JPH08196274A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 水素イオン濃度（ｐＨ）の変化により水溶性
と水不溶性の可逆的形態を有する、アミノ酸（共）重合
体と酵素とが結合した固定化酵素。 【効果】 簡単な方法により酵素を回収でき、また再利
用することが可能となり、また均一系での反応が可能で
あり、かつ反応効率も向上した固定化酵素が提供でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素に関する。
さらに詳しくは、水溶性アミノ酸（共）重合体に酵素を
固定化した固定化酵素であり、反応液の水素イオン濃度
（ｐＨ）の変化により水溶性と水不溶性の可逆的形態を
有する固定化酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、酵素反応が種々の産業分野にて利
用されるようになってきた。その場合の酵素反応の多く
は、溶液に可溶な状態の酵素による反応であった。そし
て、反応に用いた酵素を回収し、再利用することは、比
較的高価な酵素を効率よく使用でき経済的であるととも
に、廃液から酵素成分を取り除くことにより水質汚濁等
の環境公害問題を解決できる。しかしながら、反応に用
いた酵素を反応溶液から回収し、再利用するためには、
煩雑な分離・精製技術を駆使しなくてはならず、経済的
および技術的に非常に困難な問題を有している。

【０００３】このような問題を解決するべく、酵素を反
応溶液に不溶性の担体に固定化することが行なわれてい
る。この酵素を担体に固定化した固定化酵素を用いるこ
とにより反応液や生成物から酵素を容易に回収すること
ができる。また、固定化酵素をカラム等に封入すること
で、連続反応が可能となり、生産効率の向上も望める。
さらに、従来法では酵素反応制御のために熱処理や化学
処理により当該酵素を失活させる手段が度々採用されて
いたが、固定化酵素を用いることにより容易に分離する
ことができ、効率よく反応を制御できる等多くの利点が
考えられる。

【０００４】固定化酵素の製造技術は、古くから提案さ
れており、例えば酵素を、活性炭、シリカゲル、アルミ
ナ等の無機担体、セルロース、デンプン、キチン、アル
ギン酸、コラーゲン等の天然高分子担体、またはポリア
クリルアミド、ポリアミノポリスチレン、エチレン−マ
レイン酸誘導体等の合成高分子担体に、物理吸着、イオ
ン結合、共有結合、マイクロカプセル化等の方法で固定
化している。

【０００５】しかしながら、従来の固定化酵素を用いる
反応においては、酵素を不溶性担体に結合させているた
め、反応系が不均一となり、酵素の高次構造の変化が生
じたり、不溶性担体との立体的影響や静電的な影響によ
り基質と酵素との相互作用が変化したりする可能性が生
じ、結果的に長時間の反応が必要となることがある。

【０００６】そこで、反応中は水溶性となり均一反応系
の場を提供し、酵素それ自身は固定化酵素としての性質
をもつ固定化酵素が望まれ、これを目的とした固定化酵
素が開示されている（特開昭６２−１４７８２号公報参
照）。該固定化酵素は水不溶性とするためにカルシウ
ム、マグネシウム等の金属塩を加えたり、また水溶性と
するためにその金属塩を除くためのエチレンジアミン四
酢酸、クエン酸等のキレート剤を用いる必要がある。し
かし、多くの酵素はその活性を発現するためには金属イ
オンを要求するために、キレート剤を用いる上述の固定
化酵素では使用できる酵素に制限が生じる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、前記金属塩やキレート剤を使用しないで水溶性およ
び水不溶性の可逆的形態をとることができる固定化酵素
を提供することにある。

【０００８】本発明の他の目的は、使用する酵素に制限
が少ない固定化酵素を提供することにある。本発明のさ
らに他の目的は、均一系の反応を行なうことが可能な固
定化酵素を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、前記本
発明の目的は、水素イオン濃度（ｐＨ）の変化により水
溶性と水不溶性の可逆的形態を有する、アミノ酸（共）
重合体と酵素とが結合した固定化酵素により達成され
る。

【００１０】即ち、本発明の固定化酵素について簡単に
説明すると、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等
のポリアミノ酸と酵素を固定化した固定化酵素の場合
は、溶液の水素イオン濃度が中性付近では、その固定化
酵素は水溶性となり、均一系の反応として酵素反応を効
率よく進めることができ、所定の反応後、反応溶液のｐ
Ｈを酸性にすることにより、その固定化酵素は水不溶性
に変化する。このように水不溶性となった固定化酵素は
反応系から簡便に取り除くことができる。従ってこの固
定化酵素を用いる方法は、容易に酵素を反応物と分離で
きると共に、酵素の再利用が可能である。

