PL186710B1

PL186710B1 - Peptydy hormonu przytarczycznego PTH

Info

Publication number: PL186710B1
Application number: PL96325905A
Authority: PL
Inventors: Zheng X. Dong
Original assignee: Sod Conseils Rech Applic
Priority date: 1995-07-13
Filing date: 1996-07-03
Publication date: 2004-02-27
Also published as: US5723577A; EP0847278A1; KR20040053216A; KR19990028947A; ES2207680T3; JP2007302682A; KR100563112B1; JPH11509201A; CN1199340A; MX9800418A; HUP9901718A3; KR20040053215A; DK0847278T3; IL122837A; EP1405861B1; DE69638025D1; CN1521189A; EP1405861A3; DK1405861T3; DE69630133T2

Abstract

1. Peptyd o wzorze: A16-A17-A18_ A19-Arg-Val-Glu-A23-A24-Arg-Lys-A27-A28-Gln- A3 0 -A3 1 -His-Asn-A 3 4 -NH2, w którym A1 oznacza Ser Iub Dap; A3 oznacza Ser Iub Aib; A7 oznacza Leu lut Cha; A8 oznacza Met Iub Nie; A 1 1 oznacza Leu Iub Cha; A 1 2 oznacza Gly Iub Aib; A1 5 oznacza Leu Iub Cha; A1 6 oznacza Asn Iub Aib; A1 7 oznacza Ser Iub Aib; A1 8 oznacza Met Iub Nl e; A1 9 oznacza Glu Iub Aib; A23 oznacza Trp Iub Cha; A24 oznacza Leu Iub Cha; A27 oznacza Lys, hArg Iub Cha; A28 oznacza Leu Iub Cha; A30 oznacza Asp Iub Lys: A31 oznacza Val, Nle Iub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr Iub Aib; pod warunkiem, ze co najmniej jedna z A7, A11, A1 5, A23, A24, A27, A28 i A31 ozna- cza Cha, Iub co najmniej jedna z A3, A1 6 , A17, A19, i A34 oznacza Aib, i z tym warunkiem, ze A 1 2 nie oznacza Aib kiedy A34 oznacza Tyr, i pod tym warunkiem, ze peptydem nie jest [Aib 1 2 ]PTH (1- 34)NH2; Iub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są peptydowe związki PTH (1-34) o następującym wzorze

Ai-Val-A3-Glu-ILe-Gln-A7-Ag-His-Asn-An-A^-Lys-His-A]^^A16^-Al7-Aig-Ai9-Arg-Val-Glu-A23-A24-Arg-Lys-A27-A28^-GlnA30-A31 -His-As n --A3 5-NH2, w którym A| oznacza Ser lub Dap; A3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; A8 oznacza Met lub Nle; An oznacza Leu lub Cha; A12 oznacza Gly lub Aib; A15 oznacza Leu lub Cha; A16 oznacza Asn lub Aib; A17 oznacza Ser lub Aib; Ai8 oznacza Met lub Nle; A19 oznacza Glu lub Aib; A23 oznacza Trp lub Cha; A24 oznacza Leu lub Cha; A27 oznacza Lys,

186 710 hArg lub Cha; A2g oznacza Leu lub Cha; A30 oznacza Asp lub Lys; A31 oznacza Val, Nle lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr lub Aib;

pod warunkiem, że co najmniej jedna z A7, A11, A15, A23, A24, A27, A28 i A31 oznacza Cha, lub co najmniej jedna z A3, A16, A17, A19, i A34 oznacza Aib, i z tym warunkiem, że A12 nie oznacza Aib kiedy A34 oznacza Tyr, i pod tym warunkiem, że peptydem nie jest [Aibi2]PTH (1 -34)NH2; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Przedmiotem wynalazku są peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym co najmniej jedna z A7, Au, A15, A23, A24, A27, A2g i A3i oznacza Cha. Korzystnie stanowi go peptyd [Nle8·¹8,Chći ]hPTH( i -34)NH2.

Wynalazek obejmuje peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym A 3 oznacza Ser; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met lub Nle; A] 1 oznacza Leu lub Cha; A12 oznacza Gly; Ai6 oznacza Asn lub Aib; A17 oznacza Ser; Ais oznacza Met lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg lub Cha; A31 oznacza Val, Nle lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr lub Aib. Korzystnie co najmniej jedna z A7 i Au oznacza Cha.

Wynalazek obejmuje peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym A3 oznacza Ser; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met lub Nle; Au oznacza Leu lub Cha; A12 oznacza Gly; A15 oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; Ai7 oznacza Ser; Aig oznacza Met lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg lub Cha; A 31 oznacza Val, Nle, lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr lub Aib.

Wynalazek obejmuje peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym co najmniej jedna z A15, A 23, A 24, A 27, A 28, i A 31 oznacza Cha.

Peptydem według wynalazku jest [Cha⁷'^ll]hPTH(i-34)NH.2; [Cha7^-1 , ,

Tyr34]^TH(i^^^^)l^lH2; [Chai i]hPTH(i-34)NH2; lub [Cha7]hPTH(1-34)NH2.

[N1p7’ ,Cha27]hPTH(1-34)NH2; [Cha²8]hPTH(1-34)NH2, lub [Cha31]hPTH(i-34)NH2.

Peptydem według wynalazku jest [Cha²3]lhPTH(1-34)NH2 [ChaO⁴]hPTH(i-34)NH2, [Cha2⁴’28’31]hPTH(i-34)NH2 O lub [Cha¹⁵]hPTH(1-34)NH2 , [Cha²⁴2^s3;Lys³⁰]hPTH0334)NHo; lub [Cha2g’31 ]hPTH(1-34)N H2.

