serie forsøg blev udført for at fastslå, at den åbne læseramme I

af "sfr"-genet virkelig kodede for Bialaphos-resistens enzymet. For at I

bestemme 5'enden på resistensgenet, bestemtes NH^-terminal sekvensen af I

enzymet. Hvad især angår den teknik, der blev anvendt til at bestemme I

110 denne sekvens, henvises til den teknik, der er udvilket af 0. I

Vandekerckhove, Eur. J. Bioc. 152, p. 9-19, 1985, og til de franske I

patentansøgninger nr. 8514579 indleveret 1. oktober 1985 og nr. 8513046, I

indleveret 2. september 1985, som alle inkorporeres heri med hele deres I

indhold. I

15 Denne teknik muliggør immobilisering af proteiner og nukleidsyrer, I

tidligere separeret på en natriumdodecyl sul fat indeholdende polyacryl- I

amidgel, på glasfibre belagt med den polykvaternære amin, der fås i han- I

delen under det registrerede varemærke POLYBRENE. Overførslen udføres i I

det væsentlige som for proteinblottingen på nitrocellulosemembraner I

20 (ref. 8). Dette muliggør bestemmelsen af aminosyrekomposi tionen og par- I

tiel sekvens af de immobil i serede proteiner. Den del af arket, der bærer I

det immobil i serede 22 kd protein produceret af S. hygroscopicus pBG20, I

blev skåret ud, og skiven blev monteret i reaktionskammeret i en gas- I

fase sekvenator for at underkaste det glasfiberbundne 22 Kd protein den I

25 Edman'ske nedbrydningsprocedure. Følgende aminosyresekvens blev opnået:

Pro-Glu-Arg-Arg-Pro-Ala-Asp-Ile-Arg-Arg

Denne sekvens passede til en aminosyresekvens, som blev udledt fra den åbne læseramme af 625 bp Sau3A fragmentet. Dette svarede til strækningen fra kodon 3 til kondon 12.

30 N^-terminus af 22 Kd proteinet var således upstream for denne sekvens. Det blev bestemt, at oversættelsen af det pågældende protein sandsynligvis skulle initieres 2 aminosyrer tidligere på en GTG initieringskodon. GTG anvendes ofte som initiatorkodon i Streptomyces og oversættes som methionin. Proteinet oversat fra GTG initieringskodonen ville 35 være 183 aminosyrer lang og ville have en molekylevægt på 20 550. Oette var i god overensstemmelse med den observerede tilnærmede molekylevægt på 22 000.

Endvidere lokaliseredes terminationskodonen TGA netop downstream

I DK 175656 B1 I

I

for Sau3A positionen. Kloning af 625 bp Sau3A fragmentet i en BamHl po- I

sition fordøjet pUC19 resulterede ikke i rekonstruktion af slutkodonen. I

H Dette forklarede fusionsproteinerne, som blev observeret i in vitro I

transkriptions-oversættelsesanalysen. I

H 5 Mekanisme ved PPT-resistens I

Efter at en første phenotype og nogle af de fysiske kendetegn for I

resistensgenet og dets genprodukt var defineret, udførtes en serie for- I

søg for at forstå den mekanisme, ved hvilken det bibringer resistens. I

Som beskrevet ovenfor er PPT den del af Bialaphos, som inhiberer glut- I

10 aminsyntetase (GS), og N-acetyl PPT er ikke en inhibitor. Idet der I

anvendtes en standardprøve (ref. 9), vistes S. hvoroscopicus ATCC 21 705 I

derivater at indeholde et PPT acetyl transferase, som ikke fandtes i 5L_ I

1ividans. Aktiviteten acetylerede ikke Bialaphos tripeptidet. S. I

1ividans. der bærer resistensgenet klonet i pBG20 eller pBG16 (et I

15 plasmid indeholdende 625 bp Sau3A fragmentet klonet i en anden strepto- I

mycetvektor, piJ680) indeholdt også den aktivitet, der kunne acetylere I

I PPT, men ikke Bialaphos. Det PPT afledte reaktionsprodukt produceret af I

I ekstrakter af PBG20/S. 1ividans i soleredes for at bekræfte, at det vir- I

kel i g var acetyl-PPT. Analyse ved massespektroskopi viste, at molekyl- , I

I 20 vægten var øget i forhold til PPT med ækvivalenten af én acetylgruppe. I

I Det blev således konkluderet, at 625 bp Sau3A fragmentet indeholdt I

sekvenser, som koder for PPT acetyl transferase. ι I

I Forsøgsbetingelserne og reagenserne, der blev anvendt i de oven- I

nævnte teknikker er som følger: I

25 Fremstilling oo komposition af de ovenfor anvendte medier oa puf- I

fere I

I 1) P medium: 10,3 g saccharose, 0,025 g ^SO^, 0,203 g MgCl2-6H20 I

I og 0,2 ml sporelementopløsning opløses i 80 ml destilleret vand og I

I autoklaveres. Derefter tilsættes i rækkefølge 1 ml KH^PO^ (0,5%), 10 ml I

I 30 CaCl2.2H20 (3,68%), og 10 ml TES puffer (0,25 M), (pH: 7,2). Sporele- ! I

I mentopløsning (pr. liter): ZnCl2, 40 mg; FeCl3.6H20, 200 mg; CuC12.H20, I

I 10 mg; MnCl2.4H20, 10 mg; Na2B407.10H20, 10 mg; (ΝΗ^Μο^Ο^. 4H20, 10 I

I mg. I

I 2) R2YE: 10,3 g saccharose, 0,025 g K2S04, 1,012 g MgCl2.6H20, 1 g I

I 35 glucose, 0,01 g Difco casaminosyrer og 2,2 g Difco agar opløses i 80 ml · I

I destilleret vand og autoklaveres. Derefter tilsættes sekventielt 0,2 ml I

sporelementopløsning, 1 ml KH2P04 (0,5%), 8,02 ml CaCl2.2H20 (3,68%), I

I 1,5 ml l-prolin (20%), 10 ml TES puffer (0,25 M), (pH: 7,2), 0,5 ml (1 I

DK 175656 B1 I

M) NaOH, 5 ml gærekstrakt (10%). I

3) TE: 10 mM TRIS HC1, 1 mM EOTA, pH 8,0. I

4) YEME: Difco gærekstrakt (0,3%), Difco pepton (0,5%), oxoid I

. maltekstrakt (0,3%), glucose (1%). I

5 Transformation af S. lividans protoplaster I

1. En kultur dannet af 25 ml YEME, 34% saccharose, 0,005 M MgCl,,, I

0,5% glycin i en 250 ml afbøjet kolbe centrifugeres i 30-36 timer. I

2. Tabletten opløses i 10,3% saccharose og centrifugeres. Denne I

udvaskning gentages én gang. I

10 3. Myceliet suspenderes i 4 ml lysozymopløsning (1 mg/ml i P medium I

med CaCl^ og MgCl2 koncentrationer reduceret til 0,0025 M) og inkubere- I

des ved 30°C i 15-60 minutter. I

4. Opløsningen blandes ved pipettering tre gange i en 5 ml pipette og I

inkuberedes yderligere 15 minutter. I

15 5. P medium (5 ml) tilsættes og blandes ved pipettering som under I

trin 4. I

6. Opløsningen filtreres gennem bomuld, og protoplaster sedimenteres I

I forsigtigt i en bordcentrifuge ved 800 x 6 i 7 minutter. I

7. Protoplaster suspenderes i 4 ml P medium og centrifugeres igen. I

20 8. Trin 7 gentages, og protoplaster suspenderes i den dråbe af P me- I

dium, der er tilbage efter borthældning af supernatanten (til tranforma- I

tion). I

9. DNA tilsættes i mindre end 20 pg TE. I

10. 0,5 ml PEG 1000 opløsning (2,5 g PEG opløst i 7,5 ml 2,5% ' 25 saccharose, 0,0014 K^SO^, 0,1 M CaC12> 0,05 M TRIS maleinsyre, Ph 8,0, plus sporelementer) tilsattes øjeblikkeligt og pipetteres en gang for at blande bestanddelene.

11. Efter 60 sekunder tilsættes 5 ml af P medium, og protoplasterne sedimenteres ved forsigtig centrifugering.

30 12. Tabletten suspenderes i P medium (1 ml).

13. 0,1 ml udstryges på R2YE plader (til transformation tørres plader i til 85% af deres oprindelige vægt, fx i et tørreskab med laminær luftstrøm).

14. Inkubation ved 30°C.

35 A - Konstruktion af en "sfr" gen-kassette j

En "sfr" gen-kassette konstrueredes for at muliggøre efterfølgende kloning i pianteekspressionsvektorer.

