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La présente invention est relative à un nouveau procédé de préparation de composés halogéno-prégnaniques de formule
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et des 1-déhydro-composés correspondantso Dans la formule ci-dessus, R1, R2 et R3 représentent de l'hydrogène ou un hydroxyle libre ou estérifié, R de l'hydrogène ou un groupe méthyle X un atome de chlore ou de fluor, et Y un groupe oxo, ou de l'hydrogène et un hydroxyle libre ou estérifié en orientation d ou ss . o
Le nouveau procédé est caractérisé par le fait qu'on soumet;, à l'ac- tion aérobie d'enzymes capables d'introduire de l'oxygène en position 11, des composés de formule
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CH t 2 R1 CO o R4 r.t 0..R tlq%.n3 0 ce dans laquelle B, Bu et R 3 représentent;
de l'hydrogène ou un hydroxyle libre ou estérifié9 R do l'hydrogène ou un groupe méthyleg et X un atome de chlore ou de fluor, et qui peuvent présenter en position 1,2 une autre double liaison, puis que9 dans les composés obtenus, on estérifie éventuellement des hydroxyles libres ou les déshydrogène en groupe oxoo
Les enzymes utilisées peuvent être de provenance microbiologique auquel cas on incube les substances de départ de manière aérobie, par exemple avec des microorganismes vivants qui sont capables d'introduire de l'oxygène en position 11.Les mioroorganismes utilisés sont, par exemple, ceux du groupe des mucorales .du Pénicilliums des actinomycètes comme lesstreptomycètes, de l'asper- gillus, du Cuninghamella, du Curvularia,
notamment du Rhizopus nigricans du Ourvularia lunatag du Cunninghamella blakesleana du Cunninghamella bainierig du Cunninghamella elegans du cunninghamella echinulatao Pour la mise en oeuvre du procédé microbiologique, on peut incuber les substances de départ avec des cultures des microorganismes indiquésdans des conditions aérobies connues en elles-mêmes. La croissance a lieu en culture de surface ou, ce qui est technique- ment avantageux, en culture immergées en secouant ou en agitant.
Les cultures renferment du carbone assimilable;, notamment des hydrates de carbone, ainsi que le cas échéant, des substances de croissance, par exemple de l'eau de gonflement du mais ou du moût de bières, et des sels inorganiques. On peut9 par suite, utiliser des solutions nutritives naturelles; synthétiques ou semi-synthétiqueso Un procédé qui est pratiquement très simple est décrit ci-après, sans que l'invention soit pour autant limitée par ces indications -.
On cultive les organismes dans des appareils et dans des conditions identiques à ceux qui sont connus pour la fabri- cation des antibiotiques suivant le procédé dit de culture immergéeo Lorsque les cultures se sont développées;, on ajoute les substances de départ indiquées sous
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la forme d'une fine dispersion ou d'une solution, par exemple dans le méthanol, l'acétone ou l'éthylène-glycol, et poursuit l'incubationo Finalement on sépare le mycéliums, extrait le filtrat et/ou la masse de mycélium, et isole de l'extrait
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les 11-hydroy composss d'une manière connue en elle-même, par exemple par le procédé de répartition entre solvants ou mélanges de solvants non miscibles les uns avec les autres± par adsorption, chromatographieF cristallisation;, transfor- mation en dérivés fonctionnels:
, par exemple en esters et analogues. On peut aussi effectuer ces mêmes réactions en séparant tout d'abord les enzymes actives des cultures aérobies des organismes indiqués et en les utilisant à l'exclusion des cultures en croissance. C'est ainsi qu'on peut, par exemple, séparer le mycélium formé de cultures aérobies des organismes indiqués, le mettre en suspension dans de l'eau ou dans des solutions-tampons;, ajouter à ces suspensions les substances de départ indiquées et incuber.
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A la place des enzymes de provenance mierobiologiqueyon peut aussi utiliser celles obtenues à partir d'organes d'animaux, notamment de surrénales de boeufs ou de pores. Le procédé à mettre en oeuvre à cet effet;, en premier lieu l'utilisation d'homogénéisats, est également connu en lui-même et sera décrit plus en détail dans les exemples.
