SE509052C2 - Insulinanalog-hexamer-komplex - Google Patents

Description

509 052 2 monomera resulterar olyckligtvis nog också i en hög grad av polymerbildning i parenterala kompositioner. Eftersom insulin- preparat icke är användbara vid polymerhalter av 1% (U.S. Pharma- copoeia, 1990), är det ytterst viktigt att till ett minimum ned- bringa denna typ av nedbrytning för minskning av oönskade bi- verkningar. Det är därför önskvärt att bereda monomera insulin- analoger på sådant sätt att analogen undergår självassociation under bildning av en stabil konformation samtidigt som den snabba absorptionen bibehålles.

Tillsättning av vissa metalljoner, främst zink, ökar den kemiska stabiliteten genom att insulinet bringas att undergå association och bilda hexamerer, särskilt Zn(II)-¶3-konformatio- nen. Man har dessutom funnit att fenoler bindes specifikt till insulin-hexameren och framkallar en allosterisk konformations- förändring, varigenom de åtta N-terminala aminosyrorna i B-kedjan omvandlas från den utsträckta konformationen till en alfa-helix. Se Derewenda et al., Nature, 338:594-596 (1989).

Detta fenol-bundna konformationstillstånd är känt såsom zn(II)-R-tillståndet.

I stark kontrast till dessa väl dokumenterade observatio- ner att insulin lätt undergår aggregation i närvaro av zink under bildning av den väl definierade, stabila zink-hexamer- -strukturen visade tidiga undersökningar av monomera insulin- analoger att eventuell aggregation mellan zink och insulin- analogen skiljer sig från vad som observera med insulin. Se B.H. Frank, Text and Slide copies of Lecture given at the _ Conference on Insulin "Self-Association and Conformational Studies on Human Proinsulin and Insulin Analoga", University of York (August ZQ-September l, 1989). Det mycket stabila zink- -hexamer-komplex som erhålles med insulin observeras dessutom icke med monomera analoger. Brems et al. , Protein Engineering, 5:6, 527-522 (1992), har angivit att monomert LysßzßProsæ-hï (hI = humaninsulin) är mindre benäget för dimerisering och självassociation till former med högre molekylvikt än human- insulin. Brems et al. drar den slutsatsen att hspuaProsæ-hl, hlauaPräzç-hï och LysmProßæ-hl uppvisar obetydlig eller ingen zink-inducerad association och att From-insulin, LysBZB-insulin, Aspua-insulin och Alanß-insulin uppvisar Zn-inducerad association t .

Diao; 0 o 509 052 3 men i mindre grad än Zn-insulin. Opublicerade försök genomförda av oss tyder på att association med zink förekommer, men dylik association mellan zink och insulinanaloger skiljer sig från association som erhålles med insulin. Den association som obser- veras med dessa analoger leder till ett flertal högmolekylära former som skiljer sig från de dominerande, väl definierade zink-insulin-hexamererna. Det är därför klart att monomera insulinanaloger icke bildar Zn(II)-12-konformation på samma sätt som insulin.

Med hänsyn till den publicerade litteraturen är det över- raskande att man enligt föreliggande uppfinning kan åstadkomma stabila zink-fenol-hexamer-komplex av monomera insulinanaloger.

Dessa hexamer-komplex skiljer sig på ett unikt sätt från de komplex som observeras med insulin under identiska betingelser.

Insulin-komplex med zink och fenol föreligger i en Zn(II)-R¿- -konformation. Hexamer-komplexet enligt föreliggande uppfinning har en annan konformation. Det är också mycket anmärkningsvärt att insulinanalog-hexamer-komplexen uppvisar en mycket större dissociationsbenägenhet än insulin. Denna dissociationsbenägen- het visar sig genom den önskade snabba verkan.

Brange et al., Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991), har beskrivit olika snabbverkande stabila insulinmonomerer och angivit att man för att skapa ett snabb- verkande insulin bör förhindra dimer- eller hexamer-bildning.

