PT1538155E

PT1538155E - Variantes da amilase

Info

Publication number: PT1538155E
Application number: PT05002888T
Authority: PT
Inventors: Allan Svendsen; Henrik Bisgard-Frantzen; Torben Vedel Borchert
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2007-06-05
Also published as: JP2008178412A; EP0815208B1; DK0815208T3; ES2226609T3; ATE360026T1; CN1624124A; DE69637036D1; EP2455468A3; US20110177990A1; DK1538155T3; DE69636408D1; ATE335077T1; AU4483396A; ES2226609T1; BR9607735A; DE69636408T2; AR000862A1; JPH11503003A; EP1538155A2; EP2455468A2

Description

DESCRIÇÃO

VARIANTES DA AMILASE

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a variantes da α-amilase com propriedades melhoradas em relação à enzima de origem (por exemplo, estabilidade térmica e/ou oxidação melhoradas e/ou dependência reduzida do ião cálcio), e portanto com um rendimento na lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça melhoradas (e/ou desengomagem têxtil). A invenção refere-se também a construções de ADN que codificam as variantes, e a vectores e células que albergam as construções de ADN. A invenção adicionalmente refere-se a métodos para produzir as variantes da amilase, e a aditivos de detergentes e composições de detergentes que compreendem as variantes da amilase. A invenção refere-se ainda à utilização das variantes da amilase para a desengomagem têxtil e para a produção de adoçantes e do etanol a partir de amido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Há já vários anos que as enzimas da α-amilase têm vindo a ser utilizadas industrialmente e numa variedade de objectivos diferentes, sendo o mais importante a liquefacção do amido, a desengomagem têxtil, a modificação do amido no papel e na indústria da pasta de papel, e na fabricação da cerveja e na cozedura. Outra utilização das α-amilases que está a tornar-se muito importante é a eliminação das manchas amiláceas durante a lavagem da roupa ou da lavagem da louça. 1

Nestes últimos anos têm sido feitas tentativas para construir variantes da α-amilase com propriedades melhoradas no que se refere a utilizações específicas como por exemplo a liquefacção do amido e a desengomagem têxtil.

Por exemplo, o Pedido de Patente US 5,093,257 descreve a-amílases quiméricas que compreendem uma parte N-terminal de uma α-amilase de B. stearothermophilus e uma parte C-terminal de uma α-amilase de B. licheniformís. As α-amilases quiméricas destacam por ter propriedades únicas, como por exemplo uma estabilidade térmica diferente, quando comparadas com a α-amilase de origem. No entanto, todas as α-amilases quiméricas especificamente descritas mostraram ter uma diminuição da actividade enzimática quando comparadas com as α-amílases de origem. O Pedido de Patente EP 252 666 descreve as amilases híbridas da fórmula geral Q-R-L, em que Q é um resíduo do polipeptídeo N-terminal de 55 a 60 resíduos de aminoácidos, o que é pelo menos 75% homólogo aos 57 resíduos de aminoácidos N-terminais de uma α-amilase específica de B. amyloliquefaciens, R é um polipéptideo especifico, e L é um polipeptídeo C-terminal compreendendo de 390 a 400 resíduos de aminoácidos que são pelo menos 75% homólogos aos 395 resíduos de aminoácidos C-terminais de uma α-amilase especificada de B. licheniformís.

Suzuki et al. (1989) descrevem as α-amilases quiméricas, nas que as regiões especificadas de uma <x-amilase de B. amyloliquefaciens foram substituídas pelas regiões correspondentes de uma α-amilase de B. licheniformís. As a-amiiases quiméricas foram construídas com o fim de identificar as regiões responsáveis pela estabilidade térmica. Foi descoberto que estas regiões incluíam 177-186 resíduos de aminoácidos e 255-270 resíduos de aminoácidos da α-amilase de B. amyloliquefaciens. As alterações dos resíduos de aminoácidos nas 2 α-amilases quiméricas parece que não afectaram outras propriedades das enzimas além da sua estabilidade térmica. 0 Pedido de Patente WO 91/00353 descreve mutantes da a-amilase que diferem da sua α-amilase de origem em pelo menos um resíduo de aminoácido. Foi estabelecido que os mutantes da a-amilase descritos no dito Pedido de Patente mostram propriedades melhoradas para a aplicação na degradação do amido e/ou a desengomagem têxtil devido às suas substituições de aminoácidos. Alguns dos mutantes apresentam estabilidade melhorada, mas não foi registado ou indicado nenhum aumento da actividade enzimática. Os únicos mutantes exemplificados são preparados a partir de uma α-amilase de origem de B. licheníformis e conduzem a uma das seguintes mutações: H133Y ou H133Y + T149I. Outra mutação sugerida é A111T. O Pedido de Patente FR 2,676,456 descreve mutantes da a-amilase de B. licheníformis, em que o resíduo de aminoácido na proximidade de His 133 e/ou um resíduo de aminoácido na proximidade de Ala 209 foram substituídos por um resíduo de aminoácido mais hidrofóbico. Foi referido que os mutantes resultantes da α-amilase têm uma estabilidade térmica melhorada e são úteis na indústria têxtil, do papel, na fabricação da cerveja e na liquefacção do amido. O Pedido de Patente EP 285 123 descreve um método para realizar a mutagénese aleatória de uma sequência de nucleotídeo. Como um exemplo desta sequência é mencionado uma sequência de nucleotídeos que codifica uma α-amilase de B. stearothermophilus. Quando muíada, é obtida uma variante da a-amilase com actividade melhorada a baixos valores de pH.

Em nenhuma das referências anteriores é mencionado ou mesmo sugerido que os mutantes da α-amilase na Indústria dos Detergentes podem ser construídos com propriedades melhoradas. O Pedido de Patente EP 525 610 refere-se a enzimas mutantes com estabilidade melhorada para agentes tensioactivos iónicos (tensioactivos). As enzimas mutantes foram produzidas substituindo um resíduo de aminoácido na parte da superfície da enzima de origem por outro resíduo de aminoácido. A única enzima mutante especificamente descrita no Pedido de Patente EP 525 610 é uma protease. A amilase é mencionada como um exemplo de uma enzima que pode obter uma estabilidade melhorada para os agentes tensioactivos iónicos, mas o tipo de amilase, a sua origem ou mutações específicas nâo são especificadas. 0 Pedido de Patente WO 94/02597 descreve mutantes da a-amilase que mostram estabilidade e actividade melhoradas na presença de agentes oxidantes. Nas α-amilases mutantes, um ou mais resíduos de metionina foram substituídos por resíduos de aminoácidos diferentes de Cys e Met. Foi estabelecido que os mutantes da a-amilase são úteis como aditivos de detergentes e/ou de detergentes de lavagem da louça assim como para a desengomagem têxtil. O Pedido de Patente WO 94/18314 descreve mutantes da a-amilase oxidativamente estáveis, incluídas as mutações na posição Ml97 de α-amilase de B. licheniformis. O Pedido de Patente EP 368 341 descreve a utilização da pululanase e outras enzimas amilolíticas opcionalmente em combinação com uma α-amilase para a lavagem da roupa e e para a lavagem da louça. 4

Um objecto da presente invenção é o de prover variantes da a-amilase que - no que se refere à sua α-amilase de origem -possuam propriedades melhoradas importantes, inter alia, em relação com a sua eficácia na lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça das variantes em questão, por exemplo estabilidade térmica aumentada, estabilidade aumentada para a oxidação, dependência reduzida do ião Ca*T e/ou estabilidade melhorada ou actividade na região do pH de relevância, em por exemplo, na lavagem da roupa ou na lavagem da louça. Estas variantes das a-amilases têm a vantagem, entre outras, de poder ser empregues numa dosagem menor do que a sua α-amilase de origem. Além de que, as variantes da α-amilase podem ser capazes de eliminar manchas amiláceas que não podem, ou só com dificuldade, podem ser eliminadas com as enzimas do detergente da a-amilase conhecida na actualidade.

RESUMO DA INVENÇÃO

Um objectivo do trabalho subjacente à presente invenção foi o de melhorar, se possível, a estabilidade de, inter alia, as cc-amilases particulares que são obteníveis a partir das cepas de Bacillus e que elas próprias tenham sido seleccionadas com base na sua eficácia na eliminação do amido em meios alcalinos (como por exemplo nas soluções de detergentes como normalmente empregues na lavagem da roupa ou na lavagem da louça) em relação a muitas das α-amilases comercialmente disponíveis habitualmente. Relacionado com o referido acima, os presentes inventores surpreendentemente descobriram que efectivamente é possível melhorar as propriedades dos tipos anteriormente mencionados (vide supra) desta α-amilase de origem por modificação judiciosa de um ou maís resíduos de aminoácídos em várias regiões da sequência de aminoácídos da α-amilase de origem. A presente invenção está baseada nestes resultados. 5

Consequentemente, num primeiro aspecto a presente invenção refere-se a variantes de uma α-amilase de origem, a α-amilase de origem em questão apresenta pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID N°. 3, em que a variante compreende a supressão de pelo menos dois aminoácidos equivalentes a R179 e G180 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3, tendo a dita variante actividade α-amilase e exibindo pelo menos uma das seguintes propriedades relativas à dita α-amílase de origem: estabilidade térmica aumentada; estabilidade aumentada para a oxidação; e dependência de Ca2+ reduzida.

Uma variante da α-amilase da invenção deve cumprir a condição de ser uma variante que não tenha uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N° . 1, na SEQ ID N°. 2, na SEQ ID N°. 3 ou na SEQ ID N°. 7.

As sequências de ADN que codificam as três primeiras sequências de aminoácidos da α-amilase em questão são mostradas na SEQ ID N°. 4 (que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1). A SEQ ID N°. 5 (que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2) e a SEQ ID N°. 6 (que codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3).

As sequências de aminoácidos das α-amilases de origem da SEQ ID N°. 1 e da SEQ ID N°. 2, e as sequências de ADN correspondentes (SEQ ID N°. 4 e SEQ IID N°. 5. respectivamente) estão também descritas no Pedido de Patente WO 95/26397 (com os mesmos números de SEQ ID que os da presente invenção).

As variantes de acordo com a invenção têm elas próprias actividade (x-amiiase e exibem pelo menos uma das seguintes propriedades em relação à α-amilase de origem.: 6 estabilidade térmica aumentada, isto é retenção satisfatória da actividade enzimática a uma temperatura superior à adequada para ser utilizada com a enzima de origem: estabilidade à oxidação aumentada, isto é resistência aumentada à degradação por oxidantes (como por exemplo oxigénio, agentes oxidantes de branqueamento e outros); dependência de Ca2+ reduzida, isto é a capacidade para funcionar de maneira satisfatório na presença de uma concentração de Ca2+ inferior que no caso da a-amilase de origem. As α-amilases com esta dependência de Ca2+ reduzida são altamente desejáveis para serem utilizadas nas composições de detergentes, dado que estas composições habitualmente contêm quantidades relativamente grandes de substâncias (como por exemplo fosfatos, EDTA e outras) que ligam fortemente os iões cálcio.

Exemplos de outros melhoramentos ou modificações desejáveis das propriedades (em relação à α-amilase de origem em questão) que podem ser obtidas com uma variante de acordo com a invenção são: estabilidade aumentada e/ou actividade α-amilolítica com valores de pH neutros até valores relativamente elevados, por exemplo com valores de pH na faixa de 7 a 10.5, assim como na faixa de 8.5 a 10.5/ actividade α-amilolítica aumentada com temperaturas relativamente elevadas, por exemplo com temperaturas na faixa de 4 0 a 7 0 0 C; aumento ou diminuição do ponto Isoeléctrico (pi) para melhor relacionar o valor do pi para a variante da α-amilase em questão com o pH do meio (por exemplo um meio de lavagem da roupa, meio de lavagem da louça ou meio de desengomagem têxtil) no qual a variante deve ser empregue (vide infra) ; e 7 ligação melhorada de um tipo particular de substrato, especificidade melhorada para um substrato, e/ou especificidade melhorada em relação à clivagem (hidrólise) dc substrato.

Uma sequência de aminoácidos é considerada como sendo X% homóloga à α-amilase de origem se uma comparação das respectivas sequências de aminoácidos, realizada via algoritmos conhecidos, como os descritos por Lipman & Pearson em Science 227 (1985) p. 1435, revela uma identidade de X%. 0 programa informático GAP do pacote GCG, versão 7.3 (Junho 1993), pode ser utilizado adequadamente, empregando valores pré-estabelecidos para penalizações de GAP [Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711].

No contexto da presente invenção, "eficácia melhorada" em conexão com a lavagem da roupa e com a lavagem da louça, como já foi acima indicado, pretende significar, uma remoção melhorada, durante a lavagem da roupa ou da lavagem da louça, respectivamente, das manchas amiláceas, isto é as manchas que contêm amido. A sua eficácia pode ser determinada nas experiências de lavagem da roupa e da lavagem da louça habituais e a melhora pode ser avaliada como uma comparação com a eficácia da α-amilase de origem em questão. Um exemplo de um "mini teste de lavagem da louça" a pequena escala em que pode ser utilizado um indicador da eficácia da lavagem da louça é descrito na secção experimental, abaixo.

Será entendido que uma variedade de diferentes caracteristicas de uma variante da α-amílase, incluindo a actividade especifica, especificidade do substrato, Km (a assim chamada"constante de Michaelis" na equação de Michaelis-Menten), Vmax [o nível máximo (valor de patamar) da conversão de um substrato dado determinado na base da equação de Michaelis-Menten], pi, pH óptimo, temperatura óptima, activação térmica, estabilidade para agentes oxidantes ou agentes tensioactivos (por exemplo nos detergentes), etc., tomadas sozinhas ou em combinação, podem contribuir para uma eficácia melhorada. 0 técnico especializado será consciente de que a eficácia da variante, sozinha não pode, ser prognosticada na base das caracteristicas anteriores, mas deverá estar acompanhado por testes de eficácia da lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça.

Noutros aspectos a invenção refere-se a uma construção de ADN que compreende uma sequência de ADN que codifica uma variante da α-amilase da invenção, um vector de expressão recombinante que transporta a construção de ADN, uma célula que está transformada com a construção de ADN ou o vector, assim como um método para produzir uma variante da α-amilase para o cultivo desta célula sob condições propicias para a produção da variante da a-amilase, após o qual a variante da α-amilase é recuperada do cultivo.

Noutro aspecto a invenção refere-se a um método de preparação de uma variante da α-amilase de origem que em virtude das suas propriedades melhoradas como o acima descrito exibe uma eficácia melhorada da lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça em comparação com a α-amilase de origem. Este método compreende: a) a construção de uma população de células que contêm genes que codificam variantes da dita α-amilase de origem, b) a triagem da população de células pela actividade a-amilase sob condições que simulam pelo menos uma condição da lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça, c) o isolamento de uma célula da população que contém um gene que codifica uma variante da dita α-amilase de origem que tenha 9 actividade melhorada em comparação com a α-amilase de origem sob as condições seleccionadas na fase b), d) o cultivo da célula isolada na fase c) sob umas condições adequadas num meio de cultivo apropriado, e e) recuperar a variante da α-amilase obtida a partir do cultivo da fase d). A invenção refere-se ainda a uma variante (que é uma variante de acordo com a invenção) preparada por este último método.

No presente contexto, a expressão "simulando pelo menos uma condição de lavagem de roupa e/ou de lavagem de louça" é destinada a indicar uma simulação de, por exemplo, a temperatura ou o pH prevalecente durante a lavagem da roupa ou da lavagem da louça, ou da composição química de uma composição de detergente para ser utilizada no tratamento da lavagem da roupa ou da lavagem da louça. A expressão "composição química" é destinada a incluir um, ou uma combinação de dois ou mais, constituintes da composição de detergente em questão. Os constituintes de várias composições detergentes diferentes são adicionalmente abaixo listadas. A "população de células" referida na fase a) pode adequadamente ser construída mediante a clonagem de uma sequência de ADN que codifica uma α-amilase de origem e submetendo o ADN a uma mutagénese sítio dirigida ou aleatória como o descrito na presente invenção.

No presente contexto a designação "variante" é utilizada de forma permutável com a designação "mutante". A designação "variante" é destinada a incluir α-amilases híbridas, isto é a- amilases que compreendem partes de pelo menos duas enzimas a- 10 amilolíticas diferentes. Assim, este híbrido pode ser construído, por exemplo, a partir de: uma ou mais partes cada uma delas derivando de uma variante como já acima definido; ou uma ou mais partes cada uma delas derivando de uma variante como o já acima definido, e uma ou mais partes cada uma delas derivando de uma α-amilase de origem não mutada. Em relação a isto, a invenção refere-se também a um método para produzir esta α-amilase híbrida com uma eficácia de lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça melhorado em comparação com quaisquer das suas enzimas constituintes (isto é em comparação com quaisquer das enzimas que contribuem com uma parte para o híbrido), em que este método compreende: a) recombinar in vivo ou in vítro a zona da codificação N-terminal de um gene da α-amilase ou ADNc correspondente de uma das α-amilases constituintes com a zona de codificação C-terminal de um gene da α-amilase ou ADNc correspondente de outra α-amilase constituinte para formar recombinantes, b) seleccionar recombinantes que produzem uma α-amilase híbrida com uma eficácia de lavagem da roupa e/ou lavagem da louça melhorada em comparação com quaisquer das suas oc-amiiases constituintes, c) cultivar recombinantes seleccionados na fase b) sob condições adequadas num meio de cultivo apropriado, e d) recuperar a α-amilase híbrida obtida a partir do cultivo na fase c).

Noutros aspectos a invenção refere-se à utilização de uma variante da α-amilase da invenção [incluída qualquer variante ou híbrido preparado por um dos métodos acima mencionados ] como 11 uma enzima para detergente, em particular para a lavagem da roupa ou para a lavagem da louça, a um aditivo detergente e uma composição de detergente que compreende a variante da a-amilase, e à utilização de uma variante da α-amilase da invenção para a desengomagem têxtil. A mutagénese aleatória pode ser utilizada para gerar variantes de acordo com a invenção, e a invenção refere-se ainda a um método de preparação de uma variante da α-amilase de origem, em que este método compreende (a) submeter uma sequência de ADN que codifica a α-amilase de origem a uma mutagénese aleatória, (b) expressar numa célula hospedeira a sequência de ADN mutada obtida na fase (a), e (c) seleccionar as células hospedeiras que expressam uma enzima amilolitica mutada que tenha propriedades melhoradas de acordo com o acima descrito (propriedades como por exemplo dependência de cálcio diminuída, estabilidade à oxidação aumentada, estabilidade térmica aumentada, e/ou actividade melhorada em pH relativamente elevado) em comparação com α-amilase de origem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Nomenclatura

Na presente descrição e reivindicações, são utilizados os códigos habituais de uma letra para os nucleotídeos e os códigos habituais de uma e três letras para os resíduos de aminoácidos. Para maior facilidade de referência, as variantes da a-amilase da invenção estão descritas mediante a utilização da seguinte nomenclatura: 12

Amínoácido(s) original(ais) rposição(ões):aminoácido(s) substituído(s)

De acordo com esta nomenclatura, e a título de exemplo, a substituição da alanina por asparagina na posição 30 está mostrada como:

Ala 30 Asn ou A30N uma eliminação da alanina na mesma posição está mostrada como:

Ala 30 * ou ASO* e a inserção de um resíduo de amínoácido adicional, como por exemplo a lisina, está mostrada como:

Ala 30 AlaLys ou A30AK

Uma eliminação de uma extensão consecutiva de resíduos de aminoácidos, exemplificados pelos resíduos de aminoácidos 30-33, está indicada como (30-33)*.

Onde uma α-amilase específica contém uma "eliminação" (isto é falta de um resíduo de amínoácido) em comparação com outras a-amilases e nessa posição é feita uma inserção, isto é indicado como:

* 36 Asp ou *36D para a inserção de um ácido aspártico na posição 36 As mutações múltiplas são separadas por sinais de mais, isto é. :

Ala 30 Asp + Glu 34 Ser ou A30N+E34S representando as mutações nas posições 30 e 34 (em que a alanina e o ácido glutámico são substituídos, isto é são substituídos por asparagina e serina, respectivamente).

