BRPI0910348A2

BRPI0910348A2 - insulina estabilizada em protease acilada, composição farmacêutica compreendendo a mesma e seus usos

Info

Publication number: BRPI0910348A2
Application number: BRPI0910348-1A
Authority: BR
Inventors: Thomas Borglum Kjeldsen; Tine Glendorf; Patrick William Garibay; Jacob Sten Petersen; Peter Madsen; Thomas Hoeg-Jensen; Palle Jakobsen; Tina Moller Tagmose; Janos Tibor Kodra
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 2008-03-18
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2020-08-11
Also published as: HUE032284T2; JP2011515358A; JP2015147781A; KR20160073431A; RU2010141481A; US9045560B2; AU2009226910A1; JP2015147782A; IL207748A0; HUS2400029I1; DK2910570T3; PL2910570T3; EP2910571B1; CA2718738C; WO2009115469A1; ES2609288T3; FR24C1037I1; US20140073564A1; KR20160124929A; US20110105720A1

Abstract

ANÁLOGOS DE INSULINA ACILADA ESTABILIZADA EM PROTEASE, SEUS USOS, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS. A presente invenção refere-se a novos análogos de insulina acilada exibindo resistência às proteases, que podem, efetivamente, ser administrados pulmonar ou oralmente. Os análogos de insulina contêm B25H e A14E ou A14H.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLOGOS - DE INSULINA ACILADA ESTABILIZADA EM PROTEASE, SEUS USOS, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS". | CAMPO DESTA INVENÇÃO A presente invenção refere-se aos novos análogos de insulina acilada, que exibem resistência a proteases, a um método para a prepara- ção de tais análogos de insulina, a preparações de insulina contendo os aná- logos de insulina da invenção e a um método de tratar diabetes melito usan- do estes análogos de insulina.

ANTECEDENTES DESTA INVENÇÃO Diabetes melito é um distúrbio metabólico em que a habilidade para utilizar glicose é em parte ou completamente perdida. Cerca de 5% de todas as pessoas sofrem de diabetes e o distúrbio chega a proporções epi- dêmicas. Desde a introdução de insulina nos anos 20, esforços contínuos têm sido feitos para melhorar o tratamento de diabetes melito. Considerando que as pessoas que sofrem de diabetes estão sujeitas a tratamento crônico durante várias décadas, há uma necessidade principal por formulações de insulina seguras, convenientes e de melhora da qualidade de vida.

A via oral é sem dúvida a via amplamente usada para adminis- tração de fármaco e é em geral muito bem aceita por pacientes, especial- mente para terapias crônicas. Administração de peptídeos ou proteínas tera- pêuticos é, porém, frequentemente limitada às vias parenterais ao invés da administração oral preferida devido a várias barreiras tais como degradação enzimática no trato gastrointestinal (GI) e mucosa intestinal, bombas de eflu- xodo fármaco, absorção insuficiente e variável da mucosa intestinal, como também metabolismo de primeira passagem no fígado.

Normalmente, as formulações de insulina são administradas atra- vés de injeção subcutânea. Porém, administração através de outras vias, por exemplo, oralmente ou pulmonar, seria vantajoso devido à complacência dos pacientes, segurança e conveniência. Algumas das formulações de insulina disponíveis comerciais são caracterizadas por um princípio rápido de ação e outras formulações têm um princípio relativamente lento, mas apresentam uma ação mais ou menos prolongada. É muito importante para paci-

" 2 entes diabéticos que haja, no mercado, uma variedade grande de insulinas com durações diferentes de ações (perfis de ações). Brevemente, as insuli- nas podem ser classificadas como sendo de ação curta, intermediária ou longa.

WO 2008/034881 diz respeito a certos análogos de insulina em que pelo menos dois aminoácidos hidrofóbicos foram substituídos com ami- noácidos hidrófilos cujos análogos de insulina não são acilados.

EP 2008/060733 e EP 2008/060733 dizem respeito a certos aná- oe logos de insulina acilada em que o análogo de insulina compreende um a- iongamento com um aminoácido ou um resíduo de peptídeo C- terminalmente conectado ao aminoácido de A21. ' EP 2008/060734 diz respeito a certas insulinas aciladas em que uma porção de acila é ligada à insulina parental e em que a dita porção de - acila compreende unidades de repetição de aminoácidos contendo alquíileno

15. glicol.

ASPECTOS DESTA INVENÇÃO Um aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento dos análogos de insulina que, quando administrados oralmente, podem dar um controle satisfatório do nível de glicose do sangue.

) 20 Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina que, quando administrados oralmente, podem dar uma redução prolongada do nível de glicose.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que, quando administrados oralmente, podem dar uma redução prolongada do nível de glicose.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que, quando administrados oralmente, podem dar um controle satisfatório do nível de glicose do sangue seguindo administra- ção diária de três vezes.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que, quando administrados oralmente, podem dar um controle satisfatório do nível de glicose do sangue seguindo administra-

ção diária de duas vezes.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que, quando administrados oralmente, podem dar um controle satisfatório do nível de glicose do sangue seguindo administra- çãodiáriadeuma vez.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que são hidrófilos.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de [O análogos de insulina basal que são mais hidrófilos que a insulina humana. Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que são menos hidrofóbicos que a insulina hu- BR mana, quando medido pela hidrofobicidade relativa (K'rel) como descrito a- qui. . Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que são menos hidrofóbicos que insulinas paren- tais aciladas não estabilizadas em protease similares com a mesma porção de acila, como medido pela hidrofobicidade relativa (K'rel) como descrito a- qui. K'rel dos análogos de insulina basal da invenção é preferivelmente menos oe 20 que5, mais preferivelmente menos que 3, mais preferivelmente menos que 2, mais preferivelmente menos que 1, mais preferivelmente menos que 0,8, mais preferivelmente menos que 0,6, mais preferivelmente menos que 0,5, mais preferivelmente menos que 0,4, mais preferivelmente menos que 0,3, mais preferivelmente menos que 0,2, mais preferivelmente menos que 0,1. Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que, quando administrados oralmente, têm bio disponibilidades satisfatórias. Comparada com as biodisponibilidades das insulinas aciladas similares sem as mutações de estabilização de protease dadas em doses similares, a biodisponibilidade dos compostos preferidos desta invenção é pelo menos 10% mais alta, preferivelmente 20% mais alta, preferivelmente 25% mais alta, preferivelmente 30% mais alta, preferivel mente 35% mais alta, preferivelmente 40% mais alta, preferivelmente 45%

] 4 mais alta, preferivelmente 50% mais alta, preferivemente 55% mais alta, preferivelmente 60% mais alta, preferivelmente 65% mais alta, preferivel- mente 70% mais alta, preferiveimente 80% mais alta, preferivelmente 90% mais alta, preferivelmente 100% mais alta, preferivelmente mais que 100% maisaltaqueado comparador não estabilizado em protease.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que, quando administrados oralmente, têm bio- disponibilidades satisfatórias. Biodisponibilidades dos compostos preferidos desta invenção (com relação à administração i.v.) são pelo menos 0,3%, pre- o 10 feriveimente >0,5%, preferiveimente >1%, preferivelmente >1,5%, preferi- velmente >2%, preferivelmente >2,5%, preferivelmente >3%, preferivelmente >3,5%, preferivelmente >4%, preferivelmente >5%, preferivelmente >6%, - preferivelmente >7%, preferivelmente >8%, preferivelmente >9%, preferivel mente >10%,.

5 Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina basal que, quando administrados através de infusão intravenosa, têm potências satisfatórias. Comparadas com a potência de in- sulina humana, potências de análogos de insulina estabilizada em protease preferidas da invenção são preferivelmente >5%, preferivelmente >10%, pre- ferivelmente >20%, preferivelmente >30%, preferivelmente >40%, preferi- o velmente >50%, preferivelmente >75% e preferivelmente > 100%.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina que, quando administrados pulmonarmente, podem dar um controle satisfatório do nível de glicose do sangue.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina que, quando administrados pulmonamente, podem dar , um controle satisfatório do nível de glicose do sangue com um princípio rela- tivamente lento de ação e/ou uma ação mais ou menos prolongada.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina que têm uma ação prolongada satisfatória seguindo administração pulmonar. Comparada com insulina acilada similar sem as mutações de estabilização de protease dadas em doses similares, a duração

' 5 de ação dos compostos preferidos desta invenção é pelo menos 10% mais longa, preferivelmente 20% mais longa, preferivelmente 25% mais longa, preferivelmente 30% mais longa, preferivelmente 35% mais longa, preferi- veimente 40% mais longa, preferivelmente 45% mais longa, preferivelmente 50% maislonga, preferivelmente 55% mais longa, preferivelmente 60% mais longa, preferivelmente 65% mais longa, preferivelmente 70% mais longa, preferivelmente 80% mais longa, preferivelmente 90% mais longa, preferi- velmente 100% mais longa, preferivelmente mais que 100% mais longa que a do comparador.

Duração da ação pode ser medida até que a glicose do o 10 sangue seja suprimida, ou medindo as propriedades farmacocinéticas rele- vantes, por exemplo, 1/4 ou MRT (tempo de permanência médio). Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de - análogos de insulina que têm uma biodisponibilidade pulmonar satisfatória.

Comparada com a biodisponibilidade de insulina humana ou comparada com “ 15 insulina acilada similar sem mutações de estabilização de protease dada em doses similares, a biodisponibilidade dos compostos preferidos desta inven- ção é pelo menos 10% mais alta, preferivelmente 20% mais alta, preferivel- mente 25% mais alta, preferivelmente 30% mais alta, preferivelmente 35% mais alta, preferivelmente 40% mais alta, preferivelmente 45% mais alta, preferivelmente 50% mais alta, preferivelmente 55% mais alta, preferivel eo mente 60% mais alta, preferivelmente 65% mais alta, preferivelmente 70% mais alta, preferivelmente 80% mais alta, preferivelmente 90% mais alta, preferivelmente 100% mais alta, preferivelmente mais que 100% mais alta que a do comparador.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fomecimento de análogos de insulina que têm potência in vivo aparente aumentada.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fomecimento de insulinas de ação prolongada com biodisponibilidade oral.

Outro aspecto desta invenção diz respeito ao fornecimento de análogos de insulina que têm uma estabilidade proteolítica aumentada com- parada à estabilidade de insulina humana.

Comparada com a insulina hu- mana, a estabilidade proteolítica dos compostos preferidos desta invenção é pelo menos 2 vezes mais estável, preferivelmente 3 vezes mais estável, pre- ferivelmente 4 vezes mais estável, preferivelmente 5 vezes mais estável, preferivelmente 6 vezes mais estável, preferivelmente 7 vezes mais estável, preferivelmente 8 vezes mais estável, preferivelmente 9 vezes mais estável, preferivelmente 10 vezes mais estável, preferivelmente 12 vezes mais está- vel, preferivelmente 14 vezes mais estável, preferivelmente 16 vezes mais estável, preferivelmente 18 vezes mais estável, preferivelmente 20 vezes mais estável, preferiveimente 25 vezes mais estável, preferivelmente mais de 25 vezes mais estável que a do comparador. Estabilidade proteolítica po- oe 10 deser medida expondo as insulinas às (uma mistura de) enzimas proteolíti- cas, por exemplo, um extrato de enzimas do intestino como descritas aqui. O objetivo desta invenção é superar ou melhorar pelo menos - uma das desvantagens da técnica anterior, ou fornecer uma alternativa útil.

