Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych aminowych glicerolu lub propanodioli, majacych wlasciwosci antywirusowe.Zakazenia wirusowe u ssaków, w tym równiez u ludzi, sa schorzeniami zakaznymi sprawiajacy¬ mi wiele cierpien i strat ekonomicznych. Nieste¬ ty, odkrywanie zwiazków antywirusowych jest znacznie.bardziej skomplikowane i trudniejsze niz odkrywanie srodków bakteriobójczych i grzybobój¬ czych. Powodem tego jest czesciowo fakt, ze istnie¬ je scisle podobienstwo strukturalne wirusów i pewnych zasadniczych skladników komórki, takich iak kwasy rybonukleinowe i dezoksyrybonuklei¬ nowe. Nie mniej jednak w literaturze opisano licz¬ ne nieWirusowe „srodki antywirusowe", to jest sub¬ stancje, które moga wywierac dzialanie zabezpie¬ czajace lub lecznicze, z wyrazna korzyscia dla osob¬ nika zakazonego, albo tez zwiekszajace wytwarza¬ nie przeciwciala, poprawiajace jego aktywnosc po¬ lepszajace niespecyficzna odpornosc, przyspiesza¬ jace powrót do zdrowia lub tlumiace objawy /Her- rman i wspólpracownicy, Proc. Soc. Expll, Biol.Med., 103* 625 /1960//. Znane sa np. takie srodki antywirusowe jak interferon oraz produkty syn¬ tetyczne, takie jak chlorowodorek amantadyny, pi¬ rymidyny, dwuguanidy, guanidyna, pterydyny i metisazon. Znane srodki antywirusowe maja dosc waski zakres dzialania w przypadku zakazen wi¬ rusowych, przeto pozadane sa nowe srodki, któ¬ re moglyby skutecznie pomagac w lecznictwie. u 15 20 W przypadku zakazenia wirusem komórki ssa¬ ków wytwarzaja substancje, która iin^gjjtwia ko¬ mórkom opieranie sie- rozmnazaniu róznych wi¬ rusów. Substancje opierajace sie wirusom i za¬ klócajace ich dzialanie znane sa pod nazwa „in¬ terferonów". Interferony sa glikoproteinami, które moga róznic sie wlasciwosciami fizykochemiczny¬ mi, ale wszystkie maja jednakowe wlasciwosci bio¬ logiczne, a mianowicie dzialaja hamujaco na licz¬ ne nie spokrewnione wirusy, nie sa toksyczne dla komórek ani nie wywieraja na nie innego szkcdli- wego wplywu i sa gatunkowo specyficzne /Lockart, Frontiers of Biology, tom 2, „Interferons", wyd, Finter, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 196% str. 19—20/.Dotychczas nie opracowano zadnej ekonomicznej metody wytwarzania poza organizmami interfero¬ nu nadajacego sie do klinicznego stosowania prze¬ ciwko zakazeniom wirusowym. Stosowano przeto metode posrednia, a mianowicie polegajaca na po¬ dawaniu zwierzeciu, które ma byc chronione przed zakazeniem lub juz zakazonemu wirusem, niewiru- sowej substancji, która pobudza lub nasila wytwa¬ rzanie interferonu w komórkach. Wytworzony w ten sposób interferon okresla sie *jafcb „pndoge- niczny".Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 2 738 351 znane sa zwiazki o ogólnym wzo¬ rze 6, w którym Rj i R2 oznaczaja rodniki alkilo¬ we, aralkilowe, arylowe, cykloalkilowe lub rodni- 116 119116 119 3 ki arylowe podstawione grupa nitrowa, alkilowa lub alkoksylowa albo atomami chlorowca, X, Y i Z oznaczaja atomy tlenu lub siarki albo grupy sulfonylowe, ALK oznacza prosty lub rozgalezio¬ ny rodnik alkilenowy o! 1—6 atomach wegla i B b oznacza nizsza grupe Hdwualkiloaminowa, grupe piperydynowa, morfolinb^ya, pirolidynowa, nizsza grupe alkilopirolidynowa, grupe N'-alkilopiperazy- nowa albo pipekolinowa, majace wlasciwosci miej¬ scowo znieczulajace. W omówieniu ewentualnych 10 dróg syntezy (patrz kol. 1, 11, 57—70 powolanego opisu patentowego) ujawniono produkty posrednie o wyzej podanym wzorze, w którym B oznacza grupe aminowa albo nizsza grupe alkiloaminowa.Jednakze zaden ze zwiazków wymienionych szcze- 15 gólowo w tym opisie nie zawiera rodników alki¬ lowych R2 albo R2 wyzszych niz rodnik n-penty- lowy. Poza tym, w zadnym z tych zwiazków oba podstawniki Ri i R2 nie oznaczaja rodników alki¬ lowych, gdy oba symbole X i Y oznaczaja atomy 20 tlenu. Znane sa, owadobójcze i roztoczobójcze zwiazki o wzorze 7, w którym Rx i R2 oznaczaja miedzy innymi nizsze grupy alkilotio, q oznacza liczbe 0—5 i A oznacza miedzy innymi grupe 1-pi¬ perydynowa albo nizsza grupe dwualkiloaminowa. 