JPH0467918B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処
理方法に関するものである。

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野に
おいては、生物体の機能や複製のメカニズムを解
明するために、生物体のもつ遺伝情報を明らかに
することが必須のこととなつている。とりわけ、
特定の遺伝情報を担うDNA（もしくはRNA断片
物、以下同様）などの核酸の塩基配列を決定する
ことが必要不可欠なこととなつている。

DNA、RNAなどの核酸の塩基配列を決定する
ための代表的な方法として、オートラジオグラフ
イーを利用するマキサム・ギルバート（Maxam
−Gilbert）法およびサンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。前者の
マキサム・ギルバート法は、まず、塩基配列を決
定しようとしているDNAあるいはDNA断片物の
鎖状分子の一方の端部に³²P等の放射性同位元素
を含む基を結合させることにより、その対象物を
被射性標識物質としたのち、化学的な手段を利用
して鎖状分子の各構成単位間の結合を塩基特異的
に切断する。次に、この操作により得られた塩基
特異的DNA切断分解物の混合物をゲル電気泳動
法により分離展開し、多数の切断分解物がそれぞ
れ分離展開されて形成された分離展開パターン
（ただし、視覚的には見ることができない）を得
る。この分離展開パターンをたとえばＸ線フイル
ム上に可視化してそのオートラジオグラフを得、
得られたオートラジオグラフと各々の塩基特異的
切断手段とから、放射性元素が結合された鎖状分
子の端部から一定の位置関係にある塩基を順次決
定し、これにより対象物全ての塩基配列を決定す
ることができる。

また、後者のサンガー・クールソン法は、
DNAあるいはRNA断片物の鎖状分子と相補的で
あつて、かつ放射性標識が付与されたDNA合成
物を化学的な手段を利用して塩基特異的に合成
し、この塩基特異的DNA合成物の混合物を用い
て上記と同様にしてそのオートラジオグラフから
塩基配列を決定する方法である。

本出願人は、上記核酸の塩基配列決定を簡易か
つ高精度で行なうことを目的として、それに利用
されるオートラジオグラフ測定操作において、上
記Ｘ線フイルム等の写真感光材料を用いる従来の
放射線写真法の代りに、蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法を利用する方法について既
に特許出願している（特開昭59−83057号、特願
昭58−201231号）。ここで、蓄積性蛍光体シート
は輝尽性蛍光体からなるものであり、放射線エネ
ルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体に吸収さ
せたのち、可視乃至赤外領域の電磁波（励起光）
で励起することにより、放射線エネルギーを蛍光
として放出させることができるものである。この
方法によれば、露光時間を大幅に短縮化すること
ができ、また従来より問題となつていた化学カブ
リ等が発生することがない。さらに、放射性標識
物質のオートラジオグラフは、一旦放射線エネル
ギーとして蛍光体シートに蓄積されたのち輝尽光
として時系列的に読み出されるから、画像のほか
に記号、数値など任意の形で表示記録することが
可能である。

従来より、核酸の塩基配列決定をしようとする
者は、可視化されたオートラジオグラフについ
て、放射性標識が付与された核酸の塩基特異的切
断分解物もしくは塩基特異的合成物（以下、単に
核酸の塩基特異的断片物と称する）のそれぞれの
分離展開位置を視覚的に判断し、分離展開列間で
相互に比較することにより核酸の塩基配列を決定
している。よつて、得られたオートラジオグラフ
の解析は通常人間の視覚を通して行なわれてお
り、そのために多大な時間と労力が費されてい
る。

また、人間の目に依存しているため、オートラ
ジオグラフを解析して決定された核酸の塩基配列
が解析者によつて異なるなど得られる情報の精度
には限界がある。

そこで、本出願人は、上記オートラジオグラフ
をデジタル信号として得た後このデジタル信号に
適当な信号処理を施すことにより、DNAの塩基
配列を自動的に決定する方法についても既に特許
出願している（特開昭59−126527号、特開昭59−
126278号、特願昭59−89615号、特願昭59−
140908号等）。オートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号は、従来の放射線フイルムを利用する
場合には一旦オートラジオグラフを該フイルム上
に可視画像化したのち、反射光または透過光を利
用して光電的に読み取ることにより得られる。ま
た、蓄積性蛍光体シートを用いる場合には、オー
トラジオグラフが蓄積記録された蛍光体シートを
直接に読み出すことにより得られる。