DEFINIÇÕES AB Aqui, o termo insulina abrange insulinas de ocorrência natural, por exemplo, insulina humana, como também análogos de insulina das mesmas. Insulina humana consiste em duas cadeias de polipeptídeo, as as- sim chamadas cadeias A e B contendo 21 e 30 resíduos de aminoácido, respectivamente, e que são interconectadas através de duas ligações em pontesde dissulfeto de cistina.

o Aqui, o termo resíduo de aminoácido abrange um aminoácido do qual um átomo de hidrogênio foi removido de um grupo amino e/ou um gru- po hidróxi foi removido de um grupo carbóxi e/ou um átomo de hidrogênio foi removido de um grupo mercapto. Impreciso, um resíduo de aminoácido pode —serdesignado um aminoácido. Aqui, aminoácidos hidrofóbicos serão entendidos como o tripto- fano de aminoácidos de ocorrência natural (Trp, W), fenilalanina (Phe, F), valina (Val, V), isoleucina (lle, 1), leucina (Leu, L) e tirosina (Tyr, Y) (com a abreviação de três letras e uma letra entre parênteses). Aqui, aminoácidos hidrófilos serão entendidos como aminoáci- dos naturais que não são aminoácidos hidrofóbicos de acordo com a defini- ção acima. Em uma modalidade, os ácidos hidrófilos são selecionados de acordo com a invenção do grupo que consiste em: ácido glutâmico (Glu, E), ácido aspártico (Asp, D), histidina (His, H), glutamina (Gln, OQ), asparagina (Asn, N), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), prolina (Pro, P), glicina (Gly, G), lisina (Lys, K) e arginina (Arg, R). Em uma outra modalidade, os aminoácidos hidrófilos são selecionados de acordo com a invenção do grupo que consiste em: ácido glutâmico (Giu, E), ácido aspártico (Asp, D), histidina (His, H), glu- tamina (Gln, Q), asparagina (Asn, N), lisina (Lys, K) e arginina (Arg, R). Aqui, o termo análogo de insulina abrange um polipeptídeo que tem uma estrutura molecular que formalmente pode ser derivada da estrutu- oe 10 rade uma insulina de ocorrência natural, por exemplo, insulina humana, de- letando e/ou substituindo (repondo) um ou mais resíduos de aminoácido que ocorrem na insulina natural! e/ou adicionando um ou mais resíduos de ami- - noácido, Os resíduos de aminoácido adicionados e/ou substituídos podem ser resíduos de aminoácido codificáveis ou outros resíduos de aminoácido * 415 de ocorrência natural ou resíduos de aminoácido puramente sintéticos. Em uma modalidade preferida, o análogo de insulina tem duas ou mais muta- ções comparadas à insulina humana. Aqui, o termo insulina estabilizada em protease significa a insuli- na sem uma porção de acila ligada. As ditas insulinas estabilizadas em pro- teasetêm uma estabilidade melhorada contra degradação de proteases.

() Aqui, o termo insulina parental significa a insulina sem uma por- ção de acila ligada e sem mutações para melhorar a estabilidade contra de- gradação de proteases. As ditas insulinas parentais opcionalmente têm mu- tações com relação à insulina humana. Insulinas parentais são, desse modo, também análogos de insulina como definidos acima. Aqui, o termo insulina parental e insulina não estabilizada em protease abrange os mesmos com- postos.

Aqui, o termo mutação abrange qualquer alteração na sequência de aminoácido (substituições e inserções com aminoácidos codificáveis co- motambém deleções).

Aqui, os termos análogos da cadeia A e análogos das cadeias B de insulina humana abrangem as cadeias A e B da insulina humana, respec-

tivamente, tendo uma ou mais substituições, deleções e ou extensões (adi- ções) das cadeias A e B de aminoácido, respectivamente, com relação às cadeias A e B, respectivamente, da insulina humana.

Aqui, termos como A1, A2, A3, etc. indicam a posição 1, 2 € 3, respectivamente, na cadeia A de insulina (contada da extremidade N- terminal). Similarmente, termos como B1, B2, B3, etc. indicam a posição 1, 2 e 3, respectivamente, na cadeia B da insulina (contada da extremidade N- terminal). Usando os códigos de uma letra para aminoácidos, termos como A21A, A21G e A21Q designam que o aminoácido na posição de A21 é A, G o 10 eQ, respectivamente, Usando os códigos de três letras para aminoácidos, as expressões correspondentes são AlaA21, GIyVA21 e GInA2Z1, respectiva- mente. - Aqui, os termos A(O) ou B(0) indicam as posições N- terminalmente avizinhando-se das posições A1 ou B1, respectivamente, nas “15 cadeiasÃeB, respectivamente.

Os termos A(1) ou B(-1) indicam as posi- ções dos primeiros aminoácidos N-terminalmente para A(O) ou B(0), respec- tivamente.

Desse modo A(-2) e B(-2) indicam as posições N-terminalmente para A(-1) e B(-1), respectivamente, A(-3) e B(-3) indicam as posições N- terminalmente para A(-2) e B(-2), respectivamente, e assim sucessivamente.

Aqui, os termos como desB29 e desB30 indicam um análogo de oe insulina desprovidos do residuo de aminoácido B29 ou B30, respectivamen- te.

Aqui, o termo "insulina de ação rápida" abrange uma insulina que tem um princípio mais rápido de ação que a insulina humana normal ou regular.

Aqui, o termo "insulina de ação longa" ou o termo “insulina ba- sal" abrange uma insulina que tem uma duração mais longa de ação que a insulina humana normal ou regular.

Preferivelmente, a ação de tempo é mais que 5, ou 8 horas, em particularmente de pelo menos 9 horas.

Preferivel- mente, ainsulina basal tem uma ação de tempo de pelo menos 10 horas.

À insulina basal pode, desse modo, ter uma ação de tempo na faixa de cerca de 8 a 24 horas, preferivelmente na faixa de cerca de 9 a cerca de 15 horas.

A numeração das posições nos análogos de insulina, insulinas e cadeias A e B é feita de forma que o composto parental seja insulina huma- na com a numeração usada para o mesmo.

Aqui, o termo "insulina acilada" abrange modificação da insulina através da ligação de uma ou mais porções de acila por meio de um ligante à insulina estabilizada em protease.

Por insulina acilada tendo atividade de insulina é significada uma insulina acilada com a habilidade para diminuir a glicose do sangue em ma- míferos quando medida em um modelo animal adequado que pode ser, por oe 10 exemplo, um modelo de rato, coelho, ou de porco, após administração ade- . quada, por exemplo, por administração intravenosa ou subcutânea, ou um receptor de afinidade de ligação à insulina.

7 Aqui, o termo alquila abrange um grupo hidrocarboneto satura- do, ramificado ou reto.

' 15 Aqui, o termo alcóxi abrange o radical "alquil-O-". Exemplos re- presentativos são metóxi, etóxi, propóxi (por exemplo, 1-propóxi e 2- propóxi), butóxi (por exemplo, 1-butóxi, 2-butóxi e 2-metil-2-propóxi), pentóxi (1-pentóxi e 2-pentóxi), hexóxi (1-hexóxi e 3-hexóxi) e similares.

Aqui, o termo alquileno abrange um grupo hidrocarboneto biva- lente, saturado, ramificado ou reto tendo de 1 a 12 átomos de carbono. E- oe xemplos representativos incluem, mas não são limitados a, metileno; 1,2- etileno; 1,3-propileno; 1,2-propileno; 1,3-butileno; 1,4-butileno; 1,4-pentileno; 1,5-pentileno; 1,5-hexiteno; 1,6-hexileno e similares.

Aqui, o termo "aminoácido linear neutro" abrange. Exemplos não limitativos de amincácidos lineares neutros são.

Aqui, o termo "aminoácido cíclico" abrange. Exemplos não limita- tivos de aminoácidos cíclicos são.

Aqui, o termo "aminoácido acídico" abrange. Exemplos não limi- tativos de aminoácidos acídicos são.

Aqui, o termo "ácido graxo" abrange uns ácidos carboxílicos li- neares ou ramíficados, alifáticos tendo pelo menos dois átomos de carbono e sendo saturado ou insaturado. Exemplos não limitativos de ácidos graxos são ácido mirístico, ácido palmítico e ácido esteárico. Aqui, o termo "diácido graxo" abrange uns ácidos dicarboxílicos lineares ou ramificados, alifáticos tendo pelo menos dois átomos de carbono e sendo saturado ou insaturado. Exemplos não limitativos de diácidos graxos são ácido succínico, ácido hexanodioico, ácido octanodioico, ácido decano- dioico, ácido dodecanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido hexadecanodi- oico, ácido heptadecanodioico, ácido octadecanodioico e ácido eicosanodi- oico. Aqui, a nomeação das insulinas é feita de acordo com os princí- e 10 pios seguintes: os nomes são dados como mutações e modificações (acila- ções) com relação à insulina humana. Para a nomeação da porção de acila, a nomeação é feita de acordo com a nomenclatura de IUPAC e em outros - casos como nomenclatura de peptídeo. Por exemplo, nomeação da porção de acila: - o q o

ICO [) " o o go a na o pode por exemplo ser "octadecanodioi-yGlu-OEG-OEG", ou "17- carbóxi-heptadecanoil-yGIlu-OEG-OEG", em que o OEG é abreviação para o aminoácido NH2(CH2)2O(CH2)- OCH2CO2H, yGlu é abreviação para o aminoácido ácido glutâmico gama. Outras abreviações para aminoácidos são, por exemplo: PEG3 é NH2((CH3)20)ACH2CH2CO2H PEG7 é NH((CH2)O):CH2CH2COH Por exemplo, a insulina do exemplo 9 (com a sequên- cia/estrutura dada abaixo) é nomeada "A14E, B25H, B29K(NOctadecanodioil-yGluy-OEG-OEG), insulina humana de desB30" pa- ra indicar que o aminoácido na posição A14, Y na insulina humana, foi mu- tado para E, o aminoácido na posição B25, F na insulina humana, foi mutado para H, o aminoácido na posição B29, K como na insulina humana, foi modi-

] n ficado através de acilação no nitrogênio epsilo no resíduo de lisina de B29, denotado Nf, pelo resíduo octadecanodioil-YGlu-OEG-OEG, e o aminoácido na posição B30, T na insulina humana, foi deletado. Asteriscos na fórmula abaixo indicam que o resíduo em questão é diferente (isto é, mutado) quan- do comparado à insulina humana. Ao longo deste relatório descritivo, as fórmulas e os nomes das insulinas preferidas da invenção são dados o à O Ho Roo OH o 9 u o o Ooo a NA E o «Gl vEQCETS | cs LÉQL ENYGN - i PP ) i . OH mFVNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFHYTP-N Oo Aqui, os termos "estabilidade química” e “estabilidade química e alta", significam que quimicamente as insulinas da invenção são suficiente- mente estáveis na formulação desejada. Ou seja, que os produtos de degra- dação químicos são apenas formados em quantidades que não comprome- tem a vida de prateleira do produto de fármaco final. Produtos de degrada- ção química incluem produtos de desamidação, formação de isoaspartato, formação de dímero, produtos de racemização, produtos que são o resultado de processos de desidratação et cetera. Estabilidade química pode ser me- dida por análises de HPLC de amostras ou formulações velhas.