Wynalazek obejmuje peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym że co najmniej jedna z A3, A12, A)6, Ai7, A19, i A34 oznacza Aib. Grupa ta obejmuje związki w których A3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met lub Nle; A] 1 oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; A]g oznacza Met lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A31 oznacza Val, Nle, lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr, lub Aib. Korzystnie, co najmniej jedna z A3, A12, A19 i A 34 oznacza Aib.

Grupa ta obejmuje związki, w których A3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met, lub Nle; Au oznacza Leu lub Cha; A15 oznacza Leu lub Cha; A], oznacza Asn lub Aib; Au oznacza Met, lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A31 oznacza Val, Nle lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr lub Aib.

Korzystnie, co najmniej jedna z A3, A12, A], A17, A19 i A34 oznacza Aib.

Peptydem według wynalazku jest [AibOi]hPTH(1-34)NH2, [Aib³⁹]hPTH( i-34)NH₂, tob [Aib³⁴}hPTH( 1-34)NH2;

[Aib 16’19]1^PTH(1^34)NH2;

[Aib³]hPTH(1-34)NH2;

[Aib ’7]hPTHO-34)NH 2, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Wynalazek obejmuje peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym co najmniej jedna z A7, Au, A15, A23, A24, A27, A28, i A31 oznacza Cha i co najmniej jedna z A3, Au, Ai,, A]7, Au i A34 oznacza Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Wynalazek obejmuje peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym A3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met lub Nle; Au oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; Au oznacza Met lub Nle; A21 oznacza Val; A27 oznacza Lys, hArg lub Cha; A 31 oznacza Val, Nle lub Cha; His; A 34 oznacza Phe, Tye lub Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Korzystnie, co najmniej jedna z A7 i Au oznacza Cha i co najmniej jedna z A],, A19 i A34 oznacza Aib.

186 710

Korzystnie, jedna z A24, A28, i A31 oznacza Cha i co najmniej jedna z Ai6 i A17 oznacza Aib. Wynalazek obejmuje peptydy o wyżej przedstawionym wzorze, w którym A3 oznacza

Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; As oznacza Met, lub Nle; Ai 1 oznacza Leu lub Cha; A15 oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; A oznacza Met lub Nle; A₂i oznacza Val; A₂7 oznacza Lys, hArg lub Cha; A 31 oznacza Val, Nle lub Cha; A 34 oznacza Phe, Tye lub Aib;

Peptydem według wynalazkuiest [Cłu?⁴1 Nle⁸'⁸, Ad?⁶'⁹, TyrHhPTHC 1 -34)NH2, lub [Cha'1, Nie8'8’³i, Aib’’ Ty?⁴]hPTH(1-34)NH2;

[Cha'’, Aib

ΙιΡΤΗΟ^^^ hPTH(1-34)NH2;

[Cha'’, Aib [Cha', Nle*, Aib ³4]hPTHO-34)NH₂; lub .19 [Cha', Aib, Lys3°]hPTH( b34)NH₂.

[Nle3i]hPTH( 1-34JNH2, [iArg27]hPTH(1-34)NH2, lub [Dap Nle⁸,Tyr 4]hPTH(1-34)NH₂, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Wynalazek obejmuje związek;

[Glu²²^⁵, Leu²³^·³, Aib²9, Lys26³⁰]hPTHrP(1-32)NH₂. Przedmiotem wynalazku jest również peptyd określony wzorem

A]_-Val-A3-Glu-Ile-Gln-A7-Ag-His-Asn-A2ą-Ai2^-LYS-His-Ai5H

Ai6-Ai7-Aig-Aig-Arg-Val-Glu-A23-A24-Arg-Lys-A27-A28-GlnA3Q-A3i-His-Asn-A3ą-NH2, w którym Ai oznacza Ser lub Dap; A3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu; Ag oznacza Met lub Nle; A oznacza Leu, Cha; A12 oznacza Gly lub Aib; A15 oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; A17 oznacza Ser lub Aib; Ai8 oznacza Met lub Nle; A19 oznacza Glu lub Aib; A23 oznacza Trp lub Cha; A24 oznacza Leu lub Cha; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A28 oznacza Leu lub Cha; A 30 oznacza Asp lub Lys; A 31 oznacza Val, Nle, Cha; A 32 oznacza His; A33 oznacza Asn; A3) oznacza Phe, Tyr, Aib, lub delecję; pod warunkiem, że co najmniej A oznacza Dap, A27 oznacza hArg, lub A31 oznacza Nle; lub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól.

Wynalazek obejmuje także peptyd określony wzorem

H \

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-LysH

Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-A22-A23-Leu-His-His-LeuILe-Ala-A3Q-Ile-His-Thr-Ala-NH2;

w którym A22 oznacza Phe lub Cha; A23 oznacza Ph lub Cha; A 30 oznacza Glu lub Lys; pod warunkiem, że co najmniej jedna z A22 i A23 oznacza Cha, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

186 710

Wynalazek obejmuje także peptyd określony wzorem \

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-SerH

Iee-Gnn-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-AżŻ-AżS-Leu-AżS--^-^-^A29-A3Q“A31^-His-Thr-Ala-NH2, w którym

A22 oznacza Phe, Glu, Aib lub Cha; A23 oznacza Phe, Leu, Lys lub Cha; A25 oznacza His, Aib lub Glu; A26 oznacza His, Aib lub Lys; A27 oznacza Leu lub Lys; A28 oznacza Ile, Leu lub Lys; A29 oznacza Ala, Glu lub Aib; A 30 oznacza Glu, Cha, Aib lub Lys; A 31 oznacza Ile lub Leu; pod warunkiem, że co najmniej jedna z A22, A23 lub A30 oznacza Cha, oraz co najmniej jedna z A22, A25, A26, A 29 Iub A 30, oznacza Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Korzystnie, A22 oznacza Phe lub Cha; A23 oznacza Phe lub Cha; A25 oznacza His; A26 oznacza His; A27 oznacza Leu; A28 oznacza lle; A29 oznacza Ala; A30 oznacza Glu lub Lys; A 31 oznacza Ile.