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳
動法などにより支持媒体上に分離展開させて得ら
れた分離展開パターンには種々の歪みおよびノイ
ズが生じがちである。その代表的なものに、支持
媒体の中央部の分離展開距離に比べて両端部の分
離展開距離が短くなる現象（スマイリング現象）
がある。スマイリング現象は、分離展開過程にお
ける放熱（いわゆるエツジ効果）などが原因して
発生する。このような歪みが発生した場合にも、
そのオートラジオグラフに対応するデジタル信号
を効率良く信号処理して核酸の塩基配列を高精度
で自動的決定することが望まれている。

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフイーを利用し
て核酸の塩基配列を自動決定する方法において、
スマイリング現象の生じている分離展開パターン
であつてもそのオートラジオグラフに対応するデ
ジタル信号を好適に信号処理することにより、核
酸の塩基配列を簡易かつ高精度で自動決定するこ
とを実現した。

すなわち、本発明は、放射性標識が付与された
塩基特異的DNA断片物もしくは塩基特異的RNA
断片物の混合物が支持媒体上に一次元的方向に分
離展開されて形成された複数の分離展開列のオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号について
信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を
決定する方法において、 (1) 各分離展開列について、少なくとも一つのバ
ンドの位置と分離展開方向に対する傾きを検出
する工程、 (2) 該バンドの位置と傾きとから、式(1)｛ η(x)＝e^-a ａ＝∫^x ₀tanθ(x)／Ｄ(x)dx (1) （ただし、ｘは支持媒体の幅方向における中央
点からの距離であり、Ｄ(x)は位置ｘにおけるバ
ンドの分離展開距離であり、tanθ(x)は位置ｘに
おける該バンドの傾きであり、そしてη(x)は位
置ｘにおける分離展開速度補正係数である） に基づいて、各分離展開列の分離展開速度補正
係数を算出する工程；および (3) 各分離展開列において、該分離展開速度補正
係数に基づいて、式(2)： D₀(x)＝Ｄ(x)／η(x) (2) （ただし、D₀(x)は位置ｘにおけるスマイリン
グ補正された分離展開距離である） により、該列の分離展開距離を補正する工程； を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
めの信号処理方法を提供するものである。

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混
合物を支持媒体上で電気泳動することなどにより
得られる分離展開パターンにスマイリング現象が
発生している場合であつても、そのオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号をスマイリングの
補正のための信号処理機能を有する適当な信号処
理回路を通すことにより、核酸の塩基配列を簡易
にかつ高精度で得ることができる。

通常、スマイリング現象の発生している分離展
開パターンにおいては、支持媒体の幅方向に端部
に近いほど試料の分離展開速度が遅く、従つて分
離展開距離が短くなつているが、同時にそのよう
な分離展開列上の各バンド（幅方向に長い帯状の
分離展開部位）は、分離展開方向に直角（すなわ
ち、水平）ではなくスマイリング効果の程度に応
じて傾きを有している。本発明者は、このバンド
の傾きに注目して、支持媒体固有の因子（すなわ
ち、分離展開時間および核酸の塩基特異的断片物
の塩基数などには依存しない物理量）が存在する
ことを理論的および実験的に確証し、この因子
（補正係数）に基づいてスマイリング効果の補正
を適性かつ簡単に行なう方法を見い出したもので
ある。そして、スマイリングの補正がなされたデ
ジタル信号に更に適当な信号処理を施すことによ
り、核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精度で行な
うことができる。

