JPH0314428B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素の製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも実施されているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を行
なわせている。しかし、このような方法によれ
ば、反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を
補給したり、また、反応後に酵素を失活させるこ
となく、生成物と酵素を分離することが非常に困
難であり、酵素が不経済に消費される。そのう
え、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶
性の担体に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
質を反応させることが提案されている。このよう
な酵素の固定化方法の代表的なものに、水不溶性
の担体に酵素を共有重合、イオン結合又は物理吸
着によつて結合させる担体結合法が知られてい
る。しかし、従来、この方法において用いられて
いる担体は、通常、セルロース、デキストラン、
アガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルア
ミドゲル、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒
子であり、このような粒子に酵素が固定化された
固定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定さ
れて、基質溶液と接触されるので、基質が高分子
量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に
長時間を要すると共に、反応収率が低いという問
題がある。

本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素の製造方法を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素の製造方法は、(a)グリ
シジルアクリレート及び／又はグリシジメタクリ
レート0.2〜10重量％、(b)この単量体と共重合し
得る第１のラジカル重合性単量体10〜97.8重量
％、(c)多官能性内部架橋用単量体１〜20重量％、
及び(d)第２のラジカル重合性単量体としてのアク
リロニトリル又はメタクリロニトリル１〜60重量
％とからなる単量体組成を乳化共重合させ、得ら
れる水分散性高分子重合体粒子の有するグリシジ
ル基を介して酵素を共有結合にて固定化すること
を特徴とする。

本発明においては、グリシジルアクリレート及
び／又はグリシジルメタクリレート（以下、グリ
シジル（メタ）アクリレートと称する。）を１成
分とする後述する重量体組成を、好ましくは乳化
剤の不存在下で乳化共重合し、かくして得られる
水分散性高分子重合体粒子が側鎖に有するグリシ
ジル基を介して酵素を共有結合により固定化する
のである。

ここに、グリシジル（メタ）アクリレートと共
重合される第１のラジカル重合性単量体として
は、アクリロニトリルとメタクリロニトリルを除
いて、これらと共重合性を有し、且つ、得られる
共重合体が酵素反応の行なわれる温度よりも高い
ガラス転移点を有する限りは特に制限されるもの
ではないが、好ましくは、エチレン、プロピレ
ン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステ
ル、スチレン、メチルスチレン、ビニルトルエ
ン、ブタジエン、イソプレン、アクリルアミド、
メタクリルアミド等の１種又は２種以上が用いら
れる。特に、アクリル酸及びメタクリル酸のアル
キルエステルやスチレンが好ましく用いられる。

また、内部架橋用多官能性単量体としては、多
価アルコールのポリ（メタ）アクリレートが好ま
しく、具体的には、エチレングリコールジメタク
リレート、ジエチレングリコールジメタクリレー
ト、トリエチレングリコールジメタクリレート、
ジプロピレングリコールジメタクリレート、１，
３−ブチレングリコールジメタクリレート、トリ
エチレングリコールジアクリレート、トリメチロ
ールプロパントリメタクリレート、トリメチロー
ルプロパントリアクリレート、テトラメチロール
メタンテトラアクリレート等が用いられる。ジビ
ニルベンゼンも好ましく用いられる。

更に、本発明においては、水分散性高分子重合
体粒子を得るための第２のラジカル重合性単量体
成分として、アクリロニトリル及び／又はメタク
リロニトリルを含有することが必須である。

本発明においては、以上のような各単量体を水
媒体中にて通常の方法にて乳化共重合させること
により、側鎖にグリシジル基を有する水分散性高
分子重合体粒子を得ることができるが、得られる
重合体粒子中に乳化剤が混在すると、酵素の固定
化の際に酵素が失活する等の有害な影響が現れる
ことがあるので、乳化共重合に際しては乳化剤を
用いないのが好ましい。本発明による上記単量体
組成によれば、特に乳化剤を要せずして安定に共
重合させることができるが、乳化剤が酵素に対し
て有害な影響を与えなければ、乳化剤を必要に応
じて用いてもよい。