Vidare har Brange et al., Diabetes Care, 13:923-954 (1990), an- givit att när insulin administreras såsom hexamer, måste denna hexamer förutom sin lângsamare fria diffusion vara steriskt mera hindrad än en monomer under diffusionstransporten i under- huden och/eller under passagen genom kapillärmembranet. Efter subkutan injektion dissocieras dessutom Zn(II)-R5-konformationen icke direkt, utan den måste omvandlas via Zn(II)-¶3-konformatio- nen. Dessa konformationsförändringar och efterföljande dissocia- tion fördröjer insättandet av verkan. Vid tiden för uppfinningen skulle därför en fackman anse att försök att kemiskt stabilisera monomera insulinanaloger med zink genom bildning av väl definie- rade hexamer-komplex icke skulle vara framgångsrika, eller om de skulle lyckas så skulle man icke erhålla det önskade snabba in- sättandet av verkan. 509 052 4 Kompositionen enligt uppfinningen är ett zink-fenol-induce- rat hexamer-komplex som absorberas snabbt. I-Iexamer-komplexet har minst dubbelt så hög absorptionshastighet som observeras med insulin. När hexamerkomplexet formuleras, är det lika stabilt som insulin mot kemisk nedbrytning. Enligt föreliggande uppfin- ning kan man sålunda överraskande omvandla en monomer insulin- analog till ett väl definierat, stabilt zink-fenol-hexamer- -komplex. Vid formulering bibehåller detta hexamer-komplex de snabbverkande egenskaper som uppvisas av den monomera insulin- analogen. Föreliggande uppfinning omfattar följaktligen stabila och snabbverkande parenterala kompositioner av insulinanalog- -hexamer-komp lexet .

Föreliggande uppfinning avser ett humaninsulinanalog- -komplex innefattande sex molekyler av en humaninsulinanalog, två zinkjoner och minst tre molekyler av ett fenolderivat, som utgöres av m-kresol, fenol eller en blandning av m-kresol och fenol; varvid analog-komplexet är en hexamer. Uppfinningen avser vidare parenterala kompositioner innefattande hexamer-komplexet.

Pig 1 visar grafiskt verkningsprofilen av LysszsProszsi-hl och humaninsulin. Diagrammet anger den genomsnittliga glukos- infusionsresponshastigheten .

Fig 2 visar grafiskt stabiliteten av LysazßProuthuman- insulin. Värdena i diagrammet har erhållits genom mätning av polymerbildningen av insulinanalogen i hexamerassociationen jämfört med polymerbildningen av monomert LyssnProgæ-humaninsulin och insulin. _ Fig 3 visar grafiskt dissociationen av LysunPräæ-human- insulin i ett hexamer-komplex. Diagrammet illustrerar dissocia- tion in vitro av formulerat insulin (o); LysßnProßæ-hl formulerat såsom ett hexamer-komplex (A); oformulerat insulin (Ü); och monomert LysazßProåö-hl (*) . Försöksvärdena har erhållits med hjälp av statisk ljusspridning vid 488 nm och vid en vinkel av 90°. De formulerade proverna innehöll 0,5 mol Zn per mol protein, 1,25 mg m-kresol per ml, 1,09 mg fenol per ml, 7 mM natrium- fosfatbch 16 mg glycerol per ml. De oformulerade och monomera proverna innehöll inga ytterligare vehiklar.

"Fördelarna med föreliggande uppfinning framgår av ritninge- f igurerna . 5 509 052 Såsom ovan har nämnts avser föreliggande uppfinning ett hexamer-komplex av en monomer humaninsulinanalog. Med termen "monomer insulinanalog" eller "humaninsulinanalog" avses i före- liggande beskrivning ett humaninsulin vari Pro i position B28 har ersatts med Asp, Lys, Leu, Val eller Ala, och vari Lys i position B29 är lysin eller har ersatts med prolin. De nämnda termerna omfattar även des(B28-B30) och des(B27).

Monomera insulinanaloger beskrives i EP-A-383 472 och EP-A-214 826. Monomera insulinanaloger är mindre benägna för dimerisering eller självassociation än insulin.

Fackmannen inser att andra modifieringar också är möjliga.

Sådana modifieringar är allmänt kända och omfattar ersättning av histidinresten i position B10 med asparaginsyra; ersättning av fenylalaninresten i position B1 med asparaginsyra; ersättning av treoninresten i position B30 med alanin; ersättning av serin- resten i position B9 med asparaginsyra; avlägsnande av amino- syran i position Bl, eventuellt i kombination med avlägsnande av aminosyran i position B2; och avlägsnande av treoninresten i position B30.

De i föreliggande beskrivning använda aminosyraförkortning- arna är allmänt vedertagna. En särskilt föredragen monomer in- sulinanalog är LysmPrän-humaninsulin (B28 är Lys; B29 är Pro).

Hed termen "behandling" avses i föreliggande beskrivning skötsel och vård av en patient för bekämpning av en sjukdom, ett tillstånd eller en störning, och denna term omfattar administre- ring av en förening enligt uppfinningen för förhindrande av symptom eller komplikationer, lindring av symptomen eller komp- likationerna, eller eliminering av sjukdomen, tillståndet eller störningen.