［発明の構成］ 本発明におけるスマイリング効果の補正は、以
下に述べるような理論に基づくものである。

まず、仮定として、支持媒体自体にスマイリン
グ効果を生じさせる固有の因子が存在し、この因
子は、試料の分離展開位置、すなわち支持媒体の
幅方向における中央点からの距離(x)には依存する
が、分離展開時間および試料に含まれる塩基の数
には依存しない物理量（η(x)）で表わすことがで
きるものとする。また、第二の仮定として、支持
媒体上のバンドの傾き（θ(x)）はスマイリング効
果に起因するものであり、この因子と相関関係を
有する。

そこで、この物理量η(x)を分離展開速度補正係
数として、分離展開速度ｖ(x)と次のように関係づ
けて表わすことができる。

v₀(x)＝ｖ(x)／η(x) (3) （ただし、ｖ(x)は支持媒体の幅方向の位置ｘにあ
る任意のバンドの分離展開速度であり、v₀(x)は該
位置におけるスマイリング補正された分離展開速
度である） (3)式において、補正された分離展開速度v₀(x)
は、スマイリング効果が生じなかつたならば位置
ｘにおける該バンドが示したであろう仮想的な分
離展開速度を表わしている。

スマイリング効果は、一般に支持媒体の中央部
に比べて幅方向に両端部に近づくにつれて分離展
開距離が短くなる現象をいう。支持媒体の中央部
ではエツジ効果の影響を受けず分離展開速度は最
大となり、両端部では最小となる。従つて、(3)式
における補正された分離展開速度vo(x)は、支持
媒体の中央位置（ｘ＝０）における実際の分離展
開速度ｖ（０）に等しいとみなすことができる。
また、分離展開速度補正係数η(x)は、 η（０）＝１、η≦１ なる条件を満足する。

従つて、分離展開距離Ｄ(x)は、 Ｄ(x)＝ｖ(x)×ｔ＝v₀(x)×η(x)・ｔ ……(4) （ただし、Ｄ(x)は位置ｘにおけるバンドの分離展
開距離であり、ｔは分離展開時間である） で表わされる。また、このＤ(x)に対応するスマイ
リング補正された分離展開距離をD₀(x)とすれば、
D₀(x)は次のように表わされる。

D₀(x)＝v₀(x)×ｔ＝Ｄ(x)／η(x) (2) 同様に、位置ｘからΔxだけ幅方向に移動した
位置ｘ＋Δxにおける分離展開距離Ｄ（ｘ＋Δx）
は次のように表わされる。

Ｄ（ｘ＋Δx）ｖ（ｘ＋Δx）・ｔ ＝v₀(x)・η（ｘ＋Δx）・ｔ (5) 第２図に示すように、一つのバンドにかかるよ
うに位置ｘおよびｘ＋Δxをとれば、これらの位
置における該バンドの信号レベルのピーク点を結
ぶ線分が分離展開方向の垂線との間になす角度θ
について、 tanθ(x)＝｛Ｄ(x)−Ｄ（ｘ＋Δx）｝／Δx ……(6) と表わすことができる。(6)式に(4)および(5)式を代
入することにより、 tanθ(x)／v₀(x)・ｔ ＝−｛η（ｘ＋Δx）−η(x)｝／Δx (7) が得られる。

ここで、(7)式の右辺は、Δx→０のとき、 −lim｛η（ｘ＋Δx）−η(x)｝／Δx ＝−dη(x)／dx＝−η′(x) (8) と表わすことができる。また、(4)式より v₀(x)・ｔ＝Ｄ(x)／η(x) であるから、(7)式は次のように表わされる。

tanθ(x)／Ｄ(x)＝−η′(x)／η(x) ……(9) (9)式から明らかなように、バンドの傾きをその
分離分離展開で割つた値（左辺）は、試料である
核酸の塩基特異的断片物の塩基数にもその分離展
開距離にも無関係であつて、単に幅方向の位置ｘ
によつて決まる値である。

一般に、η′／η＝（log_eη）′ であるから、(9)式は、 −（log_e(x)）′＝tanθ(x)／Ｄ(x) ……(10) と表わすことができる。

(10)の右辺のtanθ(x)およびＤ(x)はそれぞれ、実際
の試料の分離展開パターンから実測により求める
ことができる値である。たとえば、実測値をグラ
フで表わすと、第３図に示すようなグラフとな
る。

