ES2615507T3

ES2615507T3 - Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas

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Publication number: ES2615507T3
Application number: ES09004064.3T
Authority: ES
Inventors: Pablo Umana; Peter BRÜNKER; Claudia Ferrara Koller; Tobias Suter; Ursula PÜNTENER; Ekkehard MÖSSNER
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2017-06-07
Anticipated expiration: 2024-11-05
Also published as: NL300801I2; PL1692182T3; SI2348051T1; HK1167682A1; KR20060130579A; NZ588860A; BR122020013239B1; CN104829719A; MX337587B; EP2077282A2; US9296820B2; LTC2380910I2; IL175367A; JP6125770B2; HRP20170398T2; JP2010081940A; NZ547589A; US20160076009A1; ECSP21023271A; DK2348051T3

Abstract

Anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEC ID nº 32 o una región variable de cadena pesqada que comprende la SEC ID nº 32 que comprende la sustitución M34I, y (b) la región variable de cadena ligera que comprende la SEC ID nº 76.

Description

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En otro aspecto, la exposición se refiere a una composición farmacéutica según la reivindicación 18, que comprende la MUA de la invención. Se encuentra contemplado que la composición farmacéutica pueda comprender además un portador farmacéuticamente aceptable, un adyuvante o una combinación del os mismos.

En un aspecto adicional, la exposición se refiere a un método para tratar una enfermedad tratable mediante la reducción marcada de las células B. El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las MUA de la presente invención en un sujeto humano que lo necesita. En una realización preferente, la enfermedad se trata mediante la administración de una MUA que es un anticuerpo quimérico o un fragmento quimérico de un anticuerpo.

En todavía otro aspecto, la exposición se refiere a una célula huésped manipulada para que exprese por lo menos un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fc de los anticuerpos producidos por la célula huésped, en la que las MUAs son capaces de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la unión a CD20 y en la que las MUAs son quiméricas. En una realización, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión. En otra realización, la MUA producida por la célula huésped es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realización adicional, la MUA comprende una región equivalente a la región Fc de una IgG humana.

La exposición se refiere además a un polinucleótido aislado que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, en el que dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Preferentemente dichos polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de unión a antígeno. En una realización el polinucleótido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otra realización, el polinucleótido codifica la región variable entera de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizado). La exposición se refiere además a los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.

En otra realización, la exposición se refiere a una molécula de unión a antígeno que comprende por lo menos una región determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno comprende la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo. En una realización particularmente útil, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo quimérico, por ejemplo humanizado. Dichas moléculas de unión a antígeno pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades, incluyendo los linfomas de células B.

La presente exposición es el primer caso conocido de manipulación de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para que presente funciones efectoras incrementadas, tales como la ADCC, conservando simultáneamente una potente capacidad de apoptosis. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II manipulado que presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha manipulación y sin pérdida de capacidad sustancial de inducir apoptosis. En una realización, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido manipulados para presentar un patrón alterado de glucosilación en la región Fc. En una realización particular, la glucosilación alterada comprende un nivel incrementado de residuos complejos bisectados en la región Fc. En otra realización particular, la glucosilación alterada comprende un número reducido de residuos fucosa en la región Fc. En otra realización, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido sometidos a manipulación del polipéptido. La invención se refiere asimismo a métodos de preparación de dichos anticuerpos de tipo II manipulados y a métodos de utilización de dichos anticuerpos en el tratamiento de diversos trastornos de las células B, incluyendo los linfomas de células B.

La célula huésped de la presente invención puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque sin limitación, una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma. En una realización, la célula huésped de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido codificante de la región VL del anticuerpo B-Ly1 murino o variantes del mismo y una secuencia codificante de una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina humana. En otra realización, la célula huésped de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido codificante de la región VH del anticuerpo B-Ly1 murino o variantes del mismo y una secuencia codificante de una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina humana.

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de entre el grupo que incluyen, aunque sin limitación, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, un nivel incrementado de unión a células NK, un nivel incrementado de unión a macrófagos, un nivel incrementado de unión a células polimorfonucleares, un nivel incrementado de unión a monocitos, la señalización directa inductora de apoptosis incrementada, la maduración incrementada de las células dendríticas y un nivel incrementado de cebado de las células T.

