JPH0559120B2 - - Google Patents

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請求の範囲 １ 次式： （式中、ｎは２ないし30の整数を表わし、 Ｂはアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およ
びチミン(T)から選択される基を表わし、そして ＸはＳおよびＯから選択される原子を表わす
が、ただし化合物中の少なくとも１つのＸはＳを
表わす）で表わされ、腫瘍遺伝子の一部に対して
アンチセンス配列である、腫瘍遺伝子の発現に起
因する疾病の治療のための化合物。 ２ 腫瘍遺伝子がｃ−myc遺伝子である請求項１
記載の化合物。 ３ ２つのモノマーにおいてＸがＳを表わし、そ
して残りのモノマーにおいてＸがＯを表わす請求
項１記載の化合物。 ４ ＸがＳを表わすモノマーで末端がキヤツプさ
れ、そして残りのモノマーにおいてＸがＯを表わ
す請求項１記載の化合物。 ５ 次式： （式中、ｎは２ないし30の整数を表わし、 Ｂはアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およ
びチミン(T)から選択される基を表わし、そして ＸはＳおよびＯから選択される原子を表わす
が、ただし化合物中の少なくとも１つのＸはＳを
表わす）で表わされ、腫瘍遺伝子の一部に対して
アンチセンス配列である、腫瘍遺伝子の発現に起
因する疾病の治療のためのポリマーと、薬学的に
許容し得る担体とからなる腫瘍細胞の成長を阻害
するための抗腫瘍剤。 ６ ２つのモノマーにおいてＸがＳを表わし、そ
して残りのモノマーにおいてＸがＯを表わす請求
項５記載の抗腫瘍剤。 ７ ポリマーが、ＸがＳを表わすモノマーで末端
がキヤツプされ、そして残りのモノマーにおいて
ＸがＯを表わす請求項６記載の抗腫瘍剤。 ８ ＸがＳを表わすモノマーと、ＸがＯを表わす
モノマーが等量で存在する請求項５記載の抗腫瘍
剤。 ９ 次式： （式中、ｎは２ないし30の整数を表わし、そし
て Ｂはアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およ
びチミン(T)から選択される基を表わす）で表わさ
れ、腫瘍遺伝子の一部に対してアンチセンス配列
である、腫瘍遺伝子の発現に起因する疾病の治療
のための化合物と、薬学的に許容し得る担体とか
らなる腫瘍細胞の成長を阻害するための抗腫瘍
剤。 １０ ｎが９ないし30の整数を表わす請求項９記
載の抗腫瘍剤。 １１ ｎが14ないし30の整数を表わす請求項９記
載の抗腫瘍剤。 １２ 次式： （式中、ｎは２ないし30の整数を表わし、そし
て Ｂはアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およ
びチミン(T)から選択される基を表わす）で表わさ
れ、外来核酸の一部に対してアンチセンス配列で
ある、宿主内の外来核酸の複製および細胞変性効
果を阻害する方法に使用する化合物。 １３ 外来核酸がヒト免疫不全ウイルスである請
求項１２記載の化合物。 １４ 宿主が後天性免疫不全症候群に罹病してい
る請求項１２記載の化合物。 １５ 次式：（dC）_o（式中、ｎは約５ないし約30
を表わし、そしてdCはデオキシシチジンを表わ
す）で表わされるオリゴデオキシシチジンホスホ
ロチオエートである請求項１２記載の化合物。 １６ 式：（dC）_o中のｎが約28を表わし、そして
dCはデオキシシチジンを表わす請求項１５記載
の化合物。 １７ 次式：（dA）_o（式中、ｎは約５ないし約30
を表わし、そしてdAはデオキシアデノシンを表
わす）で表わされるオリゴデオキシアデノシンホ
スホロチオエートである請求項１２記載の化合
物。 １８ 式：（dA）_o中のｎが約28を表わし、そして
dAはデオキシアデノシンを表わす請求項１７記
載の化合物。 １９ 次式： （式中、ｎは２ないし30の整数を表わし、 Ｂはアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およ
びチミン(T)から選択される基を表わし、そして ＸはＳおよびＯから選択される原子を表わす
が、ただし化合物中の少なくとも１つのＸはＳを
表わす）で表わされ、外来核酸の一部に対してア
ンチセンス配列であるホスホロチオエートオリゴ
デオキシリボヌクレオチドと薬学的に許容し得る
担体とからなる外来核酸複製阻害剤。 ２０ 外来核酸がヒト免疫不全ウイルスである請
求項１９記載の外来核酸複製阻害剤。 ２１ ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌ
クレオチドが約５ないし約30のモノマー単位を有
するホスホロチオエートオリゴデオキシシチジン
である請求項１９記載の外来核酸複製阻害剤。 ２２ ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌ
クレオチドが約５ないし30のモノマー単位を有す
るホスホロチオエートオリゴデオキシアデノシン
である請求項１９記載の外来核酸複製阻害剤。 ２３ ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌ
クレオチドが約28のモノマー単位を有するホスホ
ロチオエートオリゴデオキシアデノシンである請
求項１９記載の外来核酸複製阻害剤。 ２４ 担体が食塩水溶液である請求項１９記載の
外来核酸複製阻害剤。 ２５ 担体が有機担体である請求項１９記載の外
来核酸複製阻害剤。 ２６ 担体が血液である請求項２５記載の外来核
酸複製阻害剤。 ２７ 複製阻害量の請求項１２記載の式で表わ
されるオリゴデオキシヌクレオチドからなる試験
管内で細胞内の外来核酸の複製および細胞変性効
果を防止する方法に使用するための細胞増殖阻害
剤。 ２８ オリゴデオキシヌクレオチドがヒト免疫不
全ウイルスの塩基配列に相補的な塩基配列を有す
る請求項１記載の式で表わされるオリゴデオキ
シヌクレオチドを複製阻害量含む、試験管内で細
胞内の外来核酸の複製を防止する方法に使用する
ための細胞増殖阻害剤。 ２９ 請求項１記載の式で表わされる化合物と
ジデオキシヌクレオチドとからなるウイルス増殖
阻害剤。 ３０ ジデオキシヌクレオチドが2′，3′−ジデオ
キシアデノシンである請求項２９記載のウイルス
増殖阻害剤。 ３１ 次式： （式中、ｎは２ないし30の整数を表わし、 Ｂはアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およ
びチミン(T)から選択される基を表わし、そして ＸはＳおよびＯから選択される原子を表わす
が、ただし化合物中の少なくとも１つのＸはＳを
表わす）で表され、外来核酸の一部に対してアン
チセンス配列であり、外来核酸の不適当な発現に
起因する疾病の治療のための化合物。 ３２ ｎが９以上30以下である請求項３１記載の
化合物。 ３３ ｎが14以上30以下である請求項３１記載の
化合物。 ３４ 外来核酸がウイルスの核酸である請求項３
１記載の化合物。 ３５ ウイルスの核酸がヒト免疫不全ウイルスの
核酸である請求項３４記載の化合物。 ３６ ヒト免疫不全ウイルスの核酸が逆転写酵素
をコード化する核酸である請求項３５記載の化合
物。 ３７ ヒト免疫不全ウイルスの核酸がgag遺伝子
核酸である請求項３５記載の化合物。 ３８ ヒト免疫不全ウイルスの核酸がtat−遺
伝子核酸である請求項３５記載の化合物。 ３９ ヒト免疫不全ウイルスの核酸がart／trs遺
伝子核酸である請求項３５記載の化合物。 ４０ 外来核酸が腫瘍遺伝子核酸である請求項３
１記載の化合物。 ４１ HL60細胞の増殖を阻害するための請求項
１記載の化合物。 ４２ 悪性細胞の増殖を阻害するための請求項１
記載の化合物。 本発明の分野 本発明は、レトロウイルスの複製の阻害に関
し、そして通常の生細胞の存在下で外来核酸の複
製を防止するために、並びに悪性細胞
（neoplastic cell）の増殖を阻害するために使用
され得るホスホロチオエートオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド類似体に特に向けられている。 本発明の背景 ある種の遺伝情報またはウイルス配列に相補的