Korzystnie, A22 oznacza Glu, Aib lub Cha; A23 oznacza Leu, Lys lub Cha; A25 oznacza Aib lub Glu; A26 oznacza Aib lub Lys; A28 oznacza Leu lub Lys; A29 oznacza Glu lub Aib; A30 oznacza Cha, Aib lub Lys; A31 oznacza Leu.

Wynalazek obejmuje także peptyd określony wzorem

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-SerII e-Gln ~Asp- L u—Ar -^^ g-r g-A- 2 -A- 3 -L—-5- 5 ——A6 ~ -5 7 ~-2 8 ~

A29-A3 0-A3 -His- Thr-Ala-NH2, w którym A22 oznacza Phe, Glu, Aib lub Cha; A23 oznacza Phe, Leu, Lys lub Cha; A25 oznacza His, Aib lub Glu; A26 oznacza His, Aib lub Lys; A27 oznacza Leu lub Lys; A28 oznacza Ile, Leu, Lys; A 29 oznacza Ala, Glu lub Aib; Ąo) oznacza Glu, Cha, Aib Iub Lys; A 31 oznacza Ile lub Leu; pod warunkiem, że co najmniej jedna z A23, A27, lub A28 oznacza Lys; lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Korzystnie, w tym wzorze A22 oznacza Glu, Aib, lub Cha; A23 oznacza Leu, Lys lub Cha; A 25 oznacza Aib lub Glu; A26 oznacza Aib lub Lys; A28 oznacza Leu lub Lys; A29 oznacza Glu lub Aib; A 30 oznacza Cha, Aib, lub Lys; A 31 oznacza Leu.

Poza wyjątkiem N-terrninalnego aminokwasu, wszystkie skróty (np. Ala lub Aj aminokwasów w opisie oznaczają strukturą -NH-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu (np., CH3 dla Ala). Dla N-teirninalnego aminokwasu, skrót oznacza strukturę =N-CH(R)-CO-, w której R oznacza łańcuch boczny aminokwasu. Nle, Dap, Cha, Nva i Aib są skrótami następujących α-aminokwasów: norleucyny, kwasu α,fł-diaminopropionowego, cykloheksyloalaniny, norwaliny. W powyższym wzorze hydroksyalkil, hydroksyenyloalkil i hydroksynaftyloalkil mogą zawierać 1-4 podstawniki hydroksylowe. Ponadto COE1 oznacza -C=O·ΙΞ1. Przykłady-C=O-Ei obejmują między innymi acetyl i fenylopropionyl.

Peptyd według wynalazku jest tu także określany inną notacją, np., [Cha7^,H]hPTH(134)NH2, z podstawionymi aminokwasami z naturalnej sekwencji umieszczonymi w drugim zestawie nawiasów kwadratowych (np., Cha7 za Leu⁷ i Cha^H za Leu^H w hPTH). Skrót hPTH oznacza ludzki PTH, hPTHrP ludzki PTHrP, rPTH szczurzy PTH, i bPTH bydlęcy PTH.

186 710

Liczby w zwykłych nawiasach odnoszą się do liczby aminokwasów obecnych w peptydzie (np., hPTH(1-34) oznacza aminokwasy 1 do 34 sekwencji peptydu ludzkiego PTH). Sekwencje hPTH(1-34), hPTHrP(1-34), bPTH(1-34) i rPTH(1-34) wymienia Nissenson i in., Receptor, 3:193 (1993). Oznaczenie „NH2” w PTH(1 -34)NH2 wskazuje, że C-terminalny peptyd jest amidowany. PTH(1-34), z drugiej strony, ma wolny kwasowy koniec C.

Każdy peptyd według wynalazku może stymulować wzrost kości u pacjenta (to jest, ssaka takiego jak człowiek). Tak więc jest on przydatny w leczeniu osteoporozy i złamań kości przy podawaniu oddzielnie lub łącznie z leczeniem antyresoipcyjnym np., bisfosfonianami i kalcytoniną. Peptydy według wynalazku można stosować w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Przykłady takich soli obejmują między innymi tworzone z kwasami organicznymi (np., octowym, mlekowym, maleinowym, cytrynowym, jabłkowym, askorbinowym, bursztynowym, benzoesowym, metanosulfonowym, toluenosulfonowym, lub pamowym), kwasami nieorganicznymi (np., kwasem chlorowodorowym, siarkowym lub fosforowym), i kwasami polimerycznymi (np., kwasem garbnikowym, karboksymetylocelulozą, polimlekowym, poliglikolowym lub kopolimerami polimlekowo-glikolowymi).

Terapeutycznie skuteczna ilość peptydu według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik (np., węglan magnezu, laktoza lub fosfolipid z którym związek leczniczy może tworzyć micele) tworzą razem leczniczą kompozycję (np., pigułkę, tabletkę, kapsułkę lub ciecz) do podawania (np., doustnie, dożylnie, przezskórnie, dopłucnie, dopochwowo, podskórnie, donosowo, jonoforetycznie lub dotchawicznie) pacjentowi. Pigułkę, tabletkę lub kapsułkę podawaną doustnie można powlec substancją chroniącą kompozycję czynną przed kwasem żołądkowym lub enzymami jelitowymi w żołądku przez okres dostateczny do przejścia bez trawienia do jelita cienkiego. Lecznicza kompozycja może także mieć postać biodegradującego lub niebiodegradującego preparatu do spowolnionego uwalniania do podawania podskórnego lub domięśniowego. Patrz, np., opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3773919 i 4767628 i zgłoszenia patentowe pCT nr WO 94/15587. Ciągłe podawanie można także uzyskać stosując wszczepianą lub zewnętrzną pompę (np., pompę INFUSAID™). Podawanie można także prowadzić z przerwami, np., jako codzienny zastrzyk, lub w, sposób ciągły z niską dawką, np., preparatu do spowolnionego uwalniania.