Les composés obtenus peuvent être estérifiés, notamment en position 21o Pour l'obtention des esters, on se sert d'anhydrides, d'halogénures ou de thi- 01-dérivés d'acides carboxyliques aliphatiques ou cyclo-aliphatiques saturés ou non saturés, d'acides carboxyliques aromatiques ou hétérocycliques, par exemple de ceux comportant de 2 à 12 atomes de carbone.
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Pour la transformation des 11K- et 11-hydroxy-composs en les 11- cétones correspondantes7 on utilise les agents usuels de déshydrogénation;, par exemple le trioxyde de chrome dans l'acide acétique glacial ou le complexe de trioxyde de chrome et de pyridine.
Les produits du présent procédé se caractérisent par une activité biologique élevée dans le test glycogénique du foie et dans le test granulométri-
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queo A l'encontre de nombreux cortioo-stéroïdes non-halogénés en-position 6<x les nouveaux produits conformes au procédé ne montrent pas ou du moins ne montrent que dans une mesure très faible l'effet secondaire de la rétention du sodium.
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Les composés A4-prégnéniques et les csmposss 94 prégaad.ièn.q,ze qui servent de substances de départ peuvent être obtenues suivant les procédés décrits dans les demandes de brevet déposées en Belgique par la Demanderesses le 22 Mars
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1958 pour "Nouveaux composés prégnadiéniques et procédé pour leur préparation", le 9 Août 1958 pour "Procédé de préparation de fLuoro-prégnènes" et le 20 Août 1958 pour "Procédé de préparation d'halogéno-prégnènesott L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limita-
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tifs qui suivent dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centi- grades
Exemple 1
Avec 30 cm3 d'une culture en croissance de Rhizopus nigricans obtenue en ensemençant avec des spores du champignon indiqué (cultivé sur du gélose syn- thétique) ,
on mélange litre d'une solution nutritive stérilisée renfermant 20 g de peptone et 5 cm d'eau de gonflement du maïs (Corn steep liquor). On agite le mélange pendant 24 heures à 28 ,en l'aérant. A la fin de la période d'inoa- bation le pH de la culture a une valeur de 3 à 4, et la croissance du champignon est bien développée On ajoute alors à la culture 33 cm d'une solution éthano-
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lique àeà 4-6omchloroprégnène1 ?9 21-d.os-3r 20s..c xe T'enfermant 330 mg du stêroî- de;
puis agite le mélange pendant 24 heures à 2809 en i'aé'ranto On extrait le mézi lange d'incubation avec du chlorure de méthylène, lave l'extrait à l'eau, sèche sur du sulfate de sodium, filtre et concentre sous vide avec précaution.On chromatographie la solution concentrée sur du gel de siliceo0 En éluant avec un
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mélange de chloroforme et d'éthers on obtient à l'état pur laA -6<x-ohloro-pré- gF ène-110 Q 17c 9 21 -trio lm3 20-d.one ..
On obtient le même produit réactionnel lorsqu'on part d'un 21-ester, renfermant par exemple de 2 à 12 atomes de carbone;, de la L14-6-chloro-prégx-ène 1 7cx 9 21 -dio 1-3 20-di.one On dissout un gramme du trijl obtenu dans 5 cm3 de pyridine refroi-
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dit à 0 ajoute, à 0 environ, 0,28 cm d'anhydride acétique (environ 191 équiva- lent);, puis laisse le mélange reposer pendant une heure à 0 et pendant 4 heures à la température ambiante.
