RS67825B1 - Himerni antigenski receptori zasnovani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Himerni antigenski receptori zasnovani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe

Info

Publication number
RS67825B1
RS67825B1 RS20260267A RSP20260267A RS67825B1 RS 67825 B1 RS67825 B1 RS 67825B1 RS 20260267 A RS20260267 A RS 20260267A RS P20260267 A RSP20260267 A RS P20260267A RS 67825 B1 RS67825 B1 RS 67825B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
antibody
sdab
Prior art date
Application number
RS20260267A
Other languages
English (en)
Inventor
Xiaohu Fan
Chuan-Chu Chou
Qiuchuan Zhuang
Pingyan Wang
Lin Wang
Lei Yang
Jiaying Hao
Original Assignee
Legend Biotech Ireland Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Legend Biotech Ireland Ltd filed Critical Legend Biotech Ireland Ltd
Publication of RS67825B1 publication Critical patent/RS67825B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001117—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR] or CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4221—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4222—CD38 not IgG
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/29—Multispecific CARs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] OBLAST PREDMETNOG PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na himerni antigenski receptor koji sadrži jednodomenska antitela, imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom i njihovu upotrebu. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivaciju i ekspanziju ćelija za terapeutsku upotrebu, posebno za imunoterapiju T ćelija zasnovanu na himernom antigenskom receptoru.
[0007] OSNOVA PREDMETNOG PRONALASKA
[0009] Sa razvojem imunoterapije tumora i kliničke tehnologije, imunoterapija himernim antigenskim receptorom T ćelija (CAR-T) sada je jedan od najperspektivnijih pristupa imunoterapiji tumora. Generalno, himerni antigenski receptor (CAR) sadrži ekstracelularni domen koji vezuje antigen, transmembranski domen i intracelularni signalni domen. Ekstracelularni domen koji vezuje antigen može da sadrži jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji cilja identifikovani tumorski antigen. CAR se mogu eksprimirati na površini T ćelija korišćenjem tehnika transfekcije gena. Nakon vezivanja za ciljni tumorski antigen, CAR mogu aktivirati T ćelije da pokrenu specifičan antitumorski odgovor na antigen-zavisan način, bez ograničenja dostupnosti glavnih kompleksa histokompatibilnosti (MHC) specifičnih za ciljni tumorski antigen.
[0010] Jednodomenska antitela (sdAb) razlikuju se od konvencionalnih četvorolančanih antitela po tome što imaju jedan monomerni varijabilni domen antitela. Na primer, kamelide i ajkule proizvode jednodomenska antitela nazvana antitela samo sa teškim lancima (HcAb), kojima prirodno nedostaju laki lanci. Fragment koji vezuje antigen u svakom kraku antitela samo sa teškim lancima kamelida ima jedan varijabilni domen teškog lanca (V<H>H), koji može imati visok afinitet prema antigenu bez pomoći lakog lanca. Kamelidni V<H>H je poznat kao najmanji funkcionalni fragment koji vezuje antigen sa molekulskom težinom od približno 15 kD. [Ubaciti ovde sa stranice 2a]
[0011] KRATAK REZIME PREDMETNOG PRONALASKA
[0013] Predmetni pronalazak obezbeđuje himerne antigenske receptore (CAR) zasnovane na jednodomenskim antitelima (V<H>H), imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom i njihove upotrebe u imunoterapiji kancera kako su definisani u patentnim zahtevima.
[0014] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD19 sdAb koje sadrži CDR regione SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.
[0015] Kao referenca, opisano je antitelo samo sa teškim lancem anti-CD19 (HcAb) ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koje od gore opisanih anti-CD19 sdAb.
[0016] Jedan primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje CD19 himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 sdAb (kao što je bilo koje od anti-CD19 sdAb opisanih gore); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, CAR je monospecifičan. CAR se može opisati kao multivalentni (kao što je bivalentan ili trovalentan). U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan (kao što je bispecifičan).
[0017] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD20 sdAb koje sadrži CDR regione SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži aminokiselinu
[0018] WO 2013/123061 odnosi se na bispecifične CAR zasnovane na scFv.
[0019] Grada et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2013, Vol.2, e105, proučavali su TanCAR koji je posredovao u bispecifičnoj aktivaciji i ciljanju T ćelija.
[0020] Jamnani et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 2014, Vol. 1840, No. 1, pp. 378‑386, prijavili su oligoklonalne anti-HER2 CAR koji sadrže jedan V<H>H domen.
[0021] Predmetni pronalazak obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži polipeptid koji sadrži ekstracelularni domen za vezivanje antigena, a koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo sdAb koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu, svaki od prvog i drugog sdAb je V<H>H; transmembranski domen; i intracelularni signalni domen.
[0022] U jednom primeru izvođenja, prvi antigen i drugi antigen su izabrani iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77.
[0023] U jednom primeru izvođenja, prvi antigen se razlikuje od drugog antigena. U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb je anti-BCMA sdAb i drugo sdAb je anti-CD38 sdAb. U drugom primeru izvođenja, prvo sdAb je anti-BCMA sdAb i drugo sdAb je anti-CD19 sdAb. U sledećem primeru izvođenja, prvo sdAb je anti-CD 19 sdAb i drugo sdAb je anti-CD20 sdAb. U sledećem primeru izvođenja, prvo sdAb je anti-CD 19 sdAb i drugo sdAb je anti-CD22 sdAb.
[0024] U jednom primeru izvođenja, prvi antigen je isti kao i drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i drugo sdAb se specifično vezuju za isti epitop. U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i drugo sdAb se specifično vezuju za različite epitope.
[0025] U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-CD19 sdAb koje sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-CD20 sdAb koje sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
[0026] U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-BCMA sdAb koje sadrži bilo šta od sledećeg:
[0028] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0029] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0030] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0031] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0032] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0033] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0034] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
[0035] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37; ili
[0036] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39.
[0038] U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-CD38 sdAb koje sadrži bilo šta od sledećeg:
[0040] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
[0041] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
[0042] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
[0043] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
[0044] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
[0045] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
[0046] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
[0047] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
[0048] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
[0049] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
[0050] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
[0051] (12) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
[0053] U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb se nalazi na N-terminusu drugog sdAb. U drugom primeru izvođenja, prvo sdAb se nalazi na C-terminusu drugog sdAb.
[0054] U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb su kamelidni, himerni ili humanizovani.
[0055] U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i drugo sdAb su direktno fuzionisani jedan sa drugim putem peptidne veze. U jednom primeru izvođenja, prvo sdAb i drugo sdAb su fuzionisani jedan sa drugim putem peptidnog linkera. Peptidni linker je poželjno dugačak najviše 50 aminokiselina.
[0056] U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izveden iz molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1.
[0057] U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije. Primarni intracelularni signalni domen može biti izveden iz CD3ζ.
[0058] U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. Kostimulatorni signalni domen može biti izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija.
[0059] U jednom primeru izvođenja, CAR dalje sadrži zglobni domen koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U jednom primeru izvođenja, CAR dalje sadrži signalni peptid koji se nalazi na N-terminusu polipeptida.
[0060] U jednom primeru izvođenja, CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:200, 201 i 206-216.
[0061] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR ovog pronalaska.
[0062] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ovog pronalaska.
[0063] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom koja sadrži CAR, izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor ovog pronalaska. U jednom primeru izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je T ćelija.
[0064] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koji sadrži inženjerski konstruisanu imunu efektorsku ćeliju ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0065] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja kancera kod individue, gde su prvi antigen i drugi antigen tumorski antigeni. U jednom primeru izvođenja, kancer je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. sekvenca SEQ ID NO:5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0066] Kao referenca, opisano je antitelo samo za teški lanac anti-CD20 (HCAB) ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koji od gore opisanih anti-CD20 sdAb.
[0067] [0030] Jedan primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje CD20 himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD20 sdAb (kao što je bilo koje od anti-CD20 sdAb opisanih gore); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, CAR je monospecifičan. CAR se može opisati kao multivalentni (kao što je bivalentan ili trovalentan). U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan (kao što je bispecifičan).
[0068] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA sdAb koje sadrži CDR regione bilo kog od SEQ ID NO: 78-88. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb sadrži bilo koji od sledećih:
[0070] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0071] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0072] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0073] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0074] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0075] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0076] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0077] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
[0078] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37;
[0079] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; ili
[0080] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39.
[0082] U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:78-88.
[0083] Kao referenca, opisano je antitelo samo sa teškim lancem anti-BCMA (HCAB) ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koji od gore opisanih anti-BCMA sdAb.
[0084] Jedan primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje BCMA himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA sdAb (kao što je bilo koje od anti-BCMA sdAb opisanih gore); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, CAR je monospecifičan. CAR se može opisati kao multivalentni (kao što je bivalentan ili trovalentan). U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan (kao što je bispecifičan).
[0085] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 sdAb koje sadrži CDR regione bilo kog od SEQ ID NO: 89-100. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb sadrži bilo koji od sledećih:
[0087] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
[0088] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
[0089] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
[0090] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
[0091] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
[0092] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
[0093] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
[0094] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
[0095] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
[0096] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
[0097] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
[0098] (12) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
[0100] U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:89-100.
[0101] Kao referenca, opisano je antitelo samo teškog lanca anti-BCMA (HCAB) ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koji od gore opisanih anti-BCMA sdAb.
[0102] [0038] Jedan primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje CD38 himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD38 sdAb (kao što je bilo koji od anti-CD38 sdAb opisanih gore); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, CAR je monospecifičan. CAR se može opisati kao multivalentni (kao što je bivalentan ili trovalentan). U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan (kao što je bispecifičan).
[0103] Jedan primer izvođenja ovog pronalaska obezbeđuje CD22 himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD22 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, CAR je monospecifičan. CAR se može opisati kao multivalentni (kao što je bivalentan ili trovalentan). U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan (kao što je bispecifičan).
[0104] Predmetni pronalazak obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu svaki od prvog i drugog sdAb je VHH; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb se nalazi na N-terminusu drugog sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb se nalazi na C-terminusu drugog sdAb.
[0105] U nekim primerima izvođenja prema bilo kom od gore navedenih CAR, prvi antigen i drugi antigen su izabrani iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-BCMA sdAb, kao što je bilo koji od gore opisanih BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, CAR sadrži ekstracelularni domen vezivanja antigena koji sadrži najmanje dve kopije (kao što su 2, 3 ili više kopija) anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-CD19 sdAb, kao što je bilo koji od gore opisanih anti-CD19 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-CD20 sdAb, kao što je bilo koje od anti-CD20 sdAb opisanih gore. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-CD38 sdAb, kao što je bilo koje od anti-CD38 sdAb opisanih gore. U nekim primerima izvođenja, CAR sadrži ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži najmanje dve kopije (kao što su 2, 3 ili više kopija) anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-CD22 sdAb.
[0106] [0042] U nekim primerima izvođenja, prema bilo kom od gore navedenih CAR, prvi antigen se razlikuje od drugog antigena. U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-BCMA sdAb i drugo sdAb je anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-BCMA sdAb i drugo sdAb je anti-CD19 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-CD19 sdAb i drugo sdAb je anti-CD20 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je anti-CD19 sdAb i drugo sdAb je anti-CD22 sdAb.
[0107] U nekim primerima izvođenja prema bilo kom od monospecifičnih CAR navedenih gore, prvi antigen je isti kao i drugi antigen. U nekim primerima izvođenja, CAR je dvovalentan ili trovalentan. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i drugo sdAb se specifično vezuju za isti epitop. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je isto kao i drugo sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i drugo sdAb se specifično vezuju za različite epitope.
[0108] U nekim primerima izvođenja prema bilo kom od gore navedenih CAR, prvo sdAb i/ili drugo sdAb su kamelidni, himerni ili humanizovani.
[0109] U nekim primerima izvođenja prema bilo kom od gore navedenih CAR, prvo sdAb i drugo sdAb su direktno fuzionisani jedan sa drugim putem peptidne veze. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i drugo sdAb su fuzionisani jedan sa drugim putem peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojih 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 144-151.
[0110] U nekim primerima izvođenja prema bilo kom od gore navedenih CAR (uključujući CD19 CAR, CD20 CAR, BCMA CAR, CD38 CAR i CD22 CAR), transmembranski domen je izveden iz molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izveden iz CD8 ili CD28. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132 ili SEQ ID NO: 133.
[0111] U nekim primerima izvođenja, prema bilo kom od gore navedenih CAR (uključujući CD19 CAR, CD20 CAR, BCMA CAR, CD38 CAR i CD22 CAR), intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140 ili SEQ ID NO: 141.
[0112] [0048] U nekim primerima izvođenja prema bilo kom od gore navedenih CAR (uključujući CD19 CAR, CD20 CAR, BCMA CAR, CD38 CAR i CD22 CAR), intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen sadrži citoplazmatski domen CD28 i/ili citoplazmatski domen CD137. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136 i/ili SEQ ID NO: 137.
[0113] U nekim primerima izvođenja prema bilo kom od CAR (uključujući CD19 CAR, CD20 CAR, BCMA CAR, CD38 CAR i CD22 CAR) navedenih gore, CAR dalje sadrži zglobni domen koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen je izveden iz CD8α. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130.
[0114] U nekim primerima izvođenja, CAR dalje sadrži signalni peptid koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je izveden iz molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD8α, GM-CSF receptora α i teškog lanca IgG1. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je izveden iz CD8α. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127.
[0115] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje himerni antigenski receptor bilo kog od navedenih u Tabelama 5 i 6. CAR kao što su navedeni u Tabeli 4 su ovde opisani kao referenca.
[0116] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje CAR koji sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 76-100, 198-201, 206-216 i 265-270.
[0117] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bilo koji od CAR (uključujući CD19 CAR, CD20 CAR, BCMA CAR, CD38 CAR i CD22 CAR) navedenih gore. U nekim primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202-205, 217-227 i 271-276. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina dalje sadrži drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi CAR, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CAR operativno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline preko treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira samocepajući peptid, kao što je T2A, P2A ili F2A peptid. U nekim primerima izvođenja, treća sekvenca nukleinske kiseline je SEQ ID NO: 256. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je molekul DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je molekul RNK.
[0118] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje vektor koji sadrži izolovane nukleinske kiseline pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je lentivirusni vektor.
[0119] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje imunu efektorsku ćeliju, koja sadrži bilo koji od CAR (uključujući CD19 CAR, CD20 CAR, BCMA CAR, CD38 CAR i CD22 CAR) navedenih gore, ili bilo koju od izolovanih nukleinskih kiselina pronalaska, ili bilo koji od vektora pronalaska. U nekim primerima izvođenja, imuni BCMA CAR, CD38 CAR i CD22 CAR) dobijeni genetskim inženjeringom navedeni gore, gde se dva ili više CAR specifično vezuju za različite antigene. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija je T ćelija.
[0120] Jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koji sadrži bilo koju od imunih efektorskih ćelija dobijenu genetskim inženjeringom pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Dalje je obezbeđena farmaceutska kompozicija pronalaska za upotrebu u postupku lečenja kancera kod individue. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je kancer u tečnom stanju. U nekim primerima izvođenja, kancer je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer, kao što je glioblastom.
[0121] Kao referenca, otkrivena je farmaceutska kompozicija koja sadrži bilo koji od gore opisanih anti-CD19 sdAb, anti-CD20 sdAb, anti-CD38 sdAb ili anti-BCMA sdAb i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima, postoji postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod individue, koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije.
[0122] Takođe su obezbeđeni kompleti za upotrebu i proizvodi koji sadrže bilo koji od CAR, imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom, izolovane nukleinske kiseline ili vektora ovog pronalaska. Pronalazak je naveden u priloženom skupu patentnih zahteva. Primeri izvođenja i/ili primeri sledećeg opisa koji nisu obuhvaćeni priloženim patentnim zahtevima ne smatraju se delom ovog pronalaska. Bilo kakve reference u opisu na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).
[0124] KRATAK OPIS CRTEŽA
[0126]
[0127] Slika 1A upoređuje strukture V<H>H-baziranih CAR i konvencionalnih scFv-baziranih CAR. Šematska struktura sa leve strane prikazuje primer monospecifičnog monovalentnog CAR koji ima ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži V<H>H domen. Šematska struktura sa desne strane prikazuje primer monospecifičnog monovalentnog CAR koji ima ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži scFv domen.
[0128] Slika 1B upoređuje strukture V<H>H-baziranih CAR sa dva mesta za vezivanje antigena i konvencionalnih scFv-baziranih CAR sa dva mesta za vezivanje antigena. Šematska struktura sa leve strane je primer CAR sa ekstracelularnim domenom za vezivanje antigena koji se sastoji od dva V<H>H domena. Dva V<H>H domena mogu biti isti ili različiti. Šematska struktura sa desne strane prikazuje primer CAR koji ima ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži dva scFv domena. Dva scFv domena mogu biti ista ili različita.
[0129] Slika 1C prikazuje šematske strukture primera dvovalentnih i bispecifičnih V<H>H-baziranih CAR. Šematska struktura u gornjem levom panelu prikazuje primera monospecifičnog, bivalentnog CAR koji ima ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji se sastoji od dva identična V<H>H domena, od kojih se svaki specifično vezuje za epitop 1 antigena A. Šematska struktura u gornjem desnom panelu prikazuje primer monospecifičnog, bivalentnog CAR koji ima ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvi V<H>H domen koji se specifično vezuje za epitop 1 antigena A i drugi V<H>H domen koji se specifično vezuje za epitop 2 antigena A. Epitop 1 i epitop 2 antigena A mogu se razlikovati po svojim strukturama i/ili sekvencama. Šematska struktura u donjem levom panelu prikazuje primer bispecifičnog CAR koji ima ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvi V<H>H domen koji se specifično vezuje za antigen A, i drugi V<H>H domen se specifično vezuje za antigen B. Antigen A i antigen B su različiti antigeni.
[0130] Slika 1D prikazuje šematske strukture primera V<H>H-baziranih CAR sa tri ili više V<H>H domena. CAR mogu imati više V<H>H domena fuzionisane jedan sa drugim direktno ili preko peptidnih linkera. V<H>H domeni mogu biti isti ili različiti. Različiti V<H>H domeni se mogu specifično vezati za različite epitope na istom antigenu ili različitim antigenima.
[0131] Slika 1E prikazuje primere imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom koje koeksprimiraju dva različita V<H>H-bazirana CAR. Primer imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom u levom panelu koeksprimira dva različita monospecifična, monovalentna CAR. Primer imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom u srednjem panelu koeksprimira monospecifični, monovalentni CAR i bispecifični ili bivalentni CAR. Primer imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom u desnom panelu koeksprimira dva različita bispecifična ili bivalentna CAR. CAR mogu prepoznati različite antigene.
[0132] Slika 2A prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih CAR koji sadrže različite anti-BCMA (tj., anti-CD269) ili anti-CD38 jednodomenska antitela protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc.
[0133] Slika 2B prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih CAR koji sadrže različite anti-BCMA (tj., anti-CD269) ili anti-CD38 jednodomenska antitela protiv ćelijske linije glioblastoma U87MG.Luc. Slika 3A prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere bispecifičnih CAR protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc. Slika 3B prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere bispecifičnih CAR protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc. Slika 4 prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere bispecifičnih CAR protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc. Slika 5 prikazuje konstrukte primera bispecifičnog CAR koji cilja CD19 i CD20, primera monospecifičnog CAR koji cilja CD19 i primera monospecifičnog CAR koji cilja CD20.
[0134] Slika 6 prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti za različite T ćelije. Gornji levi panel prikazuje rezultate netransdukovanih kontrolnih T ćelija. Gornji desni panel prikazuje rezultate T ćelija koje eksprimiraju primer CD19 CAR. Donji levi panel prikazuje rezultate T ćelija koje eksprimiraju primer CD20 CAR. Donji desni panel prikazuje rezultate T ćelija koje eksprimiraju primer bispecifičnog CD19 × CD20 CAR. Slika 7 prikazuje rezultate in vivo antitumorskog test T ćelija koje eksprimiraju primer bispecifičnog CAR koji cilja CD19 i CD20.
[0135] Slika 8A prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih, bivalentnih CAR protiv ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc. Svaki CAR sadrži ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži dva različita anti-BCMA (tj., anti-CD269) sdAb.
[0136] Slika 8B prikazuje rezultate in vitro testa citotoksičnosti T ćelija koje eksprimiraju primere monospecifičnih, bivalentnih CAR protiv ćelijske linije glioblastoma U87MG.Luc. Svaki CAR sadrži ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži dva različita anti-BCMA (tj., anti-CD269) sdAb.
[0138] DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA
[0140] Predmetni pronalazak obezbeđuje monospecifične, multispecifične (kao što su bispecifični) i multivalentne (kao što su bivalentni ili trivalentni) himerne antigenske receptore koji sadrže ekstracelularne domene za vezivanje antigena zasnovane na jednodomenskom antitelu (sdAb), kako je definisano u patentnim zahtevima. Za razliku od fragmenata za vezivanje antigena izvedenih iz konvencionalnih četvorolančanih antitela, sdAb sadrže samo jedan varijabilni domen, kao što je V<H>H. Dakle, sdAb su mnogo manje veličine od fragmenata koji vezuju antigen, kao što su scFv koji se trenutno koriste kao ekstracelularni domeni koji vezuju antigen u CAR. Takođe, pošto nema potrebe za uparivanjem teškog i lakog lanca tokom savijanja sdAb, pogrešno savijanje ekstracelularnog domena koji vezuje antigen može se smanjiti u imunim ćelijama dobijenim genetskim inženjeringom koje eksprimiraju CAR na osnovu sdAb. CAR koji imaju ekstracelularne domene koji vezuju antigen i sadrže više kopija sdAb ili više sdAb koji ciljaju različite epitope ili antigene mogu se pogodno konstruisati i proizvesti rekombinantno, čime se obezbeđuje efikasna platforma za pripremu i skrining multivalentnih i multispecifičnih CAR. Pored toga, mali otisak sdAb može omogućiti pristup CAR skrivenim antigenskim ciljevima i epitopima u tumorskim tkivima.
[0141] [0061] Multispecifični i multivalentni CAR mogu imati poboljšanu efikasnost u odnosu na monospecifične monovalentne CAR za imunoterapiju kancera. Ćelije kancera su genetski nestabilne, što im omogućava da izbegnu ciljane terapije mutirajući ili gubeći gene koji kodiraju ciljne antigene. Ciljanjem dva ili više različitih epitopa ili antigena na ćelije kancera, multivalentni ili multispecifični CAR mogu otežati ćelijama kancera da potpuno izbegnu ciljanje od strane imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom (kao što su T ćelije) koje eksprimiraju CAR. Zbog svoje male veličine, tandemno fuziona jednodomenska antitela, koja se koriste kao ekstracelularni domeni za vezivanje antigena u multivalentnim ili multispecifičnim CAR ovog pronalaska, mogu sačuvati svoj individualni strukturni integritet i afinitet vezivanja za ciljne antigene, čime omogućavaju efikasno ciljanje svakog epitopa ili antigena od strane CAR. Imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom koje eksprimiraju multivalentne ili multispecifične CAR ili koeksprimiraju dva ili više himernih antigenskih receptora koji ciljaju različite tumorske antigene mogu prevazići mehanizme izbegavanja tumorskog imuniteta koji su posledica abnormalnosti u obradi i prezentaciji proteina i antigena.
[0142] Shodno tome, jedan aspekt ovog pronalaska obezbeđuje multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu, svaki od prvog i drugog sdAb je VHH; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu je prvi antigen različit od drugog antigena. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen je BCMA i drugi antigen je CD38. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen je CD19 i drugi antigen je BCMA. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen je CD19 i drugi antigen je CD20. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen je CD19 i drugi antigen je CD22.
[0143] U sledećem aspektu, obezbeđen je multivalentni himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za antigen, pri čemu svaki od prvog i drugog sdAb je VHH; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen.
[0144] U sledećem aspektu, obezbeđen je multivalentni himerni antigenski receptor (CAR) pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za prvi epitop antigena, i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu se prvi epitop razlikuje od drugog epitopa.
[0145] Dalje su opisana kao referenca nova anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA i anti-CD38 jednodomenska antitela i himerni antigenski receptori koji sadrže bilo koje od sdAb.
[0146] Ovde su takođe date imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom (kao što su T ćelije) koje sadrže CAR pronalaska, farmaceutske kompozicije pronalaska i farmaceutska kompozicija pronalaska za upotrebu u postupcima lečenja kancera.
[0148] I. Definicije
[0150] [0067] Praksa ovog pronalaska će koristiti, osim ako nije posebno naznačeno drugačije, konvencionalne metode virusologije, imunologije, mikrobiologije, molekularne biologije i tehnike rekombinantne DNK u okviru tehnike u ovoj oblasti, od kojih su mnoge opisane u nastavku radi ilustracije. Takve tehnike su detaljno objašnjene u literaturi. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) i druge slične reference.
[0151] Termin „antitelo“ obuhvata monoklonska antitela (uključujući antitela pune dužine sa 4 lanca ili antitela pune dužine samo sa teškim lancem koja imaju Fc region imunoglobulina), kompozicije antitela sa poliepitopskom specifičnošću, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela, diatela i jednolančane molekule), kao i fragmente antitela (npr. Fab, F(ab')<2>, i Fv). Termin „imunoglobulin“ (Ig) se ovde koristi naizmenično sa „antitelom“. Antitela koja se ovde razmatraju uključuju antitela sa jednim domenom, kao što su antitela samo sa teškim lancem.
[0152] [0069] Osnovna jedinica antitela sa 4 lanca je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. IgM antitelo se sastoji od 5 osnovnih heterotetramernih jedinica zajedno sa dodatnim polipeptidom koji se naziva J lanac i sadrži 10 mesta za vezivanje antigena, dok IgA antitela sadrže od 2-5 osnovnih jedinica sa 4 lanca koje mogu polimerizovati i formirati polivalentne sklopove u kombinaciji sa J lancem. U slučaju IgG, jedinica sa 4 lanca je generalno oko 150.000 daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Svaki H lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (V<H>) praćen sa tri konstantna domena (C<H>) za svaki od α i y lanaca i četiri C<H>domena za µ i ε izotipove. Svaki L lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (V<L>) praćen konstantnim domenom na drugom kraju. V<L>je poravnat sa V<H>i C<L>je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (C<H>1). Veruje se da određeni ostaci aminokiselina formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca. Uparivanje V<H>i V<L>formira jedno mesto za vezivanje antigena. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, videti npr., Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6. L lanac bilo koje vrste kičmenjaka može se pripisati jednom od dva jasno različita tipa, nazvana kapa i lambda, na osnovu aminokiselinske sekvence njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (C<H>), imunoglobulini mogu biti svrstani u različite klase ili izotipove. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, sa teškim lancima označenim kao α, δ, ε, γ i µ, respektivno. Klase γ i α su dalje podeljene na podklase na osnovu relativno manjih razlika u C<H>sekvenci i funkcija, npr. ljudi eksprimiraju sledeće podklase: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2.
[0153] Termin „antitelo samo sa teškim lancima“ ili „HCAb“ odnosi se na funkcionalno antitelo koje sadrži teške lance, ali mu nedostaju laki lanci koji se obično nalaze u antitelima sa 4 lanca. Poznato je da kamelide (kao što su kamile, lame ili alpake) proizvode HCAb.
[0154] Termin „jednodomensko antitelo“ ili „sdAb“ odnosi se na jedan polipeptid koji vezuje antigen i ima tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Samo sdAb je sposoban da se veže za antigen bez uparivanja sa odgovarajućim polipeptidom koji sadrži CDR. U nekim slučajevima, antitela sa jednim domenom su konstruisana od kamelidnih HCAb, a njihovi varijabilni domeni teškog lanca se ovde nazivaju „V<H>H“. Neki V<H>H mogu biti poznati i kao nanotela. Kamelidno sdAb je jedan od najmanjih poznatih fragmenata antitela koji vezuju antigen (videti, npr., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446‑8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168‑73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013‑26 (2013)). Osnovni V<H>H ima sledeću strukturu od N-terminusa do C-terminusa: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, pri čemu se FR1 do FR4 odnose na okvirne regione 1 do 4, respektivno, i pri čemu se CDR1 do CDR3 odnose na regione koji određuju komplementarnost 1 do 3.
[0155] [0072] „Izolovano“ antitelo je ono koje je identifikovano, odvojeno i/ili izolovano iz komponente svog proizvodnog okruženja (npr. prirodnog ili rekombinantnog). Poželjno je da izolovani polipeptid bude slobodan od povezivanja sa svim ostalim komponentama iz svog proizvodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente njegovog proizvodnog okruženja, kao što su one koje nastaju iz rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji bi tipično ometali istraživačku, dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu antitela i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U poželjnim primerima izvođenja, polipeptid će biti prečišćen: (1) do više od 95% težine antitela, kako je određeno, na primer, Lowry postupkom, a u nekim primerima izvođenja, do više od 99% težine; (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence upotrebom sekvencera sa rotirajućom čašicom, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod neredukujućim ili redukujućim uslovima korišćenjem Coomassie plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovano antitelo obuhvata antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija, jer barem jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, obično se izolovani polipeptid ili antitelo priprema najmanje jednim korakom prečišćavanja.
[0156] „Varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ antitela odnosi se na amino-terminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca mogu se nazivati „V<H>" i "V<L>", respektivno. Ovi domeni su generalno najvarijabilniji delovi antitela (u odnosu na druga antitela iste klase) i sadrže mesta vezivanja antigena. Antitela samo sa teškim lancem iz kamelidnih vrsta imaju jedan varijabilni region teškog lanca, koji se naziva „V<H>H". V<H>H je stoga poseban tip V<H>.
[0157] Termin „varijabilni“ odnosi se na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena značajno razlikuju u sekvenci među antitelima. V domen posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena po celom rasponu varijabilnih domena. Umesto toga, koncentrisana je u tri segmenta nazvana hipervarijabilni regioni (HVR), kako u varijabilnim domenima lakog lanca, tako i u varijabilnim domenima teškog lanca. Konzervativniji delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR). Varijabilni domeni prirodnih teških i lakih lanaca sastoje se od četiri FR regiona, koji uglavnom usvajaju konfiguraciju beta-ploče, povezane sa tri HVR, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima čine i deo strukture beta-ploče. HVR u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini FR regiona i, sa HVR iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta vezivanja antigena antitela (videti Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u antitelo zavisnoj citotoksičnosti.
[0158] [0075] Termin „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i/ili posttranslacionih modifikacija (npr., izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena protiv jednog antigenskog mesta. Za razliku od preparata poliklonskih antitela koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela imaju prednost u tome što se sintetišu u kulturi hibridoma ili rekombinantno, nekontaminirani drugim imunoglobulinima. Modifikator „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, na primer, hibridomsku metodu od Kohler and Milstein., Nature, 256:495‑97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253‑260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563‑681 (Elsevier, N.Y., 1981)), metode rekombinantne DNK (videti, npr., U.S. Pat. br. 4,816,567), tehnologije fagnog prikaza (videti, npr., Clackson et al., Nature, 352: 624‑628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581‑597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.
[0159] 338(2): 299‑310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073‑1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467‑12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1‑2): 119‑132 (2004), i tehnologije za proizvodnju humanih antitela ili antitela sličnih humanim kod životinja koje imaju delove ili sve lokuse humanih imunoglobulina ili gene koji kodiraju sekvence humanih imunoglobulina (videti, npr., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255‑258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Pat. br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779‑783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856‑859 (1994); Morrison, Nature 368: 812‑813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol.14: 845‑851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); i Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.
[0160] 13: 65‑93 (1995).
[0161] Termin „golo antitelo“ odnosi se na antitelo koje nije konjugovano sa citotoksičnim delom ili radioaktivnim markerom.
[0162] Termini „antitelo pune dužine“, „intaktno antitelo“ ili „celo antitelo“ koriste se naizmenično da bi se odnosili na antitelo u njegovom suštinski intaktnom obliku, za razliku od fragmenta antitela. Konkretno, antitela pune dužine sa 4 lanca uključuju ona sa teškim i lakim lancima, uključujući Fc region. Antitela pune dužine koja sadrže samo teški lanac uključuju teški lanac (kao što je V<H>H) i Fc region. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni prirodne sekvence (npr., konstantni domeni humane prirodne sekvence) ili varijante njihovih aminokiselinskih sekvenci. U nekim slučajevima, intaktno antitelo može imati jednu ili više efektorskih funkcija.
[0163] [0078] „Fragment antitela“ sadrži deo intaktnog antitela, poželjno deo za vezivanje antigena i/ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')<2>i Fv fragmente; diatela; linearna antitela (videti U.S. Pat. br.5,641,870, Primer 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); molekule jednolančanih antitela; jednodomenska antitela (kao što je V<H>H) i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Papainska digestija antitela proizvela je dva identična fragmenta koji vezuju antigen, nazvana „Fab“ fragmenti, i rezidualni „Fc“ fragment, oznaka koja odražava sposobnost lake kristalizacije. Fab fragment se sastoji od celog L lanca zajedno sa domenom varijabilnog regiona H lanca (V<H>), i prvog konstantnog domena jednog teškog lanca (C<H>1). Svaki Fab fragment je monovalentan u pogledu vezivanja antigena, tj., ima jedno mesto za vezivanje antigena. Tretman antitela pepsinom obezbeđuje jedan veliki F(ab')<2>fragment koji otprilike odgovara dva disulfidno povezana Fab fragmenta koji imaju različitu aktivnost vezivanja antigena i dalje je sposoban za umrežavanje antigena. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju nekoliko dodatnih ostataka na karboksi kraju C<H>1 domena koji uključuje jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. Fab'-SH je ovde oznaka za Fab' u kome cisteinski ostatak (ostaci) konstantnih domena nosi slobodnu tiolnu grupu. F(ab')<2>fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata koji imaju zglobne cisteine između sebe. Poznata su i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela.
[0164] Fc fragment sadrži karboksi-terminalne delove oba H lanca koje drže zajedno disulfidi. Efektorske funkcije antitela određene su sekvencama u Fc regionu, regionu koji takođe prepoznaju Fc receptori (FcR) koji se nalaze na određenim tipovima ćelija.
[0165] „Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera jednog varijabilnog regiona teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. Iz savijanja ova dva domena nastaje šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje doprinose aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i daju specifičnost vezivanja antigena antitelu. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri HVR specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže antigen, iako sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.
[0166] „Jednolančani Fv“, takođe skraćeno „sFv“ ili „scFv“, su fragmenti antitela koji sadrže V<H>i V<L>domene antitela povezane u jedan polipeptidni lanac. Poželjno je da sFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između V<H>i V<L>domena koji omogućavaju sFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled sFv, pogledati Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269‑315 (1994).
[0167] „Funkcionalni fragmenti“ antitela opisanih ovde sadrže deo intaktnog antitela, generalno uključujući region vezivanja antigena ili varijabilni region intaktnog antitela ili Fc region antitela koji zadržava ili ima modifikovanu sposobnost vezivanja FcR. Primeri fragmenata antitela uključuju linearno antitelo, molekule antitela sa jednim lancem i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
[0168] Termin „diatela“ odnosi se na male fragmente antitela pripremljene konstruisanjem sFv fragmenata (videti prethodni pasus) sa kratkim linkerima (oko 5-10 ostataka) između V<H>i V<L>domena tako da se postiže interlančano, ali ne i intralančano uparivanje V domena, što rezultira bivalentnim fragmentom, tj., fragmentom koji ima dva mesta za vezivanje antigena. Bispecifična diatela su heterodimeri dva „ukrštena“ sFv fragmenta u kojima su V<H>i V<L>domeni dva antitela prisutni na različitim polipeptidnim lancima. Diatela su detaljnije opisana, na primer, u EP 404,097; WO 93/11161; Holinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
[0169] Monoklonska antitela ovde posebno uključuju „himerna“ antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Pat. br.4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851‑6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju PRIMATTZFD<®>antitela gde je region antigen-vezujućih antitela izveden iz antitela proizvedenog pomoću, npr., imunizacije makaki majmuna antigenom od interesa. Kako se ovde koristi, „humanizovano antitelo“ se koristi kao podskup „himernih antitela“.
[0170] [0085] „Humanizovani“ oblici ne-humanih (npr. kamelidnih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanih imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primaoca) u kome su ostaci iz HVR (u daljem tekstu definisano) primaoca zamenjeni ostacima iz HVR ne-humane vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primat, koji imaju željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira („FR“) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Dodatno, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije mogu se napraviti da bi se dodatno usavršile performanse antitela, kao što je afinitet vezivanja. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz ne-humane imunoglobulinske sekvence, a svi ili suštinski svi FR regioni su oni iz humane imunoglobulinske sekvence, iako FR regioni mogu uključivati jednu ili više pojedinačnih supstitucija FR ostataka koje poboljšavaju performanse antitela, kao što su afinitet vezivanja, izomerizacija, imunogenost itd., broj ovih aminokiselinskih supstitucija u FR tipično nije veći od 6 u H lancu, a u L lancu nije veći od 3. Humanizovano antitelo će izborno takođe sadržati barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog od humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti, npr., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). Vidi takođe, na primer, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol.
[0171] 1:105‑115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035‑1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech.5:428‑433 (1994); i U.S. Pat. br.6,982,321 i 7,087,409.
[0172] „Humano antitelo“ je antitelo koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koju proizvodi čovek i/ili je napravljena korišćenjem bilo koje od tehnika za pravljenje humanih antitela kao što su ovde opisane. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke koji vezuju antigene koji nisu humani. Humana antitela mogu se proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke fagnog prikaza. Hoogenboom and Vinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Takođe su dostupne metode za pripremu humanih monoklonskih antitela opisane u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86‑95 (1991). Videti takođe van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela mogu se pripremiti primenom antigena transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onesposobljeni, npr., imunizovani ksenomiš (videti, npr., U.S. Pat. br. 6,075,181 i 6,150,584 u vezi sa XENOMOUSE<™>tehnologijom). Vidi takođe, na primer, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557‑3562 (2006) u vezi sa humanim antitelima generisanim preko tehnologije humanog B-ćelijskog hibridoma.
[0173] Termin „hipervarijabilni region“, „HVR“ ili „HV“, kada se ovde koristi, odnosi se na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela sa jednim domenom sadrže tri HVR (ili CDR): HVR1 (ili CDR1), HVR2 (ili CDR2) i HVR3 (ili CDR3). HVR3 pokazuje najveću raznolikost od tri HVR i veruje se da igra jedinstvenu ulogu u davanju fine specifičnosti antitelima. Videti, npr., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446‑448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol.
[0174] 3:733‑736 (1996).
[0175] Termin „region koji određuje komplementarnost“ ili „CDR“ se koristi za označavanje hipervarijabilnih regiona kako je definisano Kabatovim sistemom. Videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)
[0176] Koristi se niz HVR razgraničenja i obuhvaćena su ovde. Kabatovi regioni koji određuju komplementarnost (CDR) zasnivaju se na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se umesto toga odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR predstavljaju kompromis između Kabat HVR i Chothia strukturnih petlji i koristi ih softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. „Kontaktni“ HVR se zasnivaju na analizi dostupnih složenih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih HVR navedeni su u Tabeli 1.
[0178] Tabela 1. Razgraničenja HVR.
[0179] Petlja Kabat AbM Chothia Kontakt
[0180] L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
[0181] L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
[0182] L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
[0183] H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
[0184] (Kabat numeracija)
[0185] H1 H31-H35 H26-H3 5 H26-H32 H30-H35
[0186] (Chothia numeracija)
[0187] H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
[0188] H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
[0190] HVR mogu sadržati „proširene HVR“ kao što sledi: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u V<L>i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u V<H>. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabat et al., gore, za svaku od ovih definicija.
[0191] [0091] Aminokiselinsk ostaci jednodomenskog antitela (kao što je V<H>H) su numerisani prema opštoj numeraciji za V<H>domene datoj od strane Kabat et al. („Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No.91), kako je primenjeno na V<H>H domene iz kamelida u članku Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun.23; 240 (1‑2): 185‑195. Prema ovom numerisanju, FR1 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-30, CDR1 V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 31-35, FR2 gen V<H>H sadrži aminokiseline na pozicijama 36-49, CDR2 Vod<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-65, FR3 gen V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 66-94, CDR3 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102 i FR4 od V<H>H sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113. U tom smislu, treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u struci za V<H>domene i za V<H>H domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR može da varira i ne mora da odgovara ukupnom broju aminokiselinskih ostataka naznačenih Kabat numeracijom (to jest, jedna ili više pozicija prema Kabat numeraciji možda nisu zauzete u stvarnoj sekvenci ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka nego što je dozvoljeno Kabat numeracijom).
[0192] Izraz „numerisanje ostataka varijabilnog domena kao kod Kabat“ ili „numerisanje pozicija aminokiselina kao kod Kabat“ i njihove varijacije odnose se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca u sastavu antitela kod Kabata et al., gore. Koristeći ovaj sistem numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekveenca može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline što odgovara skraćivanju ili inserciji u FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje jedan insert aminokiseline (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 H2 i umetnute ostatke (npr. ostaci 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) posle ostatka FR teškog lanca 82. Kabat numeracija ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnanjem u regionima homologije sekvence antitela sa „standardnom“ Kabat numerisanom sekvencom.
[0193] Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, numeracija ostataka u teškom lancu imunoglobulina je ona prema EU indeksu kao kod Kabata. et al., gore. „EU indeks kao kod Kabat“ odnosi se na numeraciju ostataka humanog IgG1 EU antitela.
[0194] Ostaci „okvira“ ili „FR“ su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci HVR kako su ovde definisani.
[0195] „Humani konsenzusni okvir“ ili „akceptorski humani okvir“ je okvir koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u selekciji humanog imunoglobulina V<L>ili V<H>okvirne sekvence. Generalno, selekcija humanog imunoglobulina V<L>ili V<H>sekvence su iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Primeri uključuju za V<L>, da podgrupa može biti podgrupa kapa I, kapa II, kapa III ili kapa IV kao kod Kabat et al., gore. Pored toga, za VH, podgrupa može biti podgrupa I, podgrupa II ili podgrupa III kao kod Kabat et al. Alternativno, humani konsenzusni okvir može biti izveden iz gore navedenog u kome se određeni ostaci, kao kada je ostatak humanog okvira odabran na osnovu njegove homologije sa donorskim okvirom poravnavanjem sekvence donorskog okvira sa kolekcijom različitih sekvenci humanog okvira.
[0196] Akceptorski humani okvir „izveden iz“ humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzusnog okvira može da sadrži istu aminokiselinska sekvencu ili može da sadrži prethodno postojeće promene aminokiselinske sekvence. U nekim primerima izvođenja, broj prethodno postojećih promena aminokiselinske sekvence je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje.
[0197] „Modifikacija aminokiseline“ na određenoj poziciji, npr. Fc regiona, odnosi se na supstituciju ili deleciju navedenog ostatka, ili na inserciju najmanje jednog aminokiselinskog ostatka pored navedenog ostatka. Insercija „pored“ navedenog ostatka znači insercija unutar jednog do dva ostatka od njega. Insercija može biti N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na navedeni ostatak. Poželjna modifikacija aminokiseline ovde je supstitucija.
[0198] „Afinitetno sazrelo“ antitelo je ono sa jednom ili više promena u jednom ili više svojih HVR (Health Reverse Virgin Reverse - HVR) koje rezultuju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa matičnim antitelom koje ne poseduje te promene. U nekim primerima, afinitetno sazrelo antitelo ima nanomolarni ili čak pikomolarni afinitet za ciljni antigen. Afinitetno sazrela antitela se proizvode postupcima poznatim u struci. Na primer, Marks et al., Bio/Technology 10:779‑783 (1992) opisuju sazrevanje afiniteta pomoću premeštanja V<H>- i V<L>-domena. Slučajna mutageneza HVR i/ili ostataka okvira je opisana, na primer: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809‑3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147‑155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994‑2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310‑9 (1995); i Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889‑896 (1992).
[0199] [0098] Kako se ovde koristi, termin „specifično se vezuje“, „specifično prepoznaje“ ili je „specifično za“ odnosi se na merljive i reproducibilne interakcije kao što je vezivanje između cilja i proteina koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb), što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula, uključujući biološke molekule. Na primer, protein koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) koji se specifično vezuje za cilj (koji može biti epitop) je protein koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) koji se vezuje za ovaj cilj sa većim afinitetom, avidnošću, lakše i/ili sa većim trajanjem nego što se vezuje za druge ciljeve. U nekim primerima izvođenja, stepen vezivanja proteina koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) za nesrodni cilj je manji od oko 10% vezivanja proteina koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) za cilj mereno, npr., radioimunološkim testom (RIA). U nekim primerima izvođenja, protein koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) koji se specifično vezuje za cilj ima konstantu disocijacije (Kd) od ≦1 µM, ≦100 nM, ≦10 nM, ≦1 nM ili ≦0,1 nM. U nekim primerima izvođenja, protein koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) specifično se vezuje za epitop na proteinu koji je konzerviran među proteinima iz različitih vrsta. U nekim primerima izvođenja, specifično vezivanje može da uključuje, ali ne zahteva ekskluzivno vezivanje.