【００１１】また、ポリリシン等のポリアミノ酸を用い
た固定化酵素の場合は、溶液の水素イオン濃度が中性付
近では水溶性であり、反応溶液のｐＨをアルカリ性にす
ることにより、水不溶性に変化する。

【００１２】以下、本発明の固定化酵素についてさらに
詳細に説明する。本発明の固定化酵素の担体として使用
するアミノ酸（共）重合体は、溶解された溶液のｐＨ変
化で水溶性と水不溶性の可逆的形態変化を有するもので
あり、アミノ酸の一部または二種以上を重合したポリア
ミノ酸、ポリアミノ酸よりなるブロック成分（Ａ）と他
の重合体よりなるブロック成分（Ｂ）とにより構成され
るブロック共重合体、例えば（Ａ）−（Ｂ）ブロック共
重合体、（Ａ）−（Ｂ）−（Ａ）ブロック共重合体等が
挙げられる。

【００１３】このようなアミノ酸（共）重合体において
は、前記可逆的形態変化をより明確にさせるために、ア
ミノ酸成分としてα−アミノ酸、例えばグルタミン酸、
アスパラギン酸、リシン等を２０モル％以上（共）重合
することが好ましい。共重合割合が２０モル％より少な
いと溶液のｐＨ変化により十分な水溶性−水不溶性の可
逆的形態変化をとることができなくなる。アミノ酸の重
合は公知の方法を用いればよく、例えばＮ−カルボキシ
−α−アミノ酸無水物の開環重合法、各種活性エステル
や縮合剤を用いる方法等が知られている。本発明におけ
るアミノ酸（共）重合体の平均重合度は、５〜５,００
０の範囲が好ましく、特に好ましくは１０〜１,０００
である。平均重合度が５より小さいと、ｐＨを変化させ
た場合の溶解度の変化が小さく、分離を目的としたｐＨ
での溶解度が高すぎて、分離が困難となる。一方、平均
重合度が５,０００を越えると反応系の粘度が高くなり
取り扱いに不便が生じる。

【００１４】前述のブロック共重合体の製造方法として
は、例えばブロック成分（Ｂ）を構成する重合体の末端
の一方または両方に重合開始能を有するアミノ基を有し
ているものを用い、これを重合開始剤としてＮ−カルボ
キシ−α−アミノ酸無水物の開環重合を進めることによ
って得られる。

【００１５】本発明における酵素とアミノ酸（共）重合
体との結合は、共有結合法あるいはイオン結合法により
達成される。共有結合法による結合は、ポリアミノ酸の
側鎖のカルボキシル基、アミノ基、水酸基またはスルホ
ヒドリル基や末端のカルボキシル基またはアミノ基と、
酵素のカルボキシル基、アミノ基、水酸基、スルホヒド
リル基等との間での反応により達成されるが、その反応
方法はいかなる方法を用いてもよい。例えばペプチド法
を利用するならば、アミノ酸（共）重合体の側鎖あるい
は末端のカルボキシル基をアジド、クロリドまたはイソ
シアナート等の誘導体とし、これと酵素のアミノ基と反
応させる方法、あるいはカルボジイミド試薬やウッドワ
ード試薬Ｋのような縮合試薬を用いて、アミノ酸（共）
重合体のカルボキシル基やアミノ基と酵素のカルボキシ
ル基やアミノ基との間で反応させる。また、アルキル化
法では、アミノ酸（共）重合体をハロゲン化アセチル誘
導体、トリアジニル誘導体、ハロゲン化メタクリル誘導
体で活性化し、酵素のアミノ基、フェノール性の水酸
基、チオール基等と反応させる。あるいは、アミノ酸
（共）重合体と酵素のアミノ基の間をグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネートの如き架橋剤を用
いて結合させる反応を用いることができる。これらの中
では、グルタルアルデヒドを用いる方法が、簡便であり
特に好ましい。なお、酵素に結合するアミノ酸（共）重
合体は、酵素１分子に対して２０分子以下であるのが望
ましい。酵素１分子当りに結合した共重合体分子の数が
２０分子を越えると、酵素分子の構造に影響を与えた
り、酵素反応を阻害する危険性がある。好ましい割合は
酵素１分子当り、アミノ酸（共）重合体１〜１５分子の
範囲である。