第３図は、横軸に幅方向の位置ｘをとり、縦軸
にtanθ(x)／Ｄ(x)をとつたグラフである。

(10)式において、log_eη（０）であるから、 −log_eη(x)＝∫^x ₀tanθ(x)／Ｄ(x)dx ……(11) すなわち、 η(x)＝e^-a ａ＝∫^x ₀tanθ(x)／Ｄ(x)dx (1) である。従つて、第３図のグラフにおいて０〜ｘ
までのtanθ(x)／Ｄ(x)の累積（斜線部分の面積）を
求めることにより、分離展開速度補正係数η(x)を
決定することができる。

たとえば、ｉ番目のスロツトの分離展開列（支
持媒体中央点からの距離をx_iとする）についての
累積値： mg^xi ₀tanθ(x)／Ｄ(x)dx＝a_i であるとすると、分離展開速度補正係数および補
正された分離展開距離は、上記(1)および(2)式か
ら、 η（xi）＝e^-ai D₀（xi）＝Ｄ（xi）／η（xi） と表わすことができる。従つて、ｉ番目のスロツ
トの分離展開列について、１／η（xi）だけその
分離展開距離を引き伸ばすことにより、スマイリ
ング効果を補正することができる。

以下に、本発明の信号処理方法について説明す
る。

本発明において用いられる試料の例としては、
放射性標識が付与されたDNA、RNA等の核酸の
塩基特異的断片物の混合物を挙げることができ
る。ここで、核酸の断片物とは長鎖状の分子の一
部分を意味する。たとえば、塩基特異的DNA断
片物混合物の一種である塩基特異的DNA切断分
解物混合物は、前述のマキサム・ギルバート法に
従つて、放射性標識が付与されたDNAを塩基特
異的に切断分解することにより得られる。

また、塩基特異的DNA合成物混合物は前述の
サンガー・クールソン法に従つて、DNAをテン
プレート（鋳型）として、放射性標識が付与され
たデオキシヌクレオチドトリフオスフエートと
DNA合成酵素とを用いて合成することにより得
られる。

さらに、塩基特異的RNA断片物の混合物も上
記と同様の方法により、切断分解物混合物として
または合成物混合物として得ることができる。な
お、DNAはその構成単位としてアデニン、グア
ニン、チミン、シトシンの四種頼の塩基からなる
が、一方RNAはアデニン、グアニン、ウラシル、
シトシンの四種類の塩基からなる。

放射性標識は、これらの物質に適当な方法で
³²P、¹⁴C、³⁵S、³H、¹²⁵Iなどの放射性同位元素を保
持させることによつて付与される。

試料である放射性標識が付与された核酸の塩基
特異的断片物の混合物はゲル状支持媒体など公知
の各種の支持媒体を用いて、電気泳動法、薄層ク
ロマトグラフイー、カラムクロマトグラフイー、
ペーパークロマトグラフイーなど種々の分離展開
方法により支持媒体上に分離展開される。

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒
体について、従来の写真感光材料を用いる放射線
写真法により、あるいは蓄積性蛍光体シートを用
いる放射線像変換方法によりそのオートラジオグ
ラフが得られ、次いで適当な読取り（読出し）系
を介して放射性標識物質のオートラジオグラフに
対応するデジタル信号が得られる。

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず
支持媒体とＸ線フイルム等の写真感光材料とを低
温（−90〜−70℃）で長時間（数十時間）重ね合
わせて放射線フイルムを感光させたのち、現像し
て放射性標識物質のオートラジオグラフを放射線
フイルム上に可視画像化する。次いで、画像読取
装置を用いて放射線フイルム上に可視化されたオ
ートラジオグラフを読み取る。たとえば、放射線
フイルムに光ビームを照射してその透過光または
反射光を光電的に検出することにより、オートラ
ジオグラフは電気信号として得られる。さらに、
この電気信号をＡ／Ｄ変換することにより、オー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得るこ
とができる。