Aqui, o termo "estabilidade física alta" abrange uma tendência à fibrilação que é menos que 50% que da insulina humana. Fibrilação pode ser descrita pelo último tempo antes da formação da fibrila ser iniciada em umas condições dadas.

Um polipeptídeo com receptor de insulina e afinidade de recep-

tor de IGF-1 é um polipeptídeo que é capaz de interagir com um receptor de insulina e um receptor de IGF-1 humana em um ensaio de ligação adequa- do.

Tais ensaios de receptor são bem conhecidos dentro do campo e sao também descritos nos exemplos.

A insulina acilada presente não ligará ao receptor de IGF-1 ou terá uma afinidade bastante baixa para o dito receptor.

Mais precisamente, as insulinas aciladas desta invenção terão uma afinidade para o receptor de IGF-1 de substancialmente a mesma magnitude ou me- nos como à da insulina humana.

O termo "farmmaceuticamente aceitável" como aqui usado signifi- o 10 ca adaptado para aplicações farmacêuticas normais, isto é, dando origem a nenhum evento adverso sério em pacientes, etc.

Os termos tratamento e trato como aqui usados significam o ge- - renciamento e o cuidado de um paciente para o propósito de combater uma doença, distúrbio ou condição.

É intencionado que o termo inclua o tarda- “ 15 mentodaprogressão da doença, do distúrbio ou da condição, a mitigação ou o alívio dos sintomas e as complicações, e/ou a cura ou a eliminação da do- ença, do distúrbio ou da condição.

O paciente a ser tratado é preferivelmente um marmiífero, em particular, um ser humano.

O termo tratamento de uma doença como aqui usado significa o gerenciamento e o cuidado de um paciente que tem desenvolvido a doença, e a condição ou o distúrbio.

O propósito do tratamento é combater a doença, a condição ou o distúrbio.

Tratamento inclui a administração dos compostos ativos para eliminar ou controlar a doença, a condição ou o distúrbio como também alíviar os sintomas ou complicações associadas à doença, à condi- çãoouaodistúrbio.

O termo prevenção de uma doença como aqui usado é definido como o gerenciamento e o cuidado de um indivíduo em risco de contrair a doença antes do princípio clínico da doença.

O propósito da prevenção é combater o desenvolvimento da doença, condição ou distúrbio, e inclui a administração dos compostos ativos para impedir ou tardar o princípio dos sintomas ou das complicações e impedir ou tardar o desenvolvimento de do- enças relacionadas, condições ou distúrbios.

O termo quantidade efetiva como aqui usado significa uma do- sagem que é suficiente para que o tratamento do paciente seja efetivo com- parado sem tratamento. POT é o gene da triose fosfato isomerase Schizosaccharomyces pombe eTPl1éogene da triose fosfato isomerase de S. cerevisiae. Por um líder é significado uma sequência de aminoácido que consiste em um pré-peptideo (peptídeo sinal) e um pró-peptídeo. O termo peptídeo sinal é entendido significar um pré-peptídeo que está presente como uma sequência N-terminal na forma de precursor de o 10 uma proteína. A função do peptídeo sinal é permitir a proteína heteróloga facilitar a translocação para dentro do retículo endoplásmico. O peptídeo si- nal é normalmente clivado no curso deste processo. O peptídeo sinal pode - ser heterólogo ou homólogo ao organismo de levedura que produz a proteí- na. Vários peptídeos sinal que podem ser usados com o construto de DNA “15 destainvenção incluindo peptídeo sinal da protease aspártica de levedura 3 (YAP3) ou qualquer análogo funcional (Egel-Mitani et al. (1990) YEAST 6:127-137 e US 5.726.038) e o sinal do fator a do gene MFa1 (Thomer (1981) em The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern et al., eds., págs. 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY e US4870.00. oe Aqui, o termo "pró-peptídeo" abrange uma sequência de polipep- tídeo, cuja função é permitir direcionar o polipeptídeo expresso do retículo endoplásmico para o aparelho de Golgi e também para uma vesícula secre- tória para secreção no meio de cultura (isto é, exportação do polipeptídeo ao longo da parede celular ou pelo menos através da membrana celular para dentro do espaço periplásmico da célula de levedura). O pró-peptídeo pode ser o pró-peptídeo de fator a da levedura, vide US 4.546.082 e 4.670.008. Alternativamente, o pró-peptídeo pode ser um pró-peptídeo sintético, o que quer dizer um pró-peptídeo não encontrado na natureza. Pró-peptídeos sin- téticos adequados são aqueles descritos na US 5.395.922; 5.795.746;

5.162.498 e WO 98/32867. O pró-peptídeo preferivelmente conterá um sítio de processamento de endopeptidase na extremidade C-terminal, tal como uma sequência de Lys-Arg ou qualquer análogo funciona! do mesmo.

A menos que explicitamente indicado, os aminoácidos mencio- nados aqui são L-amino ácidos. Também, as extremidades esquerda e direi- ta de uma sequência de aminoácido de um peptídeo são, respectivamente, ostéminosNeC, amenos que do contrário especificado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Foi descoberto que insulinas que são estabilizadas para degra- dação proteolítica (através de mutações específicas) e aciladas na B29-lisina são eficazes e demoradas e possuem potencial alto como insulinas demora- o 10 das que podem ser administradas pulmonar ou oralmente. À acilação confe- re ligação à albumina sérica, e, por conseguinte, protraimento. Além disso, as insulinas aciladas da invenção exibem redução substancial de afinidade - ao receptor de insulina, comparada às insulinas aciladas similares que não são estabilizadas para degradação proteolítica. Esta redução em afinidade , 15 ao receptor de insulina das insulinas ligadas à albumina da invenção contri- bui para o protraimento da insulina acitada em circulação, uma vez que a in- sulina é interiorizada e degradada sob ativação do receptor. Consequente- mente, liberação das insulinas da invenção é reduzida, A redução de afini- dade ao receptor de insulina provavelmente não causa uma perda de potên- cia, por exemplo, conforme medida no grampo euglicêmico hiperinsulinêmico ) como descrito aqui. A combinação de afinidade de ligação alta de albumina e afinidade ao receptor de insulina baixa é, desse modo, benéfica para obter duração longa de ação das insulinas (insulinas basais). Além disso, após administração oral, estas insulinas aciladas têm um grau mais alto de biodis- — ponibilidade que as insulinas aciladas conhecidas similares que não são es- tabilizadas para degradação proteolítica. Consequentemente, estes análo- gos de insulina acilada são valiosos para administração oral. Similarmente, após administração pulmonar, estas insulinas aciladas estabilizadas em pro- tease apresentam potência aparente e/ou biodisponibilidade mais altas que as insulinas aciladas conhecidas similares que não são estabilizadas para degradação proteolítica. Além disso, estas insulinas aciladas estabilizadas em protease apresentam perfis de ação de tempo demorada quando admi-

] 15 nistradas pulmonarmente em mamíferos. Consequentemente, estes análo- gos de insulina acilada são valiosos para administração pulmonar.

As insulinas supracitadas que são estabilizadas para degrada- ção proteolítica são aqui designadas insulinas estabilizadas em protease.

A molécula de insulina estabilizada em protease tem um número limitado dos resíduos de aminoácido de ocorrência natural substituídos com outros resíduos de aminoácido com relação à insulina humana como expli- cado na parte detalhada do relatório descritivo.

Em uma modalidade, esta invenção diz respeito a uma insulina o 10 acilada, em que o análogo de insulina estabilizada em protease diverge da insulina humana em uma ou mais das deleções ou substituições seguintes: Q na posição A18, A, G ou Q na posição A21, G ou Q na posição B1 ou ne- - nhum resíduo de aminoácido na posição B1, Q, S ou T na posição B3 ou nenhum resíduo de aminoácido na posição B3, Q na posição B13, nenhum ' 15 resíduo de aminoácido na posição B27, D, E ou R na posição B28 e nenhum aminoácido na posição B30.

Em ainda um outro aspecto, esta invenção diz respeito às prepa- rações farmacêuticas compreendendo a insulina acilada desta invenção e adjuvantes e aditivos adequados tais como um ou mais agentes adequados para estabilização, conservação ou isotonia, por exemplo, fons de zinco, fe- oe nol, cresol, um parabeno, cloreto de sódio, glicerol ou manitol. O conteúdo de zinco das formulações presentes pode ser entre O e cerca de 6 átomos de zinco por 6 moléculas de insulina. O valor de pH da preparação farma- cêutica pode ser entre cerca de 4 e cerca de 8,5, entre cerca de 4 e cerca de Souentrecercade6,5e cerca de 7,5.

Em uma outra modalidade, esta invenção refere-se ao uso da insulina acilada como um farmacêutico para redução dos níveis de glicose do sangue em mamíferos, em particularmente para o tratamento de diabe- tes.

Em um outro aspecto, esta invenção refere-se ao uso da insulina acilada para a preparação de uma preparação farmacêutica para redução do nível de glicose do sangue em mamíferos, particularmente para o tratamento de diabetes.

Em uma outra modalidade, esta invenção refere-se a um método de reduzir o nível de glicose do sangue em mamíferos administrando uma dose terapeuticamente ativa de uma insulina acitada desta invenção a um pacienteem necessidade de tal tratamento.

Em um outro aspecto desta invenção, as insulinas aciladas são administradas em combinação com uma ou mais outras substâncias ativas em qualquer razão adequada. Tais agentes ativos também podem ser sele- cionados de insulina humana, análogos de insulina de ação rápida, agentes oe 10 —antidiabéticos, agentes anti-hiperlipidêmicos, agentes de antiobesidade, a- gentes anti-hipertensivos e agentes para o tratamento de complicações que resultam ou associadas à diabetes.

- Em uma modalidade, os dois componentes ativos são adminis- trados como uma preparação farmacêutica misturada. Em outra modalidade, osdois componentes são administrados separadamente de modo simultã- neo ou sequencialmente.

Em uma modalidade, as insulinas aciladas desta invenção po- dem ser administradas junto com insulina humana de ação rápida ou anáio- gos de insulina humana. Tal análogo de insulina de ação rápida pode ser tal em que o resíduo de aminoácido na posição B28 é Asp, Lys, Leu, Val, ou o Ala e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro, insulina huma- na de des(B28-B30), insulina humana de des(B27) ou insulina humana de des(B39), e um análogo em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Glu ou Asp. À insulina aci- lada desta invenção e a insulina humana de ação rápida ou análogo de insu- lina humana podem ser misturados em uma razão de cerca de 90% da insu- lina acilada a cerca de 10% da insulina humana de ação rápida ou análogo de insulina humana; preferivelmente de cerca de 70% da insulina acilada a cerca de 30% da insulina humana de ação rápida ou análogo de insulina humana, e até mesmo mais preferido de cerca de 50% da insulina acilada a cerca de 50% da insulina humana de ação rápida ou análogo de insulina humana (% sendo porcentagem em peso).