【００１６】本発明における酵素としては、例えばアミ
ノペプチダーゼ、キモトリプシン、パパイン、ウロキナ
ーゼ、ウレアーゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、プ
ロテアーゼ、グルコースフォスファターゼ、アミラー
ゼ、キチナーゼ、リゾチーム、セルラーゼ、インベルタ
ーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、各
種制限酵素（エンドデオキシリボヌクレアーゼ）等の加
水分解酵素；リシンラセマーゼ、ＵＤＰガラクトースエ
ピメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、乳酸ラセマー
ゼ、リシンアミノムターゼ等の異性化酵素；グリシンメ
チルトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、リシン
アセチルトランスフェラーゼ、グルタミルトランスフェ
ラーゼ、フォスフォリラーゼ、ヘキソキナーゼ、フォス
フォグリセロムターゼ、グルタミン酸アミノトランスフ
ェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、
ロイシンアミノペプチダーゼ、クレアチンホスホキナー
ゼ等の転移酵素；アルコールデハイドロゲナーゼ、アル
デヒドデハイドロゲナーゼ、フマレートリダクターゼ、
ラクテートデハイドロゲナーゼ、グルコースデハイドロ
ゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アミノ酸オキシダ
ーゼ、ニコチネートデハイドロゲナーゼ、ハイドロキシ
ルアミンオキシターゼ、グルタチオンデハイドロゲナー
ゼ、シトクロムｃオキシターゼ、カタラーゼ、ペルオキ
シダーゼ、リポオキシゲナーゼ、スーパーオキサイドデ
ィスムターゼ等の酸化還元酵素；オルニチンデカルボキ
シラーゼ、リシンデカルボキシラーゼ、エノラーゼ、ト
リプトファンシンセターゼ、アデニレートシクラーゼ等
のリアーゼ；ｔＲＮＡシンセターゼ、アセチルＣｏＡシ
ンセターゼ、グルタミンシンセターゼ等のリガーゼを挙
げることができる。

【００１７】本発明の固定化酵素は、溶液の水素イオン
濃度（ｐＨ）により水溶性と水不溶性の状態をとるが、
その水素イオン濃度範囲は用いるアミノ酸（共）重合体
の種類により異なる。従って、用いる酵素の反応最適ｐ
Ｈにより用いるアミノ酸（共）重合体の種類を選択す
る。

【００１８】例えば担体としてポリグルタミン酸を用い
た場合、溶液のｐＨが３以下であると本発明の固定化酵
素は水不溶性となり、ｐＨが４以上では固定化酵素は水
溶性となる。従って、このような固定化酵素を用いるこ
とによって、中性あるいはアルカリ性溶液中にて均一系
で酵素反応を効率よく進めることができ、所定の時間反
応後、溶液を酸性にすることにより固定化酵素を析出さ
せ、遠心分離等によって反応系から容易に取り出すこと
ができる。このような方法によれば、酵素反応の後処理
が簡便になるのみならず、取り出した固定化酵素を再び
中性あるいはアルカリ性にすることにより、再び水溶性
の固定化酵素として再利用できることになる。また、担
体としてポリリシンを用いた場合には、得られる固定化
酵素はポリグルタミン酸の場合と逆にアルカリ性で水不
溶性となり、中性あるいは酸性で水溶性となる。

【００１９】本発明の固定化酵素の溶液の水素イオン濃
度（ｐＨ）の調整は、既存の如何なる方法にても実施で
きるが、簡便には、酸性にするためには塩酸、硫酸、硝
酸、リン酸、ほう酸等の無機酸または酢酸、クエン酸、
しゅう酸、乳酸等の有機酸を、アルカリ性にするには、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等の無
機アルカリまたはエタノールアミン、水酸化トリメチル
アンモニウム等の有機アルカリを用いて調整することが
できる。その際、高濃度の酸やアルカリを用いると局所
的に酵素が失活するおそれがあるので、０.１〜２Ｎ程
度の濃度で調整するのが好ましい。

【００２０】このように本発明による水溶性と水不溶性
の可逆形態を有する固定化酵素は、酵素反応における反
応効率が高く、また安定性に優れ、かつ簡単な操作で酵
素を反応系から取り出すことができ、また再利用に提供
することができるという優れた固定化酵素である。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。

【００２２】実施例１ γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボン酸無水物
をトリエチルアミンを重合開始剤としてジクロロメタン
中で室温下３日間開環重合した。得られたポリ−γ−メ
チル−Ｌ−グルタミン酸（ＰＭＬＧ）１.５ｇに０.７５
重量％水酸化ナトリウム水−エタノール（１：３（重
量）として）溶液１００ｍｌを加え、４５℃で１時間加
水分解反応させ、その後通常法で精製、乾燥を行ない、
ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＬＧ）を得た（平均重合
度：２００）。合成したＰＬＧ０.２ｇをリン酸緩衝液
（ｐＨ７.４）の１０ｍｌに溶解し、５重量％濃度でリ
ン酸緩衝液に溶解しておいたセルラーゼ（Tricoderma r
eesei、Sigma製）を０.５ｍｌ添加し混合した。その混
合溶液に２０重量％グルタルアルデヒド水溶液５０ｍｌ
を徐々に滴下し、そのまま４℃で２時間反応させること
によりＰＬＧにセルラーゼを固定化し、固定化セルラー
ゼを作製した。