On verse alors dans de l'eau et extrait avec du chlo- rure de méthylèneo On lave ensuite l'extrait avec de l'acide chlorhydrique dilué;,
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a,,j,m,an&solution à 5% de carbonate de sodium et à l'eau, sèche sur du sulfate de sodi- -am, filtre et évapore à seco En cristallisant le résidu, on obtient à l'état pur le 21-acétate de la 4-6achloroprègnène11 cx 1 21 -triol-3 20-dion Si l'on utilise, pour l'estérification, -de l'anhydride propionique à la place d'anhydride acétiques on obtient alors comme substance finale le 21- propibnate de la 46c-chloroprgnène-11a 17a 21-triol-39 20-dione
Exemple"2
A une solution d'un gramme du 21-acétate (obtenu suivant l'exemple 1)
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de 1a4-6x-chloro-prégnène-11a917o921triol-3920mdione dans 10 cm d'acide acétique glaciale on ajoute goutte à goutte, en agitant,
5 cm d'une solution à 80% d'acide chromique dans l'acide acétique glacial, laisse reposer pendant 2 heu- res à la température ambiante et verse dans de l'eauo On extrait le produit d'oxy- dation avec de l'acétate d'éthyle,lave l'extrait à l'eau, avec une solution à
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5% de carbonate de sodium et à nouveau à 1 eau9 sèche sur du sulfate de sodium9 filtre et évapore à sec. En cristallisant je résidu dans un mélange d'acétone et d'hexane, on obtient le 21-acétate de la à=6a-chloro-prégnène-17a,21-diol-3911 20-trione. o Exemple 3.
Avec 30 cm3 d'une culture en croissance de Ourvularia lunata obtenue en ensemençant avec des spores du champignon indiqué (cultivé sur du gélose synthétique);, on mélange,un litre d'une solution nutritive stérilisée 'renfermant- 20 g de'peptone et 50 cm d'eau de gonflement du maïs (Corn steep liquor)o On agite le mélange pendant 48 heures à 28 , en l'aérant. A fin de la période d'incubation, le pH de la culture a une valeur de 3 à 4, et la croissance du champignon est bien développée. On ajoute alors au milieu de
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culture 33 cm d'une solution éthanolique de A -6a-chloro-prégnène-17a21-diol- 320-dione renfermant 330 mg du stéroïde, puis agite pendant 48 heuresp en aérant.
On extrait le produit réactionnel avec du chlorure de méthylène;, lave l'extraite sècheconcentre et chromatographie sur du gel de silicecomme décrit dans
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l'exemple 1; ce qui fait qu'on obtient la 4-6cx-chloroprégnène-11 3 17c 9 21-t-ioh 3,20 dione .qui est identique à un échantillon authentiquée A une solution d'un gramme du triol obtenu dans 5 cm3 de pyridine;, on ajoute un cm d'anhydride acétique laisse reposer pendant 4 heures à la tem- pérature ambiante et verse dans de l'eau.
On extrait ensuite avec du chlorure de méthylène, puis lave l'extrait avec de l'acide chlorhydrique diluée avec une
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solution à 5% de 03.rnaJze de sodium et à l'eau sur du sulfate de sodium9 filtre et évapore à sec sous vidéo En cristallisant je résidu dans un mélange d'acétone et d'hexane, on obtient le 21-acétate de la 6 6chloro-prgrène11i1721 triol-3,20-dione qui est identique à un échantillon authentiqueo
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Si à la place du composé libre on met en oeuvre le 2lpxopioaate de la 4 6-ohloro prégnène-17s21-diol3a20-dioxae9 on obtient alors également la b m6omchloro-prégnne11 i g 1.7cg 21.m3 9 20-dion qui par estérification avec de l'an- hydride propionique9 fournit le,,
21-propionate correspondante
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Exemple 4 On incube et traite suivant les indications fournies dans l'exemple
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3 'as gramme de -6or,-ob,.oompguëne-17g21-diol-3q20-dione ou d'un 21-ester do celle-oio Le produit brut obtenu est estérifié en position 21 à l'aide de 5 cm de pyridine et d'un cm3 d'anhydride acétique. Pour le purifier, on chromatogra- phie le 21-acétate brut obtenu sur 20 g d'oxyde d'aluminiumo En éluant avec un
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mélange de benzène et d'éther (60840)? on obtient le 21-acétate de la A -6chloo-prsgraëne-11 817p 21-tiol-3p 20-d.oaae qui est identique à la préparation décrite dans l'exemple 3.
