JPH11503003A - アミラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を有し；又は（ii）１又は複数の前記アミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を示し；そして／又は１つの前記アミノ酸配列を有するα−アミラーゼに対して生ぜしめられた抗体との免疫学的交差反応性を示し；そして／又は１つの前記アミノ酸配列を有するα−アミラーゼをコードするDNA 配列と同じプローブとハイブリダイズするDNA 配列によりコードされる親α−アミラーゼの変異体に関し；前記変異体においては、（ａ）前記親α−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されており；そして／又は（ｂ）前記親α−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により置換されており；そして／又は（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸残基が前記親α−アミラーゼに対して挿入されており；さらに前記変異体は、α−アミラーゼ活性を有し、そして前記親α−アミラーゼに対しての次の性質の少なくとも１つを示し：高められた熱安定性；酸化に対しての高められた安定性；及び低められたCa²⁺依存性；但し、前記変異体のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるアミノ酸配列のいづれとも同一でないことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 アミラーゼ変異体 発明の分野 本発明は、親酵素に対して改良された性質（たとえば、改良された熱及び／又 は酸化安定性、及び／又は減じられたカルシウムイオン依存性）、及びそれによ り、改良された洗浄及び／又は皿洗い（及び／又は織物糊抜き）性能を有するα −アミラーゼ変異体に関する。本発明はまた、前記変異体をコードするDNA 構造 体、及び前記DNA 構造体を有するベクター及び細胞にも関する。さらに、本発明 は、アミラーゼ変異体を製造するための方法、及びアミラーゼ変異体を含んで成 る洗浄添加剤及び洗浄組成物に関する。さらに、本発明は、織物糊抜きのためへ のアミラーゼ変異体の使用にも関する。 発明の背景 α−アミラーゼ酵素は、長年にわたり、そして種々の異なった目的、たとえば 澱粉の液化、織物の糊抜き、紙及びパルプ産業における澱粉変性、並びに醸造及 びベーキングのために産業的に使用されて来た。ますます重要になっているα− アミラーゼのさらなる使用は、洗浄又は皿洗いの間の澱粉性のしみの除去である 。 最近、特定の使用、たとえば澱粉の液化及び織物の糊抜きに関しての改良され た性質を有するα−アミラーゼ変異体を作製する試みが行なわれて来た。 たとえば、アメリカ特許第 5,093,257号は、Ｂ．ステアロサーモフィラス(B． stearothermophilus)のα−アミラーゼのＮ末端部分及びＢ．リケニホルミス（B ．licheniformis）のα−アミラーゼの Ｃ末端部分を含んで成るキメラ性α−アミラーゼを開示する。このキメラ性α− アミラーゼは、それらの親α−アミラーゼに比較して、ユニークな性質、たとえ ば異なった熱安定性を有するものとして言及されている。しかしながら、特別に 記載されるキメラ性α−アミラーゼのすべては、それらの親α−アミラーゼに比 較して、低められた酵素活性を有することが示されている。 ヨーロッパ特許第 252,666号は、一般式Ｑ−Ｒ−Ｌ（ここで、ＱはＢ．アミロ リクエファシエンス（B．amyloliquefaciens）からの特定のα−アミラーゼの57 個のＮ末端アミノ酸残基に対して少なくとも75％の相同性を有する、55〜60個の アミノ酸のＮ末端ポリペプチド残基であり、Ｒは特定のポリペプチドであり、そ してＬは特定のＢ．リケニホルミスのα−アミラーゼの 395個のＣ末端アミノ酸 残基に対して少なくとも75％の相同性を有する、390〜400 個のアミノ酸残基を 含んで成るＣ末端ポリペプチドである）を有するハイブリッドアミラーゼを記載 する。 Suzukiなど（1989）は、キメラ性α−アミラーゼを開示しており、ここでＢ． アミロリクエファシエンスのα−アミラーゼの特定の領域が、Ｂ．リケニホルミ スのα−アミラーゼのその対応する領域と置換されている。このキメラ性α−ア ミラーゼは、熱安定性を担当する領域を同定するために構成された。そのような 領域は、Ｂ．アミロリクエファシエンスのα−アミラーゼのアミノ酸残基 177〜 186、及びアミノ酸残基 255〜270 を含むことが見出された。キメラ性α−アミ ラーゼにおけるアミノ酸残基の変更は、それらの熱安定性以外の酵素の性質に影 響を及ぼすとは思われなかった。 WO91/00353は、少なくとも１のアミノ酸残基においてそれらの親α−アミラー ゼと異なるα−アミラーゼ変異体を開示する。前記特許出願に開示されるα−ア ミラーゼ変異体は、それらのアミノ酸置 換のために澱粉の分解及び／又は織物の糊抜きへの適用のために改良された性質 を示すものとして言及されている。その変異体のいくつかは、改良された安定性 を示すが、しかし酵素活性の改良点は報告されても又は指摘もされていなかった 。例示される唯一の変異体が親Ｂ．リケニホルミスのα−アミラーゼから調製さ れ、そして次の突然変異：H133Y 又は H133Y＋T1491 の１つを担持する。他の提 案される突然変異はA111T である。 フランス特許第 2,676,456号は、Ｂ．リケニホルミスのα−アミラーゼの変異 体を開示しており、ここではHis 133 に隣接するアミノ酸残基及びAla 209 に隣 接するアミノ酸残基がより疎水性のアミノ酸残基により置換されている。その得 られるα−アミラーゼ変異体は、改良された熱安定性を有し、そして織物、紙、 醸造及び澱粉液化産業において有用であるものとして言及されている。 ヨーロッパ特許第 285,123号は、ヌクレオチド配列のランダム突然変異誘発を 実施する方法を開示する。そのような配列の例として、Ｂ．ステアロサーモフィ ラスのα−アミラーゼをコードするヌクレオチド配列が言及されている。変異誘 発される場合、低いpH値で改良された活性を有するα−アミラーゼ変異体が得ら れる。 上記引例のいずれも、洗剤産業に関して改良された性質を有するα−アミラー ゼ変異体が構成され得ることを言及も又は示唆さえもしていない。 ヨーロッパ特許第 525,610号は、界面活性剤(ionic tenside)に対して改良さ れた安定性を有する変異酵素に言及している。その変異酵素は、親酵素の表面部 分におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基により置換することによって生成さ れている。ヨーロッパ特許第 525,610号に具体的に記載される唯一の変異酵素は 、プロテアーゼである。アミラーゼは、界面活性剤に対して改良された安定性を 得ることができる酵素の例として言及されているが、しかしそのアミラーゼのタ イプ、その起源又は特異的な突然変異に関しては、特定されていない。 WO94/02597号は、酸化剤の存在下で改良された安定性及び活性を示すα−アミ ラーゼ変異体を開示する。この変異アミラーゼにおいては、１又は複数のメチオ ニン残基が、Cys 及びMet とは異なるアミノ酸残基により置換されている。α− アミラーゼ変異体は、洗剤及び／又は皿洗い添加剤として並びに織物の糊抜きの ために有用であることが言及されている。 WO94/18314号は、Ｂ．リケニホルミスのα−アミラーゼのM197位置における、 酸化的に安定したα−アミラーゼ変異体（突然変異誘発を包含する）を開示する 。 ヨーロッパ特許第 368,341号は、洗浄及び皿洗いのためへの、α−アミラーゼ と任意に組合わせてのプルラナーゼ及び他の澱粉分解性酵素の使用を記載する。 本発明の目的は、中でも、問題の変異体の洗浄及び／又は皿洗い性能に関して 、それらの親α−アミラーゼよりも改良された重要な性質、たとえば洗濯又は皿 洗いにおいて、高められた熱安定性、酸化に対する高められた安定性、Ca²⁺イオ ンに対する減じられた依存性、及び／又は対応するpH領域における改良された安 定性又は活性を有するα−アミラーゼ変異体を供給することである。そのような 変異α−アミラーゼは、それらの親α−アミラーゼよりも低い用量で使用され得 る利点を中でも有する。さらに、α−アミラーゼ変異体は、今日知られているα −アミラーゼ洗剤により除去され得ないか又は除去することが困難である澱粉性 しみを除去することができる。 発明の簡単な開示 本発明の目的は、バシラス（Bacillus）株から選択することができ、そして現 在市販されている多くのα−アミラーゼに関して、アルカリ媒体（たとえば洗濯 又は皿洗いに典型的には使用されるような洗剤溶液）におけるそれらの澱粉除去 性能に基づいてそれら自体、選択された特定のα−アミラーゼの安定性を、可能 なら、改良することであった。これに関連して、本発明者は、親α−アミラーゼ のアミノ酸配列の種々の領域における１又は複数のアミノ酸残基の適切な変性に より、そのような親α−アミラーゼの上記言及されたタイプの性質を改良するこ とが実際、可能であることを驚くべきことには、見出した。本発明はこの発見に 基づかれている。 従って、第１の観点において、本発明は、親α−アミラーゼの変異体に関し、 ここで前記注目の親α−アミラーゼは： ｉ）本明細書において、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び 配列番号７で示されるアミノ酸配列の１つを有し；又は ii）配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７で示される１又は複 数のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を示し；そして／又はそれぞれ、配 列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるアミノ酸配列の１ つを有するα−アミラーゼに対して生ぜしめられた抗体との免疫学的交差反応性 を示し；そして／又はそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列 番号７に示されるアミノ酸配列の１つを有するα−アミラーゼをコードするDNA 配列と同じプローブとハイブリダイズするDNA 配列によりコードされるα−アミ ラーゼである。 本発明のα−アミラーゼ変異体は、それが配列番号１、配列番号２、配列番号 ３又は配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して同 一のアミノ酸配列を有さない変異体であることを条件とする。 注目のα−アミラーゼのアミノ酸配列の最初の３個をコードするDNA 配列は、 配列番号４（配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする）、配列番号５（ 配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする）、及び配列番号６（配列番号 ３で示されるアミノ酸配列をコードする）に示される。 配列番号１及び配列番号２の親α−アミラーゼのアミノ酸配列、及びその対応 するDNA 配列（それぞれ、配列番号４及び配列番号５）はまた、WO95/26397（本 出願におけるのと同じ配列番号下で）にも開示されている。 本発明の変異体は、（ａ）親α−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基 が欠失されており；そして／又は（ｂ）親α−アミラーゼの少なくとも１つのア ミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により置換されており；そして／又は（ｃ） 少なくとも１つのアミノ酸残基が親α−アミラーゼに対して挿入されている変異 体である。問題の変異体は、それら自体α−アミラーゼ活性を有し、そして親α −アミラーゼに対して次の性質の少なくとも１つを示す： 高められた熱安定性、すなわち親酵素の使用のために適切な温度よりも高い温 度で酵素活性の満足できる維持；高められた酸化安定性、すなわち酸化体（たと えば、酸素、酸化漂白剤及び同様のもの）による分解に対しての高められた耐性 ；減じられたCa²⁺依存性、すなわち親α−アミラーゼの場合におけるよりも低い Ca²⁺濃度の存在下で満足して機能する能力。そのような減じられたCa²⁺依存性を 有するα−アミラーゼが洗剤組成物への使用のために非常に所望される。なぜな らば、そのような組成物は典型的には、カルシウムイオンを強く結合する比較的 多量の物質（たとえばリン酸塩、EDTA及び同様のもの）を含むからである。 本発明の変異体により達成され得る性質の他の所望される改良又は変性（注目 の親α−アミラーゼに対して）の例は次の性質である： 中性〜比較的高いpH値、たとえば７〜10.5の範囲、たとえば 8.5〜10.5の範囲 のpH値での高められた安定性及び／又はα−澱粉分解活性； 変異体が使用されるべき（上記を参照のこと）媒体（たとえば、洗濯用媒体、 皿洗い用媒体又は織物糊抜き用媒体）のpHに問題のα−アミラーゼ変異体のため のpI値を良好に適合せしめるためのその等電点（pI）の上昇又は下降；及び 特定タイプの基質との改良された結合性、基質に対する改良された特異性及び ／又は基質の分解（加水分解）に対する改良された特異性。 アミノ酸配列は、既知の計算法、たとえばLipman and Pearson,Science 227（ 1985）p 1435 に記載される１つの方法を通して行なわれるそれぞれのアミノ酸 配列の比較がＸ％の同一性を示す場合、親α−アミラーゼに対してＸ％の相同性 であると思われる。GCG パッケージ、バージョン 7.3（６月、1993）からのGAP コンピュータープログラムが、GAP ペナルティーのための誤り値（default valu es）を用いて適切に使用され得る〔Genetic Computer Group（1991）Programme Manual for the GCG Package、バージョン7.575 Science Drive，Madison，Wisc onsin，USA 53711〕。 本発明においては、洗浄及び皿洗いに関して使用されるような“改良された性 能”とは、すでに上記で示されたように、それぞれ洗浄又は皿洗いの間、澱粉性 のしみ、すなわち澱粉を含むしみの改良された除去を意味するものである。その 性能は、従来の洗浄及び皿洗い実験において決定され得、そして改良点は、問題 の親α−アミ ラーゼの性能との比較として評価される。皿洗い性能のインジケーターとして使 用され得る小規模の“ミニ皿洗い試験”の例は、下記の実験セクションに記載さ れている。 単独で又は組合して取られるα−アミラーゼ変異体の種々の異なった特徴、た とえば比活性、Ｋ_m（いわゆる、ミカエリス−メンテンの式における“ミカエリ ス定数”）、Ｖ_max（ミカエリス−メンテンの式に基づいて決定された一定の基 質の転換の最大速度（プラトー値）〕、pI、最適pH、最適温度、熱活性化、酸化 体又は界面活性剤（たとえば洗剤）に対する安定性、等は、改良された性能に寄 与することが理解されるであろう。当業者は、変異体の性能は、上記特徴に基づ いて、単独では予測され得ないが、しかし洗浄及び／又は皿洗い性能試験により 達成されるべきであることに気づくであろう。 さらなる観点においては、本発明は、本発明のα−アミラーゼ変異体をコード するDNA 配列を含んで成るDNA 構造体、前記DNA 構造体を担持する組換え発現ベ クター、前記DNA 構造体又はベクターにより形質転換される細胞、及びα−アミ ラーゼ変異体の生成の助けとなる条件下でそのような細胞を培養することによっ てα−アミラーゼ変異体を生成するための方法（この後、α−アミラーゼは培養 物から回収される）に関する。 さらなる観点においては、本発明は、上記のようなその改良された性質のおか げで、親α−アミラーゼに比較して、改良された洗浄及び／又は皿洗い性能を示 す、親α−アミラーゼの変異体を調製するための方法に関する。この方法は、 ａ）前記α−アミラーゼの変異体をコードする遺伝子を含む細胞集団を構成し 、 ｂ）少なくとも１つの洗浄及び／又は皿洗い条件を刺激する条件 下でα−アミラーゼ活性について前記細胞集団をスクリーンし、 ｃ）段階ｂ）で選択された条件下で親α−アミラーゼと比較して、改良された 活性を有する前記親α−アミラーゼの変異体をコードする遺伝子を含む前記細胞 集団から細胞を単離し、 ｄ）適切な培養培地において適切な条件下で段階ｃ）で単離された細胞を培養 し、そして ｅ）段階ｄ）で得られた培養物からα−アミラーゼ変異体を回収することを含 んで成る。 本発明はまた、後者の方法により調製される変異体（本発明の変異体である） にも関する。 本明細書において、用語“少なくとも１つの洗浄及び／又は皿洗い条件を刺激 する”とは、たとえば洗浄又は皿洗いの間、支配する温度又はpHの、又は洗浄又 は皿洗い処理に使用されるべき洗剤組成物中の化学組成の刺激を意味する。用語 “化学組成”とは、注目の洗剤組成物の１つの成分、又は複数の成分の組合せを 包含することを意図する。複数の異なった洗剤組成物の構成成分がさらに下記に 列挙される。 段階ａ）で言及される“細胞集団”は、親α−アミラーゼをコードするDNA 配 列をクローニングし、そして前記DNA を本明細書に記載されるような部位特定突 然変異誘発又はランダム突然変異誘発にゆだねることによって適切に構成され得 る。 