JPH0142280B2 - - Google Patents

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JPH0142280B2
JPH0142280B2 JP57227395A JP22739582A JPH0142280B2 JP H0142280 B2 JPH0142280 B2 JP H0142280B2 JP 57227395 A JP57227395 A JP 57227395A JP 22739582 A JP22739582 A JP 22739582A JP H0142280 B2 JPH0142280 B2 JP H0142280B2
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crp
cholesterol
lowering
purified
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は新規なコレステロール低下活性蛋白質
CRP及び有効成分としてこの蛋白質を含有する
コレステロール低下乃至抗動脈硬化剤に関する。
今日、所謂典型的成入病の１種である動脈硬化性
疾患乃至高脂血症等の治療・予防薬としてはクロ
フイブレート関連製剤を始めとして幾つかが提案
されているが、薬理効果及び副作用等の点でこれ
らは必らずしも充分満足し得るものとは云い難く
より効果的な薬剤への希求が一段と高まつてい
る。 本発明者らは新規抗動脈硬化剤につき鋭意研究
の結果、ストレプトコツカス属に属する各種微生
物菌体乃至その培養上清から得られる新規蛋白質
が血中コレステロール値を極めて効果的に低下せ
しめ得るものであり且つその起源が所謂腸内細菌
であるこれら菌体乃至培養上清の当該抽出成分は
経口では実質的無毒性であることを知見し、本発
明に到達したものである。 以下、本発明に於いて使用され得る微生物、蛋
白質CRPの製法、理化学的性質及び薬理作用等
につき詳細に分説する。 微生物 １ 種類 ストレプトコツカス属に属する各種微生物が
使用され得、就中、ストレプトコツカス・フエ
シウム、ストレプトコツカス・フエカーリス、
ストレプトコツカス・ボービス、ストレプトコ
ツカス・エビウム、ストレプトコツカス・デユ
ランス、ストレプトコツカス・サリヴアリウ
ス、ストレプトコツカス・ミテイス、ストレプ
トコツカス・イクイヌス等を好適なものとして
例示し得る。 更に、本発明に於いて特に有用な具体的菌株
例を微工研受託番号と共に表示すれば下記の通
りである。
【表】 ２ 菌学的性質 菌学的性質の点では、本発明で使用の微生物
は同一分類菌につき公知各文献の示すものと同
一の諸性質を有する。 すなわち、本発明微生物の菌学的性質及び培
養条件等に関しては下記諸文献が参照される。 (1) Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology、８ th ed.、490−509（1974） (2) Int.J.Syst.Bact.16114（1966） (3) Microbiol.Immunol.25(3)、257−269
（1981） (4) J.Clin.Pathol.3353−57（1980） (5) J.General Microbiol.、128713−720
（1982） (6) Applied Microbiol.、23(6)1311−1139
（1972） ここで、前出各種菌株につきその主な菌学的
性状を要約して表示すれば次の通りである。
【表】
【表】 ３ 培養方法 これらの微生物の培養は上記の通り常法によ
るものであるが、例えばロゴサ（Rogosa）液
体培地（註）にて好気的に静置培養し、得られ
た培養液を遠心分離してその菌体が採集され
る。 （註） ロゴサ液体培地の組成 蒸留水１中に トリプチケース 10ｇ 酵母エキス ５ｇ トリプトース ３ｇ K2HPO4 ３ｇ KH2PO4 ３ｇ クエン酸三アンモニウム ２ｇ ツイーン80 １ｇ グルコース 20ｇ システイン塩酸塩 0.2ｇ ※塩類溶液 ５ml （PH７、121℃ 15分間加熱滅菌） ※塩類溶液蒸留水100mlに MgSO4・7H2O 11.5ｇ FeSO4・7H2O 0.68ｇ MnSO4・2H2O 2.4ｇ 蛋白質CRPの製法 本発明蛋白質CRPの典型的製法の１例につき