20 Nieoczekiwanie stwierdzono, ze pewne nowe po¬ chodne aminowe dwu-0-/ri-alkilo- i n-alkenylo-/- -glicerolu albo propanodioli, w których rodniki al¬ kilowe i alkenylowe sa wyzszymi^ rodnikami, ma¬ ja zdolnosc zwalczania wirusowych, zakazen u ssa- J§ ków. Te nowe zwiazki wytwarzane sposobem we¬ dlug wynalazku maja ogólny wzór 1, w którym jeden z podstawników Q* lub Q2 oznacza grupe o wzorze -O-Y-NHR3, a drugi oznacza grupe o wzo¬ rze -ORx, Rx i R2 oznaczaja rodniki n-alkilowe o 35 12—20 atomach wegla lub rodniki n-alkenylowe nie majace podwójnego wiazania w pozycji 1 i zawie¬ rajace 12—20 atomów wegla, Y oznacza rodnik alkilenowy o 2—4 atomach wegla, majacy wolne wartosciowosci przy róznych atomach wegla, grupe ^ o-, m- lub p-fenylenodwumetylenowa, grupe o wzorze 2, w którym q oznacza liczbe calkowita 1—3 i wolna wartosciowosc po lewej stronie wzo¬ ru jest zwiazana z atomem tlenu, R3 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 2—4 atomach we- |5 gla.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania zwiaz¬ ków o wzorze 1 polega na tym, ze zwiazek o wzo¬ rze 3, w którym jeden z podstawników Q5 lub Q6 oznacza grupe o wzorze -OR^ a drugi oznacza ^ grupe o wzorze -OY'-CHO, R2 i R2 maja wyzej podane znaczenie i Y' oznacza rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla lub grupe o wzorze 4, zwia¬ zana z lewej strony z atomem tlenu, albo grupe o wzorze 5, w którym q oznacza liczbe calkowita R 1—3, zwiazana z lewej strony z atomem tlenu, pod¬ daje sie w srodowisku redukujacym reakcji ze zwiazkiem o wzorze NH2R8, w którym R8 ma wy¬ zej podane znaczenie.Sposób wedlug wynalazku obejmuje równiez ^ wytwarzanie farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne zwiazków o wzorze 1 z kwasami. Zwiaz¬ ki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sta¬ nowia czynne substancje w preparatach leczni¬ czych, zawierajacych równiez farmakologicznie & 4 dopuszczalny nosnik. Preparaty te podawane ssa¬ kom dzialaja profilaktycznie antywirusowo i wy¬ woluja wytwarzanie interferonu w organizmie ssaka. Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku przejawiaja dzialanie antywirusowe w stosunku do bardzo licznych wirusów in vivo u ssaków i in vitro w kulturach tkanek ssaków. Co najmniej czesciowo aktywnosc ta jest wynikiem wytwarzania interferonu w komórkach, powodo¬ wanego przez te zwiazki, a wiec interferonu endo- genicznego.Jako farmakologicznie dopuszczalne sole addy¬ cyjne z kwasami stosuje sie sole nietoksyczne w podawanych dawkach. Moga to byc sole rozpu¬ szczalne lub nierozpuszczalne w wodzie, np. sole kwasów takich jak kwas solny, bromowodorowy, fosforowy, azotowy, siarkowy, octowy, szesciófluo- rofosforowy, cytrynowy, glikonowy, benzoesowy, propionowy, maslowy, sulfosalicylowy, maleinowy, laurynowy, maleinowy, fumarowy, bursztynowy, szczawiowy, winowy, emsonowy, to jest 4,4'-dwu- aminostylbeno-2,2'-dwusulfonowy, pamoesowy, to jest l,l'-metyleno-dwu-2-hydroksy-3-naftoesowy, stearynowy, 