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D'une manière analogue on obtient le 21-propionate de la °-6t-ehlom ao-prs gn'ene11 p 170 g 2a -tzol-3 20-dion @ Exemple 5 Suivant les indications données dans l'exemple 29 on oxyde avec de
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l'acide chromique le 21-acétate de la -6a-ohloro-prégnène-llpgl7ag2l-triol- 3, 20-dionea Le 21-acétate de. la -6a-chloo-prgnënel 7g 29-diol-3911 20-tione que l'on obtient..ainsi est identique à la préparation décrite dans l'exemple 20
En partant du 21-propionate correspondant, on obtient le 21-propionate
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de la A -6a;-chloro-prégnène,:,:
,17az 21-diol-3, 11, 20-trione
Exemple 6 A un litre d'une solution nutritive stérilisée renfermant 20 g de
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peptone et 50 cm3 d'eau de gonflement du mais (Corn steep liquor)z on ajoute 30 cm d'une culture en croissance de Curvularia lunata obtenue en ensemençant avec des spores du champignon indiqué (cultivé sur du gélose synthétique).
On agite alors le mélange pendant 48 heures à 28 , en l'aérant. A la fin de la période d' incubation: le pH de la culture a une valeur de 3 à 4 et la croissance du champignon est bien développée. A la culture indiquée;, on ajoute alors par
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litre 66 cm d'une solution éthanolique à 1& de /µ? -2-méthyl-60e-ohloro-prégna- diëne-17r21-diol-3920-cüoaeo On agite le mélange'pendant 48 heures à 28 , en Itaérant9 extrait aa chlorure de méthylène, lave l'extrait à l'eau, sèche sur du sulfate de sodi'1.UD. filtre et concentre sous vide à un petit volume;
sans sur- chauffe0 On réunit les solutions concentrées provenant des différentes incubations individuelles et les chromatographie sur du gel de silice.En éluant la colonne avec des mélanges de chloroforme et d'éther; on obtient des fractions cristallines
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que l'on rassemble et reoristallise dans un mélange d'acétone et d'hexanes ce qui fait qu'on obtient la Fm2mthyl-6-chloo-prgnada.ëne11 Q 17s 27 tr.ol 3g20-dioneo
Ce composé peut, comme décrit dans les exemples précédents être transformé en ses 21-esters.
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D'une manière araa3Qaa. b transforme la°2caéthl-6-chloro .ga s- ne-17t21diol-3a20-t'.one en ± -2tmmthyl-6sohloo sgnène11g 17<x,21-triol- 3,20-dioneo
Exemple 7
On prépare une culture de Rhizopus nigricans en ensemençant avec le champignon indiqué un milieu aqueux renfermant 2% de peptone et 5% d'eau de gonflement du mais (Corn steep liquor)g et en incubant pendant 24 heures, en agitant et en aérant. A chaque litre de culture,, on ajoute alors 30 cm d'une solu-
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tion éthanolique de 6iluoro-prgène-17c21=cll.ol-320-dione renfermant 300 mg du stéroïde.On agite le mélange pendant 24 heures à 20 ,en l'aérant.
On extrait alors le produit d'incubation avec plusieurs portions de chlorure de méthylène, lave l'extrait à l'eau, sèche sur du sulfate de sodium, filtre et
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concentre sous vide à un petit volume 0 En chromatographiant. le concentrât sur dn gel de siliceg on obtient la D m6-fluoro pgnënemllcql'ag2'B-triol-3n20-diono
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On laisse reposer pendant une nuit à la température ambiante un mélange d'un gramme du composé ci-dessus, de 10 cm3 de pyridine et d'un cm3 d'anhydride acétique, verse alors dans de l'eau et chauffe pendant une demi-heure au bain de vapeur.
