JPS5910197B2 - ３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコール酸塩を高濃度で含む培地から微生物の代
謝産物として３α・７α−ジヒドロキシ−１２一ケトー
５β−コラン酸及び／又はその塩を高収量でかつ短期間
の培養で得る方法に関し、さらに詳しくは高濃度コール
酸塩を基質として３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケ
トー５β一コラン酸及び／又はその塩を生産するアルス
ロバクター属又はプレビバクテリウム属に属する細菌を
、コール酸塩を２０〜５ｏｏ？／ｌの濃度で含む栄養培
地に培養して上記のコラン酸及び／又はその塩を生成せ
しめ、これを採取することを特徴とする３α・７α−ジ
ヒドロキシ−１２−ケトー５β−コラン酸及び／又はそ
の塩の製造方法に関する。

従来、コール酸を基質として３α・７α−ジヒドロキシ
−１２−ケトー５β−コラン酸を微生物の代謝産物とし
て得る方法は種々知られている。

例えば、早川らによるストレプトマイセス・ゲラチカス
１１６４菌株を用いる方法〔ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（日本）、第４４巻第２号第１０９〜１１
３頁（１９５７年）及びグロシーデイングス・オブ・ジ
ャパン・アカデミー、第３２巻第５１９〜５２２頁（１
９５６年）〕；長谷川らによるアスペルギルス・シンナ
モメウスＨＵＴ２０２６菌株を用いる方法〔ヒロシマ・
ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンス、第８巻第
３号第２７７〜２８３頁（１９５９年）〕；及び菊池ら
によるスタフイ口コツカス・エビデルミデイスＨ−１菌
株を用いる方法〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー、第７２巻第１号第１６５〜１７２頁（１９７２年）
〕などである。

しかし、これらの方法ではいずれも基質としてのコール
酸の濃度が低く、１０ｆＩ／Ｊ以下の濃度のものが使用
されているにすぎない。

また、本発明者らの知見によれば、上記の方法で用いら
れる微生物はいずれも２ ０ ｔ／ｌ以上の高濃度のコ
ール酸塩を含む培地では生育不良となるか全く生育しな
いため、これらの微生物の代謝産物として３α・７α−
ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸及び／又は
その塩を得ようとする場合には必然的に低濃度のコール
酸塩を基質とせざるを得ない。

本発明者らは微生物の代謝産物として３α・７α−ジヒ
ドロキシ−１２−ケトー５β−コラン酸を工業的に有利
に得るためその基質として高濃度のコール酸塩を要求す
る微生物のスクリーニングを長期間行なってきた結果、
アルスロバクター属又はプレビバクテリウム属に属する
特定の細菌が高濃度コール酸塩を基質として３α・７α
−ジヒドロキシ−１２−ケトー５β−コラン酸及ヒ／又
はその塩を高収量でしかも短期間の菌養で代謝生産する
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明者らが得た高濃度コール酸塩を基質として３α・
７α−ジヒドロキシ−１２−ケトー５β−コラン酸及び
／又はその塩を生産する能力を有する細菌としては、ア
ルスロバクタ−ＣＡ−３５（ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ Ｃ Ａ − ３ ５ ）菌株（工業技術院微生物工
業技術研究所、菌寄第５１４５号）及びプレビバクテリ
ウムＣ Ａ −６ （ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｍ
ＣＡ−６）菌株（工業技術院微生物工業技術研究所、菌
寄第５１４４号）があり、それぞれの菌学的性質ヲアル
スロハクター・シンプレツクスＩＡＭ１６６０菌株の菌
学的性質と対比して列挙すると次表のとおりである。

上記の表に示した菌学的性質に基づき、アルスロバクタ
ーＣＡ−３５菌株及びプレビバクテリウムＣＡ−６菌株
の同定を行なった。

アルスロバクターＣＡ−３５菌株はその形態、ダラム染
色などの顕微鏡的所見及び生埋学的性質などからパージ
エイズ・マニュアル・オプ・デイターミネイティブ・バ
クテリオロジー第７版及び第８版に基づき、アルスロバ
クター・シンプレックスに近縁の菌であると同定された
。