本明細書において、用語“変異体(variant)”とは、用語“変異体（mutant） ”と交換可能的に用いられる。用語“変異体”とは、ハイブリッドα−アミラー ゼ、すなわち少なくとも２種の異なるα−澱粉分解性酵素の部分を含んで成るα −アミラーゼを包含することを意味する。従って、そのようなハイブリッドは、 すでに上記で定義されたような変異体にそれぞれ由来する１又は複数の部分；又 はすでに上記で定義されたような変異体にそれぞれ由来する１又は複数の部分と 変性されていない親α−アミラーゼにそれぞれ由来する１又は複数の部分とから 構成され得る。これに関連して、本発明はまた、その構成酵素のいづれかに比較 して（すなわち、ハイブリッドの一部に寄与する酵素のいづれかに比較して）、 改良された洗浄及び／又は皿洗い性能を有するハイブリッドα−アミラーゼを生 成するための方法にも関し、ここで前記方法は、 ａ）組換え体を形成するために、成分α−アミラーゼの１つのα−アミラーゼ 遺伝子又は対応するcDNAのＮ−末端コード領域を、もう１つの成分α−アミラー ゼのα−アミラーゼ遺伝子又は対応するcDNAのＣ−末端コード領域により再構成 し、 ｂ）その成分α−アミラーゼのいづれかに比較して、改良された洗浄及び／又 は皿洗い性能を有するハイブリッドα−アミラーゼを生成する組換え体を選択し 、 ｃ）適切な培養培地において適切な条件下で段階ｂ）で選択された組換え体を 培養し、そして ｄ）段階ｃ）で得られた培養物からハイブリッドα−アミラーゼを回収するこ とを含んで成る。 さらなる観点において、本発明は、特に洗浄又は皿洗いのためへの洗剤酵素と しての本発明のα−アミラーゼ変異体〔上記方法の１つにより調製されたいづれ かの変異体又はハイブリッドを包含する〕の使用、前記α−アミラーゼ変異体を 含んで成る洗剤添加剤及び洗剤組成物、並びに織物の糊抜きのためへの本発明の α−アミラーゼ変異体の使用に関する。 ランダム突然変異誘発は、本発明の変異体を生成するために使用され得、そし て前記発明はさらに、親α−アミラーゼの変異体を調製するための方法にも関し 、ここで前記方法は、 （ａ）親α−アミラーゼをコードするDNA 配列をランダム突然変異誘発にゆだ ね、 （ｂ）段階（ａ）で得られた、突然変異誘発されたDNA 配列を宿主細胞におい て発現し、そして （ｃ）親α−アミラーゼに比較して、上記のような改良された性質（たとえば 低められたカルシウム依存性、高められた酸化安定性、高められた熱安定性、及 び／又は比較的高いpHでの改良された活性のような性質）を有する突然変異誘発 された澱粉分解性酵素を発現する宿主細胞をスクリーンすることを含んで成る。 発明の詳細な開示命名法 本発明の記載及び請求の範囲においては、ヌクレオチドのための便利な１文字 コード及びアミノ酸残基のための便利な１文字コードが使用される。参照を容易 にするために、本発明のα−アミラーゼ変異体は、次の命名法を使用により記載 される： 元のアミノ酸：位置：置換されたアミノ酸。 この命名法及び例によれば、位置30でのアスパラギンによるアラニンの置換は 次のように示され： Ala 30 Asn 又は A30N、 同じ位置でのアラニンの置換は次のように示され： Ala 30^* 又は A30^*、 そして追加のアミノ酸残基、たとえばリシンの挿入は次のように示される： Ala 30 AlaLys 又は A30AK アミノ酸残基30〜33により例示される、アミノ酸残基の連続した範囲の欠失は 、（30〜33）^*として示される。 特定のα−アミラーゼが他のα−アミラーゼに比較して“欠失”（すなわち、 アミノ酸残基の欠失）を含み、そして挿入がそのような位置で行なわれる場合、 これは、位置36でのアスパラギン酸の挿入に関しては、次のように示される： ^*36 Asp 又は ^*36 D。 複数の突然変異は“プラス（＋）”の印により分離され、すなわち Ala 30 Asp＋Glu 34 Ser又はA30N＋E34S は、位置30及び34での突然変異を表わす（ここで、アラニン及びグルタミン酸が 置換され、すなわちそれぞれアスパラギン及びセリンにより置換されている）。 １又は複数のどちらかのアミノ酸残基が一定の位置に挿入され得る場合、これ は次のように示される： 「A30N，Ｅ」、あるいは「A30N又はA30E」。 さらに、変性のための適切な位置が、いづれかの特定の修飾が示唆されないで 本明細書において特定される場合、いづれかの他のアミノ酸残基により、その位 置に存在するアミノ酸残基（すなわち、Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ， Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ及びＶの間から選択された、注目の位 置に通常存在する以外のいづれかのアミノ酸残基）が置換され得ることが理解さ れるべきである。従って、たとえば、位置202 でのメチオニンの修飾（置換）が 言及される場合（但し、特定されていない）、いづれか他のアミノ酸、すなわち Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ及 びＶによりそのメチオニンは置換され得ることが理解されるべきである。親α−アミラーゼ すでに示されたように、本発明のα−アミラーゼは、それぞれ、 配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるアミノ酸配列の １つを有する親α−アミラーゼに基づいて、非常に適切に調製される（前記を参 照のこと）。 それぞれ、配列番号１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する親α− アミラーゼは、親アルカリ性バシラス株（それぞれ菌株NCIB 12512及びNCIB 125 13）から得られ、これらの両者は、ヨーロッパ特許第0,277,216 B1号に詳細に記 載されている。それらの２種の親α−アミラーゼの調製、精製及び配列決定法は 、WO95/26397〔実験セクションを参照のこと〕に記載されている。 配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼは、バシラス・ ステアロサーモフィラスから得られ、そしてJ ．Bacteriol．166（1986）pp．635 -643中でも記載されている。 配列番号７（図１において４で番号付けされた配列と同じ配列である）に示さ れるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼは、“バシラスsp．＃707 ”から得 られ、そしてTsukamoto など.，Biochem ．Biophys．Res．Commun．151（1988）p p．25-31により記載されている。 それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるアミ ノ酸配列を有する上記親α−アミラーゼの変異体とは別として、本発明の他の興 味ある変異体は、前記４種のアミノ酸配列の少なくとも１つと高い程度の相同性 、たとえば少なくとも70％の相同性、好ましくは（すでに示されたように）少な くとも80％の相同性、所望には少なくとも85％の相同性、そしてより好ましくは 少なくとも90％の相同性、たとえば95％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有す る、親α−アミラーゼの変異体を包含する。 上記ですでに示されたように、適切な親α−アミラーゼを同定するためのさら なる基準は、ａ）α−アミラーゼがそれぞれ配列番号 １、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるアミノ酸配列の１つを有 するα−アミラーゼに対して生じさせた抗体との免疫学的交差反応を示すこと、 及び／又はα−アミラーゼがそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３及 び配列番号７に示されるアミノ酸配列の１つを有するα−アミラーゼをコードす るDNA 配列と同じプローブとハイブリダイズするDNA 配列によりコードされるこ とである。 すでに言及されたように、ポリヌクレオチド（たとえば酵素）の相同性の程度 の決定に関しては、アミノ酸配列の比較が、既知の計算法、たとえばLipman and Pearson（1985）により記載される方法を用いて実施され得る。 免疫学的交差反応性についてのアッセイは、配列番号１に示されるアミノ酸配 列を有するα−アミラーゼ、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するα −アミラーゼ、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼ 、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの少なくとも １つのエピトープに対して生じさせた又はそのエピトープと反応性の抗体を用い て実施され得る。 モノクローナル又はポリクローナルのいづれかであってもよい抗体は、当業界 において知られている方法、たとえばHudsonなど.(1989)により記載される方法 により生成され得る。当業界において良く知られている適切なアッセイ技法の例 は、たとえばHudsonなど.(1989)により記載されるようなWestern Blotting and Radial Immunodiffasion Assay を包含する。 プローブハイブリダイゼーション〔上記ｂ）の基準〕に基づいての適切な親α −アミラーゼの同定に使用するためのオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ 、配列番号１、配列番号２、配列番号３ 及び配列番号７に示される配列の１つを有するα−アミラーゼの完全な又は部分 的なアミノ酸配列に基づいて、又はそれに対応する完全な又は部分的なヌクレオ チド配列に基づいて適切には調製され得る。 ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、５×SSC におけるプ レソーキング、及び20％ホルムアミド、５×Denhardt's溶液、50mMのリン酸ナト リウム(pH6.8)及び50μｇの変性され、音波処理されたウシ胸腺DNA の溶液にお いて約40℃での１時間のプレハイブリダイゼーション、続く、100μＭのATP が 補充された前記同じ溶液における約40℃で18時間のハイブリダイゼーション又は たとえばSambrookなど.(1989)により記載される他の方法を用いてのハイブリダ イゼーションを包含する。特定の性質に対する突然変異の影響 本発明者により得られた結果から、注目の親α−アミラーゼに関する変異体に より示される特定の性質、たとえば熱安定性、又は酸化安定性の変化は、変異体 における突然変異（アミノ酸置換、欠失又は挿入）のタイプ及び位置に相当な程 度、相関すると思われる。しかしながら、特定の突然変異又は突然変異のパター ンが一定の性質の変化を導びくという観察は、注目の突然変異がさらに、他の性 質に影響を及ぼすことができる可能性を決して除外するものではないことが理解 されるべきである。 酸化安定性：その親α−アミラーゼに対してα−アミラーゼ変異体の酸化安定 性を高めることに関して、親α−アミラーゼの少なくとも１つ、そして好ましく は複数の酸化可能アミノ酸残基が欠失され、又は元の酸化可能アミノ酸残基より も酸化に対して低い敏感性を有する他のアミノ酸残基により置換されていること が特に所望されると思われる。 これに関して、特に適切な酸化可能アミノ酸残基は、システイン、メチオニン 、トリプトファン及びチロシンである。従って、たとえば、システインを含む親 α−アミラーゼの場合、システイン残基の欠失、又は低い酸化可能性のアミノ酸 残基によるその置換が、親α−アミラーゼに対して改良された酸化安定性を有す る変異体を得ることにおいて重要なものであろうことが予想される。 それぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号７に示されるアミノ酸配列を 有する上記親α−アミラーゼの場合、それらのすべてはシステイン残基を含まな いが、しかし有意なメチオニン含有量を有し、メチオニン残基の欠失又は置換は 特に、得られる変異体の改良された酸化安定性を達成することに関して適切であ る。従って、配列番号１、配列番号２及び配列番号７に示されるアミノ酸配列の 位置M9，M10，M105，M202，M208，M261，M309，M382，M430 及びM440、及び／又 は配列番号２に示されるアミノ酸配列の位置M323における１又は複数のメチオニ ン残基の欠失又は置換〔たとえば、トレオニン（Ｔ）による、又は上記列挙され た他のアミノ酸の１つによる〕（又は上記親α−アミラーゼのための他の基準の １つを満たすもう１つのα−アミラーゼの配列における同等の位置でのメチオニ ン残基の欠失又は置換）は、酸化安定性を高めることに関して、特に効果的であ ると思われる。 配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼの場合、酸化安 定性を改良するために欠失され又は置換され得る適切なアミノ酸残基は、単一の システイン残基（C363）、及び配列番号１及び配列番号３に示される配列との類 似性によれば、位置M8，M9，M96，M200，M206，M284，M307，M311，M316及びM43 8に位置するメチオニン残基を包含する。 これに関連して、用語“同等の位置”とは、両者に共通する、並 列するアミノ酸残基／領域を達成するために、注目の“対照”のα−アミラーゼ のアミノ酸配列（たとえば、配列番号１に示される配列）と、注目の親α−アミ ラーゼのアミノ酸配列との整合に基づいて、注目の対照の配列における特定の位 置に最とも接近して対応する（たとえば同じアミノ酸残基により占領される）位 置を示す。 それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号７に示されるアミノ酸配列を有 するα−アミラーゼの酸化安定性の修飾（改良点）に関する特に興味ある突然変 異は、１又は複数の次のメチオニン置換（又は本発明における親α−アミラーゼ の必要条件を満たす他のα−アミラーゼのアミノ酸配列におけるその同等物）で ある：M202A,Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ， Ｙ，Ｖ。 さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列における適切なメチオニン置換は 、M323A,Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ， Ｖである。 配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの酸化安定性の修 飾（改良点）に関する特に興味ある突然変異は、１又は複数の次のメチオニン置 換である：M200A,Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ， Ｗ，Ｙ，Ｖ；M311A,Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ ，Ｗ，Ｙ，Ｖ；及びM316A,Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ， Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ。 熱安定性：その親α−アミラーゼに対するα−アミラーゼ変異体の熱安定性を 高めることに関して、配列番号１に示されるアミノ酸配列における次のアミノ酸 残基の少なくとも１つ、及び好ましくは２又はさらに３つの残基（又はそれらの 同等物）を欠失することが特に所望されると思われる：F180，R181，G182，T183 ，G184及びK1 85。それぞれ、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるアミノ酸配列 における、その対応する、特に適切な（及び同等の）アミノ残基は、F180，R181 ，G182，D183，G184及びK185（配列番号２）；F178，R179，G180，I181，G182及 びK183（配列番号３）；並びにF180，R181，G182，H183，G184及びK185（配列番 号７）である。 このタイプの特に興味ある対様式欠失(pairwise deletion)は次の通りである ： R181^*＋G182^*；及びT183^*＋G184^*（配列番号１）； R181^*＋G182^*；及びD183^*＋G184^*（配列番号２）； R179^*＋G180^*；及び1181^*＋G182^*（配列番号３）；並びに R181^*＋G182^*；及びH183^*＋G184^*（配列番号７）； （又は、本発明における親α−アミラーゼの必要条件を満たすもう１つのα−ア ミラーゼにおけるそれらの対様式欠失の同等物）。 熱安定性に関連して重要なものであると思われる他の突然変異は、配列番号１ に示される配列におけるP260〜I275の１又は複数のアミノ酸残基の置換（又は本 発明におけるもう１つの親α−アミラーゼにおけるその同等物）、たとえば位置 269におけるリシン残基の置換である。 