Après refroidissement, on essore, lave le gâteau de filtration, sèche et purifie par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane,
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ce qui fait qu'on obtient le 21-acétate de la ì -6-fluoro-prëgnène-11917921- triol-3,20-dioneo
Dans 50 cm3 d'acétone, on dissout un gramme du 21-acétate ci-dessus, refroidit à 0 et ajoute une solution octa-normale d'acide chromique obtenue en dissolvant 1,6,g d'acide chromique dans de l'acide sulfurique dilué.On agite le mélange à 0 pendant 5 à 10 minutes, verse dans de l'eau, extrait à l'éther, lave à l'eau, sèche l'éther sur du sulfate de sodium et l'évapore sous video A partir du résidu, on obtient;
, par cristallisation dans un mélange d'acétone et l'hexane,
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la -6a-fluoro prégnêne-170 21-diol-3' 119 20-trione
Exemple'8 Si l'on remplace dans l'exemple 7 la culture de Rhizopus nigricans
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par une culture de Curvu.1aria lunata, obtenue dans des conditions analogues par une incubation de 48 heures, on obtient alors, en partant de la jj. -6a-fluoro- prégnène-17ae2l-diol-3920-clionee après avoir incubé pendant 48 heures à 29 et avoir traité suivant les indications données dans l'exemple 79 la à -6cx-fluoro- prégnène-1'(3917tx'21-triol-320-dione qui, suivant les indications données dans les exemples précédents, peut être transformée en son 21-acétate ou en un autre 21-ester et qui, par oxydation à l'acide chromique,.
peut être transformée en
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21.-acétate ou en un autre 21-ester de la 4-6-fluoro-prégnène17c921-dzol-3g11 20-trione.
Exemple 9
On prépare comme suit des solutions A, B et C dans de l'eau distillées La solution A en mélangeant 425 cm d'une solution à 1,742% de phosphate dipotas- sique avec 75 cm d'une solution à 1,38% de biphosphate de sodium; la solution B est obtenue en diluant à 5 litres..un litre d'une solution à 4,5% de chlorure de sodium, 40 cm d'une solution à 5,75% de chlorure de potassium et 10 cm d'une solution à 19,1% de sulfate de magnésium ; la solution C est obtenue en dissol-
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vant 20,9 g-.d' acide fumarique et 14s 4 g d'hydroxyde de sodium dans un litre d'eau et en diluant à 1,2 litreoOn mélange alors 475 cm de la solution A, 4,32 litres de la solution B et 1,2 litre de la solution C.
On débarrasse de leur graisse des surrénales de boeufs fraîchement abattus et les traite alors dans une machine à hacher la viande jusqu'à. obtenir une masse homogèneo On ajoute 3 kg de cette masse à 6'litres du mélange cidessus des solutions A, B et C, puis agite fortemento
On ajoute alors au tout une solution de 3 g du 21-acétate de la A4-
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6K-chloro-prêgnène-17<x,21-diol-3,20-dione dans 16 cm de propylène-glycol, puis agite le mélange à 28-37 pendant trois heures.-,On ajoute ensuite au tout 40 litres d'acétone et agite encore pendant une heure à la température ambianteo
On élimine la masse solide par filtration et lave à deux reprises
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avec chaque fois 10 litres d'ac6tone.
Après avoir réuni les filtrats, on les concentre sous vide, à une température inférieure à 30 , jusqu'à 5 litres environ. On lave alors le résidu aqueux à trois reprises avec 4 litres d'hexaneo La solution aqueuse ainsi traitée est extraite à deux reprises avec chaque fois 3 litres de chlorure de méthylèneoL'extrait est lavé à l'eau, séché sur du sulfate de sodium et concentré sous vide à une température inférieure à la température ambiante, jusqu'à 300 cm environo On verse la solution concentrée sur une colonne formée d'un mélange de 90 g de gel de silice et de 90 g de céliteo On la- ve alors la colonne avec un mélange de 900 cm3 de chlorure de méthylène et de 100 cm d'acétone,
puis finalement avec un mélange de 1600 cm de chlorure de mé-
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thylène et de 400 cm à'aaétoneaAxec 1ed9rn±r mélange solvan on élue la %, .w ch7.rm
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ro-prégnène-11,11a,21-triol-3,20-dione qu'on purifie par cristallisation dans de l'éther. D'une manière analogue, on obtient, en partant de la Ô -6a-chloro- prégnène-11a-21-diol-3,20-dione, la 46achloro-prëgnêne-11 (' 17a 21-triol-3' 20- diane.
