PT101722B

PT101722B - Formulacoes de analogo de insuluna

Info

Publication number: PT101722B
Application number: PT101722A
Authority: PT
Inventors: Bruce Hill Frank; David Nettleship Brems; Diane Lee Bakaysa; Henry Acken Havel; Allen Howard Pekar
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 1997-02-28
Also published as: NO322128B1; IE950436A1; IL114151A0; MY115631A; NL1000566C2; NZ272359A; JP2001199899A; CN1122248A; ES2091727B1; GB2291427A; TW421596B; ITMI951278A1; JPH083067A; IT1276723B1; CO4410203A1; CH689935A5; HUT73186A; RS49577B; SE9502167L; GB2291427B

Description

DESCRIÇÃO

O presente invento diz respeito a análogos monoméricos de insulina humana. Mais especificamente, o presente invento diz respeito a um complexo hexâmero que compreende um análogo de insulina, zinco e um derivado fenólico.

Desde a introdução da insulina nos anos 20, têm sido dados giandes passos no sentido de melhorar o tratamento da diabetes mellitus. Os principais avanços foram feitos no domínio da pureza e disponibilidade da insulina. Foram também desenvolvidas várias formulações com diferentes tempos de acção. Apesar destes melhoramentos, a terapia por injecção subcutânea ainda não alcança o objectivo de proporcionar ao paciente uma regulação glicémica conveniente e um controlo glicémico normalizado. Frequentes afastamentos dos níveis de glicemia normais ao longo do tempo de vida do paciente levam à hiper ou hipoglicemia e a complicações a longo prazo, incluindo retinopatia, neuropatia, nefropatia e micro e macroangiopatia.

Para ajudar a evitar níveis glicémicos extremos, os diabéticos frequentemente põem em prática uma terapia de injecção múltipla pela qual a insulina é administrada com cada uma das refeições. Contudo, esta terapia ainda não foi optimizada. A insulina de acção mais rápida comercialmente disponível atinge o máximo demasiado tarde depois da injecção e e leva muito tempo a .1 _ controlar optimamente os níveis de glicose. Recentemente, tem sido devotado um esforço considerável à criação de formulações de insulina e formulações de análogo de insulina que alteram a cinética do processo de absorção subcutânea.

Devido a todas as formulações farmacêuticas comerciais de insulina conterem insulina no estado auto-associado, e predominantemente na forma de hexâmero de zinco, acredita-se que o passo de limitação da taxa de absorção de insulina a partir do depósito de injecção subcutânea para a corrente sanguínea é a dissociação do hexâmero de insulina auto-agregada. Brange et al. em Diabets Care 13: 923-954 (1990). Para acelerar este processo de absorção, têm sido desenvolvidos análogos de insulina monoméricos. Tais análogos monoméricos possuem um início de actividade comparativamente mais rápido do que a insulina, ainda que retendo a actividade biológica da insulina humana natural. Eles proporcionam uma absorção rápida para trazer o momento da injecção e o pico da acção da insulina para uma maior proximidade do afastamento dos níveis de glicose pós-refeição associados à resposta a uma refeição. A preparação de vários análogos monoméricos é revelada em Chance et al., pedido de patente EPO número 383 472 e Brange et al., pedido de patente EPO número 214 826.

Infelizmente, as modificações da insulina, que são a causa de estes análogos serem monoméricos, também resultam numa alta taxa de formação de polímero em formulações parentéricas. Porque a expiração das preparações de insulina ocorrem quando são obtidos níveis de 1% de polímero (U.S. Pharmacopoeia, 1990), a minimização deste tipo de degradação é extremamente importante na redução de efeitos secundários indesejáveis. Por conseguinte, foi desejável formular análogos monoméricos de maneira a provocai· que o análogo se auto-associasse para formar uma conformação estável, mantendo não obstante a sua rápida absorção.

A adição de certos iões metálicos, principalmente zinco, aumenta a estabilidade química devido a levar a insulina a associar-se e a formar hexâmeros, especificamente a conformação Zn(II)-T₆. Além disso, tem-se verificado que os fenólicos se ligam especificamente ao hexâmero de insulina e induzem uma mudança confonnacional alostérica por meio da qual os aminoácidos N-terminal da cadeia B são convertidos da conformação estendida para uma hélice alfa. Derewenda et al., Nature, 338: 594-596 (1989). Este estado de conformação de ligação fenólica é conhecido como estado Zn(II)-R.