En otro aspecto, la invención se refiere a un fragmento de anticuerpo quimérico recombinante que presenta la especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino y que contiene la región Fc, que ha sido manipulado para presentar una función efectora incrementada producido mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, se da a conocer una proteína de fusión que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 1 y una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y manipulada para presentar una función efectora incrementada producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una proteína de fusión que incluye un polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº 2 y una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina y manipulada para que presenta una función efectora incrementada producida mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria.

En un aspecto, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo quimérico recombinante, producido mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo quimérico recombinante producido mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente exposición se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión producida mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La exposición se refiere además a un método de tratamiento de una enfermedad tratable mediante la reducción marcada de las células B, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo quimérico recombinante o de un fragmento del mismo, producido mediante cualquiera de los métodos de la presente invención, en un sujeto humano que lo necesita.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 2) y de aminoácidos (SEC ID nº 1) de la región VH de B-Ly1 murino. FIG. 2. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 4) y de aminoácidos (SEC ID nº 3) de la región VL de B-Ly1 murino. FIG. 3. Unión de Rituximab® y de ch-B_Ly1 (Δ) a CD20 sobre células B de linfoma de Raji. FIG. 4. Reducción marcada de las células B por Rituximab® (O) y ch-B_Lyl (Δ) en sangre completa de tres clases diferentes de genotipo FcγRIIIa-158V/F: (A) sangre completa de un donante F/F, homocigótico para el receptor de menor afinidad, (B) sangre completa de un donante F/V, heterocigótico para el receptor de afinidad, y

(C) sangre completa de un donante V/V, homocigótico para el receptor de afinidad más alta. FIG. 5. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 11) y de aminoácidos (SEC ID nº 13) de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD20 quimérico. FIG. 6. Secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 12) y de aminoácidos (SEC ID nº 14) de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD20 quimérico. FIG. 7. Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las CDR del anticuerpo B-Ly1 murino. (A) CDR predichas para la región VH. (B) CDR predichas para la región VL. FIG. 8. Perfil de MALDI-TOF de un anticuerpo B-Ly1 quimérico glucomanipulado. (A) Tabla que muestra los porcentajes de picos específicos, (B) espectro de B-Ly1 quimérico glucomanipulado, (C) espectro de B-Ly1 quimérico glucomanipulado tratado con Endo-H. FIG. 9. Unión de diferentes anticuerpos anti-CD20 humanizados a células B Raji. Las diferencias entre el constructo B-HH2 y los constructos B-HL8 y B-HL11 se localizan en las regiones de marco 1 y 2, siendo las tres CDR idénticas. B-HL8 y B-HL11 presentan secuencias FR1 y FR2 que se derivan de la clase VH3 humana, mientras que el marco completo de B-HH2 se deriva de la clase VH1 humana. B-HL11 es un derivado de B-HL8 con la mutación única Glu1Gln, siendo Gln el residuo aminoácido en el constructo B-HH2. Lo anterior significa que el intercambio Glu-Gln no altera la afinidad o la intensidad de la unión. Las otras diferencias entre B-HH2 y B-HL8 son: 14 residuos de FR, de entre los que uno o más influirá sobre el comportamiento de unión a antígeno de este anticuerpo. FIG. 10. Unión del anticuerpo anti-CD20 humanizado BHL4-KV a células diana Raji. El constructo B-HL4 se derivada del anticuerpo B-HH2 mediante la sustitución del FR1 de B-HH2 por el de la secuencia VH1_45 de la línea germinal humana. Este constructo muestra una capacidad de unión a antígeno muy reducida, a pesar de presentar aminoácidos diferentes únicamente en tres posiciones en FR1. Estos residuos se encuentran situados