On dissout un gramme du triol dans 10 cm3 de pyridine et ajoute de l'anhydride acétique. On laisse le mélange reposer pendant une nuit à la températu- re ambiante, verse dans de l'eau glacée, agite une demi-heure, sépare le précipité par filtration, le lave et le sèche et cristallise dans un mélange d'acétone et
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d'hexane, ce qui fait qu'on obtient le 21-acétate de la A'4!6oc-chloro-prégnène- 11 s 15a 21-triol-39 20 dione.
" 4 - D'une manière analogue, on peut préparer des 21-esters supérieurs de la 44-6cx-ohloro-prégnène11 17a, 21-triol-3q 20-dioxae @ Exemple 10 D'une manière analogue à celle'décrite dans l'exemple 9, on fait
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réagir 3 g de L -6a-fluoro-prëgnène-17'21-dïol-320-dione dans 16 cm de propy- lène-glycol sur 3 kg d'une bouillie de surrénales et 6 litres du mélange des solu- tions A, B et C, puis traite L'extrait obtenu au chlorure de méthylène est concentré sous vide jusqu'à 300 cm environ, puis versé sur une colonne formée de 90 g de gel de silice et de 90 g de célite. La colonne est alors éluée avec 3 litres de chlorure de méthylène et avec un mélange de 900 cm de chlorure de méthylène et de 100 cm d'acétone.
Le produit réactionnel est élué avec des mélanges de ohloru-
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re de méthylène et d'acétone (80s20 et 70:30)v En évaporant ces élua4s et en cristallisant le résidu dans de l'acétate d'éthyle, on obtient la -6a-fluoro- prégnène-11 ' 1 7tx 21-triol-3 20dione - Si l'on incube d'une manière analogue la ,1'4-6cx-fluoro-prégraadiène 1 70e, 21-diol-3, 20-dione, on obtient alors la 9 -6a-fluoo-prégne,diène-11 17x 21- triol-3' 20-dion eo Les llfi-hyàroxy-aomposés obtenus peuvent être estérifiés en position 21 suivant les indications données dans l'exemple 9, par exemple avec des acides renfermant de 2 à 12 atomes de carbone.
Exemple 11
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Aune solution agitée de 500 mg'du 2 1-acétate de la  4=6a-fluoro- prégnèae-11 17 21-triol-39 20-d2one dans 300 cm . d'acide acétique glacial on ajoute avec précaution une solution de 130 mg d'acide chromique dans un cm d'eau et 8 cm d'acide acétique glacial.
On laisse le mélange reposer pendant deux heures à la température. ambiante, verse dans de l'eau9 essore, lave et sèche le résidu et le cristallise dans un mélange d'acétone et d'hexane, ce qui fait
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qu'on obtient le 21-acétate de la -6t-fluoroprégnène17921c3.s.ol-3911920trionea D'une manière analogue on peut;, par oxydation, transformer le 21-aoé- tate de ta4 ' 9 -6cx-fluoro-prégnadièn-1181721mtriol-320-d.one en 21-acétate de la lü. -6txfluoro-prêgnadiène-17 21-diol3 g 11. 9 20trione
Exemple 12 D'une manière analogue aux indications fournies dans l'exemple 9,
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on incube 2 g de.4-2amêthyl 6mfluoro-prêgnènel7tx21-diol3a20mdiong dans 16 cm3 de propylène glycol avec 3 kg de bouillie de surrénales et 6 litres du mélange des solutions A, B et 0.