' 17 As insulinas aciladas desta invenção podem também ser usadas em tratamento de combinação junto com um agente antidiabético.

Agentes antidiabéticos incluirão insulina, GLP-1(1-37) (peptídeo- 1 semelhante ao glucagon) descrito em WO 98/08871, WO 99/43706, US 5424286, WO 00/09666, WO 2006/087537, PCT/EP2008/061755 e PCT/EP2008/061830, GLP-2, exendin-4(1-39), fragmentos insulinotrópicos dos mesmos, análogos insulinotrópicos dos mesmos e derivados insulinotró- picos dos mesmos. Fragmentos insulinotrópicos de GLP-1(1-37) são peptí- deos insulinotrópicos para os quais a sequência inteira pode ser encontrada o 10 —nasequênciade GLP-1(1-37) e onde pelo menos um aminoácido terminal foi deletado.

As insulinas aciladas desta invenção podem também ser usadas - no tratamento de combinação junto com um antidiabético oral tal como uma tiazolidindiona, metformina e outra preparação farmacêutica diabética tipo 2 : 15 paratratamento oral.

Além disso, a insulina acilada desta invenção pode ser adminis- trada em combinação com um ou mais agentes antiobesidade ou agentes reguladores de apetite.

Em uma modalidade, esta invenção refere-se a uma preparação farmacêutica pulmonar compreendendo a insulina acilada desta invenção e ) adjuvantes e aditivos adequados tais como um ou mais agentes adequados para estabilização, preservação ou isotonia, por exemplo, íons de zinco, fe- nol, cresol, um parabeno, cloreto de sódio, glicerol, propilenoglicol ou mani- tol.

Deveria ser entendido que qualquer combinação adequada das insulinas aciladas com dieta e/ou exercício, um ou mais dos compostos su- pracitados e opcionalmente uma ou mais outras substâncias ativas são con- siderados estar dentro do escopo desta invenção.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS As propriedades de estabilidade e solubilidade da insulina são aspectos subjacentes importantes para a terapia de insulina atual. Esta in- venção é direcionada para estes assuntos fomecendo análogos de insulina acilada estáveis em que a acilação diminui a flexibilidade molecular e con- comitantemente reduz a tendência de fibrilação e limita ou modifica a zona de precipitação de pH.

As insulinas aciladas desta invenção são particularmente inten- cionadas para administração pulmonar ou oral devido à sua biodisponibilida- de relativamente alta comparada, por exemplo, com insulina humana e insu- lina humana acilada. Além disso, as insulinas aciladas terão uma atividade de insulina demorada.

Como mencionado acima, insulinas que são estabilizadas para o 10 degradação proteolítica são aqui designadas insulinas estabilizadas em pro- tease. As insulinas aciladas desta invenção são ditas insulinas estabilizadas em protease que foram aciladas como descrito aqui.

- As ditas insulinas estabilizadas em protease são derivadas dos compostos de insulina que aqui são designados insulinas parentais ou insu- “15 linasnãoestabilizadas em protease.

Em uma modalidade, uma insulina parental é selecionada do grupo que consiste em a) insulina humana; b) um análogo de insulina de in- sulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B28 é Pro, Asp, Lys, Leu, Val, ou Ala e o resíduo de aminoácido está na posição B29 é Lys ouProe opcionalmente o resíduo de aminoácido na posição B30 é deletado; oe c) um análogo de insulina que é insulina humana de des(B28-B30), insulina humana de des(B27) ou insulina humana de des(B30); d) um análogo de in- sulina da insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Glu ou Asp; e) um análogo deinsulinada insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição A21 é Gly e em que o análogo de insulina é também estendido para o térmi- no C com dois resíduos de arginina; f) um derivado de insulina em que o re- síduo de aminoácido na posição B30 é substituído com um metil éster de treonina; e g) um derivado de insulina em que à posição de Nº da lisina na posição B29 da insulina humana de des(B30), uma cadeia de tetradecanoíla é ligada. Cada um destes grupos é uma modalidade específica.

Em outra modalidade, uma insulina parental é selecionada do grupo que consiste em insulina humana; insulina humana de desB30; insuli- na humana de AspB28; insulina humana de AspB28, DesB30; insulina hu- mana de LysB3, GluB29; insulina humana de LysB28,ProB29; insulina hu- mana de GIyA21, ArgB31, ArgB32; e insulina humana de desB30, ArgB31, ArgB32. Mais especificamente, a insulina estabilizada em protease é uma molécula de insulina que tem duas ou mais mutações da cadeia A e/ou B com relação à insulina parental.

Surpreendentemente, foi descoberto que substituindo dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos dentro ou em proximida- o 10 de íntimaa dois ou mais sítios de protease em uma insulina com aminoáci- dos hidrófilos, um análogo de insulina (isto é, uma insulina estabilizada em protease) é obtido que é proteoliticamente mais estável comparado à insuli- - na parental.

Em um aspecto vasto, uma insulina estabilizada em protease é um análogo de insulina em que pelo menos dois aminoácidos hidrofóbicos S 15 foram substituídos com amincácidos hidrófilos com relação à insulina paren- tal, em que as substituições são dentro ou em proximidade íntima a dois ou mais sítios de clivagem de protease da insulina parental e em que tal análo- go de insulina opcionalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais.

Em outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease é e um análogo de insulina em que . o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp e/ou o aminoácido na posição A14 é Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly ou His e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ouAspe . o aminoácido na posição B24 é His e/ou o aminoácido na posição B25 é His e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr elou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Gly ou Arg e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly ou Asp; e que opcionalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais.

Em outra modalidade uma insulina estabilizada em protease é

| 20 um análogo que compreende as mutações B25H ou B25N em combinação com as mutações em B27, opcionalmente em combinação com outras muta- ções.

Em outra modalidade uma insulina estabilizada em protease é um análogo que compreende as mutações B25H ou B25N em combinação com as mutações em B27, opcionalmente em combinação com outras muta- ções.

As mutações na posição B27 podem ser, por exemplo, Glu ou Asp.

Estes análogos de insulina estabilizada em protease acilada compreendendo as mutações B25 e B27 têm as propriedades vantajosas. o 10 Em outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease é um análogo de insulina que compreende uma sequência de aminoácido da cadeia A da fórmula 1: - Xaança-Xaaaç1-Xaano-Gly-lle-Val-Glu-Gin-Cys-Cys-Xaaa45-Ser-lle- Cys-Xaan12-Xaasiz-Xaanu-Xaaaiis-Leu-Glu-Xaanis Tyr-Cys-Xaaço: “15 Fórmula(1) (SEQIDNo:1) e uma sequência de aminoácido de cadeia B da fórmula 2: Xaapç2-Xaagr1)-XaapgoXaag;-Xaap2-Xaaga-Xaapa-seu-Leu-Cys- Gly-Ser-Xaag;o-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaagie-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly- Xaagas-Xaagos-Xaanos-Xaago7-Xaagos-Xaaçoo-Xaapzo-Xaaps1-Xaag32 Fórmula (2)(SEQID No:2) e em que Xaaaç> está ausente ou Gly; Xaaa, está ausente ou Pro; Xaan, está ausente ou Pro; Xaan é independentemente selecionado de Thr e His; Xaan2 é independentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; Xaani3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Giu; Xaan é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin, His,Lys, Gly, Arg, Pro, Sere Glu; Xaaais é independentemente selecionado de Gln, Asp e Glu; Xaanis é independentemente selecionado de Asn, Lys e GIn;

' 21 Xaan, é independentemente selecionado de Asn e Gin; Xaag 2, está ausente ou Gly; Xaag,, está ausente ou Pro; Xaago está ausente ou Pro; 8 Xaag, está ausente ou independentemente selecionado de Phe e Glu; Xaago está ausente ou Val; Xaaps; está ausente ou independentemente selecionado de Asn e Gin; oe 10 Xaag, é independentemente selecionado de Gln e Glu; Xaagio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; - Xaagis É independentemente selecionado de Tyr, Asp, Glh, His, Arg e Glu; ] 15 Xaaras é independentemente selecionado de Phe e His; Xaapos é independentemente selecionado de Asn, Phe e His; Xaagsx está ausente ou independentemente selecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; Xaago; está ausente ou independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; eo Xaagog está ausente ou independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; Xaagax está ausente ou independentemente selecionado de Lys, Arg e Gin; e, preferiveimente, Xaaga;s está ausente ou independentemente selecionado de Lys e Gln; Xaagxo está ausente ou Thr; Xaags; está ausente ou Leu; Xaagsz está ausente ou Glu; o término C pode ser opcionalmente derivatizado como uma a- mida, em que a sequência de aminoácido de cadeia A e a sequência de aminoácido de cadeia B estão conectadas através de ligações em ponte

] 22 de dissuifeto entre as cisteínas na posição 7 da cadeia À e a cisteína na po- sição 7 da cadeia B, e entre a cisteíina na posição 20 da cadeia A e a cistei- na na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da Cadeia A estão conectadas por uma ligação em ponte de dissuifeto.

Em outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease é um análogo de insulina que compreende uma sequência de aminoácido de cadeia A da fórmula 3: Gly-lle-Va-Glu-Glin-Cys-Cys-Xaans-Ser-lle-Cys-Xaaç12-Xaani3- XaanXaaasleu-Glu-Xaasis-Tyr-Cys-Xaaso, o 10 Fórmula(3)(SEQIDNo:3) e uma sequência de aminoácido de cadeia B da fórmuia 4: Xaagi-Val-Xaags-Xaaga-seu-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaag,o-Leu-Val- - Glu-Ala-Leu-Xaagie-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaago4-Seu-Xaagae-Xaagor- Xaagos-Xaagos-Xadrso “15 Fórmula(49)(SEQIDNo:4) em que Xaaxs é independentemente selecionado de Thr e His; Xaan2 é independentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; Xaaç13 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; oe Xaa, é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaaus é independentemente selecionado de Gin, Asp e Glu; Xaaus é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; Xaans, é independentemente selecionado de Asn e Gln; Xaap, é independentemente selecionado de Phe e Glu; Xaag; é independentemente selecionado de Asn e Gin; Xaag, é independentemente selecionado de Gin e Glu; Xaagio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Giu; Xaagis é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gn, His, Arg e Glu;

' 23 Xaaga, é independentemente selecionado de Phe e His; Xaagas está ausente ou independentemente selecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; Xaaga; está ausente ou independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaagag está ausente ou independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; Xaagax está ausente ou independentemente selecionado de Lys, : Arg e Gln; e, preferivelmente, Xaazax está ausente ou independentemente oe 10 selecionado de Lys e Gin; Xaagzo está ausente ou Thr; o término C pode ser opcionalmente derivatizado como uma a- - mida; em que a sequência de aminoácido de cadeia A e a sequência ] 15 de aminoácido de cadeia B estão conectadas através de ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteínas na posição 7 da cadeia À e a cisteína na po- sição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia A e a cisteí- na na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ligação em ponte de dissuífeto.