であるオリゴデオキシヌクレオチドは、“アンチ
センス”化合物と呼ばれる。これらの化合物は、
ラウス肉腫ウイルスおよびヒトＴリンパ球指向性
ウイルスタイプ（HTLV−）、新しい名称ヒ
ト免疫不全症ウイルス（HIV）に対して阻害効
果を有すると報告されている。しかしながら、通
常のオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステ
ル結合のヌクレアーゼによる分解に対する感受性
は、抗ウイルス剤としてのそれらの薬効および生
体内での持続性を減ずると予想されるであろう。 メチルホスホネート−オリゴデオキシヌクレオ
チド類似体は、ヌクレアーゼに対して耐性であ
り、そしてそれらは電荷をもたないから、これら
の化合物に高められた細胞膜透過性を与える高め
られた疏水性を有する。メチルホスホネート−オ
リゴデオキシヌクレオチドは、抗ウイルス活性を
示すことが見い出されたが、しかしこれらの化合
物は、強力な抗ウイルス作用を引き出すために、
高濃度、典型的に100−300マイクロモルを必要と
するであろう。 多くの研究者が通常のオリゴデオキシヌクレオ
チドおよびオリゴデオキシヌクレオチドの類似体
の両方の阻害特性を研究した。テイーソー
（T′so）および共同研究者らは、オリゴデオキシ
ヌクレオチドのエチルホスホトリエステルおよび
メチルホスホネート類似体を、細胞を通過しそし
てヌクレアーゼによる分解に対して比較的耐性で
ある非イオン性化合物として評価した（米国特許
第4469863号参照）。しかしながら、エチル化合物
は細胞内で分解性脱エチル化を受ける欠点を有す
ることが見い出された。メチルホスホネートは、
より安定であり、そして抗ウイルス活性を有する
ことが見い出された。 上記のようなメチルホスホネート類似体は、い
くつかの遺伝子の発現を阻害すると言われてき
た。しかしながら、これらの化合物は多くの深刻
な欠点を有する： (1) そのような化合物は、塩基触媒の加水分解に
非常に感受性であり、ポリアニオン性オリゴデ
オキシヌクレオチドに比べ、それらを通常の方
法に基づいて合成することを比較的困難にして
いる； (2) この化合物は水性媒体中で比較的低い溶解度
を有し、従つてポリアニオン性オリゴデオキシ
ヌクレオチドに比べ、それらの生物学的／化学
療法的使用を制限する； (3) 抗ウイルス活性を引き出すために、比較的高
濃度のこれらの化合物が必要であると思われ
る；そして (4) メチル基の立体効果のためにハイブリツド形
成は不十分である。 総合されたこれらの要因は、これらの化合物で
のヒトにおける化学療法を実用的でないものにし
ている。 ツアーメクニーク（Zamecnik）および共同研
究者らによる初期の仕事は、試験管内でのラウス
肉腫ウイルスの形質転換能、複製および翻訳を阻
害するために、通常の未修飾のオリゴデオキシヌ
クレオチド、並びにオリゴデオキシヌクレオチド
の3′末端がブロツクされた（2′，3′−ジデオキシ
リボシル）類似体を使用した。このアプローチ
は、プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユーエス
エー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），83巻，4143−
4146頁（1986年）における培養ヒト細胞中の
HIVウイルスの阻害を研究したツアーメクニー
ク等、およびジヤーナル・オブ・バイオケミスト
リー・バイオフイズイツクス・メソツズ（J.
Biochem.Biophys.Methods.），13巻，97−102頁
（1986年）における水疱性口内炎ウイルスからの
mRNAの翻訳の阻害を調べたビクストロム
（Wickstrom）等の両者により拡張されてきた。 上記メチルホスホネート類似体と比較して、未
修飾の、または“Ｏ”、オリゴデオキシヌクレオ
チドは、コスト有効性および合成しやすさの利点
を提供し、そしてさらに効果的なより低い投与量
の利点も加わると思われる。しかしながら、これ
らの未修飾のオリゴデオキシヌクレオチドは、
3′末端のブロツク残基を含んでさえも、ヌクレア
ーゼによる分解に対し感受性である。結果的に、
これらの化合物の試験管内での使用は著しく制限
され、そしてそれらが生体内で成功し得ること
は、ほとんどありそうもないことである。 ヒトＴリンパ球指向性ウイルスタイプ
（HTLV−）、以下ヒト免疫不全症ウイルス
（HIV）と記載する、が免疫不全症候群〔エイズ
（AIDS）〕の病因であるという発見は、エイズの
治療への化学療法的アプローチの発展における相
当な関心を促した。多くの種類の化合物がHIV
に対して試験管内での活性を有することは報告さ
れたが、しかしこれらの化合物が組込まれたウイ
ルスゲノムの発現を阻害することは知られていな
い。 センス、アンチセンス、ノンセンスおよびホモ
オリゴマーを包含する種々の配列のホスホロチオ
エートオリゴデオキシヌクレオチドは、HIVを
阻害することが見い出されたが、阻害の機械は不
明だつた。HIVゲノム内のいくつかの公知の配
列に相補的でないホモオリゴマーによる阻害は、
低濃度即ち10マイクロモル以下でHIVの逆転写
酵素の機能との相互作用および干渉を結果として
生じるということを引き続く研究は示した。相当
するmRNAの“翻訳抑制”として知られる相補
的な塩基配列阻害に初めに予想された機構は、ホ
スホロチオエート化合物のより高い濃度、即ち25
マイクロモル以上に達するまでレトロウイルス内
で明らかに作用し得ない。このことは、この阻害
プロセスに観察される配列特異性の欠如を説明す
る。 ｃ−myc遺伝子の開始コドン近傍領域に相補的
な正常オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）配
列を用いて正常リンパ球およびHL60細胞の増殖
を阻害する試みが前もつてなされた。これらの結
果は勇気づけたけれども、たとえ、これらの正常
オリゴデオキシヌクレオチドが正常リンパ球の増
殖およびｃ−mycタンパク質発現を妨げ得るとし
ても、それらは、正常アンチセンスｃ−
mycODNが100マイクロモルと高い濃度でさえも
HL60細胞内でのＣ−mycタンパク質発現の延長
された阻害には適当でないことを示した。正常オ
リゴデオキシヌクレオチドのこれらの不十分な
点、延長された阻害効果の欠如および短期間の効
果に対してさえも要求される高い濃度は実験の間
の酵素加水分解に帰因することは明らかであろ
う。 ヘイツキラ（Heikkila）等は、ネーチヤー
（Nature），328，1987年７月30日号、第445−449
頁に、ｃ−mycオリゴデオキシヌクレオチドはリ
ンパ球の有糸分裂誘導におけるＳ期内への加入を
阻害することを開示している。小さいアンチセン
スオリゴマーを大量の細胞培養液に添加した。ヒ
トｃ−mycRNAの開始コドンおよび４種の下流
のコドンに相補的なペンタデカオキシリボヌクレ
オチドは、ヒトＴリンパ球内のマイトジエン誘導
ｃ−mycタンパク質発現を阻害し、そしてＳ期加
入を妨げる。 材料の情報開示 特開昭61−12215（1983年）は、オリゴDNAを
用いて腫瘍細胞成長の阻害の方法に関する。 メリガン（Merigan）等に対するアメリカ合衆
国特許第3687808号は、チオエートを包含する合
成ポリヌクレオチドの合成に関する。 ミラー（Miller）等に対するアメリカ合衆国特
許第4511713号は、外来核酸の複製を、外来核酸
の示された配列に相補的なアルキルまたはアリー
ルオリゴヌクレオチドホスホネートで阻害するこ
とに関する。 ステツク（Stec）等，ジヤーナル・オブ・オー
ガニツク・ケミストリー（J.Org.Chem.），50(20)，
3908−3913頁，（1985年）はホスホロチオエート
の自動合成に関する。 ステツク等，ジヤーナル・オブ・クロマトグラ
フイー（J.Chromatogr.），326巻，263−280頁
（1985年）およびラプランシエ（LaPlanche）等，
ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.
