JPH0646894A - アミノペプチダーゼまたはトランスペプチダーゼの検出用の乾式分析要素および検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 本発明は6.5 〜11のpHでのロイシンアミノペ
プチダーゼアッセイ用の乾式分析要素を提供する。 【構成】 該要素の区画は芳香族性酵素基質を含有す
る。この基質は電子供与基に対してオルト位またはパラ
位において芳香環上に第一アミノ基を有する芳香族反応
体を提供する。この芳香族反応体は酸化性化合物（例え
ばオキシダーゼ）により酸化され、そしてその酸化され
た化合物が非拡散性色生成性カプラーと反応して色素を
構成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床化学に関する。特に
本発明は、水性液体、例えば生物学的流体中のアミノペ
プチダーゼまたはトランスペプチダーゼの測定用の分析
要素および測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペプチダーゼは、Ｌ−ペプチド中のペプ
チド結合に作用し、そのＮ末端のところで切断してアミ
ノ酸または低級ペプチドを遊離せしめる酵素についての
一般用語として知られている。そのような酵素として
は、ロイシンアミノペプチダーゼ、システインアミノペ
プチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、アルギニン
アミノペプチダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼおよ
びγ−グルタミルトランスペプチダーゼが挙げられる
が、それらに限定されない。

【０００３】ロイシンアミノペプチダーゼとγ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼは、ヒトの組織中および或る
種の体液、例えば血清中に広く分布している。それらの
酵素は或る種の病気状態で濃度が増加し、従って臨床診
断や治療のための重要な臨床指標である。

【０００４】ロイシンアミノペプチダーゼまたはγ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ活性についての既知のア
ッセイは、一般に比色シグナルを提供するための該酵素
による基質からのアミン化合物の遊離を伴う。種々の基
質が開発されており、当業界ではまさにこの目的で記載
されており、例えばUS-A-4,209,459, US-A-4,588,836お
よびUS-A-4,681,841並びにSchimamoto他、Clin. Chem.,
31, 1636-1639, 1985に記載されたものがある。それら
の参考文献中に記載されたアッセイは、酵素が血清被検
体中に存在する場合には溶液中で実施されて水溶性色素
を与えている。

【０００５】近年、適当なアッセイ用試薬の全部を含有
する乾式分析要素を使って非常に有利に分析物が検出さ
れている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ロイシンアミノペプチ
ダーゼについての既知のアッセイを乾式分析要素中で実
施することが望ましいだろう。しかしながら、それを行
うには多数の課題がある。既知のアッセイで生成する色
素の大部分は、ビリルビンまたはヘモグロビンからの干
渉の危険性が高い400 nm以下にシグナルを提供する。更
に、幾つかの既知の酵素基質は毒性であるため特別な取
扱いと廃棄を必要とする。

【０００７】US-A-4,681,841では、高波長での検出に有
用な色素が生成されるが、該色素を生成するのに使う発
色カプラーは水溶性である。この性質は、乾式分析要素
におけるそれらの使用に追加の問題を提供する。何故な
ら、発色カプラーが該要素全体を移動し得ることによっ
て観察可能な色素シグナルを低下させてしまうからであ
る。更に、アッセイのpHは所望の酵素活性と感度を得る
のに重大である。アッセイpHは溶液アッセイでは容易に
調節できるが、乾式分析要素を使った時はpHを調節する
のが困難である。