Quando um ou maís resíduos de aminoácídos alternativos podem ser inseridos numa posição dada isto é indicado como:

Ά30Ν,E ou A30N ou A30E

Além de que, quando uma posição adequada para a modificação está identificada na presente sem que nenhuma modificação específica seja sugerida, deve ser entendido que qualquer outro resíduo de aminoácido pode ser substituído pelo resíduo de aminoácido presente nesta posição (ou seja qualquer outro resíduo de aminoácido - diferente daquele normalmente presente na posição em questão - escolhido entre A,R,N,D,C,Q,E,G,Η, I, L, K, M,F,P,S,T,W,Y e V). Assim, por exemplo, quando uma modificação (substituição) de uma metionína na posição 202 é mencionada, mas não especificada, deve ser entendido que quaisquer outros aminoácídos podem ser substituídos pela metionina, isto é qualquer outro aminoácido escolhido entre A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I L,K,F,P,S,T W,Y e V. A ot-amilase de origem

Como já indicado, uma variante da α-amilase da invenção é muito adequadamente preparada na base de uma a-amilase de origem com uma das sequências de aminoácídos mostradas na SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2. SEQ ID N°. 3 e SEQ ID N°, 7. respectivamente (vide infra.) .

As α-amilases de origem com as sequências de aminoácídos mostradas na SEQ ID N°. 1 e na SEQ ID N°. 2. respectivamente, são obteníveis das cepas de Baciilus alcalifílicas (cepa NCIB 14 12512 e cepa NCIB 12513, respectivamente), as quais estão descritas detalhadamente no Pedido de Patente EP 0 277 216 BI. A preparação, purificação e sequenciação destas duas α-amilases de origem estão descritas no Pedido de Patente WO 95/26397 [ver a secção experimental da presente invenção (vide infra)]. Ά α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3 é obtenível a partir do Baciilus stearothermophilus e é descrita em inter alia, J. Bacteriol. 166 (1986) páginas. 635-643. Ά α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 7 (que na figura 1 é a mesma sequência que a numerada com 4) é obtenível a partir de um "Baciilus sp. #707" e está descrita por Tsukamoto et al. em Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 (1988) páginas 25-31.

Além das variantes acima mencionadas as α-amilases de origem com as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2. SEQ ID N°, 3 e SEQ ID N°. 7, respectivamente, outras variantes interessantes de acordo com a invenção incluem variantes das α-amilases de origem que têm sequências de aminoácidos que exibem um elevado grau de homologia, como por exemplo de pelo menos 80% de homologia, preferencialmente pelo menos 85% de homologia, e mais preferencialmente pelo menos 90% de homologia, por exemplo > 95% de homologia, com pelo menos uma das últimas quatro sequências de aminoácidos.

Como também já acima indicado, outros critérios adicionais para identificar uma α-amilase de origem adequada são: a) que a α-amilase apresente uma reacção cruzada imunológíca com um anticorpo desenvolvido contra uma α-amilase tendo uma das 15 sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 e SEQ ID N°. 7, respectivamente, e/ou b) que a α-amilase seja codificada por uma sequência de ADN que hibridize com a mesma sonda que uma sequência de ADN que codifica uma α-amilase que tenha uma das sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 e SEQ ID N°. 7, respectivamente.

Como já mencionado, em relação à determinação do grau de homologia dos polipeptídeos (como as enzimas), as comparações das sequências de aminoácidos podem ser realizadas com a utilização de algoritmos conhecidos, como por exemplo os descritos por Lipman & Pearson (1985).

Os ensaios para a reactividade cruzada imunológica podem ser realizados utilizando um anticorpo desenvolvido contra, ou reactivo com, pelo menos um epitopo da α-amilase que tem uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1, ou da a- amilase que tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3, ou da α-amilase que tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 7. 0 anticorpo, que pode ser monoclonal assim como policlonal, pode ser produzido por métodos conhecidos na técnica, por exemplo como o descrito por Hudson et ai. (1989). Exemplos de técnicas de ensaio adequadas bem conhecidas na especialidade incluem

Western Blottíng e Ensaios de Imunodifusão Radial, como por exemplo os descritos por Hudson et ai. (1989). Ã sonda de oligonucleotídeos para ser utilizada na identificação de α-amilases de origem adequadas com base na hibridização da sonda [critério b) acima] pode, a título de exemplo, ser adequadamente preparada com base na sequência de aminoácidos completa ou parcial de uma α-amilase que tem uma da sequências mostradas na SEQ ID N° . 1, SEQ ID N°. 2, SEQ ID N°. 3 e SEQ ID N°. 1, respectivamente, ou com base na sequência de nucleotídec· completa ou parcial a elas correspondentes.

As condições adequadas para analisar a hibridização envolve a impregnação prévia em 5xSSC e a hibridização prévia durante 1 h a ~40°C numa solução de formamida 20%, 5x solução de Denhardt, 50nM de fosfato de sódio, pH 6.8, e 50 pg de ADN de timo de vitelo desnaturalizado tratado com ultra-sons, seguido da hibridização na mesma solução completada com ΙΟΟμΜ de ATP durante 18h a ~40°C, ou com a utilização de outros métodos como por exemplo os descritos por Sambrook et al. (1989).

Influência das modificações nas propriedades particulares A partir dos resultados obtidos pelos presentes inventores parece que as mudanças numa propriedade particular, por exemplo na estabilidade térmica ou na estabilidade à oxidação, exibida por uma variante em relação à α-amilase de origem em questão podem numa uma extensão considerável ser relacionadas com o tipo e o posicionamento da(s) mutação(ões) (substituições, eliminações ou inserções dos aminoácidos) na variante. Deve no entanto ser entendido, que a observação de que uma mutação particular ou modelos de mutações conduz a modificações numa propriedade dada, de nenhum modo exclui a possibilidade de que a(s) mutação(Ões) em questão possa(m) também influenciar outras propriedades.

Estabilidade à oxidação: Relativamente ao aumento da estabilidade à oxidação de uma variante da α-amilase em relação à sua α-amilase de origem, parece ser particularmente desejável que pelo menos um, e, preferencíalmente vários, resíduo is) dos aminoãcido oxidáveis de origem tenha(m) sido eliminado(s) ou substituído (S) (isto é substituído (s) por) um resíduo de 17 aminoácido diferente que seja menos susceptível à oxidação do que o resíduo de aminoácido oxidável original.

Particularmente, os resíduos de aminoácidos oxidáveis relevantes associados são a cisteína, a metionina, o triptcfano e a tirosina. Assim, por exemplo, no caso das a-amilases de origem que contém cisteína antecipa-se que a eliminação dos resíduos de cisteína, ou a sua substituição por resíduos de aminoácidos menos oxidáveis, será importante para a obtenção de variantes com estabilidade à oxidação melhorada em relação à α-amilase de origem.

No caso das α-amilases de origem acima mencionadas com as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2 e SEQ ID N°. 7, respectivamente, todas elas sem resíduos de cisteína mas com um conteúdo significativo de metionina, a eliminação ou substituição dos resíduos de metionina é particularmente importante para a obter uma estabilidade à oxidação melhorada das variantes resultantes. Assim, a eliminação ou substituição [por exemplo por treonina (T), ou por um dos outros aminoácidos acima listados] de um ou mais dos resíduos de metionina nas posições M9, MIO, Ml05, M202, M208, M261, M309, M382, M430 e M440 das sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2 e SEQ ID N°. 7, e/ou na posição M323 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2 (ou a eliminação ou substituição dos resíduos da metionina nas posições equivalentes na sequência de outra α-amilase que encontre um dos outros critérios para uma α-amilase de origem acima mencionada) parece ser no que se refere ao aumento da estabilidade à oxidação particularmente eficaz.

No caso da α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3, os resíduos de aminoácidos relevantes que podem ser eliminados ou substituídos com a finalidade de melhorar a estabilidade à oxidação incluem o único resíduo da 18 cisteína (C363) e - por analogia com as sequências mostradas nas SEQ ID N°. 1 e SEQ ID N°. 3 - os resíduos da metionina localizados nas posições M8, M9, M96, M2Q0, M206, M284, M307, M311, M316 e M438.

Em relativamente a isto, a designação "posição equivalente" refere-se a uma posição que, na base de um alinhamento da sequência de aminoácidos da α-amilase de origem em questão com a sequência de aminoácidos da α-amilase de "referência" em questão (por exemplo a sequência mostrada na SEQ ID N°. 1) para obter a justaposição dos resíduos/regiões dos aminoácidos que são comuns a ambos, corresponde mais aproximadamente a (por exemplo está ocupado pelo mesmo resíduo de aminoácido que) uma posição particular na sequência de referência em questão.

As modificações particularmente interessantes em relação à modificação (melhoria) da estabilidade à oxidação das a-amilases com as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2 e na SEQ ID N°. 7, respectivamente, são uma ou mais das seguintes substituições da metionina (ou seus equivalentes nas sequências de aminoácidos de outras α-amilases que reúnem os requisitos de uma α-amilase de origem no contexto da invenção): M202A,R,N D,Q,E,G,H,I L,K,F,F,S,I,W,Y,V.

Outras substituições adicionais da metionina relevantes na sequência dos aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2 são: M323A, R, N, D, Q, E, G, H,I,L K,F,P,S,T, W,Y,V.

As mutações particularmente interessantes quanto à modificação (melhoria) da estabilidade à oxidação da α-amilase com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3 são uma ou mais das seguintes substituições de metionina: 19 Μ200Α,R,N,D, Q, E, G, Η,I, L, K, F,P,S,T,W, Y,V; Μ311Ά, R, N, D,Q,E,G,H,I,L,K, F,P,S,T,W,Y,Y; e M316A,R,N,D,Q,E,G,H, I, L, K, F, P, S, T, W, Y, Y.

Estabilidade térmica: Relativamente ao aumento da estabilidade térmica de uma variante da α-amilase em relação à sua a-amilase de origem, parece ser particularmente desejável eliminar pelo menos um, e preferencialmente dois ou mesmo três, dos seguintes resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1 (ou seus equivalentes): F180, R181, G182, T183, G184 e K185. Os resíduos de aminoácidos correspondentes particularmente relevantes (e equivalentes) nas sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 2, na SEQ ID N°. 3 e na SEQ ID N°. 7, respectivamente, são: F180, R181, G182, D183, G184 e

K185 (SEQ ID N°. 2); F178, R179, G180, 1181; G182 e K183 (SEQ ID N°. 3); e F180, R181, G182, H183, G184 e K185 (SEQ ID N°. 7).

As eliminações dos pares particularmente interessantes deste tipo são os seguintes: R181 * + G182*; e T183* + G184 * (SEQ ID N°. 1); R181 * + G182*; e D183* + G184* (SEQ ID N°. 2); R179* + G180*; e 1181 * + G182* (SEQ ID N°. 3); e R181 * + G182*; e H183* + G184 * (SEQ ID N°. 7). (ou equivalentes destas eliminações destes pares noutra a- amilase que reúna os requisitos de uma α-amilase de origem no contexto da presente invenção).

Outras mutações que parecem ser importantes enquanto à estabilidade térmica são substituições de um ou mais dos resíduos de aminoácidos de P260 a 1275 na sequência mostrada, na SEQ ID N°. 1 (ou os seus equivalentes noutra α-amilase de origem no contexto da invenção), assim como a substituição do resíduo de lisina na posição 269. 20

Exemplos de mutações específicas que parecem ser importantes enquanto à estabilidade térmica de uma variante da α-amilase em relação à α-amilase de origem em questão são uma ou mais das seguintes substituições na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N° . 1 (ou equivalentes da mesma noutra α-amilase de origem no contexto da invenção ) : K269R, P260E, R124P, M105F,I,L,V; M208F,W,Y; L217I; V206I, L,F.

Para α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2, outras mutações adicionais importantes (equivalentes) são, correspondentemente, uma ou mais das substituições: M105F,I,L,V; M208F,W,Y; L217I, V206I,L,F; e K269R.

Para a α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3, as mutações adicionais importantes (equivalentes) são, correspondentemente, uma ou ambas das substituições: M206E,W,Y; e L215I.

Para a α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 7, as mutações adicionais importantes (equivalentes) são, correspondentemente, uma ou mais das substituições: M105F,I,L,V; M208F,W,Y; L217I; e K269R.

Outros exemplos adicionais das mutações que parecem ser importantes, inter alia, para obter uma estabilidade térmica melhorada de uma variante da α-amilase em relação à α-amilase de origem em questão são uma ou mais das seguintes substituições nas sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, na SEQ ID N°. 2 e na SEQ ID N°. 7 (ou seus equivalentes noutra a- amilase de origem no contexto da invenção): A354C + V479C; L351C + M430C; N457D,E + K385R; L355D,E + M430R,K; L355D,E + I411R,K; e N457D,E. 21

Dependência de Ca2+: Relatívamente à obtenção de uma dependência de Ca"1'"' reduzida de uma variante da α-amilase em relação à sua a-amilase de origem [isto é em relação à obtenção de uma variante que exibe actividade amilolítica satisfatória na presença de uma concentração inferior do ião de cálcio no meio estranho que é necessário para a enzima de origem, e que, por exemplo, consequentemente seja menos sensível do que a de origem para as condições de eliminação do ião de cálcio como por exemplo as que são obtidas nos meios que contêm agentes complexantes de cálcio (como por exemplo certos reforçadores de detergentes)], parece ser particularmente desejável incorporar uma ou mais das seguintes substituições nas sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, na SEQ ID N°. 2 e na SEQ ID N°. 7 (ou uma substituição equivalente noutra α-amilase de origem no contexto da invenção): Y243F, K108R, K179R, K239R, K242R, K269R, D163N, D188N, D192N, D199N, D205N, D207N, D209N, E190Q, E194Q e N106D.

No caso da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3, as substituições particularmente desejáveis parecem, correspondentemente (de forma equivalente), ser uma ou mais das seguintes: K107R, K177R, K237R, K240R, D162N, D186N, D190N, D197N, D203N, D205N, D207N, E188Q e E192Q.

Assim como nas substituições acima mencionadas dos resíduos D pelos resíduos N, ou dos resíduos E pelos resíduos Q, outras substituições relevantes no contexto da redução da dependência de Ca2+ são as substituições dos resíduos D e/ou E em questão por qualquer outro resíduo de aminoácido.

Além de que as substituições que parecem ser importantes no contexto de obter uma dependência de Ca2+ reduzida são substituições de pares dos resíduos de aminoácidos presentes nas posições 113 e 151, e nas posições 351 e 430, nas sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, na SEQ id N°. 2 e na SEQ ID N°. 7; e nas posições 112 e 150, e nas posições 349 e 428, na 22 sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3 (ou substituições de pares equivalentes noutra α-amilase de origem no contexto da invenção), isto é substituições de pares dos seguintes resíduos de aminoácidos: G113 + N151 (em relação com SEQ ID N°. 1); A113 + T151 (em relação com SEQ ID Nc. 2 e SEQ ID N°. 7); e G112 + T150 (em relação com SEQ ID N°. 3); e L351 + M43Q (em relação com SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2 e SEQ ID N°. 7); e L349 + 1428 (em relação com SEQ ID N°. 3).

As substituições dos pares particularmente interessantes deste tipo em relação à obtenção de uma dependência de Ca2+ reduzida são as seguintes: G113T + N151I (em relação à SEQ ID N°. 1); A113T + T151I (em relação à SEQ ID N°. 2 e à SEQ ID N°. 7); e G112T + T150I (em relação à SEQ ID N°. 3); e

L351C + M430C (em relação à SEQ ID N°. 1, SEQ ID N°. 2 e SEQ ID N°. 7); e L349C + I428C (em relação à SEQ ID N°. 3).

Em relação às substituições relevantes para a dependência de

Ca2+, algumas das substituições que parecem ser importantes na estabilização da conformação da enzima, e a qual é considerada que a pode obter com por exemplo, aumentando a resistência da ligação ou retenção do ião de cálcio em ou no interior de um sitio de ligação ao cálcio no interior da enzima a-amilolítica, são uma ou mais das seguintes substituições nas sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1, na SEQ ID N°. 2 e na SEQ ID N°. 7 (ou uma substituição equivalente noutra α-amiiase de origem no contexto da invenção): G304W,F,Y,R,I,L,V,Q,N; G305A,S,N,D,Q,E,R,K; e H408Q,E. 23

As substituições correspondentes (equivalentes) na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID M°. 3 são: G3G2W, F, Y, R,I,L,V,Q,N; e G303A, S, N, D, Q, E,R,K.

Outras mutações que parecem ser importantes no contexto da obtenção de uma dependência de Ca2+ reduzida são eliminações dos pares de aminoácidos (isto é a eliminação de dois aminoácidos) nas posições seleccionadas entre R181, G182, T183 e G184 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1 (ou posições equivalentes na sequência de aminoácidos de outra α-amilase que reúna os requisitos de uma α-amilase de origem no contexto da invenção). Assim as eliminações dos pares são as seguintes: R181* + G182*; T183* + G184*; R181* + T183*; G182* + T183*; G182* + G184*; e R181* + G184* (SEQ ID N°. 1); R181* + G182*; D183* + G184*; R181* + D183*; G182* + D183*; G182* + G184*; e R181* + G184* (SEQ ID N°. 2); R179* + G180*; 1181* + G182*; R179* + 1181*; G180* + 1181*; G180* + G182*; e R179* + G182* (SEQ ID N°. 3); e R181* + G182*; H183* + G184*; R181* + H183*; G182* + H183*; G182* + G184*; e R181* + G184* (SEQ ID N°. 7); (ou equivalentes destas eliminações dos pares noutra a-amilase que reúna os requisitos de uma α-amílase de origem no contexto da presente invenção).

Ponto Isoeléctrico (pi): Qs resultados preliminares indicam que a eficácia da lavagem, por exemplo a eficácia da lavagem da roupa, de uma α-amilase é óptima quando o pH da solução de lavagem (meio de lavagem) é aproximado ao valor pi para a a-amilase em questão. Será assim desejável, quando apropriado, produzir uma variante da α-amilase com um ponto Isoeléctrico 24 (valor pI) que esteja melhor se adapte ao pH de um meio (como por exemplo um meio de lavagem) onde a enzima vai ser empregue do que o ponto Isoeléctrico da α-amilase de origem em questão.

Relativamente à diminuição do ponto Isoeléctrico, as mutações preferidas na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1 incluem uma ou mais das seguintes substituições: Q86E, R124P, S154D, T1S3D, V222E, P260E, R310A, Q346E, Q391E, N437E, K444Q e R452H. As combinações apropriadas destas substituições no contexto da diminuição do ponto Isoeléctrico incluem: Q391E + K444Q; e Q391E + K444Q + S154D.

Correspondentemente, as mutações preferidas na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3 em relação à diminuição do ponto Isoeléctrico incluem uma ou mais das substituições: L85E, S153D, I181D, K220E, P258E, R308A, P344E, Q358E e S435E.

Relativamente ao aumento do ponto Isoeléctrico, as mutações preferidas na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2 incluem uma ou mais das seguintes substituições: E86Q,L; D154S; D183T, I; E222V,K; E260P; A310R; E346Q,P; E437N,S; e H452R.

Na secção experimental abaixo, é descrita a construção de várias variantes de acordo com a invenção.

As variantes da α-amilase da invenção, para além de ter uma ou mais propriedades melhoradas como o acima discutido, preferencialmente serão de maneira a que estas tenham uma velocidade maior de hidrólise do amido com concentrações baixas do substrato que a da α-amilase de origem. Alternativamente, uma variante da α-amilase da invenção será de preferência uma que tenha um Vmax maior e/ou uma Km menor do que a α-amílase de origem quando testada sob as mesmas condições. No caso de uma a-amilase híbrida, a "α-amilase de origem" a ser utilizada para a 25 comparação deverá ser aquela em que as enzimas constituintes tenham a melhor eficácia.

Vmax e Km (parâmetros da equação Michaelis-Menten) podem ser determinados com os procedimentos bem conhecidos. Métodos de preparação das variantes da a-amilase Vários métodos para introduzir mutações nos genes são conhecidos na técnica. Após uma breve discussão sobre a clonagem das sequências de ADN que codificam uma α-amilase, serão discutidos métodos para gerar mutações em sítios específicos no interior da sequência que codifica a a-amilase.