Dawka peptydu według niniejszego wynalazku do leczenia wspomnianych chorób lub zaburzeń waha się w zależności od sposobu podawania, wieku i masy ciała pacjenta i stanu leczonego pacjenta, o czym ostatecznie zadecyduje przepisujący lekarz lub weterynarz.

W zakresie wynalazku jest peptyd o powyższym wzorze rodzajowym do stosowania w leczeniu chorób lub zaburzeń związanych z niedoborem wzrostu kości lub podobnym, np., osteoporozą lub złamaniami.

Inne cechy i korzyści z niniejszego wynalazku będą oczywiste ze szczegółowego opisu i z zastrzeżeń.

W oparciu o powyższy opis niniejszy wynalazek można wykorzystać w najpełniejszym stopniu. Poniższe konkretne przykłady powinny być uznawane za wyłącznie ilustracyjne, nie ograniczające reszty wynalazku w żaden sposób. Wszystkie publikacje cytowane tutaj są dołączane jako odnośniki.

Struktura

PTH(1-34) opisano jako zawierający dwie amfofilowe helikalne domeny alfa. Patrz, np., Barden, i in., Biochem., 32:7126 (1992). Pierwszy heliks α tworzy się pomiędzy resztami aminokwasowymi 4 do 13, a drugi heliks α tworzy się pomiędzy resztami aminokwasowymi 21 do 29. Pewne peptydy według wynalazku zawierają podstawienie Cha za jedną lub więcej reszt w lub w pobliżu tych dwu regionów PTH(1-34), np., Cha⁷ i Cha¹¹ w pierwszym heliksie α lub Cha27 i Cha2⁸ w drugim heliksie α.

Przedmiotem wynalazku są także warianty PTH(1-34) z podstawieniem Aib za resztę sąsiadującą z heliksami α, np., Aib¹⁶, Aib 1⁹ i Aib³⁴; hArg27 i Nle , lub podstawieniem Dpa za resztę N-terminalną.

Synteza

Peptydy według wynalazku można wytwarzać metodą standardowej syntezy w fazie stałej. Patrz, np. , Stewart, J. M. i in., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., wyd. 2,

186 710

1984). Poniżej opisano, jak wytwarza się [Aib34]hPTH(1-34 )NH 2. lnne peptydy według wynalazku może specjalista wytwarzać w analogiczny sposób.

Peptyd zsyntetyzowano na syntetyzatorze peptydów Applied Biosystems (Foster City, CA) model 430A, który zmodyfikowano przyspieszając syntezę peptydów w fazie stałej opartą na chemii Boc. Patrz Schnoize, i in., lnt. J. Peptide' Protein Res., 90:180 (1992). Użyto żywicy 4-metylobenzhydIrvlammowej (MBHA) (Peninsula, Belmont, CA) z podstawieniem 0,93 mmol/g. Użyto aminokwasów Boc (Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., La-Jolla, CA) z następującym zabezpieczeniem łańcuchów bocznych: Boc-Arg(Tos)-O.H, BocAsp(OcHxl)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Glu(OCHxl)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-AsnGH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Met-OH, BOC-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2ClZ)-OH’ Boc-Ser(Bzl)-OH i Boc-Tip(Fm)-OH. Syntezę przeprowadzono na skalę 0,14 mmol. Grupy Boc usunięto działając 100% tFa przez 2x1 min. Aminokwasy Boc (2,5 mmol) preaktywowano HbTu (2,0 mmol) i DlEA (1,0 ml) w 4 ml DMF i sprzężono bez wcześniejszej neutralizacji soli TFA peptydu-żywicy. Czasy sprzęgania wynosiły 5 min poza Boc-Aib-OH i następną resztą, Boc-Asn(Xan)-OH, w których czasy sprzęgania wynosiły 20 min.

Na koniec składania łańcucha peptydu żywicę potraktowano roztworem 20% merkaptoetanolu/10% DlEA w DMF przez 2 x 30 min w celu usunięcia grupy DNP na bocznym łańcuchu His. N-terminalną grupę Boć usunięto następnie działaniem 100% TFA przez 2x2 min. Po zobojętnieniu peptydu-żywicy 10% DlEA w DMF (1x1 min), grupę formylową na bocznym łańcuchu Trp usunięto działaniem roztworu 15% etanol oaminy/15% wody/70% DMF przez 2x30 min. Częściowo odbezpieczony peptyd-żywicę przemyto DMF i DCM i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Końcowe odszc/epienie wykonano mieszając poplyd-żywicę w 10 ml HF zawierającym 1 ml anizolu w temperaturze 0°C przez 75 min. Hf usunięto strumieniem azotu. Pozostałość przemyto eterem (6x10 ml) i ekstrahowano 4N HOAc (6x10 ml).