【０００８】試薬が別々に保持されそして最適結果のた
めにpHが厳密に調節されるように、乾式分析要素中でア
ミノペプチダーゼまたはトランスペプチダーゼを検出で
きることが非常に望ましいだろう。既知の技術はそれら
の課題を解決する方法を提案していない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上述した課題は、酸化性
化合物と非拡散性色生成性カプラーを含有する区画を含
んで成る分析要素であって、前記要素は、異なる区画中
に、アミノペプチダーゼまたはトランスペプチダーゼと
反応するとフェニル環上に第一アミノ基を有し且つ前記
第一アミノ基に対してオルト位またはパラ位にヒドロキ
シ、アミノまたは置換アミノ基を有する反応体を提供す
る芳香族基質を含有し、そして前記要素はアミノペプチ
ダーゼまたはトランスペプチダーゼについての生物学的
流体のアッセイの最中約 6.5〜約11のpHを提供するのに
有効な量で存在する緩衝剤を更に含んで成り、前記非拡
散性色生成性カプラーが、 a) 親電子置換を受けることができる b) 少なくとも150 の分子量を有するバラスト基を含む c) 少なくとも150 の分子量と少なくとの150 ℃の沸点
を有する有機溶剤への可溶性、および d) 前記芳香族基質により提供される第一アミノ含有反
応体の酸化形態とカプリングすると、400 〜800 nmの範
囲内に吸収を有する色素を提供する という性質を有し、第二区画中の前記酸化性化合物が、
前記第一アミノ含有反応体の前記第一アミノ基を酸化し
て、色素を生成する前記色生成性カプラーとの反応に適
するようにする化合物である、ことを特徴とする前記分
析要素を使って解決された。

【００１０】本発明は、次の段階： Ａ．液体試料を上述の分析要素と接触せしめて色素を生
成せしめる段階、そして Ｂ．400 〜800 nmの範囲内の波長で該色素の生成を検出
する段階 を含んで成るアミノペプチダーゼまたはトランスペプチ
ダーゼの測定方法も提供する。

【００１１】

【具体的な態様】本発明は、ロイシンアミノペプチダー
ゼ、γ−トランスペプチダーゼ、システインアミノペプ
チダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、アルギニンア
ミノペプチダーゼおよびアラニンアミノペプチダーゼを
包含するアミノペプチダーゼまたはトランスペプチダー
ゼの測定（定量的または定性的のいずれか）に関する。
特に、本発明は、血清、尿、リンパ、血漿、全血および
脳脊髄液を包含する生物学的流体をアッセイするのに利
用することができる。組織の流体調製物、例えば肝臓ま
たは腸組織の調製物をアッセイすることも可能である。
好ましくは、本発明を用いてヒト血清または尿がアッセ
イされる。

【００１２】本発明の乾式要素は、液体浸透性であり且
つ酵素分析物の検出に必要な全試薬を含有する２以上の
隣接する区画（または層）を有する。該要素の少なくと
も１つの区画（好ましくは、最も外側の区画）は、その
ような区画に使われている既知の材料のいずれかから調
製される多孔質展開層である。該要素は、アッセイに必
要な１または複数の試薬を含有する少なくとも１つの別
の区画を含む。

【００１３】本発明のアッセイは、ロイシンアミノペプ
チダーゼについて例示する次の反応順序を使って実施さ
れる： a) ロイシンアミノペプチダーゼが、芳香族ロイシンア
ミノペプチダーゼ基質からＬ−ロイシンと環上にヒドロ
キシ、アミノまたは置換アミノ基に対してオルトまたは
パラ位である第一アミノ基を有する芳香族反応体とへの
変換を触媒し、 b) 酸化性化合物により前記芳香族反応体の１または複
数の第一アミノ基が１または複数の反応性イミン基に酸
化され（生成した酸化された化合物はキノンイミンまた
はキノンジイミンであることができる）、そして c) 生じたイミン（またはジイミン）含有芳香族化合物
が非拡散性色生成性カプラーと反応して色素を提供す
る。

【００１４】酵素分析体のための基質は、色生成性カプ
ラーを含む区画以外の該要素の区画の１つに提供され
る。一態様では、上述した多孔質展開区画中に含めるこ
とができる。別の態様では、それを更に異なる（または
第三の）区画（または層）中に置くことができる。

【００１５】基質は芳香族性であって、且つ酵素と反応
すると、芳香環（例えばフェニル環）上に第一アミノ基
を有しそして更に前記第一アミノ基に対してオルト位ま
たはパラ位にヒドロキシ、アミノまたは置換アミノ基を
有する反応体を提供することができる。パラ位での置換
が好ましい。置換アミノ基としては、メチルアミノ、ジ
メチルアミノ、イソプロピルアミノおよびジエチルアミ
ノが挙げられる。