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en las posiciones 2, 14 y 30 según la numeración de Kabat. De estos, la posición 30 aparentemente es la posición con más influencia, debido a que es parte de la definición de Chothia de la CDR1. FIG. 11. Comparación entre el comportamiento de unión entre B-HH1, B-HH2, B-HH3 y el anticuerpo parental Bly1. Los datos muestran que todos los anticuerpos muestran un valor de EC50 similar, aunque el constructo B-HH1 se une con una intensidad/estequiometría menor que las variantes B-HH2 y B-HH3. B-HH1 puede distinguirse de B-HH2 y de B-HH3 por sus regiones CDR1 y CDR2 parcialmente humanas (definición de Kabat), así como el polimorfismo Ala/Thr en la posición 28 (numeración de Kabat). Esto indica que la posición 28, la CDR1 completa y/o la CDR2 completa resultan importantes para la interacción anticuerpo/antígeno. FIG. 12. Comparación entre B-HL1, B-HH1 y el anticuerpo parental B-ly1. Los datos mostraron la ausencia de cualquier actividad de unión en el constructo B-HL1, y aproximadamente la mitad de la intensidad/estequiometría de unión de B-HH1 que B-ly1. Tanto B-HL1 como B-HH1 han sido diseñados basándose en marcos aceptores derivados de la clase VH-1 humana. Entre otras diferencias, la posición 71 (numeración de Kabat) del constructo B-HL1 es una diferencia notable, que indica su importancia putativa para la unión de antígeno. FIG. 13. Análisis fluorocitométrico de la capacidad del anticuerpo anti-CD20 de unión a su antígeno. Los datos mostraron que los constructos B-HL2 y B-HL3 no presentaban actividad de unión a CD-20. FIG. 14. Apoptosis de los anticuerpos anti-CD20 en células Z-138 MCL. FIG. 15. Apoptosis por los anticuerpos anti-CD20. Datos del ensayo: se sembraron 5x105 células/pocillo en placas de 24 pocillos (5x105 células/ml) en medio de cultivo. Se añadieron a los pocillos 10 mg del anticuerpo respectivo, PBS como control negativo o camptotecina (CPT) 5 mM como control positivo. Las muestras se incubaron durante la noche (16 horas), se tiñeron con AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo se realizó por triplicado. (*): Se ha restado la señal de PBS solo (PBS solo proporcionó una señal de 8% y 2%, AnnV+, para las células PR-1 y Z-138, respectivamente). Los anticuerpos utilizados fueron: C2B8 (quimérico, no glucomanipulado), BHH2-KV1 (humanizado, no glucomanipulado). Nota: este ensayo no implica la adición de células efectoras adicionales, únicamente dianas más anticuerpo o controles. FIG. 16. Eliminación de células diana por parte de anticuerpos anti-CD20 con células inmunológicas efectoras. Datos del ensayo: marcada reducción de las células B en la incubación durante la noche de sangre completa normal, y análisis para CD19+/CD3+ mediante FACS. ADCC utilizando PBMC como efectoras, 4 horas de incubación: proporción de efectora:diana de 25:1, eliminación de la diana medida mediante retención de calceína respecto a la lisis con detergente (100%) y a la lisis sin anticuerpo (0%). Anticuerpos utilizados: C2B8 (quimérico, forma no glucomanipulada), BHH2-KV1-wt (forma humanizada no glucomanipulada de BHH2-KV1), BHH2-KV1-GE (forma humanizada no glucomanipulada de BHH2-KV1). FIG. 17. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasa F de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano no modificado no glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1. FIG. 18. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasaF de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g1. La glucomanipulación se realizó mediante coexpresión en células huésped de genes de anticuerpo y del gen codificante de enzima con actividad catalítica de β-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (Gnt-III). FIG. 19. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacáridos liberados con PNGasaF de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g2. La glucomanipulación se realizó mediante coexpresión en células huésped de genes de anticuerpo y genes codificantes de enzima con actividad catalítica de β-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III) y codificante de enzima con actividad catalítica de αmanosidasa II del Golgi. FIG. 20. Unión de anticuerpos no glucomanipulados y glucomanipulados a receptor FcγRIIIa expresado sobre la superficie de células CHO-CD16 recombinantes. FIG. 21. Apoptosis de anticuerpos anti-CD20 no manipulados con Fc y manipulados con Fc sobre células Z-138 MCL. Datos del ensayo: se sembraron 5x105 células/pocillo en placas de 24 pocillos (5x105 células/ml) en medio de cultivo. Se añadieron a los pocillos 10 mg del Ab respectivo, PBS para el control negativo. Las muestras se incubaron durante la noche (16 horas), se tiñeron con AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo se realizó por triplicado. Anticuerpos utilizados: C2B8=rituximab (forma no glucomanipulada quimérica, igual a la forma comercial), BHH2-KV1 (forma no glucomanipulada humanizada, ver la fig. 6 para el perfil de glucosilación), BHH2-KV1g1 (forma glucomanipulada humanizada, ver la figura 7 para el perfil de glucosilación), BHH2-KV1g2 (forma glucomanipulada humanizada, ver la fig. 8 para el perfil de glucosilación). Nota: este ensayo no implica ninguna célula efectora adicional, únicamente dianas más anticuerpo o controles. (*): se ha restado la señal de PBS solo.