Em contraste completo com estas observações bem estabelecidas de que a insulina se agrega prontainente na presença de zinco para formar uma estrutura de hexâmero de Zn estável bem definida, estudos anteriores com análogos de insulina monoméricos revelaram que qualquer agregação entre zinco e o análogo de insulina é distinta da observada com a insulina. B. H. Frank, Text and Slide copies of Lecture dado na Conferência sobre Insulina Self-Association and Conformational Studies on Human Proinsulin and Insulin Analogs, Universidade de York (20 de Agosto-1 de Setembro de 1989). Além disso, o complexo hexâmero-Zn altamente estável, conforme visto com a insulina, não é observado com análogos monoméricos. Id. Brems et al., Protein Engineering. 5:6, 527-533 (1992), revelam que a LysB28p_roB29_i_nsuh_na humana é menos propensa à dimerização e à auto-associação para formas de massa molecular mais alta do que a insulina humana. Brems et al. continuam a concluir que as AspB28p_roB29_j_nsuh_na humana, AlaB28p₁₀B29.j_nsuh_na humana e LysB28p_roB29_j_nsuii_na humana mostram pequena ou nenhuma associação

-4induzida por zinco e que as Pro^-^-insulina, Lys^-^-insulina, AspB28_j_nsu]j_nae AlaB28_i_nsu]i_na demonstram associação induzida por zinco, mas inferior à da Zn-insulina. Observações experimentais dos inventores presentes subsequentes e não publicadas sugerem que a associação com zinco é observada; contudo, tal associação entre o análogo e o zinco difere da insulina. A associação que é observada com tais análogos vai até uma grande quantidade de formas de massa molecular mais alta e distintas dos hexâmeros de Zn-insulina predominantes e bem definidos. Por conseguinte, é claro que os análogos de insulina monoméricos não formam a conformação Zn(ll)-T₆ de uma maneira análoga à insulina.

Tendo em vista a literatura publicada, é surpreendente que o presente invento produza análogos de insulina monoméricos num complexo zinco-fenol estável e bem definido. Este complexo hexâmero é exclusivamente diferente dos complexos observados com a insulina sob idênticas condições. Os complexos de insulina com zinco e fenol estão na conformação Zn(II)-R_€. O complexo hexâmero do presente invento não é idêntico a esta conformação. E também notavelmente digno de nota que o complexo hexâmero de análogo de insulina tenha uma propensão muito maior para se dissociar que a insulina. Esta propensão para se dissociar traduz-se na propriedade de actuação rápida desejada.

Brange et al., em Cunent Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991), revelam vários monómeros de insulina estáveis de acção rápida e afirmam que a via óbvia para a criação de uma insulina de acção rápida é evitar a formação de dímero ou hexâmero. De modo semelhante, Brange et al., Diabets Care. 13:923-954 (1990), revelam que quando a insulina é administrada na forma

de hexâmero, para além da sua difusão livie mais lenta, o hexâmero deve estar estericamente mais impedido do que um monómero durante o transporte por difusão na subcútis e/ou durante a sua passagem através da membrana capilar. Além disso, quando injectada subcutaneamente, a conformação Zn(II)-R_e não se dissocia directamente mas deve transformar-se através da conformação Zn(II)-T₆. Estas mudanças conformacionais e a dissociação a partir daí atrasam o começo da actividade. Por conseguinte, um perito na técnica no momento do invento acreditava que os esforços para estabilizar quimicamente o análogo de insulina monomérico com zinco por formação de um complexo hexâmero bem definido não teria sucesso ou, se bem sucedido, sacrificaria o início de acção rápido desejado.

A presente formulação é um complexo hexâmero induzido por zinco fenólico que é rapidamente absorvido. A taxa de absorção do complexo hexâmero é pelo menos duas vezes superior à observada com a insulina. Não obstante, quando o complexo hexâmero é formulado, é igualmente estável quando comparado com a insulina contra a degradação química. Por conseguinte, é surpreendente que o presente invento converta um análogo de insulina monomérico para um complexo hexâmero de fenol-zinco bem definido. Notavelmente, quando formulado, este complexo hexâmero retém as propriedades de acção rápida associadas com o análogo de insulina monomérico. De acordo com isto, o presente invento proporciona formulações parentéricas do complexo hexâmero de análogo de insulina que são estáveis e de actuação rápida.

