PL189453B1 - DNA genu kodującego zmutowaną syntazę 3-enolopiruwoiloszykimiano-5-fosforanową, zmutowane białko EPSPS, gen chimerowy, wektor do transformowania roślin, komórka roślinna, roślina oraz sposoby wytwarzania roślin i ich traktowania - Google Patents

Abstract

1. DNA genu kodujacego zmutowana syntaze 3-enolopiruwoiloszykimiano-5-fosfo- ranowa (EPSPS), który zawiera co najmniej jedna mutacje, polegajaca na podstawieniu treonina 102 — izoleucyna i zawiera dodatkowo mutacje polegajaca na podstawieniu pro- liny 106 seryna. 7. Zmutowane bialko EPSPS, które zawiera co najmniej jedno podstawienie treoniny 102 izoleucyna i podstawienie proliny 106 seryna. 8. Chimerowy gen zawierajacy sekwencje kodujaca, jak równiez elementy regulatoro- we w pozycjach 5' i 3', które sa heterologiczne i zdolne do funkcjonowania w roslinach, który zawiera jako sekwencje kodujaca co najmniej jedna sekwencje wedlug jednego z zastrz. od 1 do 6. 14. Sposób wytwarzania roslin ze zwiekszona tolerancja na herbicydy dzialajace na syn- taze EPSP, znamienny tym, ze komórki roslinne lub protoplasty transformuje sie genem wedlug jednego z zastrz. od 1 do 6 i transformowane komórki poddaje sie regeneracji. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest również chimerowy gen zawierający sekwencję kodującą, jak również elementy regulatorowe w pozycjach 5' i 3', które są heterologiczne i zdolne do funkcjonowania w roślinach, który zawiera jako sekwencję kodującą co najmniej jedną sekwencję DNA według wynalazku. W korzystnym wykonaniu wynalazku gen chimerowy zawiera promotor wirusa roślinnego, korzystniej zawiera promotor roślinny (np. a-tubuliny, histonu, intronów, aktyny, itd.).

Taki chimerowy gen będzie na przykład zawierał zgodnie z kierunkiem transkrypcji: region promotorowy, ewentualnie region peptydu sygnałowego, sekwencję genu kodującego enzym tolerancji wobec glifozatu w tym co najmniej jedną sekwencję DNA według wynalazku oraz nie podlegający translacji region sygnału poliadenylacji na końcu 3'.

Peptydy sygnałowe, które można zastosować w regionie peptydu sygnałowego mogą być jak wiadomo, pochodzenia roślinnego, przykładowo z kukurydzy, słonecznika, grochu, tytoniu i temu podobnych. Pierwszy i drugi peptyd sygnałowy mogą być identyczne, podobne lub różne. Każdy z nich może ponadto zawierać jediną lub więcej jednostek będących peptydem sygnałowym według europejskiego zgłoszenia patentowego EP0508909. Rolą takiego

189 453 charakterystycznego regionu jest umożliwienie uwolnienia dojrzałego lub natywnego białka, a w szczególności zmutowanego EPSPS, z maksymalną wydajnością w plastydach.

Korzystne jest, jeżeli region promotorowy chimerowego genu według wynalazku składa się z co najmniej jednego promotora genu lub fragmentu promotora, który jest wyrażany naturalnie w roślinach (tubulina, introny, aktyna, histon).

Niepodlegający translacji region sygnału terminacji transkrypcji na końcu 3' chimerowego genu może być dowolnego pochodzenia i jest zdolny do funkcjonowania w roślinach, na przykład pochodzenia bakteryjnego, tak jak ten z genu syntazy nopaliny, lub pochodzenia roślinnego, tak jak ten z genu histonu H4A748 z Arabidopsis thaliana według Europejskiego Zgłoszenia Patentowego (Europejskie Zgłoszenie 633 317).

Chimerowy gen według wynalazku może zawierać poza powyższymi niezbędnymi częściami, co najmniej jeden niepodlegający translacji region pośredni (łącznik), który może być umiejscowiony pomiędzy różnymi transkrybowanymi regionami opisanymi powyżej. Ten region pośredni może być dowolnego pochodzenia, na przykład pochodzenia bakteryjnego, wirusowego lub roślinnego.

Wynalazek dostarcza wektor oraz komórkę roślinną do transformowania roślin zawierające co najmniej jeden gen według wynalazku, jak również roślinę która jest otrzymana poprzez regenerację z komórki według wynalazku.

Zakres wynalazku obejmuje również sposób wytwarzania roślin ze zwiększoną tolerancją na herbicydy działające na syntazę EPSP, w którym komórki roślinne lub protoplasty transformuje się genem według wynalazku a transformowane komórki poddaje się regeneracji.

W zakres wynalazku wchodzi sposób traktowania roślin herbicydem działającym na syntazę EPSP, który to herbicyd stosuje się wobec roślin według wynalazku, korzystnie stosowanym herbicydem jest glifozat lub prekursor glifozatu.

Izolowanie cDNA kodującego EPSPS z kukurydzy:

Różne etapy, które doprowadziły do otrzymania cDNA dla EPSPS z kukurydzy, który posłużył jako substrat do wprowadzenia dwóch mutacji, są opisane poniżej. Wszystkie operacje opisane poniżej są podane jako przykład i wynikaj ją z wyboru dokonanego spośród różnych dostępnych metod prowadzących do uzyskania tego samego wyniku. Wybór ten nie ma wpływu na jakość wyniku, i konsekwentnie, biegły w tej dziedzinie może zastosować dowolną odpowiednią metodę dla uzyskania takiego samego rezultatu. Większość metod manipulowania fragmentami DNA jest opisanych w „Current Protocols in Molecular Biology” Tom 1 i 2, Ausbel F.M. i wsp., publikowane przez Greene Publishing Associates and WileyInterscience (1989) (w dalszej części odnośniki do protokołów opisanych w tej pracy będą oznaczone jako „odn. CPMB”). Operacje dotyczące DNA, które przeprowadzono zgodnie z protokołami opisanymi w tej pracy są mianowicie następujące: ligacja fragmentów DNA, traktowanie polimerazą DNA Klenowa i polimerazą DNA T4, otrzymywanie DNA plazmidowego z bakteriofaga 1, bądź jako minipreparaty, bądź jako preparaty na dużą skalę, oraz analizy DNA i RNA według technik, odpowiednio, Southern i Northern. Inne metody opisane w tej pracy są przedstawione poniżej oraz jedynie znaczące modyfikacje lub dodatki do tych protokołów będą opisane poniżej.

Przykład 1.

1. Otrzymanie fragmentu EPSPS Arabidopsis thaliana

a) Dwa 20-merowe oligonukleotydy o odpowiednich sekwencjach:

5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3'

5'-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' zostały zsyntetyzowane na podstawie sekwencji genu EPSPS Arabidopsis thaliana (Klee H.J. i wsp. (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Te dwa oligonukleotydy odpowiadają pozycjom, odpowiednio, 1523 do 1543 i 1737 do 1717, w publikowanej sekwencji i są w przeciwnej orientacji.

b) Całkowity DNA Arabidopsis thaliana (var. columbia) otrzymano z Clontech (numer katalogowy 6970-1)

c) 50 nanogramów (ng) DNA zmieszano z 300 ng każdego z oligonukleotydów i poddano 30 cyklom powielania w urządzeniu Perkin-Elmer 9600 w warunkach standardowego śro189 453 dowiska powielania, które jest zalecane przez producenta. Otrzymany w rezultacie fragment o długości 204 par zasad(bp) stanowi fragment EPSPS Arabidopsis thaliana.

2. Konstrukcja biblioteki cDNA z linii komórkowej BMS kukurydzy.

a) 5 g filtrowanych komórek mielono w ciekłym azocie, ekstrahowano całkowity kwas nukleinowy zgodnie z metodą opisaną przez Shure i wsp. z następującymi modyfikacjami:

- pH buforu do lizy doprowadzono do pH 9,0;

- po wytrąceniu izopropanolem, osad pochłonięto w wodzie i po rozpuszczeniu doprowadzano do 2,5 M LiCl. Po inkubacji przez 12 godz. w 0°C, osad, po odwirowaniu przez 15 min. przy 30000 g w0°C, ponownie upłynniano. Następnie powtarzano etap wytrącania LiCl. Upłynnione osady stanowią frakcję rNA całkowitego kwasu nukleinowego.

b) Frakcje RNA poli(A) otrzymano z frakcji RNA poprzez chromatografię na kolumnach z oligo(dT)-celulozą jak opisano w „Current Protocols in Molecular Biology”.

c) Synteza dwuniciowego cDNA, mającego syntetyczne końce Eco RI: przeprowadzono to zgodnie z protokołem dostawcy różnych odczynników potrzebnych do syntezy w postaci zestawu, „copy kit” z firmy In Vitrogen.

Dwa jednoniciowe i częściowo komplementarne oligonukleotydy o odpowiednich sekwencjach:

5' -AATTCCCGGG- 3'

5' -CCCGGG- 3' (ten drugi ufosforylowany) są dołączane poprzez ligację do tępo zakończonych dwuniciowych cDNA.

Takie dodanie adaptorów daje w rezultacie utworzenie miejsc SmaI, dołączonych do dwuniciowych cDNA i miejsc Eco RI w postaci lepkich końców na każdym końcu dwuniciowych cDNA.

d) Utworzenie biblioteki:

cDNA posiadające sztuczne lepkie końce EcoRI na swoich końcach są łączone w wyniku ligacji z DNA bakteriofaga 1 gt10, który został przecięty EcoRI i zdefosforylowany zgodnie z protokołem dostawcy New England Biolabs.

Porcje mieszaniny ligacyjnej były pakowane in vitro, przy użyciu ekstraktów do pakowania, a mianowicie Gigapack Gold, zgodnie z instrukcjami dostawcy; bibliotekę tę mianowano przy zastosowaniu bakterii E. coli C600hf1. Biblioteka otrzymana w ten sposób była amplifikowana i przechowywana zgodnie z instrukcjami tego samego dostawcy i stanowi bibliotekę cDNA z komórek BMS kukurydzy z zawiesiny.

3. Przeszukiwanie biblioteki cDNA z komórek BMS kukurydzy sondą EPSP z Arabidopsis thaliana.

Następujący poniżej protokół pochodzi z „Current Protocols in Molecular Biology” Tom 1 i 2, Ausbel F.M. i wsp., publikowany przez Greene Publishing Associates and WileyInterscience (1989) (CPMB). Pokrótce, około 10⁶ zrekombinowanych fagów wysiewa się na płytki LB przy średniej gęstości 100 fagów/cm². Zlizowane łysinki replikuje się w dwóch powtórzeniach na filtry Amersham Hybond N.

DNA wiązano z filtrami poprzez działanie UV przy 1600 kJ (Stratagene Stratalinker). Filtry prehybrydyzowano w 6 x SSC/0,1% SDS/0,25% odtłuszczone mleko przez 2 godz. w 65°C. Sondę EPSPS z Arabidopsis thaliana znakowano [^MP] metodą losowych starterów zgodnie z instrukcjami dostawcy (Pharmacia Ready to Go kit). Otrzymana aktywność specyficzna jest rzędu 10⁸ cpm na mg fragmentu. Po denaturacji przez 5 min. w 100°C, do mieszaniny prehybrydyzacyjnej dodaje się sondę i hybrydyzację kontynuuje się przez 14 godz. w 55°C. Filtry poddaje się fluorografii przez 48 godz. w -80°C na kliszy Kodak XAR5 i z ekranami wzmacniającymi Amersham Hyperscreen RPN. Dopasowanie pozytywnych plam na filtrach z płytkami, z których pochodziły, umożliwiło pobranie z płytek obszarów odpowiadających fagom, wykazującym pozytywną odpowiedź hybrydyzacyjną z sondą EPSPS z Arabidopsis thaliana. Ten etap wysiewania, przeniesienia, hybrydyzacji i odzyskiwania powtarza się, aż wszystkie miejsca na płytce z oczyszczonymi fagami są w 100% pozytywne w hybrydyzacji. Pojedyncza łysinka zlizowanych fagów jest następnie pobierana do podłoża do rozcieńczania λ (Tris-HCl pH 7,5; 10 MgSO4; 0,1 M NaCl; 0,1% żelatyna); ta zawiesina fagowa stanowi pozytywne klony dla EPSP z komórek BMS kukurydzy z zawiesiny.

189 453

4. Otrzymywanie i analiza DNA z klonów EPSP z komórek BMS kukurydzy z zawiesiny

Około 5 x 108 fagów dodawano do 20 ml bakterii CóOOlhfl przy wartości OD6oonm 2/ml i inkubowano przez 15 minut w 37°C. Zawiesinę tę rozcieńczano następnie w 200 ml bakteryjnego podłoża hodowlanego w kolbach Erlenmeyera 1-1 i wytrząsano w wytrząsąrce obrotowej przy 250 obr. na min.(rpm). Lizę obserwowano wówczas, gdy następowało wyklarowanie się podłoża, co było wynikiem lizy nieprzejrzystych bakterii i miało miejsce po około 4 godz. wytrząsania. Supematant był następnie traktowany tak, jak opisano w „Current Protocols in Molecular Biology”. Otrzymany DNA odpowiadał klonom EPSP z komórek BMS kukurydzy z zawiesiny.

Jeden do dwóch pg tego DNA przecięto EcoRI i rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym LGTA/TBE (odn. CPMB). Ostateczna weryfikacja polega na sprawdzeniu, czy oczyszczony DNA rzeczywiście wykazuje sygnał hybrydyzacyjny z sondą EPSPS z Arabidopsis thaliana. Po elektroforezie, fragmenty DNA przenoszono na filtr Amersham Hybond N zgodnie z protokołem do metody Southema w „Current Protocols in Molecular Biology”. Filtr hybrydyzowano z sondą EPSPS z Arabidopsis thaliana w warunkach opisanych w części 3 powyżej. Klon wykazujący sygnał hybrydyzacyjny z sondą EPSPS z Arabidopsis thaliana i zawierający najdłuższy fragment EcoRI ma wielkość oszacowaną z żelu na około 1,7 kb.

5. Otrzymanie klonu pRPA-ML-711

Dziesięć pg klonu fagowego zawierającego wstawkę 1,7 kb strawiono EcoRI i rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym LGTA/TBE (odn. CPMB). Fragment żelu zawierający wstawkę 1,7 kb wycinano z żelu po barwieniu Be T i fragment traktowano β-agarazą zgodnie z protokołem dostawcy, New England Biolabs. Oczyszczony DNA fragmentu 1,7 kb poddawano ligacji w 12°C przez 14 godz. z DNA plazmidu pUC 19 (New England Biolabs) przeciętym EcoRI, zgodnie z protokołem ligacji opisanym w „Current Protocols in Molecular Biology”. Dwa |il powyższej mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji porcji elektrokompetentnych E.coli DH10B; transformację przeprowadzono poprzez elektroporację przy zastosowaniu następujących warunków: mieszaninę kompetentnych bakterii i mieszaniny ligacyjnej wprowadzono do kuwety do elektroporacji o szczelinie 0,2 cm (Biorad) schłodzonej uprzednio do 0°C. Warunki fizyczne elektroporacji przy zastosowaniu elektroporatora wyprodukowanego przez Biorad były 2500 Voltów, 25 pF i 200 Ω. W tych warunkach, średni czas rozładowania się kondensatora jest rzędu 4,2 milisekund. Bakterie podnoszono następnie w 1 ml podłoża SOC (odn. CPMB) i wytrząsano przez 1 godz. w 200 rpm na wytrząsarce obrotowej w 15 ml probówkach Corning. Po wysiewie na podłoże LB/agar uzupełnione 100 pg/ml karbanicyliny, otrzymano minipreparaty bakteryjnych klonów, które hodowano przez noc w 37°C, zgodnie z protokołem opisanym w „Current Protocols in Molecular Biology”. Po strawieniu DNA EcoRI i rozdzieleniu poprzez elektroforezę w żelu agarozowym 0,8% LGTA/TBE (odn. CPMB), zachowywano klony posiadające wstawkę 1,7 kb. Ostateczna weryfikacja polega na sprawdzeniu, czy oczyszczony DNA rzeczywiście wykazuje sygnał hybrydyzacyjny z sondą EPSPS z Arabidopsis thaliana. Po elektroforezie, fragmenty DNA przenoszono na filtr Amersham Hybond N zgodnie z protokołem do metody Southema opisanym w „Current Protocols in Molecular Biology”. Filtr hybrydyzowano z sondą EPSPS z Arabidopsis thaliana w warunkach opisanych w części 3 powyżej. Klon plazmidowy wykazujący sygnał hybrydyzacyjny z sondą EPSPS z Arabidopsis thaliana otrzymano na dużą skalę i DNA otrzymany w rezultacie lizy bakterii oczyszczano na gradiencie CsCl tak, jak opisano w „Current Protocols in Molecular Biology”. Oczyszczony DNA częściowo sekwencjonowano przy użyciu zestawu Pharmacia zgodnie z instrukcjami dostawcy i stosując jako startery uniwersalne startery M13, prosty i odwrócony, zamówione u tego samego dostawcy. Otrzymana częściowa sekwencja pokrywa około 0,5 kb. Wywodząca się z niej sekwencja aminokwasowa w regionie dojrzałego białka (około 50 reszt aminokwasowych) wykazuje 100% identyczności z odpowiadającą sekwencją aminokwasową dojrzałej EPSPS opisanej w Patencie USA USP 4 971 908. Ten klon, odpowiadający fragmentowi EcoRI o wielkości 1,7 kb w DNA EPSP z komórek kukurydzy bMs, został oznaczony pRPA-ML711. Pełną sekwencję tego klonu określono z obu nici przy zastosowaniu protokołu z zestawu Pharmacia i zsyntetyzowanych komplementarnych oligonukleotydów oraz tych o przeciwnej

189 453 orientacji, każdy z nich o długości około 250 bp. Kompletna sekwencja otrzymana z tego klonu o długości 1731 bp jest przedstawioną jako SEK NR ID: 1.

6. Otrzymanie klonu pRPA-ML-715

Analiza sekwencji klonu pRPA-ML-711, a szczególnie porównanie pochodzącej z niej sekwencji aminokwasowej z sekwencją z kukurydzy, wykazuje przedłużenie sekwencji o 92 bp poprzedzających kodon GCG kodu^y INH-końćową ^munę w dojjrzaej cczści EPSPS z kukurydzy (Patent USA USP 4971908). Podobnie, obserwuje się przedłużenie sekwencji o 288 bp za kodonem AAT kodującym CoOH-koccową asparaginę w dojrzałej części EPSPS z kukurydzy (Patent USA USP 4971908). Te dwie części mogłyby odpowiadać, w przypadku przedłużenia NH^koćcowego, części sekwencji peptydu sygnałowego dla lokalizacji wplastydach, a w rrecradku przedłużenia COOH-koćcowego, nie podlegającemu translacji regionowi 3' cDNA.

W celu otrzymania cDNA kodującego dojrzałą część cDNA EPSP z kukurydzy, jak opisano w USP 4971908, przeprowadzono następujące operacje:

a) Usunięcie nie podlegającego translacji regionu 3': konstrukcja pRPA-ML-712:

Klon pRPA-ML-711 przecięto enzymem restrykcyjnym AseI i koćce uzyskane w wyniku tego cięcia przekształcono w tępe poprzez działanie fragmentu Klenowa polimerazy I DNA, zgodnie z protokołem opisanym w CPMB. Następnie przeprowadzono cięcie enzymem restrykcyjnym Sacll. DNA uzyskany w wyniku tych operacji rozdzielono poprzez elektroforezę w 1% żelu agarozowym LGTA/TBE (odn. CPMB).

Fragment żelu zawierający wstawkę „Asel-tępe koćce/Sacll” o wielkości 0,4 kb wycięto z żelu i oczyszczono zgodnie z protokołem opisanym powyżej w części 5. Klon DNA pRPA-ML-711 przecięto enzymem restrykcyjnym HindIII w miejscu HindIII znajdującym się w polilinkerzd wektora do klonowania pUC19 i otrzymane w rezultacie cięcia koćce przekształcono w tępe poprzez działanie fragmentu Klenowa polimerazy I DNA. Następnie przeprowadzono cięcie enzymem restrykcyjnym SacII. DNA uzyskany w wyniku tych operacji rozdzielono poprzez elektroforezę w 0,7% żelu agarozowym LGTA/TBE (odn. CPMB).

Fragment żelu zawierający wstawkę „HindIII-tępe koćce/SacII” o wielkości około 3,7 kb żelu i oczyszczono zgodme z protokołem opisanym powyżej w części 5.

Dwie wstawki poddano ligacji i 2 pl mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli DH10B tak, jak opisano powyżej w części 5.

Plazmidowy DNA z różnych klonów analizowano zgodnie z procedurami opisanymi dla pRPA-ML-711. Jeden z plazmidów z wyselekcjonowanych klonów zawiera wstawkę EcoRIHindIII o długości około 1,45 kb. Sekwencja koćców tego klonu wykazała, że koćce 5' wstawki odpowiadają dokładnie odpowiadającym im koćcom pRPA-ML-711 i że koćce 3' mają następującą sekwencję:

5' ...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3

Sekwencja podkreślona odpowiada kodonowi dla COO^koćcowego aminokwasu asparaginy, a następny kodon odpowiada kodonowi stop dla translacji. Dalsze nukleotydy odpowiadają sekwencji elementów sekwencji polilinkera pUC19. Klon ten, zawierający sekwencję pRPA-ML-711 do miejsca terminacji translacji dojrzałej EPSPS z kukurydzy, za którym znajdują się sekwencje polilinkera pUC19 do miejsca HindIII, nazwano pRPA-ML-712.

b) Modyfikacja koćca 5' pRPA-ML-712: konstrukcja pRPA-ML-715:

Klon pRPA-ML-712 przecięto enzymami restrykcyjnymi PstI i HindIII. DNA uzyskany w wyniku tych manipulacji rozdzielono poprzez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym LGTA/TBE (odn. CPMB). Fragment żelu zawierający wstawkę PstI-EcoRI o wielkości 1,3 kb wycięto z żelu i oczyszczono zgodnie z protokołem opisanym powyżej w części 5. Wstawkę tę poddano ligacji w obecności ekwimolarnych ilości każdej z dwóch częściowo komplementarnych sekwencji:

Oligo 1: 5-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3'

Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' jak również w obecności DNA plazmidu pUC19, strawionego enzymami restrykcyjnymi BamHI i HindIII.

Dwa pl mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli DH10B tak, jak opisano powyżej w części 5. Po przeprowadzeniu analizy plazmidowego DNA z różnych klonów

189 453 zgodnie z procedurą opisaną powyżej w części 5, jeden z klonów zawierający wstawkę o długości około 1,3 kb zachowano i poddano dalszej analizie. Sekwencja końca 5' tego wyselekcjonowanego klonu wykazała, że sekwencja DNA w tym regionie jest następująca: sekwencja polilinkera pUC19 od miejsca EcoRI do miejsca BamHI, następnie sekwencja oligonukleotydów użytych do klonowania, a następnie reszta sekwencji obecnej wpRPA-ML-712. Klon ten nazwano pRPA-ML-713. Klon ten ma kodon ATG dla metioniny znajdujący się w obrębie miejsca NcoI przed kodonem dla N-końcowej alaniny w dojrzałej syntazie EPSP. Ponadto, zachowane zostały kodony dla alaniny i glicyny na końcu N, ale ze zmodyfikowaną zmienną trzecią zasadą: z wyjściowych GCGGGt powstały zmodyfikowane GCCGGC.

Klon pRPA-ML-713 przecięto enzymem restrykcyjnym HindIII i otrzymane w rezultacie cięcia końce przekształcono w tępe poprzez działanie fragmentu Klenowa polimerazy I DNA. Następnie przeprowadzono cięcie enzymem restrykcyjnym SacI. DNA uzyskany w wyniku tych manipulacji rozdzielono poprzez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym LGTA/TBE (odn. CPMB). Fragment żelu zawierający wstawkę „HindIII-tępe końce/SacI” o wielkości około 1,3 kb wycięto z żelu i oczyszczono zgodnie z protokołem opisanym powyżej w części 5. Wstawkę tę poddano ligacji w obecności DNA plazmidu pUC19 strawionego endonukleazą restrykcyjną XbzI i otrzymane w rezultacie cięcia końce przekształcono w tępe poprzez działanie fragmentu Klenowa polimerazy I DNA. Następnie przeprowadzono cięcie enzymem restrykcyjnym SacI. Dwa pl mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji E. coli DH10B tak, jak opisano powyżej w części 5. Po przeprowadzeniu analizy plazmidowego DNA z różnych klonów zgodnie z procedurą opisaną powyżej w części 5, jeden z klonów zawierający wstawkę o długości około 1,3 kb zachowano i poddano dalszej analizie. Sekwencja końców tego wyselekcjonowanego klonu wykazała, że sekwencja DNA jest następująca: sekwencja polilinkera pUC19 od miejsca EcoRI do miejsca SacI, następnie sekwencja oligonukleotydów użytych do klonowania z których usunięte zostały 4 pary zasad GATCC z oligonukleotydu 1 opisanego powyżej, a następnie reszta sekwencji obecnej w pRPA-ML-712 do miejsca HindIII i sekwencja polilinkera pUC19 od XbaI do HindIII. Klon ten nazwano pRPA-ML-715.

7. Otrzymanie cDNA kodującego zmutowaną EPSPS z kukurydzy

Wszystkie etapy mutagenezy przeprowadzono przy użyciu zestawu do mutagenezy z firmy Pharmacia U.S.E zgodnie z instrukcjami dostawcy. Zasada działania tego systemu mutagenezy jest następująca: plazmidowy DNA denaturuje się termicznie ireasocjuje w obecności nadmiaru molowego, z jednej strony oligonukleotydu do mutagenezy, a z drugiej strony oligonukleotydu umożliwiającego eliminację pojedynczego miejsca dla enzymu restrykcyjnego obecnego w polilinkerze. Po etapie reasocjacji, przeprowadza się syntezę komplementarnej nici poprzez działanie polimerazy DNA T4 w obecności ligazy DNA T4 i białka genu 32 w odpowiednim dostarczonym buforze. Produkt syntezy inkubuje się w obecności enzymu restrykcyjnego, którego rozpoznawane miejsce miało zniknąć w wyniku mutagenezy. Szczep E. coli mający mutację mutS stosuje się jako gospodarza do transformacji tym DNA. Po hodowli w podłożu płynnym, izoluje się całkowity plazmidowy DNA i inkubuje w obecności enzymu restrykcyjnego stosowanego uprzednio. Po tym działaniu, szczep E. coli DH10B jest używany jako gospodarz do transformacji. Z wyizolowanych klonów otrzymuje się plazmidowy DNA i sprawdza się obecność mutacji poprzez sekwencjonowanie.

A) - modyfikacja miejsc iub cekwencji bez zasadniczej zcmany cechy oporności kι.kuryj dzy związanej z EPSPS na produkty, które są współzawodniczącymi inhibitorami aktywności srntazr EPSP: eliminacja z pRPA-ML-715 wewnętrznego miejsca Nco-I.

Przy numeracji sekwencji pRPA-ML-715 przyjęto arbitralnie jzkc pierwszą zasadę pozycję 1 w N-końcowym Ccecnin ζΙζ^μ^^ GCC. Sekwencja ta ma miejsce NcoI w pozycji 1217. OligonkClnotyd do modyfikacji miejsca ma sekwencję:

5'-CCACAGGATGGCGATGGCC'TTCTCC-3' .

Po zseCwencjonowaniu zgodnie z odnośnikami podanymi powyżej, odczyt sekwencji po mutzgenezie odpowiadał użytemu cligoeuklnotydowi. Miejsce NcoI rzeczywiście zostało wyeliminowane, z translacja tego regionu do aminokwasów zachowuje wyjściową sekwencje obecną w pRPA-ML-715.

189 453

Klon ten oznaczono jako pRPA-ML-716.

Sekwencja tego klonu o długości 1340 bp jest przedstawiona jako SEK NR ID: 2 i SEK NR ID: 3.

B) - modyfikocjf sakwencji umożliwiażące awiększenie oporności kukuryuzy zwićyanej z EPSPS na produkty, które są współzawodniczącymi inhibitorami aktywności syntazy EPSP.

Użyto następujących oligokuZleutydów:

a) mutacja Thr 102 -> Ile.

5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'

b) mutacja Pro 106 —> Ser.

5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

c) mutacje Gly 101 -> Ala i Thr 102 -> Ile.

5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'

d) mutacje Thr 102 -—Ile i Pro 106 -> Ser.

5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

Po ustaleniu sekwencji, odczyt sekwencji po mutagenezie trzech mutuwakykh fragmentów był identyczny z wyjściową sekwencją DNA pRPA-ML-716, z wyjątkiem wutagenizowanego regionu, który odpowiada użytym uligokuZleotydom do mutagenizacji. Klony te zostały oznaczone: pRPA-ML-717 dla mutacji Thr 102 Ile, pRPA-ML-718 dla mutacji Pro 106 — Ser, pRPA-ML-719 dla mutacji Gly 101 — Ala i Thr 102 -> Ile oraz pRPA-ML-720 dla mutacji Thr 102 — Ile i Pro 106 -> Ser.

Sekwencja pRPA-ML-720 o długości 1340 bp jest przedstawiona jako SEK NR ID: 4 i SEK NR ID: 5.

Wstawka NcuIyHikdIΠ o wielkości 1395 bp jest podstawą wszystkich kukstruktów użytych do transformacji roślin w celu wprowadzenia oporności na herbicydy, które są współzawodniczącymi inhibitorami aktywności syntazy EPSP, a w szczególności oporności na glifozat. Wstawką będzie oznaczona w pozostałej części opisu jako „podwójny mutant EPSPS z kukurydzy”.

Przykład 2

Tolerancja na glifozat różnych mutantów in vitro

2.a: Ekstrakcja syntazy EPSP

Różne geny syntazy EPSP są wprowadzane w postaci kasety NcoI-HindIII do wektora plazmidowego pTrc99a (Pharmacia, odn: 27-5007-01), przeciętego NcoI i HindIII. Zrekowbinowane bakterie E. coli BH10B kadpradukujące różne syntazy EPSP somkuje się w 40 ml buforu na 10 g osadzonych komórek i przemywa się tym samym buforem (200 mM Tris-HCl pH 7,8, 50 mM werkaptoetαkol, 5 wM EDTA i 1 wM PMSF), do którego dodawany jest 1 g śK)ΠnikylopiiΌiii^oi^u. Zawiesinę miesza się przez 15 minut w 4°C, a następnie odwironywuje się przez 20 minut przy 27000 g i w 4°C.

Do supematantu dodawany jest siarczan amonu, do uzyskania 40% nasycenia siarczanem amonu. Mieszaninę adwirowywuje się przez 20 minut przy 27000 g i 4°C. Do nowego supematantu dodawany jest siarczan amonu do uzyskania 70% nasycenia siarczanem amonu. Mieszaninę adnirowywuje się przez 30 minut w 27000 g i 4°C. Syntazę EPSP obecną w tym osadzie białkowym podnosi się w 1 ml buforu (20 mM Tris-HCl pH 7,8 i 50 wM werkaptoptakol). Roztwór ten dializuje się przez noc wobec dwóch litrów tego samego buforu w 4°C.

2.b: Aktywność enzymatyczna

Aktywność każdego enzymu, jak również jego oporność na glifozat, mierzono in vitro przez 10 minut w37°C w następującej mieszaninie reakcyjnej: 10 mM kwas maleinowy pH 5,6, 1 mM fasfoenolupirogrokian, 3 mM szykimiaka-3-fosforan (przygotowany według Knowles P.F. i Sprinson D.B. 1970. Methods in Ekzywal. 17A, 351-352 ze szczepu Aerobacter aerogenes ATCC 25597) i 10 mM fluorek potasu. Ekstrakt enzymatyczny dodaje się w ostatnim momencie, po dodaniu gUi^Ou, którego końcowe stężenie waha się od 0 do 20 mM.

Aktywność jest mierzona poprzez oznaczenie fosforanu uwolnionego zgodnie z techniką według Tausky H.A. i Shorr E. 1953. J. Biol. Chew. 202, 675- 685.

W tych warunkach, enzym typu dzikiego (WT) jest hamowany w 85% przy stężeniu glifozatu 0,12 wM. Przy tym stężeniu, zmutowany enzym, nazywany Ser 106, jest hamowany

189 453 w 50%, a inne trzy mutanty, Ileł02, Ilel02/Serl06 i Ala101/Ile102 wykazują małe lub brak hamowania.

Stężenie glifozatu musi być zwiększone dziesięcioktrotnie, to jest do 1,2 mM. w celu uzyskania 50% hamowania zmutowanego enzymu Ile 102, przy czym mutanty Ilel02/Serl06 i Ala/Ile oraz Ala nadal nie są hamowane.

Należy zauważyć, że aktywność mutantów Ala/Ile i Ala nie jest hamowana aż do stężenia glifozatu 10 mM oraz, że dla mutanta Ilel02/Serl06 nie jest ona zmniejszona nawet wtedy, kiedy stężenie glifozatu zostanie podwojone, to jest do 20 mM.

Przykład 3

Oporność transformowanych roślin tytoniu

1-1- Transformacja

Wektor pRPA-RD-173 wprowadza się do szczepu Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood i wsp., 1987), niosącego kosmid pTVK291 (Komari i wsp., 1986). Technika transformacji opiera się na procedurze Horsh i wsp. (1985).

1-2- Regeneracja

Regeneracja tytoniu PBD6 (źródło SEITA Francja) z eksplantów liściowych przeprowadza się na podłożu podstawowym Murashige i Skoog (MS), zawierającym 30 g/l sacharozy, jak również 200 pg/ml kanamycyny. Eksplanty liściowe pobiera się z roślin hodowanych w szklarni lub in vitro i transformuje zgodnie z techniką dysków liściowych (Science, 1985, tom 227, str. 1229-1231) w trzech kolejnych etapach: pierwszy obejmuje indukcję korzeni na podłożu uzupełnionym 30 g/l sacharozy, zawierającym 0,05 mg/l kwasu naftylooctowego (NAA) i 2 mg/l benzyloaminopuryny (BAP) przez 15 dni. Pędy utworzone podczas tego etapu rozwijają się następnie przez 10 dni w czasie hodowli na pożywce MS uzupełnionej 30 g/l sacharozy, ale nie zawierającej hormonu. Następnie pędy, które się rozwinęły, pobiera się hoduje na pożywce ukorzeniającej MS o średniej zawartości soli, witamin i cukru i nie zawierającej żadnego hormonu. Po około 15 dniach, ukorzenione pędy przenosi się do gleby.

1-3- Oporność na glifozat

Dwadzieścia transformowanych roślin zregenerowano i przeniesiono do szklarni dla konstruktów pRPA-RD-173. Rośliny te traktowano w szklarni w stadium 5 liści wodną zawiesiną RoundUp, odpowiadającą 0,8 kg aktywnego glifozatu na hektar.

Wyniki pozostają w zgodzie z obserwacjami oznak fototoksyczności zaobserwowanymi 3 tygodnie po działaniu. W tych warunkach stwierdzono, że rośliny transformowane konstruktem pRPA-RD-173 wykazują bardzo dobrą tolerancję, podczas gdy kontrolne rośliny nie transformowane są całkowicie zniszczone.

Wyniki te pokazują wyraźnie ulepszenie genu kodującego tolerancję na glifozat dzięki zastosowaniu chimerowego genu według wynalazku.

Przykład 4:

Transformacja i selekcja komórek kukurydzy

Komórki kukurydzy BMS (Black Mexican Sweet) w wykładniczej fazie wzrostu bombarduje się konstruktem pRPA-RD-130 zgodnie z zasadami i protokołem opisanym przez Klein i wsp., 1987 (Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. i Sandorf J.C. (1987): High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells, Nature, Tom 327, str. 70-73).

Dwa dni po bombardowaniu, komórki przenosi się do tej samej pożywki zawierającej mM N-(fosfonometylo)glicynę.

Po 8 tygodniach selekcji na tej pożywce, pobiera się rozwijający się kalus, a następnie powiela się i analizuje poprzez PCR, i wyraźnie pokazuje obecność chimerowego genu OTP-EPSPS.

Komórki nie bombardowane i hodowane na tej samej pożywce zawierającej 2 mM N-(fosfonometylo)glicynę są blokowane przez herbicyd i nie rozwijają się.

Transformowane rośliny według wynalazku mogą być użyte jako wyjściowe do otrzymania linii i hybryd mających cechy fenotypowe odpowiadające ekspresji wprowadzonego chimerowego genu.

Opis konstruowania plazmidów pRPA-RD-124: Dodanie sygnału poliadenylacji „nos” do pR-PA-ML-720 z utworzeniem kasety do klonowania, zawierającej podwójnie zmutowany gen EPSPS (Thr 102 -> Ile

189 453 i Pro 106 -> Ser). pRPA-ML-720 trawi się HindlR i poddaje działaniu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E.coli w celu wytworzenia tępych końców. Wykonuje się drugie trawienie Ncol i oczyszcza się fragment z EPSPS. Gen EPSPS poddaje się następnie ligacji z oczyszczonym pRPA-RD-12 (kaseta do klonowania zawierająca sygnał poliadenylacji syntazy nopaliny), z utworzeniem pRPA-RD-124. W celu otrzymania użytecznego oczyszczonego wektora, konieczne było uprzednie strawienie tego ostatniego SalI, traktowanie polimerazą DNA Klenowa, a następnie trawienie po raz drugi NcoI.

pRPA-RD-125: Dodanie zoptymalizowanego peptydu sygnałowego (OTP) dopRPA-RD-124 z utworzeniem kasety do klonowania, zawierającej gen EPSPS, na plazmidach. pRPA-RD-7 (Europejskie Zgłoszenie Patentowe 652286) trawi się SphI, traktuje polimerazą DNA T4, a następnie trawi SpeI i oczyszcza się fragment z OTP. Ten fragment z OTP klonuje się w pRPA-RD-124, który został uprzednio strawiony NcoI, traktuje polimerazą DNA Klenowa w celu usunięcia wystających części 3', a następnie trawi się SpeI. Klon ten następnie sekwencjonuje się w celu upewnienia się, że fuzja translacyjna pomiędzy OTP i genem EPSPS jest prawidłowa. Otrzymuje się w ten sposób plazmid pRPA-RD-125.

pRPA-RD-130: Dodanie sekwencji promotora histonu H3CV4 z kukurydzy i intronu adh1 zpRPA-RD-123 (Zgłoszenie Patentowe EP 507698) do pRPA-RD-125 z wytworzeniem kasety do ekspresji genu podwójnego mutanta EPSPS w tkankach roślin jednoliściennych. pRPA-RD-123 (kaseta zawierająca promotor histonu H3CV4 z kukurydzy, połączony z intronem adh1, trawi się NcoI i SacI. Następnie fragment DNA, zawierający promotor pochodzący zpRPA-RD-123, oczyszcza się i poddaje ligacji z pRPA-RD-125, który został uprzednio strawiony NcoI i SacI.

pRPA-RD-159: Dodanie podwójnego promotora histonu H4A748 z Arabidopsis (Zgłoszenie Patentowe EP 507698) do pRPA-RD-125, z wytworzeniem kasety do ekspresji „OTPgenu podwójnego mutanta EPSPS” w tkankach roślin dwuliściennych. pRPA-RD-132 (kaseta zawierająca podwójny promotor H4A748 (Zgłoszenie Patentowe EP 507698)) trawi się NcoI i SacI. Oczyszczony fragment DNA z promotorem klonuje się następnie w pRPA-RD-125, który został uprzednio strawiony EcoRI i SacI.

pRPA-RD-173: Dodanie genu „promotor H4A748-OTP-gen podwójnego mutanta EPSPS” z pRPA-RD-159 do plazmidu pRPA-BL-150A (Europejskie Zgłoszenie Patentowe 508909), z utworzeniem wektora do transformacji Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-159 trawi się NotI i traktuje polimerazą Klenowa. Fragment ten klonuje się następnie w pRPA-BL-150A przy użyciu SmaI.

189 453

Lista sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający: Lebrun Michael,

De Rosę Richard T, Sailland Alain (li) Tytuł zgłoszenia: Zmutowana syntaza 3-enolopiruwoiloszyklmlano-5-fosforanowa gen kodujący to białko i transformowane rośliny zawierające ten gen.

(m) Liczba sekwencji: 5 (iv) Adres do korespondencji (A) Adresat: Fracois Chretien (B) Ulica: 1420 rue Pierr Baizet (C) Miasto: Lyon Cedex 09 (D) Państwo: Francja (E) Kod pocztowy: 69263 (v) Sposób odczytu komputerowego:

(A) Typ nośnika: Dyskietka

IB) Komputer: zgodny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release »1.0, Version #»1.25 (vi) Data obecnego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia:

(B) Data zgłoszenia:

(C) Klasyfikacja:

(viii) Informacje o rzeczniku/pełnoraocniku (A) Nazwisko: Chretien Francois

Informacje telekomunikacyjne:

(A) Telefon: (33)72292646 IB) Telefax: (33)72292843 (2) Informacja o SEK NR ID: 1:

(1) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1713 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (vi) Źródło wyjściowe (A) Organizm: Zea mays (B) Szczep: Black Mexican Sweet (F) Typ tkanki: Kalus (vii) Źródło pośrednie (A) Biblioteka: lambda gtlO (B) Klon: pRPA-ML-711 (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 1:

(xii seouorc ccscnimoNt sco 10 miii AAICAA3TTC M9CASSAAA CM9C2KKAC CUCARAOO AATTCOOOCC COGOOSOOIC aicobsobcc eccABoesos ooosoootoc wooeonec osmcmmc swctoctcc ocatcamsa gatctcoooc αοοβιοαμο τοοοοοββκ auuRoeeiT kwmooba TOCTOCEMCT OSCCeoORC TOOBA0BOBA CMCASTOOT TOKZM0CH CTWACWta ABCMCTOCA CZACAIGCTC OSCOCCTTeA OCAC1CTTCO TCTCTCiaTC 6M0OOBACA AAOCMOCAA AASAOCMIA βΠσΠΟΟΟΓ <RQBMSAAA βΤΤΟΚΑΟΠ «OMMCZA aasaogaast ooacicnc ηβοβαναβ crasAAciac λμοοβοοοι TiwemcRa CICrZACIGC TGCMSMSA AAlOCAACrT AdUtUdlCA TOOCTACCA MMS6M00 *0

120

1(0

240

MO

MO

420

4(0

189 453 m\mvcoskt -rrza-rwn-rr. <τγτ«γγογλ« -kamjcmict tnmiKtnM «rtwwi t

TCCTTCłlCAC TCACT.S?XA ».'_PU fUi W TCAATCGAAT OOGAflmCTA CCTOCTGSCA aojtcaacct trrcr-Tcrcc atomowtc ΛΠΤΑσττπΑβ -roccrocm atogctgctc TmoGCTCT Τ'ϊ'ΛςΛϊτ^, ΟΑΛΑΤΤΟΑΑΛ TCATTGATAA ATTAAtCTCC ATTCOGTAOG -rCBAAATGAC ATTGAGATTG ATCOtfaerr ττοοτοτοαα «ocmsmsckt TCTCATACCT COGAOWIATT CTACATTAAG GGACGTCAAA AATACAACTC COCTAAAAAT eOCIAICTTG AACSTGATGC CTCMCOOCA AIA.W1TCT TOCCTGCTOC TCGAATTMCT OGUOOOmO TGACTGTSSA ASGTTGTGGC AOCACCACTT TCCMCCTGA ΤΟΚΜΟςΠ 0CT6MHZM: TGGAGATGAT GGCAGCGAAG CTIACATOGA COGAGACTAG CGTAACTGTT ACTOGOOCAC OGOGGGAGOC ΜΤΙΜβΜί AAACA0CI6A AGOOGATTGA TCTCTMATG AAGAAGKTOC CTGATGTOSC CAISACTCR CCTCTCGTTG OOCICTTTOC OOKMOOOOS ACACOCATCA GAGAOGTGGC TTCCTOGAGA GTAAAGGAGA COSASM3GKZ OGTTCCGAIC OGGAOSGAGC waaoact asomaact meMM esacsonsiA ctaaaaac «oaoasoaos agaagctcaa cctcaocgog jacataaet na&aetan. oukatoooc juaeocrrer OOCTTGCOGC CTGTGCGGAC CTCCOOGTCA «ΜΟΟΒΟΟΑ CCCTOGOTOC ΚΧΒΒΒΜΟΛ CCI H.LAAUA CTACTTCCA3 GTOCTCAGGA CTTTOTTCAA CAATTAAZAA ACOSTOOGAT

ACTACCACGC ACCTTGATTG AAGTCAIAGG CnCłUCtttA CGAAATACAT ΤΚΤΠΤΟΤΤ ciGirmci crrrcAOGGą attaagtttt «actciczaa camamt ttctagcaag TTTciArrrc ggatcttaag mctoact gtaasccaaa ττκαιτκλ agagtcgttc

GTTGGAATAA TAAGAATAAT AAATTACGTT TCAGTGAAAA ΑΛΛΑΑΑΛΑΑΑ AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAOOOGGGAA TTC (2) Informacja o SEK NR ID: 2:

(il Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1340 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici, podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA

S40 •<00 •to

I?0

180

840

MO •40

1020

1080

1140

1200

IZM

1120

1180

1440

1500

1580

1420

1480 :UJ (vi) Źródło wyjściowe (A) Organizm: Zea mays (B) Szczep: Black Mexican Sweet (vii) Źródło pośrednie (B) Klon: pRPA-ML-H6 (ix) Cechy:

(A) Naza/Klucz: CDS (B) Lokalizacja 6..1337 (xi) O>is sekwencji: SEK NR ID: 2:

^OCATG Alf Cl⁰ ff fi® **ί° ^{8,8 818} °° ^{005 ATC} **° ®*^{fl ATC}

Ala Gly Ala Cłu elu XI· Val Łau Ola frt II· t/f Olu II· ^{1 5} 10 ISf cff iff 5T? ί*® f^{18 008 888} ^⁰⁸ **° ^^{35 m} oc coc rac r Gly Thr v»l Lyw l«u Oly g._r Łj· 1·« _{tag λΛη} *** χχ.

¹⁵ ιο » ao

CTC CTA CTC CCC CCC CTC TOC SAG OGG fa MA OTO CTT SM AK CTC

Ł«u C«u Lau Ala Ala Lau »r Olu Oly Thr łhr Val Val Aap Am Łau ” 40 45 f” f?^{8 WT 8,8 08 TAC m CK} aaa oac m mso fet cn

Lau Am Mr Glu Α·ρ Val Hl« Trr Mat Łm βίτ Al· Łau Λ»» «IX Łeu «5

141

Ul

189 453

O7T	CTC	TCT	'JTC	gaa	nor*
Gly	L«-u	3«c* •i*.	Ya 1	Glw	Alł
<xvz	wr		GGA	AAŁŻ	TTC
-ly	-A 40	Gly	U/	Lyx	Ptw

GAC	AAA	GCT	GCC	AAA	AGA
Airp	Łya	Al.	Al*	Uyu	Arg
	70
CSA	CTT	GM>	gat	GCT	AAA
Fru	tfal	Glu	Arp	Ala	Ly«i
»					»

net <=τλ «τη σττ ;j«

Al. tfal tf.il VjI »S :<tr lis

383

431

473

327

S7S

623

671

719

767

815

863 *11 *5*

1007

10SS

1103

1131 w; 'ma στη cmi

Glu <5Lu ''.li OLn

CTC TTC	TTC GGG AAT	GCT Ala 100	GGA ACT GCA	ATG CGO CCA TTG ACA GCA GCT Nat Arg Pru Łau Thr Ala Ala
Łau «5	Pha	Łau	Gly Asn	Gly Thr	Alt
103	UO
GTT	ACT	CCI	GCT GGT	GGA	AAT GCA	ACT	tac ora en gat gga	GTA CCA
Val	Thr	Ala	Ala Gly Gly	Aan Ala	Thr	Tyr tfal Łau Aap Gly	tfal Pro
			115				120	123
MA	ATG	AGO	GM AGA	ooc	ATT OOC	GAC	TTG GTT GTC GGA TTG	AM CM
Arg	Mac	Arg	Glu Arg	Pro	Ile Gly X»P	Łau tfal tfal Gly Łau Lya Gin
			130			135	140
CTT	GGT	GGA	GAI GTT	GAT	TCT TTC CTT	GGC ACT GAC TCC CCA OCT ΟΠ
Łau	Gly Ala	Aap V.l	Aap Cya Pha	L*u	Gly Thr Aap Cya Pro	Pro tfal
		145			130		133
CGT	GTC AAT	GGA ATC GGA GGG CTA CCT GGT GOC AM GTC AM	CTG TCT
Arg	V«1	Aon	Gly Ile	Gly Gly Łau	Pro	Gly Gly Lya tfal Lya	Łau Bar
	160				163		170
GGC	TCC	ATC	AOC AGT	CM	TAC TTG	AGT	GOC TTG CTG ATG GCT	CCI GCT
Gly	Sar	Ile	Sar Sar	Gin	Tyr Łau	8ar	Ala Łau Łau Hat Ala	Ala Pro
175				180			IBS	1*0
TTC	GCT	CTT	GGG GAT	CTC	GM ATT	GAA	ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC
Łau	Al.	Łau	Gly Aap	Val	Glu tla	Glu	Ile Zla Aap Lya Łau	Ila Sar
			1*5				200	203
ATT	CCC	TAC	GTC GAA	ATG	ACA TTG	AGA TTG ATG GM CGT ITT	GGT GTG

11· Pro Tyr V«1 Glu Net Thr Lau Arg Lau Hat Glu Arg Pha Gly Val

210 213 220

AAA Lya	GCA Ala	GAG CAT	TCT GAT Sar Aap	AGC TGG GAC AGA TTC TAC ATT AM GGA GGT
Glu 225	Hla	Sar	Trp Aap 230	Arg Pha	Tyr	Zla Lya Gly Gly 233
CAA	AAA	TAC	AAG	TCC CCT	AAA	AAT CCC	tat en	GAA	CGT GAT GOC TCA
Gin	Lya	Tyr	Lya	Sar Pro	Lya	Aan Ala	Tyr tfal	Olu	Gly Aap Ala Sar
	240				245			250
AGC	GCA	AGC	TAT	TTC TTG	GCT	GGT GCT	GCA ATT	ACT	GGA GGG ACT GTC
Sar	Ala	Sar	Tyr	Pha Łau	Ala	Gly Ala	Ala Ila	Thr	Gly Gly Thr tfal
235				260			265		270
ACT	GTG	GAA	GGT	TCT GGC ACC ACC AGT	TTG CM	GOT	GAT CTG AM TTT
Thr	tfal	Glu	Gly Cya Gly Thr Thr Sar	Łau Gin	Gly Aap Val Lya Pha
				273			280		283
GCT	GM	GTA	CTG	GM ATC ATG OGA COC AM GTT	ACA TOG AOC GM ACT
Ala	Glu	tfal	Łau	Glu Kat	Mat	Gly Ala	Lya Val	Thr	Trp Thr Glu Thr
			2*0			2*5			300
AGC	CTA	ACT	en	ACT GGC	CCA	ooe asa	GM CCA	TTT	GGG AOC AAA CAC
Sar	tfal	Thr	V«1	Thr Gly	Pro	Pro Arg	Glu Pro	(ha	Gly Arg Lya Hla
		303				310			313
CTC	AM	GOS	ATT	GAT CTC	AAC	ATG AAC	AM AK	OCT	GAT CTC GCC ATC
Łau	Lya	Ala	Ila	Aap tfal	Aan	Mat Aan	Lya Hat	Pro	Aap Val Ala Not
	320				323			330
ACT	en	GCT	GTG	en GCC	CTC	ητ OOC GAT GOC	as	ACA OOC ATC AGA
Thr	Łau	Ala	V«1	tfal Ala	Łau	Pha Ala Aap Gly	Pro	Thr Ala Zla Arg
335				340			343		ISO
GAC	CTG	GCT	TCC	TOG AGA	GTA AM GM ACC GM	M8	ATC en 008 ATC
Aap	Val	Ala	Sar	Trp Arg	tfal	Lya Glu	Thr Glu Arg	Hat Val Ala Zla
				335			360		36S

COC AOC GM CIA AOC AM CTG OGA OCH KI m CM GM OO8 C00 GM Arg Thr Glu Łau itir Lya Łau Gly Ala 8ar Val Glu Glu Gly Pro Aap

189 453

n<J

J74

jao

t*c

TCC

ATC

ATC

ac;

ser.

cc:

W.

AAG

CTC

AAC

CTC

ACS

m

ATC

GAC

1154

tyr

Cy.-

(k

lic

Thr

Pro

Pcj

Olu

Lya

ta«U

Aon

Wal

Thr

Ala

Cle

Amp

JK*.

J-NJ

J·»'.

xr:

T*C

GAC

1'aAC

GAC

Acr.

AT'i

CCC

ATC

CCC

TTC

TCC

err

k:

CCC

ΤΠΤ

i;<7

rr.r

Tyr

Ajp

HU*

Arg

Mat

Ala

Hel

Ai·

Ph«

Ser

Lee

Ala

Ala

Cye

<00

405

410

ccc

GAG

GTC

COC

GTC

AOC

ATC

a»

GM

CCT

GGG

TOC

AOC

CG6

AM

ACC

1215

Ai·

Olu

V«i

Pro

Vel

Thr

Ile

Arg

Aap

Pro

Oly Cya

Thr

Arg

Lya

Thr

415

420

425

430

TTC

COC

GAC

TAC

TTC

CAT

OTS

CTG

ABC ACT

TTC CTC

AAS

AAT

1337

fh·

Pro

A*P

Tyr

ftM

Aap

Wal

Lau

Sar

Thr

Pha

Wal

Lya

Aan

435

440

ΤΑΑ 1340 (2) Informacja o SEK NR ID: 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 444 aminokwasy (B) Typ: aminokwasową (D) Topologia: liniowa (li.) Typ cząsteczki: białko (xi) O^s sekwencCi: SEK NR ID: 3:

Ala Sly Ala l	Glu Olu 5	Ila	Wal Lau Gin Pro Ila Lya Glu 10	Zła Sar Gly 15
Thr Wal Lya	Lau Pro 20	Gly Sar Lya Sar lau Sar Aan Arg 25	Ila Lau Lau 30
Lau Ala Ala 35	Lau Sar	Glu	Gly Thr Thr Wal Wal Aap Aan 40 45	Lau Lau Aan
Sar Olu Aap 50	Wal Hla	Tyr	Hat Lau Gly Ala Lau Arg Thr 55 (0	lau Gly Lau
Sar V»1 Glu 45	Ala Aap	70	Ala Ala Lya Arg Ala Wal Wal 75	Wal Gly Cya (0
Gly Cly Lya	Pha Pro SS	Wtl	Glu Aap Ala Lya Glu Glu Wal SO	Gin Lau Pha SS
Lau Gly Aan	Ala Gly 100	Thr	Ala Hat Arg Pro Lau Thr Ala 105	Ala Wal Thr 110
Ala Ala Cly Gly Aan 115	Ala	Thr Tyr Wal Lau Aap Gly Wal 120 125	Pro Arg Hat
Arg Glu Arg 130	Pro Ila	Gly Aap Lau Wal Wal Gly Lau Lya 135 140	Gin Lau Gly
Ala Aap Wal 145	Aap Cya	Pha 150	Lau Gly Thr Aap Cya Pro Pro 155	Val Arg Wal 1(0
Aan Gly tle	Cly Gly 1(5	Lau	Pro Gly Gly Lya Val Lya Lau 170	(ar Gly Sar 175
Ila Sar Sar	Gin Tyr 1(0	Lau	Sar Ala Lau Lau Hat Ala Ala 1(5	Pro lau Ala l»0
Lau Cly Aap 1SS	Wal Glu	Ila	Glu Ila Ha Aap Lya Lau Ila 200 205	Sar Ila Pro
Tyr Wal Glu 210	Mat Thr	Lau	Arg Lau Hat Glu Arg Pha Gly Wal Lya Ala 215 220
Glu Kia Sar 225	Aap Sar	Trp 230	Aap Arg Pha Tyr Ila Lya Gly Gly Gin Lya 235 240

Tyr Lya lar Pro Lya Aan Ala Tyr Wal Glu 01 y Aap Ala Sar (ar Ala 245 250 2S5

189 453

u-r

Tyr

rm-

IWWt

AL.ł

hly

AU

Ale

tle 24S

Thr

rtly

ety

Thr Wat 270

Thr

v«l

n .

Gly

cy-

Ή /

Thr

Thr

Sur

Lou 3«0

Gin

Gly

Aep

Wal

Lys Phe 77·.

Al*

CU

1 '

U··.

M j

Hr'

Art

Cty

AU

Cyw

Vei

Thr

•rep

Thr JOU

Thr

Sur

V*

Thr 105

The

1/

Pro

Pro 310

Arg

Glu

Pro

Phe

Gly 319

Arę

Lyx HI*

Leu

Ły» 320

Ala

£1«

Aep

Val

Aen 125

Met.

Aen

Lye

Met

Pro 330

*«P

Val

Ala *«t

Thr 335

Leu

Ala

Y*1

Val

Ale 340

Leu

Phe

Al*

A«P Gly 345

Pro

Thr

Al·

11« Arg 390

Aep

v*i

Ala

Ser

Trp 355

Arg

Vel

Lye

Glu

thr 340

Glu

Arg

Met

Val

Ala Ila 305

Arg

Thr

Glu

Leu 370

Thr

Ly>

Leu

Gly

Al· 375

Sar

V«1

Glu

Glu

Gly 310

Pro Aep Tyr Cy*

Ile IBS

Ile

Thr

Pro

Pro

Glu IM

Lya

Leu

Aen

V*1

Thr 395

Ala

Xla-Aep

Thr

Tyr 400

Asp

Aep

Kle

*n?

Mec 4 OS

Al*

Hat

Ala

Pha

Ber 410

Leu

Ala

Ala Cya

Ala 41S

Glu

v*l

Pro

Val

Thr 420

Ile

Arg

Aep

Pro

Gly Cya 429

Thr

Arg

Lya 73>r 430

Pha

Pro

Asp

Tyr

Phe 433

Aep

Val

leu

Ser

Thr 440

Phe

V«1

Ły·

Aan

(21 IHFORMATIOM POR KQ ID HOU:

(2) Informacja o SEK NR ID: 4:

ti) Charakterystyka sekwencji:

JA) Długość: 1340 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (vi) Źródło wyjściowe (A) Organizm: Zea mays (6) Szczep: Black Mexican Sweet lvii) Źródło pośrednie (B) Klon·. pRPA-ML-720 (ix| Cechy:

(ΑΪNazwisko/Klucz: CDS (B) Lokalizacja 6. 1337 (xiΪ Opis sekwencji: SEK NR ID: 4:

CCATG GOC GGC GOC GM CM ATC CK CM CM CCC ATC AM GM ATC 47

Al· Gly Al· Olu Glu II· V«1 Leu Gin tto He Lya Cłu II·

10

ICC GGC Ser Gly 1S	AOC GTC Thr Wal	AM Lya	CTG CCC GSG TCC AM TOG CTT TCC AAC 000 ATC	95
Leu 20	Pro	Gly Ser	Lya tar 29	leu	Sar	Aen Arg	Ile 30
CTC CTA	CTC GCC	GOC	CM	TCC	GM G00	ACA ACA	OTO	GIT	GAT AM CM	143
Leu Leu	Leu Ala	Ala	Leu	Ser	Glu Gly Thr Thr	Wal	Wal	Aep Aen	Leu
		35				40			4$
CTG AM	AGT GM	GM	GTC	CM	TM KtO	CIC GGG	GOC	TM	AGC MI	cn	191
Leu Aan	Sar Glu	Aep	V<1	Kle	Tyr Mec	Leu Gly	Ala	leu	Arg Thr	Leu
	90				95				00
GOT CIC	TCT GTC	GAA GOS	GM	AAA GCT	GCC AAA	AGA	OCI	OTA GIT	GIT	239
Gly Leu	Sar Wal	Glu Ala	Aep Lya Ala Ala Lya Arg	Ala Wal Wal	Wal
	«9				TO			TS

189 453

•rrr

ΟΤΓ

m*

AAr:

TTC

OSA

GTT

<x;

ΠΑΤ

»5CT

AAA

OAA

OTf.

CMS

207

•1/

Cy- nii

Gly

‘Hy

Ly.

ytla

Pro MS

Wal

Glu

Atłp

Ala

Mr* «10

Olu

Glu

Wal

Gin

er

(TT

m:

w.

AAT

<JCt

fłlA

ATC

GCA

A.T*i

cx;

TCC

tt*;

ACA

CO

CCT

JJS

w—· i

(Tv

Len

:iy

A ·.

AIj ino

Gly

11*

a;·

H«t

Arg US

Ser

<««ru

The

Al 1

AU 110

'ΓΓΤ

ACT

GCT

GCT

rJCT

GGA

AAT

GCA

ACT

TAC

CTG

err

OAT

GGA

CTA

CO

J8J

7 a 1

Thr

Ala

Ala

Gly lii

Gly

Aan

Ala

Thr

Tyr 120

Wal

Leu

Asp

Gly

Wal 125

Pro

AGA

ATG

AGG

GAG

AGA

COC

ATT

GGC

GAC

TTG

CTT

CTC

GGA

TTG

AAG

CAG

431

Arg

Mac

Arg

Glu 130

Ar*

Ptó

Ile

Gly

Aap 135

Lau

Wal

Wal Gly

Lau 140

Lya

Gin

CTT

GGT

GCA

GAT

CTT

GAT

TCT

TTC

CTT

GGC

ACT

GAC TGC

OCA

CCT

GTT

47»

Lau

Gly

Ala MS

Aap

Wal

Aap

cya

PtM 150

Lau

eiy

Thr

Aap Cya 155

Pro

Pro

Val

CCT

GTC

AAT

GGA

ATC

GGA

GGG

CTA

CCT

GCT

GOC

AAG

GTC

AAG

CTG

TCT

527

Arg

Val ICO

Aan

Gly

lis

ety

eiy tes

Lau

Pro

Gly

Gly Lya 170

Val

Lya

Lau

Sar

GGC

TCC

ATC

AGC

ACT

CAG

TAC

TTG

ACT

GCC

rre

CTG

ATG

GCT

GCT

CCT

575

Gly 175

Sar

Ile

Sar

Sar

Gin ISO

Tyr

Lau

Sar

Ala

Lau 185

Lau

Mac

Ala

Ala

Pro ISO

TTG

GCT

CTT

GGG

GAT

GTG

GAG

ATT

GAA

ATC

ATT

GAT

AAA

TTA

ATC

TCC

623

Lau

Ala

Lau

Gly Aap 195

Val

Glu

Ila

Glu

Ila 200

Ile

Aap

Ly»

Lau

Ul 205

Ser

ATT

COS

TAC

GTC

GAA

ATG

ACA

TTG

AGA

TTG

ATG

GAG

OST

TTT

GCT

GTG

671

11·

Pro

Tyr

Val 210

Glu

Mae

Thr

Lau

Arg 215

Lau

Mae

Glu

Arg

Pha 220

Gly

Val

AAA

GCA

GAG

CAT

TCT

GAT

AGC

TGG

GAC

AGA

TTC

TAC

ATT

AAG

GGA

GCT

719

Lya

Ala

Glu 225

His

Sar

Aap

Sar

Trp Aap 230

Arg

Pha

Tyr

Zla 235

Lya

Gly Gly

CAA

AAA

TAC

AAG

TCC

CCT

AAA

AAT

GCC

TAT

CTT

GAA

GCT

GAT

GOC

TCA

7G7

Gin

Lya 240

Tyr

Lya

Sar

Pro

Lya 245

Aan

Ala

Tyr

Val

Glu 250

Gly

Aap

Ala

Sar

AGC

GCA

AGC

TAT

TTC

TTG

GCT

GCT

GCT

GCA

ATT

ACT

GGA

GGG

ACT

CTG

815

Sar 255

Ala

Sar

Tyr

Ph·

Lau 260

Ala

Gly Ala

Ala

Ila 265

Thr

Gly

Gly

Thr

Val 270

ACT

GTG

GAA

GCT

TCT

GGC

AOC

ACC

ACT

TTG

CAG

GCT

GAT

GTG

AAG

TTT

863

ΤΛγ Val Glu Gly Cy» Gly Thr Thr Ser Leu Gin Gly Aap V«1 Lya Pha 275 280 285

SCT GAG GTA CTG GAG ATG ATG GGA GCG AAG GTT ACA TGG ACC GAG ACT Sil

Ali Glu V«l Le_U Glu Net Hat Gly Ala Lya Val Thr TCP The Olu Thr

290 2»S 300

AGC GTA ACT GTT ACT GGC CO OOG CSC GAG CO TTT GGG AGO AAA CAC 959

Sar Wal Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Pha Gly Arg Lya Hla

305 310 315

CTC AAG GCG ATT GAT CTC AAC ATS AAC AAG AZG OCT GAJ GTC GOC ATG 1007

Lau Lya Ala II· Aap Val Aan Mac Aon Lya Mat Pro Aap Wal Ala Mae

320 325 330

ACT CTT GCT CTG GTT GOC CTC TTT GOC GAT GOC COS ACA GCC ATC AGA 1055

Thr Lau Ala Wal V«l Ala Lau Pha Ala Aap Gly Pro Thr Ala Ile Arg

335 3<o 345 350

GAC GTG OCT TOC TGG AGA GTA AAG GAC AOC GAG AGO ATG GTT GOG ATC 1103

Aap v«l Ala Sar Trp Arg Wal Lya Glu Thr Glu Arg Mae Val Ala Zla

355 SCO 365

CGG AOS GAG CTA AOC AAG CTG GGA OCA TCT GTT GAG GAA GOG COS GAC 1151

Arg Thr Glu Lau Thr Lya Lau Gly Ala Sar Val Glu Glu Gly Pro Aap

370 37$ 3G0

TAC TCC ATC ATC ACG DOG OOG GAG AAG CTG AAC GTG AOS GOG ATC GAC 1199

Tyr Cya 11« 11« Thr Pro Pro Glu Lya Lau Aan Wal Thr Ala tla Aap

3*5 3*0 395

189 453

ΛΟΠ TAC GAC ‘WC CAC ARR ATG OCR ATR RC2 TTC toc crr COC CCC TGT

The Tyr A:p Aap Ml.« Arg Hat Al· Hat Al· ffw s«r Lau Al· Al· Cya

100 10) HO

-xr: gar rtc coc gtc acc atc oog cac cct om trc acc crr aac acc

Au Ilu ν·ι Pr·, »,l Thr 11« Arg Arp Pro fily Cy· The Ary Lya The ł·.·, 120 13) <20

TTC CCC CAC TAC TTC GAT GTG CTC ACC ACT TTC GTC AAC AAT

Ph« Pro Aap Tyr Pha Aap V«1 Lau Sar Thr Pha Val Lya Aan

1« «0

TAA (2) Informacja o SEK NR ID: 5:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 111 aminokwasy (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa

12Π

12»)

1JJ1

1310

(ii)	Typ cząsteczki:	białko
(xi|	Opis sekwencji:	SEK NR ID: 5:
	Ala Oly Ala Olu	Olu 11· Val Łau Oln	Pro	U· Lya Olu Ila Sar Oly
	1	s	10	1S

Thr Val Lya Leu Pro Gly Sar Lya Sar Lau Sar Aan Arg 11« Łau Lau 20 ii 30

Lau Ala Ala 3)	Lau Sar	Olu	Oly Thr Thr Val 40	Val Aap Aan Lau Lau Aan 45
Sar Olu Aap	Val Hi a	Tyr	Hat lau Oly Ala	Lau Arg Thr Lau Gly Lau
50			SS	<0
Sar V»J Olu	AJ· Aap	Lya	Ali Al· t/f» Arg	Ala Val Val Val Gly Cya
«5		10		75 S0
Gly Gly Lya	Pha Pro	V»1	Glu Aap Al· Lya	Glu Glu Val Gin Łau Pha
	es		to	»3
L»u Gly Aan	Ala Gly	11»	Ala Mat Arg- Sar	Lau Thr Ala Ala Val Thr
	100		105	110
AJ· AJ· Oly Oly Aan	AJ·	Thr Tyr Val Lau	Asp Gly Val Pro Arg Hat
11S			120	125
Arg Olu Arg	Pro Ila	Gly Aap Lau Val Val	Gly Lau Lya Gin lau Gly
130			135	140
Alt Aap Val	Aap Cya	Pha	lau Gly Thr Aap Cya Pro Pro Val Arg Val
14S		ISO		135 ICO
Aan Oly Ile	Oly Oly	Lau	Pro Oly Oly Lya	Val Lya Łau Sar Gly Sar
	1C3		110	173
Ila Sar Sar	Oln Tyr	Lau	Sar Ala Lau Lau	Kat Ala Ala Pro lau Ala
	ISO		1S5	X>0
Lau Gly Aap	Val Olu	Ila	Glu XI· XI· Aap Lya Łau XI* Sar tla Pro
1«S			200	203
Tyr Val Olu	Hat Thr	Łau	Arg Lau Mat Olu Arg Pha Oly Val Lya Ala
210			as	220
Olu Hi· Sar	Aap Sar	Trp Aap Arg Pha Tyr	Xla Lya Qr Oly Oln Lya
225		230		233 240
Tyr Lyo Sar	Pro Lya	Aan	Ala Tyr Val Glu <	Gly Aap Ala «ar Sar Ala
	21S		230	233
Sar Tyr Phe	Lau Ala	Oly	Ala Ala Ila Thr i	Gly Gly thr Val Thr Val
	2<0		2C3	270

Cłu Gly Cya Gly Thr Thr Sar L«u Oln Gly Aap Val Lya Pha Ala Olu 275 210 sss

189 453

Vjl

Luu ZKJ

Olu

Hvt

Nur

Gly

Ala 245

Ly

Val

Thr

Trp

Thr 300

Glu

Thr

Sar

Val

Thr JO'.

/ii

Thr

Μϊ

Pro

Pro J10

Ao

Glu

Pro

Pha

Gly JIS

Arg

tr-

Hla

Lcu

UW J20

Ali

i Ir

*-(/

.

Ai«n JCS

Hut

Ajan

Lya

Hut

Pro JJO

Axp

Val

AU

Nut

Thr JJS

U* u

Al·.

V»l

V«l

Ala J40

L«u

fh«

Ala

Aap Gly 345

Pro

Thr

Ala

lla

Arg 350

Aap

V«1

Ali

Sar

Trp 355

Arg

V«1

Lya

Olu

Thr 300

Glu

Arg

Hat

Val

Ala 3S5

lla

Arg

Thr

Olu

Leu 370

Thr

Lya

Uu

Gly

Ala 375

Sar

Val

Glu

Glu

Gly 3S0

Pro

Aap Tyr Cyw

11« 385

11«

Thr

Pro

Pro

Glu 380

Łya

Lau

Aan

Val

Thr 385

Ala

lla

Aap

Thr

Tyr 400

A»p Aap

Hla

Arg

N«t 405

Ala

Kat

Ala

Pha

Sar 410

Lau

Ala

Ala

Cya

Ala 415

Glu

V.l

Pro

V*1

Thr 420

11·

Arg Aap

Pro

Gly Cya 425

Thr

Arg Lya

Thr 430

Pha

Pro

Aap Tyr

Phw

Aap

V«1

Lau

Sar

Thr

Pha

Val

Lya

Aan

435 440

189 453

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. DNA genu kodującego zmutowaną syntazę 3-enolopiruwoiloszykimiano-5-fosforanową (EPSPS), który zawiera co najmniej jedną mutację, polegającą na podstawieniu treonina 102 -> izoleucyna i zawiera dodatkowo mutację polegającą na podstawieniu proliny 106 seryną.
2. 2. DNA genu według zastrz. 1, który zawiera dodatkowo mutację polegającą na podstawieniu glicyny 101 alaniną.
3. 3. DNA genu według jednego z zastrz. od 1 do 2, który jest pochodzenia bakteryjnego.
4. 4. DNA genu według zastrz. 3, który pochodzi z bakterii z rodzaju Salmonella typhimurium.
5. 5. DNA genu według jednego z zastrz. od 1 do 2, który jest pochodzenia roślinnego.
6. 6. DNA genu według zastrz. 5, który pochodzi z kukurydzy.
7. 7. Zmutowane białko EPSPS, które zawiera co najmniej jedno podstawienie treoniny 102 izoleucyną i podstawienie proliny 106 seryną.
8. 8. Chimerowy gen zawierający sekwencję kodującą, jak również elementy regulatorowe w pozycjach 5' i 3', które są heterologiczne i zdolne do funkcjonowania w roślinach, który zawiera jako sekwencję kodującą co najmniej jedną sekwencję według jednego z zastrz. od 1 do 6.
9. 9. Chimerowy gen według zastrz. 7, który zawiera promotor wirusa roślinnego.
10. 10. Chimerowy gen według zastrz. 8, który zawiera promotor roślinny (np. α-tubuliny, histonu, intronów, aktyny, itd.).
11. 11. Wektor do transformowania roślin, który zawiera co najmniej jeden gen według jednego z zastrz. od 8 do 10.
12. 12. Komórka roślinna, która zawiera co najmniej jeden gen według jednego z zastrz. od 8 do 10.
13. 13. Roślina, która jest otrzymana poprzez regenerację z komórki według zastrz. 12.
14. 14. Sposób wytwarzania roślin ze zwiększoną tolerancją na herbicydy działające na syntazę EPSP, znamienny tym, że komórki roślinne lub protoplasty transformuje się genem według jednego z zastrz. od 1 do 6 i transformowane komórki poddaje się regeneracji.
15. 15. Sposób traktowania roślin herbicydem działającym na syntazę EPSP, znamienny tym, że herbicyd stosuje się wobec roślin według zastrz. 13.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosowany jest glifozat lub prekursor glifozatu.

    Niniejszy wynalazek dotyczy DNA genu kodującego zmutowaną syntazę 3-enolopiruwoiloszykimiano-5-fosforanową, zmutowanego białka EPSPS, genu chimerowego, wektora do transformowania roślin, komórki roślinnej, rośliny oraz sposobów wytwarzania roślin i ich traktowania.

    Nowa syntaza 3-enolopiruwoiloszykimiano-5-fosforanowa (lub EPSPS), wykazująca zwiększoną tolerancję wobec herbicydów, które są inhibitorami aktywności EPSPS współzawodniczącymi z fosfoenolopirogronianem. Ta syntaza EPSP o zwiększonej tolerancji ma co najmniej jedno podstawienie „treoniny izoleucyną”. Wynalazek dotyczy również genu kodującego takie białko, komórek roślinnych transformowanych konstruktami chimerowych genów

    189 453 zawierającymi ten gen, roślin zregenerowanych z takich komórek, a także roślin pochodzących z krzyżówek z użyciem tych transformowanych roślin.

    Glifozat, sulfosat i fosametin są systemicznymi herbicydami o szerokim spektrum działania z rodziny fosfonometyloglicyny. Działają zasadniczo jako inhibitory syntazy 3-enolopiruwoiloszykimiano-5-fosforanowej (EC 2.5.1.19) lub EPSPS współzawodniczące zPEP (fosfoenolopirogronianem). Po zastosowaniu w stosunku do roślin, przemieszczają się one w roślinie i gromadzą się w szybko rosnących częściach rośliny, a w szczególności wierzchołkach łodygi i korzenia, powodując uszkodzenie prowadzące do zniszczenia wrażliwych roślin.

    Plastydowy EPSPS, główny cel tych produktów, jest enzymem w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych, który jest kodowany przez jeden lub więcej genów jądrowych i syntetyzowany w postaci prekursora cytoplazmatycznego, a następnie importowany do plastydów, gdzie akumuluje się jako forma dojrzała.

    Tolerancję roślin na glifozat i produkty z tej rodziny uzyskuje się poprzez stabilne wprowadzenie do ich genomu genu EPSPS pochodzenia roślinnego lub bakteryjnego, który jest zmutowany lub w inny sposób zmieniony pod względem charakterystyki hamowania przez glifozat produktu tego genu. W świetle sposobu działania glifozatu i stopnia tolerancji wobec glifozatu produktu stosowanych genów, korzystne jest posiadanie możliwości wyrażania produktu translacji tego genu, tak aby umożliwić jego akumulację w znacznej ilości w plastydach.

    Wiadomo, na przykład z patentu USA 4535060, że można spowodować nabycie przez roślinę tolerancji na herbicyd powyższego typu, a w szczególności N-fosfonometyloglicynę lub glifozat, poprzez wprowadzenie do genomu roślin genu kodującego EPSPS mającego co najmniej jedną mutację, która czyni ten enzym bardziej opornym wobec jego współzawodniczącego inhibitora (glifozatu) po umiejscowieniu enzymu w plastydach. Techniki te, jednakże, wymagają ulepszenia w celu uzyskania większej niezawodności przy używaniu tych roślin w warunkach upraw.

    W niniejszym opisie, „roślina” ma oznaczać dowolny zróżnicowany wielokomórkowy organizm, zdolny do fotosyntezy, a „komórka roślinna” ma oznaczać dowolną komórkę pochodzącą z rośliny i zdolną do wytwarzania komórek niezróżnicowanych, takich jak kalus albo tkanek zróżnicowanych, takich jak zarodek lub części rośliny lub nasiona.

    Przedmiotem niniejszego wynalazku jest DNA genu kodującego zmutowaną syntazę 3-enolopiruwoiloszykimiano-5-fosforanową (EPSPS), który zawiera co najmniej jedną mutację, polegającą na podstawieniu treonina 102 -> izoleucyna i zawiera dodatkowo mutację polegającą na podstawieniu proliny 106 seryną, korzystnie zawiera dodatkowo mutację polegającą na podstawieniu glicyny 101 alaniną, korzystniej DNA jest pochodzenia bakteryjnego, korzystniej pochodzi z bakterii z rodzaju Salmonella typhimurium. W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku DNA jest pochodzenia roślinnego, korzystniej pochodzi z kukurydzy.

    Podstawienia te mogą być wprowadzone lub obecne w sekwencji EPSPS pochodzącej z dowolnego źródła, a w szczególności z roślin, bakterii, glonów lub grzybów.

    Wynalazek dostarcza zmutowane białko EPSPS, które zawiera DNA według wynalazku.