3Thydroksy-2-naftoesowy, p-toluenosul- fonowy, metanosulfonowy, mlekowy i suraminowy.Korzystne wlasciwosci maja addycyjne sole zwiazków o wzorze 1 z kwasem solnym. Grupe zwiazków o korzystnych wlasciwosciach stanowia te, w których Rj i R2 oznaczaja rodniki n-alkilo¬ we. o 14—18 atomach wegla, zwlaszcza gdy rod¬ niki te sa jednakowe. Korzystne wlasciwosci ma¬ ja zwlaszcza zwiazki o wzorze 1 w których oba podstawniki Rx i R2 oznaczaja rodniki n-heksade- cylowe. Dobre wlasciwosci maja zwiazki o wzo¬ rze 1, w którym R8 oznacza atom wodoru, a Y oznacza prosty rodnik alkilenowy o 2—4 atomach wegla albo rodnik o-, m- lub p-fenylenodwume- tylenowy.Szczególnie cenne wlasciwosci maja nastepujace zwiazki i ich farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami: l,3-dwu-O-/n-heksadecylo/-2-0-/3-aminopropylo/- -glicerol, l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-3-0-/3-amino- propylo/-glicerol, l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/m- -aminometylobenzylo/-glicerol, ly2-dwu-0-/n-heksa- decylo/-3-0-/m-aminometylobenzylo/-glicerol, 1,2- -dwu-0-/n-tetradecylo/-3-0-/m-aminometylobenzylo/- -glicerol, 1,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/m-amino- metylbfenylo/-glicerol, 1,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2- -0-/p-aminometylofenylo/-glicerol, l,2-dwu-0-/n-he- ksadecylo/-3-0-/p-aminometylofenylo/-glicerol.Zwiazki o wzorze 1 wytwarza sie z odpowiednich l,2-dwu-0-/n-alkilo-, albo n-alkenylo/-gliceroli albo l,3-dwu-0-/n-alkilo- albo n-alkenylo/-gliceroli, w których rodniki alkilowe albo alkenylowe sa rod¬ nikami wyzszymi. Stosuje sie w tym celu metody analogiczne do znanych, np. zwiazki o wzorze 1, w którym R3 ma znaczenie podane na wstepie, lecz za wyjatkiem atomu wodoru i Y oznacza rod¬ nik 2-etylenowy, wytwarza sie utleniajac allilowa pochodna wyjsciowego dwu-0-/n-alkilo- lub n-al- kenylo-/glicerolu, zawierajacego wyzszy rodnik al¬ kilowy lub alkenylowy, przez kolejne traktowanie w obecnosci wody czterotlenkiem osmu (lub nad¬ manganianem potasu) i nadjodanem sodowym, po116 119 5 6 czym otrzymana pochodna formylometylowa pod¬ daje sie reakcji z amina o wzorze R3NH2 w kwas¬ nym srodowisku i nastepnie uwodornia sie otrzy¬ mana pochodna N-alkilidenowa lub N-hydroksy- alkilidenowa.Sole addycyjne zasad o wzorze 1 z kwasami wy¬ twarza sie zwyklymi sposobami, np. mieszajac zwiazek aminowy w odpowiednim rozpuszczalni¬ ku z wlasciwym kwasem, po czym sól wyosobnia sie przez odparowanie lub wytracenie za pomoca rozpuszczalnika, w którym sól ta nie rozpuszcza sie. Sole w postaci chlorowodorków mo|na latwo wytwarzac przepuszczajac chlorowodór przez roz¬ twór zwiazku aminowego w organicznym rozpu¬ szczalniku. Jak podano w przykladach, liczne chlo¬ rowodorki i dwuchlorowodorki zwiazków o wzorze 1 zawieraja duze ilosci wody, przy czym nie stwier¬ dzono, czy woda ta jest tylko przypadkowo wchlo¬ nieta podczas krystalizacji, czy tez stanowi wlas¬ ciwa wode krystalizacyjna w wodzianach, czy tez jest wynikiem innego zjawiska. Nie mniej jednak ta woda nie przeszkadza przy wytwarzaniu pre¬ paratów z omawianych zwiazków i nie trzeba jej usuwac.Pochodne l,2-dwu-0-/n-alkilo/-glicerolu z , wyz¬ szym rodnikiem alkilowym, stosowane jako pro¬ dukty wyjsciowe, mozna wytwarzac metoda M.Kates i wspólpracowników, Biochemistry, 2, 394 /1963/. Pochodne l,3-dwu-0-/n-alkilo/-glicerolu z wyzszym rodnikiem alkilowym, wytwarza sie me¬ toda R. Domenico i wspólpracowników, J. Lipid Res., 8, 63 /1967/. Produkty wyjsciowe w postaci wyzszych pochodnych 1,2- i