また、本発明においては、上記の乳化共重合に
際して、PHを７付近に保つことが望ましい。反応
時のPHが酸性又はアルカリ性に偏つていると、グ
リシジル基が開裂すると共に、水溶性重合体が生
じる傾向が大きいからであり、また、グリシジル
基の開裂によつて、酵素を固定化するためのグリ
シジル基が不足し、十分な量の酵素を固定化し難
くなるからである。

本発明における単量体組成は、グリシジル（メ
タ）アクリレート0.2〜10重量％、好ましくは0.5
〜８重量％、この単量体と共重合し得る第１のラ
ジカル重合性単量体10〜97.8重量％、好ましくは
20〜92.5重量％、多官能性内部架橋用単量体１〜
20重量％、好ましくは２〜10重量％、及びアクリ
ロニトリル又はメタクリロニトリル１〜60重量
％、好ましくは５〜40重量％とからなる。

単量体組成においてグリシジル（メタ）アクリ
レート単量体の量は、これから得られる水分散性
高分子重合体粒子の有するグリシジル基量、従つ
て、このグリシジル基に固定化し得る酵素の固定
化量とも関連し、少なすぎるときは酵素を十分な
量にて固定化することができず、多すぎるときは
重合の安定性を損なうと共に、得られる重合体粒
子の安定性も損なわれ、また、固定化の際に酵素
の失活が起こりやすいので好ましくない。

次に、グリシジル（メタ）アクリレートとこれ
に共重合性を有する第１のラジカル重合性単量体
のみを乳化共重合させると、重合が不安定であつ
て、安定な水分散性高分子重合体粒子を得ること
が困難である。しかしながら、本発明に従つて、
グリシジル（メタ）アクリレートと第１のラジカ
ル重合性単量体と内部架橋用単量体と（メタ）ア
クリロニトリルとを乳化共重合させることによ
り、重合の安定性が確保される。このような結果
が得られる理由は必ずしも明らかではないが、内
部架橋用単量体と（メタ）アクリロニトリルとが
グリシジル（メタ）アクリレートに有効に共重合
し、これを水不溶化して、重合を安定化するので
あろう。従つて、（メタ）アクリロニトリルと多
官能性内部架橋用単量体の量が上記範囲よりも少
ないとき、又へ多すぎるときは、重合の安定性が
損なわれる。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、その平均粒径が0.03μ〜2μ、好ましくは
0.07μ乃至1μである。粒径が小さすぎると、これ
を担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収が困難となり、一方、
粒径が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積
が小さくなり、酵素の固定化量が少なくなると共
に、水中に分散させるのが困難となるので好まし
くない。

このようにして得られる水分散性高分子重合体
粒子の有するグリシジル基を介して酵素を共有結
合して固定化する方法は特に制限されず、従来よ
り知られている方法が適宜に採用される。

例えば、一つの方法として、グリシジル基に直
接に酵素を固定化する場合は、重合体粒子の有す
るグリシジル基にPHが７〜９付近で酵素を反応さ
せればよい。この際、よく知られているように、
酵素が失活しないように、低温で数十時間反応さ
せるのが望ましい。また、別の方法として、重合
体粒子の有するグリシジル基にｍ−キシリレンジ
アミンのようなジアミンを反応させ、新たに形成
されたアミノ基未端に酵素を結合させることもで
きる。即ち、例えば、PH９〜13、温度20〜40℃の
範囲でジアミンを重合体粒子に反応させればよ
く、かくして重合体粒子に導入されたアミノ基に
酵素を固定化するのである。このアミノ基に酵素
を共有結合にて固定化するには、従来より知られ
ている通常の方法によることができ、例えば、ジ
アゾニウム法、カルボジイミド法、チオシアネー
ト法、ジアルデヒド法等を採用することができ
る。

以上のようにして、酵素を重合体粒子に共有結
合させた後、用いた反応試薬や固定化されていな
い酵素を遠心分離、膜分離等の適宜の手段によつ
て除去すれば、本発明の固定化酵素を得る。