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sujeto, según muestra la alineación de FASTDB, que no se encuentran apareadas/alineadas con la secuencia pregunta, son calculadas para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad.

Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se alinea con una secuencia pregunta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se producen en el extremo 5' de la secuencia sujeto y, por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases desapareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no apareadas/número total de bases en la secuencia pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. En el caso de que las 90 bases restantes se encontrasen perfectamente apareadas, el porcentaje de identidad final sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 bases con una secuencia pregunta de 100 bases. En esta ocasión las deleciones son deleciones internas, de manera que no se encuentran bases en el lado 5' o 3' de la secuencia sujeto que no estén apareadas/alineadas con la secuencia pregunta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Nuevamente, únicamente las bases situadas en el lado 5' y 3' de la secuencia sujeto que no están apareadas/alineadas con la secuencia pregunta son corregidas manualmente. No se realizan otras correcciones manuales para los fines de la presente invención.

La mención de un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia pregunta de aminoácidos de la presente invención se refiere a que dicha secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia pregunta excepto en que la secuencia polipeptídica sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia pregunta de aminoácidos. En otras palabras, para obtener un polipéptido que presente una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia pregunta de aminoácidos, deben insertarse, delecionarse o sustituirse por otro aminoácido hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia sujeto. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones aminoterminales o carboxiterminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier posición entre aquellas posiciones terminales, intercalados individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

En la práctica, si cualquier polipéptido particular es idéntico al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a un polipéptido de referencia puede determinarse convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos. Un método preferente para determinar la correspondencia global óptima entre una secuencia pregunta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominado alineación global de secuencias, puede determinarse utilizando el programa informático FASTDB, basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990. En una alineación de secuencias, las secuencias pregunta y sujeto son ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación global de secuencias se proporciona en forma de porcentaje de identidad. Los parámetros preferentes utilizados en una alineación FASTDB de aminoácidos son: Matrix=PAM 0, k-tuplo=2, Penalización por desapareamiento=1, Penalización por unión=20, Longitud de grupo de aleatorización=0, Puntuación de corte=1, Tamaño de ventana=longitud de secuencia, Penalización por hueco=5, Penalización según tamaño de hueco=0,05, Tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia sujeto de aminoácidos, la que sea más corta.

En el caso de que la secuencia sujeto sea más corta que la secuencia pregunta debido a deleciones N-terminales o C-terminales, no debido a deleciones internas, debe realizarse una corrección manual de los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no considera los truncados N-terminales y C-terminales de la secuencia sujeto al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos N-terminal y Cterminal, respecto a la secuencia pregunta, se corrige el porcentaje de identidad calculando el número de residuos de la secuencia pregunta que son N-terminales y C-terminales respecto a la secuencia sujeto, que no se encuentren apareadas/alineadas con un residuo correspondiente de la secuencia sujeto, en forma de porcentaje del número total de bases de la secuencia pregunta. Los resultados de alineación de secuencias de FASTDB permiten determinar si un residuo se encuentra apareado/alineado. A continuación, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado con el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parámetros especificados, alcanzando una puntuación final de porcentaje de identidad. Esta puntuación final de porcentaje de identidad es la que se utiliza para los fines de la presente invención. Únicamente los residuos N-terminales y C-terminales respecto de la secuencia sujeto que no se encuentren apareados/alineados con la secuencia pregunta se consideran para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Es decir, únicamente las posiciones de residuos en la secuencia pregunta en el exterior de los residuos N-terminales y C-terminales más alejados de la secuencia sujeto.

Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 residuos aminoácidos se alinea con una secuencia pregunta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se ha producido en el extremo N-terminal de la secuencia sujeto y, por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N-terminal. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos N-terminales y C-terminales no apareados/número total de residuos en la secuencia

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Las "células reconocidas por anticuerpos" son células a las que se unen anticuerpos o proteínas de fusión con Fc. Los anticuerpos o proteínas de fusión con Fc se unen a las células diana mediante la parte de la proteína N-terminal respecto a la región Fc.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada" se define como un incremento del número de "células reconocidas por anticuerpos" que resultan lisadas en un tiempo dado, a una concentración dada de anticuerpo, o de proteínas de fusión con Fc, en el medio circundante a las células diana, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc definido anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpo o de proteína de fusión con Fc, en el medio circundante a las células diana, necesario para conseguir la lisis de un número dado de "células reconocidas por anticuerpos", en un tiempo dado, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc. El incremento de la citotoxicidad celular mediada por Fc es respecto a la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo, o proteína de fusión con Fc, producido por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido producido por células huésped manipuladas para expresar la glucosiltransferasa GnTIII mediante los métodos descritos en la presente memoria.

