JPH07215958A - ベンゾピラン系化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 骨吸収抑制作用を有する新規な生理活性物質
を提供すること。 【構成】 微生物から産生される式

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物から産生され骨
吸収抑制作用を有するベンゾピラン系化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨は骨形成と骨吸収（溶解）の均衡が保
たれていることで、その強度が維持されている。骨粗鬆
症は骨吸収が亢進してしまうことで骨が脆くなり、骨折
などを起こし易くなる慢性疾患で、特に閉経後の女性に
多く見られる。従って亢進した骨吸収を抑制する薬剤は
骨粗鬆症治療薬となりうると考えられる。骨吸収を抑制
する薬剤としてはウナギおよびサケのカルシトニンが臨
床的に用いられている。骨粗鬆症のような慢性疾患では
服用できる薬剤が理想的であるが、カルシトニンはアミ
ノ酸が３２個結合した分子量約３，４００のペプチドで
あることから消化管からの吸収性は低く注射剤として利
用しているのが現状である。そのため、服用可能で骨吸
収を抑制する薬剤の出現が待たれている（中村哲朗，
「治療学」，ライフサイエンス出版株式会社，１９９１
年）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、骨吸
収抑制作用を有する新規な生理活性物質を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために自然界より多数の菌株を分離し、その菌
株の培養物について種々検討した結果、ある種の菌株の
生産する化合物が強い骨吸収抑制作用を有することを見
いだし、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、式

【０００６】

【０００７】で表わされるベンゾピラン系化合物であ
る。

【０００８】本発明のベンゾピラン系化合物（以下、こ
れをＮＧ−２４６と称する。）を生産する菌株は、本発
明者らが埼玉県大宮市吉野町にて採取した落葉から新た
に分離した菌株であり、微生物の名称「Ｓｔａｃｈｙｂ
ｏｔｒｙｓ ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ Ｆ−４７０８」お
よび受託番号「微工研菌寄第１２６６０号（ＦＥＲＭＰ
−１２６６０）」として、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。

【０００９】この菌株の菌学的性状を以下に示す。 ［形態］本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、オ
ートミール寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地等で良好に生育
し、また胞子の形成も良好である。本菌株がバレイショ
・ブドウ糖寒天培地上、２６℃、１４日間の培養で形成
したコロニーを光学顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を
有し高度に分岐しており、ロープ状の菌糸束を多数形成
している。分生子柄は菌糸束から側生し、単生か稀に分
岐する。表面は滑面、無色で隔壁を有し、先端付近に脱
落性の顆粒が多数付着している。高さは４５〜８３μ
ｍ、幅は基部で２．９〜４．８μｍ、先端付近ではやや
先細りとなり１．７〜２．９μｍである。フィアライド
は分生子柄の先端に複数個形成され、棍棒形、表面は滑
面、大きさは６．７〜１１．４×２．９〜４．８μｍ
（膨潤部）である。分生子は長円形、暗灰緑色、大きさ
は３．８〜５．９×２．７〜２．９μｍ、フィアライド
の先端で粘球状の塊となる。また、走査型電子顕微鏡で
分生子の表面を観察すると、わずかに粗面を呈してい
る。なお、培養を３週間に延長したが有性生殖器官の形
成は認められなかった。

【００１０】［培地上での諸性状］各種培地上で、２６
℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果を次の表１
に示した。なお色の表示は日本規格協会、ＪＩＳ色名帳
（１９８５）の系統色名を引用した。

【００１１】

【表１】

【００１２】［生理的性質］ １）生育ｐＨ範囲および最適ｐＨ 本菌株はＹｐＳｓ液体培地中２６℃においてｐＨ４〜１
０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜７である。 ２）生育温度範囲および最適温度 本菌株はｐＨ６．０のサブロー液体培地において、１２
〜３１℃の範囲で生育し、最適温度は２４〜２７℃であ
る。 ３）好気性，嫌気性の区別；好気性

【００１３】以上の形態的特徴および培養上の性状か
ら、本菌株が不完全菌亜門、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ
属の１菌種であることが明らかであり、宇田川俊一、椿
啓介編『菌類図鑑』（１９７８年）、Ｍ．Ｂ．Ｅｌｌｉ
ｓ著『ＤＥＭＡＴＩＡＣＥＯＵＳ ＨＹＰＨＯＭＹＣＥ
ＴＥＳ』（１９７１年）および『ＭＯＲＥ ＤＥＭＡＴ
ＩＡＣＥＯＵＳ ＨＹＰＨＯＭＹＣＥＴＥＳ』（１９７
６年）、Ｊｏｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，ＭＹＣＯＴＡ
ＸＯＮ，３，ｐｐ４０９−４８５（１９７６）に報告さ
れている多くの既知菌株と比較検討した。その結果、本
菌株はＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｐａｒｖｉｓｐｏｒ
ａ ｈｕｇｈｅｓに最も近い性状を示すことが明かとな
り、本菌株を「Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｐａｒｖｉ
ｓｐｏｒａＦ−４７０８」と命名した。