注目の親α−アミラーゼに対するα−アミラーゼ変異体の熱安定性に関連して 重要なものであると思われる特定の突然変異の例は、配列番号１に示されるアミ ノ酸配列における１又は複数の次の置換（又は本発明におけるもう１つの親α− アミラーゼにおけるその同等物）である：K269R ; P260E ; P124P ; M105F,Ｉ， Ｌ，Ｖ；M208F,Ｗ，Ｙ；L217I ；V206I,Ｌ，Ｆ。 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼのためには、重 要なさらなる（同等の）突然変異は、相応して、１又 は複数の次の置換である：M105F,Ｉ，Ｌ，Ｖ；M208F,Ｗ，Ｙ；L217Ｉ；V206I,Ｌ ，Ｆ；及びK269R 。 配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼのためには、重 要なさらなる（同等の）突然変異は、相応して、次の置換の１つ又は両者である ：M206F,Ｗ，Ｙ；及びL215I 。 配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼのためには、重 要なさらなる（同等の）突然変異は、相応して、１又は複数の次の置換である： M105F,Ｉ，Ｌ，Ｖ；M208F,Ｗ，Ｙ；L217I；及びK269R 。 注目の親α−アミラーゼに対してα−アミラーゼ変異体の改良された熱安定性 を達成することにおいて、中でも重要なものであると思われる突然変異のさらに 追加の例は、配列番号１、配列番号２及び配列番号７に示されるアミノ酸配列に おける１又は複数の次の置換（又は本発明におけるもう１つの親α−アミラーゼ におけるその同等物）である： A354C＋V479C ； L351C＋M430C ；N457D,Ｅ＋K3 85R ；L355D,Ｅ＋M430R,Ｋ；L355D,Ｅ＋I411R,Ｋ；及びN457D,Ｅ。 Ca²⁺ 依存性：その親α−アミラーゼに対してのα−アミラーゼ変異体の低めら れたCa²⁺依存性を達成することに関して〔すなわち、親酵素のために必要である よりも、外来の媒体における低い濃度のカルシウムイオンの存在下で満足する澱 粉分解活性を示し、そしてたとえば、従って、カルシウムイオン−依存性条件、 たとえばカルシウム−錯化剤（たとえば一定の洗剤ビルダー）を含む媒体におい て得られる条件に対して、親よりも低い感受性である変異体を得ることに関して 〕、配列番号１、配列番号２及び配列番号７に示されるアミノ酸配列における１ 又は複数の次の置換（又は本発明におけるもう１つの親α−アミラーゼにおける 同等の置換）を組込むことが特に所望されると思われる：Y243F，K108R，K179R ，K239R，K242 R，K269R，D163N，D188N，D192N，D199N，D205N，D207N，D209N，E190Q，E194Q 、及びN106D 。 配列番号３に示されるアミノ酸配列の場合、特に所望する置換は、相応して（ 同等に）、１又は複数の次の置換であると思われる：K107R，K177R，K237R，K24 0R，D162N，D186N，D190N，D197N，D203N，D205N，D207N，E188Q及びE192Q 。 Ｎ残基によるＤ残基の上記置換又はＱ残基によるＥ残基の置換と同様、Ca²⁺依 存性を減じることへの他の適切な置換は、いづれか他のアミノ酸残基による注目 のＤ及び／又はＥ残基の置換である。 低められたCa²⁺依存性を達成することにおいて重要なものである思われるさら なる置換は、配列番号１、配列番号２及び配列番号７に示されるアミノ酸配列に おいて位置113 及び151 、並びに位置351 及び430 ；並びに配列番号３に示され るアミノ酸配列において位置112 及び150 、及び位置349 及び428 で存在するア ミノ酸残基の対様式置換（又は本発明におけるもう１つの親α−アミラーゼにお ける同等の対様式置換）、すなわち次のアミノ酸残基の対様式置換である： G113＋N151（配列番号１に関して）；A113＋T151（配列番号２及び配列番号７ に関して）；並びにG112＋T150（配列番号３に関して）；並びにL351＋M430（配 列番号１、配列番号２及び配列番号７に関して）；並びにL349＋I428（配列番号 ３に関して）。 低められたCa²⁺依存性を達成することに関してのこのタイプの特に興味ある対 様式置換は次の通りである： G113T＋N151I（配列番号１に関して）； A113T＋T151I（配列番号２及び配列 番号７に関して）；並びに G112T＋T150I（配列番号３に関して）；並びに L351 C＋M430C（配列番号１、配列番号２及び配列番号７に関して）；並びに L349C＋ I428C（配列番号３に関して）。 Ca²⁺依存性のための適切な置換に関しては、酵素コンホメーションを安定化す ることにおいて重要なものであると思われ、そしてたとえば、α−澱粉分解性酵 素内のカルシウム結合部位での又はその部位内へのカルシウムイオンの結合又は 保持の強さを高めることによってこれを達成できると思われるいくつかの他の置 換は、配列番号１、配列番号２及び配列番号７に示されるアミノ酸配列における １又は複数の次の置換（又は本発明におけるもう１つの親α−アミラーゼにおけ る同等の置換）である：G304W,Ｆ，Ｙ，Ｒ，Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｑ，Ｎ；G305A,Ｓ，Ｎ ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｒ，Ｋ；及びH408Q,Ｅ。 配列番号３に示されるアミノ酸配列における相当する（同当の）置換は、次の 通りである：G302W,Ｆ，Ｙ，Ｒ，Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｑ，Ｎ；及びG303A,Ｓ，Ｎ，Ｄ， Ｑ，Ｅ，Ｒ，Ｋ。 低められたCa²⁺依存性を達成することにおいて重要なものであると思われるさ らなる突然変異は、配列番号１に示されるアミノ酸配列における、R181，G182， T183及びG184から選択された位置（又は本発明における親α−アミラーゼの必要 条件を満たすもう１つのα−アミラーゼのアミノ酸配列における同等の位置）で のアミノ酸の対様式欠失（すなわち２つのアミノ酸の欠失）である。従って、そ のような対様式欠失は、次の通りである： R181^*＋G182^*；T183^*＋G184^*；R181^*＋T183^*； G182^*＋T183^*；G182^*＋G184^*；及びR181^*＋G184^* （配列番号１）； R181^*＋G182^*；D183^*＋G184^*；R181^*＋D183^*； G182^*＋D183^*；G182^*＋G184^*；及びR181^*＋G184^* （配列番号２）； R179^*＋G180^*；I181^*＋G182^*；R179^*＋I181^*； G180^*＋I181^*；G180^*＋G182^*；及びR179^*＋G182^* （配列番号３）；及び R181^*＋G182^*；H183^*＋G184^*；R181^*＋H183^*； G182^*＋H183^*；G182^*＋G184^*；及びR181^*＋G184^* （配列番号７）； （又は、本発明における親α−アミラーゼの必要条件を満たすもう１つのα−ア ミラーゼにおけるそれらの対様式欠失の同等物）。 等電点（pI）：予備結果は、α−アミラーゼの洗浄性能、たとえば洗濯性能は 、洗浄流体（洗浄媒体）のpHが注目のα−アミラーゼのためのpI値に近い場合、 最適であることを示唆する。従って、注目の親α−アミラーゼの等電点よりも、 酵素が使用されるべき媒体（たとえば洗浄媒体）のpHに、より良好に適合される 等電点（pI値）を有するα−アミラーゼ変異体を生成することが所望される。 等電点を低めることに関しては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における 好ましい突然変異は、１又は複数の次の置換を包含する：Q86E，R124P，S154D， T183D，V222E，P260E，R310A，Q346E，Q391E，N437E，K440Q及びR452H 。等電点 を低めることにおけるそれらの置換の適切な組合せは次のものを包含する： Q39 1E＋K444Q ；及び Q391E＋K444Q ＋S154D 。 相応して、等電点を低めることに関して、配列番号３に示されるアミノ酸配列 における好ましい突然変異は、１又は複数の次の置換を包含する：L85E，S153D ，I181D，K220E，P258E，R308A，P344E，Q358E 及びS435E 。 等電点を高めることに関しては、配列番号２に示されるアミノ酸配列における 好ましい突然変異は１又は複数の次の置換を包含する：E86Q，Ｌ；D154S ；D183 T，Ｉ；E222V,Ｋ；E260P ；A310R ；E346Q,Ｐ；E437N,Ｓ；及びH452R 。 下記実験セクションにおいては、本発明の多くの変異体の構成が 記載されている。 本発明のα−アミラーゼ変異体は、上記で論ぜられた１又は複数の改良された 性質を有する他に、好ましくは、親α−アミラーゼよりも、低い基質濃度でより 早い澱粉加水分解速度を有するであろう。他方では、本発明のα−アミラーゼ変 異体は好ましくは、同じ条件下で試験される場合、親α−アミラーゼよりも高い Ｖ_max及び／又は低いＫ_mを有するものであろう。ハイブリッドα−アミラーゼの 場合、比較のために使用される“親α−アミラーゼ”は、最良の性能を有する構 成酵素の１つであるべきである。 Ｖ_max及びＫ_m（ミカエリス−メンテンの式のパラメーター）は、良く知られた 方法により決定され得る。α−アミラーゼ変異体の調製方法 遺伝子中への突然変異を導入するためのいくつかの方法が当業界において知ら れている。α−アミラーゼ−コードのDNA 配列のクローニングの手短かな議論の 後、α−アミラーゼ−コードの配列内の特定部位での突然変異を生成するための 方法が論ぜられるであろう。α−アミラーゼをコードするDNA 配列のクローニング 親α−アミラーゼをコードするDNA 配列は、当業界において良く知られている 種々の方法を用いて、問題のα−アミラーゼを生成するいづれかの細胞又は微生 物から単離され得る。最初に、ゲノムDNA 及び／又はcDNAライブラリーが、研究 されるべきα−アミラーゼを生成する微生物からの染色体DNA 又はメッセンジャ ーRNA を用いて構成されるべきである。次に、α−アミラーゼのアミノ酸配列が 知られている場合、相同のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され 、そしてそれを用いて、問題の生物から調製されたゲノムライブラリーからのα −アミラーゼ−コードのクローンが同定 される。他方では、既知のα−アミラーゼ遺伝子に対して相同の配列を含むラベ ルされたオリゴヌクレオチドプローブが、低い緊縮性のハイブリダイゼーション 及び洗浄条件を用いて、α−アミラーゼ−コードのクローンを同定するためのプ ローブとして使用され得る。 α−アミラーゼをコードするクローンを同定するためのさらにもう１つの方法 は、発現ベクター、たとえばプラスミド中へのゲノムDNA のフラグメントの挿入 、得られるゲノムDNA ライブラリーによるα−アミラーゼ陰性細菌の形質転換、 及び次に、α−アミラーゼのための基質を含む寒天上への前記形質転換された細 菌のプレーチング、それにより、α−アミラーゼを発現するクローンの同定を包 含する。 他方では、酵素をコードするDNA 配列は、確立された標準的方法、たとえばS ．L．Beaucage and M．H．Caruthers（1981）により記載されるホスホアミジッ ト法、又はMattesなど.(1984)により記載される方法により合成的に調製され得 る。そのホスホアミジット法においては、オリゴヌクレオチドは、たとえば自動 DNA 合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして 適切なベクターにおいてクローン化される。 最後に、DNA 配列は、標準的技法に従って、合成の、ゲノム起源の又はcDNA起 源のフラグメント（適切な場合、完全なDNA 配列の種々の部分に対応するフラグ メント）を連結することによって調製された、ゲノム及び合成起源のものの混合 、合成及びcDNA起源のものの混合、又はゲノム及びcDNA起源のものの混合であり 得る。前記DNA 配列はまた、たとえば、アメリカ特許第 4,683,202号又はR．K． Saiki など.(1988)に記載されるように、特異的プライマーを用いてのポリメラ ーゼ鎖反応(PCR)により調製され得る。特定部位の突然変異誘発 α−アミラーゼをコードするDNA 配列が単離され、そして突然変異のための所 望の部位が同定されると、突然変異が合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され 得る。それらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位を挟むヌクレオチド 配列を含み；変異体ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成の間に挿入される。 特定の方法においては、α−アミラーゼをコードする配列を架橋する、DNA の一 本鎖ギャップが、α−アミラーゼ遺伝子を担持するベクターにおいて創造される 。次に、所望の突然変異を担持する合成ヌクレオチドが、一本鎖DNA の相同部分 にアニールされる。次に、残るギャップがDNA ポリメラーゼＩ（クレノウフラグ メント）によりフィルインされ、そして構造体がＴ４リガーゼを用いて連結され る。この方法の特定の例は、Morinagaなど.(1984)に記載されている。アメリカ 特許第 4,760,025号は、カセットのマイナーな変更を行なうことによる、複数の 突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種 々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るので、さらに多くの種類の 突然変異がMorinagaの方法により一度に導入され得る。 α−アミラーゼをコードするDNA 配列中に突然変異を導入するもう１つの方法 は、Nelson and Long(1989)に記載されている。それは、PCR 反応におけるプラ イマーの１つとして化学的に合成されたDNA 鎖を用いることにより導入された所 望する突然変異を含むPCR フラグメントの３段階生成を包含する。このPCR によ り生成されたフラグメントから、突然変異を担持するDNA フラグメントが制限エ ンドヌクレアーゼによる切断により単離され、そして発現プラスミド中に再挿入 され得る。ランダム突然変異誘発 ランダム突然変異誘発は、注目の示されるアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の又 は完全な遺伝子内の少なくとも３つの部分における局在化された又は領域特異的 ランダム突然変異誘発として、適切に行なわれる。 熱安定性を改良するための領域特異的突然変異誘発のためには、次のコドン位 置が特に、適切に標的化され得る（一文字アミノ酸略語及び問題の配列における アミノ酸残基の番号付けを使用して）： 配列番号１に示されるアミノ酸配列において： 120−140 ＝ VEVNRSNRNQETSGEYAIEAW 178−187 ＝ YKFRGTGKAW 264−277 ＝ VAEFWKNDLGAIEN 配列番号２に示されるアミノ酸配列において： 120−140 ＝ VEVNPNNRNQEISGDYTIEAW 178−187 ＝ YKFRGDGKAW 264−277 ＝ VAEFWKNDLGALEN 配列番号３に示されるアミノ酸配列において： 119−139 ＝ VEVNPSDRNQEISGTYQIQAW 176−185 ＝ YKFRGIGKAW 262−275 ＝ VGEYWSYDINKLHN 配列番号７に示されるアミノ酸配列において： 120−140 ＝ VEVNPNNRNQEVTGEYTIEAW 178−187 ＝ YKFRGHGKAW 264−277 ＝ VAEFWKNDLGAIEN Ca²⁺依存性の低下を達成するためには、次のコドン位置が特に、適切に標的化 され得る： 配列番号１に示されるアミノ酸配列において： 178−209 ＝ YKFRGTGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADVDMD 237−246 ＝ AVKHIKYSFT 配列番号２に示されるアミノ酸配列において： 178−209 ＝ YKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMD 237−246 ＝ AVKHIKYSFT 配列番号７に示されるアミノ酸配列において： 178−209 ＝ YKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMD 237−246 ＝ AVKHIKYSFT α−アミラーゼ、変性された（たとえば、高い）基質特異性及び／又は基質の 切断（加水分解）に関しての変性された（たとえば、高い）特異性により基質の 改良された結合性（すなわち、α−澱粉分解性酵素のための基質である炭水化物 種、たとえばアミロース又はアミロペクチンの改良された結合性）を達成するた めには、配列番号１に示されるアミノ酸配列についての次のコドン位置（又は本 発明におけるもう１つの親α−アミラーゼのための同等のコドン位置）が特に適 切には、標的化され得ると思われる： 配列番号１に示されるアミノ酸配列において： 15−20 ＝ WYLPND 52−58 ＝ SQNDVGY 72−78 ＝ KGTVRTK 104−111 ＝ VMNHKGGA 165−174 ＝ TDWDQSRQLQ 194−204 ＝ ENGNYDYLMYA 234−240 ＝ RIDAVKH 332−340 ＝ HDSQPGEAL 上記本発明の方法の段階ａ）に従って実施される、親α−アミラーゼをコード するDNA 配列のランダム突然変異誘発は、便利には、当業界において知られてい るいづれかの方法の使用により行なわれ 得る。