Acids.Res.），14（22），9081−9093頁（1986年）
は、好ましい本発明の化合物に関する。ステツク
は、オリゴデオキシリボヌクレオチドのホスホロ
チオエート類似体に言及し、そしてラプランシエ
はホスホロチオエート修飾オリゴデオキシリボヌ
クレオチドに関与している。 シー．シー．スミス（C.C.Smith）等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，83巻，2787−2791頁
（1986年５月）は、単純ヘルペスウイルス型の
スプライス部位に相補的なオリゴ（ヌクレオシド
メチルホスホネート）の抗ウイルス効果に関す
る。 ツアーメクニーク等，Proc.Natl.Acad.Sci.
USA，83巻，4143−4146頁（1986年６月）は、
ウイルスRNAに相補的な外因性合成正常オリゴ
ヌクレオチドによるHTLV−の複製の阻害に
関する。 アメリカ化学会誌（J.Am.Chem.Sci.），106巻，
6077頁（1984年）においてステツク等は、ホスホ
ロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類似体
を合成した。 ブローダー（Broder）等，Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，84巻，7706−7710頁（1987年）。 本発明の要約 上記のような従来技術の欠点を克服することが
本発明の目的である。 レトロウイルスに対して有効な抗ウイルス剤で
ある化合物を提供することが本発明のもう１つの
目的である。 ヒトＴ細胞におけるHIVに対して有効な抗ウ
イルス剤である化合物を提供することが本発明の
さらにもう１つの目的である。 腫瘍遺伝子産生物の発現を阻害し、そして細胞
成長の停止をもたらすことが本発明の別の目的で
あり；そしてこの結果をもたらす化合物を提供す
ることがなお別の目的である。 悪性細胞の増殖を阻害することが本発明のさら
に別の目的であり；そしてこの結果をもたらす特
定の処理として用い得る化合物を提供することが
さらにもう１つの目的である。 ホスホロチオエートは、ヌクレオチドのホスフ
エート部分の非架橋酸素原子の１つが硫黄原子に
より置換されている化合物である。これらのホス
ホロチオエートは、それらを潜在的に有利な抗レ
トロウイルス類似体にする種々の特性を有する。
これらの化合物はヌクレアーゼによる切断に安定
であり、そしてそれらは通常のオリゴデオキシヌ
クレオチドと同数の電荷を有するので、良好な水
溶性を有する。これらの化合物はまた相当するメ
チルホスホネート類似体に比べ相補的DNA配列
とより効率の良いハイブリツド形成を示す。 本発明における使用のための化合物は次式： で表わされる。 式 ｎ＝２−30 Ｂ＝アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ま
たはチミン(T)。 ホスホロチオエートデオキシヌクレオチドは、
腫瘍遺伝子の増殖を阻害するためのブロツクコポ
リマーとして同様な方法で通常のデオキシヌクレ
オチドと結合され得ることもまた見い出された。
また、ホスホロチオエートデオキシヌクレオチド
は、グラフトコポリマーに類似する化合物中の通
常のデオキシヌクレオチドと結合され得、その中
でホスホロチオエート誘導体は鎖の内部に通常の
デオキシヌクレオチドを有する鎖のいずれかの末
端にある。 従つて、R¹がホスホロチオエートデオキシヌ
クレオチド基を表わし、そしてR²が通常のデオ
キシヌクレオチド基を表わす場合、化合物は例え
ば次式： R¹−R¹…R²−R²…R¹−R¹…R²−R²…R¹−R¹
() および R¹−R²−R²…R¹ () で表わすことができる。 本発明の化合物は、試験管内でかなり低濃度、
約１−20マイクロモルでHIVおよびHL−60細胞
成長を阻害することが見い出された。生体内で
は、血中に約0.1マイクロモルないし約100マイク
ロモル／clの有効成分濃度に達することが好まし
い。この濃度は、以下に記載するような種々の投
与方法で達成され得る。 本発明の化合物がホモポリマーというよりむし
ろコポリマーの形態にある場合に、それらは次
式： で表わすことができる。 式 ｎ＝２−30 Ｘ＝ＯまたはＳ ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチ
ドの自動化合成のＪ．Org.Chem，50(20)：3908−
3913（1985）におけるステツク等の方法は、所望
の化合物を合成する便利な方法を提供する。ま
た、アメリカ合衆国特許第3687808号においてメ
リガン等は、チオエートエステルを製造する他の
方法を開示している。しかしながら、これらの方
法のいずれも遺伝子研究のためのこれら化合物の
十分量の決まりきつた合成を可能にするには十分
有効なものではない。 本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、組込
まれたウイルスゲノムの発現を阻害することが見
い出された。本発明のホスホロチオエートオリゴ
デオキシヌクレオチドは適当な化、学的特徴、即
ち生理学的条件下で相補的DNA／mRNAとハイ
ブリツド形成する能力、およびメチルホスホネー
トに対するより良好な溶解度特性を有する。さら
に、チオエステルは、もとの化合物と同程度に生
物学的培体中に溶解性である。未修飾体およびホ
スホロチオエート類似体として両方のODN−１
配列の³¹P NMRスペクトルを測定すると、未修
飾オリゴデオキシヌクレオチドが約17時間の半減
期を有し、一方³¹P NMR測定の精度内でホスホ
ロチオエート結合は10日後依然損われていなかつ
た（全体の信号強度に基づいて５％以下の分解）。 【図面の簡単な説明】 第１図は、オリゴ−dC−Ｓおよびオリゴ−dA
−Ｓの３種の長さにおける抗HIV活性の比較を
示す。 第２図は、2′，3′−ジデオキシアデノシンおよ
びＳ−dC14組合せの抗ウイルス活性の相乗的促
進を示す。 第３図は、HL60細胞成長に関するＳ−ASの影
響を示す。 第４図は、HL60細胞内におけるDNA合成の
Ｓ−AS ODN阻害の影響を示す。 第５図は、HTLV−BH10内のart／trs遺伝
子のコードエクソンのDNA配列および試験され
たオリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。第
６図は、Ｓ−dCnの14−merおよび28merの間の
抗HIV活性の詳細な比較を示す。なお、本明細
書においてmerはモノマー単位を意味し、上記
14merおよび28merはそれぞれ14量体および28量
体を表す。 第７図は、Ｓ−ODN−１の抗ウイルス活性に
関するチミンのＮ−メチル化の影響を示す。第８
図は、オリゴデオキシシチジンホスホロチオエー
トの28−merによるウイルスに晒されたATH8細
胞中の新たなHIV DNA合成の阻害を示す。 好ましい実施態様の詳細な説明 通常のオリゴデオキシヌクレオチド、メチルホ
スホネートオリゴデオキシヌクレオチド、および
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド
は、標準溶液方法または自動シンセサイザー、例
えばアプライド バイオシステムズ社（Applied
Biosystems Inc.）のホスホロアミダイト法によ
るモデル380−Ｂを用いて、Ｊ．Am.Chem.Soc.