[0200] Termin „specifičnost“ se odnosi na selektivno prepoznavanje proteina koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) za određeni epitop antigena. Prirodna antitela, na primer, su monospecifična. Termin „multispecifično“, kako se ovde koristi, označava da protein koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) ima dva ili više mesta za vezivanje antigena, od kojih se najmanje dva vezuju za različiti antigen ili različiti epitop istog antigena. „Bispecifično“, kako se ovde koristi, označava da protein koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) ima dve različite specifičnosti za vezivanje antigena. Termin „monospecifično“ CAR, kako se ovde koristi, označava protein koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb) koji ima jedno ili više mesta za vezivanje, od kojih svako vezuje isti epitop istog antigena.
[0201] Termin „valentni“, kako se ovde koristi, označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja u proteinu koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb). Prirodno antitelo, na primer, ili antitelo pune dužine ima dva mesta vezivanja i bivalentno je. Kao takvi, termini „trovalentan“, „tetravalentan“, „pentavalentan“ i „heksavalentan“ označavaju prisustvo dva mesta vezivanja, tri mesta vezivanja, četiri mesta vezivanja, pet mesta vezivanja i šest mesta vezivanja, respektivno, u proteinu koji vezuje antigen (kao što je CAR ili sdAb).
[0202] [0101] „Efektorske funkcije antitela“ odnose se na biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (Fc region nativne sekvence ili Fc region varijante aminokiselinske sekvence) antitela i variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje za C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa; vezivanje za Fc receptor; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; smanjenje regulacije receptora na površini ćelija (npr., receptori B ćelija); i aktivaciju B ćelija. „Smanjena ili minimizirana“ efektorska funkcija antitela označava onu koja je smanjena za najmanje 50% (alternativno 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) u odnosu na divlji tip ili nemodifikovano antitelo. Određivanje efektorske funkcije antitela se lako određuje i meri od strane stručnjaka u ovoj oblasti. U poželjnom primeru, efektorske funkcije antitela vezivanja komplementa, citotoksičnosti zavisne od komplementa i citotoksičnosti zavisne od antitela su pogođene. U nekim primerima, efektorska funkcija je eliminisana kroz mutaciju u konstantnom regionu koja je eliminisala glikozilaciju, npr., „mutacija bez efektora“. U jednom aspektu, mutacija bez efektora je mutacija N297A ili DANA (D265A+N297A) u C<H>2 regionu. Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591‑6604 (2001). Alternativno, dodatne mutacije koje dovode do smanjene ili eliminisane efektorske funkcije uključuju: K322A i L234A/L235A (LALA). Alternativno, efektorska funkcija može biti smanjena ili eliminisana tehnikama proizvodnje, kao što je ekspresija u ćelijama domaćina koje ne glikoziliraju (npr., E. coli) ili koji dovode do izmenjenog obrasca glikozilacije koji je neefikasan ili manje efikasan u stimulaciji efektorske funkcije (npr., Shinkawa et al., J. Biol. Chem.278(5): 3466‑3473 (2003).
[0203] „Citotoksičnost zavisna od antitela“ ili ADCC odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojem se sekretovani Ig vezuje za Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr., prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i potom ubijaju ciljnu ćeliju citotoksinima. Antitela „naoružavaju“ citotoksične ćelije i neophodna su za ubijanje ciljne ćelije ovim mehanizmom. Primarne ćelije za posredovanje u ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija Fc na hematopoetskim ćelijama je sumirana u Tabeli 3 na strani 464 od Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457‑92 (1991). Da bi se procenila ADCC aktivnost molekula od interesa, može se izvršiti in vitro ADCC test, kao što je onaj opisan u U.S. Pat. br.5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i prirodne ćelije ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može se proceniti ADCC aktivnost molekula od interesa in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj objavljen u Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).
[0204] Termin „Fc region“ ovde se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc regione nativne sekvence i varijantne Fc regione. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG se obično definiše tako da se proteže od aminokiselinskih ostataka na poziciji Cys226, ili od Pro230, do njihovog karboksil-terminusa. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu numeracije) Fc regiona može se ukloniti, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Shodno tome, sastav intaktnih antitela može da sadrži populacije antitela sa svim uklonjenim K447 ostacima, populacije antitela bez uklonjenih K447 ostataka i populacije antitela koje imaju mešavinu antitela sa i bez K447 ostatka. Pogodni Fc regioni nativne sekvence za upotrebu u antitelima opisanim ovde uključuju humani IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 i IgG4.
[0205] [0104] „Afinitet vezivanja“ se generalno odnosi na jačinu ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr., antitelo ili CAR) i njegovog partnera za vezivanje (npr., antigen). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova para vezivanja (npr., antitelo i antigen, ili CAR i antigen). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti konstantom disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući i one opisane ovde. Antitela niskog afiniteta generalno sporo vezuju antigen i imaju tendenciju da lako disociraju, dok antitela visokog afiniteta generalno brže vezuju antigen i imaju tendenciju da duže ostanu vezana. U struci je poznat niz postupaka za merenje afiniteta vezivanja, od kojih se može koristiti bilo koji. Konkretni ilustrativni primeri za merenje afiniteta vezivanja opisani su u nastavku.
[0206] „Blokirajuće“ antitelo ili „antagonističko“ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. U nekim primerima, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili potpuno inhibiraju biološku aktivnost antigena.
[0207] „Agonist“ ili aktivirajuće antitelo je ono koje pojačava ili pokreće signalizaciju antigenom za koji se vezuje. U nekim primerima izvođenja, agonistička antitela izazivaju ili aktiviraju signalizaciju bez prisustva prirodnog liganda.
[0208] „Procenat (%) identičnosti aminokiselinskih sekvenci“ i „homologija“ u odnosu na peptidnu, polipeptidnu ili sekvencu antitela definišu se kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u specifičnoj peptidnoj ili polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinskih sekvenci može se postići na različite načine koji su u okviru tehnike, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili MEGALIGN<™>(DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja duž cele dužine sekvenci koje se upoređuju.
[0209] „Himerni antigenski receptor“ ili „CAR“, kako se ovde koristi, odnosi se na genetski modifikovane receptore, koji se mogu koristiti za kalemljenje jedne ili više antigenskih specifičnosti na imune efektorske ćelije, kao što su T ćelije. Neki CAR su takođe poznati kao „veštački T-ćelijski receptori“, „himerni T-ćelijski receptori“ ili „himerni imuni receptori“. CAR sadrži ekstracelularni domen za vezivanje antigena specifičan za jedan ili više antigena (kao što su tumorski antigeni), transmembranski domen i intracelularni signalni domen T ćelije i/ili drugih receptora. „CAR-T“ se odnosi na T ćeliju koja eksprimira CAR.
[0210] [0109] „Izolovani“ molekul nukleinske kiseline koji kodira CAR ili sdAb opisan ovde je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminirajućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u okruženju u kojem je proizveden. Poželjno je da izolovana nukleinska kiselina bude slobodna od vezivanja sa svim komponentama povezanim sa proizvodnim okruženjem. Izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide i antitela ovde su u obliku koji se razlikuje od oblika ili okruženja u kojem se nalaze u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se stoga razlikuju od nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide i antitela ovde koje prirodno postoje u ćelijama.
[0211] Termin „kontrolne sekvence“ odnosi se na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, izborno operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, signale poliadenilacije i pojačivače.
[0212] Nukleinska kiselina je „operativno vezana“ kada se postavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretorni lider je operativno povezana sa DNK za polipeptid ako je eksprimirana kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Generalno, „operativno povezano“ znači da su DNK sekvence koje se povezuju susedne, a u slučaju sekretornog lidera, susedne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa konvencionalnom praksom.
[0213] Termin „vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban za propagaciju druge nukleinske kiseline sa kojom je povezan. Termin uključuje vektor kao samoreplicirajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „ekspresioni vektori“.
[0214] Kako se ovde koristi, termin „autologni“ odnosi se na bilo koji materijal dobijen od iste individue u koju će kasnije biti ponovo uveden.
[0215] „Alogeni“ se odnosi na kalem dobijen od druge jedinke iste vrste.
[0216] Termin „transfektovan“ ili „transformisan“ ili „transdukovan“, kako se ovde koristi, odnosi se na postupak kojim se egzogena nukleinska kiselina prenosi ili unosi u ćeliju domaćina. „Transfektovana“ ili „transformisana“ ili „transdukovana“ ćelija je ona koja je transfektovana, transformisana ili transdukovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Ćelija uključuje primarnu predmetnu ćeliju i njeno potomstvo.
[0217] Kako se ovde koriste, izrazi „ćelija“, „ćelijska linija“ i „ćelijska kultura“ koriste se naizmenično i sve takve oznake uključuju potomstvo. Stoga, reči „transfektanti“ i „transfektovane ćelije“ uključuju primarnu ćeliju koja je predmet analize i kulture izvedene iz nje, bez obzira na broj transfera. Takođe se razume da svi potomci možda neće biti potpuno identični u sadržaju DNK, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Uključeni su i varijantni potomci koji imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji.
[0218] Termini „ćelija domaćin“, „ćelijska linija domaćina“ i „kultura ćelija domaćina“ koriste se naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarno transformisanu ćeliju i potomstvo izvedeno iz nje, bez obzira na broj pasaža. Potomstvo možda nije potpuno identično po sadržaju nukleinskih kiselina matičnoj ćeliji, ali može sadržati mutacije. Ovde je uključeno mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je potvrđeno skriningom ili selektovano u originalno transformisanoj ćeliji.
[0219] Kako se ovde koristi, „lečenje“ ili „lečiti“ je pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više od sledećeg: ublažavanje jednog ili više simptoma koji nastaju usled bolesti, smanjenje obima bolesti, stabilizacija bolesti (npr., sprečavanje ili odlaganje pogoršanja bolesti), sprečavanje ili odlaganje širenja (npr., metastaze) bolesti, sprečavanje ili odlaganje ponovne pojave bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, ublažavanje bolesnog stanja, obezbeđivanje remisije (delimične ili potpune) bolesti, smanjenje doze jednog ili više drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, odlaganje progresije bolesti, povećanje kvaliteta života i/ili produženje preživljavanja. Pod „lečenjem“ se takođe podrazumeva smanjenje patoloških posledica kancera. Upotreba ovog pronalaska obuhvata bilo koji od ovih aspekata lečenja.
[0220] Kako se ovde koristi, „individua“ ili „subjekat“ odnosi se na sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na, čoveka, govedo, konja, mačku, psa, glodara ili primata. U nekim primerima izvođenja, individua je čovek.
[0221] [0120] Termin „efikasna količina“ koji se ovde koristi odnosi se na količinu agensa, kao što je jednodomensko antitelo, imuna efektorska ćelija dobijena genetičkim inženjeringom ili njegova farmaceutska kompozicija, dovoljnu za lečenje određenog poremećaja, stanja ili bolesti, kao što je ublažavanje, palijativno ublažavanje, smanjenje i/ili odlaganje jednog ili više njegovih simptoma. U vezi sa kancerom, efikasna količina sadrži količinu dovoljnu da izazove smanjenje tumora i/ili da smanji brzinu rasta tumora (kao što je suzbijanje rasta tumora) ili da spreči ili odloži drugu neželjenu proliferaciju ćelija. U nekim primerima izvođenja, efikasna količina je količina dovoljna da odloži razvoj. U nekim primerima izvođenja, efikasna količina je količina dovoljna da spreči ili odloži ponovnu pojavu. Efikasna količina se može primeniti u jednoj ili više primena. Efikasna količina leka ili kompozicije može: (i) smanjiti broj ćelija kancera; (ii) smanjiti veličinu tumora; (iii) inhibirati, usporiti, donekle usporiti i poželjno zaustaviti infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; (iv) inhibirati (tj., usporiti donekle i poželjno zaustaviti) metastaze tumora; (v) inhibirati rast tumora; (vi) sprečiti ili odložiti pojavu i/ili ponovnu pojavu tumora; i/ili (vii) ublažiti donekle jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom.
[0222] „Adjuvantno okruženje“ se odnosi na kliničko okruženje u kojem je individua imala istoriju kancera i generalno (ali ne nužno) je reagovala na terapiju, što uključuje, ali nije ograničeno na, hiruršku intervenciju (npr., hirurška resekcija), radioterapiju i hemoterapiju. Međutim, zbog njihove istorije kancera, ove individue se smatraju u riziku od razvoja bolesti. Lečenje ili primena u „adjuvantnom okruženju“ odnosi se na naknadni način lečenja. Stepen rizika (npr., kada se individua u adjuvantnom okruženju smatra „visokorizičnom“ ili „niskorizičnom“) zavisi od nekoliko faktora, najčešće od obima bolesti prilikom prvog lečenja.
[0223] „Neoadjuvantno okruženje“ se odnosi na kliničko okruženje u kojem se postupak sprovodi pre primarne/konačne terapije.
[0224] Kako se ovde koristi, „odlaganje“ razvoja kancera znači suspendovanje, sprečavanje, usporavanje, zadržavanje, stabilizovanje i/ili odlaganje razvoja bolesti. Ovo odlaganje može biti različitog trajanja, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili individue koja se leči. Kao što je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, dovoljno ili značajno odlaganje može, u stvari, obuhvatiti prevenciju, u smislu da individua ne razvije bolest. Postupak koji „odlaže“ razvoj kancera je postupak koji smanjuje verovatnoću razvoja bolesti u datom vremenskom okviru i/ili smanjuje obim bolesti u datom vremenskom okviru, u poređenju sa nekorišćenjem postupka. Takva poređenja se obično zasnivaju na kliničkim studijama, koristeći statistički značajan broj individua. Razvoj kancera može se otkriti korišćenjem standardnih postupaka, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kompjuterizovanu aksijalnu tomografiju (CAT skeniranje), magnetnu rezonancu (MRI), abdominalni ultrazvuk, testove zgrušavanja, arteriografiju ili biopsiju. Razvoj se takođe može odnositi na progresiju kancera koja u početku može biti neotkrivena i uključuje pojavu, recidiv i početak.
[0225] [0124] Termin „farmaceutska formulacija“ odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasno biološko dejstvo aktivnog sastojka i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekta kome bi formulacija bila primenjena. Takve formulacije su sterilne. „Sterilna“ formulacija je aseptična ili bez svih živih mikroorganizama i njihovih spora.
[0226] „Nosači“, kako se ovde koriste, obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore koji su netoksični za ćeliju ili sisara koji im je izložen u korišćenim dozama i koncentracijama. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferovani rastvor. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptid male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonske surfaktante kao što je TWEEN<™>, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG).
[0227] „Razblaživač“ od interesa ovde je onaj koji je farmaceutski prihvatljiv (bezbedan i netoksičan za primenu kod ljudi) i koristan je za pripremu tečne formulacije, kao što je formulacija rekonstituisana nakon liofilizacije. Primeri razblaživača uključuju sterilnu vodu, bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferovani rastvor (npr. fosfatno puferovani fiziološki rastvor), sterilni fiziološki rastvor, Ringer-ov rastvor ili rastvor dekstroze. U alternativnom primeru izvođenja, razblaživači mogu da uključuju vodene rastvore soli i/ili pufera.
[0228] „Konzervans“ je jedinjenje koje se može dodati formulacijama ovde datim da bi se smanjila bakterijska aktivnost. Dodavanje konzervansa može, na primer, olakšati proizvodnju formulacije za višestruku upotrebu (višestruke doze). Primeri potencijalnih konzervansa uključuju oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid (mešavina alkilbenzildimetilamonijum hlorida u kojima su alkil grupe jedinjenja dugog lanca) i benzetonijum hlorid. Druge vrste konzervansa uključuju aromatične alkohole kao što su fenol, butil i benzil alkohol, alkil parabene kao što su metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol. Najpoželjniji konzervans ovde je benzil alkohol.
[0229] „Stabilna“ formulacija je ona u kojoj protein u njoj u suštini zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost i integritet tokom skladištenja. Različite analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina su dostupne u struci i pregledno su date u Peptide and Protein Drug Delivery, 247‑301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29‑90 (1993). Stabilnost se može meriti na odabranoj temperaturi tokom odabranog vremenskog perioda. Za brzi skrining, formulacija se može čuvati na 40°C tokom 2 nedelje do 1 meseca, kada se meri stabilnost. Tamo gde se formulacija skladišti na 2-8°C, generalno formulacija treba da bude stabilna na 30°C ili 40°C najmanje 1 mesec i/ili stabilna na 2-8°C najmanje 2 godine. Tamo gde se formulacija skladišti na 30°C, generalno formulacija treba da bude stabilna najmanje 2 godine na 30°C i/ili stabilna na 40°C najmanje 6 meseci. Na primer, stepen agregacije tokom skladištenja može se koristiti kao indikator stabilnosti proteina. Dakle, „stabilna“ formulacija može biti ona u kojoj je manje od oko 10%, a poželjno manje od oko 5% proteina prisutno kao agregat u formulaciji. U drugim primerima izvođenja, može se utvrditi svako povećanje formiranja agregata tokom skladištenja formulacije.
[0230] „Rekonstituisana“ formulacija je ona koja je pripremljena rastvaranjem liofilizovanog proteina ili formulacije antitela u razblaživaču tako da je protein dispergovan svuda. Rekonstituisana formulacija je pogodna za primenu (npr. subkutanu primenu) pacijentu koji se leči proteinom od interesa i, u nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, može biti ona koja je pogodna za parenteralnu ili intravensku primenu.
[0231] „Izotonična“ formulacija je ona koja ima u suštini isti osmotski pritisak kao humana krv. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 250 do 350 mOsm. Termin „hipotoničan“ opisuje formulaciju sa osmotskim pritiskom nižim od pritiska humane krvi. Shodno tome, termin „hipertoničan“ se koristi za opisivanje formulacije sa osmotskim pritiskom iznad pritiska humane krvi. Izotoničnost se može meriti, na primer, osmometrom za pritisak pare ili osmometrom sa zamrzavanjem leda. Formulacije ovog pronalaska su hipertonične kao rezultat dodavanja soli i/ili pufera.
[0232] Razume se da primeri izvođenja ovog pronalaska koja su ovde data uključuju primere izvođenja koja se „sastoje“ i/ili koja se „u suštini sastoje od“ primera izvođenja.
[0233] Referenca na „oko“ vrednosti ili parametra ovde uključuje (i opisuje) varijacije koje se odnose na tu vrednost ili parametar per se. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X“ uključuje opis „X“.
[0234] Kako se ovde koristi, referenca na „nije“ vrednost ili parametar generalno znači i opisuje „osim“ vrednosti ili parametra. Na primer, postupak se ne koristi za lečenje kancera tipa X znači da se postupak koristi za lečenje kancera drugih tipova osim X.
[0235] Termin „oko X-Y“ koji se ovde koristi ima isto značenje kao „oko X do oko Y“.
[0236] Kako se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine „a“, „ili“ i „the“ uključuju i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0238] II. Jednodomenska antitela
[0240] Ovde su, kao referenca, otkrivena jednodomenska antitela, njihovi fragmenti koji vezuju antigen i proteini koji vezuju antigen koji sadrže bilo koje od jednodomenskih antitela. Primeri jednodomenskih antitela, koja mogu biti uključena u CAR pronalaska, navedeni su u Tabeli 2 ispod.
[0241] Tabela 2. Primeri jednodomenskih antitela.
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247] Jednodomenska antitela protiv CD19
[0249] Kao referenca, otkrivena su izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za CD19, kao što je humani CD19. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD19 modulira aktivnost CD19. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD19 je antagonističko antitelo.
[0250] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0251] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo protiv CD19 koje sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili sva tri CDR izabrana od (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD19 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD19 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD19 sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0252] [0140] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR, uključujući: (a) CDR1 koji ima najmanje približno bilo koji od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:1; (b) CDR2 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2; i (c) CDR3 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:3. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, CDR koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CD19 jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD19. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 antitelo je afinitetno zrelo. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0253] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo protiv CD19 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD19 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD19 sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0254] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, V<H>H sekvenca koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CD19 jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD19. U nekim primerima izvođenja, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, inserirano i/ili deletirano u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima van CDR (tj. u FR). Izborno, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0255] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.
[0256] [0144] U nekim primerima, funkcionalni epitopi mogu biti mapirani kombinatornim skeniranjem alanina. U ovom postupku, kombinovana strategija skeniranja alanina može se koristiti za identifikaciju aminokiselina u CD19 proteinu koje su neophodne za interakciju sa jednodomenskim antitelima protiv CD19. U nekim primerima, epitop je konformacioni i kristalna struktura jednodomenskog antitela protiv CD19 vezanog za CD19 može se koristiti za identifikaciju epitopa. Kao referenca je otkriveno antitelo koje se specifično vezuje za isti epitop kao bilo koje od ovde datih jednodomenskih antitela protiv CD19. Na primer, postoji antitelo koje se vezuje za isti epitop kao jednodomensko antitelo protiv CD19 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.
[0257] Kao referenca, otkriveno je anti-CD19 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za CD19 konkurentno sa bilo kojim od ovde opisanih jednodomenskih antitela protiv CD19. U nekim primerima, kompetitivno vezivanje može biti određeno korišćenjem ELISA testa. Na primer, postoji antitelo koje se specifično vezuje za CD19 kompetitivno sa jednodomenskim antitelom protiv CD19 koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.76.
[0258] Kao referenca, opisano je anti-CD19 antitelo ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koje od gore opisanih anti-CD19 jednodomenskih antitela. U nekim primerima, anti-CD19 antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, anti-CD19 antitelo je fragment antitela, npr., V<H>H fragment. U nekim primerima, anti-CD19 antitelo je antitelo pune dužine koje sadrži samo teški lanac i sadrži Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što su IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimiziranu efektorsku funkciju.
[0259] Antitelo protiv CD19 (kao što je jednodomensko antitelo protiv CD19) ili protein koji vezuje antigen može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-7 „Karakteristike antitela“ u nastavku.
[0260] [0148] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD19 jednodomenska antitela (koja su uključena u CAR pronalaska). U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD19 jednodomensko antitelo, pri čemu nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja ima najmanje približno 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO:101. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 101. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor (npr., ekspresioni vektor) koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. Opisan je postupak za pravljenje anti-CD19 antitela, pri čemu postupak sadrži kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD19 antitelo, pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CD19 antitela, i izborno izolaciju anti-CD19 antitela iz ćelije domaćina (ili podloge za kulturu ćelija domaćina).
[0262] Jednodomenska antitela protiv CD20
[0264] Ovde su, kao referenca, otkrivena izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za CD20, kao što je humani CD20. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD20 modulira aktivnost CD20. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD20 je antagonističko antitelo.
[0265] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0266] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili sva tri CDR izabrana od (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0267] [0152] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:4; (b) CDR2 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:5; i (c) CDR3 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:6. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, CDR koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD20. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je afinitetno zrelo. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0268] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0269] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, V<H>H sekvenca koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD20. U nekim primerima izvođenja, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisana, inserirana i/ili deletirana u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima van CDR (tj. u FR). Izborno, anti-CD20 jednodomensko antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence.
[0270] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0271] U nekim primerima, funkcionalni epitopi mogu biti mapirani kombinatornim skeniranjem alanina. U ovom postupku, kombinovana strategija skeniranja alanina može se koristiti za identifikaciju aminokiselina u CD20 proteinu koje su neophodne za interakciju sa anti-CD20 jednodomenskim antitelima. U nekim primerima, epitop je konformacioni i kristalna struktura anti-CD20 jednodomenskog antitela vezanog za CD20 može se koristiti za identifikaciju epitopa. U nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za isti epitop kao bilo koje od ovde navedenih anti-CD20 jednodomenskih antitela. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-CD20 jednodomensko antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0272] Kao referenca, otkriveno je anti-CD20 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za CD20 kompetitivno sa bilo kojim od ovde opisanih anti-CD20 jednodomenskih antitela. U nekim primerima, kompetitivno vezivanje može biti određeno korišćenjem ELISA testa. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za CD20 kompetitivno sa anti-CD20 jednodomenskim antitelom koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77
[0273] Kao referenca, opisano je anti-CD20 antitelo ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koje od gore opisanih anti-CD20 jednodomenskih antitela. U nekim primerima, anti-CD20 antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, anti-CD20 antitelo je fragment antitela, npr., V<H>H fragment. U nekim primerima, anti-CD20 antitelo je antitelo pune dužine koje sadrži samo teški lanac i sadrži Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što su IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimiziranu efektorsku funkciju.
[0274] Antitelo protiv CD20 (kao što je jednodomensko antitelo protiv CD20) ili protein koji vezuje antigen može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-7 „Karakteristike antitela“ u nastavku.
[0275] [0160] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koje od anti-CD20 jednodomenskih antitela pronalaska. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD20 jednodomensko antitelo, pri čemu nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja ima najmanje približno 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO:102. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 102. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor (npr. vektor ekspresije) koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. Opisan je postupak za pripremu anti-CD20 antitela, pri čemu postupak sadrži kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD20 antitelo, pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CD20 antitela, i izborno izolaciju anti-CD20 antitela iz ćelije domaćina (ili podloge za kultivaciju ćelija domaćina).
[0277] Jednodomenska antitela protiv BCMA
[0279] Ovde su, kao referenca, otkrivena izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za BCMA, kao što je humani BCMA. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv BCMA modulira BCMA aktivnost. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv BCMA je antagonističko antitelo.
[0280] Antigen zrelih B ćelija (BCMA), takođe poznat kao CD269, član je superfamilije receptora faktora nekroze tumora, odnosno TNFRSF17 (Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192 (1):129‑135, 2000). Humani BCMA se skoro isključivo eksprimira u plazma ćelijama i ćelijama multiplog mijeloma (videti npr. Novak et al., Blood, 103(2): 689-694, 2004; Clinical Cancer Research, 73(19):5903‑5909; Felix et al., Mol. Oncology, 9(7):1348‑58, 2015). BCMA može da se veže za faktor aktiviranja B-ćelija (BAFF) i ligand koji uključuje proliferaciju (APRIL) (npr. Mackay et al., 2003 i Kalled et al., Immunological Review, 204: 43‑54, 2005). BCMA može biti pogodna meta tumorskog antigena za imunoterapeutske agense protiv multiplog mijeloma. Antitela visokog afiniteta mogu blokirati vezivanje između BCMA i njegovih nativnih liganda BAFF i APRIL. Jednodomenska antitela protiv BCMA mogu se koristiti u kombinaciji sa ćelijskom imunoterapijom korišćenjem CAR-T ćelija, na primer, da bi se pojačali citotoksični efekti protiv tumorskih ćelija.
[0281] [0163] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 78. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 79. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 80. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 81. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 82. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 83. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 85. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 86. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 87. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv BCMA je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv BCMA je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv BCMA sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0282] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili sva tri CDR izabrana od (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 7-17; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 18-28; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 29-39. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0283] [0165] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz SEQ ID NO:7-17; (b) CDR2 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 18-28; i (c) CDR3 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO:29-39. U nekim primerima izvođenja, CDR koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za BCMA. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je afinitetno zrelo. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0284] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR, uključujući: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0285] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0286] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0287] [0169] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0288] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0289] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0290] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0291] [0173] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0292] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0293] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0294] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0295] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 78-88. U nekim primerima izvođenja, V<H>H sekvenca koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr.
[0296] konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za BCMA. U nekim primerima izvođenja, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, inserirano i/ili deletirano u aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz SEQ ID NO: 78-88. U nekim primerima izvođenja, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima van CDR (tj. u FR). Izborno, jednodomensko antitelo protiv BCMA sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 78-88, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence.
[0297] [0178] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88.
[0298] U nekim primerima, funkcionalni epitopi mogu biti mapirani kombinatornim skeniranjem alanina. U ovom postupku, kombinovana strategija skeniranja alanina može se koristiti za identifikaciju aminokiselina u BCMA proteinu koje su neophodne za interakciju sa anti-BCMA jednodomenskim antitelima. U nekim primerima, epitop je konformacioni i kristalna struktura anti-BCMA jednodomenskog antitela vezanog za BCMA može se koristiti za identifikaciju epitopa. U nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za isti epitop kao bilo koje od ovde datih anti-BCMA jednodomenskih antitela. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-BCMA jednodomensko antitelo koje sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 78-88.
[0299] Kao referenca, otkriveno je anti-BCMA antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za BCMA kompetitivno sa bilo kojim od ovde opisanih anti-BCMA jednodomenskih antitela. U nekim primerima, kompetitivno vezivanje može se odrediti korišćenjem ELISA testa. Na primer, u nekim primerima postoji antitelo koje se specifično vezuje za BCMA kompetitivno sa anti-BCMA jednodomenskim antitelom koje sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 78-88.
[0300] Kao referenca, otkriveno je anti-BCMA antitelo ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koje od gore opisanih anti-BCMA jednodomenskih antitela. U nekim primerima, anti-BCMA antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, anti-BCMA antitelo je fragment antitela, npr., V<H>H fragment. U nekim primerima, anti-BCMA antitelo je antitelo pune dužine koje sadrži samo teški lanac i sadrži Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što su IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimiziranu efektorsku funkciju.
[0301] Anti-BCMA antitelo (kao što je anti-BCMA jednodomensko antitelo) ili protein koji vezuje antigen može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-7 „Karakteristike antitela“ u nastavku.
[0302] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-BCMA jednodomenska antitela sadržana u CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-BCMA jednodomensko antitelo, pri čemu nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 103-113. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 103-113. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor (npr. vektor ekspresije) koji sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. Opisan je postupak za pripremu anti-BCMA antitela, pri čemu postupak sadrži kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-BCMA antitelo, pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-BCMA antitela, i izborno izolaciju anti-BCMA antitela iz ćelije domaćina (ili podloge za kultivaciju ćelija domaćina).
[0304] Jednodomenska antitela protiv CD38
[0306] Ovde su, kao referenca, otkrivena izolovana jednodomenska antitela koja se specifično vezuju za CD38, kao što je humani CD38. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 modulira aktivnost CD38. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 je antagonističko antitelo.
[0307] CD38 je transmembranski glikoprotein tipa II koji se povezuje sa receptorima na površini ćelija, reguliše citoplazmatski Ca<2+>fluks i posreduje u prenosu signala u limfoidnim i mijeloidnim (Konopleva et al., J Immunol, 161:4702-8, 1998; Deaglio et al., Blood, 109:5390-8, 2007). Humani CD38 je visoko i ravnomerno eksprimiran na ćelijama mijeloma i eksprimiran je na relativno niskim nivoima na normalnim limfoidnim i mijeloidnim ćelijama i u nekim tkivima nehematopoetskog porekla, što ga čini potencijalnom postupkom u lečenju mijeloma (videti, na primer, Lin et al., Am J Clin Pathol, 2004, 121:482; H.M. Lokhorst et al., New Eng. J. Med., 2015, 373:13).
[0308] [0186] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 90. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 91. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 93. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 94. U nekim primerima izvođenja, postoji CAR pronalaska koji sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 95. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska koji sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 96. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska koji sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 97. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska koji sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 98. U nekim primerima izvođenja, postoji CAR pronalaska koji sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 99. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži jedan, dva ili sva tri CDR aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0309] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo protiv CD38 koje sadrži najmanje jedan, najmanje dva ili sva tri CDR izabrana od (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 40-51; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 52-63; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz SEQ ID NO: 64-75. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0310] [0188] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz SEQ ID NO:40-51; (b) CDR2 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO:52-63; i (c) CDR3 koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO:64-75. U nekim primerima izvođenja, CDR koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD38. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je afinitetno zrelo.
[0311] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo anti-CD38 koje sadrži tri CDR, uključujući: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0312] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo anti-CD38 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 41; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0313] [0191] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo protiv CD38 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 42; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0314] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo anti-CD38 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0315] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0316] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 57; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0317] [0195] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo protiv CD38 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo protiv CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0318] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-(.D38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0319] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo anti-CD38 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0320] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo anti-CD38 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 61; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0321] [0199] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 jednodomensko antitelo sadrži akceptorski humani okvir, npr., humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0322] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži jednodomensko antitelo anti-CD38 koje sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je kamelidno. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 je humanizovano. U nekim primerima izvođenja, jednodomensko antitelo anti-CD38 sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir.
[0323] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz SEQ ID NO: 89-100. U nekim primerima izvođenja, V<H>H sekvenca koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CD38. U nekim primerima izvođenja, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisana, inserirana i/ili deletirana u aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz SEQ ID NO: 89-100. U nekim primerima izvođenja, supstitucije, insercije ili delecije se javljaju u regionima van CDR (tj. u FR). Izborno, anti-CD38 jednodomensko antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz SEQ ID NO: 89-100, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence.
[0324] [0202] U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 91. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 91. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži V<H>H domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100. U nekim primerima izvođenja, CAR pronalaska sadrži polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100.
[0325] [0203] U nekim primerima, funkcionalni epitopi mogu biti mapirani kombinatornim skeniranjem alanina. U ovom postupku, kombinovana strategija skeniranja alanina može se koristiti za identifikaciju aminokiselina u CD38 proteinu koje su neophodne za interakciju sa anti-CD38 jednodomenskim antitelima. U nekim primerima, epitop je konformacioni i kristalna struktura anti-CD38 jednodomenskog antitela vezanog za CD38 može se koristiti za identifikaciju epitopa. U nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za isti epitop kao bilo koje od ovde navedenih anti-CD38 jednodomenskih antitela. Na primer, u nekim primerima postoji antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-CD38 jednodomensko antitelo koje sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 90-100.
[0326] Kao referenca, otkriveno je anti-CD38 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za CD38 kompetitivno sa bilo kojim od ovde opisanih jednodomenskih antitela protiv CD38. U nekim primerima, kompetitivno vezivanje može biti određeno korišćenjem ELISA testa. Na primer, u nekim primerima, postoji antitelo koje se specifično vezuje za CD38 kompetitivno sa jednodomenskim antitelom protiv CD38 koje sadrži bilo koju od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 89-100.
[0327] Kao referenca, opisano je anti-CD38 antitelo ili protein koji vezuje antigen koji sadrži bilo koje od gore opisanih anti-CD38 jednodomenskih antitela. U nekim primerima, anti-CD38 antitelo je monoklonsko antitelo, uključujući kamelidno, himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim primerima, anti-CD38 antitelo je fragment antitela, npr., V<H>H fragment. U nekim primerima, anti-CD38 antitelo je antitelo pune dužine koje sadrži samo teški lanac i sadrži Fc region bilo koje klase ili izotipa antitela, kao što su IgG1 ili IgG4. U nekim primerima, Fc region ima smanjenu ili minimiziranu efektorsku funkciju.
[0328] Antitelo protiv CD38 (kao što je jednodomensko antitelo protiv CD38) ili protein koji vezuje antigen može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-7 „Karakteristike antitela“ u nastavku.
[0329] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD38 jednodomenska antitela sadržanih u CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CD38 jednodomensko antitelo, pri čemu nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja ima najmanje približno 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 114-125. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 114-125. U nekim primerima izvođenja, vektor (npr., ekspresioni vektor) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. Opisan je postupak za pripremu anti-CD38 antitela, pri čemu postupak sadrži kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira anti-CD38 antitelo, pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CD38 antitela, i izborno izolaciju anti-CD38 antitela iz ćelije domaćina (ili podloge za kulturu ćelija domaćina).
[0330] Karakteristike antitela
[0332] 1. Afinitet antitela
[0334] U nekim primerima izvođenja, antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M).
[0335] Kd se može meriti testom vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA) koji se izvodi sa Fab verzijom ili V<H>H fragmentom antitela od interesa i njegovim antigenom kao što je opisano sledećim testom. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen meri se uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I)-obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pločom obloženom anti-Fab antitelom (videti, npr., Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881(1999)). Da bi se utvrdili uslovi za analizu, MICROTITER<®>ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) su preko noći obložene sa 5 µg/ml antitela za hvatanje Fab (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim blokirane sa 2% (tež./zapr.) goveđim serumskim albuminom u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U neadsorbentnoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigen se mešaju sa serijskim razblaženjima Fab od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija može da se nastavi duže vreme (npr., oko 65 sati) kako bi se osiguralo da se postigne ravnoteža. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi (npr., jedan sat). Rastvor se zatim uklanja i ploča ispira osam puta sa 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 µl/bunarčiću scintilacionog rastvora (MICROSCINT-20<™>; Packard), a ploče se očitavaju na TOPCOUNT<™>gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja biraju se za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.
[0336] [0210] Kd se može meriti korišćenjem testova površinske plazmonske rezonancije koristeći BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIACore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobilizovanim antigenskim CM5 čipovima na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilovani dekstranski biosenzorski čipovi (CM5, BIACORE, Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorid (EDC) i N-hidroksisukcinimid (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen se razblažuje sa 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre injekcije brzinom protoka od 5 µl/minut da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) spregnutog proteina. Nakon injekcije antigena, injektira se 1 M etanolamina da bi se blokirale nereagovane grupe. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab ili V<H>H antitela od interesa (0,78 nM do 500 nM) se ubrizgavaju u PBS sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20<™>) surfaktant (PBST) na 25°C pri brzini protoka od približno 25 µl/min. Brzine asocijacije (k<on>) i brzine disocijacije (k<off>) se izračunavaju korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Lengmuir-ovog modela vezivanja (BIACORE<®>Softver za evaluaciju verzije 3.2) istovremenim uklapanjem senzograma asocijacije i disocijacije. Konstanta ravnotežne disocijacije (Kd) se izračunava kao odnos k<off>/k<on>. Videti, npr., Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije prelazi 10<6>M<-1>s<-1>gore navedenim testom površinske plazmonske rezonancije, brzina reakcije može se odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescencije koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, propusni opseg od 16 nm) na 25°C 20 nM anti-antigenskog antitela (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena mereno spektrometrom, kao što je spektrometar opremljen zaustavnim protokom (Aviv Instruments) ili SLM-AMINCO serije 8000<™>spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa kivetom koja se meša.
[0338] 2. Fragmenti antitela
[0340] U nekim primerima, antitelo opisano ovde je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>, Fv i scFv fragmenti, V<H>H, i drugi fragmenti opisani u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Za pregled scFv fragmenata, videti, npr., Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269‑315 (1994); videti takođe WO 93/16185i U.S. Patenti br.5,571,894 i 5,587,458. Za diskusiju o Fab i F(ab')<2>fragmentima koji sadrže ostatke epitopa koji se vezuju za receptor za spasavanje i koji imaju povećano vreme poluraspada in vivo, videti U.S. Patent br. 5,869,046.
[0341] Diatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Holinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
[0342] Fragmenti antitela mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, proteolitičku digestiju intaktnog antitela, kao i proizvodnju rekombinantnim ćelijama domaćina (npr. E. coli ili fag), kao što je ovde opisano.
[0344] 3. Himerna i humanizovana antitela
[0346] U nekim primerima izvođenja, antitelo je himerno antitelo. Opisana su određena himerna antitela, npr., u U.S. Patentu br.4,816,567 i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851‑6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži varijabilni region koji nije humani (npr., varijabilni region izveden iz vrste kamile, kao što je lama) i humani konstantni region. U dodatnom primeru, himerno antitelo je antitelo sa „promenjenom klasom“ kod koga je klasa ili podklasa promenjena u odnosu na matično antitelo. Himerna antitela uključuju njihove fragmente koji vezuju antigen.
[0347] U nekim primerima izvođenja, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, uz zadržavanje specifičnosti i afiniteta matičnog ne-humanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima se nalaze HVR, npr., CDR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz ne-humanog antitela, a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci humanih antitela. Humanizovano antitelo će izborno takođe sadržati barem deo humanog konstantnog regiona. U nekim primerima izvođenja, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima iz ne-humanog antitela (npr., antitelo iz kojeg su izvedeni HVR ostaci), npr., da se obnovi ili poboljša specifičnost ili afinitet antitela.
[0348] Razmatraju se humanizovana antitela i postupci njihove pripreme, npr., u Almagro and Franson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)), i dalje su opisani, npr., u Riechmann et al., Nature 332:323‑329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029‑10033 (1989); US Patentima br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25‑34 (2005) (opisuje SDR (a-CDR) graftovanje); Padlan, Mol. Immunol. 28:489‑498 (1991) (opisuje "površinsko presvlačenje"); Dall’ Acqua et al., Methods 36:43‑60 (2005) (opisuje "FR mešanje"); i Osbourn et al., Methods 36:61‑68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252‑260 (2000) (opisuje pristup „vođenog izbora“ za FR mešanje).
[0349] [0217] Regioni humanog okvira koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: regione okvira odabrane korišćenjem postupka „najboljeg poklapanja“ (videti, npr., Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); okvirni regioni izvedeni iz konsenzusne sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humani zreli (somatski mutirani) okvirni regioni ili okvirni regioni humane germinativne linije (videti, npr., Almagro and Franson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirni regioni izvedeni iz skrininga FR biblioteka (videti, npr., Baca et al., J. Biol. Chem.
[0350] 272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
[0351] U nekim primerima izvođenja, jednodomenska antitela su modifikovana, kao što su humanizovana, bez smanjenja prirodnog afiniteta domena za antigen i uz smanjenje njegove imunogenosti u odnosu na heterolognu vrstu. Na primer, aminokiselinski ostaci varijabilnog domena antitela (V<H>H) antitela lame može se odrediti, i jedna ili više aminokiselina kamelida, na primer, u okvirnim regionima, zamenjuju se svojim humanim pandanom kao što se nalazi u humanoj konsenzusnoj sekvenci, bez gubitka tipičnog karaktera polipeptida, tj. humanizacija ne utiče značajno na kapacitet vezivanja antigena rezultujućeg polipeptida. Humanizacija jednodomenskih antitela kamelida zahteva uvođenje i mutagenezu ograničene količine aminokiselina u jednom polipeptidnom lancu. Ovo je u suprotnosti sa humanizacijom scFv, Fab', (Fab')2 i IgG, koja zahteva uvođenje promena aminokiselina u dva lanca, lakom i teškom lancu, i očuvanje sklopa oba lanca.
[0352] Jednodomenska antitela koja sadrže V<H>H domen mogu biti humanizovana tako da imaju sekvence slične humanim. U nekim primerima izvođenja, FR regioni V<H>H domena koji se ovde koristi sadrže najmanje bilo koju od oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više homologije aminokiselinske sekvence sa humanim V<H>okvirnim regionima. Jedna primer klase humanizovanih V<H>H domen karakteriše se time što V<H>H nose aminokiselinu iz grupe koja se sastoji od glicina, alanina, valina, leucina, izoleucina, prolina, fenilalanina, tirozina, triptofana, metionina, serina, treonina, asparagina ili glutamina na poziciji 45, kao što je, na primer, L45 i triptofan na poziciji 103, prema Kabat numeraciji. Kao takvi, polipeptidi koji pripadaju ovoj klasi pokazuju visoku homologiju aminokiselinske sekvence sa humanim V<H>okvirnim regionima i navedeni polipeptidi mogu se direktno primenjivati na čoveka bez očekivanja neželjenog imunog odgovora i bez tereta dalje humanizacije.
[0353] [0220] Još jedna primer klase humanizovanih jednodomenskih antitela kamelida opisan je u WO 03/035694 i sadrži hidrofobne FR2 ostatke koji se tipično nalaze u konvencionalnim antitelima humanog porekla ili drugih vrsta, ali kompenzuje ovaj gubitak hidrofilnosti naelektrisanim argininskim ostatkom na poziciji 103 koji zamenjuje konzervirani triptofanski ostatak prisutan u V<H>dvolančanih antitela. Kao takvi, peptidi koji pripadaju ovim dvema klasama pokazuju visoku homologiju aminokiselinske sekvence sa humanim V<H>okvirnim regionima i pomenuti peptidi mogu se direktno primenjivati na čoveka bez očekivanja neželjenog imunog odgovora i bez tereta dalje humanizacije.
[0355] 4. Humana antitela
[0357] Antitelo može biti humano antitelo. Humana antitela mogu se proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su generalno opisana u van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368‑74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.
[0358] 20:450‑459 (2008). Transgeni miševi ili pacovi sposobni da proizvode potpuno humana jednodomenska antitela su poznati u struci. Videti, npr., US20090307787A1, U.S. Pat. br.
[0359] 8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1 i WO2Z004049794.
[0360] Humana antitela mogu se pripremiti primenom imunogena transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje obično sadrže sve ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, koji zamenjuju endogene imunoglobulinske lokuse, ili koji su prisutni ekstrahromozomalno ili nasumično integrisani u hromozome životinje. Kod takvih transgenih miševa, endogeni imunoglobulinski lokusi su generalno inaktivirani. Za pregled postupak za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja, videti Lonberg, Nac. Biotehn. 23:1117-1125 (2005). Vidi takođe, npr., U.S. Patenti br.6,075,181 i 6,150,584 opisuju XENOMOUSE<™>tehnologiju; U.S. Patent br. 5,770,429 opisuje HUMAB<®>tehnologiju; U.S. Patent br.7,041,870 opisuje K-M MOUSE<®>tehnologiju i publikacija američke patentne prijave br. US 2007/0061900, opisuje VELOCIMOUSE<®>tehnologiju). Humani varijabilni regioni iz intaktnih antitela koje generišu takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr., kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
[0361] [0223] Humana antitela se takođe mogu napraviti postupcima zasnovanim na hibridomima. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. Videti, npr., Kozbor J. Imunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51‑63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).). Humana antitela generisana tehnologijom hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557‑3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz hibridomskih ćelijskih linija) i Ni, Ksiandai Mianiikue, 26(4):265-268 (2006)) (opisuje humane-humane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (Trioma tehnologija) je takođe opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927‑937 (2005) i Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185‑91 (2005).