たとえば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘 発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はPCR 生成され る突然変異誘発にDNA 配列をゆだねることにより実施され得る。さらに、ランダ ム突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいづれかの組合せの使用により行 なわれ得る。 突然変異誘発剤は、トランジッション、トランスバージョン、逆位、スクラン プリング、欠失及び／又は挿入を誘発する剤である。 本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤は、紫外線（UV）照射 、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ MNNG）、ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。 そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発が 起こる適切な条件下で、選択された突然変異誘発剤の存在下で突然変異されるべ き親酵素をコードするDNA 配列をインキュベートし、そして所望する性質を有す る、突然変異誘発されたDNA を選択することによって行なわれる。 突然変異誘発がオリゴヌクレオチドの使用により行なわれる場合、そのオリゴ ヌクレオチドは、変更される予定である位置で、オリゴヌクレオチドの合成の間 、３種の非−親ヌクレオチドによりドープ処理され又はスパイクされ得る。その ドーピング処理及びスパイキングは、所望しないアミノ酸のためのコドンが回避 されるよう行なわれる。ドープ処理された又はスパイクされたオリゴヌクレオチ ドは、たとえばPCR，LCR又はいづれかのDNA ポリメラーゼ及びリガーゼを用いて 、いづれかの公開された技法により、澱粉分解酵素をコードするDNA 中に組込ま れ得る。 PCR −生成される突然変異誘発が用いられる場合、親α−アミラ ーゼ酵素をコードする、化学的に処理された又は処理されていない遺伝子は、ヌ クレオチドの誤った組込みを高める条件下でPCR にゆだねられる(Deshler 1992 ；Lenngなど.，Technique，Vol．1，1989，pp．11-15)。 Ｅ．コリのミューテーター株(Fowlerなど.，Molec．Gen．Genet.，133，1974 ，pp．179-191)、Ｓ．セレビシアエ(S．cereviseae)又はいづれかの他の微生物 が、親酵素を含むプラスミドを用いてミューテーター株を形質転換し、前記プラ スミドを含むミューテーター株を増殖せしめ、そしてミューテーター株から突然 変異誘発されたプラスミドを単離することによって、澱粉分解性酵素をコードす るDNA のランダム突然変異誘発のために使用され得る。続いて、突然変異誘発さ れたプラスミドを用いて、発現生物を形質転換することができる。 突然変異誘発されるべきDNA 配列は便利には、澱粉分解性の親酵素を発現する 生物から調製されたゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。他方 では、DNA 配列は、適切なベクター、たとえば、それ自体、突然変異誘発剤と共 にインキュベートされ又は前記剤に暴露され得るプラスミド又はバクテリオファ ージ上に存在することができる。突然変異誘発されるべきDNA はまた、宿主細胞 のゲノムに組込まれることによって、又はその細胞に含まれるベクター上に存在 することによって宿主細胞に存在することができる。最終的に、突然変異誘発さ れるべきDNA は、単離された形で存在することができる。ランダム突然変異にゆ だねられるべきDNA 配列は好ましくは、cDNA又はゲノムDNA 配列であることが理 解されるであろう。 いくつかの場合、発現段階（ｂ）又はスクリーン段階（ｃ）が行なわれる前、 突然変異誘発されたDNA 配列を増幅することが便利で ある。そのような増幅は当業界において知られている方法に従って行なわれ、こ こで現在、好ましい方法は、親酵素のDNA 又はアミノ酸配列に基づいて調製され たオリゴヌクレオチドプライマーを用いてのPCR 生成される増幅である。 突然変異誘発剤と共にインキュベートし、又はその剤に暴露した後、突然変異 誘発されたDNA は、発現を生ぜしめる条件下で前記DNA を担持する適切な宿主細 胞を培養することによって発現される。この目的のために使用される宿主細胞は 、場合によってはベクター上に存在する突然変異誘発されたDNA 配列により形質 転換された細胞、又は突然変異誘発処理の間、親酵素をコードするDNA 配列を担 持する細胞であり得る。適切な宿主細胞の例は、次のものである：バシラス サ ブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス リケニホルミス（Bacillus lichen iformis）、バシラス レンタス（Bacillus lentus)、バシラス ブレビス（Bac illus brevis）、バシラスステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophi lus）、バシラス アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バシラス ア ミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス コアグラ ンス（Bacillus coagulans）、バシラス サーキュランス（Bacillus circulans ）、バシラス ラウタス（Bacillus lautus）、バシラス メガテリウム（Bacil lus megaterium）、バシラスツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、ス トレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトマイ セス ムリナス（Streptomyces murinus）；及びグラム陰性細菌、たとえばＥ． コリ（E．coli）。 突然変異誘発されたDNA 配列はさらに、突然変異誘発されたDNA 配列の発現を 可能にする機能をコードするDNA 配列を含んで成る。 局在化されたランダム突然変異誘発：ランダム突然変異誘発は、 好都合には、問題の親α−アミラーゼの一部に局在化され得る。これは、たとえ ば、酵素の一定の領域がその酵素の一定の性質のために特に重要なものであると して同定される場合、又は改良された性質を有する変異体をもたらすことが予測 されるよう修飾される場合、好都合であり得る。そのような領域は通常、親酵素 の三次構造が解明され、そして酵素の機能に関連される場合に同定され得る。 局在化されたランダム突然変異誘発は、便利には、上記の PCR−生成される突 然変異誘発技法の使用により、又は当業界において良く知られているいづれかの 他の適切な技法により実施される。 他方では、修飾されるべきDNA 配列の一部をコードするDNA 配列は、たとえば 適切なベクター中に挿入されることによって単離され得、そして続いて、前記部 分は上記で論ぜられたいづれかの突然変異誘発方法の使用により突然変異誘発に ゆだねられ得る。 本発明の上記方法におけるスクリーニング段階に関して、これは便利には、次 の原理に基づくフィルターアッセイの使用により実施され得る： 興味ある突然変異誘発された澱粉分解性酵素を発現することができる微生物が 適切な培地上で及び分泌されるべき酵素のために適切な条件下でインキュベート され、ここで前記培地は第１のタンパク質−結合フィルター及びその上部に、低 いタンパク質結合能力を示す第２フィルターを含んで成る二重フィルターを供給 される。微生物は、第２フィルター上に位置する。インキュベーションに続いて 、微生物から分泌された酵素を含んで成る第１フィルターが、微生物を含んで成 る第２フィルターから分離される。第１フィルターは、所望する酵素活性につい てのスクリーニングにゆだねられ、そして第２フィルター上に存在するその対応 する微生物コロニーが同定される。 酵素活性を結合するために使用されるフィルターは、いづれかのタンパク質結 合フィルター、たとえばナイロン又はニトロセルロースであり得る。発現生物の コロニーを担持する上部フィルターは、タンパク質を結合するための親和性を有 さないか又は低い親和性を有するいづれかのフィルター、たとえば酢酸セルロー ス又はDurapore^TMであり得る。フィルターは、スクリーニングのために使用され るべきいづれかの条件により予備処理され得、又は酵素活性の検出の間、処理さ れ得る。 酵素活性は、色素、螢光、沈殿、pHインジケーター、IR−吸光又は酵素活性の 検出のためのいづれか他の技法により検出され得る。 検出化合物は、いづれかの固定化剤、たとえばアガロース、寒天、ゼラチン、 ポリアクリルアミド、澱粉、フィルター紙、布；又は固定化剤のいづれかの組合 せにより固定され得る。 α−アミラーゼ活性は、アガロース上に固定される、Cibacron Redラベルされ たアミロペクチンにより検出される。高められた熱安定性及び高いpH安定性を有 する変異体についてのスクリーニングのためには、結合されたα−アミラーゼ変 異体を有するフィルターは、pH10.5及び60℃又は65℃で特定の時間、緩衝液にお いてインキュベートされ、脱イオン水によりすばやくすすがれ、そして活性検出 のためにアミロペクチン−アガロースマトリックス上に配置される。残留活性は 、アミロペクチン分解によりCibacron Redの溶解として見られる。その条件は、 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼによる活性がかろう じて検出され得るようであるように選択される。安定化された変異体は、同じ条 件下で、Cibacron Redの高められた発生により高められた色彩強度を示す。 低温で及び／又は広い温度範囲にわたって活性最適度を有する変異体について スクリーニングするためには、結合された変異体を有 するフィルターが、アミロペクチン−Cibacron Red基質プレート上に直接的に配 置され、そして所望する温度（たとえば４℃，10℃又は30℃）で特定の時間イン キュベートされる。この時点で、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するα −アミラーゼによる活性はかろうじて検出され得、ところがより低い温度での最 適な活性を有する変異体はアミロペクチン溶解の上昇を示すであろう。アミロペ クチンマトリックス上でのインキュベーションの前、すべての種類の所望する培 地、たとえばCa²⁺、界面活性剤、EDTA、又は他の適切な添加剤を含む溶液におけ るインキュベーションは、そのような添加剤による問題の変異体の変更された依 存性又は反応についてスクリーンするために実施され得る。ハイブリッドα−アミラーゼの調製方法 他の特定部位の突然変異誘発として、少なくとも２つの構成成分のα−アミラ ーゼのハイブリッドであるα−アミラーゼ変異体は、注目の個々の遺伝子の適切 な部分を組合わせることによって調製され得る。 天然に存在する酵素は一般的に、上記のようにランダム又は特定部位突然変異 誘発により変性され得る。他方では、１つの酵素の一部が、キメラ性酵素を得る ためにもう１つの酵素の一部により置換され得る。この置換は、従来のインビト ロ遺伝子スプライシング技法、又はインビボ組換え技法、もしくは両技法の組合 せにより達成され得る。従来のインビトロ遺伝子スプライシング技法を用いる場 合、α−アミラーゼ遺伝子をコードする配列の所望する部分が適切な部位特異的 制限酵素を用いて欠失され；次に、そのコード配列の欠失された部分が異なった α−アミラーゼをコードする配列の所望する部分への挿入により置換され、その 結果、新規のα−アミラーゼをコードするキメラ性ヌクレオチド配列が生成され る。他方では 、α−アミラーゼ遺伝子は、たとえばHiguchi など．1988により記載されるPCR オーバーレイ拡張方法の使用により融合され得る。 インビボ組換え技法は、高い相同性の領域(DNA配列の同一性)を有する異なっ たDNA セグメントが再結合し、すなわちDNA を分解し、そして交換し、そして前 記相同領域に新規の結合を確立することができる事実に依存する。従って、２種 の異なった、但し相同のアミラーゼ酵素のためのコード配列が宿主細胞を形質転 換するために使用される場合、相同配列のインビボ組換えがキメラ性遺伝子配列 の生成をもたらすであろう。宿主細胞によるそれらのコード配列の翻訳は、キメ ラ性アミラーゼ遺伝子生成物の生成をもたらすであろう。特定のインビボ組換え 技法は、アメリカ特許第 5,093,257号及びヨーロッパ特許第 252,666号に記載さ れている。 他方、ハイブリッド酵素は、当業界において知られている標準の化学方法によ り合成され得る。たとえば、Hunkapiller など.(1984)を参照のこと。従って、 適切なアミノ酸配列を有するペプチドが全体的に又は一部、合成され、そして本 発明のハイブリッド酵素（変異体）を形成するために連結される。α−アミラーゼ変異体の発現 本発明によれば、上記方法又は当業界において知られているいづれかの他の方 法により生成された、変異誘発されたα−アミラーゼ−コードのDNA 配列は、典 型的には制御配列をコードするプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部 位、翻訳開始シグナル、及び場合によっては、リプレッサー遺伝子又は種々の活 性化因子遺伝子を含む発現ベクターを用いて、酵素形で発現され得る。 本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列を担持する組換え発現ベ クターは、便利には組換えDNA 方法にゆだねられ得るいづれかのベクターであり 得、そしてベクターの選択はしばしば、 それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、そのベクタ ーは、自主的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体の複製に無関係で ある染色体外実在物、たとえばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外要 素、ミニクロモソーム、又は人工染色体として存在するベクターである。他方、 前記ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、 そしてそれが組込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。 前記ベクターにおいては、DNA 配列は適切なプロモーター配列に操作可能的に 連結されるべきである。前記プロモーターは、選択された宿主細胞において転写 活性を示すいづれかのDNA 配列であり、そして宿主細胞に対して相同又は非相同 のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。特に細菌宿主において、本発明の α−アミラーゼ変異体をコードするDNA 配列の転写を指図するための適切なプロ モーターの例は、Ｅ．コリlac オペロンのプロモーター、ストレプトマイセス コエリカラー(Streptomyces coelicolor)のアガラーゼ遺伝子dagAプロモーター 、バシラス リケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、 バシラス ステアロサーモフィラスのマルトゲン性アミラーゼ遺伝子（amyM）の プロモーター、バシラス アミロリクエファシエンスのα−アミラーゼ（amyQ） のプロモーター、バシラス サブチリスxylB及びxylB遺伝子のプロモーター、等 である。真菌宿主における転写のためには、有用なプロモーターの例は、Ａ．オ リザエ(A．oryzae)のTAKAアミラーゼ、リゾムカー ミエヘイ(Rhizomucor miehe i)のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）の中性α−アミラ ーゼ、Ａ．ニガーの酸性安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ 、リゾムカー ミエヘイのリパーゼ、Ａ．オリザエのアルカリ プロテアーゼ、Ａ．オリザエのトリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ニ ジランス(A．nidulans)のアセトアミダーゼに由来するものである。 