106，6077−6089（1984）におけるステツク等の方
法の変法のいずれかにより合成し得る。 化合物の精製を逆相の高性能液体クロマトグラ
フイーにより行つた。ホスホロチオエート内のＰ
−Ｓ結合の存在は、³¹P NMR分光法を用いて観
察された。N3−メチルチミジンを調製し、そし
て保護ホスホロアミダイト体に変換し、そしてオ
リゴマー合成内に組入れる。 本発明のホスホロチオエートは、アブライド
バイオシステムズ380−Ｂ DNA シンセサイザ
ーで、Ｏ−メチルホスホルアミダイトを用いる通
常のホスフエートオリゴヌクレオチドへの合成サ
イクルに類似の方法で合成され得る。主な相違点
は、酸化段階の間に使用される試薬にある。 ピリジン71mlおよびトリエチルアミン7.5mlと
一緒に二硫化炭素71ml中にまず溶かしたS₈元素状
硫黄7.5グラムからなる５％硫黄溶液を、酸化試
薬として使用する。この試薬は380Bシンセサイ
ザー上でボトル＃13を占める。与えられた全体の
容量は30merの３カラム合成には十分である。 酸化段階の前後に、ボトル＃16番目内の二硫化
炭素およびピリジンの１：１溶液で繰り返し洗浄
し、ライン内に沈殿するかも知れないあらゆる残
りの硫黄を除去する。30merの３カラム合成のた
めに、この溶液の380mlの総量は十分であるはず
である。 使用される溶液はできるだけ無水でなければな
らず、そして各々の新たな合成のために再製造す
べきである。 硫黄酸化は沃素酸化と同程度には速くなく、そ
して従つて合成サイクルの間に沃素酸化の待機時
間が30秒であるのに比べ、450秒の待機段階を要
する。また、チオフエノールをカラムに排出した
後にメタノールに溶解したあらゆる生成塩の除去
を確実にするために、普通より５秒長く全体で10
秒間逆流を行うということにおいて、最後の段階
がわずかに変更されている。もちろん変更は可能
であり、そして通常の実験法を越えることなく当
該分野の通常の熟練者には明らかであろう。 3′または5′末端でホスホロチオエートのブロツ
クを有するオリゴデオキシヌクレオチドは、酸化
サイクルを必要とされる点で自動的に変えること
により合成された。カラムからの切断およびアン
モニア水溶液中で脱ブロツク化の後に（60゜，10
時間）、ホスホロチオエートオリゴマーおよびブ
ロツクコポリマーを逆相HPLC（PRP−１カラ
ム、１％酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、PH
７−アセトニトリル（20％、20分で40％に増加）
を介して精製し、そして溶液を等容量の酢酸エチ
ルで２度抽出し、ドライアイスで凍結し、そして
凍結乾燥した。固体を1MNaCl0.3ml中に溶かし、
そして生成物を3.5容量の無水エタノールの添加
により沈殿させた。いくつかのホスホロチオエー
トオリゴマー、特にホモポリマーdC₂₈の酢酸塩は
1MNaCl中に極端に不溶性である。パスツールピ
ペツトにより、アンモニア水溶液ではなく少量の
アンモニア蒸気を導入すると、全ての固体が溶け
た。λ_naxでの吸光度から決定した収率は約30％だ
つた。 アンチセンス配列および対照センスおよびノン
センス（ランダム配列以外はアンチセンスと同じ
組成）は以下のように示される： アンチセンス：5′−AAC GTT GAG GGG
CAT ノンセンス： 5′−CTG AAG TGG CAT
GAG これらの化合物を高性能液体クロマトグラフイ
ーおよびエタノールによる沈澱法を使用して精製
した。 下記の生物学的試験のために、配列（Ｓ−
ODN−１）、ホスホロチオエートオリゴデオキシ
ヌクレオチドは、これらの遺伝子がウイルス複製
に必須であるので、HIVのtat−およびart／
trs遺伝子に存在するヌクレオチド配列に対する
アンチセンス対応物であるものが選択された。こ
のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは
tat−およびart／trs遺伝子の発現を阻止し得
る。配列（Ｓ−ODN−２）が選択されたが、そ
れはtat−の開始部位での配列に相補的である。
付加的な“ランダム”配列（Ｓ−ODN−５，オ
リゴ−dA，およびオリゴdC）も興味深かつた。
アンチセンスまたはセンス配列のいずれとしても
HIV中に存在しないＳ−ODN−５は、dA，dG，
dCおよびdT残基およびＳ−ODN−１と同じ含
有量を有するが、その他の点ではＳ−ODN−１
と関係ない。オリゴdAおよびオリゴdCを、鎖長
の効果を調べるために、５，14および28ヌクレオ
チド単位でもつて用いた。 ここで規定したように、アンチセンス塩基配列
は、遺伝子発現を選択的に抑制するように作用し
得る標的遺伝情報に相補的な配列である。 細胞増殖の阻害に関して、顆粒白血球細胞はｃ
−myc遺伝子、腫瘍遺伝子、即ち脱制御が腫瘍形
成に関係する細胞遺伝子として公知の遺伝子の類
の中の代表的なものである遺伝子の増幅されたコ
ピーを含有する。 本発明に係る方法において、前記と同じアンチ
センス配列のホスホロチオエートオリゴデオキシ
ヌクレオチド類似体は（即ち、ｃ−myc遺伝子の
開始コドンに相補的である）、HL60細胞の増殖
を阻害することが見い出された。第３図および第
４図参照。 アンチセンス配列のみが、第３図に示されるよ
うに細胞計測により、第４図に示されるように
3H−チミジン取込み並びにｃ−mycタンパク質
の減少により測定されるように、細胞増殖の顕著
な阻害を示すことが見い出された。通常のオリゴ
マーが実際の効果を有するために要するよりも格
段に低いホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチド濃度（即ち、１％以下）を用いて、この
効果は３日まで続いた。 第３図は、96ウエル（well）微量滴定板のウエ
ルに３重に細胞培養０日目に添加されたアンチセ
ンス配列（上図）およびノンセンス配列（下図）
を示し、そして細胞数を全ての培養体中で毎日測
定した。アンチセンスＳ−ODNは、0.5と10マイ
クロリツトルの間の最終濃度で成長を有効に阻害
した。コアンチセンスの0.1マイクロモル濃度は
有効だつたが、全てのノンセンスＳ−ODN濃度
は細胞増殖に影響を与えなかつた。 第４図に示した結果を得るために、ノンセンス
またはアンチセンスＳ−ODNを、３×10⁵／mlで
接種された細胞に０日目50マイクロモルの最終濃
度で添加した。1μCi³H−チミジンで４時間細胞
を培養し、その後10％トリクロロ酢酸を添加し、
そして酸沈殿性放射能をホワツトマンガラス繊維
フイルター上に留めることにより第１日目に
DNA合成を決定した。フイルターを液体シンチ
レーシヨン計測に晒し放射能レベルを決定した。 効果は３倍に再生され、そして用いられた対
照、即ちノンセンス配列はどれも同様の活性を示
さなかつた。従つて、観察された増殖の阻害は、
ここに記載された正確な塩基配列の特異的な
ODN類似体に特有である。生体内でのこの化合
物の使用は、その増殖がｃ−myc遺伝子の存在に
依存する腫瘍の成長の休止を結果として引き起こ
すことができた。外挿法によりその他の腫瘍遺伝
子の配列に相補的なＳ−ODNは、これらの腫瘍
遺伝子が発現される腫瘍の成長を阻害するであろ
う。 表１は抗ウイルス試験のために合成された化合
物の表を含む。化合物の各々は、議論の便宜のた