【００１６】好ましい態様では、芳香族基質は構造
（Ｉ）により表される：

【化１】

【００１７】上式中、Ｒはアミノ酸またはペプチドのカ
ルボン酸基と芳香環に取りつけられた第一アミノ基との
縮合生成物であるアミノ酸またはペプチドアミド基であ
る。Ｒの例としては、Ｌ−ロイシルアミド、システイニ
ルアミド、プロリルアミド、アルギニルアミド、アラニ
ルアミド、γ−グルタミルアミドおよび当業者に明らか
であろう他のものが挙げられる。

【００１８】より好ましくは、Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ⁵
であり、ここでＲ⁵ は、少なくとも１つの第一アミノ基
により置換された１〜６個の炭素原子を有する直鎖また
は分枝鎖アルキル（例えばメチル、エチル、イソプロピ
ル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシル）である。Ｒ
⁵ は１または複数のフェニルもしくは置換フェニル（例
えばヒドロキシフェニル）、ｐ−アミノフェニル、イミ
ダゾリル、インドリル、ヒドロキシ、メチルチオまたは
当業者に容易に明らかである他の基により置換されても
よい。代表的なＲ⁵ 基としては、１−アミノ−３−メチ
ルブチル、１−アミノ−２−メルカプトエチル、１−ア
ミノ−４−グアニジノブチル、１−アミノエチル、１−
アミノフェネチル、１−アミノ−３−カルボキシプロピ
ル、１−アミノ−２−カルボキシエチル、１−アミノ−
２−（５−イミダゾリル）エチル、１−アミノ−２−
（４−ヒドロキシフェニル）エチル、１−アミノ−２−
カルバモイルエチル、１−アミノ−２−カルバモイルプ
ロピル、１−アミノ−２−ヒドロキシエチル、１，５−
ジアミノペンチル、１−アミノ−２−ヒドロキシプロピ
ル、アミノメチル、１−アミノエチル、１−アミノ−２
−メチルプロピル、１−アミノ−２−メチルブチル、１
−アミノ−３−メチルブチル、１−アミノ−３−メチル
チオプロピルおよび１−アミノ−２−（３−インドリ
ル）エチルが挙げられるが、それらに限定されない。最
も好ましくは、ＲはＬ−ロイシルアミドである（即ち、
Ｒ⁵ が１−アミノ−３−メチルブチルである）。

【００１９】上記の構造（Ｉ）中、Ｒ′はヒドロキシ、
または（１〜６個の炭素原子を有する１または複数の低
級アルキル基、例えばメチル、エチル、イソプロピルお
よびｔ−ブチルにより置換された）第一、第二もしくは
第三アミノである。好ましくは、Ｒ′はヒドロキシであ
る。

【００２０】また、Ｒ¹ ，Ｒ² ，Ｒ³ およびＲ⁴ の各々
は独立的に、水素、ハロ（例えばフルオロ、クロロまた
はブロモ）、１〜６個の炭素原子を有するアルキル（例
えばメチル、エチル、イソプロピル、クロロメチルおよ
びメトキシメチル）、１〜６個の炭素原子を有するアル
コキシ（例えばメトキシ、エトキシ、イソプロポキシお
よびｔ−ブトキシ）、ヒドロキシまたはアミノ（第一、
第二または第三）であることができる。好ましくは、Ｒ
¹ とＲ⁴ が独立的にハロ（例えばクロロまたはブロモ）
であり、そしてＲ² とＲ⁴ が各々水素またはメチルであ
る。

【００２１】基質は、所望により、塩の形、例えばギ酸
塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸
塩、酒石酸塩またはシュウ酸塩の形で使うことができ
る。最も好ましい基質はロイシンアミノペプチダーゼの
測定に有用なＬ−ロイシン−３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリドである。

