BE550548A

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Publication number: BE550548A
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Description

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un produit de protamine, qu'on peut employer pour injections intravéneuses. Les protamines prennent de l'importance en thérapie et en physiologie expérimentale comme un moyen antagoniste par rapport à l'activité anti- coagulante d'héparine. Une telle substance est la clupéine dont on se servait jusqu'à présent sous forme de sulfate.

Il y a deux méthodes fondamentales pour prépa- rer la clupéine de la laitance de harengs ; produit final est soit clupéine-sulfate, soit clupéine-méthyle-ester- hydrochlorure. En thérapie, on ne se servait jusqu'à pré- sent que de clupéine-sulfate.

Les anciens procédés de préparation de la clupéine partent de l'oeuvre classique de M.A. Kessel (Ztschr.Physiol Chem.25, page 165,- 1898 - ). On isole la protamine en form@ de picrate insoluble, qu'on transforme ensuite soit en sul- fate, soit en méthylo-ester-hydrochlorure. Le procédé plus moderne de M.R.Block et de ses collaborateurs (Proc.Soc.Exp.

Biol.Med.70, page 494 - 1949 -) , arrive à une clupéine-sul- fate, qui est un produit final de ce accédé. La matière intermédiaire fondamentale d'isolement est ici la clupéine- métaphosphate.

L'ancien procédé a été employé par plusieurs auteurs pour la préparation des produits chimiques très épurés, au cours d'études de la constitution chimique des protamines. Le procédé plus moderne de M. Block a été agencé au point de vue technologique, pour la préparation de clu- péine-sulfate, à la fabrication de protamine-zinc-insuline.

Cependant, grâce aux expériences réitérées, on a trouvé que ces deux procédés ne conviennent pas du tout à la prépara- tion de la protamine, susceptible d'application intravéneuse et cela, pour des raisons suivantes :
Suivant tous les procédés modifiés, partant en principe de la méthode de M. Kessel, l'on fait précipiter et purifier la clupéine en forme de picrate; malgré sa décom- position et malgré l'élimination d'acide picrique, un peu du résidu de cet acide reste adhérent à la clupéine libérée et est entraîné aux degrés subséquents de la préparation et de la purification. Les produits préparés ainsi ne se débarrassent complètement de l'acide picrique que par préci- pitation réitérée, c'est ce qui a pour conséquence un abais- sement considérable du rendement.

Or, on ne peut pas se servir des produits, qui ne sont pas tout à fait purs, pour l'application intravéneuse.

Rien qu'une très petite quantité diacide picrique, qui est toxique, se fait connaître par une coloration jaunâtre par la toxicité et par le caractère pyrogéné de la solution d'injection.

Le procédé de MoBlock évite l'emploi d'acide picrique; cependant, il arrive à une clupéine-sulfate qui est un produit final de ce procédé et qui nest suffises- ment soluble qu'aux solutions acides et avec un pH sous 4-5.

Cette qualisé de est en contradiction avec les exigences concernant une préparation intravéneuse avec pH optima 7 et au moins 60 On a remarqué des perturbations graves au cours des expériences concernant Inapplication des solutions trop acides aux lapins ; ces perturbations excluent ces substances dans l'application intravéneuse.

On a trouvémaintenant que la clupéine-méthyle- ester-hydrochlorure se prête mieux à Inapplication intravé- neuse que la clupéine-sulfate employée jusqu'à présent et cela, en rôle d'un élément qui neutralise l'acti- vite anticoagulante de l'héparine.. La clupéine-méthyle-esten hydrochlorure est plus soluble dans des limites d'un pH 6-7; aussi sa solution d'injection est plus stable. Elle n'est pas toxique et non pyrogénée.. Donc, elle est plus avanta- geuse que la clupéine-sulfate.

La présente invention réside en ce que la clupéine-métaphosphate, préparée d'une façon connue en soi, est amenée immédiatement sous forme de clupéine-méthyle- ester-hydrochlorure, isolée de la solution méthanolique (alcool méthylique) par refroidissement ; produit obtenu

est rendu sec, lavé avec de l'éther diéthylique, repris par l'eau, neutralisé à un pH 6 et stérilisé de la façon habitua le.