その概要を各工程ごとに示せば次の通りである。 １ 菌体採集工程 前記各微生物等の菌株を前述のロゴサ液体培
地に接種し、37℃にて５〜10時間好気的に静置
培養して所定生菌数濃度の培養液をつくり、得
られた培養液を12000rpmの連続遠心分離に付
し菌体を集め、生理食塩水で２〜３回洗浄して
採集菌体とする。 ２ 菌体破壊処理工程 (a) 前記採集菌体を生理食塩水（0.85％NaCl
水溶液）に懸濁して得られる菌液を115℃で
10分間加熱（オートクレープ）し、破壊菌体
懸濁液とする。 (b) 前項(a)に示す菌液を超音波破壊処理
（15KC、60分）し、破壊菌体懸濁液とする。 ３ 脱脂処理工程 前記破壊菌体懸濁液をクロロホルム・メタノ
ール（２：1V／Ｖ）混合溶媒により充分に脱
脂する。次いで遠心分離処理（3000rpm：10
分）してクロロホルム層を捨て他を取り、これ
を以下の工程に付する。 ４ 蛋白質分解酵素処理工程 前記採取物を常法によりプロナーゼ、トリプ
シン、ペプシン等の蛋白分解酵素処理する。こ
こにおいて各種蛋白分解酵素中プロナーゼが特
に有用であり、その処理条件等は次の文献に準
ずる； Methods in Enzymology Vol.、p26
（1966）。 ５ 精製処理工程 前記酵素処理後の遠心分離上清液をトリクロ
ロ酢酸、硫酸アンモニウム等の蛋白沈澱剤等を
添加して蛋白質画分を沈澱、分取する。次いで
この画分に混入するDNA、RNA等の核酸成分
をそれらの分解酵素により分解処理し透析を繰
り返して除去する。 このようにして精製の進んだ試料は、更にゲル
ろ過法、硫安沈澱法等により精製が繰り返されて
最終的に単離された蛋白質CRP精製標品を与え
る。 尚、増殖菌体等からの蛋白質CRPの製造は、
より一般的にはその理化学的性質（後記）を参照
して沈澱−再溶解抽出、溶剤抽出、透析、カラム
クロマトグラム、電気泳動、ゲルろ過、或いはこ
れらの手段の組合せなど当該分野で汎用の多くの
分別精製方法により達成され得、従つて本発明は
特定の採取精製方法に何等限定されるものではな
い。 すなわち、当該薬理活性は蛋白質画分に認めら
れるのであるから、本発明はストレプトコツカス
属微生物より蛋白質成分を採取することより成る
コレステロール低下剤の製法にも係わるものであ
る。 そのより詳細は後記実施例が参照される。尚、
培養上清の活性は菌体の夫の約1/5程度である。 蛋白質CRPの理化学的性質 本発明蛋白質CRPの理化学的乃至生理学的諸
性質を要約して示せば次の通りである。 １ 存在状態及び溶解特性 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末標品は、
非潮解性白色粉末であり、100mg／ml程度まで
は室温で水に易溶、アセトン等の有機溶媒に易
溶。 冷時（４℃）、蛋白質CRPの水溶液に硫安、
トリクロロ酢酸の添加により各々白濁、沈澱を
生ずる。 ２ 分子量 0.3MNaCl付加25ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）で平衡化させた東洋漕達社製
ToyopearlHW−55カラム（2.7×45cm）を用
いたゲルろ過法による分子量は30000±7000で
ある。 ３ 等電点 LKB社製Ampholine（PH3.5−10）終濃度
２％を含む５％ポリアクリルアミドゲル（570
mm）、電極液0.02MH3PO4（＋）、1MNaCl（−）、
４℃、200V定電圧下通電３時間、試料添加量
100μｇ、クーマ、シーブリリアントブルーに
よる検出の条件下でのゲルデイスク等電点分離
法による等電点PHは参照蛋白質ラツトヘモグロ
ビン及び同マツコウクジラミオグロビンの間に
位置し、7.9±0.2。 ４ アミノ酸組成 試料１mgを１ml6NHClに懸濁した後、アン
プルに注入し、ドライアイス・メタノール寒剤
にて凍結し真空ポンプ減圧下、N2ガス置換す
る。この減圧置換操作を３回繰り返した後、減
圧状態で封管する。次に、110℃ドライブロツ