Isolering af et Fokl-BqlII fragment fra plasmidet pBG39 indehol-

Η DK 175656 B1 I

Η I

dende et "sfr" genfragment førte til tabet af de første kodoner, omfat- I

tende initieringskodonen, samt af de sidste kodoner, omfattende stopko- I

H donen. I

H Dette fragment af "sfr"-genet kunne rekonstrueres in vitro med I

H 5 syntetisk oligonukleotider, som koder for passende aminosyrer. I

H De komplementære syntetiske oligonukleotider var 5'CATGAGCCCAGAAC I

og 3'TCGGGTCTTGCTGC. I

Ved anvendelse af sådanne syntetiske oligonukleotider kunne 5'en- I

den af "sfr"-genet gendannes, og GTG initieringskodonen substitueres for I

10 en kodon, der var godt oversat af planteceller, især en ATG kodon. I

DNA-fragmentet indeholdende de til nsfr"-genet forbundne I

oligonukleotider blev derefter indsat i et passende plasmid, som I

indeholdt en bestemt nukleotidsekvens, der derefter blev betegnet af et I

"adapter"-fragment. I

15 Dette adapter fragment omfattede: I

en TGA terminationskodon, som muliggjorde, at de sidste kodoner af I

"sfr"-genet kunne blive gendannet; I

passende restriktionspositioner, som muliggjorde indføring af det I

H fragment af nukleotidsekvensen, der omfatter det med de syntetiske j I

20 oligonukleotider delvis gendannede "sfr-"gen; denne indføring resultere- I

I de i rekohstruktionen af et intakt "sfr-"-gen; I

I passende restriktionspositioner for isoleringeen af hele "sfr"- I

genet. I

I "sfr"-genet blev derefter indført i et andet plasmid, som inde- 1 I

I 25 holdt en passende plantepromotorsekvens. PIantepromotorsekvensen bestod I

I af blomkålsmosaikvirus promotorsekvens (p35$). Naturligvis er opfindel- I

sen ikke begrænset til anvendelsen af denne særlige promotor. Andre I

I sekvenser kunne vælges som promotorer egnede i planter, fx TR Γ-2'pro- I

I motorregionen og promotorfragmentet af en Rubisco lille subunitgen fra I

30 den herefter beskrevne Arabidopsis thaliana. I

I 1. Konstruktion af plasmid dLK56.2 ifiour 3) ' I

I Konstruktionen af plasmid pLK56.2 tilsigtede opnåelsen af en pas- I

I sende adaptor omfattende følgende sekvens af restriktionspositioner: I

I Smal, BamHI, Ncol, Kpnl, Bglll, Mlul, BamHI. Hindi11 og Xbal. I

I 35 De til denne konstruktion anvendt udgangspi asmider pLK56, pJB64 og I

I pLK33 er dem, der kendes fra Botterman (ref. 11). I

I De herefter beskrevne DNA-fragmenter isoleredes og separeredes fra I

I lavtsmeltende agarose (LGA). I

I H

DK 175656 B1 19

Plasmidet pLK56 spaltedes af enzymerne BamHI og Ndel. Et Ncol-Ndel fragment (vist i tegningen ved bue Ma" i brudt linie) opnået fra plasmid pJB64 blev substitueret i pl_K56 for BamHI-Ndel fragmentet vist ved "b". Splejsning var mulig efter fyldning i de fremstående ender af BamHI og 5 Ncol med DNA polymerase I af E. coli (Klenows fragment).

Recirkulering fandt især sted ved hjælp af T4 DNA ligase. Et nyt plasmid pLK56.3 opnåedes.

Dette plasmid blev spaltet af enzymerne Xbal og PstI.

BamHI-PstI fragmentet af pLK33 (c) (i figur 3) blev substitueret 10 for Xbal-PstI fragmentet (d) af pLK56.3, efter reparation af deres respektive ender med Klenows fragment.

Efter recirkularisering ved hjælp af T4 DNA ligase indeholdt det opnåede plasmid pLK56.2 en nukleotid sekvens, som omfattede de nødvendige restriktionspositioner for den efterfølgende indføring af "sfr"-15 genet.

2. Konstruktion af plasmid dGSH150 (figur 4al

Parallelt med den sidst anførte konstruktion blev der fremstillet I et plasmid indeholdende en promotorsekvens, genkendt af polymeraserne af planteceller og omfattende passende restriktionspositioner, downstream 20 for nævnte promotorsekvens i transskriptionsretningen, hvilke restriktionspositioner derefter er beregnet at muliggøre tilpasning af "sfr"-genet, der da fås fra pLK56.2, under kontrol af nævnte plantepromotor.

Plasmid pGV825 beskrives af Deblaere et al (ref. 10). Plasmid pJB63 kendes fra Botterman (ref. 11).

25 pGV825 blev lineariseret med Pvull og recirkulariseret med T4 DNA

ligase, hvilket resulterede i udslettelse af et internt Pvull fragment vist ved (e), (plasmid pGV956).

pGV956 spaltedes derefter af BamHI og Bol 11.

BamHI-Bol II fragmentet (f) opnået fra pJB63 dephosphoryleredes med 30 kalveintestinphosphatase (CIP) og substitueredes for BamHI-BqlII fragmentet af pGV956.

Plasmid pGV1500 opnåedes efter recirkularisering ved hjælp af T4 DNA ligase.

Et EcoRI-HindlH fragment opnået fra plasmid pGSH50 blev renset.

35 Sidstnævnte plasmid bar det duale TR Γ-2'promotorfragment beskrevet i Velten et al (ref. 13). Oette fragment blev indført i pGV1500, opløst med Hoal og HindiII og gav pGSH150.

Dette plasmid indeholder promotorfragmentet foran 3'enden af T-DNA

I DK 175656 B1 I

I 20 I

H transcript 7 og BamHI og Clal positioner til kloning. I

3. Konstruktion af plasmid PGSJ260 ffiour 4B1 I

H CP3 er et plasmid afledt fra pBR322, og som indeholder 35S promo- I

H torregionen af blomkålsmosaikvirus inden i et BamHI fragment. I

5 pGSH150 blev skåret med BamHI og Bglll. I

BamHI-BolII fragmentet (h) af CP3, som indeholdt den nukleotide I

sekvens af p35S promotor, blev substitueret for BamHI-Bol II fragmentet I

(i) i position pGSH150 til dannelse af plasmid pGSJ250. pG5J250 blev I

derefter åbnet ved dets Bgl.II restriktionsposition. I

10 Et BamHI fragment opnået fra mGV2 (ref. 12) blev indsat i pGSJ250 I

ved Bglll positionen til dannelse af plasmid pGSJ260. I

Inden indføringen af det fra pLK56.2 opnåelige "sfr-"-gen i I

plasmid pGSJ260, var det imidlertid stadig ønskeligt at modificere I

førstnævnte yderligere for at muliggøre indføringen på en mere praktisk I

15 måde. pLK56.2 blev således yderligere modificeret som anført nedenfor I

I til at give pGSRl. I

Startende fra plasmid pGSJ260 blev der fremstillet to plasmidkon- I

struktioner til efterfølgende transformationer af planteceller: I

1 et første plasmid, der muliggør ekspression af "sfr"-genet i I

I 20 cytoplasmaet af planteceller, og I

et andet plasmid, der er således modificeret, at der opnås tran- I

sport af Bialaphos-resistens enzymerne til chloroplasterne af plantecel- I

lerne. I

Første tilfælde: olasmid. der muliggør ekspression af "sfr'^genet I

25 i cytoplasmaet af planteceller. I

H

Kloning af "sfr" oen-kassetten i en planteekspressionsvektor I

fpGSR2) figur 5). I

I figur 5a vises den nukleotide sekvens af adaptoren af pLK56.2. I

Især vises beliggenhederne af BamHI. Ncol, Bglll restriktionspositioner- I

30 ne. I

Dette adaptorfragment blev spaltet af enzymerne Ncol og Bglll. I

Figur 5B viser Fokl-BolII fragmentet (j) opnået fra pBG39. Belig- I

genhederne for disse to restriktionspositioner er vist i figur 2. I

Ved anvendelse af syntetiske oligonukleotider blev de første kodo- I

35 ner af "sfr”-genet gendannet, især 5'enden af genet, hvori en ATG i ni ti- I

eringskodon blev substitueret for det initiale GTG kodon. I

Dette Fokl-BolII fragment, kompletteret med de syntetiske oligo- I

nukleotider, blev derefter substitueret i pLK56.2 for Ncol-BglII frag- I

DK 175656 B1 21 mentet af adaptoren. 3'enden af genet blev således også gendannet, efter recirkulari sering med T4 DNA ligase. Det opnåede plasmid pGSRl indeholdt således hele "sfr"-genet indført i dets adaptor.

Plasmidet pG$J260 blev derefter åbnet af BamHI (figur c), og BamHI 5 fragmentet opnået fra pGSRl, som indeholdt hele "sfr"-genet, blev indført i pGSJ260.

Det opnåede plasmid, pGSR2 (se figur 6A) Indeholdt et pBR322 replikon, et bakterielt streptomycin resistens gen (SDM-SP-AD-transfera-se) og en fremstillet T-DNA bestående af: 10 grænsefragmenter af T-DNA; et chimerisk kanamycingen, som tilvejebragte en dominerende udvælgelig markør i planteceller; og en chimerisk "sf^'-gen.

Den chimeriske "sfr"-gen bestod af: 15 promotorregionen af blomkålsmosaikvirus (p35S); "sfr"-gen kassetten som beskrvet i figur 5; den 3'uoversatte region, omfattende polyadenyleringssignalet af T-DNA transcript 7.

pGSR2 blev indført i Aarobacterium tumefaciens recipient 20 C58ClRif^ (pGV2260) ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet af Deblaere et al (ref. 10).

Denne stamme blev anvendt til at indføre det chimeriske "sfr"-gen i N. tabacum SRj planter.