なお、対照菌として挙げたアルスロバクター・シンプレ
ックスＩＡＭ１６６０菌株はコール酸塩の１ｏ？／ｌ濃
度の培地で生育しないので、本発明におけるアルスロバ
クターＣＡ−３５菌株はコール酸塩に対する態度におい
て明らかにアルスロバクター・シンプレックスＩＡＭ１
６６０菌株と異なる。

一方、プレビバクテリウムＣＡ−６菌株はそのダラム染
色などの顕微鏡的所見及び生理学的性質などからパージ
エイズ・マニュアル・オブ・デイターミネイティブ・バ
クテリオロジー第７版及び第８版に基づき、プレビバク
テリウム属に属する細菌と同定された。

しかしながら、ブどビバクテリウム属に属する細菌が周
鞭毛を有しているのに対し、本発明におけるプレビバク
テリウムＣＡ−６菌株は極単鞭毛を，有するなど、本発
明におけるプレビバクテリウムＣＡ−６菌株はプレビバ
クテリウム属に属する細菌とは若干異なる性質を有する
。

本発明の方法による３α・７α−ジヒドロキシ−１２一
ケトー５β−コラン酸及び／又はその塩の生産は、高濃
度コール酸塩を基質として３α・７α−ジヒドロキシ−
１２−ケトー５β−コラン酸及び／又はその塩を生産す
るアルスロバクター属又はプレビバクテリウム属に属す
る細菌を、コール酸塩を高濃度で含む培地に培養するこ
とにより行なわれる。

コール酸塩は具体的にはコール酸のナトリウム、カリウ
ムなどのアルカリ金属の塩又はカルシウム、マグネシウ
ムなどのアルカリ十類金属の塩であるが、好まし《はコ
ール酸のアルカリ金属塩である。

コール酸塩はそのまま所定濃度の水溶液に調整してそれ
を基質として用いてもよいし、或いは水に予めコ・−ル
酸と塩を形成し得る所定量のアルカリ金属化合物又はア
ルカリ十類金属化合物を溶かしたのち、その水溶液にコ
ール酸を加えて所定濃度に調整したコール酸塩を基質と
して用いてもよい。

コール酸塩の濃度は代謝生産される３α・７α−ジヒド
ロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸及び／又はその塩
の収量、培養条件及び操作性などの経済的観点から２０
〜５ ０ ０ ？／７３の範囲が好ましく、さらに５０
〜３００Ｐ／Ｊの範囲がより好ましい。

培養方法は原則的には一般微生物の培養で採用される方
法と同じであるが、通常は液体培地による振盪培養法又
は通気攪拌培養法が用いられる。

培地としては上記の高濃度コール酸塩を基質として３α
・７α一ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸及
び／又はその塩を生産する細菌が資化利用できる栄養源
を含有するものであればよい。

炭素源としてはコール酸塩を単一炭素源としてもよく、
或いはコール酸塩にアラビノースなどのペントース類；
グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース
などのヘキソース類；マルトースなどの二糖類；澱粉分
解物、糖アルコール類、グリセリンなどの多価アルコー
ル類；又はポリペプトン、ペプトン、肉エキス、麦芽エ
キス、コーンステイープリカー、酵母エキス、各種アミ
ノ酸などを併用してもよい。

また窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウムなどが用いられる。

また、この他に燐酸水素２カリウム、燐酸２水素カリウ
ム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が添加される。

培養条件に特徴はないが、通常２５〜３５℃で６時間〜
５日間振盪培養又は通気攪拌培養を行なう。

このようにして培養液中に蓄積された３α・７α−ジヒ
ドロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸及び／又はその
塩を分離・採用するには、まず培養液中の菌体その他の
不溶成分を濾過又は遠心分離などにより分離除去し、得
られた培養濾液又は上清に例えば塩酸を加える。