La expresión "anticuerpo que presentan citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" se refiere a un anticuerpo, tal como se define dicha expresión en la presente memoria, que presenta una ADCC incrementada según se determina mediante cualquier método adecuado conocido por el experto ordinario en la materia. Un ensayo ADCC in vitro aceptado es el siguiente:

1) el ensayo utiliza células diana que es conocido que expresan el antígeno diana reconocido por la región ligante de antígeno del anticuerpo, 2) el ensayo utiliza células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) aisladas de sangre de un donante sano seleccionado aleatoriamente, como células efectoras, 3) el ensayo se lleva a cabo siguiendo el protocolo siguiente:

i) las PBMCs se aíslan utilizando procedimientos estándares de centrifugación en gradiente de densidades y se suspenden a una densidad de 5 x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI, ii) las células diana se cultivan mediante métodos de cultivo de tejido estándares, se recolectan de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior a 90%, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microCuries de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml, iii) se transfieren 100 microlitros de la suspensión de células diana final a cada pocillo de una placa de microtitulación de 46 pocillos, iv) el anticuerpo se diluye en serie de 4.000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microtitulación de 96 pocillos, llevando a cabo ensayos por triplicado de concentraciones del anticuerpo que cubren el intervalo completo de concentraciones anteriormente indicado, v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (v/v) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv), anteriormente), vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv), anteriormente), vii) a continuación, la placa de microtitulación de 96 pocillos se centrifuga a 50 x g durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4ºC, viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMCs (punto i), anteriormente) a cada pocillo, dando lugar a una proporción de efector:célula diana de 25:1 y las placas se introducen en un incubador bajo una atmósfera con 5% de CO2 a 37ºC durante 4 horas, ix) el sobrenadante libre de células de cada pocillo se recolecta y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifica utilizando un contador gamma, x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo según la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para dicha concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles MR (ver el punto v), anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi), anteriormente).

4) la expresión "ADCC incrementada" se define como un incremento del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente, y/o una reducción de la concentración de anticuerpo necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometidas a ensayo anteriormente. El incremento de la ADCC es relativo a la ADCC, que se ha medido utilizando el ensayo anteriormente indicado, mediada por el mismo anticuerpo, producido por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos

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entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, más preferentemente entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi. Conjuntamente con un anticuerpo anti-CD20 quimérico, debido a la vida media circulante más prolongada en comparación con los anticuerpos murinos, las dosis eficaces no ablativas de médula de un tratamiento único de anticuerpos anti-CD20 quimérico marcado con yodo-131 se encuentran comprendidas

5 entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, más preferentemente son inferiores a aproximadamente 30 mCi. Los criterios de obtención de imágenes para, por ejemplo, el marcaje de indio-111, típicamente son valores inferiores a aproximadamente 5 mCi.

Con respecto a los anticuerpos anti-CD20 marcados radioactivamente, la terapia con los mismos también puede

10 realizarse en un tratamiento terapéutico único o en tratamientos múltiples. Debido al componente radionucleido, resulta preferente que, antes del tratamiento, se "recolecten" células madre periféricas ("CMP") o de médula ósea ("MO") para los pacientes que experimenten toxicidad potencialmente letal de la médula ósea debida a la radiación. La MO y/o las CMP se recolectan utilizando técnicas estándares, y después se purgan y se congelan para la posible reinfusión. Además, resulta más preferente que antes del tratamiento se realice un estudio de dosimetría diagnóstica

15 utilizando un anticuerpo marcado diagnóstico (por ejemplo utilizando indio-111), un propósito del cual es garantizar que el anticuerpo terapéuticamente marcado (por ejemplo utilizando itrio-90) no resulte innecesariamente "concentrado" en cualquier órgano o tejido normal.

En una realización preferente, la presente exposición se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una

20 secuencia que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 3, posteriormente. La exposición se refiere además a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 2, posteriormente. En otra realización, la exposición se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%,

25 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos en la Tabla 3. La exposición comprende además un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presental a secuencia de aminoácidos de cualquiera de los constructos en la Tabla 3 con sustituciones de aminoácidos conservadoras.