【００２２】本発明の要素の第二区画中には、第一アミ
ノ含有芳香族反応体を、次いで色生成性カプラー（下記
に定義する）と反応することができるイミン基を有する
化合物に変換する酸化性化合物（又は酸化体）である。
有用な酸化性化合物としては、第一アミノ基を酸化する
時に酸素を消費するオキシダーゼが挙げられる。他の酸
化性化合物としては、エチレンジアミン四酢酸第二鉄
（または等価の塩）および塩化第一銅（または等価の
塩）が挙げられる。有用なオキシダーゼの例としては、
アスコルビン酸オキシダーゼ、ラクターゼ、チロシナー
ゼ、アミノフェノールオキシダーゼ、フェノールオキシ
ダーゼおよびポリフェノールオキシダーゼが挙げられ
る。任意の適当な源からのアスコルビン酸オキシダーゼ
が酸化性化合物として好ましい。

【００２３】酸化性化合物と同じ区画中には、アミノペ
プチダーゼまたはトランスペプチダーゼが存在する場合
に要素中に適当な色素を提供する目的で使われる非拡散
性色生成性カプラーが存在する。この非拡散性色生成性
カプラーは、親電子置換を受けることができなければな
らない。これは、該カプラーが、親電子剤、即ち「陽性
の攻撃」基（双極子または誘導双極子の陽性末端または
陽イオン）、により置換される時に化合物からその電子
対を持たずに開裂される「脱離」基を有することを意味
する。「脱離」基は、例えば、水素、メルカプト、置換
メルカプト（例えばオルガノメルカプト、例えばメチル
チオ、エチルチオ、フェニルチオ、ベンジルチオおよび
３−ピバルアミドフェニルチオ）、ヒドロキシ、１〜12
個の炭素原子を有する置換または非置換アルコキシ（例
えばメトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ブトキシお
よびオクトキシ）、Ｎ−複素環基（例えばピラゾリル、
イミダゾリルおよびピロリル）またはハロ（例えばクロ
ロおよびブロモ）であることができる。好ましくは、
「脱離」基は水素または置換メルカプト基であり、２−
ピバルアミドフェニルチオが最も好ましい。

【００２４】非拡散性色生成性カプラーは、少なくとも
150 の分子量を有するバラスト（脚荷）基を含んで成
る。即ち、バラスト基は、カプラーを非拡散性にするよ
うなサイズと立体配置のものである。それらの基は該カ
プラーの非拡散性を増大するかまたは該カプラーの反応
性を変更する基により置換されてもよく、または非置換
であることができる。バラスト基は結合基を含むことが
でき、それを介してバラスト基がカプラー成分に連結さ
れる。そのような結合基としてはオキシ、チオ、イミ
ノ、カルボニルオキシ、スルファモイル、スルホンアミ
ド、アミド、カルバモイルおよびアゾが挙げられる。好
ましいバラスト基としては、アルキル、アリール（置換
または非置換）、アルコキシ、アリールオキシ、アルキ
ルチオおよびアリールチオ基が挙げられ、その各々はま
た分子量条件を満たす限り 8〜32個の炭素原子を含む。
有用なバラスト基としては、ドデシル、トリデシル、テ
トラデカンアミド、２−クロロ−５−テトラデカンアミ
ドアニリノ、４−（４−ベンジルオキシフェニルスルホ
ニル）フェノキシ、３−テトラデシルフェノキシ、４−
ブチルスルホンアミドフェノキシ、４−（２，５−ジ−
ｔ−ペンチルフェノキシ）ブチルカルバモイル、２−エ
チル−２−（３−テトラデシルフェノキシ）アセトアミ
ド、２−〔４−（４−ベンジルオキシフェニルスルホニ
ル）フェノキシ〕−２−デシルアセトアミドおよび置換
アリール、例えばトリクロロフェニルが挙げられる。

【００２５】より好ましくは、バラスト基は、10〜24個
の炭素原子を有し且つ１もしくは複数のアミノ、アミ
ド、カルバモイル、スルホンアミドまたはスルファモイ
ル基により置換されたアルキル（分枝鎖または直鎖）、
アリールまたはアルコキシ（分枝鎖または直鎖）基であ
る。それらの基はアルキル（1 〜25個の炭素原子）、ア
ルコキシ（1 〜25個の炭素原子）、ハロ、フェニル、ま
たはアルキル（1 〜10個の炭素原子）によりもしくはハ
ロにより置換されたフェニルで置換されてもよい。その
ような好ましいバラスト基としては、アルキル、アルキ
ルアミド、アルキルアミノ、アルキルカルバモイル、ア
ルキルスルホンアミド、アルキルスルファモイル、アル
キルアミドアリールアミノ、アリールオキシ、アリール
オキシアルキルアミド、アリールアミノ、アリールアミ
ド、アリールカルバモイル、アリールスルホンアミドお
よびアリールスルファモイルが挙げられる。