クバスにて24時間加水分解処理し、ロータリエ
バポレータにより完全に塩酸を除去し、１／
50NHCl200μに懸濁し、その50μをアミノ
酸分析（日立製作所社製835型日立高速アミノ
酸分析計）操作に付した。 結果を下記第３表に示す。 第 ３ 表 アミノ酸 モル比％ グリシン 25.23 アラニン 10.98 グルタミン酸 10.34 アスパラギン酸 8.20 リジン 6.39 ロイシン 5.58 バリン 5.41 イソロイシン 5.18 スレオニン 4.23 チロシン 4.19 セリン 3.46 プロリン 2.62 アルギニン 2.60 フエニルアラニン 2.51 メチオニン 1.56 ヒシチジン 1.30 システイン 0.16 ５ デイスク電気泳動パターン ポリアクリルアミドゲル（ポリアクリルアミ
ド濃度７％、トリス・グリシン緩衝液（PH
8.3）、試料25μ、通電４ｍＡ、2.5時間／ゲル
１本、ブロモフエノールブルーによる検出の条
件下でのデイスク電気泳動に於いて、距離（ス
ペーサ・ゲル先端を基準として）4.2±0.2cmの
位置に先鋭な単一のバンドを与える。 第１図はそのゲル状態図及びデンシトメータ
による泳動図である。 ６ 生理学的性質 哺乳動物に対して経口投与によりその血中コ
レステロール値低下作用を有する。 この活性は少なくとも−80〜115℃或いはPH
4.1〜10.9のはん囲内で安定である。 蛋白質CRPの薬理作用 １ 薬理効果 後記実施例に示す通り本発明蛋白質CRPよ
り成る抗動脈硬化剤は、血中コレステロール値
を極めて効果的に低下せしめるものであり、し
たがつて、この指標と密接な関連を有する動脈
硬化症を始めとし、高脂血症、高リポ蛋白血
症、黄色腫症、胆石症、高血圧症、糖尿症等の
疾患に対しその治療乃至予防薬として有用なも
のと云い得る。 本発明剤は又、経口投与、腹腔内投与、静注
等の手段で適用され得、その用量は通常約1μ
ｇ〜約１ｇ／Kg体重（１回）、より好ましくは
経口投与で約0.1mg〜約100mg／Kg体重（１回）
程度であり、その剤型としては生理食塩水等へ
の溶解液剤、注射液剤、凍結乾燥等による粉末
剤、或いは座剤、腸溶剤、舌下錠、顆粒剤、錠
剤、カプセル剤等々、通常の剤型を適当なキヤ
リヤ、増量剤、希釈剤等と共に適宜選択使用し
得る。 ２ 急性毒性 後記実施例に示す通り、本発明蛋白質CRP
のLD50値は802mg／Kg体重・マウス（腹腔内投
与）以上であり、経口投与の場合は実質的に無
毒性である。 実施例 （蛋白質CRPの製造及び精製） ストレプトコツカス・フエシウム（Strepto−
coccus faecium）ADV1009（FERM Ｐ−6624）
菌体をロゴサ液体培地２に生菌濃度１×106
個／ml接種し、37℃にて10時間、好気的に静置培
養して生菌数109個／mlの培養液を調製し、これ
を12000rpmの連続遠心分離に付して菌体を採集
し（菌体乾燥重量2.0ｇ）、生理食塩水（0.85％
NaCl水溶液）で充分洗浄した後、生理食塩水に
懸濁して菌液100ml（２×1010／ml）を得た。 次にこの菌液を115℃、10分間オートクレーブ
処理し、更にこれをクロロホルム・メタノール
（２：1V／Ｖ）混合溶媒200ml／回で３回脱脂処
理した。 脱脂処理後の菌液を3000rpm、10分間遠心分離
しその下層のクロロホルム層を捨て、残りを以下
の精製単離の出発材料とした。 次いで前記材料に0.0015MCaCl2付加リン酸緩
衝液（PH7.8）100mlを加え、これをプロナーゼ
（シグマ社製プロテアーゼ・タイプ）20mgに
より47℃、24時間酵素処理し、その後更にプロナ
ーゼ10mgを添加して47℃、24時間酵素処理した。
尚、プロナーゼによる処理条件等は次の文献に準
拠した； Methods in Enzymology Vol.、P26（1966）。
得られた被処理物を3000rpm、10分間遠心分離処
理に付し上清と沈澱に分別しその上清を取り試料
液とした。 次に試料液に100％TCA（トリクロロ酢酸；
Ｗ／Ｖ）1/9容加え４℃、３時間撹拌し、
3000rpm、10分間遠心分離処理し上清と沈澱に分
別した。沈澱は更に10％TCA同量により４℃、