To variantpi asmider afledet fra pGSR2, nemlig pGSFR280 og 25 pGSFR281, er blevet konstrueret. De er forskellige i den uoversatte sekvens, der følger efter transskriptionsinitieringspositionen. I p6SR2 består dette fragment af følgende sekvens: GAGGACACGCTGAAAT CACCAGTCTCGGAT CCAT G: 30 mens den består af GAGGACACGCT GAAAT CACCAGT CTCT CTACAAAT C6AT CCAT G; 35 i pGSR280 og af

GAGGACACGCTGAAAT CACCAGT CTCTT C ACAAAT CGATG

I DK 175656 B1 I

I I

i pGSFR281, med en ATG kodon, der er initieringskodon for "sfr"-genet. I

"sfr"-genet fusioneres også til TRI'-2'promotoren i plasmidet pGSHISO I

I {figur 4A), hvilket frembringer pGSFR160 og pGSFR161 (figur 6B). Disse I

plasmider indeholder små forskelle i pTR2 "sfr"-gen konfigurationen: I

5 "sfr"-genet fusioneres korrekt til det endogene gen 2'ATG i pGSFR161 I

I (for sekvenser se ref. 13), hvorimod fire ekstra basispar (ATCC) er til I

stede lige foran ATG kodonen i pGSFR160. Ellers er plasmiderne p65FR161 I

og p65FR160 fuldstændigt identiske. I

Alle plasmider indføres i Aarobacterium ved cointegration i accep- I

I 10 torplasmiderne pGV2260, der giver de respektive plasmider pGSFR1280, I

I pGSFR1281, pGSFRl160 og pGSFR1161. I

Andet tilfælde: Konstruktion af et plasmid indeholdende "sfr"- I

genet downstream for en DNA sekvens, der koder for et transitpeptid og H

er eonet til opnåelse af efterfølgende translokation af "sfr"-gen I

I 15 ekspressionsproduktet i plantecelle-chloroolaster. I

1 et andet sæt forsøg blev den nukleotide sekvens, som indeholdt I

nsfr"-genet, fusioneret til en DNA sekvens, der koder for et H

I transitpeptid for at muliggøre dets transport til chloroplaster. I

I Et fragment af "sfr"-genet blev isoleret fra adaptorfragmentet I

20 beskrevet ovenfor og fusioneret til et transitpeptid. Hed syntetiske H

I oligonukleotider blev hele "sfr"-genet rekonstrueret og fusioneret til I

et transitpeptid. I

I Plasmidet (plasmid pATS3 nævnt nedenfor), som indeholdt den nukle- I

I otide sekvens, der koder for transitpeptidet, omfattede også promotor- I

25 sekvensen heraf. I

I Konstruktion af plasmidet dGSR4. som indeholder "sfr"-genet I

I fusioneret til en DNA sekvens, der koder for-transitpeptid (figur 7). I

I Plasmid pLK57 er fra Botterman (ref. 11). Plasmid pATS3 er en H

I pUC19 klon, som indeholder et 2 Kb EcoRI genomisk DNA-fragment fra Ara- I

I 30 bidopsis thaliana omfattende promotorregionen og transitpeptid nukleotid H

sekvensen af genet, ekspressionen deraf er den lille subunit af ribulose I

I biphosphat carboxylase (ssu). Den lille subunit A. thaliana blev isole- H

I ret som et 1 500 bp EcoRI-Sphl fragment. Sphl spaltningspositionen frem- I H

I kommer nøjagtigt på den position, hvor koderegionen for det modne ssu H

I 35 protein starter. H

I Plasmiderne pLK57 og pATS3 blev åbnet med EcoRI og SphI. Efter H

I recirkulari sering ved hjælp af T4 DNA ligase blev der opnået et H

I rekombinant plasmid pLKABl, der indeholder den sekvens, der koder for H

DK 175656 B1 I 23 | transitpeptidet (Tp) og dets promotorregion (Pssu).

For at fusionere °sfr"-genet korrekt på signalpeptidets spaltningsposition, blev N-terminal gensekvensen først modificeret. Da det observeredes, at N-terminal genfusioner med ,,sfr“-genet bevarer deres 5 enzymatiske aktivitet, blev den anden kodon (AGC) modificeret til GAC, hvilket gav en Ncol positionsoverlapning med ATG initiatorpositionen. Et nyt plasmid, pGSSFR2, blev opnået. Det er kun forskelligt fra pGSRl (figur 5B) ved denne mutation. NcoI-BamHI fragmentet opnået fra pGSFR2 blev fusioneret til Sj)hl enden af transitpeptid sekvensen. På samme måde blev 10 "sfr"-genet fusioneret korrekt til ATG initiatoren af ssu-genet (ikke vist i figurer).

Introduktion af "sfr"-genet i en anden planteart.

Bialaphos-resistens indført i planter ved ekspression af chimeri- . ske gener, når de sidstnævnte er blevet omdannet med passende vektorer 15 indeholdende nævnte chimeriske gener, er blevet demonstreret som følger.

Rekombinantplasmiderne indeholdende "sfr"-genet blev indført separat ved

R

! bevægelse ind i Aarobacterium stamme C58Cj Rif (pGV2260) ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet af Deblaere et al., Nucl. Acid. Res., 13, p 1477, 1985. Rekombinantstammer indeholdende hybrid Ti pi asmider 20 blev dannet. Disse stammer blev brugt til at inficere og omdanne bladskiver af forskellige plantearter ifølge en fremgangsmåde i det væsentlige beskrevet af Horsh et al, 1985, Science, vol. 227. Disse forskellige plantearters transformationsprocedure, anført som eksempel, beskrives i det følgende.

25 1. Bladski vetransformation i Nicotiana tabacum

Anvendte medier beskrives i det følgende:

Aj MS salt/2 + 1% saccharose 0,8% agar pH 5,7 30 A10 B5-medium + 250 mg/1 NH4N03

750 mg/1 CaCI^O

0,5 g/1 2-(N-morpholino)-ethan- sulfonsyre (MES) pH 5,7 35 30 g/1 saccharose

Ajj B5-medium + 250 mg/1 NH^NO^ 0,5 g/1 MES pH 5,7

DK 175656 B1 I

I 24 I

2 % glukose I

I °»8% agar I

I 40 mg/l adenin I

^ + 1 ra9/l 6-benzylaminopurin (BAP) I

I mg/l indol-3-eddikesyre (IAA) I

I 500 mg/l Cl aforan I

A12 B5- medium + 250 mg/l NH4N03 I

10 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

2% glukose I

I 0,8% agar I

40 mg/1 adenin I

I 15 +1 mg/l BAP I

I 200 mg/l Cl aforan I

I ^13 salt/2 + 3% saccharose I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 20 0,7% agar I

I 200 mg/l Claforan I

I Bakterielt medium = min A: (Miller 1972) 60 mM I

I K2HP04, 3H20, I

I 25 33 mM KH2P04; 7,5 mM (NH4)2S04 I

1>7 M tri natri urne i trat; 1 mM I

MgS04; I

2 g/1 glukose; 50 mg/l vitamin Bl I

30 Plantemateriale: I

Nicotiana tabaeum cv. Petit Havana SRI I

Planterne anvendes 6*8 uger efter subkultur på medium Aj I

Infektion: I

- De midterste ribber og kanter fjernes fra bladene. I

35 - Resterende dele skæres i segmenter på ca. 0,25 cm og anbringes i infektionsmediet Ajq (ca. 12 segmenter på en 9 cm petriplade indehol-

dende 10 ml AjQ). I

- Segmenter inficeres derpå med 25 μΐ pr. petriskål af en sen log- I

DK 175656 B1 25 kultur af Aqrobacterium stamme dyrket i min A medium.

- Petriplader inkuberes 2-3 dage ved lav lysintensitet.

- Efter 2-3 dage fjernes mediet og erstattes med 20 ml medium AJ0 indeholdende 500 mg/1 clarofan.

5 Selektion oo skudinduktion - Bladskiverne anbringes på medium Aj^ indeholdende et selektivt middel: 100 mg/1 kanamycin og 10-100 mg/1 phosphinotricin.

10 - Bladskiverne overføres hver uge til et frisk medium.

- Efter 2-3 uger opstår regenererede call i. Oe adskilles og anbringes på medium Aj2 med den samme koncentration af selektivt middel som anvendt til selektionen.

i Rodfæste 15 - Efter 2-3 uger dækkes call i med skud, som kan isoleres og over føres til rodmediet AJ3 (uden selektion).

- Rodfæstet tager 1-2 uger.

- Efter et par uger mere formeres disse planter på medium Aj.

20 2. Rodknoldinfektion på Solanum tuberosum (kartoffel)

Anvendte medier beskrives i det følgende:

Cj B5-medium + 250 mg/1 NH4N03 25 300 mg/1 (CaCH2P04)2 0,5 g/1 MES pH 5,7 0>5 g/1 polyvinyl pyrrolidon (PVP) 40 g/1 mannitol (=0,22M) 0,8% agar 30 40 mg/1 adenin C- B5-medium + 250 mg/1 NH.N0.» c 4 3 400 mg/1 glutamin 0,5 g/1 MES pH 5,7 35 0,5 g/1 pvp 40 g/1 mannitol 40 mg/l adenin 0,8% agar

I DK 175656 B1 I

I 26 I

H 0,5 mg/1 transzeatin I

0,1 mg/1 IAA I

500 mg/1 clarofan I

5 C5 MS salt/2 + 3% saccharose I

0,7% agar I

pH 5,7 I

I C7 B5-medium + 250 mg/1 ΝΗ^ΝΟ^ I

10 400 mg/1 glutamln I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 PVP I

20 g/1 mannitol I

I 20 g/1 glukose I

IS 40 mg/1 adenin I

0,6% agarose I

I + 0,5 mg/1 transzeatin I

I 0,1 mg/1 IAA I

I 20 500 mg/1 clarofan I

Cg B5-medium + 250 mg/1 NH4N03 I

I 400 mg/1 glutamln I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 25 0,5 g/1 PVP I

20 g/1 mannitol I

20 g/1 glukose I

40 mg/1 adenin I

0,6% agarose I

30 I

+ 200 mg/1 clarofan I

1 mg/1 transzeatin I

Cg B5-medium + 250 mg/1 NH4N03 I

25 400 mg/1 glutamin I

0,5 g/1 MES pH 5,7 I

0,5 g/1 PVP I

20 g/1 mannitol I

DK 175656 B1 27 20 g/1 glukose 40 mg/1 adenin 0,6% agarose 15 +1 mg/1 transzeatin 0,01 mg/l gibberellicsyre (ga3) 100 mg/1 clarofan 10 Cjj MS $alt/2 + 6% saccharose 0,7% agar

Bakterielt medium = min A: (Miller 1972) 60 mM

K2HP04, 3H20, 15 33 mM KH2P04; 7,5 mM (NH4)2S04 1,7 M tri natriumcitrat; 1 mM MgS04; 2 g/1 glukose; 50 mg/1 vitamin Bl 20 Plantemateriale:

Rodknolde af Solanum tuberosum c.v. Berolina c.v. Désirée

Infektion: 25 - Kartoflerne skrælles og vaskes med vand.