本発明による固定化酵素は水分散液として用い
られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量
は、固定化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要と
する反応速度、基質濃度等により適宜に決定され
る。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でもよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て、単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵
素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の
酵素が用いられる。具体例として、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、
アスパラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシ
ンアミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−オ
キザロ酢酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミ
ン酸−ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、ク
レアチンホスホナーゼ、ヒスタミンメチルトラン
スフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルト
ランスフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ
のような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチル
コリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラ
ーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナー
ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、
ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシ
ン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダ
ーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミ
ン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホ
スホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアー
ゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リン
ゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラ
セマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコース
ホスフエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼの
ような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼの
ようなリガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、グリ
シジル基を有する水分散型高分子重合体粒子に、
上記グリシジル基を介して酵素が共有結合により
固定化されており、従来のセルロース誘導体粒子
等を担体とする場合と異なり、固定化酵素自体が
遊離の酵素と同様に反応系内を自由に移動できる
ため、基質の拡散が反応に殆ど影響を与えず、従
つて、高分子量の基質の場合にも遊離の酵素と同
様の高い反応速度で酵素反応を行なわせることが
できる。

しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の
担体に固定化されているため、酵素反応後には遠
心分離、塩析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性
膜による膜分離等によつて容易に回収でき、かく
して、長期間にわたつて高い酵素活性を保持させ
つつ、繰返して使用することができる。

また、本発明において担体として用いる水分散
性高分子重合体粒子は、その製造面からみれば、
乳化剤を用いることなく、且つ、望ましくない水
溶性重合体の生成を抑えて、安定に乳化共重合に
より得ることができ、しかし、グリシジル（メ
タ）アクリレート単量体と共に、（メタ）アクリ
ロニトリルと内部架橋用単量体を併用することに
より、得られる水分散性高分子重合体粒子は強度
が大きいと共に、粒子相互の粘着も起こらない。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例により限定されるものではな
い。

実施例 １ グリシジルメタクリレート10ｇ、メチルメタク
リレート73ｇ、トリエチレングリコールジメタク
リレート２ｇ及びアクリロニトリル15ｇを蒸留水
230ｇを加え、過硫酸カリウム0.3ｇを水10mlに溶
解した重合開始剤水溶液を70℃の温度で窒素気流
下に加え、PHを7.0に維持しつつ120rpmで撹拌し
て８時間重合させて、固形分約30％、平均粒径
0.15μの重合体粒子の水分散液を得た。重合は非
常に安定に行なわれて、凝集物は0.03％であつ
た。

この重合体粒子を遠心分離し、0.1M酢酸ナト
リウム−カ性ソーダ緩衝液（PH8.0）100mlに再分
散させた。

トリプシン1.5ｇを水30mlに溶解した酵素水溶
性を上記重合体粒子分散液に加え、10℃の温度で
48時間反応させた。反応後、遠心分離して沈降し
た重合体粒子を0.1Mリン酸水素二カリウム及び
0.1Mリン酸二水素カリウムから調製した緩衝液
（PH7.0）で洗滌して未固定のトリプシンを除き、
再び緩衝液に分散させて、本発明による固定化酵
素を得た。

この固定化酵素のトリプシン固定化量は、重合
体粒子１ｇ当り15mgであり、また、１％カゼイン
水溶性を基質として測定した活性収率は60％であ
つた。

尚、活性収率とは、固定化された酵素の活性の
理論量に対する実際の活性の割合として定義され
る。ここでは、１％のカゼイン水溶液を基質とし
て、酵素を35℃で10分間反応させた後、５％トリ
クロル酢酸により高分子量タンパク質を沈殿さ
せ、遊離の非タンパク性分解質量を280nｍの吸
光度から求め、この吸光度を１分間に1.0増加さ
せる活性を１単位として、酵素固定化量と同じ活
性を有する遊離の酵素量で除して求めた。