30 TABLA 2

CONSTRUCTO: SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS SEC ID nº

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Secuencia de señal de VH: imagen37 73

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Secuencia de señal de VL: imagen39 77

TABLA 3

CONSTRUCTO: SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS SEC ID nº

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Secuencia de señal de VH: MDWTWRILFLVAAATGAHS 74

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Secuencia de señal de VL: MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC 78

En otra realización preferente, la presente exposición se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la fig. 1 ó en la fig. 2. La exposición se refiere además a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que es por lo menos

5 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la fig. 5 o en la fig.

6. En otra realización, la exposición se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuenica que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la fig. 5 o fig. 6. La exposición comprende además un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que presenta cualquiera de las

10 secuencias de aminoácidos fig. 1, fig. 2, fig. 5 o fig. 6 con sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En otra realización, la presente exposición se refiere a un vector de expresión y/o a una célula huésped, que comprende uno o más polinucleótidos aislados indicados en la presente memoria.

15 Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de línea celular en cultivo para expresar la MUA de la presente invención. En una realización preferente, se utilizan células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto o células vegetales como la línea celular de fondo para generar las células huésped manipuladas indicadas en la presente memoria.

20 La eficacia terapéutica de las MUA indicadas en la presente memoria puede potenciarse mediante la producción de las mismas en una célula huésped que expresa adicionalmente un polinucleótido codificante de un polipéptido que presenta actividad de GnTIII. En una realización preferente, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en Golgi de un polipéptido residente en el Golgi. En

25 otra realización preferente, las expresión de las MUA de la presente invención en una célula huésped que expresa

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utilizarse un ensayo funcional que mide la unión incrementada del receptor Fc o la función efectora incrementada mediada por anticuerpos producidos por las células manipuladas con el ácido nucleico codificante de un polipéptido con actividad de GnTIII.

Identificación de transfectantes o transformantes que expresan la proteína que presenta un patrón de glucosilación modificado

Las células huésped que contienen la secuencia codificante de una MUA quimérica que presenta sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo B-Ly1 murino y que expresan los producto génicos biológicamente activos pueden identificarse mediante por lo menos cuatro enfoques generales: (a) hibridación ADN-ADN o ADN-ARN, (b) presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras", (c) evaluación del nivel de transcripción según se mide a partir de la expresión de los transcritos de ARNm respectivos en la célula huésped, (d) detección del producto génico según medición mediante inmunoensayo o a partir de su actividad biológica.

En el primer enfoque, la presente de la secuencia codificante de una MUA quimérica que presenta sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo Bly-1 murino y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII pueden detectarse mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN utilizando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que son homólogas a las secuencias codificantes respectivas, respectivamente, o partes o derivados de las mismas.

En el segundo enfoque, el vector de expresión recombinante/célula huésped puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas "marcadoras" por ejemplo actividad de timidina-quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia al metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, en el caso de que la secuencia codificante de la MUA de la invención, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII dentro de una secuencia de gen marcador del vector, puedan identificarse los recombinantes que contienen las secuencias codificantes respectivas a partir de la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, puede introducirse un gen marcador en tándem con las secuencias codificantes bajo el control del mismo promotor o de uno diferente utilizado para controlar la expresión de las secuencias codificantes. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o la selección indica la expresión de la secuencia codificante de la MUA de la invención y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII.

En el tercer enfoque, puede evaluarse mediante ensayos de hibridación la actividad transcripcional de la región codificante de la MUA de la invención, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII. Por ejemplo, puede aislarse ARN y analizarse mediante transferencia northern utilizando una sonda homóloga a las secuencias codificantes de la MUA de la invención, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipéptido que presenta actividad de GnTIII o partes particulares de la misma. Alternativamente, pueden extraerse los ácidos nucleicos totales de la célula huésped y someterse a ensayo para la hibridación a dichas sondas.

En el cuarto enfoque, la expresión de los productos proteicos puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo mediante transferencias western, inmunoensayos tales como la radioinmunoprecipitación o inmunoensayos ligados a enzima. El ensayo definitivo del éxito del sistema de expresión, sin embargo, implica la detección de los productos génicos biológicamente activos.

Generación y utilización de MUA que presentan una función efectora incrementada, incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

En realizaciones preferentes, la presente invención proporciona glucoformas de MUA quiméricas que presentan sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino y que presentan una función efectora incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La manipulación mediante glucosilación de anticuerpos ha sido descrita anteriormente (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.602.684).