Clonação de uma sequência de ADN que codifica uma a-amilase A sequência de ADN que codifica uma α-amilase de origem pode ser isolada de qualquer célula ou microrganismo que produza a a-amilase em questão, utilizando vários métodos bem conhecidos na técnica. Primeiro, um ADN genómico e/ou uma biblioteca de ADNc deveria ser construída com a utilização do ADN cromossómico ou ARN mensageiro do organismo que produz a α-amilase a ser estudada. Seguidamente, se a sequência de aminoácidos da a-amilase for conhecida as sondas de oligonucleotídeos homólogas marcadas, podem ser sintetizadas e utilizadas para identificar os clones que codificam a α-amilase a partir de uma biblioteca genómica obtida a partir do organismo em questão. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeos marcada que contém homólogos de sequências a um gene da α-amilase conhecido poderá ser utilizada como uma sonda para identificar clones que codificam a α-amilase, utilizando as condições de hibrídização e de lavagem de adstringência inferior. 26

Outro método para identificar os clones que codificam a a-amilase devem envolver a inserção de fragmentos de ADN genómico num vector de expressão, como por exemplo um plasmideo, a transformação ads bactérias α-amilase-negativas com a biblioteca de ADN genómico resultante, e seguidamente dispor em placas as bactérias transformadas em agar contendo um substrato para a-amilase, permitindo desta forma que os clones expressem a a-amilase a ser identificada.

Alternativamente, a sequência de ADN que codifica a enzima pode ser preparada sinteticamente por métodos standards estabelecidos, por exemplo o método da fosfoamidita descrito por S.L. Beaucage & M.H. Caruthers (1981) ou o método descrito por Matthes et al. (1984). No método da fosfoamidita, os oligonucleotideos são sintetizados, por exemplo num sintetizador de ADN automático, purificados, recozidos, ligados e cionados em vectores apropriados.

Finalmente, a sequência de ADN pode ser de origem mista genómica e sintética, de origem mista sintética e de ADNc ou de origem mista genómica e ADNc, preparada por fragmentos de ligação de origem sintética, genómica ou ADNc (como o apropriado, os fragmentos correspondentes a várias partes da sequência de ADN inteira), de acordo com as técnicas Standard. A sequência de ADN pode também ser preparada por reacçâo em cadeia da polimerase (PCR) com a utilização de iniciadores específicos, por exemplo de acordo com o descrito no Pedido de Patente US 4,683,202 ou por R.K. Saiki et al. (1988).

Mutaqénese sítio-diriqida

Assim que uma sequência de ADN que codifica a α-amilase tenha sido isolada, e os sítios desejáveis para a mutação identificados, as mutações podem ser introduzidas com a utilização de oligonucleotideos sintéticos. Estes 27 oligonucleotídeos contêm sequências de nucleotídeos que flanqueiam os sítios das mutações desejadas; os nucleotídeos mutantes são inseridos durante a síntese dos oligonucleotídeos. Num método específico, um espaço de uma cadeia única de ADN, que ligam a sequência de codificação da α-amílase, é criado num vector que transporta o gene da α-amilase. Assim o nucleotídeo sintético, que fixa a mutação desejada, é recozido numa parte homóloga do ADN de filamento único. 0 espaço restante é seguidamente cheio com ADN polimerase I (fragmento de Klenow) e a construção é ligada com a utilização de uma ligase T4. Um exemplo específico deste método é descrito por Morinaga et al. (1984). 0 Pedido de Patente US 4,760,025 descreve a introdução de oligonucleotídeos que codificam múltiplas mutações para realizar de alterações secundárias da cassete. No entanto, pode em qualquer momento ser introduzidas ainda uma variedade maior de mutações pelo método de Morinaga, porque numerosos oligonucleotídeos, de vários comprimentos, podem ser introduzidos.

Outro método de introdução de mutações nas sequências de ADN que codificam a α-amilase é descrito por Nelson & Long (1989). Este implica a geração em 3 fases de um fragmento da PCR que contém a mutação desejada introduzida com a utilização de uma cadeia de ADN quimicamente sintetizada como um dos iniciadores nas reacções da PCR. A partir do fragmento gerado pela reacção em cadeia da polimerase, um fragmento de ADN que transporta a mutação pode ser isolado por clivagem com as endonucleases de restrição e reinseridas num plasmídeo de expressão.

Mutagénese aleatória A mutagénese aleatória é adequadamente realizada como uma mutagénese localizada ou como uma mutagénese aleatória região-específica em pelo menos três partes do gene que se traduz na 28 sequência de amínoácidos mostrada em questão, ou no interior de todo o gene.

Para a mutagénese região-específica aleatória e com o fim de melhorar a estabilidade térmica, as seguintes posições do codão, em particular, podem ser apropriadamente marcadas (utilizando as iniciais do aminoácido de uma letra e a numeração dos resíduos de amínoácidos na sequência em questão):

Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1:

120-140 = VEVNRSNRNQETSGEYAIEAW 178-187 = YKFRGTGKAW 264-277 = VAEFWKNDLGAIEN

Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2:

120-140 = VEVNPNNRNQEISGDYTIEAW 178-187 = YKFRGDGKAW 264-277 = VAEFWKNDLGALEN

Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3:

119-139 = VEVNPSDRNQEISGTYQIQAW 176-185 = YKFRGIGKAW 262-275 = VGEYWSYDINKLHN

Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°.1\ 120-140 = VEVNPNNRNQEVTGEYTIEAW

178-187 = YKFRGHGKAW 264-277 - VAEFWKNDLGAIEN

Com o fim de obter uma dependência Ca2+ reduzida, as seguintes posições do codão, em particular, podem ser apropriadamente marcadas: 29

Na sequência de antinoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1: 178-209 = YKFRGTGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADVDMD

237-246 = AVKHIKYSFT

Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2:

178-209 = YKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMD 237-246 = AVKHIKYSFT

Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 7:

178-209 = YKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMD 237-246 * AVKHIKYSFT

Com o fim de obter uma ligação melhorada de um substrato (isto é uma ligação melhorada de uma espécie de hidrato de carbono -como por exemplo a amilose ou a amilopectina - que é um substrato para enzimas α-amilolíticas) por uma variante da a-amilase, um especificidade do substrato modificado (por exemplo mais elevada) e/ou uma especificidade modificada (por exemplo mais elevada) em relação à clivagem (hidrólise) do substrato, parece que as seguintes posições do codão para a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1 (ou as posições do codão equivalentes para outras α-amilase de origem no contexto da invenção) podem em particular ser aprcpriadamente marcadas:

Na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N° . 1:

15-20 = WYLPND 52-58 = SQNDVGY 72-78 = KGTVRTK 104-111 = VMNHKGGA 165-174 = TDWDQSRQLQ 30

194-204 = ENGNYDYLMYA 234-240 - RIDAVKH 332-340 = HDSQPGEAL A mutagénese aleatória de uma sequência de ADN que codifica uma α-amilase de origem a ser realizada de acordo com a fase a) do método da invenção acima descrito pode convenientemente ser realizada utilizando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a mutagénese aleatória pode ser realizada com a utilização de um agente adequado físico ou químico da mutagénese, com a utilização de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo a sequência de ADN à mutagénese gerada pela PCR. Além de que, a mutagénese aleatória pode ser realizada utilizando qualquer combinação de estes agentes da mutagénese. O agente da mutagénese pode, por exemplo, ser um que induza a transições, transversões, inversões, aleatorizações, eliminações, e/ou inserções.

Exemplos de um agente físico ou químico adequado da mutagénese para o objectivo da presente invenção inclui irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeos.

Quando estes agentes são utilizados, habitualmente a mutagénese é realizada incubando a sequência de ADN que codifica a enzima de origem para ser mutagenizada na presença do agente da mautagénese de escolha sob condições adequadas para que a mutagénese se dê, e seleccíonando o ADN mutado com as propriedades desejadas.

Quando a mutagénee é realizada utilizando um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado ou inoculado com os três 31 nucleotídeos não de origem durante a síntese dos oligonucleotídeos nas posições que devem ser mudadas. A dopagem ou inoculação pode ser realizada de forma a que sejam evitados os codões para os amínoácidos indesejados. 0 oligonucleotídeo dopado ou inoculado pode ser incorporado no ADN que codifica a enzima amilolítíca por qualquer técnica publicada, utilizando por exemplo PCR, LCR ou qualquer polimerase e ligase de ADN.

Quando é utilizada a mutagénese gerada pela PCR, num gene tratado ou num gene não tratado quimicamente que codifica uma enzima α-amilase de origem é submetida a PCR sob condições que aumentam a incorporação errada de nucleotídeos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1,1989, pp. 11-15).

Uma cepa modificadora de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae ou qualquer outro organismo microbiano podem ser utilizadas para a mutagénese aleatória do ADN que codifica a enzima amilolítíca por exemplo transformando um plasmídeo que contém a enzima de origem na cepa modificadora, crescendo a cepa modificadora com o plasmídeo e isolando o plasmídeo modificado da cepa modificadora. 0 plasmídeo mutado pode posteriormente ser transformado no organismo de expressão. A sequência de ADN para ser mutagenizada pode convenientemente estar presente numa biblioteca genómica ou de ADNc obtida a partir do organismo que expressa a enzima amilolítíca origem. Alternativamente, a sequência de ADN pode estar presente num vector adequado como por exemplo um plasmídeo ou um bacteriófago, que como tal pode ser incubado com ou de outra forma exposto ao agente da matagénese. 0 ADN para ser mutagenizado pode também estar presente numa célula hospedeira assim como pode estar integrado no genoma da dita célula ou estar presente num vector alojado na célula. Finalmente, o ADN a ser mutagenizado pode estar na forma isolada. Será entendido que 32 a sequência de ADN a ser submetida à mutagénese aleatória é preferencialmente uma sequência de ADNc ou de ADN genómico.

Nalguns casos pode ser conveniente amplificar a sequência de ADN mutada antes de que a fase de expressão (b) ou a fase de triagem (c) sejam realizadas. Esta amplificação pode ser realizado de acordo com métodos conhecidos na técnica, sendo o método actualmente preferido a amplificação gerada pela PCR utilizando iniciadores oligonucleotideos preparados baseados na sequência de ADN ou de aminoácidos da enzima de origem.

Subsequente à incubação com, ou à exposição ao agente da mutagénese, o ADN mutado é expresso pelo cultivo de uma célula hospedeira adequada que transporta a sequência de ADN sob condições que permitem que a expressão se dê. A célula hospedeira utilizada para esta finalidade pode ser uma que tenha sido transformada com a sequência de ADN mutada, opcionalmente presente num. vector, ou uma que fosse transportada na sequência de ADN que codifica a enzima de origem durante o tratamento da mutagénese. Exemplos de células hospedeiras adequadas são as seguintes: Bactérias gram-positivas como por exemplo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulansf Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans ou Streptomyces lívidans; e bactérias gram-negativas como por exemplo E.coli. A sequência de ADN mutado pode ainda compreender uma sequência de ADN que codifica as funções que permitem a expressão da sequência do ADN mutado.

Mutagénese aleatória localizada: a mutagénese aleatória pode vantajosamente estar localizado numa parte da α-amilase de origem em questão. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso quando 33 certas regiões da enzima tenham sido identificadas para serem de particular importância para uma propriedade dada da enzima, e quando modificadas é esperado que resultem numa variante com propriedades melhoradas. Estas regiões podem normalmente ser identificadas quando a estrutura terciária da enzima de origem tenha sido elucidada e relacionada com a função da enzima. A mutagénese localizada aleatória é convenientemente executada com a utilização das técnicas da mutagénese gerada pela POR de acordo com o acima descrito ou qualquer outra técnica adequada conhecida na especialidade.

Alternativamente, a sequência de ADN que codifica a parte da sequência de ADN para ser modificada pode ser isolada, por exemplo sendo inserida num vector adequado, e a dita parte pode ser subsequentemente submetida à mutagénese utilizando quaisquer dos métodos de mutagénese acima discutidos.

Relativamente à fase de triagem no método da invenção acima mencionado, esta pode ser convenientemente executada com a utilização de um ensaio de filtro com base no seguinte principio:

Um microrganismo capaz de expressar a enzima mutada amilolitica de interesse é incubado num meio adequado e sob condições adequadas para que a enzima seja segregada, estando o meio provido com um filtro duplo com um primeiro filtro de ligação a proteínas e na parte superior do qual o segundo filtro exibe uma baixa capacidade de ligação às proteínas. 0 microrganismo está localizado no segundo filtro. Após a incubação, o primeiro filtro que compreende enzimas segregadas a partir dos microrganismos é separado do segundo filtro que compreende os microrganismos. 0 primeiro filtro é submetido a triagem para a actividade enzimática desejada e são identificadas as colónias microbianas correspondentes presentes no segundo filtro. 34 0 filtro utilizado para ligar a actividade enzimática pode ser qualquer filtro de ligação a proteínas por exemplo nylon ou nitrocelulose. 0 filtro superior que transporta as colónias do organismo de expressão pode ser qualquer filtro que não tenha nenhuma ou que tenha baixa afinidade às proteínas de ligação por exemplo acetato de celulose ou Durapore™. 0 filtro pode ser pré-tratado com quaisquer das condições a serem utilizadas para a selecção ou pode ser tratado durante a detecção da actividade enzimática, A actividade enzimática pode ser detectada por um corante, por fluorescência, por precipitação, por indicador de pH, por absorbância a IR ou qualquer outra técnica conhecida para a detecção da actividade enzimática. 0 composto de detecção pode ser imobilizado por qualquer agente de imobilização por exemplo agarose, agar, gelatina, poliacrilamida, amido, papel de filtro, tecido; ou qualquer combinação de agentes de imobilização. Ά actividade da α-amilase é detectada por amilopectina marcada com Cíbacron Red, que é imobilizada em agarose. Para a triagem das variantes com estabilidade térmica aumentada e com um pH alto, o filtro com variantes ligadas à α-amilase é incubado num tampão com um pH 10.5 e 60° ou 65°C durante um tempo especifico, enxaguado brevemente em água desionizada e colocado na matriz de amilopectina-agarose para a detecção de actividade. É observada a actividade residual como um lise de Cíbacron Red por degradação da amilopectina. As condições são escolhidas de forma a que a actividade devida à α-amilase com a sequência de amínoácidos mostrada possa ser claramente detectada na SEQ ID N°. 1. As variantes estabilizadas mostram, sob as mesmas condições, uma intensidade de cor aumentada devido à libertação aumentada de Cíbacron Red. 35

Para a triagem das variantes com uma actividade óptima a uma temperatura inferior e/ou com uma margem de temperatura mais larga, o filtro com as variantes ligadas é colocado directamente na placa do substrato de amilopectina-Cibacron Red e incubado à temperatura desejada (por exemplo 4°C, 10°C ou 30°C) durante um tempo especifico. Após este tempo, a actividade devida à a-amílase com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N° . 1 pode ser claramente detectada, enquanto que as variantes com actividade óptima a uma temperatura inferior mostra a lise da amilopectina aumentada. Antes da incubação na matriz de amilopectina, a incubação em todos os tipos de meios desejados -por exemplo soluções que contêm Ca2+, detergentes, EDTA ou outros aditivos relevantes - pode ser realizada para a triagem da dependência mudada ou para a reacção das variantes em questão com estes aditivos. Métodos de preparação de a-amilases híbridas

Como uma alternativa à mutagénese sítio específica, as variantes da α-amilase que são híbridas de pelo menos duas a-amiiases constituintes podem ser preparadas combinando as partes relevantes dos genes respectivos em questão.

As enzimas de origem natural podem ser geneticamente modificadas por mutagénese aleatória ou por mutagénese sítio dirigido como o acima descrito. Alternativamente, parte de uma enzima pode ser substituída por uma parte de outra para obter uma enzima quimérica. Esta substituição pode ser obtida por técnicas habituais de excisâo-união dos genes in vitro ou por recombinação in vivo ou por combinações das duas técnicas. Quando são utilizadas as técnicas habituais de excisão-uníão dos genes in vitro, uma parte desejada da sequência de codificação do gene da α-amiiase pode ser eliminada utilizando enzimas adequadas de restrição sítio específicas; a parte eliminada da sequência de codificação pede seguidamente ser substituída pela 36 inserção de uma parte desejada de uma sequência de codificação da α-amilase diferente de forma a que se produza uma sequência de nucleotídeos quiméricos que codifica uma α-amilase nova. Alternativamente, os genes da α-amilase podem ser fundidos, por exemplo utilizando o método de extensão por sobreposição da PCR descrito por Higuchi et al. 1988.

As técnicas da recombinação in vivo dependem do facto de que segmentos de ADM diferentes com regiões altamente homólogas (identidade das sequências de ADN) possam recombinar-se, ou seja romper e trocar o ADN, e estabelecer novas ligações nas regiões homólogas. Consequentemente, quando as sequências de codificação para duas enzimas amilases diferentes mas homólogas são utilizadas para transformar uma célula hospedeira, a recombinação de sequências homólogas in vivo resultará na produção de sequências do gene quimérico. A tradução destas sequências de codificação pela célula hospedeira resultarão na produção de um produto do gene da amilase quimérica. As técnicas de recombinação in vivo específicas estão descritas nos Pedidos de Patente US 5,093,257 e EP 252 666.

Alternativamente, a enzima híbrida pode ser sintetizada por métodos químicos standards conhecidas na técnica. Ver por exemplo, Hunkapiller et al. (1984). Consequentemente, os peptídeos que com as sequências de aminoácidos apropriadas podem ser sintetizadas total ou parcialmente e unidas para formar as enzimas híbridas (variantes) da invenção.

Expressão das variantes da a-amilase

De acordo com a invenção, uma sequência de ADN que codifica a a-amilase mutada produzida pelos métodos acima descritos, ou por quaisquer métodos alternativos conhecidos na técnica, pode ser expressa, na forma de enzima, utilizando um vector de expressão que habitualmente inclui as sequências de controlo que codificam 37 um promotor, operador, sítio de ligação do ribossoma, sinal de iniciação da tradução, e, opcionalmente, um gene repressor cu vários genes activadores. 0 vector de expressão recombinante que transporta a sequência de ADN que codifica uma variante da α-amilase da invenção pode ser qualquer vector que possa convenientemente ser submetido a procedimentos de ADN recombinante, e a escolha do vector muitas vezes dependerá da célula hospedeira na que ele tenha que ser introduzido. Assim, o vector pode ser um vector de replicação autónoma, isto é um vector que existe como uma entidade extracromossómica, cuja a replicação é independente da replicação cromossómica, por exemplo um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento extracromossómico, minicromossoma ou um cromossoma artificial. Alternativamente, o vector pode ser um que, ao ser introduzido numa célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira e replicado com o (s) cromossoma(s) no (s) qual(ais) ele tenha sido integrado.

No vector, a sequência de ADN deverá estar funcionalmente conectada a uma sequência do promotor adequada. 0 promotor pode ser qualquer sequência de ADN que mostre actividade transcripcional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivada dos genes que codificam proteínas homólogas assim como heterólogas à célula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da sequência de ADN que codifica uma variante da α-amiiase da invenção, especialmente num hospedeiro bacteriano, são os promotores do operão lac de E.coli, os promotores dagA do gene de agarase de Streptomyces coelicolor, promotores do gene da α-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene da a-amilase maltogénico de de Bacillus stearothermophilus (amyM) , os promotores da α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis etc. para a transcrição num hospedeiro fúngico, exemplos de promotores úteis são os derivadas do gene que codifica a amilase TAKA de A. oryzae, a proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, a amilase neutra de A. Niger, a α-amilase estável em ácido de A. Niger, a glucoamilase de A. Niger, a lipase de Rhizomucor miehei, a protease alcalina de A. oryzae, a triose fosfato isomerase de A, oryzae ou a acetamidase de A. nidulans. 0 vector de expressão da invenção pode também compreender um terminador da transcrição adequado e, em, sequências eucarióticas de poliadenilação funionalmente conectadas à sequência de ADN que codifica a variante da α-amilase da invenção. As sequências de terminação e de poliadenilação podem adequadamente derivar das mesmas fontes que o promotor. 0 vector pode ainda compreender uma sequência de ADN possibilitando que o vector replique na célula hospedeira em questão. Exemplos destas sequências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBllO, pE194, pAMBl e pIJ702. 0 vector pode também compreender um marcador seleccionável, por exemplo um gene cujo produto complemente uma deficiência na célula hospedeira, como por exemplo os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um que confira resistência antibiótica comopor exemplo a resistência à ampicilina, à canamicina, ao cloranfenicol ou à tetraciclina. Além de que, o vector pode compreender marcadores de selecção de Aspergillus como por exemplo amdS, argB, niaD e sC, um marcador que dê origem à resistência à higromicina, ou a selecção pode ser realizada por co-transformação, por exemplo como o descrito no Pedido de Patente WO 91/17243.