[0362] Humana antitela se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona odabranih iz biblioteka faga izvedenih iz ljudi. Takve sekvence varijabilnog domena se zatim mogu kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za selekciju humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
[0363] Jedna tehnika za dobijanje V<H>H sekvence usmerene protiv određenog antigena ili cilja uključuju odgovarajuću imunizaciju transgenog sisara koji je sposoban da eksprimira antitela teškog lanca (tj. tako da izazove imuni odgovor i/ili antitela teškog lanca usmerena protiv navedenog antigena ili cilja), dobijanje odgovarajućeg biološkog uzorka od navedenog transgenog sisara koji sadrži (sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju) navedene V<H>H sekvence (kao što su uzorak krvi, uzorak seruma ili uzorak B-ćelija), a zatim generisanje V<H>H sekvence usmerene protiv navedenog antigena ili cilja, počevši od navedenog uzorka, korišćenjem bilo koje pogodne tehnike poznate same po sebi (kao što je bilo koja od ovde opisanih metoda ili hibridomska tehnika). Na primer, za ovu svrhu, mogu se koristiti miševi koji eksprimiraju antitela teškog lanca i dodatni postupci i tehnike opisane u WO 02/085945, WO 04/049794 i WO 06/008548 i Janssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Oct. 10; 103(41):15130-53. Na primer, takvi miševi koji eksprimiraju antitela teškog lanca mogu eksprimirati antitela teškog lanca sa bilo kojim odgovarajućim (pojedinačnim) varijabilnim domenom, kao što su (pojedinačni) varijabilni domeni iz prirodnih izvora (npr. humani (pojedinačni) varijabilni domeni, kamelidni (pojedinačni) varijabilni domeni ili ajkulini (pojedinačni) varijabilni domeni), kao i na primer sintetički ili polusintetički (pojedinačni) varijabilni domeni.
[0365] 5. Antitela izvedena iz biblioteke
[0367] [0226] Antitela se mogu izolovati skriningom kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci je poznat niz postupaka za generisanje biblioteka fagnog prikaza i skrining takvih biblioteka za antitela koja poseduju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su pregledno dati u, npr., u Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1‑37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i dodatno opisane u, npr., u McCafferty et al., Nature 348:552‑554; Clackson et al., Nature 352: 624‑628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581‑597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161‑175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299‑310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073‑1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467‑12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1‑2): 119‑132(2004). Postupci za konstruisanje biblioteka antitela sa jednim domenom su opisane, na primer, videti U.S. Pat. br.7371849.
[0368] U određenim postupcima prikazivanja faga, repertoari V<H>i V<L>gena se odvojeno kloniraju polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) i nasumično rekombinuju u fagnim bibliotekama, koje se zatim mogu podvrgnuti skriningu na fage koji vezuju antigen, kao što je opisano u Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)). Fagi tipično prikazuju fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora obezbeđuju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr., od čoveka) da bi se obezbedio jedinstveni izvor antitela na širok spektar nesopstvenih, kao i sopstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kako je opisano od strane Griffits et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Konačno, naivne biblioteke se takođe mogu napraviti sintetički kloniranjem nepreuređenih V-genskih segmenata iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže slučajnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preuređenja. in vitro, kako je opisano od strane Hoogenboom and Vinter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br. 5,750,373i US Patentne objave br. 2005 0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
[0369] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
[0371] 6. Multispecifična antitela
[0373] Antitelo može biti multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. Jedna od specifičnosti vezivanja može biti za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, BCMA i CD38, a druga je za bilo koji drugi antigen. Bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa antigena izabranog iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, BCMA i CD38. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, BCMA i CD38.
[0374] Bispecifična antitela mogu se pripremiti kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela. Tehnike za pripremu multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva para teškog i lakog lanca imunoglobulina koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), i inženjering „dugme u rupi“ (videti, npr., U.S. Patent br.
[0375] 5,731,168). Multispecifična antitela mogu se takođe napraviti inženjeringom elektrostatičkih efekata upravljanja za stvaranje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); unakrsnim vezivanjem dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr., US Patent br.4,676,980 i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); korišćenjem leucinskih rajsferšlusa za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr., Kostelni et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); korišćenjem „diatelo“ tehnologije za pripremu bispecifičnih fragmenata antitela (videti, npr., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr., Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr., u Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991); i stvaranjem polipeptida koji sadrže tandemska jednodomenska antitela (vidi, npr., U.S. Patentnu prijavu br. 20110028695 i Conrath et al. J. Biol. Chem., 2001; 276(10):7346-50). Inženjeringom konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta za vezivanje antigena, uključujući „antitela hobotnice“, takođe su ovde uključena (videti, npr., US 2006/0025576A1).
[0377] 7. Varijante antitela
[0379] U nekim primerima izvođenja, razmatraju se varijante aminokiselinske sekvence antitela. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinske sekvence antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira antitelo ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije iz i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinske sekvence antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije može se napraviti da bi se dobio konačni konstrukt, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike, npr., vezivanje antigena.
[0381] a) Varijante supstitucije, insercije i delecije
[0383] [0232] U nekim primerima izvođenja, obezbeđene su varijante antitela koje imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 3 pod naslovom „Poželjne supstitucije“. Značajnije promene su date u Tabeli 3 pod naslovom „primeri supstitucija“, i kao što je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama bočnih lanaca aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu se uvesti u antitelo od interesa, a proizvodi se mogu testirati na željenu aktivnost. npr., zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost ili poboljšani ADCC ili CDC.
[0385] TABELA 3. Supstitucije aminokiselina
[0388]
[0391] Aminokiseline se mogu grupisati prema zajedničkim svojstvima bočnih lanca:
[0393] (1) hidrofobni: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[0394] (2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[0395] (3) kiseli: Asp, Glu;
[0396] (4) bazni: His, Lys, Arg;
[0397] (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
[0398] (6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.
[0400] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati supstituciju člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0401] Jedna vrsta supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr., humanizovano ili humano antitelo). Generalno, rezultujuća varijanta(e) odabrana za dalja istraživanja imaće modifikacije (npr., poboljšanja) određenih bioloških svojstava (npr., povećan afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će u suštini zadržati određena biološka svojstva matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je antitelo sa zrelim afinitetom, koje se može pogodno generisati, npr., koristeći tehnike afinitetnog sazrevanja zasnovane na fagnom prikazu, kao što su one opisane ovde. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani i varijantna antitela su prikazana na fagu i podvrgnuta skriningu u odnosu na određenu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja).
[0402] Izmene (npr., supstitucije) mogu se vršiti u HVR, npr., da bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu se napraviti u „vrućim tačkama“ HVR tj., ostacima kodiranim kodonima koji podležu mutacijama sa velikom frekvencijom tokom procesa somatskog sazrevanja (videti, npr., Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008))), i/ili SDR (a-CDR), sa rezultujućom varijantom V<H>ili V<L>testira se na afinitet vezivanja. Opisano je sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnom selekcijom iz sekundarnih biblioteka, npr., u Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1‑37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). U nekim primerima izvođenja afinitetnog sazrevanja, raznolikost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje bilo kojim od različitih postupaka (npr., PCR sklona greškama, mešanje lanca ili mutageneza usmerena oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim podvrgava skriningu da bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznolikosti uključuje HVR-usmerene pristupe, u kojima nekoliko HVR ostataka (npr., 4-6 ostaci u datom trenutku) su randomizovani. HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr., korišćenjem mutageneze ili modeliranja skeniranja alaninom. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
[0403] U nekim primerima izvođenja, supstitucije, insercije ili delecije mogu se javiti unutar jednog ili više HVR, sve dok takve promene značajno ne smanjuju sposobnost antitela da se veže za antigen. Na primer, konzervativne promene (npr., konzervativne supstitucije kao što je ovde navedeno) koje značajno ne smanjuju afinitet vezivanja mogu se napraviti u HVR. Takve izmene mogu biti izvan HVR „vrućih tačaka“ ili CDR. U nekim primerima izvođenja varijante V<H>H sekvence date gore, svaki HVR je ili nepromenjen ili sadrži ne više od jedne, dve ili tri aminokiselinske supstitucije.
[0404] Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranja alanina“, kako je opisano od strane Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081‑1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr., naelektrisani ostaci kao što su Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr., alanin ili polialanin) da bi se utvrdilo da li je interakcija antitela sa antigenom pogođena. Dalje supstitucije mogu se uvesti na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu podvrgnuti skriningu da bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0405] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencne insercije jodnog ili više aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge insercione varijante molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C-terminalom antitela na enzim (npr., za ADEPT) ili polipeptid koji povećava poluživot antitela u serumu.
[0407] b) Varijante glikozilacije
[0409] U nekim primerima izvođenja, antitelo se menja da bi se povećao ili smanjio stepen glikozilacije antitela. Adicija ili delecija mesta glikozilacije na antitelu može se pogodno postići promenom aminokiselinske sekvence tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
[0410] Tamo gde antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrat vezan za njega može biti izmenjen. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara obično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Vidi, npr., Wright et al.
[0411] TIBTECH 15:26‑32 (1997). Oligosaharid može da sadrži različite ugljene hidrate, npr., manoza, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u „stablu“ dvoantenske oligosaharidne strukture. U nekim primerima izvođenja, modifikacije oligosaharida u antitelu mogu se izvršiti kako bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0412] U nekim primerima izvođenja, varijante antitela imaju ugljenohidratnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze unutar šećernog lanca na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr., kompleksne, hibridne i strukture sa visokim sadržajem manoze) mereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, kao što je opisano u WO 2008/077546, na primer. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi oko pozicije 297 u Fc regionu (EU numeracija ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 se takođe može nalaziti oko ± 3 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od pozicije 297, tj., između pozicija 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvenci u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu imati poboljšanu ADCC funkciju. Vidi, npr., američke patentne publikacije US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ ili „fukozno-deficijentne“ varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239‑1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije kojima nedostaje fukozilacija proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533‑545 (1986); američka patentna prijava br. US 2003/0157108 A1, Presta, Li WO 2004/056312 A1, Adams et al., posebno u Primeru 11), i ćelijske linije sa nokautom, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokautirane CHO ćelije (videti, npr., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, I. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
[0413] Varijante antitela su dodatno snabdevene bisekovanim oligosaharidima, npr., u kome je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela presečen pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr., u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent br.
[0414] 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu imati poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr., u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0416] c) Varijante Fc regiona
[0418] Jedna ili više modifikacija aminokiselina mogu biti uvedene u Fc region antitela, čime se generiše varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr., Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednoj ili više pozicija aminokiselina.
[0419] Varijanta antitela može posedovati neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je važan poluživot antitela in vivo, ali određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC) su nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti da bi se potvrdilo smanjenje/deplecija aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja za Fc receptor (FcR) mogu se sprovesti da bi se osiguralo da antitelo nema vezivanje za FcR (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII), dok monociti eksprimiraju Fc(RI), Fc(RII) i Fc(RIII). Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je sumirana u Tabeli 3 na strani 464 od Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisani su u U.S. Patentu br. 5,500,362 (videti, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. SAD 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. SAD 82:1499-1502
[0420] [0246] (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu se koristiti postupci ispitivanja koje ne koriste radioaktivne metode (vidi, na primer, ACTI<™>neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>test neradioaktivne citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i prirodne ćelije ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može se proceniti ADCC aktivnost molekula od interesa in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj objavljen u Clines et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu se takođe sprovesti kako bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da se veže za C1q i stoga nema CDC aktivnost. Vidi, npr., ELISA za vezivanje C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045‑1052 (2003); i Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738‑2743 (2004)). Vezivanje FcRn i in vivo određivanje klirensa/poluživota mogu se takođe izvršiti korišćenjem postupaka poznatih u struci (videti, npr., Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).
[0421] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više aminokiselinskih pozicija 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (US Patent br.7,332,581).
[0422] Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. Videti, npr., U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591‑6604 (2001)).
[0423] Varijanta antitela može da sadrži Fc region sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje poboljšavaju ADCC, npr., supstitucije na pozicijama 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
[0424] U Fc regionu mogu se napraviti izmene koje dovode do izmenjenih (tj., bilo poboljšano ili smanjeno) vezivanje C1q i/ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), npr., kao što je opisano u US Patentu br.6,194,551, WO 99/51642 i Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
[0425] Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinskih IgG na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976)) i Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), opisani su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija u njemu koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr., supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br. 7,371,826).
[0426] Videti takođe Duncan & Winter, Nature 322:738‑40 (1988); U.S. Patent br.5,648,260; U.S. Patent br.5,624,821i WO 94/29351 u vezi sa drugim primerima varijanti Fc regiona.
[0428] d) Varijante antitela sa cisteinom dobijene inženjeringom
[0429] U nekim primerima izvođenja, može biti poželjno inženjeringom kreirati antitela sa cisteinom, npr., „tioMAb“, u kojima je jedan ili više ostataka antitela supstituisano ostacima cisteina. U određenim primerima izvođenja, supstituisani ostaci se javljaju na pristupačnim mestima antitela. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolne grupe se time pozicioniraju na pristupačnim mestima antitela i mogu se koristiti za konjugaciju antitela sa drugim delovima, kao što su delovi leka ili delovi linkera-leka, da bi se stvorio imunokonjugat, kao što je dalje opisano ovde. U nekim primerima izvođenja, bilo koji jedan ili više sledećih ostataka mogu biti supstituisani cisteinom: A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela konstruisana cisteinom mogu se generisati kao što je opisano, npr., u U.S. Patentu br.7,521,541.
[0431] e) Derivati antitela
[0433] U nekim primerima izvođenja, antitelo može biti dalje modifikovano da bi sadržalo dodatne neproteinske delove koji su poznati u struci i lako dostupni. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliaminokiseline (bilo homopolimere ili slučajne kopolimere) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere propilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr., glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može varirati, a ako je vezano više od jednog polimera, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja koja uključuju, ali nisu ograničena na, posebna svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
[0434] [0255] U nekim primerima izvođenja postoje konjugati antitela i neproteinskog dela koji se mogu selektivno zagrejati izlaganjem zračenju. U nekim primerima izvođenja, neproteinski deo je ugljenična nanocev (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali nije ograničeno na, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski deo do temperature na kojoj su ćelije proksimalno neproteinskom delu antitela ubijene.
[0436] Postupci pripreme
[0438] Antitela (kao što su jednodomenska antitela) opisana ovde mogu se pripremiti korišćenjem bilo kojih postupaka poznatih u struci ili kao što je ovde opisano.
[0439] Opisani su postupci za pripremu jednodomenskih antitela. Videti, na primer, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674. Jednodomenska antitela (kao što je V<H>Hs) mogu se dobiti korišćenjem postupaka poznatih u struci, kao što je imunizacija kamelidne vrste (kao što su kamila ili lama) i dobijanje hibridoma od njih, ili kloniranjem biblioteke jednodomenskih antitela korišćenjem tehnika molekularne biologije poznatih u struci i naknadnom selekcijom pomoću ELISA sa pojedinačnim klonovima neselektovanih biblioteka ili korišćenjem fagnog prikaza.
[0440] Za rekombinantnu proizvodnju jednodomenskih antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju jednodomenska antitela se izoluju i ubacuju u replicirajući vektor za dalje kloniranje (amplifikaciju DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira jednodomensko antitelo se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Dostupno je mnogo vektora. Izbor vektora delimično zavisi od ćelije domaćina koja se koristi. Generalno, poželjne ćelije domaćina su prokariotskog ili eukariotskog (uglavnom sisarskog) porekla.
[0442] 1. Poliklonska antitela
[0444] [0259] Poliklonska antitela se generalno dobijaju kod životinja višestrukim potkožnim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama relevantnog antigena i adjuvansa. Može biti korisno konjugovati relevantni antigen sa proteinom koji je imunogen kod vrste koja se imunizuje. npr., hemocijanin iz mekušca „keyhole limpet“ (KLH), serumski albumin, goveđi tiroglobulin ili inhibitor sojinog tripsina, korišćenjem bifunkcionalnog ili derivatizujućeg sredstva, npr., maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija preko ostataka cisteina), N-hidroksisukcinimid (preko ostataka lizina), glutaraldehid, jantarni anhidrid, SOCl<2>, ili R1N=C=NR, gde R i R<1>su nezavisno niže alkil grupe. Primeri adjuvansa koji se mogu koristiti uključuju Freund kompletni adjuvans i MPL-TDM adjuvans (monofosforil lipid A, sintetički trehaloza dikorinomikolat). Protokol imunizacije može odabrati stručnjak u ovoj oblasti bez prekomernog eksperimentisanja.
[0445] Životinje se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombinovanjem, npr., 100 µg ili 5 µg proteina ili konjugata (za zečeve odnosno miševe) sa 3 zapremine Freund kompletnog adjuvansa i ubrizgavanje rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije, životinje se busteruju sa 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Freund kompletnom adjuvansu potkožnom injekcijom na više mesta. Sedam do četrnaest dana kasnije, životinjama se uzima krv i serum se testira na titar antitela. Životinje se busteruju dok se titar ne stabilizuje. Konjugati se takođe mogu napraviti u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao proteinske fuzije. Takođe, agensi za agregaciju poput stipse su pogodni za pojačavanje imunog odgovora.
[0447] 2. Monoklonska antitela
[0449] Monoklonska antitela se dobijaju iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i/ili posttranslacionih modifikacija (npr., izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Dakle, modifikator „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela kao da nije mešavina diskretnih antitela.
[0450] Na primer, monoklonska antitela mogu biti napravljena korišćenjem hibridomskog postupka koju je prvi put opisao Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili se mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK (U.S. Pat. br.4,816,567).
[0451] U hibridomskom postupku, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, imunizuje se kao što je gore opisano da bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti se mogu imunizovati in vitro. Limfociti se zatim fuzionišu sa ćelijama mijeloma korišćenjem odgovarajućeg sredstva za fuziju, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala hibridomska ćelija (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
[0452] [0264] Imunizacioni agens će tipično uključivati antigeni protein ili njegovu fuzionu varijantu. Generalno, koriste se ili limfociti periferne krvi („PBL“) ako su potrebne ćelije humanog porekla, ili ćelije slezine ili limfnih čvorova ako su potrebni izvori sisara koji nisu ljudi. Limfociti se zatim fuziraju sa immortalizovanom ćelijskom linijom korišćenjem odgovarajućeg agensa za fuziju, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala hibridomska ćelija (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59‑103 (Academic Press, 1986)).
[0453] Immortalizovane ćelijske linije su obično transformisane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma glodarskog, goveđeg i humanog porekla. Obično se koriste ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Tako pripremljene hibridomske ćelije se seju i gaje u odgovarajućoj podlozi za kultivaciju koja poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, matičnih ćelija mijeloma. Na primer, ako matičnim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), podloga za kultivaciju hibridoma će obično uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT podloga), koje su supstance koje sprečavaju rast ćelija sa nedostatkom HGPRT.
[0454] Poželjne imortalizovane ćelije mijeloma su one koje se efikasno spajaju, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela na visokom nivou od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Među njima, poželjne su linije mišjeg mijeloma, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 tumora miša dostupnih od Centra za distribuciju ćelija Instituta Salk, San Dijego, Kalifornija, SAD, i SP-2 ćelije (i njihovi derivati, npr., X63-Ag8-653) dostupan iz Američke kolekcije tipskih kultura, Manasas, Virdžinija, SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma su takođe opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Imunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
[0455] Podloga za kultivaciju u kojoj rastu hibridomske ćelije se testira na proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena. Poželjno je da se specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koje proizvode hibridonske ćelije određuje imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunološki test (RIA) ili enzimski imunosorbentni test (ELISA).
[0456] Podloga za kultivaciju u kojoj se kultivišu hibridomske ćelije može se testirati na prisustvo monoklonskih antitela usmerenih protiv željenog antigena. Poželjno je da se afinitet vezivanja i specifičnost monoklonskog antitela mogu odrediti imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunološki test (RIA) ili enzimski test (ELISA). Takve tehnike i testovi su poznati u struci. Na primer, afinitet vezivanja može se odrediti Scatchard analizom iz Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0457] [0269] Nakon što se identifikuju hibridomske ćelije koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi se mogu subklonirati postupcima ograničavajućeg razblaživanja i uzgajati standardnim metodama (Goding, supra). Pogodne podloge za kultivaciju u ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 podlogu. Pored toga, hibridomske ćelije se mogu uzgajati in vivo kao tumori kod sisara.
[0458] Monoklonska antitela koja luče subklonovi su na odgovarajući način odvojena od podloge za kultivaciju, ascitne tečnosti ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, protein A-sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0459] Monoklonska antitela se takođe mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK, kao što su oni opisane u U.S. Pat. br. 4,816,567, i kao što je gore opisano. DNK koja kodira monoklonska antitela se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Hibridomske ćelije služe kao poželjni izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK se može staviti u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćina kao što su ćelije Escherichia coli, ćelije majmunskog COS tipa, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, kako bi se sintetizovala monoklonska antitela u takvim rekombinantnim ćelijama domaćinima. Pregledni članci o rekombinantnoj ekspresiji DNK koja kodira antitelo u bakterijama uključuju Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993)) i Pliickthun, Immunol. Revs.
[0460] 130:151-188 (1992)).
[0461] Antitela se mogu izolovati iz biblioteka faga antitela generisanih korišćenjem tehnika opisanih u McCafferty et al., Nature, 348:552‑554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624‑628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581‑597 (1991) opisuju izolaciju mišjih i humanih antitela, respektivno, korišćenjem fagnih biblioteka. Naknadne publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokog afiniteta (nM opseg) premeštanjem lanca (Marks et al., Bio/Technology, 10:779‑783 (1992)), kao i kombinatorna infekcija i in vivo rekombinacija kao strategija za konstruisanje veoma velikih fagnih biblioteka (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265‑2266 (1993)). Stoga, ove tehnike su održive alternative tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonskih antitela za izolaciju monoklonskih antitela.
[0462] [0273] DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca umesto homolognih mišjih sekvenci (U.S. Pat. br.4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ili kovalentnim spajanjem sa kodirajućom sekvencom imunoglobulina cele ili dela kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid. Tipično, takvi neimunoglobulinski polipeptidi se supstituišu konstantnim domenima antitela ili se supstituišu varijabilnim domenima jednog mesta za kombinovanje antigena antitela da bi se stvorilo himerno bivalentno antitelo koje sadrži jedno mesto za kombinovanje antigena koje ima specifičnost za antigen i drugo mesto za kombinovanje antigena koje ima specifičnost za drugi antigen.
[0463] Monoklonska antitela opisana ovde mogu biti monovalentna, čija je priprema dobro poznata u struci. Na primer, jedan postupak uključuje rekombinantnu ekspresiju lakog lanca imunoglobulina i modifikovanog teškog lanca. Teški lanac je generalno skraćen na bilo kojoj tački u Fc regionu kako bi se sprečilo umrežavanje teškog lanca. Alternativno, relevantni ostaci cisteina mogu biti supstituisani drugim ostatkom aminokiseline ili su izbrisani kako bi se sprečilo unakrsno vezivanje. In vitro postupci su takođe pogodni za pripremu monovalentnih antitela. Digestija antitela da bi se proizveli njihovi fragmenti, posebno Fab fragmenti, može se izvršiti korišćenjem rutinskih tehnika poznatih u struci.
[0464] Himerna ili hibridna antitela se takođe mogu pripremiti in vitro korišćenjem poznatih postupaka u sintetičkoj hemiji proteina, uključujući one koje uključuju sredstva za unakrsno vezivanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati korišćenjem reakcije disulfidne razmene ili formiranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.
[0466] 3. Rekombinantna proizvodnja u prokariotskim ćelijama
[0468] a) Konstrukcija vektora
[0470] [0276] Sekvence polinukleinskih kiselina koje kodiraju antitela sadržana u CAR pronalaska mogu se dobiti korišćenjem standardnih rekombinantnih tehnika. Željene sekvence polinukleinskih kiselina mogu se izolovati i sekvencirati iz ćelija koje proizvode antitela, kao što su ćelije hibridoma. Alternativno, polinukleotidi se mogu sintetizovati korišćenjem sintetizatora nukleotida ili PCR tehnika. Nakon dobijanja, sekvence koje kodiraju polipeptide se ubacuju u rekombinantni vektor sposoban za replikaciju i ekspresiju heterolognih polinukleotida u prokariotskim domaćinima. Mnogi vektori koji su dostupni i poznati u struci mogu se koristiti u svrhu ovog pronalaska. Izbor odgovarajućeg vektora zavisiće uglavnom od veličine nukleinskih kiselina koje treba ubaciti u vektor i određene ćelije domaćina koja treba da se transformiše vektorom. Svaki vektor sadrži različite komponente, u zavisnosti od njegove funkcije (amplifikacija ili ekspresija heterolognog polinukleotida, ili oba) i njegove kompatibilnosti sa određenom ćelijom domaćinom u kojoj se nalazi. Komponente vektora generalno uključuju, ali nisu ograničene na: mesto početka replikacije, gen selekcionog markera, promotor, mesto vezivanja ribozoma (RBS), signalnu sekvencu, insert heterologne nukleinske kiseline i sekvencu za terminaciju transkripcije.
[0471] Generalno, plazmidni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence izvedene iz vrsta kompatibilnih sa ćelijom domaćinom koriste se u vezi sa ovim domaćinima. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i markerske sekvence koje su sposobne da obezbede fenotipsku selekciju u transformisanim ćelijama. Na primer, E. coli se tipično transformiše korišćenjem pBR322, plazmida izvedenog iz E. coli vrsta. pBR322 sadrži gene koji kodiraju otpornost na ampicilin (Amp) i tetraciklin (Tet) i stoga obezbeđuje jednostavan način za identifikaciju transformisanih ćelija. pBR322, njegovi derivati ili drugi mikrobni plazmidi ili bakteriofagi mogu takođe sadržati, ili biti modifikovani da sadrže, promotore koje mikrobni organizam može koristiti za ekspresiju endogenih proteina. Primeri derivata pBR322 koji se koriste za ekspresiju određenih antitela detaljno su opisani u knjizi Carter et al., U.S. Pat. br.5,648,237.
[0472] Pored toga, fagni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su kompatibilne sa mikroorganizmom domaćinom mogu se koristiti kao transformišući vektori u vezi sa ovim domaćinima. Na primer, bakteriofagi kao što je GEM<™>-11 se može koristiti u pripremi rekombinantnog vektora koji se može koristiti za transformaciju osetljivih ćelija domaćina kao što su Escherichia coli LE392.
[0473] Ekspresioni vektor može da sadrži dva ili više parova promotor-cistron, koji kodiraju svaku od polipeptidnih komponenti. Promotor je neprevedena regulatorna sekvenca koja se nalazi uzvodno (5') od cistrona i modulira njegovu ekspresiju. Prokariotski promotori se obično dele u dve klase, inducibilne i konstitutivne. Inducibilni promotor je promotor koji inicira povećane nivoe transkripcije cistrona pod svojom kontrolom kao odgovor na promene u uslovima kulture npr. prisustvo ili odsustvo hranljive materije ili promena temperature.
[0474] Veliki broj promotora koje prepoznaju razne potencijalne ćelije domaćina je dobro poznat. Odabrani promotor može biti operativno povezan sa cistronskom DNK koja kodira laki ili teški lanac uklanjanjem promotora iz izvorne DNK putem digestije restrikcionim enzimima i umetanjem izolovane promotorske sekvence u vektor. I prirodna promotorska sekvenca i mnogi heterologni promotori mogu se koristiti za usmeravanje amplifikacije i/ili ekspresije ciljnih gena. Heterologni promotori se mogu koristiti, jer generalno omogućavaju veću transkripciju i veći prinos eksprimiranog ciljnog gena u poređenju sa prirodnim promotorom ciljnog polipeptida.
[0475] [0281] Promotori pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju PhoA promotor, sisteme promotora galaktamaze i laktoze, sistem promotora triptofana (trp) i hibridne promotore kao što su tac ili trc promotor. Međutim, pogodni su i drugi promotori koji su funkcionalni u bakterijama (kao što su drugi poznati bakterijski ili fagni promotori). Njihove sekvence nukleinskih kiselina su objavljene, što omogućava stručnjaku da ih operativno veže sa cistronima koji kodiraju ciljne lake i teške lance (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) korišćenjem linkera ili adaptera za obezbeđivanje svih potrebnih restrikcionih mesta.
[0476] U jednom aspektu, svaki cistron unutar rekombinantnog vektora sadrži komponentu sekrecione signalne sekvence koja usmerava translokaciju eksprimiranih polipeptida preko membrane. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora ili može biti deo DNK ciljnog polipeptida koji je umetnut u vektor. Signalna sekvenca odabrana za potrebe ovog pronalaska treba da bude ona koja se prepoznaje i obrađuje (tj. cepa signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju signalne sekvence nativne za heterologne polipeptide, signalna sekvenca se zamenjuje prokariotskom signalnom sekvencom odabranom, na primer, iz grupe koja se sastoji od alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp ili lidera termostabilnog enterotoksina II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA i MBP. Signalne sekvence koje se koriste u oba cistrona ekspresionog sistema mogu biti STII signalne sekvence ili njihove varijante.
[0477] Proizvodnja antitela može se odvijati u citoplazmi ćelije domaćina i stoga ne zahteva prisustvo signalnih sekvenci sekrecije unutar svakog cistrona. Polipeptidne komponente, kao što je polipeptid koji kodira V<H>domen prvog dela za vezivanje antigena izborno fuzionisan sa drugim delom za vezivanje antigena, i polipeptid koji kodira V<L>domen prvog dela za vezivanje antigena, izborno fuzionisan sa drugim delom za vezivanje antigena, može biti eksprimiran, presavijen i sastavljen da bi se formirala funkcionalna antitela unutar citoplazme. Određeni sojevi domaćina (npr., E. coli trxB<->sojevi) obezbeđuju citoplazmatske uslove koji su povoljni za formiranje disulfidnih veza, čime se omogućava pravilno savijanje i sklapanje eksprimiranih proteinskih podjedinica. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
[0478] [0284] Opisan je ekspresioni sistem u kome se kvantitativni odnos eksprimiranih polipeptidnih komponenti može modulirati kako bi se maksimizirao prinos sekretovanih i pravilno sastavljenih antitela. Takva modulacija se postiže barem delimično istovremenim moduliranjem translacionih snaga za polipeptidne komponente. Jedna tehnika za modulaciju translacionih snaga je otkrivena u Simmons et al., U.S. Pat. br. 5,840,523. Ona koristi varijante regiona inicijacije translacije (TIR) unutar cistrona. Za dati TIR, može se kreirati niz varijanti sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina sa različitim translacionim jačinama, čime se obezbeđuje pogodan način za podešavanje ovog faktora za željeni nivo ekspresije specifičnog lanca. TIR varijante mogu se generisati konvencionalnim tehnikama mutageneze koje rezultuju promenama kodona koje mogu promeniti sekvencu aminokiselina, iako su poželjnije tihe promene u sekvenci nukleinskih kiselina. Promene u TIR mogu uključivati, na primer, promene u broju ili razmaku Shine-Dalgarno sekvenci, zajedno sa promenama u signalnoj sekvenci. Jedan postupak za generisanje mutantnih signalnih sekvenci je generisanje „banke kodona“ na početku kodirajuće sekvence koja ne menja sekvencu aminokiselina signalne sekvence (tj., promene su tihe). Ovo se može postići promenom treće nukleotidne pozicije svakog kodona; pored toga, neke aminokiseline, kao što su leucin, serin i arginin, imaju više prvih i drugih pozicija što može dodatno usložnjavati pravljenje banke. Ovaj postupak mutageneze je detaljno opisan u Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol.4:151‑158.
[0479] Poželjno je da se generiše skup vektora sa rasponom jačina TIR za svaki cistron u njemu. Ovaj ograničeni skup obezbeđuje poređenje nivoa ekspresije svakog lanca, kao i prinos željenih proteinskih proizvoda pod različitim kombinacijama jačina TIR. Jačine TIR mogu se odrediti kvantifikacijom nivoa ekspresije reporterskog gena, kao što je detaljno opisano u Simmons et al. U.S. Pat. br.5,840,523. Na osnovu poređenja translacione snage, željeni pojedinačni TIR se biraju za kombinovanje u konstruktima ekspresionih vektora.
[0481] b) Prokariotske ćelije domaćina.
[0483] [0286] Prokariotske ćelije domaćini pogodne za ekspresiju antitela uključuju arhebakterije i eubakterije, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi. Primeri korisnih bakterija uključuju Escherichia (npr., E. coli), bacile (npr., B. subtilis), Enterobacteria, vrste Pseudomonas (npr., P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ili Paracoccus. U nekim primerima izvođenja koriste se gram-negativne ćelije. U jednom primeru, Escherichia coli ćelije se koriste kao domaćini. Primeri Escherichia coli sojeva uključuju soj W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol.2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp.1190‑1219; ATCC Deposit br. 27,325) i njihovi derivati, uključujući soj 33D3 koji ima genotip V3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kan<R>(U.S. Pat. br.5,639,635). Drugi sojevi i njihovi derivati, kao što su E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31.537) i E. coli RV308 (ATCC 31,608) su takođe pogodni. Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući. Postupci za konstruisanje derivata bilo koje od gore pomenutih bakterija koje imaju definisane genotipove poznate su u struci i opisani su, na primer, u Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Generalno je neophodno odabrati odgovarajuće bakterije uzimajući u obzir replikabilnost replikona u ćelijama bakterije. Na primer, vrste E. coli, Serratia, ili Salmonella se mogu pogodno koristiti kao domaćini kada se dobro poznati plazmidi kao što su pBR322, pBR325, pACYC177 ili pKN410 koriste za snabdevanje replikonom.
[0484] Tipično, ćelija domaćin treba da luči minimalne količine proteolitičkih enzima, a dodatni inhibitori proteaze mogu biti poželjno uključeni u ćelijsku kulturu.
[0486] c) Proizvodnja proteina
[0488] Ćelije domaćina se transformišu gore opisanim ekspresionim vektorima i kultivišu u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim na odgovarajući način za indukovanje promotora, selekciju transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence. Transformacija znači unošenje DNK u prokariotskog domaćina tako da je DNK replicirana, bilo kao ekstrahromozomski element ili hromozomski integrant. U zavisnosti od korišćene ćelije domaćina, transformacija se vrši korišćenjem standardnih tehnika koje odgovaraju takvim ćelijama. Tretman kalcijumom koji koristi kalcijum hlorid se generalno koristi za bakterijske ćelije koje sadrže značajne barijere ćelijskog zida. Drugi postupak za transformaciju koristi polietilen glikol/DMSO. Još jedna tehnika koja se koristi je elektroporacija.
[0489] Prokariotske ćelije koje se koriste za proizvodnju antitela gaje se u medijumima poznatim u struci i pogodnim za kulturu odabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih medijuma uključuju lurija bujon (LB) plus neophodne hranljive dodatke. U nekim primerima, medijum takođe sadrži selekcioni agens, izabran na osnovu konstrukta ekspresionog vektora, kako bi selektivno omogućio rast prokariotskih ćelija koje sadrže ekspresioni vektor. Na primer, ampicilin se dodaje medijumu za rast ćelija koje eksprimiraju gen otporan na ampicilin.
[0490] Svi neophodni dodaci pored izvora ugljenika, azota i neorganskog fosfata mogu se takođe uključiti u odgovarajućim koncentracijama, uneti sami ili kao smeša sa drugim dodatkom ili medijumom, kao što je složeni izvor azota. Izborno, medijum za kultivaciju može sadržati jedno ili više redukcionih sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od glutationa, cisteina, cistamina, tioglikolata, ditioeritritola i ditiotreitola.
[0491] Prokariotske ćelije domaćina se kultivišu na odgovarajućim temperaturama. Za rast E. coli na primer, poželjna temperatura se kreće od oko 20°C do oko 39°C, poželjnije od oko 25°C do oko 37°C, još poželjnije na oko 30°C. pH vrednost podloge može biti bilo koja u rasponu od oko 5 do oko 9, u zavisnosti uglavnom od organizma domaćina. Za E. coli, pH je poželjno od oko 6,8 do oko 7,4, a još poželjnije oko 7,0.
[0492] Ako se u ekspresionom vektoru koristi inducibilni promotor, ekspresija proteina se indukuje pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotora. U jednom aspektu, PhoA promotori se koriste za kontrolu transkripcije polipeptida. Shodno tome, transformisane ćelije domaćina se kultivišu u medijumu koji ograničava fosfate radi indukcije. Poželjno je da medijum koji ograničava fosfate bude C.R.A.P medijum (videti, npr., Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Mogu se koristiti i razni drugi induktori, u skladu sa korišćenim vektorskim konstruktom, kao što je poznato u struci.
[0493] Eksprimirana antitela se luče u i izdvajaju iz periplazme ćelija domaćina. Regeneracija proteina obično podrazumeva razaranje mikroorganizma, generalno sredstvima kao što su osmotski šok, sonikacija ili liza. Kada se ćelije razore, ćelijski ostaci ili cele ćelije mogu se ukloniti centrifugiranjem ili filtracijom. Proteini se mogu dalje prečistiti, na primer, afinitetnom hromatografijom na smoli. Alternativno, proteini se mogu transportovati u podlogu za kultivaciju i izolovati u njoj. Ćelije se mogu ukloniti iz kulture, a supernatant kulture se filtrira i koncentruje radi daljeg prečišćavanja proizvedenih proteina. Eksprimirani polipeptidi mogu se dalje izolovati i identifikovati korišćenjem opšte poznatih postupaka kao što su elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (PAGE) i Western blot test.
[0494] Alternativno, proizvodnja proteina se vrši u velikim količinama procesom fermentacije. Različiti postupci fermentacije velikih razmera sa dovodom u šarže dostupni su za proizvodnju rekombinantnih proteina. Fermentacije velikih razmera imaju kapacitet od najmanje 1000 litara, poželjno oko 1.000 do 100.000 litara kapaciteta. Ovi fermentori koriste mešalice za distribuciju kiseonika i hranljivih materija, posebno glukoze (poželjnog izvora ugljenika/energije). Fermentacija malih razmera se generalno odnosi na fermentaciju u fermentoru koji nije veći od približno 100 litara u zapremini, i može se kretati od oko 1 litra do oko 100 litara.
[0495] Tokom procesa fermentacije, indukcija ekspresije proteina se obično započinje nakon što su ćelije uzgajane pod odgovarajućim uslovima do željene gustine, npr., OD<550>od oko 180-220, u kojoj su ćelije u ranoj stacionarnoj fazi. Mogu se koristiti različiti induktori, u skladu sa korišćenim vektorskim konstruktom, kao što je poznato u struci i opisano gore. Ćelije se mogu gajiti tokom kraćih perioda pre indukcije. Ćelije se obično indukuju oko 12-50 sati, mada se može koristiti duže ili kraće vreme indukcije.
[0496] [0296] Da bi se poboljšao prinos proizvodnje i kvalitet antitela, mogu se modifikovati različiti uslovi fermentacije. Na primer, da bi se poboljšalo pravilno sklapanje i savijanje sekretovanih polipeptida, dodatni vektori koji prekomerno eksprimiraju proteine šaperone, kao što su Dsb proteini (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i/ili DsbG) ili FkpA (peptidilprolil cis,trans-izomeraza sa aktivnošću šaperona) mogu se koristiti za ko-transformaciju prokariotskih ćelija domaćina. Dokazano je da proteini šaperoni olakšavaju pravilno savijanje i rastvorljivost heterolognih proteina proizvedenih u bakterijskim ćelijama domaćina. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601‑19605; Georgiou et al., U.S. Pat. br. 6,083,715; Georgiou et al., U.S. Pat. br.
[0497] 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100‑17105; Ramm i Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106‑17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol.
[0498] 39:199‑210.
[0499] Da bi se minimizirala proteoliza eksprimiranih heterolognih proteina (posebno onih koji su proteolitički osetljivi), određeni sojevi domaćina kojima nedostaju proteolitički enzimi mogu se koristiti za ovaj pronalazak. Na primer, sojevi ćelija domaćina mogu biti modifikovani da bi se izazvala genetska mutacija(e) u genima koji kodiraju poznate bakterijske proteaze kao što su Proteaza III, OmpT, DegP, Tsp, Proteaza I, Proteaza Mi, Proteaza V, Proteaza VI i njihove kombinacije. Neki sojevi E. coli sa nedostatkom proteaze su dostupni i opisani, na primer, u Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., U.S. Pat. br.5,264,365; Georgiou et al., U.S. Pat. br.
[0500] 5,508,192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63‑72 (1996).
[0501] Sojevi E. coli kojima nedostaju proteolitički enzimi i transformisani su plazmidima koji prekomerno eksprimiraju jedan ili više proteina šaperona mogu se koristiti kao ćelije domaćini u ekspresionom sistemu koji kodira antitela.
[0503] d) Prečišćavanje proteina
[0505] Antitela proizvedena ovde se dalje prečišćavaju da bi se dobili preparati koji su u suštini homogeni za dalja ispitivanja i upotrebu. Mogu se koristiti standardni postupci prečišćavanja proteina poznati u struci. Sledeći postupci su primeri odgovarajućih postupaka prečišćavanja: frakcionisanje na imunoafinitetnim ili jonoizmenjivačkim kolonama, taloženje etanolom, HPLC sa reverznom fazom, hromatografija na silicijum dioksidu ili na katjonoizmenjivačkoj smoli kao što je DEAE, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, taloženje amonijum sulfatom i gel filtracija korišćenjem, na primer, Sephadex G-75.
[0506] [0300] U jednom aspektu, protein A imobilizovan na čvrstoj fazi se koristi za imunoafinitetno prečišćavanje antitela koja sadrže Fc region. Protein A je protein ćelijskog zida od 41 kD iz Staphylococcus aureas koji se sa visokim afinitetom vezuje za Fc region antitela. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1‑13. Čvrsta faza na koju je protein A imobilisan je poželjno kolona koja sadrži staklenu ili silicijumsku površinu, još poželjnije kolona od stakla sa kontrolisanim porama ili kolona sa silicijumskom kiselinom. U nekim primenama, kolona je obložena reagensom, kao što je glicerol, u pokušaju da se spreči nespecifično prianjanje zagađivača. Čvrsta faza se zatim ispira da bi se uklonili zagađivači koji nisu specifično vezani za čvrstu fazu. Konačno, antitela od interesa se izdvajaju iz čvrste faze eluiranjem.
[0508] 4. Rekombinantna proizvodnja u eukariotskim ćelijama
[0510] Za eukariotsku ekspresiju, komponente vektora generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jednu ili više od sledećih, signalnu sekvencu, oridžin replikacije, jedan ili više marker gena i pojačivački element, promotor i sekvencu za terminaciju transkripcije.
[0512] a) Komponenta sekvence signala
[0514] Vektor za upotrebu u eukariotskom domaćinu može takođe biti insert koji kodira signalnu sekvencu ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Odabrana heterologna signalna sekvenca je poželjno ona koja se prepoznaje i obrađuje (tj., cepa se signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. U ekspresiji ćelija sisara, dostupne su signalne sekvence sisara, kao i lideri virusne sekrecije, na primer, gD signal herpes simplex.
[0515] DNK za takav prekursorski region je vezana u okviru za čitanje sa DNK koja kodira antitela.
[0517] b) Oridžin replikacije
[0519] Generalno, komponenta oridžina replikacije nije potrebna za ekspresione vektore sisara (oridžin SV40 se obično može koristiti samo zato što sadrži rani promotor).
[0521] c) Komponenta gena selekcije
[0523] Vektori za ekspresiju i kloniranje mogu da sadrže selekcioni gen, takođe nazvan selektivni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke ili (c) snabdevaju kritične hranljive materije koje nisu dostupne iz složenih medija, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za bacile.
[0524] Jedan primer šeme selekcije koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. Ćelije koje su uspešno transformisane heterolognim genom proizvode protein koji obezbeđuje otpornost na lekove zahvaljujući čemu preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.
[0525] Još jedan primer odgovarajućih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da usvoje nukleinsku kiselinu koja kodira antitela, kao što su DHFR, timidin kinaza, metalotionein-I i -II, poželjno geni metalotioneina primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza itd.
[0526] Na primer, ćelije transformisane genom za selekciju DHFR se prvo identifikuju kultivacijom svih transformanata u medijumu za kultivaciju koji sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist DHFR. Odgovarajuća ćelija domaćin kada se koristi divlji tip DHFR je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom DHFR aktivnosti (npr., ATCC CRL-9096).