- Derefter vaskes de med koncentreret kommercielt blegemiddel i 20 minutter, og - skylles 3-5 gange med sterilt vand.

- De yderste lag fjernes (1-1,5 cm) 30 - Den centrale del skæres i skiver på ca. 1 cm2 og 2-3 mm tykke.

- Skiverne anbringes på medium Cj (4 stykker i en 9 cm petriskål).

- 10 μΐ af en sen log kultur af en Aqrobacterium stamme dyrket i min A medium anvendes til hver plade.

- Pladerne inkuberes i 2 dage ved lav lysintensitet.

Selektion og skudinduktion - Skiverne tørres på et filterpapir og overføres til medium C2 med 100 mg/1 kanamycin.

I DK 175656 B1 I

I I

- Efter en måned fjernes små call i fra skiverne og overføres til I

medium Cy indeholdende 50 mg/1 kanamycin. I

- Efter yderligere nogle få uger overføres call i til medium Cg I

indeholdende 50 mg/1 kanamycin. I

5 Hvis små skud begynder at udvikles, overføres call i til elonga- I

H tionsmedium Cg indeholdende 50 mg/1 kanamycin. I

I Rodfaste I

- Langstrakte skud fraskilles og overføres til rodmediet Cjj. I

10 - Skud med rødder formeres på medium Cg. I

3. Bladpladeinfektion i Lvcopersicum esculentum (tomat) I

I Anvendte medier beskrives i det følgende: I

I 15 I

I Aj MS salt/2 + 1% saccharose I

I 0,8% agar I

I pH 5,7 I

I Bj B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg I

I 20 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 PVP I

I 300 mg/1 Ca(H2P04)2 I

2% glukose I

40 mg/1 adenin I

I 25 40 g/1 mannitol I

I B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 PVP I

I 30 400 mg/1 glutamin I

I 2% glukose I

0,6% agarose I

40 mg/1 adenin I

40 g/1 mannitol I

35 I

+ 0,5 mg/1 transzeatin I

0,01 mg/1 IAA I

500 mg/1 clarofan I

DK 175656 B1 29 B5-medium + 250 mg/1 NH^NO^

0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP

5 400 mg/1 glutamin 2% giukose 0,6% agarose 40 mg/1 adenin 30 g/1 mannitol 10 + 0,5 mg/1 transzeatin 0,01 mg/1 IAA 500 mg/1 clarofan 15 B^ B5-medium + 250 mg/1 NH^NOj 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP 400 mg/1 glutamin 2% glukose 20 0,6% agarose 40 mg/1 adenin 20 g/1 mannitol + 0,5 mg/1 transzeatin

25 0,01 mg/1 IAA

500 mg/1 clarofan

Bg B5-medium + 250 mg/1 NH^NO^ 0,5 g/1 MES pH 5,7

30 0,5 g/1 PVP

400 mg/1 glutamin 2% glukose 0,6% agarose 40 mg/1 adenin 35 10 g/1 mannitol

+0,5 mg/1 transzeatin 0,01 mg/1 IAA

Η DK 175656 B1 I

Η 30 I

Η 500 mg/1 clarofan I

Bg B5-medium + 250 mg/1 NH4N03 I

0,5 g/1 MES pH 5,7 I

5 0,5 g/] pVp I

400 mg/1 glutamin I

2% glukose I

0,6% agarose I

40 mg/1 adenin I

10 I

+0,5 mg/1 transzeatin I

I 0,01 mg/1 IAA I

200 mg/1 clarofan I

15 B7 B5-medium + 250 mg/1 ΝΗ4Ν03 I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

0,5 g/1 PVP I

I 400 mg/1 glutamin I

I 2% glukose I

I 20 0,6% agarose I

I 40 mg/1 adenin I

+ 1 mg/1 transzeatin I

200 mg/1 clarofan I

25 I

Bg MS salt/2 + 2% saccharose I

0,5 g/1 MES pH 5,7 I

0,7% agar I

30 Bg B5-medium + 250 mg/1 NH4N03 I

0,5 g/1 MES pH 5,7 . I

0,5 g/1 PVP I

2% glukose I

0,6% agarose I

35 40 mg/1 adenin I

+ 1 mg/1 transzeatin I

0,01 mg/1 GAg I

DK 175656 B1 31

Bakterielt medium = min A: (Miller 1972) 60 mM

K2HP04. 3H20,

33 mM KH2P04; 7,5 mM (NH4)2S04 5 1,7 M trinatriumcitrat; 1 mM

MgS04; 2 g/1 glukose; 50 mg/1 vitamin Bl PIantemateriale: 10

Lvcopersicum esculentum cv. Lucullus.

Planterne anvendes 6 uger efter subkultur på medium A}.

Infektion: 15 - Midterribbe fjernes fra bladene.

- Blade skæres i segmenter på ca. 0,25 til 1 cm2 (bladkanterne beskadiges ikke, således at maksimalt 3 sider af bladstykkerne beskadiges).

- Segmenterne anbringes i medium Bj (oversiden nedad), ca. 10 seg-20 menter i en 9 cm petriskål.

- Segmenterne inficeres derefter med 20 pi pr. petriskål af en sen log kultur af Aorobacterium stammen dyrket i min A medium.

- Petriskåle inkuberer 2 dage ved lav lysstyrke.

- Medium fjernes efter 2 dage og erstattes af 20 ml medium Bj 25 indeholdende 500 mg/1 clarofan.

Selektion og skudinduktion - Bladskiverne anbringes i medium B2 + 50 eller 100 mg/1 kanamy- cin.

30 - Efter 5 dage sænkes mediets osmotiske tryk ved at sænke manni tol koncentrationen, overførsler udføres efter hinanden til medium B3’ B4’ B5 09 β6' - Efter en måned fjernes små call i med meristem fra bladskiverne og anbringes på medium B^ med 50 eller 100 mg/1 kanamycin.

35 - Når der er dannet små skud, overføres call i til elongationsmedi- um Bg med 50 eller 100 mg/1 kanamycin.

Rodfæste

I DK 175656 B1 I

I 32 I

- Langstrakte skud fraskilles og overføres til rodmediet Bg til I

H rodslagning. I

- Planter formeres på medium Aj. I

5 Væksthusforsøo for herbicid resistens I

Materiale og metode I

I dette forsøg anvendes to herbicider omfattende phosphinotricin I

som aktivt middel. I

10 Disse forbindelser er tilgængelige i handelen under de registrere* I

I de varemærker BASTAR og MEIJI HERBIACE R. I

H Disse produkter fortyndes med 2% ledningsvand. Sprøjtning udføres på et I

2 I

areal på 1 m fra fire hjørner. Vækthustemperaturen er ca. 22°C for I

I tobak og tomat, og over 10°C til 15°C for kartoffel. I

I I

I Resultater I

I - Tobak sprøjteforsøg. I

a) Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI planter omdannet med de I

I ; chimeriske "sfr"-gener som til stede i pGSFRl161 eller pGSFR1282 såvel I

I 20 som uomdannede kontrol planter (fra 10 cm til 50 cm høje) behandles med I

Ir I

I 20 1 BASTA /ha. Kontrol SRI planter dør efter 6 dage, mens transformere* I

I RI

de planter er fuldt resistente over for 20 1 BASTA og fortsætter I

I væksten uden at kunne skelnes fra ubehandlede planter. Ingen synlig I

I skade detekteres, selv om behandlingen gentages hveranden uge. Behand* I

25 lingen har ingen effekt på den følgende blomstring. Den anbefalede dosis I

I BASTAR herbicid i landbrug er 2,5-7,5 1/ha. I

I b) Et lignende forsøg udføres under anvendelse af 8 1/ha MEIJA I

I HERBIACER. De transformerede planter (de samme som ovenfor) er fuldt re- I

I si stente og fortsætter væksten uden at kunne skelnes fra ubehandlede I

30 planter. Ingen synlig skade kan detekteres. I

- Kartoffel sprøjteforsøg. I

I Utransformerede og transformerede kartoffel planter (Solanum I

I tuberosum cv. Berolina) (20 cm høje) med det chimeriske "sfr"-gen som I

I til stede i pGSFRl161 eller pGSFR1281 behandles med 20 1 BASTAR/ha. Kon- I

I 35 trolplanter dør efter 6 dage, mens de transformerede planter ikke viser I

nogen synlig skade. De vokser uden at kunne skelnes fra ubehandlede I

planter. I

I - Tomatsprøjteforsøg. I

DK 175656 B1 33

Utransformerede og transformerede tomatplanter (lycopersium escu-lentum c.v. luculus) (25 cm høje) med det chimeriske "sfr"-gen som til stede i pGSFR1161 og pGSFR1281 behandles med 20 1 BASTAR/ha. Kontrol -planter dør efter 6 dage, mens transformerede planter er fuldt resisten-5 te. De viser ingen synlig skade og vokser uden at kunne skelnes fra ubehandlede planter.

- Vækstkontrol af phytopathogene fungi med transformerede planter.

I et andet sæt eksperimenter dyrkes kartoffel planter udtrykkende chimeriske "SFR"-gener som til stede i pGSFRl161 eller pGSFR1281 i en 10 væksthusafdeling ved 20°C under høj fugtighed. Planter inokuleres ved sprøjtning med 1 ml suspension af 10® Phvtophtora infestans sporer pr. ml. Planter gror i vækstkamre (20°C, 95% fugtighed, 4000 lux), indtil svampesygdomssymptomer er synlige (en uge). Et sæt planter sprøjtes på dette tidspunkt med Bialaphos i en dosis på 81/ha. To uger senere er 15 ubehandlede planter fuldstændigt indficeret af svampen. Væksten af svampen standses på Bialaphos behandlede planter, og ingen yderligere sygdomssymptomer udvikles. Planterne er effektivt beskyttet af Bialaphos' fungicide virkning.