Embora a expressão intracelular possa ser vantajosa nalguns aspectos, por exemplo quando são utilizadas certas bactérias como as células hospedeiras, é geralmente preferido que a expressão seja extra-celular. 39

Os procedimentos adequados para vectores de construção da invenção que codificam uma variante da α-amilase, e contendo o promotor, o terminador e outros elementos, respectivamente, são bem conhecidos dos técnicos especializados [conforme, por exemplo, Sambrook et al. (1989)]. A célula da invenção, que compreende uma construção de ADN assim como um vector de expressão da invenção como o acima definido, é vantajosamente utilizada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante da α-amilase da invenção. A célula pode ser transformada com a construção do ADN da invenção que codifica a variante, integrando convenientemente a construção do ADN (numa ou mais cópias) no cromossoma hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada como sendo uma vantagem já que é mais provável que a sequência de ADN seja mantida de forma estável na célula. A integração das construções do ADN no cromossoma hospedeiro pode ser realizada de acordo com os métodos habituais, por exemplo por recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vector de expressão de acordo com o modo acima descrito em relação com os diferentes tipos de células hospedeiras. A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo superior como por exemplo um mamífero ou um insecto, mas preferencialmente é uma célula microbiana, por exemplo uma célula bacteriana ou uma célula fúngica (incluindo a levedura).

Exemplos de bactérias adequadas são as bactérias gram-positivas como por exemplo Bacillus subtilís r Bacíllus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacíllus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciensr Bacillus coagulansf Bacíllus circulans, Bacíllus lautus, Bacillus megaterium, Bacíllus thuringiensls, ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus ou bactérias gram negativas como po exemplo 40 E.coli. Ά transformação das bactérias pode, por exemplo, ser efectuada por transformação do protoplasto ou com a utilização de células competentes de uma maneira conhecido per se. 0 organismo de levedura pode favoravelmente ser seleccionado de umas espécies de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo Saccharomyces cerevisiae. 0 fungo filamentoso pode vantajosamente pertencer a umas espécies de Aspergillus, por exemplo Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação do protoplasto e a transformação dos protoplastos seguida da regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Um procedimento adequado para a transformação das células hospedeiras de Aspergillus está descrita no Pedido de Patente EP 238 023.

Ainda noutro aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para a produção de uma variante da oc-amilase da invenção, este método compreende o cultivo de uma célula hospedeira de acordo com o acima descrito sob condições propicias para a produção da variante e a recuperação da variante das células e/ou do meio de cultivo. O meio utilizado para cultivar as células pode ser qualquer meio habitual adequado para o crescimento da célula hospedeira em questão e obter a expressão da variante da α-amilase da invenção. Os meios adequados estão disponíveis por fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo como as descritas nos catálogos da American Type Culture Collection). A variante da α-amilase segregada a partir das células hospedeiras pode convenientemente ser recuperada do meio de cultivo por procedimentos bem conhecidos, incluindo a separação das células do meio por centrifugado ou filtração, e 41 precipitação dos componentes proteináceos do meio por intermédio de um sal como por exemplo o sulfato de amónio, seguido da utilização de procedimentos cromatográficos como por exemplo a cromatografia de troca íónica, cromatografia de afinidade, ou outras.

Aplicações industriais

Devido à sua actividade em valores de pH alcalino, as variantes da α-amilase da invenção são bem adequadas para serem utilizados numa variedade de processos industriais. Em particular, encontram-se aplicações potenciais como um componente das composições de lavagem da roupa, lavagem da louça e detergentes de limpeza de superfícies duras (vide infra) , mas podem também ser úteis para a produção de adoçantes e etanol a partir do amido. As condições para os processos habituais da conversão do amido e os processos da liquefação e/ou da sacarificação estão por exemplo descritos, nos Pedidos de Patentes US 3,912,590, EP 252,730 e EP 63,909.

Algumas áreas de aplicação das variantes da α-amilase da invenção estão abaixo esboçadas.

Aplicações relacionadas com o papel: As variantes da a-amilase da invenção possuem propriedades valiosas na produção de materiais lignocelulósicos, como por exemplo a pasta de papel, c papel e o cartão, a partir de papel usado reforçado com amido e cartão usado, especialmente quando se dá a fabricação de uma pasta de papel secundária a um pH acima de 7, e quando as amílases possam facilitar a desintegração do material gasto através da degradação do amido de reforço. As variantes da a-amilase da invenção são bem adequadas para serem utilizadas nos processos de descoloração/reciclagem para a fabricação do papel impresso revestido de amido ou contendo amido. É habitualmente desejável eliminar a tinta de impressão para produzir papel novo 42 com um brilho elevado; exemplos de como as variantes de invenção podem ser utilizadas desta maneira estão descritos no Pedido de Patente PCT/DK94/00437.

As variantes da α-amilase da invenção podem também ser muito úteis para modificar o amido quando o amido enzimaticamente modificado é utilizado para a fabricação de papel junto com cargas alcalinas como por exemplo carbonato de cálcio, caulino e argilas. Com as variantes da α-amilase alcalina da invenção o amido pode ser modificado na presença da carga, permitindo assim um processo integrado mais simples.

Desengomagem têxtil: As variantes da α-amilase da invenção são também bem adequadas para serem utilizadas na desengomagem têxtil. Na indústria do processamento têxtil, geralmente as a-amilases são utilizadas como auxiliares no processo de desengomagem para facilitar a remoção da goma que contém o amido que serviu de revestimento protector dos fios da trama durante a tecelagem. A remoção total do revestimento de goma depois da tecelagem é importante para garantir resultados óptimos nos processos subsequentes em que o tecido é lavado, branqueado e tingido. A degradação enzimática do amido é preferida porque não danifica as fibras do têxtil ou tecido.

Para reduzir os custos de processamento e aumentar a passagem dos fios, o processamento de desengomagem é às vezes combinado com fases de lavagem e de branqueamento. Nestes casos, auxiliares não enzimáticos como por exemplo agentes alcalinos ou de oxidação são normalmente utilizados para decompor o amido, dado que as α-amilases habituais não são muito compatíveis com níveis elevados de pH e com os agentes branqueadores. A decomposição não enzimática da goma de amido leva a alguma 43 danificação da fibra devido aos produtos químicos ma is agressivos utilizados.

As variantes da α-amílase da invenção apresentam uma eficácia da degradação do amido melhorada a níveis relativamente de pH altos e na presença de agentes oxidantes (branqueamento) são assim bem adequados para serem utilizados nos processos de desengomagem de acordo com a forma acima descrita, em particular para a substituição de agentes de desengomagem não enzimáticos utilizados habítualmente. A variante da α-amilase pode ser utilizada sozinha, ou em combinação com uma celulose para desengomar o têxtil ou tecido com celulose.

Fabricação da cerveja: Pensa-se que as variantes de α-amilase da invenção são também muito úteis nos processos de fabricação da cerveja; nestes processos as variantes habitualmente serão adicionadas durante o processo de maceração.

Aplicações em aditivos de detergentes e composições de detergentes para a lavagem da roupa ou para a lavagem da louça:

Devido à eficácia melhorada da lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça que muitas vezes será uma consequência das melhorias nas propriedades como o acima discutido, as numerosas variantes da α-amilase (incluindo as híbridas) da invenção são particularmente bem adequadas para serem incorporadas em composições de detergentes, por exemplo composições de detergentes destinadas a serem eficazes com um pH na faixa de 7 a 13, particularmente com um pH na faixa de 8 a 11. De acordo com a invenção, a variante da α-amilase pode ser adicionada como um componente de uma composição de detergente. Assim, esta pode ser incluída na composição de detergente na forma de um aditivo de detergente. 44

Assim, outro aspecto da invenção refere-se a um aditivo de detergente que compreende uma variante da α-amilase de acordo com a invenção. As enzimas podem ser incluídas numa composição de detergente pela adição de aditivos separados que contêm uma ou mais enzimas, ou adicionando um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo de detergente de acordo com a invenção, isto é um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode por exemplo ser formulado, como um granulado, líquido, pasta, etc. As formulações da enzima preferidas para aditivos de detergentes são as granuladas (em particular granuladas não pulverulentas), líquidas (em particular líquidos estabilizados), pastas ou enzimas protegidas (vide infra). A composição de detergente assim como o aditivo de detergente pode adicionalmente compreender uma ou mais das outras enzimas utilizadas de forma habitual em detergentes, como por exemplo proteases, lipases, enzimas amilolíticas, oxidases (incluídas as peroxidases), ou celulases.

Foi descoberto que melhorias substanciais na eficácia da lavagem da roupa e/ou da lavagem da louça pode ser obtida quando a a-amilase é combinada com outra enzima amilolítica, como por exemplo uma pululanase, uma iso-amilase, uma beta-amilase, uma amiloglucosídase ou uma CTGase. Exemplos de enzimas amilolíticas comercialmente disponíveis adequadas para a finalidade dada são AMG™, Novamyl™ e Promozyme™, todos elas comercializadas por Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca. Consequentemente, uma forma particular de realizar a invenção refere-se a um aditivo de detergente que compreende uma variante da α-amilase da invenção em combinação com pelo menos outra enzima amilolítica (por exemplo escolhida entre as acima mencionadas).

Os granulados não pulverulentos podem ser produzidos, como por exemplo, o descrito nos Pedidos de Patente US 4,106,991 e US 4,661,452, e podem opcionalmente ser revestidos por métodos 45 conhecidos na técnica; relatívamente a outros pormenores adicionais enquanto ao revestimento são abaixo dados. Quando uma combinação de enzimas de detergentes diferentes deve de ser empregue, as enzimas podem ser misturadas antes ou depois da granulação.

As preparações enzimáticas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas agregando um poliol como por exemplo o propílenoglícol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. Outros estabilizadores da enzima são bem conhecidos na técnica. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito no Pedido de Patente EP 238 216.

Como já indicado, outro aspecto adicional da invenção refere-se a uma composição de detergente, por exemplo para a lavagem da roupa, para a lavagem da louça ou para a limpeza de superfícies duras, compreendendo uma variante da α-amilase (incluindo a híbrida) da invenção, e um agente tensioactivo. A composição de detergente de acordo com a invenção pode estar em qualquer forma conveniente, como por exemplo em pó, granulada ou líquida. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo habitualmente até 90% de água e 0 a 20% de solvente orgânico, ou não aquoso, como por exemplo o descrito no Pedido de Patente EP 120,659.

Composições de detergentes

Quando uma variante da α-amilase da invenção é empregue como um componente de uma composição de detergente (por exemplo uma composição de detergente para a lavagem da roupa, ou uma composição de detergente para a lavagem da louça), esta pode por exemplo ser incluída na composição de detergente na forma de um granulado não pulverulento, um líquido estabilizado, ou uma 46 enzima protegida. Como o acima mencionado, os granulados não pulverulentos podem por exemplo ser produzidos, como o descrito nos Pedidos de Patente US 4,106,991 e 4,661,452 (ambos de Novo Industri A/S) e podem opcionalmente ser revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento de parafina são produtos de poli(óxido de etileno) (políetilenoglicol, PEG) com pesos moleculares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados contendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois gordos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e os quais compreendem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois gordos; ácidos gordos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos gordos. Exemplos de materiais de revestimento que formam películas adequadas para a aplicação mediante técnicas de leito fluidizado são dados no Pedido de Patente GB 1483591.

As enzimas adicionadas na forma de preparações enzimáticas líquidas podem, como o acima indicado, ser estabilizadas com por exemplo, a adição de um poliol como o propilenoglicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. São bem conhecidos na técnica outros estabilizadores da enzima.

As enzimas protegidas para a inclusão numa composição de detergente da invenção podem ser preparadas, como o acima mencionado, de acordo com o método descrito no Pedido Patente EP 238,216. A composição de detergente de acordo com a invenção pode estar em qualquer forma conveniente, como por exemplo em pó, granulado, pasta ou líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo habitualmente até 70% de água e de 0 a 30% de solvente orgânico, ou não aquoso. 47 A composição de detergente compreende um ou mais agentes tensioactivos, cada um dos quais pode ser aniónico, não iónico, catiónico, ou anfotérico (zwitteriónico). 0 detergente habitualmente contém 0 a 50% de agente tensioactivo aniónico como o alquilobenzenosulfonato linear (LAS), alfa-sulfonato de olefina (AOS), sulfato de alquilo (sulfato de álcool gordo) (AS), etoxi-sulfato de álcool (AEOS ou AES), alcano sulfonatos secundários (SAS), alfa-sulfo metil ésteres de ácidos gordos, ácido alquil ou ácido alquenilsuccínico, ou sabão. Pode também conter de 0 a 40% de um agente tensioactivo não iónico como o etoxilato de álcool (AEO ou AE), propoxilato de álcool, etoxilatos de álcool carboxilados, etoxilato de nonilfenol, alquil poliglicosídeos, óxido de alquil dimetilamina, monoetanolamida de ácidos gordos etoxilada, monoetanolamida de ácidos gordos, ou polihidroxi alquil amida de ácidos gordos (como por exemplo o descrito no Pedido de Patente WO 92/06154). A composição de detergente pode adicionalmente compreender uma ou mais enzimas, como por exemplo a pululanase, esterase, lipase, cutinase, protease, celulase, peroxidase, ou oxidase, por exemplo, laccase.

Habitualmente o detergente contém de 1 a 65% de um reforçador de detergente (ainda que alguns detergentes para a lavagem da louça possam conter até 90% de um reforçador de detergente) ou agente complexante como por exemplo um zeólito, um difosfato, um trifosfato, um fosfonato, um citrato, um ácido nitrilotriacético (NTA), um ácido etilenodíaminatetraacético (EDTA), ácido dietileno triaminopentaacétíco (DTMPA), ácido alquil ou ácido alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos estratificados (por exemplo SKS-6 de Hoechst).

Os reforçadores de detergentes podem ser subdivididos em reforçadores que contêm fósforo e reforçadores que não contêm fósforo. Exemplos de reforçadores de detergentes alcalinos inorgânicos que contêm fósforo incluem os sais solúveis na água, 48 especialmente os pirofosfatos de metal alcalino, ortofosfatos, polifosfatos e fosfonatos. Exemplos de reforçadores inorgânicos que não contêm fósforo incluem os carbonetos de metal alcalino solúveis na água, boratos e silicatos, assim como os dissilícatos estratificados e os diferentes tipos de silicatos cristalinos insolúveis na água ou silicatos de alumínio amorfos dos quais os zéolitos são os representantes mais conhecidos.

Exemplos de reforçadores orgânicos adequados incluem metal alcalino, o amónio ou os sais de amónio substituídos de succinatos, malonatos, malonatos de ácidos gordos, sulfonaos de ácidos gordos, os succinatos de carboxi-metoxi, os poliacetatos, os carboxilatos, os policarboxilatos, os aminopolicarboxilatos e os carboxilatos de poliacetil. 0 detergente também pode não ser reforçado, isto é essencialmente livre de reforçador de detergente. 0 detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos destes polímeros são a carboximetilcelulose (CMC; habitualmente na forma da sal de sódio), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG), poli(álcool vinílico) (PVA), policarboxilatos como por exemplo os poliacrílatos, polimaleatos, copolímeros de ácido maleico/acrilico e copolíirteros de lauril metacrilato/ácido acrílico. A composição de detergente pode conter branqueadores do tipo cloro/bromo ou do tipo oxigénio. Os branqueadores podem estar revestidos ou encapsuladas. Exemplos de branqueadores de tipo clorina/bromina inorgânicos são o hipobromito ou o hipocloríto de lítio, sódio ou cálcio assim como fosfato trissódico clorado. 0 sistema de branqueamento pode também compreender uma fonte de H202 assim como o perborato ou o percarbonato que pode ser combinado com um activador de branqueamento formado por de perácído como por exemplo a tetra-acetiletilenodiamina (TAED) ou nonanoiloxibenzenosulfonato (NOBS). 49

Exemplos agentes orgânicos de branqueamento do tipo cloro/bromo são as imidas heterocíclicas de N-bromo e N-cloro como por exemplo o ácido tricloroisocianúrico, o ácido tribromoisocianúrico, o ácido dibromoisocíanúrico e o ácido dicloroisocianúrico, e os seus sais com catiões de solubilização na água como por exemplo o potássio e o sódio. Os compostos de hidantoína são também adequados. 0 sistema de branqueamento pode também compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amido, imida, ou sulfona.

Nos detergentes para a lavagem da louça são preferidos os branqueadores de oxigénio, por exemplo em forma de um persai inorgânico, preferencialmente com um precursor de branqueamento ou como um composto do peroxiácido. Exemplos típicos de compostos de branqueamento de peróxído adequados são os perboratos de metal alcalino, os tetrahidratos assim como os monohidratos, percarbonatos de metal alcalino, persilicatos e perfosfatos. Os materiais activadores preferidos são o TAED ou o NOBS.

As enzimas da composição de detergente da invenção podem ser estabilizadas utilizando os habituais agentes estabilizantes, como por exemplo um poliol como o propilenoglicol ou gliceol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado do ácido bórico como por exemplo, um éster de borato aromático, e a composição pode ser formulada como o por exemplo descrito nos Pedidos de Patentes WO 92/19709 e WQ 92/19708. As enzimas da invenção podem também ser estabilizadas adicionando inibídores enzimáticos reversíveis, por exemplo, do tipo proteína (como o descrito no Pedido de Patente EP 0 544 777 Bl) ou do tipo do ácido borónico. O detergente pode ainda conter outros ingredientes de detergentes habituais como por exemplo, acondicionadores do tecido incluído argilas, material desfioculante, activadores da 50 espuma/depressores da espuma (nos depressores de espuma dos detergentes para a lavagem da louça), supressores da espuma, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujidade, agentes de anti-redeposição da sujidade, corantes, agentes desídratantes, bactericidas, abrilhantadores ópticos, ou perfume. O pH (medido numa solução aquosa na concentração utilizada) habitualmente será neutro ou alcalino, por exemplo na faixa de 7 a 11.