後者の放射線像変換方法を利用する場合には、
まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で
短時間（数秒〜数十分間）重ね合わせて蛍光体シ
ートに放射性標識物質から放出される放射線エネ
ルギーを蓄積させることにより、そのオートラジ
オグラフを蛍光体シートに一種の潜像として記録
する。ここで、蓄積性蛍光体シートは、たとえば
プラスチツクフイルムからなる支持体、二価ユー
ロピウム賦活弗化臭化バリウム（BaFBr：Eu²⁺）
等の輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、および透明
な保護膜がこの順に積層されたものである。蓄積
性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体
は、Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エ
ネルギーを吸収して蓄積し、そののち可視乃至赤
外領域の光で励起すると蓄積していた放射線エネ
ルギーを輝尽光として放出するという特性を有す
る。

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シート
に蓄積記録されたオートラジオグラフを読み出
す。具体的には、たとえば蛍光体シートをレーザ
ー光で走査して放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、この輝尽光を光電的に検出することに
より、放射性標識粉質のオートラジオグラフは可
視画像化することなく直接に電気信号として得ら
れる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換するこ
とにより、オートラジオグラフに対応するデジタ
ル信号を得ることができる。

上述のオートラジオグラフ測定操作およびオー
トラジオグラフに対応するデジタル信号を得る方
法の詳細については、前記特開昭59−83057号、
特開昭59−126527号、特開昭59−126278号等の各
公報に記載されている。

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号を得る方法として、従来の放
射線写真法および放射線像変換方法を利用する方
法について述べたが、これらの方法に限定される
ものではなく、それ以外の如何なる方法により得
られたデジタル信号であつても放射性標識物質の
オートラジオグラフと対応関係がある限り、本発
明の信号処理方法を適用することが可能である。

また、上記いずれの方法においてもオートラジ
オグラフの読取り（または読出し）は、放射線フ
イルム（または蓄積性蛍光体シート）の全面に亘
つて行なう必要はなく、画像領域のみについて行
なうことも勿論可能である。

さらに、本発明においては、予め各分離展開列
の位置およびバンドの幅等についての情報を入力
して読取り（読出し）条件を設定しておき、読取
り（読出し）操作においては各バンド上を二本以
上の走査線が通過するような走査線密度で光ビー
ムによる走査を行なうことにより、読取（読出）
時間を短縮化して必要な情報を効率良く得ること
ができる。なお、本発明においてオートラジオグ
ラフに対応するデジタル信号とは、このようにし
て得られたデジタル信号をも包含する。

得られたデジタル信号Dxyは、放射線フイルム
（または蛍光体シート）に固定された座標系で表
わされた座標（ｘ、ｙ）とその座標における信号
のレベル(z)とからなる。信号のレベルはその座標
における画像濃度、すなわち放射性標識物質の量
を表わしている。従つて、一連のデジタル信号
（すなわち、デジタル画像データ）は放射性標識
物質の二次元的な位置情報を有している。

このようにして得られた支持媒体上に分離展開
された放射性標識物質のオートラジオグラフに対
応するデジタル信号には、以下に述べるような本
発明の方法により信号処理が施されて、目的の核
酸の塩基配列の決定が行なわれる。

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四
種類の放射性標識が付与された塩基特異的DNA
断片物の組合せにより形成された泳動列（分離展
開列）からなる場合について説明する。

(1) グアニン(G)特異的DNA断片物 (2) アデニン(A)特異的DNA断片物 (3) チミン(T)特異的DNA断片物 (4) シトシン(C)特異的DNA断片物 ここで、各塩基特異的DNA断片物は、塩基特
異的に切断分解もしくは合成された、すなわち末
端の塩基を同じくする種々の長さのDNA断片物
からなる。

第１図は、上記四種類の塩基特異的DNA断片
物がそれぞれ四個のスロツトに電気泳動されてな
る泳動パターンのオートラジオグラフを部分的に
示す。第１図において泳動パターンにはスマイリ
ング現象が発生している。

このオートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、信号処理回路において一旦メモリ（バツフ
アーメモリ、または磁気デイスク等の不揮発性メ
モリ）に記憶される。