【００２３】反応終了時の溶液は無色透明であった。そ
の後酢酸を添加してｐＨを３以下とすると、溶液全体が
白濁し、固定化セルラーゼが水不溶性となり、析出し
た。この溶液の遠心分離操作を行ない、上澄層を除去
し、固定化セルラーゼの濃厚溶液を得た。次いでこの溶
液の固定化セルラーゼの濃度を求め、これを基に、１％
濃度になるようにリン酸緩衝液にて溶解した。この時、
溶液は無色透明であった。この固定化セルラーゼの溶液
のｐＨによる状態の変化を測定するために、１Ｎ塩酸あ
るいは１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて溶液のｐＨを変化
させ、そのときの溶液の光透過率を測定した。結果を図
１に示す。この図１は、ｐＨの変化によって固定化セル
ラーゼが水不溶性となった場合には、溶液が白濁し、透
過光が遮へいもしくは散乱されて、光透過率が極めて低
くなることを示すものであって、溶液のｐＨを酸性にす
ることで固定化セルラーゼが、均一に溶解している状態
から、不溶となり析出することが示されている。

【００２４】作製した固定化セルラーゼをｐＨ５の酢酸
緩衝液に１重量％濃度になるように溶解し、この溶液５
ｍｌを１５ｍｌ遠心管に注いだ。基質としてカルボキシ
メチルセルロース（和光純薬社製）の１重量％酢酸緩衝
溶液を５ｍｌ、固定化セルラーゼの入った遠心管に加
え、３７℃で２時間反応させた。その後、反応液に０.
１Ｎ塩酸を滴下しｐＨを３以下とし、固定化セルラーゼ
を水不溶性にした後、遠心分離により反応系から除い
た。反応液を一部とり、生成したグルコース量をグルコ
ース定量キット（グルコースＢテストワコー、和光純薬
社製）を用いて定量し、酵素活性を求めた。分離した固
定化セルラーゼは再度酢酸緩衝液に溶解し、再び基質を
加えて同様の酵素反応を実施した。この操作を数回繰り
返し、酵素活性の変化を調べた。その結果を表１に示
す。若干酵素活性が減少しているが、数回の再使用でも
十分な活性を保持していることが分かる。

【００２５】実施例２ γ−メチル−Ｄ−グルタミン酸−Ｎ−カルボン酸無水物
をトリエチルアミンを重合開始剤としてジクロロメタン
中で室温下３日間開環重合した。得られたポリ−γ−メ
チル−Ｄ−グルタミン酸を実施例１と同様の方法で加水
分解、精製を行ない、平均重合度２００のポリ−Ｄ−グ
ルタミン酸（ＰＤＧ）を得た。このＰＤＧを実施例１と
同様の方法でセルラーゼを固定化して、実施例１と同様
の方法で酵素活性測定及びその再使用による活性の変化
を調べた。結果を表１に示す。

【００２６】実施例３ ε−ベンジル−Ｌ−リシン−Ｎ−カルボン酸無水物をト
リエチルアミンを重合開始剤としてジクロロメタン中で
室温下３日間開環重合した。得られたポリ−ε−ベンジ
ル−Ｌ−リシン（ＰＢＬＬ）を５倍当量の３３重量％臭
素酸／酢酸溶液で室温で８時間加水分解反応を行ない、
ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）を得た（平均重合度：２０
０）。得られたＰＬＬを実施例１と同様の方法でセルラ
ーゼに固定化し、ＰＬＬ固定化セルラーゼを作製した。
この固定化セルラーゼを実施例１と同様に１重量％濃度
になるようにリン酸緩衝液にて溶解し、１Ｎ塩酸あるい
は１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて溶液のｐＨを変化さ
せ、そのときの溶液の光透過率を測定した。結果を図１
に示す。図１には、実施例１とは逆にアルカリ性ｐＨに
することで固定化セルラーゼが均一に溶解している状態
から不溶となり析出することが示されている。