As formas particulares de composições de detergente para a lavagem da roupa dentro do âmbito da invenção incluem: 1) Uma composição de detergente formulada como um granulado com uma densidade de massa de pelo menos 600 g/.l que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 7 - 12% Etoxisulfato de álcool (p. ex. álcool C12-18, 1-2 EO) ou sulfato de alquilo (p. ex. Ci6_i8) 1-4% Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C14-15, 7 EO) 5-9% Carbonato de sódio (como Na2C03) 14 - 20% Silicato solúvel (como Na20, 2Si02) 2-6% Zeólito (como NaAISiOí) 15 - 22% Sulfato de sódio (como Na2S04) 0-6% Citrato de sódio/ácido cítrico (como C6H5Na307 /C6H807) 0 - 15% Perborato de sódio (como NaB03.H20) 11 - 18% TAED 2-6% Carboxímetilcelulose 0-2% Polímeros (p. ex. copolímero de ácido maleico/acrílíco, PVP, PEG) 0-3% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 -0.1% 51

Ingredientes secundários (p. ex. supressores da espuma, perfume, abrilhantador óptico, 0-5% fotobranqueador) 2) Uma composição de detergente formulada como um granulado com uma densidade de massa de pelo menos 600 g/1 que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 6 - 11% Etoxisulfato de álcool (p. ex. álcool C12-18/ 1-2 EO) ou sulfato de alquilo (p. ex. Οχβ-ιβ) 1-3% Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C14-15, 7 EO) 5- 9% Carbonato de sódio (como Na2C03) 15-21% Silicato solúvel (como Na20,2Si02) 1-4% Zeólito (como NaAISi04) 24 - 34% Sulfato de sódio (como Na2S04) 4 - 10% Citrato de sódio/ácido cítrico (como CêHsNasO? /c6h8o7) 0 - 15% Carboximetilcelulose 0-2% Polímeros (p. ex. copolímero de ácido maleíco/acrílico, PVP, PEG) 1-6% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 -0.1% Ingredientes secundários (p. ex. supressores da espuma, perfume) 0-5% 3) Uma composição de detergente formulada como um granulado com uma densidade de massa de pelo menos 600 g/1 que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 5-91 Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C12-15, 7 EO} 7 -14% Sabão como ácido gordo (p. ex. ácido gordo C16-22) 1-3% Carbonato de sódio (como Na2C03) 10 - 17% 52

Silicato solúvel (como Na20, 2Si02) 3-9% Zeólito (como NaAISi04) 23 - 33% Sulfato de sódio (como Na2S04) 0 - 4% Perborato de sódio (como NaB03-H20) 8 - 16% TAED 2-81 Fosfonato (p. ex. EDTMPA) 0-1% Carboximet.il celulose 0-2% Polímeros (p. ex. copolímero de ácido maleíco/acrílico, PVP, PEG) 0 - 31 Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. supressores da espuma, perfume, abrilhantador óptico) 0-5% 4) Uma composição de detergente formulada como um granulado com uma densidade de massa de pelo menos 600 g/1 que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 8 - 12% Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C12-15, 7 EO) 10 - 25% Carbonato sódio (como Na2C03) 14 - 22% Silicato solúvel (como Na20,2 Si02) 1-5% Zeólito (como NaAISi04) 25 - 35% Sulfato de sódio (como Na2S04) 0 - 10% Carboximetilcelulose 0-2% Polímeros (p. ex. copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1 - 3% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1 '6 Ingredientes secundários (p. ex. supressores da espuma, perfume) 0-5% 5) Uma composição de detergente líquido aquoso que compreende: 53

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 15 - 21% Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C12-15, 7 EO ou álcool C12-1S, 5 EO) 12 -18% Sabão como ácido gordo (p. ex. ácido oleico) 3 - 13% Ácido alquenilsuccínico (C12-14) 0 - 13% Aminoetanol 8 - 18% Ácido cítrico 2-8% Fosfonato 0-3% Polímeros (p. ex. PVP, PEG) 0-3% Borato (como B4O72") 0-2% Etanol 0-3% Propilenoglicol 8 - 14% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 -0.1% Ingredientes secundários (p. ex. dispersantes, supressores da espuma, perfume, abrilhantador óptico) 0-51 6) Uma composição de detergente líquido aquoso estruturado que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 15 - 21% Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C12-15, 7 EO, ou álcool C12-15, 5 EO) 3-9% Sabão como ácido gordo (p. ex. ácido oleico) 3 - 10% Zeólito (como NaAISiO.4) 14 - 22% Citrato de potássio 9 - 18% Borato (como B4 Οη2~) 0-2% Carboximetilcelulose 0-2% Polímeros (p. ex. PEG, PVP) 0 - 3% Polímeros de ancoragem como p. ex., copolímero de 0-3% 54 lauril metacrilato/ácido acrílico; rácio molar 25:1; MW 3800 Glicerol o\° LO ! O Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 -0.1% Ingredientes secundários (p. ex. dispersantes, supressores da espuma, perfume, abrilhantador óptico) 0-5% 7) Uma composição de detergente formulado como um granulado com uma densidade em massa de pelo menos 600 g/1 que compreende:

Sulfato de álcool gordo 5 - 10% Monoetanolamida de ácido gordo etoxilado 3 - 9% Sabão como ácido gordo 0-3% Carbonato de sódio (como Na2C03) 5 - 10% Silicato solúvel (como Na20.2Si02) 1-4% Zeólito (como NaAISiCd) 20 - 40% Sulfato de sódio (como Na2S04) 2-8% Perborato de sódio (como NaB03.H20) 12 - 18% TAED 2-7% Polímeros (p. ex. copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) 1-5% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. abrilhantador óptico, supressores da espuma, perfume) 0-5% 8) Uma composição de detergente formulado como um granulado que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 8 - 14% Monoetanolamida de ácido gordo etoxilado 5 - 11% Sabão como ácido gordo 0-3% 55

Carbonato de sódio (como Na2C03) 4 - 10% Silicato solúvel (como Na20,2Si02) 1-41 Zeólito (como NaAISi04) 30 - 50% Sulfato de sódio (como Na2S04) 3 - 11% Citrato de sódio (como C6H5Na307) 5 - 12% Polímeros (p. ex. PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) 1-51 Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 -0.1% Ingredientes secundários (p. ex. supressores da espuma, perfume) 0-5% 9) Uma composição de detergente formulado como um granulado que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 6 -12% Agente tensioactivo não iónico 1-4% Sabão como ácido gordo 2-6% Carbonato de sódio (como Na2C03) 14 - 22% Zeólito (como NaAISiOí) 18 - 32% Sulfato de sódio (como Na2S04) 5 - 20% Citrato de sódio (como CgHsNa 07) 3 ~ 8 % Perborato de sódio (como NaB03.H2G) 4-9% Activador do branqueamento (p. ex. NOBS ou TAED) 1-5% Carboximetilcelulose 0-2% Polímeros (p. ex. policarboxilato ou PEG) 1-5% Enzimas (calculado como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. abrilhantador óptico, perfume) 0-5% 10) Uma composição de detergente líquido aquoso que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 15 - 23% 56

Etoxisulfato de álcool (p. ex. álcool Ci2-i8r 1-2 EO) 8 - 15% Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C14-15, 7 EO, ou álcool C12-15, 5 EO) 3-9% Sabão como ácido gordo (p. ex. ácido láurico) 0-3% Aminoetanol 1-5% Citrato de sódio 5 - 10% Hidrótropo (p. ex. toluenosulfonato de sódio) 2-6% Borato (como 0 - 2% Carboximetilcelulose 0-1% Etanol 1-3% Propilenoglicol 2-5% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. polímeros, dispersantes, perfume, abrilhantadores ópticos) 0-5% 11) Uma composição de detergente líquido aquoso que compreende:

Alquilbenzeno sulfonato linear (calculado como ácido) 20 - 32% Etoxilato de álcool (p. ex. álcool C12-15, 7 EO, ou álcool C12-15/ 5 EO) 6 - 12% Aminoetanol 2-6% Acido cítrico 8 - 14% Borato (como B407s') 1-3% Polímero (p. ex. copolimero de ácido maleico/acrílico, polímero de ancoragem como, p. ex., copolimero de lauril metacrilato/ácido a cm 1 ico) 0-3% Glicerol 3-8% Enzimas (calculado como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. hidrótropos, dispersantes, perfume, abrilhantadores ópticos) 0-5% 57 12) Uma composição de detergente formulada como um granulado com uma densidade em massa de pelo menos 600 g/1 gue compreende:

Agente tensioactivo aniónico (alquilbezceno sulfonato linear, sulfato de alquilo, alfa-olefinasulfonato, metil ésteres de ácidos alfa-sulfo gordos, alcanos sulfonatos, sabão) 25 - 40% Agente tensioactivo não iónico (p. ex. etoxilato de álcool) 1 - 10% Carbonato de sódio (como Na2C03) 8 - 25% Silicatos solúveis (como Na20, 2Si02) 5 - 15% Sulfato de sódio (como Na2S04) 0-5% Zeólito (como NaAISi04) 15 - 28% Perborato de sódio (como NaB03.4H20) 0 - 20% Activador do branqueamento (TAED ou NOBS) 0-5% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. perfume, abrilhantadores ópticos) 0-3% 13) Formulações de detergentes como o descrito de 1) a 12) onde todo ou parte do alquilobenzeno sulfonato linear é substituído por (Ci2-ci8) sulfato de alquilo. 14) Uma composição de detergente formulado como um granulado com uma densidade em massa de pelo menos 600 g/1 que compreende: sulfato de alquilo (C12—Cie) 9 - 15% Etoxilato de álcool 3-6% Polihidroxi alquilo amida de ácidos gordo 1 - 5% Zeólito (como NaAISiCú) 10 - 20% Dissilicato estratificado (p. ex. SK56 de Hoechst) 10 — 2 0 % Carbonato de sódio (como Na2C03) 3 - 12% Silicato solúvel (como Na2Q,2Si02) 0-6% Citrato de sódio 4 - 8% 58

Percarbonato de sódio 13 - 22% TAED 3-8% Polímeros (p. ex. policarboxilatos e PVP) 0-5% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. abrilhantador óptico, fotobranqueador, perfume, supressores da espuma) 0-5% 15) Uma composição de detergente formulado como um granulado que tem uma densidade em massa de pelo menos 600 g/1 que compreende:

Sulfato de alquilo (C12—Cie) 4 - 81 Etoxilato de álcool 11 - 15% Sabão 1 - 4% Zeólito MAP ou zeólito A 35 - 45% Carbonato de sódio (como Na2C03) 2-8% Silicato solúvel (como Na20,2Si02) 0-4% Percarbonato de sódio 13 - 22% TAED 1-8% Carboximetilcelulose 0-3% Polímeros (p. ex. policarboxilatos e PVP) 0-3% Enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001 - 0.1% Ingredientes secundários (p. ex. abrilhantador óptico, fosfonato, perfume) 0-3% 16) Formulações de detergentes como o descrito de 1) a 15) que contém um perácido estabilizado ou encapsulado, ou como um componente adicional ou como um substituto para os sistemas de branqueamento já especificados. 17) Composições de detergentes como o descrito em 1), 3), 7), 9) e 12) em que o perborato é substituído por percarbonato. 59 18) Composições de detergentes como o descrito em 1), 3), 7), 9), 12), 14) e 15) que adicionalmente contém um catalisador de manganésio. 0 catalisador de manganésio pode, por exemplo, ser um dos compostos descritos em "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369,1994, pp. 637-639. 19) Composição de detergente formulado como um líquido de detergente não aquoso que compreende um agente tensioactivo líquido não iónico como, por exemplo, álcool primário alcoxilado linear, um sistema reforçador (por exemplo fosfato), enzima e alcali. 0 detergente pode também compreender um agente tensioactivo aniónico e/ou um sistema de branqueamento.

Formas particulares de composições de detergente para a lavagem da louça dentro do âmbito da invenção incluem:

1) COMPOSIÇÃO EM PÓ PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA

Agente tensioactivo não iónico 0.4 - 2.5% Metassilicato de sódio 0 - 20% Dissilicato de sódio 3 - 20% Trifosfato de sódio 20 - 40% Carbonato de sódio 0 - 20% Perborato de sódio 2-9% Tetra-acetiletilenodiamina (TAED) 1-4% Sulfato de sódio 5 - 33% Enzimas 0.0001 - 0.1% 2) COMPOSIÇÃO EM PÓ PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA:

Agente tensioactivo não iónico (p. ex. etoxilato de álcool) 1 - 2% Dissilicato de sódio 2 - 30% Carbonato de sódio 10 - 50% 60

Fosfonato de sódio 0-5% Di-hidrato citrato trissódico 9 - 30% Acetao nitrilotrissódico (NTA) 0 - 20% Monohidrato perborato de sódio 5 -10% Tetra-acetiletilenodiamina (TAED) 1-2% Polímero de poliacrilato (p. ex. copolímero de ácido maleíco/ácido acrílico) 6 - 25% Enzimas 0.0001 - 0.1% Perfume 0.1 - 0.5% Água 5-10 3) COMPOSIÇÃO EM PÓ PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇÃ:

Agente tensioactivo não iónico 0.5 - 2.0% Dissilicato de sódio 25 - 40% Citrato de sódio 30 - 55% Carbonato de sódio 0 -29% Bicarbonato de sódio 0 - 20% Monohidrato perborato de sódio 0 - 15% Tetra-acetiletilenodiamina (TAED) 0-6% Copolímero de ácido maleíco /ácido acrílico 0-5% Argila 1-3% Poli(aminoácidos) 0 - 20% Poliacrilato de sódio 0-8% Enzimas 0.0001 - 0.1% 4) COMPOSIÇÃO EM PÓ PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA:

Agentetensioactivo não iónico 1-2% Zeólito MAP 15 - 42% Dissilicato de sódio 30 - 34% Citrato de sódio 0 - 12% Carbonato de sódio 0 - 20% 61

Monohidrato perborato de sódio 7 - 15% Tetra-acetiletilenodiamina (TAED) 0-3% Polímero 0-4% Copolímero de ácido maleico /ácido acrílico 0-5% Fosfonato orgânico 0-4% Argila 1-2% Enzimas 0.0001 - 0.1% Sulfato de sódio Remanescente 5) COMPOSIÇÃO EM PÓ PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA:

Agente tensioactivo não iónico 1-7% Dissilicato de sódio 18 - 30% Citrato trissódico 10 - 24% Carbonato de sódio 12 - 20% Monopersulfato (2KHS05.KHS04.K2 S04) 15 - 21% Estabilizador de branqueamento 0.1 - 2% Copolímero de ácido maleico /ácido acrílico 0-6% Dietilenotriaminapentaacetato, sal pentassódico 0 - 2.5% Enzimas 0.0001 - 0.1% Sulfato de sódio, água Remanescente 6) COMPOSIÇÃO EM PÓ E LÍQUIDA PARA A LAVAGEM DA LOUÇA COM SISTEMA TENSIOACTIVO DE LIMPEZA:

Agente tensioactivo não iónico 0 - 1.5% Dihidrato N-óxido de dimetilamina octadecil 0 - 5% Mistura 80:20 em peso C18/C16 de dihidrato N-óxido de dimetilamina octadecil e dihidrato N-óxido amina hexadecildimetil 0-4% Mistura 70:30 em peso C18/C16 de anidro N-óxido 0-5% 62 bis(hidroxietil)amina octadecil e anidro N-óxido bis(hidroxietíl)amina hexadecil Alquil etoxisulfato C13-C15 com um grau médio de etoxilação de 3 0 - 10% Alquil etoxisulfato C12-C15 com um grau médio de etoxilação de 3 0-5% Álcool etoxilado C13-C15 com um grau médio de etoxilação de 12 0-5% Mistura de álcoois etoxilados C12-C15 com um grau médio de etoxilação de 9 0 - 6.5% Mistura de álcoois etoxilados C13-C15 com um grau médio de etoxilação 30 0-4% Dissilicato de sódio 0 - 33% Tripolifosfato de sódio 0 - 46% Citrato de sódio 0 - 28% Acido cítrico 0 - 29% Carbonato de sódio 0 - 20% Monohidrato perborato de sódio 0 - 11.5% Tetra-acetiletilenodiamina (TAED) 0-4% Copolímero de ácido maleico /ácido acrílico 0 - 7.5% Sulfato de sódio 0 - 12.5% Enzimas 0.0001 - 0.1% 7) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA NÃO AQUOSA PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA:

Agente tensioactivo liquido não iónico (p. ex. etoxilatos de álcool) 2.0 - 10.0% Silicato de metal alcalino 3.0 - 15.0% Fosfato de metal alcalino 20.0 - 40.0% Portador líquido seleccionado dos glicóis, poliglicoóis, polióxidos, éteres glicólicos superiores 25.0 - 45.0% Estabilizador (p. ex. um éster parcial de ácido 0.5 - 7.0% 63 fosfórico e um alcanol Cie -Cie) Supressor da espuma (p. ex. silicone) 0 - 1.5% Enzimas 0.0001 - 0.1% 8) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA NÃO AQUOSA PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA:

Agente tensioactivo líquido não iónico (p. ex. etoxilatos de álcool) 2.0 - 10.0% Silicato de sódio 3.0 - 15.0% Carbonato de metal alcalino 7.0 - 20.0% Citrato de sódio 0.0 - 1.5% Sistema estabilizador (p. ex. misturas de silicone finamente dividida e éteres de poliglicóis dialquilo com baixo peso molecular) 0.5 - 7.0% Polímero de poliacrilato com baixo peso molecular 5.0 - 15.0% Espessante de gel de argila (p. ex. bentonita) 0.0 - 10.0% Polímero de hidroxipropilcelulose 0.0 - 0.6% Enzimas 0.0001 - 0.1% Portador líquido seleccionado dos licóis, poliglicóis, polióxidos e éteres glicólicos superiores Remanescente 9) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA TIXOTRÓPICA PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA: Ácido gordo C12 -Cu 0 - 0.5% Agente tensioactivo do copolímero do bloco 1.5 - 15.01 Citrato de sódio 0 - 12% Tripolifosfato de sódio 0 - 15% Carbonato de sódio 0-8% Tristearato de alumínio 0 - 0.1% Cumeno sulfonato de sódio 0 - 1.7% Espessante de poliacrilato 1.32 - 2.5% Poliacrilato de sódio 2.4 - 6.0% 64

Acido bórico 0 - 4.0% Formato de sódio 0 - 0.45% Formato de cálcio 0 - 0.2% N-decidífenil óxido disulfonato de sódio 0 - 4.0% Monoetanol amína (MEA) 0 - 1.86% Hidróxido sódico (50%) 1.9 - 9.3% 1,2-propandiol 0 - 9.4% Enzimas 0.0001 - 0.1% Supressor da espuma, corante, perfumes, água Remanescente 10) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA:

Etoxílato de álcool 0 - 20% Sulfonato de éster de ácido gordo 0 - 30% Dodecil sulfato de sódio 0 - 20% Alquil poliglicosídeo 0 - 21% Ácido oleico 0 - 10% Monohidrato dissilicato de sódio 18 - 33% Dihidrato de citrato sódio 18 - 33% Estearato de sódio 0 - 2.5% Monohidrato perborato de sódio 0 - 13% Tetra-acetiletilenodiamina (TAED) 0 - 8% Copolímero de ácido maleico /ácido acrílico 4-8% Enzimas 0.0001 - 0.1% 11) COMPOSIÇÃO LÍQUIDA PARA A LAVAGEM AUTOMÁTICA DA LOUÇA COM PARTÍCULAS DE BRANQUEAMENTO PROTEGIDAS:

Silicato de sódio 5 - 10% Pirofosfato de tetrapotássío 15 - 25% Trifosfato de sódio 0 - 2% Carbonato de potássio 4-8% Partículas de branqueamento protegidas, p. ex. cloro 5 -10% Espessante polímérico 0.7 - 1.5% 65

Hidróxido de potássio 0-2% Enzimas 0.0001 - 0.1% Água Remanescente 11) Composições para a lavagem automática da louça como o descrito em 1), 2), 3), 4), 6) e 10), em que o perborato é substituído per percarbonato. 12) Composições para a lavagem automática da louça como se descreve em 1) - 6) que adicionalmente contém um catalisador de manganésio. O catalisador de manganésio pode, por exemplo, ser um dos compostos descritos em "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369,1994, pp. 637-639.

Uma variante da α-amilase da invenção pode ser incorporadas nos detergentes nas concentrações habitualmente empregues. Na actualidade é contemplado que, na composição de detergente de acordo com a invenção, a variante da α-amilase pode ser adicionada numa quantidade correspondente a 0.00001-1 mg (calculado como proteína de enzima pura) da α-amilase por litro de solução para a lavagem da roupa/lavagem da louça. A presente invenção é ainda descrita com referência ao desenho anexos, em que: A figura 1 é um alinhamento das sequências de aminoácidos de quatro α-amilases de origem no contexto da invenção. Os números na extremidade esquerda designam as sequências de aminoácidos respectivas como segue: 1: A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1; 2: A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2; 3: A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3; e 4: A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 7. 66

Os números na extremidade direita da figura dão o número total de funcionamento dos aminoácidos para cada uma das sequências em questão. Deve ser notado que para a sequência numerada com 3 (correspondente à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3), o alinhamento resulta em "intervalos" nas posições correspondentes ao aminoácido N°. 1 e ao amínoácido N°. 175, respectívamente, nas sequências numeradas 1 (SEQ ID N°. 1), 2 (SEQ ID N°. 2) e 4 (SEQ ID N°. 7). A figura 2 é um mapa de restrição do plasrttídeo pTVB106. A figura 3 é um mapa de restrição do plasmideo pPMl03. A figura 4 é um mapa de restrição do plasmideo pTVB112. A figura 5 é um mapa de restrição do plasmideo pTVBH4.