- Overførsel af PPT resistens gennem frø.

20 Transformerede tobaksplanter udtrykkende det chimeriske "SFR"-gen som til stede i pGSFRl161 og pGSFR1281 bringes til blomstring i væksthuset. De viser normal frugtbarhed.

Ca. 500 F1 frø af hver plante sås i jord, F1 betegnende frø af den første generation, dvs. direkte stammende fra de oprindeligt transforme-25 rede planter. Når frøplanterne er 2-3 cm høje, sprøjtes de med 8 1 p BASTA /ha. 7 dage senere kan sunde og beskadigede planter adskilles i forholdet ca. 3:1. Dette viser, at PPT resistens nedarves som en dominant markør indkodet af en enkel locus.

10 resistente F1 frøplanter dyrkes til modenhed, og frø høstes. F2 30 frøplanter dyrkes som beskrevet ovenfor og testes for PPT-resistens ved sprøjtning med BASTA i en dosis på 8 1/ha. Nogle af F1 planterne producerer F2 frøplanter, som alle er PPT-resi stente, hvilket viser at disse planter er homozygotiske over for resistensgenet. Opfindelsen angår også planteceller og planter, der er non-essentielt-biologisk-35 transformerede med et GS-inhibitor-inaktiverende-gen ifølge opfindelsen.

I en foretrukket udførelsesform af opfindelsen er planteceller og planter non-biologisk-transformerede med det ovenfor beskrevne "sfr"-gen.

DK 175656 B1 I

I 34 I

Sådanne planteceller og planter har, stabilt integreret i deres I

genom, en non-varietet-specifik karakter, som gør dem i stand til at I

producere detekterbare mængder af phosphinotricin-acetyl transferase. I

Denne karakter tildeler de transformerede planteceller og planter I

5 en non-varietet-specifik enzymatisk aktivitet, der er i stand til at I

inaktivere eller neutralisere GS-i nhi bi torer som Bialaphos og PPT. I

I overensstemmelse hermed gøres planteceller og planter, der er I

I transformeret ifølge opfindelsen, resistente over for herbicide virknin- I

H ger af Bialaphosog beslægtede forbindelser. I

10 Da Bialaphos først var beskrevet som et fungicid, kan transforme- I

rede planter også beskyttes mod svampesygdomme ved sprøjtning flere I

I 9ange med forbindelsen. I

I I en foretrukket udførelsesform anvendes Bialaphos eller beslægte- I

H de forbindelser flere gange, især med tidsintervaller på ca. 20 til 100 I

15 dage. I

I Opfindelsen angår også en ny fremgangsmåde til selektiv beskyttel- I

I se af en planteart mod svampesygdomme og til selektiv ødelæggelse af I

I ukrudt i en mark, omfattende trin til behandling af en mark med et her- I

bicid, hvori plantearten i sit genom indeholder et DNA-fragment, der I

H 20 koder for et protein med enzymatisk aktivitet, der er i stand til at I

I neutralisere eller inaktivere GS-inhibitorer, og hvor det anvendte her- I

bicid omfatter en GS-i nhi bi tor som aktiv bestanddel. I

Det vil forstås, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes I

med samme effektivitet, enten til kun at ødelægge ukrudt i en mark, hvis I

I 25 planter ikke er inficeret med svampe, eller til kun at standse udviklin- I

gen af svampe, hvis sidstnævnte viser sig efter destruktionen af ukrudt. I

I I en foretrukket udføre!sesform for fremgangsmåden ifølge opfin- I

I del sen transformeres plantearter med et DNA-fragment omfattende "sfr"- I

genet som ovenfor beskrevet, og det anvendte herbicid er PPT eller en I

I 30 beslægtet forbindelse. I

I I overensstemmelse hermed anvendes en opløsning af PPT eller en I

I beslægtet forbindelse på marken, fx ved sprøjtning, flere gange efter I

I fremkomst af den planteart, der skal dyrkes, indtil tidligt eller sent I

I spirende ukrudt er ødelagt. I

35 Det er ganske klart, at før emergens af den planteart, der skal I

I dyrkes, kan marken behandles med en herbicid komposition for at ødelægge I

I ukrudt. I

I På samme måde kan marker behandles også før såning af den plante- I

DK 175656 B1 35 art, der skal dyrkes.

Før emergens af den ønskede planteart kan marker behandles med et hvilket som helst herbicid, inklusive herbicider af Bialaphos-typen.

Efter emergens af den ønskede planteart, kan Bialaphos eller en 5 beslægtet forbindelse anvendes flere gange.

I en foretrukket udførelsesform anvendes herbicidet med tidsintervaller på omkring 20 til 100 dage.

Da planter, der skal dyrkes, transformeres på en sådan måde, at de er resistente over for den herbicide virkninger af herbicider af ^ 10 Bialaphos-typen, kan marker også behandles efter fremkomsten af de dyrkede planter.

Dette er særligt nyttigt til fuldstændigt at ødelægge tidligt og sent spirende ukrudt uden nogen virkning på de planter, der skal produceres.

15 Fortrinsvis anvendes Bialaphos eller en beslægtet forbindelse i en dosis, der går fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/ha, og fortyndet i en væskebærer til en koncentration, der muliggør dens anvendelse i marken i en mængde, der går fra ca. 2 til ca. 8 1/ha.

I det følgende gives illustrative eksempler på nogle udførelses-20 former med forskellige plantearter.

- Sukkerroer

Den nordeuropæiske sukkerroe plantes fra 15. marts til 15. april, afhængig af vejrforholdene, og mere nøjagtigt af nedbør og gennemsnitstemperatur. Ukrudtsproblemerne er mere eller mindre de samme i hvert 25 land og kan forårsage vanskeligheder, indtil afgrøden dækker jorden omkring midten af juli.

Ukrudtsproblemer kan adskilles i tre situationer: - tidlig spiring af græsukrudt, - tidlig spring af bredbladet ukrudt, 30 - sen spring af bredbladet ukrudt.

Indtil nu er der med held blevet anvendt præ-emergens herbicider.

Sådanne forbindelser kan fås i handelen under de registrerede varemærker: PYRAMIN^, GOLTIX^ og VENZEA^. Disse produkters følsomhed over for tørvejrbetingelser samt manglen på restaktivitet til kontrol af sent 35 spirende ukrudt har imidlertid fået landmanden til at anvende post-emergens produkter ud over præ-emergens produkterne.

Tabel (I) herefter viser de aktive bestanddele indeholdt i de herbicide kompositioner anført i de følgende eksempler.

I DK 175656 B1 I

I 36 I

I TABEL (I) I

I Handelsnavn Aktiv bestanddel Formel I

I 5 . I

AVADEXR Dial1 at EC 400 g/1 I

I AVADEX BWR Tri all at EC 400 g/1 I

GOLTIXR Hetamitron WP 70% I

I ROONEETR Cycloat EC 718 g/1 I

I 10 TRAMATR Ethofumerat EC 200 g/1 I

I FERVINALR Alloxydim-natrium SP 75% I

I BASTAR Phosphinotricin 200 g/1 I

I PYRAMIN FLR Chloridazon SC 430 g/1 I

I ! 15 Ifølge opfindelsen består post-emergens herbicider af Bialaphos I

I eller beslægtede forbindelser, som giver et godt niveau for kontrol af I

etårige græsser (Bromus. Avena spp., Alopecurus. POA) og bladbredede I

I (Galium. Polygonum. Senecio. Solanum. Mercurial i si. I

I Post-emergens herbicider kan anvendes på forskellige tidspunkter I

I 20 for sukkerroens vækst; på et kotyledon niveau, to-bladet niveau eller på

I et firbladet niveau. I

Tabel (II) herefter repræsenterer mulige systemer for markbehand- I

I- ling, givet som eksempel. I

I disse eksempler er det anvendte post-ermergens herbicid af Bia- I

I I

1 25 laphosklassen BASTA i kombination med forskellige præ-emergens herbici-

, der. Koncentrationer anføres i 1/ha eller kg/ha. I

37 DK 175656 B1 tf ae ce o x en x ~ —I “ ϋΐ 3 ^ ^cvj ^

S_ % O o CM

« -σ « J_ if . I · I o: cc 1 ' CD Xi < 2 £ z t> £

<£ CSJ <C CO

0> <*-. CQ CD

en £ c

>r O

•9 *- = OC --> 0) si >r> ch te ^ ·—i en ε en EU, « " £- g ~ £ ~ < . 4-> +» ' \ \

b -S£ Λ/ ^ Qi Q£ S- QH OZ

<. ^ <c <t<c< « w < <t CQ i— ^ ^ » i H- r— I— »— I- 1— 1 #y>* fS #Λ (Λ (Λ (/) C ίΛ t/> n_ o ec ro < π < <*) < <n &·—1 co <c ro te +j S CQ co co >eoca σ,-—' =3 <e s- -c ..

-Q \ σ> « -* _ “s_ « +-> cd s- *= r-' a> r- Φ · ?_, s- — S h

CD O) O

co i— "S . ae -Ω r- <C 2__ 5 _ 2_

-IH- -Μ «Λ ^ 1 * 1 1 CO 00 OO

i- o <r oo <t CO «X ro < ro

So, -S S CQ CO CQ

O -r-S- c—

S- co <D

^ -f-

^ E

3 0) trt 00 -f- 0) c +-> O) s- c σ> o- E w ω qé oc o; σ> ce σ» ^

Se E XX X-* x -* S

+j 4-> cu ·—. σ, ·—. en >—i . fr co oo i i— .ae I— ue t— in > I— l<0 i i i a£ V) ^ O O »S· O lo O Cel O CVJ n"10 ,— t/><+- C3030S 03 “- .