めの通称が与えられ、そして³¹P NMR分析によ
り判断されるとき平均硫黄含量が95％以上である
場合に、下付き添字“ｓ”により示される各内部
ヌクレオチド結合はRp，Sp−ホスホロチオエー
トであることを除いて、ポリヌクレオチドの慣用
の命名法により示される分子構造を有する。 より長いオリゴ（oligo）がより強力な効果を
有し、そしてオリゴ−dCホスホロチオエートは、
化合物のモル濃度に基づいてオリゴ−dAホスホ
ロチオエートより強い薬効を有することを見い出
した。それ故に、適切なポリヌクレオチド部位お
よび／またはウイルスの（プライマーとしての）
HIV逆転写酵素に対するオリゴの結細胞変性効
果に対する保護を導く。 【表】 第１図は、オリゴ−dC−Ｓおよびオリゴ−dA
−Ｓの３種の長さにおける抗HIV活性の比較を
示す。オリゴdC−ホスホチオエート28merは、
ウイルス複製を阻害し、そして３マイクロモルの
濃度で100％までHIVからATH8細胞を保護する
ことが見い出された、第１図および表１を参照。
各チユーブ内の標的細胞（２×105ATH8細胞）
を記載された濃度の各オリゴマーで16時間前処理
し、そして次にポリブレンと共に45分間培養す
る。遠心分離後、各組のペレツト化細胞をHIV
（最低細胞変性投与量よりはるかに多い投与量で
ある、細胞当たり500ビリオン）に暴露し、そし
て１時間培養する。Ｌ−グルタミン（4mM）、２
−メルカプトエタノール（５×10−2M）、ベニシ
リン（50単位／ml）およびストレプトマイシン
（500マイクログラム／ml）で補足され、そして15
％ウシ胎児血清およびIL−２〔マリーランド、シ
ルバースプリングのアドバンスト バイオテクノ
ロジー社（Advanced Biotechnologies，Inc.）
からの通常のIL−２ 15％およびカリフオルニ
ア、サウザンド オークス、アムゲン バイオケ
ミカルズ（Amgen Biochemi−cals）からの組
換えIL−２ 20単位／ml〕を種々の濃度のオリ
ゴマーと共に含有する完全培地（２ml
RPMI1640）を添加する。ウイルスに対して暴露
７日後、トリパンブルー排除法を用いて血球計数
器で生細胞数を数えた。黒ヌリカラムはウイルス
に暴露していない細胞を表わし、そして白ヌキカ
ラムはウイルス暴露細胞を表わす。Ｓ−dCnの阻
害効果は、14−merおよび28−merに対して、
SdAnのものより大きい。より長い配列は、より
短いものより効果的であることが見い出された。 オリゴの抗ウイルス活性のいくつかの可能な機
構、例えば逆転写酵素の阻害またはウイルス粒子
に対する直接効果がある。逆転写酵素活性の測定
法を用いる実験は、酵素活性の著しい阻害を示さ
なかつた。 本発明のホスホロチオエートは、あらゆる薬学
的に許容性の担体、例えば水、塩類溶液、ヒト血
液およびその他の許容性の担体と共に使用するこ
とができる。 オリゴデオキシヌクレオチドでのHIV培養 オリゴデオキシヌクレオチドでのHIV細胞変
性効果阻害は、HTLV−_Bへの暴露に先立ち、
オリゴでの２×10⁵個の標的細胞（ATH8細胞）
の前処理18時間で行われた。この前処理の後、標
的細胞をポリブレン（２マイクログラム／ml）と
１時間処理した。標的細胞を次いで、夫々、
HTLV−^Bウイルス（この一連の実験において
細胞当たり一般に500ピリオン）に１時間暴露し
た。２×10⁵個の細胞を次いで、IL−２および
種々の濃度のオリゴを含有する完全培地で２mlに
希釈した。 ウイルス暴露７日後、トリパンブルー排除法を
用いて血球計数器で生細胞数を数えた。試験され
た薬剤間の正確な比較を行うために、同時に行わ
れた実験から各組のデータは得られた。 HIV_gagタンパク質発現の決定 HIVのp24_gagタンパク質を発現する細胞の百分
率は、抗HIVp24マウスモノクローナル抗体を用
いることによる間接免疫螢光顕微鏡により決定さ
れた。 サザンプロツト分析 標的細胞（１×10⁷個ATH8細胞）を、種々の
濃度のＳ−dC28の存在下または不在下で16時間
前処理し、次いでポリブレンと処理し、HIV（細
胞当たり500ウイルス粒子）に暴露し、再懸濁し、
そしてＳ−dC28の存在下または不在下で培養す
る。ウイルスに暴露後４および７日目に、高分子
量DNAを抽出し、Asp718〔インデイアナ、イン
デイアナポリスのベーリンガー−マンハイム
（Boehringer−Mannheim）からのK_poＩアイソ
シゾマー〕で消化し、そして1.3kbBg1断片を
含有するHTLV−（BH10）のenv領域の分子
クローンの標識挿入物とハイブリツド形成された
サザンプロツト分析に晒す。 ODNSの抗ウイルス効果および細胞変性の結
果を表２に示す。試験された２種のｎ−ODNお
よび１種のＭ−ODNは、顕著な阻害効果を示さ
なかつたが、一方全てのＳ−ODNはHIVの細胞
変性効果の顕著な阻害を示した。驚くべきこと
に、dC（Ｓ−dC14）の14−merホスホロチオエー
トホモ−オリゴマーは、この一連の実験において
試験されたものの中で最も強力な抗ウイルス化合
物であることが見い出された。アンチセンス配列
でないホスホロチオエートが非常に有効な抗ウイ
ルス剤であることが明らかであるので、塩基組成
効果の性質を明らかにするために、ある試みがな
された。試験された各々の14−merホスホロチオ
エート５マイクロモルの効果を比較すると、ウイ
ルスの細胞変性効果の阻害は、類似体のＧ＋Ｃ含
量に対してほぼ直線的であることが見い出された
（表２からのデータ参照）。 【表】 オリゴ−dCおよびオリゴ−dAホスホロチオエ
ートの種々の長さにおける抗HIV活性の比較 相互測定変性（inter−assay variation）は薬
剤間の抗ウイルス活性の不適当な比較を生み出し
得るという可能性があるので、実験はより正確な
比較を行ない得るように同時に行われた。 14−merと28−merとの間の抗HIV活性（第１
図参照）の第６図における比較において、３種の
ヌクレオチドと同程度に短い種々のヌクレオチド
長さの増加につれてさえも明らかな長さ効果があ
ることが見い出された。 第１図に示されるように、Ｓ−dCnの阻害効果
は、14−merおよび28−merの両方に対してＳ−
dAnのものに比べより大きく、そしてより持続性
であるが、一方両方のカテゴリーに属する５−
merはウイルスの細胞変性効果を有意に阻害しな
かつた。ホモオリゴマーの有効性の順番は14−
merに対してdC＞dTdAだつた。より長い配列
は、ヌクレオチド単位の同一モル濃度でより短い
配列に比べより効果的であることがわかつた。例
えば、第６図に示されるように、0.5マイクロモ
ル（13.5マイクロモルヌクレオチド当量）と低い
濃度での28−merS−dC28は、ウイルスに対する
完全な保護を与えたが、一方５マイクロモル（65
マイクロモル当量）での相当する14−merは中程
度の効果を示すのみだつた。Ｓ−dC28は、これ
らの実験において用いられた条件下で最も一定し
たそして持続的な抗ウイルス効果を与えた。これ
らのデータは、真の長さ効果を示唆し、そして金
属イオンキレート化または反応性モノマーへの分
解のいずれかに対して反証する。 ODN類似体におけるN3−メチルチミジン置換
の抗HIV活性に関する効果 N3−メチルチミジン含有アンチセンスオリゴ