本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、及び本発明のα− アミラーゼをコードするDNA 配列に操作可能的に結合されるポリアデニル化配列 を含んで成る。終結及びポリアデニル化配列は、適切には、プロモーターと同じ 源に由来することができる。 ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてそのベクターの複製を可能にする DNA 配列を含むことができる。そのような配列の例は、プラスミドpUC19，pACYC 177，pUB110，pE194，pAMB1 及びpIJ702の複製の起点である。 ベクターはまた、選択マーカー、たとえば宿主細胞における欠損を補充する遺 伝子、たとえばＢ．サブチリス又はＢ．リケニホルミスからのdal 遺伝子、又は 耐抗生物質性、たとえば耐アンピシリン、耐カナマイシン、耐クロラムフェニコ ール又は耐テトラサイクリン性を付与する遺伝子を含むことができる。さらに、 ベクターは、アスペルギラス選択マーカー、たとえばamdS，argB，niaD及びsC、 耐ヒグロマイシン性を生ぜしめるマーカーを含むことができ、又はその選択は、 たとえばWO91/17243に記載のようにして、同時形質転換により達成され得る。 細胞内発現は、たとえば一定の細菌を宿主細胞として使用する場合、多くの点 で好都合であるが、一般的には、発現は細胞外である。 α−アミラーゼ変異体をコードし、そしてそれぞれプロモーター、ターミネー ター及び他の要素を含む本発明のベクターを構成するために適切な方法は、当業 者に良く知られている〔たとえば、Samb rookなど.(1989)を参照のこと〕。 上記で定義されるような本発明のDNA 構造体又は発現ベクターのいづれかを含 んで成る本発明の細胞は、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え生成において 宿主細胞として好都合には使用される。細胞は、変異体をコードする本発明のDN A 構造体（１又は複数のコピーで）を宿主染色体に組込むことによって、前記構 造体により形質転換され得る。この組込みは一般的には、DNA 配列が細胞におい て安定して維持される場合、好都合であると思われる。宿主染色体中へのDNA 構 造体の組込みは、従来の方法、たとえば相同又は非相同組換えにより行なわれ得 る。他方、細胞は、異なったタイプの宿主細胞に関して、上記のような発現ベク ターにより形質転換され得る。 本発明の細胞は、高等生物、たとえば哺乳類又は昆虫の細胞であり得るが、し かし好ましくは、微生物細胞、たとえば細菌又は菌類（酵母を包含する）細胞で ある。 適切な細菌の例は、グラム陽性細菌、たとえばバシラス サブチリス、バシラ ス リケニホルミス、バシラス レンタス、バシラス ブレビス、バシラス ス テアロサーモフィラス、バシラス アルカロフィラス、バシラス アミロリクエ ファシエンス、バシラスコアグランス、バシラス サーキュランス、バシラス ラウタス、バシラス メガテリウム、バシラス ツリンギエンシス、又はストレ プトマイセス リビダンス又はストレプトマイセス ムリナス、又はグラム陰性 細菌、たとえばＥ．コリである。細菌の形質転換は、たとえば、それ自体知られ ている態様で、プロトプラスト形質転換により、又はコンピテント細胞を用いる ことによってもたらされ得る。 酵母生物は好ましくは、サッカロマイセス(Saccharomyces)又は シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）の種、たとえばサッカロマイセ ス セレビシアエから選択され得る。糸状菌は好都合には、アスペルギラスの種 、たとえばアスペルギラス オリザエ又はアスペルギラス ニガーに属する。真 菌細胞は、それ自体既知の態様でのプロトプラスト形成及びプロトプラストの形 質転換、続く、細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る。アスペル ギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第 238,023号 に記載される。 さらにもう１つの観点において、本発明は、本発明のα−アミラーゼを生成す るための方法に関し、ここで前記方法は、変異体の生成を助ける条件下で上記の ような宿主細胞を培養し、そして細胞及び／又は培養培地から変異体を回収する ことを含んで成る。 細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖し、そして本 発明のα−アミラーゼ変異体の発現を得るために適切ないづれかの従来の培地で あり得る。適切な培地は、商業的な供給者から入手でき、又は公開されたレセピ ー（たとえばAmerican Type Culture Collectionのカタログに記載されるような ）に従って調製され得る。 宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は、培地から細胞を遠心分離又 は濾過により分離し、そして塩、たとえば硫酸アンモニウムによる培地中のタン パク質性化合物を沈殿する既知の方法、続くクロマトグラフィー法、たとえばイ オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又は同様の 方法の使用により培養培地から便利には、回収され得る。産業上の用途 アルカリ性pH値でのそれらの活性により、本発明のα−アミラーゼ変異体は、 種々の産業工程への使用のために十分に適合される。 特に、それらは洗浄、皿洗い及び硬質表面清浄用洗剤組成物における成分として 適用され（上記を参照のこと）、そしてまた、澱粉から甘味剤及びエタノールの 製造においても有用である。従来の澱粉−転換工程及び液化及び／又は糖化工程 のための条件は、たとえばアメリカ特許第 3,912,590号、ヨーロッパ特許第 252 ,730号及びヨーロッパ特許第63,909号に記載される。 本発明のα−アミラーゼ変異体の適用のいくつかの分野は、下記に概略されて いる。 紙−関連の用途：本発明のα−アミラーゼ変異体は、特に再パルプ化が７以上 のpHで生じ、そしてアミラーゼが強化澱粉の分解を通しての廃棄材料の砕解を促 進することができる場合、リグノセルロース材料、たとえばパルプ、紙及び厚紙 の製造において価値ある性質を有する。本発明のα−アミラーゼ変異体は、澱粉 被覆された又は澱粉含有廃棄印刷紙からの紙の製造のためのインキ抜き／再循環 工程への使用のために十分に適合化される。高い白色度の新しい紙を製造するた めに印刷インキを除去することが通常、所望される；本発明の変異体がこの手段 においていかに使用されるかの例は、PCT/DK94/00437に記載されている。 本発明のα−アミラーゼ変異体はまた、澱粉を変性することにおいてもひじょ うに有用であり、ここで酵素的に変性された澱粉はアルカリ性充填剤、たとえば 炭酸カルシウム、カオリン及びクレーと共に紙製造に使用される。本発明のアル カリα−アミラーゼ変異体により、充填剤の存在下で澱粉を変性することが実施 でき、従って、より単純で完全な工程を可能にした。 織物糊抜き：本発明のα−アミラーゼ変異体はまた、織物糊抜きへの使用のた めに十分に適合される。織物加工産業においては、α−アミラーゼは、製織の間 、よこ糸上で保護被膜として作動する澱 粉−含有糊剤の除去を促進するために糊抜き工程において助剤として使用される 。 製織の後、糊剤被膜の完全な除去は、布が精錬され、漂白され、そして染色さ れる続く工程において最適な結果を確保するために重要である。酵素的澱粉分解 は、それが織物又は布の繊維に害を与えないので好ましいものである。 処理費用を減じ、そしてミル処理量を高めるためには、糊抜き工程は、時々、 精錬及び漂白工程と組合される。そのような場合、非酵素助剤、たとえばアルカ リ又は酸化剤が典型的には、従来のα−アミラーゼは高いpHレベル及び漂白剤と ほとんど適合しないので、澱粉を分解するために使用される。澱粉糊剤の非酵素 的分解は、使用されるかなり攻撃的な化学物質のためにいくらかの繊維損傷を導 びく。 比較的高いpHレベルで及び酸化剤（漂白剤）の存在下で改良された澱粉−分解 性能を示す本発明のα−アミラーゼ変異体は、特に、現在使用されている非酵素 糊抜き剤の置換体として、上記のような糊抜き工程への使用のために十分に適合 される。α−アミラーゼ変異体は、セルロース含有布又は織物を糊抜きする場合 、単独で、又はセルロースと共に使用され得る。 ビール製造：本発明のα−アミラーゼ変異体はまた、ビール製造工程において ひじょうに有用であるとも思われており；そのような工程においては、変異体は 典型的には、マッシング工程（麦芽を湯に浸して混合する工程）の間、添加され るであろう。 洗浄又は皿洗いのための洗剤添加剤及び洗剤組成物への適用：上記で論じられ るような性質の改良の結果であろう改良された洗浄及び／又は皿洗い性能のため に、本発明の多くのα−アミラーゼ変異体（ハイブリッドを含む）は、洗剤組成 物、たとえば７〜13のpH範 囲、特に８〜11のpH範囲での実施のために意図された洗剤組成物中への導入のた めに十分に適合化される。本発明によれば、α−アミラーゼ変異体は、洗剤組成 物の成分として添加され得る。それは、洗剤組成物の形で洗剤組成物に含まれ得 る。 従って、本発明のもう１つの観点は、本発明のα−アミラーゼ変異体を含んで 成る洗剤添加剤に関する。前記酵素は、１又は複数の酵素を含む別の添加剤を添 加することによって、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤 を添加することによって、洗剤組成物に含まれ得る。本発明の洗剤添加剤、すな わち分離された添加剤又は組合された添加剤は、たとえば顆粒、液体、スラリー 、等として配合され得る。洗剤添加剤のための好ましい酵素配合物は、顆粒（特 に、非ダスチング顆粒）、液体（特に、安定化された液体）、スラリー又は保護 された酵素（前記を参照のこと）である。 洗剤組成物及び洗剤添加剤はさらに、洗剤に従来使用される１又は複数の他の 酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ、澱粉分解性酵素、オキシダーゼ（ペル オキシダーゼを含む）、又はセルラーゼを含むことができる。 洗浄及び／又は皿洗い性能の実質的な改良点は、α−アミラーゼが他の澱粉分 解性酵素、たとえばプルラナーゼ、イソ−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミロ グルコシダーゼ又はCTG アーゼと組合される場合に得られることが見出された。 前記目的のために適切な市販の澱粉分解性酵素の例は、Novo Nordisk A/S，Bags vaerd，Denmarkから市販されている、AMG^TM，Novamyl^TM及びPromozyme^TMである 。従って、本発明の特定の態様は、少なくとも１種の他の澱粉分解性酵素（たと えば、上記酵素から選択される）と組合しての本発明のα−アミラーゼ変異体を 含んで成る洗剤添加剤に関する。異な った洗剤酵素の組合せが使用される場合、酵素は顆粒化の前又は後で混合され得 る。 液体酵素調製物はたとえば、ポリオール、たとえばプロピレングリコール、糖 又は糖アルコール、乳酸又は硼酸を添加することによって、確立された方法に従 って安定化され得る。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第 238,216号に開示さ れる方法に従って調製され得る。 すでに示されたように、本発明のさらにもう１つの観点は、本発明のα−アミ ラーゼ変異体（ハイブリッドを含む）及び界面活性剤を含んで成る、洗濯、皿洗 い又は硬質表面清浄のための洗剤組成物に関する。 本発明の洗剤組成物は、いづれか便利な形で、たとえば粉末、顆粒又は液体と して存在することができる。液体洗剤は、典型的には、ヨーロッパ特許第 120,6 59号に記載されているように、90％までの水及び０〜20％の有機溶媒を含む水性 洗剤である。洗剤組成物 本発明のα−アミラーゼ変異体が洗剤組成物（たとえば洗濯洗剤組成物又は皿 洗い洗剤組成物）の成分とて使用される場合、それはたとえば、非ダスチング顆 粒、安定化された液体、又は保護された酵素の形で洗剤組成物に含まれ得る。上 記のように、非ダスチング顆粒は、アメリカ特許第 4,106,991号及び第 4,661,4 52号(Novo Industri A/S)に開示されるようにして製造され得、そして場合によ っては、当業界に知られている方法により被覆され得る。ロウ質被覆材料の例は 、1000〜20000 の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチ レングリコール、PEG）；16〜50個の酸化エチレン単位を有するエトキシル化さ れたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含み、そして15〜80 個の酸化エチレ ン単位が存在するエトキシル化された脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸 ；及び脂肪酸のモノ−及びジ−並びにトリグリセリドである。液体層技法による 適用のために適切なフィルム形成被膜の例は、GB 1483591に与えられている。 液体酵素調製物の形で添加される酵素は、上記のように、確立された方法に従 って、ポリオール、たとえばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸 又は硼酸の添加により安定化され得る。 本発明の洗剤組成物への包含のための保護された酵素は、ヨーロッパ特許第 2 38,216号に開示される方法に従って、上記のようにして調製され得る。 本発明の洗剤組成物は、いづれかの便利な形で、たとえば粉末、顆粒、ペース ト又は液体として存在することができる。液体洗剤は、典型的には70％までの水 及び０〜30％有機溶媒を含む水性洗剤、又は非水性洗剤であり得る。 洗剤組成物は、アニオン性、非イオン性、カチオン性又は両親媒性（両性イオ ン）である１又は複数の界面活性剤を含んで成る。洗剤は通常、０〜50％のアニ オン性界面活性剤、たとえば線状アルキルベンゼンスルホネート(LAS)、α−オ レフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフ ェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート(AEOS又はAES)、第二アルカ ンスルホネート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアル ケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。それはまた、０〜40％の非イオン性界面 活性剤、たとえばアルコールエトキシレート(AEO又はAE)、アルコールプロポキ シレート、カルボキシル化されたアルコールエトキシレート、ノニルフェノール エトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、 エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノ ールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（たとえばWO92/06154に 記載されるような）を含むことができる。 洗剤組成物はさらに、１又は複数の他の酵素、たとえばプルラナーゼ、エステ ラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ 又はオキシダーゼ、たとえばラッカーゼを含むことができる。 通常、洗剤は、１〜65％の洗剤ビルダー（いくつかの皿洗い用洗剤は90％まで の洗剤ビルダーを含むことができるけれども）、又は錯生成剤、たとえばゼオラ イト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、シトレート、ニトリ ロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミンの四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五 酢酸(DTMPA)、アルキル−又はアルキレン琥珀酸、可溶性シリケート又は層状化 されたシリケート（たとえば、Hoechst からの SKS−６）を含む。 洗剤ビルダーは、リン含有及び非リン含有タイプに分割され得る。リン含有無 機アルキル洗剤ビルダーの例は、水溶性塩、特にアルカリ金属ピロホスフェート 、オルトホスフェート、ポリホスフェート、及びホスホネートを包含する。非リ ン含有無機ビルダーの例は、水溶性アルカリ金属カーボネート、ボレート及びシ リケート、及び層状化されたジシリケート、並びに種々のタイプの水不溶性結晶 性又は非晶性アルミノシリケート（ゼオライトが最とも知られている代表物であ る）を包含する。 適切な有機ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウム又は置換されたアン モニウム塩、たとえばスクシネート、マロネート、脂肪マロネート、脂肪スルホ ネート、カルボキシメトキシスクシネート、ポリアセテート、カルボキシレート 、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、及びポリアセチルカル ボキシレートを包含する。 洗剤はまた、洗剤ビルターを実質的に含まない。 