[0527] Alternativno, ćelije domaćina (posebno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisane ili ko-transformisane sa polipeptidnim kodirajućim DNK sekvencama, proteinom divljeg tipa DHFR i drugim selektivnim markerom kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH) mogu biti selektovane rastom ćelija u medijumu koji sadrži selektivni agens za selektivni marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418. Videti U.S. Pat. br.4,965,199.
[0529] d) Komponenta promotora
[0531] Vektori za ekspresiju i kloniranje obično sadrže promotor koji prepoznaje organizam domaćin i koji je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira željene polipeptidne sekvence. Gotovo svi eukariotski geni imaju region bogat AT koji se nalazi približno 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde se transkripcija inicira. Još jedna sekvenca koja se nalazi 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. 3' kraj većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence mogu biti umetnute u eukariotske vektore za ekspresiju.
[0532] [0311] Drugi promotori pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promotor, sisteme promotora laktamaze i laktoze, promotor alkalne fosfataze, sistem promotora triptofana (trp) i hibridne promotore kao što je tac promotor. Međutim, pogodni su i drugi poznati bakterijski promotori. Promotori za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržati Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu operativno povezanu sa DNK koja kodira antitela.
[0533] Transkripcija polipeptida iz vektora u ćelijama domaćina sisara kontroliše se, na primer, promotorima dobijenim iz genoma virusa kao što su polioma virus, virus boginja živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B i najpoželjnije Simian virus 40 (SV40), iz heterolognih sisarskih promotora, npr., promotor aktina ili promotor imunoglobulina, iz promotora toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promotori kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0534] Rani i kasni promotori virusa SV40 se pogodno dobijaju kao restrikcioni fragment SV40 koji takođe sadrži mesto početka replikacije virusa SV40. Neposredni rani promotor humanog citomegalovirusa se pogodno dobija kao restrikcioni fragment HindIII E. Sistem za ekspresiju DNK kod sisara domaćina korišćenjem goveđeg papiloma virusa kao vektora je opisan u U.S. Pat. br.4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. Pat. br.4,601,978. Videti takođe Reyes et al., Nature 297:598‑601 (1982) za ekspresiju cDNK humanog interferona u ćelijama miša pod kontrolom promotora timidin kinaze iz virusa herpes simpleksa. Alternativno, dugačko terminalno ponavljanje virusa Rous sarkoma može se koristiti kao promotor.
[0536] e) Komponenta pojačivača
[0538] Transkripcija DNK koja kodira antitela od strane viših eukariota se često povećava umetanjem sekvence pojačivača u vektor. Mnoge sekvence pojačivača su sada poznate iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, tipično se koristi pojačivač iz virusa eukariotskih ćelija. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani oridžina replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotora citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani oridžina replikacije i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, Nature 297:17‑18 (1982) o pojačavajućim elementima za aktivaciju eukariotskih promotora. Pojačivač može biti splajsovan u vektor na poziciji 5' ili 3' u odnosu na sekvencu koja kodira polipeptid, ali je poželjno da se nalazi na mestu 5' od promotora.
[0540] f) Komponenta za završetak transkripcije
[0542] [0315] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćinima (kvasac, gljivice, insekti, biljke, životinje, ljudi ili ćelije sa nukleusom iz drugih višećelijskih organizama) takođe će sadržati sekvence neophodne za terminaciju transkripcije i za stabilizaciju iRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovani fragmenti u neprevedenom delu iRNK koja kodira polipeptid. Jedna korisna komponenta za terminaciju transkripcije je poliadenilacioni region goveđeg hormona rasta. Videti WO94/11026 i ekspresioni vektor koji je tamo otkriven.
[0544] g) Selekcija i transformacija ćelija domaćina
[0546] Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde uključuju ćelije viših eukariota opisane ovde, uključujući ćelije domaćina kičmenjaka. Razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postalo je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su linija CV1 bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija humanih embrionalnih bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); mišje Sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije karcinoma grlića materice kod ljudi (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivoljeg pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća kod ljudi (W138, ATCC CCL 75); ćelije jetre kod ljudi (Hep G2, HB 8065); tumor mlečne žlezde miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2).
[0547] Ćelije domaćina se transformišu gore opisanim vektorima ekspresije ili kloniranja za proizvodnju antitela i kultivišu u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim na odgovarajući način za indukovanje promotora, selekciju transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.
[0549] h) Kultivisanje ćelija domaćina
[0551] [0318] Ćelije domaćina koje se koriste za proizvodnju antitela mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što su Hamov F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco Modified Eagle Medium ((DMEM), Sigma) su pogodni za kultivaciju ćelija domaćina. Pored toga, bilo koji od medijuma opisanih u Ham et al., Meth. Enz.58:44 (1979), Barns et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. Pat. br. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655 ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195 ili U.S. Pat. Re.30,985 mogu se koristiti kao podloge za kultivaciju ćelija domaćina. Bilo koja od ovih podloga može se po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je lek GENTAMICIN<™>), elementi u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoza ili ekvivalentan izvor energije. Bilo koji drugi neophodni dodaci takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju i biće očigledni prosečnom stručnjaku.
[0553] i) Prečišćavanje proteina
[0555] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitela se mogu proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili direktno sekretovati u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, čestice, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Karter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) opisuju postupak za izolovanje antitela koja se luče u periplazmatski prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ćelijski ostaci se mogu ukloniti centrifugiranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvo koncentrišu korišćenjem komercijalno dostupnog filtera za koncentraciju proteina, na primer, ultrafiltracione jedinice Amicon ili Millipore Pellicon. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka da bi se inhibirala proteoliza, a antibiotici mogu biti uključeni da bi se sprečio rast slučajnih zagađivača.
[0556] [0320] Proteinski sastav pripremljen iz ćelija može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitne hromatografije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija preferirana tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog Fc domena imunoglobulina koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja su bazirana na humanim imunoglobulinima koji sadrže 1, 2 ili 4 teška lanca (Lindmark et al., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve izotipove miševa i za humani 3 (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). Matriks na koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i drugi matriksi. Mehanički stabilni matriksi kao što su staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stiren-divinil)benzen omogućavaju brže protoke i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Tamo gde antitelo sadrži C<H>3 domen, Bakerbond ABXTM smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) je korisna za prečišćavanje. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na jonoizmenjivačkoj koloni, taloženje etanolom, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE<™>Hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliaspartinskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i precipitacija amonijum sulfatom su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba izolovati.
[0557] Nakon bilo kog prethodnog koraka prečišćavanja, smeša koja sadrži antitelo od interesa i zagađivače može se podvrgnuti hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji sa niskim pH korišćenjem pufera za eluiranje pri pH između oko 2,5-4,5, poželjno izvedenoj pri niskim koncentracijama soli (npr., od oko 0-0,25M soli).
[0559] Imunokonjugati
[0561] (Odeljak „Imunokonjugati“ je dat kao referenca. Primeri izvođenja otkriveni u ovom odeljku nisu primeri izvođenja pronalaska.)
[0562] U nekim primerima izvođenja, postoje i imunokonjugati koji sadrže bilo koje od antitela (kao što su jednodomenska antitela) opisana ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi koji inhibiraju rast, toksini (npr., proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
[0563] [0324] U nekim primerima izvođenja, imunokonjugat je konjugat antitela i leka (ADC) u kome je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali ne ograničavajući se na, majtanzinoid (videti U.S. Patenti br.5,208,020, 5,416,064 i evropski patent EP 0425 235 B1); auristatin kao što su monometilauristatin, lekoviti delovi DE i DF (MMAE i MMAF) (videti U.S. Patente br.5,635,483 i 5,780,588 i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (videti U.S. Patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res.53:3336-3342 (1993)); i Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (videti Kratz et al., Current Med. Chem.13:477-523 (2006)); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358‑362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem.16:717‑721 (2005);
[0564] Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829‑834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529‑1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.45:4336‑4343 (2002); i U.S.
[0565] Patent br.6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan kao što su docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
[0566] U nekim primerima izvođenja, imunokonjugat sadrži antitelo kako je ovde opisano konjugovano sa enzimski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac egzotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina A, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin,
[0567] proteini Aleurites Fordii, proteini dianthin, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikoteceni.
[0568] U nekim primerima izvođenja, imunokonjugat sadrži antitelo kako je ovde opisano konjugovano sa radioaktivnim atomom da bi se formirao radiokonjugat. Za proizvodnju radiokonjugata dostupni su različiti radioaktivni izotopi. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao magnetna rezonanca, MRI), kao što su ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
[0569] [0330] Konjugati antitela i citotoksičnog sredstva mogu se pripremiti upotrebom različitih bifunkcionalnih agenasa za vezivanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može se pripremiti kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti WO94/11026. Linker može biti „linker koji se može iseći“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. Patent br.5,208,020).
[0570] Imunokonjugati ili ADC ovde izričito predviđaju, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za unakrsnu vezu, uključujući, ali nisu ograničeni na, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr., od kompanije Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., USA).
[0572] Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju (Odeljak „Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju“ je objavljen kao referenca. Primene opisane u ovom odeljku nisu primene pronalaska.)
[0574] U nekim primerima izvođenja, bilo koje od antitela (kao što su jednodomenska antitela) koja su ovde data su korisna za detekciju prisustva odgovarajućeg antigena (kao što su CD19, CD20, BCMA ili CD38) u biološkom uzorku. Termin „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim primerima izvođenja, biološki uzorak je krv, serum ili drugi tečni uzorci biološkog porekla. U nekim primerima izvođenja, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo.
[0575] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeno je anti-CD19 antitelo (kao što je bilo koje od anti-CD19 jednodomenskih antitela opisanih ovde) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U daljem aspektu, obezbeđen je postupak detekcije prisustva CD19 u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži detekciju prisustva CD19 proteina u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, CD19 je humani CD19. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži kontaktiranje biološkog uzorka sa anti-CD19 antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-CD19 antitela za CD19, i detekciju da li se formira kompleks između anti-CD19 antitela i CD19. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 antitelo se koristi za selekciju subjekata koji ispunjavaju uslove za terapiju anti-CD19 antitelom, npr. gde je CD19 biomarker za selekciju pacijenata.
[0576] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeno je anti-CD20 antitelo (kao što je bilo koje od anti-CD20 jednodomenskih antitela opisanih ovde) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U daljem aspektu, obezbeđen je postupak detekcije prisustva CD20 u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži detekciju prisustva CD20 proteina u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, CD20 je humani CD20. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži kontaktiranje biološkog uzorka sa anti-CD20 antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-CD20 antitela za CD20, i detekciju da li se formira kompleks između anti-CD20 antitela i CD20. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo se koristi za selekciju subjekata koji ispunjavaju uslove za terapiju anti-CD20 antitelom, npr. gde je CD20 biomarker za selekciju pacijenata.
[0577] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeno je anti-BCMA antitelo (kao što je bilo koje od anti-BCMA jednodomenskih antitela opisanih ovde) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U daljem aspektu, obezbeđen je postupak detekcije prisustva BCMA u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži detekciju prisustva BCMA proteina u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, BCMA je humani BCMA. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži kontaktiranje biološkog uzorka sa anti-BCMA antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-BCMA antitela za BCMA, i detekciju da li se formira kompleks između anti-BCMA antitela i BCMA. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA antitelo se koristi za selekciju subjekata koji ispunjavaju uslove za terapiju anti-BCMA antitelom, npr. pri čemu je BCMA biomarker za selekciju pacijenata.
[0578] U nekim primerima izvođenja, obezbeđeno je anti-CD38 antitelo (kao što je bilo koje od anti-CD38 jednodomenskih antitela opisanih ovde) za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U daljem aspektu, obezbeđen je postupak detekcije prisustva CD38 u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži detekciju prisustva CD38 proteina u biološkom uzorku. U određenim primerima izvođenja, CD38 je humani CD38. U određenim primerima izvođenja, postupak sadrži kontaktiranje biološkog uzorka sa anti-CD38 antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-CD38 antitela za CD38, i detekciju da li se formira kompleks između anti-CD38 antitela i CD38. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 antitelo se koristi za selekciju subjekata koji ispunjavaju uslove za terapiju anti-CD38 antitelom, npr. gde je CD38 biomarker za selekciju pacijenata.
[0579] U određenim primerima izvođenja, obezbeđena su obeležena antitela (kao što su anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA ili anti-CD38 jednodomenska antitela). Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili grupe koje se direktno detektuju (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektron-guste, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i grupe, kao što su enzimi ili ligandi, koje se indirektno detektuju, npr., putem enzimske reakcije ili molekularne interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofori kao što su helati retke zemlje ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr., luciferaza svitaca i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharidne oksidaze, npr., glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze kao što su urikaza i ksantin oksidaza, povezane sa enzimom koji koristi vodonik-peroksid za oksidaciju prekursora boje kao što su HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, bakteriofagne oznake, stabilni slobodni radikali i slično.
[0581] III. Himerni antigenski receptori
[0583] Himerni antigenski receptor (CAR) može da sadrži ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži jedno ili više jednodomenskih antitela (kao što je V<H>H). Bilo koje od jednodomenskih antitela opisanih u Odeljku II može se koristiti u CAR opisanim ovde. Primeri CAR koji sadrže jedan ili više V<H>H domena (tj., V<H>H-bazirani CAR) su ilustrovani i upoređeni sa konvencionalnim CAR koji sadrže scFv (tj., scFv-bazirani CAR) na slikama 1A-1D. Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da V<H>H domeni u primerima CAR na slikama 1A-1D mogu biti zamenjeni drugim sdAb.
[0584] [0339] Himerni antigenski receptor (CAR) može da sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. Predmetni pronalazak obezbeđuje CAR kako je definisano u patentnim zahtevima. U nekim primerima izvođenja, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CAR dalje sadržio zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CAR je monospecifičan. CAR se može opisati kao multivalentni, kao što je bivalentan ili trovalentan. U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan.
[0586] Himerni antigenski receptori specifičnih ciljeva
[0588] [0340] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje CAR receptore koji sadrže ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji obuhvata bilo koje od anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA ili anti-CD38 jednodomenskih antitela (sdAb), gde je svaki od prvog i drugog sdAb VHH. CAR receptori mogu biti monospecifični ili multispecifični (kao što su bispecifični ili sa većim brojem specifičnosti), a CAR receptori se mogu opisati kao multivalentni (kao što su bivalentni, trovalentni ili sa većim brojem valenci). Lista primera monospecifičnih himernih antigenskih receptora, primera sekvenci, konstrukata i njihovih vektora prikazana je u Tabeli kao referenca.
[0589] Tabele 4, 5 i 6 navedene u odeljku „III. Himerni antigenski receptor“ koriste sledeće skraćenice: Pr.: primer; Vek.: vektor; AA: aminokiselinska sekvenca CAR; NA: nukleinska kiselinska sekvenca CAR; SP: signalni peptid; Ekstracelularni: ekstracelularni domen za vezivanje antigena; sdAb: jednodomensko antitelo; TM: transmembranski domen; CO1: kostimulatorni signalni domen 1; CO2: kostimulatorni signalni domen 2; Prim.: primarni intracelularni signalni domen. Domeni su navedeni s leva na desno svakog reda koji odgovara redosledu domena od N-terminusa do C-terminusa CAR polipeptida.
[0591] 1. CD19 CAR
[0593] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CAR pronalaska koji cilja CD19 (takođe se ovde naziva „CD19 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR je monospecifičan. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR je multivalentan, kao što je bivalentan ili trovalentan. CD19 CAR se može opisati kao multispecifičan, kao što je bispecifičan, multivalentan, kao što je bivalentan ili trovalentan.
[0594] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CD19 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-CD19 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb dalje sadrži FR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 240, FR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 241, FR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 242 i/ili FR4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 243. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR je monospecifičan. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan. CD19 CAR se može opisati kao multivalentni, kao što je bivalentan ili trovalentan.
[0595] Kao referenca, otkriven je CD19 CAR koji sadrži polipeptid koji ima najmanje približno bilo koju od sledećih sekvenci: 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 248. Kao referenca, otkriven je CD19 CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 248. Takođe, kao referenca, otkriven je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 248.
[0596] U nekim primerima izvođenja, data je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od CD19 CAR pronalaska. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 250. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 250. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, dat je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju CD19 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0598] 2. CD20 CAR
[0600] [0346] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CAR pronalaska koji cilja CD20 (ovde se takođe naziva „CD20 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD20 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR je monospecifičan. Ovde je opisan kao referenca, CD20 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 249. U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan. CD20 CAR se može opisati kao multivalentni, kao što je bivalentan ili trovalentan.
[0601] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CD20 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD20 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-CD20 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb dalje sadrži FR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 244, FR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 245, FR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 246 i/ili FR4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 247. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR je monospecifičan. Kao referenca, CD20 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 249. U nekim primerima izvođenja, CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan. CD20 CAR se može opisati kao multivalentni, kao što je bivalentan ili trovalentan.
[0602] [0348] Ovde je kao referenca otkriven CD20 CAR koji sadrži polipeptid koji ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 249. Ovde je kao referenca otkriven CD20 CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 249. Takođe je kao referenca otkriven polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 249.
[0603] U nekim primerima izvođenja, data je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od CD20 CAR pronalaska. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 521. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 251. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, dat je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju CD20 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0605] 3. BCMA CAR
[0607] [0350] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CAR pronalaska koji cilja BCMA (takođe se ovde naziva „BCMA CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerano ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena koji vezuje antigen i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR je monospecifičan.
[0608] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je BCMA CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-BCMA sdAb sadrži bilo koji od sledećih:
[0610] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0611] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0612] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0613] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0614] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33;
[0615] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0616] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0617] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
[0618] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37;
[0619] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; ili
[0620] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39.
[0622] U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb sadrži V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:78-88. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR je monospecifičan.
[0623] [0353] Kao referenca, otkriven je BCMA CAR koji sadrži polipeptid koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 152-162 i 257-259. Kao referenca, otkriven je BCMA CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 152-162 i 257-259. Takođe, kao referenca, otkriven je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 152-162 i 257-259.
[0624] U nekim primerima izvođenja, data je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od BCMA CAR pronalaska. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 175-185 i 261-263. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 175-185 i 261-263. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju BCMA CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0626] 4. CD38 CAR
[0628] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CAR pronalaska usmeren na CD38 (takođe ovde nazvan „CD38 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD38 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT,
[0629] [0356] NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena koji vezuje antigen i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR je monospecifičan.
[0630] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CD38 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD38 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-CD38 sdAb sadrži bilo šta od sledećeg:
[0632] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
[0633] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
[0634] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
[0635] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
[0636] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
[0637] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
[0638] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
[0639] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
[0640] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
[0641] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
[0642] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
[0643] (12) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
[0645] [0358] U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb sadrži V<H>H domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:89-100. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje obuhvata zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR je monospecifičan.
[0646] Kao referenca, otkriven je CD38 CAR koji sadrži polipeptid koji ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 163-174 i 260. Kao referenca, otkriven je CD38 CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 163-174 i 260. Takođe, kao referenca, otkriven je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 163-174 i 260.
[0647] U nekim primerima izvođenja, data je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od CD38 CAR pronalaska. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 186-197 i 264. Kao referenca, otkrivena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 186-197 i 264. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju CD38 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0649] 5. CD22 CAR
[0651] [0361] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CAP pronalaska koji cilja CD22 (takođe se ovde naziva „CD22 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD22 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD22 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD22CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD22 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD8α, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, CD22 CAR je monospecifičan.
[0653] Tabela 4. Primeri monospecifičnih, monovalentnih CAR. (objavljeno kao referenca)
[0655]
[0656]
[0659] Multivalentni himerni antigenski receptori
[0661] [0362] Predmetni pronalazak u nekim primerima izvođenja obezbeđuje multivalentne CAR pronalaska koji imaju dva ili više (kao što je otprilike bilo koje od 2, 3, 4, 5, 6 ili više) mesta vezivanja antigena koja sadrže jednodomenska antitela kako je definisano u patentnim zahtevima. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR cilja jedan antigen i sadrži dva ili više mesta vezivanja za jedan antigen. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR cilja više od jednog antigena i sadrži dva ili više mesta vezivanja za najmanje jedan antigen. Mesta vezivanja specifična za isti antigen mogu se vezati za isti epitop antigena ili se vezati za različite epitope antigena. Mesta vezivanja specifična za isti antigen mogu sadržati ista ili različita jednodomenska antitela.
[0662] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje multivalentni (kao što je bivalentni, trovalentni ili sa većim brojem valenci) himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruka (kao što je otprilike bilo koje od 2, 3, 4, 5, 6 ili više) jednodomenska antitela (sdAb) koja se specifično vezuju za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, višestruka sdAb su kamelidna, himerna ili humanizovana. U nekim primerima izvođenja, višestruka jednodomenska antitela su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker je dugačak najviše oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR je monospecifičan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan.
[0663] [0364] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje multivalentni (kao što je bivalentni, trovalentni ili sa većim brojem valenci) himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu su prvi epitop i drugi epitop različiti. U nekim primerima izvođenja, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen obuhvata primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR je monospecifičan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan.
[0664] [0365] Multivalentni CAR opisani ovde mogu biti posebno pogodni za ciljanje multimernih antigena putem sinergističkog vezivanja pomoću različitih mesta vezivanja antigena, ili za poboljšanje afiniteta vezivanja ili avidnosti prema antigenu. Bilo koje od ovde opisanih jednodomenskih antitela, kao što su anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA ili anti-CD38 antitela, može se koristiti u ekstracelularnom domenu vezivanja antigena multivalentnih CAR opisanih ovde. Lista primera monospecifičnih multivalentnih himernih antigenskih receptora, primera sekvenci, konstrukata i njihovih vektora prikazana je u Tabeli 5.
[0666] 1. Multivalentni BCMA CAR
[0668] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CAR pronalaska koji cilja BCMA (takođe se ovde naziva „multivalentni BCMA CAR“) koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruka (kao što su 2, 3 ili više) anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo anti-BCMA sdAb je fuzionisano jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR je dvovalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR je trovalentan. Bilo koji od anti-BCMA sdAb može se koristiti za konstruisanje multivalentnog BCMA CAR.
[0669] [0367] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni BCMA CA pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruke (kao što su 2, 3 ili više) anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, gde anti-BCMA sdAb sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78. U nekim primerima izvođenja, višestruka anti-BCMA sdAb su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR je bivalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR je trovalentan.
[0670] [0368] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni BCMA CAR pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo anti-BCMA sdAb i drugo anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu se prvo anti-BCMA sdAb i drugo anti-BCMA sdAb specifično vezuju za različite epitope na BCMA. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb se nalazi na N-terminusu drugog anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb se nalazi na C-terminusu drugog anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb i drugo anti-BCMA sdAb su međusobno fuzionisani putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena koji vezuje antigen i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR je bivalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR je trovalentan. U nekim primerima izvođenja, ekstracelularni domen koji vezuje antigen dalje sadrži treći anti-BCMA sdAb koje se specifično vezuje za epitop koji je različit od prvog i drugog anti-BCMA sdAb. Bilo koji od anti-BCMA sdAb može se koristiti za konstruisanje multivalentnog BCMA CAR.
[0671] [0369] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni BCMA CAR pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo anti-BCMA sdAb i drugo anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu prvo anti-BCMA sdAb sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; i pri čemu drugo anti-BCMA sdAb sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb se nalazi na N-terminusu drugog anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb se nalazi na C-terminusu drugog anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA sdAb i drugo anti-BCMA sdAb su fuzionisani jedan sa drugim preko peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni BCMA CAR je bivalentan.
[0672] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni BCMA CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 198-199 i 265-270. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni BCMA C pronalaska koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 198-199 i 265-270. Takođe je obezbeđen polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 198-199 i 265-270.
[0673] [0371] U nekim primerima izvođenja, data je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od multivalentnih BCMA CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, data je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202-203 i 271-276. U nekim primerima izvođenja, data je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 202-203 i 271-276. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju multivalentne BCMA CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0675] 2. Multivalentni CD38 CAR
[0677] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CAR pronalaska koji cilja CD38 (takođe se ovde naziva „multivalentni CD38 CAR“) koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruka (kao što su 2, 3 ili više) anti-CD38 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, višestruka anti-CD38 sdAb su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR je dvovalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR je trovalentan. Bilo koji od anti-CD38 sdAb može se koristiti za konstruisanje multivalentnog CD38 CAR.
[0678] [0373] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CD38 CAR pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruka anti-CD38 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu svako od višestrukih anti-CD38 sdAb sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, svako od višestrukih anti-CD38 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93. U nekim primerima izvođenja, višestruka anti-CD38 sdAb su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR je bivalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR je trovalentan.
[0679] [0374] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CD38 CAR pronalaska koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo anti-CD38 sdAb i drugo anti-CD38 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu se prvo anti-CD38 sdAb i drugo anti-CD38 sdAb specifično vezuju za različite epitope na CD38. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-CD38 sdAb se nalazi na N-terminusu drugog anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-CD38 sdAb se nalazi na C-terminusu drugog anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-CD38 sdAb i drugo anti-CD38 sdAb su međusobno fuzionisani putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena koji vezuje antigen i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR je bivalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD38 CAR je trovalentan. U nekim primerima izvođenja, ekstracelularni domen za vezivanje antigena dodatno sadrži treće anti-CD38 sdAb koje se specifično vezuje za epitop koji se razlikuje od prvog i drugog anti-CD38 sdAb. Bilo koje od anti-CD38 sdAb može se koristiti za konstruisanje multivalentnog CD38 CAR.
[0680] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CD38 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 200 ili SEQ ID NO: 201. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CD38 CAR pronalaska koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 200 ili SEQ ID NO: 201. Takođe je obezbeđen polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 200 ili SEQ ID NO: 201.
[0681] [0376] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od multivalentnih CD38 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 204 ili SEQ ID NO: 205. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 204 ili SEQ ID NO: 205. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju multivalentne CD38 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0683] 3. Drugi primeri multivalentnih CAR
[0685] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CAR pronalaska koji cilja CD19 (takođe se ovde naziva „multivalentni CD19 CAR“) koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruka (kao što su 2, 3 ili više) anti-CD19 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, višestruka anti-CD19 sdAb su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD19 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD19 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD19 CAR je dvovalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD19 CAR je trovalentan. Bilo koji od anti-CD19 sdAb može se koristiti za konstruisanje multivalentnog CD19 CAR.
[0686] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CAR pronalaska usmeren na CD20 (takođe ovde nazvan „multivalentni CD20 CAR“) koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruka (kao što su 2, 3 ili više) anti-CD20 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo anti-CD20 sdAb je fuzionisano jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD20 CAR je dvovalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD20 CAR je trovalentan. Bilo koje od anti-CD20 sdAb može se koristiti za konstruisanje multivalentnog CD20 CAR.
[0687] [0379] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multivalentni CAR pronalaska koji cilja CD22 (takođe se ovde naziva „multivalentni CD22 CAR“) koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži višestruka (kao što su 2, 3 ili više) anti-CD22 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD22 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo anti-CD22 sdAb je fuzionisano jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD22 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD22 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD8α, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD22 CAR je bivalentan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CD22 CAR je trovalentan.
[0688] . A
[0689] C
[0690] g no
[0691] <l>en<t>
[0693] t<i>va u<l>
[0694] g, no<i>f<i>č<e>c<s>p
[0695] ono
[0697] <e>r i
[0698] 5.P<r>a<e>l
[0699] Tab
[0701]
[0702]
[0703]
[0704]
[0705]
[0706]
[0707]
[0708]
[0709]
[0710]
[0711]
[0712] Multispecifični himerni antigenski receptor
[0714] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje multispecifične himerne antigenske receptore pronalaska koji ciljaju dva ili više (kao što je bilo koji od 2, 3, 4, 5, 6 ili više) različitih antigena. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR ima jedno mesto vezivanja antigena za svaki antigen. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR ima više od dva mesta vezivanja za najmanje jedan antigen. Svako mesto vezivanja antigena može da sadrži jednodomensko antitelo. Na primer, u nekim primerima izvođenja, multispecifični himerni antigenski receptor je bispecifični CAR koji sadrži ekstracelularni domen vezivanja antigena koji sadrži dva različita sdAb, svako od kojih se specifično vezuje za antigen. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR je trispecifični CAR koji sadrži ekstracelularni domen vezivanja antigena koji sadrži tri različita sdAb, svaki od kojih se specifično vezuje za antigen.
[0715] [0381] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor (CAR) pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen (kao što je prvi tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen (kao što je drugi tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu je prvi antigen različit od drugog antigena. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen i/ili drugi antigen su izabrani iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligandi CD83 i njihove kombinacije. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena koji vezuje antigen i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ.
[0716] U zavisnosti od željenog antigena koji treba ciljati, CAR mogu biti konstruisani tako da uključuju odgovarajuća jednodomenska antitela koja su specifična za željene antigene. Bilo koje jedno ili više ovde opisanih anti-CD19, anti-CD20, anti-BCMA ili anti-CD38 antitela mogu se koristiti u ekstracelularnom domenu za vezivanje antigena u CAR. Jednodomenska antitela mogu biti raspoređena bilo kojim odgovarajućim redosledom. Na primer, prvo jednodomensko antitelo je fuzionisano na N-terminusu ili C-terminusu drugog jednodomenskog antitela. Pogodan peptidni linker može biti postavljen između različitih jednodomenskih antitela kako bi se izbeglo steričko ometanje između jednodomenskih antitela. Lista primera bispecifičnih himernih antigenskih receptora, primera sekvenci, konstrukata i njihovih vektora prikazana je u Tabeli 6.
[0718] 1. BCMA × CD38 CAR
[0720] U nekim primerima izvođenja, CAR ovog pronalaska je bispecifični CAR koji istovremeno cilja BCMA i CD38. Na primer, BCMA i CD38 mogu se koristiti kao kandidati za ciljanje antigena eksprimiranih na ćelijama multiplog mijeloma.
[0721] [0384] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor pronalaska koji cilja BCMA i CD38 (takođe se ovde naziva „BCMA × CD38 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za BCMA i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za CD38; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je fuzionisan na N-terminusu drugog sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je fuzionisano na C-terminusu drugog sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ.
[0722] [0385] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor pronalaska koji cilja BCMA i CD38 (takođe se ovde naziva „BCMA × CD38 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; i pri čemu anti-CD38 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb i/ili anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb sadrže V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb i anti-CD38 sdAb su međusobno fuzionisani putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je fuzionisano na N-terminusu anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-BCMA je fuzionisano na C-terminusu anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida pronalaska.
[0723] [0386] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR koji sadrži polipeptid koji sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, anti-CD38 jednodomensko antitelo, peptidni linker, anti-BCMA jednodomensko antitelo, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ; pri čemu anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; i pri čemu anti-CD38 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR sadrži polipeptid koji ima najmanje oko bilo koje od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 207-211. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 207-211. Takođe je obezbeđen polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 207-211.
[0724] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, anti-BCMA jednodomensko antitelo, peptidni linker, anti-CD38 jednodomensko antitelo, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ; pri čemu anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; i pri čemu anti-CD38 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR sadrži polipeptid koji ima najmanje oko bilo koje od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 212-216. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je BCMA × CD38 CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 212-216. Takođe je obezbeđen polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 212-216.
[0725] [0388] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od BCMA × CD38 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:218-227. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:218-227. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju BCMA × CD38 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0727] 2. CD19 × CD20 CAR
[0729] U nekim primerima izvođenja, antigeni diferencijacije B ćelija, kao što su CD19 i CD20, su kandidati za ciljne antigene u limfomu B ćelija. Neki od ovih antigena su korišćeni kao ciljevi za pasivnu imunoterapiju monoklonskim antitelima sa ograničenim uspehom. U nekim primerima izvođenja, CAR ovog pronalaska je bispecifični CAR koji istovremeno cilja CD19 i CD20.
[0730] [0390] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor pronalaska koji cilja CD19 i CD20 (takođe se ovde naziva „CD19 × CD20 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za CD19 i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za CD20; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidni, himerni ili humanizovani. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je fuzionisan na N-terminusu drugog sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb je fuzionisan na C-terminusu drugog sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ.
[0731] [0391] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor ovog pronalaska koji cilja CD19 i CD20 (takođe se ovde naziva „CD19 × CD20 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-CD20 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i pri čemu anti-CD20 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-CD20 sdAb je kamelidnog porekla, himernog ili humanizovanog. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb sadrže V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:76. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:77. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i anti-CD20 sdAb su međusobno fuzionisana putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisano na N-terminusu anti-CD20 sdAb. U nekim primerima izvođenja, prvo anti-CD19 je fuzionisano na C-terminusu anti-CD20 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida.
[0732] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CD19 × CD20 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, anti-CD19 jednodomensko antitelo, peptidni linker, anti-CD20 jednodomensko antitelo, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ; pri čemu anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i pri čemu anti-CD20 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR sadrži polipeptid koji ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 206. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je CD19 × CD20 CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206. Takođe je obezbeđen polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206.
[0733] [0393] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koji od CD19 × CD20 CAR pronalaska. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja ima najmanje približno bilo koju od 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO:217. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO:217. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je DNK. U nekim primerima izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je RNK. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju CD19 × CD20 CAR opisane gore. U nekim primerima izvođenja, vektor je ekspresioni vektor. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor, kao što je lentivirusni vektor.
[0734] Trenutno, imunoterapije usmerene na CD19 pokazale su izvanredne rezultate u kliničkim ispitivanjima. Klinička ispitivanja kratkotrajnog lečenja ALL zasnovana na CD19 CAR-T ćelijama mogu postići oko 90% efikasnosti potpune remisije. Međutim, kod približno 10% pacijenata je utvrđen recidiv nakon nekoliko meseci lečenja. Glavni razlog je bio taj što je CD19 izgubljen tokom sazrevanja B ćelija u plazma ćelije, a rezidualne tumorske ćelije su proizvele varijante za izbegavanje CD19 antigena. CD19 × CD20 CAR opisani ovde mogu istovremeno ciljati CD19 i CD20 površinske antigene tumora, što može poboljšati sistemsku antitumorsku aktivnost T ćelija i smanjiti fenomen izbegavanja cilja koji je uzrokovao najmanje 30% recidiva leukemije nakon CAR terapije.
[0736] 3. Drugi primeri multispecifični CAR
[0738] [0395] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor pronalaska koji cilja CD19 i CD22 (takođe se ovde naziva „CD19 × CD22 CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-CD22 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-CD22 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD22 jednodomensko antitelo i anti-CD22 jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisano na N-terminusu anti-CD22 sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisano na C-terminusu anti-CD22 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD22 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD22 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD8α, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.
[0739] [0396] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor pronalaska koji cilja CD 19 i BCMA (takođe se ovde naziva „CD19 × BCMA CAR“) koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-BCMA jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-BCMA jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na N-terminusu anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na C-terminusu anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD8α, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.
[0741] Tabela 6. Primeri bispecifičnih CAR.
[0743]
[0744]
[0747] Ekstracelularni domen za vezivanje antigena
[0749] Ekstracelularni domen za vezivanje antigena CAR pronalaska sadrži prvo i drugo sdAb, od kojih je svaki VHH. Jednodomenska antitela mogu biti fuzionisana jedno sa drugim direktno putem peptidnih veza ili putem peptidnih linkera.
[0751] 1. Jednodomenska antitela
[0753] CAR ovog pronalaska sadrže ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo i drugo sdAb, od kojih je svaki VHH. sdAb mogu biti istog ili različitog porekla, i istih ili različitih veličina. Primeri sdAb uključuju, ali nisu ograničeni na, varijabilne domene teškog lanca iz antitela koja sadrže samo teške lance (npr., V<H>H ili V<NAR>), vezujuće molekule koji su prirodno bez lakih lanaca, pojedinačne domene (kao što je V<H>ili V<L>) izvedene iz konvencionalnih antitela sa 4 lanca, humanizovana antitela samo sa teškim lancima, humana jednodomenska antitela proizvedena od strane transgenih miševa ili pacova koji eksprimiraju segmente humanih teških lanaca, i domene dobijene inženjeringom i jednodomenske skelete osim onih izvedenih iz antitela. Bilo koja sdAb poznata u struci ili razvijena od strane pronalazača, uključujući jednodomenska antitela opisana u gornjem odeljku, mogu se koristiti za konstruisanje CAR opisanih ovde. sdAb mogu biti izvedena iz bilo koje vrste, uključujući, ali ne ograničavajući se na miševe, pacove, ljude, kamile, lame, paklare, ribe, ajkule, koze, zečeve i goveda. Jednodomenska antitela koja se ovde razmatraju takođe uključuju prirodno prisutne molekule jednodomenih antitela iz vrsta koje nisu iz Camelidae i ajkula.
[0754] U nekim primerima izvođenja, sdAb je izveden iz prirodno prisutnog molekula koji vezuje antigen sa jednim domenom, poznatog kao antitelo teškog lanca bez lakih lanaca (ovde se takođe naziva „antitela samo sa teškim lancem“). Takvi molekuli sa jednim domenom su opisani u WO 94/04678 i Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, na primer.
[0755] Radi jasnoće, varijabilni domen izveden iz molekula teškog lanca koji prirodno nema laki lanac je ovde poznat kao V<H>H da bi se razlikovao od konvencionalnog V<H>od četiri lanca imunoglobulina. Takav V<H>H molekul može biti izveden iz antitela proizvedenih u vrsti Camelidae, na primer, kamila, lama, vikunja, jednogrba kamila, alpaka i gvanako. Druge vrste pored porodice Camelidae mogu proizvoditi molekule teškog lanca koji prirodno nemaju laki lanac, i takvi V<H>H su u okviru ovog pronalaska.
[0756] V<H>H molekuli iz kamelida su oko 10 puta manji od molekula IgG. Oni su pojedinačni polipeptidi i mogu biti veoma stabilni, otporni na ekstremne pH i temperaturne uslove. Dodatno, mogu biti otporni na dejstvo proteaza, što nije slučaj sa konvencionalnim antitelima sa 4 lanca. Dalje, in vitro ekspresija V<H>H proizvodi visok prinos, pravilno savijen funkcionalni V<H>H. Pored toga, antitela generisana kod kamila mogu prepoznati epitope osim onih koje prepoznaju antitela generisana in vitro upotrebom biblioteka antitela ili imunizacijom sisara koji nisu kamile (videti, na primer, WO9749805). Kao takvi, multispecifični ili multivalentni CAR koji sadrže jedan ili više V<H>H domena mogu efikasnije da interaguju sa ciljevima nego multispecifični ili multivalentni CAR koji sadrže fragmente koji vezuju antigen izveden iz konvencionalnih antitela sa 4 lanca. Pošto je poznato da se V<H>H vezuju za „neuobičajene“ epitope kao što su šupljine ili žlebovi, afinitet CAR koji sadrže takve V<H>Hs može biti pogodniji za terapijski tretman nego konvencionalni multispecifični polipeptidi.
[0757] U nekim primerima izvođenja, sdAb je izvedeno iz varijabilnog regiona imunoglobulina koji se nalazi u hrskavičavim ribama. Na primer, sdAb može biti izveden iz imunoglobulinskog izotipa poznatog kao Novi antigenski receptor (NAR) koji se nalazi u serumu ajkule. Postupci proizvodnje molekula sa jednim domenom izvedenih iz varijabilnog regiona NAR („IgNAR“) su opisane u WO 03/014161 i Streltsov (2005) Protein Sci.14:2901‑2909.
[0758] [0402] U nekim primerima izvođenja, sdAb je rekombinantno, CDR-kalemljeno, humanizovano, kamelizovano, deimunizovano i/ili in vitro generisano (npr., odabrano fagnim prikazom). U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca okvirnih regiona može biti izmenjena „kamelizacijom“ specifičnih aminokiselinskih ostataka u okvirnim regionima. Kamelizacija se odnosi na zamenu ili supstituciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci (prirodno prisutnog) V<H>domena iz konvencionalnog antitela sa 4 lanca jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućoj poziciji (pozicijama) u V<H>H domenu teškog lanca antitela. Ovo se može izvesti na način poznat sam po sebi, što će biti jasno stručnjaku, na primer na osnovu daljeg opisa ovde. Takve „kamelizujuće“ supstitucije se poželjno ubacuju na pozicije aminokiselina koje formiraju i/ili su prisutne na V<H>-V<L>interfejsu, i/ili na takozvanim ostacima karakterističnog obeležja Camelidae, kako je ovde definisano (videti na primer WO 94/04678, Davies and Riechmann Protein Engineering 9 (6): 531‑537, 1996; Riechmann J. Mol. Biol. 259: 957‑969, 1996; i Riechmann and Muyldermans J. Immunol. Meth. 231: 25‑38, 1999).
[0759] sdAb može biti humano jednodomensko antitelo koje proizvode transgeni miševi ili pacovi koji eksprimiraju segmente humanog teškog lanca. Videti, npr., US20090307787A1, U.S. Pat. br.8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1 i WO2004049794. U nekim primerima izvođenja, sdAb je afinitetno zrelo.
[0760] U nekim primerima izvođenja, prirodno prisutni V<H>H domeni protiv određenog antigena ili cilja, mogu se dobiti iz (naivnih ili imunih) biblioteka kamelidne V<H>H sekvence. Takvi postupci mogu, ali i ne moraju da uključuju skrining takve biblioteke korišćenjem navedenog antigena ili cilja, ili barem jednog dela, fragmenta, antigenske determinante ili epitopa istog, koristeći jednu ili više tehnika skrininga poznatih po sebi. Takve biblioteke i tehnike su, na primer, opisane u WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 i WO 03/035694. Alternativno, mogu se koristiti poboljšane sintetičke ili polusintetičke biblioteke izvedene iz (naivnog ili imunog) V<H>H biblioteke, kao što su V<H>H biblioteke dobijene iz (naivnih ili imunih) V<H>H biblioteka tehnikama kao što su slučajna mutageneza i/ili premeštanje CDR, kao što je na primer opisano u WO 00/43507.
[0761] Jednodomenska antitela mogu se generisati iz konvencionalnih četvorolančanih antitela. Videti, na primer, EP 0368 684, Ward et al. (Nature 1989 Oct.12; 341 (6242): 544‑6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484‑490; WO 06/030220; i WO 06/003388.
[0763] 2. Antigeni
[0765] Antigen(i) koje ciljaju CAR ovog pronalaska su molekuli na površini ćelija. Jednodomenska antitela mogu biti izabrana da prepoznaju antigen koji deluje kao marker na površini ćelija na ciljnim ćelijama povezanim sa posebnim bolesnim stanjem. U nekim primerima izvođenja, antigen (kao što je prvi antigen i/ili drugi antigen) je tumorski antigen. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR ciljaju dva ili više tumorskih antigena. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen je povezan sa malignitetom B ćelija. Tumori eksprimiraju brojne proteine koji mogu poslužiti kao ciljni antigen za imuni odgovor, posebno imune odgovore posredovane T ćelijama. Antigeni koje cilja CAR mogu biti antigeni na jednoj oboleloj ćeliji ili antigeni koji se eksprimiraju na različitim ćelijama, a svaka od njih doprinosi bolesti. Antigeni koje cilja CAR mogu biti direktno ili indirektno uključeni u bolesti.
[0766] Tumorski antigeni su proteini koje proizvode tumorske ćelije i koji mogu izazvati imuni odgovor, posebno imuni odgovor posredovan T-ćelijama. Izbor ciljanog antigena pronalaska zavisiće od određene vrste kancera koja se leči. Primeri tumorskih antigena uključuju, na primer, antigen povezan sa gliomom, karcinoembrionalni antigen (CEA), β-humani horionski gonadotropin, alfafetoprotein (AFP), lektin-reaktivni AFP, tiroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, reverznu transkriptazu humane telomeraze, RU1, RU2 (AS), crevnu karboksil esterazu, mut hsp70-2, M-CSF, prostazu, specifični antigen prostate (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, HER2/neu, survivin i telomerazu, antigen tumora karcinoma prostate-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, neutrofilnu elastazu, efrinB2, CD22, faktor rasta insulina (IGF)-I, IGF-II, IGF-I receptor i mezotelin.
[0767] U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen sadrži jedan ili više antigenskih epitopa kancera povezanih sa malignim tumorom. Maligni tumori eksprimiraju brojne proteine koji mogu poslužiti kao ciljni antigeni za imuni napad. Ovi molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, tkivno specifične antigene kao što su MART-1, tirozinaza i gp100 kod melanoma i kisela fosfataza prostate (PAP) i antigen specifičan za prostatu (PSA) kod kancera prostate. Drugi ciljni molekuli pripadaju grupi molekula povezanih sa transformacijom, kao što je onkogen HER2/Neu/ErbB-2. Još jedna grupa ciljnih antigena su onko-fetalni antigeni kao što je karcinoembrionski antigen (CEA). Kod B-ćelijskog limfoma, tumor-specifični idiotipski imunoglobulin predstavlja stvarni tumor-specifični imunoglobulinski antigen koji je jedinstven za pojedinačni tumor. Antigeni diferencijacije B-ćelija kao što su CD 19, CD20 i CD37 su drugi kandidati za ciljne antigene kod B-ćelijskog limfoma.