【００２６】色生成性カプラーは、少なくとも150 の分
子量と少なくとも150 ℃の沸点を有する有機溶剤に可溶
であるという性質も有する。有用な有機溶剤の例として
は、ジブチルフタレート、２，４−ジ−ｎ−ペンチルフ
ェノール、Ｎ，Ｎ−ジエチルラウロアミド、ジ−ｎ−オ
クチルフタレート、ジ−２−エチルヘキシルフタレート
およびそれらの混合物が挙げられる。

【００２７】特に有用な非拡散性色生成性カプラーは構
造（II）〜（Ｖ）により表されるものである：

【００２８】

【化２】

【００２９】構造（II）中のＲ⁶ とＲ⁶ ′は独立的に、
水素、ハロ（例えばフルオロ、クロロまたはブロモ）、
-CONR⁹R¹⁰ 、-NR⁹COR¹⁰ 、-SO₂NR⁹R¹⁰、１〜６個の炭素
原子を有するアルキル（例えばメチル、イソプロピル、
ヘキシルおよびｔ−ブチル）または１〜６個の炭素原子
を有するアルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ、イソ
プロポキシおよびヘキソキシ）である。好ましくは、Ｒ
⁶ とＲ⁶ ′は独立的に水素またはハロであり、より好ま
しくはＲ⁶ が水素でありそしてＲ⁶ ′がハロ（例えばク
ロロ）である。

【００３０】構造（II）中のＲ⁷ は、フェニルである
か、または１もしくは複数のハロ（例えばフルオロ、ク
ロロまたはブロモ）により、１〜５個の炭素原子を有す
るアルキル（例えばメチル、エチル、イソプロピルおよ
びクロロメチル）によりもしくは１〜５個の炭素原子を
有するアルコキシ（例えばメトキシ、エトキシおよびイ
ソプロポキシ）により置換されたフェニルである。好ま
しくは、Ｒ⁷ はトリクロロフェニルである。

【００３１】更に、Ｒ⁸ は水素または上記に定義したよ
うな「脱離」基である。有用な脱離基も同じく上記に定
義したものである。好ましくは、構造（II）ではＲ⁸ は
ピバルアミドフェニルチオであり、そして構造（VI）で
はＲ⁸ は水素である。

【００３２】Ｒ⁹ は水素、１〜24個の炭素原子を有する
アルキル（例えばメチル、エチル、ｔ−ブチル、ヘキシ
ル、ドデシル、ペンタデシルおよび３−メチルオクチ
ル）、フェニル、またはＲ⁷ について定義したような１
もしくは複数のハロもしくはアルキル基により置換され
たフェニルである。好ましくは、Ｒ⁹ は水素である。Ｒ
¹⁰は水素またはBALLであり、ここでBALLは上記で定義し
たようなバラスト基である。