【００１４】ＮＧ−２４６の生産は、大略一般の発酵生
成物を生産する場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地
でＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ
Ｆ−４７０８を好気的条件下で培養することにより行
う。

【００１５】培地は主として液体培地を用い、炭素源、
窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先
駆物質、消泡剤を加えることができ、ｐＨは６前後に調
整する。炭素源としては、例えばグルコース、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまた
は混合して用いる。窒素源としては、例えば酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独かまたは混
合して用いる。無機塩としては、例えば燐酸一カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウ
ムなどを単独かまたは混合して用いる。消泡剤としては
アデカノール、シリコン化合物などを用いることができ
る。

【００１６】培養方法としては振盪培養、通気撹拌培養
などの好気的培養が適しており、ｐＨ５〜７、２５〜３
０℃で３〜５日間、望ましくはｐＨ５〜７、２５〜２７
℃で４日間培養する。この培養により生産されたＮＧ−
２４６を単離するには、発酵生産物を採取する一般的な
方法に準じて行えばよい。

【００１７】すなわち、培養終了後、遠心分離または濾
過により分離した菌体および上澄液からＮＧ−２４６を
低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出し、こ
の抽出液を減圧濃縮し有機溶媒を除去した後、酢酸エチ
ル、ベンゼン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に
転溶し、これを減圧濃縮してシロップ状とする。このシ
ロップを再度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、ア
セトン、メタノールなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲ
ルを用いたカラムクロマトグラフィー、逆相分配用シリ
カゲルＯＤＳを充填した高速液体クロマトグラフィーお
よびゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付すことによ
りＮＧ−２４６を精製、単離することができる。以上の
精製によって得られた本発明の目的物質であるＮＧ−２
４６は、その分子量、紫外線吸収スペクトル、¹Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトル、¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル等の解析結果
より前記式のように構造が決定された。

【００１８】ＮＧ−２４６の理化学的性質は以下の通り
である。 （ａ）ＥＩマススペクトル： ＥＩ ｍ／ｚ ３７０（Ｍ−Ｈ₂Ｏ）⁺ （ｂ）ＳＩマススペクトル： ＳＩ ｍ／ｚ ３８７（Ｍ−Ｈ）^- （ｃ）ＨＲＥＩマススペクトル： 実測値 ３７０．２１４８ 理論値 ３７０．２１４３（Ｃ₂₃Ｈ₃₂Ｏ₅−Ｈ₂Ｏとして
計算） （ｄ）分子量：３８８ （ｅ）分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₂Ｏ₅ （ｆ）紫外線吸収スペクトル： λmax ２０８ｎｍ（ε＝７２３００） ２２８ｎｍ（ε＝２０１００） ２８０ｎｍ（ε＝６２００） （メタノール溶液中で測定） （ｇ）ＩＲ吸収スペクトル： Ｎｅａｔ法で測定した結果を図１に示す。 （ｈ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル： ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４００ＭＨｚで測定した結果を図２
に示す。 （ｉ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル： ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１００ＭＨｚで測定した結果を図３
に示す。 （ｊ）溶剤に対する溶解性： メタノール、エタノール、アセトンに可溶 ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶 水に不溶 （ｋ）呈色反応； 陽性：Ｈ₂ＳＯ₄、Ｉ₂、ＦｅＣｌ₃ 陰性：ニンヒドリン （ｌ）塩基性、酸性、中性の区別：酸性 （ｍ）物質の色：白色粉末

【００１９】

【発明の効果】本発明の化合物は、骨吸収に対し優れた
抑制作用を有するので、骨粗鬆症、高カルシウム症など
の骨代謝異常に基づく疾患の治療薬として有用である。

【００２０】

【実施例】以下、実施例および試験例を挙げて本発明を
具体的に説明する。 実施例 １００ｍｌ当りグルコース２ｇ、ポリペプトン０．５
ｇ、酵母エキス０．２ｇ、リン酸一カリウム０．１ｇお
よび硫酸マグネシウム０．０５ｇからなるｐＨ６の無菌
液体培地にＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｐａｒｖｉｓｐ
ｏｒａ Ｆ−４７０８株を接種し、２６℃、９６時間振
盪培養した。次に、５０Ｌ容培養ジャー３基および２０
０Ｌ容培養タンクを用いて、種培養と同じ組成の無菌培
地２１０Ｌに前記種培養液２．１Ｌを接種し、２６℃、
９６時間撹拌通気培養した。