0 S- S-+> O C ‘ίο s-

«Λ CD

4-> > Ό O =3 s- cu er, “c ce Lej φ "c ce ce ce ce oc 2 y-_ 01 +-> *CT3 X I— X *— 1— Η- y— ” 2 1 σ, co «Λ LU LU LU LU <t 5.-iui •r- -1— O ΙΛ O LO LU i- Lej i- Σ I- ’ 1 %'- —± ·— CO J- C - <C - 2 2 «=£ ce <C * so, o >· ro s»ro o-e- o e- ce lo S"'0 PI00 2ΐι.Μ-«ί«χα:οίΐ— . . . . . · · · o I—c CM ro 0“ LO LO I— 03 O' Η

I DK 175656 B1 I

I I

I - Kartofler I

I Kartofler dyrkes i Europa på ca. 8 x 10® ha. De vigtigste I

produkter, der anvendes til ukrudtskontrol, er Linuron/monolinuron eller I

den forbindelse, der fås i handelen under betegnelsen METRABUZIN. I

H 5 Disse produkter fungerer godt over for de fleste ukrudtsarter. I

Imidlertid kontrolleres ukrudt såsom Gal i uro og Solanum plus sent I

spirende Chenopodium og Polyqonum ikke altid effektivt, mens kontrollen I

med etårige grasser også nogen gange er tilfældig. I

I Sent spirende bredbladet ukrudt kan kun kontrolleres med post- I

10 emergens anvendelser af herbicider såsom BASTA .

I Tabel (III) herefter repræsenterer eksempler på markbehandling i I

tilfælde af kartofler. I

I TABEL (111) I

I I

Ukrudtskontrolsystemer i kartofler, baseret på anvendelse af BASTA ,

H H

forudsat kartofler, der er gjort resistente over for BASTA .

I linuron + monominuron (375 g + 375 g/ha) før emergens. I

I I

I BA$TAR 3-4 1/ha efter emergens (5-15 cm) I

I BASTAR/fluazifop-butyl 3-4 1/ha + 21/ha efter emergens (5-15 cm) I 1

Linurin WP 50% (AFAL0NR) I

I 25 Mono!inurin WP 47,5% (ARESSINR) I

I fluazifop-butyl EL 250 g/1 (FUSILADER) I

I De ovenfor anvendte stammer pGSJ260 og pBG39 er blevet deponeret I

I 12. december 1985 hos "German Collection of Micro-Organisms" (Oeutsche I

I Sammlung von Mikroorganismen) i Gottingen, Tyskland. De har fået hhv. I

I 30 deponeringsnr. DSM 3606 og DSM 3607. I

DK 175656 B1 39

REFERENCER

5 1. BAYER et al., HELVETICA CHEMICA ACTA, 1972 2. WAKABAYASHI K. and MATSUNAKA S., Proc. 1982, British Crop Protection Conference, 439-450 3. M. Mason et al., PHYTOCHEMISTRY, 1982, vol. 21, η® 4, p.

10 855-857.

14. C. J. THOMPSON et al., NATURE, July 31, 1980, vol. 286, n° 5 772, p. 525-527 5. C. J. Thompson et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, August 1982, p. 678-685 15 6. C.J. THOMPSON et al., GENE 20, 1982, p. 51-62 7. C. J. THOMPSON et al., MOL. GEN. GENET., 1984, 195, p. 39-43 8. TOWBIN et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 1979, 26, p. 4 10.

9. METHODS OF ENZYMOLOGY, VXLIII, p. 737-755 10. DEBLAERE H. et al., 1985, Nucl. Acid. Res., 13, 1 477 20 11. BOTTERMAN J., February 1986, Ph. D. Thesis, State University of Ghent 12. DEBLAERE R., February 1986, Ph. D. Thesis, Free University of Brussels, Belgium 13. VELTEN et al, EMBO J. 1984, vol. 3, n° 12, p. 2 723-2 730 25 14. CHATER et al, Gene cloning in Streptomyces. Curr. Top.

Microbiol. Immunol., 1982, 96, p. 69-75 15. OMURA et al, J. of Antibiotics, Vol. 37, 8, 939-940, 1984 16. MURAKAMI et al, Mol. Gen. Genet., 205,42-50, 1986 17. MANDERSCHEID and WILO, J. Plant Phys., 123, 135-142, 1986

I DK 175656 B1 I

I I

I FWQ.RDFELPAPPRPVRPV I

I 5 I

t o i * I

hvilken del af nævnte polypeptid er af tilstrækkelig længde til at til- I

vejebringe beskyttelse mod Bialaphos-"plante-beskyttelsesevne-" til I

10 planteceller, når den er inkorporeret genetisk og udtrykt deri. I

Herefter vil henvisning også blive givet til den "plante-beskyttende- I

I evne" mod Bialaphos af ovennævnte nukleotide sekvens. I

I Betydningen af enkeltbogstavsbetegnelsen for aminosyrer gives i I

I det følgende: I

I I

I Alanin A Leucin L I

H Arginin R Lysin K I

I Asparagin N Methionin Μ I

Asparaginsyre D Phenylalanin F I

I 20 Cystein C Prolin P I

I Cystin C Serin S I

I Glycin G Threonin T I

I GIutaminsyre E Tryptophan W I

GIutamin Q Tyrosin Y I

I 25 Hi sti di η H Valin V I

I Isoleucin 1 I

I Dette andet foretrukne DNA-fragment består af følgende nukleotid- I

sekvens: I

I 30 I

I TAAAGAGGTGCCCGCCACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAGACCACAC I

1 I

GTGAGCCCAGAACGACGCCCGGTCGAGATCCGTCCCGCCACCGCCGCCGA I

I 35 CATGGCGGCGGTCTGCGACATCGTCAATCACTACATCGAGACGAGCACGG I

DK 175656 B1 41 tcaacttccgtacggagccgcagactccgcaggagtggatcgacgacctg (

GAGCGCCTCCAGGACCGCTACCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGAGGGCGT 5 CGTCGCCGGCATCGCCTACGCCGGCCCCTGGAAGGCCCGCAACGCCTACG

actggacogtcgagtcgacggtgtacgtctcccaccggcaccagcggctc ggactgggctccaccctctacacccacctgctgaagtccatggaogccca 10 ' gggcttcaagagcgtggtcgccgtcatcggactgcccaacgacoogagcg • tgcgcctgcacgaggcgctcggatacaccgcgcgcgggacgctgogggca 15 gccggctacaagcacgggggctggcacgacgtggggttctggcagcgcga cttcgagctgccggccccgccccgccccgtccggcccgtcacacagatct gagcggagagcgcatggc 20 eller af en del deraf udtrykkende et polypeptid med plantebeskyttel-sesevne mod Bialaphos;

Herefter følger beskrivelsen af forsøg udført til isolering af 25 "sfrsv"-resistensgenet, konstruktionen af ekspressionsvektorer, som indeholder resistensgenet og som muliggør efterfølgende transformation af planteceller for at gøre dem resistente over for GS-i nhi bi torer.

Kloning af Bialaphos-resistens-"sfrsv"-qenet fra Streptomvces viridochromogenes.

30 Stammen Streptomvces viridochromogenes DSM 40735 (ref. 1) dyrkedes og total DNA af denne stamme blev fremstillet i henhold til standardteknikker. DNA prøver blev nedbrudt med hhv. PstI, Smal <>9 Sau3AI i tre forskellige reaktioner og separeret på en agarose gel sammen med plasmid DNA fra pGSRI (figur 5B) nedbrudt med BamHI. I en "Southern" analyse 35 udførtes DNA blotting på et nitrocellulosefilter, og der hybridiseredes med det mærkede BamHi fragment fra pGSRI indeholdende "sfr"-genet. I alle fire baner på gelen viste et restriktionsfragment stærkt homologi med proben: et PstI fragment på ca. 3 kb, et Smal fragment på ca. 1,2

I DK 175656 B1 I

I 42 I

kb og Sau3AI fragment på ca. 0,5 kb. For at klone dette gen, klonedes I

PstI restriktionsfragmenter direkte i Escherichia col i vector pl)C8. 3000 I

kolonier opnået efter transformation blev overført til I

nitrocellulosefiltre og hybridiseret med "sfr"-proben. Positive I

5 kandidater testedes yderligere for deres vækst på minimal medium plader I

indeholdende 300 pg/ml PPT. En transformant, som voksede på PPT- I

indeholdende medium analyseredes yderligere. Plasmidkortet og relevante I

plasmidpositioner for dette plasmid pJSl er vist i figur 8. Stammen I

' MC1061 (pJSl) er blevet deponeret 6. marts 1987 hos Deutsche Sammlung I

10 von Mikroorganismen (DSM) under deponeringsnr. DSM 4023. I

I Klonrestriktionsfragmentet er blevet sekventeret ifølge Maxam og I

Gilberts metode, og genets koderegion kunne identificeres gennem I

I homologi. Sekvensen af "sfrsv"-genet er vist i figur 9, og homologien på I

I nukelotid og aminosyresekvens niveauet med "sfr"-gen er vist i figur 10. I

I 15 Ekspression af 11 sfrsv"-genet I

En "sfrsvn-gen kassette'1 blev også konstrueret for at muliggøre I

I efterfølgende kloning i planteekspressionsvektorer. Et Banll—BolII I

I J . fragment indeholdende "sfrsv"-koderegionen uden initieringskodonen GTG I

blev isoleret fra pJSl. Dette fragment splejsedes i den med Ncol og I

20 BolII nedbrudte vektor pLK56-2 sammen med en syntetisk oligonukleotid I

5'-CATGACCC-3', på lignende måde som den for "sfr"-genet beskrevne og

I vist i figur 5. Konstruktionen af pGSRISV er vist skematisk i figur 11. I

I Da lignende kassetter af begge gener er til stede i hhv. pGSRl og I

I pGSRISV, kan de tidligere beskrevne konstruktioner for ekspressionen af I

25 "sfr"-genet i planter gentages. I

I Enzymatisk analyse af rå ekstrakter fra E. coli stammer bærende I

I plasmid pGSRISV viste syntesen af en acetyl ase, som kunne acetyl ere PPT. I

Dette vistes med tyndlagskromotografi for reaktionsprodukterne.