[0768] U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen je tumor-specifični antigen (TSA) ili tumor-asocirani antigen (TAA). TSA je jedinstven za tumorske ćelije i ne javlja se na drugim ćelijama u telu. Antigen asociran na TAA nije jedinstven za tumorsku ćeliju, već se eksprimira i na normalnoj ćeliji pod uslovima koji ne uspevaju da indukuju stanje imunološke tolerancije na antigen. Ekspresija antigena na tumoru može se desiti pod uslovima koji omogućavaju imunološkom sistemu da odgovori na antigen. TAA mogu biti antigeni koji se eksprimiraju na normalnim ćelijama tokom fetalnog razvoja, kada je imuni sistem nezreo i nije u stanju da odgovori, ili mogu biti antigeni koji su normalno prisutni na izuzetno niskim nivoima na normalnim ćelijama, ali koji se eksprimiraju na mnogo višim nivoima na tumorskim ćelijama.
[0769] [0410] Neograničavajući primeri TSA ili TAA antigena uključuju sledeće: antigeni diferencijacije kao što su MART-1/MelanA (MART-I), gp 100 (Pmel 17), tirozinaza, TRP-1, TRP-2 i tumor-specifični multilinejdž antigeni kao što su MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5; prekomerno eksprimirani embrionalni antigeni kao što je CEA; prekomerno eksprimirani onkogeni i mutirani geni supresora tumora kao što su p53, Ras, HER2/neu; jedinstveni tumorski antigeni koji nastaju usled hromozomskih translokacija; kao što su BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; i virusni antigeni, kao što su antigeni Epstein-Barr virusa EBVA i antigeni humanog papiloma virusa (HPV) E6 i E7. Drugi veliki antigeni zasnovani na proteinima uključuju TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-katenin, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfafetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 vezujući protein\ciklofilin C-asocirani protein, TAAL6, TAG72, TLP i TPS.
[0770] U nekim primerima izvođenja, antigen (kao što je prvi antigen i/ili drugi antigen) je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77.
[0772] 3. Peptidni linkeri
[0774] Različita jednodomenska antitela u multispecifičnim ili multivalentnim CAR opisanim ovde mogu biti fuzionisana jedno sa drugim putem peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, jednodomenska antitela su direktno fuzionisana jedno sa drugim bez ikakvih peptidnih linkera. Peptidni linkeri koji povezuju različita jednodomenska antitela mogu biti isti ili različiti. Različiti domeni CAR takođe mogu biti fuzionisani jedan sa drugim putem peptidnih linkera.
[0775] [0413] Svaki peptidni linker u CAR može imati istu ili različitu dužinu i/ili sekvencu u zavisnosti od strukturnih i/ili funkcionalnih karakteristika jednodomenskih antitela i/ili različitih domena. Svaki peptidni linker može biti odabran i optimizovan nezavisno. Dužina, stepen fleksibilnosti i/ili druga svojstva peptidnog (peptidnih) linkera (ili više njih) koji se koriste u CAR mogu imati određeni uticaj na svojstva, uključujući, ali ne ograničavajući se na afinitet, specifičnost ili avidnost za jedan ili više određenih antigena ili epitopa. Na primer, duži peptidni linkeri mogu biti odabrani kako bi se osiguralo da dva susedna domena ne ometaju jedan drugi. Na primer, u multivalentnom ili multispecifičnom CAR ovog pronalaska koji sadrži jednodomenska antitela usmerena protiv multimernog antigena, dužina i fleksibilnost peptidnih linkera su poželjno takve da omogućavaju svakom jednodomenskom antitelu u multivalentnom CAR da se veže za antigensku determinantu na svakoj od podjedinica multimera. U nekim primerima izvođenja, kratki peptidni linker može biti postavljen između transmembranskog domena i intracelularnog signalnog domena CAR. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži fleksibilne ostatke (kao što su glicin i serin) tako da se susedni domeni mogu slobodno kretati jedan u odnosu na drugi. Na primer, dublet glicin-serina može biti pogodan peptidni linker.
[0776] Peptidni linker može biti bilo koje odgovarajuće dužine. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker je dugačak najmanje otprilike 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ili više aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od otprilike 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili manje aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, dužina peptidnog linkera je bilo koja od oko 1 aminokiseline do oko 10 aminokiselina, oko 1 aminokiseline do oko 20 aminokiselina, oko 1 aminokiseline do oko 30 aminokiselina, oko 5 aminokiselina do oko 15 aminokiselina, oko 10 aminokiselina do oko 25 aminokiselina, oko 5 aminokiselina do oko 30 aminokiselina, oko 10 aminokiselina do oko 30 aminokiselina, oko 30 aminokiselina do oko 50 aminokiselina, oko 50 aminokiselina do oko 100 aminokiselina ili oko 1 aminokiseline do oko 100 aminokiselina.
[0777] Peptidni linker može imati prirodnu sekvencu ili sekvencu koja se ne javlja prirodno. Na primer, sekvenca izvedena iz zglobnog regiona antitela koja sadrže samo teške lance može se koristiti kao linker. Videti, na primer, WO1996/34103. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker je fleksibilni linker. Primeri fleksibilnih linkera uključuju glicinske polimere (G)<n>, glicin-serin polimere (uključujući, na primer, (GS)<n>, (GSGGS)<n>, (GGGS)<n>i (GGGGS)<n>, pri čemu je n ceo broj od najmanje jedan), glicin-alanin polimeri, alanin-serin polimere i druge fleksibilne linkere poznate u struci. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu GGGGS (SEQ ID NO: 144), (GGGGS)<2>(SEQ ID NO: 145), (GGGS)<4>(SEQ ID NO: 146), GGGGGGGGGSGGGGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 147), GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGS (SEQ ID NO: 148), (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 149), (GGGGS)<4>(SEQ ID NO: 150), ili (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 151).
[0779] Transmembranski domen
[0781] [0416] CAR ovog pronalaska sadrže transmembranski domen koji se može direktno ili indirektno fuzionisati sa ekstracelularnim domenom za vezivanje antigena. Transmembranski domen može biti izveden ili iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kako se ovde koristi, „transmembranski domen“ se odnosi na bilo koju proteinsku strukturu koja je termodinamički stabilna u ćelijskoj membrani, poželjno eukariotskoj ćelijskoj membrani. Transmembranski domeni kompatibilni za upotrebu u CAR opisanim ovde mogu se dobiti iz prirodno prisutnog proteina. Alternativno, to može biti sintetički, neprirodni proteinski segment, npr., hidrofobni proteinski segment koji je termodinamički stabilan u ćelijskoj membrani.
[0782] Transmembranski domeni se klasifikuju na osnovu trodimenzionalne strukture transmembranskog domena. Na primer, transmembranski domeni mogu formirati alfa heliks, kompleks od više alfa heliksa, beta-bure ili bilo koju drugu stabilnu strukturu sposobnu da obuhvati fosfolipidni dvosloj ćelije. Dodatno, transmembranski domeni se takođe ili alternativno mogu klasifikovati na osnovu topologije transmembranskog domena, uključujući broj prolaza koje transmembranski domen pravi kroz membranu i orijentaciju proteina. Na primer, membranski proteini sa jednim prolazom prelaze ćelijsku membranu jednom, a membranski proteini sa više prolaza prelaze ćelijsku membranu najmanje dva puta (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više puta). Membranski proteini mogu se definisati kao Tip I, Tip II ili Tip III u zavisnosti od topologije njihovih završetaka i segmenata koji prolaze kroz membranu u odnosu na unutrašnjost i spoljašnjost ćelije. Membranski proteini tipa I imaju jedan region koji prelazi membranu i orijentisani su tako da je N-terminus proteina prisutan na ekstracelularnoj strani lipidnog dvosloja ćelije, a C-terminus proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani. Membranski proteini tipa II takođe imaju jedan region koji prelazi membranu, ali su orijentisani tako da je C-terminus proteina prisutan na ekstracelularnoj strani lipidnog dvosloja ćelije, a N-terminus proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani. Membranski proteini tipa III imaju više segmenata koji prelaze membranu i mogu se dalje podklasifikovati na osnovu broja transmembranskih segmenata i lokacije N- i C-terminusa.
[0783] U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen CAR opisan ovde je izveden iz jednoprolaznog membranskog proteina tipa I. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domeni iz višeprolaznih membranskih proteina takođe mogu biti kompatibilni za upotrebu u CAR opisanim ovde. Višeprolazni membranski proteini mogu da sadrže složene (najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više) alfa heliksa ili beta nabrane ploče. Poželjno je da se N-terminus i C-terminus višeprolaznog membranskog proteina nalaze na suprotnim stranama lipidnog dvosloja, npr., N-terminus proteina je prisutan na citoplazmatskoj strani lipidnog dvosloja, a C-terminus proteina je prisutan na ekstracelularnoj strani.
[0784] [0419] U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen CAR sadrži transmembranski domen izabran od transmembranskog domena alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gama, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Taktilni), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D i/ili NKG2C. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izveden iz molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1.
[0785] U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izveden iz CD28. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je transmembranski domen CD28 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen CD28 je kodiran sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 135.
[0786] U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izveden iz CD8α. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je transmembranski domen CD8α koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen CD8α je kodiran sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 134.
[0787] Transmembranski domeni za upotrebu u CAR opisanim ovde mogu takođe da sadrže bar deo sintetičkog, neprirodnog proteinskog segmenta. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je sintetička, neprirodna alfa heliks ili beta nabrana ploča. U nekim primerima izvođenja, proteinski segment je najmanje približno 20 aminokiselina, npr., najmanje 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više aminokiselina. Primeri sintetičkih transmembranskih domena su poznati u struci, na primer u U.S. Patentu br.7,052,906 B1 i PCT objavi br. WO 2000/032776 A2.
[0788] [0423] Transmembranski domen može da sadrži transmembranski region i citoplazmatski region koji se nalazi na C-terminalnoj strani transmembranskog domena. Citoplazmatski region transmembranskog domena može da sadrži tri ili više aminokiselina i, u nekim primerima izvođenja, pomaže u orijentaciji transmembranskog domena u lipidnom dvosloju. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više cisteinskih ostataka prisutni su u transmembranskom regionu transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više cisteinskih ostataka prisutni su u citoplazmatskom regionu transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, citoplazmatski region transmembranskog domena sadrži pozitivno naelektrisane aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, citoplazmatski region transmembranskog domena sadrži aminokiseline arginin, serin i lizin.
[0789] U nekim primerima izvođenja, transmembranski region transmembranskog domena sadrži hidrofobne ostatke aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen CAR sadrži veštačku hidrofobnu sekvencu. Na primer, triplet fenilalanina, triptofana i valina može biti prisutan na C-terminusu transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, transmembranski region sadrži uglavnom hidrofobne ostatke aminokiselina, kao što su alanin, leucin, izoleucin, metionin, fenilalanin, triptofan ili valin. U nekim primerima izvođenja, transmembranski region je hidrofoban. U nekim primerima izvođenja, transmembranski region sadrži poli-leucin-alanin sekvencu. Hidropatija, ili hidrofobne ili hidrofilne karakteristike proteina ili proteinskog segmenta, mogu se proceniti bilo kojom metodom poznatom u struci, na primer, analizom hidropatije Kyte i Doolittle.
[0791] Intraćelijski signalni domen
[0793] CAR ovog pronalaska sadrže intracelularni signalni domen. Intracelularni signalni domen je odgovoran za aktivaciju najmanje jedne od normalnih efektorskih funkcija imune efektorske ćelije koja eksprimira CAR. Termin „efektorska funkcija“ odnosi se na specijalizovanu funkciju ćelije. Efektorska funkcija T ćelije, na primer, može biti citolitička aktivnost ili pomoćna aktivnost, uključujući lučenje citokina. Stoga se termin „citoplazmatski signalni domen“ odnosi na deo proteina koji prenosi signal efektorske funkcije i usmerava ćeliju da obavlja specijalizovanu funkciju. Iako se obično može koristiti ceo citoplazmatski signalni domen, u mnogim slučajevima nije neophodno koristiti ceo lanac. U meri u kojoj se koristi skraćeni deo citoplazmatskog signalnog domena, takav skraćeni deo se može koristiti umesto intaktnog lanca sve dok prenosi signal efektorske funkcije. Termin citoplazmatski signalni domen stoga treba da sadrži bilo koji skraćeni deo citoplazmatskog signalnog domena dovoljan za prenos signala efektorske funkcije.
[0794] [0426] U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, CAR sadrži intracelularni signalni domen koji se u suštini sastoji od primarnog intracelularnog signalnog domena imune efektorske ćelije. „Primarni intracelularni signalni domen“ odnosi se na citoplazmatsku signalnu sekvencu koja deluje na stimulativni način da bi indukovala imune efektorske funkcije. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen sadrži signalni motiv poznat kao motiv aktivacije zasnovan na tirozinu imunoreceptora, ili ITAM. „ITAM“, kako se ovde koristi, je konzervirani proteinski motiv koji je generalno prisutan u repnom delu signalnih molekula eksprimiranih u mnogim imunim ćelijama. Motiv može da sadrži dva ponavljanja aminokiselinskih sekvenci YxxL/I razdvojena sa 6-8 aminokiselina, gde je svaki x nezavisno bilo koja aminokiselina, proizvodeći konzervirani motiv YxxL/Ix(6-8)YxxL/I. ITAM unutar signalnih molekula su važni za transdukciju signala unutar ćelije, koja je posredovana barem delimično fosforilacijom tirozinskih ostataka u ITAM nakon aktivacije signalnog molekula. ITAM mogu takođe funkcionisati kao mesta za vezivanje za druge proteine uključene u signalne puteve. Primeri primarnih citoplazmatskih signalnih sekvenci koje sadrže ITAM uključuju one izvedene iz CD3ζ, FcR gama (FCER1G), FcR beta (Fc Epsilon Rib), CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.
[0795] U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen se sastoji od citoplazmatskog signalnog domena CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je citoplazmatski signalni domen divljeg tipa CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen divljeg tipa CD3ζ sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen divljeg tipa CD3ζ je kodiran nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 142. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je funkcionalni mutant citoplazmatskog signalnog domena CD3ζ koji sadrži jednu ili više mutacija, kao što je Q65K. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen mutanta CD3ζ sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141. U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen mutanta CD3ζ je kodiran nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 143.
[0797] Ko-stimulatorni signalni domen
[0799] [0428] Mnogim imunim efektorskim ćelijama je potrebna kostimulacija, pored stimulacije antigen-specifičnog signala, da bi se podstakla ćelijska proliferacija, diferencijacija i preživljavanje, kao i da bi se aktivirale efektorske funkcije ćelije. U nekim primerima izvođenja, CAR sadrži najmanje jedan kostimulatorni signalni domen. Termin „kostimulatorni signalni domen“, kako se ovde koristi, odnosi se na najmanje deo proteina koji posreduje u prenosu signala unutar ćelije da bi se indukovao imuni odgovor, kao što je efektorska funkcija. Kostimulatorni signalni domen himernog receptora opisanog ovde može biti citoplazmatski signalni domen iz kostimulatornog proteina, koji prenosi signal i modulira odgovore posredovane imunim ćelijama, kao što su T ćelije, NK ćelije, makrofagi, neutrofili ili eozinofili. „Kostimulatorni signalni domen“ može biti citoplazmatski deo kostimulatornog molekula. Termin „ko-stimulatorni molekul“ odnosi se na srodnog partnera za vezivanje na imunoj ćeliji (kao što je T ćelija) koji se specifično vezuje sa kostimulatornim ligandom, čime posreduje kostimulatorni odgovor imune ćelije, kao što su, ali ne ograničavajući se na, proliferaciju i preživljavanje.
[0800] U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži jedan kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži dva ili više (kao što je otprilike bilo koji od 2, 3, 4 ili više) kostimulatornih signalnih domena. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži dva ili više istih kostimulatornih signalnih domena, na primer, dve kopije kostimulatornog signalnog domena CD28. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži dva ili više kostimulatornih signalnih domena iz različitih kostimulatornih proteina, kao što su bilo koja dva ili više kostimulatornih proteina opisanih ovde. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen (kao što je citoplazmatski signalni domen CD3ζ) i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena i primarni intracelularni signalni domen (kao što je citoplazmatski signalni domen CD3ζ) su fuzionisani jedan sa drugim putem opcionih peptidnih linkera. Primarni intracelularni signalni domen i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena mogu biti raspoređeni bilo kojim odgovarajućim redosledom. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena nalaze se između transmembranskog domena i primarnog intracelularnog signalnog domena (kao što je citoplazmatski signalni domen CD3ζ). Višestruki kostimulatorni signalni domeni mogu pružiti aditivne ili sinergističke stimulativne efekte.
[0801] Aktivacija kostimulatornog signalnog domena u ćeliji domaćinu (npr., imuna ćelija) može indukovati ćeliju da poveća ili smanji proizvodnju i sekreciju citokina, fagocitna svojstva, proliferaciju, diferencijaciju, preživljavanje i/ili citotoksičnost. Kostimulatorni signalni domen bilo kog kostimulatornog molekula može biti kompatibilan za upotrebu u CAR opisanim ovde. Tip(ovi) kostimulatornog signalnog domena se biraju na osnovu faktora kao što je tip imunih efektorskih ćelija u kojima bi se efektorski molekuli eksprimirali (npr., T ćelije, NK ćelije, makrofagi, neutrofili ili eozinofili) i željena imuna efektorska funkcija (npr., ADCC efekat). Primeri kostimulatornih signalnih domena za upotrebu u CAR mogu biti citoplazmatski signalni domen kostimulatornih proteina, uključujući, bez ograničenja, članove porodice B7/CD28 (npr., B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC i PDCD6); članovi TNF superfamilije (npr.,4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB ligand/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 ligand/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 ligand/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 ligand/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR ligand/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, limfotoksin-alfa/TNF-beta, OX40/TNFRSF4, OX40 ligand/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-alfa i TNF RII/TNFRSF1B); članovi SLAM porodice (npr., 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 i SLAM/CD150); i bilo koji drugi kostimulatorni molekuli, kao što su CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA klase I, HLA-DR, Ikaros, Integrin alfa 4/CD49d, Integrin alfa 4 beta 1, Integrin alfa 4 beta 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, antigen-1 povezan sa funkcijom limfocita (LFA-1) i NKG2C.
[0802] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena su odabrani iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, CD3, antigena-1 povezanog sa funkcijom limfocita (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 i liganda koji se posebno vezuju za CD83.
[0803] U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen u CAR ovog pronalaska sadrži kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži citoplazmatski signalni domen CD3ζ i kostimulatorni signalni domen CD28. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen CD28 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen CD28 je kodiran nukleinskom kiselinskom SEQ ID NO: 138. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen je kodiran nukleinskom kiselinskom SEQ ID NO: 228.
[0804] U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen u CAR ovog pronalaska sadrži kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 (tj., 4-1BB). U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži citoplazmatski signalni domen CD3ζ i kostimulatorni signalni domen CD137. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen CD137 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen CD137 je kodiran nukleinskom kiselinskom SEQ ID NO: 139.
[0805] U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen u CAR ovog pronalaska sadrži kostimulatorni signalni domen CD28 i kostimulatorni signalni domen CD137. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži citoplazmatski signalni domen CD3ζ, kostimulatorni signalni domen CD28 i kostimulatorni signalni domen CD137. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži polipeptid koji sadrži od N-terminusa do C-terminusa: kostimulatorni signalni domen CD28, kostimulatorni signalni domen CD137 i citoplazmatski signalni domen CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen CD28 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen CD28 je kodiran sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 138. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen CD137 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen CD137 je kodiran sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 139.
[0806] Takođe u okviru ovog otkrića su varijante bilo kog od kostimulatornih signalnih domena opisanih ovde, tako da je kostimulatorni signalni domen sposoban da modulira imuni odgovor imune ćelije. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domeni sadrže do 10 varijacija aminokiselinskih ostataka (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 8) u poređenju sa ekvivalentom divljeg tipa. Takvi kostimulatorni signalni domeni koji sadrže jednu ili više varijacija aminokiselina mogu se nazvati varijantama. Mutacija aminokiselinskih ostataka kostimulatornog signalnog domena može dovesti do povećanja signalne transdukcije i poboljšane stimulacije imunih odgovora u odnosu na kostimulatorne signalne domene koji ne sadrže mutaciju. Mutacija aminokiselinskih ostataka kostimulatornog signalnog domena može dovesti do smanjenja signalne transdukcije i smanjene stimulacije imunih odgovora u odnosu na kostimulatorne signalne domene koji ne sadrže mutaciju.
[0808] Zglobni region
[0810] CAR ovog pronalaska mogu da sadrže zglobni domen koji se nalazi između ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i transmembranskog domena. Zglobni domen je segment aminokiseline koji se generalno nalazi između dva domena proteina i može omogućiti fleksibilnost proteina i kretanje jednog ili oba domena u odnosu jedan na drugi. Može se koristiti bilo koja sekvenca aminokiseline koja obezbeđuje takvu fleksibilnost i kretanje ekstracelularnog domena za vezivanje antigena u odnosu na transmembranski domen efektorskog molekula.
[0811] Zglobni domen može da sadrži oko 10-100 aminokiselina, npr., oko bilo kojeg od 15-75 aminokiselina, 20-50 aminokiselina ili 30-60 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen može biti dugačak najmanje 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ili 75 aminokiselina.
[0812] U nekim primerima izvođenja, zglobni domen je zglobni domen prirodnog proteina. Zglobni domeni bilo kog proteina za koji se u struci zna da sadrži zglobni domen su kompatibilni za upotrebu u himernim receptorima opisanim ovde. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen je bar deo zglobnog domena prirodnog proteina i obezbeđuje fleksibilnost himernom receptoru. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen je izveden iz CD8α. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen je deo zglobnog domena CD8α, npr., fragment koji sadrži najmanje 15 (npr., 20, 25, 30, 35, ili 40) uzastopnih aminokiselina zglobnog domena CD8α. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen CD8α sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen CD8α je kodiran sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 131.
[0813] Zglobni domeni antitela, kao što su IgG, IgA, IgM, IgE ili IgD antitela, takođe su kompatibilni za upotrebu u pH-zavisnim himernim receptorskim sistemima opisanim ovde. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen je zglobni domen koji spaja konstantne domene CH1 i CH2 antitela. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen je od antitela i sadrži zglobni domen antitela i jedan ili više konstantnih regiona antitela. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen sadrži zglobni domen antitela i CH3 konstantni region antitela. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen sadrži zglobni domen antitela i CH2 i CH3 konstantne regione antitela. U nekim primerima izvođenja, antitelo je IgG, IgA, IgM, IgE ili IgD antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo je IgG antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo. U nekim primerima izvođenja, zglobni region sadrži zglobni region i CH2 i CH3 konstantne regione IgG1 antitela. U nekim primerima izvođenja, zglobni region sadrži zglobni region i konstantni CH3 region IgG1 antitela.
[0814] Peptidi koji se ne javljaju u prirodi takođe se mogu koristiti kao zglobni domeni za himerne receptore opisane ovde. U nekim primerima izvođenja, zglobni domen između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje liganda Fc receptora i N-terminusa transmembranskog domena je peptidni linker, kao što je (GxS)n linker, gde x i n, nezavisno, mogu biti ceo broj između 3 i 12, uključujući 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili više.
[0816] Signalni peptid
[0817] CAR ovog pronalaska mogu da sadrže signalni peptid (takođe poznat kao signalna sekvenca) na N-terminusu polipeptida. Generalno, signalni peptidi su peptidne sekvence koje usmeravaju polipeptid na željeno mesto u ćeliji. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid usmerava efektorski molekul na sekretorni put ćelije i omogućiće integraciju i usidravanje efektorskog molekula u lipidni dvosloj. Signalni peptidi, uključujući signalne sekvence prirodnih proteina ili sintetičke, neprirodne signalne sekvence, koje su kompatibilne za upotrebu u CAR opisanim ovde, biće očigledni stručnjaku u ovoj oblasti. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je izveden iz molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD8α, GM-CSF receptora α i teškog lanca IgG1. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je izveden iz CD8α. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid CD8α sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid CD8α je kodiran sekvencom nukleinske kiselinske SEQ ID NO: 128 ili SEQ ID NO: 129.
[0819] IV. Imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom
[0821] Dalje su obezbeđene imune efektorske ćelije koje sadrže bilo koji od CAR pronalaska.
[0822] [0443] Dakle, u nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor (CAR) pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen (kao što je prvi tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen (kao što je drugi tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu se prvi antigen razlikuje od drugog antigena. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen i/ili drugi antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD8α, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je alogena.
[0823] [0444] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži BCMA × CD38 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb i/ili anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je fuzionisano na N-terminusu anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je fuzionisano na C-terminusu anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 207-216. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je alogena.
[0824] [0445] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži CD19 × CD20 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-CD20 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-CD20 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo i anti-CD20 jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na N-terminusu anti-CD20 sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na C-terminusu anti-CD20 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je alogena.
[0825] [0446] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži CD19 × CD22 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-CD22 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-CD22 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD22 jednodomensko antitelo i anti-CD22 jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na N-terminusu anti-CD22 sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na C-terminusu anti-CD22 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD22 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD22 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim primerima izvođenja, inženjeringom dobijena imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, inženjerisana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima izvođenja, inženjeringom dobijena imuna efektorska ćelija je alogena.
[0826] [0447] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži CD19 × BCMA CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-BCMA jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-BCMA jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na N-terminusu anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na C-terminusu anti-BCMA sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD8α, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je alogena.
[0827] [0448] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži multivalentni himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži više jednodomenskih antitela (sdAb) koja se specifično vezuju za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, više sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, više jednodomenskih antitela je fuzionisano jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker je dugačak najviše oko 50 (kao što je najviše oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR je monospecifičan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR je multispecifičan, kao što je bispecifičan. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 198-201.
[0828] [0449] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži multivalentni himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu su prvi epitop i drugi epitop različiti. U nekim primerima izvođenja, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena.
[0829] [0450] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži CD19 himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, gde anti-CD19 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Otkriveno kao referenca, CD19 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 248. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je T ćelija, NK ćelija, periferna mononuklearna ćelija krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena.
[0830] [0451] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija iz pronalaska) koja sadrži CD20 CAR iz pronalaska, koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD20 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, gde anti-CD20 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb dalje sadrži FR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 244, FR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 245, FR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 246 i/ili FR4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 247. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Otkriveno kao referenca, CD20 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 249. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena.
[0831] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži BCMA CAR pronalaska, a koja sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-BCMA sdAb sadrži bilo šta od sledećeg:
[0833] (12) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0834] (13) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0835] (14) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0836] (15) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0837] (16) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0838] (17) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0839] (18) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
[0840] (19) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
[0841] (20) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37;
[0842] (21) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; ili
[0843] (22) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39.
[0845] [0453] U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:78-88. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Dato kao referenca, BCMA CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 152-162. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena.
[0846] U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži CD38 CAR pronalaska, koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD38 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-CD38 sdAb sadrži bilo šta od sledećeg:
[0848] (13) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
[0849] (14) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
[0850] (15) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
[0851] (16) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
[0852] (17) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
[0853] (18) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
[0854] (19) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
[0855] (20) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
[0856] (21) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
[0857] (22) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
[0858] (23) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
[0859] (24) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
[0861] [0455] U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:89-100. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, anti-CD38 sdAb, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Kao referenca, otkriven je CD38 CAR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 163-174. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je T ćelija, NK ćelija, mononuklearna ćelija periferne krvi (PBMC), hematopoetska matična ćelija, pluripotentna matična ćelija ili embrionalna matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena.
[0862] Takođe su obezbeđene imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom koje sadrže (ili eksprimiraju) dva ili više različitih CAR. Bilo koja dva ili više CAR opisanih ovde mogu se eksprimirati u kombinaciji. CAR mogu ciljati različite antigene, čime se obezbeđuju sinergistički ili aditivni efekti. Pošto jednodomenska antitela u ekstracelularnim domenima za vezivanje antigena CAR imaju samo varijabilne lance jednog antigena (kao što su teški lanci), takve ćelije koje eksprimiraju CAR nemaju probleme sa pogrešnim uparivanjem varijabilnih lanaca, kao što se vidi kod imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom koje koeksprimiraju dva ili više CAR zasnovanih na scFv. Primeri imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom koje koeksprimiraju dva V<H>H-bazirani CAR su ilustrovane na slici 1E. Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da CAR zasnovani na drugim sdAb ili koji imaju druge strukture kao što je ovde opisano mogu biti koeksprimirani i u imunim efektorskim ćelijama dobijenim genetskim inženjeringom. Dva ili više CAR mogu biti kodirani na istom vektoru ili različitim vektorima.
[0863] Imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom može dalje eksprimirati jedan ili više terapeutskih proteina i/ili imunomodulatora, kao što su inhibitori imunoloških kontrolnih tačaka. Videti, na primer, međunarodne patentne prijave br. PCT/CN2016/073489 i PCT/CN2016/087855.
[0865] Vektori
[0867] [0458] Predmetni pronalazak obezbeđuje vektore za kloniranje i ekspresiju bilo kog od CAR iz pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vektor je pogodan za replikaciju i integraciju u eukariotske ćelije, kao što su ćelije sisara. U nekim primerima izvođenja, vektor je virusni vektor. Primeri virusnih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, adenovirusne vektore, adenoasocirane virusne vektore, lentivirusni vektor, retrovirusne vektore, vektor vakcinije, vektor virusa herpes simplex i njihove derivate. Tehnologija virusnih vektora je dobro poznata u struci i opisana je, na primer, u Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), i u drugim priručnicima iz virusologije i molekularne biologije.
[0868] Razvijen je niz sistema zasnovanih na virusima za prenos gena u ćelije sisara. Na primer, retrovirusi obezbeđuju pogodnu platformu za sisteme za isporuku gena. Heterologna nukleinska kiselina može biti umetnuta u vektor i upakovana u retrovirusne čestice korišćenjem tehnika poznatih u struci. Rekombinantni virus se zatim može izolovati i isporučiti u genetski modifikovanu ćeliju sisara in vitro ili ex vivo. U struci je poznat niz retrovirusnih sistema. U nekim primerima izvođenja, koriste se adenovirusni vektori. U struci je poznat niz adenovirusnih vektora. U nekim primerima izvođenja, koriste se lentivirusni vektori. U nekim primerima izvođenja, koriste se samoinaktivirajući lentivirusni vektori. Na primer, samoinaktivirajući lentivirusni vektori koji nose kodirajuću sekvencu imunomodulatora (kao što je inhibitor imunske kontrolne tačke) i/ili samoinaktivirajući lentivirusni vektori koji nose himerne antigenske receptore mogu biti upakovani protokolima poznatim u struci. Dobijeni lentivirusni vektori mogu se koristiti za transdukciju ćelija sisara (kao što su primarne humane T ćelije) korišćenjem postupaka poznatih u struci. Vektori izvedeni iz retrovirusa kao što je lentivirus su pogodni alati za postizanje dugoročnog prenosa gena, jer omogućavaju dugoročnu, stabilnu integraciju transgena i njegovo razmnožavanje u ćelijama potomstva. Lentivirusni vektori takođe imaju nisku imunogenost i mogu transdukovati ćelije koje se ne proliferišu.
[0869] U nekim primerima izvođenja, vektor sadrži bilo koju od nukleinskih kiselina koje kodiraju CAR pronalaska. Nukleinska kiselina se može klonirati u vektor korišćenjem bilo koje poznate metode molekularnog kloniranja u struci, uključujući, na primer, korišćenje mesta restrikcionih endonukleaza i jednog ili više selektivnih markera. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je operativno povezana sa promotorom. Različite vrste promotora su istražene za ekspresiju gena u ćelijama sisara, i bilo koji od promotora poznatih u struci može se koristiti u ovom pronalasku. Promotori se mogu grubo kategorisati kao konstitutivni promotori ili regulisani promotori, kao što su inducibilni promotori.
[0870] [0461] U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa konstitutivnim promotorom. Konstitutivni promotori omogućavaju heterolognim genima (takođe poznatim kao transgeni) da se konstitutivno eksprimiraju u ćelijama domaćinima. Primeri konstitutivnih promotora koji se ovde razmatraju uključuju, ali nisu ograničeni na, promotore citomegalovirusa (CMV), humane faktore elongacije-1alfa (hEF1α), promotor ubikvitina C (UbiC), promotor fosfoglicerokinaze (PGK), rani promotor simijan virusa 40 (SV40) i promotor kokošijeg β-aktina spregnut sa ranim pojačivačem CMV (CAGG). Efikasnost takvih konstitutivnih promotora u pokretanju ekspresije transgena je široko upoređena u velikom broju studija. Na primer, Michael C. Milone et al uporedili su efikasnost CMV, hEF1α, UbiC i PGK u pokretanju ekspresije himernih antigenskih receptora u primarnim humanim T ćelijama i zaključili da hEF1α promotor ne samo da indukuje najviši nivo ekspresije transgena, već je i optimalno održavan u CD4 i CD8 humanim T ćelijama ((Molecular Therapy, 17(8): 1453‑1464 (2009)). U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa hEF1α promotorom.
[0871] U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira CAR je operativno povezana sa inducibilnim promotorom. Inducibilni promotori pripadaju kategoriji regulisanih promotora. Inducibilni promotor može biti indukovan jednim ili više uslova, kao što su fizičko stanje, mikrookruženje imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom ili fiziološko stanje imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom, induktora (tj., indukujući agens), ili njihova kombinacija. Indukujući uslov ne mora da indukuje ekspresiju endogenih gena u genetski modifikovanoj ćeliji sisara i/ili kod subjekta koji prima farmaceutsku kompoziciju. Indukujući uslov može biti izabran iz grupe koja se sastoji od: induktora, zračenja (kao što je jonizujuće zračenje, svetlost), temperature (kao što je toplota), redoks stanja, tumorskog okruženja i stanja aktivacije genetski modifikovane ćelije sisara.
[0872] U nekim primerima izvođenja, vektor takođe sadrži selektabilni marker gen ili reporter gen za selekciju ćelija koje eksprimiraju CAR iz populacije ćelija domaćina transfektovanih kroz lentivirusne vektore. I selektabilni markeri i reporter geni mogu biti okruženi odgovarajućim regulatornim sekvencama kako bi se omogućila ekspresija u ćelijama domaćinima. Na primer, vektor može da sadrži terminatore transkripcije i translacije, inicijacione sekvence i promotore korisne za regulaciju ekspresije sekvenci nukleinskih kiselina.
[0873] U nekim primerima izvođenja, vektor sadrži više od jedne nukleinske kiseline koja kodira CAR. U nekim primerima izvođenja, vektor sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi CAR i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi CAR, pri čemu je prva nukleinska kiselina operativno povezana sa drugom nukleinskom kiselinom preko treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira samocepajući peptid. U nekim primerima izvođenja, samocepajući peptid je izabran iz grupe koja se sastoji od T2A, P2A i F2A. U nekim primerima izvođenja, T2A peptid ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254. U nekim primerima izvođenja, T2A peptid je kodiran sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 255. U nekim primerima izvođenja, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira BCMA CAR i CD38 CAR, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 239.
[0874] Imune efektorske ćelije
[0876] „Imune efektorske ćelije“ su imune ćelije koje mogu da obavljaju imuno efektorske funkcije. U nekim primerima izvođenja, imuno efektorske ćelije eksprimiraju najmanje FcyRIII i obavljaju ADCC efektorsku funkciju. Primeri imunih efektorskih ćelija koje posreduju u ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), prirodne ćelije ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije, neutrofile i eozinofile.
[0877] U nekim primerima izvođenja, imune efektorske ćelije su T ćelije. U nekim primerima izvođenja, T ćelije su CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4+/CD8+, CD4-/CD8- ili njihove kombinacije. U nekim primerima izvođenja, T ćelije proizvode IL-2, TFN i/ili TNF nakon ekspresije CAR i vezivanja za ciljne ćelije, kao što su CD20+ ili CD19+ tumorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, CD8+ T ćelije liziraju antigen-specifične ciljne ćelije nakon ekspresije CAR i vezivanja za ciljne ćelije.
[0878] U nekim primerima izvođenja, imune efektorske ćelije su NK ćelije. U drugim primerima izvođenja, imune efektorske ćelije mogu biti uspostavljene ćelijske linije, na primer, NK-92 ćelije.
[0879] U nekim primerima izvođenja, imune efektorske ćelije se diferenciraju od matičnih ćelija, kao što su hematopoetske matične ćelije, pluripotentne matične ćelije, iPS ili embrionalne matične ćelije.
[0880] Imune efektorske ćelije dobijene genetskim inženjeringom se pripremaju unošenjem CAR u imune efektorske ćelije, kao što su T ćelije. CAR se može uvesti u imune efektorske ćelije transfekcijom bilo koje od izolovanih nukleinskih kiselina ili bilo kog od vektora opisanih u Odeljku III. CAR se može uvesti u imune efektorske ćelije umetanjem proteina u ćelijsku membranu dok se ćelije propuštaju kroz mikrofluidni sistem, kao što je CELL SQUEEZE<®>(videti, na primer, U.S. objavu patentne prijave br.20140287509).
[0881] Postupci unošenja vektora ili izolovanih nukleinskih kiselina u ćeliju sisara su poznate u struci. Opisani vektori mogu se preneti u imunu efektorsku ćeliju fizičkim, hemijskim ili biološkim metodama.
[0882] [0471] Fizičke metode za unošenje vektora u imunu efektorsku ćeliju uključuju taloženje kalcijum fosfatom, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjekciju, elektroporaciju i slično. Postupci za proizvodnju ćelija koje sadrže vektore i/ili egzogene nukleinske kiseline su dobro poznate u struci. Videti, na primer, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Vektor se može uneti u ćeliju elektroporacijom.
[0883] Biološke metode za unošenje vektora u imunu efektorsku ćeliju uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori su postali najšire korišćeni postupak za umetanje gena u ćelije sisara, npr., humane ćelije.
[0884] Hemijska sredstva za unošenje vektora u imunu efektorsku ćeliju uključuju koloidne disperzione sisteme, kao što su makromolekulski kompleksi, nanokapsule, mikrosfere, perle i sistemi na bazi lipida, uključujući emulzije ulja u vodi, micele, mešane micele i lipozome. Primer koloidnog sistema za upotrebu kao sredstvo za isporuku in vitro je lipozom (npr., veštačka membranska vezikula).
[0885] Molekuli RNK koji kodiraju bilo koji od ovde opisanih CAR mogu se pripremiti konvencionalnim postupkom (npr. in vitro transkripcija) i zatim uvesti u imune efektorske ćelije putem poznatih postupaka kao što je elektroporacija iRNK. Videti, npr., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027‑1035.
[0886] Transdukovana ili transfektovana imuna efektorska ćelija može se razmnožavati ex vivo nakon uvođenja vektora ili izolovane nukleinske kiseline. Transdukovana ili transfektovana imuna efektorska ćelija može se kultivisati da bi se razmnožavala najmanje približno 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 10 dana, 12 dana ili 14 dana. Transdukovana ili transfektovana imuna efektorska ćelija može se dalje proceniti ili podvrgnuti da bi se odabrala genetski modifikovana ćelija sisara.
[0887] Reporterski geni mogu se koristiti za identifikaciju potencijalno transfektovanih ćelija i za procenu funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Generalno, reporterski gen je gen koji nije prisutan u organizmu ili tkivu primaoca ili ga on ne eksprimira i koji kodira polipeptid čija se ekspresija manifestuje nekim lako detektovanim svojstvom, npr., enzimska aktivnost. Ekspresija reporterskog gena se testira u odgovarajuće vreme nakon što je DNK uvedena u ćelije primaoca. Pogodni reporterski geni mogu uključivati gene koji kodiraju luciferazu, betagalaktozidazu, hloramfenikol acetil transferazu, sekretovanu alkalnu fosfatazu ili gen zelenog fluorescentnog proteina (npr., Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79‑82 (2000)). Pogodni ekspresioni sistemi su dobro poznati i mogu se pripremiti korišćenjem poznatih tehnika ili nabaviti komercijalno.
[0888] [0477] Drugi postupci za potvrđivanje prisustva nukleinske kiseline koja kodira CAR u imunološkoj efektorskoj ćeliji dobijenoj genetskim inženjeringom uključuju, na primer, molekularno-biološke testove dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti, kao što su Southern i Northern blotting, RT-PCR i PCR; biohemijske testove, kao što je detekcija prisustva ili odsustva određenog peptida, npr., imunološkim metodama (kao što su ELISA i Western blot).
[0890] 1. Izvori T ćelija (Odeljak „Izvori T ćelija“ je dat kao referenca. Primene u ovom odeljku nisu primene pronalaska.)
[0892] Pre ekspanzije i genetske modifikacije T ćelija, izvor T ćelija se dobija od individue. T ćelije se mogu dobiti iz više izvora, uključujući mononuklearne ćelije periferne krvi, koštanu srž, tkivo limfnih čvorova, krv iz pupčane vrpce, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascites, pleuralni izliv, tkivo slezine i tumore. U nekim primerima izvođenja, može se koristiti bilo koji broj T ćelijskih linija dostupnih u struci. U nekim primerima izvođenja, T ćelije se mogu dobiti iz jedinice krvi prikupljene od subjekta korišćenjem bilo kog broja tehnika poznatih stručnjaku, kao što je Ficoll<™>razdvajanje. U nekim izvođenjima, ćelije iz cirkulišuće krvi pojedinca dobijaju se aferezom. Proizvod afereze obično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druga bela krvna zrnca sa jedrom, crvena krvna zrnca i trombocite. U nekim izvođenjima, ćelije sakupljene aferezom mogu se isprati da bi se uklonila frakcija plazme i da bi se ćelije smestile u odgovarajući pufer ili medijum za naredne korake obrade. U nekim izvođenjima, ćelije se ispiraju fosfatno puferovanim fiziološkim rastvorom (PBS). U nekim izvođenjima, rastvoru za pranje nedostaje kalcijum i može nedostajati magnezijum ili može nedostajati mnogo, ako ne i svi dvovalentni katjoni. Ponovo, iznenađujuće, početni koraci aktivacije u odsustvu kalcijuma dovode do uvećane aktivacije. Kao što će stručnjaci u ovoj oblasti lako shvatiti, korak pranja može se izvršiti postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, kao što je korišćenje poluautomatske „protočne“ centrifuge (na primer, Cobe 2991 ćelijski procesor, Baxter CytoMate ili Haemonetics Cell Saver 5) prema uputstvima proizvođača. Nakon pranja, ćelije se mogu resuspendovati u različitim biokompatibilnim puferima, kao što je, na primer, PBS bez Ca<2+>, bez Mg<2+>, PlasmaLyte A ili drugi fiziološki rastvor sa ili bez pufera. Alternativno, neželjene komponente uzorka dobijenog aferezom mogu se ukloniti, a ćelije direktno resuspendovati u medijumu za kultivaciju.
[0893] [0479] U nekim primerima izvođenja, T ćelije se izoluju iz limfocita periferne krvi liziranjem crvenih krvnih zrnaca i uklanjanjem monocita, na primer, centrifugiranjem kroz PERCOLL<™>gradijentom ili centrifugalnom elutrijacijom u suprotnom smeru. Specifična subpopulacija T ćelija, kao što su CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ i CD45RO+ T ćelije, može se dalje izolovati tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, u nekim primerima izvođenja, T ćelije se izoluju inkubacijom sa anti-CD3/anti-CD28 (tj.3 × 28)-konjugovanim perlama, kao što su DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T, tokom vremenskog perioda dovoljnog za pozitivnu selekciju željenih T ćelija. U nekim primerima izvođenja, vremenski period je oko 30 minuta. U sledećem primeru izvođenja, vremenski period se kreće od 30 minuta do 36 sati ili duže i sve celobrojne vrednosti koje su između. U sledećem primeru izvođenja, vremenski period je najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 sati. U nekim primerima izvođenja, vremenski period je 10 do 24 sata. U nekim primerima izvođenja, vremenski period inkubacije je 24 sata. Za izolaciju T ćelija od pacijenata sa leukemijom, korišćenje dužeg vremena inkubacije, kao što je 24 sata, može povećati prinos ćelija. Duže vreme inkubacije može se koristiti za izolaciju T ćelija u bilo kojoj situaciji gde postoji malo T ćelija u poređenju sa drugim tipovima ćelija, kao što je izolovanje tumor infiltrirajućih limfocita (TIL) iz tumorskog tkiva ili od osoba sa oslabljenim imunitetom. Dalje, korišćenje dužeg vremena inkubacije može povećati efikasnost hvatanja CD8+ T ćelija. Dakle, jednostavnim skraćivanjem ili produžavanjem vremena koje je T ćelijama dozvoljeno da se vežu za CD3/CD28 perle i/ili povećanjem ili smanjenjem odnosa perli i T ćelija (kao što je dalje opisano ovde), subpopulacije T ćelija mogu biti preferencijalno odabrane za ili protiv na početku kulture ili u drugim vremenskim tačkama tokom postupka. Pored toga, povećanjem ili smanjenjem odnosa anti-CD3 i/ili anti-CD28 antitela na perlama ili drugoj površini, subpopulacije T ćelija mogu biti poželjno odabrane za ili protiv na početku kulture ili u drugim željenim vremenskim tačkama. Iskusni stručnjak će prepoznati da se mogu koristiti i višestruki krugovi selekcije. U nekim primerima izvođenja, može biti poželjno izvršiti postupak selekcije i koristiti „neselektovane“ ćelije u postupku aktivacije i ekspanzije. „Neselektovane“ ćelije takođe mogu biti podvrgnute daljim krugovima selekcije.