l,3-dwu-0-/n-alkenylo/- -glicerolu mozna wytwarzac metoda W. J. Bauman i H. K. Mangold, J. Org. Chem. 31, 498 /1966/.Antywirusowe dzialanie zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku oznacza sie dwiema odrebnymi metodami. W pierwszej z nich badany zwiazek podaje sie dootrzewnowo myszy, na 24 godziny przed podaniem jej smiertelnej dawki wi¬ rusa EMC powodujacego zapalenie mózgu i mies¬ nia sercowego. Po uplywie 10 dni liczbe zwie¬ rzat, które przezyly porównuje sie z odpowiednia liczba myszy tak samo zakazonych, ale którym nie podano badanego zwiazku. Badany zwiazek po¬ daje sie myszy na 18—24 godzin przed zakazeniem jej wirusa i w sposób inny niz wstrzykiwanie wi¬ rusa, w celu unikniecia miejscowego dzialania tego zwiazku na wirusa i w celu ustalenia, które z ba¬ danych zwiazków wywoluja reakcje antywirusowa organizmu.Wedlug drugiej metody jednowarstwowe komór¬ ki ludzkiego polipa nosowego wyhodowano na mi- kroplytkach _ do miareczkowania traktuje sie ba¬ danym zwiazkiem na okolo 18 godzin przed po¬ traktowaniem smiertelna dawka wirusa pecherzy¬ kowatego zapalenia jamy ustnej VSV. Badany zwiazek zmywa sie z warstwy przed potraktowa¬ niem wirusem. Ciecz hodowlana ekstrahuje sie z plytek po uplywie okresu hodowlanego i miarecz¬ kuje ilosc zarazliwego wirusa L-929 fibroblastów u myszy obecnego w plytkach. Wyniki te porów¬ nuje sie z odpowiednimi danymi uzyskanymi w próbie prowadzacej z komórkami polipa nie po¬ danymi dzialaniu badanego zwiazku.Poza tym, wiele zwiazków wytworzonych sposo¬ bem wedlug wynalazku badano ustalajac ich zdol¬ nosc wzmagania znanej dzialalnosci antywirusowej kwasu poliinozynowego i ,policytydylowego. Nie¬ które wreszcie zwiazki badano w celu oznaczenia ich zdolnosci do wywolywania obiegu interferonu u myszy. W tym celu podawano badane zwiazki myszom pozajelitowo i stosowano metode W. W. / Hoffmana i wspólpracowników, Antimicrobiol Agents and Chemotherapy, 3, str. 498—301 /I973E Przeprowadzono nastepujace badania; W celu oznaczenia aktywnosci chlorowodorku l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/3-aminopropylo/-gli- cerolu in vivo przeciwko wirusowi EMC sporza¬ dzono preparat w postaci emulsji, stapiajac i mie¬ szajac rózne czesci wagowe podanego wyzej zwiaz¬ ku, polisorbinianu 80 i gliceryny i nastepnie dys¬ pergujac mieszanine w goracej wodzie przy sil¬ nym mieszaniu; Stezenie substancji czynnej w pre¬ paracie doprowadzono nastepnie do wartosci kon¬ cowych dodajac 0,14 m roztwór chlorku sodowe¬ go i 0,01 m roztwór fosforanu sodowego o war¬ tosci pH 7. Dalsze rozcienczanie prowadzono przez dodawanie takich samych roztworów. Trzem gru¬ pom po 10 samic myszy bielaka o wadze ciala 20^25 g podawano przez wstrzykiwanie sródo- trzewnowo dawki zwiazku podanego w tytule w ilosci 1,5, 5 i 15 mg na 1 kg masy ciala. Czwartej grupie 10 myszy substancji tej nie podawano. Na¬ stepnie, po uplywie 18—24 godzin wszystkim my¬ szom z 4 grup wstrzyknieto podskórnie po 0,2 ml preparatu wirusa EMC, to jest wirusa powoduja¬ cego zapalenie mózgu i miesnia sercowego. Dawki te odpowiadaly 20 dawkom LD50, to jest takim, które u nie chronionych,myszy powoduja smier¬ telnosc 50% w ciagu 10 dni. W ciagu nastepnych 10 dni po zabiegu liczono myszy zywe i ustalano srednia wartosc /Sr/, to jest srednia liczbe my¬ szy z 7 prób pozostalych przy zyciu. Wyniki pró¬ by byly nastepujace Dawka badanego zwiazku # mg/kg 15 5 1 1,5 .Sr /srednia z 7 prób/ Liczba myszy pozostalych przy zyciu 61 45 24 Aktywnosc antywirusowa wyrazona jako stosunek