L'extrait obtenu au chlorure de méthylène est concentré sous vide jusqu'à 300 cm3 environ et versé sur une colonne formée de 90 g de gel de silice et de 90 g de célite. La colonne ejt alors éluée avec 3 litres de chlorure de méthylène, avec un mélange de 900 cm de chlorure de méthylène et de 100 cm d'acétone, puis finalement avec un mélange de 1600 cm de chlorure de méthylène et de 400 cm d'acétone.
En éluant avec le dernier mélange, on obtient la
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-2a-mëthyl-6cx-fluoro-prégnène-11 s 1 7a 9 21-triol-39 20dione qu'on purifie par cris- tallisation dans un mélange d'acétone et d'hexaneo On peut, suivant les indications
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fournies dans les exemples précédents, l'estérifier en position 21par exemple
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la transformer en 21-acétate et en 21-ayclopentyl-propionate de la A4-2-méthyl- 6a-fl-aoro-prégnène-l.lpg 9 1?c 9 21 triolm3 9 20-dioaa
En oxydant avec de l'acide chromique suivant les indications fournies dans l'exemple 11, on obtient à partir de ces composés le 21-acétate et le 21-
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cyclopentyl-propionate de la,
' 2obmméthylm6Ctfluorop gnène1 9 216d3.o1m3 a 11 ± 20- trio ne
Exemple 13
On obtient une culture de Cunninghamella bainieri (ATCC 9244) en ense- mençant, avec une culture en croissance du champignons, un milieu aqueux renfermant
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2% de peptone et z d'eau de gonflement de maïs (Corn steep liquor)g puis en agitant pendant 24 ..heures à 28e en aérant. On ajoute, par litre du milieu de cul- tus69 300 mg de A -2a-méthyl-6O:=fluoro-prégnène-17a21-diol-3 20=dione dans 30 cm d'éthanolg puis agite pendant 24 heures à 28 , en aéranto De cette manière;, on met.en oeuvre, au total;, 3 g du stéroïde.
Après incubation on extrait les milieux de culture au chlorure de méthylène après les avoir réunis:, lave l'extrait
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à l'eau, sèche et évaporée A partir du résidu, on obtient la Aà -2mmêthyl6 f,uoomprégnène-11 1 79 21 tr.ol-39 20dionc qui est identique au produit de l'ex- emple 12. ......
Si l'on incube d'une manière analogue, avec une culture de Cunningha.=
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m@lla bainierig de la2f -6ohl,ooprgaènam1.79 21 dl.o139 20 d.,ons de la ,'-6(X-ohloro-prégnadiène-17as21-diol"3s)20-diones, et de la A 9-6c-fluoropr- giad3.ên-17c921dio1m320diors$ .ainsi que de la A g°2mthyl6cxmfluorop dgraa.â.a 17921-dio1320-dions on obtient alo s9 après le traitement la' -6a-ohlcro- pég.ène-11 (391 x9 21-tfi1-.3 20-dionsg la j± ' 9 6cchlooprègraadièn-11 3 17c 21 la 942mxethyl.6Cflinoxoprêgxadiènsmll 3 a 1 '$9 2l.mtiolm3 20d.¯on a et la A do2-méthyl-6cx.,-;
flüoro-prégnadiène=11 11a 21.-triol=320-dione A la place d'une culture de'Cunninghamella bainieri on peut aussi utiliser une culture de Cunninghamella blakesleanao
Exemple 14
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On obtient une culture de Ounninghamella bainieri 9244s ATC09 en ensemençant avec le champignon indiqué un milieu aqueux renfermant 2% de peptone et 5% d'eau de gonflement du mais (Corn steep liquor), et en agitant pendant 24 heures à 28 , en aérant.
A chaque litre de cette culture;, on ajoute 30 cm3 d'une solution
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éthanolique de6ochloroprêgnèx-17921mdiol320=diona renfermant 300 mg du stéroide, puis agite le mélange pendant 24 heures à 28 en l'aéranto Le produit d'incubation est extrait au chlorure de r14hvlène,et l'extrait est lavé à l'eau, séché sur du sulfate de sodium et concentre sous vide à un petit volume.