Este invento proporciona um complexo de análogo de insulina humana que compreende: seis moléculas de um análogo de insulina humana, dois iões zinco e pelo menos três moléculas de um derivado fenólico seleccionado do

-6grupo constituído por w-cresol, fenol ou uma mistura de m-cresol e fenol; de tal modo que o complexo de análogo é um hexâmero. O invento proporciona ainda formulações parentéricas que compreendem o complexo hexâmero.

FIGURA 1 - é uma representação gráfica do perfil de actuação da LysB28p_roB29_i_nsuji_na humana e da insulina humana. O gráfico é a taxa média de infusão de glicose de resposta. A figura demonstra as vantagens do presente invento.

FIGURA 2 - é uma representação gráfica da estabilidade da LysB28p_roB29_i_nsuh_na humana. O gráfico representa a estabilidade medindo a formação de polímero do análogo de insulina na associação em hexâmero comparada com a Lys®28p_roB29_[_nsuh_na humana monomérica e a insulina. A figura demonstra as vantagens do presente invento.

FIGURA 3 - é uma representação gráfica da dissociação da LysB28p_roB29_i_nsuh_na humana num complexo hexâmero. O gráfico é a dissociação in vitro da insulina formulada (·), LysB28p_roB29_i_nsuhna humana formulada na forma de um complexo hexâmero (Δ), insulina não formulada (·) e LysB28p_roB29_i_nsuiina humana monomérica (*), monitorizada por dispersão de luz estática em 488 nm a um ângulo de 90°. As amostras formuladas continham 0,5 mol de Zn por mol de proteína, w-cresol a 1,25 m e fenol a l,09mg/mL, fosfato de dissódio 7 mM e glicerol a 16 mg/mL. As amostras não formuladas e monoméricas não continham excipientes adicionais. A figura demonstra as vantagens do presente invento.

Conforme acima se notou, o invento proporciona um complexo de análogo de insulina humana na forma de um hexâmero. O termo análogo de insulina monomérico ou análogo de insulina humana conforme aqui usado refere-se a insulina humana em que:

Pro na posição B28 é substituída por Asp, Lys, Leu, Vai ou Ala; e Lys na posição B29 é lisina ou é substituída por prolina;

des(B28-B30); ou des(B27).

Os análogos de insulina monoméricos são descritos em Chance et al., publicação da EPO número 383 472 e Brange et al., publicação da EPO número 214 826, e são aqui incorporados por referência. Os análogos de insulina monoméricos são menos propensos a dimerizar ou a auto-associarem-se do que a insulina.

Um perito na técnica reconhecerá que são possíveis outras modificações. Tais modificações são largamente aceites na técnica e incluem a substituição do resíduo de histidina na posição B10 por ácido aspártico; a substituição do resíduo de fenilalanina na posição BI com ácido aspártico; a substituição do resíduo de treonina na posição B30 por alanina; a substituição do resíduo de serina na posição B9 por ácido aspártico; a eliminação de aminoácidos na posição BI isolada ou em combinação com a eliminação na posição B2; e a eliminação de treonina da posição B30.

Todas as abreviaturas de aminoácidos usadas nesta revelação são as aceites por United States Patent & Trademark Offíce conforme estabelecido em

C.F.R. § 1822(b) (2). Um análogo de insulina monomérico particularmente preferido é a LysB28p_1OB29.j_nsu]j_na humana (B28 é Lys; B29 é Pro).

O teimo tratamento, conforme aqui usado, descreve a orientação e cuidados de um paciente com o propósito de combater a doença, condição ou desordem e inclui a administração de um composto do presente invento para prevenir o início dos sintomas ou complicações, o alívio dos sintomas ou complicações, ou a eliminação da doença, condição ou desordem.

O teimo agente de isotonicidade diz respeito a um agente que é fisiologicamente tolerado e confere uma tonicidade adequada à formulação para prevenir o fluxo livre de água através da membrana celular. Compostos, tais como glicerina, são comummente usados para tais propósitos em concentrações conhecidas.

O teimo derivado fenólico ou fenólico representa w-cresol, fenol ou uma mistura de w-cresol e fenol. Preferivelmente, fenólico representa w-cresol.

O teimo tampão fisiologicamente tolerado é conhecido na técnica. Um tampão físiologicamente tolerado é preferivelmente um tampão fosfato, como fosfato de sódio. Outros tampões físiologicamente tolerados incluem TRIS, acetato de sódio ou citrato de sódio. A escolha e concentração do tampão são conhecidas na técnica.