３時間撹拌、次いで同様に遠心分離により再採取
後、エーテルにてTCA除去、洗浄処理し（３
回）、蒸留水50mlに溶解して1NNaOH水溶液にて
中和し、透析して完全にTCAを除去し、遠心分
離して最終的に沈澱画分（乾燥重量345mg）を得
た。 この沈澱画分（345mg）に0.1Mトリス酢酸緩衝
液（PH8.0）５ml、0.1M酢酸マグネシウム１ml及
びDNA分解酵素（シグマ社製
Deoxyribonuclease）水溶液（２mg／ml）0.06
mlを加え、37℃、１時間振盪反応させ、分子量
3500以下透過性透析膜（半井化学薬品社製セロチ
ユーブ）で３昼夜、蒸留水で透析し、透析内液減
圧濃縮試料を調製した。次いで、この試料を
440UnitsのRNA分解酵素（シグマ社製
RibonucleaseT2）の添加された0.05M酢酸緩衝
液（PH4.6）５mlに分散、37℃、３時間反応させ、
透析処理しその透析内液（分子量＞20000）とし
て精製画分（乾燥重量285mg）を得た。 精製画分は上記と同一の条件下で再度RNA
分解酵素処理及び透析処理されて精製画分（乾
燥重量274mg）を与える。この画分を0.3MNaCl
付加25mMTris・HCl緩衝液で平衡化させた
Toyopearl HW55カラム（前出）により溶出速
度１ml／分でゲルろ過したときのカラムクロマト
グラフ図を第２図に示す。 図中、曲線Ａは280nｍで比色定量した蛋白質、
同Ｂは260nｍ比色定量核酸、同Ｃはフエノー
ル・硫酸法による糖を示すものである。 次に第２図破線Ｄ（溶出容量67ml）以上の部分
を分取し、硫安分画（55％飽和上清）処理しその
上清として精製画分（乾燥重量205.5mg）を得
た。 第３図は前記と同一の条件下での精製画分の
カラムクロマトグラフ図である。 この画分は未だわずかに糖を含むのでこれを前
記と同様に10％TCAで３回除糖、透析処理して
最終的に単離、精製された本発明蛋白質CRP（乾
燥重量197.3mg）を得た。 前記と同等条件下での蛋白質CRPのカラムク
ロマトグラフ図を第４図に示す。このようにして
単離された蛋白質CRPの理化学的性質は前記の
通りである。 ここで、以上の各工程ごとの収量（乾燥重量）、
蛋白質量（Lowry法）、RNA量（オルシノール
法）、DNA量（ジフエニルアミン法）及び糖質量
（フエノール・硫酸法）を要約して示せば下記第
４表の通りである。 表中、単位は全て乾燥重量（mg）である。
【表】 尚、第４表中、比活性は通常ラツトに於けるコ
レステロール低下活性につき死菌体の夫を１とし
たときの単位重量当りの相対活性を示すものであ
り、測定条件等は後記実施例に準ずる。 他方、前記第１表に掲示の他の菌株を使用した
場合も、収率に多少はあるが本例と全く同様に蛋
白質CRPが精製単離されることが確認された。 実施例 （蛋白質CRPの薬理効果） １ コレステロール低下活性（） 蛋白質CRP凍結乾燥精製標品各50mg／Kg体
重相当量を生理食塩水（0.85％NaCl水溶液）
１mlに溶解して試料を精製し、これを通常ラツ
ト（雄18週令、平均体重246ｇ；各群10匹）、通
常及び無菌マウス（雄18週令、平均体重30ｇ；
各群10匹）に経口的に連日投与後、12及び８週
間飼育し、次いでこれらラツトの下大動脈より
動脈血を採集、遠心分離して血清標品を得、コ
レスキツト（商品名；関東化学社製、
Zurkowski法）により血清標品中コレステロー
ル値を測定した。結果を第５表に要約して示
す。 尚、表中、対照は試料無投与ラツト及びマウ
ス群であり、各数値は対照群を100％としたと
きの低下率（％）である。 又、ダイエツトすなわち飼料の組成（重量
％）は下記第６表の通りでありこれを自由摂取
とした（以下、同様）。 第 ５ 表 動物種 低下率（％） 通常ラツト（12週間） 25.2±0.7 通常マウス（８週間） 33.5±1.1 無菌マウス（８週間） 21.7±0.9 第 ６ 表 カゼイン 20 大豆油 10 小麦でんぷん 61 ミネラル ４ ビタミン混合物 ２ ろ紙粉末 ３ ２ コレステロール低下活性（） 前記試料１mlを通常ラツト（雄18週令、平均
体重238ｇ；各群15匹）、通常及び無菌マウス