Hed termen "isotonicitetsmedel" avses ett medel som tolere- ras fysiologiskt och ger kompositionen ett lämpligt osmotiskt tryck så att nettoströmning av vatten genom cellmembranen för- hindras. Sådana föreningar som glycerol användes vanligen för dylika ändamål i kända koncentrationer.

Med termen "fenolderivat" eller "fenol" avses m-kresol, fenol eller en blandning av m-kresol och fenol. Företrädesvis användes m-kresol.

Termen "fysiologiskt tolererad buffert" är ett välkänt 0 00010 l t 509 052 6 begrepp. Den fysiologiskt tolererade bufferten är företrädesvis en fosfatbuffert, såsom natriumfosfatbuffert. Andra fysiologiskt tolererade buffertar är Tris-, natriumacetat- och natriumcitrat- -buffertar. Valet av buffert och koncentrationen därav kan be- stämmas av fackmannen.

Insulinanalogerna enligt uppfinningen bildar komplex med zinkjoner och ett fenolderivat under bildning av en stabil hexamer-konformation. Både zinken och fenolderivatet är kritiska för att man skall uppnå ett komplex som är stabilt och kan undergå snabb dissociation för snabbt insättande av verkan.

Hexamer-komplexet består av två zinkjoner per hexamer human- insulinanalog och minst tre molekyler av ett fenolderivat be- stående av m-kresol, fenol eller en blandning av m-kresol och fenol.

En löslig monomer analog omvandlas till hexamer-komplex genom att den monomera analogen löses i ett utspädningsmedel innehållande fenolderivatet vid ett pH-värde av cirka 7,5, varpå zink tillsättes.

Såsom representantiva exempel på zinksalter kan man nämna zink- acetat, zinkbromid, zinkklorid, zinkfluorid, zinkjodid och zink- sulfat. Fackmannen inser att många andra zinksalter också skulle Zinken tillsättes företrädesvis i form av salt. kunna användas enligt föreliggande uppfinning. Företrädesvis an- vändes zinkacetat och zinkklorid, eftersom dessa salter icke tillför några nya kemiska joner vid kommersiellt accepterade processer.

Upplösning av analogen kan underlättas genom det som van- ligen kallas sur upplösning, dvs pH-värdet sänkes till cirka 3,0-3,5 med en fysiologiskt tolererad syra, företrädesvis HCl, så att den monomera analogen löser sig lättare. Andra fysiolo- giskt tolererade syror är ättiksyra, citronsyra och fosforsyra. pH-värdet höjes sedan till cirka 7,4-7,5 med en fysiologiskt tolererad bas, företrädesvis natriumhydroxid. Andra fysiologiskt tolererade baser är kaliumhydroxid och ammoniumhydroxid.

Hexamer-komplexet kan beredas till stabila, snabbverkande parenterala kompositioner. Koncentrationen av insulinanalogen i kompositionen är cirka 0,5-20 mg/ml, företrädesvis 1,2-17,5 mg/ml och allra helst cirka 3,5 mg/ml. Zinkkoncentrationen är vanligen cirka 10-50 pg/ml. Den optimala koncentrationen av zink i kompo-' 509 052 7 sitionen är cirka 14-35 pg/ml, varvid två zinkjoner är bundna till varje hexamer. I formulerat tillstånd binder hexamer- -komplexet så mycket som sju fenolmolekyler. Vanligen är sex fenolmolekyler bundna till hexameren. Företrädesvis sättes ett överskott av fenol till kompositionen. Fenolen verkar också såsom konserveringsmedel. Den föredragna fenolkoncentrationen är cirka 23-35 mM, allra helst 29 mn. Fenolderivatet är företrädes- vis m-kresol.

Ett isotonicitetsmedel, företrädesvis glycerol, kan sättas till kompositionen. Isotonicitetsmedlet användes i en koncentra- tion som är vanlig i insulinkompositioner, företrädesvis cirka 16 mg/ml. Kompositionen kan buffras med en fysiologiskt tolere- rad buffert, företrädesvis en fosfatbuffert, såsom natrium- fosfatbuffert.