Algunos ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales no conjugados (mAb) destinados al tratamiento de algunos tipos de cáncer recientemente han proporcionado resultados esperanzadores (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25, 1997; Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997). Se ha autorizado una IgG1 no conjugada quimérica para el linfoma no de Hodking de células B foliculares o de grado bajo (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25, 1997), mientras que otro mAb no conjugado, una IgG1 humanizada que reconoce tumores de mama sólidos, también ha mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de fase III (Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997). Los antígenos de estos dos mAbs se expresan a nivel elevado en sus células tumorales respectivas y los anticuerpos median en la potente destrucción tumoral por parte de células efectoras in vitro e in vivo. Por el contrario, muchos otros mAbs no conjugados con finas especificidades tumorales no pueden desencadenar funciones efectoras de suficiente potencia para resultar clínicamente útiles (Frost et al.,

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Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, las cuales se encuentran en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patente US nº 3.773.919), copolímeros de ácido Lglutámico y γ-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones que deben utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto puede conseguirse mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.

Las composiciones de la invención pueden encontrarse en una diversidad de formas de dosificación, incluyendo, aunque sin limitación, soluciones líquidas o suspensiones, tabletas, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas o microvesículas, lisosomas y soluciones inyectables o infusionables. La forma preferente depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.

Las composiciones indicadas en la presente memoria también incluyen preferentemente portadores farmacéuticamente aceptables convencionales y adyuvantes conocidos de la técnica, tales como la albúmina sérica humana, intercambiadores iónicos, alúmina, lecitina, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido ascórbico, sorbato de potasio y sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina.

El modo de administración y el régimen de dosificación más eficaces para las composiciones farmacéuticas de la presente invención dependen de la severidad y curso de la enfermedad, de la salud y respuesta al tratamiento del paciente y del criterio del médico responsable. Por consiguiente, las dosis de las composiciones deben titularse para el paciente individual. Sin embargo, una dosis eficaz de las composiciones de la presente invención generalmente se encontrará comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 2.000 mg/kg.

Las moléculas indicadas en la presente memoria pueden encontrarse en una diversidad de formas de dosificación, incluyendo, aunque sin limitación, soluciones líquidas o suspensiones, tabletas, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas o microvesículas, liposomas y soluciones inyectables o infusionables. La forma preferente depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.

La composición que comprende una MUA de la presente invención se formula, se dosifica y se administra de un modo consistente con la buena praxis médica. Entre los factores a considerar en el presente contexto se incluyen la enfermedad o trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por el médico clínico. La cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista que debe administrarse se encontrará regulada por dichas consideraciones.

A modo general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo administrado parenteralmente por dosis se encontrar comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal del paciente al día, encontrándose comprendido el intervalo típico inicial de antagonista utilizado en el intervalo de entre aproximadamente 2 y 10 mg/kg.

En una realización preferente, la MUA es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo humanizado. Las dosis adecuadas para dicho anticuerpo no conjugado son, por ejemplo, de entre aproximadamente 20 mg/m2 y aproximadamente 1.000 mg/m2. En una realización, la dosis del anticuerpo difiere de la recomendada actualmente para el RITUXAN®. Por ejemplo, puede administrarse en el paciente una o más dosis de sustancialmente menos de 375 mg/m2 del anticuerpo, por ejemplo en el caso de que la dosis se encuentre comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 20 mg/m2 y aproximadamente 250 mg/m2, por ejemplo entre aproximadamente 50 mg/m2 y aproximadamente 200 mg/m2.

Además, puede administrarse una o más dosis iniciales del anticuerpo, seguido de una o más dosis posteriores, en donde la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la dosis o dosis posteriores excede la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la dosis inicial o dosis iniciales del anticuerpo. Por ejemplo, la dosis inicial puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 20 mg/m2 y aproximadamente 250 mg/m2 (por ejemplo entre aproximadamente 50 mg/m2 y aproximadamente 200 mg/m2) y la dosis posterior puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 250 mg/m2 y aproximadamente 1.000 mg/m2.

Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, estas cantidades sugeridas de las MUA se encuentran muy supeditadas al criterio terapéutico. El factor clave en la selección de una dosis y programación apropiadas es el resultado obtenido, tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, pueden resultar necesarias dosis

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Claims

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