SECÇÃO EXPERIMENTAL A preparação, purificação e sequenciação das α-amilases de origem que têm as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1 e a SEQ ID N°. 2 (da cepa de Bacíllus NCIB 12512 e NCIB 12513, respectívamente) estão descritas no Pedido de Patente WO 95/26397. Os valores de pi e os pesos moleculares destas duas a-amilases de origem (dadas no Pedido de Patente WO 95/26397) são os seguintes: SEQ ID N°. 1: PI de cerca de 8.8 a 9.0 (determinado por focagem isoeléctrica em placas PAG de LKB Ampholine™); peso molecular aproximadamente 55 kD (determinado por SDS-PAGE). SEQ ID N°. : PI aproximadamente 5.8 (determinado por focagem isoeléctrica em placas PAG de LKB Ampholine1’*5 ); peso molecular aproximadamente 55 kD (determinado por SDS- PAGE). 67

Purificação das variantes da α-amilase da invenção A construção e expressão das variantes de acordo com a invenção são descritas no exemplo 2, abaixo. A purificação das variantes da invenção é ilustrada aqui com referência às variantes das sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1 e na SEQ ID N°. 2, respectivamente:

Purificação de variantes da SEQ ID N°. 1 (pi aproximado a 9.0): O liquido de fermentação que contém a variante da a-amilase expressa é filtrado, e é adicionado a sulfato de amónio a uma concentração de 15% de saturação. O liquido é seguidamente aplicado numa coluna hidrofóbica (Toyopearl butyl/TOSOH). A coluna é lavada com 20 mM de tampão de ácido dimetil-glutárico, pH 7.0. A α-amilase é ligada muito firmamente, e é eluída com 25% p/p 2-propanol em 20 mM de tampão de ácido dimetilglutárico, pH 7.0. Após a eluição, o 2-propanol é removido por evaporação e o concentrado é aplicado num permutador de catiões (S-Sepharose™ FF, Pharmacia, Suécia) equilibrado com 20 mM de tampão de ácido dimetilglutárico, pH 6.0. A α-amilase é eluída com a utilização de um gradiente linear de 0 a 250 mM de NaCl no mesmo tampão. Após a díálíse com 10 mM de tampão de borato/KCl, pH 8.0, a amostra é ajustada a pH 9.6 e aplicado a um permutador de aniões (Q-Sepharose™ FF, Pharmacia) equilibrado com 10 mM de tampão de borato/KCl, pH 9.6. A amílase é eluída com a utilização de um gradiente linear de 0 a 250 mM de NaCl. O pH é ajustado a 7.5. A α-amilase é pura como o avaliado por rSDS-PAGE. Todos os tampões contêm 2mM de CaCl2 para estabilizar a amílase.

Purificação das variantes da SEQ ID N°. 2 (pi aproximado a 5.8): O líquido de fermentação que contém a variante da a-amilase expressa é filtrado, e é adicionado sulfato de amónio a uma concentração de 15% de saturação. 0 líquido é seguidamente 68 aplicado numa coluna hidrofóbica (Toyopearl butyl/TOSOH). A amilase ligada é eluída com um gradiente linear de 15% a 0% p/p de sulfato de amónio em 10 mM de tampão Tris, pH 8.0. Após a diiálise do eluído com 10 mM de tampão de borato/KCl, pH 8.0, o liquido é ajustado a pH 9.6 e aplicado num permutador de aniões (Q-Sepharose™ FF, Pharmacia) equilibrado com o mesmo tampão. A amilase é eluída por fases com a utilização de 150 mM de NaCl.

Após a eluição a amostra de amilase é dializada com o mesmo tampão, pH 8.0, para remover o NaCl. Após a diálise, o pH é ajustado a 9.6 e a amilase é uma vez mais ligada no permutador de aniões. A amilase é eluída com a utilização de um gradiente linear de 0 a 250 mM de NaCl. O pH é ajustado a 7.5. A amilase é pura como o avaliado por rSDS-PAGE. Todos os tampões contêm 2 mM de CaCl2 para estabilizar a amilase.

Determinação da actividade a-amilase A actividade α-amilase é determinada por um método que utiliza comprimidos de Phadebas® como substrato. Os comprimidos de Phadebas (Phadebas® Amylase Test, fornecido por Pharmacia Diagnostic) contêm um polímero de amido de cor azul insolúvel reticulado que foram misturados com albumina de soro bovino e com uma substância tampão e colocado em comprimidos. Para a determinação de cada medição individual um comprimido é colocado em suspensão num tubo que contém 5 ml de tampão 50 mM Britton-Robínson (50 mM ácido acético, 50 mM ácido fosfórico, 50 mM ácido bórico, 0.1 mM CaCia, pH ajustado ao valor de interesse com NaOH). 0 teste foi realizado em banho-maria à temperatura de interesse. A α-amilase a ser testada é diluída em x mi de 50 mM tampão Britton-Robinson. 1 ml desta solução da α-amilase é adicionado a 5 ml de tampão 50 mM Britton-Robinson. 0 amido é hidrolizado pela α-amilase dando fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azul resultante, medida 69 espectrofotometricamente a 620 nm, é uma função da actividade da α-amilase. É importante que a absorbância a 620 nm medida após 15 minutos de incubação (tempo de teste) esteja na faixa de 0.2 a 2.0 unidades de absorbância a 620 nm. Nesta faixa de absorbância há linearidade entre a actividade e a absorbância (lei de Lambert-Beer). A diluição da enzima deve portanto ser ajustada para adaptar-se este critério.

Sob um conjunto especifico de condições (temperatura, pH, tempo de reacção, condições do tampão) 1 mg de uma α-amilase dada hidrolizará uma quantidade determinada de substrato e a cor azul será produzida. A intensidade da cor é medida a 620 nm. A absorbância medida é directamente proporcional à actividade especifica (actividade/mg de proteína pura da α-amilase) da <x-amilase em questão sob o conjunto de condições dadas. Assim testando as diferentes α-amilases de interesse (incluído a a-amilase de referência, neste caso a α-amilase de origem em questão) sob condições idênticas, a actividade específica de cada uma das α-amilases a uma temperatura dada e a um pH dado podem ser comparadas directamente, e o rácio da actividade específica de cada uma das α-amilases de interesse em relação à actividade específica da α-amilase de referência pode ser determinada.

Mini ensaio de lavagem da louça:

Foi utilizado o seguinte mini ensaio de lavagem da louça: Uma suspensão de material amiláceo foi fervida e arrefecida a 20°C. A suspensão de amido arrefecida foi aplicada em placas de vidro pequenas individuais identificadas (aproxímadamente 2x2 cm) e secas a uma temperatura de cerca de 140°C numa câmara de secagem. Seguidamente as placas individuais foram pesadas. Para os objectivos do ensaio, foi preparada uma solução de detergente 70 para a lavagem automática da louça tipo Europeu Standard (5 g/1) com uma temperatura de 55°C. 0 tempo de dissolução do detergente foi de 1 minuto, após o qual a α-amilase em questão foi adicionada à solução de detergente (contido num copo de precipitação equipado com agitação magnética) para dar uma concentração enzimática de 0.5 mg/1. Ao mesmo tempo, as placas de vidro pesadas, seguradas com pequenos ganchos de suporte, foram imersas numa posição substancialmente vertical na solução de α-amilase/detergente, que foi seguidamente agitada durante 15 minutos a 55°C. As placas de vidro foram seguidamente removidas da solução de α-amilase/detergente, enxaguadas com água destilada, secas a 60°C numa câmara de secagem e novamente pesadas. A eficácia da α-amilase em questão [expressa como um índice em relação a uma α-amilase de referência escolhida (índice 100) - no exemplo abaixo (exemplo 1) a α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1] foi seguidamente determinada a partir da diferença do peso das placas do vidro antes e depois do tratamento, da seguinte maneira: { perda de peso da placa tratada com a - amilase , índice = —---£-. 100 perda de peso da placa tratada com a referência

Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente a presente invenção. Eles de nenhuma maneira estão destinados a limitar o âmbito da invenção conforme o reivindicado. EXEMPLO 1

Mini teste da lavagem da louça das variantes da «-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1 71 0 mini teste de lavagem da louça acima descrito foi realizado a pH 10.5 com a α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1 e as variantes seguintes da mesma (cuja construção e purificação estão abaixo descritas) : T183* + G184 Y243F; e K269R. O teste deu os seguintes resultados: índice: 100 índice: 120 índice: 120 índice: 131

Origem (SEQ ID N°. 1) T183* + G184*

Y243F

K269R

Está claro que cada uma das variantes avaliadas T183* + G184* (que exibem, inter alia, maior estabilidade térmica do que a a-amilase de origem), Y243F (que exibe uma dependência aos iões de cálcio inferior que a α-amilase de origem) e K269R (que exibe uma dependência aos iões de cálcio inferior e uma maior estabilidade com pH alto que a α-amilase de origem) exibem uma eficácia de lavagem da louça signíficativamente melhorada em relação à α-amilase de origem, EXEMPLO 2

Construção das variantes das oc-amílases de origem com as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°, 1 e SEQ ID N°. 2, respectivamente

Iniciadores: Os iniciadores do A DM empregues na construção das variantes como o abaixo descrito incluem os seguintes [todos os iniciadores do ADN estão escritos no sentido de 5' a 3' (esquerda para a direita); P denota um 5' fosfato]: 72 #7113: GCT GCG GTG ACC TCT TTA ΆΆΆ AAT AAC GGC Y296: CC ACC GCT ATT AGA TGC ATT GTA C #6779: CTT ACG TAT GCA GAC GTC GAT ATG GAT CAC CC #6778: G ATC CAT ATC GAC GTC TGC ATA CGT AAG ATA GTC #3811: TT A(C/G)G GGC AAG GCC TGG GAC TGG #7449: C CCA GGC CTT GCC C(C/G)T ΑΑΑ TTT ATA TAT TTT GTT TTG #3810: G GTT TCG GTT CGA AGG ATT CAC TTC TAC CGC #7450: GCG GTA GAA GTG AAT CCT TCG AAC CGA AAC CAG BI:

GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C 73 #6616: P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C #8573: CTA CTT CCC AAT CCC AAG CTT TAC CTC GGA ATT TG #8569: CAA ATT CCG AGG TAA AGC TTG GGA TTG GGA AGT AG #8570:

TTG AAC AAC CGT TCC ATT AAG AAG A: Construção de variantes da α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1

Descrição do plasmídeo pTVB106: A α-amilase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 1 e as suas variantes são expressas a partir de um gene transportado por o plasmídeo, SF16, mostrado na figura 2. O plasmídeo, pTVB106, contém uma origem de replicação obtida a partir do plasmídeo pUBUO (Gryczan et al., 1978) e o gene cat que confere resistência para o cloranfenicol. A secreção da amilase é ajudada pela sequência de sinal do Termamyl™ que é precisamente fundida, isto é codão N°. 1 da proteína madura, ao gene que codifica a α-amilase de origem que tem o nucleotídeo e a sequência de aminoácidos (proteína madura) mostrada na SEQ ID N°. 4 e na SEQ ID N°. 1, respectivamente. Q promotor de Termamyl inicia a transcrição do gene. 74 0 plasmídeo pTVBl06 é idêntico ao pDN1528 (ver Pedido de Patente dinamarquesa acessível ao público N°. 1155/94). Alguns sítios de restrição únicos estão indicados no mapa plasmídeo na figura 2, incluído BstBI, BamHI, BstEII, EeoNI, DrdI, AflIII, DraIII, Xmal, Sall e Bglll.

Construção da variante M202T: 0 método da mutagénese de extensão por sobreposição da PCR é utilizado para construir esta variante (Higuchi et al., 1988). Um fragmento de ADN de aproximadamente 350 bp de pTVB106 é amplificado numa reacção da PCR utilizando os iniciadores #7113 e iniciador mutagénico #6778. Numa reacção B com PCR idêntica, um fragmento de ADN de aproximadamente 300 bp é amplificado utilizanddo os iniciadores Y296 e #6779. 0 fragmento de ADN completo que abrange o sítio da mutação (M202) desde o iniciador #7113 até ao iniciador Y296 é amplificado na PCR C utilizando estes iniciadores e os fragmentos de ADN purificados a partir das reacções A e B. O ADN da PCR C é digerido com as endonucleases de restrição BstEII e ÃflII, e o fragmento de 480 bp é ligado com o plasmídeo pTVB106 digerido com as mesmas enzimas e transformado numa cepa de Bacillus subtilis baixa em proteases e baixa em amilases (por exemplo a cepa SHA273 mencionada no Pedido de Patente WO 92/11357).

Outras variantes M202 são construídas de maneira idêntica.

Construção de variantes T183* + G184* e R181* + G182*: O método de mutagénese de extensão por sobreposição PCR é utilizado para construir estas variantes (Higuchi et al., 1988). Os oligonucleotideos mutagénicos são sintetizados utilizando uma mistura (partes iguais) de C e G numa posição; duas mutações diferentes podem portanto ser construídas por este procedimento.

Um fragmento de ADN de aproximadamente 300 bp de pTVB106 é amplificado numa reacção A com PCR utilizando o iniciador #7113 e o iniciador mutagénico #7449. Numa reacção B por PCR idêntica, 75 ura fragmento de ADN de aproximadamente 400 bp é amplificado utilizando os iniciadores Y296 e #3811. O fragmento de ADN completo que abrange o sitio da mutação (aminoácidos 181-184} desde o iniciador #7113 até ao iniciador Y296 é amplificado pela

PCR C utilizando estes iniciadores e fragmentos de ADN purificados a partir das reacções a e B.

O ADN da PCR C é digerido com as endonucleases de restrição BstEII e AflIII e o fragmento de 480 bp é ligado com o plasmideo pTVB106 digerido com as mesmas enzimas e transformado numa cepa de B. subtilis baixa em proteases e baixa em amilases (por exemplo a cepa SHA273 mencionada no Pedido de Patente WO 92/11357) . A sequenciação do ADN plasmideo destes transformantes identifica as duas mutações correctas: Isto é R181* + G182* e T183* + G184*.

Construção da variante R124P: O método de mutagénese de extensão de sobreposição com PCR é utilizado para construir esta variante de forma idêntica à construção da variante M202T (vide supra). A reacção A da PCR (com os iniciadores #3810 e Bl) gera um fragmento de aproximadamente 500 bp, e a reacção B da PCR (iniciadores 7450 e Y296) gera um fragmento de aproximadamente 550 bp. A reacção C da PCR baseada no produto das reacções A e B da PCR e os iniciadores Bl e Y296 é digerido com as endonucleases de restrição BstEII e AflIII, e o fragmento resultante de 480 bp que abrange a posição do aminoácido 124 é subclonado no pTVB106 digerido com as mesmas enzimas e transformado em B. Subtilis como o previamente descrito.

Construção da variante R124P + T183* + G184*: Para a construção da variante que combina as mutações R124P e T183* + G184*, dois sítios de restrição EcoNI (um localizado na posição 1.774 kb, istc é entre a mutação R124P e a mutação T183* + G184*, e um localizada na posição 0.146 kb) . O fragmento EcoNI de aproximadamente 1630 bp do plasmideo tipo pTVB106 que contém a mutação 1183* + G184* foi subclonado na parte do vector 76 (fragmento de ADN de aproximadamente 3810 bp que contém a origem de replicação) de outro plasmídeo tipo pTVB106 que contém a mutação R124P digerido com a mesma enzima. A transformação em Bacillus subtilis foi efectuada como o descrito previamente.

Construção das variantes G182* + G184*; RI81* + T183*: Y243F; K269R; e L351C + M430C:

Estas variantes foram construídas da maneira seguinte:

Foi preparado um vector da mutagénese específica que contém a maior parte da zona de codificação para a sequência de aminoácidos mostrada na SEC.ID N°. 1. As características importantes deste vector (que é denotado pPM103) incluem uma origem de replicação derivada do plasmídeo pUC, o gene cat que confere resistência para o cloranfenicol e uma versão com uma mutação por deslocação do quadro de leitura do gene bla, cuja versão tipo selvagem normalmente confere resistência à ampicilina (fenotipo ampR) . Esta versão mutada do gene bla resulta num fenotipo amps. O plasmídeo pPM103 está mostrado na figura 3, e a origem de replicação do E. coll, a versão 5'- truncada do gene de amilase SF16, e ori, bla, cat e os sítios de restrição seleccionados estão indicados no plasmídeo.

As mutações são introduzidas no gene de interesse como o descrito por Deng & Nickcloff [Anal. Biochem. 200 (1992), pp. 81-88], excepto que os plasmídeos com o "iniciador de selecção" (#6616) incorporado são seleccionados baseados no fenotipo ampR de células de E. coli transformadas que contêm um plasmídeo com um gene bla reparado em vez de utilizar a selecção por digestão das enzimas de restrição delineada por Deng & Nickoloff. Os produtos químicos e enzimas utilizadas para a mutagénese foram obtidos com o kit da mutagénese Chameleon™ de Stratagene (número de catálogo 2005Q9) . 77

Após a verificação da sequência de ADN nos plasmídeos da variante, o gene truncado que contém a alteração desejada é subclonado do plasmídeo semelhante ao pPM103 em pTVB106 como um fragmento BstBl-SalI de aproximadamente 1440 bp e transformado em Bacillus subtilis para a expressão da enzima da variante.

Para a construção da variante de eliminação dos pares G182* + G184*, foi utilizado o seguinte iniciador da mutagénese:

P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT TGT CCT GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG

Para a construção da variante de eliminação dos pares R181* + T183*, foi utilizado o seguinte iniciador da mutagénese:

P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT GCC TCC GAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG AAG

Para a construção da variante de substituição Y243F, foi utilizado o seguinte iniciador da mutagénese:

P ATG TGT AAG CCA ATC GCG AGT AAA GCT AAA TTT TAT ATG TTT CAC TGC ATC

Para a construção da variante de substituição K269R, foi utilizado o seguinte iniciador da mutagénese:

P GC ACC AAG GTC ATT TCG CCA GAA TTC AGC CAC TG

Para a construção da variante de substituição dos pares L351C + M430C, foram utilizados simultaneamenoe os seguintes iniciadores da mutagénese:

1} P TGT CAG AAC CAA CGC GTA TGC ACA TGG TTT AAA CCA TTG

2) P ACC ACC TGG ACC ATC GCT GCA GAT GGT GGC AAG GCC TGA ATT 78

Construção da variante L351C + M430C + T183* + G184*: Esta variante foi construída combinando a mutação de substituição dos pares L351C + M430C com a mutação de eliminação dos pares T183* + G184* mediante a subclonagem de um fragmento HindIIl-AflII de aproximadamente 1430 bp contendo L351C + M430C num plasmídeo semelhante a pTVBlOG (ccm as mutações T183* + G184*) digerido com as mesmas enzimas.

Construção da variante Y243F + T183* + G184*: Esta variante foi construída combinando a mutação Y243F e a mutação T183* + G184* mediante a subclonagem de um fragmento Drdl de aproximadamente 1148 bp contendo T183* + G184* num plasmídeo semelhante a pTVB106 (com a mutação Y243) digerida com a mesma enzima.

Os transformantes de Bacillus subtilis foram seleccionados pela sua actividade α-amilase em placas de agar com amido e a presença das mutações correctas foi controlada pela sequenciação do ADN.

Construção da variante Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C: A mutação de substituição dos pares L351C + M430C foi subclonada como um fragmento Xmal-Sall de aproximadamente 470 bp num vector semelhante a pTVB106 (contendo Y243F.+ T183* + G184*) digerido com as mesmas enzimas.