Vid tiden för uppfinningen tydde de publicerade litteratur- uppgifterna på att aggregationen behövde elimineras för att man skulle få snabb absorption. Det är därför mycket överraskande att den formulerade hexamer-analogen ger en snabbt insättande verkan. I motsats till vad som gäller för insulin påverkar bild- ningen av ett insulinanalog-hexamer-komplex icke ogynnsamt den tid som erfordras för att man skall uppnå maximal koncentration av insulinanalogen i serum. I fig 1 visas den genomsnittliga glukosinfusionsresponshastigheten när man till människor sub- kutant administrerar en komposition innehållande monomert LyšmProåv-hl (utan zink); en formulerad LysuaProm-hï-hexamer; eller humant Regular-insulin. Det formulerade hexamer-komplexet bibehåller samma snabba verkan som det monomera LysnnProsæ-human- insulinet. Absorptionshastigheten är signifikant högre än för humant Regular-insulin. Av resultaten i fig 1 framgår sålunda för det första att LysuaProm-hI-hexamer och LyssnProuæ-hl- -monomer har liknande absorptionshastigheter, och för det andra att både hexamert och monomert Lys"”Pro""-hI har högre absorp- tionshastighet än insulin.

Kompositionen innehållande insulinanalog-komplexet såsom hexamer är stabil. Vid jämförande undersökningar visar monomert LysßzaProm-hl den största nedbrytningshastigheten, nämligen en polymerbildning av 1,63% per vecka under en försöksperiod om sex veckor. Oformulerat humaninsulin uppvisar en långsammare polymer- 509 052 8 bildning, nämligen 0,61% per vecka. Efter formulering minskas emellertid bildningen av högmolekylära polymerer till 0,095% per vecka när det gäller insulin. Formulerat Lys"ßPro""-hI i form av hexamer-komplex uppvisar en polymerbildningshastighet av 0,11% per vecka, vilket är jämförbart med den hastighet som observeras för formulerat insulin. Dessa undersökningar beskrives i exem- pel 1, och resultaten visas grafiskt i fig 2.

Insulinanalogen enligt föreliggande uppfinning kan fram- ställas enligt olika välkända metoder för peptidsyntes, såsom klassiska metoder för syntes i lösning, metoder för syntes i fast fas, halvsyntetiska metoder och de nyligen utvecklade rekombinant-DNA-metoderna. Framställning av olika monomera insulinanaloger beskrives i EP-A-383 472 och EP-A-214 826.

Uppfinningen illustreras genom följande, icke begränsande exempel. o ' s Oformulerade prover av insulin och LysnaPrän-hl framställ- des i en koncentration av 3,5 mg/ml i 7 mn natriumfosfatbuffert och beroende på vilket försök som genomfördes tillsattes dess- utom eventuellt 1,25 mg m-kresol per ml, 1,09 mg fenol per ml och 16 mg glycerol per ml. Prover av LysßzßProßæ-hï såsom hexamer- -komplex framställdes på samma sätt förutom att zink tillsattes i en koncentration av 19,7 pg/ml. Vid alla framställningar sänk- tes pH-värdet till 3,0 genom tillsättning av en syra, och vid detta pH-värde gjordes den eventuella tillsättningen av zink. pH-värdet inställdes sedan på 7,4. Före tillsättningen av fenol- derivat bestämdes proteinkoncentrationen genom UV-absorptions- spektroskopi med användning av en dubbelstråle-spektrofotometer AVIV modell 14 DS. Proteinkoncentrationerna beräknades på det sätt som har beskrivits av Frank, B.H., Pekar, A.H., och Veros, A.J., (1972), Diabetes, 21 (suppl. 2), 486-491. nzempel4 K . 1 S! 1.1.!! Nedbrytning initierades genom att formulerade och oformule- rade preparat av insulin samt monomert och hexamert LysmProkæ-hï inkuberades vid 30°C. Det formulerade insulinet och LysuaPrän-hï- 509 052 9 -hexameren innehöll 3,5 mg protein per ml, 16 mg glycerol per ml, 7 mn dinatriumvätefosfat-heptahydrat, 1,25 mg m-kresol per ml, 1,09 mg fenol per ml och 0,0245 mg zinkoxid per ml vid ett pH- -värde av 7,3-7,4. Det oformulerade insulinet och LysnaPx-om-hl- -monomeren innehöll 3,5 mg protein per ml, 16 mg glycerol per ml, 7 mn dinatriumvätefosfat-heptahydrat, 1,25 mg m-kresol per ml och 1,09 mg fenol per ml vid ett pH-värde av 7,3-7,4. Med sju dygns mellanrum uttogs prover från inkuberingslösningen, och dessa prover analyserades med hjälp av storleksuteslutnings-HPLC för bestämning av bildningen av högmolekylära föreningar. Analy- sen genomfördes genom att prover med volymen 20 pl injicerades i en kolonn Dupont Zorbax GF-250 Special (9,4 x 250 mm), varvid en blandning av 0,4 M ammoniumbikarbonat och acetonitril användes såsom elueringslösning (strömningshastighet 0,5 ml per minut vid rumstemperatur) och detektion genomfördes vid 214 nm. Polymer- bildningen i procent bestämdes med hjälp av förhållandet mellan arean av toppen för de högmolekylära föreningarna och den totala arean av topparna för monomeren och de högmolekylära föreningar- na. Resultaten visas i fig 2.