Em outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease é oe um análogo de insulina em que Xaans é independentemente selecionado de Thr e His; Xaan2 é independentemente selecionado de Ser e Glu; Xaan; é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaan é independentemente selecionado de Asp, His, e Glu; Xaanms é independentemente selecionado de GIn e Glu; Xaans é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gln; Xaan: é independentemente selecionado de Asn e Gin; Xaap, é independentemente selecionado de Phe e Glu; Xaap; é independentemente selecionado de Asn e Gin;

' 24 Xaag, É independentemente selecionado de Gln e Glu; Xaagio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; Xaag1s é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, ArgeGlu; Xaapa, É independentemente selecionado de Phe e His; Xaagas É independentemente selecionado de Phe, Asn e His; Xaagas É independentemente selecionado de Tyr, Thr, Gly e Asp; Xaaga7 é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, oe 10 His,Lys, Gly, Arg e Glu; Xaagas é independentemente selecionado do Pro, Gly e Asp; Xaagax é independentemente selecionado de Lys e Gin; - Xaaguo está ausente ou Thr; o término C pode ser opcionalmente derivatizado como uma a- mida; em que a sequência de aminoácido de cadeia A e a sequência de aminoácido de cadeia B estão conectadas através de ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteína na po- Sição 7 da cadeia B, e entre a cisteina na posição 20 da cadeia À e a cisteí- nana posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da o Cadeia A estão conectados por uma ligação em ponte de dissulfeto.

Outras modalidades de insulinas estabilizadas em protease são mencionadas abaixo.

Uma "protease" ou uma "enzima de protease" é uma enzima di- —gestivaque degrada as proteinas e os peptídeos e que é encontrada em vá- rios tecidos do corpo humano, por exemplo, o estômago (pepsina), o lúmen intestinal (quimiotripsina, tripsina, elastase, carboxipeptidases, etc.) ou su- perfícies mucosas do trato Gl (aminopeptidases, carboxipeptidases, entero- peptidases, dipeptidii peptidases, endopeptidases, etc.), o figado (enzima degradante de insulina, catepsina D, etc), e em outros tecidos.

Um análogo de insulina proteoliticamente estável (também de- signado uma insulina estabilizada em protease) é aqui para ser entendido

' 25 como um análogo de insulina que é submetido à degradação mais lenta por uma ou mais proteases com relação à insulina humana. Em uma modalida- de, uma insulina estabilizada em protease é submetida à degradação mais lenta por uma ou mais proteases com relação à insulina parental. Em uma outramodalidade, uma insulina estabilizada em protease é estabilizada con- tra degradação por uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consis- te em: pepsina (tal como, por exemplo, as isoformas pepsina A, pepsina B, pepsina C e/ou pepsina F), quimiotripsina (tal como, por exemplo, as isofor- mas quimiotripsina A, quimiotripsina B e/ou quimiotripsina O), tripsina, Enzi- oe 10 malnsulino-Degradante (IDE), elastase (tal como, por exemplo, as isoformas elastase pancreática | e/ou II), carboxipeptidase (por exemplo, as isoformas carboxipeptidase A, carboxipeptidase A2 e/ou carboxipeptidase B), amino- - peptidase, catepsina D e outras enzimas presentes nos extratos intestinais derivados de rato, porco ou ser humano.

A5 Em uma modalidade, uma insulina estabilizada em profease é estabilizada contra degradação por uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em: quimiotripsina, tripsina, Enzima Insulino-Degradante (IDE), elastase, carboxipeptidases, aminopeptidases e catepsina D. Em uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease é estabilizada con- tradegradação por uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consis- oe te em: quimiotripsina, carboxipeptidases e IDE. Em ainda uma outra modali- dade, uma insulina estabilizada em protease é estabilizada contra degrada- ção por uma ou mais enzimas selecionadas de: quimiotripsina e carboxipep- tidases.

T% pode ser determinado como descrito nos Exemplos como uma medida da estabilidade proteolítica de uma insulina estabilizada em pro- tease para enzimas de protease tais como quimiotripsina, pepsina e/ou car- boxipeptidase A. Em uma modalidade da invenção, TV é aumentado com relação à insulina humana. Em uma outra modalidade, T% é aumentado com relaçãoãà insulina parental. Em ainda uma outra modalidade, T'4 é aumenta- do pelo menos 2 vezes com relação à insulina parental. Em ainda uma outra modalidade, T% é aumentado pelo menos 3 vezes com relação à insulina

Ú 26 parental.

Em ainda uma outra modalidade, T%4 é aumentado pelo menos 4 vezes com relação à insulina parental.

Em ainda uma outra modalidade, T%z é aumentado pelo menos 5 vezes com relação à insulina parental.

Em ainda uma outra modalidade, T% é aumentado pelo menos 10 vezes com relação àinsulinaparental.

Um modo altemativo de medir a estabilidade proteolítica é medir a estabilidade relativa a um comparador, por exemplo, insulina humana.

A estabilidade relativa é definida como TY/TY(comparador), onde TZ e Tié(comparador) são as meia-vidas do análogo e do comparador, respecti- e 10 vamente, no ensaio de degradação.

Na seção dos exemplos, a estabilidade relativa das insulinas selecionadas da invenção para uma mistura de enzima extraída de duodeno de ratos é dada (com relação à insulina humana como - também com relação a uma insulina resistente à protease sem acilação). Sitios de clivagem de protease (aqui também mencionados co- ' 15 mosiítios de protease) serão entendidos como resíduos de aminoácido que são reconhecidos através de proteases e/ou resíduos de aminoácido cuja ligação de peptídeo é clivada através das proteases.

Sítios de clivagem de protease podem ser determinados determinando a clivagem de "áreas quen- tes" por análise de HPLC, MS ou LC-MS e/ou por predição com base na es- pecificidade da enzima da enzima de protease para a qual o sítio de cliva- oe gem de protease é para ser determinado.

Uma pessoa versada na técnica saberá determinar os sítios de clivagem de protease, por exemplo, com base nas especificidades da enzima como, por exemplo, descrito em Handbook of Proteolytical Enzymes, 2º ed., Barrett, A.

J., Rawlings, N.

D., Woesner, J.F. editores, Elsevier Academic Press 2004. Por exemplo, quimiotripsina é prog- nosticada clivar ligações de peptídeo C-terminais para resíduos aromáticos (Trp, Tyr, Phe ou Leu), que não sejam seguidos por Pro.

Similarmente, trip- sina é prognosticada clivar ligações de peptídeo C-terminais para resíduos básicos Lys ou Arg que não sejam seguidos por Pro, elastase é prognostica- da clivarresíduos C-terminais para Ala, Val, Gly ou Ser e carboxipeptidase A removerá qualquer aminoácido C-terminal, mas não Arg, Lys ou Pro.

Enzima insulino-degradante (IDE) é prognosticada clivar as seguintes posições da insulina humana B9-10, B10-11, B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14 e A14-15.

O termo que substitui (a) aminoácido "dentro ou em proximidade íntima" a um sítio de clivagem de protease é aqui usado para indicar a subs- tituição de um aminoácido dentro ou em proximidade íntima a uma posição da insulina parental que foi determinada para ser um sítio de clivagem de protease. Em uma modalidade, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos den- tro ou em proximidade íntima a dois ou mais sítios de protease em uma insu- lina são substituídos, em que os ditos aminoácidos hidrofóbicos são substitu- oe 10 ídos com aminoácidos hidrófilos. Em uma outra modalidade, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos dentro de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrófitos. Em ainda uma outra - modalidade, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados próximos a dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoáci- “15 dos hidrófilos. Em ainda uma outra modalidade, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados dois aminoácidos longe de dois ou mais sítios de pro- tease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrófilos. Em ain- da uma outra modalidade, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados três aminoácidos longe de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrófilos. Em ainda uma outra modalida- oe de, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados até quatro aminoácidos longe de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrófilos. Em ainda uma outra modalidade, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados um, dois ou três aminoácidos longe ou dentrode dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrófilos. Em ainda uma outra modalidade, dois ou mais aminoácidos hidrofóbicos situados um ou dois aminoácidos longe ou dentro de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrófilos. Em ainda uma outra modalidade, dois ou mais ami- —noácidos hidrofóbicos situados próximos ou dentro de dois ou mais sítios de protease em uma insulina são substituídos com aminoácidos hidrófilos. Uma insulina estabilizada em protease pode ter uma carga líqui-

: 28 da que é diferente da carga líquida da insulina parental. Em uma modalida- de, a carga líquida de uma insulina estabilizada em protease é mais positiva que a carga líquida da insulina parental. Em uma modalidade, a carga líqui- da de uma insulina estabilizada em protease é mais negativa que a carga líquida da insulina parental. Em uma modalidade, a carga de rede posítiva média de uma insulina estabilizada em protease está entre 0,5 e 5 quando medida em uma solução aquosa. Em uma modalidade, a carga de rede posi- tiva média de uma insulina estabilizada em protease está entre 1 e 5. Em uma modalidade, a carga de rede posítiva média de uma insulina estabiliza- oe 10 daemprotease está entre 1 e 4. Em uma modalidade, a carga de rede posi- tiva média de uma insulina estabilizada em protease está entre 1 e 3. Em uma modalidade, a carga de rede positiva média de uma insulina estabiliza- - da em protease está entre 2 e 3. Em uma modalidade, a carga de rede ne- gativa média de uma insulina estabilizada em protease está entre -0,5 e -5 : 15 quando medida em uma solução aquosa. Em uma modalidade, a carga de rede negativa média de uma insulina estabilizada em protease está entre -1 e -5. Em uma modalidade, a carga de rede negativa média de uma insulina estabilizada em protease está entre -1 e 4. Em uma modalidade, a carga de rede negativa média de uma insulina estabilizada em protease está entre -1 e-3 Em uma modalidade, a carga de rede negativa média de uma insulina oe estabilizada em protease está entre -2 e -3.

Em uma modalidade, uma insulina estabilizada em protease po- de ter solubilidade aumentada com relação à insulina humana. Em uma ou- tra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade au- —mentada com relação à insulina humana em pH 3-9. Em ainda uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumen- tada com relação à insulina humana em pH 4-8,5. Em ainda uma outra mo- dalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com relação à insulina humana em pH 4-8, Em ainda uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com re- lação à insulina humana em pH 4,5-8. Em uma outra modalidade, uma insu- lina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com relação à in-

sulina humana em pH 5-8. Em ainda uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com relação à insulina humana em pH 5,5-8. Em uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com relação à insulina humana em pH68.

Em uma modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com relação à insulina humana em pH 2-4.

Em uma modalidade, uma insulina estabilizada em protease po- de ter solubilidade aumentada com relação à insulina parental. Em uma ou- oe 10 tra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade au- mentada com relação à insulina parental em pH 3-9. Em ainda uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumen- - tada com relação à insulina parental em pH 4-8,5. Em ainda uma outra mo- dalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada : 15 comrelação à insulina parental em pH 4-8. Em ainda uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com re- lação à insulina parental em pH 4,5-8. Em ainda uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com relação à insulina parental em pH 5-8. Em ainda uma outra modalidade, uma insulina estabilizadaem protease tem solubilidade aumentada com relação à insulina o parental em pH 5,5-8. Em uma outra modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com reação à insulina parental em PH 6-8.