Os análogos de insulina do presente invento complexam com iões zinco e um derivado fenólico para formarem uma conformação de hexâmero

estável. Quer o zinco quer o derivado fenólico são críticos para se conseguir um complexo que é estável e capaz de dissociação e início de acção rápida. O complexo hexâmero consiste de dois iões zinco por hexâmero de análogo de insulina humana e pelo menos três moléculas de um derivado fenólico seleccionado do grupo constituído por w-cresol, fenol ou uma mistura de w-cresol e fenol.

O análogo monomérico solúvel é convertido para o complexo hexâmero dissolvendo o análogo monomérico num diluente que contém o derivado fenólico a um pH de cerca de 7,5 e adicionando zinco. O zinco é preferivelmente adicionado na forma de um sal. Exemplos representativos de sais de zinco incluem acetato de zinco, brometo de zinco, cloreto de zinco, fluoreto de zinco, iodeto de zinco e sulfato de zinco. O perito na técnica reconhecerá que há muitos outros sais de zinco que também podem ser usados no processo do presente invento. Preferivelmente, é usado o acetato de zinco ou o cloreto de zinco porque tais sais não adicionam novos iões químicos aos processos comercialmente aceites.

A dissolução do análogo pode ser ajudada pelo que é comummente conhecido como uma dissolução ácida, i.e., o pH é diminuído até cerca de 3,0 a

3,5 com um ácido físiologicamente tolerado, preferivelmente HC1, para ajudar na dissolução do análogo monomérico. Outros ácidos físiologicamente tolerados incluem ácido acético, ácido cítrico e ácido fosfórico. O pH é em seguida ajustado com uma base físiologicamente tolerada, preferivelmente hidróxido de sódio até cerca de 7,4 a 7,5. Outras bases físiologicamente toleradas incluem hidróxido de potássio e hidróxido de amónio.

O complexo hexâmero pode ser formulado em formulações parentérícas estáveis de reacção rápida. A concentração de análogo de insulina na formulação é cerca de 0,5 mg/mL até cerca de 20 mg/mL; preferivelmente cerca de 1,2 mg/mL até cerca de 17,5 mg/mL; mais preferivelmente cerca de

3,5 mg/mL. Em geral, a concentração de zinco é cerca de 10 pg/mL até cerca de 50 pg/mL. A concentração óptima de zinco na formulação situa-se desde cerca de 14 pg/mL até cerca de 35 pg/mL, da qual dois iões zinco estão ligados a cada hexâmero. Quando formulado, o complexo hexâmero liga-se a tantos como sete fenólicos. Geralmente, quando formulado, seis fenólicos estão ligados ao hexâmero. De acordo com isto, o fenólico é preferivelmente adicionado em excesso à formulação. O fenólico também actua como conservante. Por conseguinte, a concentração preferida é de cerca de 23 mM até 35 mM, mais preferivelmente 29 mM. O fenólico é preferivelmente o m-cresol.

Um agente de isotonicidade, preferivelmente glicerina, pode ser adicionado à solução. A concentração do agente de isotonicidade situa-se na gama conhecida na técnica para as formulações de insulina, preferivelmente cerca de 16 mg/mL. O pH da formulação pode ser tamponizado com um tampão físiologicamente tolerado, preferivelmente um tampão fosfato, como o fosfato de sódio.

No momento do invento, a literatura publicada sugeria que um perito na técnica necessitava de eliminar a agregação de maneira a conseguir-se uma absorção rápida. Por conseguinte, é bastante surpreendente que o análogo hexâmero formulado traga um início de acção rápido. Ao contrário da insulina, o hexâmero complexo de análogo de insulina não afecta adversamente o tempo necessário para se alcançar o pico de concentração de análogo de insulina no

- 11 soro. A Figura I demonstra, em pacientes humanos, a taxa média de infusão de glicose de resposta a uma formulação que contém Lys^28p_roB29.i_nsuh_nahumana monomérica (formulada sem zinco), um hexâmero de LysB28p_roB29_i_nsuii_na humana e uma insulina humana Regular. O complexo hexâmero formulado retém a acção rápida da LysB28p₁₀B29_i_nsuh_na humana monomérica. A taxa de absorção é significativamente maior (maior rapidez) do que a da insulina humana Regular. Por conseguinte, os resultados da Figura I ilustram: primeiro, o hexâmero de Lys^28p_r0B29.j_nsuh_na humana e a Ly_SB28p_r0B29_j_nsuii_na humana monomérica têm taxas de absorção semelhantes; em segundo lugar, a LysB28p_roB29_j_nsu]i_na humana quer hexamérica quer monomérica têm taxas de absorção mais rápidas que a insulina.