C'est ainsi qu'on surmonte les inconvénients des procédés anciens ; ce qui permet de préparer un bon produit par voie simple et de rendement très satisfaisant, produit qui est.propre à l'application intravéneuse sans qu'il soit nécessaire de l'épurer d'une façon quelconque.

Suivant le procédé, qui fait l'objet de cette invention, on soumet d'abord la clupéine-mataphosphate obte- nue à une déshydrataticnà l'aide d'alcool méthylique anhydre.

On met le métaphosphate desséché en suspension dans l'alcool méthylique et on introduit, dans cette suspension, un courant de gaz chlorhydrique sec. Le mélange réactionnel est refroi. di, la température ne doit pas dépasser 10 C. L'acide picri- que mis à l'écart, on gagne la clupéine-méthyle-ester-hydro- chlorure par refroidissement avec un rendement à peu près quantitatif et en état tellement pur, qu'une épuration subsé- quente, habituellement indispensable, serait superflue.

Exemple de procédure :
On obtient la clupéine-métaphosphate d'une façon connue en soi, à savoir par extraction de la laitance de harengs, soit fraîche, soit congelée, à l'aide d'acide acéti- que dilué ou à l'aide d'acide citrique, par séparation de la nucléoprotamine dans la centrifugeuse, par décomposition de la nucléoprotamine à l'aide d'un acide minéral dilué, par écartement de matières albuminoldes superflues en zone alca- line et par isolation de la protamine sous forme d'un méta- phosphate.

100 Grammes de clupéine-métaphosphate, obtenus de la façon décrite plus haut, sont soumis à la déshydratatioi

parfaite par broyage avec de l'alcool méthylique anhydre dans un mortier. La préparation sèche, pulvérulente est mise en suspension dans deux litres d'alcool méthylique anhydre dans un ballon muni d'agitateurs et fermé par un petit tuyau en chlorure de chaux. On introduit le gaz chlorhydrique sec pendant deux heures, en agitant fortement et en refroidissant du dehors à l'aide de glace. La tempé- rature, dans cette phase, ne doit pas dépasser 10 C.

La clupéine-métaphosphate ne dissout pas complète*- ment pendant l'introduction d'acide chlorhydrique; la disso- lution se fait progressivement; aussi le méthyle-ester-hydre chlorure tombe progressivement hors de la solution. Cela apparaît par la transfromation des particules compactes, relativement lourdes de métaphosphate, en suspension légère de méthyle-ester-hydrochlorure pulvérulent et fin, qui monte dans la solution vers la surface. La réaction est terminée, alors que la quantité entière de la protamine présente, en état solide, change de caractère comme décrit plus haut, ce qui dure approximativement deux heures.

Le dégagement de
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méthyle-ester-hydrochlorure ne se termine qu'après le repos de deux heures dans la glacière,à la température, de 0 - 4 C.

Toute la quantité du produit dégagé est essorée sur la frit te, lavée par éther anhydre, qu'on élimine ensuite dans le vide. Le rendement égale 95-98 pour cent par rapport à la
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quantité de métaphosphate; employée. Le produit obtenu,en forme de poudre blanche,se dissout en solution de 1 pour cent dans l'eau redistillée, la réaction acide est neutrali sée par une solution d'hydrate de sodium diluée à un pH 6,0 et la solution est stérilisée en chauffant dans l'autoclave, La dissolution stérile, qui en résulte, est préparée pour l'application intravéneuse.

Claims

RESUME, Procédé de préparation d'un produit de protamine pour injections intravéneuses partant des sels de clupéine, caractérisé par ce qu'on transforme la clupéine-métaphospha- te, obtenue de façon connue en soi, immédiatement en clupéi EMI6.1 ne-méthyle-ester-hydrochlurure, isolée par refroidissement au-dessous de 10 C de la solution d'alcool méthylique, et qu'on dessèche ensuite le produit obtenu, qu'on le lave à l'aide d'éther diéthylique, qu'on le dissout dans l'eau, qu'on neutralise la solution à pH 6,0 et qu'on la stérilise enfin de façon habituelle.