RS56469B1

RS56469B1 - Ciljano vezujući agensi usmereni na b7-h1

Info

Publication number: RS56469B1
Application number: RS20171053A
Authority: RS
Inventors: Christophe Queva; Michelle Morrow; Scott Hammond; Marat Alimzhanov; John Babcook; Ian Foltz; Jaspal Singh Kang; Laura Sekirov; Melanie Boyle; Matthieu Chodorge; Kathleen Ann Mulgrew; Ross Stewart
Original assignee: Medimmune Ltd
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2018-01-31
Also published as: CY1122816T1; KR20170123347A; AU2016203758B2; SMT202000195T1; PL3279215T3; US20210017282A1; JP2018093873A; EP2504364A1; HRP20171653T1; IL219876A0; EP3279215A1; PT3279215T; NL300964I2; PL2504364T3; HUS1900002I1; JP5837504B2; FR19C1001I2; SI2504364T1; FR19C1001I1; IL219876A

Description

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na ciljano vezujuće agense usmerene na B7-H1 protein i na upotrebu takvih agenasa. U nekim slučajevima, pronalazak se odnosi na potpuno humana monoklonalna antitela usmerena na B7-H1 i upotrebu ovih antitela. Aspekti pronalaska se takođe odnose na ćelijske linije koje eksprimiraju takve ciljano vezujuće agense ili antitela. Opisani ciljano vezujući agensi su korisni za dijagnostiku i za lečenje bolesti povezanih sa aktivnošću i/ili ekspresijom B7-H1.

Opis stanja tehnike

[0002] Adaptivni imunski odgovor uključuje aktivaciju, selekciju i klonsko umnožavanje dve glavne klase limfocita nazvanih T ćelije i B ćelije. Nakon susreta sa antigenom, T ćelije se umnožavaju i diferenciraju u antigen specifičnih efektornskih ćelija, dok se B ćelije umnožavaju i diferenciraju u ćelije koje izlučuju antitela. Aktivacija T ćelija je višestepeni proces koji zahtijeva nekoliko signalnih događaja između T ćelije i antigen prezentujuće ćelije (APC). Za aktiviranje T ćelija, dve vrste signala moraju se isporučiti u mirujuću T ćeliju. Prvi tip je posredovan antigen-specifičnim T ćelijskim receptorom (TcR) i daje specifičnost imunološkom odgovoru. Drugi, kostimulatorni tip, reguliše veličinu odgovora i isporučuje se pomoću dodatnih receptora na T ćeliji.

[0003] Primarni kostimulatorni signal se isporučuje preko aktivirajućeg CD28 receptora uz angažovanje njegovih liganda B7-1 ili B7-2. Nasuprot tome, angažovanje inhibitornih CTLA-4 receptora pomoću istih B7-1 ili B7-2 liganda dovodi do slabljenja odgovora T ćelija. Prema tome, CTLA-4 signali suprotstavljaju se kostimulaciji posredovanoj sa CD28. Kod visokih koncentracija antigena, CD28 kostimulacija preklapa CTLA-4 inhibitorni efekat. Vremensko regulisanje ekspresije CD28 i CTLA-4 održava ravnotežu između aktivacionih i inhibitornih signala i osigurava razvoj efektivnog imunskog odgovora, a štiti od razvoja autoimunosti.

[0004] Nedavno su identifikovani molekularni homologi CD28 i CTLA-4 i njihovi ligandi poput B-7. ICOS je kostimulatorni receptor poput CD28. PD-1 (programirana smrt 1) je inhibitorni receptor i parnjak CTLA-4. Ovaj pronalazak se odnosi na modulaciju imunskih odgovora posredovanih sa B7-H1

[0005] B7-H1, takođe poznat i kao PD-L1, je transmembranski protein tipa I veličine otprilike 53kDa. Kod ljudi B7-H1 se eksprimira na brojnim tipovima imunih ćelija uključujući aktivirane i anergijske/iscrpljene T ćelije, na naivne i aktivirane B ćelije, kao i na mijeloidne dendritske ćelije (DC), monocite i na ćelije mastocita. Takođe se eksprimira na neimunskim ćelijama, uključujući ostrvca pankreasa, Kupferove ćelije jetre, vaskularni endotel i izabrani epitel, na primer epitel disajnih puteva i epitel bubrežne tubule, gde se njegovo eksprimiranje povećava tokom inflamatornih epizoda. B7-H1 ekspresija se takođe nalazi sa povećanim nivoima na brojnim tumorima, uključujući, ali ne ograničavajući se na tumore dojke, debelog creva, kolorektalne, plućne, bubrežne, uključujući karcinom bubrežnih ćelija, želudačne, bešike, na karcinom pluća sa obuhvaćenim ne-sitnim ćelijama (NSCLC), hepatocelularni karcinom (HCC) i na karcinom pankreasa kao i na melanom.

[0006] B7-H1 je član B7 familije proteina, koji sadrži dva ekstracelularna Ig domena, jedan N-terminalni V-tip domen praćen domenom C-tipa. Intracelularni domen dužine 30 aminokiselina ne sadrži očigledne signalne motive, ali nosi potencijalno mesto za fosforilaciju protein kinaze C. Oblik B7-H1 kod miševa ima 69% identičnih aminokiselina sa humanim oblikom B7-H1, a takođe deli konzerviranu strukturu.

[0007] Poznato je da B7-H1 vezuje dva alternativna liganda, prvi od njih, PD-1, je 50-55 kDa tip I transmembranski receptor koji je prvobitno bio identifikovan u T ćelijskoj liniji podvrgnutoj aktivacijom indukovanoj apoptozi. PD-1 se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, B ćelijama i monocitima, kao i na drugim ćelijama imunog sistema i vezuje i B7-H1 (PD-L1) i srodni B7-DC (PD-L2). Drugi je B7-1 član porodice B7, koji se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, B ćelijama, monocitimima i antigen prezentujućim ćelijama.

[0008] PD-1 je član superfamilije imunoglobulina (Ig) koji sadrži jedinstveni domen Ig V u svom vanćelijskom regionu. PD-1 citoplazmatski domen sadrži dva tirozina, sa većinskim membranskiproksimalnim tirozinom (VAYEEL (SEK ID BR: 110) u PD-1 iz miševa) koji je lociran u okviru ITIM (inhibitorni motiv zasnovan na imuno-receptorskom tirozinu). Prisustvo ITIM-a na PD-1 ukazuje na to da je funkcija ovog molekula da umanji signalizaciju receptora antigena regrutovanjem citoplazmatskih fosfataza. Humani i PD-1 proteini miševa dele oko 60% identiteta aminokiselina sa konzervacijom četiri potencijalna N-glikozilacijska mesta i ostatke koji definišu domen Ig-V. ITIM u citoplazmatičnom regionu i ITIM-u sličan motiv koji okružuje karboksi-terminalni tirozin (TEYATI (SEK ID BR: 111) kod ljudi i miševa) takođe su konzervirani između humanih i mišjih ortologa.

[0009] Veruje se da signalizacija preko PD-1/B7-H1 ose služi kritičnim, ne-redundantnim funkcijama unutar imunog sistema, negativno regulisanim odgovorom T ćelija. Ova regulacija je uključena u razvoj T ćelija u timusu, u regulaciji hroničnih inflamatornih odgovora i u održavanju periferne tolerancije i imunske privilegije. Kritična priroda ovih funkcija je pokazana kod PD-1 deficijentnih miševa, koji pokazuju autoimunski fenotip. Nedostatak PD-1 kod miševa C57BL/6 dovodi do hroničnog progresivnog lupusnog glomerulonefritisa i artritisa. Kod miševa Balb/c, PD-1 deficijencija dovodi do teške kardiomiopatije zbog prisustva srčanotkivnih specifičnih samo-reagujućih antitela. Funkcija signalizacije preko B7-H1/B7-1 je manje jasna, ali se smatra da je uključena u davanje negativnih regulatornih signala za obe T ćelije i za ćelije koje prezentuju antigen.

[0010] Veruje se da ekspresija B7-H1 na tumorskim ćelijama pomaže tumoru u izbegavanju otkrivanja i eliminacije od strane imunog sistema. B7-H1 funkcioniše u tom pogledu kroz nekoliko alternativnih mehanizama uključujući pokretanje iscrpljenja i anergiju tumora koji infiltriraju T limfocite, stimulaciju sekrecije imunskih represivnih citokina u tumorsko mikro-okruženje, stimulaciju represivne regulatorne T ćelijske funkcije i zaštitu B7-H1 eksprimirajuće tumorske ćelije od lize pomoću tumor specifičnih citotoksičnih T ćelija.

[0011] Generalno, postoji potreba da se obezbede sigurne i efikasne terapeutske metode za poremećaje koji su povezani sa represijom imunskog odgovora kao što su, na primer, karcinom i hronična virusna infekcija. Modulacija imunskih odgovora uključenih u ove poremećaje može se postići manipulacijom B7-H1/PD-1 puta.

[0012] US 2009/055944 A1 (KORMAN I SAR., 26. februar 2009.) odnosi se na humana monoklonalna antitela koja se vezuju za PD-L1.

[0013] EP 1537 878 A1 (ONO PHARMACEUTICAL CO; HONJO T, 8. jun 2005) odnosi se na kompozicije koje inhibiraju funkciju PD-1, PD-L1 ili PD-L2 i terapije koje ih koriste. STROME i sar., (CANCER RESEARCH, vol 63, 2003, str.6501-6505) odnosi se na blokadu B7-H1 koja povećava adoptivnu T-ćelijsku imunoterapiju karcinoma skvamoznih ćelija. BLANK C i sar., (INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol 119, broj 2, 1. juli 2006, str. 317-327) odnosi se na PD-L1 (B7-H1) povećane odgovore humanih specifičnih T ćelija in vitro. NING LI i sar., (JOURNAL OF CLINICAL IMMUNOLOGY, vol 27, broj 1, 16. decembar 2006, str. 117-130) odnosi se na potencijalni sistemski antitumorski imunitet koji je indukovan vakcinacijom gensko modifikovanim ćelijama tumora udruženim sa hemostatsko-prostatnim tumorom i blokadom B7-H1.

[0014] WO 2009/089149 A1 (UNIV JOHNS HOPKINS, CHEN LIEPING, 16. jul 2009.) odnosi se na B7-H1 (CD274) antagoniste koji indukuju apoptozu tumorskih ćelija. WO 2006/133396 A2 (DANA FARBER CANCER INST INC; BRIGHAM & VOMENSHOSPITAL; UNIV, 14. decembar 2006) odnosi se na metode i kompozicije za lečenje trajnih infekcija.

[0015] L. ZHANG i sar. (BLOOD, vol 114, broj 8, 20. avgust 2009, str. 1545-1552) odnosi se na PD-1/PD-L 1 interakcije koje inhibiraju antitumorski imunski odgovor u akutnom mijeloidnom leukemijskom modelu kod miševa. NOMI i sar., (CLINICAL CANCER RESEARCH, vol 13, 2007, strane 2151-2157) odnosi se na klinički značaj i terapeutski potencijal puta programirane smrti-1 kod humanog karcinoma pankreasa.

[0016] PAREKH VV i sar., (THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, broj 182, broj 5, 1. mart 2009, strane 2816-2826) odnosi se na PD-1/PD-L blokadu koja sprečava indukciju anergije i poboljšava antitumorske aktivnosti nepromenljivih NKT ćelija aktiviranih glikolipidom. EP 2172219 A1 (SNU R&DB FOUNDATION, 7. april 2010) odnosi se na sredstvo protiv karcinoma koje sadrži iNKT ligand i anti-PD-1 antitelo ili anti-PD-L1 antitelo. WO 2010/077634 A1 (GENENTECH INC; IRVING BRIAN; CHEUNG JEANNE; CHIU HENRI, 8. jul 2010.) odnosi se na anti-PD-L1 antitela i njihovu upotrebu kako bi se poboljšala funkcija T-ćelija.

Kratak opis pronalaska

[0017] Predmetni pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ovi aspekti/primeri predmetnog pronalaska koji čine pronalazak su definisani zahtevima.

[0018] Predmetni pronalazak se odnosi na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i inhibiraju biološku aktivnost B7-H1. U jednom slučaju pronalaska, pronalazak se odnosi na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i time inhibiraju aktivnost B7-H1. U drugom primeru pronalaska, pronalazak se odnosi na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju vezivanje B7-H1 za PD-1. U još jednom primeru pronalaska, pronalazak se odnosi na ciljano vezujuće agense koji blokiraju B7-H1 indukovanu supresiju T ćelija i time poboljšavaju antitumorni imunitet. U još jednom primeru pronalaska, pronalazak se dalje odnosi na ciljano vezujuće agense koji mogu dalje stimulisati jednu ili više od sledećih aktivnosti uključujući proliferaciju T ćelija, IFN-Ȗ i/ili IL-2 sekreciju u reakcijama mešanih limfocita. Primeri pronalaska, odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i inhibiraju biološku aktivnost B7-H1. U jednom slučaju ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% biološke aktivnosti u odnosu na aktivnost koja bi se javila u odsustvu ciljnog vezujućeg agensa.

[0019] Primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7H1 i time inhibiraju aktivnost B7-H1. U jednom slučaju ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% od B7-H1 aktivnostii u odnosu na aktivnost koja bi se javila u odsustvu ciljnog vezujućeg agensa.

[0020] Primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i time inhibiraju vezivanje za PD-1. U jednom slučaju vezujuće agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% B7-H1/PD-1 receptor vezujući ligand u poređenju sa onim što bi se dogodilo u odsustvu ciljano vezujućeg agensa.

[0021] U drugom primeru, ciljani vezujući agensi pronalaska mogu inhibirati vezivanje PD-1/Fc za humani B7-H1 koji je eksprimiran na ES-2 ćelijama. U jednom primeru ciljano vezujući agens inhibira vezivanje sa IC50 manjim od 1 nM, 0.5 nM, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07 ili 0.06 nM. Nadalje, u drugom slučaju, antitela pronalaska imaju IC50 od oko 1 nM naniže do oko 0.06 nM; ili od oko 0.5 nM naniže do oko 0.06 nM; ili od oko 0.1 nM naniže do oko 0.06 nM; ili od oko 1 nM naniže do oko 0.1 nM; ili od oko 1 nM naniže do oko 0.5 nM.

[0022] Primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju vezivanje za njegov ligand B7-1. U jednom primeru ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% B7-H1/B7-1 receptor vezujući ligand u poređenju sa onim što bi se dogodilo u odsustvu ciljano vezujućeg agensa.

[0023] Primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju sa B7-H1 indukovane proliferacije tumora. U jednom primeru ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% B7-H1 indukovane proliferacije tumora koja bi se desila u odsustvu ciljano vezujućeg agensa.

[0024] Dalje, primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju preživljavanje ćelija tumora indukovanih sa B7-1. U jednom primeru ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% preživljavanje ćelija tumora indukovanih sa B7-1 koja bi se desila u odsustvu ciljano vezujućeg agensa.

[0025] Dalje, primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju rast tumora kod A375 ili HPAC karcinomskih ćelijskih linija. U jednom primeru ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% rasta ćelijskih linija nakon 30 dana u poređenju sa izotopskom kontrolom.

[0026] Dalje, primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju B7-H1 posredovano suzbijanje tumorskih reaktivnih T-ćelija, čime se povećava anti-tumorska citolitička aktivnost T-ćelija. U jednom primeru ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% B7-H1 posredovano suzbijanje aktivnost tumorskih reaktivnih T-ćelija koje bi se desilo u odsustvu ciljano vezujućeg agensa.

[0027] Dalje, primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i time poboljšavaju anti-tumorski imunitet. U jednom primeru ciljano vezujući agens poboljšava najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% anti-tumorskog imuniteta koji bi se desio u odsustvu ciljano vezujućeg agensa.

[0028] Dalje, primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju umnožavanje ćelija. U jednom primeru ciljano vezujući agens inhibira najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% umnožavanja ćelija koje bi se desilo u odsustvu ciljano vezujućeg agensa.

[0029] Dalje, primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i povećavaju specifičnu citolitičku aktivnost (CTL) usmerenu na B7-H1 eksprimirajuće tumorske ćelije. U jednom primeru, antitela pronalaska pokazuju EC50 vrednost manju od ili jednaku sa 100 nM, 50 nM ili 1 nM. Nadalje, u drugom slučaju, antitela pronalaska pokazuju EC50 vrednost od oko 100 nM naniže do oko 1 nM; ili od oko 50 nM naniže do oko 1 nM; ili od oko 20 nM naniže do oko 1 nM; ili od oko 100 nM naniže do oko 50 nM; ili od oko 100 nM naniže do oko 70 nM.

[0030] Dalje, primeri pronalaska odnose se na ciljano vezujuće agense koji se specifično vezuju za B7-H1 i na taj način inhibiraju B7-H1 posredovano suzbijanje umnožavanje T-ćelija pri EC50 vrednosti manjoj od ili jednakoj 100 nM. U jednom primeru, antitela pronalaska pokazuju EC50 vrednost manju od ili jednaku sa 100 nM, npr., 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ili 10 nM. Nadalje, u drugom slučaju, antitela pronalaska pokazuju EC50 vrednost od oko 100 nM naniže do oko 10 nM; ili od oko 50 nM naniže do oko 10 nM; ili od oko 20 nM naniže do oko 10 nM; ili od oko 100 nM naniže do oko 50 nM; ili od oko 100 nM naniže do oko 70 nM; ili od oko 100 nM naniže do oko 80 nM.

[0031] Ciljano vezujući agensi takođe inhibiraju adheziju tumorskih ćelija, pokretljivost, invazivnost i ćelijske metastaze i dodatno, ciljano vezujući agensi su korisni za smanjenje rasta tumora. Mehanizmi kojima se to može postići mogu uključivati ali bez ograničavanja na to, inhibiciju B7-H1 aktivnostii.

[0032] U jednom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens je antitelo. U jednom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens je monoklonalno antitelo. U jednom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens je kompletno humano monoklonalno antitelo ili njegov deo. Takva monoklonalna antitela mogu se ovde navesti kao anti-B7-H1 antitela ili antitela pronalaska.

[0033] Antitela, monoklonalna antitela i humana monoklonalna antitela uključuju antitela sa IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 izotipovima, na primer IgG2. U jednom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens je kompletno humano monoklonalno antitelo sa IgG2 izotipom. Ovaj izotip ima smanjeni potencijal da izazove efektorsku funkciju u poređenju sa drugim izotipovima, što može dovesti do smanjene toksičnosti. U drugom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens je kompletno humano monoklonalno antitelo sa IgG1 izotipom. IgG1 izotip ima povećani potencijal da izazove Antitelom usmerenu ćelijski-posredovanu citotoksičnost (ADCC) u poređenju sa drugim izotipovima, što može dovesti do poboljšane efikasnosti. IgG1 izotip ima poboljšanu stabilnost u poređenju sa drugim izotipovima, npr. IgG4, što može dovesti do poboljšane biodostupnosti/lake proizvodnje/dužeg polu-života. U jednom primeru kompletno humano monoklono antitelo sa IgG1 izotipom je z, za ili f alotipa. U jednom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens ima poželjna terapeutska svojstva, izabrana od jednog ili više od sledećih: visok afinitet vezivanja za B7-H1, sposobnost da inhibira B7-H1 aktivnosti in vitro i in vivo, sposobnost da inhibira sa B7-H1 posredovano preživljavanje tumorskih ćelija i sposobnost da inhibira sa B7-H1 posredovano suzbijanje tumorski reaktivnih T-ćelija, što za uzvrat može da smanji umnožavanje tumorskih ćelija, pokretljivost, invazivnost, metastaze i rast tumora.

[0034] U jednom primeru, pronalazak uključuje antitela koja se specifično vezuju za B7-H1 sa veoma jakim afinitetom (Kd). U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa afinitetom vezivanja (Kd) manjim od 5 nanomola (nM). U drugim primerima, ciljano vezujući agens vezuje sa Kd manjim od 4 nM, 3 nM, 2.5nM, 2 nM ili 1 nM. Dalje, u nekim drugim primerima antitela pronalaska vezuju B7-H1 sa Kd od oko 5 nM do oko 1 nM; ili oko 5 nM do oko 2 nM; ili oko 5 nM do oko 3 nM; ili oko 5 nM do oko 4 nM; ili oko 3 nM do oko 1 nM; ili oko 2 nM do oko 1 nM. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 950 pikomola (pM). U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 900 pM. U drugim primerima, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 800 pM, 700 pM ili 600 pM. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 500 pM. U drugim primerima, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 400 pM. U još nekim slučajevima ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 300 pM. U nekim drugim primerima, the targeted binding agent vezuju B7-H1 sa Kd manjim od 200 pM. U nekim drugim primerima, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 100 pM. Dalje, u nekim drugim primerima antitela pronalaska vezuju B7-H1 sa Kd od oko 900 pM do oko 100 pM; ili oko 900 pM do oko 200 pM; ili oko 900 pM do oko 300 pM; ili oko 900 pM do oko 400 pM; ili oko 900 pM do oko 500 pM; ili oko 900 pM do oko 600 pM; ili oko 900 pM do oko 700 pM; ili oko 200 pM do oko 100 pM; ili oko 300 pM do oko 200 pM; ili oko 400 pM do oko 300 pM. U nekim drugim primerima, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 55pM ili 50pM. U nekim drugim primerima, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 60 pM. U nekim drugim primerima, ciljano vezujući agens vezuje B7-H1 sa Kd manjim od 55 pM. Dalje, u nekim drugim primerima antitela pronalaska vezuju B7-H1 sa Kd od oko 100 pM do oko 50 pM; ili oko 100 pM do oko 70 pM; ili oko 100 pM do oko 80 pM; ili oko 100 pM do oko 90 pM; ili oko 70 pM do oko 50 pM; ili oko 60 pM do oko 50 pM; ili oko 55 pM do oko 50 pM. Kd se može proceniti korišćenjem postupka koji je ovde opisan ili poznat poznavaocu oblasti (npr., BIAcore esej, ELISA) (Biacore International AB, Uppsala, Sweden). Ciljano vezujući agensi pronalaska poseduju značajno poboljšan afinitet vezivanja za B7-H1 u poređenju sa antitelima opisanim u stanju tehnike.

[0035] Svojstva vezivanja ciljano vezujćeg agensa ili antitela pronalaska mogu takođe biti izmerena putem referentnih brzina disocijacije ili asocijacije (koffi konredom).

[0036] U jednom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska može imati konbrzinu (antitelo (Ab) antigen (Ag)<km>ĺ Ab-Ag) od najmanje 10<4>M<-1>s<-1>, najmanje 5 X 10<4>M<-1>s<-1>, najmanje 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 2 X 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 5 X 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 5 X 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 5 X 10<7>M<-1>s<-1>ili najmanje 10<8>M<-1>s<-1>prema merenjima sa BIAcore esejem. Dalje, u nekim drugim primerima antitela pronalaska imaju konbrzinu od oko 5 X 10<4>M<-1>s<-1>do oko 5 X 10<8>M<-1>s<-1>; ili od oko 5 X 10<5>M<-1>s<-1>do oko 5 X 10<8>M<-1>s<-1>; ili od oko 5 X 10<6>M<-1>s<-1>do oko 5 X 10<8>M<-1>s<-1>; ili od oko 5 X 10<7>M<-1>s<-1>do oko 5 X 10<8>M<-1>s<-1>, prema merenjima sa BIAcore esejem.

[0037] U drugom primeru pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo može imati koffbrzinu ((Ab-Ag)<koff>ĺ antitelo (Ab) antigen (Ag)) manju od 5x10<-1>s<-1>, manju nego 10<-1>s<-1>, manju nego 5x10<-2>s<-1>, manju nego 10<-2>s<-1>, manju nego 5x10<-3>s<-1>, manju nego 10<-3>s<-1>, manju nego 5x10<-4>s<-1>, manju nego 10<-4>s<-1>, manju nego 5x10<-5>s<-1>, manju nego 10<-5>s<-1>, manju nego 5x10<-6>s<-1>, manju nego 10<-6>s<-1>, manju nego 5x10<-7>s<-1>, manju nego 10<-7>s<-1>, manju nego 5x10<-8>s<-1>, manju nego 10<-8>s<-1>, manju nego<-9 -1 -9 - -10 -1>

5x10 s , manju nego 10 s<1>

ili manju nego 10 s prema merenjima sa BIAcore esejem. Dalje, u<-4 -1>0 s do oko 1 X 10<-5>s<-1>nekim drugim primerima antitela pronalaska imaju koffbrzinu od oko 1 X 1 ;<-4>

ili od oko 1 X 10<-4>s<-1>do oko 5 X 10 s<-1>

, prema merenjima sa BIAcore esejem.

[0038] Ciljano vezujući agens pronalaska specifično vezuje humani B7-H1. U nekim primerima, ciljano vezujući agens pronalaska ne vezuje druge imunske komodulatorne proteine, npr., humani PD-L2, humani B7-H2, humani B7-H3, humani CD28, humani CTLA-4 i humani PD1.

[0039] U drugom primeru, ciljano vezujući agens pronalaska je unakrsno reaktivan sa drugim B7-H1 proteinima iz drugih vrsta. U jednom primeru, ciljano vezujući agens pronalaska je unakrsno reaktivan sa B7-H1 majmuna makaki rakojeda. U drugom primeru, ciljano vezujući agens pronalaska je unakrsno reaktivan sa B7-H1 miša, npr., 2.7A4. U drugom primeru, ciljano vezujući agens pronalaska je unakrsno reaktivan sa B7-H1 majmuna makaki rakojeda i sa B7-H1 miša, npr., 2.7A4. U drugom primeru, ciljano vezujući agens pronalaska je unakrsno reaktivan sa B7-H1 majmuna makaki rakojeda ali ne i sa B7-H1 miša, npr., 2.9D10 i 2.14H9.

[0040] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja sadrži bilo koju od sekvenci teškog lanca (VH) prikazanu u Tabeli 8. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja sadrži bilo koju od sekvenci teškog lanca antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT. Promiskuitet lakog lanca je dobro poznat u oblasti, na taj način, ciljano vezujući agens ili antitelo koje obuhvata sekvencu koja sadrži bilo koju od sekvenci teškog lanca antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT ili drugog antitela kako je ovde opisano, mogu dalje da sadrže bilo koju od sekvenci lakog lanca (VL) prikazanu u Tabeli 9 ili antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT ili drugog antitela kako je ovde opisano. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja sadrži bilo koju od sekvenci teškog lanca antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT i dalje sadrži odgovarajuću sekvencu lakog lanca antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0041] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja sadrži bilo koju od sekvenci lakog lanca prikazanu u Tabeli 9. U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja sadrži bilo koju od sekvenci lakog lanca antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0042] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata bilo koju sekvencu teškog lanca antitela 2.7A4 i dalje obuhvata sekvencu lakog lanca antitela 2.7A4. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata bilo koju sekvencu teškog lanca antitela 2.14H9 i dalje obuhvata sekvencu lakog lanca antitela 2.14H9. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata bilo koju sekvencu teškog lanca antitela 2.9D10 i dalje obuhvata sekvencu lakog lanca antitela 2.9D10. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata bilo koju sekvencu teškog lanca antitela 2.7A.4OPT i dalje obuhvata sekvencu lakog lanca antitela 2.7A.4OPT. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata bilo koju sekvencu teškog lanca antitela 2.14H9OPT i dalje obuhvata sekvencu lakog lanca antitela 2.14H9OPT.

[0043] U nekim primerima, ciljano vezujući agens je bilo koje od monoklonalnih antitela kako je prikazano u Tabeli 1. U nekim primerima, ciljano vezujući agens je monoklonalno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od: 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT. U jednom primeru, ciljano vezujući agens sadrži jedno ili više kompletnih humanih monoklonalnih antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je monoklonalno antitelo 2.7A4. U određenim drugim primerima, ciljano vezujući agens je monoklonalno antitelo 2.14H9. U još nekim slučajevima, ciljano vezujući agens je monoklonalno antitelo 2.9D10. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je monoklonalno antitelo 2.7A4OPT. U određenim drugim primerima, ciljano vezujući agens je monoklonalno antitelo 2.14H9OPT. U dodatnim slučajevima, ciljano vezujući agens je izveden iz bilo kog od prethodnih monoklonalnih antitela.

[0044] U drugom primeru ciljano vezujući agens može sadržati sekvencu koja sadrži bilo koju od CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilnih sekvenci teškog lanca kodiranog polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G, 2.14H9_G, i 2.9D10_NG koji su deponovani u bazi NCIMB pod brojem 41598, 19. novembra 2008., pod brojem 41597, 19. novembra 2008., i pod brojem 41599, 19. novembra 2008., redom.

[0045] U drugom primeru ciljano vezujući agens može sadržati sekvencu koja sadrži bilo koji od CDR1, CDR2 ili CDR3 sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca kodiranih polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G, 2.14H9_G i 2.9D10_NG koji su deponovani pod brojem 41598, 19. novembra 2008., pod brojem 41597, 19. novembra 2008. ili pod brojem 4159919. novembra 2008, redom.

[0046] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u odredjenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 41598, 19. novembra 2008. i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 41598, 19. novembra 2008.

[0047] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 41598, 19. novembra 2008.

[0048] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 4159819. novembra 2008.

[0049] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 41598, 19. novembra 2008. i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 4159819. novembra 2008.

[0050] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597 19. novembra 2008.

[0051] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008., i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 4159719. novembra 2008.

[0052] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008.

[0053] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008.

[0054] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008. i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008.

[0055] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41599, 19. novembra 2008.

[0056] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41599, 19. novembra 2008. i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži CDR3, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41599, 19. novembra 2008.

[0057] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 4159919. novembra 2008.

[0058] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 4159919. novembra 2008.

[0059] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41599, 19. novembra 2008. i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili najmanje tri od CDR-a antitela, kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 4159919. novembra 2008.

[0060] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB broj 4159819. novembra 2008.

[0061] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska sadrži varijabilnu sekvencu teškog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 4159719. novembra 2008.

[0062] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41599, 19. novembra 2008.

[0063] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41598, 19. novembra 2008.

[0064] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008.

[0065] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 4159919. novembra 2008.

[0066] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41598, 19. novembra 2008. i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.7A4_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41598, 19. novembra 2008.

[0067] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008. i sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41597, 19. novembra 2008.

[0068] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41599, 19. novembra 2008. i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela kodiranu polinukleotidom u određenom plazmidu 2.9D10_NG koja je deponovana u bazi NCIMB pod brojem 41599, 19. novembra 2008.

[0069] U jednom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata CDR11 (HCDR1) teškog lanca, CDR2 (HCDR2) teškog lanca i CDR3 (HCDR3) teškog lanca koja je odabrana od bilo kojih sekvenci prikazanih u Tabeli 8. U jednom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata CDR1 (LCDR1) lakog lanca, CDR2 (LCDR2) lakog lanca i CDR3 (LCDR3) lakog lanca koja je odabrana od bilo kojih sekvenci prikazanih u Tabeli 9. U jednom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 koji je odabran od bilo kojih CDR-a antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8 ili 3.18G1. U jednom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata LCDR1, LCDR2 i LCDR3 koji je odabran od bilo kojih CDR-a antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8 ili 3.18G1.

[0070] Još jedan primer je ciljano vezujući agens ili antitelo koje se specifično vezuje za B7-H1 i obuhvata sekvencu koja obuhvata jednu od CDR2 i jednu od CDR3 sekvenci prikazanih u Tabeli 9. U daljem primeru ciljano vezujući agens ili antitelo dalje obuhvata sekvencu koja obuhvata: CDR3 sekvencu koja je prikazana u Tabeli 8. U daljem primeru ciljano vezujući agens ili antitelo dalje obuhvata sekvencu koja obuhvata: CDR2 i CDR3 sekvencu koja je prikazana u Tabeli 8 i/ili Tabeli 9. U daljem primeru ciljano vezujući agens ili antitelo dalje obuhvata sekvencu koja obuhvata: CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu koja je prikazana u Tabeli 8 i/ili Tabeli 9.

[0071] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata bilo koju od CDR1, CDR2 ili CDR3 iz bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, koja su prikazana u Tabeli 8. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata bilo koju od CDR1, CDR2 ili CDR3 iz bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, koja su prikazana u Tabeli 9. U jednom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT, koja su prikazana u Tabeli 8. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo može sadržati sekvencu koja obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 iz bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT, koje su prikazane u Tabeli 9. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4 koje su prikazane u Tabeli 8 i CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4 koje su prikazane u Tabeli 9. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.14H9 koje su prikazane u Tabeli 8 i CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.14H9 koje su prikazane u Tabeli 9. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.9D10 koje su prikazane u Tabeli 8 i CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.9D10 koje su prikazane u Tabeli 9. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0072] Primetno je da osobe stručne za stanje tehnike mogu lako izvršiti određivanje CDR-a. Videti na primer, Kabat i sar., Sekvence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Kabat obezbeđuje poravnanje multiplih sekvenci lanca imunoglobulina iz brojnih vrsta izotipova antitela. Poravnate sekvence su numerisane prema jedinstvenom numeričkom sistemu, kabatovom brojnom sistemu. Kabatove sekvence su ažurirane od publikacije iz 1991. godine i dostupne su kao baza elektronskih podataka (trenutno na raspolaganju na Kabat Database Website; videte takođe Nukleinska kiselinas Research, 2000, 28(1), 214-218). Svaka imunoglobulinska sekvenca može biti numerisana prema Kabatu tako što se vrši poravnanje sa referentnim nizom Kabata. Shodno tome, Kabat sistem numeracije obezbeđuje jedinstven sistem za numerisanje imunoglobulinskih lanaca.

[0073] Još jedan primer pronalaska je ciljano vezujući agens ili antitelo koja obuhvata sekvencu koja sadrži graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDRove, posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3, od bilo koje od sekvenci 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT ili koje su prikazane u Tabeli 8 ili Tabeli 9. Još jedan primer pronalaska je ciljano vezujući agens ili antitelo koja obuhvata sekvencu koja sadrži graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDRove, posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3, od bilo koje od sekvenci 2.9D10,2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT ili koje su prikazane u Tabeli 8 i Tabeli 9. U jednom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDRove, posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3, od bilo koje od sekvenci od monoklonalnih antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT ili koje su prikazane u Tabeli 8 ili Tabeli 9. Još jedan primer pronalaska je ciljano vezujući agens ili antitelo koja obuhvata sekvencu koja sadrži graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDRove, posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3, od bilo koje od sekvenci od monoklonalnih antitela 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT ili koje su prikazane u Tabeli 8 i Tabeli 9. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0074] U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska obuhvata CDR3 sekvencu koja je prikazana u Tabeli 8 ili 9; ili bilo koju od CDR1, CDR2 ili CDR3 sekvencu koja je prikazana u Tabeli 8 ili 9; ili CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu od sekvenci varijabilnog domena lakog lanca koje su prikazane u Tabeli 8; ili CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu od sekvenci varijabilnog domena teškog lanca koje su prikazane u Tabeli 9.

[0075] Jedan primer obezbeđuje ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, gde agens ili antitelo ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.:2, SEK ID BR.:7, SEK ID BR.: 12, SEK ID BR.: 17, SEK ID BR.:22, SEK ID BR.:27, SEK ID BR.:32, SEK ID BR.:37, SEK ID BR.:42, SEK ID BR.:47, SEK ID BR.:52, SEK ID BR.:57, SEK ID BR.:62, SEK ID BR.:67, SEK ID BR.:72 ili SEK ID BR.:77.

[0076] Jedan primer obezbeđuje ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, gde agens ili antitelo ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:2. U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:7. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0077] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:2 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:7.

[0078] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:12. U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.: 17. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0079] U jednom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:12 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:17.

[0080] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:22. U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:27. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0081] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:22 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:27.

[0082] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:32. U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:37. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0083] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:32 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:37.

[0084] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:42. U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:47. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0085] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:42 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:47.

[0086] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:52. U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:57. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:52 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:57.

[0087] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:62. U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:67. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0088] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:62 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:67.

[0089] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:72. U drugom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, dalje obuhvata sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEK ID BR.:77. U nekim primerima, antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0090] U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:72 i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa amino kiselinom iz SEK ID BR:77.

[0091] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata varijante ili derivate CDR-a opisanih ovde, graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDRove (posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3), sekvence lakog ili teškog lanca opisanih ovde ili antitela opisanih ovde. Varijante uključuju ciljano vezujuće agense ili antitela koja obuhvataju sekvence koji imaju čak dvadeset, šesnaest, deset, devet ili manje, npr. jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest aminokiselinskih adicija, supstitucija, delecija, i/ili umetanja u bilo kom od CDR1, CDR2 ili CDR3ova koji su prikazani u Tabeli 8 ili Tabeli 9, graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDR-a (posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3) koje su prikazane u Tabeli 8 ili Tabeli 9, sekvence lakog ili teškog lanca opisanih ovde ili sa monoklonalnim antitelima opisanim ovde. Varijante uključuju ciljano vezujuće agense ili antitela koja obuhvataju sekvence koji imaju jednu, dve ili tri aminokiselinske adicije, supstitucije, delecije, i/ili umetanja u bilo kom od CDR1, CDR2 ili CDR3ova koji su prikazani u Tabeli 8 ili Tabeli 9, graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDRove (posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3) koje su prikazane u Tabeli 8 ili Tabeli 9, sekvence lakog ili teškog lanca opisanih ovde ili sa monoklonalnim antitelima opisanim ovde. Varijante uključuju ciljano vezujuće agense ili antitela koja obuhvataju sekvence koje imaju najmanje oko 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 ili oko 99% identične aminokiselinske sekvence sa bilo kojim od CDR1, CDR2 ili CDR3ova koje su prikazane u Tabeli 8 ili Tabeli 9, graničnu sekvencu koja premošćava okvirne regione i CDRove (posebno od FR1 preko FR4 ili CDR1 preko CDR3) koje su prikazane u Tabeli 8 ili Tabeli 9, sekvence lakog ili teškog lanca opisanih ovde ili sa monoklonalnim antitelima opisanim ovde. Procenat identičnosti dve aminokiselinske sekvence može se odrediti bilo kojom metodom poznatom stručnjaku u oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, poravnanje uparenih proteina. U jednom primeru varijante obuhvataju promene u CDR sekvencama ili sekvencama lakog ili teškog lanca opisanim ovde koje se prirodno javljaju ili su uvedeni in vitro inženjeringom nativnih sekvenci korišćenjem rekombinantnih DNK tehnika ili tehnika mutageneze. Varijante koje se prirodno javljaju uključuju one koji se generišu in vivo u odgovarajućim nukleotidnim sekvencama germinalnih ćelijskih linija tokom stvaranja antitela kao odgovor na strani antigen.

[0092] U jednom primeru varijante uključuju ciljano vezujuće agense ili antitela koja obuhvataju sekvence koje imaju (a) VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 3;

(b) VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 4;

(c) VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 5;

(d) VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na VL CDR1 SEK ID BR: 8;

(e) VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 9; i

(f) VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 10.

[0093] U drugom primeru, varijante uključuju ciljano vezujuće agense ili antitela koja obuhvataju sekvence koje imaju VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 23;

(b) VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 24;

(c) VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 25;

(d) VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na VL CDR1 SEK ID BR: 28;

(e) VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 29; i

(f) VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu identičnu sa ili koji obuhvata supstituciju 1,2 ili 3 aminokiselinska ostatka u odnosu na SEK ID BR: 30.

[0094] U jednom primeru derivat može biti heteroantitelo, to je antitelo u kome su dva ili više antitela povezana zajedno. Derivati uključuju antitela koja su hemijski modifikovana. Primeri uključuju kovalentno vezivanje jednog ili više polimera, kao što su vodorastvorni polimeri, N-vezani ili O-vezani ugljeni hidrati, šećeri, fosfati, i/ili drugi slični molekuli. Derivati se modifikuju na način da se razlikuje od prirodnog ili početnog antitela, bilo u tipu ili u lokaciji vezanih molekula. Derivati dalje uključuju deleciju jedne ili više hemijskih grupa koje su prirodno prisutne na antitelu.

[0095] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 2. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 2, gde SEK ID BR.: 2 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostataka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 10. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 2, gde SEK ID BR.: 2 obuhvata bilo koju, bilo koja dva, bilo koja tri, bilo koja četiri ili svih pet ostataka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 10. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 2, gde SEK ID BR.: 2 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostataka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 10. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 2, gde SEK ID BR.: 2 obuhvata bilo koju, bilo koja dva, bilo koja tri, bilo koja četiri ili svih pet ostataka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 10.

[0096] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 7, gde SEK ID BR.: 7 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostataka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 11 i bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostataka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 11. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 7, gde SEK ID BR.: 7 obuhvata bilo koju, bilo koja dva, bilo koja tri, bilo koja četiri bilo kojih pet za svih pet ostataka germinalnih ćelijskih linija kako je naznačeno u Tabeli 11.

[0097] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 12. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 12, gde SEK ID BR.: 12 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostataka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 12. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 12, gde SEK ID BR.: 12 sadrži bilo koji, bilo koja dva ili oba ostatka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 12.

[0098] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 17. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 17, gde SEK ID BR.: 17 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostataka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija kako je naznačeno u svakom redu u Tabeli 13. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 17, gde SEK ID BR.: 17 obuhvata bilo koji, bilo koja dva, bilo koja tri, bilo koja četiri ili sva četiri ostatka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 13.

[0099] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 27. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 27, gde SEK ID BR.: 27 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostataka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 14. U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 27, gde SEK ID BR.: 27 obuhvata bilo koji, bilo koja dva, bilo koja tri ili sva tri ostatka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 14.

[0100] Još jedan primer pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo koji se takmiči u vezivanju za B7-H1 sa ciljano vezujućim agensom ili antitelima pronalaska. U drugom primeru pronalaska postoji antitelo koji se takmiči u vezivanju za B7-H1 sa ciljano vezujućim agensom ili antitelima pronalaska. U drugom primeru ciljano vezujući agens ili antitelo se takmiče u vezivanju za B7-H1 sa bilo kojim od kompletnih humanih monoklonalnih antitela 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D 10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT. "Takmičiti se" ukazuje na to da ciljano vezujući agens ili antitelo se takmiče u vezivanju za B7-H1 sa bilo kojim od kompletnih humanih monoklonalnih antitela 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT, tj. konkurencija je jednosmerna.

[0101] Primeri pronalaska uključuju ciljano vezujući agens ili antitelo koji se unakrsno takmiče sa bilo kojim od kompletnih humanih monoklonalnih antitela 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT u vezivanju za B7-H1. "Unakrsno se takmiče" ukazuje na to da ciljano vezujući agens ili antitelo se takmiče u vezivanju za B7-H1 sa bilo kojim od kompletnih humanih monoklonalnih antitela 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT, i obrnuto, tj. konkurencija je dvosmerna.

[0102] Još jedan primer pronalaska je ciljano vezujući agens ili antitelo koji se vezuju za isti epitop ili epitope na ekstracelularnom domenu humanog B7-H1 kao ciljano vezujući agens ili antitela pronalaska. Primeri pronalaska takođe uključuju ciljano vezujući agens ili antitelo koji se vezuju za isti epitop ili epitope na ekstracelularnom domenu humanog B7-H1 kao bilo koje od kompletnih humanih monoklonalnih antitela 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT.

[0103] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo vezuju epitop na humanom B7-H1 uključujući najmanje jednu ili više od sledećih aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od Asp na poziciji 122 i Arg na poziciji 125. U drugom primeru, antitelo pronalaska vezuje epitop na humanom B7-H1 koji obuhvata najmanje dva od sledeća tri aminokiselinska ostatka Asp na poziciji 122, Arg na poziciji 125 i Arg na poziciji 113. U drugom primeru, antitelo vezuje epitop na humanom B7-H1, gde antitelo ne pokazuje vezu za Ile na poziciji 54, Ser na poziciji 117 i Ala na poziciji 121 na humanom B7-H1. U još jednom slučaju, antitelo pronalaska gubi sposobnost vezivanja za humani B7-H1 ako je Arg na poziciji 113 mutiran do Ala ili do Tyr ili do Leu kao što je određeno esejem kompeticije u poređenju sa vezivanjem za divlji tip B7-H1. U još jednom slučaju, antitelo pronalaska gubi sposobnost vezivanja za humani B7-H1 ako je Arg na poziciji 125 mutiran do Ala ili do Gln ili do Ser kao što je određeno esejem kompeticije u poređenju sa vezivanjem za divlji tip B7-H1. U još jednom slučaju, antitelo pronalaska zadržava svoju sposobnost vezivanja za humani B7-H1 ako je Arg na poziciji 123 mutiran do Ala ili do Phe ili do Thr kao što je određeno esejem kompeticije u poređenju sa vezivanjem za divlji tip B7-H1. U ovom primeru, antitelo je 2.14H9. U drugom primeru, antitelo je 2.14H9OPT.

[0104] U jednom primeru, ciljano vezujući agens ili antitelo vezuje epitop na ekstracelularnom domenu humanog B7-H1 koji sadrži najmanje jednu ili više od sledećih aminokiselina Asp na poziciji 122 i Thr na poziciji 20. U jednom primeru, antitelo se vezuje na najmanje dva od sledeća tri aminokiselinska ostatka Phe na poziciji 19, Thr na poziciji 20 i Asp na poziciji 122 na humanom B7-H1. U drugom primeru, ne pokazuje vezivanje za najmanje jedan od sledeća tri aminokiselinska ostatka Ile na poziciji 54, Met na poziciji 115, Ser na poziciji 117 i Ala na poziciji 121 na humanom B7-H1. U još jednom slučaju, antitelo pronalaska gubi sposobnost vezivanja za humani B7-H1 ako je Phe na poziciji 19 mutiran do Ala ili do Gly ili do Ser kao što je određeno esejem kompeticije u poređenju sa vezivanjem za divlji tip B7-H1. U još jednom slučaju, antitelo pronalaska gubi sposobnost vezivanja za humani B7-H1 ako je Thr na poziciji 20 mutiran do Ala ili do Val ili do Asp kao što je određeno esejem kompeticije u poređenju sa vezivanjem za divlji tip B7-H1. U još jednom slučaju, antitelo pronalaska gubi sposobnost vezivanja za humani B7-H1 ako je Asp na poziciji 122 mutiran do Asn ili do Glu kao što je određeno esejem kompeticije u poređenju sa vezivanjem za divlji tip B7-H1. U još jednom slučaju, antitelo pronalaska zadržava svoju sposobnost vezivanja za humani B7-H1 ako je Arg na poziciji 123 mutiran do Ala ili do Phe ili do Thr kao što je određeno esejem kompeticije u poređenju sa vezivanjem za divlji tip B7-H1. U jednom primeru, antitelo je 2.7A4. U drugom primeru, antitelo je 2.7A4OPT.

[0105] U jednom primeru, ciljano vezujući agens je bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo je antitelo koje ima vezujuću specifičnost za najmanje dva različita epitopa na istom ili na različitim proteinima. Metode za izradu bispecifičnih antitela poznate su u stanju tehnike. (Videti, na primer, Millstein i sar., Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker i sar., EMBO J., 10:3655-3659 (1991); Suresh i sar., Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelny i sar., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992); Hollinger i sar., Proc. Natl acid. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Gruber i sar., J. Immunol., 152:5368 (1994); U.S. Patent Br.4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; i 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; i EP 03089.)

[0106] Primeri pronalaska opisani ovde odnose se na monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za B7-H1 i utiču na B7-H1 funkcionisanje. Drugi primeri se odnose na kompletna humana antitela koja se specifično vezuju za B7-H1 i na njihovo dobijanje sa željenim svojstvima sa terapeutskog aspekta, uključujući visok afinitet vezivanja za B7-H1, visoku selektivnost u inhibiciji B7-H1 signalizacije, slabu toksičnost, sposobnost blokiranja aktivnosti PD-1 receptora, sposobnost da inhibira B7-H1-indukovano preživljavanje tumorskih ćelija preko imunosupresije, sposobnost da inhibira B7-H1 posredovanu represiju antitumorske imunosti, što za uzvrat može da inhibira proliferaciju ili invazivnosti srodnih bolesti uključujući neoplastična oboljenja, i/ili sposobnost tumorskih ćelija da rastu in vitro i in vivo. Još neki drugi primeri se odnose na metod represije B7-H1-posredovane inhibicije T ćelija kod životinja davanjem životinji, kojima je to potrebno delotvornu količinu kompozicije koja sadrži antitela pronalaska. Još neki drugi primeri se odnose na kompletna humana antitela koja se specifično vezuju za B7-H1 i na njihovo dobijanje koje ne rezultiraju značajnim Odgovorom humanog anti-himernog antitela (HACA), omogućavajući time ponovnu administraciju.

[0107] U jednom primeru pronalaska obezbeđen je molekul nukleinske kiseline koji kodira za bilo koji od ciljano vezujućih agensa ili antitela pronalaska. U jednom primeru je molekul nukleinske kiseline koja kodira za laki lanac ili za teški lanac antitela pronalaska. U jednom primeru molekul nukleinske kiseline kodira za laki lanac ili teški lanac kompletnog humanog monoklonalnog antitela bilo kog antitela opisanog ovde. U jednom primeru, molekul nukleinske kiseline kodira za laki lanac ili teški lanac bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT. U drugom primeru, molekul nukleinske kiseline kodira za laki lanac i teški lanac bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT. Pronalazak takođe obuhvata polinukleotide koji hibridizuju pod strogim ili manje strogim uslovima hibridizacije, kako je definisano ovde, do polinukleotida koji kodiraju za bilo koji od ciljano vezujućih agensa ili antitela opisanih ovde.

[0108] U drugom primeru pronalaska obezbeđen je vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline ili molekule kao što je ovde opisano, gde vektor kodira za ciljano vezujući agens kao što je opisano gore. U jednom primeru pronalaska obezbeđen je vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline ili molekule kao što je ovde opisano, gde vektor kodira za laki lanac i/ili za teški lanac antitela kako je definisano gore. U jednom primeru, vektor sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira za laki lanac i/ili za teški lanac kompletnog humanog monoklonalnog antitela. U jednom primeru, vektor sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira za laki lanac ili za teški lanac iz bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT. U drugom primeru, vektor sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira za laki lanac i za teški lanac iz bilo kog od kompletnog humanog monoklonalnog antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT.

[0109] U dodatnom slučaju obezbeđuje se ćelija domaćina transformisana sa bilo kojim molekulom nukleinske kiseline kako je gore opisano. U drugom primeru pronalaska obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline kako je ovde opisano. U jednom primeru ćelija domaćina može sadržati više od jednog vektora.

[0110] Kao što je poznato u oblasti, antitela poželjno mogu biti, na primer, poliklonalna, oligoklonalna, monoklonalna, himerična, humanizovana, i/ili kompletno humana antitela.

[0111] Biće prihvaćeno da primeri pronalaska nisu limitarni na bilo koji posebni oblik antitela ili postupak generisanja ili proizvodnje. U nekim primerima pronalaska ciljano vezujući agens je vezujući fragment kompletnog humanog monoklonalnog antitela. Na primer, ciljano vezujući agens može biti antitelo kompletne dužine (npr., ima netaknuti humani Fc region) ili vezujući fragment antitela (npr., Fab, Fab’ ili F(ab’)2, Fv, dAb ili drugi dobro poznati fragment antitela, kao što je detaljnije opisano u nastavku). Pored toga, antitela mogu biti antitela sa pojedinačnim domenom kao što su kamelidni ili humani pojedinačni VH ili VL domeni koji se vezuju na B7-H1, kao što je dAb fragment.

[0112] Primeri pronalaska opisani ovde takođe obezbeđuju ćelije za proizvodnju ovih antitela. Primeri ćelija uključuju hibridome ili rekombinantno kreirane ćelije, kao što su ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), varijante CHO ćelija (na primer DG44) i NS0 ćelije koje proizvode antitela usmerena na B7-H1. Dodatne informacije o varijantama CHO ćelija mogu se naći u Andersen i Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15, 456-462.

[0113] Antitelo može biti proizvedeno iz hibridoma koji luče antitela ili iz rekombinantno konstruisane ćelije koja je transformisana ili transfektovana genom ili genima koji kodiraju za antitelo.

[0114] Pored toga, jedan primer pronalaska je metod proizvodnje ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska kultivacijom ćelija domaćina pod uslovima u kojim molekul nukleinske kiseline je eksprimiran za proizvodnju ciljano vezujućeg agensa ili antitela nakon čega sledi izdvajanje ciljano vezujućeg agensa ili antitela. U jednom primeru je metod proizvodnje antitela pronalaska kultivacijom ćelija domaćina pod uslovima u kojim molekul nukleinske kiseline je eksprimiran za proizvodnju antitela, nakon čega sledi izdvajanje antitela. Još neki drugi primeri uključuju antitelo pronalaska proizvedeno metodom kultivacije ćelija domaćina koje eksprimiraju za antitelo kodirano sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira za antitelo pronalaska, i izolovanja naznačenog antitela iz naznačene kulture.

[0115] Trebalo bi se shvatiti da primeri pronalaska takođe uključuju bilo koji molekul nukleinske kiseline koji kodira za antitelo ili fragment antitela pronalaska uključujući sekvence nukleinske kiseline optimizovane za povećani prinos antitela i njihovih fragmenata kada se transfektiraju u ćelije domaćina za proizvodnju antitela.

[0116] Još jedan primer ovde uključuje metod za proizvodnju antitela koja se specifično vezuju za B7-H1 i inhibiraju biološku aktivnost B7-H1, pomoću imunizacije sisara sa ćelijama koje eksprimiraju za B7-H1, izolovanim ćelijskim membranama koje sadrže B7-H1, prečišćenim B7-H1 ili njegovim delom, i/ili jednom ili više ortolognih sekvenci ili njihovim fragmentima.

[0117] Još jedan primer ovde uključuje metod za proizvodnju antitela sa visokim afinitetom koja se specifično vezuju za B7-H1 i inhibiraju biološku aktivnost B7-H1, pomoću imunizacije sisara sa ćelijama koje eksprimiraju za B7-H1, izolovanim ćelijskim membranama koje sadrže B7-H1, prečišćenim B7-H1 ili njegovim delom, i/ili jednom ili više ortolognih sekvenci ili njihovim fragmentima.

[0118] Drugi primeri su zasnovani na generisanju i identifikaciji izolovanih antitela koja se specifično vezuju za B7-H1 i inhibiraju biološku aktivnost B7-H1. B7-H1 je eksprimiran na brojnim tipovima tumora. Antitela koja se specifično vezuju za B7-H1 mogu sprečiti Sa B7-H1 posredovano preživljavanje tumorskih ćelija i inhibirati B7-H1 posredovanu represiju antitumorskih imunskih odgovora preko imunosupresije, što za uzvrat može smanjiti invazivnost tumorskih ćelija, metastaze, rast tumora, i druga svojstva.

[0119] Pored toga, antitelo može biti proizvedeno iz hibridoma koji luče antitela ili iz rekombinantno konstruisane ćelije koja je transformisana ili transfektovana sa genom ili genima koji kodiraju za antitelo.

[0120] U jednom primeru postoji hibridom koji proizvodi ciljano vezujući agens ili antitela pronalaska. U jednom primeru postoji hibridom koji proizvodi laki lanac i/ili teški lanac antitela pronalaska. U jednom primeru hibridom može da proizvede laki lanac i/ili teški lanac kompletnog humanog monoklonalnog antitela. U drugom primeru, hibridom proizvodi laki lanac i/ili teški lanac kompletnog humanog monoklonog antitela 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT. Alternativno, hibridom može da proizvede antitelo koje se vezuje za isti epitop ili epitope kao kompletno humano monoklonalno antitelo 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT. Alternativno, hibridom može da proizvede antitelo koje se takmiči u vezivanju za B7-H1 sa kompletnim humanim monoklonalnim antitelom 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT. Alternativno, hibridom može da proizvede antitelo koje se unakrsno takmiči u vezivanju za B7-H1 sa kompletnim humanim monoklonalnim antitelom 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT.

[0121] U drugim primerima pronalazak obezbeđuje kompozicije, uključujući ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska ili njihovog vezujućeg fragmenta i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0122] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode za lečenje proliferativnih ili invazivnih srodnih oboljenja kod životinja davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za proliferativno ili invazivno srodno oboljenje, i davanje životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima, životinja je čovek. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je kompletno humano monoklonalno antitelo. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je antitelo pronalaska i može biti izabrano iz grupe koja se sastoji od 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT.

[0123] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode inhibicije ćelijske proliferacije ili invazivnog srodnog oboljenja, sa B7-H1 posredovanom komponentom, kod životinja davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za priliferativno ili invazivno srodno oboljenje, sa 87-H1 posredovanom komponentom, davanje navedenoj životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima, životinja je čovek. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je kompletno humano monoklonalno antitelo. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je antitelo pronalaska i može biti izabrano iz grupe koja se sastoji od 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT.

[0124] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode inhibicije invazivnosti tumorskih ćelija, ćelijske metastaze ili rast tumora kod životinja davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za tumorske ćelije, invazivnost, ćelijske metastaze ili rast tumora, i davanje životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima, životinja je čovek. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je kompletno humano monoklonalno antitelo. U određenim slučajevima, ciljano vezujući agens je antitelo pronalaska i može biti izabrano iz grupe koja se sastoji od 2.7A4, 2.14H9 ili 2.9D10, 2.7A4OPT ili 2.14H9OPT.

[0125] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode lečenja životinje koja pati od neoplastične bolesti davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za neoplastičnu bolest, i davanje životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska.

[0126] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode lečenja životinje koja pati od ne-neoplastične bolesti davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za neneoplastičnu bolest, i davanje životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska.

[0127] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode lečenja životinje koja pati od hronične viralne infekcije davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za hroničnu viralnu infekciju, i davanje životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska.

[0128] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode lečenja životinje koja pati od malignog tumora davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za maligni tumor, i davanje životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska.

[0129] Drugi još primeri pronalaska uključuju metode lečenja životinje koja pati od oboljenja ili stanja udruženih sa B7-H1 ekspresijom davanjem životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska. U određenim slučajevima metod dalje obuhvata odabir životinje kojoj je potreban tretman za oboljenja ili stanja udruženih sa B7-H1 ekspresijom, i davanje životinji terapeutski delotvorne doze ciljano vezujućeg agensa pronalaska.

[0130] Maligni tumor može biti izabran iz grupe koja se sastoji od: čvrsti tumori kao što su melanomi, karcinoma kože, karcinom malih ćelija pluća, karcinom ne-malih ćelija pluća, glioma, hepatocelularnog karcinoma (jetre), karcinom žučne kese, tumor štitaste žlezde, karcinom kostiju, gastrični (želudačni) karcinom, karcinom prostate, karcinom grudi, rak jajnika, rak grlića materice, karcinom materice, vulvalni karcinom, karcinom endometrijuma, karcinom testisa, karcinom mokraćne bešike, karcinom pluća, glioblastom, karcinom endometrijuma, karcinom bubrega, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom debelog creva, kolorektalni, karcinom pankreasa, karcinom ezofagusa, karcinom mozga/CNS, karcinomi glave i vrata, neuronalni karcinom, mezoteliomi, sarkomi, bilijarni (holangiokarcinomi), adenokarcinomi tankih creva, pedijatrijski maligniteti, epidermoidni karcinomi, sarkomi, karcinom pleuralnih/peritonealnih membrana i leukemije, uključujući i akutnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastičnu leukemija i višestruki mielom.

[0131] Tretirajuće proliferativne ili invazivne srodne bolesti uključuju neoplastične bolesti, kao što su, melanom, karcinom kože, karcinom malih ćelija pluća, karcinom ne-malih ćelija pluća, pljuvačni žlezda, gliomi, hepatocelularni karcinom (jetre), karcinom žučne kese, tumor štitaste žlezde, karcinom kostiju, gastrični karcinom (želuca), rak prostate, karcinom grudi, tumor jajnika, karcinoma grlića materice, karcinom materice, vulvalni karcinom, karcinom endometrijuma, rak testisa, rak bešike, karcinom pluća, glioblastom, karcinom štitne žlezde, karcinom endometrijuma, karcinom debelog creva, karcinom pankreasa, karcinoma jednjaka, karcinom mozga/CNS, rak neurona, karcinomi glave i vrata, mezoteliomia, sarkomi, bilijarni (holangiokarcinom), adenokarcinomom tankih creva, pedijatrijski maligniteti, epidermoidni karcinomi, sarkomi, karcinomi pleuralnih/peritonealnih membrana i leukemije, uključujući akutnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, i višestruki mielom. Tretirajuće hronične virusne infekcije uključujući HIV, hepatitis B virus (HBV), i hepatitis C virus (HCV) kod ljudi, simijan virus imunodeficijencije (SIV) kod majmuna, i limfocitni koriomeningitis virus (LCMV) kod miševa.

[0132] Invazivnost ćelija i/ili proliferacija ćelija kao posledica bolesti može biti bilo koja abnormalna, nepoželjna ili patološka invazivnost i/ili proliferacija ćelija, na primer, invazivnost i/ili proliferacija ćelija u vezi sa tumorom.

[0133] U jednom primeru, neoplastična bolest je čvrst tumor odabran od bilo kojeg od sledećih: karcinom dojke, debelog creva, kolorektalni, prostate, želuca, gastrični, jajnika, jednjaka, pankreasa, žučne kese, karcinom malih ćelija pluća, tiroidne žlezde, endometrijski, glave i vrata, bubrežni karcinom bubrežnih ćelija, bešike i gliomi.

[0134] U jednom primeru predmetni pronalazak je pogodan za primenu kod inhibicije B7-H1, kod pacijenata sa tumorom koji samostalno ili delimično zavisi od B7-H1.

[0135] Drugi još primeri pronalaska uključuju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi medikamenta za lečenje životinje koja pati od proliferativne ili od bolesti povezane sa invazijom. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman za proliferativnu ili invazivnu bolest.

[0136] Drugi još primeri pronalaska obuhvataju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi medikamenta za lečenje bolesti proliferacije ili invazije, sa B7-H1 posredovanom komponentom, kod životinje. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman za proliferaciju ili bolest vezanu za invaziju, sa B7-H1 posredovanom komponentom.

[0137] Drugi još primeri pronalaska uključuju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi medikamenta za lečenje invazije tumorskih ćelija, ćelijske metastaze ili rasta tumora kod životinja. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potrebno lečenje od invazije tumorskih ćelija, ćelijske metastaze ili tumora.

[0138] Drugi još primeri pronalaska obuhvataju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi leka za lečenje životinja koja pati od neoplastične bolesti. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman za neoplastičnu bolest.

[0139] Drugi još primeri pronalaska uključuju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi leka za lečenje životinje koja pati od bolesti u kojoj je etiologija povezana sa infektivnim agensom, kao što je, na primer, hepatocelularni kancer, karcinom želuca ili rak grlića materice. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman za neoplastičnu bolest.

[0140] Drugi još primeri pronalaska uključuju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi medikamenta za lečenje životinje koja pati od ne-neoplastične bolesti. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman za neneoplastičnu bolest.

[0141] Drugi još primeri pronalaska uključuju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi medikamenta za lečenje životinje koja pati od hronične virusne infekcije. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman za neneoplastičnu bolest. U još nekim slučajevima, upotreba dalje obuhvata očnu bolest, zapaljensku bolest, kardiovaskularne bolesti i sepsu.

[0142] Drugi još primeri pronalaska obuhvataju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi medikamenta za lečenje životinja koja pati od malignog tumora. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman malignog tumora.

[0143] Drugi još primeri pronalaska uključuju upotrebu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska u pripremi medikamenta za lečenje životinje koja pati od bolesti ili stanja povezanih sa ekspresijom B7-H1. U određenim slučajevima upotreba dalje obuhvata selekciju životinje kojoj je potreban tretman za bolest ili stanje povezano sa ekspresijom B7-H1.

[0144] Drugi još primeri pronalaska uključuju ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska za upotrebu kao medikamenta za lečenje životinje koja pati od proliferativnog ili invazivnog srodnog oboljenja.

[0145] Drugi još primeri pronalaska uključuju ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska za upotrebu kao medikamenta za lečenje životinje koja pati od invazije tumorskih ćelija, ćelijske metastaze ili rasta tumora kod životinje.

[0146] Drugi još primeri pronalaska uključuju ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska za upotrebu kao medikamenta za lečenje životinje koja pati od bolesti ili stanja povezanih sa ekspresijom B7-H1.

[0147] U jednom primeru tretman:

- proliferativnog ili invazivnog srodnog oboljenja;

- neoplastične bolesti;

- ne-neoplastične bolesti;

- malignog tumora; ili

- hronične virusne infekcije; ili

- bolesti ili stanja povezanih sa ekspresijom B7-H1,

obuhvata upravljanje, poboljšanje, sprečavanje bilo koje od pomenutih bolesti ili stanja.

[0148] U jednom primeru lečenje neoplastične bolesti obuhvata inhibiciju rasta tumora, odlaganje rasta tumora, regresiju tumora, skupljanje tumora, produženje vremena do ponovnog rasta tumora po prestanku lečenja, produženje vremena do ponovnog javljanja tumora, usporavanje progresije bolesti.

[0149] U jednom primeru lečenje bolesti ili stanja povezanih sa ekspresijom B7-H1 obuhvata inhibiranje rasta ćelija koje eksprimiraju B7-H1.

[0150] U nekim primerima, nakon primene ciljno vezujućeg agensa ili antitela pronalaska, primenjuje se sredstvo za čišćenje, da bi se uklonio višak cirkulišućeg antitela iz krvi.

[0151] U nekim primerima pronalaska, životinja koja se tretira je čovek.

[0152] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens je kompletno humano monoklonalno antitelo.

[0153] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens je izabran iz grupe koja se sastoji od kompletnih humanih monoklonalnih antitela 2.7A4, 2.14H9 i 2.9D10.

[0154] Primeri pronalaska uključuju konjugat koji sadrži ciljano vezujući agens kao što je ovde opisano i terapeutsko sredstvo. U nekim slučajevima pronalaska, terapeutski agens je toksin. U drugim slučajevima, terapeutski agens je radioizotop. U još nekim slučajevima, terapeutski agens je farmaceutska kompozicija.

[0155] U drugom aspektu, obezbeđen je metod selektivnog ubijanja kancerogene ćelije kod pacijenta. Postupak obuhvata davanje konjugata potpuno humanog antitela pacijentu. Konjugat potpuno humanog antitela sadrži antitelo koje se može vezati za B7-H1 i agens. Agens je ili toksin, radioizotop ili druga supstanca koja će ubiti ćeliju kancera. Konjugat antitela na taj način selektivno ubija ćelije kancera.

[0156] U jednom aspektu, obezbeđeno je konjugovano potpuno humano antitelo koje se specifično vezuje za B7-H1. Vezan za antitelo je agens, a vezivanje antitela na ćeliju rezultira u isporuci agensa u ćeliju. U jednom slučaju, gore navedeno konjugovano kompletno humano antitelo se vezuje za ekstracelularni domen B7-H1. U drugom slučaju, antitelo i konjugovani toksin se internalizuju ćelijom koja eksprimira B7-H1. U drugom slučaju, agens je citotoksični agens. U drugom slučaju, agens je, na primer, saporin ili auristatin, pseudomonasov egzotoksin, gelonin, ricin, kaliheamicin ili imunokonjugati zasnovani na maitansinu, i slično. U još jednom primeru, agens je radioizotop.

[0157] Ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska može se davati samostalno ili se može primeniti u kombinaciji sa dodatnim antitelima ili hemoterapeutskim lekovima ili radioterapijom ili terapijskim vakcinama. Na primer, monoklonalna, oligoklonska ili poliklonalna smeša sa B7-H1 antitelima koja blokira B7-H1 posredovanu represiju protiv tumorske imunosti može se primeniti u kombinaciji sa lekom koji je pokazo da inhibira proliferaciju tumorskih ćelija.

[0158] Prema još jednom aspektu pronalaska obezbeđen je farmaceutski preparat koji sadrži ciljano vezujući agens antitela pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0159] Još jedan primer pronalaska uključuje metod za dijagnostikovanje bolesti ili stanja u kojima antitelo opisano ovde služi za otkrivanje prisustva i/ili nivoa B7-H1 u pacijentu ili u uzorku pacijenta. U jednom slučaju, uzorak pacijenta je krv ili krvni serum ili urin. U drugim slučajevima prikazane su metode za identifikaciju faktora rizika, dijagnozu bolesti i fazu bolesti koja uključuje identifikaciju ekspresije i/ili prekomerne ekspresije B7-H1 koristeći anti-B7-H1 antitela. U nekim slučajevima, metode obuhvataju davanje pacijentu konjugat kompletnog humanog antitela koji se selektivno vezuje za B7-H1 na ćeliji. Konjugat antitela sadrži antitelo koje se specifično vezuje za B7-H1 i oznaku. Metode dalje obuhvataju posmatranje prisustva oznaka kod pacijenta. Relativno visoka količina oznaka ukazuje na relativno visok rizik od oboljenja, a relativno niska količina oznaka ukazuje na relativno mali rizik od oboljenja. U jednom slučaju, oznaka je zeleni fluorescentni protein.

[0160] Pronalazak dalje obezbeđuje metode za ispitivanje prisustva i/ili nivoa B7-H1 u uzorku pacijenta, koji obuhvata kontakt antitela kako je ovde opisano sa biološkim uzorkom pacijenta i otkrivanje nivoa vezivanja između navedenog antitela i B7-H1 u navedenom uzorku. U specifičnijim slučajevima, biološki uzorak je krv, plazma ili serum.

[0161] Drugi primer pronalaska obuhvata metod za dijagnostiku stanja povezanog sa ekspresijom B7-H1 u ćeliji, dovođenjem u kontakt seruma ili ćelije sa antitelom kako je ovde opisano, a zatim detekcijom prisustva B7-H1. U jednom slučaju, stanje može biti proliferativna ili sa invazijom povezana bolest koja uključuje, ali nije ograničena na, neoplastičnu bolest.

[0162] U drugom primeru, pronalazak uključuje esejski set za detekciju B7-H1 u sisarskim tkivima, ćelijama ili telesnim tečnostima. Takav set bi bio koristan za proveru prisustva bolesti povezanih sa B7-H1. Set sadrži ciljano vezujući agens ili antitelo pronalaska i sredstvo za indikaciju reakcije ciljano vezujućeg sredstva ili antitela sa B7-H1, ako je prisutno. U jednom slučaju antitelo je monoklonalno antitelo. U jednom slučaju, antitelo koje vezuje B7-H1 je označeno. U drugom slučaju, antitelo je neoznačeno primarno antitelo, a set dalje sadrži sredstva za detekciju primarnog antitela. U jednom slučaju, sredstva za detekciju uključuju označeno drugo antitelo koje je anti-imunoglobulin. Antitelo može biti obeleženo oznakom koja se bira iz grupe koju čine fluorohrom, enzim, radioizotop i radioaktivni materijal.

[0163] U nekim primerima, ciljano vezujući agensi ili antitela kako su opisani ovde mogu se modifikovati kako bi se povećala njihova sposobnost fiksiranja komplementa i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). U drugim slučajevima ciljano vezujući agensi ili antitela mogu se modifikovati kako bi se povećala njihova sposobnost aktiviranja efektorskih ćelija i Xčestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). U još nekim slučajevima ciljano vezujući agensi ili antitela mogu se modifikovati kako bi se povećala njihova sposobnost aktiviranja efektorskih ćelija i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) kao i povećati njihovu sposobnost fiksiranja komplementa i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC).

[0164] U nekim primerima, ciljano vezujući agensi ili antitela kako su opisani ovde mogu se modifikovati da bi se smanjila njihova sposobnost fiksiranja komplementa i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). U drugim slučajevima ciljano vezujući agensi ili antitela mogu se modifikovati da bi se smanjila njihova sposobnost aktiviranja efektorskih ćelija i Xčestvovanje u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). U još nekim slučajevima ciljano vezujući agensi ili antitela kako su opisani ovde mogu se modifikovati kako bi se smanjila njihova sposobnost aktiviranja efektorskih ćelija i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) kao i smanjila njihova sposobnost fiksiranja komplementa i učestvovanja u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC).

[0165] U određenim slučajevima, vreme poluraspada ciljano vezujućeg sredstva ili antitela kako su opisani ovde i kompozicije pronalaska je najmanje oko 4 do 7 dana. U određenim slučajevima, vreme poluraspada ciljanog vezujućeg sredstva ili antitela kako je ovde opisano i kompozicije pronalaska je najmanje oko 2 do 5 dana, 3 do 6 dana, 4 do 7 dana, 5 do 8 dana, 6 do 9 dana, 7 do 10 dana, 8 do 11 dana, 8 do 12, 9 do 13, 10 do 14, 11 do 15, 12 do 16, 13 do 17, 14 do 18, 15 do 19 ili 16 do 20 dana. U drugim slučajevima, vreme poluraspada ciljanog vezujućeg sredstva ili antitela kako je ovde opisano i kompozicije pronalaska je najmanje oko 17 do 21 dan, od 18 do 22 dana, od 19 do 23 dana, od 20 do 24 dana, 21 do 25, dana, 22 do 26 dana, 23 do 27 dana, 24 do 28 dana, 25 do 29 dana ili 26 do 30 dana. U još nekim slučajevima vreme poluraspada ciljanog vezujućeg sredstva ili antitela, kao što je ovde opisano, i kompozicije pronalaska može biti do oko 50 dana. U određenim slučajevima, vreme poluraspada antitela i kompozicije pronalaska može se produžiti metodama poznatim u stanju tehnike. Takvo produženje može, s druge strane, smanjiti količinu i/ili učestalost doziranja kompozicija antitela. Antitela sa poboljšanim in vivo vremenom poluraspada in vivo i metode za njihovu pripremu opisani su u US patentu broj 6,277,375; i međunarodnoj objavi br. WO 98/23289 i WO 97/3461.

[0166] U drugom primeru, pronalazak obezbeđuje predmet proizvodnje uključujući i kontejner.

Kontejner sadrži kompoziciju koja sadrži ciljano vezujući agens ili antitelo kao što je ovde opisano i uložak u pakovanju ili etiketu koja ukazuje na to da se kompozicija može koristiti za lečenje adhezije ćelija, bolesti invazije, angiogeneze i/ili proliferacije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, bolesti koje karakteriše ekspresija ili prekomerna ekspresija B7-H1.

[0167] U drugim primerima, pronalazak obezbeđuje set za lečenje bolesti koje uključuju ekspresiju B7-H1, koja obuhvata ciljano vezujući agens ili antitelo kako je ovde opisano, kao i uputstva za davanje monoklonalnih antitela subjektu kojem je potrebno lečenje.

[0168] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulaciju proteina koji sadrže varijantu Fc regiona. To je ne-prirodni Fc region, na primer Fc region koji obuhvata jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji se prirodno ne pojavljuju. Takođe, obuhvaćeni varijantnim Fc regionima predmetnog pronalaska su Fc regioni koji sadrže delecije, adicije i/ili modifikacije aminokiselina.

[0169] Period vremena poluraspada seruma proteina koji sadrže Fc regione može se povećati povećanjem afiniteta vezivanja Fc regiona za FcRn. U jednom primeru, Fc varijantni protein je poboljšao vreme poluraspada seruma u odnosu na uporedivi molekul.

[0170] U drugom primeru, predmetni pronalazak obezbeđuje Fc varijantu, pri čemu Fc region sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja se ne pojavljuje prirodno u jednoj ili više pozicija odabranih iz grupe koja se sastoji od 239, 330 i 332, kao što je označeno EU indeksom kao set u Kabatu. U konkretnom primeru, predmetni pronalazak obezbeđuje Fc varijantu, pri čemu Fc region sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja nije prirodno prisutna koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od 239D, 330L i 332E, kao što je označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. Opciono, region Fc može dodatno da sadrži dodatnu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija odabranih iz grupe koja se sastoji od 252, 254 i 256, kao što je označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U konkretnom primeru, predmetni pronalazak obezbeđuje Fc varijantu, pri čemu Fc region sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje izabranu iz grupe koji se sastoji od 239D, 330L i 332E, kao što je to označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu i najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 252I, 254T i 256E, kako je to označeno od strane EU indeksa kako je navedeno u Kabatu.

[0171] U drugom primeru, predmetni pronalazak obezbeđuje Fc varijantu, gde Fc region sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja nije prirodno prisutna u jednoj ili više pozicija odabranih iz grupe koja se sastoji od 234, 235 i 331, kao što je označeno indeksom EU postavljenim u Kabatu. U konkretnom primeru, predmetni pronalazak obezbeđuje Fc varijantu, pri čemu Fc region sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje, a koja je izabrana iz grupe koju čine 234F, 235F, 235Y, 235E i 331S, kao što je označeno EU indeksom kako je navedeno u Kabatu. U daljem specifičnom slučaju, Fc varijanta pronalaska sadrži 234F, 235F i 331S ostatke aminokiseline koja nije prirodno prisutna, kao što je označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U drugom specifičnom primeru, Fc varijanta pronalaska sadrži 234F, 235Y i 331S ostatke aminokiseline koja se prirodno ne pojavljuje, kao što je to označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U drugom specifičnom primeru, Fc varijanta pronalaska sadrži 234F, 235E i 331S ostatke aminokiseline koja nije prirodno prisutna, kao što je do označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. Opciono, region Fc može dodatno da sadrži dodatnu aminokiselinu koja nije prirodno prisutna, na jednoj ili više pozicija odabranih iz grupe koja se sastoji od 252, 254 i 256, kao što je označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U konkretnom slučaju, predmetni pronalazak obezbeđuje Fc varijantu, pri čemu region Fc sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja se ne prirodno javlja, izabrana iz grupe koju čine 234F, 235F, 235I, 235E i 331S, kao što je to označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu; najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje, izabranu iz grupe koja se sastoji od 234F, 235F i 331S, kao što je označeno indeksom EU kako je navedeno u Kabatu, a najmanje jedna aminokiselina koja se prirodno ne pojavljuje u jednoj ili više pozicija odabrana je od grupe koja se sastoji od 252Y, 254T i 256E, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. Kao što je ovde korišćeno, oznake "OPT" i "TM" su sinonimi i koriste se za opisivanje antitela pronalaska koja su konstruisana da uvedu tri mutacije; L234F i L235E u okvir i P331S u CH2 domen molekula IgG da bi se eliminisala njegova sposobnost pokretanja ćelijski posredovane citotoksičnosti, zavisne od antitela, i citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (Oganesian V. i sar. (2008), Acta Crist., D64 : 700-704).

[0172] U drugom primeru, predmetni pronalazak obezbeđuje Proteinsku formulaciju Fc varijante, pri čemu Fc region obuhvata najmanje aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 239, 330 i 332, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U specifičnom slučaju, predmetni pronalazak obezbeđuje proteinsku formulaciju Fc varijante, pri čemu Fc region obuhvata najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje izabranu iz grupe koja se sastoji od 239D, 330L i 332E, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. Opciono, Fc region može dalje da obuhvata dodatnu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 252, 254, i 256, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U specifičnom slučaju, predmetni pronalazak obezbeđuje proteinsku formulaciju Fc varijante, pri čemu Fc region obuhvata najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje izabranu iz grupe koja se sastoji od 239D, 330L i 332E, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu i najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od 252Y, 254T i 256E, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu.

[0173] U drugom primeru, predmetni pronalazak obezbeđuje proteinsku formulaciju Fc varijante, pri čemu Fc region obuhvata najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 234, 235 i 331, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U specifičnom slučaju, predmetni pronalazak obezbeđuje proteinsku formulaciju Fc varijante, pri čemu Fc region obuhvata najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje izabranu iz grupe koja se sastoji od 234F, 235F, 235Y, 235E i 331S, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. Opciono, Fc region može dalje da obuhvata dodatnu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od 252, 254, i 256, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu. U specifičnom slučaju, predmetni pronalazak obezbeđuje proteinsku formulaciju Fc varijante, pri čemu Fc region obuhvata najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje izabranu iz grupe koja se sastoji od 234F, 235F, 235Y, 235E i 331S, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu; i najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje na jednoj ili više pozicija koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od 252Y, 254T i 256E, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu.

[0174] Metode za generisanje Fc regiona koji se prirodno ne pojavljuju poznate su u stanju tehnike. Na primer, supstitucija aminokiselina i/ili delecija može se generisati metodama mutageneze, ukljčujući, ali ne ograničavajući se na, lokacijom usmerena mutageneza (Kunkel, Proc. Natl. acid. Sci. USA 82:488-492 (1985)), PCR mutageneza (Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide do Methods i Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)), i kasetna mutageneza(Wells i sar., Gene 34:315-323 (1985)). Poželjno, lokacijom usmerena mutageneza je izvedena pomoću preklopno-produžene PCR metode (Higuchi, in "PCR Technology: Principles i Applications for DNK Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989)). Tehnika preklopno-produžene PCR (Higuchi, ibid.) se takođe može koristiti za uvođenje bilo koje željene mutacije(a) u cilljanu sekvencu (startujuća DNK). Na primer, prvi krug PCR u preklopnoproduženoj metodi uključuje amplifikaciju ciljane sekvence sa nekim spoljnim prajmerom (primer 1) i sa nekim unutrašnjim prajmerom mutageneze (primer 3), i odvojeno sa drugim spoljašnjim prajmerom (primer 4) i unutrašnjim prajmerom (primer 2), dajući dva PCR segmenta (segmenti A i B). Unutrašnji prajmer mutageneze (primer 3) je konstruisan da sadrži neusklađenost sa ciljnom sekvencom navodeći željenu mutaciju(e). U drugom krugu PCR, proizvod prvog kruga PCR (segmenti A i B) su amplificirani sa PCR korišćenjem dva spoljna prajmera (prajmeri 1 i 4). Dobijeni PCR segment pune dužine (segment C) je digestovan restrikcionim enzimima i dobijeni restrikcioni fragment je kloniran u odgovarajući vektor. Kao prvi korak mutageneze, polazni DNK (npr., koji kodira za Fc fuzioni protein, antitelo ili jednostavno Fc region), je operativno kloniran u vektor mutageneze. Prajmeri su konstruisani da reflektuju željenu aminokiselinsku supstituciju. Druge metode korisne za generisanje varijantnih regiona Fc su poznati u tehnici (videti, npr., U.S. Patent Br.5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; U.S. Patentna publikacija Br.2004/0002587 i PCT publikacija WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 041063351).

[0175] U nekim primerima pronalaska, obrasci glikozilacije antitela koji su ovde navedeni su modifikovani kako bi se poboljšala ADCC i CDC efektorska funkcija. Videti Shields RL i sar., (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa T i sar., (2003) JBC.278:3466 i Okazaki A i sar., (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239. U nekim primerima, Fc varijantni protein obuhvata jednu ili više konstruisanih glikoformi, tj., ugljenohidratnu kompoziciju koja je kovalentno vezana za molekul koji sadrži Fc region. Konstruisani glikoformi mogu biti korisne za različite namene, uključujući ali se ne ograničavajući na pojačavanje ili smanjenje efektorske funkcije. Konstruisane glikoforme mogu se generisati bilo kojim metodom poznato stručnjaku u tehnici, na primer korišćenjem konstruisanih ili sojeva za ekspresiju varijanti, pomoću koekspresije sa jednim ili više enzima, na primer DI N-acetilglukozaminiltransferaze III (GnTI11), eksprimiranjem molekula koji sadrže Fc region u različitim organizmima ili pomoću ćelijskih linija različitih organizama ili modifikovanjem ugljenih hidrata nakon što je eksprimiran molekul koji sadrži Fc region. Metode generisanja konstruisanih glikoformi poznate su stručnjaku u tehnici, i uključujući ali se ne ograničavajući na one opisane u Umana i sar., 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies i sar., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields i sar., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa i sar., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) U.S. Pat. Br.6,602,684; U.S. Ser. Br.10/277,370; U.S. Ser. Br.10/113,929; PCT WO 00/61739Al; PCT WO 01/292246Al; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland). Videti, npr., WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki i sar., 2004, JMB, 336: 1239-49.

[0176] Takođe je poznato u tehnici da se glikolizacija Fc regiona može modifikovati tako da se poveća ili smanji efektorska funkcija (videti na primer, Umana i sar., 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies i sar., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields i sar., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa i sar., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) U.S. Pat. Br. 6,602,684; U.S. Ser. Br. 10/277,370; U.S. Ser. Br. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland). Shodno tome, u jednom primeru Fc regioni antitela pronalaska obuhvataju izmenjenu glikozilaciju aminokiselinskih ostataka. U drugom primeru, izmenjena glikozilacija aminokiselinskih ostataka dovodi do smenjene efektorske funkcije. U drugom primeru, izmenjena glikozilacija aminokiselinskih ostataka dovodi do povećane efektorske funkcije. U specifičnom slučaju, Fc region ima smanjenu fukozilaciju. U drugom primeru, Fc region je afukozilovan (videti na primer, U.S. Patentna prijava Objava Br.2005/0226867).

Kratak opis crteža

[0177]

Sl. 1 je grafikon koji pokazuje efekte anti-B7-H1 antitela pronalaska na proliferaciju T ćelija u eseju sa kuglicama.

Sl. 2 je grafikon koji pokazuje poboljšanje u proliferaciji T-ćelija sa anti-B7-H1 antitelima pronalaska u DCMLR eseju.

Sl. 3 je grafikon koji pokazuje IFN-Ȗoslobađanje pomoću anti-B7-H1 antitela pronalaska u DCMLR eseju.

Sl. 4 je grafikon koji pokazuje 95% intervala pouzdanosti za anti-B7-H1 IC50 sa anti-B7-H1 antitelima pronalaska u humanom PD1/humani B7-H1 eseju inhibicije liganda za evaluaciju uticaja zamene IgG klase i germinalnih linija na aktivnost antitela.

Sl. 5 je linijski grafikon koji pokazuje rezultate iz ELISA eseja koji je izveden u cilju procene unakrsne reaktivnosti anti-B7-H1 atitela pronalaska sa komodulatornim antigenima.

Sl. 6 je grafikon koji pokazuje efekte anti-B7-H1 antitela pronalaska u in-vitro Tet-povratnom eseju.

Sl. 7 je grafikon koji pokazuje rezultate iz testiranja agonističke aktivnosti anti-B7-H1 antitela pronalaska korišćenjem Tet-povratnog eseja.

Sl. 8A/B/C su linijski grafikoni koji pokazuju efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na HPAC ćelije u ksenograft modelu sa miševima.

Sl. 9A/B/C su linijski grafikoni koji pokazuju efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na A375 ćelije u ksenograft modelu sa miševima.

Sl. 10A/B su linijski grafikoni koji pokazuju efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na HPAC ćelije u ksenograft modelu sa miševima.

Sl. 11 je linijski grafikon koji pokazuje efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na HPAC ćelije u ksenograft modelu sa miševima.

Sl. 12A/B/C/D su linijski grafikoni koji pokazuju efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na A375 ćelije u ksenograft modelu sa miševima.

Sl. 13A/B su linijski grafikoni koji pokazuju efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na A375 ćelije u ksenograft modelu sa miševima sa i bez prisustva T ćelije.

Sl. 14A/B su linijski grafikoni koji pokazuju efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na A375 ćelije u ksenograft modelu sa miševima sa i bez prisustva T ćelije.

Sl. 15 je linijski grafikon koji pokazuje efekat anti-B7-H1 antitela pronalaska na A375 ćelije u ksenograft modelu sa miševima.

Definicije

[0178] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini ovde korišćeni imaće značenje koje se obično razume od strane stručnjaka u oblasti. Dodatno, ukoliko nije drugačije zahtevano kontekstom, izrazi u jednini će uključivati množine i termini u množini će uključivati jednine. Uopšteno, nomenklature koje se koriste u vezi sa, i tehnike ćelijskih i tkivnih kultura, molekularne biologije i hemije proteina i oligo- ili polinukleotida i hibridizacije opisane ovde su one koje su dobro poznate i obično se koriste u oblasti.

[0179] Standardne tehnike su korišćene za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kulture tkiva i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvedene prema specifikaciji proizvođDča ili kako se uobičajeno postiže u tehnici ili kako je opisano ovde. Prethodne tehnike i procedure su generalno izvedene prema konvencionalnim metodama dobro poznatim u oblasti i kako je opisano u različitim opštim i konkretnijim navodima koji su citirani i diskutovani kroz predmetnu specifikaciju. Videti na primer, npr., Sambrook i sar. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), koja je ovdje inkorporisana referencom. Nomenklature koje se koriste u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde su dobro poznate i uobičajeno korišćene u oblasti. Standardne tehnike su korišćene za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije, i apliakciju, i tretman pacijenata.

[0180] Kako je korišćeno u skladu sa predmetnim pronalaskom, smatra se da sledeći termini, osim ako nije drugačije naznačeno, imaju sljedeće značenje:

Antagonist ili inhibitor može biti polipeptid, nukleinska kiselina, ugljeni hidrat, lipid, jedinjenje male molekulske mase, oligonukleotid, oligopeptid, RNK interferenca (RNKi), antismislena, rekombinantni protein, antitelo ili njihovi fragmenti ili konjugati ili njihovi fuzioni proteini. Za pregled RNKi videti Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. (Pharmacol Rev.2003 Dec;55(4):629-48. Review) i za antismisleni niz (videti Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE. 2003 Oct 28;2003 (206):pe47.)

[0181] Jedinjenje se odnosi na bilo koje jedinjenje male molekulske mase sa molekulskom masom manjom od oko 2000 daltona.

[0182] Termin "B7-H1" se odnosi na humani B7-H, B7H1, B7-H1, B7 homolog 1, CD274 antigen, PDCD1L1, PDCD1LG1, PDCD1 ligand 1, PDL1, PD-L1, Prekursor liganda 1 programirane ćelijske smrti 1 ili ligand 1 programirane ćelijske smrti.

[0183] Termin "neutrališe" ili "inhibira" kada se odnosi na ciljano vezujući agens, kao što je antitelo, odnosi se na sposobnost navedenog agensa da eliminiše, umanji ili značajno umanji, aktivnost ciljanog antigena. Prema terminu “neutrališe” anti-B7-H1 antitelo pronalaska je sposobno da eliminiše ili značajno smanjuje aktivnost B7-H1. Neutrališuće, antagonizujuće ili inhibirajuće antitelo koje specifično vezuje B7-H1 može, na primer, da deluje blokiranjem vezivanja B7-H1 za svoje srodne ligande. Idealno, antitelo koje neutrališe B7-H1 inhibira B7-H1 posredovanu represiju T-ćelijske imunosti. Neutrališuće, antagonizujuće ili inhibirajuće antitelo koje specifično vezuje B7-H1 može, na primer, da deluje inhibiranjem vezivanja B7-H1 za PD-1 i/ili za B7-1.

[0184] " Inhibicija biološke aktivnosti B7-H1" obuhvata inhibiciju B7-H1 aktivnosti za najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% u poređenju sa biološkom aktivnošću u odsustvu ciljano vezujućeg agensa ili antitela pronalaska.

[0185] Termin "polipeptid" je ovde korišćen kao generički izraz koji se odnosi na nativni protein, fragmente ili analoge polipeptidne sekvence. Otuda nativni protein, fragmenti i analozi su vrste polipeptidnog roda. Poželjni polipeptidi u skladu sa pronalaskom obuhvataju molekule teškog lanca humanog imunoglobulina i molekule kapa lakog lanca humanog imunoglobulina, kao i molekule antitela formirane kombinacijom koja obuhvata molekule teškog lanca imunoglobulina i molekule lakog lanca imunoglobulina, kao što su kapa ili lambda molekuli lakog lanca imunoglobulina, i obrnuto, kao i njihove fragmente i analoge. Poželjni polipeptidi u skladu sa pronalaskom mogu takođe da obuhvataju isključivo molekule teškog lanca humanog imunoglobulina ili njihove fragmente.

[0186] Termin "koji se prirodno javlja" koji se ovdje koristi primenjuje se kao objekat koji se odnosi na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući i viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koja nije bila namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji ili se na neki drugi način javlja u prirodni.

[0187] Termin "kontrolna sekvenca" koji je ovde korišćen, se odnosi na polinukleotidne sekvence koje su neophodne bilo da imaju efekat ili da utiču na ekspresiju i procesiranje kodirajućih sekvenci za koje su vezani. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina; kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno uključuju promoter, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu završetka transkripcije; kod eukariota, uopšteno, takve kontrolne sekvence mogu uključivati promotere, pojačivače, introne, sekvencu završetka transkripcija, poliadenilacijske signalne sekvence, i 5’ i ’3 netranslatovane regione. Namera termina "kontrolne sekvence" je da uključi, kao minimum, sve komponente čije prisustvo je esencijalno za ekspresiju i procesiranje, i može takođe uključiti dodatne komponente čije prisustvo je povoljno, na primer, lider sekvence i fuzione partnerske sekvence.

[0188] Termin "polinukleotid" kao što je ovde navedeno označava polimerni oblik nukleotida od najmanje 10 baza u dužini, bilo ribonukleotida ili dezoksinukleotida ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida ili RNK-DNK heterodupleksa. Termin uključuje jednolančani ili dvolančani oblik DNK.

[0189] Termin "oligonukleotid" ovde naveden uključuje nukleotide koji se prirodno javljaju i modifikovane nukleotide povezane zajedno vezama koje se prirodno javljaju i koje se ne javljaju prirodno. Oligonukleotidi su polinukleotidni podskup koji generalno obuhvata lanac dužine od 200 baza ili manje. Poželjno, oligonukleotidi su 10 do 60 baza u dužini i najpoželjnije 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 do 40 baza u dužini. Oligonukleotidi su obično jednolančani, npr. za sonde; mada oligonukleotidi mogu biti dvolančani, npr. za korišćenje u konstrukciji genskog mutanta. Oligonukleotidi mogu biti bilo smisaoni ili antismisaoni oligonukleotidi.

[0190] Termin "nukleotidi koji se prirodno javljaju" ovde naveden uključuje dezoksiribonukleotide i ribonukleotide. Termin "modifikovani nukleotidi" ovde naveden uključuje nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i slično. Termin "oligonukleotidne veze" ovde naveden uključuje oligonukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforomidat, i slično. Videti npr., LaPlanche i sar. Nucl. Acids Res.14:9081 (1986); Stec i sar. J. Am. Chem. Soc.106:6077 (1984); Stein i sar. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon i sar. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon i sar. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec i sar. U.S. Patent Br. 5,151,510; Uhlmann i Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990).

[0191] Oligonukleotid može uključiti oznaku za detekciju, ako je potrebno.

[0192] Termin "selektivno hibridizovati" ovde naveden znači da se detektibilno i specifično vezuju. Polinukleotidi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti se selektivno hibridizuju u nukleinske kiseline pod uslovima hibridizacije i ispiranja koji minimiziraju značajne količine detektibilnog vezivanja za nespecifične nukleinske kiseline. Uslovi visoke preciznosti mogu se koristiti za postizanje selektivnih uslova hibridizacije kao što je poznato u struci i diskutovano ovde. Uopšteno, homologija sekvence nukleinske kiseline između polinukleotida, oligonukleotida ili fragmenata antitela i sekvence nukleinske kiseline od značaja, biće najmanje 80% i više, obično sa poželjnim povećanjem homologije od najmanje 85%, 90%, 95%, 99%, i 100%.

[0193] Precizni uslovi hibridizacije uključuju, ali nisu limitirani na, hibridizaciju na filter vezane DNK u 6X natrijum hlorid/natrijum citrat rastvoru (SSC) (0,9 M NaCl/90 mM Na-citrat, pH 7.0) na oko 45°C praćeno jednim ili višestrukim pranjem u 0,2X SSC/0.,1% SDS na oko 50-65°C, visoko precizni uslovi kao što su hibridizaciju na filter vezane DNK u 6X SSC na oko 45°C praćeno jednim ili višestrukim pranjem u 0,1X SSC/0,2% SDS na oko 60°C ili bilo koji drugi precizni uslovi hibridizacije poznati onima koji su stručni u oblasti (videti, na primer, Ausubel, F.M. i sar., eds.

1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol.1, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley i Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 do 6.3.6 i 2.10.3).

[0194] Dve aminokiselinske sekvence su "homologne" ako postoji delimični ili potpuni identitet između njihovih sekvenci. Na primer, 85% homologije znači da 85% amnokiselina je identično kada su dve sekvence poravnate za maksimalno poklapanje. Šupljine (u bilo kojoj od dve sekvence koje se podudaraju) su dozvoljeni u maksimalnom podudaranju; šupljina dužine od 5 ili manje je poželjna, a poželjnije od 2 ili manje. Alternativno, i poželjno, dve proteinske sekvence (ili polipeptidne sekvence dobijene od njih, od najmanje oko 30 aminokiselina dužine) su homologne, u skladu sa terminom koji je ovde korišćen, ako imaju stepen poravnanja od više nego 5 (u jediniciama standardne devijacije) korišćenjem programa ALIGN sa matricom podataka o mutaciji i sa ocenom “gap penalty” od 6 ili više. Videti Dayhoff, M.O., u Atlas of Protein Sequence i Structure, pp.101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) i Supplement 2 ovog volumena, pp. 1-10. Dve sekvence ili ili njihovi delovi su poželjnije homologni ako su njihove aminokiseline više od ili 50% identične kada su optimalno poravnate korišćenjem ALIGN programa. Trebalo bi se ceniti da se mogu razlikovati regioni homologije unutar dve ortologne sekvence. Na primer, funkcionalni regioni ortologa miša i ljudi mogu imati viši stepen homologije od nefunkcionalnih regiona.

[0195] Termin "odgovara" se ovde koristi da označi da je polinukleotidna sekvenca homologna (tj. identična, ne striktno evoluciono povezana) sa celom ili sa delom referentne polinukleotidne sekvence, ili da je polipeptidna sekvenca identična sa referentnom polipeptidnom sekvencom.

[0196] Suprotno tome, termin "komplementarno sa" ovde se koristi da bi se označilo da je komplementarna sekvenca homologna sa celom ili sa delom referentne polinukleotidne sekvence. Za ilustraciju, nukleotidna sekvenca "TATAC" odgovara referentnoj sekvenci "TATAC" i komplementarna je referentnoj sekvenci "GTATA".

[0197] Termin "identičnost sekvence" znači da su dve polinukleotidne ili aminokiselinske sekvence identične (tj., na osnovu poređenja nukleotida sa nukleotidom ili ostatku sa ostatkom) unutar okvira poređenja. Termin "procenat identičnosti sekvence" izračunava se poređenjem dve optimalno poravnate sekvence unutar okvira poređenja, određujući broj pozicija kod kojih se identična baza nukleinske kiseline (npr. A, T, C, G, U ili I) ili aminokiselinski ostatak pojavljuje u obe sekvence da bi se dobio broj usklađenih položaja, deljenjem broja usklađenih pozicija sa ukupnim brojem pozicija unutar okvira poređenja (tj. veličini okvira) i množenjem rezultata sa 100 da bi se postigao procenat identičnosti sekvence. Termini "znatna identičnost" koji se ovde koriste označavaju karakteristiku polinukleotida ili aminokiselinske sekvence, pri čemu polinukleotid ili aminokiselina obuhvata sekvencu koja ima najmanje 85 procenata identičnosti sekvence, poželjno najmanje 90 do 95 procenata identičnosti sekvence, poželjnije najmanje 99 procenata identičnosti sekvence, u poređenju sa referentnom sekvencom unutar okvira poređenja sa najmanje 18 nukleotida (6 aminokiselina), često unutar okvira poređenja sa najmanje 24-48 nukleotida (8-16 amino kiselina), pri čemu se procenat identičnosti sekvence izračunava upoređivanjem referentne sekvence sa sekvencom koja može uključivati delecije ili adicije od ukupno 20 procenata ili manje od referentne sekvence unutar okvira poređenja. Referentna sekvenca može biti podskup veće sekvence. Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih amino kiselina i njihovih skraćenica prate konvencionalnu upotrebu. Videti Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub i D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).

[0198] Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) od dvadeset konvencionalnih aminokiselina, unnatural aminokiseline kao što su Į-, Į-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline mogu takođe biti pogodne komponente polipeptida predmetnog pronalaska. Primeri za nekonvencionalne aminokiseline uključuju: 4-hidroksiprolin, Ȗ-karboksiglutamat, İ-N,N,N-trimetillizin, İ-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, ı-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i iminokiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U polipeptidnom obeležavanju koje se ovde koristi, levi smer je amino-terminalni smer, a desni smer je karboksi-terminalni smer, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom. Slično tome, ako nije drugačije naznačeno, levi kraj jednostrukih polinukleotidnih sekvenci je 5' kraj; levi smer dvostrukih polinukleotidnih sekvenci označava se kao pravac 5'. 5' do 3' pravac dodavanja kod nastajućeg RNK transkripta naziva se pravac transkripcije; sekvencioni regioni na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao i RNK i koji su 5' do 5' kraja transkripta RNK nazivaju se "uzvodne sekvence"; sekvencioni regioni na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao i RNK i koji su na 3' do 3' kraja transkripta RNK nazivaju se "nizvodne sekvence". Kao što je primenjeno na polipeptide, termin "značajna identičnost" znači da su dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što to mogu uz pomoć programa GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane težinske praznine, dele najmanje 80 procenata identičnosti sekvence, poželjno najmanje 90 procenata identičnosti sekvence, poželjnije najmanje 95 procenata identičnosti sekvence, a najpoželjnije najmanje 99% identičnosti sekvence. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se po konzervativnim supstitucijama amino kiselina. Konzervativne aminokiselinske supstitucije se odnose na zamenljivost ostataka sa sličnim bočnim lancima. Na primer, grupa aminokiselina sa alifatskim bočnim lancima je glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; grupa aminokiselina sa alifatsko-hidroksilnim bočnim lancima je serin i treonin; grupa aminokiselina sa amidnim bočnim lancima je asparagin i glutamin; grupa amino kiselina koje imaju aromatične bočne lance su fenilalanin, tirozin i triptofan; grupa aminokiselina sa baznim bočnim lancima je lizin, arginin i histidin; i grupa aminokiselina koja sadrže sumporne bočne lance je cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe aminokiselina su: valin-leucinizoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamin-aspartan i asparagin-glutamin. Kao što je ovde diskutovano, male varijacije u sekvencama aminokiselina antitela ili imunoglobulinskih molekula su obuhvaćene ovim prikazom, pod uslovom da varijacije u aminokiselinskoj sekvenci održavaju najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, 90% , 95% i najpoželjnije 99% identičnosti sekvence sa antitelima ili molekulima imunoglobulina koji su ovde opisani. Konkretno, zamenjene konzervativne aminokiseline su posebno razmatrane. Konzervativne zamene su one koje se odvijaju u porodici aminokiselina koje imaju povezane bočne lance. Genetski kodirane aminokiseline su generalno podeljene u porodice: (1) kisele = aspartat, glutamat; (2) bazne = lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisane polarne = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Poželjnije porodice su: serin i treonin su iz alifatsko-hidroksilne porodice; asparagin i glutamin su iz porodice koja sadrži amid; alanin, valin, leucin i izoleucin su iz alifatske porodice; i fenilalanin, triptofan i tirozin su iz aromatičnea porodice. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina sa izoleucinom ili valinom, aspartata sa glutamatom, treonina sa serinom ili sličniom zamenom neke aminokiseline sa strukturno povezanom aminokiselinom, neće imati veliki efekat na vezujuću funkciju ili svojstva rezultujućeg molekula, posebno ako zamena ne uključuje aminokiselinu unutar lokacije okvira. Da li promena aminokiselina utiče na funkcionalni peptid, lako se može odrediti analizom specifične aktivnosti polipeptidnog derivata. Analize su detaljno opisane ovde. Fragmente ili analoge antitela ili molekula imunoglobulina mogu lako pripremiti stručnjaci u oblasti. Poželjni amino- i karboksi-terminalni fragmenti ili analozi se javljaju u blizini granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu biti identifikovani upoređivanjem podataka o nukleotidnim i/ili aminokiselinskim sekvencama sa javnim ili vlasničkim bazama podataka o sekvencama. Poželjno, kompjuterizovane metode poređenja koriste se za identifikaciju sekvencionih motiva ili predviđenih domena konformacije proteina koji se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Poznate su metode za identifikaciju proteinskih sekvenci koje prelaze u poznatu trodimenzionalnu strukturu. Bovie i sar. Science 253: 164 (1991). Prema tome, gore navedeni primeri pokazuju da stručnjaci u stanju tehnike mogu prepoznati motive sekvence i strukturne konformacije koje se mogu koristiti za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena u skladu sa antitelima koja su ovde opisana. Glutaminilni i asparaginilni ostaci često se deamidišu odgovarajućim glutamilnim i aspartilnim ostacima, respektivno. Ovi ostaci su deamidirani u neutralnim ili osnovnim uslovima. Deamidirani oblik ovih ostataka spada u obim ovog pronalaska.

[0199] Uopšteno, ostaci cisteina u proteini su ili angažovani u cistein-cistein disulfidnim vezama ili sterički zaštićeni od formiranja disulfidne veze, kada su deo umotanog proteina. Formiranje disulfidnih veza u proteinima je složen proces, koji je određen redoks potencijalom okoline i specijalizovanim enzimima za razmenu tiolisulfida (Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984; Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44,2002). Kada ostatak cisteina nema par u proteinskoj strukturi i nije sterički zaštićen preklapanjem, on može formirati disulfidnu vezu sa slobodnim cisteinom iz rastvora u postupku poznatom kao disulfidno mešanje. U drugom procesu poznatom kao disulfidno šmirglanje, slobodni cisteini mogu takođe ometati prirodne disulfidne veze (kao što su oni prisutni u strukturama antitela) i dovode do niskog stepena vezivanja, niske biološke aktivnosti i/ili niske stabilnosti.

[0200] Poželjne supstitucije aminokiselina su one koje: (1) smanjuju osetljivost na proteolizu, (2) smanjuju osetljivost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja za formirajuće proteinske komplekse, (4) menjaju afinitet vezivanja i (4) dodeljuju ili modifikuju druge fizičkohemijske ili funkcionalne osobine takvih analoga. Analozi mogu da uključuju različite muteine sekvence koji nisu prirodna peptidna sekvenca. Na primer, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (poželjno konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu se napraviti u prirodnoj sekvenci (poželjno u delu polipeptida izvan domena) koji formiraju intermolekularne kontakte. Konzervativna supstitucija aminokiselina ne bi trebalo bitno promeniti strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., zamena aminokiseline ne bi trebala naginjati da lomi heliks koji se javlja u roditeljskoj sekvenci, ili da poremeti druge tipove sekundarne strukture koja karakteriše roditeljsku sekvencu). Primeri poznati u stanju tehnike, sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida opisani su u Proteins, Structures i Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman i Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et at. Nature 354:105 (1991). Pored toga, takvi postupci se mogu koristiti za pravljenje aminokiselinskih supstitucija ili delecija jednog ili više ostataka cisteina varijabilnog regiona koji učestvuju u intralančanoj disulfidnoj vezi da generišu molekule antitela koji nemaju jednu ili više intralančanih disulfidnih veza.

[0201] Termin "CDR region" ili "CDR" namenjen je da ukaže na hipervarijabilne regione teških i lakih lanaca antitela koji prenose antigen vezujuću specifičnost na antitelo. CDR-ovi mogu biti definisani u skladu sa sistemom Kabat (Kabat, E.A. i sar. (1991) Sekvence of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), i kasnije edicije. Antitelo tipično sadrži 3 CDR teškog lanca i 3 CDR lakog lanca. Termin CDR ili CDR-ovi se ovde koristi kako bi se, u zavisnosti od slučaja, označio jedan od ovih regiona ili nekoliko, ili čak kompletni delovi, onih regiona koji sadrže većinu aminokiselinskih ostataka odgovornih za vezivanje pomoću afiniteta antitela za antigen ili epitop koji prepoznaje.

[0202] Treći CDR teškog lanca (HCDR3) ima veću varijabilnost veličine (veća raznovrsnost u suštini zahvaljujući mehanizmima raspoređivanja gena koji ga čine). Može biti kraći od 2 aminokiseline, iako je najduža poznata veličina 26. Dužina CDR-a može se takođe razlikovati u zavisnosti od dužine koja se može prilagoditi određenom osnovnom okviru. Funkcionalno, HCDR3 ima delimičnu ulogu u određivanju specifičnosti antitela (Segal i sar., PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit i sar., Science, 233:747-753, 1986, Chothia i sar., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987, Chothia i sar., Nature, 342:877- 883, 1989, Caton i sar., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon i sar., PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon i sar., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat i sar., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).

[0203] Termin "set CDR-ova" pomenutih ovde obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3. Tako, skup HCDR-ova odnosi se na HCDR1, HCDR2 i HCDR3, i set LCDR-ova se odnosi na LCDR1, LCDR2 i LCDR3.

[0204] Varijante VH i VL domena i CDR-ova predmetnog pronalaska, uključujući one za koje su ovde navedene aminokiselinske sekvence i koje se mogu koristiti za ciljano vezujuća sredstava i antitela za B7-H1, mogu se dobiti pomoću postupaka alteracije ili mutacije sekvence i skrininga za ciljanje antigena sa željenim karakteristikama. Primeri željenih karakteristika obuhvataju, ali nisu ograničeni na: povećani vezujući afinitet za antigen u odnosu na poznata antitela koja su specifična za antigen; povećana neutralizacija aktivnosti antigena u odnosu na poznata antitela koja su specifična za antigen, ako je aktivnost poznata; specifična kompetitivna sposobnost sa poznatim antitelom ili ligandom antigena kod specifičnog molarnog odnosa; sposobnost imunoprecipitacije kompleksa receptor-ligand; sposobnost vezivanja za određeni epitop; linearni epitop, npr. peptidna sekvenca identifikovana pomoću skeniranja vezivanja za peptide, npr.

koristeći peptide prikazane u linearnoj i/ili ograničenoj konformaciji; konformacioni epitop, formiran od diskontinualnih ostataka; sposobnost modulacije nove biološke aktivnosti sa B7-H1, ili nizvodne molekule; sposobnost vezivanja za i/ili neutralizacije B7-H1 i / ili bilo koje druge željene osobine. Tehnike potrebne za vršenje supstitucija u okviru amino kiselinskih sekvenci CDR-ova, VH ili VL domena antitela i mesta za vezivanje antigena su dostupni u oblasti. Varijante molekula antitela koji su ovde objavljeni mogu se proizvesti i koristiti u predmetnom pronalasku. Prateći trag računarske hemije u primeni multivarijantnih tehnika za analizu podataka u odnosima strukture/svojstva-aktivnosti (Wold, i sar. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984) kvantitativni aktivnost-svojstvo odnosa antitela može se izvesti korišćenjem poznatih matematičkih tehnika, kao što su statistička regresija, prepoznavanje uzoraka i klasifikacija (Norman i sar. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification i Regression (Wiley Series in Probability i Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002); Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design i Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery). U nekim slučajevima osobine antitela mogu biti izvedene iz empirijskih i teorijskih modela (na primer, analiza verovatnih kontaktnih ostataka ili izračunate fizičkohemijske osobine) sekvence antitela, funkcionalnih i trodimenzionalnih struktura i ova svojstva mogu se posmatrati pojedinačno i u kombinaciji. Antitelo-antigen vezujuće mesto sastavljeno od VH domena i VL domena obično se formira sa šest petlji polipeptida: tri od varijabilnog domena lakog lanca (VL) i tri od varijabilnog domena teškog lanca (VH). Analiza antitela poznate atomske strukture ima razjašnjene odnose između sekvence i trodimenzionalne strukture mesta kombinovanja antitela. Ovi odnosi impliciraju da, osim trećeg regiona (petlje) u VH domenima, vezne petlje imaju jednu od malobrojnih konformacija glavnog lanca: kanonske strukture. Pokazano je da je kanonska struktura formirana u određenoj petlji određena njenom veličinom i prisustvom određenih ostataka na ključnim mestima kako u petlji, tako i u regionima okvira.

[0205] Ova studija odnosa sekvence-strukture može se koristiti za predviđanje onih ostataka u antitelu sa poznatom sekvencom, ali sa nepoznatom trodimenzionalnom strukturom, koji su važni za održavanje trodimenzionalne strukture njegovih CDR petlji i time za održavanje vezujuće specifičnosti. Ova predviđanja mogu se potpomognuti poređenjem predviđanja sa rezultatima iz eksperimenata optimizacie. U strukturnom pristupu, može se stvoriti model molekula antitela koristeći bilo koji slobodno dostupan ili komercijalni paket, kao što je WAM. Softverski paket za vizuelizaciju i analizu proteina, kao što je Insight II (Accelris, Inc.) ili Deep View, mogu se zatim koristiti za procenu mogućih zamena na svakoj poziciji CDR-a. Ove informacije se zatim mogu koristiti da bi se izvršile izmene koje mogu imati minimalan ili blagotvoran efekat na aktivnost ili dati druge poželjne osobine.

[0206] Termin "polipeptidni fragment" koji je ovde korišćen, se odnosi na polipeptid koji ima amino-terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca identična sa odgovarajućim pozicijama u prirodnoj sekvenci koja je izvedena, na primer, iz celokpne dužine cDNK sekvence. Fragmenti su obično dugi najmanje 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina, poželjno najmanje 14 aminokiselina, poželjnije najmanje 20 aminokiselina, obično najmanje 50 aminokiselina, a još poželjnije najmanje 70 aminokiselina dužine. Termin "analog" koji je ovde korišćen, se odnosi na polipeptide koji se sastoje od segmenta od najmanje 25 aminokiselina koji ima značajnu identičnost sa delom izvodeće aminokiselinske sekvence i ima najmanje jednu od sledećih osobina: (1) specifično vezivanje za B7-H1, u odgovarajućim uslovima vezivanja, (2) sposobnost blokiranja odgovarajućeg vezivanja B7-H1-protein ili (3) sposobnosti da inhibira aktivnost B7-H1. Uobičajeno, polipeptidni analozi obuhvataju konzervativnu supstituciju aminokiselina (ili adiciju ili deleciju) u odnosu na prirodno prisutnu sekvencu. Analozi su obično dugi najmanje 20 aminokiselina, poželjno najmanje 50 aminokiselina ili duže i često mogu imati kompletnu dužinu kao polipeptid koji se prirodno pojavljuje.

[0207] Peptidni analozi se najčešće koriste u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa svojstvima koja su analogna svojstvima šablonskog peptida. Ove vrste ne-peptidnih jedinjenja se nazivaju "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici". Fauchere, J. Adv. Drug Res.15:29 (1986); Veber i Freidinger TINS p.392 (1985); i Evans i sar. J. Med. Chem.30:1229 (1987). Takva jedinjenja se često razvijaju pomoću kompjuterizovanog molekularnog modeliranja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu se koristiti za stvaranje ekvivalentnog terapeutskog ili profilaktičkog efekta. Generalno, peptidomimetici su strukturno slični polipeptidu paradigme (t.j., polipeptid koji ima biohemijsko svojstvo ili farmakološku aktivnost), kao što su humano antitelo, ali imaju jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih vezom odabranom iz grupe koju čine: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-, postupcima koji su dobro poznati u tehnici. Sistemska supstitucija jedne ili više aminokiselina konsenzusne sekvence sa D-aminokiselinom istog tipa (npr. D-lizin umesto L-lizina) može se koristiti za stvaranje stabilnijih peptida. Pored toga, ograničeni peptidi koji sadrže konsenzusnu sekvencu ili jako identičnu varijaciju konsenzusa mogu se generisati metodima poznatim u stanju tehnike (Rizo i Gierasch Ann. Rev. Biochem., 61: 387 (1992); na primer, dodavanjem internih cisteinskih ostataka koji su sposobni da formiraju intramolekulske disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.

[0208] Kako je ovde korišćeno, "antitelo" i "antitela" (imunoglobulini) mogu biti oligoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo (uključujući monoklonska antitela u punoj dužini), kamelizovano antitelo, himerno antitelo, antitelo sa CDR graftom, multi-specifično antitelo, bi-specifično antitelo, katalitičko antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo, potpuno humano antitelo, anti-idiotipično antitelo i antitela koja se mogu označiti u rastvorljivoj ili vezanoj formi, kao i fragmenti, varijante ili njihovi derivati, ili sami ili u kombinaciji sa drugim sekvencama aminokiselina koje su obezbeđene poznatim tehnikama. Antitelo može biti iz bilo koje vrste. Antitelo sadrži polipeptid ili grupu polipeptida koji se sastoje od najmanje jednog vezujućeg domena koji se formira od preklapanja polipeptidnih lanaca koji imaju trodimenzionalne vezujuće prostore sa unutrašnjim oblicima površine i raspodele naelektrisanja komplementarne karakteristikama antigenske determinante antigena. Antitelo tipično ima tetramerni oblik, koji sadrži dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan "laki" i jedan "teški" lanac. Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac formiraju vezujuće mesto antitela. Nativna antitela su uglavnom heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem pomoću jedne kovalentne disulfidne veze, dok je broj disulfidnih veza različit između teških lanaca različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac ima i regularno razmaknute unutrašnje disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH), praćen brojnim konstantnim domenima. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantan domen na drugom kraju; konstanta domena lakog lanca je poravnata sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca poravnat je sa varijabilnom domenom teškog lanca. Laki lanci se klasifikuju kao lambda lanci ili kapa lanci na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog regiona lakog lanca. Varijabilni domen kapa lakog lanca može se ovde označiti kao VK. Termin "varijabilni region" takođe se može koristiti za opisivanje varijabilnog domena teškog lanca ili lakog lanca. Smatra se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca. Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac čine vezujuće mesto antitela. Takva antitela mogu biti dobijena od bilo kog sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, majmune, svinje, konje, zečeve, pse, mačke, miševe itd.

[0209] Termin "antitelo" ili "antitela" obuhvata vezujuće fragmente antitela iz pronalaska, primeri fragmenata uključuju jednolančane Fvs (scFv), jednolančana antitela, antitela sa jednim domenom, domene antitela, Fv fragmente, Fab fragmente, F (ab') fragmente, F (ab')2 fragmente, fragmente antitela koji pokazuju željenu biološku aktivnost, varijabilne regione stabilizovane disulfidom (dsFv), dimerne varijabilne regione (Diabody), anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr. anti-Id antitela na antitela iz pronalaska), intratela, linearna antitela, molekule jednolančanog antitela i multispecifičnih antitela formiranih iz fragmenata antitela i fragmenta vezanih za epitop bilo kog od gore navedenih. Posebno, antitela uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne fragmente molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže antigen vezujuće mesto. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo koje vrste (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.

[0210] Digestija antitela sa enzimom, papainom, rezultira sa dva identična antigen vezujuća fragmenta, poznatih i kao fragment "Fab" i fragment "Fc", koji nemaju antigen vezujuću aktivnost, ali imaju sposobnost kristalizacije. Digestija antitela sa enzimom, pepsinom, rezultira sa fragmentom F(ab')2u kome su dva kraka molekula antitela ostala povezana i obuhvataju dva antigen vezujuća mesta. F(ab')2fragment ima sposobnost unakrsnog povezivanja antigena.

[0211] "Fv" kada se ovde koristi odnosi se na minimalni fragment antitela koji zadržava i antigenprepoznavajuće i antigen-vezujuće mesto. Ovaj region se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog i jednog laka lanca u čvrstoj, nekovalentnoj ili kovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji sva tri CDR-ova svakog varijabilnog domena interaguju da definišu antigen vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Kolektivno, šest CDR-ova prenose antigen-vezujuću specifičnost na antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri CDR-ova specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, iako sa nižim afinitetom u odnosu na celokupno vezujuće mesto.

[0212] "Fab", kada se ovde koristi, odnosi se na fragment antitela koji sadrži konstantni domen lakog lanca i CH1 domen teškog lanca.

[0213] "dAb", kada se ovde koristi, odnosi se na fragment antitela koji je najmanja funkcionalna vezujuća jedinica humanih antitela. "dAb" je pojedinačni domen antitela i sadrži ili varijabilni domen teškog lanca antitela (VH domen) ili varijabilni domen lakog lanca antitela (VL domen) Svaki dAb sadrži tri od šest prirodnih CDR-ova (Ward i sar., Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989); Holt, i sar., Domain antibodies: protein for therapy, Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)). Sa molekulskim težinama u rasponu od 11 do 15 kDa, oni su četiri puta manji od antigen vezujućeg fragmenta (Fab)2i polovine veličine jednolančanog molekula Fv (scFv).

[0214] "Kamelid", kada se ovde koristi, odnosi se na molekule antitela, koji se sastoje od dimera teškog lanca, koji su lišeni lakih lanaca, ali ipak imaju širok antigen vezujući repertoar (Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R (1993) Koji se prirodno javlja antitela devoid of light chains. Nature 363:446-448).

[0215] Termin "diatela" odnosi se na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, gde fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Koristeći linker koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva mesta za vezivanje antigena. Diatela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0216] Pokazano je da fragmenti čitavog antitela mogu obavljati funkciju vezujućih antigena. Primeri vezujućih fragmenata su (Vard, E. S. i sar., (1989) Nature 341, 544-546) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (McCafferti i sar. (1990) Nature, 348, 552-554) Fd fragment koji se sastoji od domena VH i CH1; (Holt i sar. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) Fv fragment koji se sastoji od domena VL i VH pojedinačnog antitela; (iv) fragment dAb (Ward, E.S. i sar., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], koji se sastoji od VH ili VL domena; (v) izolovani CDR regioni; (vi) F(ab')2 fragment, dvovalentni fragment koji sadrži dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančani Fv molekuli (scFv), gde su VH domen i VL domen povezani peptidnim linkerom koji dozvoljava da se oba domena udružuju i da formiraju mesto vezivanja antigena (Bird i sar., (1988) Science, 242, 423-426, Huston i sar., (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) bispecifični jednolančani Fv dimeri (PCT/US92/09965) i (ix) "diatela", multivalentni ili multispecifični fragmenti konstruisani fuzijom gena (WO94/13804; Holliger, P. (1993) i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448,). Fv, scFv ili molekuli diatela se mogu stabilizovati inkorporiranjem disulfidnih mostova koji povezuju VH i VL domene (Reiter, Y. i sar., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Minitela koja obuhvataju scFv spojene sa CH3 domenom takođe mogu biti napravljena (Hu, S. i sar., (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061). Drugi primeri vezujućih fragmenata su Fab', koji se razlikuje od fragmenata Fab dodavanjem nekoliko ostataka na karboksilnom kraju CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz hinge regiona antitela i Fab'-SH, koji je Fab-fragment u kome ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu.

[0217] Termin "varijabilan" se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena u velikoj meri razlikuju u sekvencama između antitela i odgovorni su za specifičnost vezivanja svakog određenog antitela za njegov specifičan antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Koncentrisana je u segmentima koji se zovu Regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), kako u lakom lancu tako i u varijabilnim domenima teškog lanca. Više konzervisanih delova varijabilnih domena se naziva okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca sadrži po četiri FR regiona, u velikoj meri usvajajući konfiguraciju ȕ-traka, povezanih sa tri CDR-a, koji formiraju petljaste veze, a u nekim slučajevima i su sastavni deo strukture ȕ-traka. CDR-i u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini FR regiona, a sa CDR-om iz drugog lanca doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (videti, Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Konstantni domeni uglavnom nisu uključeni direktno u vezivanje antigena, ali mogu uticati na afinitet vezivanja antigena i mogu pokazati različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ADCC, CDC i/ili apoptozi.

[0218] Termin "hipervarijabilni region", kada se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su povezani sa njegovim vezujućim svojstvom za antigen. Hipervarijabilni regioni obuhvataju aminokiselinske ostatke regiona koji određuju komplementarnost ili CDR-e (npr. ostatke 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) varijabilnog domena lakog lanca i ostatke 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) varijabilnog domena teškog lanca; Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) i/ili ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (npr. ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji slede CDR. FR ostaci su prisutni u himernim, humanizovanim, humanim, domenskim antitelima, diatelima, vakcitelima, linearnim antitelima i bispecifičnim antitelima.

[0219] Kada se ovde koristi, "ciljano vezujući agens", "ciljano vezujući protein", "specifični vezujući protein" i slični izrazi odnose se na agens, na primer antitelo ili njegov vezujući fragment, koji se preferencijalno vezuje za ciljanu lokaciju. U jednom primeru, ciljano vezujući agens je specifičan samo za jedno ciljano mesto. U drugim slučajevima ciljano vezujući agens je specifičan za više od jednog ciljanog mesta. U jednom slučaju ciljano vezujući agens može biti monoklonsko antitelo i ciljano mesto može biti epitop. Ciljano vezujući agens može sadržati najmanje jedan domen za vezivanje antigena (npr. CDR) na antitelu, pri čemu je navedeni domen kondenzovan ili sadržan unutar skafolda heterolognog proteina, npr. skafold proteina koji nije antitelo.

[0220] "Vezujući fragmenti" antitela proizvedeni su tehnikom rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. Vezujući fragmenti uključuju Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb i jednolančana antitela. Za svako antitelo koje nije "bispecifično" ili "bifunkcionalno" antitelo, svako od njegovih vezujućih mesta je identično. Antitelo u suštini inhibira adheziju receptora na kontrareceptor kada višak antitela smanjuje količinu receptora vezanog za kontraceptor za najmanje oko 20%, 40%, 60% ili 80% i obično više od oko 85% (mereno u in vitro kompetitivno vezujućem testu).

[0221] Termin "epitop" uključuje bilo koji determinant proteina koji je sposoban za specifično vezivanje za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Epitopske determinante obično se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula poput aminokiselina ili šećernih strana lanaca i mogu, ali ne uvek, imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Određeno je da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta disociacije 1 mM, poželjno 100 nM i najpoželjnije 10 nM.

[0222] Termin "agens" se ovde koristi da označava hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.

[0223] "Aktivni" ili "aktivnost" u odnosu na B7-H1 polipeptid odnosi se na deo polipeptida aB7-H1 koji ima biološku ili imunološku aktivnost nativnog B7-H1 polipeptida. "Biološki" kada se ovde koristi, odnosi se na biološku funkciju koja je rezultat aktivnosti nativnog B7-H1 polipeptida. Poželjna B7-H1 biološka aktivnost uključuje, na primer, B7-H1 indukovanu proliferaciju ćelija, adheziju ćelija i invazivnost.

[0224] "Sisar", kada se ovde koristi, odnosi se na bilo koju životinju koja se smatra sisarom. Poželjno, sisar je čovek.

[0225] "Životinjski" kada se koristi ovde obuhvata životinje koje se smatraju sisarima. Poželjno, životinja je čovek.

[0226] Termin "pacijent" uključuje ljudske i veterinarske subjekte.

[0227] Termin "mAb" se odnosi na monoklonalno antitelo.

[0228] "Lipozom", kada se ovde koristi, odnosi se na malu vezikulu koja može biti korisna za isporuku lekova koji mogu uključiti B7-H1 polipeptid pronalaska ili antitela na takav B7-H1 polipeptid kod sisara.

[0229] "Oznaka" ili "obeležen" kako se ovde koristi odnosi se na dodavanje detektabilnog dela polipeptidu, na primer, radiooznaka, fluorescentne oznake, enzimske oznake, hemiluminiscentne oznake ili biotinilne grupe. Radioizotopi ili radionuklidi mogu uključivati<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I, fluorescentne oznake mogu uključivati rodamin, lantanidne fosfore ili FITC i enzimske oznake mogu uključivati perokidase rena, ȕ-galaktozidazu, luciferazu, alkalne fosfataze.

[0230] Dodatne oznake uključuju ilustrativno, a bez ograničenja: enzime, kao što su glukoza-6-fosfat dehidrogenaza ("G6PDH"), alfa-D-galaktozidaza, glukozooksidaza, glukozoamilaza, karbonska anhidraza, acetilholinesteraza, lizozim, malatdehidrogenaza i peroksidaza; boje; dodatne fluorescentne oznake ili fluoresciri uključuju, fluorescein i njegove derivate, fluorohrom, GFP (GFP za "zeleni fluorescentni protein"), dansil, umbeliferon, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid i fluoresamin; fluorofore kao što su lantanidni kriptati i helati, npr.

Europium itd. (Perkin Elmer i Cisbio Assais); hemoluminescentne oznake ili hemiluminiscenti, uključuju izoluminol, luminol i dioksetane; senzibilizatore; koenzime; enzimske supstrate; čestice, kao što su lateks ili ugljenične čestice; metalna sol; kristalit; lipozomi; ćelije, itd., koje se dalje mogu označiti bojom, katalizatorom ili drugim detektabilnim grupama; molekule kao što su biotin, digokigenin ili 5-bromodeoksiuridin; ostatke toksina, kao što je na primer ostatak toksina odabran iz grupe pseudomonadni egzotoksin (PE ili citotoksični fragment ili njegov mutant), toksin difterije ili citotoksični fragment ili njegov mutant, botulinum toksin A, B, C, D, E ili F, ricin ili njegov citotoksični fragment, npr. ricin A, abrin ili njegov citotoksični fragment, saporin ili njegov citotoksični fragment, vinobojkin antivirusni toksin ili njegov citotoksični fragment i briodin 1 ili njegov citotoksični fragment.

[0231] Termin "farmaceutski agens ili lek" kako se ovde koristi odnosi se na hemijsko jedinjenje ili sastav koji može da izazove željeni terapeutski efekat kada se pravilno primeni na pacijentu. Drugi hemijski pojmovi ovde se koriste prema konvencionalnoj upotrebi u struci, kao što je prikazano na u The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

[0232] Kao što je ovde korišćeno, "jako čist" označava da je data prisutna vrsta, preovlađujuća vrsta (tj. na molarnoj osnovi je obilnija od bilo koje druge pojedinačne vrste u sastavu), i poželjno je da jako prečišćena frakcija je sastav u kome se data vrsta sadrži u najmanje oko 50 procenata (na molarnoj osnovi) u odnosu na sve prisutne vrste makromolekula. Generalno, jako čista kompozicija će obuhvatiti više od oko 80 procenata svih makromolekularnih vrsta prisutnih u sastavu, poželjnije je više od oko 85%, 90%, 95% i 99%. Najpoželjnije je da se data vrsta prečisti do esencijalne homogenosti (ne mogu se detektovati kontaminantne vrste u kompoziciji konvencionalnim metodama detekcije), pri čemu se sastav sastoji u osnovi od jedne makromolekularne vrste.

[0233] "Antitelom usmerena ćelijski-posredovana citotoksičnost" i "ADCC" odnose se na reakciju posredovanu ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje izražavaju Ig Fc receptore (FcRs) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), monociti, neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezujuće antitelo na ciljnoj ćeliji i naknadno izazivaju lizu ciljne ćelije. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelija, eksprimiraju samo FcȖRIII, dok monociti eksprimiraju FcȖRI, FcȖRII i FcȖRIII. FcRs ekspresija na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 9 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Da bi se procenila aktivnost ADCC molekula od interesa, može se izvršiti in vitro ADCC analiza, kao što je opisano u US patentu broj 5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je opisano u Clynes i sar. PNAS (USA) 95:652-656 (1988).

[0234] "Citotoksičnost zavisna od komplementa" i "CDC" odnose se na mehanizam pomoću kojeg antitela izvršavaju svoju funkciju ubijanja ćelija. Inicira se vezivanjem C1q, konstituenta prve komponente komplementa, u domen Fc Igsa, IgG ili IgM koji su u kompleksu sa antigenom (Hughs-Jones, NC, i B. Gardner 1979. Mol Imunol 16: 697). C1q je veliki, strukturno složeni glikoprotein ~ 410 kDa prisutan u humanom serumu u koncentraciji od 70 mg/ml (Cooper, N.R.

1985. Adv. Immunol., 37: 151). Zajedno sa dve serinske proteaze, C1r i C1s, Clq formira

kompleks C1, prvu komponentu komplementa. Najmanje dve N-terminalne globularne glave C1q moraju biti vezane za Fc iz Igs za aktivaciju C1, pa time i za iniciranje komplementne kaskade (Cooper, N.R.1985. Adv. Immunol. 37:151).

[0235] Termin "vreme poluraspada", kako se ovde koristi, znači farmakokinetičko svojstvo antitela koje je mera srednjeg vremena preživljavanja molekula antitela nakon njihove primene. Vreme poluraspada antitela se može izraziti kao vreme potrebno za eliminaciju 50 odsto poznate količine imunoglobulina iz tela pacijenta ili njegovog specifičnog odeljka, na primer, mereno u serumu ili plazmi, tj. vreme poluraspada u cirkulaciji ili u drugim tkivima. Vreme poluraspada može varirati od jednog imunoglobulina ili klase imunoglobulina do drugog. Generalno, povećanje polu-života antitela dovodi do povećanja srednjeg vremena zadržavanja (MRT) u cirkulaciji za antitelo koje se daje.

[0236] Termin "izotip" odnosi se na klasifikaciju konstantnog regiona teškog ili lakog lanca antitela. Konstantni domeni antitela nisu uključeni u vezivanje za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije. Zavisno od aminokiselinske sekvence konstantnog regiona teškog lanca, dato humano antitelo ili imunoglobulin može se dodeliti jednoj od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Nekoliko od ovih klasa može se dalje podeliti na podklase (izotipove), npr. IgG1 (gama 1), IgG2 (gama 2), IgG3 (gama 3) i IgG4 (gama 4), i IgA1 i IgA2. Konstantni regioni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se Į, į, İ, Ȗ, i m, respektivno. Strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. Od različitih klasa humanih imunoglobulina, poznato je da samo humani IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 i IgM aktiviraju komplement. Poznato je da humani IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 vezuju Fc gama receptore, koji posreduju različitim efektorskim funkcijama uključujući ADCC. Konstantni regioni humanog lakog lanca mogu se klasifikovati u dve glavne klase, kapa i lambda.

[0237] Ako je potrebno, može se zameniti izotip antitela koji specifično vezuje B7-H1, na primer, da iskoristi biološku osobinu drugog izotipa. Na primer, u nekim okolnostima može biti poželjno u vezi sa generisanjem antitela kao terapijskim antitelima usmerenim na B7-H1 kada bi antitela mogla fiksirati komplement i učestvovati u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). Postoji veliki broj izotipa antitela koji su sposobni za istu, uključujući, bez ograničenja, sledeće: mišji IgM, mišji IgG2a, mišji IgG2b, mišji IgG3, humani IgM, humani IgA, humani IgG1 i humani IgG3. U drugim slučajevima može biti poželjno u vezi sa generisanjem antitela kao terapeutskih antitela usmerenih na B7-H1 kada bi antitela bila sposobna da vezuju Fc receptore na efektorskim ćelijama i Xčestvuju u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). Postoji veliki broj izotipa antitela koji su sposobni da budu takvi, uključujući, bez ograničenja, sledeće: mišji IgG2a, mišji IgG2b, mišji IgG3, humani IgG1 i humani IgG3. Biće prihvaćeno da antitela koja se generišu ne moraju inicijalno imati takav izotip, već antitelo kao što je generisano može posedovati bilo koji izotip i antitelo može biti izotip koji je zamenjen kasnije upotrebom konvencionalnih tehnika koje su dobro poznate u struci. Takve tehnike uključuju upotrebu direktnih rekombinantnih tehnika (videti npr. U.S. Patent br.

4,816,397), tehnike fuzije ćelija sa ćelijom (videti npr., U.S. Patent Br. 5,916,771 i 6,207,418), između drugih.

[0238] Kao primer, anti-B7-H1 antitela koja su ovde razmatrana su potpuno humana antitela. Ako bi antitelo imalo željeno vezivanje za B7-H1, lako bi se izotip mogao zameniti da generiše humani IgM, humani IgG1 ili humani IgG3 izotip, koji poseduje isti varijabilni region (koji definiše specifičnost antitela i neki od njegovih afiniteta). Takav molekul bi tada bio u stanju da fiksira komplement i učestvuje u CDC i/ili da bude sposoban da se vezuje za Fc receptore na efektorskim ćelijama i učestvuje u ADCC-u.

[0239] "Analize cele krvi" koriste nefrakcionisanu krv kao izvor prirodnih efektora. Krv sadrži komplement u plazmi, zajedno sa FcR-ekspresivnim ćelijskim efektorima, kao što su polimorfonuklearne ćelije (PMNs) i mononuklearne ćelije (MNCs). Na taj način, testiranje cele krvi omogućava istovremenu procenu sinergije oba ADCC i CDC efektorska mehanizma in vitro.

[0240] "Terapeutski efikasna" količina koja se ovde koristi je količina koja pruža određeno poboljšanje ili koristi subjektu. Navedeno na drugi način, "terapeutski efikasna" količina je količina koja obezbeđuje određeno ublažavanje, ublažavanje i/ili smanjenje barem jednog kliničkog simptoma. Klinički simptomi povezani sa poremećajima koji se mogu tretirati metodama pronalaska su dobro poznati onima koji su stručni u oblasti. Osim toga, stručnjaci u oblasti će ceniti da terapeutski efekti ne moraju biti potpuni ili kurativni, sve dok se neka pomoć obezbeđuje subjektu.

[0241] Primeri karcinoma kod ljudi uključuju tumor mokraćne bešike, tumor dojke, tumor prostate, karcinom bazalnih ćelija, karcinom bilijarnog trakta, kancer mokraćne bešike, kancer kostiju, rak mozga i CNS (npr. gliomni tumor), rak grlića materice, horiokarcinom, rak vezivnog tkiva, kancer digestivnog sistema; karcinom endometrijuma, rak jednjaka; rak očiju; kancer glave i vrata; kancer želuca; intra-epitelna neoplazma; rak bubrega; rak laringsa; leukemija; rak jetre; karcinom pluća (npr. male ćelije i ne-male ćelije); limfom uključujući Hodgkinov i ne-Hodgkinov limfom; melanom; mijelom, neuroblastomom, rak oralne šupljine (npr. usne, jezika, usta i grla); rak jajnika; rak pankreasa, retinoblastom; rabdomiosarkom; rak rektuma, bubrežni karcinom, kancer respiratornog sistema; sarkom, rak kože; rak želuca, rak testisa, rak tiroide; rak uterusa, kancer urinarnog sistema, kao i drugi karcinomi i sarkomi.

[0242] Primeri hroničnih infekcija kod ljudi uključuju HIV, hepatitis B virus (HBV) i hepatitis C virus (HCV).

[0243] Termin "i/ili" koji se koristi ovde treba da se uzima kao specifični opis svake od dve navedene karakteristike ili komponente sa ili bez druge. Na primer, "A i/ili B" treba uzeti kao specifično opisivanje svake od (i) A, (ii) B i (iii) A i B, kao što je i svaka navedena pojedinačno ovde.

Struktura antitela

[0244] Poznato je da osnovna struktura antitela sadrži tetramer. Svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koji su prvenstveno odgovorni za prepoznavanje antigena. Karboksiterminalni deo svakog lanca definiše konstantni region koji je primarno odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgA i IgE, respektivbr. U okviru lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni se pridružuju regionu "J" sa oko 12 ili više aminokiselina, a teški lanac uključuje i "D" region sa oko 10 aminokiselina više. Videti uopšteno, Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

[0245] Varijabilni regioni svakog laki/teški para lanca formiraju mesto vezivanja antitela.

[0246] Na taj način, intaktno antitelo ima dva mesta vezivanja. Osim u bifunkcionalnim ili bispecifičnim antitelima, dva mesta vezivanja su ista.

[0247] Svi lanci pokazuju istu opštu strukturu relativno konzervisanih okvirnih regiona (FR) kojima se pridružuju tri hiper-varijabilne regije, takođe nazvane CDR. CDR-i iz dva lanca svakog para su poravnati okvirnim regionima, omogućavajući vezivanje za određeni epitop. Od N-terminala do C-terminala, i laki i teški lanci sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabat Sekvence of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); Chothia i sar. Nature 342:878-883 (1989).

[0248] Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teških i lakih lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu se proizvoditi različitim metodama, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab’ fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny i sar. J. Immunol.

148:1547-1553 (1992). Bispecifična antitela ne postoje u obliku fragmenata koji imaju pojedinačno vezujuće mesto (npr. Fab, Fab' i Fv).

[0249] Obično, VH domen je uparen sa VL domenom kako bi se obezbedilo antigen-antitelo vezujuće mesto, iako se samo VH ili VL domen može koristiti za vezivanje antigena. VH domen (vidi tabelu 9) može biti uparena sa VL domenom (videti tabelu 13), tako da se formira antigenantitelo vezujuće mesto koje obuhvata i VH i VL domene.

Humana antitela i humanizacija antitela

[0250] Sa humanim antitelima se izbegavaju neki od problema povezanih sa antitelima koja imaju mišji ili pacovski varijabilni i/ili konstantni regioni. Prisustvo takvih proteina iz miševa ili pacova može dovesti do brzog čišćenja od antitela ili može dovesti do stvaranja imunskog odgovora prema antitelu od strane pacijenta. Kako bi se izbeglo korišćenje mišjih antitela ili antitela pacova, moguće je generisati kompletno humana antitela kroz uvođenje funkcionalnog lokusa humanog antitela u glodare, druge sisare ili životinje, tako da glodar, drugi sisar ili životinja proizvode kompletno humana antitela.

[0251] Jedan od načina za generisanje potpuno ljudskih antitela je upotreba XenoMouse® sojeva miševa koji su konstruisani tako da sadrže to, ali manje od 1000 kb veličine germinalne ćelijske linije konfigurisanih fragmenata humanog lokusa teškog lanca i kapa lokus lakog lanca. Videti Mendez i sar. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green i Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998). XenoMouse<®>sojevi su dostupni preko Amgen, Inc. (Fremont, California, U.S.A).

[0252] Takvi miševi su, tada, sposobni da proizvode humane imunoglobulinske molekule i antitela i deficijentni su u proizvodnji imunoglobulinskih molekula i antitela miševa. Tehnologije korišćene za postizanje istih su objavljene u U.S. Patentna prijava Serijski Br. 08/759,620, podnetana 3. decembra, 1996 i Međunarodna patentna prijava Br. WO 98/24893, objavljena 11. juna, 1998 i WO 00/76310, objavljena 21. decembra, 2000. Videti takođe Mendez i sar. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

[0253] Proizvodnja XenoMouse® sojeva miševa se dalje razmatra i objašnjava u U.S. Patentnoj prijavia Serijski Br. 07/466,008, podnetana 12. januara, 1990, 07/610,515, podnetana 8. novembra, 1990, 07/919,297, podnetana 24. jula, 1992, 07/922,649, podnetana 30. jula, 1992, 08/031,801, podnetana 15. marta, 1993, 08/112,848, podnetana 27. avgusta, 1993, 08/234,145, podnetana 28. aprila, 1994, 08/376,279, podnetana 20. januara, 1995, 08/430, 938, podnetana 27. aprila, 1995, 08/464,584, podnetana 5. juna, 1995, 08/464,582, podnetana 5. juna, 1995, 08/463,191, podnetana 5. juna, 1995, 08/462,837, podnetana 5. juna, 1995, 08/486,853, podnetana 5. juna, 1995, 08/486,857, podnetana 5. juna, 1995, 08/486,859, podnetana 5. juna, 1995, 08/462,513, podnetana 5. juna, 1995, 08/724,752, podnetana 2. oktobra, 1996, 08/759,620, podnetana 3. decembra, 1996, U.S. Objavi 2003/0093820, podnetana 30. novembra, 2001 i U.S. Patent Br.6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, i 5,939,598 i Japanski Patent Br.3068 180 B2, 3 068506 B2, i 3 068507 B2. Videti takođe Evropski patent Br., EP 0 463151 B1, odobrenje objavljeno 12. juna, 1996, Međunarodna patentna prijava Br., WO 94/02602, objavljena 3. februara, 1994, Međunarodna patentna prijava Br., WO 96/34096, objavljena 31. oktobra, 1996, WO 98/24893, objavljena 11. juna, 1998, WO 00/76310, objavljena 21. decembra, 2000.

[0254] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., koriste "minilokus" pristup. U minilokus pristupu, egzogeni Ig lokus se mimikuje kroz uključivanje komada (pojedinačnih gena) iz Ig lokusa. Na taj način, jedan ili više VHgena, jedan ili više DHgena, jedan ili više JHgena, mu konstantni region i obično drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) formiraju se u konstrukt za insertovanje u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patent Br. 5,545,807 do Surani i sar. i U.S. Patent Br.5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, i 6,255,458 svaki do Lonberg i Kay, U.S. Patent Br.

5,591,669 i 6,023.010 do Krimpenfort i Berns, U.S. Patent Br.5,612,205, 5,721,367, i 5,789,215 do Berns i sar., i U.S. Patent Br. 5,643,763 do Choi i Dunn, i GenPharm International U.S. Patentna aplikacija Serial Br.07/574,748, podnetana 29. avgusta, 1990, 07/575,962, podnetana 31. avgusta, 1990, 07/810,279, podnetana 17. decembra, 1991, 07/853,408, podnetana 18. marta, 1992, 07/904,068, podnetana 23. juna, 1992, 07/990,860, podnetana 16. decembra, 1992, 08/053,131, podnetana 26, aprila, 1993, 08/096,762, podnetana 22. jula, 1993, 08/155,301, podnetana 18. novembra, 1993, 08/161,739, podnetana 3. decembra, 1993, 08/165,699, podnetana 10. decembra, 1993, 08/209,741, podnetana 9. marta, 1994. Videti takođe Evropski patent Br. 0546 073 B1, Međunarodna patentna prijava Br. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. Patent Br.5,981,175.

[0255] Videti dalje Taylor i sar., 1992, Chen i sar., 1993, Tuaillon i sar., 1993, Choi i sar., 1993, Lonberg i sar., (1994), Taylor i sar., (1994), i Tuaillon i sar., (1995), Fishwild i sar., (1996).

[0256] Kirin je takođe pokazao generisanje humanih antitela iz miševa u kojima su, putem mikroćelijske fuzije, uvedeni veliki delovi hromozoma ili čitavi hromozomi. Videti Evropska patentna aplikacija Br.773288 i 843961.

Dodatno, KM™- miševi, koji su rezultat unakrsnog gajenja Kirinovih Tc miševa sa Medarek-ovim minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi poseduju humani IgH transhromozom Kirin miševa i transgeni kapa lanac Genfarm miševa (Ishida i sar., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

[0257] Humana antitela mogu takođe biti izvedena metodama in vitro. Pogodni primeri uključuju, ali nisu ograničeni na prikaz faga (Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (ranije Proliferon), Affimed) prikaz ribozoma (CAT), prikaz kvasca i slično.

Priprema antitela

[0258] Antitela, kako je opisano ovde, pripremljeni su korišćenjem tehnologije XenoMouse®, kako je opisano u nastavku. Takvi miševi su sposobni da proizvedu humane imunoglobulinske molekule i antitela i deficitarni su u proizvodnji mišjih imunoglobulinskih molekula i antitela. Tehnologije koje se koriste za postizanje istih opisane su u patentima, aplikacijama i referencama objavljenim u ovom odeljku. Posebno, međutim, opisan je preferirani primer transgene proizvodnje miševa i antitela iz nje u U.S. Patentna prijava Serijski Br. 08/759,620, podnetana 3. decembra, 1996 i Međunarodna patentna prijava Br. WO 98/24893, objavljena 11. juna, 1998 i WO 00/76310, objavljena 21. decembra, 2000. Videti takođe Mendez i sar. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

[0259] Kroz upotrebu takve tehnologije proizvedena su kompletno humana monoklonska antitela za različite antigene. U suštini, linije miševa XenoMouse® imunizovane su sa antigenom od interesa (npr. B7-H1), limfne ćelije (kao što su B-ćelije) su odvojene iz hiperimunizovanih miševa, a odvojeni limfociti su spojeni sa ćelijskom linijom mijeloidnog tipa za pripremu besmrtne hibridomske ćelijske linije. Ove ćelijske linije hibridoma su skriningovane i odabrane da bi se identifikovale hibridomske ćelijske linije koje su proizvele antitela specifična za antigen od interesa. Ovde su navedeni postupci za proizvodnju višestrukih hibridomskih ćelijskih linija koje proizvode antitela specifična za B7-H1. Dalje, ovde je opisana karakterizacija antitela proizvedenih od takvih ćelijskih linija, uključujući analize nukleotida i aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca takvih antitela.

[0260] Alternativno, umesto da se spoje za ćelije mijeloma da generišu hibridom, B ćelije mogu biti direktno testirane. Na primer, CD19+ B ćelije mogu biti izolovane iz hiperimunizovanih XenoMouse® miševa i dozvoiti im da proliferišu i diferenciraju u plazma ćelijama koje izlučuju antitela. Antitela iz ćelijskih supernatana se zatim skrininguju pomoću ELISA za reaktivnost usmerenu na B7-H1 imunogen. Supernatanti bi takođe mogli biti skriningovani za imunoreaktivnost usmerenu na fragmente B7-H1 kako bi se dalje mapirala različita antitela za vezivanje za domene na B7-H1 od funkcionalnog interesa. Antitela mogu takođe biti skriningovana na drugim srodnim humanim proteinama i usmereni na pacove, miševe i ne-humane primate, kao što su majmun makaki rakojed, ortologi iz B7-H1, poslednji kako bi se odredila unakrsna reaktivnost. B ćelije iz bunarčLća koji sadrže antitela od interesa mogu se imortalisati različitim metodama uključujući fuziju kako bi se uspostavili hibridomi ili iz pojedinačnih ili iz udruženih bunarčLća, ili infekcijom sa EBV ili transfekcijom od strane poznatih gena za besmrtnost, a potom postavljanjem na odgovarajućem medijumu. Alternativno, pojedinačne plazma ćelije koje izlučuju antitela sa željenim specifičnostima, zatim se izoluju korišćenjem B7-H1 specifičnog hemolitičkog plak testa (videti na primer Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)). ûelije ciljane za lizu su poželjno crvene krvne ćelije ovaca (SRBC) obložene antigenom B7-H1.

[0261] U prisustvu kulture B ćelija koja sadrži plazma ćelije koje sekretuju imunoglobulin koji je od interesa i komplement, formiranje plaka ukazuje na specifičnu sa B7-H1 posredovanu lizu crvenih krvnih ćelija ovaca koje okružuju plazma ćeliju od interesa. Pojedinačna antigen-specifična plazma ćelija u centru plaka može biti izolovana i genetske informacije koje kodiraju za specifičnost antitela se izoluju iz jedne plazma ćelije. Koristeći reverznu transkripciju praćenu sa PCR (RT-PCR), može se klonirati DNK koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela. Tako klonirana DNK se zatim može dalje ubaciti u pogodan ekspresioni vektor, poželjno vektorsku kasetu kao što je pcDNK, poželjnije kao što je pcDNK vektor koji sadrži konstantne domene teškog i lakog lanca imunglobulina. Generisani vektor se zatim može transfektovati u ćelije domaćina, npr. HEK293 ćelije, CHO ćelije i kultivisati u konvencionalnom nutritivnom medijumu modifikovanom kako je odgovarajuće, za indukciju transkripcije, selekciju transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju za željene sekvence.

[0262] Kao što će se ceniti, antitela kako su ovde opisana mogu se eksprimirati u ćelijskim linijama koje nisu hibridomske ćelijske linije. Sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se koristiti za transformaciju pogodne ćelije domaćina sisara. Transformacija može biti bilo kojom poznatom metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije domaćina sa virusom (ili vektorima) ili postupcima transfekcije poznatim u oblasti, kao što je prikazano u U.S. Patent Br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Korišćena procedura transformacije zavisi od domaćina koji se transformiše. Metode za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznate u struci i obuhvataju dekstran-posredovane transfekcije, precipitaciju kalcijum fosfata, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozomima i direktno mikroinjektiranje DNK u nukleuse.

[0263] ûelijske linije sisara koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u struci i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije koje su dostupne iz NCIMB-a, uključujući, ali bez ograničenja, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega beba hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2), humane epitelne 293 ćelije bubrega (Hek293) i niz drugih ćelijskih linija. ûelijske linije određene preferencije se biraju pomoću određivanja koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije i proizvode antitela sa konstitutivnim B7-H1 veznim svojstvima.

[0264] U tehnikama ćelija-ćelija fuzije pripremljen je mijelom CHO ćelija ili druge ćelijske linije koja poseduje teški lanac sa bilo kojim željenim izotipom i pripremljen je drugi mijelom, CHO ćelija ili druge ćelijske linije koja poseduje laki lanac. Takve ćelije mogu, nakon toga, biti spojene i može se izolovati ćelijska linija koja eksprimira intaktno antitelo.

[0265] Shodno tome, kako se generišu kandidati za antitela koja zadovoljavaju željene "strukturalne" atribute kao što je prethodno razmatrano, uopšteno se mogu obezbediti barem izvesni željeni "funkcionalni" atributi pomoću izmene izotipa.

[0266] U tehnikama ćelija-ćelija fuzije pripremljen je mijelom, CHO ćelija ili druge ćelijske linije koja poseduje teški lanac sa bilo kojim željenim izotipom i pripremljen je drugi mijelom, CHO ćelija ili druge ćelijske linije koja poseduje laki lanac. Takve ćelije mogu, nakon toga, biti spojene i može se izolovati ćelijska linija koja eksprimira intaktno antitelo.

[0267] Shodno tome, kako se generišu kandidati za antitela koja zadovoljavaju željene "strukturalne" atribute kao što je prethodno razmatrano, uopšteno se mogu obezbediti barem izvesni željeni "funkcionalni" atributi pomoću izmene izotipa.

Sekvence antitela

[0268] Primeri pronalaska uključuju antitela navedena ispod u Tabeli 1. Ova tabela prikazuje identifikacioni broj svakog antitela, zajedno sa SEK ID brojem varijabilnog domena odgovarajućeg teškog lanca i lakog lanca gena i polipeptida, respektivno. Svaka sekvenca antitela dobila je identifikacioni broj.

Tabela 1

Terapeutska administracija i formulacije

[0269] Primeri pronalaska uključuju sterilne farmaceutske formulacije anti-B7-H1 antitela koja su korisna kao tretman za oboljenja. Takve formulacije bi inhibirale vezivanje B7-H1 sa jednim ili više njegovih srodnih liganda, čime bi se tretirali patološki uslovi u kojima je, na primer, B7-H1 seruma ili tkiva abnormalno povišeno. Antitela pronalaska poželjno poseduju adekvatan afinitet za snažno inhibiranje B7-H1 aktivnosti ili inhibiranje B7-H1 vezivanja za jedan ili više njegovih srodnih liganda, a poželjno imaju adekvatno trajanje delovanja da bi se omogućilo ređe doziranje kod ljudi. Produženo trajanje delovanja će omogućiti manje česte i jednostavnije rasporede doziranja sa alternativnim parenteralnim pravcima kao što je subkutano ili intramuskularno ubrizgavanje.

[0270] Sterilne formulacije se mogu dobiti, na primer, filtracijom kroz sterilne filtracione membrane, pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije antitela. Antitelo se obično čuva u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Terapeutska antitela se uglavnom stavljaju u kontejner koji ima sterilni pristupni port, na primer, intravenoznu vreću za rastvor ili bočicu koja ima adapter koji omogućava izvlačenje formulacije, kao što je zatvarač koji može da se probije sa potkožnom iglom za injektiranje.

[0271] Trasa administracije antitela je u skladu sa poznatim metodama, npr. injekcijom ili infuzijom intravenskim, intraperitonealnim, intracerebralnim, intramuskularnim, intraokularnim, intraarterijalnim, intratekalnim, inhalacionim ili intralezionim putem, direktnim ubrizgavanjem u mesto tumora ili sa sistemima sa produženim oslobađanjem kao što je napomenuto u nastavku. Antitelo se poželjno primenjuje kontinuirano infuzijom ili ubrizgavanjem bolusa.

[0272] Delotvorna količina antitela koja će biti primenjena terapeutski će zavisiti, na primer, od terapijskih ciljeva, načina primene i stanja pacijenta. Shodno tome, poželjno je da terapeut dozira titar i modifikuje put administracije kako je potrebno kako bi se dobio optimalni terapeutski efekat. Tipično, lekar će dati antitela dok se ne postigne doza koja postiže željeni efekat. Napredak ove terapije se lako kontroliše konvencionalnim testovima ili testovima koji su ovde opisani.

[0273] Antitela, kako je opisano ovde, mogu se dobiti u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Ovaj terapeutski sastav se može ordinirati intravenozno ili kroz nos ili pluća, poželjno kao tečni ili praškasti aerosol (liofilizovan). Kompozicija se takođe može davati parenteralno ili subkutano po želji. Kada se sistemski primenjuje, terapeutski sastav treba da bude sterilan, bez pirogena i u parenteralno prihvatljivom rastvoru uz poštovanje pH, izotoničnosti i stabilnosti. Ovi uslovi su poznati onima koji su stručni u oblasti. Ukratko, dozne formulacije jedinjenja opisanih ovde su pripremljene za čuvanje ili administriranje mešanjem jedinjenja sa željenom stepenom čistoće sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, pomoćnim supstancama ili stabilizatorima. Takvi materijali nisu otrovni za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što su TRIS HCl, fosfat, citrat, acetat i druge soli organskih kiselina; antioksidansi kao što je askorbinska kiselina; peptidi niske molekulske mase (manje od oko deset ostataka) kao što su poliarginin, proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidinon; aminokiseline kao što su glicin, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina ili arginin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući celulozu ili njene derivate, glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajući agensi kao što su EDTA; šećerni alkoholi kao što su manitol ili sorbitol; surfaktanti kao što su natrijum i/ili nejonski surfaktanti kao što su TWEEN, PLURONICS ili polietilenglikol.

[0274] Sterilne kompozicije za injekcije mogu se formulisati prema konvencionalnoj farmaceutskoj praksi kako je opisano u Remingtonu: The Science and Practice of Pharmacy (20. izdanje, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Na primer, može se poželjno rastvarati ili suspendovati aktivno jedinjenje u nosaču kao što je voda ili prirodno biljno ulje poput sesamovog, kikirikijevog ili ulja od pamuka ili u sintetičkom masnom nosaču poput etil-oleata ili slično. Puferi, konzervansi, antioksidansi i slično mogu biti inkorporirani u skladu sa prihvaćenom farmaceutskom praksom.

[0275] Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže polipeptid, a matrice su u obliku oblikovanih predmeta, filmova ili mikrokapsula. Primeri matriksa sa produženim oslobađanjem uključuju poliestere, hidrogelove (npr. poli(2-hidroksietil-metakrilat), kao što su opisali Langer i sar., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 i Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105 ili poli (vinilalkohol)), polilaktidi (U.S. Pat. Br.3,773,919, EP 58,481), kopolimeri L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman i sar., Biopolymers, (1983) 22:547-556), nedegradabilni etilenvinilacetat (Langer i sar., supra), degradabilni kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su LUPRON Depot™ (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetat) i poli-D -(-)-3-hidroksibuterna kiselina (EP 133,988).

[0276] Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula više od 100 dana, određeni hidrogelovi otpuštaju proteine za kraće vremenske periode. Kada inkapsulirani proteini ostanu u telu dugo vremena, mogu denaturisati ili agregirati kao rezultat izlaganja vlazi na 37° C, što rezultira gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promenama imunogenosti. Racionalne strategije mogu biti osmišljene za stabilizaciju proteina u zavisnosti od uključenog mehanizma. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije intermolekularna formacija S-S veze kroz disulfidnu zamenu, stabilizacija se može postići modifikacijom sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, primenom adekvatnih aditiva i razvojem specifičnih kompozicija polimernih matrica.

[0277] Kompozicije sa produženim otpuštanjem takođe uključuju pripreme kristala antitela suspendovanih u odgovarajućim formulacijama sposobnim za održavanje kristala u suspenziji. Ovi preparati kada se ubrizgavaju subkutano ili intraperitonealno mogu dovesti do efekta produženog oslobađanja. Druge kompozicije takođe uključuju lipozomalno upletena antitela. Liposomi koji sadrže takva antitela pripremaju se po poznatim metodama per se: U.S. Pat. Br. DE 3,218,121; Epstein i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; Japanska patentna prijava 83-118008; U.S. Pat. Br.4,485,045 i 4,544,545; i EP 102,324.

[0278] Doziranje formulacije antitela za određenog pacijenta određuje lekar koji uzima u obzir različite faktore za koje je poznato da modifikuju delovanje lekova uključujući težinu i vrstu bolesti, telesne težine, pol, ishranu, vreme i načine primene, druge lekove i druge relevantne kliničke faktore. Terapeutski efikasne doze mogu se odrediti bilo in vitro ili in vivo metodama.

[0279] Efikasna količina antitela, opisana ovde, koja će se koristiti terapeutski zavisiće, na primer, od terapijskih ciljeva, načina primene i stanja pacijenta. Prema tome, poželjno je da terapeut dozira titar i modifikuje put administracije kako je potrebno kako bi se dobio optimalni terapeutski efekat.

Tipična dnevna doza može se kretati od oko 0,0001 mg/kg, 0,001 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg sve do 100 mg/kg, 1000 mg/kg, 10000 mg/kg ili više, telesne težine pacijenta u zavisnosti od gore navedenih faktora. Doziranje može biti između 0,0001 mg/kg i 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 5 mg/kg, 0,0001 i 2 mg/kg, 0,0001 i 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg do 0,25 mg/kg, 0,001 do 0,15 mg/kg, 0,0001 do 0,10 mg/kg, 0,001 do 0,5 mg/kg, 0,01 do 0,25 mg/kg ili 0,01 do 1,10 mg/kg telesne težine pacijenta u zavisnosti od gore navedenih faktora. Tipično, lekar će administrirati terapeutsko antitelo dok se ne postigne doza koja postiže željeni efekat. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim testovima ili kako je ovde opisano.

[0280] Doze antitela pronalaska mogu se ponoviti i administracije mogu biti razdvojene najmanje 1 dan, 2 dana, 3 dana, 5 dana, 10 dana, 15 dana, 30 dana, 45 dana, 2 meseca, 75 dana, 3 meseca , ili najmanje 6 meseci.

[0281] Biće prihvaćeno da će administracija terapeutskih entiteta u skladu sa sastavima i metodima ovde biti primenjena sa odgovarajućim nosačima, ekscipijentima i drugim agensima koji su inkorporirani u formulacije kako bi se obezbedio poboljšani transfer, isporuka, tolerancija i slično. Ove formulacije obuhvataju, na primer, prahove, paste, masti, žele, vosak, ulja, lipide, lipid (katjonski ili anjonski) koji sadrži vezikule (kao Lipofectin™), konjugate DNK, paste za anhidrovu apsorpciju, ulje u vodi i voda u ulju emulzije, karbovaks emulzije (polietilen glikoli različitih molekularnih težina), polutvrde gelove i polučvrste smeše koje sadrže karbovaks. Bilo koja prethodno navedena smeša može biti pogoDNK za tretmane i terapije u skladu sa predmetnim pronalaskom, pod uslovom da aktivni sastojak u formulaciji nije inaktiviran formulacijom, a formulacija je fiziološki kompatibilna i tolerantna sa načinom primene. Videti takođe Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilisation i development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm.203(1-2):1-60 (2000), Charman WN " Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts" J Pharm Sci .89(8):967-78 (2000), Powell i sar. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311 (1998) i citatea u njima za dodatne informacije vezane za formulacije, ekscipijente i nosače dobro poznate farmaceutskim hemičarima.

Dizajn i generisanje drugih terapeutika

[0282] U skladu sa predmetnim pronalaskom i zasnovano na aktivnostima antitela koja su proizvedena i okarakterisana ovde, u odnosu na B7-H1, dizajn drugih terapeutskih modaliteta pored delova antitela, je olakšan i otkriven stručnoj osobi. Takvi modaliteti uključuju, bez ograničenja, naprednu terapiju antitelima, kao što su bispecifična antitela, imunotoksini, radioaktivno označena terapija i V domeni pojedinačnog antitela, antitelima slični agensi za vezivanje zasnovani na drugim, pored skeleta V regiona, antitela sa jednim domenom, generisanje peptidnih terapeutika, B7-H1 vezujući domeni u novim skeletima, genske terapije, posebno intratela, antisens terapeutici i mali molekuli.

[0283] Mesto za vezivanje antigena može se obezbediti pomoću aranžmana CDR-ova na skeletima proteina koji nisu iz antitela, kao što su fibronektin ili citohrom B itd. (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide i sar. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren i sar. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469) ili randomizacijom ili mutiranjem aminokiselinskih ostataka petlje unutar proteinske skele kako bi se dodelila vezujuća specifičnost za željeni cilj. Skeleti za konstruisanje novih mesta za vezivanje u proteinima detaljno su razmatreni od strane Nygren i sar. (Nygren i sar. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469). Proteinski skeleti za imitaciju antitela opisane su u WO/0034784, u kojem pronalazači opisuju proteine (imitacije antitela) koji uključuju domen tipa fibronektin tipa III koji ima najmanje jednu randomizovanu petlju. Pogodni skelet u koji se graftuju jedan ili više CDR-ova, npr. skup HCDR-ova, može biti obezbeđen od strane bilo kog člana domena superfamilije gena imunoglobulina. Skelet može biti humani ili ne-humani protein. Prednost ne-antitelske proteinske skele je to što može da obezbedi mesto za vezivanje antigena u molekulu skeleta koji je manji i/ili lakši za proizvodnju od bar nekih molekula antitela. Mala veličina vezujućeg člana može dati korisna fiziološka svojstva, kao što je sposobnost ulaska u ćelije, duboka penetricija u tkiva ili dostizanje ciljanih unutar drugih struktura, ili povezivanje unutar proteinskih šupljina ciljnog antigena. Upotreba mesta za vezivanje antigena u skeletima proteina koji nisu iz antitela razmatrana je u Wess, 2004 (Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report na BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004). Tipični su proteini koji imaju stabilnu kičmu i jednu ili više varijabilnih petlji, u kojima je aminokiselinska sekvenca petlje ili petlji specifično ili slučajno mutirana da bi se stvorilo antigen-vezjuće mesto koje vezuje ciljani antigen. Takvi proteini uključuju IgG vezujući domen proteina A iz S. aureus, transferin, albumin, tetranektina, fibronektin (na primer, 10-ti domen fibronektina tipa III), lipokalini, kao i gama-kristalin i drugi Affilin™ skeleti (Scil proteini). Primeri drugih pristupa uključuju sintetička "mikrotela" zasnovana na ciklotidima - malim proteinima sa intramolekularnim disulfidnim vezama, Mikroproteine (Versabodies™, Amunix) i ankirinske ponavljajuće proteine (DARPins, Molecular Partners).

[0284] Pored sekvenci antitela i/ili mesta za vezivanje antigena, ciljano vezujući agens predmetnom pronalasku, može sadržati druge aminokiseline, npr. koje formiraju peptid ili polipeptid, kao što je umotani domen, ili da dodaju molekulu drugu funkcionalnu karakteristiku pored sposobnosti da se vezuju za antigen. Ciljano vezujući agensi pronalaska mogu nositi detektibilnu oznaku ili mogu biti konjugovani sa toksinom ili ciljanim delom ili enzimom (npr. preko peptidilne veze ili linkera). Na primer, ciljano vezujući agens može sadržati katalitičko mesto (npr. u domenu enzima), kao i mesto za vezivanje antigena, pri čemu se mesto vezivanja antigena vezuje za antigen i time usmerava katalitičko mesto na antigen. Katalitičko mesto može inhibirati biološku funkciju antigena, npr. cepanjem.

[0285] U konekciji sa generisanjem naprednih terapeutika iz antitela, gde je fiksiranje komplementa poželjan atribut, može se izbeći zavisnost od komplementa za ubijanje ćelija putem primene bispecifičnih antitela, imunotoksina ili radiooznaka, na primer.

[0286] Na primer, mogu se generisati bispecifična antitela koja obuhvataju (i) dva antitela jedno sa specifičnošću za B7-H1 i drugo za drugi molekul, koja su konjugovana zajedno, (ii) jedno antitelo koje ima jedan lanac specifičan za B7-H1 i drugi lanac specifičan za drugi molekul, ili (iii) antitelo sa jednim lancem koje ima specifičnost za B7-H1 i drugi molekul. Takva bispecifična antitela mogu se generisati korišćenjem tehnika koje su dobro poznate; na primer, u vezi sa (i) i (ii) videti, npr., Fanger i sar. Immunol Methods 4:72-81 (1994) i Wright i Harris, supra. i u vezi sa (iii) videti npr., Traunecker i sar. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992). U svakom slučaju, druga specifičnost se može napraviti po želji. Na primer, druga specifičnost se može napraviti za receptore aktivacije teškog lanca, uključujući, bez ograničenja, CD16 ili CD64 (videti npr., Deo i sar. Immunol. Today 18:127 (1997)) ili CD89 (videti npr., Valerius i sar. Blood 90:4485-4492 (1997)).

[0287] Antitela takođe mogu biti modifikovana tako da deluju kao imunotoksini koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Videti npr., Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Videti takođe U.S. Patent Br. 5,194,594. U konekciji sa izradom radioaktivno označenih antitela, takva modifikovana antitela se takođe lako mogu pripremiti koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Videti npr., Junghans i sar. in Cancer Chemotherapy i Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner i Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Videti takođe U.S. Patent Br.4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, i 5,697,902. Svaki imunootoksin ili radioaktivno označeni molekul verovatno će ubiti ćelije koje eksprimiraju željenu subjedinicu multimernog enzimskog domena oligomerizacije.

[0288] Kada je antitelo vezano za agens (npr. radioizotop, farmaceutsku kompoziciju ili toksin), pretpostavlja se da agens poseduje farmaceutsko svojstvo izabrano iz grupe antimitotskih, alkilacionih, antimetabolitskih, antiangiogenih, apoptotskih, alkaloidnih, COX-2, i antibiotskih agenasa i njihovih kombinacija. Agens se može odabrati iz grupe azotnih iperita, derivata etilenimina, alkil sulfonata, nitrozoureaza, triazena, analoga folne kiseline, antraciklina, taksana, inhibitora COX-2, analoga pirimidina, analoga purina, antimetabolita, antibiotika, enzima, epipodofilotoksina, kompleksa za platinsku koordinaciju, vinka alkaloida, supstituisanih urea, derivata metil hidrazina, supresivnih adrenokortikoida, antagonista, endostatina, taksola, kamptotecina, oksaliplatina, doksorubicina i njihovih analoga i njihovih kombinacija. Primeri toksina dalje uključuju gelonin, Pseudomonasov egzotokin (PE), PE40, PE38, toksin difterije, ricin, abrin, alfa toksin, saporin, ribonukleazu (RNaze), DNaze I, stafilokokni enterotoksin-A, vinobojkin antivirusni protein, gelonin, Pseudomonasov endotoksin, članovi enediina porodice molekula, kao što su kalihemicin i esperamicin, kao i derivati, kombinacije i njihove modifikacije. Hemijski toksini se takođe mogu uzimati iz grupe koja se sastoji od: duokarmicin (videti, npr., U.S. Patent Br.

5,703,080 i U.S. Patent Br. 4,923,990), metotreksat, doksorubicin, melfalan, hlorambucil, ARA-C, vindezin, mitomicin C, cis-platinum , etopozid, bleomicin i 5-fluorouracil. Primeri hemoterapeutskih sredstava uključuju i Adriamicin, Doksorubicin, 5-Fluorouracil, Citozin arabinozid (Ara-C), Ciklofosfamid, Tiotepa, Taksoter (docetaksel), Busulfan, Citoksin, Taksol, Metotrekat, Cisplatin, Melfalan, Vinblastin, Bleomicin, Etopozid, Ifosfamid, Mitomicin C, Mitoksantron, Vinkreistin, Vinorelbin, Karboplatin, Tenipozid, Daunomicin, Karminomicin, Aminopterin, Daktinomicin, Mitomicini, Esperamicini (videti patent US 4,675,187), Melfalan i drugi srodni azotnom iperitu. Pogodni toksini i hemoterapeutski agensi opisani su u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), i u Goodman i Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985). Ostali pogodni toksini i/ili hemoterapeutski agensi su poznati stručnim osobama iz oblasti.

[0289] Primeri za radioizotope obuhvataju gama emitere, pozitronske emitere i rendgenske emitere koji se mogu koristiti za lokalizaciju i/ili terapiju, i beta emitere i alfa-emitere koji se mogu koristiti za terapiju. Radioizotopi koji su ranije opisani kao korisni za dijagnostiku, prognostiku i izvođenje su takođe korisni za terapiju.

[0290] Neograničavajući primeri anti-kancerogenih ili anti-leukemijskih agenasa uključuju antracikline kao što su doksorubicin (adriamicin), daunorubicin (daunomicin), idarubicin, detorubicin, karminomicin, epirubicin, ezorubicin i morfolino i supstituisane derivate, njihove kombinacije i modifikacije. Primeri farmaceutskih agensa uključuju cis-platinum, taksol, kalihemicin, vinkristin, citarabin (Ara-C), ciklofosfamid, prednizon, daunorubicin, idarubicin, fludarabin, hlorambucil, interferon alfa, hidroksiurea, temozolomid, talidomid i bleomicin i derivate, kombinacije i njihove modifikacije. Poželjno, anti-kancer ili anti-leukemijski agens je doksorubicin, morfolinodoksorubicin ili morfolinodaunorubicin.

[0291] Antitela pronalaska takođe obuhvataju antitela koja imaju vreme poluraspada (npr., vreme poluraspada u serumu) kod sisara, poželjno čoveka, veće od onog kod neizmenjenih antitela. U jednom slučaju, vreme poluraspada antitela je veći od oko 15 dana, veći od oko 20 dana, veći od oko 25 dana, veći od oko 30 dana, veći od oko 35 dana, veći od oko 40 dana, veći od oko 45 dana, veći od oko 2 meseca, veći od oko 3 meseca, veći od oko 4 meseca, ili većia od oko 5 meseci. Povećano vreme poluraspada antitela predmetnog pronalaska ili njihovih fragmenata kod sisara, poželjno čoveka, rezultuju višim serumskim titrom pomenutih antitela ili fragmenata antitela kod sisara, i time smanjuju učestalost administriranja navedenog antitela ili fragmenta antitela i/ili smanjuje koncentraciju pomenutih antitela ili fragmenata antitela za primenu. Antitela ili njihovi fragmenti koji imaju povećanje vremena poluraspada in vivo mogu biti generisani tehnikama poznatim stručnjacima u oblasti. Na primer, antitela ili fragmenti sa povećanim in vivo vremenom poluraspada mogu se generisati modifikovanjem (npr. zamena, delecija ili adicija) ostataka amino kiselina identifikovanih das u uključeni u interakcije između domena Fc i FcRn receptora (videti, npr., Međunarodna objava Br. WO 97/34631 i WO 02/060919. Antitela ili njihovi fragmenti sa povećanim vremenom pluraspada in vivo mogu se generisati vezivanjem, na pomenuta antitela ili fragmente antitela, polimernih molekula kao što je polietilenglikol visoke molekulske mase (PEG). PEG se može spojiti sa navedenim antitelima ili fragmentima antitela sa ili bez multifunkcionalnog linkera bilo putem specifične lokacije konjugacije PEG na N- ili C-terminuse pomenutih antitela ili fragmenata antitela ili putem epsilon-amino grupa prisutnih na ostacima lizina. Koristi se linearna ili razgranata derivacija polimera koja rezultira minimalnim gubitkom biološke aktivnosti. Stepen konjugacije će se pažljivo pratiti sa SDS-PAGE i masenom spektrometrijom kako bi se osigurala pravilna konjugacija PEG molekula na antitela. Nereagovani PEG može biti odvojen od antitela-PEG konjugata, npr., isključivanjem veličine ili jono izmenjivačkom hromatografijom.

[0292] Kao što će biti poznato stručnjacima, u navedenim slučajevima, dok vrednosti afiniteta mogu biti važne, drugi faktori mogu biti isto toliko važni ili više, u zavisnosti od određene funkcije antitela. Na primer, za imunotoksin (toksin povezan sa antitelom), akcija vezivanja antitela za cilj može biti korisna; međutim, u nekim slučajevima, internalizacija toksina u ćeliju je željeni krajnji rezultat. Kao takva, antitela sa visokom procentualnom internalizacijom mogu biti poželjna u ovim situacijama. Na taj način, u jednom slučaju, razmatrana su antitela sa visokom efikasnošću u internalizaciji. Visoka efikasnost internalizacije može se meriti kao procenat internalizovanih antitela i može biti od niskih vrednosti do 100%. Na primer, u različitim slučajevima, 0,1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 , 90-99 i 99-100% može biti visoka efikasnost. Kao što će biti poznato stručnjacima u ovoj oblasti, poželjna efikasnost može biti različita u različitim slučajevima, u zavisnosti od, na primer, povezanog agensa, količine antitela koja se može primeniti na neku površinu, neželjenih efekata antitelo-agen kompleksa, tipa (npr. tip kancera) i ozbiljnosti problema koji treba tretirati.

[0293] U drugim slučajevima antitela koja su ovde opisana obezbeđuju analitički set za detekciju ekspresije B7-H1 u tkivima ili ćelijama sisara kako bi se ustanovila bolest ili poremećaj koji je povezan sa promenama ekspresije B7-H1. Set sadrži antitelo koje vezuje B7-H1 i sredstva za indikaciju reakcije antitela sa antigenom, ako je prisutna.

[0294] U nekim primerima, obezbeđen je proizveni proizvod koji sadrži kontejner, koji sadrži kompoziciju koja sadrži antitelo koje specifično vezuje B7-H1, kao i insert ili etiketu u pakovanju koja ukazuje na to da se kompozicija može koristiti za lečenje bolesti posredovane ekspresijom B7-H1. Poželjno, sisar, a još poželjnije, čovek, prima antitelo koje se specifično vezuje za B7-H1.

Kombinacije

[0295] Antitumorski tretman definisan ovde može biti primenjen kao jedina terapija ili može uključiti, osim jedinjenja pronalaska, konvencionalnu operaciju, transplantaciju koštane srži i perifernih matičnih ćelija ili radioterapiju ili hemoterapiju. Takva hemoterapija može uključivati jednu ili više od sledećih kategorija anti tumornih agenasa:

(i) drugi antiproliferativni/antineoplastični lekovi i njihove kombinacije, kao što se koriste u medicinskoj onkologiji, kao što su sredstva za alkilovanje (na primer, cis-platin, oksaliplatin, karboplatin, ciklofosfamid, azotni iperit, melfalan, hlorambucil, busulfan, temozolamid i nitrozouree); antimetaboliti (na primer gemcitabin i antifolati kao što su fluoropirimidini kao što su 5-fluorouracil i tegafur, raltitreksed, metotreksat, citozin arabinozid i hidroksiurea); anti-tumorski antibiotici (na primer antraciklini kao što su adriamicin, bleomicin, doksorubicin, daunomicin, epirubicin, idarubicin, mitomicin-C, daktinomicin i mitramicin); antimitotični agensi (na primer, vinka alkaloidi kao što su vinkristin, vinblastin, vindezin i vinorelbin i taksoidi kao što je taksol i taksoter i inhibitori polokinaze); i inhibitori topoizomeraze (na primer epipodofilotoksini poput etopozida i tenipozida, amsakrina, topotekana i kamptotecina);

(ii) citostatici kao što su antiestrogeni (na primer, tamokifen, fulvestrant, toremifen, raloksifen, drooksifen i jodoksifen), antiandrogeni (na primer bikalutamid, flutamid, nilutamid i ciproteron acetat), LHRH antagonisti ili LHRH agonisti (na primer goserelin, leuprorelin i buserelin), progestogeni (na primer megestrol acetat), inhibitori aromataze (na primer kao đto je anastrozol, letrozol, vorazol i eksemestan) i inhibitori 5Į-reduktaze kao što je finasterid;

(iii) anti-invazivni agensi (na primer, inhibitori familije c-Src kinaze kao što su 4-(6-hloro-2,3-metilendioksianilino)-7-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoksi]-5-tetrahidropiran-4-iloksikinazolin (AZD0530; MeđunaroDNK patentna prijava WO 01/94341) i N-(2-hloro-6-metilfenil)-2-{6-[4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il]-2-metilpirimidin-4-ilamino}tiazol-5-karboksamid (dasatinib, BMS-354825, J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661) i inhibitori metaloproteinaze kao što su marimastat, inhibitori receptorske funkcije urokinaze plazminogena aktivatora ili inhibitori aktivnosti katepsina, inhibitori serinskih proteaza, na primer matriptaza, hepsina, urokinaze i inhibitora integrinske ĮYȕ6 funkcije. (iv) citotoksični agensi kao što su fludarabin, 2-hlorodooksiadenozin, hlorambucil ili doksorubicin i njihove kombinacije kao što je Fludarabin ciklofosfamid, CVP: ciklofosfamid vinkristin prednizon, ACVBP: doksorubicin ciklofosfamid vindezin bleomicin prednizon, CHOP: ciklofosfamid doksorubicin vinkristin prednizon, CNOP: ciklofosfamid mitoksantron vinkristin prednizon, m-BACOD: metotreksat bleomicin doksorubicin ciklofosfamid vinkristin deksametazon leukovorin., MACOP-B: metotreksat doksorubicin ciklofosfamid vinkristin prednizonska fiksna doza bleomicin leukovorin ili ProMACE CytaBOM: prednizon doksorubicin ciklofosfamid etopozid citarabin bleomicin vinkristin metotreksat leukovorin.

(v) inhibitori funkcije faktora rasta: na primer, takvi inhibitori uključuju antitela faktora rasta i antitela receptora faktora rasta (na primer antitelo anti-erbB2 antitelo trastuzumab [Herceptin™], anti-EGFR antitelo panitumumab, anti-erbB1 antitelo cetuksimab [Erbituk, C225] i bilo koji faktor rasta ili antitela receptora faktora rasta koji je opisao Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, vol 54, str.11-29); takvi inhibitori takođe uključuju inhibitore tirozin kinaze, na primer inhibitore familije epidermalnog faktora rasta (na primer inhibitori tirozin kinaze EGFR porodice kao što su N-(3-hloro-4-fluorofenil)-7-metoksi-6-(3-morfolinopropoksi)hinazolin-4-amin (gefitinib, ZD 1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoksietoksi)kinazolin-4-amin (erlotinib, OSI-774) i 6-akrilamido-N-(3-hloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoksi)-hinazolin-4-amin (CI 1033), inhibitori erbB2 tirozin kinaze, kao što su lapatinib, inhibitori porodice faktora rasta hepatocita, inhibitori faktora rasta iz trombocita kao što su imatinib, inhibitori serin/treonin kinaza (na primer inhibitori Ras/Raf signala kao što su inhibitori farnezil transferaze, na primer sorafenib (BAY 43-9006)), inhibitori signalizacije ćelija preko MEK i/ili AKT kinaza, inhibitori porodice faktora rasta hepatocita, c-kit inhibitori, abl kinaza inhibitori, IGF receptor (faktor rasta koji je sličan insulinu) kinaza inhibitori; inhibitori aurora kinaze (na primer AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 i AX39459) i ciklin-zavisni inhibitori kinaze kao što su CDK2 i/ili CDK4 inhibitori i inhibitori proteina signalizacije preživljavanja kao što su Bcl-2, Bcl-XL na primer ABT-737;

(vi) antiangiogeni agensi kao što su oni koji inhibiraju efekte faktora rasta vaskularnog endotela, (na primer, anti-vaskularni faktor rasta endotelnih ćelija antitelo bevacizumab (Avastin™)] i VEGF inhibitori receptora tirozin kinaze 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metoksi-7- (1-metilpiperidin-4-ilmetoksi)kinazolin (ZD6474, Primer 2 unutar WO 01/32651), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5-iloksi)-6-metoksi-7-(3-pirolidin-1-ilpropoksi)kinazolin (AZD2171, Primer 240 unutar WO 00/47212), vatalanib (PTK787, WO 98/35985) i SU11248 (sunitinib, WO 01/60814), jedinjenja kao što su ona opisana u međunarodnim patentnim prijavama WO97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO00/47212 i WO01/32651, anti-vaskularni endotelni faktor rasta receptor antitela kao što je anti-KDR antitela i anti-flt1 antitela) i jedinjenja koja rade sa drugim mehanizmima (na primer linomid, inhibitori integrin ĮYȕ3 funkcije i angiostatin)] ili stimulirajući faktor kolonija 1 (CSF1) ili CSF1 receptor; Dodatne detalje o AZD2171 mogu se naći u Wedge et al (2005) Cancer Research. 65 (10): 4389-400. Dodatni detalji o AZD6474 mogu se naći u Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cancer.92 Dodatak 1: S6-13.

(vii) agensi vaskularnog oštećenja kao što su Kombretastatin A4 i jedinjenja otkrivena u Međunarodnoj patentnoj aplikacijas WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 i WO 02/08213;

(viii) antisens terapije, na primer one koje su usmerene na gore navedene ciljeve, kao što su ISIS 2503, anti-ras antisens ili G3139 (Genasense), anti bcl2 antisens;

(ix) pristupi genske terapije, uključujući na primer pristupe za zamenu aberantnih gena kao što su aberantni p53 ili aberantni BRCA1 ili BRCA2, GDEPT (gen-usmeren enzim pro-lek terapija), pristupi kao što su oni koji koriste citozin deaminazu, timidin kinazu ili bakterijski nitroreduktazni enzim i pristupe za povećanje tolerancije pacijenta na hemoterapiju ili radioterapiju, kao što je genska terapija rezistentnosti na više lekova;

(x) pristupi imunoterapije, uključujući na primer tretman sa Alemtuzumabom (campat-1H™), monoklonalno antitelo usmereno na CD52, ili lečenje sa antitelima usmerenim na CD22, ex vivo i in vivo pristupe za povećanje imunogenosti tumorskih ćelija pacijenata, transfekcija sa citokinima kao što su kao interleukin 2, interleukin 4 ili faktor stimulacije kolonija granulocitnih makrofaga, pristupi smanjenja anergije T ćelija kao što je tretman sa monoklonskim antitelima koja inhibiraju CTLA-4 funkciju, pristupi koji koriste transfektirane imunske ćelije kao što su dendritične ćelije transfektirane sa citokinom, pristupi koji primenjuju tumorkse ćelijske linije transfektovane citokinima i pristupe koji koriste anti-idiotipska antitela, adoptivni T-ćelijski transfer korišćenjem T-ćelija koje nisu posebno aktivirane ili su usmerene na specifičan antigen od interesa ex vivo;

(xi) Pristupi koji uključuju vakcinaciju, uključujući na primer, tretman sa vakcinom usmerenom protiv specifične virusne infekcije kao što je HIV ili HBV, ili tretman vakcinom usmerenom na specifični tumorski antigen;

(xii) inhibitori degradacije proteina kao što je inhibitor proteazoma, kao što je Velcade (bortezomib); i

(xiii) bioterapijski terapeutski pristupi na primer oni koji koriste peptide ili proteine (kao što su antitela ili rastvorne konstrukcije eksternih receptorskih domena) koji ili sekvestiraju receptorske ligande, blokiraju vezu liganda na receptor ili smanjuju signalizaciju receptora (npr. zahvaljujući povećanoj degradaciji receptora ili smanjenim nivoima ekspresije).

[0296] U jednom primeru, anti-tumorski tretman definisan ovde može uključiti, pored jedinjenja pronalska, tretman sa drugim antiproliferativnim/antineoplastičnim lekovima i njihovim kombinacijama, kako se koristi u medicinskoj onkologiji, kao što su agensi za alkilovanje (na primer cis-platin, oksaliplatin, karboplatin, ciklofosfamid, azotni iperit, melfalan, hlorambucil, busulfan, temozolamid i nitrozouree); antimetaboliti (na primer gemcitabin i antifolati kao što su fluoropirimidini kao što su 5-fluorouracil i tegafur, raltitreksed, metotreksat, citozin arabinozid i hidroksiurea); antitumorski antibiotici (na primer antraciklini kao što su adriamicin, bleomicin, doksorubicin, daunomicin, epirubicin, idarubicin, mitomicin-C, daktinomicin i mitramicin); antimitotični agensi (na primer, vinka alkaloidi kao što su vinkristin, vinblastin, vindezin i vinorelbin i taksoidi kao taksol i taksoter i inhibitori polokinaze); i inhibitori topoizomeraze (na primer epipodofilotoksini poput etopozida i tenipozida, amsacrina, topotekana i kamptotecina).

[0297] Takav zajednički tretman može se postići putem istovremenog, sekvencijalnog ili odvojenog doziranja pojedinačnih komponenti tretmana. Ovakvi kombinovani proizvodi koriste jedinjenja ovog pronalaska ili njihove farmaceutski prihvatljive soli u okviru doznog opsega opisanog ovde prethodno i druge farmaceutski aktivne agense u okviru odobrenog doznog opsega

PRIMERI

[0298] Sledeći primeri, uključujući eksperimente koji su sprovedeni i gde su postignuti rezultati, dati su samo u ilustrativne svrhe i ne smeju se tumačiti kao ograničavajući na ovde navedena učenja.

PRIMER 1: EKSPRESIJA REKOMBINANTNOG HUMANOG B7-H1

[0299] Humani B7-H1 cDNK (Dong, H. i sar., 1999, Nat. Med. 5:1365 - 1369) je amplifikovan iz Image clone 7262208 (ATCC) koristeći polimeraznu lančanu reakciju (PCR), a zatim je kloniran u Nhe 1 i EcoR1 mesta na pcr3.1Bid vektoru. Ovaj konstrukt je bio lipofektiran u CHO ćelije (American Type Tissue Collection, katalog #CCL-61), a ekspresija na površini ćelija potvrđena je analizom sa fluorescentno aktiviranin sort ćelijama (FACS).

[0300] Ekstracelularni domen humanih B7-H1 (aminokiselinski ostaci 1-239) je spojen sa Fc regionom humanog IgG1s koji je nabavljen iz R&D Systems Inc., katalog #156-B7-100.

PRIMER 2: IMUNIZACIJA I ODREĈIVANJE TITRA

Imunizacija

[0301] Monoklona antitela usmerena na humani B7-H1 razvijena su sekvencijalnom imunizacijom miševa XenoMouse<®>(sojevi XenoMouse: XMG2 (IgG2 kapa/lambda) i XMG4 (IgG4 kapa/lambda) Amgen, Inc. Vankuver, Britanska Kolumbija, Kanada) sa 5-10 ug B7-H1/Fc himera proteina ili 1-2k10(6) CHO ćelija koje eksprimiraju rekombinantni humani B7-H1 kao što je opisano u Primeru 1.

[0302] Imunizacije su sprovedene prema metodama objavljenim u Američkoj patentnoj prijavi serij. Br. 08/759,620, podneta 3. decembra 1996. i u Međunarodnim patentnim prijavama br. WO 98/24893, objavljena 11. juna 1998. i WO 00/76310, objavljena 21. decembra, 2000.

Programi imunizacije su rezimirani u Tabeli 2.

Izbor životinja za sakupljanje po titru

[0303] Titri antitela u serumu od imuniziranih miševa određeni su u ELISA testu. Ploče (Corning Costar, kat #3368) su obložene humanim B7-H1/Fc proteinom (R&D Systems Inc., katalog #156-B7-100). B7-H1-specifična antitela su detektovana sa mišjim anti-humanim IgG antitelima i kozijim anti-mišjim IgG Fc antitelima koja su konjugovana sa peroksidazom rena. Uobičajeno je odabrano pet životinja sa najvišim titrima u okviru svake kohorte imunizacije za izolaciju limfocita i generisanje hibridoma.

Tabela 2. Sažetak programa imunizacije

Grupa Imunogen Soj Br. miševa Putevi imunizacije

1 Rekombinantni humani B7-H1/Fc protein IgG2 10 IP/SC, dva puta/ned, u toku 5 nede ja 2 Rekombinantni humani B7-H1/Fc protein IgG4 10 IP/SC, dva puta/ned, u toku 5 nede ja 3 CHO ćelije koje eksprimiraju humani B7-H1 IgG2 10 IP/SC, dva puta/ned, u toku 5 nede ja 4 CHO ćelije koje eksprimiraju humani B7-H1 IgG4 10 IP/SC, dva puta/ned, u toku 5 nede ja "IP" se odnosi na "intraperitonealni" i "SC" se odnosi na "subkutani"

PRIMER 3: IZDVAJANJA LIMFOCITA, IZOLACIJE B-ûELIJA, FUZIJE I GENERACIJA HIBRIDOMA

[0304] Imunizovani miševi bili su žrtvovani cervikalnim dislokacijom, a odvodni limfni čvorovi su se sakupljali i udruživali iz svake kohorte. Limfoidne ćelije su disocirane brušenjem u DMEM da bi se oslobodile ćelije iz tkiva i ćelije su suspendovane u DMEM. ûelije su prebrojane, a 0,9 ml DMEM na 100 miliona limfocita dodato je u ćelijski pelet da se ćelije resuspenduju blago ali u potpunosti. Koristeći 100 ml CD90+ magnetnih zrna na 100 miliona ćelija, ćelije su označene inkubiranjem ćelija sa magnetnim perlama na 4°C tokom 15 minuta. Magnetski obeležena suspenzija ćelija koja sadrži do 10<8>pozitivnih ćelija (ili do 2x10<9>ukupno ćelija) ubačena je u kolonu LS+ i kolona je isprana pomoću DMEM-a. Ukupan efluent je sakupljen kao CD90 negativna frakcija (od većine ovih ćelija se očekivalo da su B ćelije).

[0305] Fuzija je izvršena mešanjem ispranih obogaćenih B ćelija iz gornjih i nesekretornih mijeloma P3X63Ag8.653 ćelija kupljenih od ATCC, kat. #CRL 1580 (Kearney i sar., J. Immunol.

123, 1979, 1548-1550) u odnosu od 1:1. Mešavina ćelija je lagano peletirana centrifugiranjem na 800 x g. Posle potpunog uklanjanja supernatanta, ćelije su tretirane sa 2-4 ml rastvora Pronaze (CalBiochem, kat. #53702, 0,5 mg/ml u PBS) ne više od 2 minuta. Zatim je dodato 3-5 ml FBS da bi se zaustavila aktivnost enzima, a suspenzija je prilagođena na 40 ml ukupne zapremine korišćenjem elektrofuzionog rastvora ćelija (ECFS, 0,3 M Sahroza, Sigma, kat. #S7903, 0,1 mM magnezijum acetat, Sigma, kat. #M2545, 0,1mM kalcijum acetat, Sigma, kat #C4705). Supernatant je uklonjen nakon centrifugiranja i ćelije su resuspendovane u 40 ml ECFS. Ovaj korak pranja je ponovljen i ćelije su ponovo resuspendovane u ECFS-u do koncentracije 2x10<6>ćelija/ml.

[0306] Elektro-ćelijska fuzija izvršena je korišćenjem generatora fuzije (model ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA). Veličina fuzionisane komore je bila 2,0 ml, koristeći sledeća podešavanja instrumenta:

• Uslov poravnanja: napon: 50 V, vreme: 50 sek.

• Membranski prelom na: napon: 3000 V, vreme: 30 msec

• Vreme održavanja posle fuzije: 3 sek

[0307] Nakon ECF-a, suspenzije ćelija pažljivo su uklonjene iz fuzione komore u sterilnim uslovima i prenete u sterilnu cevčicu koja sadrži isti volumen Hybridoma Culture Medium (DMEM, JRH Biosciences), 15% FBS (Hyclone), dopunjen sa L-glutaminom, pen/strep, OPI (oksaloacetat, piruvat, goveđi insulin) (svi iz Sigme) i IL-6 (Boehringer Mannheim). ûelije su inkubirane 15-30 minuta na 37°C i zatim centrifugirane na 400 x g (1000 obrtaja u minuti) tokom pet minuta. ûelije su lagano resuspendovane u maloj zapremini Hibridoma selekcionog medijuma (Hybridoma Culture Medium dopunjen sa 0,5x HA (Sigma, kat #A9666)), a zapremina je prilagođena odgovarajućoj količini sa dodatkom Hibridoma selekcionog medijuma, na osnovu finalnog postavljanja u ploče od 5x10<6>B ćelija ukupno po ploči sa 96 bunarskih ploča i 200 ml po bunaru. ûelije su lagano mešane i pipetirane su u ploče sa 96 bunara gde su ostavljene da rastu. Na dan 7. ili 10., polovina medijuma je uklonjena, a ćelije su ponovo hranjene sa Hibridoma selekcionim medijumom.

[0308] Hibridomi su gajeni rutinski u selektivnom medijumu. Iscrpni supernatanti sakupljeni iz hibridoma su testirani u različitim testovima kao što je opisano u Primerima 4-5. Samo da napomenemo, antitela koja počinju sa cifrom 3, npr. 3.15G8, su IgG4 i antitela koja počinju sa cifrom 2, npr., 2.9D10, su IgG2.

PRIMER 4: VEZIVANJE ZA ûELIJSKU VEZU HUMANIH I B7-H1 MAKAKI RAKOJEDA MAJMUNA

[0309] Supernatanti koji su sakupljeni iz ćelija hibridoma testirani su da bi se procenila sposobnost sekreciranih antitela da se vezuju za 293T ćelije tranzitivno eksprimirajućo bilo humani ili makaki rakojed majmunski B7-H1 pune dužine. Kao negativna kontrola korišćena je mok-transfektovana 293T ćelijska linija. ûelije razblažene u PBS sa 2% FBS su zasejane u gustini od 2500-3000 ekspresivnih i 15000-17500 mok transfektovanih ćelija u 40 ml/bunaru u 384 bunara na ploči (Coming Costar, katalog #3712). Odmah posle postavljanja u ploče dodato je 10 ml/bunaru supernatanta hibridoma i ploče su inkubirane 1,5 h na sobnoj temperaturi. Zatim su dodati 10 ml /bunaru Cy5-konjugovani koziji anti-humani IgG Fc (700 ng/ml, Jackson Immunoresearch, katalog #109-175-098) i ploče su inkubirane 3 sata na sobnoj temperaturi pre nego što su se čitali signali fluorescencije na instrumentu FMAT 8200 (Applied Biosystems). Rezultati za 6 supernatanta hibridoma prikazani su u Tabeli 3.

Tabela 3. Vezivanje supernatanta hibridoma na ćelijski vezani humani ili B7-H1 iz makaki rakojed majmuna

PRIMER 5: INHIBICIJA SA B7-H1/PD-1 RECEPTOR-LIGAND VEZIVANJA

[0310] Da bi se utvrdila relativna jačina supernatanta koji sadrže antitela, procenjena je njihova sposobnost da inhibišu vezivanje humanog PD-1/Fc proteina na humani B7-H1, eksprimiran na površini CHO ćelija.25000 ćelija/bunaru je položeno u 50 ml medijuma u bunare ploča za kulture tkiva sa 384 bunara (Coming Costar, katalog #3712). Sledećeg dana dodato je 50 ml/bunaru razblaženog (1:5) supernatanta hibridoma i ploče su inkubirane na 4°C tokom 1 sata na šejkeru. Biotinilovani humani PD-1/Fc protein (R&D Systems, katalog #1086-PD) dodat je u konačnu koncentraciju od 1,25 ug/ml, a ploče su inkubirane na 4°C tokom 1 sata na šejkeru. ûelije su isprane i fiksirane u 100 ul PBS koji sadrži 3,7% formaldehida i 3% goveđeg serumskog albumina, tokom 20 min na sobnoj temperaturi. ûelije su isprane i inkubirane u 100 ul PBS sa 0,6% H2O2i 3% goveđeg serumskog albumina tokom 10 min na sobnoj temperaturi. ûelije su isprane i inkubirane u 50 ul streptavidina konjugovanog peroksidazom rena koji je razblažen u odnosu 1:4000 tokom 30 min na 4°C. ûelije su isprane pre detekcije signala. Podaci su prikazani kao procenat od (ODmaks-ODmin), gde je ODmaks prosečna vrednost dobijena sa ćelijama inkubiranim sa irelevantnim supernatantima hibridoma u prisustvu biotin-konjugovanog humanog PD-1/Fc proteina i ODmin je prosečna vrednost dobijena sa ćelijama koje su inkubirane sa irelevantnim supernatantima hibridoma u odsustvu biotin-konjugovanog humanog PD-1/Fc proteina. 0% maksimalnog odgovora ukazuje na 100% inhibicije vezivanja B7-H1/PD-1 pomoću supernatanta hibridoma (Tabela 4).

Tabela 4. Inhibicija vezivanja humanog PD1 na humane ćelije koje eksprimiraju B7-H1 supernatantima hibridoma

PRIMER 6: VEZIVANJE PREýIŠûENOG ANTI-B7-H1 ANTITELA ZA HUMANI B7-H1, HUMANI B7-DC, MIŠJI B7-H1

[0311] Sposobnost pročišćenih antitela da se vezuju za humani B7-H1, B7-DC, mišji B7-H1 i B7-H1 iz makaki rakojed majmuna je određen pomoću FACS analize. Ukratko, 293T ćelije su ili moktransfektovane ili tranzijentno transfektovane sa bilo humanim B7-H1 ili humanim B7-DC koristeći Lipofectamine 2000 (Invitrogen, katalog #11668). Mišje J558 ćelije koje eksprimiraju mišji B7-H1 dobijene su od ATCC (katalog #TIB-6). ûelije su resuspendovane u PBS sa 2% FBS (FACS pufer) i zasejane na 50000 ćelija/bunaru u ploče sa V-dnom. Anti-B7-H1 i antitela za kontrolu izotipa koja su razblažena u FACS puferu su dodata u konačnoj koncentraciji od 5 mg/ml, a ploče su inkubirane tokom 1 h na 4°C. Nakon pranja sa FACS puferom, koziji anti-humani Fc Cy5 (5 mg/ml, Jackson Immunoresearch, katalog #109-175-098) i 7-AAD (5 mg/ml) su dodati i ploče su inkubirane 15 min na 4°C pre nego što su ponovo oprani sa FACS puferom i očitani na instrumentu FACSCalibur. Tabela 5 pokazuje sposobnost prečišćenih antitela (5 mg/ml) da se vežu na 293T ćelije transfektovane sa humanim B7-H1. Nijedno od izabranih antitela se ne vezuje za 293T ćelije transfektovane sa humanim B7-DC ili za J558 ćelije koje eksprimiraju mišji B7-H1. Kao pozitivna kontrola za ekspresiju B7-DC korišćeno je mišje anti-humano B7-DC (PD-L2) antitelo (R&D systems kat #MAB1224, detektovano sa kozijim anti-mišjim Fc Cy5, Jackson Immunoresearch). PE-konjugovano anti-mišje B7-H1 antitelo pacova (eBioscience, klon M1H5, detektovan sa kozijim anti-pac Fc Cy5, Jackson Immunoresearch) korišćeno je kao pozitivna kontrola za ekspresiju mišjeg B7-H1.

Tabela 5. Vezivanje prečišćenog anti-B7-H1 antitela za ćelijski vezan humani B7-H1, mišji B7-H1 ili humani B7-DC

PRIMER 7: VEZIVANJE PREýIŠûENOG HUMANOG ANTI-B7-H1 ANTITELA ZA STIMULISANE HUMANE I T ûELIJE MAJMUNA MAKAKI RAKOJEDA

[0312] 96 visoko vezivnih ploča ploče inkubirano je sa 100 ul/bunaru anti-CD3 antitela razblaženih na 1 ug/ml u PBS (OKT3 klon, eBioscience, katalog #160037) na 4<o>C preko noći. Humane T ćelije su izolovane iz zamrznutog leukopaka koristeći set za obogaćenje T ćelija (StemCell Technologies, katalog #19051). Anti-CD3 mAb obložene ploče su isprane sa PBS, a prečišćene T ćelije su dodate u 200 ul ICM medijuma na 360000 ćelija/bunaru i kultivisane tokom 72 sata. T ćelije su zatim sakupljene, isprane u FACS puferu i pomešane sa razblaženim prečišćenim anti-B7-H1 antitelima ili irelevantnim humanim IgG2 ili IgG4 antitelima u finalnoj koncentraciji od 1g/ml u pločici za testiranje sa 96 bunarčLća sa dnom V oblika (50 ul/bunar). Posle 2 časa inkubacije na 4<o>C, T ćelije su isprane dva puta u FACS puferu, a zatim obojene sa Cy5-konjugovanim kozijim anti-humanim IgG Fc antitelom (5 ug/ml, Jackson Immunoresearch, katalog #109-175-098) i sa 7-AAD (10 ug/ml). ûelije su inkubirane 30 minuta na 4°C, pre nego što se ponovo operu sa FACS puferom i očitaju se na instrumentu FACSCalibur. Populacija živih limfocita izabrana je za analizu na osnovu napred i bočnog rasejanja, kao i negativnog bojenja za 7-AAD.

[0313] Za aktivaciju T-ćelija majmuna makaki rakojeda, ploča sa 96 visokih vezivnih bunara inkubirana je sa 100 ul/bunaru kozjeg anti-mišjeg IgG Fc antitela koje je razblaženo do 1 ug/ml u PBS na 4<o>C preko noći. Ploče su isprane sa PBS i inkubirane sa anti-CD3 antitelom razblaženim do 1 ug/ml u ICM medijumu (klon SP-34, BD katalog #556610) na 37<o>C tokom 2 sata. PBMC majmuna makaki rakojeda su izolovani iz periferne krvi (Bioreclamation, katalog #CINVBCPT). Anti-CD3 mAb obložene ploče su isprane sa PBS i izolovani PBMC su dodati u 200 ul ICM medijuma na ~200000 ćelija/bunaru i kultivisani tokom 72 sata. ûelije su zatim sakupljene, isprane u FACS puferu i pomešane sa razblaženim prečišćenim anti-B7-H1 antitelima ili irelevantnim humanim IgG2 ili IgG4 antitelima u konačnoj koncentraciji od 1g/ml pločici za testiranje sa 96 bunarčLća sa dnom V oblika (50 ul/bunaru). Posle 2 sata inkubacije na 4<o>C, ćelije su isprane dva puta u FACS puferu, a zatim obojene sa Cy5-konjugovanim kozijim anti-humanim IgG Fc antitelom (5 ug/ml, Jackson Immunoresearch, katalog #109-175-098), FITC-konjugovanim anti-CD3 antitelom (razređeno 1:25, Biospecialty) i sa 7-AAD (10 ug/ml). ûelije su inkubirane 1 sat na 4°C pre nego što su ponovo oprane sa FACS puferom i čitaju se na instrumentu FACSCalibur. Populacija T limfocita majmuna izabrana je za analizu na osnovu napred i bočnog rasejanja, kao i pozitivnim bojenjem za CD3 marker i negativnim bojenjem za 7-AAD. Tabela 6 pokazuje sposobnost prečišćenih anti-B7-H1 antitela (1 mg/ml) da se vezuju za aktivirane humane T ćelije, kao i za aktivirane T ćelije majmuna makaki rakojeda.

Tabela 6. Vezivanje prečišćenih anti-B7-H1 antitela za stimulisane humane ili T-ćelije majmuna makaki rakojeda

PRIMER 8: INHIBICIJA SA B7-H1/PD-1 RECEPTOR-LIGAND VEZIVANJEM

[0314] Procenjena je sposobnost prečišćenih humanih anti-B7-H1 antitela da inhibiraju vezivanje humanog PD-1/Fc proteina na humani B7-H1, eksprimiran na površini ES-2 ćelija (ATCC, katalog #CRL-1978). Ukratko, 50000 ćelija/bunaru položeno je u 50 ml PBS u ploče za kulture tkiva sa 384 bunara (Coming Costar, katalog #3712). Zatim je dodato 50 ml/bunaru razblaženog monoklonalnog antitela u konačnoj koncentraciji od 2,5, 0,5, 0,1, 0,02, 0,004, 0,008, 0,00016 nM, a ploče su inkubirane na 4<o>C tokom 1 sata. ûelije su isprane dva puta i dodato je 100 ml/bunaru biotinilovanog humanog PD-1/Fc proteina (10 mg/ml, R&D Systems, katalog #1086-PD), a ploče su inkubirane na 4<o>C tokom 1 sata. ûelije su jednom isprane i dodato je 100 ml/bunaru Cy5-konjugovanog streptavidina, a ploče su inkubirane na 4<o>C 15 minuta pre nego se operu sa PBS koji sadrži 2% FCS i čita se na instrumentu FACSCalibur. Neki bunari su inkubirani sa irelevantnim humanim IgG2 i IgG4 monoklonskim antitelima sa ili bez biotinom-konjugovanim humanim PD-1/Fc, kako bi se postavio minimalni (0%) i maksimalni (100%) nivo inhibicije vezivanja B7-H1/PD-1. Procenat inhibicije u odnosu na koncentraciju antitela analiziran je korišćenjem alata za fitovanje krive (GraphPad Prism softver) za izračunavanje IC50 vrednosti za svako antitelo, koje su prikazane u tabeli 7.

Tabeli 7. Inhibicija vezivanja humanog PD1 za humani B7-H1 koji eksprimira ES-2 ćelije sa prečišćenim anti-B7-H1 antitelima

PRIMER 9: ODREĈIVANJE EFEKATA ANTI-B7-H1 ANTITELA NA PROLIFERACIJU CD4 T ûELIJA

[0315] Dokazano je da protein B7-H1 ko-prezentovan sa anti-CD3 antitelom na nosaču inhibira aktivaciju CD3-posredovanih T ćelija (Freeman i sar., J. Exp. Med., 2000, 192 (7): 1027-1034; Bennet i saradnici, The Journal of Immunology, 2003, 170: 711-718). Sposobnost prečišćenih humanih monoklonskih anti-B7-H1 antitela da ometaju sa B7-H1-posredovanu supresiju aktivacije T-ćelija je određena na sledeći način.

[0316] Ukratko, 5x10(8) perlica/ml od ispranog Dynabeads M-450 aktiviranog sa tozilom (Invitrogen, kat #140.13) su obložene sa 50 ug/ml mišijih anti-humanih CD3 antitela (BD Bioscience, kat #555329) u 0,1 M natrijum-fosfatnom puferu (pH 7,4-8,0) na 37°C tokom 24 sata uz šejkiranje. 4x10(8) sa CD3 obloženih perlica/ml je dalje spojeno sa rekombinantnim humanim IgG1Fc (R&D Systems, kat #110-HG-100) na 160 ug/ml ili sa rekombinantnim humanim proteinom B7-H1/Fc (R&D Systems, kat #156-B7-100) na 80 ug/ml u kombinaciji sa humanim IgG1Fc proteinom na 80 ug/ml (ukupna koncentracija 160 ug/ml) i inkubirano na 37°C tokom 24 sata uz šejkiranje. Perlice su zatim inkubirane u PBS sa 0,05% goveđeg serumskog albumina na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, isprane četiri puta u 0,1% BSA i 2 mM EDTA u PBS (pH 7,4) i konačno resuspendovane u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FBS na 5x10(7) perli/ml.

[0317] Monociti periferne krvi su izolovani iz leukafereze pakovanja korišćenjem Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03) centrifugiranja gradijenta gustine, resuspendovani u RPMI 1640 bez seruma (Gibco 22400-089), a CD4+ T-ćelije su izolovane iz PBMC korišćenjem Dynal CD4 negativni izolacijski set (Invitrogen, kat #113-37D) prema uputstvima proizvođDča.10 ul obloženih perlica pomešano je sa 10 ul razblaženog anti-B7-H1 ili kontrolnog IgG2/4 antitela u tubi za uzorke i inkubirano na sobnoj temperaturi 3-4 sata na šejkeru. Prečišćene CD4+ T ćelije su stavljene u 10(5) ćelija/80 ul/bunaru na pločici sa 96 bunarčLća (Coming, cat#3603) i mešavina perlice-antitela je dodata na 20 ul/bunar do ukupne zapremine od 100 ul/bunaru. Aktivacija T ćelija u odsustvu B7-H1 inhibitornog efekta određena je korišćenjem perli obloženih sa anti-CD3 antitelom i humanim IgG1Fc proteinom. ûelije su kultivisane tokom 5 dana, a supernatanti se sakupljaju i analiziraju za IFN-Ȗ oslobađanje pomoću BD Human IFN-Ȗ ELISA Kit II (BD kat. br. 550612) po instrukcijama proizvođDča. Proliferacija ćelija je merena na 5 dana dodavanjem 10 ml/bunaru AlamarBlue (Invitrogen DAL 1025). ûelije su inkubirane tokom 5 sati, a fluorescencija je kvantifikovana na SpectraMax Gemini EM spektrofotometru sa talasnom dužinom ekscitacije od 545nm i emisijom talasne dužine od 600nm. Podaci su predstavljeni kao procenat od ODmaks, gde je ODmaks prosečna vrednost dobijena sa T-ćelijama aktiviranim sa anti-CD3/IgG1Fc perlama. Videti sliku 1.

PRIMER 10: ODREĈIVANJE EFEKATA ANTI-B7-H1 ANTITELA NA AKTIVACIJU CD4 T ûELIJA U ANALIZI DENDRITIýNIH ûELIJA-T-ûELIJA MEŠANIH LIMFOCITIA

[0318] Povećanje aktivacije T ćelija antitelima usmerenih na B7-H1 određeno je u dendritičkom ćelija-T-ćelija mešovitom limfocitu (DCMLR). Dendritičke ćelije su generisane od monocitskih prekursora kao što je prethodno opisano (Curr Protoc Immunol., 2001. maj, Poglavlje 7: Jedinica 7.32). Monociti periferne krvi su izolovani iz leukafereze pakovanja korišćenjem centrifugiranja gradijentom gustine Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03), resuspendovani u RPMI 1640 bez seruma (Gibco 22400-089) i ostavljeni da se adhezuju na T150 boce ćelijske kulture (Coming 430825). Posle 1 sata na 37°C, neadhezovane ćelije su uklonjene, a ćelije su kultivisane u RPMI, obogaćenoj sa 5% humanog seruma (Invitrogen 34005100). Citokini su dodati u konačnoj koncentraciji od 2 ng/ml GM-CSF (BD Biosciences 550068) i 10 ng/ml IL-4 (BD Biosciences 554605). Svež medijum sa citokinima dodavan je svaka 2-3 dana. Na 6. dan kultivacije, ćelije su maturizovane sa 20 ng/ml TNF-Į (BD Biosciences 554618) i ostavljene da se inkubiraju 24 sata. Zrele dendritičke ćelije su sakupljene, fenotipizovane i zamrznute za kasniju upotrebu.

[0319] CD4+ T-ćelije su izolovane iz PBMC koristeći set za magnetnu izolaciju (Dynal 113.17) po uputstvima proizvođDča i kultivisane u primarnom MLR kao što je prethodno opisano (J Immunol., 2003, 1. april, 170(7): 3637-44). 1.5E5 alogene CD4+ reagujuće T-ćelije su kultivisane u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčLća sa ravnim donjim delom (Costar 3595) sa dendritičkim ćelijama u odnosu ćeliji T-ćelija:dendritičke ćelije od 1:2,5. Preparati dendritičkih ćelija tretirani su sa 100 mg/ml mitomicina C (Sigma M4287) pre dodavanja kokulture kako bi se sprečila bilo koja proliferacija od kontaminirajućih limfocita. Antitela su dodata u različitim koncentracijama u finalnom volumenu od 200 ml RPMI 10% humanog seruma. Inkorporacija timidina merena je na 5 dana sa 16-časovnim impulsom sa [<3>H] timidinom (1 mci/bunaru, Perkin-Elmer NET027001MC). Supernatanti su sakupljeni pre radioaktivnog obeležavanja i analizirani za IFN-Ȗ oslobađanje pomoću Lumineks testa (BioRad 171-B11921) po uputstvima proizvođDča. Povećanje proliferacije T ćelija pomoću anti-B7-H1 antitela iz ponovljenih eksperimenata je prikazano na slici 2. Odgovarajuće IFN-Ȗ oslobađanje je prikazano na slici 3.

PRIMER 11: STRUKTURALNA ANALIZA B7-H1 ANTITELA

[0320] Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela su sekvencirani da bi se odredile njihove DNK sekvence. Kompletna informacija o sekvencama za anti-B7-H1 antitela je obezbeđena u listi sekvenci sa sekvencama nukleotida i aminokiselina za svaku kombinaciju gama i kapa ili lambda lanca. Analizirane su varijabilne teške sekvence kako bi se odredila VH familija i sekvenca J-regiona. Sekvence su zatim prevedene da bi se odredila primarna aminokiselinska sekvenca i upoređena sa sekvencama VH i J-regiona germinalne ćelijske linije za procenu somatskih hipermutacija.

[0321] Tabele 8 i 9 su tablice poređenja regiona antitela teškog lanaca sa njihovim srodnim regionom germinalne ćelijske linije teškog lanca i regiona antitela lakog lanca sa njihovim srodnim regionom germinalne ćelijske linije lakog lanca. Numerisanje aminokiselina je vršeno numeričkim obeležavanjem.

[0322] Geni imunoglobulina podležu različitim modifikacijama tokom maturacije imunološkog odgovora, uključujući rekombinaciju između genskih segmenata V, D i J, izmene izotipova i hipermutaciju u varijabilnim regionima. Rekombinacija i somatska hipermutacija su osnova za generisanje raznovrsnosti antitela i sazrevanja afiniteta, ali takođe mogu generisati prepreke sekvenci koje mogu učiniti komercijalnu proizvodnju takvih imunoglobulina kao terapeutskih agensa teškom ili povećati rizik od imunogenosti antitela. Generalno, mutacije u CDR regionima verovatno će doprineti poboljšanom afinitetu i funkciji, dok mutacije u okviru mogu povećati rizik od imunogenosti. Ovaj rizik se može smanjiti reverzijom okvirnih mutacija na germinalnu liniju, uz istovremeno osiguranje da nema negativnog uticaja na aktivnost antitela. Neke strukturne prepreke mogu biti generisane procesima diversifikacije, ili mogu postojati u sekvencama germinalne ćelijske linije koje doprinose varijabilnim domenima teškog i lakog lanca. Bez obzira na izvor, može biti poželjno ukloniti potencijalne strukturne prepreke koje mogu dovesti do nestabilnosti, agregacije, heterogenosti proizvoda ili povećane imunogenosti. Primeri nepoželjnih prepreka obuhvataju neuparene cisteine (što može dovesti do stvaranja disulfidnih veza ili formiranja promenljivih sulfhidrilnih adukta), N-povezanih mesta glikozilacije (što rezultira heterogenom strukturom i aktivnosti), kao i deamidacije (npr. NG, NS), izomerizacije (DG), oksidacija (izloženi metionin) i (DP) mesta hidrolize.

[0323] Da bi se smanjio rizik od imunogenosti i poboljšala farmaceutska svojstva vodećih antitela, može biti poželjno da se smanji broj mutacija iz germinalne ćelijske linije i/ili uklone strukturne prepreke.

[0324] Na taj način, u jednom primeru, kada se određeno antitelo razlikuje od svoje odgovarajuće sekvence germinalne ćelijske linije na nivou aminokiseline, sekvenca antitela može se mutirati unatrag na sekvencu za germinalnu liniju. Takve korektivne mutacije mogu se pojaviti na jednoj, dve, tri ili više pozicija ili u kombinaciji bilo koje mutirane pozicije, koristeći standardne molekularne biološke tehnike. Tabele 10-14 dole ilustruju pozicije takvih varijacija unazad na germinalne ćelijske linije za mAb 2.9D10, 2.7A4 i 2.14H9. Svaki red predstavlja jedinstvenu kombinaciju ostataka germinalne ćelijske linije i ne-germinalne ćelijske linije na poziciji označenoj masnim slovima. Položaj aminokiseline je predstavljen numeričkom oznakom.

[0325] U drugom primeru, pronalazak uključuje zamenu bilo kakvih strukturnih prepreka u nizu koji mogu uticati na heterogenost antitela pronalaska. Takve prepreke uključuju mesta glikozilacije, neuparenim cisteine, metinoni izloženi na površini, itd. da bi se smanjio rizik od takve heterogenosti, predloženo je da se izvrše izmene da bi se uklonila jedna ili više takvih strukturnih prepreka.

[0326] U jednom primeru, može biti poželjno ukloniti jednu ili više konsenzusnih N-povezanih glikozilacionih mesta iz germinalne ćelijske linije antitela ili sekvence antitela. Stučno lice u oblasti bi bilo u stanju da identifikuje takvu lokaciju glikozilacije. Tipično, sekvenca N-povezanog glikozilacijski konsenzusnog mesta ima sekvencu Asn-bilo koja AA-Ser ili Thr gde srednja aminokiselina ne može biti prolin (Pro). U drugom slučaju, neupareni cisteini mogu se zameniti samostalno ili u kombinaciji sa drugim strukturnim promenama. Neupareni cistein se može mutirati u odgovarajuću aminokiselinu koja ima uporedive karakteristike bočnog lanca, kao što je serin.

[0327] Kao što je ovde navedeno, sekvenca koja je optimizovana je sekvenca koja je mutirana u jednoj ili više pozicija unazad u njenu sekvencu za germinalnu liniju ili se može modifikovati da bi se uklonila jedna ili više drugih prepreka kao što su strukturne prepreke. Optimizovana sekvenca može takođe uključiti sekvencu koja je mutirana u jednoj ili više pozicija unazad u njenu sekvencu za germinalnu liniju i koja je takođe dalje modifikovana da bi se uklonila jedna ili više strukturnih prepreka.

Tabela 10. Primeri mutacije u 2.7A4 teškog lanca (SEK ID BR: 2) do germinalne ćelijske linije na indikovanom broju ostatka

[0328] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 2. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 2 obuhvata bilo koju od kombinacija ostataka za germinalnu liniju i ne-germinalne ćelijske linije naznačene u svakom redu Tabele 10. U nekim slučajevima, SEK ID BR: 2 sadrži bilo koju jednu, bilo koja dva, bilo koja tri, bilo koja četiri, bilo koja pet, ili svih pet ostataka germinalne ćelijske linije kako je navedeno u Tabeli 10. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 2 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostatka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 10. U jednom specifičnom primeru, sekvenca negerminalne ćelijske linije se mutira unazad na germinalnu liniju na poziciji 80, gde je F promenjen u Y i na poziciji 87 gde je K promenjen u R. Specifičan primer takve sekvence je 2.7A4VHOPT kao što je prikazano u Tabeli 15.

Tabela 11: Primer mutacije lanca u 2.7A4 (SEK ID BR: 7) do germinalne ćelijske linije na indikovanom broju ostatka

[0329] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 7. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 7 obuhvata bilo koju od kombinacija ostataka germinalne ćelijske linije i ne-germinalne ćelijske linije koji su navedeni u svakom redu u Tabeli 11. U nekim primerima, SEK ID BR: 7 obuhvata bilo koju, bilo koja dva, bilo koja tri, bilo koja četiri ili svih pet ostatka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 11. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 7 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostatka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 10. Specifični primeri varijabilnog lakog domena 2.7A4 koji je mutiran u određene sekvence germinalne ćelijske linije uključuju 2.7A4 VLOPT (optimizovan tamo gde je sekvenca ne-germinalne ćelijske linije mutirana od A do T na poziciji 17 i R do K na poziciji 104 ) kao što je prikazano u Tabeli 15.

Tabela 12. Primeri mutacije 2.9D10 teškog lanca (SEK ID BR: 12) do germinalne ćelijske linije na indikovanom broju ostatka

[0330] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 12. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 12 obuhvata bilo koju od kombinacija ostataka germinalne ćelijske linije i negerminalne ćelijske linije koje su naznačene u svakom redu u Tabeli 12. U nekim primerima, SEK ID BR: 12 obuhvata bilo koju, bilo koja dva, ili oba ostatka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 12 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostatka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 12.

Tabela 13. Primeri mutacija 2.9D10 lakog lanca (SEK ID BR: 17) do germinalne ćelijske linije na indikovanom broju ostatka

[0331] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 17. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 17 obuhvata bilo koju od kombinacija ostataka germinalne ćelijske linije i negerminalne ćelijske linije koje su naznačene u svakom redu u Tabeli 13. U nekim primerima, SEK ID BR: 17 obuhvata bilo koju, bilo koja dva, bilo koja tri, bilo koja četiri ili sva četiri ostatka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 7. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 17 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostatka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 13. SEK ID BR: 17 može se izmeniti ili dalje izmeniti tako što se izmene negerminalne ćelijske linije u SEK ID BR: 17. U jednom primeru, SEK ID NO: 17 se može promeniti tako da je promena od F do Y na poziciji 37 i od F do Y na poziciji 50.

Tabela 14. Primeri mutacija 2.14H9 lakog lanca (SEK ID BR: 27) do germinalne ćelijske linije na indikovanom broju ostatka

[0332] U nekim primerima pronalaska, ciljano vezujući agens ili antitelo obuhvata sekvencu koja obuhvata SEK ID BR.: 27. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 27 obuhvata bilo koju od kombinacija ostataka germinalne ćelijske linije i negerminalne ćelijske linije koje su naznačene u svakom redu u Tabeli 14. U nekim primerima, SEK ID BR: 27 obuhvata bilo koju, bilo koja dva, bilo koja tri, ili sva tri ostatka germinalne ćelijske linije kako je naznačeno u Tabeli 14. U određenim slučajevima, SEK ID BR.: 27 obuhvata bilo koju od jedinstvenih kombinacija ostatka germinalnih i ne-germinalnih ćelijskih linija što je naznačeno u svakom redu u Tabeli 14. Specifični primeri za varijabilni laki domen 2.7A4 koji je mutiran u određenu sekvencu germinalne ćelijske linije uključuje 2.14H9OPT (optimizovan tamo gde je sekvenca ne-germinalne ćelijske linije mutirana iz E na K na poziciji 104) kao što je prikazano u Tabeli 15.

[0333] Teški lanac od 2.14H9 može se promeniti u aminokiselini 31 iz SEK ID BR: 22 od R do S.

Primeri za specifične germinalne ćelijske linije

[0334]

Aminokiselinske sekvence VH iVLdomena ne-germinalnih ćelijskih linija (NG) anti-B7-H1 antitela 2.7A4, 2.14H9 i 2.9D10 su poravnate sa poznatim humanim sekvencama germinalnih ćelijskih linija u VBASE bazi podataka (Tomlinson, 1997; http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), a najbliža linija je identifikovana sličnošću sekvenci. Rezultati najveće sličnosti u slaganju germinalnih linija za anti-B7-H1 antitela opisani su u tabelama 16 i 17. Bez razmatranja Vernier ostataka (Foote & Winter, J Mol Biol Mar 20: 224(2): 487-99, 1992), koji su ostali nepromenjeni, pozicije koje treba menjati opisane su u Tabeli 18.

Tabela 16: Najbliže slaganje anti-B7-H1 teškog lanca germinalnih ćelijskih linija V i J

Tabela 17: Najbliže slaganje anti-B7-H1 lakog lanca germinalnih ćelijskih linija V i J

[0335] Uzimajući u obzir antitelo 2.7A4, postoje 2 promene u okviru VHdomena i 2 promene u okviru VLdomena. Ovi ostaci, locirani na Kabatu broj 79 i 83 (ili ostaci 80 i 87, ako se koristi numeričko obeležavanje) za VHdomen i na Kabatu broj 18 i 103 (ili ostaci 17 i 104, ako se koristi numeričko obeležavanje) za VLdomen, su reverzirani u humanu germinalnu ćelijsku liniju. Videti Tabelu 18. Za antitelo 2.14H9 ne postoje promene u okviru VHdomena i postoji 1 promena u okviru VLdomena. Ovaj ostatak, koji se nalazi na Kabatu broj 103 u VLdomenu (ili 104 ako je ostatak izračunat pomoću numeričkog obeležavanja), je reverziran u humanu germinalnu ćelijsku liniju. Videti tabelu 18. U antitelu 2.9D10 ne postoje promene u okviru VHdomena i postoje 2 promene u VLdomenu, lociranom na Kabatu na broju 36 i 49 kabata (ili ostacima 37 i 50 numeričkim obeležavanjem). Međutim, ta dva ostatka nalaze se na poziciji Vernier i nisu mutirani tako da ne menjaju CDR strukturu petlje.

Tabela 18: Primer ostataka mutiranih tokom germliniranja za anti-B7-H1 V domena. Ostaci se numerišu prema nomenklaturi Kabata

[0336] Germliniranje ovih aminokiselinskih ostataka vršeno je primenom standardnih tehnika usmerenih mutageneza sa odgovarajućim mutagenim prajmerima. Germlinirane sekvence imaju prefiks "OPT" nakon naziva antitela, na primer, 2.7A4VHOPT, 2.7VLOPT i 2.14H9VLOPT. Germlinirani IgG se zatim ponovo procenjuju u humanom testu inhibicije liganda B7-H1/hPD1 da bi se potvrdilo da nije bilo smanjenja antitela u in vitro aktivnostima.

[0337] Primer aktivnosti za germlinirane naspram ne-germliniranih anti-B7-H1 antitela su prikazani na slici 4.

Primer sinteze gena i reformatiranja kao IgG1 i IgG1-TM

[0338] Klonovi su konvertovani iz scFv u IgG format pomoću subkloniranja VHi VLdomena u vektore koji eksprimiraju teške i lake lance kompletnih antitela. VHdomeni su klonirani u vektor pEU15.1 da eksprimiraju IgG1 ili vektor pEU15.1-TM da eksprimiraju IgG1-TM antitela. Oba vektora sadrže konstantne domene humanog teškog lanca i regulatorne elemente za ekspresiju čitavog IgG teškog lanca u ćelijama sisara. Vektor pEU15.1-TM je modifikovan pEU15.1 humani IgG1 vektor. Konstruisan je da uvede tri mutacije; L234F i L235E u šarku i P331S u CH2 domen IgG molekula kako bi se eliminisala njegova sposobnost pokretanja complement-zavisne citotoksičnosti i ćelijski posredovane od antitela zavisne citotoksičnosti (Oganesyan V. i saradnici (2008), Acta Cryst., D64: 700-704). Vektorski inženjering je izveden primenom standardnih metoda usmerenih mutageneza sa odgovarajućim mutagenim prajmerima.

[0339] VLdomeni su klonirani u pEU4.4 i pEU3.4 vektore za ekspresiju konstantnih domena humanog lambda i kapa lakog lanca, respektivno, sa regulatornim elementima za ekspresiju kompletnog IgG lakog lanca u ćelijama sisara. Vektori za ekspresiju teških lanaca i lakih lanaca su prvobitno opisani u Vaughan i sar. (Nature Biotechnology 14(3): 309-314, 1996). Ovi vektori su konstruisani jednostavno uvođenjem OriP elementa.

[0340] Da bi se dobili IgG, vektori ekspresije IgG teškog i lakog lanca su transfektovani u EBNA-HEK293 ćelije sisara (Invitrogen R620-07). IgG su eksprimirane i izlučene u medijum. Sakupljanje je bilo udruženo i kombinovano pre prečišćavanja. IgG je prečišćen korišćenjem proteinske A hromatografije koristeći sistem za prečišćavanje AKTA Express (GE Healthcare) koji je ranije bio sanitiziran da bi se izbegla kontaminacija uzorka endotoksinima. Supernatanti kulture se ubacuju na 1mL HiTrap™ MabSelectSure™ kolone (GE Healthcare, 11-0034-93) i ispiraju sa 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM NaCl. Vezani IgG eluira se iz kolone koristeći 0,1 M natrijum citrata (pH 3,0) i neutrališe se dodavanjem 1M Tris-HCl (pH 9,0). Elutirani materijal je puferski izmenjen u PBS pomoću Nap10 kolona (Amersham, 17-0854-02) i filtriran pre utvrđivanja nivoa koncentracije proteina i nivoa endotoksina. Koncentracija IgG je određena spektrofotometrijskim korišćenjem koeficijenta ekstinkcije koji je zasnovan na aminokiselinskoj sekvenci IgG (Vaughan i sar. supra). Nivo endotoksina određen je korišćenjem Endosafe PTS prenosnog test sistema (Charles River Laboratories) koji je fitovan sa 1-0,1 EU/mL i 10-0,1 EU/mL LAL kertridžima (Charles River Laboratories, PT520). Prečišćeni IgG su analizirani za degradaciju pomoću SDS-PAGE.

[0341] Anti-B7-H antitela u IgG1-TM formatu su evaluirana i upoređena sa istim antitelima, ali u IgG1 formatu u humanom testu inhibicije liganda B7-H1/hPD1 da bi se potvrdilo da nije bilo smanjenja antitela u in vitro aktivnosti zbog do izmene izotipa IgG (slika 4).

PRIMER 12: ANALIZA VEZIVANJA HUMANOG B7H1/FC ZA HUMANI PD1/FC - HTRF<®>

[0342] Opisani test je TR-FRET test homogenosti korišćenjem HTRF® test tehnologije, bez potrebe za korakom pranja. Dodaje se u Kostar 3676 mikrotitrsku ploču, 5 ul/bunaru biotinilovanog PD1/Fc na 1 nM razblažen u PBS. Ovo je praćeno dodavanjem 5 µl/bunaru streptavidina XLent (CisBio) na 4nM razblažen u puferu za testiranje (PBS 0,1% BSA 0,8M KF). 5 µl/bunaru titracionog materijala uzorka koji je razblažen u PBS dodato je u relevantne bunare. Za definisanje ukupnog vezivanja, po bunaru je dodato 5 µl PBS ili relevantnog pufera za uzorak. Za definisanje nespecifičnog vezivanja korišćen je dodatnih (600nM) neoznačenih B7H1/Fc ili PD1/Fc. Konačni postupak je dodavanje 5 µl/bunaru kriptatom označenog B7H1/Fc (označavanje kriptatom - CisBio, B7H1/Fc - RnD Systems i) koji su razblaženi u odnosu 1:100 u puferu za analizu. Test ploča je ostavljena 3 sata na sobnoj temperaturi pre nego što je pročitana na čitaču HTRF® kompatibilnog čitača ploča.

[0343] Primer utvrđivanja IC50 u testu inhibicije humani PD1/humani B7-H1 liganda za anti-B7-H1 antitela dat je u Tabeli 19. Sva ant-humana B7-H1 antitela nalaze se u formatu IgG1-TM.

Tabela 19. Primer utvrđivanja IC50 (n=2) u testu inhibicije humani PD1/humani B7-H1 liganda za anti-B7-H1 IgG

PRIMER 13: ANALIZA VEZIVANJA HUMANOG B7H1/FC ZA HUMANI B7-1/FC - HTRF<®>

[0344] Opisani test je TR-FRET test homogenosti korišćenjem HTRF® test tehnologije, bez potrebe za korakom pranja. Dodaje se u Kostar 3676 mikrotitrsku ploču, 5 ul/bunaru biotinilovanog B7-1/Fc na 8nM razblažen u PBS. Ovo je praćeno dodavanjem 5 ul/bunaru streptavidina XLent (CisBio) na 20nM razblažen u puferu za testiranje (PBS 0,1% BSA 0,8M KF). 5 ul/bunaru titracionog materijala uzorka koji je razblažen u PBS dodato je u relevantne bunare. Za definisanje ukupnog vezivanja, po bunaru je dodato 5 ul PBS ili relevantnog pufera za uzorak. Za definisanje nespecifičnog vezivanja korišćeno je dodatnih (200nM) neoznačenih B7H1/Fc ili B7-1/Fc. Konačni postupak je dodavanje 5 ul/bunaru kriptatom označenog B7H1/Fc (označavanje kriptatom - CisBio, B7H1/Fc - RnD Systems i) koji su razblaženi u odnosu 1:100 u puferu za analizu. Test ploča je ostavljena preko noći na 4°C nakon čega je ostavljena do sobne temperature pre i pročitana na čitaču HTRF® kompatibilnog čitača ploča.

[0345] Primer utvrđivanja IC50 u testu inhibicije humani B7-1/humani B7-H1 liganda za anti-B7-H1 antitela dat je u Tabeli 20. Sva anti-humana B7-H1 antitela nalaze se u formatu IgG1-TM.

Tabela 20: Primer utvrđivanja IC50 (n=2) u testu inhibicije humani B7-1/humani B7-H1 liganda za anti-B7-H1 IgG

PRIMER 14: UNAKRSNA REAKTIVNOST ANTI-B7-H1 ANTITELA SA DRUGIM IMUNSKIM KOMODULACIJSKIM PROTEINIMA

[0346] ELISA testovi su izvedeni da bi se odredila unakrsna reaktivnost anti-B7-H1 IgG1-TM antitela za druge imunsko ko-modulacijske molekule. ELISA se sastojala od oblaganja MaxiSorp ploča (NUNC) na 4°C preko noći sa 250 ng po bunarčLću ćelija ekstracelularnog domena (ECD) humanog B7-H1 (R&D Systems, 156-B7), humanog PD-L2 (R&D Systems, 1224- PL), humanog B7-H2 (R&D Systems, 165-B7), humanog B7-H3 (R&D Systems, 1027-B3), humanog CD28 (R&D Systems, 342-CD), humanog CTLA-4 (R&D Systems 325-CT) i humanog PD1 (R&D Systems, 1086-PD), što je praćeno blokiranjem ploča sa PBS koji sadrži 3% praha mleka u prahu na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa. Istraživana je takođe mišja unakrsna reaktivnosti oblaganjem ECD mišjeg B7-H1 (R&D Systems, 1019-B7). Biotinilovani anti-B7-H1 IgG1-TM razblaženi u 100 nM u PBS sa 3% praha mleka u prahu, inkubirani su na sobnoj temperaturi tokom 2h da bi se omogućilo vezivanje. Vezani biotinilovani IgG su detektovani sa streptavidinom označenim sa europijumom N1 (Perkin Elmer, 1244-360) u koncentraciji 0,2 g/mL. Kontrolni eksperiment koji pokazuje antigen oblogu na NUNC ploči izvršen je korišćenjem komercijalnih antitela mišjeg IgG2a anti-humanog B7-H1 (R&D Systems, MAB156), mišjeg IgG2b anti-humanog PD-L2 (R&D Systems, MAB1224), mišjeg IgG2b anti-humanog B7-H2 (R&D Systems, MAB165), mišjeg IgG1 anti-humanog B7-H3 (R&D Systems, MAB1027), mišjeg IgG1 anti-humanog CD28 (R&D Systems, MAB342), mišjeg IgG2a anti-humanog CTLA-4 (Abcam, ab33320) mišjeg IgG2b anti-humanog PD1 (R&D Systems, MAB1086) i pacovskog IgG2a anti-mišjeg B7-H1 (R&D Systems, MAB1019). Primarna antitela su inkubirana na 5 ug/mL u PBS sa 3% praškastog mleka u prahu u toku 2 h na sobnoj temperaturi. Detekcija je izvedena inkubiranjem sekundarnih konjugata anti-mišje IgG peroksidaze (Sigma, A2554) ili anti-pacovskih IgG peroksidaza konjugata (Sigma, A5795) razblaženih u odnosu 1:5000 u PBS koji sadrži 3% praškastog mleka u prahu u toku 1 sata na sobnoj temperaturi uz naknadni dodatak TMB (Sigma, T0440). Svih osam antigena moglo se detektovati na ploči Maxisorp NUNC. Nespecifično vezivanje je određeno korišćenjem bunara prevučenih kontrolom izotipa IgG1 pri 5 ug/mL. Unakrsne reaktivnosti su izračunate u procentu od specifičnog vezivanja za antigen u odnosu na humani B7-H1.

[0347] Unakrsna reaktivnost 3 anti-B7-H1 IgG1-TM antitela 2.7A4OPT, 2.9D10 i 2.14H9OPT na panelu od osam imunoloških ko-modulatornih antigena utvrđena su u tri ponavljanja. Kod koncentracije antitela od 100 nM, sva tri anti-B7-H1 antitela ne pokazuju unakrsnu reaktivnost za bilo koji od sedam humanih imunoloških ko-modulacionih molekula koje smo testirali (Slika 5). IgG1-TM anti-B7-H1 antitelo 2.7A4OPT pokazuje merljivu unakrsnu reaktivnost za mišji B7-H1 sa nivoom signala od 5,3% u proseku u poređenju sa 100% vezivanjem za humani B7-H1. Druga dva testirana anti-B7-H1 antitela, 2.9D10 i 2.14H9OPT, ne pokazuju nikakvu unakrsnu reaktivnost za mišje B7-H1 (Slika 5).

PRIMER 15: AFINITET ANTI-B7-H1 ANTITELA ZA HUMANI I B7-H1 MAKAKI RAKOJED MAJMUNA

[0348] Afiniteti vezivanja i kinetički parametri anti-B7-H1 antitela u formi IgG1-TM za monomerni humani i B7-H1 makaki rakojed majmuna su određeni površinskom plazmonskom rezonancom pomoću BIAcore T100 instrumenta (BIAcore, Uppsala, Švedska). Ukratko, eksperimenti su izvedeni na 25°C koristeći HBS-EP pufer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20) kao aktivni pufer. IgG-ovi su bili afinitetom uhvaćeni na površini CM5 senzorskog čipa (BIAcore) preko proteina G, koji je bio aminokuplovan na CM5 površinu kako bi se postigla gustina jedinica odziva od -500 (RU – response unit), prema uputstvima proizvođDča (BIAapplications Handbook, BIAcore). Rekombinantni monomeri iz humanog ili B7-H1 iz makaki rakojed majmuna FlagHis10("His10" je opisan kao SEK ID BR: 93) ekstracelularnih domena (ECD) su korišćeni kao analiti. Razblaženja sa B7-H1 ECD (200-3,12 nM) u aktivnom puferu ubrizgavana su sa konstantnim protokom od 100 ml/min u trajanju od 60 sekundi. Sva merenja su korigovana na osnovu oduzimanja senzograma dobijenog sa kontrolnom (aktivirana-deaktivirana) protočnom ćelijom, kao i sa dvostrukim referencama praznih (nulte koncentracije) injekcijama. Podaci su analizirani korišćenjem softverskog paketa T-100 BIAevaluation i fitovani su u jednostavni 1:1 Lengmuir-ov vezni model sa lokalnim Rmaksi indeksom refrakcije podešenim do 0. Podaci su izračunati iz najmanje dva nezavisna eksperimenta. Efekti transporta mase su ograničeni održavanjem nivoa IgG koji su afinitetno zauzeti ispod 250 RU. Senzorgrami dobijeni sa svim testiranim antitelima mogu biti lako fitovani na monoeksponencijalni 1:1 model vezivanja koji daje odlične adekvatne vrednosti Chi<2>konzistentno 0,3.

[0349] Afinitet anti-B7-H1 antitela 2.7A4OPT i 2.14H9OPT za monomerni humani B7-H1 je 1nM i 175pM, respektivno (Tabela 21).

Tabela 21: Analiza afiniteta i kinetičkih parametara anti-B7-H1 antitela u vezivanju za humani

B7-H1

[0350] Afinitet anti-B7-H1 antitela 2.7A4OPT i 2.14H9OPT za monomerni B7-H1 makaki rakojed majmuna je 835pM i 367pM respektivno (Tabela 22). Ova dva antitela su snažno unakrsno reaktivna za B7-H1 makaki rakojed majmuna jer su afiniteti veoma blizu onima za humani B7-H1.

Tabela 22: Analiza afiniteta i kinetičkih parametara anti-B7-H1 antitela u vezivanju za B7-H1 iz makaki rakojed majmuna

PRIMER 16: MAPIRANJE EPITOPA ANTI-B7-H1 ANTITELA

[0351] Mapiranje epitopa je izvršeno kako bi se identifikovali ostaci humanih B7-H1 koji su uključeni u vezivanje anti-B7-H1 antitela. Struktura ekstracelularnog domena humanog B7H1 u kompleksu sa mišjim PD1 prethodno je opisana u literaturi (Lin, D i sar., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.105, p3011-3016) i otkriva se da je četrnaest B7-H1 ostataka uključeno u vezivanje za PD1 (Tabela 23).

Tabela 23: Humani B7-H1 ostaci uključeni u vezivanje za mišji PD1. Pozicije 121-125 su opisane kao SEK ID BR: 112.

[0352] Anti-B7-H1 antitela se takmiče za vezivanje humanog B7-H1 na humani PD1 (primer 5, 8 i 12), tako da treba da interaguju sa nekim od tih 14 ostataka ako pretpostavimo da postoje zanemarljive razlike između B7H1 vezujućeg interfejsa na PD1 čoveka i miša (62% identičnosti aminokiselina između ekstracelularnog domena dve vrste). Mutanti B7-H1 sa jednom aminokiselinom će biti generisani za svih 14 položaja opisanih u Tabeli 23. Mutanti će biti testirani na vezivanje za anti-B7-H1 antitela pomoću fag ELISA testa i na sposobnost da se nadmeću u vezivanju anti-B7-H1 antitela na humane B7-H1 u HTRF® testu kompeticije. Sva anti-B7-H1 antitela opisana su u IgG1-TM formatu.

Kloniranje humanog B7-H1 infuzije gena iz ekstracelularnog domena sa bakteriofagnim genom III za ekspresiju fagnog prikaza

[0353] Gen za kodiranje ekstracelularnog domena humanog B7-H1 proteina (Uniprot pristupni broj Q9NZQ7, aminokiselina [19-238]) je sintetizovan eksterno pomoću DNA2.0 Inc. i amplificiran pomoću PCR korišćenjem prajmera B7H1_FOR (5’-AATAATGGCCCAGCCGGCCATG GCCTTTACCGTGACGGTACCG-3’ (SEK ID BR: 94)) i B7H1_REV (5’-AATA ATGCGGCCGCCCTTTCGTTTGGGGGATGC-3’ (SEK ID BR: 95)) za uvođenje Sfi I i Not I ograničavajućih mesta na 5' i 3' kraju. PCR proizvod je potom kloniran u vektoru pCANTAB6 (McCafferty J. i sar., 1994, Appl. Biochem. Biotechn., Vol.47, p 157-173) korišćenjem Sfi I i Not I restrikcijskih mesta. E. coli soj TG1 su transformisani pomoću ligacije i pojedine kolonije su skriningovane sekvencioniranjem da bi se identifikovao B7-H1 transformant nazvan B7H1_pCANTA6.

Generisanje i identifikacija B7-H1 mutanta

[0354] B7-H1 mutanti su generisani zasićenom mutagenezom kod svih 14 ostataka PD1 interfejsa koristeći potpuno randomizovane NNS prajmere (tabela 24) i plazmid B7-H1_pCANTA6 kao DNK šablon. Mutageneza je izvršena sa Stratagene’s QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis setom (katalog #200513) prema uputstvima proizvođDča. Mutagenske reakcije su korišćene kako bi se transformisao E. coli soj TG1, a pojedine kolonije su skriningovane sekvencioniranjem da bi se identifikovale B7-H1 varijante. Identifikovano je ukupno 252 varijanti među 280 mogućih (20 aminokiselina puta 14 pozicija) i proizvod je pokupljen u 3 kultivacione ploče sa 96 bunarčLća.

Tabela 24: Mutageni prajmeri korišćeni za generisanje B7-H1 varijanti (SEK ID BR. 96-109, respektivno, po redu pojavljivanja)

Fag ELISA za B7-H1 mutante u vezivanju za anti-B7-H1 antitela

[0355] Vezivanje B7-H1 mutanata na anti-B7-H1 antitela 2.14H9OPT, 2.7A4OPT ili referencu Ab#1 su procenjene sa fag ELISA testom nakon što su se uverili da bi ekstracelularni domen B7-H1 u fuziji sa proteinom gena III mogao biti prikazan na površini faga. Uzgajane TG1 kulture izabrane od uzgajanih su i superinficirane sa M13K07 helper fagom, kako bi se proizvele fagne čestice koje prikazuju B7-H1 mutante na njihovoj površini. Supernatanti faga su blokirani u PBS 3% obranom mleku i inkubirani u NUNC MaxiSorb pločama koje su prethodno obložene preko noći sa 1ug/mL 2.14H9OPT, 2.7A4OPT ili referentnim antitelom #1 u PBS i blokirani sa PBS 3% obranom mlekom. Vezani fagi su detektovani korišćenjem streptavidina zajedno sa europijumom (Perkin Elmer) nakon inkubacije sa biotinilovanim anti-M13 sekundarnim antitelom (Progen).

[0356] Među 14 humanih B7-H1 ostataka lociranih na PD1 interfejsu, četiri nisu uključena u vezivanje za bilo koje od tri testirana anti-B7-H1 antitela (Asp26, Tir56, Glu66 i Lys124). Njihova zamena alaninom ili glicinom ne utiču značajno na signal vezivanja. Na osnovu podataka fag ELISA testa, ukupno 28 mutanata koji poseduju od 2 do 3 ključne promene za svaku od 10 drugih pozicija su izabrana da bi potvrdili svoj profil vezivanja, ali koristeći prečišćene proteine.

Testiranje biohemijske kompeticije

[0357] Ekstracelularni domen humanog B7-H1 divljeg tipa i mutanti su eksprimirani u bakterijama i prečišćeni afinitetnom hromatografijom kao što je prethodno opisano (Bannister D. i sar., 2006, Biotechnology i bioengineering, 94, 931-937).

[0358] HTRF® testovi kompeticije merili su vezivanje anti-B7-H1 antitela na HIS FLAG označeni B7-H1. Titracija B7-H1 uzoraka bez tagova, pripremljena kao što je prethodno opisana, takmičLće se sa HIS FLAG označenim B7-H1 za vezivanje na anti-B7-H1 antitelo, što dovodi do smanjenja signala testa. Antitela 2.14H9OPT, 2.7A4OPT i referentno antitelo #1 su korišćena za uspostavljanje testa kompeticije za karakterizaciju relativnog vezivanja prečišćenih divljih vrsta ili mutanata B7-H1. Ovo će potvrditi koji su B7-H1 ostaci potrebni za vezivanje antitela.10 ml uzorka B7-H1 je dodato u test ploču od 384 bunarčLća male zapremine (Coming 3673). Ovo je praćeno dodavanjem 5 µL bilo 0,29 nM 2.14H9OPT ili 1,15 nM 2.7A4OPT ili 1,15 nM referentnog antitela #1 konjugovanih na DyLight649 prema uputstvima proizvođDča (ThermoFisher, 53051) i 5 µL mešanog rastvora od 0,43 nM anti-FLAG kriptata (Cisbio International, 61FG2KLB) i 1,25 nM HIS FLAG tagovanog humanog B7-H1. Test ploče su inkubirane 4 sata na sobnoj temperaturi pre nego što je vreme otklanjanja fluorescencije resolvirano na talasnim dužinama emitovanja od 620 nm i 665 nm korišćenjem čitača EnVision ploča (Perkin Elmer).

[0359] Tri dodatna ostataka B7-H1 (Ile54, Ser117 i Ala121) nisu uključena u vezivanje na 2.14H9OPT i 2.7A4OPT kao IC50 kao B7-H1 mutanati, jer su ostaci slični ili marginalno modifikovani u poređenju sa divljim tipom B7-H1. Podaci o konkurentnosti 3 anti-B7-H1 antitela za divlje tipove i svi ostali B7-H1 mutanti su sumirani u Tabeli 25.

Tabela 25: IC50u nM, u testu kompetitivnosti humanog B7-H1 u vezivanju za anti-B7-H1 antitela

[0360] Arg113 i Arg125 su snažno uključeni u vezivanje na 2.14H9OPT. Zamena sa Ala ili sa drugim aminokiselinama (Tir ili Leu na poziciji 113 i Gln ili Ser na poziciji 125) dovodi do potpunog gubitka vezivanja za to antitelo. Vezni profil onih B7-H1 mutanata na 2.7A4OPT ili referentnom antitelu #1 je sličan divljim tipovima B7-H1. Ovo pokazuje da gubitak vezivanja nije posledica generalne strukturne modifikacije B7-H1 kao što je, na primer, neumotani protein, već direktnog uključivanja tih ostataka sa vezivanjem 2.14H9OPT. Ovi podaci takođe pokazuju da je epitop vezivanja 2.14H9OPT različit od epitopa 2.7A4OPT i referentnog antitela #1. Met115, Asp122 i Tir123 takođe su uključeni u vezivanje na 2.14H9OPT, ali u manjoj meri. Zamena Met115 od strane Ala ne utiče na vezivanje na 2.14H9OPT ili 2.7A4OPT, ali zamena sa Asn dovodi do potpunog gubitka aktivnosti vezivanja na 2.14H9OPT, ali ne na 2.7A4OPT. Na sličan način zamena Asp 122 sa Asn utiče na vezivanje na 2.14H9OPT, ali ne i na referentno antitelo #1. Mutirajući Tir123 pomoću Ala ili Thr izuzetno modifikuje vezni profil na 2.14H9OPT, ali ne na 2.7A4OPT. Zanimljivo je da zamena Phe ne menja vezivanje na 2.14H9OPT što ukazuje na to da hidroksilna grupa tirozina 123 nije uključena u vezujuću interakciju.

[0361] Phe19, Thr20 i Asp122 su snažno uključeni u vezivanje na 2.7A4OPT. Svi B7-H1 mutanti na tim pozicijama nemaju vezivanja za to antitelo, ali vezuju 2.14H9OPT ili referentno antitelo #1 na sličan način kao i za divlji tip B7-H1, izuzev mutanta B7H1_D122E koji manje efikasno povezuje ova 2 antitela. Ova tri ostatka su specifični za vezivanje epitopa 2.7A4OPT mAb i ne dele ih sa 2.14H9OPT ili sa referentnim antitelom #1. Arg113 je takođe uključen u epitop 2.7A4OPT, ali u manjoj meri. Zamena Ala ne utiče na vezivanje za to antitelo, ali mutacije Tir ili Leu dovode do potpunog gubitka vezivanja. Ove mutacije na poziciji 113 ne utiču na vezivanje za referentno antitelo #1, što pokazuje da mutanti B7-H1 još uvijek imaju tačnu konformaciju. Moguće je da zamena većom aminokiselinom kao Tir može predstavljati neke sterične prepreke. Ovi rezultati sugerišu da Arg113 nije direktno uključen u kontakt sa 2.7A4OPT antitelom, ali je vrlo blizu aktuelnom vezivanju epitopa.

[0362] Ovaj primer pokazuje da tri anti-B7-H1 antitela 2.14H9OPT, 2.7A4OPT i referentno antitelo #1 imaju različite vezivne epitope na B7-H1 interfejsu sa PD1. Štaviše, moguće je da se ta antitela mogu takođe vezati sa drugim humanim ostacima B7-H1, ali koji se ne nalaze na PD1 interfejsu.

PRIMER 17. DETERMINACIJA EFEKATA ANTI-B7-H1 ANTITELA NA MEMORIJSKI ODGOVOR T-ûELIJA NA SUBOPTIMALNE KONCENTRACIJE ODZIVA ANTIGENA

[0363] Interakcija B7-H1 sa PD-1 pokazala je da inhibira antigen specifične T-ćelijske reakcije. Da bi se procenio uticaj anti-B7-H1 antitela na ovu inhibiciju, izvršen je test suboptimalnog odziva antigena.

[0364] Monociti periferne krvi (PBMC) su izolovani iz humanih krvnih kapaka koristeći centrifugu gradijenta gustine Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03) prema uputstvima proizvođDča. Sledeće izolovane ćelije su resuspendovane u RPMI 1640 Glutamax I medijumu (GIBCO, 61870) uz dodatak 1% pen/strep (GIBCO, 15140) i 4% humanog AB seruma (Invitrogen 34005), a zatim su kultivisane u 96 bunara sa zaobljenim dnom, na ploči za kultivaciju tkiva (Corning, 3799) na 37<o>C, 5% CO2, sa ili bez 0,1 µg/mL tetanusnog toksoida (Calbiochem 582231) u gustini od 1x10<5>ćelija po bunarčLću. Nakon tri dana kultivacije, anti-B7-H1 antitela u formi IgG1-TM ili kontrola izotipa su dodati u navedenim koncentracijama, a kulture se vraćaju na 37°C u toku 2 dana, pri čemu su supernatanti uzimani i analizirani pomoću DELFIA za nivoe interferona-Ȗ. Poboljšanje otpuštanja interferona-Ȗ pomoću anti-B7-H1 antitela prikazano je na slici 6.

[0365] Anti-B7-H1 antitela 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT mogu povećati oslobađanje interferona-Į. Ovi podaci potvrđuju sposobnost 2.9D10, 2.7A4OPT i 2.14H9OPT da poboljšaju antigen specifične T-ćelijske odgovore.

PRIMER 18. DETERMINACIJA EFEKATA ANTI-B7-H1 ANTITELA NA MEMORIJSKI ODGOVOR T-ûELIJA NA OPTIMALNE KONCENTRACIJE ODZIVA ANTIGENA

[0366] Sugerisano je da B7-H1 poseduje potencijalne inhibitorne signalne osobine. Potencijal za anti-B7-H1 antitela koja deluju kao agonisti koji mogu da dovedu do takve inhibitorne signalizacije je testirana ispitivanjem njihove sposobnosti da inhibiraju odziv antigena.

[0367] Monociti periferne krvi (PBMC) su izolovani iz humanih krvnih kapaka koristeći centrifugu gradijenta gustine Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare 17-1440-03) prema instrukcijama proizvođDča. Sledeće izolovane ćelije su resuspendovane u RPMI 1640 Glutamax I medijumu (GIBCO, 61870) uz dodatak 1% pen/strep (GIBCO, 15140) i 4% humanog AB seruma (Invitrogen 34005), a zatim su kultivisane, u gustini 1x10<5>ćelija po bunaru, u 96 bunara sa zaobljenim dnom, na ploči za kultivaciju tkiva (Corning, 3799) na 37<o>C, 5% CO2, zajedno sa 5 µg/mL tetanus toksoida (Calbiochem 582231) i u prisustvu ili odsustvu različitih koncentracija anti-B7-H1 antitela u IgG1-TM formatu ili kontrola izotipa. Antitelo protiv T-ćelijskog ko-receptora korišćeno je kao pozitivna kontrola. Nakon 5 dana kultivacije ćelije su pulsirane sa 0,5 mCi/bunaru tritiranog timidina približno 16 sati kako bi se procenila proliferativna aktivnost.

[0368] Nije bilo inhibitornih efekata kod 2,9D10, 2,7A4 i 2,14H9 anti-B7-H1 antitela, za razliku od pozitivne kontrole, kao što je prikazano na slici 7. Ovo ukazuje na to da su antitela 2.9D10, 2.7A4 i 2.14H9 čisti antagonisti, bez bilo koje agonističke aktivnosti.

PRIMER 19. AKTIVNOST INIBITACIJE RASTA TUMORA SA ANTI-B7-H1 ANTITELIMA

[0369] In-vivo aktivnost anti-humanih B7-H1 antitela istraživana je u modelima miševa ksenografta pomoću imunokompromitovanih NOD/SCID (ne-gojaznih dijabetičkih/teških kombinovanih imunodeficijencija) miševa. Miševima su subkutano nakalemljeni (SC) sa humanim ćelijskim linijama karcinoma koji eksprimiraju humane B7-H1 i humane CD4+ i CD8+ T ćelije koje su izolovane iz mononuklearnih ćelija periferne krvi zdravih donora i kultivisane za obogaćivanje za aloreaktivne efektorske T ćelije. Intraperitenalne (IP) doze anti-humanih B7-H1 antitela date su miševima inokulisanim sa HPAC ćelijskom linijom pankreasa ili humanom ćelijskom linijom melanoma A375. Efekat antitela je primećen kod rasta tumora sve do zapremine tumora od 2000 mm<3>ili ukupne tumorske nekroze.

[0370] Za generisanje CD4+ i CD8+ T ćelijskih linija, humani PBMC od zdravih donora obogaćeni su sa CD4+ ili CD8+ T ćelijama dodavanjem 1 ml proizvoda za obogaćivanje RosetteSep T ćelija na 20 ml celokupne krvi. Nakon toga je sledila 20-minutna inkubacija i naknaDNK izolacija centrifugiranjem gradijenta gustine pomoću medija za gustinu RosetteSep DM-L. Nakon centrifugiranja, ćelije su isprane sa PBS i ponovo resuspendovane u medijumu RPMI 1640, dopunjenom sa 10% PBS. Obogaćene CD4+ i CD8+ T ćelije su kultivisane odvojeno 7-10 dana u medijumu dopunjenom sa rhIL-2 i svaki je kombinovan sa mitomiozin C tretiranim A375 ili HPAC ćelijama. T ćelije su sakupljene i odvojeno kultivisane ponovo 7-10 dana u medijumu dopunjenim sa rhIL-2 i svaki je kombinovan sa mitomiozin C tretiranim A375 ili HPAC ćelijama. CD4+ i CD8+ T ćelije su sakupljene i kombinovane u odnosu 1:1.

[0371] A375 i HPAC ćelijske linije raka i PBMC obogaćene sa CD4+ i CD8+ T ćelijama su pomešani neposredno pre subkutane (SC) primene kod naznačenih odnosa efektora-do-cilja (E:T). Broj inokulacije ćelija za svaku ćelijsku liniju kancera unapred je utvrđen empirijskim studijama doza za formiranje tumora; uopšteno, 2,5 x 10<6>ćelija u ukupnoj zapremini od 0,2 ml bile su umetnute u svaku životinju.

[0372] Za svaku eksperimentalnu grupu dodeljeno je šest životinja. Životinje su dobijale izotipski kontrolni humani IgG2a ili IgG1OPT (takođe ovde označeni kao "IgG1TM") antitela ili anti-B7-H1 antitela 2.14H9 IgG2a, 2.14H9OPT, 2.7A4OPT ili referentno antitelo #1 u formatu IgG1OPT. Izvedeno je ukupno osam nezavisnih eksperimenata, a studijski dizajn za svaki eksperiment predstavljen je u tabelama 26 - 33. Opisana anti-B7-H1 antitela su u formatu IgG1OPT, osim tamo gde je drugačije navedeno.

[0373] Prva doza (200 mL) testiranih ćelija je administrirana IP 1 sat nakon ubacivanja karcinom/efektor T ćelija; životinje su primile do 4 dodatne doze testiranog materijala na dane ispitivanja 3, 5, 8 i/ili 10. Kao pozitivnu kontrolu za povećanje aloreaktivnosti u nekim studijama, rhIL-2 je primenjen IP 1 sat nakon uzimanja karcinom/efektor T ćelije; životinje su primile 4 dodatne dnevne doze rhIL-2 tokom 4 uzastopna dane. Formiranje tumora je praćeno kod svake životinje jedan ili dva puta nedeljno. Tumori su mereni pomoću kalipera; zapremine tumora (V) izračunate su koristeći sledeću formulu:

V(mm<3>) = 0,5 (dužina (mm) x širina (mm) x širina (mm)/2)

[0374] Za svaku grupu rezultati su prijavljeni kao aritmetička sredina. Antikancerogeni efekat, izražen kao procenat inhibicije rasta tumora (TGI), izračunava se sledećom metodom:

% TGI = >1-(srednja V tumora tretirane grupe) y (srednja V tumora kontrolne grupe)@ x 100

[0375] U studiji 1, anti-B7-H1 antitela 2.14H9 IgG2a i 2.7A4OPT značajno su inhibirali rast ćelija raka HPAC (pankreasa) na dan 30 do 61% i 50% u odnosu na izotipsku kontrolnu grupu (Slika 8 i Tabela 26).

Tabela 26: Studija 1 – Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute HPAC kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0376] U studiji 2, anti-B7-H1 antitela 2.14H9OPT i 2.7A4OPT inhibirali su rast ćelija raka HPAC (pankreasa) na dan 39 do 70% i 68% u odnosu na izotipsku kontrolnu grupu (Slika 9 i Tabela 27).

Tabela 27: Studija 2 - Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute HPAC kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0377] U studiji 3, anti-B7-H1 antitelo 2.14H9OPT značajno je inhibiralo rast ćelija raka HPAC (pankreasa) na dan 30 do 60% u poređenju sa kontrolnom grupom izotipova (Slika 10 i Tabela 28).

Tabela 28: Studija 3 - Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute HPAC kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0378] U studiji 4 anti-B7-H1 antitelo 2.14H9OPT značajno je inhibiralo rast ćelija raka HPAC (pankreasa) na dan 22 do 74% u poređenju sa kontrolnom grupom izotipova (Slika 11 i Tabela 29).

Tabela 29: Studija 4 - Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute HPAC kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0379] U studiji 5, IP administracija 2.14H9 IgG2a ili 2.7OPT anti-B7-H1 antitela u modelu ksenografta A375 (melanoma) značajno je inhibirala rast tumora na dan 29 za čak 64% i 61% u odnosu na izotip kontrolne grupe (Slika 12 i Tabela 30).

Tabela 30: Studija 5. - Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute A375 kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0380] U studiji 6, anti-B7-H1 antitelo 2.14H9OPT značajno je inhibiralo rast ćelija raka A375 (melanom) kada je kombinovano sa T ćelijama na dan 25 do 77% u poređenju sa kontrolnom grupom izotipova (Slika 13 i Tabela 31)

Tabela 31: Studija 6. - Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute A375 kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0381] U studiji 7, anti-B7-H1 antitelo 2.14H9OPT značajno je inhibiralo rast ćelija raka A375 (melanom) kada je kombinovano sa T ćelijama na dan 25 do 82% u poređenju sa kontrolnom grupom izotipova (slika 14 i tabela 32) .

Tabela 32: Studija 7. - Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute A375 kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0382] U studiji 8, anti-B7-H1 antitelo 2.14H9OPT značajno je inhibiralo rast ćelija karcinoma A375 (melanom) u kombinaciji sa T ćelijama na dan 25 do 93% u poređenju sa kontrolnom grupom izotipova (Slika 15 i Tabela 33).

Tabela 33: Studija 8. - Testirane grupe i procenat inhibicije rasta tumora kod miševa kojima su umetnute A375 kancerske ćelije nakon intravenozne primene anti-B7-H1 antitela

[0383] Ovi rezultati pokazuju da anti-humana B7-H1 antitela 2.14H9 IgG2a, 2.14H9OPT i 2.7A4OPT imaju snažnu in vivo antikancerogenu aktivnost u ksenograftovanim modelu na mišu za humani karcinom i pružaju dokaze da ta anti-humana B7-H1 antitela mogu imati aktivnost kao terapija sa jednim agensom za lečenje bolesnika sa kancerom koji eksprimira B7-H1.

[0384] Navedena pisana specifikacija se smatra dovoljnom da omogući stručnjaku u oblasti da praktikuje pronalazak. Prethodni opis i primeri detaljno opisuju određene poželjne primere pronalaska i opisuju najbolji način rada pronalazača. Međutim, biće prihvaćeno da bez obzira na to koliko se prethodno navedeno može pojaviti u tekstu, pronalazak se može praktikovati na više načina, a pronalazak treba tumačiti u skladu sa priloženim zahtevima

LISTA SEKVENCI

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani B7-H1, gde antitelo ili njegov vezujući fragment obuhvata:

VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu GFTFSRIVMS; i

VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu NIKQDGSEKYYVDSVKG; i

VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu EGGWFGELAFDY; i

VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu RASQRVSSSYLA; i

VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu DASSRAT; i

VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu QQYGSLPWT,

i gde antitelo ili njegov vezujući fragment inhibiraju B7-H1 izazvanu proliferaciju tumora.

2. Izolovano antitelo ili njegov vezujući fragment prema zahtevu 1, gde antitelo ili njegov fragment vezuju humani B7-H1 sa KD manjim od 2 nM, kao što je određeno sa BIAcore na 25°C u HBS-EP puferu.

3. Izolovano antitelo ili njegov vezujući fragment prema zahtevu 1 ili 2, gde antitelo ili njegov vezujući fragment, unakrsno reaguju sa B7-H1 iz makaki rakojed majmuna.

4. Izolovano antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde antitelo ili njegov vezujući fragment vezuju B7-H1 iz makaki rakojed majmuna sa Kd manjim od 2 nM, kao što je određeno sa BIAcore na 25°C u HBS-EP puferu.

5. Izolovano antitelo, ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde antitelo ili njegov vezujući fragment pokazuje aktivaciju CD4+ T ćelija u ispitivanju dendritičnih ćelija-T-ćelija mešanih limfocita.

6. Izolovano antitelo, ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde antitelo ili njegov vezujući fragment inhibira vezivanje humanog B7-H1 na PD-1 eksprimiranog na ES-2 ćelijama sa IC50 manjim od 0,2 nM.

7. Izolovano antitelo, ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde antitelo ili njegov vezujući fragment inhibira vezivanje humanog B7-H1 na B7-1 koristeći ispitivanje TR-FRET homogenosti sa IC50 manjim od 0,1 nM.

8. Izolovano antitelo, ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 7 koje se specifično vezuje za B7-H1, gde antitelo vezuje humani B7-H1 sa Kd manjim od 1,0 nM, kao što je određeno sa BIAcore na 25°C u HBS-EP puferu; ili

gde navedeno antitelo vezuje humani B7-H1 sa Kd manjim od 200 pM, kao što je određeno sa BIAcore na 25°C u HBS-EP puferu.

9. Antitelo prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde navedeno antitelo je kompletno humano monoklonalno antitelo.

10. Vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde navedeni vezujući fragment je izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv i dAb fragmenta.

11. Antitelo ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 7 koje ima aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata:

aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je kodirana polinukleotidom u plazmidu označenom 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 41597 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je kodirana polinukleotidom u plazmidu označenom 2.14H9_G koja je deponovana u bazi NCIMB pod depozitnim brojem 41597.

12. Izolovano antitelo ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde antitelo ili njegov vezujući fragment, imunospecifično vezuju B7-H1 i obuhvataju:

varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinom iz SEK ID BR: 72; i

varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEK ID BR: 77;

gde navedeno antitelo ima aktivnost vezivanja za B7-H1

13. Antitelo ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, 11, ili 12, gde navedeno antitelo dalje obuhvata Fc varijantu, pri čemu Fc region obuhvata najmanje jednu aminokiselinu koja se prirodno ne pojavljuje, izabranu iz grupe koja se sastoji od 234F, 235F, i 331 S, kao što je obeleženo indeksom EU kako je navedeno u Kabatu.

14. Molekul nukleinske kiseline koja kodira za antitelo, ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od prethodnih zahteva.

15. ûelija domaćina transfektovana sa vektorom koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14.

16. Antitelo proizvedeno postupkom koji obuhvata, kultivisanje pomenute ćelije domaćina prema zahtevu 15, ekspresiju antitela kodiranog molekulom nukleinske kiseline prema zahtevu 14, i izolovanje navedenog antitela iz pomenute kulture.

17. Kompozicija koja sadrži antitelo, ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 12.

18. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 12 i farmaceutski prihvatljiv nosač

19. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 18 za upotrebu u terapiji.

20. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 18 za upotrebu u lečenju malignog tumora kod životinja; i opcionu gde je navedena životinja čovek.

21. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 20, gde je navedeni maligni tumor odabran iz grupe koja se sastoji od: melanom, karcinom plućnih ne-malih ćelija, hepatocelularni karcinom, karcinom želuca, rak bešike, rak pluća, karcinoma bubrežnih ćelija, rak grlića materice, rak debelog creva, kolorektalni rak, rak glave i vrata, rak dojke, ezofagalni rak, rak kostiju, kancer prostate, karcinom bazalnih ćelija, karcinom bilijarnog trakta, rak mozga i CNS, horiokarcinom, rak vezivnog tkiva, kancer digestivnog sistema, karcinom endometrijuma, karcinom očiju, intraepitelni karcinom, karcinom bubrega, karcinom laringsa, leukemije, karcinom jetre, rak pluća, limfom, mijelom, neuroblastom, rak usne šupljine, karcinom jajnika, rabdomijosarkom, sarkom, karcinom kože, karcinom testis, tiroidni karcinom, karcinom uterusa, karcinom urinarnog trakta, i rak pankreasa.

22. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 18 za upotrebu u lečenju hronične virusne infekcije kod životinja; opciono gde je navedena životinja čovek.

23. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 22, gde je navedena hronična virusna infekcija izabrana iz grupe koju čine: HIV, HBV i HCV.

24. Antitelon ili njegov vezujući fragment, prema bilo kom od zahteva 1 do 12 ili 16 za samostalnu primenu ili u kombinaciji sa dodatnim antitelima, hemoterapeutskim lekovima, radioterapijom ili terapijskim vakcinama.