このようにして培養濾液又は上清を酸性とすることによ
り３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケトー５β−コラ
ン酸をはじめとするコール酸塩の変換物が沈澱する。

なお、この際、未変換のコール酸塩はコール酸として沈
澱する。

沈澱物を除去した液に例えば酢酸エチルを加えて残存す
る上記のコール酸塩の変換物並びに未変換のコール酸及
び／又はその塩を抽出し、しかるのち酢酸エチルを溜去
することによりほぼ完全に３α・７α−ジヒドロキシ−
１２−ケトー５β−コラン酸をはじめとするコール酸塩
の変換物を採取し、未変換のコール酸及び／又はその塩
を回収することができる。

このようにして得られたコール酸塩の変換物並びに未変
換のコール酸及び／又はその塩を例えばメチルエステル
に変換後、シリカゲル力ラムに吸着させ、クロロホルム
、クロロホルム／エタノールの９９／１容量比の混合液
及びクロロホルム／エタノールの９７／３容量比の混合
液により順次溶出させる。

すなわち、クロロホルムにより７α−ヒドロキシー３・
１２−ジケトー５β−コラン酸メチルエステルを溶出さ
せ、クロロホルム／エタノールの９９／１容量比の混合
液によりまず７α・１２α一ジヒドロキシー３−ケトー
５β−コラン酸メチルエステルを溶出させ、ついで目的
とする３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケ｝−５β−
コラン酸のメチルエステルを溶出させる。

さらに、クロロホルム／エタノールの９７／３容量比の
混合液によりコール酸メチルエステルを溶出させる。

得られた３α・７α−ジヒドロキシー１２−ケトー５β
−コラン酸メチルエステルは常法により加水分解するこ
とにより３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケトー５β
−コラン酸とすることができる。

本発明の方法により得られる３α・７α−ジヒドロキシ
−１２−ケトー５β−コラン酸はファン・ミンロン還元
反応に供することにより胆石溶解剤として有用なケノデ
オキシコール酸（ＣＤＣＡ）に容易に変換できる。

以下実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例 １ アルスロバクターＣＡ−３５菌株（工業技術院微生物工
業技術研究所、菌寄第５１４５号）を次に示す方法で培
養した。

コール酸１００ｖ、硝酸アンモニウム２．０ク、燐酸２
水素カリウム２．Ｏｆｆ、燐酸水素２カリウム５．０？
、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｆ、酵母エキス０
．１？及び水酸化ナトリウム１０グに蒸留水を加えて容
量を１ｌに調整し、これを培地とした。

この培地を５００ｍｌ容坂口フラスコに１００ｍｌ宛１
０本に分注し、１２０℃で１５分間、蒸気殺菌を行なっ
た。

予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機にて２日間増
殖させた種菌を上記の５００ｍｌ容坂口フラスコあたり
１０ｒｒＬｌ宛添加し、２日間振盪培養した。

培養後、これらの培養液を集め、遠心分離で菌体を除去
後、得られた培養上清に塩酸を添加して該上清を塩酸酸
性にするとコール酸塩の変換物及び未変換コール酸が沈
澱した。

この沈澱物を採取し、残りの溶液を酢酸エチル１ｌで抽
出し、ロータリー・エバポレーターで酢酸エチルを溜去
後、得られた残存物を先の沈澱物と合わせることにより
、８５グのコール酸塩変換物及び未変換コール酸の混合
物を得た。

この混合物の極く一部を取り、これにメタノールを加え
て１％溶液とし、この溶液１０μｌをミクロボンダパッ
クＣ−１８カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー
（米国ウォー〕ターズ社製、ＨＬＣ−ＧＰ（，−２４４
型）に注入した。