洗剤は１又は複数のポリマーを含むことができる。例は、カルボキシメチルセ ルロース(CMC；典型的にはナトリウム塩の形での)、ポリ（ビニルピロリドン） （PVP）、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、 ポリカルボキシレート、たとえばポリアクリート、ポリマレエート、マレイン酸 ／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー である。 洗剤組成物は、塩素／臭素タイプ及び酸素タイプの漂白剤を含むことができる 。漂白剤は被覆され、又はカプセルを封入され得る。無機塩素／臭素タイプの漂 白剤の例は、リチウム、ナトリウム又はカルシウム次亜塩素酸塩又は次亜臭素酸 塩、及び塩素化されたリン酸三ナトリウムである。漂白剤システムはまた、H₂O₂ 源、たとえば過酸形成漂白活性剤、たとえばテトラアセチルエチレンジアミン（ TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）と組合され得る過硼 酸塩又は過酸酸塩を含んで成る。 有機塩素／臭素タイプの漂白剤の例は、複素環式Ｎ−ブロモ及びＮ−クロロイ ミド、たとえばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロ モイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、及び水可溶性カチオン、たとえ ばカリウム及びナトリウムとのそれらの塩である。ヒダントイン化合物もまた適 切である。漂白剤システムはまた、たとえばアミド、イミド又はスルホンタイプ のペルオキシ酸を含んで成る。 皿洗い用洗剤においては、たとえば無機過酸塩の形での、好ましくは漂白剤前 駆体を有する又はペルオキシ酸化合物としての酸素漂白剤が好ましい。適切なペ ルオキシ漂白化合物の典型的な例は、アルカリ金属過硼酸塩、四水和物及び一水 和物、アルカリ金属過炭酸 塩、過珪酸塩及び過リン酸塩である。好ましい活性剤材料はTAED又はNOBSである 。 本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤、たとえばポリオール、たとえ ばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、 又は硼酸誘導体、たとえば芳香族ボレートエステルを用いて安定化され得、そし て前記組成物はたとえば、WO92/19709及びWO92/19708に記載されるようにして配 合され得る。 本発明の酵素はまた、たとえばタンパク質タイプ（EP0544777 B1に記載されるよ うな）又は硼酸タイプの可逆性酵素インヒビターを添加することによっても安定 化され得る。 洗剤はまた、他の従来の洗剤成分、たとえば布コンディショナー、たとえばク レー、解膠剤材料、フォームブースター／フォーム抑制剤（皿洗い洗剤フォーム 抑制剤において）、石鹸泡抑制剤、耐蝕性剤、土壌−懸濁剤、抗−土壌−再沈着 剤、顔料、脱水剤、殺菌剤、螢光増白剤又は香料を含むことができる。 pH（使用濃度での水溶液において測定される）は、通常、中性又はアルカリ性 、たとえば７〜11の範囲で存在するであろう。 本発明の範囲内の洗濯用洗剤組成物の特定の形は、次のものを包含する： １）下記成分を含んで成る少くとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物として 配合される洗剤組成物： ２）下記成分を含んで成る少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし て配合される洗剤組成物： ３）下記成分を含んで成る少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし て配合される洗剤組成物： ４）下記成分を含んで成る少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし て配合される洗剤組成物： ５）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： ６）下記成分を含んで成る構築された水性液体洗剤組成物： ７）下記成分を含んで成る少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし て配合される洗剤組成物： ８）下記成分を含んで成る粒質物として配合される洗剤組成物： ９）下記成分を含んで成る粒質物として配合される洗剤組成物： 10）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： 11）下記成分を含んで成る水性液体洗剤組成物： 12）下記成分を含んで成る少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし て配合される洗剤組成物： 13）すべての又は一部の線状アルキルベンゼンスルホネートが（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈） アルキルスルフェートにより置換されている、１）〜12）に記載されるような洗 剤配合物。 14）下記成分を含んで成る少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし て配合される洗剤組成物： 15）下記成分を含んで成る少なくとも600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし て配合される洗剤組成物： 16）追加の成分として又はすでに特定された漂白剤システムの置換体として、 安定化された又は封入された過酸を含む、１）〜15）に記載されるような洗剤配 合物。 17）過硼酸塩が過炭酸塩により置換されている、１），３），７），９）及び 12）に記載されるような洗剤組成物。 18）さらにマンガン触媒を含む、１），３），７），９），12），14）及び15 ）に記載されるような洗剤組成物。マンガン触媒は、たとえば“Efficient mang anese catalysts for low-temperature bleaching”，Nature 369，1994，pp．6 37-639 に記載される化合物の１つであり得る。 19）液体非イオン性界面活性剤、たとえば線状アルコキシル化第一アルコール 、ビルダーシステム（たとえばホスフェート）、酵素及びアルカリを含んで成る 非水性洗剤液体として配合される洗剤組成物。その洗剤はまた、アニオン性界面 活性剤及び／又は漂白システムも含むことができる。 本発明の範囲内の皿洗い洗剤組成物の特定の形は次の通りである： １）粉末自動皿洗い組成物： ２）粉末自動皿洗い組成物： ３）粉末自動皿洗い組成物： ４）粉末自動皿洗い組成物： ５）粉末自動皿洗い組成物： ６）清浄界面活性剤システムを有する粉末及び液体皿洗い組成物： ７）非水性液体自動皿洗い組成物： ８）非水性液体皿洗い組成物： ９）チキソトロープ性液体自動皿洗い組成物： 10）液体自動皿洗い組成物： 11）保護された漂白剤粒子を含む液体自動皿洗い組成物： 11）過硼酸塩が過炭酸塩により置換されている、１），２），３），４），６ ）及び10）に記載されるような自動皿洗い組成物。 12）マンガン触媒をさらに含む、１）〜６）に記載されるような自動皿洗い組 成物。マンガン触媒は、たとえば“Efficient manganese catalysts for low-te mperature bleaching”，Nature 369，1994，pp．637-639 に記載される化合物 の１つであり得る。 本発明のα−アミラーゼは、洗剤において従来使用される濃度で導入され得る 。本発明の洗剤組成物においては、α−アミラーゼ変異体は、洗浄／皿洗い流体 １ｌ当たりα−アミラーゼ 0.00001〜１mg（純粋な酵素タンパク質として計算さ れる）に対応する量で添加され得る。 本発明は添付図面によりさらに説明される。 図１は、本発明における親α−アミラーゼのアミノ酸配列の整合図である。最 左端上の数字は、次のようなそれぞれのアミノ酸配列を示す： １：配列番号１に示されるアミノ酸配列； ２：配列番号２に示されるアミノ酸配列； ３：配列番号３に示されるアミノ酸配列；及び ４：配列番号７に示されるアミノ酸配列。 図の最右端上の数字は、問題の配列の個々のためのアミノ酸の連続合計数を与 える。３の番号付けされた配列（配列番号３に示されるアミノ酸配列に対応する ）に関して、その整合は、１（配列番号１）、２（配列番号２）及び４（配列番 号７）の番号付けされた配列において、それぞれアミノ酸番号１及びアミノ酸番 号175 に対応する位置での“ギャップ”をもたらす。 図２は、プラスミドpTVB106 の制限地図である。 図３は、プラスミドpPM103の制限地図である。 図４は、プラスミドpTVB112 の制限地図である。 図５は、プラスミドpTVB114 の制限地図である。 実験セクション 配列番号１及び配列番号２（それぞれバシラス株NCIB 12512及びNCIB 12513か ら）に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼの調製、精製及び配列決 定は、WO95/26397に記載されている。それらの２種のα−アミラーゼ（WO95/263 97に記載されている）のpI値及び分子量は次の通りである： 配列番号１：pI＝約 8.8〜9.0（LKB Ampholine^TMPAGプレート上での等電点電 気泳動により決定される）；分子量＝約55kD（SDS-PAGEにより決定される）。 配列番号２：pI＝約5.8（LKB Ampholine^TM PAGプレート上での等電点電気泳動 により決定される）；分子量＝約55kD（SDS-PAGEにより決定される）。本発明のα−アミラーゼ変異体の精製 本発明の変異体の構成及び発現は、下記例２に記載される。本発明の変異体の 精製は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列の変異体に 関して本明細書において例示される。 配列番号１の変異体（pI＝約9.0）の精製：発現されたα−アミラーゼ変異体 を含む発酵液体を濾過し、そして硫酸アンモニウムを添加し、15％の飽和濃度に する。次に、前記液体を疎水性カラム（Toyopearl ブチル／TOSOH)上に適用する 。カラムを20mMのジメチル−グルタル酸緩衝液(pH7.0)により洗浄する。α−ア ミラーゼをひじょうにきつく結合し、そして20mMのジメチルグルタル酸緩衝液(p H7.0)中、25％（ｗ／ｗ）２−プロパノールにより溶出する。溶出の後、２−プ ロパノールを蒸発により除去し、そしてその濃縮物を、20mMのジメチルグルタル 酸緩衝液(pH6.0)により平衡化されたカチ オン交換体（Ｓ−Sepharose^TM FF，Pharmacia，Sweden）上に適用する。 アミラーゼを、同じ緩衝液中、０〜250mM のNaClの線状グラジエントを用いて 溶出する。10mMの硼素酸塩／KCl 緩衝液(pH8.0)に対しての透析の後、サンプル をpH9.6に調整し、そして10mMの硼素酸塩／KCl 緩衝液(pH9.6)により平衡化され たアニオン交換体（Ｑ−Sepharose^TM FF，Pharmacia）に適用する。アミラーゼ を０〜250mM のNaClの線状グラジエントを用いて溶出する。そのpHを7.5 に調整 する。α−アミラーゼは、rSDS−PAGEにより調節される場合、純粋である。すべ ての緩衝液は、アミラーゼを安定化するために２mMのCaCl₂を含む。 配列番号２の変異体(pI＝約5.8)の精製：発現されたα−アミラーゼ変異体を 含む発酵液体を濾過し、そして硫酸アンモニウムを添加し、15％の飽和濃度にす る。次に、液体を疎水性カラム(Toyopearlブチル／TOSOH)上に適用する。結合さ れたアミラーゼを、10mMのトリス緩衝液(pH8.0)中、15％〜０％（ｗ／ｗ）の硫 酸アンモニウムの線状グラジエントにより溶出する。10mMの硼酸塩／KCl 緩衝液 (pH8.0)に対しての溶出物の透析の後、液体を、同じ緩衝液により平衡化された アニオン交換体（Ｑ−Sepharose^TM FF，Pharmacia）上に適用する。アミラーゼ を、150mMのNaClを用いて段階的に溶出する。 溶出の後、アミラーゼサンプルを、同じ緩衝液(pH8.0)に対して透析し、NaCl を除去する。透析の後、pHを9.6 に調整し、そしてアミラーゼをアニオン交換体 上にもう１度、結合する。アミラーゼを０〜250mM のNaClの線状グラジエントを 用いて溶出する。pHを7.5に調整する。アミラーゼは、rSDS−PAGEにより決定さ れる場合、純粋である。すべての緩衝液は、アミラーゼを安定化するために２mM のCaCl₂を含む。α−アミラーゼ活性の決定 法により決定する。Phadehas錠剤（Pharmacia Diagnosticにより供 緩衝液物質と共に混合され、そして錠剤化された、架橋された不溶性の青色の澱 粉ポリマーを含む。あらゆる一回の測定値の決定のためには、１つの錠剤が、50 mMの Britton−Robinson緩衝液（50mMの酢酸、50mMのリン酸、50mMの硼酸、0.1m M のCaCl₂，pHはNaOHにより興味ある値に調整される）５mlを含む管において懸 濁される。試験は、興味ある温度で水槽において行なわれる。試験されるべきα −アミラーゼは、50mMの Britton−Robinson緩衝液×mlに希釈される。このα− アミラーゼ溶液１mlを、50mMの Britton−Robinson緩衝液５mlに添加する。澱粉 をα−アミラーゼにより加水分解し、可溶性の青色フラグメントを付与する。62 0nm で分光光度計により測定される前記青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活 性の関数である。 15分間（試験時間）のインキュベーション後での測定された 620nmでの吸光度 は、620nm で0.2〜2.0 の吸光度単位の範囲で存在することは重要である。この 吸光度範囲においては、活性と吸光度との間に直線性が存在する（Lambert−Bee r法）。従って、酵素の希釈度は、この基準に適合するよう調節されるべきであ る。 特定された組の条件（温度、pH、反応時間、緩衝液の条件）下で、与えられた α−アミラーゼ１mgは一定量の基質を加水分解し、そして青色が生成されるであ ろう。その色の強度を 620nmで測定する。測定された吸光度は、与えられた組の 条件下で問題のα−アミラーゼの比活性（活性／１mgの純粋なα−アミラーゼタ ンパク質）に 直接的に比例する。従って、同一の条件下で興味ある種々のα−アミラーゼ（対 照のα−アミラーゼを包含する、この場合、問題の親α−アミラーゼ）を試験す る場合、与えられた温度及びpHでの個々のα−アミラーゼの比活性を直接的に比 較することができ、そして対照のα−アミラーゼの比活性に対する興味ある個々 のα−アミラーゼの比活性の割合を決定することができる。ミニ皿洗いアッセイ 次のミニ皿洗いアッセイを行なった：澱粉性材料の懸濁液を煮沸し、そして20 ℃に冷却した。その冷却された澱粉懸濁液を小さな、それぞれ同定されているガ ラスプレート（約２×２cm）上に適用し、そして乾燥キャビネットにおいて約 1 40℃の温度で乾燥せしめた。次に、個々のプレートを計量した。アッセイ目的の ためには、55℃の温度を有する標準のヨーロッパタイプの自動皿洗い洗剤（５ｇ ／ｌ）の溶液を調製した。洗剤を１分間、溶解せしめ、この後、問題のα−アミ ラーゼを前記洗剤溶液（磁気撹拌器を備えたビーカーに含まれる）を添加し、0. 5mg／ｌの酵素濃度を付与した。同時に、小さな支持用クランプに保持された、 計量測定されたガラスプレートを、α−アミラーゼ／洗剤溶液において実質的に 垂直な位置で含浸せしめ、次にこれを55℃で15分間、撹拌した。次に、ガラスプ レートをα−アミラーゼ／洗剤溶液から除去し、蒸留水によりすすぎ、乾燥キャ ビネットにおいて60℃で乾燥せしめ、そして再び計量した。問題のα−アミラー ゼの性能〔選択された対照のα−アミラーゼに対する指数として表わされる−下 記例（例１）においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する親α−ア ミラーゼ〕を、次の通りに、処理の前及び処理の後、ガラスプレートの重量の差 異から決定した： 次の例は本発明を、さらに例示する。それらは、例示的であって、本発明を制 限するものではない。例１．配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラー ゼの変異体のミニ皿洗い試験 上記ミニ皿洗い試験を、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する親α−ア ミラーゼ及び次のその変異体（その構成及び精製は下記に説明される）によりpH 10.5で実施した。：T183^*＋G184^*； Y243F ；及びK269R。その試験は次の結果を 与えた： 親（配列番号１） 指数：100 T183^*＋G184^* 指数：120 Y243F 指数：120 K269R 指数：131 試験された変異体T183^*＋G184^*（親α−アミラーゼよりも高い熱安定性を示す ）、Y243F（親α−アミラーゼよりも低いカルシウムイオン依存性を示す）及びK 269R（親α−アミラーゼよりも低いカルシウムイオン依存性及び高いpHでの高い 安定性を示す）の個々は、親α−アミラーゼに対して有意に改良された皿洗い性 能を示すことが明らかである。