De cette manièreg on fait-réagir au total 3 g de la substance de départ.
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Après avoir réuni les extraits concentrés9 on les utilise pour imprégner une colonne de 60 g de gel de silice et de 60 g de célite qui est lavée
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au chlorure de méthylène La 6a-chloro-hydroeortisone est éluée de la colonie avec un mélange de chlorure de méthylène et d'acétone (80.20).On peut la purifier par cristallisation dans un mélange de chlorure de méthylène et d'acétone
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D'une manière analogue on peut transformer la jj1 4=6a=ohloro-prég.Ga= dîène-17ag2l-diol-3920-dîone en 6a-ol7iloro-prednisolons.
-'On peut, pour l'hydroxylation en 11ss, utiliserg à la place de Cunnin- ghamelle bainieri, les organismes ATCC suivants : Cunninghamella elegans 679569 7929, 92469 10028 a, 10028 b Cunninghamella blakesleana 86888 , 8688 b,
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Cunninghamellea echinulata 1386.
<Desc/Clms Page number 8>
Exemple 15
Si l'on procède d'une manière analogue à celle décrite dans l'exemple 14, avec cette différence que les substances de départ utilisées dans ledit exem-
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ple sont remplacées par la lµ -60e-iluoro-prégnène-170E,21-diol-3y20-àione et la ' -6-fluoro-prégnadiène-17c321-diol-320-dion' on obtient alors comme substances finales la 6a-fluoro-hydrocortisone et la 6a-fluoro-prednisoloneo BB73NDICàTIONSO
Un prpoédé de préparation de composés halogéno-prégnaniques caracté- risé par le fait qu'on soumet, à l'aotion aérobie d'enzymes capables d'introduire
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de l'oxygène dans la position Il des composes de icrmuie 4 1 CH-R' OH r ¯2 -R Co' 9 00 ) 0 3 dans laquelle R R 2 et R 3 représentent de l'hydrogène ou un hydroxyle libre ou estérifié, R de l'hydrogène ou un groupe méthyle, et X un atome de chlore ou de fluor,
et qui peuvent présenter dans la position 192 une autre double liaison, et queg dans les composés obtenusq on estérifie le cas échéant des hydroxyles libres ou les transforme en groupes oxo par deshydrogénation.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants
1) On effectue l'hydroxylation en position 11 à l'aide de Rhizopus nigrioans, de Curvularia lunata, de Cunninghamella blakesleana, de Cunninghamella bainierig de Cunninghamella elegans ou de Cunninghamella echinulatao
2) On effectue l'hydroxylation en position 11 à l'aide d'homogénéisats de surrénales de boeufs ou de porcs.
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3) On utilise comme substance de départ 3.a 4 6aohloro-prgnèn-17c 21-diol-3e2O-dione ou un ester de celle-ci.
4) On utilise comme substance de départ la 4 6a-fluorc-prégnène-17a 21-diol 3920-dione ou un ester de celle-ci.
5) On utilise comme substance de départ la 1 4 6cx-chloro prégnadiènem 17a,21-diol-3,20-dione ou un ester de celle-ci.
6) On utilise comme substance de départ la 1'46a-fha.oro prégxaad' ène- 17a 21-diol-3s 20 d5.one ou un ester de celle-ci ....' 7) On utilise comme substance de départ la -2cx méthyl-&cxehloro- prégnène-17<Xp81-diol-3920-dione ou un ester de celle-cio " 8)"On utilise comme substance de départ la A4-2a.-méthyl-6o;-fluoro-pré- gnène-17a21;--,Uol-3920-dione ou un ester de colle-ci.
9) On utilise comme substance de départ la 1 1 ,4-2-méthyl-6a-chloro- piégnaàiène-17 ,21-diol-3,20-dione ou un ester de celle-ci.
10) On-'utilise comme substance de départ la A -2-méthyl-6o:-fluoro-pré'- gnadiène-17ay2l-diol-3920-clione ou un ester de celle-ci.
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