【００３３】Ｒ¹¹は、1 〜20個の炭素原子を有する置換
または非置換アルキル（例えばメチル、エチル、イソプ
ロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、オクチル、ノニ
ル、イソノニル、デシル、ドデシルおよびヘキサデシ
ル）、環中に6 〜14個の炭素原子を有する置換または非
置換炭素環式アリール（例えばフェニル、ナフチル、ア
ントリル、トリル、キシリル、カルバモイルフェニル、
３，５−ジクロロフェニルおよび４−シアノフェニ
ル）、複素環または上記で定義したBALLである。好まし
くは、Ｒ¹¹はアリールまたは複素環である。Ｒ¹¹が複素
環である時、それは炭素原子と少なくとも１つの窒素、
硫黄または酸素原子を有し、そして場合によりそれに結
合した１個または２個の縮合芳香族基（例えばベンゾま
たはナフト）を有する５員もしくは６員環である。Ｒ¹¹
を定義する上記基のいずれも、１または複数のハロ（例
えばフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、シア
ノ、カルボキシ、上記で定義した置換もしくは非置換ア
ルキル、上記で定義した置換もしくは非置換アリール、
カルバモイル、スルファモイル、アルキルホルムアミド
もしくはアリールホルムアミド（上記で定義したアルキ
ルまたはアリールを有する）、アルキルスルホンアミド
もしくはアリールスルホンアミド（上記で定義したアル
キルまたはアリールを有する）、1 〜12個の炭素原子を
有するアルコキシ、6 〜10個の炭素原子を有するアリー
ルオキシ、アルコキシカルボニル（上記で定義したアル
コキシを有する）、アリールオキシカルボニル（上記で
定義したアリールオキシを有する）、1 〜12個の炭素原
子を有するアシル、1 〜12個の炭素原子を有するアシル
オキシ、または上記で定義したBALL基により置換される
ことができる。

【００３４】構造Ｖ中のＸは、水素、ハロ（例えばクロ
ロまたはブロモ）またはフェノキシ（置換基を有するか
または有しない）である。好ましくは、クロロまたは非
置換のフェノキシである。構造II中のBALLは、好ましく
は上記で定義したようなアルキルまたはアリールであ
る。

【００３５】構造（II）を有する非拡散性色生成性カプ
ラーが好ましい。代表的な非拡散性色生成性カプラーを
下記に列挙する。構造（VI）が最も好ましい。

【００３６】

【化３】

【００３７】

【化４】

【００３８】

【化５】

【００３９】

【化６】

【００４０】

【化７】

【００４１】本発明の要素は、様々な製造または作業上
の利点のために通常組み込まれる１または複数の他の追
加物を含むこともできる。アッセイの最中該要素内部の
pHを6.5 〜11に維持する１または複数の緩衝剤が特に有
用である。該アッセイは好ましくは6.5 〜9 のpHで実施
され、8 〜8.5 のpHが最も好ましい。緩衝剤は該要素の
任意の区画中に存在することができる。許容される緩衝
剤としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、グリシン、ホウ酸塩およびＮ−トリス（ヒドロキシ
メチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸が挙げら
れる。

【００４２】該要素中に配合することができる試薬の量
は、一般に当業者の技術の範囲内である。より特別に
は、アミノペプチダーゼまたはトランスペプチダーゼ芳
香族基質は0.05〜1 g/m²の範囲で存在する。色生成性カ
プラーは通常0.05〜0.5 g/m²の量で存在する。酸化性化
合物がオキシダーゼである場合、通常有用な量は1000〜
50,000 I.U./m²である。酸化性化合物が酵素でない場
合、有用な量はオキシダーゼの酸化力に匹敵する酸化力
を提供するであろう量となるように容易に算出すること
ができる。例えば、エチレンジアミンペンタ酢酸（また
はその塩）については、モルに基づく量は0.1 〜2 モル
/m² であろう。

【００４３】本出願明細書中で使用する時、１ I.U. は
酵素活性の国際単位を表し、そして標準的pHおよび温度
条件下で１分間あたり１マイクロモルの基質の変換を触
媒するのに要する酵素活性の量として定義される。本明
細書中に記載のオキシダーゼ（例えばアスコルビン酸オ
キシダーゼ）についての標準条件は37℃の温度および7.
8 のpHである。

【００４４】本発明の一態様では、多層要素は、上述の
非拡散性色生成性カプラーと酸化性化合物とを含有する
第一試薬層、上述のアミノペプチダーゼのための芳香族
基質を含有する第二試薬層、および上述の多孔質展開層
を上に有する不活性の高分子支持体を含んで成り、前記
要素は更に上述の１または複数の層に緩衝剤を含んで成
る。

【００４５】本発明の好ましい態様では、多層要素は下
記の順序でおよび流体接触状態で、上述の非拡散性色生
成性カプラーと酸化性化合物とを含有する試薬層、場合
により下層、および酵素分析物のための芳香族基質を含
有する上述の多孔質展開層を上に有する不活性高分子支
持体を含んで成り、前記要素は更に上述の１または複数
の層の中に緩衝剤を含んで成る。