【００２１】培養終了後遠心分離機で上澄液と菌体に分
離した。得られた菌体をアセトンで２回抽出し、これを
減圧濃縮してアセトンを除去した後、半量の酢酸エチル
で４回抽出した。この抽出液を合わせ無水硫酸ナトリウ
ムで脱水後、減圧濃縮乾固し褐色シロップ１７０ｇを得
た。

【００２２】この褐色シロップ状物質をクロロホルムに
溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［ワコーゲ
ルＣ−２００（商品名、和光純薬社製）］の４．５Ｌカ
ラムに吸着させた。クロロホルムで洗浄後、クロロホル
ム−メタノール（９８：２、９６：４）の混合溶媒で順
次溶出し、この区分を除去した。次にクロロホルム−メ
タノール（９２：８、９０：１０）の混合溶媒で順次溶
出を行い、それを減圧乾固し褐色物質２０．８４ｇを得
た。

【００２３】シリカゲルカラム精製で得られた褐色物質
を少量のヘキサン−アセトン（９０：１０）の混合溶媒
に溶解し、ヘキサン−アセトン（９０：１０）の混合溶
媒で調製したシリカゲル［ワコーゲルＣ−２００（商品
名、和光純薬社製）］のカラム６００ｍｌに吸着させ
た。ヘキサン−アセトン（９０：１０、８５：１５）の
混合溶媒で順次溶出しこの区分を除去した。次に、ヘキ
サン−アセトン（８０：２０）の混合溶媒で溶出を行
い、この区分を減圧乾固し褐色物質１．７３ｇを得た。

【００２４】この褐色物質を少量のクロロホルム−メタ
ノール−ヘキサン（５：１：５）の混合溶媒に溶解し、
セファデックスＬＨ−２０（商品名：ファルマシア社
製）を用いクロロホルム−メタノール−ヘキサン（５：
１：５）の混合溶媒でゲル濾過し、得られた活性区分を
集め減圧乾固し褐色物質０．３９ｇを得た。

【００２５】この褐色物質を少量のメタノールに溶解
し、この溶液を５５％アセトニトリルを移動相とした分
取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：センシュー
科学社製３１１０；カラム：センシューパックＯＤＳ−
４２５１−Ｎ（２０φ＊２５０ｍｍ）］を用い、ＵＶ吸
収２１５ｎｍでモニターしながら流速１０ｍｌ／ｍｉｎ
条件で１７．６〜２１．６ｍｉｎに溶出されるピークを
それぞれ分取した。これらの区分を酢酸エチルで抽出
し、その抽出液を減圧濃縮乾固してＮＧ−２４６の白色
粉末３２．０ｍｇを得た。

【００２６】試験例［骨吸収抑制活性試験］ （１）骨吸収抑制活性の測定法 ５日齢のウサギより大腿骨および頸骨を摘出後ハサミで
細切し、５％ウシ胎児血清を含むα−ミニマムエッセン
シャルメジウム（α−ＭＥＭ）中で３０秒攪拌した。３
分間静置後、分離した破骨細胞を含む細胞懸濁液の上清
を、直径６ｍｍ、厚さ１５０μｍにスライスした象牙片
を入れた９６ｗｅｌｌプレートに、４×１０⁵／２５０
μｌ／ｗｅｌｌになるように播種した。３７℃、５％イ
ンキュベーター中で２時間放置し細胞を象牙片上に接着
させた後、上清を取り除き、ジメチルスルホキシドにて
所要濃度に調製した本発明化合物を添加した５％ＦＢＳ
を含むα−ＭＥＭを１００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。３７
℃、１０％インキュベーター中で２４時間培養した後、
上清および象牙片上の細胞を取り除いた。アシッドヘマ
トキシリン原液を５０μｌ／ｗｅｌｌ入れ、象牙片上に
できた吸収窩を５分間染色した後、蒸留水で３回洗浄し
た。顕微鏡下で染色された吸収窩の数を計測し、化合物
無添加の対照群で形成された吸収窩の数を１００％とし
たときの化合物添加群の吸収窩数を算出し、５０％骨吸
収抑制濃度（ＩＣ₅₀値）を求めた。その結果、本発明化
合物のＩＣ₅₀値は３．３μｇ／ｍｌでなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｎｅａｔ法で測定したＮＧ−２４６の赤外線吸
収スペクトルを示す。

【図２】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、４００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−２４６の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】ＤＭＳＯ−ｄ₆中、１００ＭＨｚで測定したＮ
Ｇ−２４６の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 菅原 孝子 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 で表されるベンゾピラン系化合物