（雄18週令、平均体重31ｇ；各群10匹）に12週
間、経口的に連日投与し、前記と同様にして血
清中コレステロール値を測定した。結果を第７
表に示す。 尚、表中、“コレステロール負荷”又は“果
糖負荷”は、前記飼料に更に１％コレステロー
ルを添加したもの或いは小麦でんぷんを果糖に
て全量置換した飼料を使用した場合を示すもの
であり、数値は無投与群を100％としたときの
低下率（％）である。
【表】 ３ コレステロール低下活性（） 蛋白質CRP精製標品各10mg／生理食塩水１
mlの試料を、コレステロール負荷ダイエツトに
より作製した高脂血ラツト（雄18週令、平均体
重250ｇ、各群５匹）に連日経口的に２週間投
与し、前記と同様にしてその血清中コレステロ
ール値を測定した。 結果を第８表に示す。表中、対照群は試料無
投与群であり、数値は無投与群を対照としたと
きの低下率である。 第 ８ 表 コレステロール低下率（％） 投与群 49.9対照群 ０ ４ 用量−反応関係 蛋白質CRP精製標品各0.1mg〜20mgを生食水
１mlに溶解して試料を調製し、これを通常ラツ
ト（雄６週令、平均体重216ｇ、各群５匹）に
４週間、経口的に連日投与し、前記と同様にし
て血清中コレステロール値を測定した（対照無
投与群）。 結果を第９表に示す。
【表】 ５ 急性毒性 ICR系マウス（雄６週令、平均体重31.4±0.6
ｇ、各群10匹）を使用し、蛋白質CRP精製標
品１mg、10mg及び100mgの３段階の投与量でそ
の生理食塩水0.5ml溶解液を腹腔内投与し、14
日間マウスの生死を観察した。 Behrens−Ka¨rber法に従つて算出したLD50
値は802mg／Kg体重以上であり、経口投与の場
合は実質的に無毒性であつた。 尚、対照は生理食塩水である。 ６ 製剤例 蛋白質CRP精製標品50mgを精製でんぷん
末250mgと均一に混合、打錠して経口投与用
錠剤とした。この錠剤は体重50Kgの成人にお
ける死菌体用量約1010個／Kg体重に相当す
る。 蛋白質CRPは炭酸カルシウム、ラクトー
ス等の賦形剤、でんぷん、アルギン酸塩等の
顆粒形成剤、ステアリン酸、タルク等の滑沢
剤等々と混合、打錠して経口投与用錠剤形態
を取り得るものであるが、その１日当りの投
与量は通常、0.1mg〜100mg／Kg・体重程度で
ある。 本品900mgをシロツプで呈味した精製水30
c.c.に分散、溶解してシロツプ液剤を調製し
た。
【図面の簡単な説明】
添付第１図は本発明蛋白質CRPのポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動実験説明図、第２乃至４図
は本発明実施例の実験説明図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) ゲルろ過法による分子量：30000±7000 (b) 等電点：7.9±0.2 (c) アミノ酸組成（モル比％）：グリシン25.23、
    アラニン10.98、グルタミン酸10.34、アスパラ
    ギン酸8.20、リジン6.39、ロイシン5.58、バリ
    ン5.41、イソロイシン5.18、スレオニン4.23、
    チロシン4.19、セリン3.46、プロリン2.62、ア
    ルギニン2.60、フエニルアラニン2.51、メチオ
    ニン1.56、ヒスチジン1.30及びシステイン0.16 (d) 電気泳動パターン：ポリアクリルアミドゲル
    電気泳動（ポリアクリルアミド濃度７％、トリ
    ス・グリシン緩衝液（PH8.3））に於いて陽極側
    に先鋭な単一のバンドを与え、且つ (e) 哺乳動物に対しその血中コレステロール低下
    作用を有することを特徴とする、コレステロー
    ル低下活性蛋白質CRP。 ２ ストレプトコツカス属に属する微生物より得
    られることを更に特徴とする特許請求の範囲第１
    項に記載の前記蛋白質CRP。 ３ 有効成分として蛋白質CRPを含有すること
    を特徴とするコレステロール低下乃至抗動脈硬化
    剤。
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