【００４６】通常試料と該要素との接触の２分以内に、
該要素中に生成されたいずれかの色素の１回目の分光光
度測定が行われる。分析物が或る期間に渡り反応する酵
素であるため、通常は数分後に２回目の測定が行われ
る。

【００４７】分析物の指標として生成される色素は、通
常400 〜800 nmの範囲内の波長で評価され、500 〜670
nmの波長での測定が好ましい。上記に化合物（VI）とし
て同定された最も好ましい色生成性カプラーは、540 nm
に最大波長を有する色素を提供する。

【００４８】

【実施例】

実施例１ ロイシンアミノペプチダーゼの測定用の多層
分析要素 下記に例示する要素は、常用の方法と溶剤を使って各層
の材料を塗布用分散液中に配合しそしてそれらを標準的
な塗布方法を使って指摘の順序で塗布することにより調
製した。

【００４９】

【表１】

【００５０】以下の方法で要素を用いてロイシンアミノ
ペプチダーゼを測定した。様々な量（50〜1500 I.U./リ
ットル）のロイシンアミノペプチダーゼを含む血清試料
（各10μＬ）を各要素の多孔質展開層上にスポットし
た。該要素を37℃でインキュベートしながら、６分間に
渡り540 nmで反射率濃度の読みを記録した。図１は、各
試料についての時間に関する生成した色素シグナルを示
し、これはアミノペプチダーゼが本発明の要素を使って
適切に測定できることを指摘する。

【００５１】実施例２ 好ましい分析要素およびアッセ
イ この実施例は、芳香族基質が展開層中に置かれているよ
うなロイシンアミノペプチダーゼ測定用の本発明の好ま
しい態様を説明する。

【００５２】この実施例の要素は、「第一試薬層」が削
除されていること以外は実施例１に示した要素と同じで
あった。基質Ｌ−ロイシン−３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリド（0.3 g/m²）を展開層に塗布した。実
施例１に記載のプロトコールを使ってアッセイを実施し
た。

【００５３】図２は、６分間に渡る色素シグナル（反射
率濃度）測定（500 〜1500 I.U. 分析物／リットル）の
結果を示す。この態様は、曲線がより急速に（一般に２
分以内に）直線になるため、実施例１に示したものを上
回る改善である。よって、基質を展開層に入れると、ア
ッセイを一層短時間で実施することができる。

【００５４】図３は、50〜1500 I.U. 分析物／リットル
を使って作成された検量線（活性／色素シグナルにより
測定された速度）である。

【００５５】

【発明の効果】本発明は、アミノペプチダーゼまたはト
ランスペプチダーゼ、例えばロイシンアミノペプチダー
ゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、システイン
アミノペプチダーゼ等のアッセイのための単純で比較的
迅速で且つ鋭敏な手段を提供する。この手段は乾式分析
システムの既知の利点を全てを有する。乾式要素は自動
化アッセイ装置に容易に適合でき、触感が乾燥してい
る。加えて、本発明は、移動しないので色素シグナルの
損失を引き起こさないであろう色生成性カプラーを該要
素中に効果的に含んでいる。更に、色生成性カプラーは
非毒性であり、高感度を提供する。展開層の使用は、生
物学的被検体中の不必要な物質から生じる干渉を有利に
減少させる。１または複数の区画中の緩衝剤の使用によ
って該要素中でアッセイpHが注意深く調節され、その結
果として感度が最適化される。ヘモグロビンまたはビリ
ルビンからの干渉が回避される。

【００５６】それらの利点は、特に、分析物のための芳
香族基質を含有する区画から離れた該要素の区画中に置
かれる或る種の色生成性カプラーによって達成される。
この色生成性カプラーは次の性質を有する： a) 親電子置換を受けることができる、 b) 少なくとも150 の分子量を有するバラスト基を含
む、 c) 少なくとも150 の分子量と少なくとの150 ℃の沸点
を有する有機溶剤に可溶である、および d) 芳香族基質により提供される第一アミノ含有反応体
の酸化形態とカプリングすると、400 〜800 nmの範囲内
に吸収を有する色素を提供する。