[0894] Obogaćivanje populacije T ćelija negativnom selekcijom može se postići kombinacijom antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno selektovane ćelije. Jedan postupak je sortiranje i/ili selekcija ćelija putem negativne magnetne imunoadhezije ili protočne citometrije koja koristi koktel monoklonskih antitela usmerenih na površinske markere ćelija prisutne na negativno selektovanim ćelijama. Na primer, da bi se obogatio za CD4+ ćelije negativnom selekcijom, koktel monoklonskih antitela obično uključuje antitela na CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR i CD8. U određenim primerima izvođenja, može biti poželjno obogatiti ili pozitivno selektovati za regulatorne T ćelije koje tipično eksprimiraju CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ i FoxP3+. Alternativno, u određenim primerima izvođenja, T regulatorne ćelije se iscrpljuju pomoću konjugovanih perli anti-C25 ili drugim sličnim postupkom selekcije.
[0895] [0481] Za izolaciju željene populacije ćelija pozitivnom ili negativnom selekcijom, koncentracija ćelija i površina (npr., čestice kao što su perle) mogu varirati. U određenim primerima izvođenja, može biti poželjno značajno smanjiti zapreminu u kojoj se perle i ćelije mešaju (tj. povećati koncentraciju ćelija), kako bi se osigurao maksimalan kontakt ćelija i perli. Na primer, u jednom primeru izvođenja, koristi se koncentracija od 2 milijarde ćelija/ml. U jednom primeru izvođenja, koristi se koncentracija od 1 milijarde ćelija/ml. U sledećem primeru izvođenja, koristi se veća od 100 miliona ćelija/ml. U sledećem primeru izvođenja, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 miliona ćelija/ml. U još jednom primeru izvođenja, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 miliona ćelija/ml. U daljim primerima izvođenja, mogu se koristiti koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Korišćenje visokih koncentracija može dovesti do povećanog prinosa ćelija, aktivacije ćelija i ekspanzija ćelija. Dalje, upotreba visokih koncentracija ćelija omogućava efikasnije hvatanje ćelija koje mogu slabo eksprimirati ciljne antigene od interesa, kao što su CD28-negativne T ćelije, ili iz uzoraka gde je prisutno mnogo tumorskih ćelija (npr. leukemijska krv, tumorsko tkivo itd.). Takve populacije ćelija mogu imati terapeutsku vrednost i bilo bi poželjno da se dobiju. Na primer, upotreba visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniju selekciju CD8+ T ćelija koje normalno imaju slabiju ekspresiju CD28.
[0896] U nekim primerima izvođenja, može biti poželjno koristiti niže koncentracije ćelija. Značajnim razblaživanjem smeše T ćelija i površinskih (npr., čestice kao što su perle), interakcije između čestica i ćelija su minimizirane. Ovo selektuje ćelije koje eksprimiraju velike količine željenih antigena da se vežu za čestice. Na primer, CD4+ T ćelije eksprimiraju veće nivoe CD28 i efikasnije se hvataju od CD8+ T ćelija u razblaženim koncentracijama. U nekim primerima izvođenja, koncentracija korišćenih ćelija je 5×10<6>/ml. U nekim primerima izvođenja, korišćena koncentracija može biti od oko 1×10<5>/ml do 1×10<6>/ml, i bilo koja celobrojna vrednost između.
[0897] U nekim primerima izvođenja, ćelije se mogu inkubirati na rotatoru različito vreme pri različitim brzinama na 2-10°C ili na sobnoj temperaturi.
[0898] [0484] T ćelije za stimulaciju takođe mogu biti zamrznute nakon koraka pranja. Bez ograničavanja teorijom, zamrzavanje i naknadni korak odmrzavanja obezbeđuju ujednačeniji proizvod uklanjanjem granulocita i donekle monocita u ćelijskoj populaciji. Nakon koraka pranja koji uklanja plazmu i trombocite, ćelije mogu biti suspendovane u rastvoru za zamrzavanje. Iako su mnogi rastvori i parametri za zamrzavanje poznati u struci i biće korisni u ovom kontekstu, jedan postupak uključuje upotrebu PBS koji sadrži 20% DMSO i 8% humanog serumskog albumina, ili medijuma za kultivaciju koji sadrži 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% humanog serumskog albumina i 7,5% DMSO, ili 31,25% Plasmalyte-A, 31,25% dekstroze 5%, 0,45% NaCl, 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% humanog serumskog albumina i 7,5% DMSO ili drugih pogodnih medijuma za zamrzavanje ćelija koji sadrže, na primer, Hespan i PlasmaLyte A, ćelije se zatim zamrzavaju na -80°C brzinom od 1° u minuti i čuvaju u parnoj fazi rezervoara za skladištenje tečnog azota. Mogu se koristiti i drugi postupku kontrolisanog zamrzavanja, kao i nekontrolisano zamrzavanje odmah na -20°C ili u tečnom azotu.
[0899] U nekim primerima izvođenja, krioprezervirane ćelije se odmrzavaju i peru kao što je ovde opisano i ostavljaju se da odstoje jedan sat na sobnoj temperaturi pre aktivacije.
[0900] [0486] Takođe je kao referenca dato prikupljanje uzoraka krvi ili proizvoda afereze od subjekta u vremenskom periodu pre nego što bi ekspandirane ćelije, kao što je ovde opisano, mogle biti potrebne. Kao takav, izvor ćelija koje treba ekspandirati može se prikupiti u bilo kom potrebnom trenutku, a željene ćelije, kao što su T ćelije, izolovati i zamrznuti za kasniju upotrebu u T ćelijskoj terapiji za bilo koji broj bolesti ili stanja koja bi imala koristi od T ćelijske terapije, kao što su ona opisana ovde. U jednom primeru izvođenja, uzorak krvi ili afereza se uzima od generalno zdravog subjekta. U određenim primerima izvođenja, uzorak krvi ili afereza se uzima od generalno zdravog subjekta koji je u riziku od razvoja bolesti, ali koji još nije razvio bolest, a ćelije od interesa se izoluju i zamrzavaju za kasniju upotrebu. U određenim primerima izvođenja, T ćelije se mogu ekspandirati, zamrznuti i koristiti kasnije. U određenim primerima izvođenja, uzorci se prikupljaju od pacijenta ubrzo nakon dijagnoze određene bolesti kao što je ovde opisano, ali pre bilo kakvih tretmana. U sledećem primeru izvođenja, ćelije se izoluju iz uzorka krvi ili afereze od subjekta pre bilo kog broja relevantnih modaliteta lečenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lečenje sredstvima kao što su natalpronalaskab, efalpronalaskab, antivirusna sredstva, hemoterapija, zračenje, imunosupresivna sredstva, kao što su ciklosporin, azatioprin, metotreksat, mikofenolat i FK506, antitela ili druga imunoablativna sredstva kao što su CAMPATH, anti-CD3 antitela, citoksan, fludarabin, ciklosporin, FK506, rapamicin, mikofenolna kiselina, steroidi, FR901228 i zračenje. Ovi lekovi inhibiraju ili kalcijum zavisnu fosfatazu kalcineurin (ciklosporin i FK506) ili inhibiraju p70S6 kinazu koja je važna za signalizaciju indukovanu faktorom rasta (rapamicin) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Birer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). U sledećem primeru izvođenja, ćelije se izoluju za pacijenta i zamrzavaju za kasniju upotrebu zajedno sa (npr., pre, istovremeno ili nakon) transplantacije koštane srži ili matičnih ćelija, ablativne terapije T ćelija korišćenjem hemoterapijskih sredstava kao što su fludarabin, terapija spoljašnjim zračenjem (XRT), ciklofosfamid ili antitela kao što su OKT3 ili CAMPATH. U drugom primeru izvođenja, ćelije se izoluju pre i mogu se zamrznuti za kasniju upotrebu za lečenje nakon ablativne terapije B-ćelija kao što su sredstva koja reaguju sa CD20, npr., Rituksan.
[0901] U nekim primerima izvođenja, T ćelije se dobijaju od pacijenta direktno nakon lečenja. U tom smislu, primećeno je da nakon određenih tretmana kancera, posebno tretmana lekovima koji oštećuju imuni sistem, ubrzo nakon lečenja tokom perioda kada bi se pacijenti normalno oporavljali od lečenja, kvalitet dobijenih T ćelija može biti optimalan ili poboljšan zbog njihove sposobnosti ekspandiranja ex vivo. Slično tome, nakon ex vivo manipulacije korišćenjem ovde opisanih postupaka, ove ćelije mogu biti u poželjnom stanju za poboljšano prihvatanje i ekspandiranje in vivo. Stoga se u kontekstu ovog pronalaska razmatra sakupljanje krvnih ćelija, uključujući T ćelije, dendritične ćelije ili druge ćelije hematopoetske loze, tokom ove faze oporavka. Dalje, u određenim primerima izvođenja, mobilizacija (na primer, mobilizacija sa GM-CSF) i režimi kondicioniranja mogu se koristiti za stvaranje stanja kod subjekta u kojem je favorizovana repopulacija, recirkulacija, regeneracija i/ili ekspanzija određenih tipova ćelija, posebno tokom definisanog vremenskog perioda nakon terapije. Ilustrativni tipovi ćelija uključuju T ćelije, B ćelije, dendritične ćelije i druge ćelije imunog sistema.
[0903] 2. Aktivacija i ekspanzija T ćelija (Odeljak „Aktivacija i ekspanzija T ćelija“ je dat kao referenca. Primeri izvođenja u ovom odeljku nisu primeri izvođenja pronalaska.)
[0905] Bez obzira pre ili posle genetske modifikacije T ćelija sa CAR opisanim ovde, T ćelije se mogu aktivirati i umnožavati generalno korišćenjem postupaka kao što je opisano, na primer, u U.S. Pat. br. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041 i U.S. objavi patenen prijave br.20060121005.
[0906] [0489] Generalno, T ćelije se mogu umnožiti kontaktom sa površinom na koju je pričvršćeno sredstvo koje stimuliše signal povezan sa CD3/TCR kompleksom i ligand koji stimuliše kostimulatorni molekul na površini T ćelija. Konkretno, populacije T ćelija mogu biti stimulisane kao što je ovde opisano, kao što je kontakt sa anti-CD3 antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, ili anti-CD2 antitelom imobilizovanim na površini, ili kontaktom sa aktivatorom protein kinaze C (npr., briostatin) u kombinaciji sa kalcijum jonoforom. Za kostimulaciju pomoćnog molekula na površini T ćelija, koristi se ligand koji se vezuje za pomoćni molekul. Na primer, populacija T ćelija može biti kontaktirana sa anti-CD3 antitelom i anti-CD28 antitelom, pod uslovima pogodnim za stimulaciju proliferacije T ćelija. Da bi se stimulisala proliferacija CD4+ T ćelija ili CD8+ T ćelija, mogu se koristiti anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Primeri anti-CD28 antitela uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France), kao i drugi postupci poznati u struci (Berg et al., Transplant Proc.
[0907] 30(8):3975‑3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med.190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1‑2): 53‑63, 1999).
[0908] U nekim primerima izvođenja, primarni stimulatorni signal i kostimulatorni signal za T ćeliju mogu biti obezbeđeni različitim protokolima. Na primer, sredstva koja obezbeđuju svaki signal mogu biti u rastvoru ili povezana sa površinom. Kada su povezana sa površinom, sredstva mogu biti povezana sa istom površinom (tj. u „cis“ formaciji) ili sa odvojenim površinama (tj. u „trans“ formaciji). Alternativno, jedno sredstvo može biti povezano sa površinom, a drugo sredstvo u rastvoru. U jednom primeru izvođenja, sredstvo koje obezbeđuje kostimulatorni signal je vezano za ćelijsku površinu, a sredstvo koje obezbeđuje primarni signal aktivacije je u rastvoru ili povezano sa površinom. U određenim primerima izvođenja, oba sredstva mogu biti u rastvoru. U drugom primeru izvođenja, sredstva mogu biti u rastvorljivom obliku, a zatim umrežena sa površinom, kao što je ćelija koja eksprimira Fc receptore ili antitelo ili drugo sredstvo za vezivanje koje će se vezati za sredstva. U tom pogledu, videti na primer, U.S. objave patentnih prijava br. 20040101519 i 20060034810 za veštačke ćelije koje prezentuju antigen (aAPC) koje su predviđene za upotrebu u aktiviranju i ekspanziji T ćelija u ovom pronalasku.
[0909] U nekim primerima izvođenja, T ćelije se kombinuju sa perlama obloženim sredstvom, perle i ćelije se potom razdvajaju, a zatim se ćelije kultivišu. U alternativnom primeru izvođenja, pre kulture, perle obložene sredstvom i ćelije se ne razdvajaju, već se kultivišu zajedno. U sledećem primeru izvođenja, perle i ćelije se prvo koncentrišu primenom sile, kao što je magnetna sila, što rezultira povećanom ligacijom markera na površini ćelija, čime se indukuje stimulacija ćelija.
[0910] [0492] Na primer, proteini ćelijske površine mogu se vezati tako što se paramagnetne perlice na koje su pričvršćeni anti-CD3 i anti-CD28 (3×28 perlica) dovedu u kontakt sa T ćelijama. U jednom primeru izvođenja, ćelije (na primer, 10<4>do 10<9>T ćelije) i perle (na primer, DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T paramagnetne perle (u odnosu 1:1) se kombinuju u puferu, poželjno PBS (bez dvovalentnih katjona kao što su kalcijum i magnezijum). Ponovo, stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da shvate da se može koristiti bilo koja koncentracija ćelija. Na primer, ciljna ćelija može biti veoma retka u uzorku i činiti samo 0,01% uzorka ili ceo uzorak (tj. 100%) može činiti ciljnu ćeliju od interesa. Shodno tome, bilo koji broj ćelija je u kontekstu ovog pronalaska. U određenim primerima izvođenja, može biti poželjno značajno smanjiti zapreminu u kojoj se čestice i ćelije mešaju (tj. povećati koncentraciju ćelija), kako bi se osigurao maksimalan kontakt ćelija i čestica. Na primer, u jednom primeru izvođenja, koristi se koncentracija od oko 2 milijarde ćelija/ml. U drugom primeru izvođenja, koristi se više od 100 miliona ćelija/ml. U sledećem primeru izvođenja, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 miliona ćelija/ml. U još jednom primeru izvođenja, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 miliona ćelija/ml. U dodatnim primerima izvođenja, mogu se koristiti koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Korišćenje visokih koncentracija može dovesti do povećanog prinosa ćelija, aktivacije ćelija i širenja ćelija. Dalje, upotreba visokih koncentracija ćelija omogućava efikasnije hvatanje ćelija koje mogu slabo eksprimirati ciljne antigene od interesa, kao što su CD28-negativne T ćelije. Takve populacije ćelija mogu imati terapeutsku vrednost i bilo bi poželjno dobiti ih u određenim primerima izvođenja. Na primer, korišćenje visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniju selekciju CD8+ T ćelija koje normalno imaju slabiju ekspresiju CD28.
[0911] [0493] U nekim primerima izvođenja, smeša se može kultivisati nekoliko sati (oko 3 sata) do oko 14 dana ili bilo koji broj sati između. U drugom primeru izvođenja, smeša se može kultivisati 21 dan. U jednom primeru izvođenja pronalaska, perle i T ćelije se kultivišu zajedno oko osam dana. U drugom primeru izvođenja, perle i T ćelije se kultivišu zajedno 2-3 dana. Može biti poželjno i nekoliko ciklusa stimulacije, tako da vreme kulture T ćelija može biti 60 dana ili više. Uslovi pogodni za kulturu T ćelija uključuju odgovarajuću podlogu (npr., Minimal Essential Media ili RPMI Media 1640 ili X-vivo 15, (Lonza)) koji mogu da sadrže faktore neophodne za proliferaciju i održivost, uključujući serum (npr., fetalni goveđi ili humani serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ i TNF-α ili bilo koji drugi aditivi za rast ćelija poznati stručnjaku. Ostali aditivi za rast ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, surfaktant, plazmanat i redukcione agense kao što su N-acetilcistein i 2-merkaptoetanol. Medijumi mogu da uključuju RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 i X-Vivo 20, Optimizer, sa dodatkom aminokiselina, natrijum piruvata i vitamina, bilo bez seruma ili dopunjeni odgovarajućom količinom seruma (ili plazme) ili definisanim skupom hormona, i/ili količinom citokina dovoljnim za rast i ekspandiranje T ćelija. Antibiotici, npr., penicilin i streptomicin, uključeni su samo u eksperimentalne kulture, a ne u kulture ćelija koje se daju subjektu infuzijom. Ciljne ćelije se održavaju u uslovima neophodnim za podršku rastu, na primer, odgovarajuća temperatura (npr., 37 °C) i atmosfera (npr., vazduh plus 5% CO<2>). T ćelije koje su bile izložene različitim vremenima stimulacije mogu pokazivati različite karakteristike. Na primer, tipična krv ili aferezni proizvodi mononuklearnih ćelija periferne krvi imaju populaciju pomoćnih T ćelija (TH, CD4+) koja je veća od populacije citotoksičnih ili supresorskih T ćelija (TC, CD8). Ex vivo ekspanzija T ćelija stimulisanjem CD3 i CD28 receptora proizvodi populaciju T ćelija koja se pre oko 8-9 dana sastoji pretežno od TH ćelija, dok nakon oko 8-9 dana, populacija T ćelija sadrži sve veću populaciju TC ćelija. Shodno tome, u zavisnosti od svrhe lečenja, infuzija subjektu populacije T ćelija koja se pretežno sastoji od TH ćelija može biti korisna. Slično, ako je izolovan antigenspecifičan podskup TC ćelija, može biti korisno izvršiti ekspanziju ovog podskupa u većoj meri.
[0912] Dalje, pored CD4 i CD8 markera, drugi fenotipski markeri značajno variraju, ali uglavnom reproduktivno tokom procesa ćelijske ekspanzije. Stoga, takva reproduktivnost omogućava mogućnost prilagođavanja aktiviranog T ćelijskog proizvoda za specifične svrhe.
[0914] V. Farmaceutske kompozicije
[0916] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koju od imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom koje sadrže bilo koji od CAR pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije mogu se pripremiti mešanjem više imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom željenog stepena čistoće sa izbornim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora.
[0917] Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere, antioksidante uključujući askorbinsku kiselinu, metionin, vitamin E, natrijum metabisulfit; konzervanse, izotonifikatore, stabilizatore, metalne komplekse (npr. Zn-proteinske komplekse); helatne agense kao što su EDTA i/ili nejonski surfaktanti.
[0918] Puferi se koriste za kontrolu pH vrednosti u opsegu koji optimizuje terapeutsku efikasnost, posebno ako je stabilnost zavisna od pH vrednosti. Puferi su poželjno prisutni u koncentracijama u rasponu od oko 50 mM do oko 250 mM. Pogodna puferska sredstva za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli. Na primer, citrat, fosfat, sukcinat, tartarat, fumarat, glukonat, oksalat, laktat, acetat. Pored toga, puferi mogu da sadrže soli histidina i trimetilamina kao što je Tris.
[0919] Konzervansi se dodaju da bi se usporio rast mikroba i obično su prisutni u rasponu od 0,2%-1,0% (tež/zapr). Pogodni konzervansi za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum halide (npr., hlorid, bromid, jodid), benzetonijum hlorid; timerosal, fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol, 3-pentanol i mkrezol.
[0920] Sredstva za toničnost, ponekad poznata kao „stabilizatori“, prisutna su da bi podesila ili održala toničnost tečnosti u kompoziciji. Kada se koriste sa velikim, naelektrisanim biomolekulima kao što su proteini i antitela, često se nazivaju „stabilizatorima“ jer mogu da interaguju sa naelektrisanim grupama bočnih lanaca aminokiselina, čime se smanjuje potencijal za inter- i intra-molekularne interakcije. Sredstva za toničnost mogu biti prisutna u bilo kojoj količini između 0,1% i 25% po težini, poželjno 1 do 5%, uzimajući u obzir relativne količine ostalih sastojaka. Poželjna sredstva za toničnost uključuju polihidroksilne šećerne alkohole, poželjno trihidroksilne ili više šećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol.
[0921] Dodatni ekscipijensi uključuju sredstva koja mogu služiti kao jedno ili više od sledećeg: (1) sredstva za povećanje zapremine, (2) sredstva za poboljšanje rastvorljivosti, (3) stabilizatori i (4) sredstva koja sprečavaju denaturaciju ili prianjanje na zid posude. Takvi ekscipijensi uključuju: polihidroksilne šećerne alkohole (navedene gore); aminokiseline kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd.; organski šećeri ili šećerni alkoholi kao što su saharoza, laktoza, laktitol, trehaloza, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr., inozitol), polietilen glikol; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tiosulfat; proteini male molekulske težine kao što su humani serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili drugi imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; monosaharidi (npr., ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi (npr., laktoza, maltoza, saharoza); trisaharidi kao što je rafinoza; i polisaharidi kao što su dekstrin ili dekstran.
[0922] Nejonski surfaktanti ili deterdženti (poznati i kao „sredstva za vlaženje“) prisutni su da bi pomogli u rastvaranju terapeutskog sredstva, kao i da bi zaštitili terapeutski protein od agregacije izazvane agitacijom, što takođe omogućava da formulacija bude izložena površinskom naprezanju smicanja bez izazivanja denaturacije aktivnog terapeutskog proteina ili antitela. Nejonski surfaktanti prisutni su u rasponu od oko 0,05 mg/ml do oko 1,0 mg/ml, poželjno od oko 0,07 mg/ml do oko 0,2 mg/ml.
[0923] [0502] Pogodni nejonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 40, 60, 65, 80, itd.), polioksamere (184, 188, itd.), PLURONIC<®>poliole, TRITON<®>, polioksietilen sorbitan monoetre (TWEEN<®>-20, TWEEN<®>-80, itd.), lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenizovano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, estar masne kiseline saharoze, metil celulozu i karboksimetil celulozu. Anjonski deterdženti koji se mogu koristiti uključuju natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i dioktil natrijum sulfonat. Katjonski deterdženti uključuju benzalkonijum hlorid ili benzetonijum hlorid.
[0924] Da bi se farmaceutske kompozicije koristile za in vivo primenu, moraju biti sterilne. Farmaceutska kompozicija se može sterilizovati filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Farmaceutske kompozicije ovde se generalno stavljaju u kontejner koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, kesu ili bočicu za intravenski rastvor sa čepom koji se može probušiti iglom za hipodermičku injekciju.
[0925] Način primene je u skladu sa poznatim i prihvaćenim postupcima, kao što je jednokratni ili višestruki bolus ili infuzija tokom dužeg vremenskog perioda na odgovarajući način, npr., injekcija ili infuzija subkutanim, intravenskim, intraperitonealnim, intramuskularnim, intraarterijskim, intralezionalnim ili intraartikularnim putem, lokalnom primenom, inhalacijom ili putem produženog oslobađanja ili načina primene sa produženim oslobađanjem.
[0926] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antagonist, a koje su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr., filmovi ili mikrokapsule. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. br.
[0927] 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT<™>(injekcione mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibuterne kiseline.
[0928] Farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja ili sredstva, kako je potrebno za određenu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim dejstvima koja ne utiču negativno jedno na drugo. Alternativno, ili pored toga, kompozicija može da sadrži citotoksično sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, citokin, imunosupresivno sredstvo ili sredstvo za inhibiciju rasta. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.
[0929] Aktivni sastojci mogu takođe biti zarobljeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinskom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, respektivno, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th edition.
[0930] VI. Upotreba u postupcima lečenja kancera
[0932] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje CAR ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupcima ćelijske imunoterapije. U nekim primerima izvođenja, ćelijska imunoterapija je namenjena lečenju kancera, uključujući, ali ne ograničavajući se na hematološke malignitete i solidne tumore. Bilo koje od jednodomenskih antitela, himernih antigenskih receptora i imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom opisanih ovde može se koristiti u postupku lečenja kancera. CAR opisani ovde mogu biti korisni za lečenje tumora sa mutacijama koje dovode do gubitka antigena, i za smanjenje otpornosti na postojeće terapije. U nekim primerima izvođenja, kompozicije pronalaska mogu se koristiti u postupcima lečenja drugih bolesti koje su povezane sa antigenima koje specifično prepoznaju jednodomenska antitela ili CAR, uključujući, na primer, autoimune bolesti.
[0933] [0509] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži multispecifični (kao što je bispecifični) himerni antigenski receptor (CAR) pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen (kao što je prvi tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za drugi antigen (kao što je drugi tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu se prvi antigen razlikuje od drugog antigena; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen i/ili drugi antigen su odabrani iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena koji vezuje antigen i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multispecifični CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD8α, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: signalni peptid CD8α, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, zglobni domen CD8α, transmembranski domen CD28, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer.
[0934] [0510] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koji sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži BCMA × CD38 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb i/ili anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo i anti-CD38 jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je fuzionisano na N-terminusu anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je fuzionisano na C-terminusu anti-CD38 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68. U nekim primerima izvođenja, BCMA × CD38 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 207-216. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer. U nekim primerima izvođenja, tečni kancer je multipli mijelom.
[0935] [0511] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) CD19 × CD20 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i anti-CD20 jednodomensko antitelo; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb i/ili anti-CD20 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 jednodomensko antitelo i anti-CD20 jednodomensko antitelo su fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na N-terminusu anti-CD20 sdAb. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je fuzionisan na C-terminusu anti-CD20 sdAb. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 144-151. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 antitelo sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim primerima izvođenja, CD19 × CD20 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer. U nekim primerima izvođenja, tečni kancer je B-ćelijski limfom.
[0936] [0512] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod pojedinca (kao što je humani pojedinac), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži multivalentni himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži više jednodomenskih antitela (sdAb) koja se specifično vezuju za antigen (kao što je tumorski antigen); (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo jednodomenskih antitela je fuzionisano jedno sa drugim putem peptidnih veza ili peptidnih linkera. U nekim primerima izvođenja, svaki peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo koje od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je signalni peptid CD8α) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 198-201 i 265-270. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer.
[0937] [0513] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži multivalentni himerni antigenski receptor pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži prvo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za prvi epitop antigena (kao što je tumorski antigen) i drugo jednodomensko antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop antigena; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, gde su prvi epitop i drugi epitop različiti; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77. U nekim primerima izvođenja, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, prvo jednodomensko antitelo i drugo jednodomensko antitelo su fuzionisana jedno sa drugim putem peptidne veze ili peptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, peptidni linker nije duži od oko 50 (kao što je ne više od oko bilo kojeg od 35, 25, 20, 15, 10 ili 5) aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen je izabran iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, multivalentni CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena koji vezuje antigen i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer.
[0938] [0514] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži himerni antigenski receptor CD19 pronalaska, koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD19 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-CD19 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD19 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD19 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Kao referenca, CD19 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 248. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer.
[0939] [0515] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži CD20 CAR pronalaska i koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD20 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen, pri čemu anti-CD20 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb dalje sadrži FR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 244, FR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 245, FR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 246 i/ili FR4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 247. U nekim primerima izvođenja, anti-CD20 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD20 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen za vezivanje antigena, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Otkriveno kao referenca, CD20 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 249. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je autologna. U nekim primerima izvođenja, imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer.
[0940] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) pronalaska koja sadrži BCMA CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-BCMA sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu anti-BCMA sdAb sadrži bilo koji od sledećih:
[0942] (23) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0943] (24) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0944] (25) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0945] (26) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0946] (27) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33;
[0947] (28) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34;
[0948] (29) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35;
[0949] (30) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36;
[0950] (31) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37;
[0951] (32) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; ili
[0952] (33) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39.
[0954] [0517] U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-BCMA sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:78-88. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je CD8α zglobni domen) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, BCMA CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Otkriveno kao referenca, BCMA CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 152-162. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer.
[0955] U nekim primerima izvođenja, postoji postupak lečenja kancera kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži: (1) imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom (kao što je T ćelija) koja sadrži CD38 CAR pronalaska koji sadrži polipeptid koji sadrži: (a) ekstracelularni domen za vezivanje antigena koji sadrži anti-CD38 sdAb; (b) transmembranski domen; i (c) intracelularni signalni domen; i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu anti-CD38 sdAb sadrži bilo koji od sledećih:
[0957] (25) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
[0958] (26) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
[0959] (27) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
[0960] (28) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
[0961] (29) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
[0962] (30) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
[0963] (31) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
[0964] (32) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
[0965] (33) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
[0966] (34) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
[0967] (35) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
[0968] (36) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
[0970] [0519] U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb je kamelidno, himerno ili humanizovano. U nekim primerima izvođenja, anti-CD38 sdAb sadrži V<H>H domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:89-100. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije (kao što je T ćelija). U nekim primerima izvođenja, primarni intracelularni signalni domen je izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen. U nekim primerima izvođenja, kostimulatorni signalni domen je izveden iz kostimulatornog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje sadrži zglobni domen (kao što je zglobni domen CD8α) koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena. U nekim primerima izvođenja, CD38 CAR dalje sadrži signalni peptid (kao što je CD8α signalni peptid) koji se nalazi na N-terminusu polipeptida. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, prvi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD28, drugi kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. U nekim primerima izvođenja, polipeptid sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, ekstracelularni domen koji vezuje antigen, CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, kostimulatorni signalni domen izveden iz CD137 i primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ. Ovde otkriveno kao referenca, CD38 CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 163-174. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je autologna. U nekim primerima izvođenja, genetski modifikovana imuna efektorska ćelija je alogena. U nekim primerima izvođenja, kancer je tečni kancer, kao što je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni kancer.
[0971] Kao referenca, otkriven je postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu anti-CD19 jednodomensko antitelo sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3. U nekim primerima, anti-CD19 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.
[0972] Kao referenca, otkriven je postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD19 jednodomensko antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu anti-CD20 jednodomensko antitelo sadrži tri CDR koji sadrže: (a) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5; i (c) CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim primerima, anti-CD20 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77.
[0973] Kao referenca, otkriven je postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-BCMA jednodomensko antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu anti-BCMA sdAb sadrži bilo šta od sledećeg:
[0975] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
[0976] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
[0977] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31;
[0978] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
[0979] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
[0980] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
[0981] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35;
[0982] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
[0983] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37;
[0984] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38; ili
[0985] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39.
[0987] U nekim primerima, anti-BCMA sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 78-88.
[0988] Kao referenca, otkriven je postupak lečenja bolesti (kao što je kancer) kod individue (kao što je humana individua), koji sadrži primenu na individuu efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD38 jednodomensko antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu anti-CD38 sdAb sadrži bilo koji od sledećih: CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
[0990] (1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
[0991] (2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
[0992] (3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
[0993] (4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
[0994] (5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
[0995] (6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
[0996] (7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
[0997] (8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
[0998] (9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
[0999] (10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
[1000] (11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
[1002] U nekim primerima, anti-CD38 sdAb sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 89-100.
[1003] Postupci opisani ovde su pogodni za lečenje različitih vrsta kancera, uključujući i solidni kancer i tečni kancer. Postupci su primenljive na kancere svih stadijuma, uključujući kancer u ranom stadijumu, uznapredovali stadijum i metastatski kancer. Postupci opisani ovde mogu se koristiti kao prva terapija, druga terapija, treća terapija ili kombinovana terapija sa drugim vrstama terapija kancera poznatim u struci, kao što su hemoterapija, hirurgija, zračenje, genska terapija, imunoterapija, transplantacija koštane srži, transplantacija matičnih ćelija, ciljana terapija, krioterapija, ultrazvučna terapija, fotodinamička terapija, radiofrekventna ablacija ili slično, u ađuvantnom ili neoađuvantnom okruženju.
[1004] Primena farmaceutskih kompozicija može se izvršiti na bilo koji pogodan način, uključujući injekciju, gutanje, transfuziju, implantaciju ili transplantaciju. Kompozicije se mogu primeniti na pacijenta transarterijski, subkutano, intradermalno, intratumoralno, intranodalno, intramedularno, intramuskularno, intravenski ili intraperitonealno. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje sistemski. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje na individuu infuzijom, kao što je intravenska infuzija. Tehnike infuzije za imunoterapiju su poznate u struci (videti, npr., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)). U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje na individuu intradermalnom ili potkožnom injekcijom. U nekim primerima izvođenja, kompozicije se primenjuju intravenskom injekcijom. U nekim primerima izvođenja, kompozicije se injektiraju direktno u tumor ili limfni čvor. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje lokalno na mesto tumora, kao što je direktno u tumorske ćelije ili u tkivo koje ima tumorske ćelije.
[1005] [0528] Multipli mijelom (MM) je neizlečivi agresivni maligni tumor plazme, koji se kategoriše kao B-ćelijska neoplazija i nekontrolisano se širi u koštanoj srži, ometajući normalnu metaboličku proizvodnju krvnih ćelija i uzrokujući bolne koštane lezije (Garfall, A.L. et al., Discovery Med. 2014, 17, 37). Multipli mijelom se može klinički manifestovati hiperkalcemijom, bubrežnom insuficijencijom, anemijom, koštanim lezijama, bakterijskim infekcijama, hiperviskozitetom i amiloidozom (Robert Z. Orlowski, Cancer Cell.2013, 24(3)). Prema istraživanjima i statistikama, skoro 86.000 pacijenata će svake godine biti dijagnostikovano sa mijelomom, dok oko 63.000 pacijenata svake godine umre od komplikacija povezanih sa bolešću (Becker, 2011). Zbog starenja stanovništva, predviđa se da će se broj slučajeva mijeloma povećavati iz godine u godinu. Kao i kod mnogih vrsta kancera, ne postoji poznati uzrok multiplog mijeloma, niti lek. Neki tretmani za multipli mijelom su slični tretmanima za druge vrste kancera, kao što su hemoterapija ili radioterapija, transplantacija matičnih ćelija ili transplantacija koštane srži, ciljana terapija ili biološka terapija (George, 2014). Ćelijske imunoterapije zasnovane na antitelima pokazale su značajnu kliničku korist za pacijente sa hematološkim malignitetima, posebno kod B-ćelijskog ne-Hodgkin-ovog limfoma. Postoji potreba za efikasnim imunoterapeutskim sredstvom za lečenje multiple mijelomije.
[1006] Doze i željena koncentracija leka farmaceutskih kompozicija ovog pronalaska mogu varirati u zavisnosti od konkretne predviđene upotrebe. Određivanje odgovarajuće doze ili načina primene je u okviru veštine prosečnog stručnjaka. Eksperimenti na životinjama obezbeđuju pouzdane smernice za određivanje efikasnih doza za ljudsku terapiju. Interspecijsko skaliranje efikasnih doza može se izvršiti prateći principe koji su utvrđeni u Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42‑46. U okviru ovog pronalaska je da će različite formulacije biti efikasne za različite tretmane i različite poremećaje, i da primena namenjena lečenju određenog organa ili tkiva može zahtevati isporuku na način koji se razlikuje od onog u drugom organ ili tkivu.
[1007] Opisano kao referenca, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži bilo koje od ovde opisanih jednodomenskih antitela, farmaceutska kompozicija se primenjuje u dozi od oko 10 ng/kg do oko 100 mg/kg telesne težine pojedinca ili više dnevno, na primer, u dozi od oko 1 mg/kg/dan do 10 mg/kg/dan, u zavisnosti od načina primene. Uputstva u vezi sa određenim dozama i postupcima primene data su u literaturi; videti, na primer, U.S. Pat. br. 4,657,760; 5,206,344; ili 5,225,212.
[1008] [0531] U nekim primerima izvođenja, pri čemu farmaceutska kompozicija sadrži bilo koju od genetski modifikovanih imunih ćelija pronalaska, farmaceutska kompozicija se primenjuje u dozi od najmanje približno bilo koje od 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>ili 10<9>ćelija/kg telesne težine individue. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje u dozi od oko 10<4>do oko 10<5>, oko 10<5>do oko 10<6>, oko 10<6>do oko 10<7>, oko 10<7>do oko 10<8>, oko 10<8>do oko 10<9>, oko 10<4>do oko 10<9>, oko 10<4>do oko 10<6>, oko 10<6>do oko 10<8>, ili oko 10<5>do oko 10<7>ćelija/kg telesne težine individue.
[1009] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje jednom. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje više puta (kao što je bilo koji od 2, 3, 4, 5, 6 ili više puta). U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija se primenjuje jednom nedeljno, jednom u 2 nedelje, jednom u 3 nedelje, jednom u 4 nedelje, jednom mesečno, jednom u 2 meseca, jednom u 3 meseca, jednom u 4 meseca, jednom u 5 meseci, jednom u 6 meseci, jednom u 7 meseci, jednom u 8 meseci, jednom u 9 meseci ili jednom godišnje. U nekim primerima izvođenja, interval između primena je otprilike bilo koji od 1 nedelje do 2 nedelje, 2 nedelje do 1 meseca, 2 nedelje do 2 meseca, 1 mesec do 2 meseca, 1 mesec do 3 meseca, 3 meseca do 6 meseci ili 6 meseci do godinu dana. Optimalnu dozu i režim lečenja za određenog pacijenta može lako odrediti stručnjak u medicinskoj oblasti praćenjem pacijenta u odnosu na znake bolesti i prilagođavanjem lečenja u skladu sa tim.
[1010] Dodatno, doze se mogu primenjivati jednom ili više odvojenih doza, ili kontinuiranom infuzijom. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se održava dok se ne postigne željeno suzbijanje simptoma bolesti. Međutim, mogu biti korisni i drugi režimi doziranja. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
[1012] VII. Kompleti i proizvodi
[1014] Dalje su obezbeđeni kompleti, jedinične doze i proizvedeni predmeti koji sadrže bilo koji od himernih antigenskih receptora ili imunih efektorskih ćelija dobijenih genetskim inženjeringom pronalaska. U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je komplet koji sadrži bilo koju od farmaceutskih kompozicija pronalaska i poželjno obezbeđuje uputstva za njegovu upotrebu.
[1015] Kompleti ovog pronalaska su u odgovarajućem pakovanju. Odgovarajuće pakovanje uključuje, ali nije ograničeno na, bočice, bočice, tegle, fleksibilno pakovanje (npr., zapečaćene Mylar ili plastične kese) i slično. Kompleti mogu izborno da sadrže dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije. Predmetni pronalazak stoga takođe obezbeđuje proizvodne artikle, koji uključuju bočice (kao što su zapečaćene bočice), boce, tegle, fleksibilna pakovanja i slično.
[1016] [0536] Proizvodni artikal može da sadrži kontejner i etiketu ili uputstvo za upotrebu na kontejneru ili povezano sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, bočice, boce, špriceve, itd. Kontejneri mogu biti napravljeni od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Generalno, kontejner sadrži kompoziciju koja je efikasna za lečenje bolesti ili poremećaja (kao što je kancer) opisanih ovde i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probušiti iglom za hipodermalnu injekciju). Etiketa ili uputstvo u pakovanju ukazuju da se kompozicija koristi za lečenje određenog stanja kod individue. Etiketa ili uputstvo u pakovanju će dalje sadržati uputstva za primenu kompozicije na individuu. Etiketa može da sadrži uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Kontejner koji sadrži farmaceutsku kompoziciju može biti bočica za višekratnu upotrebu, što omogućava ponovljenu primenu (npr. od 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Uputstvo za upotrebu se odnosi na uputstva koja se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, a koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda. Pored toga, proizvodni predmet može dalje da sadrži drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatno puferovani fiziološki rastvor, Ringer-ov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može da sadrži i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
[1017] Kompleti ili proizvodni artikal mogu da sadrže višestruke jedinične doze farmaceutskog sastava i uputstva za upotrebu, upakovane u količinama dovoljnim za skladištenje i upotrebu u apotekama, na primer, bolničkim apotekama i apotekama za proizvodnju lekova.
[1018] Primeri u nastavku su namenjeni isključivo kao primeri pronalaska i stoga ih ne treba smatrati ograničenjem pronalaska na bilo koji način. Sledeći primeri i detaljan opis su ponuđeni kao ilustracija, a ne kao ograničenje.
[1020] PRIMERI
[1022] Primeri opisani ovde ne predstavljaju eksperimente u nastavku kao sve ili jedine izvedene eksperimente. Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu korišćenih brojeva (na primer, količina, temperature itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.
[1024] Primer 1. Priprema jednodomenskih antitela
[1025] Da bi se razvila jednodomenska antitela sa visokim afinitetom vezivanja za određene antigene, lame su imunizovane i konstruisana je biblioteka fagnog prikaza za identifikaciju V<H>H kandidata. Različiti klonovi su nasumično odabrani i klasifikovani prema regionu 3 koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR3), regionu koji može igrati glavnu ulogu u vezivanju antigena.
[1026] Da bi se dobila jednodomenska antitela, lame su redovno imunizovane odgovarajućim imunogenima, koji mogu uključivati rekombinantni humani BCMA protein sa C-terminalnom Fc oznakom (ACRO Biosystems, kat. br.: BC7-H5254), rekombinantni humani CD38 protein sa C-terminalnom His oznakom (ACRO Biosystems, kat. br.: CD8-H5224), rekombinantni humani CD19 protein sa C-terminalnom Fc oznakom (ACRO Biosystems, kat. br.: CD9-H5229) i rekombinantni humani CD20 protein sa C-terminalnom Fc oznakom (ACRO Biosystems, kat. br.: CD0-H526a).
[1027] Postupak generisanja jednodomenskih antitela protiv BCMA opisan je u nastavku kao primer za generisanje jednodomenskih antitela protiv različitih antigena. Generisanje jednodomenskih antitela protiv humanog CD38, humanog CD19 i CD20 izvršeno je sličnim postupcima kao što su opisani u nastavku. Opisani su i drugi protokoli za pripremu jednodomenskih antitela. Videti, na primer, Els Pardon et al, Nature Protocol, 2014; 9(3): 674.
[1029] 1. Imunizacija životinja i test imunog odgovora
[1031] 1.1 Imunizacija životinja
[1033] Svaki imunogen koji sadrži rekombinantni antigenski protein pomešan je sa ađuvansom ili PBS i ubrizgan lami. Životinje su imunizovane od strane dobavljača usluga (Cedarline) sedam puta, obično sa 200 µg imunogena i CFA (kompletni Freund-ov ađuvant) svaki put u intervalima od oko 1 do 2 nedelje. Uzorci periferne krvi su prikupljeni u fazi pre imunizacije i nakon 5. i 7. imunizacije. Nakon više rundi imunizacije, imunološke reakcije lama protiv ciljnog antigena su procenjene kako bi se potvrdio titar antigen-specifičnih jednodomenskih antitela. Limfociti su izolovani gradijentnim centrifugiranjem iz oko 100 ml periferne krvi. Ćelije su dopunjene sa RNALATER<™>i čuvani na -80°C. Serumi su dobijeni centrifugiranjem uzoraka krvi sa antikoagulantom i čuvani na -80°C.
[1035] 1.2 Frakcionisanje IgG
[1036] Frakcionisanje IgG podklase je sprovedeno prema GenScript standardnoj operativnoj proceduri. IgG podklase su frakcionisane iz seruma terminalnog krvarenja korišćenjem proteinskih G i proteinskih A smola. Uzorak seruma od 1 ml je nanesen na 1 ml HITRAP<®>proteinske G HP kolone i kolona je isprana sa 10 ml fosfatnog pufera (20 mM, pH 7,0). Frakcija IgG3 (MW 100.000 Da) je eluirana sa 0,15 M NaCl, 0,58% sirćetne kiseline (pH 3,5) i eluat je neutralisan sa 1 M Tris-HCl (pH 9,0) do pH 7,4. Nakon toga, frakcija IgG1 (MW 170.000 Da) je eluirana sa 0,1 M glicinom-HCl (pH 2,7) i eluat je neutralisan sa 1 M Tris-HCl (pH 8,5) do pH 7,4. Protok HITRAP<®>proteinske G HP kolone je zatim napunjen na 1 ml HITRAP<®>protein A HP kolone i kolona je isprana sa 20 ml fosfatnog pufera (20 mM, pH 7,0). Frakcija IgG2 (MW 100.000 Da) je eluirana sa 0,15 M NaCl, 0,58% sirćetne kiseline (pH 4,5) i eluat je neutralisan sa 1M Tris-HCl (pH 9,0) do pH 7,4. Koncentracije prečišćenih IgG1, IgG2 i IgG3 antitela su određene pomoću OD280, a čistoća svakog je procenjena i redukujućom i neredukujućom SDS-PAGE analizom.