移動相としてｐＨ２．５に調整した水／メタノールの３
０／７０容量比の混合液を流速１１ｌｌ／分で流し、検
出を屈折率方式で行なったところ第１図のクロマトグラ
ムが得られた。

このクロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピー
クＣ及びピークＤは標準品のピークと照合することによ
り各々７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５βーコ
ラン酸、３α・７α−ジヒドロキシ−１２ −ケ｝−５
β−コラン酸、７α・１２α−ジヒドロキシ−３−ケト
ー５β−コラン酸及びコール酸のものと一致した。

また、これらのピークＡ、ピークＢ及びピークＣの各々
の部分に相当する化合物を分取し、マススペクトル、赤
外線吸収スペクトル及びＮＭＲスペクトルにより化合物
の構造確認を行なったところ、それぞれ上記の７α−ヒ
ドロキシ−３・１２−ジケトー５β−コラン酸、３α・
７α−ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸及び
７α・１２α−ジヒドロキシ−３−ケトー５β−コラン
酸であった。

なお、ピークＡ、ピークＢ及びピークＣの各々の部分に
相当する化合物の赤外線吸収スペクトル（Ａ，Ｂ及びＣ
）はメチルエステル化後の化合物についてのものであり
、それらを標準品の赤外線吸収スペクトル（ Ａ／、Ｂ
′及びＣＤと対比してそれぞれ第２図、第３図及び第４
図に表示する。

さらに、分取したクロマトグラムのピークＡ、ピークＢ
及びピークＣの部分に相当する化合物及びそれらのメチ
ルエステルの融点を測定すると次表に示すとおりであっ
た。

第１図のクロマトグラムの面積比から得られたコール酸
塩変換物の収量及び未変換コール酸の残存量を算出する
と次表に示すとおりである。

実施例 ２ アルスロバクターＣＡ−３５菌株（前述に同じ）を用い
、実施例１における培地にグルコース５．０１を添加す
る以外は実施例１と同じ方法により培養を行なったとこ
ろ、培養液からコール酸塩変換物及び未変換コール酸の
混合物を９１．Ｏｆ得た。

この混合物９１．ＯＳ’をメタノール２７０ｒｕｌに溶
解せしめ、これに濃塩酸９ｒＩＬｌを加えたのち２０分
間還流煮沸することにより、混合物中に含まれるコール
酸塩変換物及び未変換コール酸のメチルエステルを行な
った。

シリカゲルＣ−２００の１５００２をカラム（直径７０
ｍｉＸ１２００朋）に充填し、これに上記のメチルエス
テル化物を吸着させたのち、クロロホルムで溶出すると
７α−ヒドロキシー３・１２−ジケトー５β−コラン酸
メチルエスミ；テルカ得ラれた。

ついで、クロロホルム／エタノール９９／１容量比の混
合液で溶出するとまず７α・１２α−ジヒドロキシ−３
−ケトー５β−コラン酸メチルエステルが得られ、つい
で３α・７α−ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−コラ
ン酸メチルエステルが得られた。

各々の化合物の収量は７α−ヒドロキシ−３・１２−ジ
ケトー５β−コラン酸メチルエステルが２５．１ｚ１７
α・１２α−ジヒドロキシ−３一ケトー５β−コラン酸
メチルエステルが１．４０ｆ、３α・７α−ジヒドロキ
シ−１２−ケトー５β−コラン酸メチルエステルが５６
．４ｆであった。

これらを各々加水分解することによりそれぞれ７α−ヒ
ドロキシ−３・１２−ジケトー５β−コラン酸を２４．
８グ、７α・１２α−ジヒドロキシ−３−ケトー５β−
コラン酸を１．３８Ｐ、３α・７α−ジヒドロキシ−１
２一ケトー５β−コラン酸を５６．Ｏｆ得た。