また、反応後の上記固定化酵素を遠心分離し、
緩衝液で洗滌して再び基質と反応させたところ、
最初の反応とほぼ同じ活性を示した。

比較例 １ グリシジルメタクリレート10ｇ、メチルメタク
リレート75ｇ及びアクリロニトリル15ｇを実施例
１と同様にして乳化共重合させ、固形分30％、平
均粒径0.15μの重合体粒子の水分散液を得た。凝
集物は0.5％であつた。

この重合体粒子に実施例１と同様の方法により
トリプシンを固定化したところ、トリプシンの固
定化量は重合体粒子１ｇ当り10mgであり、活性収
率は実施例１と同じ条件下で60％であつた。ま
た、この反応後に遠心分離して沈降した重合体粒
子を緩衝液で洗滌した後、再び基質と反応させた
ところ、その活性は最初の活性の70％に低下して
いた。

比較例 ２ グリシジルメタクリレート10ｇ、メチルメタク
リレート88ｇ及びトリエチレングリコールジメタ
クリレート２ｇを実施例１と同様に乳化共重合さ
せ、固形分29％、平均粒径0.25μの重合体粒子の
水分散液を得た。重合は不安定であつて、凝集物
は５％であつた。

実施例 ２ グリシジルクリレート10ｇ、スチレン50ｇ、メ
チルメタクリレート18ｇ、ジビニルベンゼン２ｇ
及びアクリロニトリル20ｇを蒸留水230ｇに加え、
実施例１と同様の方法により乳化共重合して、固
形分30％、平均粒径0.25μの重合体粒子の水分散
液を得た。重合は非常に安定に行なわれて、凝集
物は0.03％であつた。

この重合体粒子を遠心分離し、0.05M酢酸ナト
リウム−カ性ソーダ緩衝液（PH10）100mlに再分
散させ、これにｍ−キシリレンジアミン２ｇを添
加して、30℃で24時間反応させた。次に、残存す
るｍ−キシリレンジアミンを除くために遠心分離
し、0.1Mリン酸二カリウム及び0.1Mリン酸二水
素カリウムから調製した緩衝液（PH6.0）で洗滌
し、同じ緩衝液100mlに再分散させた。この分散
液に１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンス
ルホネート2.5ｇを加え、撹拌しつつ、PHを5.0に
調整した。

次に、α−アミラーゼ2.5ｇを水50mlに溶解さ
せ、PHを5.0に調整した酵素水溶液を上記重合体
粒子分散液に加え、撹拌下、PHを5.0に調整しつ
つ、５℃で24時間反応させて、α−アミラーゼを
重合体粒子に固定化した。反応後、遠心分離によ
り沈降した重合体粒子を緩衝液にて洗滌して未固
定のα−アミラーゼを除去し、再び緩衝液に分散
させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のα−アミラーゼ固定化量は、
重合体粒子１ｇ当り30mgであり、活性収率は54％
であつた。活性収率は、ここでは、１％デンプン
水溶液を基質として、固定化酵素を35℃で30分間
反応させ、ヨウ素デンプン反応からデンプンの分
解量を求めることにより、固定化酵素の活性、即
ち、デンプン分解速度（mg／分）を得、これと等
しい活性を有する遊離の酵素量を酵素固定化量で
除して求めた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a)グリシジルアクリレート及び／又はグリシ
   ジメタクリレート0.2〜10重量％、(b)この単量体
   と共重合し得る第１のラジカル重合性単量体10〜
   97.8重量％、(c)多官能性内部架橋用単量体１〜20
   重量％、及び(d)第２のラジカル重合性単量体とし
   てのアクリロニトリル又はメタクリロニトリル１
   〜60重量％とからなる単量体組成を乳化共重合さ
   せ、得られる水分散性高分子重合体粒子の有する
   グリシジル基を介して酵素を共有結合にて固定化
   することを特徴とする固定化酵素の製造方法。 ２ 水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
   粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の固定化酵素の製造方法。 ３ 第１のラジカル重合性単量体がアクリル酸又
   はメタクリル酸のアルキルエステルであることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵
   素の製造方法。 ４ 多官能性内部架橋用単量体が多価アルコール
   のポリ（メタ）アクリレートであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素の製
   造方法。