liczby myszy, które przezyly w trzech grupach pod¬ dawanych dzialaniu badanego zwiazku do odpo¬ wiedniej liczby w próbie kontrolnej w 10 dniu próby, to jest wartosc Sr obliczono z wzoru 8, po¬ danego na rysunku. We wzorze tym Sr oznacza wzgledna liczbe myszy przy zyciu. Sr oznacza pro¬ cent myszy z 3 grup, które zyly po 10 dniach, Xi oznacza liczbe myszy zywych w dniu „i" w 3 grupach, przy czym i oznacza liczbe 1—10, zas ej oznacza licbe myszy zywych w dniu „i" w gru¬ pie kontrolnej.Okreslanie zmniejszania wydajnosci wirusa na komórkach ludzkiego polipa in vitro pod . wply¬ wem chlorowodorku l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0- lt 15 20 25 50 35 40 45 50 55 607 " . -/3-aminopropyIoglicerolu przeprowadzono nastepu¬ jaco: Pozywke przygotowano uzupelniajac 100 ml mi¬ nimalnej pozywki zasadniczej Eagle'a przez doda¬ nie 2 m stokrotnie stezonego roztworu antybio- tycznego — przeciwgrzybiczego, 1 ml roztworu glu¬ taminy o stezeniu 0,2 m, 1 inl stokrotnie stezo¬ nego roztworu niepodstawowych aminokwasów, 1 ml roztworu pirogronianu sodowego o stezeniu 0,1 m i 10% dezaktywowanej przez ogrzewanie plo¬ dowej surowicy cielecej. W kazdym gniazdku ply¬ tek do mikromiareczkowania o 96 gniazdkach umieszczono po okolo 50 000 komórek ludzkiego polipa nosowego w postaci zawiesiny w 0,2 ml pozywki. Plytki nastepnie utrzymywano w ciagu £—10 dni, w temperaturze 37°C w atmosferze za¬ wierajacej 5% C02, w celu wyhodowania pojedyn¬ czych komórek. Po uplywie 8—10 dni zlewajace sie pojedyncze warstwy na plytkach splukano czterokrotnie solanka z dodatkiem fosforanowej substancji buforowej i niezwlocznie po tym do kazdego gniazdka dodawano 0,2 ml pozywki z za¬ wartoscia odpowiednio 10, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 i 0 mi- krogramów zwiazku podanego wyzej w tytule na 1 ml pozywki hodowanej. Pozywka ta byla iden¬ tyczna z podana wyze} pozywka wzrostowa, ale zawierala nie 10%, lecz 2% plodowej surowicy cie¬ lacej. Plytki poddawano hodowli w ciagu dal¬ szych 18 godzin w temperaturze 37°C, po czym pojedyncze warstwy plukano czterokrotnie solanka buforowana fosforanem, w celu usuniecia bada¬ nego zwiazku i nastepnie traktowano preparatem wirusa pecherzykowatege zapalenia jamy ustnej ffl&Vfi w dawkach wiekszych 1000 razy od dawki TCIDu, to jest dawki, która w niechronionyeh kulturach powoduje 50% wzrost predkosci roz¬ szerzania sie zakazenia. Po zakazeniu' plytki utrzy¬ mywano w ciagu 2 godzin w temperaturze 37°C, po czym splukano czterokrotnie solanka buforo¬ wana fosforanem, w celu usuniecia czastek wiru¬ sa nie zaadsorbowanego, a nastepnie dostarczono ponownie do kazdego gniazdka 0,2" ml pozywki ho¬ dowlane} o wyze} podanym skladzie. Plytki pod¬ dawano nastepnie hodowli w ciagu 7 godzin w temperaturze 37°C i zbierano ciecz hodowlana z 5-t* powtarzajacych sie komórek z kazdej plytki, przechowywano zamrozona w probówkach i nas¬ tepnie miareczkowano, w celu okreslenia ilosci za¬ kaznego wirusa L-929 fibroblastów u myszy w plytkach do mikromiareczkowania. Kultury L-929 myszy notowano pod mikroskopem i analizowano po uplywie 3—4 dni, otrzymujac nastepujace wy¬ niki: Procentowe zmniejszenie wydajnosci wirusa przy stezeniu badanego zwiazku w i*g/ml 10 5,0 1,0 0,5 0,1 94% 90% 84% 75% . < 68% W sposób opisany powyzej badano zmnie}szehie wydajnosci wirusa na komórkach ludzkiego polipa in vitro pod wplywem zwiazku opisanego w przy¬ kladzie I. Znak + oznacza zmniejszenie wieksze niz 68%, znak — oznacza zmniejszenie mniejsze niz *f8%, a ND oznacza, ze ósmej próby nie wy¬ konano. .