Mieszaninę peptydów w wodnym ekstrakcie oczyszczono metodą preparatywnęl wysokociśnieniowej cieczowej chromatografii z odwróconymi fazami (HPLC) stosując kolumnę Vydac™ C1 z odwróconymi fazami (Nest Group, Southborough, MA). Kolumnę eluowano liniowym gradientem (10% do 45% roztwór B w czasie 130 min) przy przepływie 10 ml/min. (Roztwór A = 0,1% wodny roztwór TFA; Roztwór B = acetonitryl zawierający 0,1% TFA). Frakcje zebrano i sprawdzono metodą analitycznej HPLC. To zawierające czysty produkt połączono i liofilizowano do suchej masy. Otrzymano 62,3 mg białego ciała stałego. Czystość wynosiła >99% metodą analitycznej HPLC. Analiza spektrometrem masowym z elektrowTyskiwaniem dała masę cząslejzkową4054,7 (zgodnie z obliczoną masą cząsteczkową 4054,7).

Syntezę i oczyszczanie [Cha⁷’11)hPTH(1-34)NH2 przeprowadzono w taki sam sposób jak powyższą syntezę [A^^hPTH (1 -34)NH2. Zabezpieczony aminokwas Boc-Cha-OH nabyto od Bachem, CA. Czystość końcowego produktu wynosiła >98%, a analiza spektrometrem masowym z elektrowtryskiwaniem dała masę cząsteczkową 4197,0 (obliczona masa cząsteczkowa wynosi 4196,9).

Pełne nazwy dla skrótów użytych powyżej są następujące: Boc dla t-butyloksykarbonylu, HF dla fluorowodoru, Fm dla formylu, Xan dla ksantylu, Bzl dla benzylu, Tos dla tosylu, DNP dla 2,4-dinilrofenylu, DMF dla dimetyloformamidu, DCM dla dichlorometanu, HBTU dla heksafluorofosforanu 2-(1H-bemzotriazol-1-ilu)-1,1,3,3-tetrametylom-omowego’ DlEA dla diizopropyloetyloaminy, HOAc dla kwasu octowego, TFA dla kwasu trifluoroojlowogo, 2C1Z dla 2-chłorobenzyloksykarbonylu i OcHx1 dla O-cykloheksylu.

Próby funkcyjne

A. Wiązanie z receptorem PTH

Peptydy według wynalazku testowano na ich zdolność do wiązania receptora PTH obecnego na SaOS-2 (ludzkie komórki kostniakomięsaka). Komórki SaOS-2 (American Type Culture Collection’ Rockville, MD; ATCC #HTB 85) trzymano w pożywce RPMl 1640 (Sigma, St. Louis, MO) uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 2 mM glutaminy w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO 2 w powietrzu. Środowisko zmieniano co trzy lub cztery dni, i komórki dzielono na kultury co tydzień przez trypsynizację.

186 710

Komórki SaOS-2 trzymano przez cztery dni, aż do osiągnięcia zlewania. Pożywkę zastąpiono 5% FBS wRPMI 1640 i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z mono-^I-pNle^^Ty^p-^IjjbPTHO-S-tyNHa (10x10* zliczeń na minutę) w obecności współzawodniczących peptydów według wynalazku w różnych stężeniach pomiędzy 10'¹¹ M do 10'1 M. Komórki przemyto czterokrotnie lodowato zimnym PBS i lizowano 0,1 M NaOH, a radioaktywność związaną z komórkami zliczono w liczniku scyntylacyjnym. Syntezę mono1 25i-[Nle⁸’18, (3-⁵))]bPTH(l-34)14¾ prowadzono jak opisano u Goldmana, M . E . i in. ,

Endocrinol., 123:1468 (1988).

Próbę wiązania prowadzono z różnymi peptydami według wynalazku i obliczano wartość IC50, (połowę maksymalnej inhibicji wiązania moar-l25I-[Nie8’^,8, Tyr^-^i^bPTH (1 -34 )NH2, dla każdego peptydu.

Jak pokazano w tabeli l, wszystkie testowane peptydy miały wysokie powinowactwo wiązania z receptorem PTH na komórce SaOS-2.

B. Stymulacja aktywności cyklazy αdeaylαaowęj

Zmierzono zdolność peptydów według wynalazku do indukcji biologicznej odpowiedzi w komórkach SaOS-2. Dokładnie, wszelką, stymulację cyklazy adenylanowej określono mierząc poziom syntezy cAMP (3',5'-monofosforaa adenozyny), jak opisał uprzednio Rodan, i in., J. Clin. 1nvest. 72: 1511 (1983) i Goldman, i in., Endoci-inol., 123:1468 (1988). Zlane komórki SaOS-2 na 24-dołkowych płytkach inkubowano z 0,5 pCi [3H)adeniny (26,9 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, Ma) w świeżej pożywce w temperaturze 37°C przez 2 godziny, i przemyto dwukrotnie zbilansowanym roztworem soli Hanka (Gibco, Gaithersburg, MD). Komórki potraktowano 1 mM lBMX [izobutylo-metylo-ksantyna, Sigma, St. Louis, MO) w świeżej pożywce przez 15 minut, i peptydy według wynalazku dodano do pożywki w celu inkubacji przez 5 min. Reakcję zatrzymano dodając 1,2 M kwas trichlorooctowy (TCA) (Sigma, St. Louis, MO), następnie zobojętniając próbkę 4 N KOH. cAMP wydzielono metodą dwukolumnowej chromatografii (Salmon, i in., 1974, Anal. Biochem. 58, 541). Radioaktywność zliczono w liczniku scyntylacyjnym (Liquid Scintillatira Counter 2200CA, PACKARd, Downers Grove, 1L).

Obliczono odpowiednie wartości EC50 (połowa maksymalnej stymulacji cyklazy adenylanowej) dla testowanych peptydów i pokazano je w tabeli 1. Wszystkie testowane peptydy okazały się być silnymi stymulatorami aktywności cyklazy adenylanowej, która jest biochemiczną śc^^^^ą wyst<ę)ującąjakr bliski sygnał namnażania ostooblastów (np., wzrostu kości).