I "sfrsv"-genet blev derefter indsat i plasmidvektoren pGSJ260 (fi- . M

I 30 gur 4B) under kontrol af CaMV 35s promotor, til at give et plasmid I

I pGS2SV, svarende til pGSR2 (figur 6A) med undtagelse af, at "sfrsv"- I

I genet er substitueret for "sfr"-genet. I

I Det er klart, at herbicidresistensgener af ovennævnte type kan fås

I fra mange andre mikroorganismer, som producerer PPT eller PPT derivater. I

I 35 Herbicidresistensgen kan derefter inkorporeres i planteceller med I

I henblik på at beskytte dem mod virkningen af sådanne glutamin syntetase I

I inhibitorer. Et Bialaphos-resistens-gen kan fx opnås fra Kitasotosporia I

I (ref. 15).

DK 175656 B1 43

Transformerede planteceller og planter som indeholder "sfrsv"-resi stensgenet kan opnås med plasmid pGSR2SV ved anvendelse af det samme Agrobacterium-medierede-transformationssystem som beskrevet ovenfor for transformation af forskellige plantearter med "$fr"-genet.

5 Planter regenereres og testes for deres resistens med lignende sprøjtetests som beskrevet ovenfor. Alle planter opførte sig på lignende måde og viste resistens mod herbicider bestående af glutaminsyntetasein-hibitorer.

Endelig angår opfindelsen også kombinationen af planter, der er 10 resistente over for en inhibitor af glutaminsyntetase som defineret ovenfor, med den tilsvarende inhibitor af glutaminsyntetase til brug ved produktionen af kulturer af nævnte planter fri for ukrudt.

15 I 20 25 30 35

I DK 175656 B1 I

I I

I REFERENCER I

I 5 I

I 1. BAYER et al., HELVETICA CHEMICA ACTA, 1972 I

2. WAKABAYASHI K. and MATSUNAKA S., Proc. 1982, British Crop I

Protection Conference, 439-450 I

3. M. Mason et al., PHYTOCHEMISTRY, 1982, vol. 21, n° 4, p. I

I 10 855-857. I

4. C. J. THOMPSON et al., NATURE, July 31, 1980, vol. 285, I

I n° 5 772, p. 525-527 I

I 5. C. J. Thompson et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, August 1982, I

I p. 678-685 I

I 15 6. C. J. THOMPSON et al., GENE 20, 1982, p. 51-62 I

I 7. C. J. THOMPSON et al., MOL. GEN. GENET., 1984, 195, p. 39-43 I

I 8. TOWBIN et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 1979, 76, p. 4 10. I

I 9. METHODS OF ENZYMOLOGY, VXLIII, p. 737-755 I

I 10. DEBLAERE H. et al., 1985, Nuel. Acid. Res., 13, 1 477 I

I 20 11. BOTTERMAN J., February 1986, Ph. D. Thesis, State University I

I of Ghent I

I 12. DEBLAERE R., February 1986, Ph. D. Thesis, Free University of I

Brussels, Belgium I

I 13. VELTEN ét al, EMBO J. 1984, vol. 3, n° 12, p. 2 723-2 730 I

I 25 14. CHATER et al, Gene cloning in Streptomyces. Curr. Top. I

Microbiol. Immunol., 1982, 96, p. 69-75 I

I 15. OMURA et al, J. of Antibiotics, Vol. 37, 8, 939-940, 1984 I

I 16. MURAKAMI et al, Mol. Gen. Genet., 205,42-50, 1986 I

I 17. MANDERSCHEID and WILD, J. Plant Phys., 123, 135-142, 1986 .

I 30 I

Claims (38)

40 DK 175656 B1

1. Fremgangsmåde til at kontrollere virkningen i planteceller, og planter omfattende sådanne celler, af en glutaminsyntetaseinhibitor, når førstnævnte bringes i kontakt med sidstnævnte, 5 hvilken fremgangsmåde omfatter forårsagelse af den stabile integration i det genome DNA af plantecellerne af et heterologt DNA omfattende en promoter genkendt af polymeraser hos plantecellerne, og en fremmed nukleotidsekvens, der er i stand til at blive udtrykt i form af et protein i plantecellerne og planterne, under kontrol af promoteren, og hvor proteinet har en enzymatisk aktivititet, der er i stand til at forårsage inaktivering eller neutralisering af 10 glutaminsyntetaseinhibitoren.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor det heterologe DNA-fragment omfatter en fremmed nukleotidsekvens, der koder for et polypeptid med en acetyltransferaseaktivititet, i særdeleshed PPT acetyltransferase aktivititet, med hensyn til glutaminsyntetaseinhibitoren. 15

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvor den fremmede nukleotidsekvens er afledt af genomet fra en antibiotikumproducerende Streptomyces stamme eller er en nukleotidsekvens, der koder for samme aktivititet.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, hvor det heterologe DNA omfatter en fremmed nukleotidsekvens, der koder for et protein med følgende sekvens: X SER PRO GLU 183

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, hvor det heterologe DNA- I I fragment omfatter følgende nukleotidsekvens: I I 25 GTG AGC CCA GAA I I 183 I I CGA CGC CCG GCC GAC ATC CGC CGT GCC ACC GAG GCG GAC ATG CCG I I 228 I I GCG GTC TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACG GTC I I 30 273 I I ACC TTC CGT ACC GAG CCG CAG GAA CCG CAG GAG TGG ACG GAC GAC I I 318 I I CTC GTC CGT CTG CGG GAG CGC TAT CCC TGG CTC GTC GCC CAG GTG I 363 DK 175656 B1 42 GAC GGC GAG GTC GCC GGC ATC GCC TAC GCG GGC CCC TGG AAG GCA 409 CGC AAC GCC TAC GAC TGG ACG GCC GAG TCG ACC GTG TAC GTC TCC 5 453 CCC CGC CAC CAG CGG ACG GGA CTG GGC TCC ACG CTC TAC ACC CAC 498 CTG CTG AAG TCC CTG GAG GCA CAG GGC TTC AAG AGC GTG GTC GCT 543

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, hvor det heterologe DNA-fragment omfatter nukleotidsekvensen ifølge krav 5, hvor initieringskodonen ATG substitueres for initieringskodonen GTG.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en plante eller reproduktionsmateriale af planten, omfattende et heterologt genetisk materiale, som er stabilt integreret deri og i stand til at blive kunne udtrykt i planterne eller reproduktionsmaterialet i form af et protein, der er i stand til at inaktivere eller neutralisere aktiviteten af en glutaminsyntetaseinhibitor, hvilken fremgangsmåde omfatter transformation af planteceller eller plantevæv med en DNA 30 rekombinant indeholdende et heterologt DNA omfattende en fremmed nukleotidsekvens, som koder for proteinet, samt reguleringselementerne udvalgt blandt sådanne, der er i stand til at forårsage den stabile integration af det heterologe DNA i plantecellerne eller plantevævet og muliggøre ekspressionen af den fremmede nukleotidsekvens i plantecellerne I DK 175656 B1 I I I eller plantevævet, regeneration af planter eller reproduktionsmateriale af planterne, eller I begge dele, fra plantecellerne eller vævet, der er transformeret med det heterologe DNA og, I eventuelt, biologisk replikation af sidstnævnte planter eller reproduktionsmateriale eller I begge dele. I I I

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvor udgangsceller transformeres med et rekombinant I H DNA, som indeholder det heterologe DNA som defineret i et hvilket som helst af kravene 2 I I 6. I

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor det rekombinante DNA er en vektor, der er egnet til I transformation af plantens celler. I

10 CTG CCG GTA CCG CCC CGT CCG GTC CTG CCC GTC ACC GAG ATC I

723 I hvori Y er enten ATG eller GTG. I

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 8 eller 9, hvorved der bibringes I I resistens mod de herbicide virkninger af Bialaphos, PPT eller beslægtede derivater til de I 15 transformerede planteceller. I

10. GTC ATC GGG CTG CCC AAC GAC CCG AGC GTG CGC AT G CAC GAG GCG 588 CTC GGA TAT GCC CCC CGC GGC ATG CTG CGG GCG GCC GGC TTC AAG 633 CAC GGG AAC TGG CAT GAC GTG GGT TTC TGG CAG CTG GAC TTC AGC 15 678 CTG CCG GTA CCG CCC CGT CCG GTC CTG CCC GTC ACC GAG ATC 7.23 eller den tilsvarende del deraf. 20

10 LEU GLY TYR ALA PRO ARG GLY MET LEU ARG ALA ALA GLY PHE LYS I I 633 I I HIS GLY ASN TRP HIS ASP VAL GLY PHE TRP GLN LEU ASP PHE SER I I 678 I LEU PRO VAL PRO PRO ARG PRO VAL LEU PRO VAL THR GLU ILE I I 15 72 3 I I hvori X betegner MET eller VAL, eller koder for en del af proteinet, hvor delen har en I I tilstrækkelig længde til at besidde den enzymatiske aktivititet af hele proteinet og, når DNA- I I fragmentet er udtrykt i planteceller, at beskytte sidstnævnte mod I I 20 glutaminsyntetaseinhibitorens herbicide virkning. I

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 10, hvor det heterologe I I DNA-fragment omfatter en nukleotidsekvens, der koder for et transitpeptid indskudt mellem I plantepromoterregionen og den fremmede nukleotidsekvens, der koder for I 20 glutaminsyntetaseinhibitoren. I

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, hvor transitpeptidet vælges blandt ribulose-l,5-bifosfat- I I carboxylase og klorofyl a/b bindende proteiner. I I 25

13 . Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 8 til 12, hvor vektoren er et Ti I plasmid indeholdende det heterologe DNA-fragment. I

14. Planteceller, der er non-biologisk transformerede, som besidder et heterologt DNA I stabilt integreret i deres genom, hvilket heterologt DNA-fragment indeholder en fremmed I I 30 nukleotidsekvens, der koder for et protein med non-varietet-specifik enzymatisk aktivititet, I I der er i stand til at neutralisere eller inaktivere en glutaminsyntetaseinhibitor under kontrol I I af en promoter genkendt af plantecellens polymeraser. I DK 175656 B1 I

44 I

15. Planteceller ifølge krav 14, som kan regenereres til en plante, der er i stand til at I producere frø. I

16. Planteceller ifølge krav 14.eller 15, som transformeres ved fremgangsmåden ifølge et I 5 hvilket som helst af kravene 7 til 13. I

17. Planteceller ifølge et hvilket som helst af kravene 14 til 16, som producerer påviselige I mængder af fosfinotricinacetyltransferase. I 110

18. Fremgangsmåde til selektiv beskyttelse af en planteartkultur og selektiv ødelæggelse af I ukrudt, hvilken fremgangsmåde omfatter behandling af marken med et herbicid bestående af I en glutaminsyntetaseinhibitor, hvor planteartens celler i deres genom indeholder en I fremmed nukleotidsekvens, der koder for et protein med en enzymatisk aktivitet, der er i I stand til at neutralisere eller inaktivere glutaminsyntetaseinhibitoren under kontrol af en I 15 promot er genkendt af plantecellernes polymeraser. I

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, hvor plantearten indeholder et heterologt DNA-fragment som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 6.