- *¦' 119 8 Procentowe zmniejszenie wydajnosci wirusa przy stezeniu badanego zwiazku \i$/m\ wynoszacym 10 1 + 5,0 + 1,0 0,5 — | ND ^ 0,1 1 ND | Zdolnosc chlorowodorku l,3-dwu-0-/n-heksadecy- lo/-2-0-/3-aminopropyIp/-gUcerQlu do pobudzania ig wytwarzania krazeniowego interferonu badano na- ' y.ostepujaco: Mieszanine jednakowych wagowo ilosci badane¬ go zwiazku, polisorbinianu 80 i gliceryny stopnio¬ wo zmieszano homogenicznie w goracym roztworze *• wodnym chlorku sodowego o stezeniu 0,14 m, za¬ wierajacym roztwór wodny fosforanu sodowego /PBS/ o stezeniu 0;01 m i wartosci pH 7. Otrzy¬ mana emulsje typu olej w wodzie mozna bylo la¬ two rozcienczac PBS przed podawaniem./ Po 0,5 ml ** tef emulsji wstrzykiwano sródotrzewnowo sami¬ com myszy szwajcarskiej o wadze ciala 20—25 gr stosujac emulsje tak rozcienczona, aby podana dawka zawierala 9o6c .badanego zwiazku odpo¬ wiadajaca 25 mg na 1 kg masy ciala. Po uplywie ** 8, 12, 16 i 30 godzin od wstrzykniecia pobierano próbki plazmy 4 myszy i po szeregowym rozcien¬ czeniu pozywka L-I5 Leiboritza, zawierajaca 5% cielecej surowicy plodowej poddawano hodowli w plytkach do mikromiareczkowania w ternperatu- 3* rze 37°G na rozplywajacych sie pojedynczych war¬ stwach fibroblastów myszy L-929. Warstwy te splukiwano nastepnie pozywka nie zawierajaca pro¬ tein i zarazano wirusem pecherzykowatego zapa¬ lenia jamy ustnej VSV w dfawce 10 razy wiekszej » od dawki TCIDM, to jest od tej, która w nie¬ chronionych kulturach powoduje 50% zakazenia.Po zakazeniu plytki utrzymywano w temperatu¬ rze 3T°C w ciagu 1 godziny, po czym plukano, ponownie traktowano wyzej wymieniona pozywka 4* L-15 i hodowano w temperaturze 37°C w ciagu 48 godzin. Kultury L-929 badano nastepnie pod mikroskopem w celu stwierdzenia wirusowej- cyto- patologii i analizowano oznaczajac zawartosc in¬ terferonu w plazmie, bedaca odwrotnoscia roz- 45 cienczenia plazmy przy którym uzyskuje sie 50% ochrony warstw L-929. ¦ * ¦ Drugi szereg prób wykonano stosujac wyzej podana metode, ale myszom wstrzykiwano po 10 mg podanego wyzej zwiazku na 1 kg masy *• ciala i próbki otrzewnowych popluczyn pobiera¬ no z 4 myszy po uplywie 6, 9, 12, 15 i 18 godzin od wstrzykniecia. Próbki te pobierano w ten spo¬ sób, ze do jamy otrzewnowej po obnazeniu prze¬ pony wstrzykiwano 1 ml zrównowazonego roztwo^ 5& ru soli Henk*a, zawierajacego 100 jednostek pe¬ nicyliny na 1 ml i 100 mikrogramów streptomycy¬ ny na 1 ml, po czym krótko masowano brzucha a nastepnie zasysano ciecz otrzewnowa.W obu wyzej opisanych próbach otrzymano na- It stepujace wyniki.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku zwiaz¬ ki podaje sie pozajelitowa, miejscowo lub dono- sowo przed narazeniem ssaka na daialanie wiru— 66 sa. Zwiazki najdogodniej podaje sie w postact116 119 9 10 Zródlo interferonu Plazma Ciecz otrzewnowa Zawartosc interferonu jednostek/ml po uplywie czasu /gocjziny/ od wstrzykniecia 6 <16 8 34 9 768 12 67 320 15 448 16 52 18 448 20 40 zdyspergowanej w dopuszczalnym, zazwyczaj sto¬ sowanym nosniku.Okreslenie „zdyspergowane" oznacza stan, w którym czastki sa zmieszane dokladnie ze stalym nosnikiem, tworzac mieszanine w postaci proszku lub pylu. Moga one tez stanowic mieszaniny na¬ dajace sie elo rozpylania, a wiec roztwory, zawie¬ siny czy emulsje.Przy podawaniu pozajelitowym (podskórnie, do- mesniowo, dootrzewnowo) zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku stosuje sie w ilosci od okolo X mg do okolo 250 mg, korzystnie od oko¬ lo 100 mg, a zwlaszcza