Inne odmiany

Należy rozumieć, że chociaż wynalazek opisano w związku ze szczegółowym jego opisem, powyższy opis ma ilustrować wynalazek, a nie ograniczać jego zakres, który jest zdefiniowany zakresem załączonych zastrzeżeń. Inne aspekty, korzyści i modyfikacje mieszczą się w zakresie zastrzeżeń.

Ig] 710

Tabela I

Peptyd	Kd (pM)	EC50 (nM)
[Οκ^'υΐιρπια-μοΝΗ,	0,01	0,6
[Cha²³]hPTH(U34)NH2	0,2	20
[Cha²)]hPTH(U34)NH2	0,1	10
[Nk!¹’¹ g^ha^lhPTHU^łlNL	0,05	2
[Cha²g]hPTH(i-34)NH2	0,05	2,5
[Cha3UhPTH(U34)NH2	0,03	4
[Aib¹-] 1^^(134^¾	0,004	0,7
[Aib-⁹] 1^^(1-34^¾	0,005	0,6
[Albr]hPTO(1-34)NH₂	0,007	3
[)lp3UhPTH(1-34)^^2	0,004	0,7
[łArg27hPTH( 1-34)ΝΗ₃	0,007	1
[DapJNeg’¹ i/TyPhhPTIH i -34)NH₂	0,150	10
[Ομ^ ²7’iι,Lds3⁰]hPTH(U34)NH2	0,5	7
[Cha⁷· 11 ,NIp7'’ gTyr^hPTHł i -^NH	0,006	0,6
[Cha⁷’- -,N1p7’u,Aib'-·’TTyr^PPTHi l334)NH₂	0,005	1,5
[Cha⁷ --,N1p7 l7 3i,Ab^\|6i⁹,Tyι^>]heTH(i-34)NH2	0,04	4
[Ομι^'^-·^)^	0,005	2
[Cha²g’3ⁱ]hPTH(U34)NH2	0,06	7
[^NN^AA^łPTTHa ^NHj	0,03	-,5
[ChaiijhPTHO^NHj	0,005	-,3
[Cha⁷ - - ,Albl⁹]hPTH(U34)NH2	0,007	0,5
[Cha⁷ ll,AibU)hPTN(U34)NN₂	0,004	1,1
[AibU-i^hPTHa^NHz	0,004	0,6
	0,005	2
[AibrlieTT(U34)NH2	0,004	1,1
[Cha⁷ - ι,Aibll,Lds3⁰]hPTH(U34)NH2	0,004	2
[Cha⁷]hPTT(U34)NH2	0,02	2,3
[Cha* ²g’3¹ i1xeTIT(U34)lNT₂	1,0	30
[Aib-]hPTH(1-34)	0,05	3
[Cha^7-l-^,-⁵]hPTH(1-34)	0,01	1,4

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Peptyd o wzorce:

H \

Ai-Val-A3-Glu-ILe-Gln-A7-Ag-His-Asn-Ai]_-A]_2^-Lys-His-A]_5Z

H ^A16^-Al7^-A18^-A19^_Arg^_Val_Glu-A23^_A24^-Arg^-Ly^s_A27^-A28^-Gln_

A3 0 -A3 - Hi s - As 1--A3 4-NH₂, w którym Ai oznacza Ser lub Dap; A3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met lub Nle; A11 oznacza Leu lub Cha; A12 oznacza Gly lub Aib; A15 oznacza Leu lub Cha; A)6 oznacza Asn lub Aib; A17 oznacza Ser lub Aib; Aig oznacza Met lub Nle; A19 oznacza Glu lub Aib; A23 oznacza Trp lub Cha; A24 oznacza Leu lub Cha; A 27 oznacza Lys, hArg lub Cha; A28 oznacza Leu lub Cha; A30 oznacza Asp lub Lys; A31 oznacza Val, Nle lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr lub Aib;

pod warunkiem, że co najmniej jedna z A7, Au, A15, A23, A24, A27, ^A28 i A31 oznacza Cha, lub co najmniej jedna z A3, Ai6, Ai7, A19, i A34 oznacza Aib, i z tym warunkiem, że A12 nie oznacza Aib kiedy A34 oznacza Tyr, i pod tym warunkiem, że peptydem nie jest [Aib ’2]PTH(i-34)NH2;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
2. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jedna z A7, Au, A15, A23, A24, A27, A28 i A31 oznacza Cha; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
3. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że A3 oznacza Ser; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met lub Nle; A i oznacza Leu lub Cha; A12 oznacza Gly; Ai6 oznacza Asn lub Aib; A17 oznacza Ser; Aig oznacza Met lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A31 oznacza Val, Nle, lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr lub Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
4. Peptyd według zastrz. i, znamienny tym, że A3 oznacza Ser; A7 oznacza Leu lub Cha; Ag oznacza Met lub Nle; Au oznacza Leu lub Cha; A12 oznacza Gly; A15 oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; Ai7 oznacza Ser; Aig oznacza Met lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A3i oznacza Val, Nle, lub Cha; A34 oznacza ehe, Tyr, lub Aib.
5. Peptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że co najmniej jedna z A7 i Ai oznacza Cha.
6. Peptyd według zastrz. i, znamienny tym, że peptydem jest [Cha7’^H] hPTH (I-34)NH2.
7. Peptyd według zastrz. i, znamienny tym, że jest nim [Cha7’ii, Nle⁸1¹⁸,Tyr³⁴]łP>TH (1-34)NH₂;

[Cha7^J1]hPTH(i-34)NH2; lub [Cha⁷]hPTH(I-34)NH2.
8. Peptyd według zastrz. 2, znamienny tym, że jest nim [Cha^7,H,i5] hPTH (i-34)NH2.
9. Peptyd według zastrz. i, znamienny tym, że co najmniej jedna z A15, A23, A24, A27, A2g, i A31 oznacza Cha; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
10. Peptyd według zastrz. i, znamienny tym, że jest nim [Nleg’ig, Cha27]hPTH (i-34)NH2, [ChaO⁸]hPTH(i-34)NH2, lub [Cha³¹]hPTH(i-34)NH2.