Em uma modalidade, uma insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumentada com relação à insulina parental em pl 24.

Por "tem solubilidade aumentada em um pH dado" é significado que uma concentração maior de uma insulina estabilizada em protease dis- solve em uma solução aquosa ou de tampão no pH da solução com relação à insulina parental. Métodos para determinar se a insulina contida em uma solução é dissolvida são conhecidos na técnica, Em uma modalidade, a solução pode ser submetida à centrifu- gação durante 20 minutos a 30.000 g e depois a concentração de insulina no sobrenadante pode ser determinada por RP-HPLC.

Se esta concentração for igual dentro de erro experimental à concentração de insulina originalmente usada para fazer a composição, então a insulina é completamente solúvel na composição da invenção.

Em outra modalidade, a solubilidade da insulina em uma composição da invenção pode ser determinada simplesmente exa- minando por olho o recipiente dentro do qual a composição está contida.

A insulina é solúvel se a solução estiver clara ao olho e não importa particula- do ou é suspensa ou precipitada nas laterais/fundo do recipiente.

Uma insulina estabilizada em protease pode ter potência aparen- e 10 tee/ou biodisponibilidade aumentadas com relação à insulina parental quan- do comparada na medição.

Ensaios-padrão para medir a potência da insulina in vitro são - conhecidos à pessoa versada na técnica e são incluídos inter afia (1) ensai- os radiorreceptores de insulina em que a potência relativa de uma insulina é ' 15 definida como a razão de insulina para o análogo de insulina requerido para especificamente deslocar 50% da 2º |-insulina ligada aos receptores de insu- lina presentes nas membranas celulares, por exemplo, uma fração da mem- brana plasmática de fígado de rato; (2) ensaios de lipogênese, executados, por exemplo, com adipócitos de rato em que a potência de insulina relativa é definida como a razão de insulina para análogo de insulina requerido para oe alcançar 50% da conversão máxima de [3-º*H] glicose em material orgânico- extraível (isto é, lipídios); (3) ensaios de oxidação de glicose em células adi- posas isoladas em que a potência relativa do análogo de insulina é definida como a razão de insulina para o análogo de insulina alcançar 50% da con- versão máxima de glicose-1-["*C] em [CO]; (4) radioimuncensaio de insu- lina que pode determinar a imunogenicidade dos análogos de insulina me- dindo a efetividade pela qual a insulina ou um análogo de insulina compete com “**Linsulina ligando aos anticorpos anti-insulina específicos; e (5) outros ensaios que medem a ligação da insulina ou um análogo de insulina aos an- ticorpos nas amostras de plasma de sangue animal, tais como ensaios de ELISA que possuem anticorpos de insulina específicos.

Potência aparente in vivo aumentada pode ser estima-

da/visualizada por comparação dos perfis de glicose do sangue vs. tempo da insulina em questão com uma insulina similar sem mutações de estabiliza- ção de protease dadas em doses similares. A insulina da invenção terá efei- to redutor de glicose sanguínea aumentada com relação ao comparador.

Ensaios-padrão para medir a biodisponibilidade da insulina são conhecidos à pessoa versada na técnica e incluem inter alia medição das áreas relativas sob a curva (AUC) para a concentração da insulina em ques- tão administrada pulmonar ou oralmente e de modo intravenoso (i.v.) nas mesmas espécies. Quantificação das concentrações de insulina em amos- o 10 trasde sangue (plasma) pode ser feita usando, por exemplo, ensaios de an- ticorpo (ELISA) ou através de espectrometria de massa. Administração pul- monar pode ser executada através de vários meios. Por exemplo, insulinas - podem ser dosadas em ratos através de instilação a gotas, ou em porcos através de insufiação de pó seco.

' 15 Insulina estabilizada em protease pode ser opcionalmente anali- sada para outros sítios de protease que podem estar sujeitos a mais substi- tuições de um ou mais aminoácidos hidrofóbicos com aminoácidos hidrófilos. Uma insulina estabilizada em protease pode ser um análogo de insulina que tem pelo menos dois ácidos hidrófilos nos sítios de protease comparados à insulina parental, à primeira insulina modificada, e que tem também pelo oe menos uma substituição de aminoácido em um sítio de protease novo da primeira insulina modificada em que pelo menos um aminoácido hidrofóbico foi substituído com pelo menos um aminoácido hidrófilo. Por causa de conveniência, aqui segue os nomes de aminoáci- dos naturais codificáveis, com os códigos de três letras & códigos de uma letra usuais entre parêntese: Glicina (Gly & G), prolina (Pro & P), alanina (Ala & A), valina (Val & V), leucina (Leu & L), isoleucina (lle & |), metionina (Met & M), cisteína (Cys & CO), fenilalanina (Phe & FP), tirosina (Tyr & YO), triptofano (Trp & W), histidina (His & H), lisina (Lys & K), arginina (Arg & R), glutamina (GIn&O), asparagina (Asn & N), ácido glutâmico (Glu & E), ácido aspártico (Asp & D), serina (Ser & S) e treonina (Thr & T). Se, devido a erros de tipa- gem, houver desvios dos códigos comumente usados, os códigos comumen-

] 32 te usados aplicam-se. Os aminoácidos presentes nas insulinas desta inven- ção são, preferivelmente, aminoácidos que podem ser codificados por um ácido nucleico. Em uma modalidade, a insulina ou um análogo de insulina é substituído por Gly, Glu, Asp, His, GIn, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg e/ou Pro e/ou Gly, Glu, Asp, His, Gin, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg e/ou Pro é/são acrescenta- do(s) à insulina ou um análogo de insulina. Em uma modalidade, a insulina ou um análogo de insulina é substituído por Glu, Asp, His, Gin, Asn, Lys e/ou Arg e/ou Glu, Asp, His, GIn, Asn, Lys e/ou Arg é/são acrescentado(s) à insu- lina ou um análogo de insulina.

o 10 Em uma modalidade, uma insulina estabilizada em protease é selecionada do grupo que consiste nos compostos seguintes: insulina hu- mana de A14E, B25H, desB30; insulina humana de A14H, B25H, desB30; - insulina humana de A14E, B1E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B28D, desB30; insu- “15 linahumanade A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina humana de ASH, A14E, B25H, desB30; insulina humana de ASH, A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana de ASH, A14E, B1E, B25H, desB30; insulina humana de ASH, A14E, B1E, B25H, B27E, desB30; insulina humana de A8H, A14E, B1E, B16E, B25H, B27E, desB30; insulina oe humana de A8H, A14E, B16E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26D, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, desB30; insuli- na humana de A14E, B27E, desB30; insulina humana de A14E, B28D, desB30; insulina humana de A14E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, desB30; insulina hu- mana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30; insulina humana de A14D, B25H, desB30; insulina humana de B25N, B27E, desB30; insulina humana de ASH, B25N, B27E, desB30; insulina humana de A14E, B27E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B28E, desB30; insulina humana de B25H, B27E, desB30; insulina humana de B1E, B25H, B27E, desb30;. insulina humana de ASH, insulina humana de B1E, B25H, B27E,

desB30; insulina humana de ASH, B25H, B27E, desB30; insulina humana de B29N, B27D, desB30; insulina humana de ASH, B25N, B27D, desB30; insu- lina humana de B25H, B27D, desB309;. insulina humana de ASH, B25H, B27D, desB30; insulina humana de A(-1)P, A(O)P, A14E, B25H, desB30; in- sulina humana de A14E, B(C1)P, B(O0)P, B25H, desB30; insulina humana de AÇ1)P, A(O)P, A14E, B(-1)P, B(O)P, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B30T, B31L, B32E; insulina humana de A14E, B25H; insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B10P, B25H, desB30; insulina humana de AT4E, B10E, B25H, desB30; insulina e 10 humana de A14E, B4E, B25H, desB30; insulina humana de A14H, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14H, B10E, B25H, desB30; insulina humana de A13H, A14E, B10E, B25H, desB30; insulina humana de A13H, - A14E, B25H, desB30; insulihta humana de A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B24H, B25H, desB30; insulina humana : 15 de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, B28R, desB30; insulina humana de A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A18Q, A210, B3Q, B25H, B27E, desB30; insulina humana de A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30; insu- oe lina humana de A13H, A14E, B1E, B25H, desB30; insulina humana de A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13N, A14E, B1E, B25H, desB30; insulina humana de A(-2)G, A(1)P, A(O)P, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A1t4E, B(-2)G, B(-1)P, B(0)P, B25H, desB30; insulina humana de A(2)G, AC1)P, A(O)P, A1T4E, B(-2)G, B(1)P, B(O)P, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, B29K, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27H, desB30; insu- lina humana de A14E, A18Q0, B3Q, B25H, desB30; insulina humana de A1SE, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A12E, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A15E, A14E, B25H, desB30; insulina humana

' 34 de A13E, B25H, desB30; insulina humana de A12E, B25H, desB30; insulina humana de A15E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26D, B27E, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27R, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27N, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27D, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27Q, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27G, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27K, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27P, desB30; insulina oe 10 humana de A14E, B25H, B278, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27T, desB30; insulina humana de A13SR, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13N, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13D, A14E, - B25H, desB30; insulina humana de A13Q0, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13E, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13G, A14E, “15 B25H,desB30; insulina humana de A13H, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13K, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13P, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13S, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A13T, A14E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16R, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16D, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16Q, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16E, e B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14R, B25H, desB30; insulina humana de A14N, B25H, desB30; insulina humana de A14D, B25H, desB30; insulina humana de A14Q, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB30; insulina humana de A14G, B25H, desB30; insulina humana de A14H, B25H, desB30; insulina humana de A8H, B10D, B25H; e insulina humana de A8H, A14E, B10E, B25H, desB30 e esta modalidade pode, opcionalmente, compreender insuli- na humana de A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana de B25H,

desB30; e insulina humana de B25N, desB30. Em uma modalidade preferida, uma insulina estabilizada em pro- tease é selecionada do grupo que consiste nos compostos seguintes: insuli- na humana de A14E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16H,

' 35 B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16GE, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de B25H, desB30 e insulina humana de A14E, B25H, desB27, desB30.

Em uma modalidade preferida, uma insulina estabilizada em pro- tease é selecionada de quaisquer dos grupos acima que, além disso, está contendo a mutação de desB27.

Em uma modalidade preferida, uma insulina estabilizada em pro- tease é selecionada do grupo que consiste nos compostos seguintes: insuli- oe 10 na humana de A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B16E, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29R, desB30 e - insulina humana de B25H, desB27, desB30. Em uma modalidade, uma insulina estabilizada em protease é : 15 selecionada de quaisquer dos grupos acima que, além disso, está contendo as mutações seguintes na posição A21 e/ou B3 para melhorar a estabilidade química: A21G, desA21, B3Q ou B3G.