EmmmzLZ Med hjälp av statisk ljusspridning bestämdes dissociations- egenskaperna in vitro för monomert LysmPronæ-hl, LysuaProaæ-hl såsom hexamer-komplex och insulin.

Tre stamlösningar av formulerat och oformulerat protein framställdes på ovan beskrivet sätt förutom att stamlösningarna av oformulerat protein icke innehöll zink, glycerol eller konserveringsmedel. Utgående från dessa stamlösningar med kon- centrationen 3,5 mg/ml genomfördes en serie utspädningar så att man erhöll lösningar av både insulin och LysnßProm-hï med proteinkoncentrationer från 3,5 mg/ml till 0,2 mg/ml. Alla ut- spädningar gjordes till en slutlig volym av 10 ml med 7 mn natriumfosfatbuffert (pH 7,4) för efterliknande av förhållandena vid subkutan injektion. Före genomförandet av mätningarna filt- rerades alla lösningar genom ett 0,2 pm lågprotein-bindande Gelman-filter. Proteinkoncentrationen i dessa prover bestämdes genom HPLC i omvänd fas. 509 052 10 För analys av de formulerade proverna framställdes protein- fria kontrollösningar av lösningsmedel för varje sats av pro- teinprover. Dessa kontrollösningar innehöll vehiklar i samma koncentrationer som motsvarande proteinlösningar. För analys av de oformulerade proverna användes en enda kontrollösning (7 mM natriumfosfat). Användning av dessa kontrollösningar säker- ställde att försöksresultaten motsvarade endast ljusspridning av det lösta ämnet utan bidrag från lösningsmedlet.

Försöken med statisk ljusspridning genomfördes med använd- ning av en autokorrelator och goniometer Brookhaven Instruments 2030AT. Alla mätningar genomfördes med ett 1-millimeters hål vid en spridningsvinkel av 90° med användning av en argonjonlaser Lexel modell 3500 inställd på 488 nm. Temperaturen hölls vid 25%: i ett termostatbad Neslab RTE-110. Signalen vid fotomultiplikator- röret kalibrerades med användning av toluen filtrerat genom ett filter med porositeten 0,1 pm.

Viktmedelmolekylvikterna beräknades med användning av de ekvationer som har beskrivits av Cantor, C.R., och Schimmel, P.R., Biophysical Chemistry, W.H. Freeman and Company, New York, p. 838-843 (1982). I fig 3 visas resultaten av ljusspridnings- försöken. LysszaProm-hl såsom hexamer-komplex och insulin har helt olika dissociationsprofiler in vitro. Insulinanalogen upp- visar sålunda en snabb dissociation, vilket medför att den absorberas snabbare än humaninsulin. Även om båda preparaten innehåller hexamera associationstillstånd och kompositionerna är lika stabila mot kemisk nedbrytning, har LysszßProuw-hl-hexameren en större benägenhet att dissocieras än insulin.

Claims (7)

509 052 ll 2 a 1 g g t k ; a v

1. Humaninsulinanalog-komplex innefattande sex molekyler av en humaninsulinanalog, tvâ zinkjoner och minst tre molekyler av ett fenolderivat bestående av m-kresol, fenol eller en blandning av m-kresol och fenol; varvid analog-komplexet är en hexamer.

2. Parenteral farmaceutisk komposition innefattande human- insulinanalog-komplexet enligt krav 1.

3. Komposition enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d a v att den dessutom innefattar ett isotonicitetsmedel och en fysio- logiskt tolererad buffert.

4. Komposition enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a d a v att humaninsulinanalogen är LysmProBN-humaninsulin.

5. Komposition enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d a v att den innefattar cirka 3,5 mg LysazaProsæ-humaninsulin per ml, cirka 19,7 pg zink per ml, cirka 7 mn natriumfosfat, cirka 16 mg glycerol per ml och cirka 29 mM m-kresol.

6. Humaninsulinanalog-komplex enligt krav 1, t e c k n a t k ä n n e - a v att humaninsulinanalogen är LysizßProszç- -humaninsulin. k ä n n e - t e c k n a t a v att humaninsulinanalogen är Asp“æ-human- insulin.

7. Humaninsulinanalog-komplex enligt krav 1,