【００２７】作製した固定化セルラーゼをｐＨ５の酢酸
緩衝液に１％濃度になるように溶解し、この溶液５ｍｌ
を１５ｍｌ遠心管に注いだ。基質としてカルボキシメチ
ルセルロース（和光純薬社製）の１％酢酸緩衝溶液を５
ｍｌ、固定化セルラーゼの入った遠心管に加え、３７℃
で２時間反応させた。反応液に０.１Ｎ水酸化ナトリウ
ムを滴下しｐＨを１０以上にして固定化セルラーゼを水
不溶性にした後、遠心分離により反応系から除いた。反
応液を一部とり、生成したグルコース量をグルコース定
量キット（グルコースＢテストワコー、和光純薬社製）
を用いて実施例１と同様にして酵素活性を求めた。分離
した固定化セルラーゼは再度酢酸緩衝液に溶解し、再び
基質を加えて同様の酵素反応を実施した。この操作を数
回繰り返し、酵素活性の変化を調べた。結果を表１に示
す。

【００２８】実施例４ β−メチル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水
物をトリエチルアミンを重合開始剤としてジクロロメタ
ン中で室温下３日間開環重合した。得られたポリ−β−
メチル−Ｌ−アスパラギン酸を実施例１と同様の方法で
加水分解、精製を行ない、平均重合度２００のポリ−Ｌ
−アスパラギン酸（ＰＬＡ）を得た。このＰＬＡを実施
例１と同様の方法でセルラーゼを固定化して、実施例１
と同様の方法で酵素活性測定及びその再使用による活性
の変化を調べた。結果を表１に示す。

【００２９】実施例５ γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−Ｎ−カルボン酸無水
物を片末端をアミン変性した分子量５０００のポリブタ
ジエンを重合開始剤としてジクロロメタン中で室温下３
日間開環重合した。得られたポリ−γ−ベンジル−Ｌ−
グルタミン酸−ポリブタジエン共重合体を５倍当量の３
３重量％臭素酸／酢酸溶液で加水分解、精製を行ない、
（Ａ）−（Ｂ）ブロック共重合体であるポリ−Ｌ−グル
タミン酸−ポリブタジエン共重合体（ポリ−Ｌ−グルタ
ミン酸の共重合割合：５０モル％、平均重合度：３０
０）を得た。この共重合体を実施例１と同様にしてセル
ラーゼを固定化した。この固定化セルラーゼを実施例１
と同様の方法で酵素活性測定及びその再使用による活性
の変化を調べた。結果を表１に示す。

【００３０】実施例６ 実施例１で合成したＰＬＧの０.２ｇを、１０ｍｌのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７.４）に溶解し、別に調製したセル
ラーゼの５重量％リン酸緩衝液と混合して、イオン結合
による固定化セルラーゼを作製した。得られた固定化セ
ルラーゼを実施例１と同様の方法で酵素活性測定及びそ
の再使用による活性の変化を調べた。結果を表１に示
す。

【００３１】

【表１】

【００３２】以下、本発明の固定化酵素およびその好ま
しい態様を列挙する。 １. 水素イオン濃度（ｐＨ）の変化ににより水溶性と水
不溶性の可逆的形態を有する、アミノ酸（共）重合体と
酵素とが結合した固定化酵素。 ２. アミノ酸（共）重合体の平均重合度が５〜５,００
０の範囲である前記１項記載による固定化酵素。 ３. 酵素１分子当りに結合したアミノ酸（共）重合体分
子数が２０分子以下である前記１項記載による固定化酵
素。 ４. アミノ酸（共）重合体と酵素とが共有結合により結
合している前記１項記載による固定化酵素。 ５. 共有結合がグルタルアルデヒドを使用することによ
り形成された前記４項記載による固定化酵素。 ６. アミノ酸（共）重合体が、ポリ−α−アミノ酸また
はその共重合体である前記１項記載による固定化酵素。 ７. ポリアミノ酸が、ポリ−グルタミン酸、ポリ−リシ
ンまたはポリ−アスパラギン酸による前記１項記載の固
定化酵素。

【００３３】

【発明の効果】本発明の固定化酵素は、反応液の水素イ
オン濃度（ｐＨ）を変化させるという簡便な操作で回
収、再使用が可能となり、高価な酵素を効率よく使用で
きるとともに、均一系での反応を可能にするため従来の
固定化酵素に比べ反応効率の向上した酵素反応の場を提
供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例１において得られた固定化セ
ルラーゼの溶液における水素イオン濃度（ｐＨ）の変化
による光透過率（５５０ｍｍ）および実施例３において
得られた固定化セルラーゼの溶液における水素イオン濃
度（ｐＨ）の変化による光透過率（５５０ｍｍ）を調べ
た結果を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 林 壽郎 京都府京都市北区小山下内河原町60番

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水素イオン濃度（ｐＨ）の変化により水
   溶性と水不溶性の可逆的形態を有する、アミノ酸（共）
   重合体と酵素とが結合した固定化酵素。