まず、各泳動列（レーン）上の少なくとも一つ
のバンドについて、バンドの位置および泳動方向
に対する傾きを検出する。

デジタル信号の検出を、前記のように各バンド
について少なくとも一本の走査線がかかるような
走査線密度で各レーンに沿つて走査することによ
り行なつた場合には（第１図参照、１：泳動バン
ド、２：走査線）、直接に各走査線について位置
(y)と信号のレベル(z)とからなる一次元波形を作成
することができる。また、オートラジオグラフを
全面に渡つて読み取つた場合には、デジタル画像
データ上で上記と同様の走査を行なうことにより
各レーンに沿つて信号を抽出したのち、一次元波
形を作成する。

バンドの位置は、各一次元波形上で信号レベル
が極大となる位置（ピーク位置）を検出し、複数
の一次形波形間でピーク位置における信号レベル
が最大となる位置をバンドの位置［ｘ、Ｄ(x)］と
決定することができる。あるいは、泳動列の中央
位置に相当する一次元波形上のピーク位置をバン
ドの位置としてもよい。ここで、ｘは支持媒体の
幅方向における中央点からの距離であり、またＤ
(x)は泳動開始位置からの距離（泳動距離）であ
る。

デジタル信号処理によりバンドの位置を決定す
る方法の詳細については、本出願人による特願昭
60−181432号および昭和60年10月11日出願の特願
昭60−226091号の各明細書に記載されている。

バンドの傾きは、まず二つの一次元波形上で信
号レベルが極大となる位置を探し出す。たとえ
ば、第２図に示すように、信号レベルのピーク位
置をバンドの中央部および端部で探し出したのち
（それぞれ、［ｘ、Ｄ(x)］および［ｘ＋Δx、Ｄ（ｘ
＋Δx）］）、上記(6)式に代入することにより、バン
ドの傾きtanθ(x)を得ることができる。

このバンドの位置と傾きとから、tanθ(x)／Ｄ(x)
を算出する。

各レーンについて以上の操作を行なうことによ
り、レーンごとにtanθ(x)／Ｄ(x)を求め、この結果
からtan(x)／Ｄ(x)をｘの関数として近似式で表わ
す。たとえば、得られた結果をグラフにまとめる
と、第３図に示す支持媒体の幅方向の位置ｘと
tanθ(x)／Ｄ(x)との関係を表わすグラフに類したグ
ラフが得られる。

次に、各レーンについて、中央点（ｘ＝０）か
らレーンの位置（xi）までのtanθ(x)／Ｄ(x)の累積
値（積分値）： ∫^xi ₀tanθ(x)／Ｄ(x)dx を上記近似値または近似グラフを用いて算出す
る。得られた累積値を前記(1)式に代入することに
より、各レーンの泳動速度補正係数η（xi）： η（xi）＝e^-ai a_i＝∫^xi ₀tanθ(x)／Ｄ(x)dx を得ることができる。

この補正係数η（xi）を前記(2)式に代入するこ
とにより、 D₀（xi）＝Ｄ（xi）／η（xi） を求めることができる。

得られたD₀（xi）がｉ番目のレーンのスマイリ
ング補正された泳動距離である。

バンドの傾きは、精度の向上の点から、一般に
傾きの大きな下部（泳動距離が相対的に大である
領域）のバンドについて傾きを検出するのが好ま
しい。あるいは、レーンを泳動方向に複数個に区
分し、その区分ごとに上述の操作を行なつてスマ
イリング補正を施してもよい。

また、通常スマイリング効果は支持媒体の幅方
向にほぼ左右対象に現れるから、上記tanθ(x)／Ｄ
(x)の近似式を支持媒体の片側についてのみ求めて
もよい。

補正により得られた泳動距離は、スマイリング
効果が発生しなかつたならば泳動したであろう位
置を示すものである。

このようにして、泳動パターンにスマイリング
現象が生じている場合であつてもスロツトごとに
泳動距離の補正のための信号処理を行なうことに
より、スマイリング効果を是正することができ
る。