実施例 ３ アルスロバクターＣＡ−３５菌株（前述に同じ）を用い
、実施例１におけるコール酸の濃度を変化させ、かつ水
酸化ナトリウムを使用するコール酸の１／１０重量加え
る以外は実施例１と同様の方法により培養を行ない、各
々の基質濃度におげる３α・７α−ジヒドロキシ−１２
一ケトー５β−コラン酸、７α−ヒドロキシ−３・１２
−ジケトー５β−コラン酸及び７α・１２α−ジヒドロ
キシ−３−ケトー５β−コラン酸の収量並びに未変換コ
ール酸の残存量を求めて次表に示した。

実施例 ４ プレビバクテリウムＣＡ−６菌株（工業技術院微生物工
業技術研究所、菌寄第５１４４号）を用いる以外は実施
例１と同じ方法で培養し、同様の処理によって得られた
コール酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物を実施例
１と同様にして高速液体クロマトグラフイーにかけたと
ころ、第５図に示すクロマトグラムが得られた。

このクロマトグラムにおけるピークＥ、ピークＡ、ピー
クＢ及びピークＤの各々の部分（相当する化合物を分取
し、マススペクトル、赤外線吸収スペクトル及びＮＭＲ
スペクトルにより化合物の構造確認を行ない、それぞれ
７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー△４−コレン酸
、７α−ヒドロキシ−３ ・１２−ジケトー５β−コラ
ン酸、３α・７α−ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−
コラン酸及びコール酸と同定した。

なお、ピークＸ及びピークＹの各々の部分に相当する化
合物は未同定物質である。

第５図のクロマトグラムにおいて、ピークＸ及びピーク
Ｙを除いた残りのピークの面積比はＥ：Ａ：Ｂ：Ｄ：＝
１２．２：２２．２：４４、９：２０．７であった。

実施例 ５ 実施例２において培養時間を２４時間にした以外は実施
例２と同様の方法により培養を行なったところ、培養液
からコール酸塩変換物及び未変換コール酸塩の混合物が
９８．Ｏｆ得られた。

この混合物を実施例１と同様にして高速液体クロマトグ
ラフイーによりその組成及び組成比を求めた結果を次に
示す。

参考例 １ ３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケトー５βーコラン
酸１０１を三ツ口丸底フラスコに入れ、ついでエチレン
グリコール１００ｍｌ及び水酸化カリウム水溶液（水酸
化カリウム１０グ＋水２０ｍｌ）を注入した。

ついで８５％ヒドラジンハイドレート１０１ｆＬｌを添
加し、得られた混合液を１００℃で２時間還流した。

温度を次第に上げ、１８５〜１９０℃の温度で４時間還
流することによりヒドラジンハイドレートを溜去した。

得られた反応混合液を冷却後、過剰の水を加えて希釈し
、攪拌しながらｐＨを３に調整すると沈澱が生じた。

これを濾過し、得られた沈澱物を水洗し、風乾すること
により３α・７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸（Ｃ
ＤＣＡ）を８．５２得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたコール酸塩変換物及び未変
換コール酸の液体クロマトグラムを表わし、第２〜４図
はそれぞれ第１図のクロマトグラムのピークＡ、ピーク
ーＢ及びピークＣの各々の部部に相当する化合物をメチ
ルエステル化したものの赤外線吸収スペクトル（Ａ，Ｂ
及びＣ）を標準品の赤外線吸収スペクトル（Ａ′、Ｂ′
及びσ）と対比して表示したものである。 第５図は実施例４で得られたコール酸塩変換物及び未変
換コール酸の液体クロマトグラムを表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 高濃度コール酸塩を基質として３α・７α一ジヒド
   ロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸及び／又はその塩
   を生産するアルスロバクター属又はプレビバクテリウム
   属に属する細菌を、コール酸塩を２０〜５ｏｏ？／ｌの
   濃度で含む栄養培地に培養して上記のコラン酸及び／又
   はその塩を生成せしめ、これを採取することを特徴とす
   る３α・７α−ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−コラ
   ン酸及び／又はその塩の製造方法。