od okolo 5 do okolo 50 mg na 1 kg masy ciala. Preparaty do podawania do- nosowego zwykle zawieraja 1,0—100 mg substancji czynnej na 1 ml nosnika, a preparaty o stezeniu 30—50 mg/ml umozliwiaja podawanie odpowiedniej objetosci srodka.Przy podawaniu miejscowym substancje antywi¬ rusowe korzystnie stosuje sie w nosniku ulatwia¬ jacym dawkowanie i dobra absorpcje. Zwykle od¬ powiednie sa preparaty o stazeniu czynnej sub¬ stancji od okolo 1,0 do okolo 250 mg na 1 ml.Ogólnie biorac, w obu wyzej omówionych sposo¬ bach podawania stosuje sie czynne substancje w ilosci od okolo 1,0 mg do okolo 250 mg, a korzyst¬ nie od okolo 5,0 do okolo 50 mg na 1 kg masy ciala.Przyklad I. Chlorowodorek l,2-dwu-0-/n-he» ksadecylo/-3-0-/2-izopropyloaminoetylo/-glicerolu.A. l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-3-0-alliloglicerol. 1,78 g 50% dyspersji wodorku sodowego /37 mi- limoli/ w oleju mineralnym dodaje sie w tem¬ peraturze 60°C "clo roztworu 10 g /18,5 milimole/ l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-glicerolu w 100 ml N'N- -dwumetyloformamidu i otrzymany roztwór mie¬ sza w temperaturze 60°C w ciagu 20 minut, po czym wkrapla sie 4,47 g (37 milimoli) bromku alli- lu, miesza w temperaturze 90°C w ciagu 3 go¬ dzin, chlodzi, rozciencza ostroznie 200 ml wody i ekstrahuje 3 porcjami eteru po 150 ml. Polaczone wyciagi plucze sie nasyconym roztworem wodnym chlorku sodowego, suszy /MgS04/, przesacza i od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc oczyszcza sie chromatograficznie na ze¬ lu krzemionkowym, eluujac benzenem. Otrzymuje sie 10 g /93°/o wydajnosci teoretycznej/ zadanego produktu o konsystencji oleju, N.M.R. /CDCl3/8 5,66—6,16 /m, 1, —OCH_2—CHCH_2/, 5,25 /d du¬ bletów, 2, —OCH2CH=CH_2/ i 4,03 /d, 2, —OCHACH =CH2/.B. 1,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-3-0-formylometylo- glicerol. 90 mg /354 milimola/ czterotlenku osmu doda¬ je sie do roztworu 4,5 g (7,75 milimola) l,2-dwu-0- -/n-heksadecylo/-3-0-alliloglicerolu w 120 ml mie- 10 15 30 35 40 45 50 55 65. szaniny czterowodorofuranu z woda /3 : 1/ i miesza, otrzymany roztwór w ciagu 5 minut w tempera¬ turze pokojowej. Nastepnie dodaje sie 9 g /42 milimole/ nadjodanu sodowego 'i miesza w atmo¬ sferze azotu w temperaturze pokojowej w ciagu 16 godzin, po czym roztwór rozciencza sie 150 ml wody i ekstrahuje 2 porcjami po 150 ml eteru.Polaczone wyciagi plucze sie 150 ml wody, suszy /MgS04/ i odparowuje pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Oleista pozostalosc oczyszcza sie chroma¬ tograficznie na zelu krzemionkowym, eluujac mie¬ szanina benzenu z octanem etylu. Otrzymuje sie 2,6 g /57°/o wydajnosci teoretycznej/ woskowatego produktu, IR /CHC1/ 1736 cm-1, N.NLR. /CDCl8/6 9,38 /t, J = l Hz, 1, —OCH_2CHO/ i 4,07 /d, J=l Hz, 2, —OCH_2CHO/.C. Zwiazek podany w tytule przykladu. ; 0,1 g /1,6 milimola/ cyjanoborowodorku sodowego dodaje sie do roztworu 1,5 g /2,6 milimola/ 1,2-dwu- -0-/n-heksadecylo/-3-0-formylometyloglicerolu i 0,89 g /15 milimoli/ izopropyloaminy w 50 ml mie¬ szaniny metanolu z czterowodorofuranem,/l : 1/, po czym miesza sie w ciagu 2 godzin w pokojowej temperaturze. Nastepnie mieszanine zakwasza sie do wartosci pH 6 za pomoca 5n metanolowego roz¬ tworu kwasu solnego i miesza w ciagu dalszych 60 godzin w temperaturze pokojowej, po czym przesacza, dodaje do przesaczu 10 rpl 3n wodoro¬ tlenku sodowego, dodaje 200 ml nasyconego wod¬ nego roztworu chlorku sodowego i ekstrahuje 2 porcjami eteru po 150 ml. Polaczone wyciagi su¬ szy sie