さらに、泳動距離の補正された走査線の一次元
波形について、たとえば、該波形上に現れた信号
のレベルが極大となる全ての位置を検出すること
により、各レーン上の全てのバンドの位置を検出
することができる。バンド位置は、レーンのほぼ
中央部を通る走査線の極大値の位置としてもよい
し、あるいは該レーンの各走査線の極大値の位置
の平均をとつてもよい。

なお、本発明において泳動パターンにオフセツ
ト歪みおよび／またはバンドの融合が発生してい
る場合には、デジタル信号に上述の信号処理を施
す前または後にこれらの補正を行なつてもよい。

ここで、オフセツト歪みとはレーン間相互の全
体的な位置ズレをいい、スロツトの形状の相違等
により試料の電気泳動の開始位置が各スロツトで
異なることなどが原因となつて生じる。また、バ
ンドの融合は、泳動が十分でないために、二乃至
三個のバンドが連結して一個の幅広なバンドを形
成していることをいう。一般にパターン上部の泳
動開始位置に近い領域で発生しやすい。

オフセツト歪みの補正は、泳動パターンの下部
領域においては一般にバンドの間隔が疎であるこ
とから、まず各レーンについて下部領域で複数の
バンドを検出して下端から順にバンドに通し番号
を付けたのち、バンド番号とその泳動距離との相
関関係（例えば、回帰直線）を得る。この相関関
係からレーン間の泳動距離の差を求め、レーン間
の位置ズレとして各レーンの泳動位置を全体にず
らすことにより一括して補正することができる。
あるいは、各レーンについて区分的にオフセツト
歪みの補正をすることもできる。

融合バンドの補正は、まず各レーンの下部領域
で連結的に複数のバンドを検出して下端から順に
バンドに通し番号を付けたのち、バンド間の距離
とバンド番号との相関関係を得る。この相関関係
から未検出のバンドの位置を予測し、この予測位
置に基づいて新たにバンドを検出することによ
り、個々のバンドに分離することができる。バン
ド位置の予測は一括して行なつてもよいし、ある
いは区分的に行なつてもよい。

信号処理によるこれらの補正の詳細について
は、本出願人による特願昭60−85275号、特願昭
60−85276号、特願昭60−111186号および特願昭
60−111187号の各明細書に記載されている。

補正が施されたバンドの位置に基づいて、各バ
ンドに泳動パターンの下部から順に序列付けを行
なう。この際に、上記四種類の塩基特異的DNA
断片物の組合せが排他的な組合せであることか
ら、泳動方向に沿つた同一位置にはただ一つのバ
ンドのみが存在しうることを利用して、容易に序
列を決定することができる。上記(1)〜(4)のスロツ
トはそれぞれ(G)、(A)、(T)、(C)からなる末端塩基に
ついての情報を有するから、各バンドの属するス
ロツトに対応する塩基で置換することにより、
DNAの塩基配列（例えばＡ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−
Ａ−Ｇ−…）を得ることができる。

このようにして、DNAの片方の鎖状分子につ
いての塩基配列を決定することができる。なお、
DNAの塩基配列についての情報は、上記の表示
形態に限られるものではなく、たとえば所望によ
り同時に各バンドの強度（z′）を放射性標識物質
の相対量として表示することも可能である。さら
に、DNAの二本の鎖状分子両方についての塩基
配列を表示することもできる。

あるいはまた、上記のスマイリング補正がなさ
れたデジタル信号に基づいて画像として表示する
こともできる。この際に同時に、オリジナルのオ
ートラジオグラフを可視画像化して表示すること
も可能である。この場合に、最終的な塩基配列決
定は解析者自身がこの表示画像に基づいて行なう
ことが可能である。

なお、上記の実施態様においては、試料である
塩基特異的DNA断片物の混合物として（Ｇ、Ａ、
Ｔ、Ｃ）の排他的組合せを利用した場合について
説明したが、本発明の信号処理方法はこの組合せ
に限定されるものではなく、例えば（Ｇ、Ｇ＋
Ａ、Ｔ＋Ｃ、Ｃ）などの種々の組合せに適用する
ことができる。また同様に、塩基特異的RNA断
片物の混合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合
せ）についても本発明の信号処理方法を適用する
ことができる。さらに、スマイリング効果の補正
は、一組の核酸の塩基特異的断片物の分離展開列
に限定されるものではなく、支持媒体上に同時に
分離展開された全ての分離展開列について行なう
ことが可能である。