[1038] 1.3 Test imunog odgovora
[1040] Imuni odgovor lama je procenjen ELISA metodom, u kojoj su uzorci seruma i prečišćeni IgG testirani na vezivanje za imobilizovane imunogene. Serumi prikupljeni pre imunizacije, nakon pete imunizacije i na terminalnom uzorku krvi su procenjeni. Antigen (tj., rekombinantni humani antigenski protein) je razblažen u puferu za premazivanje na 4 µg/ml. Mikrotitarska ploča je obložena razblaženim antigenom na 4°C preko noći. Ploča je zatim isprana 3 puta puferom za pranje, a zatim blokirana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ploča je potom isprana 4 puta puferom za ispiranje. Serija razblaženih seruma ili IgG je dodata na ploču i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sata. Ploča je zatim isprana 4 puta puferom za pranje. Sekundarno antitelo IgG konjugovano sa HRP je dodato na ploču i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon pranja, TMB supstrat je dodat u svaki bunarčić i inkubiran 10 minuta pre nego što je zaustavljen sa 1 M HCl. Da bi se kvantifikovalo vezivanje, apsorbancija na 450 nm je merena za svaki bunarčić pomoću MK3 spektrometra.
[1042] 2. Konstrukcija biblioteke VHH fagnog prikaza
[1044] 2.1 Ekstrakcija RNK
[1045] Ukupna RNK je ekstrahovana iz izolovanih limfocita (iz 1.1.1) korišćenjem TRIZOL<®>reagensa prema protokolu proizvođača. Količina i kvalitet ukupne RNK su procenjeni gel elektroforezom i kvantifikovani merenjem apsorbancije na OD260/280.
[1047] 2.2 RT-PCR i VHH amplifikacija
[1049] Ukupna RNK je reverzno transkribovana u cDNK sa oligo(dT)<20>prajmerom koristeći PRIMESCRIPT<™>komplet za sintezu prvog lanca cDNK prema protokolu proizvođača. Šest specifičnih degenerisanih specifičnih prajmera za unapred i dva za unazad su dizajnirana za amplifikaciju V<H>H fragmenata, koji su imali dva BglI restrikciona mesta. V<H>H fragmenti su amplifikovani prema GenScript standardnoj operativnoj proceduri (SOP) kao što je opisano u nastavku.
[1050] Varijabilni regioni teškog lanca imunoglobulina (tj., V<H>H) su amplifikovani korišćenjem dvostepene polimerazne lančane reakcije (PCR). U prvoj PCR, 100 ng cDNK šablona je pomešano sa prajmerima CALL001 (SEQ ID NO: 229) i CALL002 (SEQ ID NO: 230). DNK proizvodi iz prve PCR reakcije su analizirani elektroforezom na agaroznom gelu. Nakon prečišćavanja gela, DNK proizvodi prve PCR su korišćeni kao šabloni u drugoj PCR. Druga PCR je izvedena sa prajmerima BACK-1 (SEQ ID NO: 231), BACK-2 (SEQ ID NO: 232) i PMCF (SEQ ID NO: 233). Amplifikovani drugi PCR proizvodi koji sadrže V<H>H PCR fragmente su prečišćeni na gelu i enzimski digestirani, a zatim inserirani u fagemidne plazmide. Rekombinantni plazmidi sa fragmentima V<H>H gena su elektrotransferisani u E. coli ćelije kako bi se generisala imuna biblioteka fagnog prikaza V<H>H.
[1051] Postupak PCR reakcije ima početni korak denaturacije na 94°C tokom 7 minuta, nakon čega sledi 30 ciklusa od 94°C tokom 1 minuta, 55°C tokom 1 minuta i 72°C tokom 1 minuta; i nakon čega sledi završni korak produženja na 72°C tokom 7 minuta.
[1053] 2.3 Izgradnja fagnih biblioteka
[1055] [0550] V<H>H PCR proizvodi su dobijeni amplifikacijom korišćenjem različitih parova prajmera. PCR proizvodi su zatim digestirani sa BglI i prečišćeni na gelu. Prečišćeni fragmenti na gelu su inserirani u GenScript interni fagemid vektor. Konstruisana je pilot biblioteka radi optimizacije uslova ligacije i transformacije. Optimizovani uslovi ligacije i transformacije su korišćeni za razvoj fagemid biblioteke. Mali deo transformisanih ćelija je razblažen i posejan na 2×YT ploče dopunjene sa 100 µg/ml ampicilina. Kolonije su prebrojane da bi se izračunala veličina biblioteke. Pozitivni klonovi su nasumično odabrani i sekvencionisani da bi se procenio kvalitet biblioteke. Ostatak transformisanih ćelija je posejan na YT ploče dopunjene sa 100 µg/ml ampicilina i 2% glukoze. Površine sa kolonijama su sastrugane sa ploča. Mali alikvot ćelija je korišćen za izolaciju plazmida biblioteke. Ostatak je dopunjen glicerolom i čuvan na -80°C kao zaliha.
[1057] 3. Paning fagnog prikaza
[1059] 3.1 Bio-paning
[1061] Fagna biblioteka konstruisanog V<H>H je testirana u odnosu na rekombinantni humani BCMA protein i CHO ćelije koje eksprimiraju humani BCMA (tj., CHO-BCMA ćelije, pripremljene interno od strane Legend Biotec) koristeći standardni postupak koji je razvio GenScript. Materijal biblioteke je uzgajan do log faze, a zatim je biblioteka rekuperovana pomoću M13KO7 pomoćnog faga i amplifikovana preko noći na 25°C u šejkeru. Fag je zatim istaložen sa PEG/NaCl, resuspendovan u PBS i čuvan na -80°C. Za paning u čvrstoj fazi, bunaričći mikroploče su obloženi rekombinantnim humanim BCMA proteinom u PBS na 4°C preko noći. Za paning u tečnoj fazi, CHO-BCMA ćelije su blokirane blokirajućim puferom na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Tokom koraka oblaganja ili blokiranja, čestice faga su prethodno inkubirane sa blokirajućim puferom i Fc kontrolnim proteinom u bunarčićima mikroploče. Nakon prethodne inkubacije, čestice faga su dodate u bunarčiće obložene BCMA proteinima ili rastvorom CHO-BCMA, respektivno, i inkubirane tokom 1 sata. Nakon inkubacije, nevezani i nespecifično vezani fagi su isprani ispiranjem bunarčića ili CHO-BCMA ćelija sa PBST šest puta, dopunjenim sa dva dodatna ispiranja PBS. Vezane čestice faga su eluirane sa 100 mM trietilamina (TEA), a eluat je neutralisan sa 1 M Tris-HCl (pH 7,4). Polovina eluata je zatim korišćena za infekciju eksponencijalno rastućih E. coli TG1 ćelija (OD<600>= 0,4~ 0,6) za izlaznu titraciju.
[1063] 3.2 Fagni ELISA
[1065] [0552] Fagni ELISA je sproveden da bi se identifikovali klonovi specifični za ciljne antigene. Pojedinačni izlazni fagni klonovi su uzgajani na ploči sa 96 dubokih bunarčića i rekuperovani su pomoćnim fagom M13KO7 preko noći. Da bi se identifikovali klonovi koji se vezuju za antigenske proteine, ELISA mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića su obložene rekombinantnim humanim BCMA proteinom i Fc kontrolnim proteinom, respektivno, u puferu za oblaganje preko noći na 4°C, a zatim su ploče blokirane blokirajućim puferom. Nakon blokiranja, približno 50 µl po bunarčiću fagnog supernatanta iz ćelijske kulture uzgajane preko noći je dodato na ploče radi 1,5-časovne inkubacije na 4°C. Ploče su isprane četiri puta, a HRP-konjugovano anti-M13 monoklonsko antitelo je dodato na ploče radi 45-minutne inkubacije na 4°C. Ploče su ponovo isprane pet puta i rastvor supstrata je dodat u bunarčiće za razvijanje. Apsorpcija na 450 nm je merena za svaki bunarčić.
[1066] Da bi se identifikovali klonovi koji se vezuju za CHO-BCMA ćelije, CHO-BCMA ćelije su blokirane blokirajućim puferom na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon blokiranja, približno 20 µl po bunarčiću fagnog supernatanta iz ćelijske kulture uzgajane preko noći dodato je u ćelijske rastvore radi inkubacije od 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon što su ćelije isprane 4 puta, dodato je HRP-konjugovano anti-M13 monoklonsko antitelo radi inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane pet puta, a zatim je dodat rastvor supstrata za razvijanje. Apsorpcija je merena na 450 nm.
[1067] Nakon paninga, pojedinačni klonovi pozitivni na fage ELISA testom su nasumično odabrani i DNK je pripremljena iz izlaznog faga korišćenjem kompleta za ekstrakciju plazmida. Inserti u plazmidima su sekvencirani. Jedna ili više V<H>H sekvenci je dobijeno za svaki ciljni antigen, videti, na primer, Tabelu 2.
[1069] Primer 2. Priprema monospecifičnih VHH himernih antigenskhi receptora
[1071] Sekvenca CAR kičme koja kodira kičmu CAR polipeptida koji sadrži od N-terminusa do C-terminusa: CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, CD28 citoplazmatski domen, CD137 citoplazmatski domen i CD3ζ citoplazmatski domen su hemijski sintetizovani i klonirani u prethodno modifikovani lentivirusni vektor nizvodno i operativno povezani sa konstitutivnim hEF1α promotorom. Dobijeni vektor kičme CAR je nazvan „PLLV-hEF1α-8281373“. Višestruka mesta kloniranja (MCS) u vektoru su omogućila inserciju sekvence nukleinske kiseline koja sadrži Kozak sekvencu (SEQ ID NO: 126) operativno povezanu sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CD8α signalni peptid fuzionisan sa N-terminusom V<H>H fragmenta u vektor PLLV-hEF1α-8281373, uzvodno i operativno povezan sa sekvencom kičme CAR.
[1072] [0556] Da bi se konstruisao monospecifični CAR sa jednim V<H>H domenom koristeći PLLV-hEF1α-8281373 kičmu, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira V<H>H domen je operativno povezana sa 3' krajem sekvence nukleinske kiseline koja kodira CD8α signalni peptid. Fuziona sekvenca nukleinske kiseline je hemijski sintetizovana i klonirana u PLLV-hEF1α-8281373 CAR kičmu preko EcoRI (SEQ ID NO: 234: 5'-GAATTC-3') i SpeI (SEQ ID NO: 235: 5'-ACTAGT-3') restrikcionih mesta tehnikama molekularnog kloniranja poznatim u struci. Tabela 4 navodi vektore koji su konstruisani da eksprimiraju primere monospecifičnih, monovalentnih anti-BCMA i anti-CD38 CAR.
[1073] Radi lakšeg dodatnog inseriranja dodatnih sekvenci, kao što je nukleotid koji kodira drugi V<H>H, prilikom dizajniranja monospecifičnog CAR konstrukta (npr. anti-BCMA ili anti-CD38), restrikciona mesta, uključujući HpaI (SEQ ID NO: 236: 5'-GTTAAC-3'), MluI (SEQ ID NO: 237: 5'-ACGCGT-3'), NsiI (SEQ ID NO: 238: 5'-ATGCAT-3'), bila su uključena između sekvence nukleinske kiseline signalnog peptida CD8α i V<H>H sekvence nukleinske kiseline.
[1074] Smeša plazmida za pakovanje lentivirusa, koja uključuje pCMV-ΔR-8.74 i pMD2.G (Addgene#12259), prethodno je pomešana sa vektorima PLLV-hEF1α-8281373 koji imaju V<H>H fragmente (Tabela 4) u prethodno optimizovanom odnosu sa polietarimidom (PEI), zatim dobro pomešani i inkubirani na sobnoj temperaturi 5 minuta. Transfekciona smeša je zatim ukapavanjem dodata ćelijama HEK293 i pažljivo pomešana. Nakon toga, ćelije su inkubirane preko noći na 37°C i 5% CO<2>u ćelijskom inkubatoru. Supernatanti su sakupljeni nakon centrifugiranja na 4°C, 500 g tokom 10 minuta.
[1075] Supernatanti koji sadrže virus su filtrirani kroz PES filter od 0,45 µm, nakon čega je usledilo ultracentrifugiranje radi koncentrovanja lentivirusa. Nakon ultracentrifugiranja, supernatanti su pažljivo odbačeni, a virusni talozi su pažljivo isprani prethodno ohlađenim DPBS. Virus je pravilno alikvotiran, a zatim odmah čuvan na -80°C. Titar virusa je određen pomoću p24 na osnovu HTRF kompleta koji je razvio GenScript.
[1077] Priprema PBMC
[1079] [0560] Leukociti su sakupljeni od zdravih donora aferezom, a koncentracija ćelija je podešena na 5×10<6>ćelija/ml u R10 medijumu. Leukociti su zatim pomešani sa 0,9% rastvorom NaCl u odnosu 1:1 (zapr/zapr).3 ml limfoprep medijuma je dodato u epruvetu za centrifugiranje od 15 ml, a 6 ml razblažene smeše limfocita je polako naneseno preko limfoprep medijuma. Smeša limfocita je centrifugirana na 800 g tokom 30 minuta bez prekida na 20°C. Limfocitni „buffy coat“ je zatim sakupljen pipetom od 200 µl. Sakupljena frakcija je razblažena najmanje 6 puta sa 0,9% NaCl ili R10 da bi se smanjila gustina rastvora. Sakupljena frakcija je zatim centrifugirana na 250 g tokom 10 minuta na 20°C. Supernatant je potpuno aspiriran, a 10 ml R10 je dodato u ćelijski talog da bi se ćelijski talog resuspendovao. Smeša je dalje centrifugirana na 250 g tokom 10 minuta na 20°C. Supernatant je ponovo aspiriran.2 ml R10 prethodno zagrejanog na 37°C sa 100 IU/ml IL-2 je dodato ćelijskom talogu, a ćelijski talog je blago resuspendovan. Broj ćelija je određen nakon bojenja tripan plavom bojom, a ovaj uzorak PBMC je bio spreman za kasnije eksperimente.
[1081] Prečišćavanje T ćelija
[1083] Humane T ćelije su prečišćene iz PBMC koristeći Miltenyi Pan komplet za izolaciju T ćelija (kat. br.130-096-535), prateći protokol proizvođača kao što je opisano u nastavku. Prvo je određen broj ćelija, a ćelijska suspenzija je centrifugirana na 300 g tokom 10 minuta. Supernatant je zatim potpuno aspiriran, a ćelijski talozi su resuspendovani u 40 µl pufera na 10<7>ukupno ćelija. Dodato je 10 µl Pan T ćelija biotin-antitelo koktela na 10<7>ukupno ćelija, dobro pomešano i inkubirano oko 5 minuta u frižideru (2~8°C). Zatim je dodato 30 µl pufera na 10<7>ćelija. Dodato je 20 µl Pan T Cell MicroBead koktela na 10<7>ćelije. Smeša ćelijske suspenzije je dobro promešana i inkubirana dodatnih 10 minuta u frižideru (2~8°C). Za magnetnu separaciju je potrebno minimum 500 µl. Za magnetnu separaciju, LS kolona je postavljena u magnetno polje odgovarajućeg MACS separatora. Kolona je pripremljena ispiranjem sa 3 ml pufera. Ćelijska suspenzija je zatim naneta na kolonu, a protok koji je sadržao neobeležene ćelije je sakupljen, što je predstavljalo obogaćene frakcije T ćelija. Dodatne T ćelije su sakupljene ispiranjem kolone sa 3 ml pufera i sakupljanjem neobeleženih ćelija koje su prošle kroz nju. Ove neobeležene ćelije su ponovo predstavljale obogaćene T ćelije i kombinovane su sa protokom iz prethodnog koraka. Sakupljene obogaćene T ćelije su zatim centrifugirane i resuspendovane u R10+100IU/ml IL-2.
[1084] Pripremljene T ćelije su potom prethodno aktivirane tokom 48-96 sati pomoću kompleta za aktivaciju/ekspanziju humanih T ćelija (Miltenyi#130-091-441) prema protokolu proizvođača u kojem su anti-CD3/CD28 MACSiBead čestice dodate u odnosu perlica i ćelija od 1:2.
[1085] Preaktivirane T ćelije su transdukovane lentivirusnim stokom u prisustvu 7 µg/ml polibrena uz centrifugiranje na 1200 g, 32°C tokom 1,5 h. Transdukovane ćelije su zatim prebačene u inkubator za ćelijsku kulturu radi ekspresije transgena pod odgovarajućim uslovima.
[1086] [0564] Trećeg ili sedmog dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelije su sakupljene i koinkubirane sa tumorskim ćelijama u odnosu efektorskih (CAR-T) i ciljnih ćelija od 20:1 tokom 20 sati. Ciljne ćelije su bile ili ćelijska linija humanog multiplog mijeloma RPMI8226.Luc ili ćelijska linija humanog glioblastoma U87MG.Luc, obe ćelijske linije su interno konstruisane da eksprimiraju luciferazu svitaca. Da bi se testirala citotoksičnost CAR-T na tumorskim ćelijama, reagensi za analizu luciferaze One-glo luminescentne luciferaze (Promega#E6110) su pripremljeni prema protokolu proizvođača i dodati kokultivisanim ćelijama da bi se detektovala preostala aktivnost luciferaze u bunarčiću. Pošto se luciferaza eksprimira samo u ćelijama RPMI8226.Luc ili U87MG.Luc, preostala aktivnost luciferaze u bunarčiću direktno korelira sa brojem održivih ciljnih ćelija u bunarčiću. Maksimalna aktivnost luciferaze je dobijena dodavanjem podloge za kultivaciju ciljnim ćelijama u odsustvu efektorskih ćelija. Minimalna aktivnost luciferaze određena je dodavanjem Triton X-100 u konačnoj koncentraciji od 1% u vreme kada su započeti testovi citotoksičnosti. Specifična citotoksičnost izračunata je formulom: Specifična citotoksičnost% = 100% * (1-(RLUuzorka-RLUmin)/(RLUmax-RLUmin)).
[1087] Monospecifični CAR klonovi koji ciljaju BCMA (CD269) kodirani su počevši od cifara „269“, dok su monospecifični CAR klonovi koji ciljaju CD38 slično kodirani počevši od cifara „38“. Kao što je prikazano na slici 2A, odabrani klonovi su pokazali različite nivoe citotoksičnosti na ćelijama ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc, sa preko 60% monospecifičnih V<H>CAR-T na bazi H pokazuju >50% citotoksičnosti prema ćelijama RPMI8226.Luc. Klonovi CAR-T na bazi 269A37346, 269A37348, 269A37353, 269A37355, 38A37326, 38A37331, 38A37717 i 38A37719 su odabrani za dalje testiranje. Konkretno, klonovi 269A37346, 269A37348, 267A37353, 269A37355, 38A37326, 38A37331, 38A37717 zasnovani na CAR-T pokazali su snažnu citotoksičnost na ćelijama ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc sa povećanjem od preko 20%-30% u ubijanju ćelija RPMI8226.Luc CAR-T tretmanom u poređenju sa netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Ipak, takvo povećanje citotoksičnosti nije se dogodilo na ćelijama ćelijske linije humanog glioblastoma U87MG.Luc (videti Sl. 2B). Nisu otkriveni značajni efekti citotoksičnosti na U87MG.Luc od strane ovih monospecifičnih V<H>H-baziranih CAR-T ćelija u poređenju sa UnT kontrolama. Prethodno navedeno zapažanje je ukazalo na to da bi neki od ovih klonova mogli biti specifični za cilj i potentni na BCMA ili CD38 pozitivne ćelije.
[1089] Primer 3. Priprema primera bispecifičnih ili multivalentnih himernih antigenskih receptora
[1091] [0566] Potencijalno potentni klonovi kao što su opisani u Primeru 2 takođe bi mogli biti povoljni kandidati za generisanje bispecifičnih ili multivalentnih V<H>H-baziranih CAR. Dva reprezentativna V<H>H klona (anti-BCMA V<H>H klon 269A37346 i anti-CD38 V<H>H klon 38A37717) su odabrani za konstruisanje različitih primera CAR konstrukata.
[1092] BCMA × CD38 V<H>H-bazirani CAR mogu se generisati kombinovanjem BCMA specifičnih V<H>H i CD38 specifičnih V<H>H preko odgovarajućeg peptidnog linkera (npr. Gly-Ser polimer) praćen vektorom kičme signalnog domena CAR. Primeri bispecifičnih BCMA×CD38 CAR konstrukata (GSI5001 do GSI5010) navedeni su u Tabeli 6. Prvo, aminokiselinska sekvenca anti-BCMA V<H>H i anti-CD38 V<H>H su povezani zajedno preko Gly-Ser linkera koji je mogao biti različitih dužina. Zatim je povezana aminokiselinska sekvenca postavljena nakon sekvence signalnog peptida CD8α. Ova kombinovana sekvenca uključuje Kozak-CD8α signalni peptid-bispecifični V<H>H je direktno sintetisan i kloniran u PLLV-hEF1α-81373 kičmu CAR putem EcoRI i SpeI restrikcionih mesta, uobičajenim protokolima molekularnog kloniranja poznatim u struci. Sekvenca kičme CAR kodira polipeptid kičme CAR koja sadrži, od N-terminusa do C-terminusa: CD8α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, CD137 citoplazmatski domen i CD3ζ citoplazmatski domen, hemijski sintetizovani i klonirani u prethodno modifikovani lentivirusni vektor nizvodno i operativno povezani sa konstitutivnim hEF1α promotorom. Dobijena kičma CAR je dobila naziv „PLLV-hEF1α-81373“.
[1093] Pored toga, konstruisan je primer vektora koekspresije koji kodira BCMA CAR i CD38 CAR kombinovanjem BCMA specifičnih V<H>H-baziranih CAR i CD38 specifičnih V<H>H-baziranih CAR u jednom CAR vektoru preko odgovarajućeg linkera zasnovanog na splajsima (T2A, P2A ili F2A). Na primer, GSI5013 konstrukt ima sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 239. Sekvenca nukleinske kiseline u GSI5013 kodira od 5' do 3': CD8α signalni peptid, 38A37717 V<H>H, CD8 α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, CD137 kostimulatorni domen, CD3ζ citoplazmatski signalni domen, T2A, CD8α signalni peptid, 269A37346 V<H>H, CD8 α zglobni domen, CD8α transmembranski domen, CD137 kostimulatorni domen i CD3ζ citoplazmatski signalni domen.
[1094] [0569] Multivalentni V<H>H CAR se mogu konstruisati uvođenjem sekvenciranja nukleinskih kiselina koje kodira više kopija jednog V<H>H fuzionisanih jednu sa drugom peptidnim linkerima u vektor koji čini kičmu CAR signalnog domena. Primeri monovalentnih multivalentnih CAR konstrukata (GSI5014, GSI5015, GSI5016, GSI5017) navedeni su u Tabeli 5. Ovi konstrukti su pripremljeni povezivanjem 2-3 kopije V<H>H pomoću glicin-serin linkera, nakon čega sledi direktna sinteza ove povezane sekvence u kombinaciji sa sekvencom nukleinske kiseline signalnog peptida Kozak-CD8α i kloniranje u CAR lanac PLLV-hEF1α-81373 preko restrikcionih mesta EcoRI i SpeI. Kao kontrole, jedna kopija V<H>H je takođe klonirana u isti PLLV-hEF1α-81373 CAR lanac identičnim postupcima (GSI5011 i GSI5012, navedeni u Tabeli 4).
[1095] Lentivirusni vektori koji nose CAR gene od GSI5001 do GSI5017 su pakovani i titrovani prema protokolima kao što su opisani u Primeru 2. Koristeći protokole opisane u Primeru 2, humane PBMC su pripremljene iz periferne krvi dobrovoljaca za dalju izolaciju primarnih humanih T ćelija korišćenjem Miltenyi kompleta za izolaciju humanih PanT ćelija. Prečišćene T ćelije su prethodno aktivirane i ekspandirane korišćenjem Miltenyi anti-CD3/CD28 mikroperlica kao što je opisano u Primeru 2. Pre-aktivirane T ćelije su zatim transdukovane lentivirusnim zalihom u prisustvu 7 µg/ml polibrena centrifugiranjem na 1200 g, 32°C tokom 1,5 h. Transdukovane ćelije su zatim prebačene u inkubator za ćelijsku kulturu radi ekspresije transgena pod odgovarajućim uslovima.
[1096] Trećeg dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelije su sakupljene i koinkubirane sa tumorskim ćelijama u odnosu efektorskih (CAR-T) i ciljnih ćelija od 20:1 tokom 20 sati. Da bi se testirala citotoksičnost CAR-T na tumorskim ćelijama, One-glo reagensi za analizu luminescentne luciferaze (Promega#E6110) su dodati kokultivisanim ćelijama i specifična citotoksičnost za svaki CAR-T je merena kao što je opisano u Primeru 2.
[1097] Broj kopija integrisanih CAR gena za svaku grupu određen je semikvantitativnim PCR (q-PCR) testom. Ukratko, genomska DNK iz svake grupe CAR-T je pripremljena pomoću Gentra Puregene Cell Kit (Qiagen). Koncentracija genomske DNK je određena pomoću Nanodrop, a uzorak od 10 ng genomske DNK je obrađen za standardizovani q-PCR test sa SYBR Green Realtime PCR Master mix plus (Toyobo) na ABI#7300 q-PCR instrumentu koristeći CAR specifične prajmere (prajmer za unapred 137P2F (SEQ ID NO: 252): 5'-GTCCTTCCTGTCACTGGTTAT-3'; i prajmer za unazad 137P2R (SEQ ID NO: 253): 5'-TCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCA-3'). Relativni broj kopija svakog integrisanog CAR gena izračunat je na osnovu standardne krive uspostavljene korišćenjem plazmida koji sadrži ciljne sekvence.
[1098] Kao što je prikazano u Tabeli 7 ispod, određen je broj kopija za svaki CAR-T preparat i podaci sugerišu visoku integraciju ciljnog gena u genom T ćelija.
[1100] TABELA 7. Broj kopija integracije genoma.
[1103]
[1104]
[1107] Kao što je ilustrovano na slikama 3A-3B, monospecifični V<H>H CAR protiv BCMA (GSI5011) i monospecifični V<H>H CAR protiv CD38 (GSI5012) pokazao je snažnu citotoksičnost na ćelijskoj liniji multiplog mijeloma RPMI8226.Luc. Sa GSI5011 CAR, lizirano je 42,98±2,86% RPMI8226.Luc ćelija, a sa GSI5012, lizirano je 61,25±1,92% RPMI8226.Luc ćelija, u poređenju sa nespecifičnom lizom netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT, 9,25±1,11%).
[1108] [0575] Bispecifične CAR ćelije GSI5001-GSI5010 izazvale su snažnu specifičnu lizu ćelijske linije multiplog mijeloma RPMI8226.Luc u poređenju sa netransdukovanim kontrolnim T ćelijama (UnT). Kao što je prikazano na slikama 3A i 3B, specifični procenat lize ćelija RPMI8226.Luc bio je 98,91±0,17% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5001, 97,10±0,26% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5002, 93,85±0,69% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5003, 82,81±2,40% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5004, 98,95±0,66% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5005, 93,91±1,25% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5006, 96,49±1,05% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5007, 94,41±0,75% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5008, 90,72±0,62% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5009 i 85,05±2,69% za CAR-T ćelije koje eksprimiraju GSI5010, u poređenju sa nespecifičnom lizom netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT, 9,25±1,11%). Ovi rezultati takođe ukazuju na to da kraći Gly-Ser linker izgleda pokazuje nešto bolje citotoksične performanse na ciljnim tumorskim ćelijama. Dalja istraživanja bi mogla biti sprovedena pod neoptimalnim uslovima ispitivanja kako bi se proučili takvi efekti. Dodatno, redosled anti-BCMA V<H>H i anti-CD38 V<H>H u vektoru nije pokazao značajan uticaj na konačne performanse citotoksičnosti na ćelijama RPMI8226.Luc. Dve CAR-T ćelije zasnovane na scFv su takođe pripremljene u testu, u kojem je GSS005 bio CAR zasnovan na anti-BCMA scFv, dok je GSI005 bio CAR zasnovan na anti-CD38 scFv. I GSS005 i GSI005 su takođe pokazali snažnu specifičnu lizu protiv ćelija RPMI8226.Luc (57,94±1,91% za GSS5005, 61,25±1,92% za GSI005).
[1109] Pripremljene su T ćelije dobijene genetskim inženjeringom sa BCMA-specifičnim monovalentnim CAR (GSI5011), BCMA specifičnim bivalentnim CAR (GSI5012) ili BCMA specifičnim trivalentnim CAR (GSI5013), i T ćelije dobijene genetskim inženjeringom sa CD38-specifičnim monovalentnim CAR (GSI5012), CD38 specifičnim bivalentnim CAR (GSI5016) ili CD38 specifičnim trivalentnim CAR (GSI5017) i izvršeni su testovi citotoksičnosti na RPMI8226.Luc ćelijama kao što je gore opisano. Kao što je prikazano na slici. 4, specifični procenat lize ćelija RPMI8226.Luc bio je 63,25±2,64% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5011, 61,04±2,75% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5014 i 59,57±2,64% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5015, u poređenju sa 0,05%±2,33% od strane netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Takođe, kao što je prikazano na slici 4, specifična liza ćelija RPMI8226.Luc pomoću anti-CD38 V<H>H CAR-T je bila 95,79±0,62% kod CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5012, 94,16±0,31% kod CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5016 i 97,61±0,77% kod CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5015, u poređenju sa 57,92%±2,88% kod netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Podaci sugerišu da ovi CAR sa različitim modalitetima vezivanja antigena imaju snažno antitumorsko dejstvo protiv BCMA pozitivnih ćelija.
[1111] Primer 4. Priprema, in vitro i in vivo analize primera CD19×CD20 CAR
[1113] [0577] Primeri anti-CD19 sdAb i anti-CD20 sdAb su dobijeni sličnim postupcima kao u Primeru 1. Ova jednodomenska antitela su navedena u Tabeli 2. Monospecifični CD19 CAR zasnovan na CD19 V<H>H i monospecifični CD20 CAR na bazi CD20 V<H>H su pripremljeni kao što je opisano u Primeru 2 i navedeni su u Tabeli 4. Primer bispecifičnog CD19×CD20 CAR zasnovanog na CD19 V<H>H i CD20 V<H>H je konstruisan kao što je opisano u Primeru 3 i naveden u Tabeli 6. CAR vektor kičme koji se koristi za konstruisanje primera CD19 CAR, CD20 CAR i CD19×CD20 CAR kodira od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, CD8α zglobni domen, CD28 transmembranski domen, citoplazmatski domen CD28 i citoplazmatski domen CD3ζ. Slika 5 prikazuje konstrukte CD19 CAR, CD20 CAR i bispecifičnog CD19×CD20 CAR. Inženjeringom konstruisane CAR-T ćelije koje eksprimiraju CD19 CAR, CD20 CAR ili bispecifični CD19×CD20 CAR su pripremljeni kao što je opisano u Primeru 2.
[1114] Citotoksičnost CAR-T ćelija je određena u testu ko-kulture od 4 sata. U eksperimentima, pripremljene CAR-T ćelije su centrifugalno sakupljene, zatim razblažene do željenih koncentracija pomoću DPBS sa 10% humanog AB seruma i kultivisane na pločama sa 96 bunarčića. Ćelije Raji tumora, poznate po jakoj ekspresiji CD19 i CD20, obeležene su sa Calcein-AM (BD Biosciences). Obeležene CAR-T ćelije i Raji ćelije su kultivisane u odnosu efektora i cilja od 10:1 na 37°C tokom 4 sata. Nakon toga, citotoksičnost CAR-T ćelija je detektovana pomoću FACS.
[1115] Kao što je prikazano na slici 6 gornji levi panel, nije bilo značajne lize Raji ćelija od strane netransdukovanih T ćelija. Citotoksičnost na Raji ćelijama bila je oko 40% bilo od strane CD19 (39%, gornji desni panel) ili CD20 (41%, donji levi panel) monospecifičnih V<H>H CAR-T ćelija. Kada su isti CD19 V<H>H i CD20 V<H>H fuzionisani da služe kao ekstracelularni domen za vezivanje antigena u istom konstruktu, tj. u bispecifičnim CAR-T ćelijama CD19xCD20, citotoksičnost ćelija Raji tumora (75,24%) bila je povećana u poređenju sa monospecifičnim CD19 V<H>H CAR-T ili CD20 V<H>H CAR-T ćelijama (slika 6 donji desni panel).
[1117] Studije modela tumora na miševima
[1119] NOG miševima je infuzirano 4x10<6>Raji ćelija po mišu putem injekcije u repnu venu. Nakon 10 dana, miševi su ravnomerno podeljeni u četiri grupe nasumično, pri čemu je svakoj grupi injektirano ekvivalentno nekoliko doza netransdukovanih T ćelija, CD19 CAR-T ćelija, CD20 CAR-T ćelija ili CD19xCD20 bispecifičnih CAR-T ćelija, respektivno, i kontinuirano su posmatrani tokom 5 nedelja.
[1120] Kao što je prikazano na slici 7, in vivo podaci o preživljavanju ukazuju na to da je ukupna stopa preživljavanja za miševe tretirane CD19xCD20 bispecifičnim CAR ćelijama bila veća nego za CD19 ili CD20 monospecifičnim CAR-T ćelijama.
[1122] Primer 5. Priprema primera monospecifičnih, bivalentnih CAR koji imaju dva različita domena vezivanja BCMA
[1124] [0582] Potencijalni V<H>H klonovi, kao što su opisani u Primeru 2, takođe bi mogli biti korišćeni za generisanje monospecifičnih, multivalentnih CAR koji imaju dva ili više različitih domena za vezivanje cilja u ekstracelularnom domenu za vezivanje antigena. Dva reprezentativna anti-BCMA sdAb klona (klon 269A37353 i klon 269A37917) su odabrana za konstruisanje različitih primera monospecifičnih, bivalentnih CAR konstrukata u ovom primeru.
[1125] BCMA ciljajući bivalentni CAR (tj., dvovalentni BCMA CAR) mogu se generisati spajanjem dva različita BCMA-specifična V<H>H domena preko odgovarajućeg peptidnog linkera (npr. Gly-Ser polimer), a zatim insercijom fuzionog konstrukta u vektor kičme CAR signalnog domena. Primeri bivalentnih BCMA CAR konstrukata (GSI5021-GSI5026) sa dva različita BCMA vezujuća domena 269A37353 i 269A37917 navedeni su u Tabeli 5. Peptidni linkeri različitih dužina korišćeni su u različitim konstruktima. Konstrukti GSI5021-GSI5023, svaki kodiran od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, 269A37353, peptidni linker, 269A37917, CD8α zglob, CD8α transmembranski domen, citoplazmatski domen CD137 i citoplazmatski domen humanog CD3ζ. Konstrukti GSI5024-GSI5026, svaki kodirana od N-terminusa do C-terminusa: CD8α signalni peptid, 269A37917, peptidni linker, 269A37353, CD8α zglob, CD8α transmembranski domen, citoplazmatski domen CD137 i citoplazmatski domen humanog CD3ζ. Svaki konstrukt je dalje fuzionisan sa Kozak sekvencom na 5' da bi se dobila puna kodirajuća sekvenca. Puna kodirajuća sekvenca je direktno sintetizovana i klonirana u PLLV-hEF1α-81373 CAR lanac preko EcoRI i SpeI restrikcionih mesta korišćenjem uobičajenih protokola molekularnog kloniranja poznatih u struci. Nasuprot tome, monospecifični, monovalentni CAR (GSI5019 i GSI5020, navedeni u Tabeli 4) koji imaju isti CAR signalni domen lanac su konstruisani korišćenjem sličnih postupaka.
[1126] Lentivirusni vektori koji nose svaki od CAR konstrukata GSI5019-GSI5026 su upakovani i titrovani prema protokolima kao što je opisano u Primeru 2. Koristeći protokole opisane u Primeru 2, humane PBMC su pripremljene iz uzoraka periferne krvi od dobrovoljaca za dalju izolaciju primarnih humanih T ćelija korišćenjem Miltenyi kompleta za izolaciju humanih PanT ćelija. Prečišćene T ćelije su prethodno aktivirane i proširene korišćenjem Miltenyi anti-CD3/CD28 mikro-perlica kao što je opisano u Primeru 2.
[1127] Preaktivirane T ćelije su zatim transdukovane lentivirusnim stokom u prisustvu 7 µg/ml polibrena centrifugiranjem na 1200 g, 32°C tokom 1,5 h. Transdukovane ćelije su zatim prebačene u inkubator za ćelijsku kulturu radi ekspresije transgena pod odgovarajućim uslovima.
[1128] [0586] Trećeg dana nakon transdukcije, transdukovane T ćelije su sakupljene i koinkubirane sa tumorskim ćelijama (RPMI8226.Luc ćelije ili U87MG.Luc ćelije) u odnosu efektorskih (CAR-T) i ciljnih ćelija od 20:1 tokom 20 sati. RPMI8226.Luc ćelije su ćelije multiplog mijeloma koje eksprimiraju luciferazu i BCMA su pozitivne. U87MG.Luc ćelije su ćelije glioblastoma koje eksprimiraju luciferazu i BCMA su negativne. Da bi se testirala citotoksičnost CAR-T na tumorskim ćelijama, One-glo reagensi za analizu luminiscentne luciferaze (Promega#E6110) su dodati kokultivisanim ćelijama i specifična citotoksičnost za svaki CAR-T je merena kao što je opisano u Primeru 2.
[1129] Kao što je prikazano na slici.8A, specifični procenat lize ćelija RPMI8226.Luc bio je 88,21±1,29% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5019, 93,84±1,13% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5020, 71,45±1,79% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5021, 99,80±0,45% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5022, 97,46±0,50% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5023, 81,29±1,27% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5024, 93,50±0,47% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5025, 87,83±0,23% od strane CAR-T ćelija koje eksprimiraju GSI5026, respektivno, u poređenju sa 13,49% ± 1,75% od strane netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Takođe, kao što je prikazano na slici 8B, specifični procenat lize BCMA-negativne ćelijske linije U87MG.Luc bio je 2,84±7,41% od strane GSI5019-eksprimirajućih CAR-T ćelija, 15,50±2,24% od strane GSI5020-eksprimirajućih CAR-T ćelija, 6,74±3,37% od strane GSI5021-eksprimirajućih CAR-T ćelija, 8,03±2,36% od strane GSI5022-eksprimirajućih CAR-T ćelija, 9,00±1,88% od strane GSI5023-eksprimirajućih CAR-T ćelija, 17,03±2,27% od strane GSI5024-eksprimirajućih CAR-T ćelija, 16,81±1,98% od strane GSI5025-eksprimirajućih CAR-T ćelija, -11,55±5,43% od strane GSI5026-eksprimirajućih CAR-T ćelija, u poređenju sa 12,49%±3,79% od strane netransdukovanih kontrolnih T ćelija (UnT). Podaci ukazuju na to da su multivalentne CAR ćelije sa različitim modalitetima vezivanja antigena imale snažno antitumorsko dejstvo protiv BCMA pozitivnih ćelija, ali ne i protiv BCMA negativnih ćelija.

Claims (24)

1. Patentni zahtevi
1. Himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži polipeptid koji sadrži:
(a) ekstracelularni domen koji vezuje antigen koji sadrži prvo jednodomensko antitelo (sdAb) koje se specifično vezuje za prvi antigen i drugo sdAb koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu, svako od prvog i drugog sdAb je V<H>H;
(b) transmembranski domen; i
(c) intracelularni signalni domen.
2. CAR prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su prvi antigen i drugi antigen izabrani iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, BCMA, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3 i glikolipida F77.
3. CAR prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je prvi antigen različit od drugog antigena.
4. CAR prema patentnom zahtevu 3, pri čemu
(i) prvo sdAb je anti-BCMA sdAb i drugo sdAb je anti-CD38 sdAb;
(ii) prvo sdAb je anti-BCMA sdAb i drugo sdAb je anti-CD19 sdAb;
(iii) prvo sdAb je anti-CD 19 sdAb i drugo sdAb je anti-CD20 sdAb; ili
(iv) prvo sdAb je anti-CD 19 sdAb i drugo sdAb je anti-CD22 sdAb.
5. CAR prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu, prvi antigen je isti kao drugi antigen.
6. CAR prema patentnom zahtevu 5, pri čemu se prvo sdAb i drugo sdAb specifično vezuju za isti epitop.
7. CAR prema patentnom zahtevu 5, pri čemu se prvo sdAb i drugo sdAb specifično vezuju za različite epitope.
8. CAR patentnom prema zahtevu 1, pri čemu, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-CD19 sdAb koje sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.
9. CAR prema patentnom zahtevu 1, pri čemu, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-CD20 sdAb koje sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.
10. CAR prema patentnom zahtevu 1, pri čemu, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-BCMA sdAb koje sadrži bilo šta od sledećeg:
(1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29;
(2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30;
(3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32;
(4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33;
(5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:34;
(6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35;
(7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36;
(8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37; ili
(9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39.
11. CAR prema patentnom zahtevu 1, pri čemu, prvo sdAb i/ili drugo sdAb je anti-CD38 sdAb koje sadrži bilo šta od sledećeg:
(1) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:52; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64;
(2) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65;
(3) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:54; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:66;
(4) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:67;
(5) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68;
(6) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:45; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69;
(7) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:46; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:58; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70;
(8) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:47; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:59; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:71;
(9) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:60; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72;
(10) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:73;
(11) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:62; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:74; ili
(12) CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:51; CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:63; i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75.
12. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu se prvo sdAb nalazi na N-terminusu drugog sdAb; ili
pri čemu se prvo sdAb nalazi na C-terminusu drugog sdAb.
13. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, pri čemu, prvo sdAb i/ili drugo sdAb su kamelidno, himerno ili humanizovano.
14. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, pri čemu su prvo sdAb i drugo sdAb direktno fuzionisani jedno sa drugim putem peptidne veze; ili
pri čemu su prvo sdAb i drugo sdAb fuzionisani jedno sa drugim preko peptidnog linkera, poželjno pri čemu peptidni linker nije duži od 50 aminokiselina.
15. CAR prema bilo kom patentnih od zahteva 1 do 14, pri čemu
(i) transmembranski domen je izveden iz molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 i PD1;
(ii) intracelularni signalni domen sadrži primarni intracelularni signalni domen imune efektorske ćelije, pri čemu je izborno primarni intracelularni signalni domen izveden iz CD3ζ; i/ili
(iii) intracelularni signalni domen sadrži kostimulatorni signalni domen, pri čemu je izborno kostimulatorni signalni domen izveden iz kostimulatornog molekula izabranog
iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda CD83 i njihovih kombinacija.
16. CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15, koji dodatno sadrži zglobni domen koji se nalazi između C-terminusa ekstracelularnog domena za vezivanje antigena i N-terminusa transmembranskog domena, i/ili signalni peptid koji se nalazi na N-terminusu polipeptida.
17. CAR prema patentnom zahtevu 1, pri čemu CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:200, 201 i 206-216.
18. Izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17.
19. Vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 18.
20. Imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom koja sadrži CAR prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17, izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 18 ili vektor prema patentnom zahtevu 19.
21. Imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom prema patentnom zahtevu 20, pri čemu imuna efektorska ćelija dobijena genetskim inženjeringom je T ćelija.
22. Farmaceutska kompozicija koji sadrži imunu efektorsku ćeliju dobijenu genetskim inženjeringom prema patentnom zahtevu 20 ili 21 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
23. Farmaceutska kompozicija kako je definisana u patentnom zahtevu 22 za upotrebu u postupku lečenja kancera kod individue, pri čemu prvi antigen i drugi antigen su tumorski antigeni.
24. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, pri čemu, kancer je multipli mijelom, akutna limfoblastična leukemija ili hronična limfocitna leukemija.