Construção de variante Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C + Q391E + K444Q: Um vector semelhante ao pPM103 contendo as mutações Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C foi construído mediante a substituição da versão truncada de SF16 em pPM103 com o fragmento BstBl-Sa/I de aproximadamente 1440 bp do vector semelhante a pTVBIQG que contém as cinco mutações em questão. As mutações Q391 e e K444Q foram introduzidas simultaneamente no vector semelhante ao pPM103 (contendo Y243F + T183* + G184* + L351C + M430C) mediante a utilização dos dois seguintes 7 9 iniciadores da mutagénese de forma idêntica à mutagénese descrita previamente era pPMl03:

P GGC AAA AGT TTG ACG TGC CTC GAG AAG AGG GTC TAT

P TTG TCC CGC TTT ATT CTG GCC AAC ATA CAT CCA TTT B: Construção das variantes da a-amiiase de origem com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2

Descrição do plasmídeo pTVB112: Foi construído um vector, denotado pTVB112, a ser utilizado para a expressão em B. subtilis da α-amilase com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 2. Este vector é muito similar ao pTVB106 excepto porque o gene que codifica a α-amilase madura da SEQ ID N°. 2 está inserido entre os sítios PstI e HindIII em pTVB106. Assim, a expressão desta α-amilase (SEQ ID N°. 2) está também dirigida pelo promotor amyL e a sequência de sinal. 0 plasmídeo pTVB112 é mostrado na figura 4.

Construção da variante D183* + G184*: A construção desta variante foi obtida utilizando o método de mutagénese de extensão por sobreposição da PCR como o referido anteriormente (vide supra). Os iniciadores #8573 e Bl foram utilizados na reacção A da PCR, e os iniciadores #8569 e #8570 foram utilizados na reacção B da PCR. Os fragmentos purificados da reacção A e da reacção B e os iniciadores 1B e #8570 foram utilizados na reacção C da PCR, resultando num fragmento de ADN de aproximadamente 1020 bp. Este fragmento foi digerido com as endonucleasas de restrição Pst 1 e Mlul, e subclonado no vector de expressão e transformado em B. subtilis.

Construção de outras variantes: Por analogia com a construção (vide supra) do plasmídeo pPMl03 utilizado na produção de mutantes da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1, um plasmídeo (denotado pTVB114: mostrado na figura 5) foi 80 construído para a mutagénese continuada na variante D183* + G184* (SEQ ID N°. 2). As mutações foram introduzidas em pTVB114 (SEQ ID N°. 2; D183*+G184*) de forma idêntica ao de pPM103 (SEQ ID N° . 1) .

Para a construção das variantes de eliminação dos pares R181* + D183* e R181* + G182*, foi escolhido alterar os aminoácidos flanqueantes na variante D183* + G184* em vez de eliminar os aminoácidos específicos no gene do tipo selvagem para a SEQ ID N°. 2. 0 seguinte iniciador da mutagénese foi utilizado para a mutagénese com pTVB114 como molde:

PCC CAA TCC CAA GCT ITA CCA (T/C)CG AAC TTG TAG ATA CG A presença de uma mistura de duas bases (T/C) numa posição permite a presença de dois aminoácidos flanqueantes de eliminação diferentes com base num iniciador da mutagénese. A sequenciação do ADN dos plasmídeos resultantes verifica a presença de uma ou da outra mutação. 0 gene mutado de interesse é subclonado como um fragmento PstI-DralII em pTVB112 digerido com as mesmas enzimas e transformado em B. subtilis.

Para a construção de G182* + G184* e R181* + G184*, foi utilizado o seguinte iniciador da mutagénese com pTVB114 como molde:

PCC CAA TCC CAA GCT TTA TCT C(C/G)G AAC TTG TAG ATA CG

Como anteríormente, a presença de uma mistura de duas bases (C/G) numa posição permite a presença de dois aminoácidos flanqueantes de eliminação diferentes com base num iniciador da mutagénese. A sequenciação do ADN dos plasmídeos resultantes verifica a presença de uma ou da outra mutação. G gene mutado de interesse é subclonado como um fragmento PstI-DralTI em pTVB112 digerido com as mesmas enzimas e transformado em B. subtilis. 81

Para a construção de D183* + G184* + M202L foi utilizado o seguinte iniciador da mutagénese:

PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAC AGT AAA TAA TC

Para a construção de Dl83* + G184* + M202I foi utilizado o seguinte iniciador da mutagénese:

PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAA ATT AAA TAA TC EXEMPLO 3

Determinação da estabilidade à oxidação das variantes de substituição M202 das a-amilases de origem que têm as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1 e na SEQ ID N°. 2

A: Estabilidade à oxidação das variantes da sequência na SEQ ID N°. 1

As medições foram feitas utilizando soluções das respectivas variantes em 50mM de tampão Britton-Robinson (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl2, pH ajustado ao valor de interesse com NaOH), pH 9.0, às quais foi adicionado o peróxido de hidrogénio (no tempo t = 0) para dar uma concentração final de 200mM H202. As soluções foram seguidamente incubadas a 40°C em banho-maria.

Após a incubação durante 5, 10, 15 e 20 minutos após a adição de peróxido de hidrogénio, a activídade da α-amilase residual foi medida utilizando o ensaio Phadebas acima descrito. A activídade residual nas amostras foi medida utilizando 50mM de tampão Britton-Robinson, pH 7.3, a 37°C (ver publicação analítica Novo AF207-1/1, disponível mediante solicitação a Novo Nordisk A/S). A descida na activídade foi medida em relação a uma solução de 82 referência correspondente da mesma enzima a 0 minutos a qual não foi incubada com peróxido de hidrogénio (100% actividade) . A percentagem da actividade inicial como uma função do tempo é mostrada e para as no quadro variantes abaixo para em questão. a enzima de origem i (SEQ ID N Variante % actividade após a 0 5 incubação 10 durante ( 15 minutos) 20 M202L 100 90 72 58 27 M202F 100 100 87 71 43 M202A 100 99 82 64 30 M202I 100 91 75 59 28 M202T 100 87 65 49 20 M202V 100 100 87 74 43 M202S 100 100 85 68 34 Origem 100 51 26 13 2

Todas as variantes de substituição M202 testadas exibem claramente estabilidade significativamente melhorada quanto à oxidação em relação à α-amilase de origem (SEQ ID N°. 1). B: Estabilidade à oxidação das variantes da sequência na 5EQ ID N°. 2

As medições foram realizadas de acordo com o acima descrito utilizando a α-amilase de origem em questão (SEQ ID N°. 2), a variante M202L + D183* + G184* (designada L no quadro à continuação) e a variante M202I + D183* + G184* (designado I no quadro à continuação), respectivamente. Neste caso, foram empregues os tempos de incubação (após a adição de peróxido de hidrogénio) de 5, 10, 15 e 30 minutos. Como no quadro anterior, a percentagem da actividade inicial como uma função de tempo é 83 mostrado no quadro abaixo para a enzima de origem e para as variantes em questão.

Variante % actividade 0 após a 5 incubação 10 durante 15 (minutos) 30 L 100 91 85 71 43 I 100 81 61 44 18 Origem 100 56 26 14 4

As duas variantes testadas "substituição + eliminação dos pares" (em que ambas compreendem uma substituição de M202) claramente exibem estabilidade significativamente melhorada quanto à oxidação em relação à α-amilase de origem (SEQ ID N°. 2). EXEMPLO 4

Determinação da estabilidade térmica das variantes das g-amilases de origem com as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1 e SEQ ID N°. 2 A: Estabilidade térmica das variantes de eliminação dos pares da sequência na SEQ ID N°, 1

As medições foram realizadas utilizando soluções das respectivas variantes em 50mM de tampão Britton-Robinson (vide supra), pH 9.0. As soluções foram incubadas a 65°C em banho-maria, e foram retiradas amostras após a incubação nos períodos de tempo indicados. A actividade da oc-amilase residual de cada mostra retirada foi medida utilizando o ensaio Phadebas, como o acima descrito. A descida na actividade foi medida em relação a uma solução de referência correspondente da mesma enzima a 0 minutos a qual não foi incubada (100% de actividade). 84 é D em A percentagem de actívidade inicial como uma função de tempo mostrada no quadro abaixo para a enzima de origem (SEQ ID N°. e para as seguintes variantes de eliminação dos pares questão:

Variante 1: R181* + G182* Variante 2: R181* + T183* Variante 3: G182* + G184* Variante 4: T183* + G184* Variante 5: T183* + G184* + R124P

Variante % actividade 0 5 após a 10 incubação 15 durante 30 (minutos) 45 60 1 100 81 66 49 24 14 8 2 100 80 53 39 17 8 3 3 100 64 40 28 10 4 2 4 100 64 43 34 20 8 5 5 100 78 73 66 57 47 38 Origem 100 13 2 0 0 0 0 É evidente que todas as variantes de eliminação dos pares testados exibem estabilidade térmica significativamente melhorada em relação à α-amilase de origem (SEQ ID N°. 1), e que a estabilidade térmica da variante 5, que além da mutação da eliminação dos pares da variante 4 compreende a substituição R124P, é marcadamente mais elevada do que as outras variantes. Assim que os resultados calorimétricos para a variante de substituição R124P (que compreende apenas a substituição R124P) revela uma estabilização térmica de aproximadamente 7°C da mesma em relação à α-amilase de origem, parece ser que os termoestabilizantes da mutação R124P e da eliminação de pares, respectivamente, reforçam-se entre si. 85 B: Estabilidade térmica das variantes de eliminação dos pares da sequência na SEQ ID N°. 2

As medições correspondentes foram realizadas para a enzima de origem (SEQ ID N°. 2) e para as seguintes variantes de eliminação dos pares:

Variante a: D183* + G184*

Variante B: R181* + G182*

Variante C: G182* + G184*

Variante % actividade 0 após 5 a incubação 10 durante 15 (minutos) 30 A 100 87 71 63 30 B 100 113 85 76 58 C 100 99 76 62 34 Origem 100 72 55 44 18

Novamente, é evidente que as variantes de eliminação dos pares em questão exibem estabilidade térmica significativamente melhorada em relação à a-amilase de origem (SEQ ID N0.). C: Estabilidade térmica de uma variante combinação múltipla da sequência na SEQ ID N°. 1

As medições correspondentes comparativas foram também feitas para as seguintes variantes da sequência de aminoácidos mostradas na SEQ ID N°. 1:

Variante 4: 1183* + G184*

Variante 6: L351C + M430C Variante 7: Y243F Variante 8: Q391 E + K444Q 86

Variante K444Q 9: T183* + G184* + L351C + I 443QC + Y243F + Q391E + Variante % actividade 0 após 5 a incubação 10 durante 15 (minutos) 30 4 100 66 41 22 1 ! 6 100 87 73 65 43 7 100 14 2 1 0 8 100 69 4 6 31 14 9 100 92 93 89 82 Novamente , resultado que o efeito termoestabílizante das mutações múltiplos, cada uma das quais tem um efeito termoestabílizante, é - pelo menos qualitativamente acumulativo. EXEMPLO 5

Afinidade de ligação ao cálcio das variantes da a-amilase de acordo com a invenção O desdobramento das amilases pela exposição ao calor ou a desnaturalizantes como o cloridrato de guanidina é acompanhada por uma redução na fluorescência. A perda de iões de cálcio conduz a um desdobramento, e a afinidade de uma série de a-amilases ao cálcio pode ser medida pelas medições da fluorescência antes e depois da incubação de cada α-amilase (por exemplo a uma concentração de 10 μα/ml; num tampão (por exemplo 50 mM HEPES, pH 7) com diferentes concentrações de cálcio (por exemplo na faixa de 1 μΜ-100 mH) ou de EGTA (por exemplo na faixa de 1 a 1000 μΜ) [EGTA = ácido l-di(2-aminoetoxi)etano-N,NrN,Wr-tetra-acético] por um período de tempo suficientemente longo (como por exemplo 22 horas a 55°C). A fluorescência F medida é composta de contribuições e formam as formas dobradas e desdobradas da enzima. A seguinte equação pode ser derivada para descrever a dependência de F na concentração do cálcio ( [Ca]): F = \Ca]/(Kji*+[Ca])(aN -fiN\og([Ca]) + \Ca\)(av -βυlog([Cu]) onde aN é a fluorescência da forma nativa (dobrada) da enzima, βΝέ a dependência linear de aN no logaritmo da concentração do cálcio (como foi experimentalmente observado), % é a fluorescência da forma desdobrada e βυ é a dependência linear de ahr no logaritmo da concentração de cálcio. Kdjss é a constante de ligação ao cálcio aparente para um processo de equilíbrio como segue:

Kdiss N - Ca <r>U + Ca (N = enzima nativa; U - enzima desdobrada)

De facto, o desdobramento prossegue extremamente devagar e é irreversível. 0 índice de desdobramento é dependente da concentração de cálcio, e a dependência para uma α-amilase dada provê uma medida da afinidade de ligação ao Ca da enzima. Definindo um conjunto Standard das condições da reacção (por exemplo 22 horas a 55°C), pode ser feita uma comparação significativa de Kdjss para diferentes α-amilases. As curvas de dissociação do cálcio para as α-amilases geralmente podem ser ajustadas à equação acima, permitindo a determinação dos valores correspondentes a Kdjm.

Os seguintes valores para Kdm foram obtidas para as α-amilases de origem com as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID Io. 1 e SEQ ID N°. 2, e para as variantes da α-amilase indicadas de acordo com a invenção (sendo a α-amilase de origem indicada entre parêntesis):

Variante K-dm (mol/L) í D183* + G184* (SEC ID N° . 2) 1.2 (±0.5) X Χ(Γ4 L351C + M430C + T183* + G184* (SEC ID N°. 1) 1.7 (±0.5) X 10~3 T183* + G184* (SEC ID N° • D 4.3 (±0.7) X 10“3 SEC ID N°. 2 (origem) 4.2 (±1.2) X 10~2 SEC ID N°. 1 (origem) 3.5 (±1.1) X 10_1 É evidente que a partir do anterior a afinidade da ligação ao cálcio das últimas enzimas α-amilolíticas diminui de forma decresceste através do quadro acima, isto é que a variante de eliminação dos pares D183* + G184* (SEQ ID N°. 2) se liga ao cálcio mais fortemente (isto é tem uma dependência do cálcio mínima) enquanto que a α-amilase de origem da SEQ ID N°. 1 se liga ao cálcio com menos força (isto é tem a mais elevada dependência ao cálcio). 89

REFERÊNCIAS CITADAS NA ESPECIFICAÇÃO

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<21Q> 1 <211> 485 <212> PRT <213> cepa de Bacillus NCIB12512 <400> 1 92

Hie Kl6 Asn. Oly Thr Asn Gly Thr Mefc M«fc Gin Tyr Phe Ol« Trp Tyr 1 5 10 15 teu Pro Aen. Aap Gly M& Hie Trp Aen Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 50

Aen Leu Lye Ser Lys Gly ile Thr Ala Vai Trp He Pro Pro Ala Trp 35 40 45

Lya Gly Thr Ser Gin Aan Asp Vai Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 50 Άβρ Leu Gly Glu Phe Aan Gin Lya Gly Thr Vai Arg Thr Lya Tyr Gly 65 ' -' · · 70 75- , 80

Thr Arg Aen Gin Leu Gin Ala Ala Vai Thr ser Leu Lya Aan Asm Gly 85 90 95

Ile Gin Vai Tyr Gly Aep Vai Vai Met Aen Hie Lya Gly Gly Ala Asp 100 105 110

Gly Thr Glu Ile Vai Aen Ala Vai Glu Vai Aan Arg Ser Aen Arg Asn 115 120 135 *!

Gin Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ale Trp Thr Lys Phe Αβρ 130 135 140

Phe Pro Gly Arg Gly Aen Aan Hie Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160

Hie Phe Aep Gly Thr Asp Trp Asp Gin Ser Arg Gin Leu Gin Asn Lye 165 170 175 93

Ile Tyr Lys She Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu vai Αβρ ISO 185 190 '· Vk * w»

Thr Glu Aan Gly Αβη Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Αβρ vai ASp Met Í95 200 205

Asp His Pro Glu Vai lie His Giu Leu Ara Asa Trp Gly Vai Trp Tyr 310 215 220

Thr Asa Thr Leu Aaa Leu Aap Gly Phe Arg Ile Asp Ala Vai Lya His 225 230 235 240 Π» Lya Tyr Ser Phe Thr Arg. Asp Trp Leu Thr His Vai Arg Aan Thr 245 250 255

Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala vai Ala Glu Phe Trp Lys Aan Aap Leu 260 265 270

Gly Ala Ile Glu Abr Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp As» His Ser Vai 275 280 285

Phe Asp vai Pro Leu Hia Tyr Aan Leu Tyr Asa Ala Ser Aan Ser Gly 290 295 300

Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Aan Ile Leu Asn Gly Ser vai Vai Glu Lya 305 310 315 320

Hia Pro Thr Hia Ala Vai Thr Phe Vai Asp Asn His Asp S«r Gin Pro 325 330 335

Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Vai Gin Gin Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 34$ 350

Tyr Ala Leu Vai Leu Thr Arg Glu Gin Gly Tyr Pro Ser Vai Phe Tyr 355 360 365

Gly Asp fyr Tyr Gly rle Pro Thr Hia Gly Vai Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380

Lys Ile Aap Pro Leu Leu Qla Ala Arg sln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr 36$ 390 395 400

Gin His Asp Tyr phe Aap His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 94 <210> <211> <212> <213> <4 0 0>

Gly Αβη Ser Ser Hís 420 Gly iro Gly Qly A»n 435 Gin Vai Trp Arg Asp 450 Ire Ass Ser Gly Leu Ala Thr Ile Het Ser Asp 425 430 Lys Trp Met Tyr Vai Gly Lys Asn Lys Ala Gly 440 445 Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Vai Thr Ile 455 450 Gly Asn Phe Ser vai Asn Gly Gly Ser Vai Sec 470 475 450

Aan Ala Asp Gly Trp 465

Vai Trp vai Lya Gin 485 ' " 2 485

PRT cepa de Bacillus NCIB 12513 2 95 Híb Híb Ain Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gin Tyr Phe Glu Trp His 15 10 15

Leu Pro Aia Asp Oly Aan Híb Trp Asn Arg Leu Arg hsp Abp Ala Ser 20 25 30

Aan Leu Arg ftah Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala ,Trp 35 40 45

Lye Gly Thr Ser Gin Asn Asp Vai Oly Tyr Gly Ala Tyr Aap Leu Tyr 50 55 60

Asp Leu Oly Glu Phe Asn Gin Lys Gly Thr Vai Arg Thr Lya Tyr Gly 65 70 75 80

Thr Arg ser.Gin Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Αβλ Asn Gly 85 90 95

Vai Gin Val Tyr Gly Asp Vai Vai Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110

Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala val Glu Val Asn Pro as» Asa Arg Asn lis 120 125

Gin Glu lie Ser Gly Aap TV* Thr Ile Gltt Ala Trp Thr Lys Phe Aep 96 130 135 140

Phe Pro Gly Arg Sly Açn Thr Tyr S*r Asp Phe Lys Trp Arg ΪΓΡ Tyr 145 150 155· 160

His Phe Asp Gly Vai Asp Trp Asp Gin Ser Arg Gin Phe Gin As π Arg 165 170 Π5

lie Tyr Lys Phe Arg Oly Asp Gly Lys Ale Trp Asp Trp Glu vel Asp 180 185 ISO

Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr teu Met Tyr Ala asp V«1 Asp Met 195 200 205

Asp His Pro Glu Vai Vai Asn Glu leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr 210 215 220

Thr Asn Thr Leu Aaft Leu A?p Gly Phe Arg Ile Asp Ala Vai liys His 225 230 235 240 11« Ly* Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His vai Arg Asn Ala 245 250 255

Thr Gly Lys Glu Met lhe Ala Vai Ala Glu Phe Trp Lye Asn Aep Leu 260 265 270

Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn Hiâ ser Vai . -275 ·-.·. · , .280 . - 285 . ...