20 ARG ARG PRO ALA ASP ILE ARG ARG ALA THR GLU ALA ASP MET PRO 228 ALA VAL CYS THR ILE VAL ASN HIS TYR ILE GLU THR SER THR VAL 273 ASN PHE ARG THR GLU PRO GLN GLU PRO GLN GLU TRP THR ASP ASP 25 318 LEU VAL ARG LEU ARG GLU ARG TYR PRO TRP LEU VAL ALA GLU VAL 363 ASP GLY GLU VAL ALA GLY ILE ALA TYR ALA GLY PRO TRP LYS ALA 408

20. Fremgangsmåde ifølge krav 18 eller 19, hvor plantearten transformeres ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 13.

21. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 20, hvor en opløsning af glutaminsyntetaseinhibitoren anvendes flere gange på marken efter fremkomst af den t 25 dyrkede planteart, i særdeleshed i tidsintervaller på ca. fra 20 til 100 dage, indtil tidligt- eller sent-spirende ukrudt er ødelagt.

22. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 21, hvor glutaminsyntetaseinhibitoren vælges fra en gruppe, som omfatter Bialaphos, fosfinotricin og 30 beslægtede forbindelser.

23. Fremgangsmåde til selektiv beskyttelse af en planteart på en mark mod svampesygdomme, hvilken fremgangsmåde omfatter de trin, at man behandler marken med ! DK 175656 B1 I I I et herbicid bestående af en glutaminsyntetaseinhibitor, hvor plantearten i genomet af sine I celler indeholder heterologt DNA inklusiv en promoter genkendt af cellens polymeraser og I en fremmed nukleotidsekvens, der koder for et protein med en enzymatisk aktivitet, der er i I stand til at neutralisere eller inaktivere glutaminsyntetaseinhibitoren under kontrol af I 5 promoteren. I

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, hvor plantearten indeholder et heterologt DNA som I I defineret i et hvilket som helst af kravene 2 til 6. I

25. Fremgangsmåde ifølge krav 23 til 24, hvor plantearten transformeres ved I fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 13. I

25 ARG ARG PRO ALA ASP ILE ARG ARG ALA THR GLU ALA ASP MET PRO 228 ALA VAL CYS THR ILE VAL ASN HIS TYR ILE GLU THR SER THR VAL 273 ASN PHE ARG THR GLU PRO GLN GLU PRO GLN GLU TRP THR ASP ASP 30 318 LEU VAL ARG LEU ARG GLU ARG TYR PRO TRP LEU VAL ALA GLU VAL 363 ASP GLY GLU VAL ALA GLY ILE ALA TYR ALA GLY PRO TRP LYS ALA I DK 175656 B1 I m 41 I

408 I ARG ASN ALA TYR ASP TRP THR ALA GLU SER THR VAL TYR VAL SER I I 453 I PRO ARG HIS GLN ARG THR GLY LEU GLY SER THR LEU TYR THR HIS I I 5 498 I LEU LEU LYS SER LEU GLU ALA GLN GLY PHE LYS SER VAL VAL ALA I

543 I VAL ILE GLY LEU PRO ASN ASP PRO SER VAL ARG MET HIS GLU ALA I I 588 I

26. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 23 til 25, hvor en opløsning af I I glutaminsyntetaseinhibitoren anvendes flere gange på en mark efter forekomst af dyrkede 15 plantearter, i særdeleshed i tidsintervaller på ca. fra 20 til 100 dage, indtil svampene er I ødelagt. I

27. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 23 til 26, hvor I I glutaminsyntetaseinhibitoren vælges blandt en gruppe omfattende Bialaphos, fosfinotricin I I 20 og beslægtede forbindelser. I

28. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18 til 27, hvor Bialaphos, PPT I eller beslægtede forbindelser anvendes i en dosis i området fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/ha. I

29. Fremgangsmåde ifølge krav 28, hvor Bialaphos, PPT eller beslægtede forbindelser ' I fortyndes i en fluid bærer til en koncentration, der muliggør anvendelse i marken i en I mængde i området fra ca. 21/ha til ca. 8 1/ha. I

30 ARG ASN ALA TYR ASP TRP THR ALA GLU SER THR VAL TYR VAL SER 453 ! PRO ARG HIS GLN ARG THR GLY LEU GLY SER THR LEU TYR THR HIS 498 i I DK 175656 B1 I H 47 I Η I LEU LEU LYS SER LEU GLU ALA GLN GLY PHE LYS SER VAL VAL ALA I I 543 I I VAL ILE GLY LEU PRO ASN ASP PRO SER VAL ARG MET HIS GLU ALA I I 588 I I 5 LEU GLY TYR ALA PRO ARG GLY MET LEU ARG ALA ALA GLY PHE LYS I I 633 I I HIS GLY ASN TRP HIS ASP VAL GLY PHE TRP GLN LEU ASP PHE SER I B 678 I I LEU PRO VAL PRO PRO ARG PRO VAL LEU PRO VAL THR GLU ILE I I 10 723 I hvori X betegner MET eller VAL, eller koder for en del af proteinet, hvor delen har en I I tilstrækkelig længde til at besidde den enzymatiske aktivitetet og, når DNA-fragmentet I I udtrykkes i planteceller, at beskytte sidstnævnte mod glutaminsyntetaseinhibitorens I I IS herbicide aktivitet. I

30. Fremgangsmåde ifølge krav 28 eller 29, som anvendes selektivt til beskyttelse af 30 plantearter valgt blandt sukkerroe, ris, kartoffel, tomat, majs, tobak. I

31. Vektor til transformation af planteceller, hvilken vektor indeholder et heterologt DNA H indeholdende en promoter genkendt af plantecellernes polymeraser og en fremmed H DK 175656 B1 I

46 I nukleotidsekvens, som koder for et polypeptid med en enzymatisk aktivitet, der er i stand til I at forårsage inaktivering eller neutralisering af en glutaminsyntetaseinhibitor under kontrol af promoteren. I

32. Vektor ifølge krav 31, som indeholder en fremmed nukleotidsekvens, der koder for et I polypeptid med acetyltransferaseaktivitet, i særdeleshed PPT acetyltransferaseaktivitet. I

33. Vektor ifølge krav 32, som omfatter de reguleringselementer, der er nødvendige for I stabil integration af den fremmede nukleotidsekvens i det genome DNA af plantecellerne og I 10 planterne. I

34. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 31 til 33, som indeholder et DNA-fragment I tilhørende genomet af en antibiotikum-producerende Streptomyces-st&mme. I

35. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 31 til 34, hvor den fremmede I nukleotidsekvens koder for et protein med følgende sekvens: I X SER PRO GLU 183

36. Vektor ifølge krav 35 omfattende følgende nukleotidsekvens: I I Y AGO CCA GAA I I 20 183 I I CGA CGC CCG GCC GAC ATC CGC CGT GCC ACC GAG GCG GAC ATG CCG I I 228 I I GCG GTC TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACG GTC B I 273 I I 25 ACC TTC CGT ACC GAG CCG CAG GAA CCG CAG GAG TGG ACG GAC GAC I I 318 I I CTC GTC CGT CTG CGG GAG CGC TAT CCC TGG CTC GTC GCC CAG GTG I I 363 I I GAC GGC GAG GTC GCC GGC ATC GCC TAC GCG GGC CCC TGG AAG GCA I I 30 408 I CGC AAC GCC TAC GAC TGG ACG GCC GAG TCG ACC GTG TAC GTC TCC I

453 B CCC CGC CAC CAG CGG ACG GGA CTG GGC TCC ACG CTC TAC ACC CAC I DK 175656 B1 I

48 I I 498 I CTG CTG AAG TCC CTG GAG GCA CAG GGC TTC AAG AGC GTG GTC GCT I

543 I j. GTC ATC GGG CTG CCC AAC GAC CCG AGC GTG CGC ATG CAC GAG GCG I 5 588 I CTC GGA TAT GCC CCC CGC GGC ATG CTG CGG GCG GCC GGC TTC AAG I

633 I CAC GGG AAC TGG CAT GAC GTG GGT TTC TGG CAG CTG GAC TTC AGC I

678 I

37. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 31 til 36, hvor det heterologe DNA I omfatter en nukleotidsekvens, der koder for et transitpeptid indskudt mellem I plantepromoterregionen og den fremmede nukleotidsekvens, der koder for I glutaminsyntetaseinhibitoren. I

38. Vektor ifølge krav 37, som er et Ti plasmid indeholdende det heterologe DNA. 1 I t