【００５７】該カプラーはバラスト（脚荷）を付けられ
ているため、他の層に移動することができない。しか
し、他の試薬が該要素の区画全体を容易に移動できるた
め、該カプラーは容易に他の試薬との反応に利用でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１に記載の要素を使った様々な
濃度（50〜1500 I.U. ／リットル）のロイシンアミノペ
プチダーゼの測定について時間に関して作成した反射率
濃度データを表すグラフである。

【図２】図２は、実施例２に記載の要素を使った様々な
濃度（50〜1500 I.U. ／リットル）のロイシンアミノペ
プチダーゼの測定について時間に関して作成した反射率
濃度データを表すグラフである。

【図３】図３は、50〜1500 I.U. ／リットルの酵素分析
物を使ったロイシンアミノペプチダーゼ測定用の検量線
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン ウィリアム ハーダー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14606, ロチェスター，テリークレスト レーン ６

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酸化性化合物と非拡散性色生成性カプラ
   ーを含有する区画を含んで成る分析要素であって、 前記要素は、異なる区画中に、アミノペプチダーゼまた
   はトランスペプチダーゼと反応するとフェニル環上に第
   一アミノ基を有し且つ前記第一アミノ基に対してオルト
   位またはパラ位にヒドロキシ、アミノまたは置換アミノ
   基を有する反応体を提供する芳香族基質を含有し、そし
   て前記要素は、アミノペプチダーゼまたはトランスペプ
   チダーゼについての生物学的流体のアッセイの最中 6.5
   〜11のpHを提供するのに有効な量で存在する緩衝剤を更
   に含んで成り、 前記非拡散性色生成性カプラーが、 a) 親電子置換を受けることができる、 b) 少なくとも150 の分子量を有するバラスト基を含
   む、 c) 少なくとも150 の分子量と少なくとの150 ℃の沸点
   を有する有機溶剤への可溶性、および d) 前記芳香族基質により提供される第一アミノ含有反
   応体の酸化形態とカプリングすると、400 〜800 nmの範
   囲内に吸収を有する色素を提供するという性質を有し、 第二区画中の前記酸化性化合物が、前記第一アミノ含有
   反応体の前記第一アミノ基を酸化して、色素を生成する
   前記色生成性カプラーとの反応に適するようにする化合
   物である、ことを特徴とする前記分析要素。
2. 【請求項２】 次の段階： Ａ．流体試料を分析要素と接触せしめる段階であって、 ここで前記分析要素は酸化性化合物と非拡散性色生成性
   カプラーを含有する区画を含んで成り、 前記要素は、異なる区画中に、アミノペプチダーゼまた
   はトランスペプチダーゼと反応するとフェニル環上に第
   一アミノ基を有し且つ前記第一アミノ基に対してオルト
   位またはパラ位にヒドロキシ、アミノまたは置換アミノ
   基を有する反応体を提供する芳香族基質を含有し、そし
   て前記要素は、アミノペプチダーゼまたはトランスペプ
   チダーゼについての生物学的流体のアッセイの最中 6.5
   〜11のpHを提供するのに有効な量で存在する緩衝剤を更
   に含んで成り、 前記非拡散性色生成性カプラーが a) 親電子置換を受けることができる b) 少なくとも150 の分子量を有するバラスト基を含む c) 少なくとも150 の分子量と少なくとの150 ℃の沸点
   を有する有機溶剤への可溶性、および d) 前記芳香族基質により提供される第一アミノ含有反
   応体の酸化形態とカプリングすると、400 〜800 nmの範
   囲内に吸収を有する色素を提供するという性質を有し、 第二区画中の前記酸化性化合物が、前記第一アミノ含有
   反応体の前記第一アミノ基を酸化して、色素を生成する
   前記色生成性カプラーとの反応に適するようにする化合
   物である段階；そして Ｂ．400 〜800 nmの範囲内の波長で色素の生成を検出す
   る段階 を含んで成るアミノペプチダーゼまたはトランスペプチ
   ダーゼの測定方法。