Phe Asp Vai Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 3oo

Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Vai Vai Gin Lye 305 310 315 320

His Pro Met His Ala vai Thr Phe Vai Asp Αβη His A&p ser Gin Pro 325 330 335

Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Vai Gin Glu Trp Phe Lye Pr« Leu Ala 340 34$ 350

Tyr Ala Leu He Leu Thr Arg Glu θΐη sly Tyr Pro Ser vai Phe Tyr 355 360 365

Gly Asp Tyr Tyr Gly He Pro Thr His Ser Vai Pro Ala Mat Lys Ala 370‘ 375 360 97

Lyf Ile ASP Pr© Ile Leu □lu Ala Arg Gin Asn Phe Ala Tyr Gly Thr 385 3 30 ,, 395 4 00 Gin Hia Asp Tyr Phe ASp Hi» Kie Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg GlU 401 410 415 Gly A&n Thr Pr© ASn ôer Gly Leu Ala Thr ile Mec ser Aep 420 421 430 Gly Fr© siy Gly Glu Lye Trp Met Tyr Vai Gly Gin Asn Lye Ala Gly 435 440 445 Gin Vai Trp His Aap Ile Thr Gly Aen Lya pra Gly Thr Val Thr lie 450 455 460 Aen Ala Aep Gly Trp Ala Aan Phe Ser Vai Aen õiy Gly Ser Val ser 465 470 475 460

Ile Trp Vai Lys Arg 465

<210> 3 <211> 514 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 3 98 I ·<· - * ' · * ' · n J * Αία Ala Pro Phe Aen Gly Thr Met Met Qln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 15 10 15

Pro Asp A8p Gly Thx Leu Trp Thr Lys vai Ala Abc Glu Ala Asn Asn 20 25 30

Leu Ser ser Leu Gly Jle Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45

Gly Thr Ser Ara Ser Asp Vai Gly Tyr Gly Vai Tyr Aap Leu Tyr Aep 50 S» 50

Leu Gly Glu Phe Asn Gin Lye Gly Ala Vâl Arg Thr Lyi Tyr Gly Thr * * " «Γ » «f 65 70 75 60

Lys Ala Gin Tyr Leu Gin Ala He Gin Ala Ala Hia Ala Ala Gly Met 55 90 55 99 (31n Vai Tyr Ala Asp Vil Vai Phe Asp His Lya Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 no

Thr Glu Trp Vai Asp Ala Vai Glu Vai Asn Pro Ser A*p Arg Asn gin 115 120 125

Glu lie Ser Gly Thr Tyr Oln Ile Gin Ala Trp Thr Ly* Phe Asp Phe ISO 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lya Trp Arg Trp Tyr Ml* 145 150 155 100

Phe Asp Gly Vai Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lya Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175

Lys Phe Arg Gly ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Vai Asp Thr Glu 1Θ0 105 190

Asn Gly Asn Tyr Aap Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His 195 200 205

Pro Glu vai vai Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Vai Aan 310 215 220

Thr Thr Aan Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Vai Lys Bis Ile Lys 225 230 335 240

Phe Ser Pb« Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Vai Arg Ser Gin-Thr Gly.... 245 350 255

Lys Pro Leu Phe Thr Vai Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys 360 265 270

Leu His Asn Tyr Ile Met Lya Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp 275 280 385

Ala pro Leu Hie Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr 290 295 300

Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lye Asp Gin Pro 305 310 225 320

Thr Leu Ala vai Thr Phe Vai Asp Aan His Asp Thr Glu Pro Gly Gin 32S 330 335

Ale Leu Gin Ser Trp Vai Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 100 340 345 350

Phe lie Leu Thr Arg Gla du Gly Tyr Pro Cye Vai Phe Tyr 91y Asp 355 350 3*5

Tyr Tyr Gly Ile pro Gla Tyr Asa Ile Pro ser Leu Lye Ser ty* 3le 370 375 330

Aap Pro teu Leu Ile Ale Arg Arg Aflp Tyr Ala Tyr Qly Thr Gla His 385 390 395 400

Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp lie Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Vai «0S 410 415

Thr Glu Lye pro Gly Ser Gly Leu Ale Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430

Gly Gly Ser Lya Trp «et Tyr vai Gly Lys Gin His Ala Gly Lys Vai 435 440 445

Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Aen Arg Ser Asp Thr Vai Thr Ile Asn Ser 450 455 460

Aap Gly Trç Gly Glu Phe Lyo Vai Aen Gly Gly Ser Vai Ser Vai Trp 465 470 475 480

Vai Pro Arg Lya Thr Thr Vai Ber Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr . 485 · - 499‘ 495

Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Vai Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Vel 500 505 510

Ale Trp

<210>4 <211> 1455 <212> ADN <213> cepa de Bacillus NCIB 12512 <400> 4 101

cafccataatg gaacaaatgg fc&ctatgets caatatttcg aatggtattt gccaaafcgac· SO gggaatcatt ggaacaggtt gagggatgac gcagctaact taaagagtaa agggataaca 120 gctgtstgga tcccacctgc atggaagggg acttcccaga atgatgtagg ttatggagcc 130 tatgatttafc atgatcttgg agagtttaac cagaagggga eggttcgtac aaaatatgga 240 acacgfiaâcc agctacaggc tgçggtgaec tetttaaaaa ataacggsac tcaggtatat 300 ggtgatgtcg teatgaatca taaaggtgga gcagatggta cggaaattgt aaatgcggtâ 360 gaagtgaatc ggagcaaccg aaaccaggas. aectcaggsg agcatgcaat agaagegtgg 420, aeaaagtttg attttcctgg aagaggaaat aaccattcca gctttaagtg gcgctggtat 480 cattttgatg ggactgafctg ggaçcagtca cgecagcttc aa*acaaa&t «tataaattc 540 aggggaaeag geaaggectg ggaetgggaa gtcgstacag agaatggcaa ctatgactat soo ctfcatgtatg cagacgtgga tatggatcac ccagaagtaa tacatgasct tagaaactgg 660 ggagtgtggt atacgaatac actgaacctt gacggattfca gaatagatgc agtgaaacat 720 ataaaatat* getttacgag agittggcfct aeaoatgtgc gtaaeaecac aggtaaacea 780 atgcttgcag tggctgagtt ttggaaaaat gaeattggfcg c&attgaaaa ctatttgaat 640 aaaacaagtt ggaatcactc ggtgtttgat gttcctctcc actataattt gcaca&cgca 900 tetaatagcg gtggttatta tgatatgaga aatattttaa atggttctgt ggtgcaaaaa 960 catcoaacae atgccgttac ttttgttgat aaccatgafcfc ctcagcccgg ggaagcattg 1020 gaatcctttg ttcaacaatg gtttaaacc* cttgcatatg cattggttee gaeaagggaa 1080 caaggtt&te ettccgtatt ttatggggab tactacggta tcccaaccca tggtgttccg 1140 gctatgaaat ctaaaataga ccotcttctg caggcacgtc aaacttttgc ctatggtacg 1200 cagcatgatt açtttgatca tcatgatact atcggtígga caagagaggg aaatagctcc 1260 cateeaaatb caggeettge caeeattacg tcagatggtc eaggtggcaa caaatggatg 1320 tàsgtgggga aaa'ataa«ge·,gggacaagbt tggagagata ttâceggaaa.-taggaçaggo.·: 13-9,0... accgtcacaa ttaatgcaga eggaeggggt aatttctctg ttaatggagg gtccgtttcg 1440 gtttgggtga agcaa 1455

<210> 5 <211> 1455 <212> ADN <213> cepa de Bacillus NCIB 12513 <400> 5 102 cafccataatf ggacaaatgg gacgatgafcg caatactttg aaeggcactt gcctaatgafc €0 gggaateaoe gga&tagatt aagagatgat getagtaatc taagaaatag aggtscascc 120 getatttgga tícegcctgc ctggaasggg acetcgcaaa atgatgtggg gtatggagcc 1Θ0 tatgstcfctfc atgatttagg ggaattfcaat caaaagggga cggttcgtac taagratggg 340 acacgtagsç aattggagtc tgccatecafc gctttaaaga ataatggcgt teaagtctat 300 ggggatgtag tgatgaacca taaaggagga getgatgcta cagaaaacgt tcttgotgto 360 gaggfcgaacc caaatsaccg gaatcaagas atatctgggg actacacaat tgaggettgg 420 actaagottg attttceagg gaggggtaat acatacteag acttt&aatg gcgttggcat 480 cattccgatg'gtgtagattg ggaccaacca cgaoaattce aaaatcgtae· ccaeaaatte 540 cgaggfcgatg gtaaggcatg ggattgggaa gtagettcgg aaaacggaaa ttatgattat 600 ccaatgtatg cagatgfcage tatggafccat ccggaggtag taaatgagct tagaagatgg 660 ggagaatggt atacaaatac attaaatctt gatçgattta ggatcgatge ggtgaagcat 720 attaaatata gctttacacg tgattggttg acccatgtas gaaacgcaac gggaaaagaa 760 atgtctgctg ttgctgaatt ttggaaaaat gatttaggtg ccttggagaa ctacttaaat 810 aaaacaaact ggaatcattc tgtctttgat gtccccctte attataatct ttataacgcg 900 tcaa'atagtg gaggcaacta tgaeatggca aaacttctta atggaacggt tgttcaaaag - 960 catccaatgc atgccgtaac ttttgtggat aatcacgatt ctcaacctgg ggaafceatta 1020 gaatcatttg taeaagaaçg gtttaageca cttgctucg cgcttatttfc aacaagagaa ιοβο caaggctatc cotctgtcct ceatggtgac tactatggaa ttccaacaca tagtgteeea 1140 gcaatgaaag ccaagattga tccaatctta gaggcgcgtc aaaattttgc atatggaaca 1200 eaecatgatt atCttgacca tcstaataea atcggatgga cacgtgaaga aaataccacg 1260 catcecaatt caggacccgc gactatcatg tcggatgggc cagggggaga gaaatggatg 1320 tacgtagggc aaaataaagc aggtcaagtfc tggcatgaca taaccggaaa taaaccagga 13S0 aeagtfcacga scaatgcaga tggatgggct aattttteag taaatggagg aietgtttcc 1440 aVttgggfcgs aaeg* ·....... . , - ·.-» *··,. *. 1455 <210> 6 <211> 1548

<212> ADN <213> Bacillus stearothermophilus <4 00> 6 103 gccgcaccgt ttaacggcac catgatgcag tattttgaat ggtacttgcc ggatgatggc 60 acgttaCgga cesaagtggc caatgaagcc aac&acttBC ccagccttgg catcaccgct 130 ctttggqcgc cgcccgctta eaaaggaaca agccgcegcg acgcagggta cggagtatac 160 gaettgtatg acctcgçcga atteaatc&a aaagggaceg tccgc&e&aa atacggaaca 340 aaagctoaat stcttcaagc cattcaagcc gcceaegccg ctggaatgca agtgtacgce SOO gatgtcgtgt tcgaccacaa aggcggcgct gacggcacgg aatgggtgga cgccgtcgaa 360 gtcaatccgt ccgaccgcaa ccaagaaatc tcgggcacct atcaaatcca agcatggacg 420 aaatttgact ttcccgggcg gggcaacacc taofccoegct ttaagtggcg ctggtaccat 480 eetgacggcg ttgatCggga cga&agcega aaattgagcc gcatttacae attccgcggc 540 atcggcasag cgtgggattg ggaagtagac acggaaaacg gsaaetatgs ctacttaatg 500 tatgccgacc ctgatatgga tcatcccgaa gfccgegaccg agctgaaaaa ctgggggasa 660 tggtatgtca acacaaegaa cattgatggg ttccggcttg atgccgtcaa gcatattaag 730 ttcagtcttt ttcctgattg gttgtegtat gtgcgttctc agaetggcaa gccgctattt 760 aecgtegggg aatattggag ccatgacatc aacaagttgc acaattacat tacgaaaaca 640 gacgga&cga tgtetttgtt tgatgccceg ctacacaaca aattttatac cgcttccaae 900 tcagggggcg eatttgatat gcgcacgtta atgaccaafca cteteatgaa agatcaaccg 960 acettggocg tcaccttcgt cgataatcat gacaccgaae ccggccaagc gctgeagtca 1020 tgggtcgacc catggcccaa accgttggct ca.cgcettta ttctaactcg gcaggaagga 1060 tacccgtgcg tcttttatgg tgactattat ggcatcccac aatataacat tccttcgctg 1149 aaaagcíaaa cegatccgct cctcaccgeg cgcagggatt atgcttacgg aacgcaacat 1200 gattfctcttg ateactccga eatcateggg tggaeaaggg aagggggcac tgaaaaaeea 1260 ggatccggac çggccgcect gatc&eegat gggccgggag gaageaaatg gatgtaegtt 1320 gfeaaaeaac acgctggaaa agbgttctat gaccttaccg gcaaeeggag tgacaccgtc I3sc acsafceaaca gtgatggatg gggggaatts aaagccaatg gcggtteggt tteggtttgg 1440 gttcccagaa aaacgaecgt etetaeeatc getcggaega tcaeaaeccg acegtggact isoo ggtgaatteg tccgttggac egaaeeacgg ttggtggcat ggccttga 1548

<210> 7 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. #707 <400> 7 104

His Elis Asn Gly Thr Asn Qly Thr Het Het Gin iyr Phe Qlu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn ASp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser 20 35 30 Asa Leu Lye Sit Lys Cly Ile Thr Ale V al Trp Ile Pro Pro Ale Trp 35 40 46 Lye Cly Ale Ser Gin Asn Aep Vai Gly Tyr Qly Ala Tyr Aep Leu Tyr so 65 50 ASp Leu Qly 01 u pfce Asn Gin Lyo Gly Thr Vai Arg Thr Lye Tyr Gly 105 55 70 75 ao

Thr Arg ser Sln Leu Gin Ma Ala Vai Thr Ser Leu Lys* Aíft A*n Qly 85-' 90 '95

Ile sln Vai Tyr Gly Asp vai vai Met Asn Hi· Lye Gly Qly Ala Asp 10D 105 110

Ala Thr Qlu Htc Vai Arg Ala vai Glu Vai Asn ?ro Asn Asn Arg Asn 115 120 135

Gin Olu Vai Thr Gly Olu Tyr Thr Ile Olu Ala Trp Thr Arg Phe Asp 130 135 140

Phe Prc Gly Arg Gly Asn Thr Kis Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 ISO

Hie phe Aep Gly Vai Asp Trp Asp Gin Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg 155 170 175 ne Tyr Lye Phe Arg Qly Kis Gly Lye Ala Trp Asp Trp Qlu Va.1 Asp ISO 185 190

Thr Qlu Asn Qly A$n Tyr Aap Tyr Leu Met Tyr Ala A*p ile Asp Met 19S 200 205

Asp His Pro Qlu Vai vai Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly vai Trp Tyr 210 215 220

Thr Asn Thr Leu. Gly Leu Aap Gly Phe Arg He Asp Ala vai Lys His 225 230 235 240 ile Lys Tyr Sex Phe Thr Arg Asp Trp ile Aen Hie Vai Arg Ser Ala 245 250 255

Thr Qly Lys Asn Met Phe Ala Vai Ala Glu Ph# Trp Lye A*n Aap Leu 260 265 270

Gly Ala Ile Olu Asn Tyr Leu Gin Lys Thr Asn Trp Asn Kis ser Vai 275 280 285

Phe Asp Vai Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Qly 290 285 300

Qly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Qly Thr Vai Vai 31n Arg 305 3io 31S 320 106

Hie pro ser Hie Alã Val Thr Phe Vai AiP Asn Hie Asp Ser Gin Pro 325 130 335

Glu Gltt Ala Leu Glu Sar phe Vai Glu Glu Trp Phe Lye pro Leu Ala 340 345 350

Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gin Gly Tyr Pro Ser Vai Phe Tyr 355 360 355

Gly Asp Tyr Tyr Gly ile Pro Thr Hie Gly Vai Pro Ala Met Arg Ser 370 375 380 .Lya ile Asp Pro lie Leu Glu Ala Arg Gin Lye Tyr Ala Tyr Gly -Lya 385 390 395 400

Gin Aan Asp Tyr Leu Asp Hie Hia Aan Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415

Gly Asn Thr Ala His Pro Aan ser Gly Leu Ala Thr lie Met Ser Asp 430 425 430

Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Vai Qly Arg Aan Lye Ala Gly 435 440 445 oln val ττρ Ser Aep Ile Thr Gly Asm Arg Thr Gly Thr vai Thr Ile 450 455 460 A$n Ala Asp Gly Trp Gly Aan Phe Ser val Aan Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 460

Ile Trp Val Aan Lye 485

Lisboa, 24 de Maio de 2007. ente ciai

'^Agente OfJ â

ROSÃfUG CRUZ GARCIA Agente Otlliai da Propriedade Industrial Av.* Con$elbeWdiiB»efido de Sousa, 11-15.° 1070-072 LISBOA 107

Claims

reivindicações 1. Uma variante da α-amilase de origem, em que α-amilase de origem tem pelo menos 80% de identidade corri as sequências de aminoácídos SEQ ID N°. 3, caracterizada por a variante compreender a eliminação dos amínoácidcs equivalentes a R179 e G180 da sequência de aminoácídos mostrada na SEQ ID N°. 3, e por a dita variante ter actividade α-amilase e exibir pelo menos uma das seguintes propriedades em relação à dica α-amilase de origem: estabilidade térmica aumentada; estabilidade aumentada à oxidação; e dependência de Ca2+ reduzida.
2. Uma variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por menos um resíduo de aminoácido oxidável da dita α-amilase de origem ter sido eliminada ou ter sido substituída por um residuo de aminoácido diferente que é menos susceptível à oxidação que o dito resíduo de aminoácido oxidável.
3. Uma variante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o dito resíduo de aminoácido oxidável ser seleccionado do grupo formado por metionina, triptofano, cisteína e tirosina.
4. Uma variante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o resíduo de metionina ter sido substituído por treonina.
5. Uma construção de ADN caracterizada por compreender uma sequência de ADN que codifica uma variante da α-amilase de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 4.
6. Um vector de expressão recombínante caracterizado por transportar a construção de ADN de acordo com a reivindicação 5.
7. Uma célula hospedeira caracterizada por esta ser transformada com uma construção de ADN de acordo com a reivindicação 5 ou com um vector de acordo a reivindicação 6.
8. Uma célula de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por esta ser um microrganismo.
9. Uma célula de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por esta ser uma bactéria ou um fungo.
10. Uma célula de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por esta ser uma bactéria gram positiva como Bacillus subtilis, Bacillus lícheníformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautusr Bacillus thuringiensis ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus,, ou uma bactéria gram negativa como E.coli.
11. Um método para produzir uma variante da α-amilase de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por uma célula de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 7 a 10 ser cultivada em condições propicias para a produção da variante da «-amiiase, e por a variante da α-amilase ser posteriormente recuperada do cultivo.
12. Utilização de uma variante da α-amilase de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 4 caracterizada por esta ser utilizada para a lavagem da roupa e/ou para a lavagem da louça.
13. Um aditivo de detergente caracterizado por este compreender uma variante da α-amilase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, opcionalmente em forma de granulado não pulverulento, de um líquido estabilizado ou de uma enzima protegida. 2
14. Um aditivo de detergente de acordo com a reivindicação 13, caraeterizado por este compreender 0.02-200 mg de proteína enzimática per grama de aditivo.
15. Um aditivo de detergente de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caraeterizado por este adicionalmente compreender outra enzima como por exemplo uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.
16. Uma composição de detergente caracterizada por esta compreender uma variante da α-amilase de acordo com qualquer uma das reivindicações de la 4, e um agente tensioactivo.
17. Uma composição de detergente de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por esta adicionalmente compreender outra enzima como por exemplo uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.
18. Uma composição de detergente para lavar a louça à mão ou à máquina caracterizada por esta compreender uma variante da a-amilase de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 1 a 4, e um agente tensioactivo.
19. Uma composição de detergente para a lavagem da louça de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por esta adicionalmente compreender outra enzima como por exemplo uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.
20. Uma composição para a lavagem da roupa à mão ou à máquina caracterizada por esta compreender uma variante da α-amilase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, e um agente tensioactivo. 3
21. Uma composição para a lavagem da roupa de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por esta adicionalmente compreender outra enzima como por exemplo uma protease, uma lípase, uma percxidase, uma enzima amilolitica e/ou uma ceiulase.
22. A utilização de uma variante da α-airtilase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada por ser para a desengomagem têxtil. Lisboa, 24 de Maio de 2007. Pela Requerente rOJpgente Oficial ROSÁRIO CRUZ GARCIA Agente Oficial da?íopriedade Industrial Av.5 Conselheiro Fernando de Sousa, 1Π5,0 1070-072 LISBOA 4