Em uma modalidade preferida, uma insulina estabilizada em pro- tease é selecionada das seguintes insulinas estabilizadas em protease: insu- lina humana de A14E, AZ21G, B25H, desB30; insulina humana de A14E, o A21G, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B16E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H,B26G,B27G,B28G, B29R, desB30; insulina humana de A21G, B25H, desB30 e A21G, B25N, desB30, e, preferivelmente, é selecionada das se- guintes insulinas estabilizadas em protease: insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B16E, B25H, desB30; insulina humanade AÍT4E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A21G, B25H, desB30 e insulina humana de A21G, B25N, desB30.

Em uma modalidade preferida, uma insulina estabilizada em pro- tease é acilada na posição B29, na posição de nitrogênio epsilo de B29K. Em uma modalidade preferida, uma insulina estabilizada em pro- tease é acilada na posição A1, na posição de nitrogênio alfa de A1.

Em uma modalidade preferida, uma insulina estabilizada em pro- tease é acilada na posição A1, na posição de nitrogênio alfa de A1, e a insu- lina estabilizada em protease está compreendendo a mutação de B29R.

As insulinas estabilizadas em protease são produzidas expres- sando uma sequência de DNA que codifica a insulina em questão em uma oe 10 célula hospedeira adequada através de técnica bem conhecida como descri- ta, por exemplo, na Patente US 6.500.645. A insulina estabilizada em prote- ase ou é expressada diretamente ou como uma molécula de precursor que . tem uma extensão N-terminal na cadeia B. Esta extensão N-terminal pode ter a função de aumentar o rendimento do produto diretamente expresso e ] 15 pode ser de até 15 resíduos de aminoácido. A extensão N-terminal será cli- ' vada in vitro após isolamento do caldo de cultura e terá um sitio de clivagem, portanto próximo a B1. Extensões N-terminais do tipo adequado nesta in- venção são descritas na Patente U. S. 5.395.022, e Patente europeia

765.395A. A sequência de polinucleotídeo que codifica para a insulina es- oe tabilizada em protease pode ser sinteticamente preparada através de méto- dos-padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosfoamidita descrito por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3: 801-805. De acordo com o método de fosfoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exem- plo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, duplexados e liga- dos para formar o construto de DNA sintética. Um modo correntemente pre- ferido de preparar o construto de DNA é através de reação em cadeia da po- limerase (PCR). As sequências de polinucleotídeo podem também ser de origem genômica misturada, de cDNA e sintética. Por exemplo, uma sequência ge- nômica ou de cDNA que codifica um peptídeo líder pode ser unida a uma sequência genômica ou de cDNA que codifica as cadeias A e B após a qual a sequência de DNA pode ser modificada em um sítio inserindo oligonucleo- tídeos sintéticos que codificam a sequência de aminoácido desejada para recombinação homóloga de acordo com procedimentos bem conhecidos ou preferivelmente gerando a sequência desejada por PCR usando oligonucleo- tídeos adequados.

O método recombinante tipicamente fará uso de um vetor que é capaz de replicar-se no micro-organismo selecionado ou célula hospedeira e que carrega uma sequência de polinucleotídeo que codifica a insulina estabi- o 10 lizada em protease.

O vetor recombinante pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômi- ca, a replicação deste é independente da replicação cromossômica, por e- - xemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromos- somo ou um cromossomo artificial.

O vetor pode conter quaisquer meios pa- , 15 ra assegurar autorreplicação.

Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) ao(s) qual(is) foi integrado.

Além disso, um só vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos con- têm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson, pode ser usado.

O vetor pode ser plasmídeos circulares lineares e ou fechados e pode preferivelmente conter um/uns elemento(s) que permi- te(m) integração estável do vetor no genoma da célula hospedeira ou repli- cação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

O vetor de expressão recombinante é capaz de replicar-se em levedura.

Exemplos de sequências que permitem o vetor a se replicar em levedura são genes de replicação de 2 um de plasmídeo de levedura REP 1- 3 e origem de replicação.

O vetor pode conter um ou mais marcadores selecionáveis que permitem seleção fácil das células transformadas.

Um marcador selecioná- veléum produto de gene que fomece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e outros.

Exemplos de marcado- res selecionáveis bacterianos são os genes dai de Bacillus subtilis ou Bacil-

' 38 lus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência antibiótica tal co- mo resistência à ampícilina, canamiícina, cioranfenicol ou de tetraciclina.

Marcadores selecionáveis para o uso em uma célula hospedeira fúngica fi- lamentosa incluem amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiitransfera- se), pyrG (orotidina-S'-fosfato descarboxilase) e trpoC (antranilato sintase). Marcadores adequados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Um marcador selecionável bem conhecido para levedura é o gene TP! de Schizosaccharomyces pompe (Russell (1985) Gene 40:125-130). oe 10 No vetor, a sequência de polinucleotídeo está operavelmente conectada a uma sequência de promotor adequada.

O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que mostre atividade transcricional na - célula hospedeira de escolha incluindo os promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtida de genes que codificam polipeptídeos extrace- í 15 lulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcri- ção em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do o- peron ac de E. cofi, gene da agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene da levansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyl), gene da amilase maltogênica de Bacillus stea- oe rofhermophilus (amyM), gene da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), e gene da penicilinase de Bacillus licheniformis (penP). Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição em uma célula hos- pedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos dos genes para TAKA da amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor mie- hei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, e alfa-amilase estável de ácido de Aspergillus niger.

Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são os promotores de Ma1, TPI, ADH ou PGK de Saccharomyces cerevisiae.

A sequência de polinucleotídeo que codifica a insulina estabili- zadaemprotease também tipicamente será operavelmente conectada a um terminador adequado.

Em levedura, um terminador adequado é o terminador de TPI (Alber et al. (1982) J.

Mol.

Appl.

Genet. 1:419-434).

Os procedimentos usados para ligar a sequência de polinucleo- tídeo que codifica a insulina estabilizada em protease, o promotor e o termi- nador, respectivamente, e os inserir em um vetor adequado que contém a informação necessária para replicação no hospedeiro selecionado, são bem S conhecidos às pessoas versadas na técnica. Será entendido que o vetor ou pode ser construído primeiro preparando um construto de DNA contendo a sequência de DNA inteira que codífica as insulinas desta invenção, e subse- quentemente inserindo este fragmento em um vetor de expressão adequado, ' ou sequencialmente inserindo os fragmentos de DNA contendo informação oe 10 genética aos elementos individuais (tais como o sinal, pró-peptídeo, peptídeo de conexão, cadeias A e B) seguido por ligação.

O vetor que compreende a sequência de polinucleotideo que - codifica a insulina estabilizada em protease é introduzido em uma célula hospedeira de forma que o vetor seja mantido como um cromossômico inte- “15 granteoucomo um vetor extracromossômico autorreplicativo. O termo "célu- la hospedeira" abrange qualquer progênie de uma célula parental que não seja idêntica à célula parental devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A célula hospedeira pode ser um micro-organismo unicelular, por exemplo, um procarioto, ou um micro-organismo não unicelular, por exem- plo, um eucarioto. Células unicelulares úteis são células bacterianas tais o como bactérias gram-positivas incluindo, mas não limitadas a, uma célula de Bacillus, célula de Strepfomyces, ou bactérias gram-negativas tais como E.

coli e Pseudomonas sp. Células eucariotas podem ser células mamíferas, de inseto, vegetais, ou fúngicas. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de levedura. O organismo de levedura pode ser qualquer orga- nismo de levedura adequado que, sob cultivo, produz quantidades grandes da insulina de cadeia simples da invenção. Exemplos de organismos de le- vedura adequados são cepas selecionadas das moedas metálicas de leve- dura Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces Kluyveri, Schizosaccha- romyces pombe, Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Píchia kKluyveri, Yarrowia li política, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., e Geo-

trichum fermentans.

A transformação das células de levedura pode ser realizada, por exemplo, por formação de protoplasto seguida por transformação de uma maneira conhecida per se. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar organismos de levedura. A insulina segregada, uma proporção significativa desta estará presente no meio em forma corretamente processada, pode ser restabelecida do meio através de procedimentos convencionais incluindo separando as células de levedura do meio através de centrifugação, filtração ou pegando o precursor o 10 deinsulina por uma matriz de permuta de íons ou por uma matriz de absor- ção de fase reversa, precipitando os componentes proteináceos do sobrena- dante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amônio, segui- - do por purificação por uma variedade de procedimentos cromatográficos, por exemplo, cromatografia de permuta de íons, cromatografia de afinidade, ou “15 outros.

Preferivelmente, as insulinas aciladas desta invenção são mo- nossubstituídas tendo apenas um grupo de acilação preso a um résíduo de amincácido lisina na molécula de insulina estabilizada em protease.

Em uma modalidade, a porção de acila ligada à insulina estabili- zadaemprotease tem a fórmula geral: oe Acy-AA1,-AA2,-AA3,- O.

em que n é 9 ou um número inteiro na faixa de 1a 3; mé O ou um número inteiro na faixa de 1 a 10; p é O ou um número inteiro na faixa de 1 a 10; insulina humana de Acy é um ácido graxo ou um diácido graxo que compreende de cerca de 8 a cerca de 24 átomos de carbono; insulina hu- mana de AA1 é um resíduo de aminoácido linear ou cíclico neutro; insulina humana de AA2 é um resíduo de amincácido acídico; insulina humana de AA3 é um resíduo de aminoácido neutro, contendo alquilenoglicol; a ordem pela qual AA1, AA2 e AA3 aparece na fórmula pode ser independentemente trocada; insulina humana de AAZ2 pode ocorrer várias vezes ao longo da fórmula (por exemplo, Acy-AA2-AA32-AA2-); insulina humana de AA2 pode ocorrer independentemente (= sendo diferente) várias vezes ao longo da fórmula (por exemplo, Acy-AA2-AA3z-AA2-); as conexões entre Acy, AA1I, AA?Z efou AA3 são ligações de amida (peptídeo) que, formalmente, podem ser obtidas por remoção de um átomo de hidrogênio ou um grupo hidroxila (água) de cada um de Acy, AA1, AAZ2 e AAS; e ligação à insulina estabilizada em protease pode ser da extremidade C-terminal de um resíduo de AA1, AA2Z, ou AA3 na porção de acila da fórmula (1) cu de uma das cadeias late- rais de um resíduo de AA2 presente na porção da fórmula (1). Em outra modalidade, a porção de acila ligada à insulina estabi- lizada em protease tem a fórmula geral Acy-AA1,-AA2,,-AA3,- (1), em que oe 10 AA é selecionado de Gly, D- ou L-Ala, BAla, ácido 4-aminobutírico, ácido 5- aminovalérico, ácido 6-amino-hexanoico, D- ou L-Glu-a-amida, D- ou 1-Glu- y-amida, D- ou L-Asp-a-amida, D- ou L-Asp-B-amida, ou um grupo de uma - das fórmulas:

PA HN .. HN,, um nm o

OA DA ácido tranexâmico (Tr) , o, om. HA “O. “O, o o OH ou OH dos quais um átomo de hidrogênio e/ou um grupo hidroxila o 15 foi(ram) removido(s) e em que q é 0, 1, 2, 3 ou 4 e, nesta modalidade, AA1 pode, alternativamente, ser ácido 7-amino-heptanoico ou ácido 8-amino- octanoico. Em outra modalidade, a porção de acila ligada à insulina estabi- lizada em protease tem a fórmula geral Acy-AA1,-AA2n-AA3,- (1), em que AA1 é como definido acima e AA2 é selecionado de L- ou D-Glu, L- ou D- Asp, L- ou D-homoGlu ou qualquer um dos seguintes: o o a OF OH Por Por ÂÃ Pi HN. OH HN oH q. OH as De ; o, ' Tt ;

o dor NU, mo HAN. ? ou O o O o o Ho “o Ho So =— Ho“o =—— Ho <——. o INC ou oo co o e HO to e — no Yo q ——> Or dos quais um átomo de hidrogênio e/ou um grupo hidroxila foi(ram) removido(s) e em que as setas indicam o ponto de ligação ao grupo amino de AA1, AA2, AAS, ou ao grupo amino da insulina estabilizada em protease.