A formulação que compreende o complexo de análogo de insulina na forma de hexâmero é estável. Em estudos comparativos, a LysB28p_roB29_i_nsuiina humana monomérica mostra a maior taxa de degradação com um aumento na formação de polímero de 1,63% por semana ao longo de seis semanas de estudo. A insulina humana não formulada experimenta uma taxa de formação de polímero mais lenta de 0,61% por semana. Em formulação, contudo, a taxa de formação de polímero de massa molecular mais alta é reduzida para 0,095% por semana para a insulina. A Lys®28p_roB29_j_nsuii_na humana formulada, na forma de complexo hexâmero, exibe uma diminuída taxa de formação de polímero de massa molecular mais alta de 0,11% por semana, que é comparável à taxa vista para a insulina formulada. Estes estudos são exemplificados no Exemplo 1 e ilustrados na Figura 2.

O análogo de insulina do presente invento pode ser preparado por qualquer de uma variedade de técnicas de síntese de péptido reconhecidas que

- 12incluem métodos clássicos (solução), métodos de fase sólida, métodos semi-sintéticos e métodos de DNA recombinante mais recentes. Por exemplo, Chance et al., publicação do pedido de patente EPO número 383 472 e Brange et al., publicação do pedido de patente EPO número 214 826, revelam a preparação de vários análogos monoméricos.

Os seguintes exemplos e preparações são proporcionados meramente para melhor ilustrar a preparação dos análogos de insulina e o invento. O âmbito e alcance do invento não é construído como consistindo meramente dos exemplos que se seguem.

Preparação 1 Preparação de Stock de Proteína

Amostras não formuladas de insulina e LysB28p_IOB29_i_nsu]i_nahumana foram preparadas a 3,5 mg/mL em fosfato de dissódio 7 mM e com ou sem w-cresol a 1,25 mg/mL, fenol a 1,09 mg/mL e glicerol a 16 mg/mL, dependendo do experimento realizado. Amostras de Lys®28p_1OB29_j_nsuii_nahumana na forma de complexo hexâmero foram preparadas de uma maneira idêntica, com a excepção de que foi adicionado zinco a 19,7 pg/mL. Todas as amostras foram tomadas através de um passo de passagem por ácido até pH 3,0, momento em que foi adicionado o zinco nos lotes de formulação. O pH foi em seguida ajustado para 7,4. As concentrações de proteína foram determinadas antes da adição dos fenólicos por espectroscopia de absorção de UV, usando um espectrofotómetro de feixe duplo AVIV modelo 14 DS. As concentrações de proteína foram calculadas conforme descrito em Frank, B. H., Pekar, A. H. e Veros, A. J. (1972), Diabets. 21 (Supl. 2), 486-491.

Exemplo 1 Estabilidade Química

A degradação é iniciada pela incubação de preparações formuladas e não formuladas de insulina e LysB28p_roB29_i_nsuh_na humana monomérica e hexamérica a 30 °C. As insulina e hexâmero de LysB28p_roB29.j_nsuh_na humana formuladas continham: proteína a 3,5 mg/mL, glicerol a 16 mg/mL, fosfato de sódio dibásico hepta-hidrato 7 mM, z7?-cresol a 1,25 mg/mL, fenol a 1,09 mg/mL e óxido de zinco a 0,0245 mg/mL a um pH de 7,3 a 7,4. As insulina e LysB28p_roB29_i_nsu]i_na humana monomérica não formuladas continham: proteína a 3,5 mg/mL, glicerol a 16 mg/mL, fosfato de sódio dibásico hepta-hidrato 7 mM, w-cresol a 1,25 mg/mL e fenol a 1,09 mg/mL a um pH de 7,3 a 7,4. A intervalos de sete dias, as amostras foram removidas da incubação a 30 °C e ensaiadas para a formação de espécies de massa molecular alta usando HPCL de exclusão de dimensão. A análise é realizada injectando amostras de 20 gL numa coluna Dupont Zorbax GF-250 Special (9,4 x 250 mm) usando uma mistura de bicarbonato de amónio 0,4 M e acetonitrilo como solução de eluição (velocidade de fluxo de 0,5 mL/min à temperatura ambiente e detecção em 214 nm). A percentagem de formação de polímero é determinada a partir da razão do pico de massa molecular alta para a área total do monómero e picos de massa molecular alta. Os resultados são ilustrados na Figura 2.