デオキシヌクレオチドのＮ−Me−ODN−１を第
５図に示すが、これは４位と９位にメチル化チミ
ジンを有する。ランダム配列ODN−４は、ODN
−１と同一の塩基含量を有するが、しかしアンチ
センスまたはセンスのようなHTLV−BH10ゲ
ノム配列におけるあらゆる配列と70％以下の相同
性を有する。dCおよびdAのホモオリゴマーをｎ
が５，14およびび28である３種の長さに合成し
た。 第７図に示されるように、N3−メチル−チミ
ジン含有Ｓ−ODN−１は抗ウイルス活性を示さ
なかつたが、一方Ｓ−ODN−１はHIVに対する
実質的な活性を一定して示した。ピリミジン塩基
のN3−置換は、相補的なアデノシン残基への水
素結合合を十分に減らすことが知られているか
ら、ホスホロチオエートのこのN3−メチル−チ
ミン含有類似体の相対的な不活性は、抗ウイルス
活性を少なくとも１つの機構でヌクレオチド配列
に結合することにより生じ得ることを示唆する。 ウイルスに暴露されたATH8細胞における新
たなHIVDNA合成のオリゴデオキシシチジン
ホスホロチオエートの28−merによる阻害 第８図は、標的細胞における新たなHIV
DNA合成に関するホスホロチオエートオリゴデ
オキシシチジン類似体（Ｓ−dC28）の阻害効果
を示す。ウイルスへの暴露後４および７日目に、
ウイルスDNAの実質的な量を抗ウイルス剤なし
でサザンプロツト分析により検出した。Ｓ−
dC28、並びに2′，3′−ジデオキシアデノシンは、
１マイクロモルと低い濃度でウイルスDNAの新
たな合成を著しく阻害した。 Ａ−Ｅ列に示されるウイルスへの暴露４日目、
およびＦ−Ｊ列に示される７日目に、高分子量
DNAが抽出された。ウイルスに暴露され、そし
てＳ−dC28により保護されなかつたATH8細胞
からのDNAをＡ列およびＦ列は含む。１マイク
ロモル、５マイクロモルおよび７マイクロモルの
Ｓ−dC28で夫々前処理および培養されたATH8
細胞からのDNAをＢ列およびＧ列、Ｃ列および
Ｈ列、Ｄ列およびＩ列は含む。50マイクロモルの
2′，3′−ジデオキシアデノシンで処理された
ATH8細胞からのDNAをＥ列およびＪ列を含み、
そしてウイルスに暴露されなかつたATH8細胞
からのDNAをＫ列は含む。ウイルスゲノムの
2.7Kbenv含有内部KPNI断片はＡ列およびＦ列
にのみ検出された。 長期のHIV感染細胞における28−merオリゴデ
オキシシチジンホスホロチオエート（Ｓ−
dC28）によるウイルスタンパク質の発現阻止
の停止 表３に示されるように、120時間の実験期間25
マイクロモルと高い濃度での長期のHIV感染H9
細胞における間接免疫螢光測定法により、決定さ
れた標的細胞のgagタンパク質陽性を、Ｓ−dC28
は減らさなかつた。 【表】 14−merオリゴデオキシシチジンホスホロチオ
エートによる2′，3′−ジデオキシアデノシンの
抗ウイルス活性の相乗的増大 アジドチミジン（AZT）、ジデオキシシチジン
およびジデオキシアデノシンを包含する種々のジ
デオキシヌクレオシドは、標的細胞内での同化ホ
スホリル化を活性レトロウイルス剤となるために
必要とする。作用の機構は、逆転写酵素の競合阻
害および／または初期のDNA鎖形成の終結であ
ることが明らかである。 第２図は、2′，3′−ジデオキシアデノシンおよ
びＳ−dC14の組合せの効果を示す。相乗効果は
Ｓ−dC28またはＳ−dC14およびジデオキシヌク
レオシドの組合せで得られた。標的細胞（チユー
ブ当たり２×10⁵個ATH8細胞）を、記載した濃
度のＳ−dC14と24時間予備培養し、そして２マ
イクログラム／mlのポリブレンと45分間前処理し
た。遠心分離後、ペレツト化細胞をHIV（細胞当
たり1000ピリオン）に１時間暴露した。細胞を
IL−２含有の完全培地２ml中培養し、そして生
細胞を第13日目に数えた。 本発明のオリゴマーは異なる機構で作用するよ
うであり、そして同化ホスホリル化が必要である
と考えられない。しかしながら、第２図に示され
るように、2′，3′−ジデオキシアデノシンと14−
merオリゴデオキシシチジンホスホロチオエート
との組合せは、抗ウイルス活性の著しい相乗的増
大を与えた。例えば、ジデオキシアデノシン２マ
イクロモルは、Ｓ−dC14 ５マイクロモルと共
に、ウイルス細胞変性効果に対する標的細胞の完
全な保護を示したが、一方２種の薬剤の各々単独
では、この実験において不十分な保護効果しか示
さなかつた。 第２図に示される抗ウイルス活性の増大に対し
て、標的細胞を種々の濃度のＳ−dC14で16時間
前処理し、そして次に２マイクログラム／mlポリ
ブレンで前処理し、細胞当たり1000ウイルス粒子
に１時間暴露し、種々の濃度の2′，3′−ジデオキ
シアデノシンの存在下または不在下でIL−２を
含有する完全培地２ml中に再懸濁する。ウイルス
への暴露後13日目に、トリパンブル−排除法によ
り生細胞を数えた。これらの実験は、ここに記載
されたその他の実験におけるよりもより長期間よ
り強力なウイルス接種を包含する。 表２に示されるように、ホスホロチオエート類
似体だけが抗HIV活性を示した。従つて、ホス
ホロチオエート類似体をｎ−ODNに関して保持
し、そしてそれらをそれらの標的部位に到達させ
そして留めるのは主としてヌクレアーゼに対する
その相対的な耐性であるということは信じられ
る。このことは、時間の関数としてｎ−ODN−
１およびＳ−ODN−１化合物の³¹P NMRスペク
トルを追うことにより試験管内での試験系で使用
される培地に関して支持された。通常のオリゴデ
オキシヌクレオチドの分解は、これらの条件下で
約17時間の半減期を示して、末端のホスフエート
ピークの増大から観察されたが、一方Ｓ類似体
は、この方法の５％以上の精度内で、１週間後で
さえも顕著な分解を示さなかつた。 同様に、試験管内細胞変性アツセイから取ら
れ、そしてヒト血清中37℃で培養されたＳ−
ODN溶液の試料は、７日後分解を示さなかつた。
細胞変性阻害アツセイにおけるメチルホスホネー
ト類似体（Ｍ−ODN−１）の不活性化は、標的
配列に強くハイブリツド形成する弱い能力に帰因
し得る。 試験された最も薬効のある類似体の１つ、Ｓ−
dC28の抗HIV活性の効果は、モル濃度に基づい
て2′，3′−ジデオキシシチジンのものにほとんど
匹敵するものであり、即ち両方の薬剤は、本アツ
セイ系において並びに治療指数、有効濃度に対す
る細胞変性濃度の比に換算して0.5マイクロモル
で完全な抗ウイルス活性を示した。Ｓ−dC28は
一般に、ジデオキシシチジンおよびジデオキシア
デノシンのものに匹敵する試験管内指数を示す。 一般に、アンチセンス配列は、翻訳抑制により
種々の遺伝子の発現を阻害する、即ちそれらは
mRNAに結合しそしてその翻訳を阻止すると考
えられてきた。この可能性を試験するために、顕
微鏡下での間接免疫螢光アツセイにより長期
HIV−感染および−産生H9細胞内でのgagタン
パク質合成を、分析した。表３に示されるよう
に、Ｓ−dC28は、25マイクロモルと高い濃度で
H9／HTLV−ｂ内のgagタンパク質陽性を阻
害しなかつた。細胞のgag陽性は、タンパク質産
生の部分的な定量的パラメーターにすぎないけれ
ども、0.5マイクロモルと低い濃度でのＳ−dC28
の強い抗HIV活性は翻訳抑制それ自体に由来す
るものではないことをこの結果は示唆する。ま