例２．それぞれ配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列 を有する親α−アミラーゼの変異体の作製 プライマー：下記のような変異体の構成に使用されるDNA プライマーは、次の ものを包含する〔すべてのDNA プライマーは５’から３’の方向に（左から右の 方向に）書かれている；Ｐは５’ホスフェートを示す〕： ♯7113： GCT GCG GTG ACC TCT TTA AAA AAT AAC GGC Y296 ： CC ACC GCT ATT AGA TGC ATT GTA C ♯6779： CTT ACG TAT GCA GAC GTC GAT ATG GAT CAC CC ♯6778： G ATC CAT ATC GAC GTC TGC ATA CGT AAG ATA GTC ♯3811： TT A(C/G)G GGC AAG GCC TGG GAC TGG ♯7449： C CCA GGC CTT GCC C(C/G)T AAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG ♯3810： G GTT TCG GTT CGA AGG ATT CAC TTC TAC CGC ♯7450： GCG GTA GAA GTG AAT CCT TCG AAC CGA AAC CAG Ｂ１： GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C ♯6616： P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C ♯8573： CTA CTT CCC AAT CCC AAG CTT TAC CTC GGA ATT TG ♯8569： CAA ATT CCG AGG TAA AGC TTG GGA TTG GGA AGT AG ♯8570： TTG AAC AAC CGT TCC ATT AAG AAGＡ．配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼ の変異体の構成 プラスミドpTVB106 の記載：配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する親α −アミラーゼ及びその変異体は、図２に示される、プラスミドを生む遺伝子、す なわちSF16から発現される。プラスミドpTVB106 は、プラスミドpUB110(Gryczan など.，1978)から得られた複製の起点及びクロラムフェニコールに対して耐性 を付与するcat 遺伝子を含む。アミラーゼの分泌は、それぞれ配列番号４及び配 列番号１に示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列（成熟タンパク質）を有する 親α−アミラーゼをコードする遺伝子に正確に融合されるTermamyl^TMシグナル配 列、すなわち成熟タンパク質のコドン No.１により助けられる。前記Termamylプ ロモーターは、遺伝子の転写を開始せしめる。 プラスミドpTVB106 は、pDN1528 に類似する（デンマーク特許出願第1155／94 号を参照のこと。いくつかのユニーク制限部位、たとえばBstBＩ，BamHＩ，BstE II，EcoNＩ， DrdＩ， AflIII， DraIII， XmaＩ， SalＩ及びBglII図２におけ るプラスミド地図上に示されている。 変異体M202T の構成：PCR オーバーラップ拡張突然変異誘発方法を用いて、こ の変異体を構成する(Higuchiなど.，1988)。pTVB106の約 350bpのDNA フラグメ ントを、プライマー♯7113及び突然変異誘発性プライマー♯6778を用いてPCR 反 応Ａにおいて増幅する。類似するPCR 反応Ｂにおいては、約 300bpのDNA フラグ メントを、プライマーY296及び♯6779を用いて増幅する。プライマー♯7113から プライマーY296に突然変異部位（M202）を結合する完全なDNA フラグメントを、 それらのプライマー、及び反応Ａ及びＢからの精製されたDNA フラグメントを用 いてPCR 反応Ｃにおいて増幅する。 PCR 反応ＣのDNA を制限エンドヌクレアーゼBstEII及び AflIIIにより消化し 、そして 480bpのフラグメントを、同じ酵素により消化 されたプラスミドpTVB106 により連結し、そして低−プロテアーゼ及び低−アミ ラーゼバシラス カブチリス株（たとえばWO92/11357に言及される株SHA273）を 形質転換する。 他のM202変異体を類似する態様で構成する。 変異体T183^*＋G184^*及びR181^*＋G182^*の構成：PCR オーバーラップ拡張突然変 異誘発方法を用いて、それらの変異体を構成する(Higuchiなど.，1988)。突然変 異誘発性オリゴヌクレオチドを、１つの位置におけるＣ及びＧの混合物（等しい 部分）を用いて合成し；従って、２つの異なった突然変異をこの方法により構成 することができる。pTVB106 の約 300bpのDNA フラグメントを、プライマー♯71 13及び突然変異誘発性プライマー♯7449を用いてPCR 反応Ａにおいて増幅する。 類似するPCR 反応Ｂにおいて、約 400bpのDNA フラグメントを、プライマーY296 及び♯3811を用いて増幅する。プライマー♯7113からプライマーY296に突然変異 部位(アミノ酸 181−184)を結合する完全なDNA フラグメントを、それらのプラ イマー、及び反応Ａ及びＢからの精製されたDNA フラグメントを用いてPCR 反応 Ｃにおいて増幅する。 PCR 反応ＣのDNA を制限エンドヌクレアーゼBstEII及び AflIIIにより消化し 、そして 480bpのフラグメントを、同じ酵素により消化されたプラスミドpTVB10 6 により連結し、そして低−プロテアーゼ及び低−アミラーゼＢ．サブチリス株 （たとえばWO92/11357に言及される株SHA273）を形質転換する。それらの形質転 換体からのプラスミドDNA の配列決定は、２つの正しい突然変異、すなわちR181^* ＋G182^*及びT183^*＋G184^*を同定する。 変異体R124P の構成：PCRオーバーラップ拡張突然変異誘発方法を用いて、変 異体M202T（前記を参照のこと）の構成に類似する態様でこの変異体を構成する 。PCR 反応Ａ（プライマー♯3810及びＢ１ ）は約 500bpのフラグメントを生成し、そしてPCR 反応Ｂ（プライマー7450及び Y296）は約 550bpのフラグメントを生成する。PCR 反応Ａ及びＢの生成物、及び プライマーＢ１及びY296に基づくPCR 反応Ｃを制限エンドヌクレアーゼBstEII及 び AflIIIにより消化し、そしてアミノ酸位置124 を結合するその得られる 480b pのフラグメントを、同じ酵素により消化されたpTVB106 中にサブクローン化し 、そして前記のようにしてＢ．サブチリスを形質転換する。 変異体R124P ＋T183^*＋G184^*の構成：R124P 及びT183^*＋G184^*突然変異を組合 す変異体の構成のために、２つのEcoNＩ制限部位（１つは位置 1.774kbで、すな わちR124P 突然変異とT183^*＋G184^*突然変異との間に位置し、そして１つは位置 0.146kbで位置する）を用いた。T183^*＋G184^*突然変異を含むpTVB106 様プラス ミドの約1630bpのEcoNＩフラグメントを、同じ酵素により消化されたR124P 突然 変異を含むもう１つのpTVB106 様プラスミドのベクター部分（複製の起点を含む 約3810bpのDNA フラグメント）中にサブクローン化した。バシラスサブチリスの 形質転換は、前記のようにして実施された。 変異体G182^*＋G184^*；R181^*＋T183^*；Y243F ；K269R；及びL351C ＋M430C の 構成 ：それらの変異体を次の通りに構成した：配列番号１に示されるアミノ酸配 列のためのコード領域の主要部分を含む特定の突然変異誘発ベクターを調製した 。このベクター（pPM103と称する）の重要な特徴は、pUC プラスミドに由来する 複製の起点、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するcat 遺伝子及びbla 遺伝子のフレームシフト突然変異含有バージョン（この野生型バージョンは通常 、アンピシリンに対する耐性を付与する（amp^R表現型））を包含する。bla 遺伝 子のこの突然変異誘発されたバージョンは、amp^S表現型をもたらす。プラスミド pPM103は図３に示さ れており、そして複製のＥ．コリ起点、SF16アミラーゼ遺伝子の５’−切断され たバージョン、及びori，bla，cat 及び選択された制限部位が、プラスミド上に 示されている。 突然変異は、Deng and Nickoloff〔Anal．Biochem．200(1992)，pp．81-88〕 により記載されるように興味ある遺伝子に導入される。但し、導入される“選択 プライマー”（♯6616）を有するプラスミドは、Deng and Nickoloffにより概略 された制限酵素消化による選択を用いる代わりに修復されたbla 遺伝子を有する プラスミドを含む形質転換されたＥ．コリ細胞の amp^R表現型に基づいて選択さ れる。突然変異誘発のために使用される化学物質及び酵素は、Stratageneからの Chameleon^TM突然変異誘発キット（カタログ番号200509）から得られた。変異体 プラスミドにおけるDNA 配列の確認の後、所望する変更を含む切断された遺伝子 を、約1440bpのBstBＩ− SalＩフラグメントとしてpPM103様プラスミドからpTVB 106 中にサブクローン化し、そして変異体酵素の発現のためにバシラス サブチ リスを形質転換した。 対様式欠失変異体G182^*＋G184^*の構成のためには、次の突然変異誘発プライマ ーを使用した： P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT TGT CCT GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG 対様式欠失変異体R181^*＋T183^*の構成のためには、次の突然変異誘発プライマ ーを使用した： P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT GCC TCC GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG 置換変異体Y243F の構成のためには、次の突然変異誘発プライマーを使用した ： P ATG TGT AAG CCA ATC GCG AGT AAA GCT AAA TTT TAT ATG TTT CAC TGC ATC 置換変異体K269R の構成のためには、次の突然変異誘発プライマーを使用した ： P GC ACC AAG GTC ATT TCG CCA GAA TTC AGC CAC TG 対様式置換変異体 L351C＋M430C の構成のためには、次の突然変異誘発プライ マーが同時に使用した： １）P TGT CAG AAC CAA CGC GTA TGC ACA TGG TTT AAA CCA TTG ２）P ACC ACC TGG ACC ATC GCT GCA GAT GGT GGC AAG GCC TGA ATT 変異体L351C ＋M430C ＋T183^*＋G184^*の構成：この変異体を、同じ酵素により 消化されたpTVB106 様プラスミド（T183^*＋G184^*突然変異を有する）中に L351C ＋M430C を含む約1430bpのHindIII−AflIIIフラグメントをサブクローン化する ことによって、L35C＋M430C 対様式置換突然変異及びT183^*＋G184^*対様式欠失突 然変異を組合すことにより構成した。 変異体Y243F ＋T183^*＋G184^*の構成：この変異体を、同じ酵素により消化され たpTVB106 様プラスミド（Y243突然変異を有する）中に、T183^*＋G184^*を含む約 1148bpの DrdＩフラグメントをサブクローン化することによって、Y243F 突然変 異及びT183^*＋G184^*突然変異を組合すことにより構成した。 バシラス サブチリス形質転換体を澱粉含有寒天プレート上でのα−アミラー ゼ活性についてスクリーンし、そして正しい突然変異の存在をDNA 配列決定によ り調べた。 変異体Y243F ＋T183^*＋G184^*＋L351C ＋M430C の構成：M430C対象置換変異を 、約470bp のXmal− SalＩ断片として、同じ酵素で消化されたpTVB106 様ベクタ ー（Y243F ＋T183^*＋T184^*を含有する）にサブクローニングした。 変異体Y243F ＋T183^*＋G184^*＋L351C ＋M430C ＋Q391E ＋K444Q の構成：突然 変異Y243F ＋T183^*＋G184^*＋L351C ＋M430C を含むpPM103様ベクターを、問題の ５つの突然変異を含むpTVB106 様ベクターの約1440bpのBstB１−SalＩフラグメ ントにより、pPM103におけるSF16の切断されたバージョンを置換することにより 構成した。Q391E 及びK444Q 突然変異を、pPM103に対しての上記突然変異誘発に 類似する態様で次の２つの突然変異誘発プライマーの使用によりpPM103様ベクタ ー（Y243F ＋T183^*＋G184^*＋L351C ＋M430C を含む）中に同時に導入した： P GGC AAA AGT TTG ACG TGC CTC GAG AAG AGG GTC TAT P TTG TCC CGC TTT ATT CTG GCC AAC ATA CAT CCA TTTＢ．配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する親α−アミラーゼ の変異体の構成 プラスミドpTVB112 の記載：配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するα− アミラーゼの、Ｂ．サブチリスにおける発現のために使用される、pTVB112 と称 するベクターを構成した。このベクターはpTVB106 にひじょうに類似する。但し 、配列番号２の成熟α−アミラーゼをコードする遺伝子がpTVB106 における Pst Ｉ及びHindIII部位間に挿入される。従って、α−アミラーゼ（配列番号２）の 発現はまた、amyLプロモーター及びシグナル配列により指図される。プラスミド pTVB112 は図４に示される。 変異体D183^*＋G184^*の構成：この変異体の構成を、前記で言及されたPCR オー バーラップ拡張突然変異誘発方法（前記を参照のこと）を用いて達成した。プラ イマー♯8573及びＢ１をPCR 反応Ａに使用し、そしてプライマー♯8569及び♯85 70をPCR 反応Ｂに使用した。反応Ａ及び反応Ｂからの精製されたフラグメント及 びプライマー１Ｂ及び♯8570をPCR 反応Ｃに使用し、約1020bpのDNA フラグメ ントをもたらした。このフラグメントを制限エンドヌクレアーゼ PstＩ及び Mlu Ｉにより消化し、そして発現ベクター中にサブクローン化し、そしてＢ．サブチ リスを形質転換した。 追加の変異体の構成：配列番号１のアミノ酸配列の変異体の生成に使用される プラスミドpPM103の構成（前記参照のこと）に類似して、プラスミド（pTVB114 と称する；図５に示される）を、変異体D183^*＋G184^*（配列番号２）に対する連 続した突然変異誘発のために構成した。突然変異は、pPM103（配列番号１）のた めの態様に類似する態様でpTVB114(配列番号２；D183^*＋G184^*)に導入された。 対様式欠失変異体R181^*＋D183^*及びR181^*＋G182^*の構成のために、配列番号２ のための野生型遺伝子における特定されたアミノ酸を欠失する代わりに、変異体 D183^*＋G184^*におけるフランキングアミノ酸を変更することが選択された。次の 突然変異誘発プライマーが、鋳型としてのpTVB114による突然変異誘発のために 使用された： PCC CAA TCC CAA GCT TTA CCA(T/C)CG AAC TTG TAG ATA CG。 １つの位置での２つの塩基の混合物（Ｔ／Ｃ）の存在は、１つの突然変異誘発 プライマーに基づく２つの異なった欠失フランキングアミノ酸の存在を可能にす る。得られるプラスミドのDNA 配列決定は、１つの又は他の突然変異の存在を確 認する。対象の突然変異誘発された遺伝子を、同じ酵素により消化されたpTVB11 2 中に PstＩ− DraIIIフラグメントとしてサブクローン化し、そしてＳ．サブ チリスを形質転換する。 G182^*＋G184^*及びR181^*＋G184^*の構成のために、次の突然変異誘発プライマー が鋳型としてのpTVB114 による突然変異誘発のために使用された： PCC CAA TCC CAA GCT TTA TCT C(C/G)G AAC TTG TAG ATA CG。 前述のように、１つの位置での２つの塩基の混合物（Ｃ／Ｇ）の存在は、１つ の突然変異誘発プライマーに基づく２つの異なった欠失フランキングアミノ酸の 存在を可能にする。得られるプラスミドのDNA 配列決定は、１つの又は他の突然 変異の存在を確認する。対象の突然変異誘発された遺伝子を、同じ酵素により消 化されたpTVB112 中に PstＩ− DraIIIフラグメントとしてサブクローン化し、 そしてＳ．