Exemplo 2

Dispersão de Luz Estática

As propriedades de dissociação in vitro de LysB28p_roB29_i_nSulina humana monomérica, LysB28p_r0B29_j_nsuh_na humana na forma de um complexo hexâmero e insulina são sondadas usando dispersão de luz estática.

- 14 Três soluções para stock de proteína formulada e não formulada são preparadas conforme descrito, com a excepção de que as soluções de stock de proteína não formulada não contêm zinco, glicerol ou conservantes. Usando estes stocks de 3,5 mg/mL, é preparada uma série de diluições quer para a insulina quer para a Lys^28p_1OB29_i_nsuh_na humana estendendo a gama de concentração de proteína de 3,5 mg/mL até 0,2 mg/mL. Todas as diluições são feitas até um volume final de 10 mL com tampão fosfato de sódio 7 mM, pH 7,4, de modo a imitar o local subcutâneo sob injecção. Todas as soluções foram filtradas através de filtros de ligação de proteína baixos Gelman 0,2 pm antes da realização das medidas SLS (dispersão de luz estática). A concentração de proteína para estas amostras é determinada usando HPLC de inversão de fases.

Para análise das amostras formuladas, foram preparados brancos de solvente isento de proteína para cada conjunto de amostras de proteína. Estes brancos continham excipientes na mesma concentração que os correspondentes conjuntos de amostras de proteína. Para análise das amostras não formuladas, é usado um único branco de fosfato de sódio 7 mM. Usando estes brancos de solvente apropriados assegurou-se que os dados reflectiram apenas a dispersão do soluto e não uma contribuição adicionada devida às mudanças de solvente.

Os experimentos de dispersão de luz estática (SLS) são realizados usando um goniómetro e autoconelacionador Brookhaven Instruments 203OAT. Todas as medidas são feitas com um furo de 1 nnn a um ângulo de dispersão de 90° usando um laser de ião árgon Lexel Model 3500 regulado a 488 nm. A temperatura é mantida a 25 °C por um banho de temperatura Neslab RTE-110. O sinal no tubo fotomultiplicador é calibrado usando tolueno filtr ado em 0,1 μιη.

- 15As massas moleculares de massa média são calculadas usando as equações descritas em Cantor, C. R., e Schiminel, P. R.., Biophysical Chemistry. W. H. Freeman and Company, new York, pp. 838-843 (1982). A Figura 3 revela os resultados do estudo de dispersão de luz. O perfil de dissociação in vitro da LysB28p_r0B29_i_nsu]i_na h_umana na forma de um complexo hexâmero e da insulina são bastante diferentes. Os resultados do análogo de insulina demonstram uma dissociação rápida, o que permite uma absorção mais rápida do que a insulina humana. Ainda que ambas as preparações contenham estados de associação hexaméricos e as formulações sejam igualmente estáveis contra a degradação química, o hexâmero de Lys^28p_roB29_i_nsu]j_na humana tem uma maior propensão para se dissociar do que a insulina.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Complexo de análogo de insulina humana, caracterizado por compreender: seis moléculas de um análogo de insulina humana, dois iões zinco e pelo menos três moléculas de um derivado fenólico seleccionado do grupo constituído por w-cresol, fenol ou uma mistura de w-cresol e fenol; de tal modo que o complexo de análogo é um hexâmero.

,z
2. Formulação farmacêutica parentérica, caracterizada por compreender o complexo de análogo de insulina humana de acordo com a reivindicação 1.
3. Formulação farmacêutica parentérica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por compreender ainda um agente de isotonicidade e um tampão fisiologicamente tolerado.

a
4. Formulação farmacêutica parentérica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o análogo de insulina humana ser Ly_SB28p_r0B29_i_nsu]i_na humana.
5. Formulação farmacêutica parentérica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender: Lys®28p_r0B29_j_nsuii_na humana a cerca de 3,5 mg/mL, zinco a cerca de 19,7 pg/mL, fosfato de sódio cerca de 7 mM, glicerol a cerca de 16 mg/mL e w-cresol cerca de 29 mM.
6. Complexo de análogo de insulina humana de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o análogo de insulina humana ser Ly_SB28p_roB29_i_nsu]j_na humana.
7. Complexo de análogo de insulina humana de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o análogo de insulina humana ser AspB28_i_nsu]j_na humana.