た、あらゆる翻訳抑制のレベルは、顕微鏡下での
間接免疫螢光アツセイによる検出のいき値以下で
あつた。対照的に、標的細胞内でのHIV DNA
の新たな合成を調べるために使用されるサザンブ
ロツト分析は、１マイクロモルより低い濃度でＳ
−dC28による完全阻害を示した。それ故に、抗
ウイルス作用に対する１つの機構は、おそらくプ
ロウイルスのDNA合成に先立つか、またはその
段階にウイルス複製を阻止することに依存し得
る。 Ｓ−ODN類似体が標的細胞に結合するHIVを
妨害する可能性が試験された。細胞表面上のT4
分子は、T4＋細胞におけるHIVの主要なレセプ
ターであることが知られている。T4細胞（H9）
におけるT4分子に標識されたウイルスの特異的
結合のための放射標識ウイルスを用いる実験にお
いて、Ｓ−dC28による阻害は観察されず、従つ
て細胞表面へのウイルス結合の阻害は活性に関連
しないことを示唆する。さらに、ATH8細胞の
細胞表面上のT4、HLA−DR、T8、T3または
Tac抗原の検出可能な変化は、１マイクロモルＳ
−dC28との培養16時間後の螢光活性化細胞螢光
定量法により見られなかつた。全般的に、これら
の発見は、塩基組成効果および長さ効果を包含し
て、抗ウイルス活性がHIVプロウイルスのDNA
合成の阻害により仲介され、少なくとも部分的に
はウイルスヌクレオチド配列へのＳ−ODNの結
合によりおそらく発生することを示唆する。 考えられるべきもう１つの機構は、ポリ−ｒ
（Ｉ−Ｃ）のホスホロチオエート類似体に提案さ
れるようなインターフエロン産生の誘導である。
ガンマインターフエロンの誘導は、Ｓ−dC14と
の培養液の上清に観察されず、そして培養液に直
接添加された組換えアルフアーまたはガンマーイ
ンターフエロン100単位はアツセイ系において細
胞変性効果を阻害しなかつた。また、ホスホロチ
オエート内部ヌクレオチド結合がチオール特性を
有し、そして従つてジスルフイドを形成し得ると
いう概念を支持するデータがないから、作用の機
構は、チオール化塩基例えば５−メルカプト−シ
トシンまたは−ウラシルを有する抗ウイルスポリ
ヌクレオチドに提案されているものとはおそらく
異なる。 標的細胞の透過性を調べるために、ホスフアタ
ーゼ−耐性³⁵S−ホスホロチオエート末端標識Ｓ
−dC28を用いた。ATH8およびH9細胞における
放射活性の著しい増加は、数分以内に観察され、
従つて細胞によるこれら化合物の取込みを支持す
る。 鋳型としてのＭ−13ベクター内にユニバーサル
プライマーと共に挿入されたウイルスDNA（3′−
orf）を用いる試験管内での実験における精製
HIV逆転写酵素活性の実質的な阻害をＳ−ODN
も示した。いくつかの条件下で、ホスホロチオエ
ート類似体が鋳型−プライマーの競合的阻害剤と
して作用し得、そしてこの類の化合物が作用の多
様な機構を有することは明らかであることを見い
出した。しかしながら、抗ウイルス活性の非配列
特異性、ウイルスDNAポリメラーゼの直接阻害
または相補的配列に対する高濃度での付加的な翻
訳抑制を包含する正確な機構は、現時点でさらに
研究が必要である。 培養液中で数日後、一般的には７−10日後、
HIV感染による実質的な細胞死（HIV細胞変性
効果）またはHIVの細胞変性に対するオリゴの
保護効果のいずれかが観察された。 その他の実験において、標的細胞（ATH8細
胞）は、ホスホロチオエートオリゴ（Ｓ−ODN
−１，２、および４）によりHIVに対して保護
されるように見えたが、しかし同一配列を有する
非修飾オリゴによつては見られなかつた。さら
に、同じ実験において、ホスホロチオエートの
“ランダム”配列、例えば14−merオリゴ−dCお
よびＳ−ODN−５は、HIV細胞変性効果に対し
て実質的な保護を示した。ウイルス感染および細
胞変性効果に対して関連するポリヌクレオチド部
位に結合することより生じたホスホロチオエート
オリゴの保護効果もまた調べ、並びに細胞変性効
果アツセイにおけるオリゴ−dCおよびオリゴ−
dAホスホロチオエート（５，14、および28mer）
の種々の長さに関しても調べた。バイオ試験はミ
ツヤ（Mitsuya）等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
83巻，1911−1915頁（1986年）に記載されてい
る。 腫瘍成長の阻害に関して、全ホスホロオリゴマ
ーの効果は、全ホスホロチオエート化オリゴマー
の効果と全く異なる。さらに、化学的に結合され
た本発明のオリゴマーの組合せた混合物は、腫瘍
細胞の増殖を阻害するために用い得る。 これらのコポリマーは、種々の立体配置、例え
ば14−merポリマーの各末端で２つのホスホロチ
エート化オリゴマーを有する末端がキヤツプされ
たポリマーを推測することができる。また、ブロ
ツクコポリマーを提供し得、例えば反復単位を有
するポリマー、例えば27個の内部ヌクレオチドホ
スフエート結合を有する28merポリマーにおける
９ホスホネート、９ホスホチオネートおよび９ホ
スホネート化ポリマー、または１つずつ交互のコ
ポリマーである。これらコポリマーの多くは中間
体特性を有する。 通常のオリゴマーは血清中で約17時間後に切断
されるが、しかし細胞内ではこれらの化合物の半
減期は数日間と長いことが見い出された。ホスホ
ロチオネート化誘導体の使用は、活性化合物の寿
命を延長し、腫瘍遺伝子の発現を阻害するために
より長い時間をこれら化合物に与える。 末端がキヤツプされた化合物はヌクレアーゼに
対して約100倍も耐性であるが、しかし表４に示
されるような、それらの融解温度により示される
ように、通常のホスホネート化化合物とほぼ同様
にハイブリツド形成することを初めの物理化学的
な研究は示す。 【表】 脚注：Ｓ−dA／Ｔ T_nsはかなり低いが、しか
し Ｓ−dC／Ｇは比較的高い。 種々のオリゴデオキシヌクレオチドをDN_ase感
受性に関して研究した、表５参照。これらはシチ
ジンホモポリマー、ODN−４〔HIV BH10クロ
ーンのart／trs領域の3′領域に相補的なアンチ−
メツセージ（anti−message）28mer〕および
myc−１（Ｃ−myc腫瘍遺伝子の開始コドン領域
に相補的な15−mer）を包含する。用いられる
DNaseは主にエンドヌクレアーゼＳ１、エキソ
−およびエンドヌクレアーゼＰ１、およびヘビ毒
（SV）ホスホジエステラーゼだつた。通常のおよ
びPS類似体はこの酵素により極端にゆつくり分
解されるので、Ｓ１ヌクレアーゼの濃度はオリゴ
dCの反応の10倍高かつた（100マイクロモル／
ml）。150−merが28−merよりいくらかより速く
消化され、Ｓ１およびＰ１ヌクレアーゼ消化は、
通常のオリゴマーに対してよりＳ−ODNに対し
て２−45倍ゆつくり進む。2sキヤツプ化myc−１
種は、全てのPS化合物と同様にふるまつた。 Ｓ−ODNはSVホスホジエスラーゼの効果には
ほとんど影響されず、そしてこの場合、通常のオ
リゴとの違いは全く劇的である。ホモポリマーに
対して、＞10⁵秒の半減期が測定され、これは通常
のオリゴマーに対して速度の３桁の低下を意味す
る。同様の結果がmyc−１およびODN−４に見
い出された。SVホスホジエステラーゼによる2S
−cap−myc−１の消化も、表５に示されるよう
に速いが、しかしその他の種のいくつかと同様に