このようにして得られた塩基配列情報について
はこのほかにも、たとえば、既に記録保存されて
いる他の核酸の塩基配列と照合するなどの遺伝言
語学的情報処理を行なうことも可能である。

上述の信号処理により決定された核酸の塩基配
列についての情報は、信号処理回路から出力され
たのち、次いで直接的に、もしくは必要により、
磁気デイスクが磁気テープなどの記憶保存手段を
介して記録装置に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に表示された記号・数値をビデオ・プリ
ンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱記録
材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた
記録装置を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、スマイリング現象が発生した泳動パ
ターンの例を示す部分図である。第２図は、傾斜
したバンドの拡大図である。第３図は、支持媒体
の幅方向の位置ｘとtanθ(x)／Ｄ(x)との関係を示す
グラフである。 １：泳動バンド、２：走査線。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 放射性標識が付与された塩基特異的DNA断
   片物もしくは塩基特異的RNA断片物の混合物が
   支持媒体上に一次元的方向に分離展開されて形成
   された複数の分離展開列のオートラジオグラフに
   対応するデジタル信号について信号処理を行なう
   ことにより、核酸の塩基配列を決定する方法にお
   いて、 (1) 各分離展開列について、少なくとも一つのバ
   ンドの位置と分離展開方向に対する傾きを検出
   する工程、 (2) 該バンドの位置と傾きとから、式(1)： η(x)＝e^-a ａ＝∫^x ₀tanθ(x)／Ｄ(x)dx (1) （ただし、ｘは支持媒体の幅方向における中央
   点からの距離であり、Ｄ(x)は位置ｘにおけるバ
   ンドの分離展開距離であり、tanθ(x)は位置ｘに
   おける該バンドの傾きであり、そしてη(x)は位
   置ｘにおける分離展開速度補正係数である） に基づいて、各分離展開列の分離展開速度補正
   係数を算出する工程；および (3) 各分離展開列において、該分離展開速度補正
   係数に基づいて、式(2)： D₀(x)＝Ｄ(x)／η(x) (2) （ただし、D₀(x)は位置ｘにおけるスマイリン
   グ補正された分離展開距離である） により、該列の分離展開距離を補正する工程； を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のた
   めの信号処理方法。 ２ 上記デジタル信号を、各バンドに少なくとも
   二本の走査線がかかるようにオートラジオグラフ
   上を走査することにより得、そして第一工程にお
   いて、各走査線における信号のレベルが極大とな
   る位置を求め、この位置に基づいて傾きを検出す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ３ 上記第一工程において、各分離展開列の下部
   のバンドの位置と傾きを検出することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決
   定のための信号処理方法。 ４ 上記分離展開列を分離展開方向に区分し、各
   区分ごとに上記第一乃至第三工程を行なうことを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
   基配列決定のための信号処理方法。 ５ 上記塩基特異的DNA断片物の混合物が、 (1) グアニン特異的DNA断片物、 (2) アデニン特異的DNA断片物、 (3) チミン特異的DNA断片物、 (4) シトシン特異的DNA断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類
   の塩基特異的DNA断片物がそれぞれ支持媒体上
   に分離展開されて形成された四列の分離展開列か
   らなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ６ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積
   性蛍光体シートとを重ね合わせて、支持媒体上の
   放射性標識物質のオートラジオグラフを該蛍光体
   シートに蓄積記録したのち、該蛍光体シートに励
   起光を照射して該オートラジオグラフを輝尽光と
   して光電的に読み出すことにより得られたもので
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ７ 上記オートラジオグラフに対応するデジタル
   信号が、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせ
   て、支持媒体上の放射性標識物質のオートラジオ
   グラフを該感光材料に感光記録したのち、該感光
   材料上に可視化されたオートラジオグラフを光電
   的に読み取ることにより得られたものであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の
   塩基配列決定のための信号処理方法。