186 710
11. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest nim [Cha²³]hPTH(1-34)NH2, [Cha²4]hPTH(1-34414¾ [Cha2⁴’2*'³¹]hPTH(1-34)NH2; lub [Cha¹⁵]hPTH(1-34)NH2.
12. Peptyd według zastrz. 9, znamienny tym, że jest nim [Clu^⁸’³¹, Lys³⁽⁾]hPTH (1-34)NH2:lub [Cha2^XJi]hPTH(1-34)NH2.
13. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jedna z A3, A12, Ai6, A17, A19, i A34 oznacza Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
14. Peptyd według zastrz. 13, znamienny tym, że A3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; A8 oznacza Met, lub Nle; A11 i oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; Ai8 oznacza Met, lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A31 oznacza Val, Nle, lub Cha; A 34 oznacza Phe, Tyr, lub Aib.
15. Peptyd według zastrz. 13, znamienny tym, że A 3 oznacza Ser lub Aib; A7 oznacza Leu lub Cha; A8 oznacza Met, lub Nle; Au oznacza Leu lub Cha; A15 oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; A1 oznacza Met, lub Nle; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A31 oznacza Val, Nle, lub Cha; A34 oznacza Phe, Tyr, lub Aib.
16. Peptyd według zastrz. 14, znamienny tym, że co najmniej jedna z A3, A12, Ai6, A19 i A 34 oznacza Aib.
17. Peptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że co najmniej jedna z A3, A12, Aić, A17, A19 i A34 oznacza Aib.
18. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest nim [Aib*6]hPTH(1-34)NH2, [Aib 19]^TH(1-34)NH2, lub [Aib³⁴]hPTH(1^34)NH(2.
19. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest nim [Aib16’19]hPTH(1-34)NH2.
20. Peptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że jest nim [Aib3lhPTH(1-34)NH2.
21. Peptyd według zastrz. 17, znamienny tym, że jest nim [Aib”]hPTH(1-34)NH2, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
22. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jedna z A7, A11, A15, A23, A24’ A 27, A28, i A31 oznacza Cha i co najmniej jedna z A 3, A12, Aić, A17, A19 i A34 oznacza Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
23. Peptyd według zastrz. 22, znamienny tym, że A 3 oznacza Ser lub Aib; A 7 oznacza Leu lub Cha; A8 oznacza Met, lub Nle; A11 oznacza Leu lub Cha; Ai6 oznacza Asn lub Aib; Ai8 oznacza Met, lub Nle; A21 oznacza Val; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A31 oznacza Val, Nle, lub Cha; His; A34 oznacza Phe, Tye, lub Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
24. Peptyd według zastrz. 22, znamienny tym, że A3 oznacza Ser lub Aib; A 7 oznacza Leu lub Cha; A8 oznacza Met, lub Nle; A11 oznacza Leu lub Cha; A15 oznacza Leu lub Cha; A|6 oznacza Asn lub Aib; Ai8 oznacza Met, lub Nle; A21 oznacza Val; A27 oznacza Lys, hArg, lub Cha; A 31 oznacza Val, Nle, lub Cha; A 34 oznacza Phe, Tye, lub Aib.
25. Peptyd według zastrz. 23, znamienny tym, że co najmniej jedna z A 7 i A11 oznacza Cha i co najmniej jedna z A^, A19 i A 34 oznacza Aib.
26. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest nim [Cha7’11, Nle8^J8, Aib^’1⁹, kDTU/1 _ΊΛΥ\Π-Γ. l,,k rr^ko⁷·¹¹ KTU⁸’'8,31 Aik’⁶’¹^ -laYNTU..

19_η __r wediug zastrz. 25, znamienny tym, że iesi nim [Cha ' , Aio

Tyr34]hPTH( 1-34)NH2, lub [Cha'³', Nke*’^, Aib^^TyU^hPTHO^JNH·,.
27. Peptyd według zastrz. 25, znamienny tym, że jest nim [Cha', Aib*9]hPTH(1 34)NH2; [Cha7’ⁿ, Aib6]hPTH(1- 34)NH2; [Cha'·¹¹, Nle^^, Aib34]hPTH(1-34)NH2; lub [Cha'’, Aib^, Lys3°]hPTH(l-34)NH2.
28. Peptyd według zastrz. 23, znamienny tym, że co najmniej jedna z A24, A28, i A31 oznacza Cha i co najmniej jedna z Ai6 i A17 oznacza Aib.
29. Peptyd według zastrz. 1. znamienny tym, że jest nim [N^¹] hPTH(1-34)NH2, IhArg^hPTHO-UNIb, lub [Dap‘, Nle^^, Tyr34]hPTH(1-34)NH₂, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
30. Związek o wzorze [Glu²²'²⁵, Leu²³'²8’31, Aib²9, Lys²63°]hPTHrP(1-32)NH2

186 710
31. Peptyd o wzorce:

^H\ /Al Val A3 Glu Ile Gln-Ag-Ag-His-Asn-A^i-Aj^-Lys-His-Ai 5H

A-1 6~A-17 “Ali 8 Ά-19 ^_-rrg-Val~Glu-A23-A2 4 -Arg-Lys-A2 7-A2 «-GlnA30^-A3i-His-Asn-A34-NH2, którym A1 oznacza Ser lub Dap; A3 oznacza Ser lub Aib; Αη oznacza Leu; A₈ oznacza Met Iub Nle; Au oznacza Leu, Cha; A12 oznacza Gly Iub Aib; A15 oznacza Leu Iub Cha; A16 oznacza Asn Iub Aib; A17 oznacza Ser Iub Aib; A i₈ oznacza Met Iub Nle; A19 oznacza Glu Iub Aib; A 23 oznacza Trp Iub Cha; A24 oznacza Leu Iub Cha; A27 oznacza Lys, hArg, Iub Cha; A28 oznacza Leu Iub Cha; A30 oznacza Asp Iub Lys; A31 oznacza Val, Nle, Cha; A32 oznacza His; A33 oznacza Asn; A34 oznacza Phe, Tyr, Aib, Iub delecję; pod warunkiem, że co najmniej Aj oznacza Dap, A27 oznacza hArg, Iub A31 oznacza Nle; Iub ich farmaceutycznie dopuszczalna sól.
32. Peptyd określony wzorem

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-SerV,

Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-A22^_A23-Leu-His-His-Leu-ILe-AlaA30~Ile-His-Thr-Ala-NH2;

w którym

A22 oznacza Phe lub Cha; A23 oznacza Ph lub Cha; A30 oznacza Glu lub Lys; pod warunkiem, że co najmniej jedna z A22 i A23 oznacza Cha, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
33. Peptyd określony wzorem

Ala Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Serii/

I le-Gln-Asp-Leu-Arg-Ar g-Arg-A2 2-A2 -~Leu~A2--A2--27 7-A- θ A29-A30-A31-His-Thr-Ala-NH2, w którym w którym

A22 oznacza Phe, Glu, Aib lub Cha; A23 oznacza Phe, Leu, Lys lub Cha; A25 oznacza His, Aib lub Glu; A26 oznacza His, Aib lub Lys; A27 oznacza Leu lub Lys; A28 oznacza Ile, Leu lub Lys; A 29 oznacza Ala, Glu lub Aib; A30 oznacza Glu, Cha, Aib lub Lys; A 31 oznacza Ile lub Leu; pod warunkiem, że co najmniej jedna z A22, A23 Iub A30 oznacza Cha, oraz co najmniej jedna zA22, A25, A26, A29 Iub A30, oznacza Aib; lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
34. Peptyd według zastrz. 33, znamienny tym, że A22 oznacza Phe lub Cha; A23 oznacza Phe lub Cha; A25 oznacza His; A26 oznacza His; A27 oznacza Leu; A28 oznacza Ile; A29 oznacza Ala; A 30 oznacza Glu lub Lys; A 31 oznacza Ile.
35. Peptyd według zastrz. 33, znamienny tym, że A 22 oznacza Glu, Aib lub Cha; A23 oznacza Leu, Lys, lub Cha; A25 oznacza Aib lub Glu; A26 oznacza Aib lub Lys; A28 oznacza Leu, lub Lys; A 29 oznacza Glu lub Aib; A 30 oznacza Cha, Aib, lub Lys; A 31 oznacza Leu.

186 710

Ile-Gln-Asp-Leu -Arg-Arg Arg-Ah2-Ah 3-Leu-A25-2.2Q-27?7-1828 ”

A 29”A30-A3i-His-Thr-Ala-ira2, w którym A22 oznacza Phe, Glu, Aib lub Cha; A23 oznacza Phe, Leu, Lys lub Cha; A25 oznacza His, Aib Iub Glu; A 26 oznacza His, Aib Iub Lys; A27 oznacza Leu Iub Lys; A28 oznacza Ile, Leu, Lys; A 29 oznacza Ala, Glu Iub Aib; A 30 oznacza Glu, Cha, Aib Iub Lys; A 31 oznacza Ile Iub Leu; pod warunkiem, że co najmniej jedna z A23, A27, Iub A28 oznacza Lys; Iub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.
37. Peptyd weyiug edstrz.36, znamienny tym, że A22 OAiaczz Glu, Aib lub Cha; A23 oznacza Leu, Lys lub Cha; A25 oznacza Aib lub Glu; A26 oznacza Aib lub Lys; A28 oznacza Leu lub Lys; A29 oznacza Glu lub Aib; A 30 oznacza Cha, Aib, lub Lys; A 31 oznacza Leu.

Wynalazek dotyczy polipeptydu, hormonu przytarczycznego „PTH”, wytwarzanego przez gruczoły przytarczyczne. Dojrzała krążąca postać hormonu składa się z 84 reszt aminokwasowych. Biologiczne działanie PTH można odtworzyć poprzez fragment peptydzwe na terminalnym N. (np. reszt aminokwasowych 1 do 34). Związane z hormonem przytarczycznym białko („PTHrP”) jest białkiem mającym 139 do 173 aminokwasów z N-terminalną homzlogią do PTH. PTHrP wykazuje wiele biologicznych efektów PTH, w tym wiązanie ze zwykłym receptorem PTH/PTHrP. Tregear, i in., EndocriiKil., 93:1349 (1983). Zbadano peptydy PTH z wielu różnych źródeł, np., ludzkie, bydlęce, szczurze, kurze. Nissenson, i in., Receptor, 3:193 (1993).

PTH okazał się wpływać na masę i jakość kości. Dempster, i in., Endocrine Rev., 14:690 (1993); i Riggs, Amer. J. Med., 91 (Suplement 5B):37S (1991). Działanie anaboliczne podawanego dorywczo PTH zaobserwowano u mężczyzn i kobiet z osteoporozą w obecności lub bez jednoczesnej ter^^^^i anteresorpcyjmej. Slovik, i in., J. Bone Miner. Res., 1:377 (1986); Reeve, i in., Br. Med. J., 301:314 (1990); i Hesch, R-D., i in., Calcif. Tissue lnt’1, 44:176 (1989).