著しくはない。しかしながら、³¹P NMRにより
測定されるように、50％ヒト血清中の3′，5′−2S
−cap−myc−１の半減期は、通常のmyc−１の
２ないし３日に対して１ケ月より大きい。 【表】 【表】 前記したように、本発明の化合物の好ましい投
与量は、約0.1ないし約100マイクロモル／clの血
中濃度を保持するのに必要である量である。この
濃度は種々の方法で達成し得る。 本発明の範囲内の薬学的組成物は、その意図さ
れる目的を達成するための有効量でそれらの活性
成分を含有する組成物を包含する。好ましい範囲
は上記され、そして腫瘍またはウイルスの各タイ
プを処理するための最も有効な量の決定は、当該
分野の技術内である。 本発明のホスホチオエート化化合物に加えて、
これらの薬学的組成物は、薬学的に使用され得る
調剤に有効化合物の加工を促進する適当な賦形剤
および補助剤を含有しても良い。好ましくは、調
剤は、特に、経口投与の好ましいタイプ、例えば
錠剤、糖衣錠およびカプセルであつて良く、そし
て腸を経由して投与され得る調剤、例えば坐剤、
並びに非経口的にまたは経口的に投与するのに適
した溶液であつて良く、そして含有化合物を包含
して頬側にまたは舌下に投与され得る組成物は、
賦形剤と共に有効成分約0.1ないし約99重量％含
有する。 本発明の薬学的調剤はそれ自体当該技術分野で
十分に公知である方法で製造される。例えば、薬
学的調剤は慣用の混合、粒状化、糖衣製造、溶解
または凍結乾燥工程により製造しても良い。使用
すべき方法は、最終的には使用される有効成分の
物理的特性に依存するであろう。 適当な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖例え
ば乳糖またはシヨ糖、マンニトールまたはソルビ
トール、セルロース生成物および／またはリン酸
カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリ
ン酸水素カルシウム、並びに結合剤、例えばトウ
モロコシデンプン、コムギデンプン、ライススタ
ーチ、ポテトスターチ、ゼラチン、トラガガント
ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメ
チルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセ
ルロースおよび／またはポリビニルピロリドンを
用いる例えばデンプン、ペーストである。所望に
より分解剤を添加しても良く、それらは例えば上
記のスターチ並びにカルボキシメチルスターチ、
架橋ポリビニルピロリドン、アガーまたはアルギ
ン酸またはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリ
ウムである。補助剤は流れ調整剤および潤滑剤、
例えばシリカ、タルタ、ステアリン酸またはそれ
らの塩、例えばステアリン酸マグネシウムまたは
ステアリン酸カルシウム、および／またはポリエ
チレングリコールである。糖衣錠の核は、所望に
より胃液に耐性であつて良い適当な被膜を供給さ
れても良い。この目的のために濃縮糖溶液を用い
ても良く、場合によつてはアラビアゴム、タル
ク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコ
ールおよび／または二酸化チタン、ラツカー溶液
および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有し
ても良い。胃液に耐性の被膜を製造するために、
例えばアセチルセルロースフタレートまたはヒド
ロキシプロピルメチルセルロースフタレートのよ
うな適当なセルロース生成物溶液が使用される。
例えば有効化合物投与量の異なつた組合せ同定の
ためにまたは特徴づけのために、染料および顔料
を糖衣被膜の錠剤に添加しても良い。 経口的に使用され得るその他の薬学的調剤は、
ゼラチンからなるプツシユフイツト（push−fit）
カプセル、ゼラチン並びにゼラチンおよび可塑剤
例えばグリセロールまたはソルピトールからなる
軟かい密封カプセルを包含する。プツシユフイツ
トカプセルは、充填剤例えば乳糖、結合剤例えば
スターチ、および／または潤滑剤例えばタルクま
たはステアリン酸マグネシウムおよび場合によつ
ては安定剤とで混合されても良い顆粒の形態で有
効化合物を含有することができる。軟らかいカプ
セルにおいて、有効化合物は好ましくは、適当な
液体、例えば脂肪油、液体パラフインまたは液体
ポリエチレングリコール中に溶解するか、または
懸濁する。さらに安定剤を添加しても良い。 腸を経由して使用され得る可能な薬学的調剤
は、例えば坐剤ベースと有効化合物の組合せから
なる坐剤を含む。適当な坐剤ベースは、例えば天
然または合成トリグリセリド、パラフイン炭化水
素、ポリエチレングリコールまたは高級アルカノ
ールである。さらに、ベースと有効化合物の組合
せからなるゼラチン腸経由カプセルを使用するこ
とも可能である。可能なベース剤は、例えば液体
トリグリセリド、ポリエチレングリコール、また
はパラフイン炭化水素を包含する。 非経口投与のための適当な製剤は、水に溶けた
または水に分散した形態にある有効化合物の水溶
液を包含する。さらに、適当な油状注射懸濁液と
しての有効化合物の懸濁液が投与されても良い。
適当な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例
えばゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えばエ
チルオレエートまたはトリグリセリドを包含す
る。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる物
質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロー
ス、ソルビトール、および／またはデキストラン
を含有しても良い。所望により、懸濁液はまた安
定剤を含有しても良い。 さらに、本発明の化合物はまた、リポソーム内
にカプセル化されて投与されてもよく、有効成分
が脂肪性層に粘着性の水性同心層からなる微粒子
内に分散されるかまたは別の形態で存在して含有
される薬学的組成物であつて良い。有効成分はそ
の溶解性に依存して、水性層および脂肪性層の両
方に存在しても良く、または一般にリポソーム懸
濁液と呼ばれる形態で存在しても良い。疏水性層
は、一般的にしかし排他的ではなく、リン脂質例
えばレシチンおよびスフインゴマイセリン、ステ
ロイド例えばコレステロール、いくぶんイオン性
の界面活性剤例えばジセチルホスフエート、ステ
アリルアミン、またはホスフアチジン酸および／
または疏水性のその他の物質からなる。リポソー
ムの直径は一般に約15nmないし約５ミクロンの
範囲内である。 特定の実施態様の前述の記載は本発明の一般的
な性質を十分に表わしているであろうから、他人
が現在の知識を適用することにより、一般的な概
念から逸脱することない特定の実施態様のような
種々の施用のために容易に変更および／または採
用することができ、そしてそれ故にその様な採用
および変更は、開示された実施態様の同等の意味
および範囲内であると理解されたい。ここで使用
される表現法および専門用語は記載のためのもの
であつて、限定のためではない。