RS20260267A 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigenski receptori zasnovani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe RS67825B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510490002 2015-08-11
CN201510733585.2A CN105384825B (zh) 2015-08-11 2015-11-02 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
PCT/CN2016/094408 WO2017025038A1 (en) 2015-08-11 2016-08-10 Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof
EP16834662.5A EP3334765B1 (en) 2015-08-11 2016-08-10 Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67825B1 true RS67825B1 (sr) 2026-03-31

Family

ID=55417644

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260562A RS68082B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe
RS20240831A RS65866B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe
RS20260267A RS67825B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigenski receptori zasnovani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260562A RS68082B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe
RS20240831A RS65866B1 (sr) 2015-08-11 2016-08-10 Himerni antigen receptori bazirani na jednodomenskim antitelima i postupci njihove upotrebe

Country Status (37)

Country Link
US (2) US10934363B2 (sr)
EP (5) EP4755460A2 (sr)
JP (6) JP6859347B2 (sr)
KR (2) KR20240173368A (sr)
CN (9) CN105384825B (sr)
AU (4) AU2016305075B2 (sr)
BR (1) BR112018002844A2 (sr)
CA (1) CA2994579C (sr)
CL (4) CL2018000378A1 (sr)
CO (2) CO2018001405A2 (sr)
CR (2) CR20210225A (sr)
CY (1) CY2024032I2 (sr)
DK (2) DK4063397T3 (sr)
EA (1) EA201890302A1 (sr)
ES (3) ES3067089T3 (sr)
FI (3) FI4063397T3 (sr)
FR (1) FR24C1050I2 (sr)
HR (2) HRP20260300T1 (sr)
HU (3) HUE067869T2 (sr)
IL (3) IL294683A (sr)
LT (4) LT4063397T (sr)
MX (2) MX2018001739A (sr)
MY (3) MY188362A (sr)
NL (1) NL301301I2 (sr)
NO (1) NO2024054I1 (sr)
NZ (1) NZ750366A (sr)
PH (2) PH12018500295B1 (sr)
PL (3) PL3334765T3 (sr)
PT (2) PT4063397T (sr)
RS (3) RS68082B1 (sr)
SA (2) SA518390904B1 (sr)
SG (2) SG10201913485QA (sr)
SI (2) SI3334765T1 (sr)
SM (3) SMT202600176T1 (sr)
UA (2) UA125818C2 (sr)
WO (1) WO2017025038A1 (sr)
ZA (2) ZA201800703B (sr)

Families Citing this family (302)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4050103A1 (en) 2014-04-07 2022-08-31 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-nme antibody
CN104004095B (zh) * 2014-06-04 2016-11-23 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种cd7纳米抗体、其编码序列及应用
EP3234120B1 (en) 2014-12-15 2025-09-03 The Regents of the University of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective t cell mediated killing
WO2016100232A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
US10434153B1 (en) 2015-05-20 2019-10-08 Kim Leslie O'Neill Use of car and bite technology coupled with an scFv from an antibody against human thymidine kinase 1 to specifically target tumors
EP3297672B1 (en) 2015-05-21 2021-09-01 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3368571B1 (en) 2015-10-30 2022-12-07 The Regents of The University of California Transforming growth factor-beta-responsive polypeptides and their methods for use
JP2019506155A (ja) 2016-01-12 2019-03-07 クレッシェンド、バイオロジックス、リミテッドＣｒｅｓｃｅｎｄｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ 治療分子
MA44254A (fr) 2016-02-17 2018-12-26 Seattle Genetics Inc Anticorps bcma et leur utilisation pour traiter le cancer et les troubles immunologiques
CN110699371A (zh) * 2016-03-18 2020-01-17 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
KR102427334B1 (ko) * 2016-04-01 2022-08-03 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 및 t 세포 수용체 및 사용 방법
NZ746700A (en) 2016-04-01 2023-04-28 Kite Pharma Inc Bcma binding molecules and methods of use thereof
GB201607968D0 (en) * 2016-05-06 2016-06-22 Crescendo Biolog Ltd Chimeric antigen receptor
KR102530742B1 (ko) 2016-05-20 2023-05-09 하푼 테라퓨틱스, 인크. 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
IL299221A (en) 2016-06-21 2023-02-01 Teneobio Inc Cd3 binding antibodies
CN109562126A (zh) * 2016-06-24 2019-04-02 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
WO2018002181A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Umc Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
WO2018014039A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors (cars) specific for muc1 and methods for their use
WO2018014122A1 (en) * 2016-07-18 2018-01-25 Helix Biopharma Corp. Car immune cells directed to carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6 to treat cancer
PL3896091T3 (pl) 2016-08-10 2024-04-29 Legend Biotech Ireland Limited Chimeryczne receptory antygenowe nakierowane na bcma i sposoby ich zastosowania
CR20220578A (es) * 2016-09-14 2023-01-17 Teneobio Inc Anticuerpos de unión a cd3
WO2018058432A1 (zh) * 2016-09-28 2018-04-05 李华顺 一种多基因重组嵌合抗原受体分子及其应用
WO2018068201A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
CN106701827A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 刘晓明 表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体t细胞的转化及扩增培养与保存方法
CN106755108A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 刘晓明 一种表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法
CN106755109A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 刘晓明 一种表达人cd19和cd20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体
EP3581190B1 (en) 2016-12-09 2021-03-10 ONK Therapeutics Limited Engineered natural killer cells and uses thereof
CN106822184A (zh) * 2016-12-15 2017-06-13 梁爱斌 多靶点联合的car‑t细胞制剂与制备方法
EP3559035A1 (en) * 2016-12-21 2019-10-30 TeneoBio, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
CN108276493B (zh) * 2016-12-30 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN106749677B (zh) * 2017-01-04 2020-06-12 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种靶向mll白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用
EP3565842A1 (en) 2017-01-06 2019-11-13 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death (pd-1)
US20190375815A1 (en) 2017-01-31 2019-12-12 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
IL268349B2 (en) 2017-02-17 2024-08-01 Hutchinson Fred Cancer Res Combination therapies for treatment of bcma-related cancers and autoimmune disorders
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
MY200973A (en) 2017-04-11 2024-01-26 Inhibrx Inc Multispecific Polypeptide Constructs Having Constrained Cd3 Binding And Methods Of Using The Same
CN108728465A (zh) * 2017-04-14 2018-11-02 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种表达靶细胞-效应细胞桥接器的微环dna载体及其制备方法和应用
WO2018200582A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Chimeric antibody/t-cell receptor constructs and uses thereof
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
PL3618842T3 (pl) 2017-05-01 2024-02-19 Juno Therapeutics, Inc. Kombinacja terapii komórkowej i związku immunomodulującego
SG10202107880XA (en) 2017-05-12 2021-09-29 Harpoon Therapeutics Inc Mesothelin binding proteins
EP3624834A1 (en) * 2017-05-17 2020-03-25 Thunder Biotech Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
US10415017B2 (en) 2017-05-17 2019-09-17 Thunder Biotech, Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
CN107299110B (zh) 2017-05-27 2019-11-22 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的胰腺癌、恶性间皮瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107245500B (zh) * 2017-05-27 2019-05-17 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN107337736B (zh) * 2017-06-06 2019-07-26 上海优卡迪生物医药科技有限公司 Octs-car双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用
JP7240335B2 (ja) * 2017-06-20 2023-03-15 テネオワン， インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体
CN110891971B (zh) * 2017-06-20 2024-01-12 特尼奥生物股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2019006072A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS TO ANTIGEN OF MATURATION OF LYMPHOCYTES B WITH HUMAN DOMAINS
GB201711068D0 (en) 2017-07-10 2017-08-23 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules binding PSMA
CN109232742B (zh) * 2017-07-11 2021-10-22 深圳市第二人民医院 一种嵌合抗原受体及其应用
WO2019014891A1 (zh) * 2017-07-20 2019-01-24 深圳普瑞金生物药业有限公司 一种用于治疗肿瘤的egfr单域抗体cart及其应用
WO2019018525A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS BINDING TO CD123
AU2018309735B2 (en) * 2017-07-31 2025-03-13 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD19/CD20 immunotherapy
US20200207867A1 (en) * 2017-09-13 2020-07-02 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes
WO2019066435A2 (ko) 2017-09-29 2019-04-04 재단법인 목암생명과학연구소 Bcma에 높은 친화도를 가지는 항-bcma 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
CA3078969A1 (en) * 2017-10-13 2019-04-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
SG11202003415XA (en) 2017-10-18 2020-05-28 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
US11066475B2 (en) 2017-11-01 2021-07-20 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen and encoding polynucleotides
AU2018359907A1 (en) 2017-11-06 2020-05-07 Fred Hutchinson Cancer Center Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
CA3082297A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma
WO2019099639A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Navartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
MX2020005651A (es) 2017-11-30 2020-10-28 Novartis Ag Receptor de antigeno quimerico dirigido a bcma y usos del mismo.
US20190192678A1 (en) * 2017-12-18 2019-06-27 Novather, Inc. System and method for the treatment of disease using a hyperspecific modified protein system
AU2018393110B2 (en) 2017-12-20 2023-04-27 Poseida Therapeutics, Inc. VCAR compositions and methods for use
MA51428A (fr) * 2017-12-22 2020-11-04 Bluebird Bio Inc Récepteur d'antigène chimérique multivalent
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
WO2019127215A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric receptors comprising an nkg2d domain and methods of use thereof
CN109971715A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 深圳华大生命科学研究院 一种扩增特异性car-t细胞的培养方法
CN109988242A (zh) * 2018-01-02 2019-07-09 武汉波睿达生物科技有限公司 联合嵌合抗原受体、表达载体、慢病毒及t细胞
WO2019136432A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
CN108285486A (zh) * 2018-01-15 2018-07-17 浙江阿思科力生物科技有限公司 以cd20为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
KR102115236B1 (ko) * 2018-01-29 2020-05-27 (주)에스엠티바이오 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
AU2019215031C1 (en) 2018-01-31 2026-02-26 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CN108341881B (zh) * 2018-01-31 2020-08-18 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108314739B (zh) * 2018-02-05 2020-07-14 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN110129369B (zh) * 2018-02-09 2023-10-13 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种嵌合抗原受体基因工程载体、免疫细胞及其应用
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
GB201802573D0 (en) 2018-02-16 2018-04-04 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules that bind to LAG3
CN108220247A (zh) * 2018-03-20 2018-06-29 杭州史迪姆生物科技有限公司 一种双car-t细胞及其制备方法和应用
EP3773633A4 (en) 2018-04-06 2022-01-26 The Regents of The University of California METHODS OF TREATMENT OF GLIOBLASTOMA
CA3096202A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 The Regents Of The University Of California Methods of treating egfrviii expressing glioblastomas
EP3549597A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Synthetic signalling constructs and its use
TW202010757A (zh) 2018-04-11 2020-03-16 美商英伊布里克斯公司 具有經受限cd3結合的多重特異性多肽構築體以及相關方法及用途
CN116836297A (zh) * 2018-04-12 2023-10-03 上海赛比曼生物科技有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其制法和应用
MX2020012217A (es) 2018-05-14 2021-03-02 Harpoon Therapeutics Inc Porción de unión para activación condicional de moléculas de inmunoglobulina.
WO2019220368A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Janssen Biotech, Inc. Bcma/cd3 and gprdc5d/cd3 bispecific antibodies for use in cancer therapy
CN110606893B (zh) * 2018-06-15 2022-11-15 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 一种靶向cd19和cd20双抗原的嵌合性抗原受体t细胞治疗肿瘤的方法
WO2019242632A1 (en) * 2018-06-19 2019-12-26 1§1Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
LT3823990T (lt) * 2018-07-20 2026-04-10 TeneoTwo, Inc. Antikūnai iš sunkiosios grandinės, besirišantys prie cd19
WO2020023553A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
SG11202101415UA (en) * 2018-08-10 2021-03-30 Sangamo Therapeutics France New car constructs comprising tnfr2 domains
GB201813178D0 (en) * 2018-08-13 2018-09-26 Autolus Ltd Cell
CN109134665B (zh) 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
CN111542343B (zh) * 2018-08-24 2023-08-18 上海先博生物科技有限公司 抗bcma的单域抗体及其应用
SI3844267T1 (sl) 2018-08-31 2025-10-30 Novartis Ag Postopki izdelave celic, ki izražajo receptorje himernega antigena
US20210171909A1 (en) 2018-08-31 2021-06-10 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
WO2020052543A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies against cd33 and constructs thereof
CN109293781A (zh) * 2018-09-12 2019-02-01 中国人民解放军总医院 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用
CN109081870B (zh) * 2018-09-21 2021-12-03 成都阿帕克生物科技有限公司 一种抗人促绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CN119306844A (zh) 2018-09-25 2025-01-14 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
CN109265550B (zh) * 2018-09-25 2020-09-15 华东师范大学 Bcma抗体、嵌合抗原受体和药物
WO2020061796A1 (en) * 2018-09-26 2020-04-02 Hrain Biotechnology Co., Ltd. Bcma-and-cd19-targeting chimeric antigen receptor and uses thereof
CN109503716B (zh) * 2018-10-08 2021-04-27 浙江生研生物科技有限公司 一种双特异性嵌合抗原受体分子及其在肿瘤治疗上的应用
JP7611820B2 (ja) * 2018-10-11 2025-01-10 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｄｌｌ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
US12590169B2 (en) 2018-10-11 2026-03-31 Inhibrx Biosciences, Inc. 5T4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020087065A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to cd38
CN109504660B (zh) * 2018-11-02 2021-08-06 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
CN113573719A (zh) 2018-11-08 2021-10-29 朱诺治疗学股份有限公司 治疗和t细胞调节的方法和组合
US12466892B2 (en) 2018-11-08 2025-11-11 The Regents Of The University Of California Systems and methods for targeting cancer cells
CN113226340A (zh) 2018-11-26 2021-08-06 恩卡尔塔公司 同时扩增多种免疫细胞类型的方法、相关组合物及其在癌症免疫疗法中的用途
CN109468283A (zh) * 2018-11-30 2019-03-15 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和bcma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
CN110951689A (zh) * 2018-11-30 2020-04-03 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和cd30的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用
KR20250116790A (ko) 2018-12-12 2025-08-01 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 수용체 및 car-t 세포 및 사용 방법
CN109485732B (zh) * 2018-12-20 2021-09-24 四川大学华西医院 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途
CN109651511B (zh) * 2018-12-26 2020-06-09 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
US20220144960A1 (en) * 2018-12-26 2022-05-12 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Cd30-binding moieties, chimeric antigen receptors, and uses thereof
CN109652379B (zh) * 2018-12-29 2022-08-16 博生吉医药科技(苏州)有限公司 Cd7嵌合抗原受体修饰的nk-92mi细胞及其应用
CN109485734B (zh) * 2018-12-30 2020-05-12 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma和cd19的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3908613A4 (en) * 2019-01-07 2022-10-19 Celluris Participações Ltda. BISPECIFIC IN-TANDEM RECEPTOR CAR AND METHODS FOR MODULATION OF THE TUMOR MICROAREA
WO2020154150A1 (en) 2019-01-22 2020-07-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use
CN113330038A (zh) * 2019-01-22 2021-08-31 亘喜生物科技（上海）有限公司 Cd20组合靶向的工程化免疫细胞
EP3920693A4 (en) * 2019-02-04 2022-10-05 Minerva Biotechnologies Corporation ANTI-NME ANTIBODIES AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER OR CANCER METASTASIS
CN109734814A (zh) * 2019-02-12 2019-05-10 南京卡提医学科技有限公司 具有免疫受体的工程化t细胞治疗癌症的用途
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
CN113613664B (zh) 2019-03-01 2025-11-18 阿奇洛伊斯生物制药公司 在抗原特异性免疫细胞中调节cd160功能的方法及其用途
KR20210137085A (ko) 2019-03-05 2021-11-17 엔카르타, 인크. Cd19 유도된 키메라 항원 수용체 및 면역 요법에서 이의 용도
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
CA3133654A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to psma
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959307A4 (en) * 2019-04-22 2023-08-23 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
CN109942709B (zh) * 2019-04-22 2019-12-27 广州百暨基因科技有限公司 一种抗bcma的单域抗体及其应用
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
JP7711945B2 (ja) 2019-04-30 2025-07-23 センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド キメラ受容体及びその使用方法
EP3966245A1 (en) * 2019-05-04 2022-03-16 Inhibrx, Inc. Cd33-binding polypeptides and uses thereof
WO2020232303A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM BINDING PROTEINS AND METHODS OF USE
CN114206927B (zh) 2019-06-14 2025-03-21 特尼奥生物股份有限公司 与cd22和cd3结合的多特异性重链抗体
CN114341365A (zh) * 2019-08-30 2022-04-12 詹森生物科技公司 B细胞成熟复合物car t构建体和引物
CN114667294B (zh) * 2019-09-02 2024-04-16 成都盛世君联生物技术有限公司 特异性结合b细胞成熟抗原的抗体及其用途
CN112739721B (zh) * 2019-09-26 2023-01-31 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体
WO2021081133A1 (en) * 2019-10-21 2021-04-29 Purdue Research Foundation Engineered natural killer cells and methods for using the same in immunotherapy and autophagy inhibition techniques
CA3156761A1 (en) 2019-10-22 2021-04-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity nanobodies targeting b7h3 (cd276) for treating multiple solid tumors
US12522645B2 (en) 2019-11-05 2026-01-13 Janssen Biotech, Inc. BCMA-targeted CAR-T cell therapy of multiple myeloma
WO2021105989A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Chimeric antigen receptor to carbohydrate antigens
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021105988A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Antibodies to carbohydrate antigens
CN114829405B (zh) * 2019-12-10 2025-07-18 爱必乐生物公司 抗bcma/抗4-1bb双特异性抗体及其用途
CN115916818A (zh) 2019-12-11 2023-04-04 库利南肿瘤股份有限公司 抗cd19抗体和多特异性结合蛋白
EP4077398A4 (en) * 2019-12-16 2024-04-10 Legend Biotech Ireland Limited SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TARGETTING BCMA AND METHODS OF USE THEREOF
CN115135672A (zh) 2019-12-20 2022-09-30 波赛达治疗公司 抗muc1组合物和使用方法
CN111235113A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 南京北恒生物科技有限公司 包含嵌合抗原受体的免疫细胞及其用途
EP4097129A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 Inhibrx, Inc. Cd28 single domain antibodies and multivalent and multispecific constructs thereof
CN111196858B (zh) * 2020-02-05 2021-02-09 武汉科技大学 一种治疗血液肿瘤合并hiv感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用
CN113248620A (zh) * 2020-02-13 2021-08-13 四川大学 一种嵌合抗原受体的共刺激信号结构域及其应用
CN115698285A (zh) * 2020-02-14 2023-02-03 小利兰·斯坦福大学董事会 具有cd2激活的嵌合抗原受体
IL295878A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
JP2023516008A (ja) 2020-02-27 2023-04-17 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
CN115768899B (zh) 2020-03-09 2026-03-27 詹森生物科技公司 用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
IL297147B1 (en) 2020-04-10 2026-05-01 Juno Therapeutics Inc Methods and uses related to engineered cell therapy with a chimeric antigen receptor directed against a B-cell maturation antigen
CA3181399A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Juno Therapeutics, Inc. Combination of bcma-directed t cell therapy and an immunomodulatory compound
KR20250007022A (ko) 2020-04-29 2025-01-13 테네오원, 인코포레이티드 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 다중특이적 중쇄 항체
EP3915576A1 (en) * 2020-05-28 2021-12-01 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
CN111574629B (zh) * 2020-06-01 2021-07-20 宁夏医科大学 一种抗cd20的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用
JP2023530039A (ja) 2020-06-08 2023-07-12 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 抗ｎｍｅ抗体および癌または癌転移の治療方法
US20230332104A1 (en) 2020-06-11 2023-10-19 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
CA3183682A1 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Minerva Biotechnologies Corporation Anti-nme antibody and method of treating cancer or cancer metastasis
WO2022011531A1 (zh) * 2020-07-14 2022-01-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
CN116390941A (zh) * 2020-07-16 2023-07-04 南京传奇生物科技有限公司 多特异性嵌合抗原受体及其用途
US20230250184A1 (en) * 2020-07-16 2023-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Cd22 binding molecules and uses thereof
JP7846667B2 (ja) * 2020-07-16 2026-04-15 レジェンド バイオテック アイルランド リミテッド Ｃｄ２０結合分子及びその使用
CA3186065A1 (en) * 2020-07-16 2022-01-20 Xiaohu FAN Cd19 binding molecules and uses thereof
CN111848798B (zh) * 2020-07-27 2022-05-13 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合bcma的纳米抗体及其应用
AU2021317073A1 (en) * 2020-07-29 2023-02-16 National Research Council Of Canada Anti-CD22 single domain antibodies and therapeutic constructs
US20230340146A1 (en) 2020-08-13 2023-10-26 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-1 (gpc1) for treating solid tumors
EP4201960A4 (en) * 2020-08-20 2024-09-04 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. BCMA-BINDING SINGLE MOLECULE WITH VARIABLE DOMAIN AND ANTIGEN-BINDING MOLECULE
WO2022040586A2 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
JP2023549780A (ja) 2020-11-04 2023-11-29 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 改変されたインバリアントｃｄ３免疫グロブリンスーパーファミリー鎖遺伝子座からキメラ受容体を発現する細胞ならびに関連するポリヌクレオチドおよび方法
WO2022116086A1 (en) * 2020-12-03 2022-06-09 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
US20240059794A1 (en) * 2020-12-17 2024-02-22 Parasol Biotech Ltd. Gucy2c binding molecules and uses thereof
JP2024500189A (ja) 2020-12-21 2024-01-04 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド プロテアーゼ活性化ｃｄ４５ゲートｃａｒ
CA3209218A1 (en) * 2021-01-27 2022-08-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Bi-specific car t cells for b cell malignancies
MX2023008809A (es) 2021-01-29 2023-08-04 Allogene Therapeutics Inc ATENUACIÓN O INACTIVACIÓN DE UNO O MÁS DE TAP2, NLRC5, ß2M, TRAC, RFX5, RFXAP Y RFXANK PARA MITIGAR EL RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS T DE PRODUCTOS CELULARES ALOGÉNICOS.
CN112778427B (zh) * 2021-01-29 2022-03-15 武汉思安医疗技术有限公司 双特异性cs1-bcma car-t细胞及其应用
WO2022183160A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Methods for treating cd83-expressing cancer
KR20230165771A (ko) 2021-03-03 2023-12-05 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포 요법 및 dgk 억제제의 조합
CN115109156B (zh) * 2021-03-22 2024-03-08 浙江纳米抗体技术中心有限公司 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用
PE20260568A1 (es) * 2021-04-06 2026-03-10 Teneobio Inc Anticuerpos anti-cd19 y estructuras car-t
KR20230171994A (ko) 2021-04-16 2023-12-21 셀진 코포레이션 선행 줄기 세포 이식을 받은 환자에서의 t 세포 요법
CN117337303A (zh) * 2021-04-16 2024-01-02 特尼奥生物股份有限公司 抗cd20抗体及car-t结构
CN118201618A (zh) 2021-04-16 2024-06-14 细胞基因公司 与bcma定向t细胞疗法的组合疗法
AR125468A1 (es) 2021-04-27 2023-07-19 Novartis Ag Sistema de producción de vectores virales
WO2022232612A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
WO2022228579A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting gpc3 and methods of use thereof
CN117916256A (zh) 2021-05-06 2024-04-19 朱诺治疗学有限公司 用于刺激和转导t细胞的方法
TW202309522A (zh) 2021-05-11 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於監測復發性及／或難治性多發性骨髓瘤之治療的方法及組成物
IL308345A (en) 2021-05-11 2024-01-01 Janssen Biotech Inc Methods for Minimizing Neurotoxicity Associated with Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Therapy
CN117425670A (zh) * 2021-05-19 2024-01-19 细胞编辑有限责任公司 双特异性嵌合抗原受体和表达此类双特异性嵌合抗原受体的基因工程化免疫细胞
CA3216228A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
KR20240051112A (ko) 2021-07-01 2024-04-19 인답타 세라뷰틱스 인코포레이티드 조작된 자연 살해(nk) 세포 및 관련 방법
CN113651893B (zh) * 2021-08-12 2023-08-01 上海生物制品研究所有限责任公司 联合her2和meso双靶点car-t载体及其构建方法和在癌症中的应用
CA3228773A1 (en) * 2021-08-12 2023-02-16 Gaurav KHARYA Chimeric antigen receptors (car) for b cell malignancies
EP4388000A1 (en) 2021-08-20 2024-06-26 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
CN115894704B (zh) * 2021-09-24 2023-12-26 四川大学 一种特异性靶向肿瘤EpCAM抗原的抗体及应用
TW202330594A (zh) 2021-09-29 2023-08-01 美商莫德斯醫療公司 抗原結合多肽、抗原結合多肽複合物及其使用方法
US20250000976A1 (en) * 2021-10-07 2025-01-02 National Research Council Of Canada Anti-bcma single domain antibodies and therapeutic constructs
US20240417446A1 (en) 2021-10-26 2024-12-19 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CN114015674B (zh) 2021-11-02 2024-08-30 辉大(上海)生物科技有限公司 一种CRISPR-Cas12i系统
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
WO2023081735A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen for use in treating myeloma
JP2024540275A (ja) 2021-11-04 2024-10-31 ヤンセン バイオテック， インク． Ｂｃｍａを標的とする、多発性骨髄腫のためのｃａｒ－ｔ細胞療法関連出願の相互参照
WO2023077343A1 (en) 2021-11-04 2023-05-11 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
CN118556086A (zh) 2021-11-09 2024-08-27 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（gpc3）的含有igg4铰链的嵌合抗原受体及其用途
CN115466331B (zh) * 2021-11-18 2023-05-30 合源生物科技(天津)有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
CA3241912A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-15 Huafeng Wei Antibody binding to bcma and use thereof
CN114195898B (zh) * 2021-12-13 2022-10-28 南京凯地医疗技术有限公司 人源化抗cd33的单域抗体及其构建体制备方法和应用
CN118401561A (zh) * 2021-12-16 2024-07-26 浙江瑞加美生物科技有限公司 人源化的bcma抗体和bcma-car-t/bcma-car-dnt细胞
JP2025508298A (ja) * 2021-12-29 2025-03-26 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー シングルドメイン高親和性抗体及びその使用方法
KR20240137075A (ko) 2022-01-28 2024-09-19 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 조성물의 제조 방법
CN119156404A (zh) 2022-02-15 2024-12-17 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向gpc2的含有cd28铰链和跨膜结构的嵌合抗原受体及其用途
JP2025507678A (ja) 2022-02-28 2025-03-21 ヤンセン バイオテック， インク． Ｂｃｍａを標的とする、多発性骨髄腫のためのｃａｒ－ｔ細胞療法
CN114685664B (zh) * 2022-04-12 2023-10-20 内蒙古农业大学 抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用
US20250297282A1 (en) 2022-05-05 2025-09-25 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
CN119212724A (zh) * 2022-05-09 2024-12-27 上海先博生物科技有限公司 工程化免疫效应细胞及其与CBL-b抑制剂联用的应用
US20250295771A1 (en) 2022-05-11 2025-09-25 Celgene Corporation Methods and uses related to t cell therapy and production of same
US20250302954A1 (en) 2022-05-11 2025-10-02 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
US20250345432A1 (en) 2022-05-25 2025-11-13 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
AU2023276514A1 (en) * 2022-05-27 2024-12-05 Shenzhen Immunofoco Biotechnology Co., Ltd. Chimeric antigen receptor containing cldn18.2 single domain antibody and application thereof
KR20250023513A (ko) * 2022-06-13 2025-02-18 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 개선된 글리칸 의존성 면역치료 이중특이적 융합 단백질 및 키메라 항원 수용체
US12297285B2 (en) * 2022-06-24 2025-05-13 Orna Therapeutics, Inc. Circular RNA encoding chimeric antigen receptors targeting BCMA
CN117343905A (zh) * 2022-06-27 2024-01-05 广西医科大学 靶向EGFRvⅢ分泌PD1单域抗体的CAR-T细胞及其制备方法和应用
CN114805582B (zh) * 2022-06-29 2022-10-04 上海恒润达生生物科技股份有限公司 抗Trop2纳米抗体及其用途
US20250375524A1 (en) 2022-06-30 2025-12-11 Indapta Therapeutics, Inc. Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods
US20240042030A1 (en) 2022-07-29 2024-02-08 Allogene Therapeutics, Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition
US20260151429A1 (en) * 2022-08-25 2026-06-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting interleukin 13 receptor subunit alpha 2 and methods of use thereof
WO2024050399A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes
CN116023495B (zh) * 2022-09-05 2023-10-03 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗cd40纳米抗体及其制备方法与应用
KR20250061756A (ko) 2022-09-08 2025-05-08 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포 요법과 연속적 또는 간헐적 dgk 억제제 투여의 조합
CN115925947B (zh) * 2022-09-27 2023-08-22 上海百英生物科技股份有限公司 一种亲和力成熟方法及抗人pd-l1单域抗体的亲和力成熟
JP2026519263A (ja) 2022-10-26 2026-06-15 ノバルティス アーゲー レンチウイルス製剤
AU2023373360A1 (en) * 2022-11-02 2025-06-12 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy of multiple myeloma
US20260166082A1 (en) 2022-11-02 2026-06-18 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
CN117069844B (zh) * 2022-12-06 2024-02-09 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 包含特定等电点的抗人bcma纳米抗体的双特异性抗体及应用
CN121100267A (zh) 2022-12-09 2025-12-09 朱诺治疗学股份有限公司 使用全息成像预测细胞表型的机器学习方法
US20260232729A1 (en) 2023-02-03 2026-08-13 C3S2 Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
WO2024168192A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Celgene Corporation Assessment of bcma in biological samples
CN116199781B (zh) * 2023-02-22 2025-07-18 成都优赛诺生物科技有限公司 一种靶向cd22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
WO2024206209A1 (en) * 2023-03-27 2024-10-03 Modernatx, Inc. Anti-cd38, anti-bcma, anti-gprc5d, and anti-fcrh5 antibodies and uses to treat various diseases such as cancer
PE20260290A1 (es) 2023-03-31 2026-02-10 Abelzeta Inc Receptores de antigeno quimericos biespecificos dirigidos a cd20 y bcma
CN116640229B (zh) * 2023-04-10 2024-01-30 中国人民解放军总医院第五医学中心 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用
CA3205511A1 (en) * 2023-04-19 2025-03-17 Legend Biotech Usa Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
WO2024238346A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies that specifically bind the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein and compositions and uses thereof
WO2024240248A1 (zh) * 2023-05-24 2024-11-28 茂行制药(苏州)有限公司 用于靶向b7h3的同种异体嵌合抗原受体t细胞的给药的方法和组合物
CN116574181B (zh) * 2023-05-31 2026-06-09 华道(上海)生物医药股份有限公司 一种抗Glypican 3抗体及其应用
EP4719352A1 (en) 2023-05-31 2026-04-08 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
CN117986387A (zh) * 2023-05-31 2024-05-07 四川大学华西医院 一种新型小型化car设计及制备方法和应用
CN116789859B (zh) * 2023-06-29 2024-02-23 徐州医科大学 一种用于评价bcma靶向car-t细胞药效的靶细胞及其应用
CN116949099B (zh) * 2023-07-12 2024-04-02 山东大学第二医院 一种靶向cd38和cs1抗原的并联嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2025019228A1 (en) 2023-07-20 2025-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human monoclonal antibodies and chimeric antigen receptors against cd276 for the treatment of solid tumors
GR1010884B (el) * 2023-08-30 2025-02-19 Janssen Biotech, Inc., Θεραπεια τ κυτταρων με χιμαιρικο υποδοχεα αντιγονου (car) με στοχευμενο αντιγονο ωριμανσης των β κυτταρων (bcma) για πολλαπλο μυελωμα
CN121969385A (zh) 2023-09-11 2026-05-01 丹娜-法伯癌症研究院 含有il-2变体以增强car t细胞的功能性的car-衔接子
CN117024594B (zh) * 2023-09-21 2025-02-28 武汉波睿达生物科技有限公司 一种抗cd20的纳米抗体及其应用
WO2025067472A1 (en) * 2023-09-27 2025-04-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Methods of culturing gamma delta t cells
KR20260085124A (ko) 2023-10-05 2026-06-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Car-t 세포 의약품의 생성을 위한 렌티바이러스 제조의 개선된 방법
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
KR20260105764A (ko) 2023-10-30 2026-07-07 알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드 조작된 세포
CN120025440B (zh) * 2023-11-21 2026-07-17 南京融捷康生物科技有限公司 一种抗Nkp46的单域抗体及其用途
WO2025130984A1 (en) * 2023-12-20 2025-06-26 Overland Therapeutics (Us) Inc. Single domain antibodies for bcma
CN117821608A (zh) * 2023-12-28 2024-04-05 华道(上海)生物医药有限公司 一种检测car细胞的引物探针组合及其应用
KR102869233B1 (ko) * 2024-01-24 2025-10-15 주식회사 박셀바이오 Bcma 특이적 키메라 항원 수용체를 포함하는 신규한 골수 침윤 림프구 집단 및 이의 제조방법
AU2025218081A1 (en) 2024-02-05 2026-07-16 Janssen Biotech, Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
WO2025193685A1 (en) 2024-03-12 2025-09-18 Legend Biotech Usa Inc. Bcma-targeted car-t cell therapy for multiple myeloma
CN117866903B (zh) * 2024-03-12 2024-06-04 北京贝来药业有限公司 单域抗体修饰的干细胞及其在疾病治疗中用途
CN117866904B (zh) * 2024-03-12 2024-06-07 北京贝来药业有限公司 基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025221781A2 (en) 2024-04-15 2025-10-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting fgfr4 and/or cd276 and use thereof for the treatment of cancer
US20260041768A1 (en) 2024-05-03 2026-02-12 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025231372A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025232812A1 (en) * 2024-05-08 2025-11-13 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Biomolecule conjugated lipid nanoparticles
WO2025235598A1 (en) 2024-05-09 2025-11-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting glypican-2 and/or cd276 and their use for treating solid tumors
WO2025240496A1 (en) 2024-05-14 2025-11-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Natural killer cells expressing a mesothelin-targeted chimeric antigen receptor and interleukin-15 for the treatment of solid tumors
WO2026025092A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Juno Therapeutics, Inc. Synthetic promoters for t cell expression
WO2026026960A1 (zh) * 2024-08-01 2026-02-05 原启生物科技(上海)有限责任公司 一种靶向bcma的人源化纳米抗体及其应用
WO2026072709A1 (en) 2024-09-25 2026-04-02 Orna Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors targeting bcma
WO2026090579A1 (en) 2024-10-25 2026-04-30 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating smoldering multiple myeloma with ciltacabtagene autoleucel
WO2026103881A1 (en) * 2024-11-15 2026-05-21 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Bcma binding moieties and uses thereof
CN122071528A (zh) * 2024-11-22 2026-05-22 浙江纳米抗体技术中心有限公司 多特异性抗原结合分子及其应用
WO2026128545A1 (en) 2024-12-11 2026-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin-targeted car t cells with increased anti-tumor efficacy, persistence and resilience and use thereof for the treatment of mesothelin-positive cancers
WO2026158639A1 (en) * 2025-01-26 2026-07-30 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Bcma binding moieties and uses thereof
CN120173114B (zh) * 2025-03-24 2025-09-26 广州泽朗生物医药科技有限公司 Cart细胞及其在制备抗癌症药物中的应用

Family Cites Families (183)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1990003430A1 (en) 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
FI903489A7 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Yhden osan sisältävät ligandit, näitä ligandeja sisältävät reseptorit, menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä ligandien ja reseptorien käytt ö
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
DE69334275D1 (de) 1992-08-21 2009-05-20 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne Leichtkette
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
ATE374248T1 (de) 1996-06-27 2007-10-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antikörpermoleküle, die spezifisch mit dem aktiven zentrum oder dem aktiven spalt eines zielmoleküls interagieren
EP1972194A1 (en) 1996-12-03 2008-09-24 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
AU3596599A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
AU2474700A (en) 1998-12-01 2000-06-19 Genentech Inc. Secreted amd transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ATE276359T1 (de) 1999-01-19 2004-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP2002541845A (ja) 1999-04-16 2002-12-10 セルテック セラピューティックス リミテッド 合成膜貫通成分
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
HK1052372A1 (zh) 2000-02-24 2003-09-11 Xcyte Therapies, Inc. 细胞的同步刺激和富集
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
US20030190598A1 (en) 2000-05-26 2003-10-09 Jasmid Tanha Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
AU2002319544B2 (en) 2001-08-10 2008-07-10 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
JP2005516958A (ja) * 2001-12-20 2005-06-09 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド Ｔｒａｉｌレセプターに免疫特異的に結合する抗体
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE038955T2 (hu) 2003-11-05 2018-12-28 Roche Glycart Ag Antigén-kötõ molekulák fokozott Fc receptor-kötõ affinitással és effektor funkcióval
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
AU2005250408B2 (en) 2004-05-27 2010-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
EP1776383B1 (en) 2004-07-22 2014-08-20 Erasmus University Medical Center Rotterdam Binding molecules
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
TWI404727B (zh) 2006-01-25 2013-08-11 荷蘭鹿特丹Ｅｒａｓｍｕｓ大學醫學中心 對偶基因排除
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20100166734A1 (en) 2006-12-20 2010-07-01 Edward Dolk Oral delivery of polypeptides
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
HRP20150086T1 (xx) * 2007-06-12 2015-02-27 Ac Immune S.A. Humanizirana antitijela za beta amiloid
CA2706425A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CN101550416B (zh) * 2008-03-18 2012-01-25 陈志南 人源化单抗Hu-ScFv18的轻、重链可变区基因和其编码多肽及其应用
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
WO2011072204A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
EP2580243B1 (en) * 2010-06-09 2019-10-16 Genmab A/S Antibodies against human cd38
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
WO2013059343A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Intracellular delivery
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
EP2814846B1 (en) * 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
BR112014020502A2 (pt) 2012-02-22 2019-09-24 Univ Pennsylvania sequência de ácido nucleico isolada, receptor quimérico de antígeno isolado, célula, vetor, e, métodos para estimular uma resposta imune, para fornecer uma imunidade antitumoral, para tratamento de um mamífero, para gerar e para expandir uma população de células - t, e para modular a quantidade de citocina secretada por uma célula -t
AU2013246443B2 (en) 2012-04-11 2017-04-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen
KR20150029714A (ko) * 2012-07-13 2015-03-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 이중특이적 항체의 공-도입에 의한 ｃａｒ 세포의 활성 증강
WO2014055442A2 (en) * 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US9243058B2 (en) * 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
JP6636803B2 (ja) * 2013-02-05 2020-01-29 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａに対する抗体の選択のための方法
CN104045713B (zh) * 2013-03-13 2019-02-12 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种抗Blys的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物
UY35468A (es) * 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
EP3789487A1 (en) * 2013-04-03 2021-03-10 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
CN103421115B (zh) * 2013-09-02 2015-06-03 东南大学 一种cd38纳米抗体及应用
GB201317929D0 (en) 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US10189908B2 (en) 2014-02-05 2019-01-29 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific TN glycopeptide variants
AU2015230938C1 (en) 2014-03-21 2021-10-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
AU2015292744C1 (en) 2014-07-21 2021-01-21 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
EP3172231B1 (en) 2014-07-24 2021-05-05 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
PL3177643T3 (pl) * 2014-08-04 2019-09-30 F.Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen aktywujące komórki T
US11154615B2 (en) * 2014-11-11 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
EP3029067A1 (en) 2014-12-01 2016-06-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Use of blocking-reagents for reducing unspecific T cell-activation
US20180334490A1 (en) * 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
US10383929B2 (en) * 2014-12-12 2019-08-20 Bluebird Bio, Inc. BCMA chimeric antigen receptors
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN105777911B (zh) 2016-04-12 2019-07-02 上海优卡迪生物医药科技有限公司 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用
PL3896091T3 (pl) * 2016-08-10 2024-04-29 Legend Biotech Ireland Limited Chimeryczne receptory antygenowe nakierowane na bcma i sposoby ich zastosowania
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
CR20210225A (es) 2021-06-24
CY2024032I1 (el) 2026-02-25
PL3334765T3 (pl) 2026-04-27
WO2017025038A1 (en) 2017-02-16
MX2018001739A (es) 2018-08-15
CL2021001706A1 (es) 2022-01-28
EP4755460A2 (en) 2026-06-10
KR102970371B1 (ko) 2026-05-29
PL4063397T3 (pl) 2024-11-18
MY199874A (en) 2023-11-27
PH12019500193A1 (en) 2019-07-29
CN122562971A (zh) 2026-08-14
EP3334765A1 (en) 2018-06-20
KR20240173368A (ko) 2024-12-11
SG10201913485QA (en) 2020-02-27
CN113185615A (zh) 2021-07-30
EP4424376B1 (en) 2026-02-18
NL301301I2 (nl) 2025-04-09
AU2025271439A1 (en) 2026-01-08
EP4063397B1 (en) 2024-06-19
SMT202600176T1 (it) 2026-07-16
CN117756941A (zh) 2024-03-26
CN113234173A (zh) 2021-08-10
US20210261675A1 (en) 2021-08-26
CN113234174A (zh) 2021-08-10
EP4755458A2 (en) 2026-06-10
ZA201800703B (en) 2018-12-19
UA125818C2 (uk) 2022-06-15
CN118085090A (zh) 2024-05-28
CN113234173B (zh) 2022-03-11
CY2024032I2 (el) 2026-02-25
US20180230225A1 (en) 2018-08-16
ES2984851T3 (es) 2024-10-31
PL4424376T3 (pl) 2026-07-06
CO2018001405A2 (es) 2018-11-22
FR24C1050I2 (fr) 2025-12-05
CN105384825B (zh) 2018-06-01
EP4755458A3 (en) 2026-08-12
MY188362A (en) 2021-12-03
DK3334765T3 (da) 2026-03-16
HRP20260300T1 (hr) 2026-04-24
LT3334765T (lt) 2026-03-25
JP7168173B2 (ja) 2022-11-09
IL294683A (en) 2022-09-01
CN109311999A (zh) 2019-02-05
MY192392A (en) 2022-08-18
IL257297B (en) 2022-08-01
JP2025159117A (ja) 2025-10-17
JP2024032975A (ja) 2024-03-12
SI4063397T1 (sl) 2024-10-30
EP3334765B1 (en) 2026-02-11
AU2016305075B2 (en) 2019-10-10
LTPA2024535I1 (sr) 2024-12-27
CL2021001686A1 (es) 2022-01-28
NZ750366A (en) 2022-10-28
EP4424376A3 (en) 2024-12-04
AU2020200151A1 (en) 2020-01-30
CN109311999B (zh) 2026-06-09
LTC4063397I2 (sr) 2026-05-25
CL2019000326A1 (es) 2019-10-04
IL264607A (en) 2019-02-28
DK4063397T3 (da) 2024-07-22
NO2024054I1 (no) 2024-12-10
PT4063397T (pt) 2024-07-29
IL257297A (en) 2018-03-29
AU2020200151B2 (en) 2022-03-17
SA518390904B1 (ar) 2023-02-22
UA130798C2 (uk) 2026-05-20
US10934363B2 (en) 2021-03-02
EA201890302A1 (ru) 2018-10-31
FIC20240042I1 (fi) 2024-12-11
SMT202400311T1 (it) 2024-11-15
CN113234174B (zh) 2024-01-09
SG11201900635QA (en) 2019-02-27
EP4424376C0 (en) 2026-02-18
LT4063397T (lt) 2024-09-25
CL2018000378A1 (es) 2018-08-17
JP2021094037A (ja) 2021-06-24
HUE064534T2 (hu) 2024-03-28
PH12018500295B1 (en) 2023-08-11
AU2022204180A1 (en) 2022-07-07
JP2026099826A (ja) 2026-06-18
AU2016305075A1 (en) 2018-03-08
RS68082B1 (sr) 2026-05-29
AU2020200151C1 (en) 2022-09-08
FI3334765T3 (fi) 2026-03-26
SMT202600116T1 (it) 2026-05-12
EP4063397A1 (en) 2022-09-28
FR24C1050I1 (fr) 2025-01-17
CN105384825A (zh) 2016-03-09
FI4063397T3 (fi) 2024-08-09
ES3068096T3 (es) 2026-05-27
CA2994579A1 (en) 2017-02-16
LT3896091T (lt) 2023-12-27
PT3334765T (pt) 2026-03-03
KR20180035918A (ko) 2018-04-06
SI3334765T1 (sl) 2026-05-29
EP4424376A2 (en) 2024-09-04
HUE067869T2 (hu) 2024-11-28
JP2022183283A (ja) 2022-12-08
JP6859347B2 (ja) 2021-04-14
JP2018525033A (ja) 2018-09-06
HRP20241057T1 (hr) 2024-11-08
CR20180153A (es) 2018-08-09
CA2994579C (en) 2023-07-11
PH12018500295A1 (en) 2021-05-10
MX2022015823A (es) 2023-01-24
SA519401072B1 (ar) 2024-02-01
ZA201807836B (en) 2019-08-28
NZ778787A (en) 2025-05-02
CO2019000946A2 (es) 2019-02-08
CN113185616A (zh) 2021-07-30
EP3334765A4 (en) 2019-05-08
BR112018002844A2 (pt) 2019-04-30
CN113185616B (zh) 2024-03-01
HUS2400044I1 (hu) 2025-01-28
ES3067089T3 (en) 2026-05-19
RS65866B1 (sr) 2024-09-30
NZ791176A (en) 2025-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUS2400044I1 (hu) Egydoménes antitesteken alapuló kiméra antigén-receptorok és eljárások alkalmazásukra
IL263626A (en) Chimeric antigen receptors and methods of use
IL265800A (en) Anti-lag-3 antibodies and methods of using them
IL255336A0 (en) Chimeric antigen receptors and methods of using them
ZA201705720B (en) Anti-dll3 chimeric antigen receptors and methods of use
IL252295A0 (en) Chimeric antigen receptors and methods of using them
SG11201808411RA (en) Chimeric antigen and t cell receptors and methods of use
ZA201703471B (en) Anti-cldn chimeric antigen receptors and methods of use
ZA201608305B (en) Monoclonal antibodies against her2 epitope and methods of use thereof
ZA201605655B (en) Chimeric antigen receptors and methods of making
IL265957A (en) Anti-c1s antibodies and methods of using them
IL270793A (en) Anti-HTRA1 antibodies and methods of using them
SG11201707886WA (en) Humanized anti-c1s antibodies and methods of use thereof
IL273538A (en) Anti-TRKB Monoclonal Antibodies and Methods of Use
HK1256354A1 (en) Chimeric antigen receptors based on single-domain antibodies and methods of use thereof
AU2016222891A1 (en) Anti-DLL3 chimeric antigen receptors and methods of use