INLgSOJ, przesacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Stala pozostalosc, nieco oleista, oczyszcza sie chromatograficznie na zelu krzemionkowym, eluujac benzenem z etanolem.Produkt rozpuszcza sie w metanolu, .nasyca roz¬ twór gazowym chlorowodorem i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Stala pozostalosc prze- krystalizowuje sie z octanu etylu, otrzymujac 400 mg /23% wydajnosci teoretycznej/ stalego pro¬ duktu, zawierajacego na 1 mol okolo 0,25 mola H20, topniejacego w tempe N.M.R. /CDCI3/8 1,42 /d, —NHCH/CH_3/2/.Analiza elementarna %C obliczono 72,02 znaleziono 71,89 Postepujac w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I i stosujac odpowiednie produkty wyjsciowe otrzymuje sie: Przykla-d II. Chlorowodorek l,3-dwu-0-/n- -heksadecylo/-2-0-/3-etyloaminopropylo/-glicerolu o temperaturze topnienia 61—62°C, N.M.R. /CDCl8/5 1,47 /t, 3, —NHCH2CH_8/.Analiza elementarna %C %H %N obliczono 72,51 12,78 2,11 znaleziono 72,47 12,56 2,03 aturze J=6 12,76 12,34 71—72°C, Hz, 6, %N 2,10 2,09%H 12,79 12,46 patent owe %N 2,04 1,94 Przyklad III. Chlorowodorek l,3-dwu-0-/n- -heksadecylo/-2-0-/3-izopropyloaminopropylo/-glice- rolu o temperaturze topnienia 72—73°C, N.M.R./CDcyd 1,42 /d, e, —nhch/ch3/2/.• Analiza elementarna °/oC obliczono 71,82 znaleziono 71,92 Zastrzezenia 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych ami¬ nowych glicerolu' lub pfopanodioli o wzorze 1, w którym jeden z podstawników Q1 lub Q2 ozna¬ cza grupe o wzorze -0-Y-NHR8, a drugi oznacza grupe o wzorze -ORi, Ri i R2 oznaczaja rodniki n-alkilowe o 12—20 atomach wegla albo rodniki n-alkenylowe o 12—20 atomach wegla, nie majace podwójnego wiazania w pozycji 1, R8 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 2—4 atomach wegla i Y oznacza rodnik alkilenowy o 2—4 ato¬ mach wegla, majacy obie wolne wartosciowosci przy róznych atomach wegla, albo rodniki o-, m- lub p-fenylenodwumetylenowy, grupe o worze 2, w którym q oznacza liczbe calkowita 1—3 i grupa ta jest z lewej strony zwiazana z atomem tlenu, 116 119 12 10 15 20 znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 3, w któ^ rym jeden z podstawników Q5 lub Q6 oznacza grupe o wzorze -OR1} a drugi oznacza grupe o wzorze -OY'-CHO, Rx i R2 maja wyzej podane znaczenie i Y' oznacza rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla lub grupe o wzorze 4, zwiazana z lewej strony z atomem tlenu, albo grupe o wzo¬ rze 5, w którym q oznacza liczbe calkowita 1—3, zwiazana z lewej strony z atomem tlenu, poddaje sie w srodowisku redukujacym reakcji ze zwiaz¬ kiem o wzorze NH2R3, w którym Rs ma wyzej podane znaczenie, po czym otrzymany zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w jego farmakolo¬ gicznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcji poddaje sie zwiazek o wzorze 3, w któ¬ rym Rj i R2 oznaczaja rodniki n-heksadecylowe, a pozostale podstawniki maja znaczenia, podane w zastrz. 1. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcji podaje sie zwiazek o wzorze 3, w któ¬ rym Q5 i Q6 maja znaczenie podane w zastrz. 1, przy czym grupa o wzorze -OY'CHO znajduje sie w pozycji 2, Rj i R2 oznaczaja rodniki n-heksade¬ cylowe, a Y' oznacza rodnik etylenowy.CW9 — Q1 1 2 CM — CP I CH2 — 0R2 Ri—X-CH2 R9-Y-CH, CH-Z-ALK-B WZCfR 1 WZCfR 4 WZ0R 6 WZ0R 2 CH9 — Q5 i CU —Q6 I CH2 —0R2 WZ0R 3 F*!— CH2 ^2)^ — CM-(CH2)q—A R2— CH2 WZÓR. 5 WZ0R 7 Sr = sx + 100 ZZ i="1 do + 100 - Xj — 10 ¦IZZ i = 1 do 10 i=1 do 10 x100 WZ0R 8 Bltk 497/82 95 egz. A4 . Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL