RS68082B1 - Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe

Info

Publication number
RS68082B1
RS68082B1 RS20260562A RSP20260562A RS68082B1 RS 68082 B1 RS68082 B1 RS 68082B1 RS 20260562 A RS20260562 A RS 20260562A RS P20260562 A RSP20260562 A RS P20260562A RS 68082 B1 RS68082 B1 RS 68082B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
acid sequence
car
Prior art date
Application number
RS20260562A
Other languages
English (en)
Inventor
Xiaohu Fan
Chuan-Chu Chou
Qiuchuan Zhuang
Pingyan Wang
Lin Wang
Lei Yang
Jiaying Hao
Original Assignee
Legend Biotech Ireland Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Legend Biotech Ireland Ltd filed Critical Legend Biotech Ireland Ltd
Publication of RS68082B1 publication Critical patent/RS68082B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001117—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR] or CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4221—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4222—CD38 not IgG
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/29—Multispecific CARs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

[0001] Opis
[0002] OBLAST OVOG PRONALASKA
[0003] Ovaj pronalazak se odnosi na himerni antigenski receptori koji obuhvata jednodomenska antitela, konstruisane imunske efektorske ćelije, i njihove upotrebe. Ovo otkrivanje se dalje odnosi na aktivaciju i širenje ćelija za terapeutske upotrebe, naročito za imunoterapiju T-ćelijama baziranu na himernim antigen receptorima.
[0005] POZADINA OVOG PRONALASKA
[0006] Sa razvojem imunoterapije tumora i kliničke tehnologije, imunoterapija T ćelijama himernih antigen receptora (CAR-T) je sada jedan od pristupa imunoterapiji tumora koji najviše obećava.
[0007] Generalno, himerni antigen receptor (CAR) obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen. Ekstracelularni antigenski vezujući domen može da obuhvata jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji cilja identifikovani tumorski antigen. CAR mogu biti eksprimirani na površini T ćelija pomoću tehnika genske transfekcije. Nakon vezivanja za ciljani tumorski antigen, CAR mogu da aktiviraju T ćelije kako bi se pokrenuo konkretan anti-tumorski odgovor tako da to zavisi od antigena, bez ograničenja na dostupnost glavnih histokompatibilnih kompleksa (MHC) specifičnih za ciljani tumorski antigen.
[0008] WO 2013/123061 se odnosi na bispecifične CAR bazirane na scFv.
[0009] Grada et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2013, Vol.2, e105, su izučavali TanCAR koji je posredovao u bispecifičnoj aktivaciji i ciljanju T ćelija.
[0010] Jamnani et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 2014, Vol.1840, No.1, strane 378-386, su prijavljivali oligoklonalne anti-HER2 CAR koji obuhvataju pojedinačni V<H>H domen.
[0011] Jednodomenska antitela (sdAb) su različita od uobičajenih 4-lančanih antitela po tome što imaju jedan varijabilni domen monomernog antitela. Na primer, kamelide i ajkule proizvode jednodomenska antitela pod nazivom antitela samo teškog lanca (HcAb), kojima prirodno nedostaju laki lanci. Antigenvezujući fragment u svakom kraku antitela samo teških lanaca kamelida ima jedan varijabilni domen teškog lanca (V<H>H), koji može da ima visok afinitet za antigen bez pomoći lakog lanca. Kamelidni V<H>H je poznat kao najmanji funkcionalni antigenski vezujući fragment molekulske mase od približno 15 kD.
[0013] KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA
[0014] [0007] Ovaj pronalazak obezbeđuje himerne antigen receptore (CAR) bazirane na jednodomenskim antitelima (V<H>H), konstruisane imunske efektorske ćelije, i njihove upotrebe u imunoterapiji kancera kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje himerni antigen receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo sdAb koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu najmanje jedno od prvog antigena i drugog antigena predstavlja BCMA, i pri čemu svako prvo i drugo sdAb je V<H>H; b) transmembranski domen; i c) intracelularni signalizirajući domen; pri čemu prvo sdAb ili drugo sdAb predstavlja sdAb anti-BCMA koje obuhvata bilo koji od sledećih: (1) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31; ili (2) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38.
[0016] U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb se nalazi na N-kraju ili na C-kraju drugog sdAb.
[0017] U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano.
[0018] U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i drugo sdAb su direktno međusobno povezani peptidnom vezom.
[0019] U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i drugo sdAb su međusobno spojeni peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker u dužini ima više od 50 aminokiselina.
[0020] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je transmembranski domen molekula izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1.
[0021] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je primarni intracelularni signalizirajući domen iz CD3ζ.
[0022] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, taj kostimulatorni signalizirajući domen je kostimulatorni signalizirajući domen kostimulatornog molekula izabran iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 i njihove kombinacije.
[0023] U nekim načinima ostvarivanja CAR dalje obuhvata zglobni domen koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid koji se nalazi na N-kraju polipeptida.
[0024] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR ovog pronalaska.
[0025] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu ovog pronalaska.
[0026] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje konstruisanu imunsku efektorsku ćeliju koja obuhvata CAR ovog pronalaska, izolovanu nukleinsku kiselinu ovog pronalaska, ili vektor ovog pronalaska.
[0027] U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunksa efektorska ćelija je T ćelija.
[0028] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata konstruisanu imunsku efektorsku ćeliju ovog pronalaska, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0029] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pojedinca.
[0030] U nekim načinima ostvarivanja, kancer je multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija, ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj kancer predstavlja multipli mijelom.
[0031] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema ovom pronalasku obuhvata anti-CD19 sdAb koji obuhvata CDR regione SEQ ID NO:76. U nekim načinima, anti-CD19 sdAB obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 sdAb obuhvata V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:76.
[0032] Ovde otkriveno kao referenca je da postoji anti -CD19 samo antitelo teškog lanca (HcAb) ili antigen vezujući protein koji obuhvata bilo koje od prethodno opisanih anti-CD19 sdAb.
[0033] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema ovom pronalasku obuhvata anti-CD20 sdAb koje obuhvata CDR regione SEQ ID NO: 77. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 sdAb obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 sdAb obuhvata V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0034] Ovde otkriveno kao referenca je da postoji anti-CD20 samo antitelo teškog lanca (HCAB) ili antigen vezujući protein koji obuhvata bilo koje od prethodno opisanih anti-CD20 sdAb.
[0035] U nekim načinima ostvarivanja, CAR ovog pronalska obuhvata sdAb anti-BCMA koje obuhvata CDR regione bilo koje od SEQ ID NO: 78, 88. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA obuhvata bilo koji od sledećih:
[0036] (1) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0037] (2) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30;
[0038] (3) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31;
[0039] (4) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0040] (5) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0041] (6) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0042] (7) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0043] (8) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36;
[0044] (9) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37;
[0045] (10) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; ili
[0046] (11) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39. Prvo sdAb ili drugo sdAb CAR prema ovom pronalasku je sdAb anti-BCMA koje obuhvata jedno od (3) ili (10).
[0047] U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA obuhvata V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:78-88.
[0048] Otkriveno kao referenca je anti-BCMA antitelo samo teškog lanca (HCAB) ili antigen vezujući protein koji obuhvata bilo koje od prethodno opisanih sdAb anti-BCMA.
[0049] CAR ovog pronalaska predstavlja BCMA himerni antigen receptor koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata sdAb anti-BCMA kao što je definisano u patentnim zahtevima; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, CAR je monospecifičan. CAR može biti opisan kao viševalentan (kao što je dvovalentan ili trovalentan). U nekim načinima ostvarivanja, CAR je multispecifičan (kao što je bispecifičan).
[0050] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema ovom pronalasku obuhvata anti-CD38 sdAb koji obuhvata CDR regione bilo koje od SEQ ID NO: 89-100. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-CD38 obuhvata bilo koji od sledećih:
[0051] (1) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
[0052] (2) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
[0053] (3) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
[0054] (4) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
[0055] (5) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
[0056] (6) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
[0057] (7) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
[0058] (8) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
[0059] (9) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
[0060] (10) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
[0061] (11) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
[0062] (12) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
[0063] U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 sdAb obuhvata V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:89-100.
[0064] Otkriveno ovde kao referenca je da postoji anti-BCMA antitelo samo teškog lanca (HCAB) ili antigen vezujući protein koji obuhvata bilo koje od prethodno opisanih sdAb anti-BCMA.
[0065] Ovaj pronalazak obezbeđuje himerni antigen receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen; pri čemu jedno od prvog i drugog sdAb predstavlja VHH; i pri čemu prvo sdAb ili drugo sdAb predstavlja sdAb anti-BCMA kako je definisano u patentnim zahtevima. (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb se nalazi na N-kraju drugog sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb se nalazi na C-kraju drugog sdAb.
[0066] U nekim načinima ostvarivanja, prvi antigen i drugi antigen su izabrani iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123 IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77 pri čemu najmanje jedan od prvog antigena I drugog antigena je BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb je anti-BCMA sdAb, kao što je bilo koje od prethodno opisanih sdAb BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, CAR obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata najmanje dve kopije (kao što je 2, 3, ili više kopija) sdAb anti-BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb predstavlja anti-CD19 sdAb, kao što je bilo koje od prethodno opisanih anti-CD19. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb predstavlja anti-CD20 sdAb, kao što je bilo koje od prethodno opisanih anti-CD20 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb predstavlja anti-CD38 sdAb, kao što je bilo koje od prethodno opisanih anti-CD38 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, CAR obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata najmanje dve kopije (kao što je 2, 3, ili više kopija) anti-CD38 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb predstavlja anti-CD22 sdAb.
[0067] [0035] U nekim načinima ostvarivanja prema bilo kom od prethodno datih CAR, pri čemu je prvi antigen drugačiji od drugog antigena. U nekim načinima ostvarivanja, CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb predstavlja anti-BCMA sdAb, I drugo sdAb predstavlja sdAb anti-CD38. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb predstavlja anti-BCMA sdAb, i drugo sdAb predstavlja anti-CD19 sdAb. U nekim primerima koji su ovde otkriveni kao referenca, prvo sdAb predstavlja anti-CD19 sdAb, i drugo sdAb predstavlja anti-CD20 sdAb. U nekim primerima koji su ovde otkriveni kao referenca, prvo sdAb predstavlja anti-CD19 sdAb, i drugo sdAb predstavlja anti-CD22 sdAb.
[0068] U nekim načinima ostvarivanja prvi antigen je isti kao drugi antigen. U nekim načinima ostvarivanja, CAR je bivalentan ili trovalentan. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i drugo sdAb se specifično vezuju za isti epitop. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb je isto kao drugo sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i drugo sdAb se specifično vezuju za različite epitope.
[0069] U nekim načinima ostvarivanja prema bilo kojem od ovde datih CAR, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano.
[0070] U nekim načinima ostvarivanja prema bilo kojem od ovde datih CAR prvo sdAb i drugo sdAb su direktno međusobno povezani peptidnom vezom. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i drugo sdAb međusobno su spojeni peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 144-151.
[0071] U nekim načinima ostvarivanja prema bilo kojem od CAR ovog pronalaska, transmembranski domen je izveden od od molekula izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz CD8 ili CD28. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132 ili SEQ ID NO: 133.
[0072] U nekim načinima ostvarivanja prema bilo kojem od CAR ovog pronalaska, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140 ili SEQ ID NO: 141.
[0073] U nekim načinima ostvarivanja prema bilo kojem od CAR ovog pronalaska, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabran iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen obuhvata citoplazmatski domen iz CD28 i/ili citoplazmatski domen iz CD137. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136 i/ili SEQ ID NO:
[0074] U nekim načinima ostvarivanja prema bilo kojem od CAR ovog pronalaska, CAR dalje obuhvata zglobni domen koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130.
[0075] U nekim načinima ostvarivanja, CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, signalizirajući peptid je izveden iz molekula izabranog iz grupe koju čine CD8α, GM-CSF receptor α, i IgG1 teški lanac. U nekim načinima ostvarivanja, signalizirajući peptid je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, signalizirajući peptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127.
[0076] Primeri CAR ovog pronalaska su navedeni u tabeli 5. U nekim načinima ostvarivanja, CAR obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 265-270. CAR kako su navedeni u tabelama 4 i 6 su ovde otkriveni radi reference.
[0077] Otkriven kao referenca je polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 152-174, 198-201, 206-216, 248-249 i 257-260. U nekim načinima ostvarivanja, CAR ovog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 80, 76-100 i 265-270.
[0078] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bilo koji od CAR ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline izabranu od SEQ ID NO: 271-276. Otkrivena kao referenca je sekvenca nukleinske kiseline izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 175-197, 202-205, 217-227, 250-251 i 261-264. U nekim načinima ostvarivanja, izolovanu nukleinsku kiselinu dalje obuhvata drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi CAR, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CAR operabilno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline preko treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira samocepajući peptid, kao što je T2A, P2A, ili F2A peptid. U nekim načinima ostvarivanja, ta treća sekvenca nukleinske kiseline je SEQ ID NO: 256. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je DNK molekul. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je RNK molekul.
[0079] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje vektor koji obuhvata izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, vektor predstavlja ekspresioni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor predstavlja virusni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor predstavlja lentivirusni vektor.
[0080] [0048] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje konstruisanu imunsku efektorsku ćeliju, koja obuhvata bilo koji od CAR ovog pronalaska ili bilo koju od izolovanih nukleinskih kiselina ovog pronalaska, ili bilo koji od vektora ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunska efektorska ćelija obuhvata ili eksprimira dva ili više CAR ovog pronalaska pri čemu ta dva ili više CAR se specifično vezuju za različite antigene. U nekim načinima ostvarivanja, imunska efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija, ili embrionska matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, imunska efektorska ćelija je T ćelija.
[0081] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata bilo koju od konstruisanih efektorskih ćelija ovog pronalaska I farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovde je dodatno obezbeđena farmaceutska kompozicija ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, ta konstruisana imunska efektorska ćelija je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunska efektorska ćelija je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, kaner je tečni kancer. U nekim načinima ostvarivanja, taj kancer je multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija, ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, taj kancer je čvrsti kancer, kao što je glioblastom.
[0082] Otkrivena kao referenca je farmaceutska kompozicija koja obuhvata bilo koje od prethodno opisanih anti-CD19 sdAb, anti-CD20 sdAb, anti-CD38 sdAb ili sdAb anti-BCMAi i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima, postoji postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod pojedinca, koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije.
[0083] Ovde su takođe obezbeđeni kompleti za upotrebe, i proizvodni artikli koji obuhvataju bilo koji od CAR, konstruisane imunske efektorske ćelije, izolovane nukleinske kiseline, ili vektore ovog pronalaska. Ovaj pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Načini ostvarivanja i/ili primeri opisa u nastavku koji nisu obuhvaćeni priloženim patentnim zahtevima se ne smatraju delom ovog pronalaska. Bilo koje reference u ovom opisu na postupke lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja čoveka (ili životinje) terapijom (ili radi dijagnoze).
[0085] KRATAK OPIS CRTEŽA
[0086]
[0087] FIG.1A upoređuje strukture CAR baziranog na V<H>H i uobičajenog CAR baziranog na scFv. Šematska struktura na levoj strani prikazuje primer monospecifičnog jednovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata V<H>H domen. Šematska struktura sa desne strane prikazuje primer monospecifičnog jednovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata scFv domen.
[0088] FIG.1B upoređuje strukture CAR baziran na V<H>H sa dva mesta vezivanja antigena i uobičajenog CAR baziranog na scFv sa dva mesta vezivanja antigena. Šematska struktura sa leve strane predstavlja primer CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata dva V<H>H domena. Ta dva V<H>H domena mogu biti ista ili različita. Šematska struktura sa desne strane prikazuje primer CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata dva scFv domena. Ta dva scFv domena mogu biti ista ili različita.
[0089] FIG.1C prikazuju šematske strukture primera dvovalentnih i bispecifičnih CAR baziranih na V<H>H.
[0090] Šematska struktura u gornjem levom panelu prikazuje primer monospecifičnog, dvovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata dva identična V<H>H domena, od kojih se svaki specifično vezuje za epitop 1 antigena A. Šematska struktura u gornjem desnom panelu prikazuje primer monospecifičnog, dvovalentnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata prvi V<H>H domen koji se specifično vezuje za epitop 1 antigena A, i drugi V<H>H domen koji se specifično vezuje za epitop 2 antigena A. Epitop 1 i epitop 2 antigena A mogu da se razlikuju po strukturama i/ili sekvencama. Šematska struktura u donjem levom panelu prikazuje primer bispecifičnog CAR sa ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenom koji obuhvata prvi V<H>H domen koji se specifično vezuje za antigen A, i drugi V<H>H domen koji se specifično vezuje za antigen B. Antigen A i antigen B su različiti antigeni.
[0091] FIG.1D prikazuje šematske strukture primera CAR baziranog na V<H>H sa tri ili više V<H>H domena. CAR mogu da imaju veći broj V<H>H domena međusobno spojenih direktno ili putem peptidnih linkera. V<H>H domeni mogu biti isti ili različiti. Različiti V<H>H domeni mogu specifično da se vezuju za različite epitope na istom antigenu ili različitim antigenima.
[0092] FIG.1E prikazuje primere konstruisanih imunih efektorskih ćelija koje zajedno eksprimiraju dva različita CAR bazirana na V<H>H. Primer konstruisane imunske efektorske ćelije sa leve strane panela zajednički eksprimira dva različita monospecifična, jednovalentna CAR. Primer konstruisane imunske efektorske ćelije u sredini panela zajednički eksprimira monospecifičan, jednovalentan CAR i bispecifičan ili dvovalentan CAR. Primer konstruisane imunske efektorske ćelije u desnom panelu zajednički eksprimira dva različita bispecifične ili dvovalentne CAR. CAR mogu da prepoznaju različite antigene.
[0093] FIG.2A prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecific CARs koja obuhvata razna anti-BCMA (tj., anti-CD269) ili anti-CD38 jednodomenska antitela against ćelijska linija multiplog mijeloma RPMI8226.Luc.
[0094] FIG.2B prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih CAR koji obuhvataju razna anti-BCMA (tj., anti-CD269) ili anti-CD38 jednodomenska antitela protiv ćelijske linije glioblastoma U87MG.Luc.
[0095] FIG.3A prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere bispecifičnih CAR protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc.
[0096] FIG.3B prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere bispecifičnih CAR protiv ćelijske linija multiplog mijeloma RPMI8226.Luc.
[0097] FIG.4 prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere bispecifičnih CAR protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc.
[0098] FIG.5 prikazuje konstrukte primera bispecifičnog CAR koji cilja CD19 i CD20, primer monospecifičnog CAR koji cilja CD19, i primer monospecifičnog CAR koji cilja CD20.
[0099] FIG.6 prikazuje rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti za razne T ćelije. Gornji levi panel prikazuje rezultate netransdukovanih kontrolnih T ćelija. Gornji desni panel prikazuje rezultate T ćelija koje eksprimiraju primer CD19 CAR. Donji levi panel prikazuje rezultate T ćelija koje eksprimiraju CD20 CAR. Donji desni panel prikazuje rezultate T ćelija koje eksprimiraju primer bispecifičnog CD19 × CD20 CAR. FIG.7 prikazuje rezultate in vivo antitumorskog ispitivanja T ćelija koje eksprimiraju primer bispecifičnog CAR koji cilja CD19 i CD20.
[0100] FIG.8A prikazuju rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih, dvovalentnih CAR protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc. Svaki od CAR obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata dva različita anti-BCMA (tj., anti-CD269) sdAb.
[0101] FIG.8B prikazuje rezultate in vitro ispitivanja citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih, dvovalentnih CAR protiv ćelijske linije glioblastoma U87MG.Luc. Svaki od CAR obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata dva različita anti-BCMA (tj., anti-CD269) sdAb.
[0103] DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA
[0104] Ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentni CAR kao što je definisano u patentnim zahtevima. Za razliku od antigen vezujućih fragmenata koji su izvedeni iz konvencionalnih četvoročlanih antitela, sdAb sadrže samo jedan varijabilni domen, kao što je V<H>H. Stoga su sdAb znatno manjih dimenzija u poređenju sa antigen vezujućim fragmentima kao što su scFv, koji se trenutno koriste kao ekstracelularni antigen-vezujući domeni u CAR. Takođe, budući da nema potrebe za uparivanjem teškog lanca i lakog lanca tokom presavijanja sdAb, smanjuje se rizik od nepravilnog presavijanja ekstracelularnog antigenvezujućeg domena kod konstruisanih imunih ćelija koje eksprimiraju CAR bazirane na sdAb. CAR koji sadrže ekstracelularne antigen-vezujuće domene koji uključuju višestruke kopije jednog sdAb ili više sdAb usmerenih na različite epitope ili antigene mogu se lako konstruisati i proizvesti rekombinantno, pružajući efikasnu platformu za pripremu i skrining viševalentnih i multispecifičnih CAR. Takođe, mala veličina sdAb može da omogući pristup CAR skrivenim antigenskim metama i epitopima u tumorskim tkivima.
[0105] [0054] Multispecifični i viševalentni CAR mogu imati poboljšanu efikasnost u odnosu na monospecifične monovalentne CAR za imunoterapiju kancera. Ćelije kancera su genetski nestabilne, što im omogućava da izbegnu ciljane terapije mutacijama ili gubitkom gena koji kodira ciljane antigene. Ciljanjem dva ili više različitih epitopa ili antigena na kancerogenim ćelijama, viševalentni ili multispecifični CAR mogu otežati ćelijama kancera potpuno izbegavanje ciljanja od strane konstruisanih imunih efektorskih ćelija (kao što su T ćelije) koje eksprimiraju CAR. Zbog njihove male veličine, tandemski fuziona jednodomenska antitela, koja se koriste kao ekstracelularni antigen vezujući domeni u viševalentnim ili multispecifičnim CAR ovog otkrivanja, mogu sačuvati svoj individualni strukturni integritet i afinitet vezivanja za ciljane antigene, čime se omogućava efikasno ciljanje svakog epitopa ili antigena pomoću CAR. Konstruisane imunske efektorske ćelije koje eksprimiraju viševalentne ili multispecifične CAR ili koje istovremeno eksprimiraju dva ili više hibridnih antigen receptora koji ciljaju različite tumorske antigene mogu prevazići mehanizme imunog izbegavanja tumora koji su uzrokovani abnormalnostima u obradi i prikazivanju proteina-antigena.
[0106] Shodno tome, jedan način ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuje multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigen receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi kako je definisano u patentnim zahtevima; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu taj prvi antigen je drugačiji od drugog antigena. U nekim načinima ostvarivanja, prvi antigen je BCMA, i drugi antigen je CD38. U nekim načinima ostvarivanja, prvi antigen je CD19, a drugo antigen je BCMA. U nekim primerima koji su opisani kao referenca, prvi antigen je CD19, a drugi antigen je CD20. U nekim primerima, koji su opisani kao referenca prvi antigen je CD19, a drugi antigen je CD22.
[0107] Ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentni himerni antigen receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata prvo i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za antigen kao što je definisano u patentnim zahtevima; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen.
[0108] U drugom načinu ostvarivanja, ovde je obezbeđen viševalentni himerni antigen receptor (CAR) ovog pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za prvi epitop antigena, drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu se prvi epitop razlikuje od drugog epitopa.
[0109] Dalje otkriveno kao referenca su nova anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA, i anti-CD38 jednodomenska antitela i himerni antigen receptori koji obuhvataju bilo koje od navedenih sdAb.
[0110] Ovde su takođe obezbeđene konstruisane imunske efektorske ćelije (kao što su T ćelije) koje obuhvataju CAR) ovog pronalaska, farmaceutska kompozicije ovog pronalaska, i farmaceutska kompozicija ovog pronalaska za upotrebu u postupcima lečenja kancera.
[0112] I. Definicije
[0113] [0060] Praksa ovog pronalaska će, osim ako nije specifično naznačeno drugačije, koristiti konvencionalne postupke virusologije, imunologije, mikrobiologije, molekularne biologije i tehnike rekombinantne DNK u kontekstu stanja tehnike, mnogi od kojih su opisani u nastavku u svrhu ilustracije. Takve tehnike su potpuno objašnjene u literaturi. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001 ); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) i druge slične reference.
[0114] Pojam "antitelo" uključuje monoklonalna antitela (uključujući 4-lančana antitela pune dužine ili antitela samo teškim lancima pune dužine koja imaju imunoglobulinski FC region), kompozicije antitela sa poliepitopskom specifičnošću, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela, dijatela, i jednolančane molekule), kao i fragmente antitela (npr., Fab, F(ab')<2>, i Fv). Pojam "imunoglobulin" (Ig) se ovde koristi naizmenično sa "antitelom". Antitela koja su ovde u razmatranju uključuju jednodomenska antitela, kao što su antitela samo teških lanaca.
[0115] Osnovna jedinica 4-lančano antitela je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva teška (H) lanca. IgM antitelo se sastoji od 5 osnovnih heterotetramernih jedinica zajedno sa dodatnim polipeptidom pod nazivom J lanac, i sadrži 10 antigen vezujućih mesta, dok IgA antitela obuhvataju od 2-5 osnovnih 4-lančanih jedinica koje mogu da polimerizuju kako bi se obrazovali polivalentni sklopovi u kombinaciji sa J lancem. U slučaju IgG, 4-lančana jedinica je generalno oko 150,000 daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su ta dva H lanca međusobno povezana jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki H lanac ima na N-kraju, varijabilni domen (V<H>) praćen sa tri konstantna domena (C<H>) za svaki od α i γ lanaca i četiri C<H>domena za µ i ε izotipove. Svaki L lanac ima na N-kraju, varijabilni domen (V<L>) praćen konstantnim domenom sa njegove druge strane. V<L>je poravnan sa V<H>i C<L>je poravnan sa prvim konstantni domenom teškog lanca (C<H>1). Za određene aminokiselinske ostatke se veruje da obrazuju interfejs između lakog lanca i varijabilnih domena teških lanaca. Uparivanje V<H>i V<L>zajedno obrazuje pojedinačno antigenvezujuće mesto. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, videti npr., Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, strana 71 i poglavlje 6. L lanac iz bilo koje vrste kičmenjaka može da se dodeli jednom od dva jasno različita tipa, pod nazivom kappa I lambda, bazirana na aminokiselinskim sekvencama njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (C<H>), imunoglobulini mogu biti dodeljeni različitim klasama ili izotipovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, sa tečkim lancima koji su označeni sa α, δ, ε, γ i µ, tim redom. γ i α klase su dalje podeljene na podklase na osnovu relativno manjih razlika u C<H>sekvenci i funkciji, npr., ljudi eksprimiraju sledeće podklase: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2.
[0116] Pojam "antitelo samo teškog lanca" ili "HCAb" se odnosi na funkcionalno antitelo, koje obuhvata teške lance, ali mu nedostaju laki lanci koji se obično nalaza u 4-lančanim antitelima. Kamelidne životinje (kao što su kamile, lame, ili alpake) su poznate da proizvode HCAb.
[0117] Pojam "jednodomensko antitelo" ili "sdAb" se odnosi na pojedinačni antigenski vezujući polipeptid sa tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR). Samo sdAb može da se vezuje za antigen bez uparivanja sa odgovarajućim polipeptidom koji sadrži CDR. U nekim slučajevima, jednodomenska antitela su konstruisana od kamelidnih HCAb, i njihovi varijabilnih domena teških lanaca su ovde označeni kao "V<H>Hs". Neki V<H>Hs takođe mogu biti poznati kao nanotela. Kamelidno sdAb je jedno od najmanjih poznatih fragmenata antigen-vezujućeg antitela (videti, npr., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)). Osnovni V<H>H ima sledeću strukturu od N-kraja do C-kraja: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, u kojoj se FR1 do FR4 odnosi na okvirne regione 1 do 4, tim redom, i u kojima se CDR1 do CDR3 odnose na regione za određivanje komplementarnosti 1 do 3.
[0118] "Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano, razdvojeno i/ili oporavljeno od komponente proizvodnog okruženja (npr., prirodnog ili rekombinantnog). Poželjno, izolovani polipeptid nije u vezi sa svim drugim komponentama iz svog proizvodnog okruženja. Komponente kontaminanta proizvodnog okruženja, kao što su one koje nastaju kao rezultat rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji se obično mešaju sa istraživanjem, dijagnostičkim ili terapeutskim upotrebama za antitelo, i mogu da uključuju enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske solute. U poželjnim načinima ostvarivanja, polipeptid će biti prečišćen: (1) do više od 95 mas.% antitela ko što je određeno, na primer, Lorijevom metodom, i u nekim načinima ostvarivanja, do više od 99 mas.%; (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence upotrebom proteinskog sekvenatora, ili (3) do homogenosti putem SDS-PAGE u neredukujućim ili redukujućim uslovima pomoću Coomassie plave ili, poželjno, srebrne mrlje. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih T ćelija budući da najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Ipak obično izolovani polipeptid ili antitelo će biti pripremljeni najmanje jednom fazom prečišćavanja.
[0119] "Varijabilni region" ili "varijabilni domen" antitela se odnosi na amino-terminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca mogu biti označeni sa "V<H>" i "V<L>", tim redom. Ovi domeni su generalno najvarijabilniji delovi antitela (u odnosu na druga antitela iste klase) i sadrže antigen vezujuća mesta. Antitela samo teških lanaca od kamelidnih vrsta imaju jedan varijabilni region teškog lanca, koji je označen sa "V<H>H". V<H>H je samim tim poseban tip V<H>.
[0120] [0067] Pojam "varijabilni" se odnosi na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena razlikuju u velikoj meri u sekvenci među antitelima. V domen posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije jednako raspoređena preko celog luka varijabilnih domena. Umesto toga, koncentrisana je u tri segmenta pod nazivom hipervarijabilni regioni (HVR) i u varijabilnim domenima lakih lanaca i teških lanaca. Više konzervirani delovi varijabilnih domena se zovu okvirni regioni (FR). Od varijabilnih domena nativnih teških i lakih lanaca, svaki obuhvata četiri FR regiona, koji u velikoj meri usvajaju konfiguraciju beta ploče, povezani sa tri HRV, koji obrazuju petlje koje povezuju a u nekim slučajevima obrazuju deo, strukture beta-ploče. HVR u svakom lancu se drže blizu na malom rastojanju FR regionima I, sa HRV iz drugog lanca, doprinose obrazovanju antigen vezujućeg mesta antitela (videti Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu uključeni direktno u vezivanje antitela za antigen, već ispoljavaju efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela.
[0121] Pojam "monoklonalno antitelo" kako se ovde koristi se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju tu populaciju su identična izuzev mogućih mutacija koje se javljaju prirodno i/ili post-translacionih modifikacija (npr., izomerizacija, amidacija) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su izuzetno specifična, pošto su usmerena protiv pojedinačnog antigenskog mesta. Nasuprot pripremama poliklonalnog antitela koje obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinante na antigen. Pored njihove specifičnosti, monoklonalna antitela su poželjna u tome što ih sintetiše hibridomska kultura ili se sintetišu rekombinanto, tako da ih nekontaminiraju drugi imunoglobulini. Modifikator "monoklonalno" označava karakter antitela kao da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi trebalo da se tumači kao da mu je potrebna proizvodnja antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonalna antitela koja se koriste prema ovom pronalasku mogu biti napravljena pomoću raznih tehnika, uključujući, na primer, hibridomski postupak (npr., Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), postupci rekombinantne DNK (videti, npr., američki pat. br.4,816,567), tehnologije prikaza faga (videti, npr., Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), i tehnologije za proizvodnju humanih ili poput humanih antitela kod životinja koje imaju delove ili sve humane imunoglobulinske lokuse ili gene koji kodiraju humane imunoglobulinske sekvence (videti, npr., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol.
[0122] 7:33 (1993); američki pat. br.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol.14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.14: 826 (1996); i Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).
[0123] Pojam "golo antitelo" se odnosi na antitelo koje nije konjugovano na citotoksičnoj grupi ili radioobeležju.
[0124] Pojmovi "antitelo pune dužine", "intaktno antitelo" ili "celo antitelo" se naizmenično koriste kako bi se označilo antitelo u svojoj suštinski intaktnom obliku, nasuprot fragmenta antitela. Specifično, 4-lančana antitela pune dužine uključuju ona sa teškim i lakim lancima koja uključuju Fc region. Antitela samo teških lanaca pune dužine uključuju teški lanac (kao što je V<H>H) i Fc region. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr., konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijante njihove aminokiselinske sekvence . u nekim slučajevima, intaktno antitelo može da ima jednu ili više efektorskih funkcija.
[0125] "Fragment antitela" obuhvata deo intaktnog antitela, poželjno antigen vezujući i/ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')<2>i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (videti američki pat. br.5,641,870, primer 2; Zapata et al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 [1995]); molekule jednolančanog antitela; jednodomenska antitela (kao što je V<H>H), i multispecifična antitela koja nastaju od fragmenata antitela. Digestija dva antitela papainom je proizvela dva identična antigen-vezujuća fragmenta, nazvana "Fab" fragmenti, i rezidualni "Fc" fragment, oznaku koja odražava mogućnost brze kristalizacije. Fab fragment se sastoji od čitavog L lanca zajedno sa domenom varijabilnog regiona H lanca (V<H>), I prvog konstantnog domena teškog lanca (C<H>1). Svaki Fab fragment je jednovalentan u odnosu na vezivanje antigena, tj., ima jedno antigen-vezujuće mesto.
[0126] Lečenje pepsinom antitela obezbeđuje jedan veliki F(ab')<2>fragment koji grubo odgovara dva disulfidno povezana Fab fragmenta sa različitim antigenski vezujućim dejstvom i dalje ima mogućnost unakrsnog povezivanja antigena. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju nekoliko dodatnih ostataka na karboksi kraju C<H>1 domena uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. Fab'-SH je ovde oznaka za Fab' u kojem citeinski ostatak(ci) konstantnih domena nose slobodnu tiolsku grupu. Antitela F(ab')<2>fragmenta su originalno proizvedena u obliku parova Fab' fragmenta koji imaju zglobne cisteine između njih. Druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela su takođe poznata.
[0127] Fc fragment obuhvata karboksi-terminalne delove oba H lanca koja zajedno drže disulfidi.
[0128] Efektorske funkcije antitela su određivane po sekvencama u Fc regionu, pri čemu je taj region takođe reorganizovan po Fc receptorima (FcR) pronađenim na određenim tipovima ćelija.
[0129] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži mesto potpunog prepoznavanja i vezivanja antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera domena varijablnog regiona jednog teškog i lakog lanca u čvrstom, nekovalentnom spoju. Od uvijanja ova dva domena proizlazi šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje doprinose aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i daju antitelu specifičnost vezivanja antigena. Međutim, čak i jedna varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, iako sa nižim afinitetom od celog vezujućeg mesta.
[0130] [0074] "Jednolančani Fv" takođe skraćeno kao "sFv" ili "scFv" su fragmenti antitela koji sadrže V<H>i V<L>domene antitela povezane u jedan polipeptidni lanac. Poželjno je da polipeptid sFv dodatno sadrži polipeptidni linker između V<H>i V<L>domena koji omogućava sFv da obrazuje željenu strukturu za vezivanje antigena. Radi pregleda sFv, videti Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
[0131] "Funkcionalni fragmenti" ovde opisanih antitela sadrže deo intaktnog antitela, generalno uključujući vezivanje antigena ili varijabilni region intaktnog antitela ili Fc region antitela koje zadržava ili ima modifikovanu sposobnost vezivanja FcR. Primeri fragmenata antitela uključuju linearna antitela, jednolančane molekule antitela i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
[0132] Pojam "dijatela" odnosi se na male fragmente antitela pripremljene konstruisanjem fragmenata sFv (videti prethodni stav) sa kratkim linkerima (oko 5-10) ostataka) između V<H>i V<L>domena tako da se postiže međulančano, ali ne unutarlančano uparivanje V domena, što dovodi do dvovalentnog fragmenta, tj. fragmenta koji ima dva antigen-vezujuća mesta. Bispecifična dijatela su heterodimeri dva "unakrsna" sFv fragmenta u kojima su V<H>i V<L>domeni dva antitela prisutni na različitim polipeptidnim lancima. Dijatela su detaljnije opisana u npr., EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
[0133] Monoklonalna antitela ovde posebno uključuju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču iz određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(a) identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja proističu iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (američki pat. br.4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od značaja ove uključuju PRIMATTZFD<®>antitela pri čemu antigenski vezujući region antitela je izveden iz antitela proizvedenog iz, npr., imunizovanja makaki majmuna sa antigenom od značaja. Kako se ovde koristi, "humanizovano antitelo" se koristi kao podskup "himernog antitela."
[0134] "Humanizovani" oblici nehumanih (npr.kamelidnih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz nehumanog imunoglobulina. U nekim načinima ostvarivanja, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primaoca) u kojem su ostaci iz HVR (u nastavku definisanog) primaoca zamenjeni ostacima iz HVR nehumane vrste (antitela donora) kao što su miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, okvirni ("FR") ostaci humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim nehumanim ostacima. Dalje, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije mogu da se naprave za dalje poboljšanje učinka antitela, kao što je afinitet vezivanja. Generalno, humanizovano antitelo će obuhvatati uglavnom sve od najmanje jednog, a uobičajeno dva varijabilna domena, u kojima sve ili gotovo sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima nehumane imunoglobulinske sekvence, i sve ili uglavnom sve od FR regiona su one humane imunoglobulinske sekvence, iako FR regioni mogu da uključuju jednu ili više pojedinačnih supstitucija FR ostataka koje poboljšavaju učinak antitela, kao što je afinitet vezivanja, izomerizacija, imunogenost, itd. Broj ovih supstitucija aminokiselina u FR je obično ne više od 6 u H lancu, a u L lancu, ne više od 3.
[0135] Humanizovano antitelo će opciono takođe obuhvatati najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično onog od humanog imunoglobulina. Za dodatne pojedinosti, videti, npr., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
[0136] 2:593-596 (1992). Videti takođe, na primer, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994); i američki pat. br.6,982,321 i 7,087,409.
[0137] "Humano antitelo" je antitelo koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj od antitela proizvedenog od strane ljudi i/ili je napravljeno pomoću bilo koje od tehnika za pravljenje humanih antitela kao što je ovde otkriveno. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje obuhvata nehumane antigen-vezujuće ostatke. Humana antitela mogu da se proizvede različitim tehnikama poznatim u ovoj oblasti, uključujući biblioteke prikaza
[0138] faga. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Za pripremu humanih monoklonalnih antitela su postupci opisani u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Videti takođe van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela mogu biti pripremljena primenom antigena transgenoj životinji koji je modifikovan da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr., imunizovani ksenomiševi (videti, npr., američki pat. br.6,075,181 i 6,150,584 vezano za XENOMOUSE<™>tehnologiju). Videti takođe, na primer, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) vezano za humana antitela koja se stvaraju putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija.
[0139] Pojam "hipervarijabilni region," "HVR," ili "HV," kada se ovde koristi se odnosi na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili obrazuju strukturno definisane petlje. Generalno, sdAb se sastoje od tri HVR (ili CDR): HVR1 (ili CDR1), HVR2 (ili CDR2) i HVR3 (ili CDR3). HVR3 prikazuje najveću raznolikost od tri HVR i veruje se da igra jedinstvenu ulogu u davanju fine specifičnosti antitelima. Videti, , Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol.3:733-736 (1996).
[0140] Pojam "region za određivanje komplementarnosti" ili "CDR" se koriste da označe hipervarijabilne regione kao što je definisano Kabatovim sistemom. Videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.
[0141] (1991).
[0142] [0082] Ovde je obuhvaćen određeni broj HVR delineacija koje su u upotrebi. Kabatovi regioni koji određuju komplementarnost (CDR) se baziraju na varijabilnosti sekvenci i najčešće su u upotrebi(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se umesto toga odnosi na mesto strukturnih petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). AbM HVR predstavljaju neki kompromis između Kabatovih HVR i Chothia strukturnih petlji, i koristi ih softver za modelovanje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. "Kontaktni" HVR su bazirani na analiti dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci od svakog od ovih HVR su zabeleženi u tabeli 1 u nastavku.
[0143] Tabela 1. HVR delineacije
[0146]
[0149] HVR mogu da obuhvataju "produžene HVR" kao što sledi: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u V<L>i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102, ili 95-102 (H3) u V<H>. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabat et al., supra, za svaku od ovih definicija.
[0150] Aminokiselinski ostaci sdAb (kao što su V<H>H) su numerisani prema opštem numerisanju za V<H>domene koje je dao Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No.91), kako se primenjuju naV<H>H domene iz Kamelide u članku Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun.23; 240 (1-2): 185-195. Prema ovom numerisanju, FR1 od V<H>H uključuje aminokiselinske ostatke na položajima 1-30, CDR1 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 31-35, FR2 od V<H>H uključuje aminokiseline na položajima 36-49, CDR2 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 50-65, FR3 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 66-94, CDR3 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 95-102, a FR4 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 103-113. U tom pogledu, treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u ovoj oblasti za V<H>domene i za V<H>H domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR-ova može varirati i ne mora odgovarati ukupnom broju aminokiselinskih ostataka naznačenih Kabatovim numerisanjem (to jest, jedan ili više položaja prema Kabatovom numerisanju možda neće biti zauzeti u stvarnoj sekvenci ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka od broja dopuštenog Kabatovim numerisanjem).
[0151] [0085] Ekspresija "varijabilni-domen numerisanje ostataka po sistemu Kabata" ili "numerisanje položaja aminokiselina po sistemu Kabata," i njihove varijacije, se odnosi na sistem za numerisanje koji se koristi za varijabilne domene teških lanaca ili varijabilne domene lakih lanaca kompilacije antitela kao kod Kabat et al., supra. Korišćenjem ovog sistema numerisanja, stvarna linearna sekvenca aminokiselina može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili umetanju u FR ili HVR varijabilne domene. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje jedno umetanje aminokiseline (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 od H2 i umetnute ostatke (npr. ostatke 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) nakon FR ostatka 82 teškog lanca. Kabatovo numerisanje ostataka može da se odredi za dato antitelo poravnavanjem regiona homologije sekvence antitela sa "standardnim" Kabatovim numerisanjem sekvence.
[0152] Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka u teškom lancu imunoglobulina je ono za EU indeks kao kod Kabata et al., supra. "EU indeks kao kod Kabata" se odnosi na numerisanje ostataka humanog IgG1 EU antitela.
[0153] "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji se razlikuju od HVR ostataka kako je ovde definisano.
[0154] "Humani konsenzusni okvir" ili "humani okvir primaoca" je okvir koji predstavlja aminokiselinske ostatke koji se najčešće pojavljuju prilikom izbora humanog imunoglobulina V<L>ili V<H>okvirne sekvence. Generalno, odabir humanog imunoglobulina V<L>ili V<H>sekvenci je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao kod Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Primeri uključuju za V<L>, podgrupa može biti podgrupa kapa I, kapa II, kapa III ili kapa IV kao kod Kabata et al., supra. Dodatno, za VH, podgrupa može biti podgrupa I, podgrupa II ili podgrupa III kao kod Kabata et al. Alternativno, ljudski konsenzusni okvir može da se izvede iz gore navedenog u kojem su određeni ostaci, kao kada se ostatak ljudskog okvira bira na osnovu njegove homologije sa okvirom donora poravnavanjem sekvence okvira donora sa kolekcijom različitih humanih okvirnih sekvenci. Humani okvir primaoca "izveden iz" humanog imunoglobulinskog okvira ili ljudskog konsenzusnog okvira može da sadrži istu njihovu aminokiselinsku sekvencu ili može da sadrži već postojeće promene aminokiselinske sekvence. U nekim načinima ostvarivanja, broj već postojećih promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje.
[0155] "Modifikacija aminokiselina" na određenom položaju, npr. Fc regiona, se odnosi na supstituciju ili brisanje specifičnog ostatka, ili umetanje najmanje jednog aminokiselinskog ostatka uz specifični ostatak. Umetanje "uz" određeni ostatak znači umetanje unutar jednog do dva njegova ostatka.
[0156] Umetanje može biti N-terminalna ili C-terminalna na konkretnom ostatku. Poželjna modifikacija aminokiseline je ovde supstitucija.
[0157] [0090] Antitelo "sazrelog afiniteta" je ono sa jednom ili više promena u jednom ili više svojih HVR koje dovode do poboljšanja afiniteta antitela za antigen, u odnosu na roditeljsko antitelo koje ne poseduje te promene. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo sazrelog afiniteta ima nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljani antigen. Antitela sazrelog afiniteta proizvode se postupcima poznatim u ovoj oblasti. Na primer, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje sazrevanje afiniteta mešanja V<H>- i V<L>-domena. Nasumičnu mutageneza HVR i/ili okvirne ostatke opisuju, na primer: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); i Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
[0158] Kako se ovde koristi, pojam "specifično se vezuje," "specifično prepoznaje," ili je "specifičan za" se odnosi na merljive i reproduktivne interakcije kao što je vezivanje između cilja i antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb), koji određuje prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula uključujući biološke molekule. Na primer, antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji specifično veže cilj (koji može biti epitop) je antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji veže ovaj cilj sa većim afinitetom, aviditetom, lakše i/ili sa dužim trajanjem nego što veže druge ciljeve. U nekim načinima ostvarivanja, stepen vezivanja antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb) za nepovezani cilj manji je od oko 10% vezivanja antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb) za cilj prema merenju, npr., radioimunom metodom (RIA). U nekim načinima ostvarivanja, antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji specifično vezuje cilj ima konstantu disocijacije (Kd) od ≦1 µM, ≦100 nM, ≦10 nM, ≦1 nM ili ≦0,1 nM . U nekim načinima ostvarivanja, antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) specifično vezuje epitop za protein koji je konzerviran među proteinima različitih vrsta. U nekim načinima ostvarivanja, specifično vezivanje može da uključuje, ali ne zahteva isključivo vezivanje.
[0159] Pojam "specifičnost" se odnosi na selektivno prepoznavanje antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb) za određeni epitop antigena. Prirodna antitela, na primer, su monospecifična. Pojam "multispecifičan" kako se ovde koristi označava da antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) ima dva ili više mesta za vezivanje antigena od kojih najmanje dva vezuju različit antigen ili različit epitop istog antigena. "Bispecifičan" kako se ovde koristi označava da antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) ima dve različite antigen-vezujuće specifičnosti. Pojam "monospecifičan" CAR kako se ovde koristi označava antigenski vezujući protein (kao što je CAR ili sdAb) koji ima jedno ili više mesta vezivanja od kojih svako veže isti epitop istog antigena.
[0160] Pojam "valentan" kako se ovde koristi označava prisustvo naznačenog broja mesta vezivanja kod antigen-vezujućeg proteina (kao što je CAR ili sdAb). Prirodno antitelo na primer ili antitelo pune dužine ima dva mesta vezivanja i dvovalentno je. Kao takvo, pojmovi "trovalentno", "četvorovalentno", "petovalentno" i "heksavalentno" označava prisustvo dva vezujuća mesta, tri vezujuća mesta, četiri vezujuća mesta, pet vezujućih mesta, i šest vezujućih mesta, tim redom, u antigen-vezujućem proteinu (kao što je CAR ili sdAb).
[0161] [0094] " Efektorske funkcije antitela" se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (Fc regionu nativne sekvence ili varijanti Fc regiona aminokiselinske sekvence) antitela, i variraju sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisnu od komplementa; vezivanje sa Fc receptorom; citotoksičnost posredovana ćelijama u zavisnosti od antitela (ADCC); fagocitoza; smanjena regulacija receptora na ćelijskoj površini (npr. B ćelijski receptori); i aktivacija B ćelija. "Smanjena ili svedena na minimum" efektorska funkcija antitela označava onu koja je smanjena za najmanje 50% (alternativno 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) iz divljeg tipa ili nemodifikovanog antitela. Stručnjak iz oblasti može lako da odredi i izmeri efektorsku funkciju antitela. U poželjnom primeru, pogođene su efektorske funkcije antitela vezivanja komplementa, citotoksičnosti zavisne od komplementa i citotoksičnosti zavisne od antitela. U nekim primerima, efektorska funkcija je eliminisana mutacijom u konstantnom regionu koja je eliminisala glikozilaciju, npr., "mutaciju bez efektora." U jednom aspektu, mutacija bez efektora je mutacija N297A ili DANA (D265A+N297A) u C<H>2 regionu. Shields et al., J. Biol. Chem.276 (9): 6591-6604 (2001).
[0162] Alternativno, dodatne mutacije koje rezultiraju smanjenom ili eliminiranom efektorskom funkcijom uključuju: K322A i L234A/L235A (LALA). Alternativno, efektorska funkcija može da se smanji ili eliminiše tehnikama proizvodnje, kao što je ekspresija u ćelijama domaćina koje ne glikozilišu (npr. E. coli.) ili koje dovode do promenjenog obrasca glikozilacije koji je neefektivan ili manje efektivan u promovisanju efektorske funkcije (npr., Shinkawa et al., J. Biol. Chem.278(5): 3466-3473 (2003).
[0163] " Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela" ili ADCC odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojem izlučeno Ig vezano na Fc receptore (FcRs) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofazi) omogućavaju da se ove citotoksične efektorske ćelije specifično vezuju za ciljanu ćeliju koja nosi antigen i zatim ubijaju ciljanu ćeliju citotoksinima. Antitela "naoružavaju" citotoksične ćelije i potrebna su za ubijanje ciljanih ćelija ovim mehanizmom. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija Fc na hematopoetskim ćelijama sažeta je u tabeli 3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9: 457-92 (1991). Za procenu ADCC aktivnosti molekule od značaja, in vitro ADCC test, kao što je onaj opisan u američkom pat. br.5,500,362 ili 5,821,337 može da se izvede. Korisne efektorske ćelije za takva ispitivanja uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može da se proceni ADCC aktivnost molekula od značaja in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj otkriven u Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).
[0164] [0096] Pojam "Fc region" se ovde koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući prirodne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG obično se definiše da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226 ili od Pro230 do njegovog karboksilnog kraja. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu za numerisanje) Fc regiona može da se ukloni, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Prema tome, sastav intaktnih antitela može da sadrži populacije antitela sa svim uklonjenim K447 ostacima, populacije antitela bez uklonjenih K447 ostataka i populacije antitela koje imaju mešavinu antitela sa i bez K447 ostatka. Pogodni Fc regioni nativne sekvence za upotrebu u ovde opisanim antitelima uključuju humani IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 i IgG4.
[0165] "Afinitet vezivanja" se generalno donosi na snagu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja jednog molekula (npr. antitelo ili CAR) i njegov partner u vezivanju (npr. antigen). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" se odnosi na intrinzični afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitelo i antigen, ili CAR i antigen). Afinitet molekula X prema svom partneru Y generalno može da se prikaže konstantom disocijacije (Kd). Afinitet može da se meri uobičajenim postupcima poznatim u ovoj oblasti, uključujući one opisane ovde. Antitela sa niskim afinitetom generalno sporo vezuju antigen i imaju tendenciju da se lako odvoje, dok antitela visokog afiniteta generalno brže vezuju antigen i imaju tendenciju da ostanu duže vezana. U ovoj oblasti su poznati različiti postupci merenja afiniteta vezivanja, od kojih se svaki može koristiti. Specifični ilustrativni i primeri za merenje afiniteta vezivanja su opisani u nastavku.
[0166] "Blokirajuće" antitelo ili "antagonističko" antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena koji vezuje. U nekim načinima ostvarivanja, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili potpuno inhibiraju biološku aktivnost antigena.
[0167] "Agonist" ili aktivirajuće antitelo predstavlja ono koje pojačava ili pokreće signaliziranje antigenom za koji se vezuje. U nekim načinima ostvarivanja, antitela agonista uzrokuju ili aktiviraju signaliziranje bez prisustva prirodnog liganda.
[0168] "Procenat (%) identiteta sekvence aminokiselina" i "homologija" u odnosu na sekvencu peptida, polipeptida ili antitela definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u specifičnom peptidu ili polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje u svrhu određivanja procenta identiteta aminokiselinske sekvence može da se postigne na različite načine koji su poznati stručnjaku iz oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili MEGALIGN<™>(DNASTAR) softver. Stručnjaci iz oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja celom dužinom sekvenci koje se porede.
[0169] [0101] "Himerni antigen receptor" ili "CAR" kako se ovde koristi se odnosi na genetski modifikovane receptore, koji mogu da se koriste za presađivanje jedne ili više specifičnosti antigena na imunske efektorske ćelije, kao što su T ćelije. Neki CAR su takođe poznati kao "veštački T-ćelijski receptori", "himerni T-ćelijski receptori" ili "himerni imuni receptori". CAR obuhvata ekstracelularni antigenski vezujući domen specifičan za jedan ili više antigena (kao što su tumorski antigeni), transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen T ćelije i/ili drugih receptora. "CAR-T" se odnosi na T ćeliju koja eksprimira CAR.
[0170] "Izolovani" molekul nukleinske kiseline koja kodira CAR ili ovde opisano sdAb je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminiranog molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u okruženju u kojem je proizveden. Poželjno, izolovana nukleinska kiselina nije povezana sa svim komponentama koje su povezane sa proizvodnim okruženjem. Izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide i antitela ovde su u obliku koji je različit od oblika ili okruženja u kojem se nalaze u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se stoga razlikuju od nukleinske kiseline koja kodira polipeptide i antitela koja ovde prirodno postoje u ćelijama.
[0171] Pojam "kontrolne sekvence" se odnosi na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promoter, opciono sekvencu operatera i vezujuće mesto ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotere, poliadenilacione signale, i pojačivače.
[0172] Nukleinska kiselina je "operativno povezana" kada se postavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider operativno povezan sa DNK za polipeptid ako se eksprimira kao predprotein koji učestvuje u izlučivanju polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakšava translaciju. Generalno, "operativno povezan" znači da su sekvence DNK koje se povezuju susedne, a u slučaju sekretornog lidera, uzastopne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa uobičajenom praksom.
[0173] Pojam "vektor," kako se ovde koristi, se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji može da razmnožava drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Pojam uključuje vektor kao samoreplicirajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori mogu da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde nazivaju "ekspresioni vektori."
[0174] Kako se ovde koristi, pojam "autologni" se odnosi na bilo koji materijal izvedene iz istog pojedinca sa kojim se kasnije ponovo uvodi u pojedinca.
[0175] "Alogeni" se odnosi na kalem izveden iz različitog pojedinca iste vrste.
[0176] Pojam "transfektovan" ili "transformisan" ili "transdukovan" kako se ovde koristi se odnosi na postupak kojim se egzogena nukleinska kiselina prenosi ili uvodi u ćeliju domaćina. "Transfektovana" ili "transformisana" ili "transdukovana" ćelija je ona koja je transfektovana, transformisana ili transdukovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Ćelija uključuje primarnu predmetnu ćeliju i njeno potomstvo.
[0177] Kako se ovde koriste, izrazi "ćelija", "ćelijska linija”, i "ćelijska kultura" se naizmenično koriste i sve takve oznake uključuju potomstvo. Prema tome, reči "transfektanti" i "transfektovane ćelije" uključuju primarnu predmetnu ćeliju i kulture koje su iz nje izvedene bez obzira na broj prenosa. Takođe se podrazumeva da svo potomstvo ne mora biti potpuno identično po sadržaju DNK, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Uključeno je varijantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je pretraženo u izvorno transformisanoj ćeliji.
[0178] Pojmovi "ćelija domaćina," "ćelijska linija domaćina," i "ćelijska kultura domaćina" se koriste naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćina uključuju "transformante" i "transformisane ćelije," koje uključuju primarno transformisane ćelije i potomstvo izvedeno iz njih bez obzira na broj prolaza. Potomstvo ne mora biti potpuno identično po sadržaju nukleinske kiseline roditeljskoj ćeliji, ali može da sadrži mutacije. Ovde je uključeno mutirano potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao pretraženo ili odabrano u izvorno transformisanoj ćeliji.
[0179] Kako se ovde koristi, "lečenje" ili "koji se leči" predstavlja pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata uključujući kliničke rezultate. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali bez ograničenja na, jedan ili više od sledećih: ublažavanje jednog ili više simptoma koji nastaju od ove bolesti, smanjivanje opsega bolesti, stabilizovanje bolesti (npr., sprečavanje ili odlaganje pogoršanja bolesti), sprečavanje ili odlaganje širenja (npr., metastaza) bolesti, sprečavanje ili odlaganje ponovnog vraćanja bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje stope bolesti, obezbeđivanje remisije (delimične ili ukupne) bolesti, smanjenje doze jednog ili više lekova potrebnih za lečenje bolesti, odlaganje napredovanja bolesti, povećanje kvaliteta života, i/ili produžavanje preživljavanja. Takođe se pod "lečenjem" misli na smanjenje patološke posledice kancera. Upotrebe ovog pronalaska uzimaju jedan ili više aspekata lečenja.
[0180] Kako se ovde koristi, "pojedinac" ili "subjekat" se odnosi na sisara, uključujući, ali bez ograničenja na, čoveka, govedo, konja, mačku, psa, glodara ili primata. U nekim načinima ostvarivanja, taj pojedinac je čovek.
[0181] [0113] Pojam "efektivna količina" kako se ovde koristi se odnosi na količinu agensa, kao što je jednodomensko antitelo, konstruisana imunska efektorska ćelija, ili njihova farmaceutska kompozicija, dovoljnu da se leči naznačeni poremećaj, stanje ili bolest kao što je poboljšanje, ublažavanje, smanjenje i/ili odlaganje jednog ili više njegovih simptoma. U odnosu na kancer, efektivna količina uključuje količinu dovoljnu da izazove smanjenje tumora i/ili da smanji stopu rasta tumora (kao što je suzbijanje rasta tumora) ili da spreči ili odloži drugu neželjenu proliferaciju ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, efektivna količina je količina dovoljna da odloži razvoj. U nekim načinima ostvarivanja, efektivna količina je količina dovoljna da spreči ili odloži ponovno pojavljivanje. Efektivna količina može da se primeni u jednoj ili više primena. Efektivna količina leka ili kompozicije može da: (i) smanji broj ćelija kancera; (ii) smanji veličinu tumora; (iii) inhibira, uspori, u određenoj meri uspori i poželjno zaustavi infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; (iv) inhibira (tj. uspori do neke mere i poželjno zaustavi) metastazu tumora; (v) inhibira rast tumora; (vi) spreči ili odloži pojavu i/ili recidiv tumora; i/ili (vii) u određenoj meri ublaži jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom.
[0182] "Adjuvansno okruženje" se odnosi na kliničko okruženje u kojem pojedinac u anamnezi ima kancer, i generalno (ali ne nužno) je reagovao na terapiju, što uključuje, ali nije ograničeno na, operaciju (npr. hiruršku resekciju), radioterapiju i hemoterapiju. Međutim, zbog svoje istorije kancera, za te pojedince se smatra da su u riziku od razvoja bolesti. Lečenje ili primena u "adjuvansnom okruženju" odnosi se na naknadni način lečenja. Stepen rizika (npr. kada se pojedinac u adjuvansnom okruženju smatra "visokorizičnim" ili "niskorizičnim") zavisi od nekoliko faktora, najčešće od opsega bolesti pri prvom lečenju.
[0183] "Neoadjuvansno okruženje" se odnosi na kliničko okruženje u kojem se postupak izvodi pre primarne/definitivne terapije.
[0184] Kako se ovde koristi, "odlaganje" razvoja kancera znači da se odloži, spreči, uspori, ometa, stabilizuje, i/ili odloži razvoj bolesti. Ovo odlaganje može da traje različito dugo, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedincu koji se leči. Kao što je za stručnjaka iz ove oblasti evidentno, dovoljno ili značajno odlaganje može, u stvari, da obuhvati sprečavanje, time što pojedinac ne razvij bolest. Postupak koji "odlaže" razvoj kancera je postupak koji smanjuje verovatnoću razvoja bolesti u određenom vremenskom okviru i/ili smanjuje opseg bolesti u određenom vremenskom okviru, u poređenju sa nekorišćenjem postupka. Takva poređenja se obično zasnivaju na kliničkim ispitivanjima, uz korišćenje statistički značajnog broja pojedinaca. Razvoj kancera može da se otkrije standardnim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kompjuterizovanu aksijalnu tomografiju (CAT skeniranje), magnetsku rezonancu (MRI), ultrazvuk abdomena, testove zgrušavanja, arteriografiju ili biopsiju. Razvoj takođe može da se odnosi na napredovanje kancera koje u početku može da se otkrije i uključuje pojavu, recidiv i početak.
[0185] Pojam "farmaceutska formulacija" se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava biološko dejstvo aktivnog sastojka da bude efektivan, i da ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekata kojem se formulacija daje. Takve formulacije su sterilne. "Sterilna" formulacija je aseptična ili ne sadrži žive mikroorganizme i njihove pore.
[0186] [0118] "Nosači" kako se ovde koristi uključuje farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense, ili stabilizatore koji su netoksični za ćeliju ili sisara koji je izložen dozama i koncentracijama u upotrebi. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferisani rastvor. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijumov hlorid; heksametonijumhlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezsorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptid male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protuioni koji stvaraju so kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN<™>, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG).
[0187] "Razblaživač" od značaja je onaj koji je farmaceutski prihvatljiv (siguran i netoksičan za davanje ljudima) i koristan je za pripremu tečne formulacije, kao što je formulacija koja se rekonstituiše nakon liofilizacije. Primeri razblaživača uključuju sterilnu vodu, bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferisani rastvor (npr. fosfatno puferisani fiziološki rastvor), sterilni slani rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. U alternativnom načinu ostvarivanja, razblaživači mogu da uključuju vodene rastvore soli i/ili pufere.
[0188] "Konzervans" je jedinjenje koje može da se doda u formulacije kako bi se smanjila bakterijska aktivnost. Dodavanje konzervansa može, na primer, da olakša proizvodnju formulacije za višestruku upotrebu (više doza). Primeri potencijalnih konzervansa uključuju oktadecildimetilbenzil amonijumov hlorid, heksametonijum-hlorid, benzalkonijum-hlorid (mešavina alkilbenzildimetilamonijevih hlorida u kojoj su alkilne grupe predstavljaju dugolančana jedinjenja) i benzetonijum-hlorid. Ostale vrste konzervansa uključuju aromatske alkohole kao što su fenol, butil i benzil alkohol, alkil parabene kao što su metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol. Najpoželjniji konzervans ovde je benzil alkohol.
[0189] "Stabilna" formulacija je ona u kojoj protein u njoj suštinski zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost i integritet nakon skladištenja. Razne analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina dostupne su u ovoj oblasti i pregledane su u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev.10: 29-90 (1993). Stabilnost može da se meri izabranoj temperaturi za izabrano vremensko razdoblje. Za brzi skrining, formulacija može da se drži na 40°C tokom 2 nedelje do 1 meseca, i tokom tog vremena se meri stabilnost. Ako je potrebno da se formulacija čuva na 2-8°C, generalno bi formulacija trebalo da bude stabilna 30°C ili 40°C najmanje 1 mesec i/ili stabilna na 2-8°C najmanje 2 godine. Tamo gde je potrebno da se formulacija čuva na 30°C, generalno bi formulacija trebalo da bude stabilna najmanje 2 godine na 30°C i/ili stabilna na 40°C najmanje 6 meseci. Na primer, stepen agregacije tokom skladištenja može da se koristi kao pokazatelj stabilnosti proteina. Prema tome, "stabilna" formulacija može biti ona u kojoj je manje od oko 10%, a poželjno manje od oko 5% proteina prisutno kao agregat u formulaciji. U drugim načinima ostvarivanja, može da se odredi bilo kakvo povećanje stvaranja agregata tokom skladištenja formulacije.
[0190] [0122] "Rekonstituisana" formulacija je ona koja se priprema rastvaranjem liofilizovanog proteina ili formulacije antitela u razblaživaču tako da se protein rasprši u njemu. Rekonstituisana formulacija je pogodna za davanje (npr. supkutanom primenom) pacijentu koji bi trebalo da se leči proteinom od značaja i, u nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, može biti pogodan za parenteralnu ili intravensku primenu.
[0191] "Izotonična" formulacija je ona koja suštinski ima isti osmotski pritisak kao ljudska krv. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 250 do 350 mOsm. Pojam "hipotoničan" opisuje formulaciju sa osmotskim pritiskom ispod ljudskog krvnog pritiska. Shodno tome, pojam "hipertoničan" se koristi za opisivanje formulacije sa osmotskim pritiskom iznad ljudskog krvnog pritiska. Izotoničnost može da se meri pomoću npr. pritiska pare ili tipa osmometra za smrzavanje leda. Formulacije ovog pronalaska su hipertonične kao rezultat dodatka soli i/ili pufera.
[0192] Podrazumeva se da načini ostvarivanja ovog pronalaska koji su obezbeđeni uključuju “koji se sastoji od” i/ili "koji se suštinski sastoji od' načine ostvarivanje.
[0193] Pozivanje na "oko" vrednost ili parametar ovde uključuje (i opisuje) varijacije koje su usmerena na onu vrednost ili parametar per se. Na primer, opis koji se odnosi na "oko X" uključuje opis "X ".
[0194] Kako se ovde koristi, pozivanje na "nije" vrednost ili parametar generalno znači i opisuje "osim" vrednosti ili parametra. Na primer, postupak se ne koristi za lečenje kancera tipa X znači da se taj postupak koristi za lečenje drugih vrsta kancera osim X.
[0195] Pojam "oko X-Y" koji se ovde koristi ima isto značenje kao "oko X do oko Y."
[0196] Kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "neki," "ili," i "taj" uključuju reference u množini ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0198] II. Jednodomenska antitela
[0199] Ovde su kao referenca otkrivena jednodomenska antitela, njihovi antigen-vezujući fragmenti, I entigen vezujući proteini koji obuhvataju bilo koje od jednodomenskih antitela. Primeri jednodomenskih antitela su navedeni u tabeli 2 u nastavku.
[0201] Tabela 2. Primeri jednodomenskih antitela.
[0203]
[0204]
[0205]
[0207] Primeri Anti-CD38 jednodomenskih antitela
[0208]
[0210] *= sdAb koje obuhvata CAR ovog pronalaska.
[0212] Anti-CD19 jednodomenska antitela
[0213] Kao referenca ovde su otkrivena izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za CD19, kao što je humani CD19. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 modulira CD19 dejstvo. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 je antitelo antagonista.
[0214] U nekim načinima ostvarivanja CAR pronalaska obuhvata jednodomensko antitelo anti-CD19 koje obuhvata jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 76. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 može biti kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 može biti humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 može da sadrži humani okvir primaoca, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0215] U nekim načinima ostvarivanja, CAR ovog pronalaska obuhvata anti-CD19 najmanje dva ili sva tri CDR odabrana između (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 1; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 2; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 3. U načinima ostvarivanja, sdAb anti-CD19 je kamelidno . U načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 sadrži ljudski okvir primaoca, npr., ljudski imunoglobulinski okvir ili ljudski konsenzusni okvir.
[0216] [0133] U nekim načinima ostvarivanja, CAR ovog pronalaska, obuhvata anti-CD19 jednodomensko antitelo anti-CD19 koje obuhvata tri CDR koja obuhvataju: (a) CDR1 sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od SEQ ID NO:1; (b) CDR2 sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2; i (c) CDR3 sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:3. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, CDR sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), umetanja, ili brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali jednodomensko antitelo anti-CD19 koje obuhvata tu sekvencu zadržava mogućnost vezivanja za CD19. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 je zrelo u smislu afiniteta. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 obuhvata humani okvir akceptora, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0217] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD19 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1;
[0218] (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima, anti-CD19 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-BCMA je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 obuhvata humani okvir akceptora, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0219] U nekim ostvarenjima, CAR ovog pronalaska obuhvata jednodomensko antitelo anti-CD19 koje obuhvata V<H>H domen sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 76. U nekim načinima ostvarivanja, V<H>H sekvenca sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identiteta sadrži supstitucije
[0220] (npr., konzervativne supstitucije), umetanja, ili brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali jednodomensko antitelo anti-CD19 koje obuhvata tu sekvencu koja zadržava mogućnost vezivanja za CD19. U nekim načinima ostvarivanja, ukupno 1 do 10 aminokiselina su supstituisane, umetnute i/ili obrisane u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 76. U nekim načinima ostvarivanja, supstitucije, umetanja, ili brisanja se javljaju u regionima izvan CDR (tj., u FR). Opciono, jednodomensko antitelo anti-CD19 obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 76, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo anti-CD19 obuhvata humani okvir akceptora, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0221] U nekim načinima ostvarivanja, CAR ovog pronalaska obuhvata jednodomensko antitelo anti-CD19 koje obuhvata V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 76. U nekim načinima ostvarivanja, CAR ovog pronalaska obuhvata polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.
[0222] [0137] U nekim primerima, funkcionalni epitopi mogu se mapirati kombinatornim alaninskim skeniranjem. U ovom postupku, kombinatorna strategija alaninskog skeniranja može se koristiti za identifikaciju aminokiselina u proteinu CD19 koje su neophodne za interakciju sa anti-CD19 jednodomenskim antitelima. U nekim primerima, epitop je konformacioni i kristalna struktura anti-CD19 jednodomenskog antitela vezanog za CD19 može se koristiti za identifikaciju epitopa.
[0223] Otkriveno kao referenca je antitelo koje se specifično vezuje za isti epitop kao neko od ovde opisanih jednodomenskih antitela protiv. Na primer, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao jednodomensko antitelo anti-CD19 koje uključuje aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:76.
[0224] Otkriveno kao referenca je anti-CD19 antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se specifično vezuje za BCMA kompetitivno sa bilo kojim od ovde opisanih anti-CD19 jednodomenskih antitela. U nekim primerima kompetitivno vezivanje može da se odredi pomoću ELISA ispitivanja. Na primer, u nekim primerima obezbeđeno je antitelo koje se specifično vezuje za CD19 kompetitivno sa anti-CD19 jednodomenskim antitelom koje obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:76.
[0225] Otkriveno kao referenca je anti-CD19 antitelo ili antigen vezujući protein koji obuhvata bilo koje od prethodno opisanih anti-CD19 jednodomenskih antitela. U nekim primerima anti-CD19 antitelo je monoklonalno antitelo, koje uključuje kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima anti-CD19 antitelo je fragment antitela, npr., V<H>H fragment. U nekim primerima anti-CD19 antitelo je antitelo samo sa teškim lancem pune dužine koje obuhvata Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što je IgG1 ili IgG4. U nekim primerima Fc region smanjuje ili na minimum svodi funkciju efektora.
[0226] Ovde otkriveno anti-CD19 antitelo (kao što je anti-CD19 jednodomensko antitelo) ili antigen vezujući protein može obuhvatati bilo koje od svojstava, pojedinačno ili u kombinaciji, kako je opisano u odeljcima 1–7 „karkateristike antitela“ u nastavku.
[0227] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD19 jednodomenska antitela koje obuhvataju CAR ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira jednodomensko antitelo anti-CD19 , pri čemu nukleinska kiselina obuhvata sekvencu sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 101. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 101. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen se vektor (npr. ekspresioni vektor) koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U nekim ostvarenjima, obezbeđuje se ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. Takođe je opisan postupak dobijanja anti-CD19 antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD19 antitelo, pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CD19 antitela, i opciono izdvajanje anti-CD19 antitela iz ćelije domaćina (ili iz podloge za kulturu ćelije domaćina).
[0229] Jednodomenska antitela anti-CD20
[0230] Ovim putem su, kao referenca, opisna izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za CD20, kao što je humani CD20. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo moduliše aktivnost CD20. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je antagonističko antitelo.
[0231] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 77. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0232] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili sva tri CDR-a izabrana iz: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0233] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 5; i (c) CDR3 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 6. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, CDR koji ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu anti-CD20 jednodomensko antitelo koje obuhvata tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD20. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je afinitetno sazrevano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0234] [0147] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0235] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži VHH domen koji ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 77. U nekim načinima ostvarivanja, VHH sekvenca koja ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu anti-CD20 jednodomensko antitelo koje obuhvata tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD20. U nekim načinima ostvarivanja, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili brisano u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 77. U nekim načinima ostvarivanja, supstitucije, umetanja ili delecije se javljaju u regionima izvan CDR-ova (tj. u FR-ovima). Opciono, anti-CD20 jednodomensko antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence.
[0236] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži VHH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0237] U nekim primerima, funkcionalni epitopi se mogu mapirati kombinatornim alaninskim skeniranjem. U ovom postupku, kombinatorna strategija alaninskog skeniranja može se koristiti za identifikovanje aminokiselina u proteinu CD20 koje su neophodne za interakciju sa anti-CD20 jednodomenskim antitelima. U nekim primerima, epitop je konformacioni, a kristalna struktura anti-CD20 jednodomenskog antitela vezanog za CD20 može se koristiti za identifikovanje epitopa. U nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za isti epitop kao bilo koje od anti-CD20 jednodomenskih antitela ovde opisanih. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0238] Kao referenca je opisano anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za CD20 kompetitivno sa bilo kojim od anti-CD20 jednodomenskih antitela opisanih ovde. U nekim primerima, kompetitivno vezivanje se može odrediti korišćenjem ELISA testa. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za CD20 kompetitivno sa anti-CD20 jednodomenskim antitelom koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0239] [0152] Kao referenca je opisano anti-CD20 antitelo ili antigen vezujući protein koji obuhvata bilo koje od gore opisanih anti-CD20 jednodomenskih antitela. U nekim primerima, anti-CD20 antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, anti-CD20 antitelo je fragment antitela, npr. VHH fragment. U nekim primerima, anti-CD20 antitelo je punodužinsko antitelo koje sadrži samo teške lance i obuhvata Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što su IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimizovanu efektorsku funkciju.
[0240] Anti-CD20 antitelo (kao što je anti-CD20 jednodomensko antitelo) ili antigen vezujući protein može obuhvatati bilo koje od svojstava, pojedinačno ili u kombinaciji, kako je opisano u odeljcima 1–7 „Svojstva antitela“ u nastavku.
[0241] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koje od anti-CD20 jednodomenskih antitela prema pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD20 jednodomensko antitelo, pri čemu nukleinska kiselina obuhvata sekvencu koja ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 102. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 102. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor (npr., ekspresioni vektor) koji obuhvata kao što je nukleinska kiselina. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je ćelija domaćina koja obuhvata takvu nukleinsku kiselinu. Postupak pravljenja anti-CD20 antitela je otkriven pri čemu taj postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD20 antitelo, u uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CD20 antitela, i opciono oporavak anti-CD20 antitela iz ćelije domaćina (ili podloge za kultivisanje ćelije domaćina).
[0243] Jednodomenska antitela anti-BCMA
[0244] Ovde su, kao referenca, opisna izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za BCMA, kao što je humani BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo moduliše aktivnost BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je antagonističko antitelo.
[0245] Antigen zrelih B-ćelija (BCMA), takođe poznat kao CD269, pripada superfamiliji receptora faktora nekroze tumora, odnosno TNFRSF17 (Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192 (1):129–135, 2000). Humani BCMA se gotovo isključivo eksprimira u plazma ćelijama i ćelijama multiplog mijeloma (videti npr. Novak et al., Blood, 103(2):689–694, 2004; Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19):5903–5909; Felix et al., Mol. Oncology, 9(7):1348–58, 2015). BCMA može da veže faktor aktivacije B-ćelija (BAFF) i ligand koji indukuje proliferaciju (APRIL) (npr. Mackay et al., 2003 i Kalled et al., Immunological Review, 204:43–54, 2005). BCMA može biti pogodan tumorski antigenski cilj za imunoterapijske agense protiv multiplog mijeloma. Antitela visokog afiniteta mogu blokirati vezivanje između BCMA i njegovih prirodnih liganada BAFF i APRIL. Anti-BCMA jednodomenska antitela mogu se koristiti u kombinaciji sa ćelijskom imunoterapijom korišćenjem CAR-T ćelija, na primer, radi pojačavanja citotoksičnih efekata protiv tumorskih ćelija.
[0246] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 80. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 81. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 82. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 83. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 85. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 86. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 87. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0247] [0158] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili sva tri CDR-a izabrana iz: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 7–17; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 18–28; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 29– 39. CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA sdAb koji sadrži jedno od: (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31; ili (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0248] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 7–17; (b) CDR2 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 18–28; i (c) CDR3 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 29–39. U nekim načinima ostvarivanja, CDR koji ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu anti-BCMA jednodomensko antitelo koje obuhvata tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je afinitetno sazrevano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0249] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0250] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0251] [0162] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0252] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0253] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0254] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0255] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0256] [0167] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0257] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0258] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0259] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata drugo anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0260] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži VHH domen koji ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 78–88. U nekim načinima ostvarivanja, VHH sekvenca koja ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu anti-BCMA jednodomensko antitelo koje obuhvata tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili brisano u aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz SEQ ID NO: 78–88. U nekim načinima ostvarivanja, supstitucije, umetanja ili delecije se javljaju u regionima izvan CDR-ova (tj. u FR-ovima). Opciono, anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 78–88, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence.
[0261] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 78. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 79. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 80. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 81. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 82. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 83. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 84. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 85. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 86. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 87. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 88. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88.
[0262] [0173] U nekim primerima, funkcionalni epitopi mogu biti mapirani kombinatornim alaninskim skeniranjem. U ovom postupku, može se koristiti strategija kombinatornog alaninskog skeniranja radi identifikacije aminokiselina u BCMA proteinu koje su neophodne za interakciju sa anti-BCMA jednodomenskim antitelima. U nekim primerima, epitope je konformacioni i kristalna struktura kompleksa anti-BCMA jednodomenskog antitela vezanog za BCMA može se koristiti za identifikaciju epitopa. U nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za isti epitop kao bilo koje od anti-BCMA jednodomenskih antitela opisanih ovde. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-BCMA jednodomensko antitelo koje obuhvata bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 78–88.
[0263] Kao referenca je otkriveno anti-BCMA antitelo, ili antigen-vezujući fragment tog antitela, koje se specifično vezuje za BCMA kompetitivno sa bilo kojim od anti-BCMA jednodomenskih antitela opisanih ovde. U nekim primerima, kompetitivno vezivanje se može odrediti ELISA testom. Na primer, u nekim primerima postoji antitelo koje se specifično vezuje za BCMA kompetitivno sa anti-BCMA jednodomenskim antitelom koje sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 78–88.
[0264] Kao referenca je otkriveno anti-BCMA antitelo ili antigen-vezujući protein koji obuhvata bilo koje od gore opisanih anti-BCMA jednodomenskih antitela. U nekim primerima, anti-BCMA antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, anti-BCMA antitelo je fragment antitela, npr. V<H>H fragment. U nekim primerima, anti-BCMA antitelo je kompletno antitelo sa teškim lancem koje sadrži Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što su IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimizovanu efektorsku funkciju.
[0265] Anti-BCMA antitelo (kao što je anti-BCMA jednodomensko antitelo) ili antigen-vezujući protein može obuhvatati bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kako je opisano u odeljcima 1–7 „Karakteristike antitela“ u nastavku.
[0266] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-BCMA jednodomensko antitelo obuhvaćeno CAR-om prema pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-BCMA jednodomensko antitelo, pri čemu nukleinska kiselina obuhvata sekvencu koja ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa nukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 103–113. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe SEQ ID NO: 103– 113. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor (npr. ekspresioni vektor) koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. Otkriven je i postupak za dobijanje anti-BCMA antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-BCMA antitelo, u uslovima pogodnim za ekspresiju anti-BCMA antitela, i opciono izdvajanje antitela iz ćelije domaćina (ili iz medijuma kulture ćelija domaćina).
[0267] Jednodomenska antitela anti-CD38
[0268] Kao referenca su otkrivena izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za CD38, kao što je humani CD38. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo moduliše aktivnost CD38. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je antagonističko antitelo.
[0269] CD38 je transmembranski glikoprotein tipa II koji se povezuje sa receptorima na površini ćelije, reguliše citoplazmatski Ca2+ tok i posreduje u signalnoj transdukciji u limfoidnim i mijeloidnim ćelijama (Konopleva et al., J Immunol, 161:4702–8, 1998; Deaglio et al., Blood, 109:5390–8, 2007). Humani CD38 je visoko i uniformno eksprimovan na ćelijama mijeloma i izražen je na relativno niskim nivoima na normalnim limfoidnim i mijeloidnim ćelijama i u nekim tkivima nehematopoetskog porekla, što ga čini potencijalnom metom u lečenju mijeloma (videti, na primer, Lin et al., Am J Clin Pathol, 2004, 121:482; H. M. Lokhorst et al., New Eng. J. Med., 2015, 373:13).
[0270] [0180] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 90. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 91. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 93. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 94. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 95. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 96. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 97. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 98. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR-a iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0271] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili sva tri CDR-a iz: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 40–51; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 52–63; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 64–75. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0272] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 40–51; (b) CDR2 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 52–63; i (c) CDR3 ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 64–75. U nekim načinima ostvarivanja, CDR koji ima najmanje oko bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži takvu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD38. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je afinitetno poboljšano.
[0273] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0274] [0184] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0275] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 42; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0276] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0277] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0278] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 57; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0279] [0189] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0280] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0281] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0282] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 61; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0283] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0284] [0194] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR-a, pri čemu: (a) CDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; (b) CDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63; i (c) CDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata prihvatni humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0285] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje ima V<H>H domen sa najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 89–100. U nekim načinima ostvarivanja, V<H>H sekvenca sa najmanje oko 85% do 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, pri čemu anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD38. U nekim načinima ostvarivanja, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili deleisano u aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz SEQ ID NO: 89–100. U nekim načinima ostvarivanja, supstitucije, umetanja ili delecije se javljaju u regionima izvan CDR-ova (tj. u FR regionima). Opcionalno, anti-CD38 jednodomensko antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 89–100, uključujući post-translacijske modifikacije te sekvence.
[0286] [0196] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 89. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 90. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 91. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 91. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 92. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 93. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 94. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 95. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 96. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 97. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 98. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 99. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 100. U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema pronalasku obuhvata polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100.
[0287] U nekim primerima, funkcionalni epitopi se mogu mapirati kombinatornim alanin skeningom. U ovom postupku, kombinatorna strategija alanin skeninga može se koristiti za identifikaciju aminokiselina u CD38 proteinu koje su neophodne za interakciju sa anti-CD38 jednodomenskim antitelima. U nekim primerima, epitope je konformacioni i kristalna struktura kompleksa anti-CD38 jednodomenskog antitela vezanog za CD38 može se koristiti za identifikaciju epitopa. U nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za isti epitope kao bilo koje od anti-CD38 jednodomenskih antitela datih ovde. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se vezuje za isti epitope kao anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 90–100.
[0288] Kao referenca se otkriva anti-CD38 antitelo, ili antigen-vezujući fragment istog, koje se specifično vezuje za CD38 kompetitivno sa bilo kojim od anti-CD38 jednodomenskih antitela opisanih ovde. U nekim primerima, kompetitivno vezivanje može se odrediti ELISA testom. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za CD38 kompetitivno sa anti-CD38 jednodomenskim antitelom koje sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 89–100.
[0289] Kao referenca se otkriva anti-CD38 antitelo ili antigen-vezujući protein koji obuhvata bilo koje od gore opisanih anti-CD38 jednodomenskih antitela. U nekim primerima, anti-CD38 antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, anti-CD38 antitelo je fragment antitela, npr. V<H>H fragment. U nekim primerima, anti-CD38 antitelo je kompletno antitelo sa teškim lancem koje sadrži Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što su IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimizovanu efektorsku funkciju.
[0290] Anti-CD38 antitelo (kao što je anti-CD38 jednodomensko antitelo) ili antigen-vezujući protein može obuhvatiti bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1–7 „Karakteristike antitela“ u nastavku.
[0291] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD38 jednodomenska antitela obuhvaćena CAR-om prema pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD38 jednodomensko antitelo, pri čemu nukleinska kiselina obuhvata sekvencu sa najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe SEQ ID NO: 114–125. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe SEQ ID NO: 114–125. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor (npr. ekspresioni vektor) koji obuhvata takvu nukleinsku kiselinu. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je host ćelija koja obuhvata takvu nukleinsku kiselinu. Otkiva se i postupak za dobijanje anti-CD38 antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje host ćelije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD38 antitelo, u uslovima pogodnim za ekspresiju antitela, i opciono izolovanje antitela iz host ćelije (ili iz medijuma kulture host ćelije).
[0293] Karakteristike antitela
[0294] 1. Afinitet antitela
[0295] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, ili ≤ 0.001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M to 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M).
[0296] [0203] Kd može da se izmeri ispitivanjem vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA) izvedenim sa Fab verzijom ili V<H>H fragmentom antitela od značaja i njegovim antigenom kako je opisano sledećim ispitivanjem. Na primer, afinitet vezivanja Fab rastvora za antigen se meri dovođenjem u ravnotežu Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) obeleženog antigena u prisustvu serije titracija neobeleženog antigena, zatim hvatanje vezanog antigena pločom obloženom anti-Fab antitelima (videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)). Kako bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, MICROTITER<®>ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) su preko noći obložene sa 5 µg/ml hvatajućeg anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum-karbonata (pH 9.6), a zatim blokirane sa 2% (w/v) albumina goveđeg seruma u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U nefluoridnoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [125I]-antigena se mešaju sa serijama razblaženja Fab-a od značaja (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res.57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći, mada inkubacija može trajati duže (npr., oko 65 sati) kako bi se obezbedilo postizanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju na sobnoj temperaturi (npr., jedan sat). Rastvor se potom uklanja, a ploča se osam puta opere sa 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20®) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 µl/bunarčić scintilatora (MICROSCINT-20<™>; Packard), i ploče se prebrojavaju na TOPCOUNT<™>gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje obezbeđuju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su odabrane za upotrebu u kompetetivnim ispitivanjima vezivanja.
[0297] Kd može da se izmeri pomoću ispitivanja rezonance površinskog plazmona pomoću BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobilisanim antigenskim CM5 čipovima na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorski čipovi karboksimetilisanog dekstrana (CM5, BIACORE, Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) u skladu sa uputstvima dobavljača. Antigen se razblaži sa 10 mM natrijum-acetata, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre ubrizgavanja pri brzini protoka od 5 µl/minuta kako bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, ubrizgava se 1 M etanolamina da blokira neizreagovane grupe. Za merenja kinetike, ubrizgavaju se dvostruka serijska razblaženja Fab ili V<H>H antitela od značaja (0,78 nM do 500 nM) u PBS sa 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN-20).<™>) surfaktantom (PBST) na 25°C pri brzini protoka od približno 25 µl/min. Stope pridruživanja (k<on>) i stope disocijacije (k<off>) se izračunavaju pomoću jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja jedan na jedan (BIACORE<®>Softver za procjenu verzija 3.2) simultanim prilagođavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) se izračunava kao odnos k<off>/k<on>. Videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako je stopa uključenja veća od 10<6>M-
[0298] <1>s<-1>gornjim ispitivanjem površinske plazmonske rezonance, tada brzina uključivanja može da se odredi upotrebom tehnike gašenja fluorescentne svetlosti koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuđivanje = 295 nm; emisija = 340 nm, propusnost pojasa od 16 nm) na 25°C 20 nM antitela anti-antigena (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je izmereno u spektrofotometru, kao što je spektofotometar opremljen sa zaustavljanjem protoka (Aviv Instruments) ili 8000 -series SLM-AMINCO<™>spektrofotometrom (ThermoSpectronic) sa kivetom za umešavanje.
[0300] 2. Fragmenti antitela
[0301] U nekim primerima, ovde otkriveno antitelo predstavlja fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali bez ograničenja na, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>, Fv, i scFv fragmente, V<H>H, i druge fragmente opisane u nastavku. Radi pregleda fragmenata određenih antitela, videti Hudson et al. Nat. Med.9:129-134 (2003). Zbog pregleda scFv fragmenata, videti, npr., Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i američki patent br.5,571,894 i 5,587,458. Radi rasprave o Fab i F(ab')<2>fragmenti koji sadrže ostatke epitopa koji se vezuje za receptore spašavanja i koji imaju produženi in vivo poluživot, videti američki patent br.5,869,046.
[0302] [0206] Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
[0303] Fragmenti antitela mogu biti napravljeni raznim tehnikama, uključujući ali bez ograničenja na proteolitičku digestiju intaktnog antitela kao i proizvodnju rekombinantnim ćelijama domaćina (npr. E. coli ili fag), kao što je ovde opisano.
[0305] 3. Himerna i humanizovana antitela
[0306] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo može biti himerno antitelo. Određena antitela su opisana npr., u američki patent br.4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo obuhvata nehumani varijabilni region (npr., varijabilni region izveden iz kamelidnih vrsta, kao što su lame) i humani konstantni region. U dodatnom primeru, himerno antitelo predstavlja antitelo "koje je isključeno iz klase" u kojem je klasa ili podklasa promenjena iz klase roditeljskog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
[0307] U nekim načinima ostvarivanja, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Obično je nehumano antitelo humanizovano kako bi se smanjila imunogenost po ljude, dok zadržava specifičnost i afinitet roditeljskog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo obuhvata jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR, npr., CDR (ili njihovi delovi) izvedeni iz nehumanog antitela, a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci humanih antitela. Humanizovano antitelo će opciono takođe obuhvatati najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim načinima ostvarivanja, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani sa odgovarajućim ostacima iz nehumanog antitela
[0308] (npr., antitela iz kojeg su izvedeni HVR ostaci), npr., kako bi se povratila ili popravila specifičnost ili afinitet antitela.
[0309] Humanizovana antitela i postupci njihovog pravljenja su pregledani, npr., u Almagro
[0310] and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), i dodatno su opisani, npr., u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); američki patent br.
[0311] 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (koji opisuju SDR (a-CDR) kalemljenje); Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (koji opisuje "ponovno izbijanje na površinu"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (koji opisuje "FR mešanje"); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (koji opisuje pristup “vođenog izbora” FR mešanju).
[0312] [0211] Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju ali bez ograničenja na: okvirne regione izabrane postupkom "najboljeg para" (videti, npr., Sims et al. J. Immunol.151:2296 (1993)); okvirne regione izvedene iz konsenzusne sekvence humanog antitela određene podgrupe varijabilni regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili humane okvirne regione iz nasledne linije (videti, npr., Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione izvedene iz skrininga FR biblioteka (videti, npr., Baca et al., J. Biol. Chem.
[0313] 272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
[0314] U nekim načinima ostvarivanja, jednodomenska antitela su modifikovana, kao što je humanizovana, bez umanjenja nativnog afiniteta domena za antigen i dok se smanjuje njegova imunogenost u odnosu na heterolognu vrstu. Na primer, aminokiselinski ostaci varijabilnog domena antitela (V<H>H) lame može da se odredi, a jedna ili više kamelidnih aminokiselina, na primer, u okvirnim regionima, zamenjuju se svojim humanim dvojnikom kako se nalazi u humanoj konsenzusnoj sekvenci, a da taj polipeptid ne izgubi svoj tipični karakter, tj. humanizacija ne utiče značajno na sposobnost vezivanja antigena dobijenog polipeptida. Humanizacija kamelidnih jednodomenskih antitela zahteva uvođenje i mutagenezu ograničene količine aminokiselina u jednom polipeptidnom lancu. Ovo je u suprotnosti sa humanizacijom scFv, Fab', (Fab')2 i IgG, koja zahteva uvođenje aminokiselinskih promena u dva lanca, laki i teški lanac i očuvanje sastava obaju lanaca.
[0315] Jednodomenska antitela koja obuhvataju V<H>H domen mogu biti humanizovana tako da imaju sekvence poput humanih. U nekim načinima ostvarivanja, FR regioni V<H>H domena koji se ovde koristi može da sadrži najmanje bilo koju od 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više homologije aminokiselinske sekvence sa humanim V<H>okvirnim regionom. Jedan primer klase humanizovanog V<H>H domena je okarakterisan time što V<H>H nose aminokiselinu iz grupe koju čine glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, tirozin, triptofan, metionin, serin, treonin, asparagin ili glutamin na položaju 45, kao što su, na primer, L45 i triptofan na poziciji 103, prema Kabat numerisanju. Kao takvi, polipeptidi koji pripadaju ovoj klasi pokazuju visoku homologiju aminokiselinske sekvence sa humanim V<H>okvirnim regionima i pomenuti polipeptidi mogu da se primenjuju na čoveka direktno bez očekivanja neželjenog imunog odgovora, i bez tereta dodatne humanizacije.
[0316] Još jedan primer klase humanizovanih kamelidnih jednodomenskih opisana je u WO 03/035694 i sadrži hidrofobne FR2 ostatke koji se obično nalaze u uobičajenim antitelima humanog porekla ili drugih vrsta, ali nadoknađujući ovaj gubitak hidrofilnosti argininskim ostatkom pod nabojem na položaju 103 koji supstituiše konzervirani ostatak triptofana prisutan u V<H>iz dvolančanih antitela. Kao takvi, peptidi koji pripadaju ovim dvema klasama pokazuju visoku homologiju aminokiselinske sekvence sa humanim V<H>okvirnim regionima i pomenuti peptidi mogu da se primenjuju na čoveka direktno bez očekivanja neželjenog imunog odgovora, i bez tereta dodatne humanizacije.
[0318] 4. Humana antitela
[0319] [0215] Antitelo može biti humano antitelo. Humana antitela mogu biti proizvedena raznim tehnikama poznatim u ovoj oblasti. Humana antitela su generalno opisana u van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008). Transgeni miševi ili pacovi koji mogu da proizvode u potpunosti humana jednodomenska antitela su dobro poznati u ovoj oblasti. Videti npr., US20090307787A1, U.S. Pat. br.8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, i WO2Z004049794.
[0320] Humana antitela mogu da se pripreme davanjem imunogena transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje obično sadrže sve ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, koji zamenjuju endogene imunoglobulinske lokuse, ili koji su prisutni ekstrakromosomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. Kod takvih transgenih miševa, endogeni imunoglobulinski lokusi su generalno neaktivisani. Za pregled postupaka za dobijanje humanih antitela iz transgenih životinja, videti Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005). Videti takođe, npr., američki patent br.6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ technology; američki patent br. 5,770,429 koji opisuje HUMAB® technology; američki patent br.7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® technology, i objava američke patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje VELOCIMOUSE® technology). Humani varijabilni regioni iz intaktnih antitela koje su stvorile takve životinje mogu dalje da se modifikuju, npr. kombinovanjem sa različitim ljudskim konstantnim regionom.
[0321] Humana antitela takođe mogu da se proizvedu postupcima zasnovanim na hibridomu. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela. (Videti, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antitelo Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela stvorena tehnologijom hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u američki patent br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonalnih humanih IgM antitela iz hibridomskih ćelijskih linija) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006.) (opisuje humane-humane hibridome). Tehnologija humanog hibridoma (Trioma tehnologija) je takođe opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
[0322] Humana antitela takođe mogu da se stvaraju izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona odabranih iz biblioteka prikaza faga koje su izvedene od ljudi. Takve sekvence varijabilnog domena mogu zatim da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za odabir humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
[0323] [0219] Jedna tehnika za dobijanje V<H>H sekvenci usmerenih protiv određenog antigena ili cilja uključuju pogodno imunizaciju transgenog sisara koji je sposoban da eksprimira antitela teškog lanca (tj. kako bi se podigao imuni odgovor i/ili antitela teškog lanca usmerena protiv navedenog antigena ili cilja), čime se dobija odgovarajući biološki uzorak navedenog transgenog sisara koji sadrži (kodirajuće sekvence nukleinske kiseline) pomenute V<H>H sekvence (kao što je uzorak krvi, uzorak seruma ili uzorak B-ćelija), a zatim stvaranje V<H>H sekvence usmerene protiv pomenutog antigena ili cilja, počevši od pomenutog uzorka, pomoću bilo koje pogodne tehnike poznate per se (kao što je bilo koji od ovde opisanih postupaka ili tehnika hibridoma). Na primer, u tu svrhu, miševi sa ekspresijom antitela teškog lanca i dodatni postupci i tehnike opisane u WO 02/085945, WO 04/049794 i WO 06/008548 i Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2006 Oct.10; 103(41): 15130-53 mogu da se koriste. Na primer, takvi miševi koji eksprimiraju antitela teškog lanca mogu da eksprimiraju antitela teškog lanca sa bilo kojim pogodnim (jednim) varijabilnim domenom, kao što su (pojedinačni) varijabilni domeni iz prirodnih izvora (npr. humane (pojedinačne) varijabilne domene, kamelidne (pojedinačne) varijabilne domene ili (pojedinačne) varijabilne domene morskog psa), kao i na primer sintetičke ili polusintetčke (pojedinačne) varijabilne domene.
[0325] 5. Antitela izvedena iz biblioteke
[0326] Antitela se mogu izolovati pretraživanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u ovoj oblasti su poznati različiti postupci za pravljenje biblioteka za prikaz faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja poseduju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su pregledani, npr., u McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004). Postupci za konstruisanje biblioteka sdAb su opisani, na primer ,videti američki pat. br.7371849.
[0327] U određenim postupcima prikaza faga, repertoari V<H>i V<L>gena se odvojeno kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i rekombinuju se nasumično u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pregledaju radi fagova koji vezuju antigene, kao što je opisano u Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fag tipično prikazuje fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može da se klonira (npr. iz čoveka) kako bi se dobio jedan izvor antitela za širok raspon ne-vlastitih i vlastitih antigena bez ikakve imunizacije kako je opisano u Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993.). Konačno, naivne biblioteke takođe mogu da se naprave sintetički kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koje sadrže nasumične sekvence za kodiranje vrlo varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preraspodele in vitro, kako je opisao Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne objave koje opisuju biblioteke faga humanog antitela uključuju, na primer: američki patent br.5,750,373, i američka patentna objava br.
[0328] 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/02 92936, i 2009/0002360.
[0329] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
[0331] 6. Multispecifična antitela
[0332] Antitelo može biti multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. Jedna od specifičnosti vezivanja može biti za antigen odabran iz grupe koju čine CD19, CD20, BCMA i CD38, a druga je za bilo koji drugi antigen. Bispecifična antitela mogu da se vezuju na dva različita epitopa antigena odabrana iz grupe koju čine CD19, CD20, BCMA i CD38. Bispecifična antitela takođe mogu da se koriste za lokalizaciju citotoksičnih sredstava na ćelije koje eksprimiraju antigen odabran iz grupe koju čine CD19, CD20, BCMA i CD38.
[0333] Bispecifična antitela mogu da se pripreme u obliku antitela pune dužine ili fragmenata antitela. Tehnike za pravljenje multispecifičnih antitela uključuju, ali bez ograničenja na, rekombinantno zajedničko eksprimiranje dva para teški lanac-laki lanac imunoglobulina koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)), i konstruisanje "kvaka u rupi" (videti, npr., američki patent br.5,731,168). Multi-specifična antitela takođe mogu da budu napravljena konstruisanjem elektrostatičlih upravljačkih efekata za pravljenje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); umrežavanje dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr., američki patent br.4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); pomoću leucinskih zatvarača kako bi se proizvela bispecifična antitela (videti, npr., Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); pomoću tehnologije "dijatela" za pravljenje antitela bispecifičnih fragmenata (videti, npr., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i pomoću jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr., Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr., u Tutt et al. J. Immunol.147: 60 (1991); i pravljenjem polipeptida koji obuhvataju tandem jednodomenska antitela (videti, npr., američka patentna prijava br.
[0334] 20110028695; i Conrath et al. J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50). Konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih antigen vezujućih mesta, uključujući "Octopus antitela," koja su ovde takođe obuhvaćena (videti, npr., US 2006/0025576A1).
[0336] 7. Varijante antitela
[0337] [0225] U nekim načinima ostvarivanja, ovde se u razmatranje uzimaju varijante sekvenci aminokiselina antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante sekvence aminokiselina antitela mogu da se pripreme uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanja iz, i/ili umetanja u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i supstitucije može da se napravi kako bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike, npr., vezivanje antigena.
[0339] a) Varijante supstitucija, umetanja, i brisanja
[0340] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđene su varijante antitela sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija. Mesta od značaja za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR.
[0341] Konzervativne supstitucije su prikazane u tabeli 3 pod nazivom "Poželjne supstitucije". Značajnije promene su date u tabeli 3 pod nazivom "primerne supstitucije", i kao što je dalje opisano u nastavku u odnosu na klase bočnih lanaca aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu da se uvedu u antitelo od značaja i proizvodi se pregledaju na željenu aktivnost, npr., zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost ili poboljšani ADCC ili CDC.
[0343] TABELA 3. Aminokiselinske supstitucije
[0344] Originalni ostatak Primeri supstitucija Poželjne supstitucije
[0347]
[0348] Thr ; Ser
Ser
[0350] Trp ; Phe Tyr
[0353]
[0355] Val Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
[0357] Aminokiseline mogu biti grupisane prema uobičajenim svojstvima bočnog lanca:
[0358] (1) hidrofobni: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[0359] (2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[0360] (3) kiseli: Asp, Glu;
[0361] (4) bazni: His, Lys, Arg;
[0362] (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
[0363] (6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.
[0364] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati razmenu člana jedne od klasa za drugu klasu.
[0365] Jedna vrsta supstitucione varijante uključuje zamenu jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovano ili ljudsko antitelo). Generalno, dobijena varijanta(e) odabrana za dalje istraživanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) u određenim biološkim svojstvima (npr. povećani afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će značajno zadržati određena biološka svojstva roditeljskog antitela. Primer supstitucione varijante je antitelo sazrelog afiniteta, koje može pogodno da se proizvede, npr., pomoću tehnika sazrevanja afiniteta zasnovane na prikazu faga kao što su one koje su ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutirano i varijante antitela prikazane na fagu i podvrgnute skriningu zbog određene biološke aktivnosti (npr. afinitet vezivanja).
[0366] Izmene (npr., supstitucije) mogu da se naprave u HVR, npr., kako bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu biti napravljene u HVR "gorućim tačkama," tj., ostaci koje kodiraju kodoni koji su podvrgnuti mutaciji pri visokoj frekvenciji tokom postupka somatskog sazrevanja (videti,
[0367] npr., Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), i/ili SDR (a-CDR), sa dobijenom varijantom V<H>ili V<L>koja je ispitivana radi afiniteta vezivanja dobijenom varijantom V<H>ili V<L>koji je ispitivan radi afiniteta vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka je opisano, npr., u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ur., Human Press, Totowa, NJ, (2001.)).) U nekim primerima sazrevanja afiniteta, raznolikost se uvodi u varijabilne gene odabrane za sazrevanje bilo kojom od različitih postupaka (npr. PCR sklon greškama, mešanje lanaca ili mutageneza usmerena na oligonukleotide). Zatim se stvara sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pregleda kako bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznolikosti uključuje pristupe usmerene na HVR, u kojima je nekoliko HVR ostataka (npr.4-6 ostataka odjednom) nasumično raspoređeno. HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu specifično da se identifikuju, npr., korišćenjem mutageneze ili modelovanja skeniranjem alanina. CDR-H3 i CDR-L3 su posebno često ciljani.
[0368] U nekim primerima, supstitucije, umetanja, ili brisanja mogu da se javljaju unutar jednog ili više HVR toliko dugo da takve promene suštinski ne smanjuju mogućnost antitela da se vezuje za antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr., konzervativne supstitucije kao što su ovde obezbeđene) koje suštinski ne smanjuju afinitet vezivanja mogu da se naprave u HVR. Takve promene mogu biti izvan HVR "gorućih tačaka" ili CDR. U nekim primerima ovde date varijante V<H>H sekvenci, svaki HVR ili je neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri aminokiselinske supstitucije.
[0369] Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koja mogu biti ciljana za mutagenezu naziva se "mutageneza skeniranja alanina", kako je opisano u Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. ostaci pod nabojem kao što su Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno nabijenom aminokiselinom (npr. alanin ili polialanin) kako bi se utvrdilo da li utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu da se uvedu na mestima aminokiselina čime se pokazuje funkcionalna osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo za identifikaciju kontaktnih tačaka između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za zamenu. Varijante se mogu pregledati kako bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0370] Umetanja aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije koje su u opsegu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i umetanja međusekvenca jednog ili više aminoksielinskih ostataka. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatak. Ostale varijante umetanja molekule antitela uključuju spajanje na N-ili C-kraju antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom koji produžava poluživot antitela u serumu.
[0372] b) Varijante glikosilacije
[0373] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo se menja kako bi se povećao ili smanjio opseg do kojeg se to antitelo glikoziliše. Dodavanje ili brisanje mesta glikosilacije antitelu uobičajeno može da se postigne izmenom aminokiselinske sekvence tako što se pravi ili uklanja jedno ili više mesta glikosilacije.
[0374] [0235] Kada antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrat pričvršćen za njega može da biti promenjen. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara obično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno pričvršćen N-vezom za Asn297 CH2 domen Fc regiona. Videti, npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da uključuje različite ugljene hidrate, npr., manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu pričvršćenu za GlcNAc u "stabljici" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim načinima ostvarivanja, modifikacije oligosaharida u antitelu mogu da se naprave kako bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0375] Varijante antitela mogu da imaju strukturu ugljenih hidrata kojoj nedostaje fukoza pričvršćena (direktno ili indirektno) na Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze određena je izračunavanjem prosečne količine fukoze unutar lanca šećera na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr. kompleksne, hibridne strukture i strukture sa visokim udelom manoze) mereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom , kako je opisano u WO 2008/077546, na primer. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koja se nalazi na otprilike poziciji 297 u Fc regionu (EU numerisanje ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi na oko ± 3 aminokiseline ushodno ili nishodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvenci u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Videti, npr., američka patentna objava br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koji se odnose na varijante "defukosilisanog" ili "fukozno deficijentnog" antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO
[0376] 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koji mogu da proizvode defukosilisana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije kojima nedostaje proteinska fukosilacija (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); američka patentna prijava br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., posebno u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fuksiltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti, npr., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
[0377] Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr., u kojima je biantenarni oligosaharid pričvršćen za Fc region antitela prepolovljen GlcNAc-om. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); američki patent br.6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidima pričvršćenim za Fc regionu. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu funkciju CDC. Takve varijante antitela su mogle da imaju poboljšanu CDC funkciju. Opisane su takve varijante antitela, npr., u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0379] c) Varijante Fc regiona
[0380] [0238] Jedna ili više aminokiselinskih modifikacija može biti uvedena u Fc region antitela čime se stvara varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da obuhvata sekvencu humanog Fc regiona (npr., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koja obuhvata aminokiselinsku modifikaciju (npr. supstituciju) na jednom ili više položaja aminokiselina.
[0381] Varijanta antitela može da poseduje poseduje neke ali ne sve efektorske funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojim polu-život antitela in vivo je važna, mada su određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC) neophodne ili štetne. In vitro i/ili in
[0382] vivo citotoksičnost ispitivanja može d ase izvede kako b ise potvrdila redukcija/deplecija CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, ispitivanja vezivanja Fc receptora (FcR) mogu da se izvedu kako bi se osiguralo da antitelu nedostaje vezivanje FcyR (dakle verovatno nedostaje ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII), dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII). Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama sažeta je u tabeli 3 na stranici 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro ispitivanja za procenu ADCC aktivnosti molekula od značaja opisani su u američki patentu br.
[0383] 5,500,362 (videti, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.
[0384] 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu da se koriste neradioaktivni postupci ispitivanja (videti, na primer, ACTI<™>ispitivanje neradioaktivne citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>ispitivanje neradioaktivne citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može da se proceni ADCC aktivnost molekule od značaja in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj otkriven u Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ispitivanja C1q vezivanja takođe mogu da se izvod ekako bi se potvrdilo da antitelo ne može da se vezuje za C1q i samim tim mu nedostaje CDC aktivnost. Videti, npr. C1q i C3c vezivanje ELISA u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Za procenu aktivacije komplementa može da se izvede CDC ispitivanje (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Metode 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004.)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota takođe može da se izvede postupcima poznatim u ovoj oblasti (videti, npr. Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).
[0385] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (američki patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani "DANA" Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 na alanin (američki patent br. 7,332,581).
[0386] Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili umanjenim vezivanjem za FcR. (Videti, npr., američki patent br.6,737,056; WO 2004/056312, i Shields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).)
[0387] Varijanta antitela može da obuhvata Fc region sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje poboljšavaju ADCC, npr., supstitucije na položajima 298, 333, i/ili 334 Fc regiona (EU numerisanje ostatka).
[0388] Promene mogu da se prave u Fc regionu koje dovode do promenjenog (tj. bilo poboljšanog ili smanjenog) vezivanja C1q i/ili citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC), npr. kako je opisano u američkom patentu br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie et al. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
[0389] Antitela sa produženim polu-životima i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), su opisani u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ova antitela obuhvataju Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr., supstitucija ostataka Fc regiona 434 (američki patent br.7,371,826).
[0390] Videti takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); američki patent br.
[0391] 5,648,260; američki patent br.5,624,821; i WO 94/29351 se bave drugim primerima varijanti Fc regiona.
[0393] d) Cisteinski konstruisane varijante antitela
[0394] U nekim načinima ostvarivanja, može biti poželjno stvoriti antitela proizvedena cisteinom, npr., "tioMAb," u kojima su jedan ili više ostataka antitela supstituisani cisteinskim ostacima. U određenim načinima ostvarivanja, supstituisani ostaci se pojavljuju na dostupnim mestima antitela. Supstitucijom tih ostataka sa cisteinom, reaktivne tiolne grupe se na taj način postavljaju na dostupna mesta antitela i mogu se koristiti za konjugovanje antitela na drugim delovima, kao što su delovi leka ili delovi linker-lek, kako bi se stvorio imunokonjugat, kako je ovde dalje opisano . U nekim načinima ostvarivanja, bilo koji jedan ili više od sledećih ostataka može biti supstituisano cisteinom: A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela proizvedena cisteinskim inženjeringom mogu da se stvaraju kako je opisano, npr., u američki patentu br.7,521,541.
[0396] e) Derivati antitela
[0397] [0247] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo može dalje da se modifikuje da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u ovoj oblasti i lako dostupni. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali bez ograničenja na polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali bez ograničenja na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli- 1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliaminokiseline (bilo homopolimeri ili nasumični kopolimeri) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimeri propropilen glikola, kopolimeri prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilisani polioli (npr., glicerol), polivinil alkohol i njihove mešavine. Polietilen glikol propionaldehid može da ima prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske mase, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera pričvršćenih za antitelo može da varira, a ako je vezano više od jednog polimera, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili tip polimera korišćenih za derivatizaciju može da se odredi na osnovu razmatranja uključujući, ali bez ograničenja na, posebna svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
[0398] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni su konjugati antitela i neproteinskog dela koji se može selektivno grejati izlaganjem zračenju. U nekim načinima ostvarivanja, neproteinski deo je ugljenična nanocev (Kam et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali bez ograničenja na, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski deo do temperature na kojoj su ćelije koje su najbliže neproteinskom delu antitela ubijene.
[0400] Postupci pripreme
[0401] Antitela (kao što je jednodomenska antitela) opisana ovde mogu biti pripremljena pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti kao što je ovde opisano.
[0402] Opisani su postupci pripreme jednodomenskih antitela. Videti, na primer, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674. Jednodomenska antitela (kao što su V<H>Hs) mogu da se dobiju pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti kao što je imunizovanjem Camelid vrsta (kao što su kamila ili lama) i dobijanjem hibridoma od njih, ili kloniranjem biblioteke jednodomenskih antitela pomoću tehnika molekulske biologije opisanih u ovoj oblasti i naknadnim izborom ELISA-om sa pojedinačnim klonovima neizabranih biblioteka ili pomoću prikaza faga.
[0403] Za rekombinantnu proizvodnju jednodomenskih antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju sdAb su izolovane i umetnute u vektor koji može dalje da se umnožava za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira jednodomenska antitela lako se izoluje i sekvencira korišćenjem uobičajenih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje se mogu specifično vezivati za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Mnogi vektori su dostupni. Izbor vektora delimično zavisi od ćelije domaćina koji se koristi. Generalno, poželjne ćelije domaćini su ili prokariotskog ili eukariotskog (generalno sisarskog) porekla.
[0405] 1. Poliklonalna antitela
[0406] [0252] Poliklonalna antitela se generalno povećavaju kod životinja višestrukim supkutanim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama odgovarajućeg antigena i adjuvansa. Može biti korisno da se odgovarajući antigen konjuguje sa proteinom koji je imunogen u vrsti koja je potrebno da se imunizuje, npr., hemocijanin limpetice (KLH), serumski albumin, goveđi tireoglobulin ili inhibitor tripsina iz soje, pomoću dvofunkcionalnog ili derivatizujućeg sredstva, npr., estar maleimidobenzoil sulfosukcinimida (konjugacija preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimida (preko lizinskih ostataka), glutaraldehida, jantarni anhidrida, SOCl<2>, ili R<1>N=C=NR, pri čemu R i R<1>R3 nezavisno predstavljaju niže alkilne grupe. Primeri adjuvansa koji mogu da se upotrebljavaju uključuju Freundov potpuni adjuvans i MPL-TDM adjuvans (monofosforil lipid A, sintetički trehaloza dikorinomikolat).
[0407] Protokol imunizacije može da izabere stručnjak iz oblasti bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0408] Životinje se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombiniovanjem, npr., 100 µg ili 5 µg ili proteina ili konjugata (za zečeve ili miševe, tim redom) sa 3 zapremine Freundovog kompletnog adjuvansa i intradermalnim ubrizgavanjem rastvora na više mesta. Mesec dana kasnije, životinje su pojačane sa 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Freundovom potpunom adjuvansu supkutanom injekcijom na više mesta. Sedam do četrnaest dana kasnije, životinjama se uzima krv i serum se ispituje na titar antitela. Životinje su pojačane dok se ne postigne titar. Konjugati takođe mogu da se naprave u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao proteinske fuzije. Takođe, sredstva za agregaciju kao što je stipsa su pogodna za jačanje imunog odgovora.
[0410] 2. Monoklonalna antitela
[0411] Monoklonalna antitela se dobijaju iz populacije uglavnom homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija i/ili post-translacionih modifikacija (npr., izomerizacije, amidacije) koji mogu biti prisutni u manjim količinama. Prema tome, modifikator "monoklonalno" ukazuje na to da antitelo nije mešavina diskretnih antitela.
[0412] Na primer, monoklonalna antitela mogu biti napravljena pomoću postupka hibridoma koji su prvi opisali Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili može biti napravljen postupcima rekombinantne DNK (američki pat. br.4,816,567).
[0413] Kod postupka hibridomom, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, je imunizovana kao što je ovde prethodno opisano kako bi se dobili limfociti koji proizvode ili koji mogu da proizvode antitela koja će specifično da vezuju protein koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. Limfociti se zatim spajaju sa ćelijama mijeloma koje koriste pogodan agens za spajanje, kao što je polietilen glikol, kako bi se obrazovala hibridomska ćelija (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986).
[0414] Imunizujuće sredstvo će obično uključivati antigenski protein ili njegovu fuzionu varijantu.
[0415] Generalno se koriste ili limfociti periferne krvi ("PBL") ako se žele ćelije humanog porekla, ili se koriste ćelije slezine ili ćelije limfnih čvorova ako su željeni izvori sisara nehumanog porekla. Limfociti se zatim spajaju sa besmrtnom ćelijskom linijom pomoću odgovarajućeg sredstva za spajanje, kao što je polietilen glikol, da se formira ćelija hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), str.59-103.
[0416] [0258] Besmrtne ćelijske linije obično su transformisane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma glodara, goveda i ljudi. Obično se koriste ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Tako pripremljene hibridomske ćelije su zasađene i rastu u odgovarajućoj podlozi kulture koja poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nespojenih roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljskim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin gvanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), podloga kulture za hibridome će obično uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT podlogu), a to su stvari koje sprečavaju rast ćelija kojima nedostaje HGPRT.
[0417] Poželjne besmrtne ćelije mijeloma su one koje se efikasno spajaju, podržavaju stabilan visok nivo proizvodnje antitela od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela i osetljive su na podlogu kao što je HAT podloga. Među njima, poželjne su linije mišjeg mijeloma, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 mišjih tumora dostupnih iz Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, i SP-2 ćelije (i njihovi derivati, npr., X63-Ag8-653) dostupne od American Type Culture Collection, Manassas, Va. USA. Ćelijske linije ljudskog mijeloma i mišje-ljudskog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju ljudskih monoklonalnih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antitelo Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
[0418] Podloga kulture u kojoj rastu hibridomske ćelije se ispituje na proizvodnju monoklonalnih antitela usemrenih protiv antigena. Poželjno je da se specifičnost vezivanja monoklonalnih antitela proizvedenih od strane ćelija hibridoma određuje imunoprecipitacijom ili in vitro ispitivanjem vezivanja, kao što je radioimuno ispitivanje (RIA) ili imunoenzimskom probom (ELISA).
[0419] Podloga kulture u kojoj se kultivišu ćelije hibridoma može da se ispita na prisutnost monoklonalnih antitela usmerenih protiv željenog antigena. Poželjno je da afinitet vezivanja i specifičnost monoklonalnog antitela može da se odredi imunoprecipitacijom ili in vitro ispitivanjem vezivanja, kao što je radioimuno ispitivanje (RIA) ili imunoenzimskom probom (ELISA). Takve tehnike i ispitivanja su poznati u ovoj oblasti. Na primer, afinitet vezivanja može da se odredi putem the Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0420] Nakon sto su identifikovane hibridomske ćelije koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili dejstva, klonovi mogu biti podklonirani ograničavanjem postupaka razblaženja i mogu da se gaje standardnim postupcima (Goding, supra). Podloge pogodne za kulture za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 podlogu. Pored toga, hibridomske ćelije mogu da se gaje in vivo kao tumori kod sisara.
[0421] Monoklonalna antitela koja izlučuju subklonovi su pogodno odvojena od podloge kulture, ascitne tečnosti ili seruma uobičajenim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što je, na primer, protein A-sefaroze, hidroksilapatitna kromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0422] [0264] Monoklonalna antitela takođe mogu da se dobiju postupcima rekombinantne DNK poput onih opisanih u američki pat. br.4,816,567, i kao što je prethodno opisano. DNK koja kodira monoklonalna antitela se lako izoluje i sekvencira uobičajenim postupcima (npr., pomoću oligonukleotidnih sondi koje mogu specifično da se vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Hibridomske ćelije služe kao poželjni izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK može da se stavi u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćina kao što su E coli ćelije, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, kako bi se sintetisala monoklonalna antitela u takvim rekombinantnim ćelijama domaćina. Prikazani članci rekombinantne ekspresije DNK koja kodira antitelo uključuju ni članci o rekombinantnoj ekspresiji DNK koja kodira antitela u bakterijama uključuju Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Pliickthun, ImmunoL Revs.130: 151-188 (1992).
[0423] Antitela mogu da se izoluju iz biblioteka faga antitela napravljenih pomoću tehnika opisanih u McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990.). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991.) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) opisuju izolaciju mišjih i humanih antitela, pomoću biblioteke faga. Naknadne publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokog afiniteta (nM raspon) mešanjem u lancu (Marks et al., BioMechnology, 10:779-783 (1992)), kao i kombinatornu infekciju i in vivo rekombinaciju kao strategiju za konstruisanje vrlo velikih biblioteka faga (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Stoga ove tehnike predstavljaju održive alternative tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonalnih antitela za izolaciju monoklonalnih antitela.
[0424] DNK takođe može da se modifikuje, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za humane konstantne domene teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvenci (američki pat. br.
[0425] 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. SAD, 81:6851 (1984)), ili kovalentnim spajanjem imunoglobulinske kodirajuće sekvence cele ili dela kodirajuće sekvence za ne-imunoglobulinski polipeptid. Obično se takvi neimunoglobulinski polipeptidi zamenjuju za konstantne domene antitela, ili se zamenjuju za varijabilne domene jednog antigen-kombinujućeg mesta antitela kako bi se napravilo himerno dvovalentno antitelo koje sadrži jedno antigen-kombinujuće mesto koje ima specifičnost za antigen i drugo mesto za spajanje antigena koje ima specifičnost za različiti antigen.
[0426] Ovde opisana monoklonalna antitela mogu biti jednovalentna, čija je priprema dobro poznata u ovoj oblasti. Na primer, jedan postupak uključuje rekombinantnu ekspresiju lakog lanca imunoglobulina i modifikovanog teškog lanca. Teški lanac je generalno skraćen na bilo kom mestu u Fc regionu tako da se spreči umrežavanje teškog lanca. Alternativno, relevantni cisteinski ostaci mogu biti supstituisani drugim aminokiselinskim ostatkom ili izbrisani kako bi se sprečilo umrežavanje. In vitro postupci su takođe pogodni za pripremu jednovalentnih antitela. Digestija antitela za proizvodnju njihovih fragmenata, posebno Fab fragmenata, može da se postigne pomoću rutinskih tehnika poznatih u ovoj oblasti.
[0427] Himerna ili hibridna antitela takođe mogu da se naprave in vitro korišćenjem poznatih postupaka u hemiji sintetičkih proteina, uključujući one koje uključuju sredstva za umrežavanje. Na primer, imunotoksini mogu da se konstruišu pomoću reakcije izmene disulfida ili stvaranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidata.
[0428] 3. Rekombinantna proizvodnja kod prokariotskih ćelija
[0429] a) Konstrukcija vektora
[0430] Sekvence polinukleinskih kiselina koje koje kodiraju antitela koja obuhvata CAR ovog pronalaska mogu da se dobiju pomoću standardnih rekombinantnih tehnika. Željene sekvence polinukleinskih kiselina mogu da se izoluju i sekvenciraju iz ćelija koje proizvode antitela kao što su hibridomske ćelije. Alternativno, polinukleotidi mogu da se sintetišu pomoću sintetizatora nukleotida ili PCR tehnike. Nakon što se dobiju, sekvence koje kodiraju polipeptid se umeću u rekombinantni vektor sposoban za replikaciju i ekspresiju heterolognih polinukleotida u prokariotskim domaćinima. Mnogi vektori koji su dostupni i poznati u ovoj oblasti mogu da se koriste u svrhu ovog pronalaska. Izbor pogodnog vektora će uglavnom zavisiti od veličine nukleinskih kiselina koje će se umetati u vektor i određenoj ćeliji domaćinu koja će se transformirati sa vektorom. Svaki vektor sadrži različite komponente, u zavisnosti od njegove funkcije (amplifikacija ili ekspresija heterolognog polinukleotida, ili oboje) i njegovoj kompatibilnosti sa određenom ćelijom domaćinom u kojoj se nalazi. Komponente vektora generalno uključuju, ali bez ograničenja na: poreklo replikacije, gen marker izbora, promoter, mesto vezivanja ribozoma (RBS), signalizirajuću sekvencu, heterologno umetanje nukleinske kiseline i sekvencu za završetak transkripcije.
[0431] Generalno, plazmidni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su izvedene iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćinom se koriste u vezi sa tim domaćinima. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i sekvence za označavanje koje su sposobne da osiguraju fenotipski izbor u transformisanim ćelijama. Na primer, E coli se obično transformiše pomoću pBR322, plazmida izvedenog iz E coli vrsta. pBR322 sadrži gene koji kodiraju otpornost na ampicilin (Amp) i tetraciklin (Tet) i na taj način osigurava jednostavan način za identifikaciju transformisanih ćelija. pBR322, njegovi derivati ili drugi mikrobni plazmidi ili bakteriofazi mogu takođe da sadrže, ili da budu modifikovani da sadrže, promotere koje mikrobni organizam može da koristi za ekspresiju endogenih proteina. Primeri derivata pBR322 koji se koriste za ekspresiju određenih antitela detaljno su opisani u Carter et al., američki pat. br. 5,648,237.
[0432] Pored toga, vektori faga koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su kompatibilne sa mikroorganizmom domaćinom mogu da se koriste kao transformirajući vektori u vezi sa tim domaćinima. Na primer, bakteriofag kao što je GEM<™>-11 može da se koristi za izradu rekombinantnog vektora koji može da se koristi za transformaciju osetljivih ćelija domaćina kao što su E coli LE392.
[0433] Ekspresioni vektor može da obuhvata dva ili više parova promoter-cistron, koji kodiraju svaku od polipeptidnih komponenti. Promoter je neprevedena regulatorna sekvenca koja se nalazi ushodno (5') od cistrona koji modulira njegovu ekspresiju. Prokariotski promoteri obično spadaju u dve klase, inducibilne i konstitutivne. Inducibilni promoter je promoter koji pokreće povećane nivoe transkripcije cistrona pod svojom kontrolom kao odgovor na promene u uslovima kulture, npr. prisutnost ili odsutnost hranjivog sastojka ili promena temperature.
[0434] Dobro je poznat veliki broj promotera koje prepoznaju raznolike potencijalne ćelije domaćina.
[0435] Odabrani promoter može operativno da se poveže sa cistron DNK koja kodira laki ili teški lanac uklanjanjem promotera iz izvorne DNK digestijom restrikcionog enzima i umetanjem izolovane promoterske sekvence u vektor. I nativna sekvenca promotera i mnogi heterologni promoteri mogu da se koriste za usmeravanje pojačanja i/ili ekspresije ciljanih gena. Mogu da se koriste heterologni promoteri, budući da oni generalno dopuštaju veću transkripciju i veće prinose eksprimiranog ciljanog gena u poređenju sa nativnim ciljanim polipeptidnim promoterom.
[0436] Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju PhoA promoter, sisteme promotera galaktamaze i laktoze, sistem promotera triptofana (trp) i hibridne promotere kao što je tac ili trc promoter. Međutim, drugi promoteri koji su funkcionalni u bakterijama (kao što su drugi poznati bakterijski ili fagni promoteri) su takođe pogodni. Njihove sekvence nukleinskih kiselina su objavljene, čime je iskusnom radniku omogućeno operativno povezivanje sa cistronima koji kodiraju ciljane lake i teške lance (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) pomoću linkera ili adaptera za snabdevanje bilo kog od traženog restrikcionog mesta.
[0437] U jednom aspektu, svaki cistron unutar rekombinantnog vektora sadrži komponentu sekvence signala sekrecije koja usmerava premeštanje eksprimiranih polipeptida preko membrane. Generalno, signalizirajuća sekvenca može biti komponenta vektora ili može biti deo DNK ciljanog polipeptida koji je umetnut u vektor. Sekvenca signala odabrana u svrhu ovog pronalaska bi trebalo da bude ona koju prepoznaju i obrađuju (tj. cepa se signalizirajućom peptidazom) ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju signalizirajuće sekvence izvorne za heterologne polipeptide, signalizirajuća sekvenca je zamenjena prokariotskom signalizirajućom sekvencom odabranom, na primer, iz grupe koja se sastoji od alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp ili enterotoksina II (STII) stabilnog u smislu toplote, LamB, PhoE, PelB, OmpA i MBP. Signalizirajuće sekvence koje se koriste u oba cistrona ekspresionog sistema mogu biti STII signalizirajuće sekvence ili njihove varijante.
[0438] Proizvodnja antitela može da se javi u citoplazmi ćelije domaćina i stoga ne zahteva prisutnost signalizirajućih sekvenci sekrecije unutar svakog cistrona. Polipeptidne komponente, kao što je polipeptid koji kodira V<H>domen prvog antigen-vezujućeg antigena opciono spojen sa drugim antigenski vezujućim delom antigena, i polipeptid koji kodira V<L>domen prvog antigen-vezujućeg dela po izboru spojen sa drugim antigenski vezujućim delom, mogu biti eksprimirane, savijene i sklopljene tako da obrazuju funkcionalna antitela unutar citoplazme. Određeni sojevi domaćina (npr., E coli trxB sojevi) obezbeđuju uslove citoplazme koji su povoljni za obrazovanje disulfidne veze, čime se dopušta pravilno savijanje i sastavljanje eksprimiranih proteinskih podjedinica. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
[0439] [0277] Ovde je otkriven ekspresioni sistem u kojem kvantitativni odnos eksprimiranih polipeptidnih komponenata može biti moduliran kako bi se maksimalno povećao prinos izlučenih i pravilno sklopljenih antitela. Takva modulacija se postiže barem delimično istovremenim moduliranjem translacionih snaga za polipeptidne komponente. Jedna tehnika za moduliranje translacione snage je otkrivena u Simmons et al., američki pat. br.5,840,523. Koristi varijante regiona inicijacije translacije (TIR) unutar cistrona. Za dati TIR, niz varijanti sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina može da se kreira sa opsegom translacionih snaga, čime se osigurava pogodan način za podešavanje ovog faktora za željeni nivo ekspresije specifičnog lanca. TIR varijante mogu da nastaju uobičajenim tehnikama mutageneze koje dovode do promena kodona koje mogu promeniti sekvencu aminokiselina, iako su poželjne tihe promene u sekvenci nukleinske kiseline. Promene u TIR-u mogu da uključuju, na primer, promene u broju ili razmaku Shine-Dalgarno sekvenci, zajedno sa promenama u signalizirajućoj sekvenci. Jedan postupak za stvaranje mutantnih signalizirajućih sekvenci je stvaranje "banke kodona" na početku kodirajuće sekvence koja ne menja aminokiselinsku sekvencu signalizirajuće sekvence (tj., promene su tihe). To može da se postigne promenom položaja trećeg nukleotida svakog kodona; dodatno, neke aminokiseline, kao što su leucin, serin i arginin, imaju višestruke prve i druge položaje koji mogu dodatno da otežaju stvaranje banke. Ovaj postupak mutageneze detaljno je opisan u Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158.
[0440] Poželjno je da se skup vektora pravi u opsegu TIR snaga za svaki cistron u njemu. Ovaj ograničeni skup pruža poređenje nivoa ekspresije svakog lanca kao i prinos željenih proteinskih proizvoda pod različitim kombinacijama TIR snage. Snage TIR mogu da se odrede kvantifikovanjem nivoa ekspresije reporterskog gena kao što je detaljno opisano u Simmons et al. američki pat. br.5,840,523. Na osnovu poređenja translacione snage, odabrani su željeni pojedinačni TIR koji će se kombinovati u ekspresionim vektorskim konstruktima ove prijave.
[0442] b) Prokariotske ćelije domaćina.
[0443] Prokariotske ćelije domaćina pogodne za ekspresiju antitela uključuju Archaebacteria i Eubacteria, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi. Primeri korisnih bakterija uključuju Escherichia (npr. E. coli), Bacili (npr. B. subtilis), enterobakterije, Pseudomonas vrsta (npr. P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ili Paracoccus. U nekim načinima ostvarivanja koriste se gram-negativne ćelije. U jednom primeru, E coli ćelije se koriste kao domaćini. Primeri za sojeve E coli uključuju soj W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol.2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp.
[0444] 1190-1219; ATCC broj depoa 27,325) i njihove derivate, uključujući soj 33D3 koji ima genotip W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kan<R>(američki pat. br.5,639,635). Drugi sojevi i njihovi derivati, kao što je E coli 294 (ATCC 31,446), E coli B, E coli 1776 (ATCC 31,537) i E coli RV308 (ATCC 31,608) su takođe pogodni. Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući. Postupci za konstruisanje derivata bilo koje od gore pomenutih bakterija koje imaju definisane genotipove poznate su u ovoj oblasti i opisane u, na primer, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Generalno je potrebno da se izaberu odgovarajuće bakterije uzimajući u obzir replikaciju replikona u ćelijama bakterije. Na primer, E. coli, Serratia, ili Salmonela vrste mogu pogodno da se koriste kao domaćini kada se dobro poznati plazmidi kao što su pBR322, pBR325, pACYC177 ili pKN410 koriste za snabdevanje replikonom.
[0445] Obično, ćelija domaćina bi trebalo da luči minimalne količine proteolitičkih enzima, a dodatni inhibitori proteaze mogu poželjno da se ugrađuju u ćelijsku kulturu.
[0447] c) Proizvodnja proteina
[0448] Ćelije domaćina se transformišu sa goreopisanim ekspresionim vektorima i kultivišu se u uobičajenim hranjivim podlogama modifikovanim prema potrebi za indukovanje promotera, izbor transformanata ili pojačanje gena koji kodiraju željene sekvence. Transformacija znači uvođenje DNK u prokariotski domaćin tako da se DNK može replicirati, bilo kao ekstrakromosomski element ili kromosomski integrant. U zavisnosti od ćelije domaćina koja se koristi, transformacija se izvodi pomoću standardnih tehnika pogodnih za takve ćelije. Tretiranje kalcijumom koje koristi kalcijum-hlorid se generalno koristi za bakterijske ćelije koje sadrže suštinske barijere ćelijskih zidova. Drugi postupak za transformaciju koristi polietilen glikol/DMSO. Još jedna tehnika koja se koristi je elektroporacija.
[0449] Prokariotske ćelije koje se koriste za proizvodnju antitela uzgajaju se u podlogama poznatim u ovoj oblasti i pogodnim za kulturu odabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih podloga uključuju luria bujon (LB) plus potrebne hranjive dodatke. U nekim primerima, podloga takođe sadrži selekciono sredstvo, odabrano na osnovu konstrukcije ekspresionog vektora, da se selektivno omogući rast prokariotskih ćelija koje sadrže ekspresioni vektor. Na primer, ampicilin se dodaje u podlogu za rast ćelija koje eksprimiraju gen otporan na ampicilin.
[0450] Svi potrebni dodaci osim izvora ugljenika, azota i neorganskih fosfata takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama uvedeni sami ili kao mešavina sa drugim dodatkom ili podlogom kao što je složeni izvor azota. Opciono, podloga kulture može da sadrži jedno ili više redukcionih sredstava izabranih iz grupe koju čine glutation, cistein, cistamin, tioglikolat, ditioeritritol i ditiotreitol.
[0451] Prokariotske ćelije domaćina se kultivišu na odgovarajućim temperaturama. Za rast E coli, na primer, poželjna temperatura je u opsegu od oko 20°C do oko 39°C, poželjnije od oko 25°C do oko 37°C, još poželjnije na oko 30°C. pH podloge može biti bilo koji pH u opsegu od oko 5 do oko 9, u zavisnosti uglavnom od organizma domaćina. Za E coli, pH je poželjno od oko 6,8 do oko 7,4, a poželjnije oko 7,0.
[0452] Ako se inducibilni promoter koristi u ekspresionom vektoru, ekspresija proteina se inducira pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotera. U jednom aspektu PhoA promoteri se koriste za kontrolu transkripcije polipeptida. U skladu sa tim, transformisane ćelije domaćina se kultivišu u podlozi za ograničavanje fosfata za indukciju. Poželjno, podloga za ograničavanje fosfata je C.R.A.P podloga (videti, npr. Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Mogu se koristiti različiti drugi induktori, u skladu sa konstruktom vektora koji se koristi, kao što je poznato u ovoj oblasti.
[0453] [0286] Eksprimirana antitela se izlučuju u periplazmu ćelija domaćina i iz nje se oporavljaju. Oporavak proteina obično uključuje ometanje mikroorganizama, generalno sredstvima kao što su osmotski šok, sonikacija ili liza. Kada se ćelije poremete, ćelijski ostaci ili cele ćelije mogu da se uklone centrifugiranjem ili filtracijom. Proteini mogu dalje da se pročiste, na primer, hromatografijom na afinitetnoj smoli. Alternativno, proteini se mogu transportovati u podlogu kulture i iz nje se izolovati. Ćelije mogu da se uklone iz kulture, a supernatant kulture se filtrira i koncentruje za dalje prečišćavanje proizvedenih proteina. Eksprimirani polipeptidi mogu dalje da se izoluju i identifikuju pomoću opšte poznatih postupaka kao što je elektroforeza u poliakrilamidnom gelu (PAGE) i Western blot analiza.
[0454] Alternativno, proizvodnja proteina se izvodi u velikim količinama postupkom fermentacije. Za proizvodnju rekombinantnih proteina dostupni su različiti postupci fermentacije velikih razmera sa punjenjem. Fermentacije velikih razmera imaju najmanje 1000 litara kapaciteta, poželjno oko 1.000 do 100.000 litara kapaciteta. Ovi fermentori koriste propelere mešalice za distribuciju kiseonika i hranjivih materija, posebno glukoze (poželjni izvor ugljenika/energije). Fermentacija u malim razmerama generalno se odnosi na fermentaciju u fermentoru čiji zapreminski kapacitet nije veći od približno 100 litara, a može se kretati od oko 1 litra do oko 100 litara.
[0455] Tokom procesa fermentacije, indukcija ekspresije proteina obično se pokreće nakon što se ćelije uzgajaju u odgovarajućim uslovima do željene gustine, npr., OD<550>od oko 180-220, u kojoj su fazi ćelije u ranoj stacionarnoj fazi. Mogu da se koriste različiti induktori, u skladu sa korišćenim konstruktom vektora, kao što je poznato u ovoj oblasti i opisano gore. Ćelije mogu da se uzgajaju tokom kraćih perioda pre indukcije. Ćelije se obično indukuju oko 12-50 sati, iako mogu da se koriste duže ili kraće vreme indukcije.
[0456] Da bi se poboljšao proizvodni prinos i kvalitet antitela, različiti uslovi fermentacije mogu da se modifikuju. Na primer, za poboljšanje pravilnog sastavljanja i savijanja izlučenih polipeptida, dodatni vektori koji prekomerno eksprimiraju šaperonske proteine, kao što su Dsb proteini (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i/ili DsbG) ili FkpA (peptidilprolil cis,trans-izomeraza sa šaperonskom aktivnošću ) mogu da se koriste za kotransformaciju prokariotskih ćelija domaćina. Dokazano je da proteini šaperona olakšavaju pravilno savijanje i rastvorljivost heterolognih proteina proizvedenih u bakterijskim ćelijama domaćinima. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., američki pat. br.
[0457] 6,083,715; Georgiou et al., američki pat. br.6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem.
[0458] 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem.275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol.39:199-210.
[0459] Kako bi se proteoliza eksprimiranih heterolognih proteina (posebno onih koji su proteolitički osjetljivi) svela na minimum, određeni sojevi domaćina sa nedostatkom proteolitičkih enzima mogu da se koriste za ovaj pronalazak. Na primer, sojevi ćelija domaćina mogu da se modifikuju da utiču na genetsku(e) mutaciju(e) u genima koji kodiraju poznate bakterijske proteaze kao što su Proteaza III, OmpT, DegP, Tsp, Proteaza I, Proteaza Mi, Proteaza V, Proteaza VI i njihove kombinacije. Neki E coli sojevi sa manjkom proteaze dostupni su i opisani u, na primer,, Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., američki pat. br.5,264,365; Georgiou et al., američki pat. br.5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
[0460] Sojevi E. coli kojima fale proteolitičke enzime i transformisani sa plazmidima koji prekomerno eksprimiraju jedan ili više proteina šaperona mogu da se koriste kao ćelije domaćini u ekspresionom sistemu koji kodira antitela.
[0462] d) Prečišćavanje proteina
[0463] Ovde proizvedena antitela dalje se prečišćavaju kako bi se dobili preparati koji su suštinski homogeni za dalje analize i upotrebe. Mogu da se upotrebe standardni postupci prečišćavanja proteina poznati u ovoj oblasti. Sledeći postupci su primeri prikladnih postupaka prečišćavanja: frakcionisanje na imunoafinitetnim ili jonsko-izmjenjivačkim kolonama, taloženje etanolom, reverzno-fazna HPLC, hromatografija na silicijumu ili na katjonsko-izmjenjivačkoj smoli kao što je DEAE, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, taloženje amonijum-sulfatom, i gel filtracija pomoću, na primer, Sephadex G-75.
[0464] U jednom aspektu, Protein A imobilisan na čvrstoj fazi koristi se za imunoafinitetno prečišćavanje antitela koja sadrže Fc region ove prijave. Protein A je protein ćelijskog zida 41 kD Staphylococcus aureas koji se sa visokim afinitetom veže na Fc region antitela. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth.
[0465] 62:1-13. Čvrsta faza na kojoj je protein A imobilisan je poželjno kolona koja sadrži površinu od stakla ili silicijuma, poželjnije staklena kolona sa kontrolisanim porama ili kolona silicijumove kiseline. U nekim je primenama kolona obložena reagensom, poput glicerola, u pokušaju da se spreči nespecifično prianjanje kontaminanata. Čvrsta faza se zatim ispere kako bi se uklonili kontaminanti nespecifično vezani za čvrstu fazu. Na kraju se antitela od značaja izdvajaju iz čvrste faze eluiranjem.
[0467] 4. Rekombinantna proizvodnja u eukariotskim ćelijama
[0468] Za eukariotsku ekspresiju, komponente vektora generalno uključuju, ali bez ograničenja na, jednu ili više od sledećih, signalizirajuću sekvencu, izvor replikacije, jedan ili više marker gena i pojačivač element, promoter i sekvencu za završetak transkripcije.
[0470] a) Komponenta signalizirajuće sekvence
[0471] Vektor za upotrebu u eukariotskom domaćinu takođe može predstavljati umetanje koje kodira signalizirajuću sekvencu ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-kraju zrelog proteina ili polipeptida. Poželjno je da odabrana heterologna signalizirajuća sekvenca bude ona koja se prepoznaje i obrađuje (tj., cepan signalizirajućom peptidazom) od strane ćelije domaćina. U ekspresiji ćelija sisara, dostupne su signalizirajuće sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, signalizirajući herpes simplex gD.
[0472] DNK za takav prekursorski region je ligirana u okviru za očitavanje sa DNK koja kodira antitela.
[0473] b) Poreklo replikacije
[0474] Generalno, poreklo replikacione komponente nije potrebno za ekspresione vektore sisara (SV40 poreklo može obično da se koristi samo jer sadrži rani promoter).
[0476] c) Selekciona genska komponenta
[0477] Ekspresioni vektori i kloniranja mogu da sadrže selekcioni gen, koji se takođe naziva selektivni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) nadopunjuju auksotrofne nedostatke, ili (c) snabdevaju kritične hranjive materije koje nisu dostupne iz složenih podloga, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za bacile.
[0478] Jedan primer selekcione šeme koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. One ćelije koje su uspešno transformisane heterolognim genom proizvode protein koji daje otpornost na lekove i tako preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.
[0479] Još jedan primer prikladnih markera koji mogu da se izaberu za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih za preuzimanje nukleinske kiseline koja kodira antitela, kao što su DHFR, timidin kinaza, metalotionein-I i -II, poželjno metalotioneinski geni primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaze itd.
[0480] Na primer, ćelije transformisane DHFR selekcionim genom su prve identifikovane kultivisanjem svih transformanta u podlozi za kulture koja sadrži metotreksat (Mtx), kompetetivni antagonist DHFR. Prigodna ćelija domaćina kada se koristi DHFR divljeg tipa je jajna ćelijska linija kineskog hrčka (CHO) kod DHFR dejstva (npr., ATCC CRL-9096).
[0481] Alternativno, ćelije domaćina (naročito domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisane ili ko-transformisane sa sekvencama DNK koje kodiraju polipeptid, divljim tipom DHFR proteina i drugim selektivnim markerom kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH) mogu biti izabrane po ćelijskom ratu u podlozi koja sadrži selekcioni agens za selektabilni marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418. Videti američki pat. br.4,965,199.
[0483] d) Komponenta promotera
[0484] Ekspresioni i klonirajući vektori obično sadrže promoter koji prepoznaje organizam domaćina i koji je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira željene polipeptidne sekvence.
[0485] Praktično svi eukariotski geni imaju AT-bogati region smešten 25 do 30 ushodno od mesta gde je transkripcija započeta. Druga sekvenca pronađena 70 do 80 baza ushodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid.3' kraj većine eukariota je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence mogu da se umetnu u eukariotske ekspresione vektore.
[0486] Ostali promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoter, sisteme promotera laktamaze i laktoze, promoter alkalne fosfataze, promoteriki sistem triptofana (trp) i hibridne promotere kao što je tac promoter. Međutim, pogodni su drugi poznati bakterijski promoteri. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe će sadržati Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu operativno povezanu sa DNK koja kodira antitela.
[0487] Transkripciju polipeptida iz vektora u ćelijama domaćina sisara kontrolišu, na primer, promoteri dobijeni iz genoma virusa kao što su polioma virus, virus kokošijih boginja, adenovirus (kao što je adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus , virus hepatitisa B i najpoželjnije Simian virus 40 (SV40), iz heterolognih promotera sisara, npr., promoter aktina ili promoter imunoglobulina, od promotera toplotnog udara, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0488] Rani i kasni promoteri SV40 virusa se uobičajeno dobijaju u obliku SV40 restrikcionog fragmenta koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promoter ljudskog citomegalovirusa se uobičajeno dobija kao HindIII E restrikcioni fragment. Sistem za ekspresiju DNK u domaćinima sisarima koji koriste goveđi papiloma virus kao vektor otkriven je u američkom pat. br.4,419,446.
[0489] Modifikacija ovog sistema opisana je u američkom pat. br.4,601,978. Videti takođe Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) o ekspresiji cDNK humanog interferona u mišjim ćelijama pod kontrolom promotera timidin kinaze iz herpes simplex virusa. Alternativno, dugo terminalno ponavljanje virusa Rousovog sarkoma može da se koristi kao promoter.
[0491] e) Komponenta elementa pojačivača
[0492] Transkripcija DNK koja kodira antitela kod viših eukariota se često povećava umetanjem pojačivačke sekvence u vektor. Mnoge pojačivačke sekvence sada su poznate iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, obično se koristi pojačivač iz virusa eukariotskih ćelija. Primeri uključuju SV40 pojačivač na kasnoj strani početka replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani polazišta replikacije i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) o elementima za poboljšanje aktivacije eukariotskih promotera. Pojačivač može da se spoji u vektor na položaju 5' ili 3' u odnosu na sekvencu koja kodira polipeptid, ali se poželjno nalazi na mestu 5' od promotera.
[0494] f) Terminaciona komponenta transkripcije
[0495] [0308] Ekspresioni vektori korišćeni u eukariotskim ćelijama domaćinima (kvasci, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudi ili ćelije sa jezgrom iz drugih višećelijskih organizama) takođe će sadržati sekvence potrebne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže segmente nukleotida transkribovane kao poliadenilisani fragmenti u neprevedenom delu mRNK koja kodira polipeptid. Jedna korisna komponenta završetka transkripcije je region poliadenilacije goveđeg hormona rasta. Videti WO94/11026 i ekspresioni vektor koji je tamo otkriven.
[0497] g) Izbor i transformacija ćelija domaćina
[0498] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde uključuju ćelije višeg eukariota koje su ovde opisane, uključujući ćelije domaćine kičmenjaka. Razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kulturi tkiva) postalo je rutinski postupak. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su linija CV1 bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega ljudskog embriona (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., J. Gen Virol.
[0499] 36:59 (1977)); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 77:4216 (1980)); mišje Sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije majmunskog bubrega (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije ljudskog karcinoma vrata materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivolskog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije ljudskih pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija ljudskog hepatoma (Hep G2).
[0500] Ćelije domaćina se transformišu sa gore opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za proizvodnju antitela i kultivišu u uobičajenim hranjivim podlogama modifikovanim prema potrebi za indukovanje promotera, izbor transformanata ili pojačanje gena koji kodiraju željene sekvence.
[0502] h) Kultivisanje ćelija domaćina
[0503] Ćelije domaćina koje se koriste za proizvodnju antitela mogu da se uzgajaju u različitim podlogama. Komercijalno dostupne podloge kao što su Hamov F10 (Sigma), minimalna esencijalna podloga ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbekova modifikaciona Eagleova podloga ((DMEM), Sigma) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Osim toga, bilo koja podloga opisana u Ham et al., Meth. Enz.58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), američki pat. br.
[0504] 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili američka pat. re. 30,985 mogu da se koriste kao podloge za kulturu ćelija domaćina. Bilo koja od ovih podloga može prema potrebama da se dopunjava hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što je insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što je natrijum-hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES ), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je GENTAMYCIN<™>lek), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoza ili ekvivalentni izvor energije. Svi drugi potrebni dodaci takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima iz ove oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju, i biće očigledni običnom stručnjaku iz oblasti.
[0506] i) Prečišćavanje proteina
[0507] Pri korišćenju rekombinantnih tehnika antitela mogu biti proizvedena intracelularno, u periplazmatskom prostoru ili se direktno izlučuju u podlogu. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, čestice otpadaka, bilo ćelija domaćina ili lizovanih fragmenata se uklanjaju, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) opisuju postupak za izolaciju antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor E coli. Ukratko, ćelijska pasta se otopi u prisustvu natrijum-acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ostaci ćelija mogu da se uklone centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo izlučuje u podlogu, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvo koncentruju upotrebom komercijalno dostupnog filtera za koncentraciju proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltraciona jedinica. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može da se uključi u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize, a antibiotici mogu da se uključe kako bi se sprečio rast sporednih kontaminanata.
[0508] Sastav proteina proizvedenog od ćelija može biti prečišćen pomoću, na primer, hidroksilapatitne hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog Fc domena imunoglobulina koji je prisutan u antitelu. Protein A može da se koristi za prečišćavanje antitela koja su bazirana na humanim imunoglobulinima koji sadrže 1, 2 ili 4 teška lanca (Lindmark et al., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve izotipove miševa i za ljude 3 (Guss et al., EMBO J.5:1567-1575 (1986.)). Matrica na koju je vezan afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice kao što je staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stiren-divinil)benzen omogućavaju brže protoke i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Kada antitelo sadrži C<H>3 domen, Bakerbond ABXTM smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) se koristi za prečišćavanje. Ostale tehnike za prečišćavanje proteina kao što je frakcionisanje na koloni za jonsku razmenu, taloženje etanolom, HPLC reverzne faze, hromatografija na silikagelu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE<™>hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmjenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromatografsko fokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum-sulfatom su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba da se oporavi.
[0509] Nakon bilo kog preliminarnog koraka prečišćavanja, mešavina koja sadrži antitelo od značaja i kontaminante može se podvrgne hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji sa niskom pH pomoću elucionog pufera na pH između oko 2,5-4,5, poželjno izvedeno pri niskim koncentracijama soli (npr., od oko 0-0,25 M soli).
[0510] Imunokonjugati (Odeljak "Imunokonjugati" je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja otkriveni u ovom odeljku Imunokonjugati nisu načini ostvarivanja ovog pronalaska.)
[0511] U nekim načinima ostvarivanja takođe postoje imunokonjugati koji sadrže bilo koja od ovde opisanih antitela (kao što su jednodomenska antitela) konjugovana na jednom ili više citotoksičnih sredstava, kao što su hemoterapijska sredstva ili lekovi, sredstva za inhibiciju rasta, toksini (npr., proteinski toksini, enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
[0512] U nekim načinima ostvarivanja, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kojem je antitelo konjugovano na jednom ili više lekova, uključujući ali bez ograničenja na majtanzinoid (videti američki patent br.5,208,020, 5,416,064 I evropski patent EP 0425235 B1); auristatin kao što su monometilauristatinski delovi DE i DF (MMAE i MMAF) (videti američke patente br.
[0513] 5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (videti američke patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res.53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (vidjeti Kratz et al., Current Med. Chem.13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Pisma 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Akad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Pisma 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.45:4336-4343 (2002); i američki patent br.
[0514] 6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan poput docetaksela, paklitaksela, larotaksela, tesetaksela i ortataksela; trihotecen; i CC1065.
[0515] U nekim načinima ostvarivanja, imunokonjugat obuhvata antitelo kao što je ovde opisano konjugovano na enzimatski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući ali bez ograničenja na lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac eksotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina A, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, proteini diantin, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, curcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restriktocina, fenomicina, enomicina i trikotecena.
[0516] U nekim načinima ostvarivanja, imunokonjugat obuhvata antitelo kao što je ovde opisano konjugovano na radioaktivnomm atomu kako bi se obrazovao radiokonjugat. Razni radioaktivni izotopi su dostupni za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokojnugat koristi za detekciju, mogu da obuhvataju radioaktivni atom za scintigrafska ispitivanja, na primer tc99m ili I123, ili spinsko obeležavanje za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznatom kao slikanje magnetnom rezonancom, mri), kao što su jod-123 ponovo, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili železo.
[0517] [0319] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu da se naprave pomoću raznih dvofunkcionalnih proteinskih agensa za spajanje kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), dvofunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bisdiazonija (kao što je bis-(p-diazonijbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivni jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2, 4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može da se napravi kako je opisano u Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenik-14-označena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentaoctena kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionukleotida na antitelo. Videti WO94/11026. Linker može biti "linker koji se može cepati" koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može da se koristi kiselinskilabilan linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetilni linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Res.52: 127-131 (1992); američki patent br.5,208,020).
[0518] Imunokonjugati ili ADC koji su ovde naročito u razmatranju, ali bez ograničenja na takve konjugate pripremljene sa reagensima za umrežavanje, uključujući, ali bez ograničenja na, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr., od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., SAD).
[0520] Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju (odeljak „Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju“ je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja otkriveni u ovom odeljku ne predstavljaju načine ostvarivanja ovog pronalaska.)
[0521] U nekim načinima ostvarivanja, bilo koje od ovde obezbeđenih antitela (kao što su jednodomenska antitela) je korisno za detektovanje prisustva odgovarajućeg antigena (kao što je CD19, CD20, BCMA, ili CD38) u biološkom uzorku. Pojam "detektovanje" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim načinima ostvarivanja, biološki uzorak je krv, serum ili drugi tekući uzorci biološkog porekla. U nekim načinima ostvarivanja, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo.
[0522] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo anti- CD19 (kao što je bilo koje od ovde opisanih sdAb anti- CD19 ) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U daljem aspektu, dat je postupak detekcije prisustvu CD19 u biološkom uzorku. U nekim načinima ostvarivanja, postupak uključuje otkrivanje prisustvu CD19 proteina u biološkom uzorku. U određenim načinima ostvarivanja, CD19 je humani CD19. U određenim načinima ostvarivanja, postupak uključuje dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa anti-CD19 antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-CD19 antitela na CD19, i otkrivanje ukoliko se obrazuje kompleks između anti-CD19 antitela i CD19. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 antitelo se koristi za odabir subjekata pogodnih za terapiju anti-CD19 antitelima, npr. gde je CD19 biomarker za odabir pacijenata.
[0523] [0323] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeno je anti-CD20 antitelo (kao što je bilo koje od ovde opisanih anti-CD20 jednodomenskih antitela) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U dodatnom aspektu, obezbeđen je postupak detektovanja prisustva CD20 u biološkom uzorku. U određenim načinima ostvarivanja, postupak obuhvata detektovanje prisustva CD20 proteina u biološkom uzorku. U određenim načinima ostvarivanja, CD20 je humani CD20. U određenim načinima ostvarivanja, postupak obuhvata stupanje u kontakt biološkog uzorka sa anti-CD20 antitelom kao što je ovde opisano u uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-CD20 antitela za CD20, i detektovanje da li je kompleks obrazovan između anti-CD20 antitela i CD20. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD20 antitelo se koristi kako bi se izabrali subjekti koji su pogodni za terapiju anti-CD20 antitelom, npr. gde CD20 predstavlja biomarker za odabir pacijenata.
[0524] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeno je anti-BCMA antitelo (kao što kao što je bilo koje od ovde opisanih anti-BCMA jednodomenskih antitela) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U dodatnom aspektu, obezbeđen je postupak detektovanja prisustva BCMA u biološkom uzorku. U određenim načinima ostvarivanja, postupak obuhvata detektovanje prisustva BCMA protein u biološkom uzorku. U određenim načinima ostvarivanja, BCMA je humani BCMA. U određenim načinima ostvarivanja, postupak obuhvata stupanje u kontakt biološkog uzorka sa anti-BCMA antitelom kao što je ovde opisano u uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-BCMA antitela za BCMA, i detektovanje da li je kompleks obrazovan između anti-BCMA antitela i BCMA. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA antitelo je korišćeno za biranje subjekata pogodnih za terapiju sa anti-BCMA antitelom, npr. gde je BCMA biomarker za izbor pacijenata.
[0525] U nekim načinima ostvarivanja, ovde je obezbeđeno anti-CD38 antitelo (kao što kao što je bilo koje od ovde opisanih anti-CD38 jednodomenskih antitela) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U dodatnom aspektu, obezbeđen je postupak detektovanja prisustva CD38 u biološkom uzorku. U određenim načinima ostvarivanja, postupak obuhvata je humani CD38. U određenim načinima ostvarivanja, postupak obuhvata stupanje u kontakt biološkog uzorka sa anti-CD38 antitelo kao što je ovde opisano u uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-CD38 antitela za CD38, i detektovanje da li je kompleks obrazovan između anti-CD38 antitelo i CD38. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 antitelo je korišćeno za biranje subjekata pogodnih za terapiju sa anti-CD38 antitelom, npr. gde je CD38 biomarker za odabir pacijenata.
[0526] [0326] U određenim načinima ostvarivanja, obezbeđena su obeležena antitela (kao što su anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA, ili anti-CD38 jednodomenska antitela). Obeležja uključuju, ali bez ograničenja na, oznake ili ostatke koji se direktno detektuju (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronske-guste, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se neposredno detektuju, npr., putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali bez ograničenja na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H<131>I, fluorofori kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr., luciferaza svica i bakterijska luciferaza (američki patent br.4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterocikličke oksidaze kao što su urikaza i ksantin oksidaza, zajedno sa enzimom koji koristi vodonik-peroksid za oksidaciju prekursora boje kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spinska obeležavanja, bakteriofagne oznake, stabilni slobodni radikali, i slično.
[0528] III. Himerni antigen receptori Ovaj pronalazak obezbeđuje CAR kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0529] Himerni antigen receptor (CAR) može da obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jedno ili više jednodomenskih antitela (kao što je V<H>H<S>). Bilo koje od jednodomenskih antitela opisanih u odeljku II može da se koristi u ovde opisanim CAR. Primeri CAR koji obuhvataju jedno ili više V<H>H domena (tj., V<H>H-baziranih na CAR) su ilustrovani i upoređeni sa uobičajenim CAR koji obuhvataju scFv (tj., scFv-baziranih CAR) na FIG.1A-1D. Stručnjak iz ove oblasti će znati da V<H>H domeni u primerima CAR sa FIG.1A-1D mogu biti supstituisani sa drugim sdAb.
[0530] [0328] Himerni antigen receptor (CAR) može da obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. Antigen može biti izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77. sdAb može biti kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen is izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabran iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja CAR je monospecifičan. CAR može biti opisan kao viševalentan, kao što je dvovalentan ili trovalentan. U nekim načinima ostvarivanjam, CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan.
[0532] Himerni antigen receptori specifičnih ciljeva
[0533] U nekim načinima ostvarivanja, CAR prema ovom pronalasku obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata bilo koji od ovde opisanih anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA, ili anti-CD38 jednodomenskih antitela. CAR mogu biti monospecifični ili višespecifični (kao što su dvospecifični ili većeg broja specifičnosti), i CAR mogu biti opisani kao viševalenti (kao što su dvovalentni, trovalentni, ili većeg broja valentnosti). Lista primera monospecifičnih himernih antigen receptora, primera sekvenci, konstrukata i njihovih vektora su prikazani u tabeli 4 kao referenca.
[0534] Tabele 4, 5, i 6 navedene u odeljku "III. Himerni antigen receptor" koriste sledeće skraćenice: Eks: primer; Vec.: vektor; AA: aminokiselinska sekvenca iz CAR; NA: sekvenca nukleinske kiseline iz CAR; SP: signalizirajući peptid; ekstracelularni: ekstracelularni antigen vezujući domen; sdAb: jednodomensko antitelo; TM: transmembranski domen; CO1: kostimulatorni signalizirajući domen 1; CO2: kostimulatorni signalizirajući domen 2; Prim.: primarni intracelularni signalizirajući domen. Domeni su navedeni sa leva na desno svakog reda koji odgovara redosledu domena N-kraja do C-kraja CAR polipeptida.
[0536] 3. BCMA CAR
[0537] [0331] Ovaj pronalazak obezbeđuje CAR koji cilja BCMA (ovde se takođe navodi kao "BCMA CAR") koji obuhvata polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata sdAb anti-BCMA kako je definisano patentnim zahtevima (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarnu intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen sadrži kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden izveden iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) smešten između C-kraja ekstracelularnog domena vezivanja antigena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje sadrži signalizirajući peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domeni, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28 , druga kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid se sastoji od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigenski vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR može da se opiše kao monospecifičan.
[0538] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je BCMA CAR ovog pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata anti—BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu anti-BCMA sdAb obuhvata bilo koji od sledećih:
[0539] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29;
[0540] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0541] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0542] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0543] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0544] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0545] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0546] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
[0547] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37;
[0548] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38.
[0549] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39. Prvo sdAb ili drugo sdAb CAR-a prema pronalasku u nekim načinima ostvarivanja je anti-BCMA sdAb i može obuhvatati jednu od sekvenci (3) ili (10).
[0550] U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA može da obuhvata V<H>H domen koja sadrži aminokiselinsku sekvencu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 78-88. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen sadrži primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, Ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dodatno obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji je lociran između C-kraja ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dodatno obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji je lociran na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid od N-kraja do C-kraja obuhvata: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigen-vezujući domen, CD8α zglobni domen CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid od N-kraja do C-kraja obuhvata: CD8α signalni peptid, ekstracelularni antigen-vezujući domen, CD8α zglobni domen CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR je monospecifičan.
[0551] Otkriven kao referenca je BCMA CAR koji obuhvata polipeptid sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 152-162, i 257-259. Otkriven kao referenca je BCMA CAR koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 152-162, i 257-259. Takođe otkriven kao referenca je polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 152-162, i 257-259.
[0552] [0334] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od ovde otkrivenih BCMA CAR prema ovom pronalasku. Otkrivena kao referenca je izolovana nukleinska kiselina sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 175-185, i 261-263. Otkrivena kao referenca je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 175-185, i 261-263. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina može biti DNK. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina može biti RNK. U nekim načinima ostvarivanja, vektor može da obuhvata bilo koju od nukleinskih kiselina koji kodira prethodno opisane BCMA CAR ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, vektor može biti ekspresioni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0554] Tabela 4. Primeri monospecifičnih, monovalentnih CAR (otkrivenih kao referenca) Eks. vektor Eks. AA Eks. NA SP Ekstracelularno. Zglobni TM Intracelularno signaliziranje
[0556]
[0557]
[0558]
[0561] Viševalentni himerni antigen receptori
[0562] [0335] U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentne CAR-ove prema pronalasku koji imaju dva ili više (kao što je bilo koji od približno 2, 3, 4, 5, 6 ili više) mesta za vezivanje antigena koja obuhvataju jednodomenska antitela. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR cilja jedan antigen i obuhvata dva ili više mesta za vezivanje za taj antigen. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR cilja više od jednog antigena, pri čemu viševalentni CAR obuhvata dva ili više mesta za vezivanje za najmanje jedan antigen. Mesta vezivanja specifična za isti antigen mogu da se vezuju za isti epitop antigena ili se vezuju za različite epitope antigena. Mesta za vezivanje specifična za isti antigen mogu obuhvatati ista ili različita jednodomenska antitela.
[0563] U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentni (kao što je dvovalentni, trovalentni ili sa većim brojem valentnosti) himerni antigen receptor prema ovom pronalasku koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen-vezujući domen koji sadrži veći broj (kao što je najmanje bilo koji od 2, 3, 4, 5, 6 ili više) vezujućih delova koji se specifično vezuju za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U CAR prema ovom pronalasku, najmanje jedan od prvog i drugog antigena je BCMA. Otkriven ovde kao referenca, antigen može da se izabere iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77. U nekim načinima ostvarivanja, većina sdAb može biti kamelidna, himerna, ili humanizovana. U nekim načinima ostvarivanja, većina jednodomenskih antitela može biti međusobno spojena peptidnim vezama ili peptidnim linkerima. U nekim načinima ostvarivanja, svaki peptidni linker može imati dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen može biti izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen može da obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen može biti izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR može dalje da obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. Viševalentni CAR može dalje da obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid može da obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR može biti monospecifičan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR može biti multispecifičan, kao što je bispecifičan.
[0564] [0337] U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje viševalentni (kao što je dvovalentni, trovalentni, ili veće valentnosti) himerni antigen receptor ovog pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen), i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu su prvi epitop i drugi epitop različiti. U CAR ovog pronalaska, najmanje jedan od prvog i drugog antigena je BCMA. Otkriven ovde kao referenca, antigen može biti izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su međusobno povezani peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše 35, 25, 10, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen može je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen može biti izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen može biti izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje može da obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR može biti monospecifičan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan.
[0565] Ovde opisani viševalentni CAR mogu biti naročito pogodni za ciljanje multimernih antigena sinergističkim vezivanjem različitim antigen vezujućim mestima, ili za pojačavanje afiniteta vezivanja ili aviditeta antigena. Bilo koje od ovde opisanih jednodomenskih antitela, kao što su anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA, ili anti-CD38 antitela, mogu da se koriste u ekstracelularnom antigen vezujućem domenu ovde opisanih viševalentnih CAR. Lista primera monospecifičnih viševalentnih himernih antigen receptora, primera sekvenci, konstrukata i njihovih vektora je prikazana z tabeli 5.
[0567] 1. Viševalentni BCMA CAR
[0568] [0339] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je viševalentni CAR ovog pronalaska koji cilja BCMA (takođe označen kao "viševalentni BCMA CAR") koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata brojna (kao što je 2, 3, ili više) sdAb anti-BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, većina sdAb anti-BCMA se međusobno spaja peptidnim vezama ili peptidnim linkerima. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše 35, 25, 10, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen može je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen može biti izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR dalje da obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. Polipeptid može da obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR je dvovalentan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR je trovalentan. Bilo koji od sdAb anti-BCMA može da se koristi za konstruisanje viševalentnog BCMA CAR.
[0569] [0340] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je viševalentni BCMA CAR ovog pronalaska koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu se prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA specifično vezuju za različite epitope na BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na N-kraju drugog sdAb anti-BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na C-kraju drugog sdAb anti-BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. Peptidni linker može imati dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše 35, 25, 10, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata ko-stimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, ko-stimulatorni signalizirajući domen je izveden od ko-stimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR može biti dvovalentan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR može biti trovalentan. U nekim načinima ostvarivanja, ekstracelularni antigen vezujući domen dalje da obuhvata treći sdAb anti-BCMA koji se specifično vezuje za epitop koji je drugačiji od prvog i drugog sdAb anti-BCMA. Bilo koji od sdAb anti-BCMA može da se koristi za konstruisanje viševalentnog BCMA CAR.
[0570] [0341] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je viševalentni BCMA CAR ovog pronalaska koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu prvo sdAb anti-BCMA obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; i pri čemu drugo sdAb anti-BCMA obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA obuhvata V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA obuhvata V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na N-kraju drugog sdAb anti-BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA se nalazi na C-kraju drugog sdAb anti-BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb anti-BCMA i drugo sdAb anti-BCMA su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabran iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni BCMA CAR može biti opisan kao dvovalentan.
[0571] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je viševalentni BCMA CAR ovog pronalaska koja obuhvata polipeptid sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 265-270. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je viševalentni BCMA CAR ovog pronalaska koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 265-270. Ovde je takođe obezbeđen polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 265-270.
[0572] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od viševalentnih BCMA CAR ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 271-276. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 271-276. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor koji obuhvata bilo koju od nukleinskih kiselina koja kodira viševalentne BCMA CAR ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0574] Tabela 5. Primeri monospecifičnog, viševalentnog CAR.
[0576]
[0577]
[0579] (*= viševalentni BCMA CAR ovog pronalaska. Drugi CAR su otkriveni kao referenca.)
[0581] Multispecifični himerni antigen receptor
[0582] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje multispecifične himerne antigen receptore ovog pronalska koji ciljaju dva ili više (kao što je oko bilo koji od 2, 3, 4, 5, 6, ili više) različitih antigena. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR ima jedno antigen vezujuće mesto za svaki antigen. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR ima više od dva vezujuća mesta za najmanje jedantigen. Svako vezujuće mesto antigena može da obuhvata jednodomensko antitelo. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, multispecifični himerni antigen receptor je bispecifični CAR koja obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata dva različita sdAb od kojih se svaki specifično vezuje za antigen. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR predstavlja trospecifični CAR koja obuhvata ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata tri različita sdAb od koji se svako specifično vezuje za antigen.
[0583] [0345] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigen receptor (CAR) ovog pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen (kao što je prvi tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen (kao što je drugi tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu je prvi antigen drugačiji od drugog antigena. U nekim načinima ostvarivanja, prvi antigen i/ili drugi antigen je izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77, pri čemu jedan od prvog ili drugog antigena je BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, taj peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja taj transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ.
[0584] [0346] U zavisnosti od željenog antigena koji se cilja, CAR mogu biti konstruisani kako bi uključivali odgovarajuća jednodomenska antitela koja su specifična za željene antigene. Bilo koje ili više ovde opisanih anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA, ili anti-CD38 antitela mogu da se koriste u ekstracelularnom antigen vezujućem domenu u CAR. Jednodomenska antitela mogu biti raspoređena po bilo kom odgovarajućem redosledu. Na primer, prvo jednodomensko antitelo je spojeno na N-kraju ili C-kraju drugog jednodomenskog antitela. Odgovarajući peptidni linker može biti smešten između različitih jednodomenskih antitela kako bi se izbegla sterična smetnja između jednosmenskih antitela. Lista primera bispecifičnih himernih antigen receptora, primera sekvenci, konstrukata i njihovih vektora je prikazana u tabeli 6 kao referenca.
[0586] 1. BCMA × CD38 CAR
[0587] U nekim načinima ostvarivanja, CAR ovog pronalaska je bispecifični CAR koji istovremeno cilja BCMA i CD38. Na primer, BCMA i CD38 mogu da se koriste kao kandidati za ciljanje antigena eksprimiranih na ćelijama multiplog mijeloma.
[0588] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigen receptor ovog pronalaska koji cilja BCMA i CD38 (takođe ovde označen kao "BCMA × CD38 CAR") koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za BCMA i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za CD38; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb je spojeno na N-kraju drugog sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb je spojeno na C-kraju drugog sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, taj peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144-151. U nekim načinima ostvarivanja taj transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ.
[0589] [0349] Načini ostvarivanja otkriveni u stavovima [0372]–[0375] navedeni su kao reference i ne predstavljaju načine ostvarivanja ovog pronalaska.U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigen receptor koji cilja BCMA i CD38 (takođe ovde označen kao "BCMA × CD38 CAR") koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo anti-BCMA i anti-CD38 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu to jednodomensko antitelo anti-BCMA obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; i pri čemu anti-CD38 antitelo obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA i/ili anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMAs obuhvata V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 sdAb obuhvataju V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA i anti-CD38 sdAb su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA je spojen na N-kraju anti-CD38 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, prvi anti-BCMA je spojen na C-kraju anti-CD38 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, taj peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144-151. U nekim načinima ostvarivanja taj transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida.
[0590] [0350] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR koji obuhvata polipeptid koji obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, anti-CD38 jednodomensko antitelo, peptidni linker, jednodomensko antitelo anti-BCMA , CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ; pri čemu jednodomensko antitelo anti-BCMA obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; i pri čemu anti-CD38 antitelo obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim načinima ostvarivanja, taj peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144-151. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR koji obuhvata polipeptid sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 207-211. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 207-211. Ovde je takođe obezbeđen polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 207-211.
[0591] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR koji obuhvata polipeptid koji obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, jednodomensko antitelo anti-BCMA , peptidni linker, anti-CD38 jednodomensko antitelo, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ; pri čemu jednodomensko antitelo anti-BCMA obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; i pri čemu anti-CD38 antitelo obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim načinima ostvarivanja, taj peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144-151. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR koja obuhvata polipeptid sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 212-216. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 212-216. Ovde je takođe obezbeđen polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 212-216.
[0592] [0352] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od ovde obezbeđenih BCMA × CD38 CAR. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina sa najmanje oko bilo kog od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO:218-227. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:218-227. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim načinima ostvarivanja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je vektor koji obuhvata bilo koju od nukleinskih kiselina koja kodira BCMA × CD38 CAR kao što je prethodno opisano. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0594] 3. Drugi primeri multispecifičnih CAR
[0595] [0353] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigen receptor ovog pronalaska koji cilja CD19 i BCMA (takođe ovde označen kao "CD19 × BCMA CAR") koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-BCMA jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo and anti-BCMA jednodomensko antitelo su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 sdAb je spojeno na N-kraju anti-BCMA sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 sdAb je spojeno na C-kraju anti-BCMA sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, taj peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144-151. U nekim načinima ostvarivanja taj transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, CD19 × BCMA CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, CD19 × BCMA CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 jednodomensko antitelo obuhvata CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.
[0596] Tabela 6. Primeri bispecifičnih CAR.
[0598]
[0599] Ekstracelularni antigen vezujući domen
[0600] Ekstracelularni antigen vezujući domen CAR ovog pronalaska obuhvataju prvo i drugo sdAb, od kojih je svako VHH. Jednodomenska antitela mogu biti međusobno spojena direktno peptidnim vezama, ili peptidnim linkerima.
[0602] 1. Jednodomenska antitela
[0603] CAR ovog pronalaska obuhvataju ekstracelularni antigenski vezujući domen koji obuhvata prvo i drugo sdAb, od kojih svako predstavlja VHH. Ta sdAb mogu biti istog različitog porekla, i stih ili različitih veličina. Primeri sdAb uključuju, ali bez ograničenja na, varijabilne domene antitela samo teških lanaca (npr., V<H>H ili V<NAR>), vezujuće molekule koji prirodno ne sadrže lake lance, pojedinačne domene (kao što su V<H>ili V<L>) izvedene iz uobičajenih 4-lančanih antitela, humanizovana antitela samo teških lanaca, humana jednodomenska antitela koja proizvode transgeni miševi ili pacovi koji eksprimiraju segmente humanih teških lanaca, i konstruisani domeni i rešetke pojedinačnog domena pored onih izvedenih iz antitela. Bilo koja jednodomenska antitela poznata u ovoj oblasti ili koje je pronalazač razvio, uključujući sdAb opisana u prethodnom odeljku II, mogu da se koriste za konstruisanje ovde opisanih CAR. SdAb mogu biti izvedena iz bilo koje vrste uključujući, ali bez ograničenja na miša, pacova, čoveka, kamilu, lamu, zmijuljicu, ribu, morskog psa, kozu, zeca i govedo. Jednodomenska antitela koja su ovde razmatrana takođe uključuju prirodne molekule sdAb iz vrsta koje nisu Camelidae i ajkule.
[0604] U nekim načinima ostvarivanja, sdAb je izvedeno iz antigenskog vezujućeg molekula pojedinačnog lanca koji se prirodno javlja poznatog kao antitelo teškog lanca bez lakih lanaca (ove takođe označeno kao "antitela samo teških lanaca"). Takvi molekuli sa jednim domenom otkriveni su u WO 94/04678 i Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, na primer. Radi jasnoće, varijabilni domeni izvedeni iz molekule teškog lanca koji je prirodno lišen lakog lanca ovde je poznat kao V<H>H kako bi se razlikovao od uobičajenog V<H>od četiri lanca imunoglobulina. Takav V<H>molekula H može da se dobije iz antitela podignutih u Camelidae vrste, na primer, kamila, lama, vikunja, dromedar, alpaka i guanako. Druge vrste osim Camelidae mogu da proizvode molekule teškog lanca koji su prirodno lišeni lakog lanca, a takvi V<H>H su unutar opsega ovog pronalaska.
[0605] [0357] V<H>H molekuli iz kamelida su oko 10 puta manji od molekula IgG. Oni su pojedinačni polipeptidi i mogu biti vrlo stabilni, otporni na ekstremne pH i temperaturne uslove. Štaviše, mogu biti otporni na delovanje proteaza što nije slučaj sa uobičajenim 4-lančanim antitelima. Dalje, in vitro pojam V<H>H sa proizvodi visokoprinosne, pravilno savijene funkcionalne V<H>H. Osim toga, antitela stvorena u kamelidima mogu da prepoznaju epitope koji nisu prepoznati stvorenim antitelima in vitro upotrebom biblioteke antitela ili imunizacijom sisara osim kamelida (videti, na primer, WO9749805). Kao takvi, multispecifični ili viševalentni CAR koji sadrže jedan ili više V<H>H domena mogu efikasnije da komuniciraju sa ciljevima multispecifičnih ili viševalentnih CAR koji sadrže fragmente za vezivanje antigena izvedene iz uobičajenih 4-lančanih antitela. Budući da je za V<H>poznato da se H vezuju u 'neuobičajene' epitope kao što su šupljine ili brazde, afinitet CAR koji sadrže takve V<H>H<S>može biti prikladniji za terapijsko lečenje nego uobičajeni multispecifični polipeptidi.
[0606] U nekim načinima ostvarivanja, sdAb je izvedeno iz varijabilnog regiona imunoglobulina koji se nalazi u hrskavičnim ribama. Na primer, sdAb može da se izvede iz izotipa imunoglobulina poznatog kao novi antigen receptor (NAR) koji se nalazi u serumu morskog psa. Postupci proizvodnje molekula sa jednim domenom izvedenim iz varijabilnog regiona NAR ("IgNAR") opisani su u WO
[0607] 03/014161 i Streltsov (2005) Protein Sci.14:2901-2909.
[0608] U nekim načinima ostvarivanja, sdAb je rekombinantno, CDR-nakalemljeno, humanizovano, kamelizovano, deimunizovano i/ili in vitro generisano (npr., odabrano prikazom faga). U nekim načinima ostvarivanja, aminokiselinska sekvenca okvirnih regiona može da se promeni "kamelizacijom" specifičnih aminokiselinskih ostataka u okvirnim regionima. Kamelizacija se odnosi na zamenu ili supstituciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci (prirodnog) V<H>domena uobičajenog 4-lančanog antitela jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućem položaju(ima) u V<H>H domena antitela teškog lanca. To može da se izvede na način poznat per se, koji će biti jasan stručnjaku, na primer na osnovu daljeg ovde datog opisa. Takve "kamelizujuće" supstitucije poželjno su umetnute na položaje aminokiselina koje stvaraju i/ili su prisutne na V<H>-V<L>interfejsu i/ili na takozvanim ostacima kamelida, kako je ovde definisano (videti na primer WO 94/04678, Davies and Riechmann FEBS Letters 339: 285-290, 1994; Davies and Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531-537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol.259: 957-969, 1996; i Riechmann and Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25-38, 1999).
[0609] sdAb može biti humano jednodomensko antitelo koje proizvode transgeni miševi ili pacovi koji eksprimiraju segmente humanog teškog lanca. Videti , npr., US20090307787A1, U.S. Pat. No.
[0610] 8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, i WO2004049794. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb je zrelo po afinitetu.
[0611] U nekim načinima ostvarivanja, V<H>H domeni koji se prirodno javljaju protiv određenog antigena ili cilja, mogu da se dobiju iz (naivnih ili imunih) biblioteka kamelidnih V<H>H sekvenci. Takvi postupci mogu ali ne moraju da uključuju pregled takve biblioteke upotrebom navedenog antigena ili cilja, ili barem jednog njegovog dela, fragmenta, antigenske determinante ili epitopa korišćenjem jedne ili više tehnika pregleda poznatih per se. Takve biblioteke i tehnike opisane su na primer u WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 i WO 03/035694. Alternativno, poboljšane sintetičke ili polusintetičke biblioteke izvedene iz (naivnog ili imunog) V<H>biblioteka mogu da se koriste, kao što su V<H>H biblioteke dobijene iz (naivnih ili imunih) V<H>H biblioteka tehnikama kao što su nasumična mutageneza i/ili mešanje CDR, kao što je na primer opisano u WO 00/43507.
[0612] Jednodomenska antitela mogu da nastanu od uobičajenih četvorolančanih antitela. Videti, na primer, EP 0368684, Ward et al. (Nature 1989 Oct.12; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; WO 06/030220; i WO 06/003388.
[0613] 2. Antigeni
[0614] Najmanje jedan od prvog i drugog antigena CAR-a pronalaska je BCMA. Antigeni na koji ciljaju CAR ovog pronalaska su molekuli ćelijske površine. Jednodomenska antitela mogu da se izaberu kako bi se prepoznao antigen koji deluje kao marker ćelijske površine na ciljane ćelije povezane sa posebnim bolesnim stanjem. U nekim načinima ostvarivanja, prvi antigen i drugi antigen su tumorski antigeni. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR-ovi ciljaju dva ili više tumorskih antigena. U nekim načinima ostvarivanja, tumorski antigen je povezan sa malignom B ćelijom. Tumori eksprimiraju brojne proteine koji mogu da posluže kao ciljani antigen za imuni odgovor, posebno za imuni odgovor posredovan T-ćelijama. Antigeni na koje cilja CAR mogu biti antigeni na jednoj bolesnoj ćeliji ili antigeni koji se eksprimiraju na različitim ćelijama od kojih svaka pridonosi bolesti. Antigeni na koje cilja CAR mogu biti direktno ili indirektno uključeni u bolesti.
[0615] Tumorski antigeni su proteini koje proizvode tumorske ćelije koje mogu da izazovu imuni odgovor, posebno imuni odgovor posredovan T-ćelijama. Izbor ciljanog antigena će zavisiti od određene vrste kancera koji se leči. Primeri tumorskih antigena uključuju, na primer, antigen povezan sa gliomom, karcinoembrionalni antigen (CEA), β-humani korjonski gonadotropin, alfafetoprotein (AFP), lektinreaktivni AFP, tireoglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, reverzna transkriptaza ljudske telomeraze , RU1, RU2 (AS), intestinalna karboksil esteraza, mut hsp70-2, M-CSF, prostaza, antigen specifičan za prostatu (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, HER2 /neu, survivin i telomeraza, tumorski antigen-1 karcinoma prostate (PCTA-1), MAGE, ELF2M, neutrofilna elastaza, efrinB2, CD22, faktor rasta insulina (IGF)-I, IGF-II, IGF-I receptor i mezotelin.
[0616] Tumorski antigen može da sadrže jedan ili više antigenskih epitopa kancera povezanih sa malignim tumorom. Maligni tumori eksprimiraju neki broj proteina koji mogu da posluže kao ciljani antigeni za imuni napad. Ovi molekuli uključuju, ali bez ograničenja na antigene specifične za tkiva kao što su MART-1, tirozinaza i gp100 u melanomu i fosfataza prostatične kiseline (PAP) i antigen specifičan za prostatu (PSA) u kanceru prostate. Ostali ciljani molekuli pripadaju grupi transformacionih molekula kao što je onkogen HER2/Neu/ErbB-2. Još jedna grupa ciljanih antigena su onko-fetalni antigeni kao što je karcinoembrionalni antigen (CEA). U B-ćelijskom limfomu idiotip imunoglobulina specifičan za tumor čini istinski imunoglobulinski antigen specifičan za tumor koji je jedinstven za pojedinačni tumor.
[0617] Antigeni diferencijacije B-ćelija kao što su CD 19, CD20 i CD37 drugi su kandidati za ciljane antigene u B-ćelijskom limfomu.
[0618] [0366] Tumorski antigen može biti antigen specifičan za tumor (TSA) ili antigen povezan sa tumorom (TAA). TSA je jedinstven za tumorske ćelije i ne javlja se na drugim ćelijama u telu. Antigen povezan sa TAA nije jedinstven za tumorsku ćeliju, već se takođe eksprimira na normalnoj ćeliji pod uslovima koji ne uspevaju da indukuju stanje imune tolerancije na antigen. Do ekspresije antigena na tumoru može da dođe u uslovima koji omogućavaju imunom sistemu da odgovori na antigen. TAA mogu biti antigeni koji se eksprimiraju na normalnim ćelijama tokom razvoja fetusa, kada je imuni sistem nezreo i ne može da odgovori ili mogu biti antigeni koji su normalno prisutni u ekstremno niskim nivoima na normalnim ćelijama, ali koji se eksprimiraju na mnogo višim nivoima na tumorskim ćelijama.
[0619] Neograničavajući primeri TSA ili TAA antigena uključuju sledeće: antigeni diferencijacije kao što su MART-1/MelanA (MART-I), gp 100 (Pmel 17), tirozinaza, TRP-1, TRP-2 i multilinijski antigeni specifični za tumor kao što je MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; prekomerno izraženi embrionalni antigeni kao što je CEA; prekomerno izraženi onkogeni i mutirani tumor-supresorski geni kao što su p53, Ras, HER2/neu; jedinstveni tumorski antigeni koji su rezultat hromozomskih translokacija; kao što su BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; i virusni antigeni, kao što su antigeni Epstein Barr virusa EBVA i antigeni humanog papiloma virusa (HPV) E6 i E7. Drugi veliki, antigeni bazirani na proteinima uključuju TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-katenin, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 vezujući protein\protein povezan sa ciklofilinom C, TAAL6, TAG72, TLP, i TPS.
[0620] U nekim načinima ostvarivanja, antigen (kao što je prvi antigen i/ili drugi antigen) je izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77, pri čemu najmanje jedan od prvog i drugog antigena je BCMA.
[0622] 3. Peptidni linkeri
[0623] Razna jednodomenska antitela u multispecifičnim ili viševalentnim CAR koje su ovde opisane mogu međusobno da se spoje peptidnim linkerima. U nekim načinima ostvarivanja, jednodomenska antitela su direktno međusobno spojene bez bilo kakvih peptidnih linkera. Peptidni linkeri koji povezuju različita jednodomenska antitela mogu biti isti ili različiti. Različiti domeni CAR takođe mogu biti međusobno spojeni peptidnim linkerima.
[0624] [0370] Svaki peptidni linker u CAR može da ima istu ili različitu dužinu i/ili sekvencu u zavisnosti od strukturnih i/ili funkcionalnih karakteristika jednodomenskih antitela i/ili različitih domena. Svaki peptidni linker može nezavisno da se izabere i optimizuje. Dužina, stupanj fleksibilnosti i/ili druga svojstva peptidnog/ih linkera koji se koristi u CAR mogu da imaju određeni uticaj na svojstva, uključujući ali bez ogrnaičenja na na afinitet, specifičnost ili avidnost za jedan ili više određenih antigena ili epitopa. Na primer, duži peptidni linkeri mogu da se izaberu kako bi se osiguralo da se dva susedna domena međusobno ne mešaju sterički. Na primer, u viševalentnom ili multispecifičnom CAR ovog pronalaska koji obuhvata jednodomenska antitela usmerena protiv multimernog antigena, dužina i fleksibilnost peptidnih linkera su poželjno takve da omogućavaju svakom jednodomenskom antitelu u viševalentnom CAR da se vezuje za antigensku determinantu na svakoj od podjedinica multimera. U nekim načinima ostvarivanja, kratki peptidni linker može biti smešten između transmembranskog domena i intracelularnog signalizirajućog domena CAR. U nekom načinu ostvarivanja, peptidni linker sadrži fleksibilne ostatke (kao što su glicin i serin) tako da se susedni domeni mogu slobodno kretati jedna u odnosu na drugi. Na primer, dublet glicin-serina može biti pogodan peptidni linker.
[0625] Peptidni linker može imati bilo koju pogodnu dužinu. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker je najmanje bilo koje dužine od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ili više aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko bilo koje od 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili manje aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, dužina peptidnog linkera je bilo koja od oko 1 aminokiseline do oko 10 aminokiselina, oko 1 aminokiselina do oko 20 aminokiselina, oko 1 aminokiseline do oko 30 aminokiselina, oko 5 aminokiselina do oko 15 aminokiselina, oko 10 aminokiselina do oko 25 aminokiselina, oko 5 aminokiselina do oko 30 aminokiselina, oko 10 aminokiselina do oko 30 aminokiselina u dužini, oko 30 aminokiselina do oko 50 aminokiselina, oko 50 aminokiselina do oko 100 aminokiselina, ili oko 1 aminokiseline do oko 100 aminokiselina.
[0626] Peptidni linker može da ima sekvencu koja se prirodno javlja ili sekvencu koja se ne javlja prirodno. Na primer, sekvenca izvedena iz zglobnog regiona antitela samo teškog lanca može da se koristi kao linker. Videti, na primer, WO1996/34103. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker je fleksibilni linker. Primeri fleksibilnih linkera uključuju polimere glicina (G)<n>, polimere glicin-serina (uključujući, na primer, (GS)<n>, (GSGGS)<n>, (GGGS)<n>, i (GGGGS)<n>, gde n predstavlja ceo broj od najmanje jednog), glicin-alaninske polimere, alanin-serinske polimere, i druge fleksibilne linkere poznate u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu GGGGS (SEQ ID NO: 144), (GGGGS)<2>(SEQ ID NO: 145), (GGGS)<4>(SEQ ID NO: 146), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGS (SEQ ID NO: 147), GGGGSGGGGSGGGGGGSGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 148), (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 149), (GGGGS)<4>(SEQ ID NO: 150), ili (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 151).
[0628] Transmembranski domen
[0629] CAR ovog pronalaska obuhvataju transmembranski domen koji može direktno ili indirektno da se spoji na ekstracelularni antigenski vezujući domen. Transmembranski domen može biti izveden ili iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kako se ovde koristi, "transmembranski domen" se odnosi na bilo koju strukturu proteina koja je termodinamički stabilna u ćelijskoj membrani, poželjno eukariotskoj ćelijskoj membrani. Transmembranski domeni kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim CAR mogu da se dobiju iz prirodnog proteina. Alternativno, to može biti sintetički proteinski segment koji se ne pojavljuje u prirodi, npr. hidrofobni proteinski segment koji je termodinamički stabilan u ćelijskoj membrani.
[0630] [0374] Transmembranski domeni su klasifikovani na osnovu trodimenzionalne strukture transmembranskog domena. Na primer, transmembranski domeni mogu da obrazuju alfa heliks, kompleks od najviše jednog alfa heliksa, beta-barel, ili bilo koju drugu stabilnu strukturu koja može da premosti fosfolipidni dvosloj ćelije. Dalje, transmembranski domeni takođe mogu ili alternativno mogu biti klasifikovani na osnovu topologije transmembranskog domena, uključujući broj prolaza koje transmembranski domen pravi kroz membranu i orijentaciju proteina. Na primer, jednoprolazni membranski proteini prolaze ćelijsku membranu jednom, a višeprolazni membranski proteini prolaze ćelijsku membranu najmanje dva puta (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više puta). Membranski proteini mogu da se definišu kao tip I, tip II ili tip III u zavisnosti od topologije njihovih krajeva i segmen(a)ta koji prolaze kroz membranu u odnosu na unutrašnjost i spoljašnost ćelije. Membranski proteini tipa I imaju jedan membransko-premošćujući region i usmereni su tako da je N-kraj proteina prisutan na ekstracelularnoj strani lipidnog dvosloja ćelije, C-kraj proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani. Membranski protein tipa II takođe imaju jedan membransko-premošćujući region ali su usmereni tako da je C-kraj proteina prisutan na ekstracelularnoj strani lipidnog dvosloja ćelije, a N-kraj proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani. Membranski proteini tipa III više membransko-premošćujućih segmenata i dodatno mogu biti podklasifikovani na osnovu broja transmembranskih segmenata i položaja N- i C-krajeva.
[0631] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen ovde opisan CAR je izveden iz jednoprolaznog membranskog proteina tipa I. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domeni iz proteina višeprolazne membrane takođe mogu biti kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim CAR. Proteini višeprolazne membrane mogu da obuhvataju kompleks (najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više) alfa heliksa ili strukture beta lista. Poželjno, N-kraj i C-kraj proteina višeprolazne membrane su prisutni na suprotnim stranama lipidnog dvosloja, npr., N-kraj proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani lipidnog dvosloja, a C-kraj proteina je prisutan na ekstracelularnoj strani.
[0632] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CAR obuhvata transmembranski domen izabran iz grupe transmembranskih domena koju čine alfa, beta ili zeta lanac T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFI), CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gama, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (taktilni), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, i/ili NKG2C. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz molekula izabranog iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1.
[0633] [0377] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz CD28. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je transmembranski domen CD28 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CD28 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 135.
[0634] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je transmembranski domen CD8α koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CD8α kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 134.
[0635] Transmembranski domeni za upotrebu u ovde opisanim CAR takođe mogu da obuhvataju najmanje deo sintetičkog, proteinskog segmenta koji se prirodno javlja. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je sintetički, alfa heliks ili beta list koji se ne javlja prirodno. U nekim načinima ostvarivanja, proteinski segment je najmanje približno 20 aminokiselina, npr., najmanje 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ili više aminokiselina. Primeri sintetičkih transmembranskih domena su poznati u tehnici, na prime u američki patentu br.7,052,906 B1 i PCT objavi br. WO 2000/032776 A2.
[0636] Transmembranski domen može da obuhvata transmembranski region i citoplazmatski region koji se nalazi na strani C-kraja transmembranskog domena. Citoplazmatski region transmembranskog domena može da obuhvata tri ili više aminokiselina i, u nekim načinima ostvarivanja, pomaže da se usmeri transmembranski domen u lipidnom dvosloju. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više cisteinskih ostataka je prisutno u transmembranskom regionu transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više cisteinskih ostataka su prisutni u citoplazmatskom regionu transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, citoplazmatski region transmembranskog domena obuhvata aminokiselinu pod pozitivnim nabojem. U nekim načinima ostvarivanja, citoplazmatski region transmembranskog domena obuhvata aminokiselinski arginin, serin, i lizin.
[0637] U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski region transmembranskog domena sadrži hidrofobne aminokiselinske ostatke. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen CAR sadrži veštačku hidrofobnu sekvencu. Na primer, triplet fenilalanina, triptofana i valina može biti prisutan na C kraju transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski region sadrži uglavnom hidrofobne aminokiselinske ostatke, kao što su alanin, leucin, izoleucin, metionin, fenilalanin, triptofan ili valin. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski region je hidrofoban. U nekim načinima istraživanja, transmembranski region sadrži poli-leucin-alaninsku sekvencu. Hidropatija, ili hidrofobne ili hidrofilne karakteristike proteina ili proteinskog segmenta, mogu da se procene bilo kojim postupkom poznatim u ovoj oblasti, na primer Kyte i Doolittle analizom hidropatije.
[0639] Intracelularni signalizirajući domen
[0640] CAR ovog pronalaska obuhvataju intracelularni signalizirajući domen. Intracelularni signalizirajući domen je odgovoran za aktivaciju najmanje jedne od normalnih efektorskih funkcija imunske efektorske ćelije koja eksprimira CAR. Izraz "efektorska funkcija" odnosi se na specijalizovanu funkciju ćelije.
[0641] Efektorska funkcija T-ćelije, na primer, može biti citolitička aktivnost ili pomoćna aktivnost uključujući izlučivanje citokina. Stoga se izraz "citoplazmatski signalizirajući domen" odnosi na deo proteina koji transdukuje signal efektorske funkcije i usmerava ćeliju da izvrši specijalizovanu funkciju. Iako obično može da se koristi ceo citoplazmatski signalizirajući domen, u mnogim slučajevima nije potrebno da se koristi ceo lanac. U meri u kojoj se koristi skraćeni deo citoplazmatskog signalizirajućog domena, takav skraćeni deo može da se koristi umesto intaktnog lanca sve dok transdukuje signal efektorske funkcije. Izraz citoplazmatski signalizirajući domen stoga je potrebno da uključuje bilo koji skraćeni deo citoplazmatskog signalizirajućog domena dovoljan za transdukciju signala efektorske funkcije.
[0642] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarnu intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, CAR sadrži intracelularni signalizirajući domen koji se uglavnom sastoji od primarnog intracelularnog signalizirajućog domena imunske efektorske ćelije. "Primarni intracelularni signalizirajući domen" odnosi se na citoplazmatsku signalizirajuću sekvencu koja deluje na stimulirajući način da indukuje imunske efektorske funkcije. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen sadrži signalizirajući motiv poznat kao aktivacioni motiv baziran na imunoreceptorskom tirozinu, ili ITAM. "ITAM", kako se ovde koristi, je konzervirani proteinski motiv koji je generalno prisutan u repnom delu signalizirajućih molekula izraženih u mnogim imunim ćelijama. Motiv može da sadrži dva ponavljanja aminokiselinske sekvence YxxL/I odvojene sa 6-8 aminokiselina, pri čemu je svako x nezavisno bilo koja aminokiselina, stvarajući konzervirani motiv YxxL/Ix(6-8)YxxL/I. ITAM unutar signalizirajućih molekula su važni za prenos signala unutar ćelije, koji je barem delimično posredovan fosforilacijom tirozinskih ostataka u ITAM nakon aktivacije signalizirajućog molekula. ITAM takođe mogu funkcionirati kao mesta spajanja za druge proteine uključene u signalizirajuće puteve. Primeri primarnih citoplazmatskih signalizirajućih sekvenci koje sadrže ITAM uključuju one izvedene iz CD3ζ, FcR gama(FCER1G), FcR beta (Fc Epsilon Rib), CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.
[0643] U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen se sastoji od citoplazmatskog signalizirajućeg domena CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je citoplazmatski signalizirajući domen divljeg tipa CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen divljeg tipa CD3ζ obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen divljeg tipa CD3ζ kodira nukleinska kiselina SEQ ID NO: 142. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je funkcionalni mutant citoplazmatskog signalizirajućeg domena CD3ζ koji sadrži jednu ili više mutacija, kao što je Q65K. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen mutanta CD3ζ obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141. U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen kodira sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 143.
[0644] Kostimulatorni signalizirajući domen
[0645] Mnoge imunske efektorske ćelije zahtevaju ko-stimulaciju, uz stimulaciju antigen-specifičnog signala, za promovisanje ćelijske proliferacije, diferencijacije i preživljavanja, kao i za aktiviranje efektorskih funkcija ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, CAR obuhvata najmanje jednu kostimulatorni signalizirajući domen. Izraz "kostimulatorni signalizirajući domen," kako se ovde koristi, se odnosi najmanje na deo proteina koji posreduje u prenosu signala unutar ćelije kako bi se indukovao imuni odgovor kao što je efektorska funkcija. Ovde opisani kostimulatorni signalizirajući domen himernog receptora može biti citoplazmatski signalizirajući domen iz kostimulatornog proteina, koji transdukuje signal i modulira odgovore posredovane imunim ćelijama, kao što su T ćelije, NK ćelije, makrofazi, neutrofili ili eozinofila. "Kostimulatorni signalizirajući domen" može biti citoplazmatski deo kostimulatornog molekula. Izraz "kostimulatorni molekul" odnosi se na srodnog partnera za vezivanje na imunoj ćeliji (kao što je T ćelija) koji se specifično vezuje sa kostimulatornim ligandom, čime posreduje u kostimulatornom odgovoru imune ćelije, kao što je, ali nije ograničeno na proliferaciju i preživljavanje.
[0646] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata jedan kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata dva ili više (kao što je oko bilo koji od 2, 3, 4, ili više) kostimulatornih signalnih domena. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata dva ili više istih kostimulatornih signalnih domena, na primer, dve kopije kostimulatornog signalneg domena CD28. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata dva ili više kostimulatornih signalnih domena iz različitih kostimulatornih proteina, kao što je dva ili više ovde opisanih kostimulatornih proteina. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen (kao što su citoplazmatski signalizirajući domen CD3ζ) i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena i primarni intracelularni signalizirajući domen (kao što su citoplazmatski signalizirajući domen CD3ζ) međusobno su spojeni opcionim peptidnim linkerima.
[0647] Primarni intracelularni signalizirajući domen, i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena mogu biti raspoređeni bilo kojim pogodnim redom. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena se nalaze između transmembranskog domena i primarnog intracelularnog signalneg domena (kao što su citoplazmatski signalizirajući domen CD3ζ). Višestruki kostimulatorni signalizirajući domeni mogu da obezbede dodatne ili sinergističke simulatorne efekte.
[0648] [0387] Aktivacija kostimulatornog signalnog domena u ćeliji domaćina (npr., imuna ćelija) može da indukuje ćeliju da poveća ili smanji proizvodnju i izlučivanje citokina, fagocitnih svojstava, proliferacije, diferencijacije, preživljavanja i/ili citotoksičnosti. Kostimulatorni signalizirajući domen bilo kog kostimulatornog molekula može biti kompatibilan za upotrebu u CAR koji su ovde opisani. Tip(ovi) kostimulatornog signalnog domena je izabran na osnovu faktora kao što je vrsta imunih efektorskih ćelija u kojima bi se efektorski molekuli eksprimirali (npr., T-ćelije, NK-ćelije, makrofazi, neutrofili ili eozinofili) i željenu funkciju imunog efektora (npr., ADCC efekat). Primeri kostimulatornih signalnih domena za upotrebu u CAR mogu biti citoplazmatski signalizirajući domeni kostimulatornih proteina, uključujući, bez ograničenja, članove porodice B7/CD28 (npr., B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD- 1, PD-L2/B7-DC, i PDCD6); članovi TNF superporodice (npr.,4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB Ligand/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 Ligand/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 Ligand/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 Ligand/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR Ligand/TNF SF18, HVEM/TNFRSF 14, LIGHT/TNFSF14, limfotoksin-alfa/TNF-beta, OX40/TNFRSF4, OX40 Ligand/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-alfa, i TNF RII/TNFRSF1B); članovi SLAM porodice (npr., 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, i SLAM/CD150); i bilo koje druge kostimulatorne molekule, kao što su CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA Klasa I, HLA-DR, Ikaros, Integrin alfa 4/CD49d, Integrin alfa 4 beta 1, Integrin alfa 4 beta 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, limfocitna funkcija povezana sa antigenom-1 (LFA-1), i NKG2C.
[0649] U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više kostimulatornih signalizirajućih domena je izabran iz grupe koju čine CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, CD3, limfocitni antigen povezan sa funkcijom 1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 i ligandi koji se specifično vezuju za CD83.
[0650] U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen u CAR ovog pronalaska obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata a citoplazmatski signalizirajući domen iz CD3ζ i kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28 koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 138. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 228.
[0651] U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen u CAR ovog pronalaska koji obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 (tj., 4-1BB). U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata citoplazmatski signalizirajući domen iz CD3ζ i kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 139.
[0652] [0391] U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen u CAR ovog pronalaska koji obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28 i kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata citoplazmatski signalizirajući domen iz CD3ζ, kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28, i kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata polipeptid koji obuhvata od N-kraja do C-kraja: kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28, kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137, i citoplazmatski signalizirajući domen iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen iz CD28 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 138. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen iz CD137 kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 139.
[0653] Takođe u okviru opsega ovog otkrivanja su varijante bilo koje od ovde opisanih kostimulatornih signalnih domena, tako da je kostimulatorna signalna domena sposobna da modulira imuni odgovor imune ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domeni sadrže do 10 varijacija aminokiselinskih ostataka (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 8) u poređenju sa kopijom divljeg tipa. Takvi kostimulatorni signalizirajući domeni koji sadrže jednu ili više varijacija aminokiselina mogu se nazvati varijantama. Mutacija aminokiselinskih ostataka kostimulatornog signalnog domena može da dovede do povećanja signalne transdukcije i pojačane stimulacije imunih odgovora u odnosu na kostimulatorne signalne domene koji ne sadrže mutaciju. Mutacija aminokiselinskih ostataka kostimulatornog signalnog domena može da dovede do smanjenja signalne transdukcije i smanjene stimulacije imunih odgovora u odnosu na kostimulatorne signalne domene koji ne sadrže mutaciju.
[0655] Zglobni region
[0656] CAR ovog pronalaska mogu da obuhvataju zglobni domen koji se nalazi između ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena i transmembranskog domena. Zglobni domen je aminokiselinski segment koji se generalno nalazi između dva domena proteina i može da omogući fleksibilnost proteina i kretanje jednog ili oba domena u međusobnom odnosu. Može da se koristi bilo koja aminokiselinska sekvenca koja obezbeđuje takvu fleksibilnost i kretnje ekstracelularnog antigenskog vezujućeg domena u odnosu na transmembranski domen efektorskog molekula.
[0657] Zglobni domen može da sadrži oko 10-100 aminokiselina, npr., oko bilo koju od 15-75 aminokiselina, 20-50 aminokiselina, ili 30-60 aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen može da ima dužinu bilo koju od oko 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, ili 75 aminokiselina.
[0658] [0395] U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen predstavlja zglobni domen proteina koji se prirodno javlja. Zglobni domeni bilo kog proteina poznatog u ovoj oblasti da obuhvataju zglobni domen su kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim himernim receptorima. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je najmanje deo zglobnog domena proteina koji se prirodno javlja i daje fleksibilnost himernom receptoru. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je deo zglobnog domena CD8α, npr., fragment koji sadrži najmanje 15 (npr., 20, 25, 30, 35, ili 40) uzastopnih aminokiselina zglobnog domena CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen CD8α obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen CD8α kodira sekvencu nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 131.
[0659] Zglobni domeni antitela, kao što su IgG, IgA, IgM, IgE, ili IgD antitela, su takođe kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim sistemima himernih receptora zavisnih od pH. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je zglobni domen koji spaja konstantne domene CH1 i CH2 antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen je antitelo i obuhvata zglobni domen antitela i jedan ili više konstantnih regiona antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen obuhvata zglobni domen antitela i CH3 konstantni region antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen obuhvata zglobni domen antitela i CH2 i CH3 konstantni regiona antitela. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo je IgG, IgA, IgM, IgE, ili IgD antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo je IgG antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, to antitelo je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni region obuhvata zglobni region i CH2 i CH3 konstantne regione IgG1 antitela. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni region obuhvata zglobni region i CH3 konstantni region IgG1 antitela.
[0660] Peptidi koji se ne javljaju prirodno takođe mogu da se koriste kao zglobni domeni za ovde opisane himerne receptore. U nekim načinima ostvarivanja, zglobni domen između C-kraja ekstracelularnog domena vezivanja liganda Fc receptora i N-terminala transmembranskog domena je peptidni linker, kao što je (GxS)n linker, pri čemu x i n, nezavisno mogu predstavljati ceo broj između 3 i 12, uključujući3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili više.
[0662] Signalni peptid
[0663] [0398] CAR ovog pronalaska mogu da sadrže signalni peptid (takođe poznat kao signalna sekvenca) na N-kraju polipeptida. Generalno, signalni peptidi su peptidne sekvence koje ciljaju polipeptid na željeno mesto u ćeliji. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid usmerava efektorski molekul na sekretorni put ćelije i omogućiće integraciju i usidrenje efektorskog molekula u lipidni dvosloj. Signalni peptidi uključujući signalne sekvence prirodnih proteina ili sintetičke signalne sekvence koje se ne javljaju prirodno, a koji su kompatibilni za upotrebu u ovde opisanim CAR će biti očigledni stručnjaku iz oblasti. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid je izveden iz molekula odabranog iz grupe koju čine CD8α, GM-CSF receptor α i teški lanac IgG1. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid je izveden iz CD8α. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid CD8α sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 127. U nekim načinima ostvarivanja, signalni peptid CD8α je kodiran sekvencom nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 128 ili 129.
[0665] IV. Konstruisane imunske efektorske ćelije
[0666] Dalje su ovde obezbeđene imunske efektorske ćelije koje obuhvataju bilo koji od CAR ovog pronalaska.
[0667] Stoga se, u nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema (kao što je T-ćelija) koja obuhvata multispecifični (kao što je bispecifični) himerni receptor antigena (CAR) pronalaska, pri čemu navedeni CAR obuhvata polipeptid koji sadrži:
[0668] (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen (kao što je prvi tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen (kao što je drugi tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu se prvi antigen razlikuje od drugog antigena. U nekim načinima ostvarivanja, prvi antigen i/ili drugi antigen izabran je iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipid F77, pri čemu je jedan od prvog ili drugog antigena BCMA.
[0669] U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo međusobno su spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu ne veću od oko 50 (kao što je ne više od bilo koje od vrednosti 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen izabran je iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen efektorske ćelije imunog sistema (kao što je T-ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden od CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, ko-stimulatorni signalizirajući domen je izveden od ko-stimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji je smešten između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji je smešten na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD28 transmembranski domen, prvi ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, drugi ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD8α transmembranski domen, ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD28 transmembranski domen, ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je T-ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je alogena.
[0670] [0401] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema (kao što je T-ćelija) koja obuhvata BCMA × CD38 CAR pronalaska, pri čemu navedeni CAR obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb i/ili anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo međusobno su spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb je spojen na N-kraju anti-CD38 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb je spojen na C-kraju anti-CD38 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu ne veću od oko 50 (kao što je ne više od bilo koje od vrednosti 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144–151. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen izabran je iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen efektorske ćelije imunog sistema (kao što je T-ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden od CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata ko-stimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, ko-stimulatorni signalizirajući domen je izveden od kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji je smešten između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA × CD38 CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji je smešten na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD8α transmembranski domen, ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 antitelo obuhvata CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:44, CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:56 i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:68. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je T-ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je alogena.
[0671] [0402] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema (kao što je T-ćelija) koja obuhvata CD19 × BCMA CAR pronalaska, pri čemu navedeni CAR obuhvata polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-BCMA jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-BCMA jednodomensko antitelo međusobno su spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 sdAb je spojen na N-kraju anti-BCMA sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 sdAb je spojen na C-kraju anti-BCMA sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu ne veću od oko 50 (kao što je ne više od bilo koje od vrednosti 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144–151. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen izabran je iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen efektorske ćelije imunog sistema (kao što je T-ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden od CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata ko-stimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, ko-stimulatorni signalizirajući domen je izveden od kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, CD19 × BCMA CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji je smešten između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, CD19 × BCMA CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji je smešten na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD8α transmembranski domen, ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD28 transmembranski domen, ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD19 jednodomensko antitelo obuhvata CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:1, CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:2 i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:3. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je T-ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je alogena.
[0672] [0403] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema (kao što je T-ćelija) koja obuhvata viševalentni himerni receptor antigena (CAR) pronalaska, pri čemu navedeni CAR obuhvata polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata više jednodomenskih antitela (sdAb) koja se specifično vezuju za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen. Antigen može biti izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipid F77. U nekim načinima ostvarivanja, više sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, više jednodomenskih antitela međusobno su spojena peptidnim vezama ili peptidnim linkerima. U nekim načinima ostvarivanja, svaki peptidni linker ima dužinu ne veću od oko 50 (kao što je ne više od bilo koje od vrednosti 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen izabran je iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen efektorske ćelije imunog sistema (kao što je T-ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden od CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata ko-stimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden od ko-stimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji je smešten između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji je smešten na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR je monospecifičan. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan. U nekim primerima navedenim radi upućivanja, viševalentni CAR obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 198–201.
[0673] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema (kao što je T-ćelija) koja obuhvata viševalentni himerni receptor antigena (CAR) pronalaska, pri čemu navedeni CAR obuhvata polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata prvo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu se prvi epitop razlikuje od drugog epitopa. Antigen može biti izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipid F77. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo međusobno su spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu ne veću od oko 50 (kao što je ne više od bilo koje od vrednosti 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen izabran je iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen efektorske ćelije imunog sistema (kao što je T-ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden od CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, ko-stimulatorni signalizirajući domen je izveden od ko-stimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji je smešten između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji je smešten na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD8α transmembranski domen, ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je T-ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je alogena.
[0674] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđuje se inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema (kao što je T-ćelija) koja obuhvata BCMA CAR pronalaska, pri čemu navedeni CAR obuhvata polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; I (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu anti-BCMA sdAb obuhvata bilo koju od sledećih varijanti:
[0675] (12) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:7; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:18; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:29;
[0676] (13) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:8; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:19; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:30;
[0677] (14) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:9; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:20; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:31;
[0678] (15) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:10; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:21; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:32;
[0679] (16) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:11; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:22; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:33;
[0680] (17) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:12; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:23; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:34;
[0681] (18) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:13; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:24; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:35;
[0682] (19) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:14; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:25; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:36;
[0683] (20) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:15; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:26; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:37;
[0684] (21) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:16; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:27; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:38; ili
[0685] (22) CDR1 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:17; CDR2 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:28; i CDR3 koji obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:39. Prvi sdAb ili drugi sdAb CAR-a pronalaska je anti-BCMA sdAb koji obuhvata jednu od varijanti (14) ili (21). U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb obuhvata VHH domen koji sadrži sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:78–88. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen efektorske ćelije imunog sistema (kao što je T-ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen potiče od CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalizirajući domen obuhvata ko-stimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, ko-stimulatorni signalizirajući domen potiče od kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji je smešten između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dalje obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji je smešten na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD28 transmembranski domen, prvi ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja prema C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen CD8α transmembranski domen, ko-stimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR obuhvata sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:152–162. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je T-ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovana efektorska ćelija imunog sistema je alogena.
[0686] Takođe su date konstruisane imunske efektorske ćelije koje sadrže (ili eksprimiraju) dva ili više različitih CAR. Bilo koja dva ili više ovde opisanih CAR mogu da se izraze u kombinaciji. CAR mogu da ciljaju različite antigene, pružajući tako sinergističke ili dodatne efekte. Budući da antitela sa jednim domenom u ekstracelularnim antigenskim vezujućim domenima CAR imaju samo pojedinačne varijabilne lance antigena (kao što su teški lanci), takve ćelije koje eksprimiraju CAR nemaju problema sa pogrešnim spajanjem varijabilnog lanca, kao što se vidi u konstruisanim imunim efektorskim ćelijama koje zajedno eksprimiraju dva ili više CAR baziranih na scFv. Primeri konstruisanih imunih efektorskih ćelija koje zajedno eksprimiraju dva CAR zasnovanih na V<H>H su ilustrovani na FIG.1E. Stručnjak iz oblasti će prepoznati da CAR bazirani na drugim sdAb ili koji imaju druge strukture kao što je ovde opisano mogu takođe zajedno da eksprimiraju takođe u konstruisanim imunim efektorskim ćelijama. Dva ili više CAR mogu biti kodirani na istom vektoru ili različitim vektorima.
[0687] Konstruisana imunska efektorska ćelija može dalje da eksprimira jedan ili više terapeutskih proteina i/ili imunomodulatora, kao što su inhibitori imunih kontrolnih tačaka. Videti, na primer, međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/CN2016/073489 i PCT/CN2016/087855.
[0689] Vektori
[0690] [0408] Ovaj pronalazak obezbeđuje vektore za kloniranje i eksprimiranje bilo kof od CAR pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, vektor je pogodan za replikaciju i integraciju eukariotskih ćelija, kao što su ćelije sisara. U nekim načinima ostvarivanja, vektor predstavlja virusni vektor. Primeri virusnih vektora uključuju, ali bez ograničenja na, adenovirusne vektore, adeno-povezane virusne vektore, lentivirusni vektor, retrovirusne vektore, vektor vakcinije, virusni vektor herpes simplex, i njihovi derivati.
[0691] Tehnologija virusnih vektora je dobro poznata u tehnici i opisana je, na primer, kod Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), i u drugim uputstvima za virusologiju i molekulsku biologiju.
[0692] Razvijen je neki broj virusnih sistema za prenos gena u ćelije sisara. Na primer, retrovirusi obezbeđuju pogodnu platformu za sisteme isporuke gena. Heterologna nukleinska kiselina može da se umetne u vektor i upakuje u retrovirusne čestice pomoću tehnika poznatih u ovoj oblasti.
[0693] Rekombinantni virus se tada može izolovati i dostaviti u ćeliju sisara proizvedenu inženjeringom in vitro ili ex vivo. Brojni retrovirusni sistemi poznati su u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja koriste se adenovirusni vektori. Brojni adenovirusni vektori su poznati u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja koriste se lentivirusni vektori. U nekim načinima ostvarivanja koriste se samoinaktivirajući lentivirusni vektori. Na primer, samo-inaktivirajući lentivirusni vektori koji nose kodirajuću sekvencu imunomodulatora (kao što je inhibitor imune kontrolne točke) i/ili samo-inaktivirajući lentivirusni vektori koji nose himerne antigen receptore mogu da se upakuju sa protokolima poznatim u ovoj oblasti. Dobijeni lentivirusni vektori mogu da se koriste za transdukciju ćelija sisara (kao što su primarne ljudske T ćelije) pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti. Vektori izvedeni iz retrovirusa kao što je lentivirus pogodni su alati za postizanje dugotrajnog prenosa gena, jer omogućavaju dugoročnu, stabilnu integraciju transgena i njihovo umnožavanje u ćelijama potomaka. Lentivirusni vektori takođe imaju nisku imunogenost i mogu transdukovati neproliferujuće ćelije.
[0694] U nekim načinima ostvarivanja, vektor obuhvata bilo koju od nukleinskih kiselina koja kodira CAR ovog pronalaska. Nukleinska kiselina može biti klonirana u vektor pomoću bilo kog poznatog postupka molekulskog kloniranja u ovoj oblasti, uključujući na primer, upotrebu mesta restrikcione endonukleaze i jednog ili više selektabilnih markera. U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina je operabilno povezana sa promoterom. Razni promoteri su ispitani za gensku ekspresiju u ćelijama sisara, I bilo koji od promotera poznatih u ovoj oblasti može da se koristi u ovom pronalasku. Promoteri mogu biti grubo kategorisani kao konstitutivni promoteri ili regulisani promoteri, kao što su inducibilni promoteri.
[0695] [0411] U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa konstitutivnim promoterom. Konstitutivni promoteri omogućavaju heterolognim genima (takođe označenim kao transgeni) da se eksprimiraju konstitutivno u ćelijama domaćina. Primeri konstitutivnih promotera koji su u ovde razmatranju uključuju, ali bez ograničenja na, promotere citomegalovirusa (CMV), humane faktore elongacije-1alfa (hEF1α), promoter ubikvitina C (UbiC), promoter fosfoglicerokinaze (PGK), rani promoter virusa majmuna 40 (SV40), i pileći promoter β-aktina spojen sa CMV ranim pojačivačem (CAGG). Efikasnosti takvih konstitutivnih promotera na promovisanje ekspresije transgena se široko porede u velikom broju ispitivanja. Na primer, Michael C. Milone et al su poredili efikasnost CMV, hEF1α, UbiC i PGK za podsticanje ekspresije himernog antigen receptora u primarnim ljudskim T ćelijama i zaključili da promoter hEF1α ne samo da je indukovao najviši nivo ekspresije transgena, nego se takođe optimalno održavao u CD4 i CD8 ljudskim T ćelijama (Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009.)). U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa hEF1α promoterom.
[0696] U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa inducibilnim promoterom. Inducibilni promoteri pripadaju kategoriji regulisanih promotera. Inducibilni promoter može biti indukovan jednim ili više uslova, kao što je fizičko stanje, mikrookruženje modifikovane imunske efektorske ćelije ili fiziološko stanje modifikovane imunske efektorske ćelije, induktor (tj., indukujuće sredstvo), ili njihovu kombinaciju. Indukujuće stanje možda neće indukovati ekspresiju endogenih gena u ćeliji sisara proizvedenoj inženjeringom i/ili u subjektu koji prima farmaceutsku kompoziciju. Indukujuće stanje može da se izabere iz grupe koju čine: induktor, zračenja (kao što je jonizirajuće zračenje, svetlost), temperatura (kao što je toplina), redoks stanje, tumorsko okruženje i stanje aktivacije konstruisane ćelije sisara.
[0697] U nekim načinima ostvarivanja, vektor takođe sadrži pogodan genski marker ili reporterski gen za odabir ćelija koje eksprimiraju CAR iz populacije ćelija domaćina transfektovanih putem lentivirusnih vektora. Oba pogodna markera i reporterski geni mogu biti flankirani odgovarajućim regulatornim sekvencama kako bi se omogućila ekspresija u ćelijama domaćina. Na primer, vektor može da sadrži terminatore transkripcije i translacije, sekvence inicijacije, i promotere korisne za regulaciju ekspresije sekvenci nukleinske kiseline.
[0698] U nekim načinima ostvarivanja, vektor obuhvata više od jedne nukleinske kiseline koja kodira CAR. U nekim načinima ostvarivanja, vektor obuhvata nukleinsku kiselinu koja obuhvataju prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi CAR i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi CAR, pri čemu prva nukleinska kiselina je operativno povezana sa drugom nukleinskom kiselinom putem treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira samocepajući peptid. U nekim načinima ostvarivanja, samocepajući peptid je izabran iz grupe koju čine T2A, P2A i F2A. U nekim načinima ostvarivanja, T2A peptid ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254. U nekim načinima ostvarivanja, T2A peptid kodira sekvenca nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 255.
[0700] Imunske efektorske ćelije
[0701] "Imunske efektorske ćelije" su imune ćelije koje mogu da obavljaju imunske efektorske funkcije. U nekim načinima ostvarivanja, imunske efektorske ćelije eksprimiraju najmanje FcγRIII i izvode ADCC efektorsku funkciju. Primeri imunih efektorskih ćelija koje posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije, neutrofile i eozinofile.
[0702] [0416] U nekim načinima ostvarivanja, imunske efektorske ćelije su T ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije su CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8-, ili njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije proizvode IL-2, TFN, i/ili TNF nakon eksprimiranja CAR i vezivanja za ciljane T ćelije, kao što su CD20+ ili CD19+ tumorske ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, CD8+ T ćelije lizuju ciljane ćelije specifične za antigen nakon ekspresije CAR i vezivanja za ciljane ćelije.
[0703] U nekim načinima ostvarivanja, imunske efektorske ćelije su NK ćelije. U drugim načinima ostvarivanja, imunske efektorske ćelije mogu biti utvrđene ćelijske linije, na primer, NK-92 ćelije.
[0704] U nekim načinima ostvarivanja, imunske efektorske ćelije su različite od matične ćelije, kao što je hematopoietična matična ćelija, pluripotentna matična ćelija, iPS, ili embrionska matična ćelija.
[0705] Konstruisana imunske efektorske ćelije se pripremaju uvođenjem CAR imunske efektorske ćelije, kao što suT ćelije. CAR može da se uvede u imunske efektorske ćelije transfekcijom bilo koje od izolovanih nukleinskih kiselina ili bilo kojeg vektora opisanog u Odeljku III. CAR može da se uvede u imunske efektorske ćelije umetanjem proteina u ćelijsku membranu dok ćelije prolaze kroz mikrofluidni sistem, kao što je CELL SQUEEZE<®>(videti, na primer, američku objavu patentne prijave br.20140287509).
[0706] Postupci uvođenja vektora ili izolovanih nukleinskih kiselina u ćelije sisara su poznati u ovoj oblasti. Opisani vektori mogu zatim da se transfektuju u imunsku efektorsku ćeliju fizičkim, hemijskim, ili biološkim postupcima.
[0707] Fizički postupci za uvođenje vektora u imunsku efektorsku ćeliju uključuju taloženje kalcijumfosfatom, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjekciju, elektroporaciju i slično. Postupci za proizvodnju ćelija koje sadrže vektore i/ili egzogene nukleinske kiseline dobro su poznati u ovoj oblasti. Videti, na primer, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Vektor se može uneti u ćeliju elektroporacijom.
[0708] Biološki postupci za uvođenje vektora u imunsku efektorsku ćeliju uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori su postali postupak koji se najviše koristi za umetanje gena u sisarske, npr., humane ćelije.
[0709] Hemijska sredstva za uvođenje vektora u imunsku efektorsku ćeliju uključuju koloidne disperzione sisteme, kao što su kompleksi makromolekula, nanokapsule, mikrosfere, zrnca i sistemi bazirani na lipidima uključujući emulzije ulje u vodi, miscele, mešane miscele i lipozome. Primer koloidalnog sistema za upotrebu u funkciji vehikuluma isporuke in vitro je lipozom (npr., vezikula sa veštačkom membranom).
[0710] RNK molekuli koji kodiraju bilo koji od ovde opisanih CAR mogu da se pripreme uobičajenim postupkom (npr., in vitro transkripcijom) a zatim se uvode u imunske efektorske ćelije poznatim postupcima kao što je mRNK elektroporacijom. Videti, npr., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035.
[0711] [0425] Transdukovana ili transfektovana imunska efektorska ćelija može da se razmnožava ex vivo nakon uvođenja vektora ili izolovane nukleinske kiseline. Transdukovana ili transfektovana imunska efektorska ćelija može da se kultiviše za razmnožavanje najmanje oko bilo kojeg od 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 10 dana, 12 dana ili 14 dana. Transdukovana ili transfektovana imunska efektorska ćelija može dalje da se procenjuje i pregleda kako bi se odabrala modifikovana ćelija sisara.
[0712] Reporterski geni mogu da se koriste za identifikaciju potencijalno transfektovanih ćelija i za procenu funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Generalno, reporterski gen je gen koji nije prisutan u organizmu ili tkivu primaoca niti ga eksprimira i koji kodira polipeptid čija se ekspresija očitava nekim lako detektabilnim svojstvom, npr., enzimska aktivnost. Ekspresija reporterskog gena se ispituje u odgovarajuće vreme nakon što je DNK uvedena u ćelije primaoca. Prikladni reporterski geni mogu da uključuju gene koji kodiraju luciferazu, beta-galaktozidazu, kloramfenikol acetil transferazu, izlučenu alkalnu fosfatazu ili gen za zeleni fluorescentni protein (npr., Ui-Tei et al. FEBS Letters
[0713] 479: 79-82 (2000)). Prikladni ekspresioni sistemi su dobro poznati i mogu da se pripreme poznatim tehnikama ili da se dobiju komercijalno.
[0714] Drugi postupci za potvrdu prisustva nukleinske kiseline koja kodira CAR u konstruisanoj imunoj efektorskoj ćeliji, uključuju, na primer, molekulska biološka ispitivanja dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti, kao što su Saudern i Nordern blot, RT-PCR i PCR ; biohemijska ispitivanja, kao što je detektovanje prisustvu ili odsutnosti određenog peptida, npr., imunim postupcima (kao što su ELISA ispitivanja i Western blotovi).
[0716] 1. Izvori T ćelija (Odeljak "Izvori T ćelija" je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja u ovom odeljku nisu načini ostvarivanja pronalaska.)
[0717] [0428] Pre ekspanzije i genetske modifikacije T ćelija, izvor T ćelija se dobije od pojedinca. T ćelije se mogu da se dobiju iz brojnih izvora, uključujući mononuklearne ćelije periferne krvi, koštanu srž, tkivo limfnih čvorova, krv iz pupka, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascites, pleuralni izliv, tkivo slezine i tumore. U nekim načinima ostvarivanja, može da se koristi bilo koji broj T ćelijskih linija dostupnih u ovoj oblasti. U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije mogu da se dobiju iz jedinice krvi prikupljene od subjekta pomoću bilo kog broja tehnika poznatih stručnjaku, kao što je Ficoll<™>odvajanje. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije iz krvotoka pojedinca se dobijaju se aferezom. Proizvod afereze obično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druge bele krvne ćelije sa jezgrom, crvena krvna zrnca i trombocite. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije prikupljene aferezom mogu da se isperu da se ukloni frakcija plazme i da se ćelije stave u odgovarajući pufer ili podlogu za sledeće korake obrade. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije se isperu fosfatnim puferom fiziološkog rastvora (PBS). U nekim načinima ostvarivanja, rastvoru za pranje nedostaje kalcijum i može da nedostaje magnezijum ili može da nedostaje mnogo ako ne i svi dvovalentni katjoni. Opet, iznenađujuće, početne faze aktivacije u nedostatku kalcijuma dovode do pojačane aktivacije. Kao što bi stručnjaci u ovoj oblasti tehnike lako shvatili, faza ispiranja može da se postigne postupcima koji su poznati stručnjacima, kao što je upotreba poluautomatizovane "protočne" centrifuge (na primer, Cobe 2991 cell procesor, Baxter CytoMate ili Haemonetics Cell Saver 5) prema uputstvima proizvođača. Nakon ispiranja, ćelije se mogu ponovo suspendovati u različitim biokompatibilnim puferima, kao što je, na primer, Ca<2+>-slobodan, Mg<2+>-slobodan PBS, PlasmaLyte A ili drugi fiziološki rastvor sa ili bez pufera. Alternativno, nepoželjne komponente afereznog uzorka mogu da se uklone, a ćelije direktno mogu da se ponovo suspenduju u podlozi kulture.
[0718] U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije su izolovane iz limfocita periferne krvi lizom crvenih krvnih ćelija i smanjenjem monocita, na primer, centrifugiranjem kroz PERCOLL<™>gradijent ili centrifugalnim elutricijom suprotnog protoka. Specifična subpopulacija T ćelija, kao što su CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ i CD45RO+T ćelije, može dalje da se izoluje tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, T ćelije se izoluju inkubacijom sa anti-CD3/anti-CD28 (tj.3×28)-konjugovanim kuglicama, kao što su DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T, u vremenskom razdoblju dovoljnom za pozitivnu selekciju željenih T ćelija. U nekim načinima ostvarivanja, vremenski period je oko 30 minuta. U dodatnom načinu ostvarivanja, vremenski period je u rasponu od 30 minuta do 36 sati ili duže i sve celobrojne vrednosti između. U dodatnom načinu ostvarivanja, vremenski period je najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 sati. U nekim načinima ostvarivanja, vremenski period je 10 do 24 sata. U nekim načinima ostvarivanja, vremenski period inkubacije je 24 sata. Za izolaciju T ćelija iz pacijenata sa leukemijom, korišćenje dužeg vremena inkubacije, kao što je 24 sata, može da poveća prinos ćelija. Duže vreme inkubacije može da se koristi za izolaciju T ćelija u bilo kojoj situaciji u kojoj ima malo T ćelija u poređenju sa drugim vrstama ćelija, kao što je izolacija limfocita koji infiltriraju tumor (TIL) iz tumorskog tkiva ili od pojedinaca sa oslabljenim imunitetom. Dalje, korišćenje dužeg vremena inkubacije može da poveća efikasnost hvatanja CD8+ T ćelija. Prema tome, jednostavnim skraćivanjem ili produženjem vremena u kojem se T-ćelijama omogućava vezivanje za zrnca CD3/CD28 i/ili povećanjem ili smanjenjem odnosa zrnaca i T-ćelija (kao što je ovde dalje opisano), subpopulacije T-ćelija mogu poželjno da se izaberu za ili protiv na početku kulture ili u drugim vremenskim tačkama tokom postupka. Dodatno, povećanjem ili smanjenjem odnosa anti-CD3 i/ili anti-CD28 antitela na kuglicama ili drugoj površini, subpopulacije T ćelija mogu poželjno da se izaberu za ili protiv na početku kulture ili u drugim željenim vremenskim tačkama. Stručnjak iz oblasti će prepoznati da takođe može da se koristi više krugova odabira. U nekim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se izvede postupak selekcije i koriste "neodabrane" ćelije u postupku aktivacije i ekspanzije. "Neodabrane" ćelije takođe mogu da se podvrgnu daljim krugovima selekcije.
[0719] [0430] Obogaćivanje populacije T ćelija negativnom selekcijom može da se postigne kombinacijom antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno odabrane ćelije. Jedan postupak je razvrstavanje ćelija i/ili selekcija putem negativne magnetske imunoadherencije ili protočne citometrije koja koristi koktel monoklonalnih antitela usmerenih na markere ćelijske površine prisutne na negativno odabranim ćelijama. Na primer, za obogaćivanje ćelija CD4+ negativnom selekcijom, koktel monoklonalnih antitela obično uključuje antitela na CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR i CD8. U određenim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se obogate ili pozitivno izaberu regulatorne T ćelije koje tipično eksprimiraju CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ i FoxP3+. Alternativno, u određenim načinima ostvarivanja, T regulatorne ćelije su iscrpljene anti-C25 konjugovanim kuglicama ili drugim sličnim postupkom odabira.
[0720] Za izolaciju željene populacije ćelija pozitivnom ili negativnom selekcijom, koncentracija ćelija i površina (npr., čestice kao što su kuglice) mogu da variraju. U određenim načinima ostvarivanja, može biti poželjno značajno smanjenje zapremine u kojoj se kuglice i ćelije mešaju zajedno (tj. povećanje koncentracije ćelija), kako bi se osigurao maksimalan kontakt ćelija i kuglica. Na primer, u jednom načinu ostvarivanja koristi se koncentracija od 2 milijarde ćelija/ml. U jednom načinu ostvarivanja koristi se koncentracija od 1 milijarde ćelija/ml. U daljem načinu ostvarivanja koristi se više od 100 miliona ćelija/ml. U daljem načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 miliona ćelija/ml. U još jednom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 miliona ćelija/ml. U daljim načinima ostvarivanja mogu da se koristiti koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Korišćenje visokih koncentracija može da dovede do povećanog prinosa ćelija, aktivacijom ćelija i ćelijskim širenjem. Dalje, upotreba visokih koncentracija ćelija omogućava efikasnije hvatanje ćelija koje mogu slabo da eksprimiraju ciljane antigene od značaja, kao što su CD28-negativne T ćelije, ili iz uzoraka u kojima je prisutno mnogo tumorskih ćelija (tj. leukemijska krv, tumorsko tkivo itd. ). Takve populacije ćelija mogu da imaju terapeutsku vrednost i bilo bi ih poželjno dobiti. Na primer, korišćenje visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniju selekciju CD8+ T ćelija koje inače imaju slabiju ekspresiju CD28.
[0721] U nekim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se koriste niže koncentracije. Značajnim razblaživanjem mešavine T ćelija i površine (npr., čestice kao što su kuglice), interakcija između čestica i ćelija je svedena na minimum. Ovim se biraju ćelije koje eksprimiraju velike količine željenih antigena koji se vežu za čestice. Na primer, CD4+ T ćelije eksprimiraju više nivoe CD28 i efikasnije se hvataju od CD8+ T ćelija u razblaženim koncentracijama. U nekim načinima ostvarivanja, koncentracija korišćenih ćelija je 5×10<6>/ml. U nekim načinima ostvarivanja, korišćena koncentracija može biti od oko 1×10<5>/ml do 1×10<6>/ml, i bilo koja vrednost celog broja između.
[0722] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije mogu biti inkubirane na rotatoru u različitim vremenskim trajanjima pri različitim brzinama ili na 2-10°C, ili na sobnoj temperaturi.
[0723] [0434] T ćelije za stimulaciju takođe mogu da se zamrznu nakon faza pranja. Bez želje za vezivanjem za neku teoriju, zamrzavanje i naknadna faza odmrzavanja osigurava uniformniji proizvod uklanjanjem granulocita i do neke mere monocita u populaciji ćelija. Nakon koraka ispiranja kojim se uklanjaju plazma i trombociti, ćelije mogu da se suspenduju u rastvoru za zamrzavanje. Dok su mnogi rastvori i parametri za zamrzavanje poznati u ovoj oblasti i od koristi u ovom kontekstu, jedan postupak uključuje korišćenje PBS-a koji sadrži 20% DMSO i 8% humanog serumskog albumina, ili podloge za kulturu koja sadrži 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% ljudski serumski albumin i 7,5% DMSO, ili 31,25% PlasmaLyte-A, 31,25% dekstrozu 5%, 0,45% NaCl, 10% dekstran 40 i 5% dekstrozu, 20% ljudski serumski albumin i 7,5% DMSO ili drugu pogodnu podlogu za zamrzavanje ćelija koja sadrži na primer Hespan i PlasmaLyte A, ćelije se zatim smrzavaju na -80°C brzinom od 1° u minuti i čuvaju se u fazi pare suda za čuvanje tečnog azota. Mogu da se koriste i drugi postupci kontrolisanog zamrzavanja, kao i nekontrolisano zamrzavanje neposredno na -20°C ili u tečnom azotu.
[0724] U nekim načinima ostvarivanja, kriokonzervisane ćelije se odmrznu i isperu kako je ovde opisano i ostave se da odstoje jedan sat na sobnoj temperaturi pre aktivacije.
[0725] Kao referenca je takođe otkriveno uzimanje uzoraka krvi ili proizvoda afereze od subjekta u vremenskom periodu pre nego što bi proširene ćelije kao što je ovde opisano mogle biti potrebne. Kao takav, izvor ćelija koje bi trebalo da se prošite može da se uzme u bilo kojoj neophodnoj vremenskoj tački, a željene ćelije, kao što su T ćelije, izoluje i zamrzne za kasniju upotrebu u T ćelijskoj terapiji za bilo koji broj bolesti ili stanja koja bi imala koristi od terapija T ćelijama, poput onih koje su ovde opisane. U jednom načinu ostvarivanja uzorak krvi ili afereza se uzima od subjekta zdravog opšteg stanja. U određenim načinima ostvarivanja, uzorak krvi ili afereza se uzima od generalno zdravog subjekta koji je u opasnosti od razvoja bolesti, ali koji još nije razvio bolest, a ćelije od značaja se izoluju i zamrzavaju za kasniju upotrebu. U određenim načinima ostvarivanja, T ćelije mogu da se prošire, zamrznu i koriste kasnije. U određenim načinima ostvarivanja, uzorci se prikupljaju od pacijenata ubrzo nakon dijagnoze određene bolesti kako je ovde opisano, ali pre bilo kakve terapije. U daljem načinu ostvarivanja, ćelije se izoluju iz uzorka krvi ili afereze subjekta pre bilo kog broja relevantnih modaliteta lečenja, uključujući ali bez ograničenja na lečenje sredstvima kao što su natalizumab, efalizumab, antivirusna sredstva, hemoterapija, zračenje, imunosupresivna sredstva, kao što su ciklosporin, azatioprin, metotreksat, mikofenolat i FK506, antitela ili druga imunoablativna sredstva kao što su CAMPATH, anti-CD3 antitela, citoksan, fludarabin, ciklosporin, FK506, rapamicin, mikofenolna kiselina, steroidi, FR901228, i zračenje. Ovi lekovi inhibiraju fosfatazu kalcineurin koja zavisi od kalcijuma (ciklosporin i FK506) ili inhibiraju p70S6 kinazu koja je važna za signalizaciju indukovanu faktorom rasta (rapamicin) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Imun.5: 763-773, 1993). U daljem načinu ostvarivanja, ćelije su izolovane za pacijenta i zamrznute za kasniju upotrebu u kombinaciji sa (npr., pre, istovremeno ili nakon) transplantacije koštane srži ili matičnih ćelija, ablativne terapije T ćelija upotrebom hemoterapijskih sredstava kao što je fludarabin, terapija spoljašnjim snopom zračenja (XRT), ciklofosfamida ili antitela kao što su OKT3 ili CAMPATH. U drugom načinu ostvarivanja, ćelije se izoluju pre i mogu da se zamrznu za kasniju upotrebu za lečenje nakon ablativne terapije B-ćelija kao što su sredstva koja reagiraju sa CD20, npr., Rituxan-om.
[0726] [0437] U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije se dobijaju od pacijenta neposredno nakon lečenja. S tim u vezi, uočeno je da nakon određenih terapija kancera, posebno tretmana lekovima koji oštećuju imuni sistem, kratko nakon terapije tokom vremenskog perioda kada bi se pacijenti inače oporavljali od terapije, kvalitet dobijenih T ćelija može biti optimalan ili poboljšan zbog svoje sposobnosti širenja ex vivo. Slično, nakon ex vivo manipulacije upotrebom ovde opisanih postupaka, ove ćelije mogu biti u poželjnom stanju za pojačano presađivanje i in vivo širenje. Stoga se u kontekstu ovog pronalaska razmatra prikupljanje krvnih ćelija, uključujući T ćelije, dendritične ćelije ili druge ćelije hematopoetske loze, tokom ove faze oporavka. Dalje, u određenim načinima ostvarivanja, mobilizacija (na primer, mobilizacija sa GM-CSF) i režimi kondicioniranja mogu da se koriste za stvaranje stanja kod subjekta pri čemu se prednost daje repopulaciji, recirkulaciji, regeneraciji i/ili ekspanziji određenih vrsta ćelija, posebno tokom definisanog vremenskog okvira nakon terapije. Ilustrativni tipovi ćelija uključuju T ćelije, B ćelije, dendritične ćelije i druge ćelije imunog sistema.
[0728] 2. Aktivacija i širenje T ćelija (Odeljak "Aktivacija i širenje T ćelija" je otkriven kao referenca. Načini ostvarivanja u ovom odeljku ne predstavljaju načine ostvarivanja ovog pronalaska.)
[0729] Bilo pre ili posle genetske modifikacije T ćelija sa ovde opisanim CAR, T ćelije mogu biti aktivirane i proširene pomoću postupaka kao što je opisano, na primer, u američki pat. br.
[0730] 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,1 72,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; i američka objava patentne prijave br.20060121005.
[0731] Generalno, T ćelije mogu da se prošire kontaktom sa površinom na koju je pričvršćen agens koji stimuliše signal povezan sa CD3/TCR kompleksom i ligand koji stimuliše kostimulatorni molekul na površini T ćelija. Određenije, populacije T ćelija mogu da se stimuliši kao što je ovde opisano, kao što je kontakt sa anti-CD3 antitelom, ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen, ili anti-CD2 antitelom koje je imobilisano na površini, ili kontaktom sa C aktivatorom protein kinaze (npr., briostatinom) u kombinaciji sa kalcijumovim jonoforom. Za kostimulaciju pomoćnog molekula na površini T ćelija koristi se ligand koji vezuje pomoćni molekul. Na primer, populacija T ćelija može da se dovede u kontakt sa anti-CD3 antitelom i anti-CD28 antitelom, pod uslovima prikladnim za stimulaciju proliferacije T ćelija. Za stimulaciju proliferacije ili CD4+ T ćelija ili CD8+ T ćelija, anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Primeri anti-CD28 antitela uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, Francuska) koji mogu da se koriste kao i drugi postupci poznati u ovoj oblasti (Berg et al., Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med.190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth.227(1-2):53-63, 1999).
[0732] [0440] U nekim načinima ostvarivanja, primarni stimulatorni signal i kostimulatorni signal za T ćeliju mogu da obezbede različiti protokoli. Na primer, sredstva koja daju svaki signal mogu biti u rastvoru ili spojena na površini. Kada se spajaju na površini, sredstva mogu da se spajaju na istoj površini (tj. u "cis" formaciji) ili na odvojenim površinama (tj. u "trans" formaciji). Alternativno, jedno sredstvo može biti spojeno na površini, a drugo sredstvo u rastvoru. U jedno načinu ostvarivanja, agens koji daje kostimulatorni signal vezan je za površinu ćelije, a agens koji daje primarni aktivacioni signal je u rastvoru spojen na površini. U određenim načinima ostvarivanja, oba sredstva mogu biti u rastvoru. U drugom načinu ostvarivanja, sredstva mogu da budu u topljivom obliku, a zatim umrežena na površini, kao što je ćelija koja eksprimira Fc receptore ili antitelo ili drugo vezivno sredstvo koje će se vezivati za sredstva. U tom smislu, videti npr. američku objavu patentne prijave br.20040101519 i 20060034810 za umetne ćelije koje predstavljaju antigen (aAPC) koje su predviđene za upotrebu u aktiviranju i širenju T ćelija u ovom pronalasku.
[0733] U nekim načinima ostvarivanja, T ćelije se kombinuju sa kuglicama obloženim sredstvom, kuglice i ćelije se zatim odvajaju, a zatim se ćelije kultivišu. U alternativnom načinu ostvarivanja, pre kulture, kuglice obložene sredstvom i ćelije se ne odvajaju, već se zajedno kultivišu. U daljem načinu ostvarivanja, zrnca i ćelije se prvo koncentruju primenom sile, kao što je magnetska sila, što dovodi do pojačane ligacije markera ćelijske površine, čime se indukuje ćelijska stimulacija.
[0734] Primera radi, proteini ćelijske površine mogu da se vezuju dopuštanjem paramagnetnim kuglicama na koje su pričvršćeni anti-CD3 i anti-CD28 (3×28 kuglica) da dođu u kontakt sa T ćelijama. U jednom načinu ostvarivanja ćelije (na primer, 10<4>do 10<9>T ćelije) i kuglice (na primer, DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T paramagnetnim kuglice u odnosu 1:1) se pomešaju u puferu, poželjno PBS (bez dvovalentnih katjona kao što su kalcijum i magnezijum). Opet, stručnjaci iz ove oblasti mogu lako da procene bilo koju koncentraciju ćelija koja može da se koristi. Na primer, ciljana ćelija može biti vrlo retka u uzorku i može da sadrži samo 0,01% uzorka ili ceo uzorak (tj.100%) može da sadrži ciljanu ćeliju od značaja. Prema tome, bilo koji broj ćelije je unutar konteksta ovog pronalaska. U određenim načinima ostvarivanja, može biti poželjno da se značajno smanji zapremina u kojoj su čestice i ćelije pomešane zajedno (tj. poveća koncentracija ćelija), kako bi se obezbedio maksimalni kontakt ćelija i čestica. Na primer, u jednom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija od oko 2 milijarde ćelija/ml. U drugom načinu ostvarivanja koristi se više od 100 miliona ćelija/ml. U dodatnom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 miliona ćelija/ml. U još jednom načinu ostvarivanja, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 miliona ćelija/ml. U daljim načinima ostvarivanja mogu da se koriste koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Upotreba visokih koncentracija može da dovede do povećanog prinosa ćelija, aktivacije ćelija i ćelijskog širenja. Dalje, upotreba visokih koncentracija ćelija omogućuje efikasnije hvatanje ćelija koje mogu slabo da eksprimiraju ciljane antigene od značaja, kao što su CD28-negativne T ćelije. Takve populacije ćelija mogu da imaju terapeutsku vrednost i bilo bi poželjno da se dobiju u određenim načinima ostvarivanja. Na primer, upotreba visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniji odabir CD8+ T ćelija koje inače imaju slabiju ekspresiju CD28.
[0735] U nekim načinima ostvarivanja, smeša se može kultivisati nekoliko sati (oko 3 sata) do oko 14 dana ili do bile koje vrednosti celog broja između. U drugom načinu ostvarivanja, smeša se može kultivisati 21 dan. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, kuglice i T-ćelije se kultivišu zajedno otprilike osam dana. U drugom načinu ostvarivanja, kuglice i T-ćelije se kultivišu zajedno 2-3 dana.
[0736] Takođe se može poželeti više ciklusa stimulacije tako da vreme kulture T-ćelija može biti 60 dana ili duže. Uslovi pogodni za kulturu T-ćelija uključuju odgovarajuću podlogu (npr. Minimal Essential Media ili RPMI Media 1640 ili X-vivo 15 (Lonza)) koja može da sadrži faktore neophodne za proliferaciju i preživljavanje, uključujući serum (npr. fetalni goveđi ili ljudski serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, i TNF-α ili bilo koje druge dodatke za rast ćelija poznate stručnjaku iz ove oblasti. Drugi dodaci za rast ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, surfaktant, plazmanat, i redukcione agense kao što su N-acetil-cistein i 2-merkaptoetanol. Podloge mogu uključivati RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, i X-Vivo 20, Optimizer, sa dodatim amino kiselinama, natrijum piruvatom, i vitaminima, ili bez seruma ili sa odgovarajućom količinom seruma (ili plazme) ili definisanim setom hormona i/ili dovoljnom količinom citokina za rast i širenje T ćelija. Antibiotici, kao što su penicilin i streptomicin, uključuju se samo u eksperimentalnim kulturama, a ne u kulturama ćelija koje će se infuzirati u subjekta. Ciljane ćelije se održavaju pod uslovima potrebnim za podršku rastu, na primer, pri odgovarajućoj temperaturi (npr.37 °C) i atmosferi (npr. vazduh plus 5% CO2). T ćelije koje su izložene različitim vremenima stimulacije mogu pokazati različite karakteristike. Na primer, tipični proizvodi krvi ili aferisinisanih mononuklearnih ćelija iz periferne krvi imaju populaciju pomoćnih T ćelija (TH, CD4+) koja je veća od populacije citotoksičnih ili supresorskih T ćelija (TC, CD8+). Ex vivo širenje T ćelija stimulacijom CD3 i CD28 receptora proizvodi populaciju T ćelija koja pre otprilike 8-9 dana uglavnom obuhvata TH ćelije, dok nakon otprilike 8-9 dana populacija T ćelija obuhvata sve veći broj TC ćelija. Shodno tome, u zavisnosti od svrhe lečenja, infuzija subjekta sa populacijom T ćelija koja uglavnom obuhvata TH ćelije može biti od koristi. Slično tome, ako je izolovan antigen-specifičan podskup TC ćelija, može biti korisno za proširenje ovog podskupa u većoj meri.
[0737] Dalje, pored CD4 i CD8 markera, drugi fenotipski markeri značajno mogu da variraju, ali u većoj meri, reproduktibilno tokom procesa širenja ćelija. Samim tim, takva reproduktibilnost omogućava mogućnost da se aktivirani proizvod T ćelija prilagodi za konkretne svrhe.
[0739] V. Farmaceutske kompozicije
[0740] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju bilo koju od konstruisanih imunih efektorskih ćelija koje obuhvataju bilo koji od CAR pronalaska, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije mogu biti pripremljene mešanjem većeg broja konstruisanih efektorskih ćelija sa željenim stepenom čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.
[0741] (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija i vodenih rastvora.
[0742] Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama dozama i koncentracijama, i uključuju pufere, antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu, metionin, vitamin E, natrijumov metabisulfit; konzervansi, izotonicifikatori, stabilizatori, metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); helatna sredstva kao što su EDTA i/ili nejonski surfaktanti.
[0743] [0447] Puferi se koriste za kontrolu pH u opsegu koji optimizuje terapijsku efikasnost, posebno ako stabilnost zavisi od pH. Puferi su poželjno prisutni u koncentracijama u opsegu od oko 50 mM do oko 250 mM. Pogodna sredstva za puferisanje za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli. Na primer, citrat, fosfat, sukcinat, tartarat, fumarat, glukonat, oksalat, laktat, acetat. Dodatno, puferi mogu da sadrže soli histidina i trimetilamina kao što je Tris.
[0744] Konzervansi se dodaju kako bi se usporio rast mikroba, a obično su prisutni u opsegu od 0,2%-1,0% (w/v). Pogodni konzervansi za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijumovi halidi (npr., hlorid, bromid, jodid), benzetonijum-hlorid; timerozal, fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol.
[0745] Sredstva za povećanje toničnosti, ponekad poznata kao "stabilizatori", prisutna su za podešavanje ili održavanje toničnosti tečnosti u kompoziciji. Kada se koriste sa velikim, nabijenim biomolekulima kao što su proteini i antitela, često se nazivaju "stabilizatorima" jer mogu da deluju u interakciji sa nabijenim grupama bočnih lanaca aminokiselina, čime se smanjuje mogućnost inter- i intramolekulskih interakcija. Sredstva za povećanje toničnosti mogu da budu prisutna u bilo kojoj količini između 0,1% do 25% mase, poželjno 1% do 5%, uzimajući u obzir relativne količine ostalih sastojaka. Poželjna sredstva za povećanje toničnosti uključuju polihidrične šećerne alkohole, poželjno trohidrične ili višešećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol.
[0746] Dodatni ekscipijensi uključuju agense koji mogu služiti kao jedan ili više od sledećeg: (1) agensi za povećanje zapremine, (2) pojačivači rastvorljivosti, (3) stabilizatori i (4) agensi koji sprečavaju denaturaciju ili prianjanje na zid suda. Takvi ekscipijensi uključuju: višebazne šećerne alkohole (gore nabrojane); aminokiseline kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd.; organski šećeri ili šećerni alkoholi kao što su saharoza, laktoza, laktitol, trehaloza, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr., inozitol), polietilen glikol; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, amonotioglicerol i natrijum tio sulfat; proteini niske molekulske mase kao što su ljudski serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili drugi imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; monosaharidi (npr., ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza); disaharidi (npr., laktoza, maltoza, saharoza); trisaharide kao što je rafinoza; i polisaharide kao što je dekstrin ili dekstran.
[0747] Nejonski surfaktanti ili deterdženti (takođe poznati kao "ovlaživač") prisutni su kako bi pomogli u solubilizaciji terapeutskog agensa kao i za zaštitu terapeutskog proteina od agregacije izazvane agitacijom, što takođe dopušta da formulacija bude izložena površinskom naprezanju smicanja a da se ne uzrokuje denaturacija aktivnog terapijskog proteina ili antitela. Nejonski surfaktanti prisutni su u rasponu od oko 0,05 mg/ml do oko 1,0 mg/ml, poželjno oko 0,07 mg/ml do oko 0,2 mg/ml.
[0748] [0452] Pogodni nejonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 40, 60, 65, 80, itd.), polioksamere (184, 188, itd.), PLURONIC<®>poliole, TRITON<®>, polioksietilen sorbitan monoetre (TWEEN<®>-20, TWEEN<®>-80, itd.), lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenirano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, estar masne kiseline saharoze, metil celuloza i karboksimetil celuloza. Anjonski deterdženti koji se mogu koristiti uključuju natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i dioktil natrijum sulfonat. Katjonski deterdženti uključuju benzalkonijim hlorid ili benzetonijum hlorid.
[0749] Kako bi farmaceutske kompozicije mogle da se koriste za in vivo primenu, moraju biti sterilne. Farmaceutska kompozicija može da se učini sterilnim filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Farmaceutske kompozicije se ovde generalno stavljaju u sud koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, vrećicu za intravenski rastvor koja ima zatvarač koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju.
[0750] Put primene je u skladu sa poznatim i prihvaćenim postupcima, kao što su jednokratni ili višestruki bolus ili infuzija tokom dugog vremenskog razdoblja na odgovarajući način, npr., injekcijom ili infuzijom supkutanim, intravenskim, intraperitonealnim, intramuskularnim, intraarterijskim, intralezijskim ili intraartikularnim putevima, lokalnom primenom, inhalacijom ili produženim oslobađanjem ili produženim oslobađanjem.
[0751] Mogu da se pripreme preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antagonist, a koje su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (američki pat. br.3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT<™>(injektabilne mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksimaslačne kiseline.
[0752] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja ili sredstva prema potrebi za određenu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču nepovoljno jedno na drugo. Alternativno, ili dodatno, kompozicija može da sadrži citotoksično sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, citokin, imunosupresivno sredstvo ili sredstvo za inhibiciju rasta. Takvi molekuli su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efektivne za predviđenu svrhu.
[0753] Aktivni sastojci takođe mogu da budu zarobljeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međufaznom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatinske mikrokapsule odnosno poli-(metilmetacilatne) mikrokapsule, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences 18. izdanje.
[0755] VI. Upotrebe u postupcima lečenja kancera
[0756] [0458] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje CAR ili farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u postupcima ćelijske imunoterapije. U nekim načinima ostvarivanja, ćelijska imunoterapija je za lečenje kancera, uključujući ali bez ograničenja na hematološke malignitete i čvrste tumore. Bilo koje od ovde opisanih jednodomenskih antitela, himernih antigen receptora, i konstruisanih imunih efektorskih ćelija mogu da se koriste u postupku lečenja kancera. Ovde opisani CAR mogu biti korisni za lečenje tumora sa mutacijama za beg gubitka antigena, i za smanjenje otpornosti na postojeće terapije. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije ovog pronalaska mogu da se koriste u postupcima za lečenje drugih bolesti koje su povezane sa antigenima koje specifično prepoznaju jednodomenska antitela ili CAR, uključujući, na primer, autoimmune bolesti.
[0757] [0459] U nekim načinima ostvarivanja, postoji postupak lečenja kancera kod pojedinca (kao što je čovek), koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja obuhvata: (1) konstruisanu imunsku efektorsku ćeliju (kao što je T ćelija) koja obuhvata multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigen receptor (CAR) ovog pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuju za antigen (kao što je prvi tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen (kao što je drugi tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu se prvi antigen razlikuje od drugog antigena; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim načinima ostvarivanja, prvi antigen i/ili drugi antigen je izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, i glikolipid F77, pri čemu najmanje jedan od prvog antigena i drugog antigena predstavlja BCMA. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja taj transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, multispecifični CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja ka C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja ka C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobno domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD28, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunska efektorska ćelija is autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunska efektorska ćelija je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, kancer predstavlja tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija, ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je čvrsti kancer.
[0758] [0460] U nekim načinima ostvarivanja postoji postupak lečenja kancera kod pojedinca (kao što je čovek), koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja obuhvata: (1) konstruisanu imunsku efektorsku ćeliju (kao što je T ćelija) koja obuhvata BCMAxCD38 CAR ovog pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb i/ili anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno, ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo su međusobno spojeni peptidnom vezom ili peptidnim linkerom. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA je spojeno na N-kraju sdAb anti-CD38. U nekim načinima ostvarivanja, sdAb anti-BCMA je spojeno na C-kraju anti-CD38 sdAb. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker ima dužinu od najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10, ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 144-151. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, BCMAxCD38 CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, CAR usmeren na BCMA × CD38 dodatno obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalizirajući domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, anti-CD38 antitelo obuhvata CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56, i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunska efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima, konstruisana imunska efektorska ćelija je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je tečni kancer. U nekim načinima ostvarivanja, taj tečni kancer je je multipli mijelom.
[0759] [0461] U nekim načinima ostvarivanja, postoji postupak lečenja kancera kod pojedinca (kao što je čovek) koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja obuhvata: (1) konstruisanu imunsku efektorsku ćeliju (kao što je T ćelija) koja obuhvata viševalentni himerni antigen receptor ovog pronalaska koji obuhvata polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata veći broj jednodomenskih antitela (sdAb) kojia se specifično vezuju za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalizirajući domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima antigen je izabran iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, and glycolipid F77. U nekim načinima ostvarivanja, većina sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim načinima ostvarivanja, više pojedinačnih single-domain antitela je međusobno spojeno preko peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim načinima ostvarivanja, svaki peptidni linker ima dužinu ne veću od približno 50 aminokiselina (kao što je ne više od približno bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5 aminokiselina). U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen se bira iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:80 i 87, CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalizirajući domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, taj intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalizirajući domen je onaj od kostimulatornog molekula izabran iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dalje obuhvata pojedinačan peptid (kao što je CD8α signalizirajući peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α signalizirajući peptid, ekstracelularni antigen vezujući domen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalizirajući domen iveden iz CD137, i primarni intracelularni signalizirajući domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, multivalentni CAR obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2 i 65-270. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunska efektorska ćelija je autologna. U nekim načinima ostvarivanja, konstruisana imunska efektorska ćelija je alogena. U nekim načinima ostvarivanja, taj kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija, ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, kancer je čvrsti kancer.
[0760] U nekim načinima ostvarivanja, postoji postupak lečenja karcinoma kod pojedinca (kao što je ljudski pojedinac), koji obuhvata primenu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) inženjerski modifikovane imune efektorske ćelije (kao što su T ćelije) koje obuhvataju viševalentni himerni antigenski receptor (CAR) prema pronalasku, koji sadrži polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata prvo single-domain antitelo specifično koje se vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen) i drugo single-domain antitelo specifično koje se vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu su prvi epitop i drugi epitop različiti; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima, antigen se bira iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim načinima ostvarivanja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb su kamelidskog, himernog ili humanizovanog porekla. U nekim načinima ostvarivanja, prvo single-domain antitelo i drugo single-domain antitelo su spojeni jedno sa drugim preko peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim načinima ostvarivanja, peptidni linker nije duži od približno 50 (kao što je ne više od približno 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen se bira iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganada CD83 i njihovih kombinacija.
[0761] U nekim načinima ostvarivanja, viševalentni CAR dodatno obuhvata hinge domen (kao što je CD8α hinge domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja ka C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α hinge domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137, i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovane imune efektorske ćelije su autologne. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovane imune efektorske ćelije su alogene. U nekim načinima ostvarivanja, karcinom je hematološki malignitet, kao što su multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, karcinom je čvrsti tumor.
[0762] U nekim načinima ostvarivanja, postoji postupak lečenja karcinoma kod pojedinca (kao što je ljudski pojedinac), koji obuhvata primenu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) inženjerski modifikovane imune efektorske ćelije (kao što su T ćelije) koje obuhvataju BCMA CAR prema pronalasku, koji sadrži polipeptid koji obuhvata: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu anti-BCMA sdAb obuhvata bilo koji od sledećih:
[0763] (23) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0764] (24) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0765] (25) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0766] (26) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0767] (27) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0768] (28) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0769] (29) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0770] (30) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
[0771] (31) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37;
[0772] (32) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; ili
[0773] (33) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39.
[0774] Prvo sdAb ili drugo sdAb CAR-a prema pronalasku je anti-BCMA sdAb koji obuhvata jedan od (25) ili (32). U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb je kamelidskog, himernog ili humanizovanog porekla. U nekim načinima ostvarivanja, anti-BCMA sdAb obuhvata VHH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:78–88. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim načinima ostvarivanja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ.
[0775] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim načinima ostvarivanja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganada CD83 i njihovih kombinacija. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dodatno obuhvata hinge domen (kao što je CD8α hinge domen) koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigena vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena. U nekim načinima ostvarivanja, BCMA CAR dodatno obuhvata signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-kraju polipeptida. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja ka C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α hinge domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid obuhvata, od N-kraja ka C-kraju: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α hinge domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. BCMA CAR se, kao referenca, obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:152– 162. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovane imune efektorske ćelije su autologne. U nekim načinima ostvarivanja, inženjerski modifikovane imune efektorske ćelije su alogene. U nekim načinima ostvarivanja, karcinom je hematološki malignitet, kao što su multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim načinima ostvarivanja, karcinom je solidni tumor.
[0776] Otkriven kao referenca je postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod pojedinca (kao što je čovek), koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine farmaceutske kompozicije koja obuhvata jednodomensko antitelo anti-BCMA i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu sdAb anti-BCMA obuhvata bilo koji od sledećih:
[0777] (1) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0778] (2) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30;
[0779] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0780] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0781] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0782] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34
[0783] (7) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0784] (8) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36;
[0785] (9) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37;
[0786] (10) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; or
[0787] (11) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39.
[0788] U nekim primerima, sdAb anti-BCMA obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 78-88.
[0789] Ovde opisani postupci su pogodni za lečenje raznih kancera, uključujući i čvrste i tečne kancere. Ti postupci mogu da se primenjuju na kancera svih stadijuma, uključujući rani stadijum, uznapredovali stadijum i metastatski kancer. Ovde opisani postupci mogu da se koriste kao prva terapija, druga terapija, treća terapija, ili kombinovana terapija sa drugim tipovima kancerskih terapija poznatih u ovoj oblasti, kao što su hemoterapija, hirurgija, zračenje, genska terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, transplantacija matičnih ćelija, ciljana terapija, krijoterapija, terapija ultrazvukom, fotodinamična terapija, radiofrekventna ablacija ili tom sličnom, u adjuvansnom ili neadjuvansnom okruženju.
[0790] Primena farmaceutskih kompozicija može da se izvede na bilo koji pogodan način, uključujući injekcijom, gutanjem, transfuzijom, implantacijom ili transplantacijom. Kompozicije mogu da se daju pacijentu transarterijski, subkutano, intradermalno, intratumoralno, intranodalno, intramedularno, intramuskularno, intravenski ili intraperitonealno. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se primenjuje sistemski. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje e pojedincu infuzijom, kao što je intravenska infuzija. Tehnike infuzije za imunoterapiju poznate su u struci (videti, npr., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319: 1676 (1988)). U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje pojedincu intradermalnom ili supkutanom injekcijom. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije se daju intravenskom injekcijom. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije se ubrizgavaju direktno u tumor ili limfni čvor. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se primenjuje lokalno na mesto tumora, kao što je direktno u tumorske ćelije, ili u tkivo koje ima tumorske ćelije.
[0791] Multipli mijelom (MM) je neizlečiva agresivna maligna bolest plazme, koja se kategorizuje kao neoplazija B-ćelija i nekontrolisano se širi u koštanoj srži, ometajući normalnu metaboličku proizvodnju krvnih ćelija i uzrokujući bolne lezije na kostima (Garfall, A.L. et al., Discovery Med.2014, 17, 37).
[0792] Multipli mijelom se može klinički manifestovati hiperkalcemijom, renalnom insuficijencijom, anemijom, koštanim lezijama, bakterijskim infekcijama, hipervizkozitetom i amiloidozom (Robert Z. Orlowski, Cancer Cell.2013, 24(3)). Prema istraživanjima i statistikama, skoro 86.000 pacijenata godišnje bude dijagnostikovano sa mijelomom, dok oko 63.000 pacijenata godišnje umre od komplikacija povezanih sa ovom bolešću (Becker, 2011). Zbog starenja populacije, predviđa se da će broj slučajeva mijeloma godišnje rasti. Kao i kod mnogih karcinoma, uzrok multiplom mijelomu nije poznat, a nema ni leka. Neke terapije za multipli mijelom su slične terapijama za druge karcinome, poput hemoterapije ili radioterapije, transplantacije matičnih ćelija ili koštane srži, ciljane terapije ili biološke terapije (George, 2014). Imunoterapije zasnovane na antitelima su pokazale značajne kliničke koristi za pacijente sa hematološkim malignitetima, posebno kod B-ćelijskog Non-Hodžkinovog limfoma. Postoji potreba za efikasnim imunoterapijskim agensima za lečenje multiplom mijeloma.
[0793] Doze i željena koncentracija leka u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska mogu da variraju u zavisnosti od određene predviđene upotrebe. Određivanje odgovarajuće doze ili načina davanja je dobro poznato stručnjaku iz ove oblasti. Eksperimenti na životinjama daju pouzdane smernice za određivanje efektivnih doza za lečenje ljudi. Skaliranje među vrstama efektivnih doza može da se izvede prema načelima utvrđenim u Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46. Unutar opsega ovog pronalaska je da će različite formulacije biti efektivne za različite terapije i različite poremećaje, i da primena namenjena lečenju specifičnog organa ili tkiva može da zahteva isporuku na način koji se razlikuje od onoga u drugi organ ili tkivo.
[0794] Otkriveno kao referenca, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži bilo koji od ovde opisanih jednodomenskih antitela, farmaceutska kompozicija se primenjuje u dozi od oko 10 ng/kg do oko 100 mg/kg telesne mase pojedinca ili više dnevno, za na primer, od oko 1 mg/kg/dan do 10 mg/kg/dan, u zavisnosti od načina primene. Smernice o određenim dozama i načinima isporuke date su u literaturi; videti, na primer, američki pat. br.4,657,760; 5,206,344; ili 5,225,212.
[0795] U nekim načinima ostvarivanja, pri čemu farmaceutska kompozicija obuhvata bilo koju prema ovom pronalasku od konstruisanih imunih ćelije, farmaceutska kompozicija se primenjuje u dozi od najmanje oko bilo koje od 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, ili 10<9>ćelija/kg telesne mase pojedinca. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje u bilo kojoj dozi od oko 10<4>do oko 10<5>, oko 10<5>do oko 10<6>, oko 10<6>do oko 10<7>, oko 10<7>do oko10<8>, oko 10<8>do oko 10<9>, oko 10<4>do oko 10<9>, oko 10<4>do oko 10<6>, oko 10<6>do oko 10<8>, ili oko 10<5>do oko 10<7>ćelija/kg telesne mase pojedinca.
[0796] [0471] U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se primenjuje jednokratno. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se primenjuje više puta (kao što je bilo koji od 2, 3, 4, 5, 6, ili više puta). U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje jednom nedeljno, jednom u 2 nedelje, jednom u 3 nedelje, jednom u 4 nedelje, jednom mesečno, jednom u 2 meseca, jednom u 3 meseca, jednom u 4 meseca, jednom u 5 meseci, jednom na 6 meseci, jednom na 7 meseci, jednom na 8 meseci, jednom na 9 meseci ili jednom godišnje. U nekim načinima ostvarivanja, interval između primena je otprilike bilo koji od 1 nedelje do 2 nedelje, 2 nedelje do 1 meseca, 2 nedelje do 2 meseca, 1 meseca do 2 meseca, 1 meseca do 3 meseca, 3 meseca do 6 meseci, ili 6 meseci do godinu dana. Optimalno doziranje i režim lečenja za određenog pacijenta može lako da odredi stručnjak iz medicinske oblasti praćenjem pacijenta radi znakova bolesti i prilagođavanjem lečenja u skladu sa tim.
[0797] Štaviše, doze mogu da se primenjuju jednom ili više odvojenih primena ili kontinuiranom infuzijom. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se nastavlja sve dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak ove terapije lako se prati uobičajenim tehnikama i ispitivanjima.
[0799] VII. Kompleti i proizvodni artikli
[0800] Ovde su dalje obezbeđeni kompleti, jedinične doze i proizvodni artikli koji sadrže bilo koji od himernih antigen receptora ili konstruisanih imunoloških efektora ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđen je komplet koji sadrži bilo koji od farmaceutskih kompozicija pronalaska i poželjno su obezbeđena dalja uputstva za njegovu upotrebu.
[0801] Kompleti ovog pronalaska su u prigodnom pakovanju. Prigodno pakovanje uključuje, ali nije ograničeno na, bočice, boce, tegle, fleksibilna pakovanja (npr., zatvorene Mylar ili plastične vrećice) i slično. Kompleti mogu opciono da obezbede dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije. Ovaj pronalazak samim tim obezbeđuje proizvodne artikle koji uključuju bočice (kao što su zaptivene bočice), boce, tegle, fleksibilna pakovanja i slično.
[0802] Proizvodni artikal može da sadrži sud i etiketu ili uputstvo za upotrebu na povezanom sudu. Pogodni sudovi uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, itd. Sudovi mogu biti napravljeni od raznih materijala kao što su staklo ili plastika. Generalno, sud sadrži kompoziciju koja je efikasna za lečenje bolesti ili poremećaja (kao što je rak) koji je ovde opisan, i može da ima sterilni pristupni otvor (na primer, sud može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica koja ima zatvarač koji se može probušiti iglom za potkožnu injekciju). Oznaka ili uputstvo za upotrebu pokazuje da se kompozicija koristi za lečenje određenog stanja kod pojedinca. Etiketa ili uputstvo za upotrebu dalje sadrže uputstvo za davanje kompozicije pojedincu. Oznaka može sadržavati upute za rekonstituciju i/ili upotrebu. Sud u kojem se nalazi farmaceutska kompozicija može biti višenamenska bočica, koja omogućava ponovnu primenu (npr. od 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Uputstvo za upotrebu se odnosi na uputstva koja se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima terapijskih proizvoda koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda. Dodatno, predmet proizvodnje može dalje da sadrži drugi sud koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatno puferisani fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne tačke gledišta, uključujući druge pufere, razređivače, filtere, igle i špriceve.
[0803] [0476] Kompleti ili proizvodni artikal mogu da uključuju višejedinične doze farmaceutske kompozicije i uputstva za upotrebu, pakovana u količinama dovoljnim za čuvanje i upotrebu u apotekama, na primer, bolničkim apotekama i apotekama za pravljenje jedinjenja.
[0804] Primeri u nastavku su predviđeni da budu čisto primeri pronalaska i samim tim ne bi trebalo da se smatraju kao ograničenje pronalaska na bilo koji način. Sledeći primeri su dati kao ilustracija a ne kao ograničenje.
[0806] PRIMERI
[0807] Primeri o kojima će biti reči u nastavku su predviđeni da služe čisto kao primer pronalaska i ne bi trebalo da se smatraju ograničenjem pronalaska na bilo koji način. Primeri nisu predviđeni da predstavljaju primere jedinih eksperimenata koji mogu da se izvedu. Uloženi su napori da se osigura tačnost u smislu brojeva koji se koriste (na primer, količine, temperature, itd.) ali trebalo bi da se računa na neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi predstavljaju masene delove, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je izražena u Celzijusovim stepenima, a pritisak je atmosferski, ili je blizu istog.
[0809] Primer 1. Priprema jednodomenskih antitela
[0810] Da bi se razvila jednodomenska antitela velikog afiniteta prema naznačenim antigenima, lame su imunizovane. Biblioteka prikaza faga je zatim konstruisana kako bise identifikovali V<H>H lideri. Različiti klonovi su nasumično izabrani i klasifikovani su prema regionu za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR3), regionu koji igra glavnu ulogu u vezivanju antigena.
[0811] Da bi se dobila jednodomenska antitela, lame su imunizovane redovno odogvarajućim imunogenima, koji mogu da uključuju rekombinantni humani BCMA protein sa C-terminalnim Fc obeležjem (ACRO Biosystems, Cat No.:BC7-H5254), rekombinantni humani CD38 protein sa C-terminalnim His obeležjem (ACRO Biosystems, Cat No.: CD8-H5224), rekombinantni humani CD19 protein sa C-terminalnim Fc obeležjem (ACRO Biosystems, Cat No.:CD9-H5229) i rekombinantni humani CD20 protein sa C-terminalnim Fc obeležjem (ACRO Biosystems, Cat No.: CD0-H526a).
[0812] Postupak generisanja anti-BCMA jednodomenskih antitela je opisan u nastavku kao primer za generisanje jednodomenskih antitela protiv raznih antigena. Generisanje anti-humanog CD38, antihumanog-CD19 i anti-CD20 jednodomenska antitela je izvedeno sličnim postupcima kao što je opisano u nastavku. Drugi protokoli za pripremu jednodomenskih antitela su opisani. Videti, na primer, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674.
[0814] 1. Imunizacija životinja i ispitivanje imunog odgovora
[0815] 1.1 Imunizacija životinja
[0816] [0482] Svaki immunogen koji obuhvata rekombinantni antigen protein pomešan je sa adjuvansom ili PBS-om i ubrizgan lamama. Životinje je imunizovao uslužni prodavac (Cedarline) sedam puta, obično sa 200 ug imunogena i CFA (kompletnog Freundovog adjuvansa) svaki put u intervalima od oko 1 do 2 nedelje. Uzorci periferne krvi su uzeti u fazi pre imunizacije i nakon 5. i 7. imunizacije. Nakon više ciklusa imunizacije, imune reakcije lama protiv ciljanog antigena su procenjene kako bi se utvrdio titar antigenspecifičnih jednodomenskih antitela. Limfociti su izolovani gradijentnim centrifugiranjem iz oko 100 ml periferne krvi. Ćelije su dopunjene sa RNALATER<™>i čuvane na -80°C. Serumi su dobijeni centrifugiranjem antikoagulisanih uzoraka krvi i čuvani na -80°C.
[0818] 1.2 IgG frakcionisanje
[0819] Frakcionisanje podklase IgG je izvedeno prema standardnom operativnoj proceduri GenScripta. Podklase IgG frakcionisane su iz seruma terminalnog krvarenja pomoću smola Protein G i Protein A. Uzorak seruma od 1 ml napunjen je na 1 ml HITRAP<®>Protein G HP koloni, i kolona je isprana sa 10 ml fosfatnog pufera (20 mM, pH 7,0). Frakcija IgG3 (MW 100,000 Da) eluirana je sa 0,15 M NaCl, 0,58% sirćetnom kiselinom (pH 3,5), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 9,0) do pH 7,4. Potom je frakcija IgG1 (MW 170,000 Da) eluirana sa 0,1 M glicin-HCl (pH 2,7), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 8,5) do pH 7,4. Protok HITRAP-a<®>Protein G HP kolona je zatim napunjena na 1 ml HITRAP<®>Protein A HP koloni, i kolona je isprana sa 20 ml fosfatnog pufera (20 mM, pH 7,0). Frakcija IgG2 (MW 100,000 Da) je eluirana sa 0,15 MNaCl, 0,58% sirćetnom kiselinom (pH 4,5), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 9,0) do pH 7,4. Koncentracije prečišćenih IgG1, IgG2 i IgG3 antitela su određene pomoću OD280, a čistoća svakog od njih procenjena je i redukcionom i neredukcionom SDS-PAGE analizom.
[0821] 1.3 Ispitivanje imune reakcije
[0822] Imuni odgovor lama procenjen je ELISA-om, u kojoj su uzorci seruma i pročišćena IgG su testirani na vezivanje za imobilisane imunogene. Procenjeni serumi su uzeti pre imunizacije, nakon 5. imunizacije i pri terminalnom krvarenju. Antigen (tj., rekombinantni protein humanog antigena) je razblažen u puferu za oblaganje na 4 µg/ml. Mikrotitarska ploča je obložena razblaženim antigenom na 4°C preko noći. Ploča je zatim isprana 3 puta puferom za ispiranje nakon čega je usledilo blokiranje na sobnoj temperaturi 2 tokom sata. Ploča je zatim isprana 4 puta puferom za ispiranje. Serija razblaženih seruma ili IgG-a je dodata na ploču i inkubirana na sobnoj temperaturi 1,5 sat. Ploča je zatim isprana 4 puta puferom za pranje. HRP-konjugovano anti-lama IgG sekundarno antitelo je dodatno na ploču i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon ispiranja, TMB supstrat je dodat u svaki bunarčić i inkubiran 10 minuta pre zaustavljanja sa 1 M HCl. Da bi se kvantifikovalo vezivanje, izmerena je apsorbanca na 450 nm za svaki bunarčić pomoću MK3 spektrometra.
[0824] 2. Konstrukcija biblioteke prikaza faga V<H>H
[0825] 2.1 Ekstrakcija RNK
[0826] Ukupna RNK je ekstrahovana iz izolovanih limfocita (iz 1.1.1) pomoću reagensa TRIZOL<®>prema protokolu proizvođača. Količina i kvalitet ukupne RNK su procenjeni gel elektroforezom, a kvantifikovani merenjem apsorbance na OD260/280.
[0828] 2.2 RT-PCR i V<H>H amplifikacija
[0829] Ukupna RNK je obrnuto transkribovana u cDNK sa oligo(dT)<20>prajmerom pomoću kompleta PRIMESCRIPT<™>1st Strand cDNA Synthesis Kit prema protokolu proizvođača. Šest prednjih i dva obrnuta specifična degenerisana prajmera su napravljena da pojačavaju V<H>H fragmente, koji su imali dva uvedena BglI restriktivna mesta. V<H>H fragmenti su bili pojačana prema GenScript-ovoj standardnoj operativnoj proceduri (SOP) kao što je opisano u nastavku.
[0830] Varijabilni regioni imunoglobulina teških lanaca (tj., V<H>H<S>) amplifikovani su lančanom reakcijom polimeraze (PCR) u dva koraka. U prvom PCR-u, 100 ng cDNK uzorka pomešano je sa prajmerima CALL001 (SEQ ID NO: 2294) i CALL002 (SEQ ID NO: 230). DNK proizvodi iz prve PCR reakcije analizirani su elektroforezom u agaroznom gelu. Nakon prečišćavanja gelom, DNK proizvodi prvog PCR au korišćeni u drugoj PCR. Drugi PCR je izveden sa prajmerima BACK-1 (SEQ ID NO: 231), BACK-2 (SEQ ID NO: 232) i PMCF (SEQ ID NO: 233). Amplifikovani drugi PCR proizvodi koji sadrže V<H>H PCR fragmente su prečišćeni gelom i digestovani enzimom, a zatim umetnuti u fagemidne plazmide. Rekombinantni plazmidi sa fragmentima gena V<H>H su elektrotransportovani u E coli ćelije kako bi se stvorio prikaz faga V<H>H imune biblioteke.
[0831] Postupak PCR reakcije ima početnu fazu denaturacije na 94°C tokom 7 minuta, nakon čega sledi 30 ciklusa od 94°C za 1 min, 55°C za 1 min, i 72°C za 1 min; i nakon toga je usledila faza finalnog proširenja na 72°C za 7 min.
[0833] 2.3 Konstrukcija biblioteke faga
[0834] V<H>H PCR proizvodi dobijeni su amplifikacijom pomoću različitih parova prajmera. PCR proizvodi su zatim digestovani sa BglI i prečišćeni gelom. Fragmenti prečišćeni gelom umetnuti su u fagemidni vektor GenScript-a. Pilot biblioteka je konstruisana da optimizuje uslove vezivanja i transformacije.
[0835] Optimizovani uslovi vezivanja i transformacije korišćeni su za razvoj biblioteke fagemida. Mali deo transformisanih ćelija je razblažen i razvučen na 2 x YT ploče sa dodatkom 100 µg/ml ampicilina. Kolonije su prebrojane kako bi se izračunala veličina biblioteke. Ostatak transformisanih ćelija je razvučen na YT pločama sa dodatkom 100 ug/ml ampicilina i 2% glukoze. Travnjaci kolonija su ostrugani sa ploča. Mali alikvot ćelija je korišćen za izolaciju plazmida iz biblioteke. Ostatak je dopunjen glicerolom i čuvan na -80°C kao zaliha.
[0837] 3. Pomeranje prikaza faga
[0838] 3.1 Bio-pomeranje
[0839] Konstruisana V<H>H biblioteka faga je pomerena u osnovu na rekombinantni humani BCMA protein i CHO ćelije koje eksprimiraju humani BCMA (tj., CHO-BCMA ćelije, pripremljene u kompaniji od strane Legend Biotec) tim redom pomoću standardne procedure koju je razvio GenScript. Zaliha biblioteke je gajena do faze logovanja, a zatim je biblioteka spašena pomoćnim fagom M13KO7 i pojačana preko noći na 25°C u mešalici. Fag je tada istaložen sa PEG/NaCl, ponovno suspendovan u PBS i čuvan na -80°C. Za ispiranje čvrste faze, bunarčići mikroploče obložene su rekombinantnim humanim BCMA proteinom u PBS-u na 4°C preko noći. Za ispiranje tekuće faze, CHO-BCMA ćelije su blokirane puferom za blokiranje na sobnoj temperaturi 1 sat. Tokom faze oblaganja ili blokiranja, čestice faga su prethodno inkubirane sa puferom za blokiranje i Fc kontrolnim proteinom u bunarčićima mikroploče. Nakon predinkubacije, čestice faga dodate su u bunarčiće obložene BCMA proteinima odnosno rastvorom CHO-BCMA i inkubirane 1 sat. Nakon inkubacije, nevezani i nespecifično vezani fagovi su isprani ispiranjem bunarčića ili CHO-BCMA ćelija sa PBST-om šest puta uz dva dodatna ispiranja PBS-om. Vezane čestice faga su eluirane sa 100 mM trietilamina (TEA), a eluat je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl (pH 7,4). Polovina eluata je zatim korišćena za infekciju eksponencijalno rastućih E coli TG1 ćelija (OD<600>= 0,4-0,6) za izlaznu titraciju.
[0841] 3.2 ELISA faga
[0842] Izvedena je fagna ELISA za identifikaciju klonova specifičnih za ciljane antigene. Pojedinačni izlazni klonovi faga su gajeni u ploči sa 96 dubokih bunarčića i spašeni pomoćnim fagom M13KO7 preko noći. Kako bi se identifikovali klonovi koji se vezuju za proteine antigena, ELISA mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića obložene su rekombinantnim humanim BCMA proteinom i Fc kontrolnim proteinom u puferu za oblaganje preko noći na 4°C, a ploče su zatim blokirane puferom za blokiranje. Nakon blokiranja, otprilike 50 µl po bunarčiću supernatanta faga iz ćelijske kulture preko noći dodato je pločama za 1,5-satnu inkubaciju na 4°C. Ploče su isprane četiri puta, a HRP-konjugovano anti-M13 monoklonalno antitelo je dodato pločama za 45-minutnu inkubaciju na 4°C. Ploče su opet isprane pet puta i rastvor supstrata je dodat u bunarčiće za razvijanje. Za svaki bunarčić izmerena je apsorpcija na 450 nm.
[0843] Kako bi se identifikovali klonovi koji vezuju CHO-BCMA ćelije, CHO-BCMA ćelije su blokirane puferom za blokiranje na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon blokiranja, približno 20 µl po bunarčiću fagnog supernatanta iz ćelijske kulture preko noći dodato je rastvorima ćelija za 1-satnu inkubaciju na sobnoj temperaturi. Nakon što su ćelije isprane 4 puta, dodato je HRP-konjugovano anti-M13 monoklonalno antitelo za 30-minutnu inkubaciju na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane pet puta i zatim je dodat rastvor supstrata za razvijanje. Apsorpcija je izmerena na 450 nm.
[0844] Nakon pomeranja, pozitivni pojedinačni klonovi dobijeni Phage ELISA-om su slučajno odabrani, a DNK je izolovana iz izlaznih faga korišćenjem kompleta za ekstrakciju plazmida. Umeci u plazmidima su sekvencirani. Za svaki ciljani antigen dobijene su jedna ili više V<H>H sekvenci, videti, na primer, tabelu 2.
[0845] Primer 2. Priprema monospecifičnih V<H>H himernih antigen receptora
[0846] Glavna sekvenca CAR koja kodira glavni polipeptid CAR koji obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, CD28 citoplazmatski domen, CD137 citoplazmatsk domen i CD3ζ citoplazmatski domen hemijski je sintetisana i kloniran u pre-modificikaciono lentivirusni vektor nizvodno i operativno povezan sa konstitutivnim hEF1α promoterom. Dobijeni glavni CAR vektor nazvan je "PLLV-hEF1α-8281373." Mesta za višestruko kloniranje (MCS) u vektoru omogućila su umetanje sekvence nukleinske kiseline koja sadrži Kozakovu sekvencu (SEQ ID NO: 126) operativno povezanu sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CD8α signalni peptid spojen sa N-krajem V<H>H fragmenta u vektor PLLV-hEF1α-8281373, uzvodno i operativno povezan sa glavnom sekvencom CAR.
[0847] Da bi se konstruisao monospecifičan CAR koji ima jedan V<H>H domen koji koristi okosnicu PLLV-hEF1α-8281373, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira V<H>H domen je operativno povezan sa 3' sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CD8α signalni peptid. Fuziona sekvenca nukleinske kiseline je hemijski sintetisana i klonirana u okosnicu PLLV-hEF1α-8281373 CAR putem EcoRI (SEQ ID NO: 234: 5'-GAATTC-3') i SpeI (SEQ ID NO: 235: 5'-ACTAGT -3') restrikcionih mesta tehnikama molekularnog kloniranja poznatog u ovoj oblasti. U tabeli 4 navedeni su vektori koji su konstruisani za ekspresiju primernih monospecifičnih, jednovalentnih anti-BCMA CAR i anti-CD38 CAR.
[0848] Radi lakšeg daljeg umetanja dodatnih sekvenci, kao što je nukleotid koji kodira drugi V<H>H, pri pravljenju monospecifičnog CAR konstrukta (npr. anti-BCMA ili anti-CD38), restrikciona mesta uključujući HpaI (SEQ ID NO: 236: 5'-GTTAAC-3'), MluI (SEQ ID NO: 237: 5'-ACGCGT-3'), NsiI (SEQ ID NO: 238: 5'-ATGCAT-3') mesta su uključena između sekvence nukleinske kiseline signalnog peptida CD8α i V<H>H sekvence nukleinske kiseline.
[0849] Mešavina plazmida za pakovanje lentivirusa uključujući pCMV-ΔR-8.74 i pMD2.G (Addgene#12259) prethodno je pomešana sa vektorima PLLV-hEF1α-8281373 koji imaju V<H>H fragmente (tabela 4) u unapred optimizovanom odnosu sa polieterimidom (PEI), zatim je pravilno pomešana i inkubirana na sobnoj temperaturi 5 minuta. Transfekciona mešavina se zatim u kapima dodaje u HEK293 ćelije i meša se lagano. Nakon toga, ćelije su inkubirane preko noći na 37°C i 5% CO<2>ćelijski inkubator. Supernatanti su sakupljeni nakon centrifugiranja na 4°C, 500 g tokom 10 minuta.
[0850] Supernatanti koji sadrže virus su filtrirani kroz 0,45 um PES filter, nakon čega je usledilo ultracentrifugiranje za koncentraciju lentivirusa. Nakon ultracentrifugiranja, supernatanti su pažljivo odbačeni, a virusne pelete se oprezno ispiraju prethodno ohlađenim DPBS-om. Virus je pravilno podeljen u alikvote, zatim se odmah čuva na -80°C. Titar virusa određen je p24 baziranog na HTRF kompleta koji razvija GenScript.
[0852] Priprema PBMC
[0853] [0499] Leukociti su prikupljeni od zdravih donora aferezom, a koncentracija ćelija je podešena na 5×10<6>ćelija/ml u podlozi R10. Leukociti su zatim pomešani sa 0,9% rastvorom NaCl u odnosu 1:1 (v/v).3 ml podloge lymphoprep je dodato u epruvetu za centrifugiranje od 15 ml, a 6 ml razblažene mešavine limfocita se polako nanosi na vrh lymphoprep podloge. Mešavina limfocita je centrifugirana na 800 g 30 minuta bez kočenja na 20°C. Limfocitni sloj istaloženih leukocita i trombocita je zatim sakupljen pipetom od 200 ul. Sakupljena frakcija razblažena je najmanje 6 puta sa 0,9% NaCl ili R10 kako bi se smanjila gustina rastvora. Sakupljena frakcija je zatim centrifugirana na 250 g 10 minuta na 20°C. Supernatant je potpuno usisan i 10 ml R10 je dodato ćelijskom peletu radi ponovne suspenzije ćelijskog peleta.
[0854] Mešavina se dalje centrifugira na 250 g 10 minuta na 20°C. Supernatant je ponovno usisan.2 ml R10 prethodno zagrejanog na 37°C sa 100 IU/ml IL-2 je dodato ćelijskom peletu, i ćelijski pelet je lagano ponovo suspendovan. Broj ćelija je određen nakon bojenja Trypan Blue, a ovaj PBMC uzorak je bio spreman za kasnije eksperimente.
[0856] Prečišćavanje T ćelija
[0857] Humane T ćelije su prečišćene iz PBMC-a pomoću kompleta za izolaciju T ćelija Miltenyi Pan (Cat#130-096-535), prema protokolu proizvođača kako je opisano u nastavku. Prvo je određen broj ćelija i ćelijska suspenzija je centrifugirana na 300 g 10 minuta. Supernatant je zatim potpuno usisan, a ćelijske pelete su ponovo suspendovane u 40 µl pufera na 10<7>ukupnih ćelija. Dodato je 10 µl Pan T Cell koktela biotin-antitela po 10<7>ukupnih ćelija, temeljno se promeša i inkubira oko 5 minuta u frižideru (2~8°C). Zatim je dodato 30 µl pufera na 10<7>ćelija. Dodato je 20 µl Pan T Cell MicroBead koktela na 10<7>ćelija. Mešavina ćelijske suspenzije je dobro promešana i inkubirana dodatnih 10 minuta u frižideru (2~8°C). Za magnetno razdvajanje potrebno je najmanje 500 µl. Za magnetno razdvajanje, LS kolona je postavljena u magnetno polje odgovarajućeg MACS separatora. Kolona je pripremljena ispiranjem sa 3 ml pufera. Suspenzija ćelija je zatim nanesena na kolonu, i sakupljen je protok koji sadrži neobeležene ćelije, koje su predstavljale obogaćene frakcije T ćelija. Dodatne T ćelije su sakupljene ispiranjem kolone sa 3 ml pufera i sakupljanjem neobeleženih ćelija koje prolaze. Ove neobeležene ćelije ponovno su predstavljale obogaćene T ćelije i kombinovane su sa protokom iz prethodne faze. Pulovane obogaćene T ćelije su zatim centrifugirane i ponovno suspendovane u R10+100 IU/ml IL-2.
[0858] Pripremljene T ćelije su naknadno prethodno aktivirane 48-96 sati sa kompletom za aktivaciju/ekspanziju humanih T ćelija (Miltenyi#130-091-441) u skladu sa protokolom proizvođača u kojem su anti-CD3/CD28 MACSiBead čestice dodate u odnosu kuglica-ćelija od 1:2.
[0859] Prethodno aktivirane T ćelije su transdukovane sa zalihama lentivirusa u prisustvu 7 µg/ml polibrena sa centrifugiranjem na 1200 g, 32°C tokom 1.5 h. Transdukovane ćelije su zatim prenesene u inkubator za ćelijsku kulturu za transgeno eksprimiranje u pogodnim uslovima.
[0860] [0503] Trećeg ili sedmog dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelija su sakupljene i zajednički inkubirane sa tumorskim ćelijama na efektoru (CAR-T) do odnosa ciljanih ćelija od 20:1 tokom 20 sati. Ciljane ćelije su bile ili humana ćelijska linija multiplog mijeloma RPMI8226.Luc, ili humana ćelijska linija glioblastoma U87MG.Luc ćelije. Obe ćelijske linije projektovane u kući za ekspresiju luciferaze svitaca. Za ispitivanje citotoksičnosti CAR-T na tumorske ćelije, One-glo<™>reagensi za analizu luminescentne luciferaze (Promega#E6110) pripremljeni su prema protokolu proizvođača i dodati zajednički kultivisanim ćelijama kako bi se otkrila preostala aktivnost luciferaze u bunarčiću. Budući da se luciferaza eksprimira samo u RPMI8226.Luc ili U87MG.Luc ćelijama, preostala aktivnost luciferaze u bunarčiću je direktno u korelaciji sa brojem održivih ciljanih ćelija u bunarčiću. Maksimalna aktivnost luciferaze dobijena je dodavanjem podloge kulture ciljanim ćelijama u odsutnosti efektorskih ćelija. Minimalna aktivnost luciferaze određena je dodavanjem Tritona X-100 u konačnoj koncentraciji od 1% u vreme kada su započeta ispitivanja citotoksičnosti. Specifična citotoksičnost izračunata je po formuli: specifična citotoksičnost%= 100% * (1-(RLUzorak-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin)).
[0861] Monospecifični CAR klonovi koji ciljaju BCMA (CD269) su kodirani počevši sa ciframa "269" dok monospecifični CAR klonovi ciljaju CD38 su slično kodirani počevši sa ciframa "38." Kao što je prikazano na FIG.2A, izabrani klonovi su ispoljili različite nivoe citotoksičnosti na ćelijskoj liniji multiplog mijeloma RPMI8226.Luc ćelije, sa više od 60% monospecifičnih V<H>H-baziranih CAR-T koji pokazuju >50% citotoksičnosti prema RPMI8226.Luc ćelijama. Klonovi 269A37346, 269A37348, 269A37353, 269A37355, 38A37326, 38A37331, 38A37717, i 38A37719 bazirani CAR-T su izabrani radi daljeg ispitivanja.
[0862] Određenije, klonovi 269A37346, 269A37348, 267A37353, 269A37355, 38A37326, 38A37331, 38A37717 bazirani CAR-T su ispoljili potentnu citotoksičnost na ćelijsku liniju multiplog mijeloma RPMI8226.Luc ćelije sa više od 20%-30% povećanja u RPMI8226. Ubijanje Luc ćelija terapijama CAR-T u poređenju sa netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Međutim, takav porast citotoksičnosti se nije desio na humanoj ćelijskoj liniji glioblastoma U87MG.Luc (videti FIG.2B). Nisu primećeni značajni citotoksični efekti na U87MG.Luc ćelijama ovim monospecifičnim V<H>H baziranim CAR-T ćelijama u poređenju sa kontrolama bez transdukovanja (UnT). Gorenavedeno zapažanje ukazuje da neki od ovih klonova mogu biti specifični i potentni na BCMA ili CD38 pozitivne ćelije.
[0864] Primer 3. Priprema primera bispecifičnih ili viševalentnih himernih antigen receptora
[0865] Potencijalno potentni klonovi, kako je opisano u primeru 2, takođe mogu biti povoljni kandidati za generisanje bispecifičnih ili viševalentnih V<H>H baziranih CAR. Odabrana su dva reprezentativna V<H>H klona (anti-BCMA V<H>H klon 269A37346 i anti-CD38 V<H>H klon 38A37717) kako bi se konstruisali razni CAR konstrukti kao primeri.
[0866] [0506] BCMA × CD38 V<H>H bazirani CAR mogu biti generisani spajanjem BCMA specifičnog V<H>H i CD38 specifičnog VHH putem odgovarajućeg peptidnog linkera (na primer, Gly-Ser polimer), nakon čega sledi CAR signalizirajući domenski vektor. Primeri bispecifičnih BCMA×CD38 CAR konstrukata (GSI5001 do GSI5010) navedeni su u tabeli 5 i 6. Prvo, aminokiselinske sekvence anti-BCMA V<H>H i anti-CD38 V<H>H su povezane zajedno putem Gly-Ser linkera koji može biti različitih dužina. Zatim je povezana amino kiselinska sekvenca postavljena nakon CD8α signalnog peptida. Ova kombinovana sekvenca, uključujući Kozak-CD8α signalni peptid-bispecifični V<H>H, direktno je sintetisana i klonirana u PLLV-hEF1α-81373 CAR backbone vektor putem EcoRI i SpeI restrikcionih mesta, korišćenjem uobičajenih molekularnih klonirajućih protokola poznatih u struci. Glavna sekvenca CAR kodira glavni polipeptidni CAR koji obuhvata od N-kraja do C-kraja: CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, CD137 citoplazmatski domen, i CD3ζ citoplazmatski domen, koji su hemijski sintetisani i klonirani u premodifikovani lentivirusni vektor nizvodno i operabilno povezani sa konstitutivnim hEF1α promoterom. Dobijeni CAR backbone vektor nazvan je "PLLV-hEF1α-81373."
[0867] Dodatno, eksperimentalni ko-ekspresioni vektor koji kodira BCMA CAR i CD38 CAR konstruisan je spajanjem BCMA specifičnog VHH baziranog CAR i CD38 specifičnog V<H>H baziranog CAR u jedan CAR vektor putem odgovarajućeg splajs baziranog linkera (T2A, P2A ili F2A). Na primer, konstrukt GSI5013 ima nukleinsku kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 239. Sekvenca nukleinske kiseline u GSI5013 kodira od 5' ka 3': CD8α jednostruki peptid, 38A37717 V<H>H, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, CD137 ko-stimulatorni domen, CD3ζ citoplazmatski signalizirajući domen, T2A, CD8α jednostruki peptid, 269A37346 V<H>H, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, CD137 ko-stimulatorni domen, i CD3ζ citoplazmatski signalizirajući domen.
[0868] Viševalentni V<H>H CAR mogu biti konstruisani uvođenjem nukleinske kiseline koja kodira višestruke kopije jednog V<H>H spojenih peptidnim linkerima u CAR signalizirajući domenski vektor. Primeri monovalentnih viševalentnih CAR konstrukata (GSI5014, GSI5015, GSI5016, GSI5017) navedeni su u tabeli 5. Ovi konstrukti su pripremljeni spajanjem 2-3 kopije V<H>H pomoću glicin-serin linkera, nakon čega je direktno sintetisana ova povezana sekvencu u kombinaciji sa Kozak-CD8α signalnim peptidom sekvencom nukleinske kiseline, i klonirana u PLLV-hEF1α-81373 CAR backbone vektor putem EcoRI i SpeI restrikcionih mesta. Kao kontrola, jednostruki V<H>H su takođe klonirani u isti glavni PLLV-hEF1α-81373 CAR korišćenjem identičnih postupaka (GSI5011 i GSI5012, navedeni u tabeli 4).
[0869] Lentivirusni vektori koji nose CAR gene od GSI5001 do GSI5017 su pakovani i titrovani prema protokolima opisanim u primeru 2. Korišćenjem protokola opisanih u primeru 2, ljudski PBMC (periferni krvni mononuklearni ćelije) su pripremljeni iz krvi volontera radi dalje izolacije primarnih ljudskih T ćelija korišćenjem Miltenyi humanih PanT ćelijskih izolacionih kompleta. Čiste T ćelije su zatim prethodno aktivirane i proširene koristeći Miltenyi anti-CD3/CD28 mikro-perle, kako je opisano u primeru 2.
[0870] Prethodno aktivirane T ćelije su potom transducirane lentivirusnim zaliham u prisustvu 7 µg/ml polibrenom centrifugiranjem na 1200 g, 32°C tokom 1,5 h. Transdukovane ćelije su zatim prebačene u inkubator za ćelijsku kulturu radi ekspresije transgena pod odgovarajućim uslovima.
[0871] 3. dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelije su bile prikupljene i ko-inkubirane sa tumorskim ćelijama u odnosu efektora (CAR-T ćelije) prema ciljanoj ćeliji od 20:1 tokom 20 sati. Radi procene citotoksičnosti CAR-T ćelija na tumorskim ćelijama, reagensi za One-glo luminescentni luciferaza test (Promega #E6110) su dodati ko-kultivisanim ćelijama, a specifična citotoksičnost za svaki CAR-T je merena kako je opisano u primeru 2
[0872] Broj kopija integrisanih CAR gena za svaku grupu je određen polukvantitativnom PCR (q-PCR) analizom. Ukratko, genomska DNK iz svake grupe CAR-T ćelija je pripremljen pomoću Gentra Puregene Cell Kit (Qiagen). Koncentracija genomskog DNK je određena pomoću Nanodrop uređaja, a uzorak od 10 ng genomskog DNK je obrađen standardizovanom q-PCR analizom sa SYBR Green Realtime PCR Master mix plus (Toyobo) na ABI#7300 q-PCR instrumentu koristeći specifične prajmere za CAR (prednji prajmer 137P2F (SEQ ID NO: 252): 5'-GTCCTTCTCCTGTCACTGGTTAT-3'; i reverzni prajmer 137P2R (SEQ ID NO: 253): 5'-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCA-3'). Relativan broj kopija svakog integrisanog CAR gena je izračunat na osnovu standardne krivulje koja je uspostavljena korišćenjem plazmida koji sadrži ciljane sekvence.
[0873] Kao što je prikazano u tabeli 7 u nastavku, brojevi kopija za svaku pripremu CAR-T su određeni i podaci ukazuju na visoku integraciju ciljanog gena u genom T ćelija.
[0874] TABELA7. Brojevi kopija integracije genoma.
[0875] CAR-T ćelije sa konstruktima Kopije /ng gDNK
[0878] GSI5001 1825
[0881] GSI500 1510
[0884] GSI500 1730
[0887] GSI500 2735
[0889] GSI500 Nije
[0892] GSI500 6692
[0895] GSI500 6929
[0898] GSI500 1554
[0901] GSI500 1060
[0904] GSI501 7353
[0907] GSI501 3089
[0910] GSI501 6505
[0913] GSS00 1070
[0916] GSI005 3215
[0918] UnT 72.77
[0921] Voda
117
[0923] [0513] Kao što je ilustrovano na FIG.3A-3B, monospecifičan V<H>H CAR usmeren protiv BCMA (GSI5011) i monospecifični V<H>H CAR usmeren protiv CD38 (GSI5012) pokazali su snažnu citotoksičnost na ćelijskoj liniji multiplog mijeloma RPMI8226.Luc. Sa GSI5011 CAR-om, 42.98±2.86% RPMI8226.Luc ćelija je bilo lizirano, dok je sa GSI5012, 61.25±1.92% RPMI8226.Luc ćelija bilo lizirano, u poređenju sa netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT) koje su pokazale nespecifičnu lizu od 9.25±1.11%).
[0924] Bispecifični CAR GSI5001-GSI5010 pokazao je snažnu specifičnu lizu ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc u poređenju sa netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Kako je prikazano na FIG.3A i 3B, specifičan procenat lize RPMI8226.Luc ćelija bio je 98.91±0.17% za GSI5001-eksprimirane CAR-T ćelije, 97.10±0.26% za GSI5002-eksprimirane CAR-T ćelije, 93.85±0.69% za GSI5003-eksprimirane CAR-T ćelije, 82.81±2.40% za GSI5004-eksprimirane CAR-T ćelije, 98.95±0.66% za GSI5005-eksprimirane CAR-T ćelije, 93.91±1.25% za GSI5006-eksprimirane CAR-T ćelije, 96.49±1.05% za GSI5007-eksprimirane CAR-T ćelije, 94.41±0.75% za GSI5008-eksprimirane CAR-T ćelije, 90.72±0.62% za GSI5009-eksprimirane CAR-T ćelije, i 85.05±2.69% za GSI5010-eksprimirane CAR-T ćelije, u odnosu na nespecifičnu lizu netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT, 9.25±1.11%). Ovi rezultati takođe ukazuju da se kraći Gly-Ser linker čini da pokazuje nešto bolju citotoksičnu aktivnost na ciljanim tumorskim ćelijama. Dalja istraživanja mogu biti sprovedena pod sub-optimalnim uslovima ispitivanja kako bi se proučili takvi efekti. Takođe, redosled anti-BCMA V<H>H i anti-CD38 V<H>H u vektoru nije pokazao značajan uticaj na krajnju citotoksičnu aktivnost na RPMI8226.Luc ćelijama. U eksperimentu su takođe pripremljene i dve CAR-T ćelije bazirane na scFv (jednomerkovnom Fv) strukturi, pri čemu je GSS005 bio anti-BCMA scFv bazirani CAR dok je GSI005 bio anti-CD38 scFv bazirani CAR. Obe GSS005 i GSI005 su takođe pokazale snažnu specifičnu lizu protiv RPMI8226.Luc ćelija (57.94±1.91% za GSS5005, 61.25±1.92% za GSI005).
[0925] Konstruisane T ćelije sa monovalentnim CAR specifičnim za BCMA (GSI5011), dvovalentnim CAR specifičnim za BCMA (GSI5012) ili trovalentnim CAR specifičnim za BCMA (GSI5013), kao i inženjerske T ćelije sa monovalentnim CAR specifičnim za CD38 (GSI5012), dvovalentnim CAR specifičnim za CD38 (GSI5016) ili trovalentnim CAR specifičnim za CD38 (GSI5017), pripremljene su i citotoksični testovi su izvedeni na RPMI8226.Luc ćelijama kao što je prethodno opisano. Kako je prikazano na FIG.4, specifična liza RPMI8226.Luc ćelija je bila 63.25±2.64% za CAR-T ćelije eksprimirane GSI5011, 61.04±2.75% za CAR-T ćelije eksprimirane GSI5014, i 59.57±2.64% za CAR-T ćelije eksprimirane GSI5015, u poređenju sa 0.05%±2.33% netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Takođe, kako je prikazano na FIG.4, specifična liza RPMI8226.Luc ćelija od strane anti-CD38 V<H>H CAR-T ćelija iznosila je 95.79±0.62% za CAR-T ćelije eksprimirane GSI5012, 94.16±0.31% za CAR-T ćelije eksprimirane GSI5016, i 97.61±0.77% za CAR-T ćelije eksprimirane GSI5015, u poređenju sa 57.92%±2.88% netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Ovi podaci ukazuju da ovi CAR sa različitim modalitetima vezivanja za antigene imaju snažnu antitumorsku aktivnost protiv BCMA pozitivnih ćelija.
[0926] Primer 4. Priprema, in vitro i in vivo ispitivanja primera CD19×CD20 CAR
[0927] Primerom 1 dobijena su jednodomenska antitela protiv anti-CD19 i anti-CD20, koja su navedena u tabeli 52. Monospecifični CD19 CAR baziran na CD19 V<H>H i monospecifični CD20 CAR baziran na CD20 V<H>H su pripremljeni kao što je opisano u primeru 2, i navedeni su u tabeli 4. Bispecifični CD19×CD20 CAR baziran na CD19 V<H>H i CD20 V<H>H je konstruisan kao što je opisano u primeru 3, i naveden je u tabeli 6. CAR glavni vektor koji je korišćen za konstrukciju ovih eksperimentalnih CD19 CAR, CD20 CAR i CD19×CD20 CAR kodira od N-kraja do C-kraja: CD8α pojedinačni peptid, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, citoplazmatski domen iz CD28, i citoplazmatski domen iz CD3ζ. FIG.5 prikazuje konstrukte CD19 CAR, CD20 CAR i bispecifičnog CD19×CD20 CAR. Inženjerske CAR-T ćelije koje eksprimiraju CD19 CAR, CD20 CAR ili bispecifični CD19×CD20 CAR pripremljene su kako je opisano u primeru 2.
[0928] Citotoksičnost CAR-T ćelija je određena u 4-satnom ko-kultivacionom testu. U eksperimentima, pripremljene CAR-T ćelije su centrifugalno prikupljene, zatim razblažene do željenih koncentracija u DPBS sa 10% humanog AB seruma, i kultivisane na pločama sa 96 bunarčića. Tumorske ćelije Raji, poznate po jakom eksprimiranju CD19 i CD20, su obeležene sa Calcein-AM (BD Biosciences). Obeležene CAR-T ćelije i Raji ćelije su kultivisane u odnosu efektora prema ciljanoj ćeliji 10:1 na 37°C tokom 4 sata. Nakon toga, citotoksičnost CAR-T ćelija je detektovana pomoću FACS analize.
[0929] Kao što je prikazano na FIG.6, u gornjem levom panelu, nije bilo značajne lize Raji ćelija od strane netransdukovanih T ćelija. Citotoksičnost na Raji ćelijama je bila oko 40%, kako kod CD19 (39%, gornji desni panel), tako i kod CD20 (41%, donji levi panel) monospecifičnih V<H>H CAR-T ćelija. Kada su isti CD19 V<H>H i CD20 V<H>H spojeni da služe kao ekstracelularni antigen-vezujući domen u istom konstrukt, tj. u CD19xCD20 bispecifičnim CAR-T ćelijama, citotoksičnost prema Raji tumorskim ćelijama (75.24%) je bila povećana u poređenju sa mono-specifičnim CD19 V<H>H CAR-T ili CD20 V<H>H CAR-T ćelijama (donji desni panel FIG.6).
[0931] Ispitivanja na modelu mišjeg tumora
[0932] NOG miševi su infuzirani sa 4×10<6>Raji ćelija po mišu putem injekcije u repnu venu. Nakon 10 dana, miševi su nasumično podeljeni u četiri grupe, gde su svakoj grupi ubrizgavane ekvivalentne doze netransdukovanih T ćelija, CD19 CAR-T ćelija, CD20 CAR-T ćelija ili CD19×CD20 bispecifičnih CAR-T ćelija, redom. Miševi su bili neprekidno praćeni tokom 5 nedelja.
[0933] Kao što je prikazano na FIG.7, in vivo podaci o preživljavanju ukazuju da je ukupna stopa preživljavanja miševa tretiranih sa CD19×CD20 bispecifičnim CAR-T ćelijama bila veća u poređenju sa miševima tretiranim sa CD19 ili CD20 monospecifičnim CAR-T ćelijama.
[0935] Primer 5. Priprema primera monospecifičnih, dvovalentnih CAR sa dva različita BCMA vezujuća domena
[0936] Potencijalni V<H>H klonovi, kako je opisano u primeru 2, mogu takođe biti korišćeni za generisanje monospecifičnih, viševalentnih CAR koji imaju dva ili više različitih vezujućih domena za ciljane antigene u ekstracelularnom antigen-vezujućem domenu. Dva reprezentativna sdAb anti-BCMA klona (klon 269A37353 i klon 269A37917) su odabrana za konstrukciju raznih monospecifičnih, dvovalentnih CAR konstrukata u ovom primeru.
[0937] Dvovalentni BCMA CAR (tj. dvovalentni BCMA CAR) mogu biti generisani spajanjem dva različita BCMA-specifična V<H>H domena putem odgovarajućeg peptidnog linkera (npr. Gly-Ser polimer), a zatim umetanjem fuzionog konstrukta u CAR signalizirajući domen vektora osnove. Primeri dvovalentnih BCMA CAR konstrukata (GSI5021-GSI5026) koji sadrže dva različita BCMA vezujuća domena, 269A37353 i 269A37917, navedeni su u tabeli 55. Peptidni linkeri različitih dužina korišćeni su u različitim konstruktima. Konstrukti GSI5021-GSI5023 svaki kodiraju od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, 269A37353, peptidni linker, 269A37917, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, citoplazmatski domen iz CD137 i citoplazmatski domen humanog CD3ζ. Konstrukti GSI5024-GSI5026 svaki kodiraju od N-kraja do C-kraja: CD8α signalni peptid, 269A37917, peptidni linker, 269A37353, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, citoplazmatski domen iz CD137 i citoplazmatski domen humanog CD3ζ. Svaki konstrukt je dalje fuzioniran sa Kozak sekvencom na 5' kraju kako bi se obezbedio kompletan kodirajući sekvencu. Kompletna kodirajuća sekvencu je direktno sintetisana i klonirana u PLLV-hEF1α-81373 CAR vektor osnove putem EcoRI i SpeI restrikcionih mesta koristeći uobičajene molekularne klonirajuće protokole poznate u stručnoj literaturi. Nasuprot tome, monospecifični, monovalentni CAR (GSI5019 i GSI5020, navedeni u tabeli 4) koji imaju istu CAR signalnu domen vektora osnove konstruisani su koristeći slične postupke.
[0938] Lentivirusni vektori koji nose svaki od CAR konstrukata GSI5019-GSI5026 bili su pakovani i titrirani prema protokolima opisanim u primeru 2. Korišćenjem protokola opisanih u primeru 2, humane PBMC su pripremljene iz uzoraka periferne krvi od dobrovoljaca za dalju izolaciju primarnih ljudskih T ćelija korišćenjem Miltenyi humanih PanT setova za izolaciju ćelija. Prečišćene T ćelije su bile prethodno aktivirane i proširene koristeći Miltenyi anti-CD3/CD28 mikro-kuglice kako je opisano u primeru 2.
[0939] Prethodno aktivirane T ćelije su zatim bile transdukovane lentivirusnim osnovnim rastvorom u prisustvu 7 µg/ml polibrena centrifugiranjem na 1200 g, 32°C tokom 1.5 sati. Transdukovane ćelije su zatim prebačene u inkubator za ćelijske kulture radi ekspresije transgena u odgovarajućim uslovima.
[0940] Trećeg dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelije su bile sakupljene i koinkubirane sa tumorskim ćelijama (RPMI8226.Luc ćelije ili U87MG.Luc ćelije) u odnosu na efektor (CAR-T) prema ciljanoj ćeliji u razmeri 20:1 tokom 20 sati. RPMI8226.Luc ćelije su ćelije multipli mijeloma koje izražavaju luciferazu i koje su pozitivne na BCMA. U87MG.Luc ćelije su ćelije glioblastoma koje izražavaju luciferazu i koje su negativne na BCMA. Za analizu citotoksičnosti CAR-T ćelija na tumorske ćelije, korišćeni su Oneglo luminescentni reagensi za luciferazu (Promega #E6110), i specifična citotoksičnost za svaki CAR-T je merena kako je opisano u primeru 2.

Claims (15)

1. [0526] Kao što je prikazano na FIG.8A, konkretan procenat lize RPMI8226.Luc ćelija je bio 88.21±1.29% GSI5019-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 93.84±1.13% GSI5020-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 71.45±1.79% GSI5021-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 99.80±0.45% GSI5022-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 97.46±0.50% GSI5023-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 81.29±1.27% GSI5024-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 93.50±0.47% GSI5025-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 87.83±0.23% GSI5026-eksprimiranjem CAR-T ćelija, tim redom, u odnosu na 13.49%±1.75% netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Takođe, kao što je prikazano na FIG.8B, konkretan procenat lize BCMA-negativne ćelijske linije U87MG. Luc je bio 2.84±7.41% GSI5019-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 15.50±2.24% GSI5020-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 6.74±3.37% GSI5021-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 8.03±2.36% GSI5022-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 9.00±1.88% GSI5023-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 17.03±2.27% GSI5024-eksprimiranjem CAR-T ćelija, 16.81±1.98% GSI5025-eksprimiranjem CAR-T ćelija, -11.55±5.43% GSI5026-eksprimiranjem CAR-T ćelija, u odnosu na 12.49%±3.79% netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Podaci ukazuju da su viševalentni CAR sa različitim antigen-vezujućim grupama imali potentno antitumorsko dejstvo na BCMA pozitivne ćelije, ali ne i na BCMA negativne ćelije.
Patentni zahtevi
1. Himerni antigen receptor (CAR) koji obuhvata polipeptid koji obuhvata:
a) ekstracelularni antigen vezujući domen koji obuhvata prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo sdAb koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu najmanje jedan od prvog antigena i drugog antigena je BCMA, i pri čemu svako prvo i drugo sdAb predstavlja V<H>H;
b) transmembranski domen; i
c) intracelularni signalizirajući domen; i
pri čemu to prvo sdAb ili drugo sdAb predstavlja anti-BCMA sdAb koje obuhvata bilo koji od sledećih:
(1) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31; ili (2) CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38.
2. CAR prema zahtevu 1, pri čemu se prvo sdAb nalazi na N-kraju ili na C-kraju drugog sdAb.
3. CAR prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu je prvo sdAb i/ili drugo sdAb kamelidno, himerno, ili humanizovano.
4. CAR prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu su prvo sdAb i drugo sdAb direktno međusobno spojeni peptidnom vezom.
5. CAR prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu su prvo sdAb i drugo sdAb međusobno spojeni peptidnim linkerom, opciono pri čemu taj peptidni linker nema više od 50 aminokiselina u dužini.
6. CAR prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu:
a) transmembranski domen predstavlja transmembranski domen molekula izabran iz grupe koju čine CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1;
b) intracelularni signalizirajući domen obuhvata primarni intracelularni signalizirajući domen imunske efektorske ćelije, opciono pri čemu primarni intracelularni signalizirajući domen predstavlja primarni intracelularni signalizirajući domen iz CD3ζ;
i/ili
c) intracelularni signalizirajući domen obuhvata kostimulatorni signalizirajući domen; opciono pri čemu taj kostimulatorni signalizirajući domen je kostimulatorni signalizirajući domen kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koju čine CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 i njihove kombinacije.
7. CAR prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu CAR dalje obuhvata zglobni domen koji se nalazi između C-kraja ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i N-kraja transmembranskog domena; i/ili signalni peptid koji se nalazi na N-kraju polipeptida.
8. Izolovana nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR prema bilo kom od zahteva 1-7.
9. Vektor koji obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 8.
10. Konstruisana imunska efektorska ćelija koja obuhvata CAR prema bilo kom od zahteva 1-7, izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 8, ili vektor prema zahtevu 9.
11. Konstruisana imunska efektorska ćelija prema zahtevu 10, pri čemu konstruisana imunska efektorska ćelija je T ćelija.
12. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata konstruisanu imunsku efektorsku ćeliju prema zahtevu 10 ili 11, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
13. Farmaceutska kompozicija kako je definisana u zahtevu 12 za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pojedinca.
14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je taj kancer multipli mijelom, akutna limfoblastna leukemija, ili hronična limfocitna leukemija.
15. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu je taj kancer multipli mijelom.
RS20260562A 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe RS68082B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510490002 2015-08-11
CN201510733585.2A CN105384825B (zh) 2015-08-11 2015-11-02 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP24174651.0A EP4424376B1 (en) 2015-08-11 2016-08-10 Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS68082B1 true RS68082B1 (sr) 2026-05-29

Family

ID=55417644

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260562A RS68082B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe
RS20240831A RS65866B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe
RS20260267A RS67825B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigenski receptori zasnovani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240831A RS65866B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe
RS20260267A RS67825B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigenski receptori zasnovani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe

Country Status (37)

Country Link
US (2) US10934363B2 (sr)
EP (5) EP4755460A2 (sr)
JP (6) JP6859347B2 (sr)
KR (2) KR20240173368A (sr)
CN (9) CN105384825B (sr)
AU (4) AU2016305075B2 (sr)
BR (1) BR112018002844A2 (sr)
CA (1) CA2994579C (sr)
CL (4) CL2018000378A1 (sr)
CO (2) CO2018001405A2 (sr)
CR (2) CR20210225A (sr)
CY (1) CY2024032I2 (sr)
DK (2) DK4063397T3 (sr)
EA (1) EA201890302A1 (sr)
ES (3) ES3067089T3 (sr)
FI (3) FI4063397T3 (sr)
FR (1) FR24C1050I2 (sr)
HR (2) HRP20260300T1 (sr)
HU (3) HUE067869T2 (sr)
IL (3) IL294683A (sr)
LT (4) LT4063397T (sr)
MX (2) MX2018001739A (sr)
MY (3) MY188362A (sr)
NL (1) NL301301I2 (sr)
NO (1) NO2024054I1 (sr)
NZ (1) NZ750366A (sr)
PH (2) PH12018500295B1 (sr)
PL (3) PL3334765T3 (sr)
PT (2) PT4063397T (sr)
RS (3) RS68082B1 (sr)
SA (2) SA518390904B1 (sr)
SG (2) SG10201913485QA (sr)
SI (2) SI3334765T1 (sr)
SM (3) SMT202600176T1 (sr)
UA (2) UA125818C2 (sr)
WO (1) WO2017025038A1 (sr)
ZA (2) ZA201800703B (sr)

Families Citing this family (302)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4050103A1 (en) 2014-04-07 2022-08-31 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-nme antibody
CN104004095B (zh) * 2014-06-04 2016-11-23 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种cd7纳米抗体、其编码序列及应用
EP3234120B1 (en) 2014-12-15 2025-09-03 The Regents of the University of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective t cell mediated killing
WO2016100232A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
US10434153B1 (en) 2015-05-20 2019-10-08 Kim Leslie O'Neill Use of car and bite technology coupled with an scFv from an antibody against human thymidine kinase 1 to specifically target tumors
EP3297672B1 (en) 2015-05-21 2021-09-01 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3368571B1 (en) 2015-10-30 2022-12-07 The Regents of The University of California Transforming growth factor-beta-responsive polypeptides and their methods for use
JP2019506155A (ja) 2016-01-12 2019-03-07 クレッシェンド、バイオロジックス、リミテッドＣｒｅｓｃｅｎｄｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ 治療分子
MA44254A (fr) 2016-02-17 2018-12-26 Seattle Genetics Inc Anticorps bcma et leur utilisation pour traiter le cancer et les troubles immunologiques
CN110699371A (zh) * 2016-03-18 2020-01-17 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
KR102427334B1 (ko) * 2016-04-01 2022-08-03 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 및 t 세포 수용체 및 사용 방법
NZ746700A (en) 2016-04-01 2023-04-28 Kite Pharma Inc Bcma binding molecules and methods of use thereof
GB201607968D0 (en) * 2016-05-06 2016-06-22 Crescendo Biolog Ltd Chimeric antigen receptor
KR102530742B1 (ko) 2016-05-20 2023-05-09 하푼 테라퓨틱스, 인크. 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
IL299221A (en) 2016-06-21 2023-02-01 Teneobio Inc Cd3 binding antibodies
CN109562126A (zh) * 2016-06-24 2019-04-02 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
WO2018002181A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Umc Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
WO2018014039A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors (cars) specific for muc1 and methods for their use
WO2018014122A1 (en) * 2016-07-18 2018-01-25 Helix Biopharma Corp. Car immune cells directed to carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6 to treat cancer
PL3896091T3 (pl) 2016-08-10 2024-04-29 Legend Biotech Ireland Limited Chimeryczne receptory antygenowe nakierowane na bcma i sposoby ich zastosowania
CR20220578A (es) * 2016-09-14 2023-01-17 Teneobio Inc Anticuerpos de unión a cd3
WO2018058432A1 (zh) * 2016-09-28 2018-04-05 李华顺 一种多基因重组嵌合抗原受体分子及其应用
WO2018068201A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
CN106701827A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 刘晓明 表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体t细胞的转化及扩增培养与保存方法
CN106755108A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 刘晓明 一种表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法
CN106755109A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 刘晓明 一种表达人cd19和cd20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体
EP3581190B1 (en) 2016-12-09 2021-03-10 ONK Therapeutics Limited Engineered natural killer cells and uses thereof
CN106822184A (zh) * 2016-12-15 2017-06-13 梁爱斌 多靶点联合的car‑t细胞制剂与制备方法
EP3559035A1 (en) * 2016-12-21 2019-10-30 TeneoBio, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
CN108276493B (zh) * 2016-12-30 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN106749677B (zh) * 2017-01-04 2020-06-12 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种靶向mll白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用
EP3565842A1 (en) 2017-01-06 2019-11-13 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death (pd-1)
US20190375815A1 (en) 2017-01-31 2019-12-12 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
IL268349B2 (en) 2017-02-17 2024-08-01 Hutchinson Fred Cancer Res Combination therapies for treatment of bcma-related cancers and autoimmune disorders
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
MY200973A (en) 2017-04-11 2024-01-26 Inhibrx Inc Multispecific Polypeptide Constructs Having Constrained Cd3 Binding And Methods Of Using The Same
CN108728465A (zh) * 2017-04-14 2018-11-02 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种表达靶细胞-效应细胞桥接器的微环dna载体及其制备方法和应用
WO2018200582A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Chimeric antibody/t-cell receptor constructs and uses thereof
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
PL3618842T3 (pl) 2017-05-01 2024-02-19 Juno Therapeutics, Inc. Kombinacja terapii komórkowej i związku immunomodulującego
SG10202107880XA (en) 2017-05-12 2021-09-29 Harpoon Therapeutics Inc Mesothelin binding proteins
EP3624834A1 (en) * 2017-05-17 2020-03-25 Thunder Biotech Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
US10415017B2 (en) 2017-05-17 2019-09-17 Thunder Biotech, Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
CN107299110B (zh) 2017-05-27 2019-11-22 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的胰腺癌、恶性间皮瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107245500B (zh) * 2017-05-27 2019-05-17 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107337736B (zh) * 2017-06-06 2019-07-26 上海优卡迪生物医药科技有限公司 Octs-car双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用
JP7240335B2 (ja) * 2017-06-20 2023-03-15 テネオワン， インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体
CN110891971B (zh) * 2017-06-20 2024-01-12 特尼奥生物股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2019006072A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS TO ANTIGEN OF MATURATION OF LYMPHOCYTES B WITH HUMAN DOMAINS
GB201711068D0 (en) 2017-07-10 2017-08-23 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules binding PSMA
CN109232742B (zh) * 2017-07-11 2021-10-22 深圳市第二人民医院 一种嵌合抗原受体及其应用
WO2019014891A1 (zh) * 2017-07-20 2019-01-24 深圳普瑞金生物药业有限公司 一种用于治疗肿瘤的egfr单域抗体cart及其应用
WO2019018525A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS BINDING TO CD123
AU2018309735B2 (en) * 2017-07-31 2025-03-13 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD19/CD20 immunotherapy
US20200207867A1 (en) * 2017-09-13 2020-07-02 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes
WO2019066435A2 (ko) 2017-09-29 2019-04-04 재단법인 목암생명과학연구소 Bcma에 높은 친화도를 가지는 항-bcma 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
CA3078969A1 (en) * 2017-10-13 2019-04-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
SG11202003415XA (en) 2017-10-18 2020-05-28 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
US11066475B2 (en) 2017-11-01 2021-07-20 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen and encoding polynucleotides
AU2018359907A1 (en) 2017-11-06 2020-05-07 Fred Hutchinson Cancer Center Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
CA3082297A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma
WO2019099639A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Navartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
MX2020005651A (es) 2017-11-30 2020-10-28 Novartis Ag Receptor de antigeno quimerico dirigido a bcma y usos del mismo.
US20190192678A1 (en) * 2017-12-18 2019-06-27 Novather, Inc. System and method for the treatment of disease using a hyperspecific modified protein system
AU2018393110B2 (en) 2017-12-20 2023-04-27 Poseida Therapeutics, Inc. VCAR compositions and methods for use
MA51428A (fr) * 2017-12-22 2020-11-04 Bluebird Bio Inc Récepteur d'antigène chimérique multivalent
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
WO2019127215A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric receptors comprising an nkg2d domain and methods of use thereof
CN109971715A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 深圳华大生命科学研究院 一种扩增特异性car-t细胞的培养方法
CN109988242A (zh) * 2018-01-02 2019-07-09 武汉波睿达生物科技有限公司 联合嵌合抗原受体、表达载体、慢病毒及t细胞
WO2019136432A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
CN108285486A (zh) * 2018-01-15 2018-07-17 浙江阿思科力生物科技有限公司 以cd20为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
KR102115236B1 (ko) * 2018-01-29 2020-05-27 (주)에스엠티바이오 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
AU2019215031C1 (en) 2018-01-31 2026-02-26 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CN108341881B (zh) * 2018-01-31 2020-08-18 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108314739B (zh) * 2018-02-05 2020-07-14 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN110129369B (zh) * 2018-02-09 2023-10-13 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种嵌合抗原受体基因工程载体、免疫细胞及其应用
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
GB201802573D0 (en) 2018-02-16 2018-04-04 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules that bind to LAG3
CN108220247A (zh) * 2018-03-20 2018-06-29 杭州史迪姆生物科技有限公司 一种双car-t细胞及其制备方法和应用
EP3773633A4 (en) 2018-04-06 2022-01-26 The Regents of The University of California METHODS OF TREATMENT OF GLIOBLASTOMA
CA3096202A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 The Regents Of The University Of California Methods of treating egfrviii expressing glioblastomas
EP3549597A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Synthetic signalling constructs and its use
TW202010757A (zh) 2018-04-11 2020-03-16 美商英伊布里克斯公司 具有經受限cd3結合的多重特異性多肽構築體以及相關方法及用途
CN116836297A (zh) * 2018-04-12 2023-10-03 上海赛比曼生物科技有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其制法和应用
MX2020012217A (es) 2018-05-14 2021-03-02 Harpoon Therapeutics Inc Porción de unión para activación condicional de moléculas de inmunoglobulina.
WO2019220368A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Janssen Biotech, Inc. Bcma/cd3 and gprdc5d/cd3 bispecific antibodies for use in cancer therapy
CN110606893B (zh) * 2018-06-15 2022-11-15 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 一种靶向cd19和cd20双抗原的嵌合性抗原受体t细胞治疗肿瘤的方法
WO2019242632A1 (en) * 2018-06-19 2019-12-26 1§1Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
LT3823990T (lt) * 2018-07-20 2026-04-10 TeneoTwo, Inc. Antikūnai iš sunkiosios grandinės, besirišantys prie cd19
WO2020023553A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
SG11202101415UA (en) * 2018-08-10 2021-03-30 Sangamo Therapeutics France New car constructs comprising tnfr2 domains
GB201813178D0 (en) * 2018-08-13 2018-09-26 Autolus Ltd Cell
CN109134665B (zh) 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
CN111542343B (zh) * 2018-08-24 2023-08-18 上海先博生物科技有限公司 抗bcma的单域抗体及其应用
SI3844267T1 (sl) 2018-08-31 2025-10-30 Novartis Ag Postopki izdelave celic, ki izražajo receptorje himernega antigena
US20210171909A1 (en) 2018-08-31 2021-06-10 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
WO2020052543A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies against cd33 and constructs thereof
CN109293781A (zh) * 2018-09-12 2019-02-01 中国人民解放军总医院 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用
CN109081870B (zh) * 2018-09-21 2021-12-03 成都阿帕克生物科技有限公司 一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CN119306844A (zh) 2018-09-25 2025-01-14 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
CN109265550B (zh) * 2018-09-25 2020-09-15 华东师范大学 Bcma抗体、嵌合抗原受体和药物
WO2020061796A1 (en) * 2018-09-26 2020-04-02 Hrain Biotechnology Co., Ltd. Bcma-and-cd19-targeting chimeric antigen receptor and uses thereof
CN109503716B (zh) * 2018-10-08 2021-04-27 浙江生研生物科技有限公司 一种双特异性嵌合抗原受体分子及其在肿瘤治疗上的应用
JP7611820B2 (ja) * 2018-10-11 2025-01-10 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｄｌｌ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
US12590169B2 (en) 2018-10-11 2026-03-31 Inhibrx Biosciences, Inc. 5T4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020087065A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to cd38
CN109504660B (zh) * 2018-11-02 2021-08-06 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
CN113573719A (zh) 2018-11-08 2021-10-29 朱诺治疗学股份有限公司 治疗和t细胞调节的方法和组合
US12466892B2 (en) 2018-11-08 2025-11-11 The Regents Of The University Of California Systems and methods for targeting cancer cells
CN113226340A (zh) 2018-11-26 2021-08-06 恩卡尔塔公司 同时扩增多种免疫细胞类型的方法、相关组合物及其在癌症免疫疗法中的用途
CN109468283A (zh) * 2018-11-30 2019-03-15 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
CN110951689A (zh) * 2018-11-30 2020-04-03 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和cd30的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
KR20250116790A (ko) 2018-12-12 2025-08-01 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포 및 사용 방법
CN109485732B (zh) * 2018-12-20 2021-09-24 四川大学华西医院 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途
CN109651511B (zh) * 2018-12-26 2020-06-09 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
US20220144960A1 (en) * 2018-12-26 2022-05-12 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Cd30-binding moieties, chimeric antigen receptors, and uses thereof
CN109652379B (zh) * 2018-12-29 2022-08-16 博生吉医药科技(苏州)有限公司 Cd7嵌合抗原受体修饰的nk-92mi细胞及其应用
CN109485734B (zh) * 2018-12-30 2020-05-12 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma和cd19的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3908613A4 (en) * 2019-01-07 2022-10-19 Celluris Participações Ltda. BISPECIFIC IN-TANDEM RECEPTOR CAR AND METHODS FOR MODULATION OF THE TUMOR MICROAREA
WO2020154150A1 (en) 2019-01-22 2020-07-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use
CN113330038A (zh) * 2019-01-22 2021-08-31 亘喜生物科技（上海）有限公司 Cd20组合靶向的工程化免疫细胞
EP3920693A4 (en) * 2019-02-04 2022-10-05 Minerva Biotechnologies Corporation ANTI-NME ANTIBODIES AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER OR CANCER METASTASIS
CN109734814A (zh) * 2019-02-12 2019-05-10 南京卡提医学科技有限公司 具有免疫受体的工程化t细胞治疗癌症的用途
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
CN113613664B (zh) 2019-03-01 2025-11-18 阿奇洛伊斯生物制药公司 在抗原特异性免疫细胞中调节cd160功能的方法及其用途
KR20210137085A (ko) 2019-03-05 2021-11-17 엔카르타, 인크. Cd19 유도된 키메라 항원 수용체 및 면역 요법에서 이의 용도
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
CA3133654A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to psma
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959307A4 (en) * 2019-04-22 2023-08-23 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
CN109942709B (zh) * 2019-04-22 2019-12-27 广州百暨基因科技有限公司 一种抗bcma的单域抗体及其应用
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
JP7711945B2 (ja) 2019-04-30 2025-07-23 センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド キメラ受容体及びその使用方法
EP3966245A1 (en) * 2019-05-04 2022-03-16 Inhibrx, Inc. Cd33-binding polypeptides and uses thereof
WO2020232303A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM BINDING PROTEINS AND METHODS OF USE
CN114206927B (zh) 2019-06-14 2025-03-21 特尼奥生物股份有限公司 与cd22和cd3结合的多特异性重链抗体
CN114341365A (zh) * 2019-08-30 2022-04-12 詹森生物科技公司 B细胞成熟复合物car t构建体和引物
CN114667294B (zh) * 2019-09-02 2024-04-16 成都盛世君联生物技术有限公司 特异性结合b细胞成熟抗原的抗体及其用途
CN112739721B (zh) * 2019-09-26 2023-01-31 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体
WO2021081133A1 (en) * 2019-10-21 2021-04-29 Purdue Research Foundation Engineered natural killer cells and methods for using the same in immunotherapy and autophagy inhibition techniques
CA3156761A1 (en) 2019-10-22 2021-04-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity nanobodies targeting b7h3 (cd276) for treating multiple solid tumors
US12522645B2 (en) 2019-11-05 2026-01-13 Janssen Biotech, Inc. BCMA-targeted CAR-T cell therapy of multiple myeloma
WO2021105989A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Chimeric antigen receptor to carbohydrate antigens
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021105988A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Antibodies to carbohydrate antigens
CN114829405B (zh) * 2019-12-10 2025-07-18 爱必乐生物公司 抗bcma/抗4-1bb双特异性抗体及其用途
CN115916818A (zh) 2019-12-11 2023-04-04 库利南肿瘤股份有限公司 抗cd19抗体和多特异性结合蛋白
EP4077398A4 (en) * 2019-12-16 2024-04-10 Legend Biotech Ireland Limited SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TARGETTING BCMA AND METHODS OF USE THEREOF
CN115135672A (zh) 2019-12-20 2022-09-30 波赛达治疗公司 抗muc1组合物和使用方法
CN111235113A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 南京北恒生物科技有限公司 包含嵌合抗原受体的免疫细胞及其用途
EP4097129A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 Inhibrx, Inc. Cd28 single domain antibodies and multivalent and multispecific constructs thereof
CN111196858B (zh) * 2020-02-05 2021-02-09 武汉科技大学 一种治疗血液肿瘤合并hiv感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用
CN113248620A (zh) * 2020-02-13 2021-08-13 四川大学 一种嵌合抗原受体的共刺激信号结构域及其应用
CN115698285A (zh) * 2020-02-14 2023-02-03 小利兰·斯坦福大学董事会 具有cd2激活的嵌合抗原受体
IL295878A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
JP2023516008A (ja) 2020-02-27 2023-04-17 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
CN115768899B (zh) 2020-03-09 2026-03-27 詹森生物科技公司 用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
IL297147B1 (en) 2020-04-10 2026-05-01 Juno Therapeutics Inc Methods and uses related to engineered cell therapy with a chimeric antigen receptor directed against a B-cell maturation antigen
CA3181399A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Juno Therapeutics, Inc. Combination of bcma-directed t cell therapy and an immunomodulatory compound
KR20250007022A (ko) 2020-04-29 2025-01-13 테네오원, 인코포레이티드 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 다중특이적 중쇄 항체
EP3915576A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-01 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
CN111574629B (zh) * 2020-06-01 2021-07-20 宁夏医科大学 一种抗cd20的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用
JP2023530039A (ja) 2020-06-08 2023-07-12 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 抗ｎｍｅ抗体および癌または癌転移の治療方法
US20230332104A1 (en) 2020-06-11 2023-10-19 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
CA3183682A1 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-nme antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
WO2022011531A1 (zh) * 2020-07-14 2022-01-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
CN116390941A (zh) * 2020-07-16 2023-07-04 南京传奇生物科技有限公司 多特异性嵌合抗原受体及其用途
US20230250184A1 (en) * 2020-07-16 2023-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Cd22 binding molecules and uses thereof
JP7846667B2 (ja) * 2020-07-16 2026-04-15 レジェンド バイオテック アイルランド リミテッド Ｃｄ２０結合分子及びその使用
CA3186065A1 (en) * 2020-07-16 2022-01-20 Xiaohu FAN Cd19 binding molecules and uses thereof
CN111848798B (zh) * 2020-07-27 2022-05-13 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合bcma的纳米抗体及其应用
AU2021317073A1 (en) * 2020-07-29 2023-02-16 National Research Council Of Canada Anti-CD22 single domain antibodies and therapeutic constructs
US20230340146A1 (en) 2020-08-13 2023-10-26 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-1 (gpc1) for treating solid tumors
EP4201960A4 (en) * 2020-08-20 2024-09-04 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. BCMA-BINDING SINGLE MOLECULE WITH VARIABLE DOMAIN AND ANTIGEN-BINDING MOLECULE
WO2022040586A2 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
JP2023549780A (ja) 2020-11-04 2023-11-29 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 改変されたインバリアントｃｄ３免疫グロブリンスーパーファミリー鎖遺伝子座からキメラ受容体を発現する細胞ならびに関連するポリヌクレオチドおよび方法
WO2022116086A1 (en) * 2020-12-03 2022-06-09 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
US20240059794A1 (en) * 2020-12-17 2024-02-22 Parasol Biotech Ltd. Gucy2c binding molecules and uses thereof
JP2024500189A (ja) 2020-12-21 2024-01-04 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド プロテアーゼ活性化ｃｄ４５ゲートｃａｒ
CA3209218A1 (en) * 2021-01-27 2022-08-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Bi-specific car t cells for b cell malignancies
MX2023008809A (es) 2021-01-29 2023-08-04 Allogene Therapeutics Inc ATENUACIÓN O INACTIVACIÓN DE UNO O MÁS DE TAP2, NLRC5, ß2M, TRAC, RFX5, RFXAP Y RFXANK PARA MITIGAR EL RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS T DE PRODUCTOS CELULARES ALOGÉNICOS.
CN112778427B (zh) * 2021-01-29 2022-03-15 武汉思安医疗技术有限公司 双特异性cs1-bcma car-t细胞及其应用
WO2022183160A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Methods for treating cd83-expressing cancer
KR20230165771A (ko) 2021-03-03 2023-12-05 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포 요법 및 dgk 억제제의 조합
CN115109156B (zh) * 2021-03-22 2024-03-08 浙江纳米抗体技术中心有限公司 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用
PE20260568A1 (es) * 2021-04-06 2026-03-10 Teneobio Inc Anticuerpos anti-cd19 y estructuras car-t
KR20230171994A (ko) 2021-04-16 2023-12-21 셀진 코포레이션 선행 줄기 세포 이식을 받은 환자에서의 t 세포 요법
CN117337303A (zh) * 2021-04-16 2024-01-02 特尼奥生物股份有限公司 抗cd20抗体及car-t结构
CN118201618A (zh) 2021-04-16 2024-06-14 细胞基因公司 与bcma定向t细胞疗法的组合疗法
AR125468A1 (es) 2021-04-27 2023-07-19 Novartis Ag Sistema de producción de vectores virales
WO2022232612A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
WO2022228579A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting gpc3 and methods of use thereof
CN117916256A (zh) 2021-05-06 2024-04-19 朱诺治疗学有限公司 用于刺激和转导t细胞的方法
TW202309522A (zh) 2021-05-11 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於監測復發性及／或難治性多發性骨髓瘤之治療的方法及組成物
IL308345A (en) 2021-05-11 2024-01-01 Janssen Biotech Inc Methods for Minimizing Neurotoxicity Associated with Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Therapy
CN117425670A (zh) * 2021-05-19 2024-01-19 细胞编辑有限责任公司 双特异性嵌合抗原受体和表达此类双特异性嵌合抗原受体的基因工程化免疫细胞
CA3216228A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
KR20240051112A (ko) 2021-07-01 2024-04-19 인답타 세라뷰틱스 인코포레이티드 조작된 자연 살해(nk) 세포 및 관련 방법
CN113651893B (zh) * 2021-08-12 2023-08-01 上海生物制品研究所有限责任公司 联合her2和meso双靶点car-t载体及其构建方法和在癌症中的应用
CA3228773A1 (en) * 2021-08-12 2023-02-16 Gaurav KHARYA Chimeric antigen receptors (car) for b cell malignancies
EP4388000A1 (en) 2021-08-20 2024-06-26 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
CN115894704B (zh) * 2021-09-24 2023-12-26 四川大学 一种特异性靶向肿瘤EpCAM抗原的抗体及应用
TW202330594A (zh) 2021-09-29 2023-08-01 美商莫德斯醫療公司 抗原結合多肽、抗原結合多肽複合物及其使用方法
US20250000976A1 (en) * 2021-10-07 2025-01-02 National Research Council Of Canada Anti-bcma single domain antibodies and therapeutic constructs
US20240417446A1 (en) 2021-10-26 2024-12-19 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CN114015674B (zh) 2021-11-02 2024-08-30 辉大(上海)生物科技有限公司 一种CRISPR-Cas12i系统
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
WO2023081735A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen for use in treating myeloma
JP2024540275A (ja) 2021-11-04 2024-10-31 ヤンセン バイオテック， インク． Ｂｃｍａを標的とする、多発性骨髄腫のためのｃａｒ－ｔ細胞療法関連出願の相互参照
WO2023077343A1 (en) 2021-11-04 2023-05-11 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
CN118556086A (zh) 2021-11-09 2024-08-27 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（gpc3）的含有igg4铰链的嵌合抗原受体及其用途
CN115466331B (zh) * 2021-11-18 2023-05-30 合源生物科技(天津)有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
CA3241912A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-15 Huafeng Wei Antibody binding to bcma and use thereof
CN114195898B (zh) * 2021-12-13 2022-10-28 南京凯地医疗技术有限公司 人源化抗cd33的单域抗体及其构建体制备方法和应用
CN118401561A (zh) * 2021-12-16 2024-07-26 浙江瑞加美生物科技有限公司 人源化的bcma抗体和bcma-car-t/bcma-car-dnt细胞
JP2025508298A (ja) * 2021-12-29 2025-03-26 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー シングルドメイン高親和性抗体及びその使用方法
KR20240137075A (ko) 2022-01-28 2024-09-19 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 조성물의 제조 방법
CN119156404A (zh) 2022-02-15 2024-12-17 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向gpc2的含有cd28铰链和跨膜结构的嵌合抗原受体及其用途
JP2025507678A (ja) 2022-02-28 2025-03-21 ヤンセン バイオテック， インク． Ｂｃｍａを標的とする、多発性骨髄腫のためのｃａｒ－ｔ細胞療法
CN114685664B (zh) * 2022-04-12 2023-10-20 内蒙古农业大学 抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用
US20250297282A1 (en) 2022-05-05 2025-09-25 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
CN119212724A (zh) * 2022-05-09 2024-12-27 上海先博生物科技有限公司 工程化免疫效应细胞及其与CBL-b抑制剂联用的应用
US20250295771A1 (en) 2022-05-11 2025-09-25 Celgene Corporation Methods and uses related to t cell therapy and production of same
US20250302954A1 (en) 2022-05-11 2025-10-02 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
US20250345432A1 (en) 2022-05-25 2025-11-13 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
AU2023276514A1 (en) * 2022-05-27 2024-12-05 Shenzhen Immunofoco Biotechnology Co., Ltd. Chimeric antigen receptor containing cldn18.2 single domain antibody and application thereof
KR20250023513A (ko) * 2022-06-13 2025-02-18 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 개선된 글리칸 의존성 면역치료 이중특이적 융합 단백질 및 키메라 항원 수용체
US12297285B2 (en) * 2022-06-24 2025-05-13 Orna Therapeutics, Inc. Circular RNA encoding chimeric antigen receptors targeting BCMA
CN117343905A (zh) * 2022-06-27 2024-01-05 广西医科大学 靶向EGFRvⅢ分泌PD1单域抗体的CAR-T细胞及其制备方法和应用
CN114805582B (zh) * 2022-06-29 2022-10-04 上海恒润达生生物科技股份有限公司 抗Trop2纳米抗体及其用途
US20250375524A1 (en) 2022-06-30 2025-12-11 Indapta Therapeutics, Inc. Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods
US20240042030A1 (en) 2022-07-29 2024-02-08 Allogene Therapeutics, Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition
US20260151429A1 (en) * 2022-08-25 2026-06-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting interleukin 13 receptor subunit alpha 2 and methods of use thereof
WO2024050399A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes
CN116023495B (zh) * 2022-09-05 2023-10-03 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗cd40纳米抗体及其制备方法与应用
KR20250061756A (ko) 2022-09-08 2025-05-08 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포 요법과 연속적 또는 간헐적 dgk 억제제 투여의 조합
CN115925947B (zh) * 2022-09-27 2023-08-22 上海百英生物科技股份有限公司 一种亲和力成熟方法及抗人pd-l1单域抗体的亲和力成熟
JP2026519263A (ja) 2022-10-26 2026-06-15 ノバルティス アーゲー レンチウイルス製剤
AU2023373360A1 (en) * 2022-11-02 2025-06-12 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy of multiple myeloma
US20260166082A1 (en) 2022-11-02 2026-06-18 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
CN117069844B (zh) * 2022-12-06 2024-02-09 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 包含特定等电点的抗人bcma纳米抗体的双特异性抗体及应用
CN121100267A (zh) 2022-12-09 2025-12-09 朱诺治疗学股份有限公司 使用全息成像预测细胞表型的机器学习方法
US20260232729A1 (en) 2023-02-03 2026-08-13 C3S2 Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
WO2024168192A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Celgene Corporation Assessment of bcma in biological samples
CN116199781B (zh) * 2023-02-22 2025-07-18 成都优赛诺生物科技有限公司 一种靶向cd22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
WO2024206209A1 (en) * 2023-03-27 2024-10-03 Modernatx, Inc. Anti-cd38, anti-bcma, anti-gprc5d, and anti-fcrh5 antibodies and uses to treat various diseases such as cancer
PE20260290A1 (es) 2023-03-31 2026-02-10 Abelzeta Inc Receptores de antigeno quimericos biespecificos dirigidos a cd20 y bcma
CN116640229B (zh) * 2023-04-10 2024-01-30 中国人民解放军总医院第五医学中心 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用
CA3205511A1 (en) * 2023-04-19 2025-03-17 Legend Biotech Usa Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
WO2024238346A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies that specifically bind the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein and compositions and uses thereof
WO2024240248A1 (zh) * 2023-05-24 2024-11-28 茂行制药(苏州)有限公司 用于靶向b7h3的同种异体嵌合抗原受体t细胞的给药的方法和组合物
CN116574181B (zh) * 2023-05-31 2026-06-09 华道(上海)生物医药股份有限公司 一种抗Glypican 3抗体及其应用
EP4719352A1 (en) 2023-05-31 2026-04-08 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
CN117986387A (zh) * 2023-05-31 2024-05-07 四川大学华西医院 一种新型小型化car设计及制备方法和应用
CN116789859B (zh) * 2023-06-29 2024-02-23 徐州医科大学 一种用于评价bcma靶向car-t细胞药效的靶细胞及其应用
CN116949099B (zh) * 2023-07-12 2024-04-02 山东大学第二医院 一种靶向cd38和cs1抗原的并联嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2025019228A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors against cd276 for the treatment of solid tumors
GR1010884B (el) * 2023-08-30 2025-02-19 Janssen Biotech, Inc., Θεραπεια τ κυτταρων με χιμαιρικο υποδοχεα αντιγονου (car) με στοχευμενο αντιγονο ωριμανσης των β κυτταρων (bcma) για πολλαπλο μυελωμα
CN121969385A (zh) 2023-09-11 2026-05-01 丹娜-法伯癌症研究院 含有il-2变体以增强car t细胞的功能性的car-衔接子
CN117024594B (zh) * 2023-09-21 2025-02-28 武汉波睿达生物科技有限公司 一种抗cd20的纳米抗体及其应用
WO2025067472A1 (en) * 2023-09-27 2025-04-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Methods of culturing gamma delta t cells
KR20260085124A (ko) 2023-10-05 2026-06-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Car-t 세포 의약품의 생성을 위한 렌티바이러스 제조의 개선된 방법
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
KR20260105764A (ko) 2023-10-30 2026-07-07 알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드 조작된 세포
CN120025440B (zh) * 2023-11-21 2026-07-17 南京融捷康生物科技有限公司 一种抗Nkp46的单域抗体及其用途
WO2025130984A1 (en) * 2023-12-20 2025-06-26 Overland Therapeutics (Us) Inc. Single domain antibodies for bcma
CN117821608A (zh) * 2023-12-28 2024-04-05 华道(上海)生物医药有限公司 一种检测car细胞的引物探针组合及其应用
KR102869233B1 (ko) * 2024-01-24 2025-10-15 주식회사 박셀바이오 Bcma 특이적 키메라 항원 수용체를 포함하는 신규한 골수 침윤 림프구 집단 및 이의 제조방법
AU2025218081A1 (en) 2024-02-05 2026-07-16 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
WO2025193685A1 (en) 2024-03-12 2025-09-18 Legend Biotech Usa Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
CN117866903B (zh) * 2024-03-12 2024-06-04 北京贝来药业有限公司 单域抗体修饰的干细胞及其在疾病治疗中用途
CN117866904B (zh) * 2024-03-12 2024-06-07 北京贝来药业有限公司 基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025221781A2 (en) 2024-04-15 2025-10-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting fgfr4 and/or cd276 and use thereof for the treatment of cancer
US20260041768A1 (en) 2024-05-03 2026-02-12 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025231372A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025232812A1 (en) * 2024-05-08 2025-11-13 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Biomolecule conjugated lipid nanoparticles
WO2025235598A1 (en) 2024-05-09 2025-11-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting glypican-2 and/or cd276 and their use for treating solid tumors
WO2025240496A1 (en) 2024-05-14 2025-11-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Natural killer cells expressing a mesothelin-targeted chimeric antigen receptor and interleukin-15 for the treatment of solid tumors
WO2026025092A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Juno Therapeutics, Inc. Synthetic promoters for t cell expression
WO2026026960A1 (zh) * 2024-08-01 2026-02-05 原启生物科技(上海)有限责任公司 一种靶向bcma的人源化纳米抗体及其应用
WO2026072709A1 (en) 2024-09-25 2026-04-02 Orna Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors targeting bcma
WO2026090579A1 (en) 2024-10-25 2026-04-30 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating smoldering multiple myeloma with ciltacabtagene autoleucel
WO2026103881A1 (en) * 2024-11-15 2026-05-21 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Bcma binding moieties and uses thereof
CN122071528A (zh) * 2024-11-22 2026-05-22 浙江纳米抗体技术中心有限公司 多特异性抗原结合分子及其应用
WO2026128545A1 (en) 2024-12-11 2026-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin-targeted car t cells with increased anti-tumor efficacy, persistence and resilience and use thereof for the treatment of mesothelin-positive cancers
WO2026158639A1 (en) * 2025-01-26 2026-07-30 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Bcma binding moieties and uses thereof
CN120173114B (zh) * 2025-03-24 2025-09-26 广州泽朗生物医药科技有限公司 Cart细胞及其在制备抗癌症药物中的应用

Family Cites Families (183)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1990003430A1 (en) 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
FI903489A7 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Yhden osan sisältävät ligandit, näitä ligandeja sisältävät reseptorit, menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä ligandien ja reseptorien käytt ö
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
DE69334275D1 (de) 1992-08-21 2009-05-20 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne Leichtkette
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
ATE374248T1 (de) 1996-06-27 2007-10-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antikörpermoleküle, die spezifisch mit dem aktiven zentrum oder dem aktiven spalt eines zielmoleküls interagieren
EP1972194A1 (en) 1996-12-03 2008-09-24 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
AU3596599A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
AU2474700A (en) 1998-12-01 2000-06-19 Genentech Inc. Secreted amd transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ATE276359T1 (de) 1999-01-19 2004-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP2002541845A (ja) 1999-04-16 2002-12-10 セルテック セラピューティックス リミテッド 合成膜貫通成分
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
HK1052372A1 (zh) 2000-02-24 2003-09-11 Xcyte Therapies, Inc. 细胞的同步刺激和富集
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
US20030190598A1 (en) 2000-05-26 2003-10-09 Jasmid Tanha Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
AU2002319544B2 (en) 2001-08-10 2008-07-10 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
JP2005516958A (ja) * 2001-12-20 2005-06-09 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド Ｔｒａｉｌレセプターに免疫特異的に結合する抗体
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE038955T2 (hu) 2003-11-05 2018-12-28 Roche Glycart Ag Antigén-kötõ molekulák fokozott Fc receptor-kötõ affinitással és effektor funkcióval
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
AU2005250408B2 (en) 2004-05-27 2010-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
EP1776383B1 (en) 2004-07-22 2014-08-20 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
TWI404727B (zh) 2006-01-25 2013-08-11 荷蘭鹿特丹Ｅｒａｓｍｕｓ大學醫學中心 對偶基因排除
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20100166734A1 (en) 2006-12-20 2010-07-01 Edward Dolk Oral delivery of polypeptides
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
HRP20150086T1 (xx) * 2007-06-12 2015-02-27 Ac Immune S.A. Humanizirana antitijela za beta amiloid
CA2706425A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CN101550416B (zh) * 2008-03-18 2012-01-25 陈志南 人源化单抗Hu-ScFv18的轻、重链可变区基因和其编码多肽及其应用
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
WO2011072204A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
EP2580243B1 (en) * 2010-06-09 2019-10-16 Genmab A/S Antibodies against human cd38
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
WO2013059343A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Intracellular delivery
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
EP2814846B1 (en) * 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
BR112014020502A2 (pt) 2012-02-22 2019-09-24 Univ Pennsylvania sequência de ácido nucleico isolada, receptor quimérico de antígeno isolado, célula, vetor, e, métodos para estimular uma resposta imune, para fornecer uma imunidade antitumoral, para tratamento de um mamífero, para gerar e para expandir uma população de células - t, e para modular a quantidade de citocina secretada por uma célula -t
AU2013246443B2 (en) 2012-04-11 2017-04-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen
KR20150029714A (ko) * 2012-07-13 2015-03-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 이중특이적 항체의 공-도입에 의한 ｃａｒ 세포의 활성 증강
WO2014055442A2 (en) * 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US9243058B2 (en) * 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
JP6636803B2 (ja) * 2013-02-05 2020-01-29 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａに対する抗体の選択のための方法
CN104045713B (zh) * 2013-03-13 2019-02-12 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物
UY35468A (es) * 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
EP3789487A1 (en) * 2013-04-03 2021-03-10 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
CN103421115B (zh) * 2013-09-02 2015-06-03 东南大学 一种cd38纳米抗体及应用
GB201317929D0 (en) 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US10189908B2 (en) 2014-02-05 2019-01-29 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific TN glycopeptide variants
AU2015230938C1 (en) 2014-03-21 2021-10-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
AU2015292744C1 (en) 2014-07-21 2021-01-21 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
EP3172231B1 (en) 2014-07-24 2021-05-05 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
PL3177643T3 (pl) * 2014-08-04 2019-09-30 F.Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen aktywujące komórki T
US11154615B2 (en) * 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
EP3029067A1 (en) 2014-12-01 2016-06-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Use of blocking-reagents for reducing unspecific T cell-activation
US20180334490A1 (en) * 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
US10383929B2 (en) * 2014-12-12 2019-08-20 Bluebird Bio, Inc. BCMA chimeric antigen receptors
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN105777911B (zh) 2016-04-12 2019-07-02 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
PL3896091T3 (pl) * 2016-08-10 2024-04-29 Legend Biotech Ireland Limited Chimeryczne receptory antygenowe nakierowane na bcma i sposoby ich zastosowania
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
CR20210225A (es) 2021-06-24
CY2024032I1 (el) 2026-02-25
PL3334765T3 (pl) 2026-04-27
WO2017025038A1 (en) 2017-02-16
RS67825B1 (sr) 2026-03-31
MX2018001739A (es) 2018-08-15
CL2021001706A1 (es) 2022-01-28
EP4755460A2 (en) 2026-06-10
KR102970371B1 (ko) 2026-05-29
PL4063397T3 (pl) 2024-11-18
MY199874A (en) 2023-11-27
PH12019500193A1 (en) 2019-07-29
CN122562971A (zh) 2026-08-14
EP3334765A1 (en) 2018-06-20
KR20240173368A (ko) 2024-12-11
SG10201913485QA (en) 2020-02-27
CN113185615A (zh) 2021-07-30
EP4424376B1 (en) 2026-02-18
NL301301I2 (nl) 2025-04-09
AU2025271439A1 (en) 2026-01-08
EP4063397B1 (en) 2024-06-19
SMT202600176T1 (it) 2026-07-16
CN117756941A (zh) 2024-03-26
CN113234173A (zh) 2021-08-10
US20210261675A1 (en) 2021-08-26
CN113234174A (zh) 2021-08-10
EP4755458A2 (en) 2026-06-10
ZA201800703B (en) 2018-12-19
UA125818C2 (uk) 2022-06-15
CN118085090A (zh) 2024-05-28
CN113234173B (zh) 2022-03-11
CY2024032I2 (el) 2026-02-25
US20180230225A1 (en) 2018-08-16
ES2984851T3 (es) 2024-10-31
PL4424376T3 (pl) 2026-07-06
CO2018001405A2 (es) 2018-11-22
FR24C1050I2 (fr) 2025-12-05
CN105384825B (zh) 2018-06-01
EP4755458A3 (en) 2026-08-12
MY188362A (en) 2021-12-03
DK3334765T3 (da) 2026-03-16
HRP20260300T1 (hr) 2026-04-24
LT3334765T (lt) 2026-03-25
JP7168173B2 (ja) 2022-11-09
IL294683A (en) 2022-09-01
CN109311999A (zh) 2019-02-05
MY192392A (en) 2022-08-18
IL257297B (en) 2022-08-01
JP2025159117A (ja) 2025-10-17
JP2024032975A (ja) 2024-03-12
SI4063397T1 (sl) 2024-10-30
EP3334765B1 (en) 2026-02-11
AU2016305075B2 (en) 2019-10-10
LTPA2024535I1 (sr) 2024-12-27
CL2021001686A1 (es) 2022-01-28
NZ750366A (en) 2022-10-28
EP4424376A3 (en) 2024-12-04
AU2020200151A1 (en) 2020-01-30
CN109311999B (zh) 2026-06-09
LTC4063397I2 (sr) 2026-05-25
CL2019000326A1 (es) 2019-10-04
IL264607A (en) 2019-02-28
DK4063397T3 (da) 2024-07-22
NO2024054I1 (no) 2024-12-10
PT4063397T (pt) 2024-07-29
IL257297A (en) 2018-03-29
AU2020200151B2 (en) 2022-03-17
SA518390904B1 (ar) 2023-02-22
UA130798C2 (uk) 2026-05-20
US10934363B2 (en) 2021-03-02
EA201890302A1 (ru) 2018-10-31
FIC20240042I1 (fi) 2024-12-11
SMT202400311T1 (it) 2024-11-15
CN113234174B (zh) 2024-01-09
SG11201900635QA (en) 2019-02-27
EP4424376C0 (en) 2026-02-18
LT4063397T (lt) 2024-09-25
CL2018000378A1 (es) 2018-08-17
JP2021094037A (ja) 2021-06-24
HUE064534T2 (hu) 2024-03-28
PH12018500295B1 (en) 2023-08-11
AU2022204180A1 (en) 2022-07-07
JP2026099826A (ja) 2026-06-18
AU2016305075A1 (en) 2018-03-08
AU2020200151C1 (en) 2022-09-08
FI3334765T3 (fi) 2026-03-26
SMT202600116T1 (it) 2026-05-12
EP4063397A1 (en) 2022-09-28
FR24C1050I1 (fr) 2025-01-17
CN105384825A (zh) 2016-03-09
FI4063397T3 (fi) 2024-08-09
ES3068096T3 (es) 2026-05-27
CA2994579A1 (en) 2017-02-16
LT3896091T (lt) 2023-12-27
PT3334765T (pt) 2026-03-03
KR20180035918A (ko) 2018-04-06
SI3334765T1 (sl) 2026-05-29
EP4424376A2 (en) 2024-09-04
HUE067869T2 (hu) 2024-11-28
JP2022183283A (ja) 2022-12-08
JP6859347B2 (ja) 2021-04-14
JP2018525033A (ja) 2018-09-06
HRP20241057T1 (hr) 2024-11-08
CR20180153A (es) 2018-08-09
CA2994579C (en) 2023-07-11
PH12018500295A1 (en) 2021-05-10
MX2022015823A (es) 2023-01-24
SA519401072B1 (ar) 2024-02-01
ZA201807836B (en) 2019-08-28
NZ778787A (en) 2025-05-02
CO2019000946A2 (es) 2019-02-08
CN113185616A (zh) 2021-07-30
EP3334765A4 (en) 2019-05-08
BR112018002844A2 (pt) 2019-04-30
CN113185616B (zh) 2024-03-01
HUS2400044I1 (hu) 2025-01-28
ES3067089T3 (en) 2026-05-19
RS65866B1 (sr) 2024-09-30
NZ791176A (en) 2025-09-26