サブチリスを形質転換する。 D183^*＋G184^*＋M202L の構成のためには、次の突然変異誘発プライマーが使用 された： PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAC AGT AAA TAA TC。 D183^*＋G184^*＋M202I の構成のためには、次の突然変異誘発プライマーが使用 された： PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAA ATT AAA TAA TC。例３．配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する 親α−アミラーゼのM202置換変異体の酸化安定性の決定 Ａ．配列番号１における配列の変異体の酸化安定性 過酸化水素が 200mMの最終濃度を付与するために添加される（時間ｔ＝０で） 、50mMの Britton−Robinson緩衝液(pH9.0)（50mMの酢酸、50mMのリン酸、50mM の硼酸、0.1mM のCaCl₂，NaOHにより興味ある値に調節されたpH）におけるそれ ぞれの変異体の溶液を用いて、測定が行なわれた。次に、その溶液を、水槽にお いて40℃でインキュベートした。 過酸化水素の添加の後、５，10，15及び20分間のインキュベーションの後、残 留α−アミラーゼ活性を、上記Phadebasアッセイを用いて測定した。サンプル中 の残留活性を、37℃で、50mMの Britton−Robinson緩衝液(pH7.3)を用いて測定 した（Novo Nordisk A/Sか ら要求に応じて入手できるNovo分析出版物 AF207−１／１を参照のこと）。活性 の低下が、過酸化水素と共にインキュベートされていない（100％活性）０分で の同じ酵素の対応する対照溶液に対して測定された。 時間の関数としての初期活性の％が、親酵素（配列番号１）及び問題の変異体 のために下記表に示される。 試験されたM202置換変異体のすべては、親α−アミラーゼ（配列番号１）に対 しての酸化に対して有意に改良された安定性を明確に示す。Ｂ．配列番号２における配列の変異体の酸化安定性 測定は、それぞれ、問題の親α−アミラーゼ（配列番号２）、変異体M202L ＋ D183^*＋G184^*（下記表においてＬとして示される）及び変異体M202I ＋D183^*＋G 184^*（下記表においてＩとして示される）を用いて上記のようにして行なわれた 。この場合、５，10，15及び30分のインキュベーション時間（過酸化水素の添加 の後）が 使用された。上記表におけるように、時間の関数としての初期活性の％が、親酵 素及び問題の変異体について下記表に示される。 試験される２種の“置換＋対様式欠失”変異体（両者とも、M202置換を包含す る）は明確に、親α−アミラーゼ（配列番号２）に対しての酸化に対して有意に 改良された安定性を示す。例４．配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する 親α−アミラーゼの変異体の熱安定性の決定 Ａ．配列番号１における配列の対様式欠失変異体の熱安定性 測定は、50mMの Britton−Robinson緩衝液（前記参照のこと）（pH9.0）にお けるそれぞれの変異体の溶液を用いて行なわれた。溶液を水槽において65℃でイ ンキュベートし、そしてサンプルを、示される期間のインキュベーションの後、 採取した。個々のサンプルの残留α−アミラーゼ活性を、上記のようにして、Ph adebasアッセイを用いて測定した。活性の低下が、インキュベートされなかった (100％活性)０分で、同じ酵素の対応する参照溶液に対して測定された。 時間の関数としての初期活性の％が、親酵素（配列番号１）及び次の問題の対 様式欠失変異体のために下記表に示される。 変異体１：R181^*＋G182^* 変異体２：R181^*＋T183^* 変異体３：G182^*＋G184^* 変異体４：T183^*＋G184^* 変異体５：T183^*＋G184^*＋R124P 試験された対様式欠失変異体のすべては親α−アミラーゼ（配列番号１）に対 して有意に改良された熱安定性を示し、そして変異体４の対様式欠失突然変異の 他に、置換R124P を包含する変異体５の熱安定性は他の変異体のものよりも著し く高いことが明らかである。置換変異体R124P(置換R124P のみを含む)について の熱量結果は親α−アミラーゼに対して約７℃の熱安定性を示すので、それぞれ 、突然変異R124P 及び対様式欠失の熱安定効果がお互い強化すると思われる。Ｂ．配列番号２における配列の対様式欠失変異体の熱安定性 対応する測定は、親酵素（配列番号２）及び次の対様式欠失変異体のために行 なわれた： 変異体Ａ：D183^*＋G184^* 変異体Ｂ：R181^*＋G182^* 変異体Ｃ：G182^*＋G184^* 再び、問題の対様式欠失変異体は、親α−アミラーゼ（配列番号２）に対して 有意に改良された熱安定性を示すと思われる。Ｃ．配列番号１における配列の多数組合せ変異体の熱安定性 対応する比較測定がまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列の次の変異体の ために行なわれた： 変異体４：T183^*＋G184^* 変異体６：L351C ＋M430C 変異体７：Y243F 変異体８：Q391E ＋K444Q 変異体９：T183^*＋G184^*＋L351C ＋M430C ＋Y243F ＋Q391E ＋K444Q 再び、複数の突然変異（個々は熱安定効果を有する）の熱安定効果は少なくと も定性的に、累積性であると思われる。 例５本発明のα−アミラーゼ変異体のカルシウム結合親和性 熱又は変性剤、たとえばグアニジン塩酸塩への暴露によるアミラーゼの変性が 、螢光の低下により付随される。カルシウムイオンの損失は変性を導びき、そし てカルシウムに対する一連のα−アミラーゼの親和性は、十分に長時間（たとえ ば55℃で22時間）、異なった濃度のカルシウム（たとえば１μＭ〜１００mM の 範囲での）又は異なった濃度のEGTA（たとえば１〜1000μＭの範囲での）〔EGTA ＝１，２−ジ（２−アミノエトキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸 〕と共に緩衝液（たとえば50mMの HEPES，pH７）において個々のα−アミラーゼ （たとえば10μｇ／mlの濃度での）をインキュベートする前及びインキュベート した後の螢光測定により測定され得る。 測定された螢光Ｆは、酵素の変性されていない形及び変性された形を形成する ためへの寄与から成る。次の等式が、カルシウム濃度（〔Ca〕）に対するＦの依 存性を説明するために誘導され得る： Ｆ＝〔Ca〕／（Ｋ_diss＋〔Ca〕）（α_N−β_Nlog（〔Ca〕））＋ Ｋ_diss／（Ｋ_diss＋〔Ca〕）（α_U−β_Ulog（〔Ca〕）） ここで、α_Nは酵素の活性（変性されていない）形の螢光であり、β_Nはカルシ ウム濃度の対数に対するα_Nの線状依存性であり（実験的に観察されるように） 、α_Uは変性された形の螢光であり、そしてβ_Uはカルシウム濃度の対数に対する α_Uの線状依存性である。Ｋ_dissは次のような平衡工程のための見掛けのカルシ ウム−結合定数である： 実際、変性はひじょうにゆっくりと進行し、そして不可逆的である。変性の速度 はカルシウム濃度に依存し、そして一定のα−アミラーゼのための依存性は酵素 のCa−結合親和性の測定を提供する。標準組の反応条件（たとえば55℃で22時間 ）を定義することによって、異なったα−アミラーゼのためのＫ_dissの意義深い 比較が行なわれ得る。一般的に、α−アミラーゼのためのカルシウム解離曲線は 上記等式に適合され、Ｋ_dissのその対応する値の測定が可能にされる。 Ｋ_dissについての次の値が、配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配 列を有する親α−アミラーゼのために、及び示されるα−アミラーゼ変異体のた めに本発明に従って得られた（親α−アミラーゼは括弧で示されている）： 後者のα−澱分解性酵素のカルシウム−結合親和性は上記表を通して下方向に つれて低下し、すなわち対様式欠失変異体D183^*＋G184^*（配列番号２）は最とも 強くカルシウムを結合するが（すなわち、最低のカルシウム依存性を有する）、 ところが配列番号１の親 α−アミラーゼは最とも弱くカルシウムを結合する（すなわち、最高のカルシウ ム依存性を有する）ことが、上記から明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (31)優先権主張番号 １０９７／９５ (32)優先日 1995年９月29日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １１２１／９５ (32)優先日 1995年10月６日 (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ボルチャート，トルベン ベデル デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に 示されるアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を有し；又は（ii）１又は複 数の前記アミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を示し；そして／又は１つの前 記アミノ酸配列を有するα−アミラーゼに対して生じさせた抗体との免疫学的交 差反応性を示し；そして／又は１つの前記アミノ酸配列を有するα−アミラーゼ をコードするDNA 配列と同じプローブとハイブリダイズするDNA 配列によりコー ドされる親α−アミラーゼの変異体であって；前記変異体においては、 （ａ）前記親α−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されてお り；そして／又は （ｂ）前記親α−アミラーゼの少なくとも１つのアミノ酸残基が異なったアミ ノ酸残基により置換されており；そして／又は （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸残基が前記親α−アミラーゼに対して挿入さ れており； 前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、そして前記親α−アミラーゼに対し ての次の性質の少なくとも１つを示し：高められた熱安定性；酸化に対しての高 められた安定性；及び低められたCa²⁺依存性；但し、前記変異体のアミノ酸配列 は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号７に示されるア ミノ酸配列のいづれとも同一でないことを特徴とする変異体。 ２．前記親α−アミラーゼの少なくとも１つの酸化可能アミノ酸残基が欠失さ れており、又は前記酸化可能アミノ酸残基よりも酸化に対して低い感受性である 異なったアミノ酸残基により置換されている請求の範囲第１項記載の変異体。 ３．前記酸化可能アミノ酸残基が、メチオニン、トリプトファン、システイン 及びチロシンから成る群から選択される請求の範囲第２項記載の変異体。 ４．前記酸化可能アミノ酸残基が、配列番号１に示されるアミノ酸残基のM9， M10，M105，M202，M208，M261，M309，M382，M430 又はM440であり、又はそれら に対して同等のメチオニンである請求の範囲第２又は３項記載の変異体。 ５．配列番号１に示されるアミノ酸配列における次の置換：M9L; M10L ; M105 L ; M202L，Ｔ，Ｆ，Ｉ，Ｖ；M208L ; M261L ; M309L ; M382L ; M430L ; M440L の１つであるか、又はそれらに対して同等のメチオニン置換を含んで成る請求 の範囲第４項記載の変異体。 ６．前記メチオニン残基がトレオニンにより置換されている請求の範囲第３〜 ５のいづれか１項記載の変異体。 ７．配列番号１に示されるアミノ酸配列のF180，R181，G182，T183，G184又は K185であるか、又はそれらに対して同等の少なくとも１つのアミノ酸が欠失され ている請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の変異体。 ８．前記欠失されたアミノ酸が、前記アミノ酸残基のいづれか２種の残基又は それらの２種の残基に対して同等である請求の範囲第７項記載の変異体。 ９．前記欠失が、R181^*＋G182^*；又はT183^*＋G184^*であるか、又はそれに対し て同等である請求の範囲第８項記載の変異体。 10．配列番号１に示されるアミノ酸配列における次の置換：K269R ; P260E ; R124P ; M105F，Ｉ，Ｌ，Ｖ；M208F,Ｗ，Ｙ；L217I ；V206I,Ｌ，Ｆの１つであ るか、又はそれに対して同等のアミノ酸置換を含んで成る請求の範囲第１〜９の いづれか１項記載の変異体。 11．配列番号１に示されるアミノ酸配列における次の置換：Y243F ; K108R ; K179R ; K239R ; K242R ; K269R ; D163N ; D188N ; D192N ; D199N ; D205N ; D207N ; D209N ; E190Q ; E194Q ; N106D の１つであるか、又はそれに対して同 等のアミノ酸置換を含んで成る請求の範囲第１〜10のいづれか１項記載の変異体 。 12．請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載のα−アミラーゼをコードするDN A配列を含んで成るDNA構造体。 13．請求の範囲第12項記載のDNA構造体を担持する組換え発現ベクター。 14．請求の範囲第12項記載のDNA 構造体又は請求の範囲第13項記載のベクター により形質転換される細胞。 15．微生物である請求の範囲第14項記載の細胞。 16．細菌又は菌類である請求の範囲第15項記載の細胞。 17．グラム陽性細菌、たとえばバシラス・サブチリス、バシラス・リケニホル ミス、バシラス・レンタス、バシラス・ブレビス、バシラス・ステアロサーモフ ィラス、バシラス・アルカロフィラス、バシラス・アミロリクエファシエンス、 バシラス・コアグランス、バシラス・サーキュランス、バシラス・ラウタス、バ シラス・ツリンギエンシス、又はストレプトマイセス・リビダンスもしくはスト レプトマイセス・ムリナス、又はグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリである請求 の範囲第16項記載の細胞。 18．請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載のα−アミラーゼ変異体を生成す るための方法であって、請求の範囲第14〜17のいづれが１項記載の細胞が、前記 α−アミラーゼ変異体の生成の助けとなる条件下で培養され、そして前記α−ア ミラーゼ変異体が続いて、培養物から回収されることを含んで成る方法。 19．洗浄及び／又は皿洗いへの請求の範囲第１〜11のいづれか１ 項記載のα−アミラーゼ変異体の使用。 20．請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載のα−アミラーゼ変異体を、場合 によっては、非ダスチング粒質物、安定化された液体又は保護された酵素の形で 含んで成る洗剤添加剤。 21．前記添加剤１ｇ当たり酵素タンパク質0.02〜200mg を含んで成る請求の範 囲第20項記載の洗剤添加剤。 22．さらに、他の酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ 、もう１つの澱粉分解性酵素、及び／又はセルラーゼを含んで成る請求の範囲第 20又は21項記載の洗剤添加剤。 23．請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載のα−アミラーゼ変異体、及び界 面活性剤を含んで成る洗剤組成物。 24．さらに、他の酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ 、もう１つの澱粉分解性酵素及び／又はセルラーゼを含んで成る請求の範囲第23 項記載の洗剤組成物。 25．請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載のα−アミラーゼ変異体、及び界 面活性剤を含んで成る手動又は自動皿洗い用洗剤組成物。 26．さらに、他の酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ 、もう１つの澱粉分解性酵素及び／又はセルラーゼを含んで成る請求の範囲第25 項記載の皿洗い用洗剤組成物。 27．請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載のα−アミラーゼ変異体、及び界 面活性剤を含んで成る手動又は自動洗濯用組成物。 28．さらに他の酵素、たとえばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、 もう１つの澱粉分解性酵素及び／又はセルラーゼを含んで成る請求の範囲第27項 記載の洗濯用組成物。 29．織物糊抜きへの請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載のα−アミラーゼ 変異体の使用。