- 5 Em um aspecto, o resíduo de aminoácido cíclico neutro desig- nado AA1 é um aminoácido que contém um anel carbocíclico saturado de 8 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo de nitrogênio, e preferi- velmente o anel é um anel de ciclo-hexano ou um anel de piperidina. Preferi- velmente, o peso molecular deste aminoácido cíclico neutro é na faixa de cercade 100 acerca de 200 Da. oe O resíduo de aminoácido acídico designado AAZ2 é um aminoá- cido com um peso molecular de até cerca de 200 Da compreendendo dois grupos de ácido carboxílico e um grupo de amino primário ou secundário. Alternativamente, resíduo de aminoácido acídico designado AA2 é um ami- — noácido com um peso molecular de até cerca de 250 Da compreendendo um grupo ácido carboxílico e um grupo sulfonamida primário ou secundário.

O resíduo de aminoácido contendo alquilenoglicol neutro desig- nado AA3 é uma porção de alquilenoglicol, opcionalmente uma porção de oligo ou polialquilenogiicol que contém uma funcionalidade de ácido carboxf- lico em uma extremidade e uma funcionalidade de grupo amino na outra ex- tremidade.

Aqui, o termo porção de alquilenoglicol abrange porções de mo- noalquitenoglicol como também porções de oligoalquilenogiicol. Mono e oli-

goalquilenoglicóis compreendem cadeias com base em mono e oligoetileno- glicol, com base em mono e oligopropilenoglicol, com base em mono e oli- gobutilenoglicol, isto é, cadeias que são com base na unidade de repetição - CHICHO-, -CHCH20H20- ou -CHCH2CH20H2O-. A porção de alquileno- glicol é monodispersa (com comprimento / peso molecular bem definido). Porções de moncatlquilenoglicol compreendem grupos diferentes contendo - OCH2CH20-, -OCHICH2CH20- ou OCH2CH2CH2CH20- em cada extremida- de. Como mencionado aqui, a ordem pela qual AA1, AA2 e AA3 a- o 10 parecem na porção de acila com a fórmula (1) (Acy-AA1,-AAZr-AA3p-) pode ser trocada independentemente. Por conseguinte, a fórmula Acy-AA1,- AALÇ-AA3,- também abrange porções como, por exemplo, a fórmula Acy- - AAZÇ-AAT1,-AA3,-, a fórmula Acy-AA2-AA3,-AA2-, e a fórmula Acy-AA3,- AA2Ç-AA17-, em que Acy, AAT, AA2, AA3, n, m e p são como definidos aqui. 5 Como mencionado aqui, as conexões entre as porções Acy, AA1, AAZ e/ou AA3 são obtidas formalmente através de formação da ligação de amida (ligação de peptídeo) (-CONH-) mediante remoção de água dos compostos parentais dos quais eles são formalmente construídos. Isto signi- fica que para adquirir a fórmula completa para a porção de acila com a fór- mula (Il) (Acy AA1,-AAZÇr AAS,, em que Acy, AA1, AAZ, AA3, n, m e p são oe como definidos aqui), um tem, formalmente, levar os compostos dados para os termos Acy, AAT, AA2 e AA3 e remover um hidrogênio efou hidroxila de- les e, formalmente, conectar os blocos de construção assim obtidos às ex- tremidades livres assim obtidas.

Exemplos não limitativos, específicos das porções de acila da fórmula Acy-AA1,-AA2Z7-AA3,- que podem estar presentes nos análogos de insulina acilada desta invenção são os seguintes:

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NN 4 RU AAA ANAA, o H i o À : À ON NAN IsAO SI, o wo não o a ' . Qualquer um dos exemplos específicos não limitativos acima de porções de acila da fórmula Acy-AA1,-AA2,,-AA3, - pode ser ligado a um grupo amino épsilo de um resíduo de lisina presente em qualquer um dos exemplos específicos não limitativos acima de análogos de insulina assim dando outros exemplos específicos de análogos de insulina acilada desta invenção.

Qualquer um dos exemplos específicos não limitativos acima de porções de acila da fórmula Acy-AA1,-AA26n-AA3,- pode ser ligado a um grupo alfa amino de um resíduo A1 presente em qualquer um dos exemplos específicos não limitativos acima de análogos de insulina assim dando ou- tros exemplos específicos de análogos de insulina acilada desta invenção. As insulinas estabilizadas em protease podem ser convertidas na insulina estabilizada em protease acilada desta invenção introduzindo o grupo desejado da fórmula Acy-AA1,-AA2r-AA3,- no resíduo de lisina ou em uma posição N-terminal no análogo de insulina. O grupo desejado da fórmu- la Acy-AA1,-AA2rn-AA3,- pode ser introduzido por qualquer método conveni- ente e muitos métodos são descritos na técnica anterior por tais reações.

Mais detalhes aparecem dos exemplos aqui. . Em uma modalidade, a presente invenção não diz respeito a compostos descritos em EP 07114387.9, isto é, insulinas aciladas em que ' uma porção de acila é ligada à insulina parental e em que a dita porção de acila compreende unidades de repetição de alquileno glicol que contêm ami- noácidos e em que há apenas um resíduo de lisina (K & Lys) na insulina pa- rental. Composições farmacêuticas As insulinas aciladas desta invenção podem ser administradas subcutânea, nasal, oral ou pulmonarmente.

Para administração subcutânea, as insulinas aciladas desta in- venção são formuladas analogamente com a formulação de insulinas conhe- cidas. Além disso, para administração subcutânea, as insulinas aciladas des- ta invenção são administradas analogamente com a administração de insuli- “15 nas conhecidas e, em geral, os médicos estão familiarizados com este pro- . cedimento.

Insulinas aciladas desta invenção podem ser administradas atra- vés de inalação em uma dose eficaz para aumentar os níveis de insulina circulantes e/ou diminuir os níveis de glicose circulantes. Tal administração pode ser eficaz para tratar distúrbios tais como diabetes ou hiperglicemia. Alcançar doses eficazes de insulina requer administração de uma dose ina- lada de mais que cerca de 0,5 ug/kg a cerca de 50 ug/kg de insulinas acila- das desta invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser de- terminada por um médico treinado que levará em conta fatores incluindo ní- velde insulina, níveis de glicose do sangue, a condição física do paciente, o estado pulmonar do paciente ou similares.

As insulinas aciladas desta invenção podem ser liberadas atra- vés de inalação para alcançar absorção lenta e/ou liberação sistêmica redu- zida das mesmas. Dispositivos de inalação diferentes tipicamente fornecem farmacocinética similar quando tamanhos de partícula similares e níveis si- milares de deposição pulmonar são comparados.

As insulinas aciladas desta invenção podem ser liberadas por qualquer de uma variedade de dispositivos de inalação conhecidos na técni- . ca por administração de um agente terapêutico através de inalação.

Estes dispositivos incluem inaladores de dose medida, nebulizadores, geradores , de pó seco, pulverizadores e similares.

Preferivelmente, as insulinas acila- dassão liberadas por um inalador de pó seco ou um pulverizador.

Há várias características desejáveis de um dispositivo de inalação para administrar insulinas aciladas desta invenção.

Por exemplo, liberação pelo dispositivo de inalação é vantajosamente seguro, reprodutível, e preciso.

O dispositivo de inalação deveria liberar partículas pequenas ou aerossóis, por exemplo, me- — nos que cerca de 10 um, por exemplo, cerca de 1-5 um, para respirabilidade boa.

Alguns exemplos específicos de dispositivos de inalação comercialmen- te disponíveis adequados para a prática desta invenção são TurbohalerO& (Astra), Rotahaler& (Glaxo), DiskusO& (Glaxo), inalador Spiros& (Dura), dis- positivos comercializados por Inhale Therapeutics, AERxO (Aradigm), o ne- “15 bulizador Ultravent& (Mallinckrodt), o nebulizador de Arcon 1I& (Marquest . Medical Products), o inalador de dose medida Ventolin& (Glaxo), o inalador de pó Spinhaler& (Fisons) ou similares.

Como aqueles versados na técnica reconhecerão, a formulação de insulinas aciladas desta invenção, a quantidade da formulação liberada e aduração de administração de uma dose simples dependem do tipo de dis- positivo de inalação empregado.

Para alguns sistemas de liberação de ae- rossol, tais como nebulizadores, a frequência de administração e o compri- mento de tempo para o que o sistema é ativado dependerão principalmente da concentração de insulinas aciladas no aerossol.

Por exemplo, períodos mais curtos de administração podem ser usados em concentrações mais altas de insulinas aciladas na solução de nebulizador.

Dispositivos tais como inaladores de dose medida podem produzir concentrações de aerossol mais altas, e podem ser operados durante períodos mais curtos para liberarem a quantidade desejada das insulinas aciladas.

Dispositivos tais como inalado- res de pó liberam agente ativo até uma carga dada de agente ser expelida do dispositivo.

Neste tipo de inalador, a quantidade de insulinas aciladas de insulina desta invenção em uma quantidade dada do pó determina a dose liberada em uma administração simples. . O tamanho de partícula das insulinas aciladas desta invenção na formulação liberada pelo dispositivo de inalação é crítico com respeito à ha- ' bilidade da insulina para torná-la dentro dos pulmões, e preferivelmente nas vias aéreas inferiores ou alvéolos. Preferivelmente, as insulinas aciladas deste íon da invenção são formuladas de forma que pelo menos cerca de 10% das insulinas aciladas liberados sejam depositados no pulmão, preferi- velmente cerca de 10 a cerca de 20%, ou mais. É conhecido que a eficiência máxima de deposição pulmonar para seres humanos respirando pela boca é —obtidacom tamanhos de partícula de cerca de 2 um a cerca de 3 um. Quan- do tamanhos de partícula forem acima de cerca de 5 um, deposição pulmo- nar diminui substancialmente. Tamanhos de partícula abaixo de cerca de 1 um fazem a deposição pulmonar diminuir, e fica difícil de liberar partículas com massa suficiente a ser terapeuticamente efetiva. Desse modo, partícu- “15 lasdasinsulinas aciladas liberadas por inalação têm um tamanho de partícu- - la preferivelmente menos que cerca de 10 um, mais preferivelmente na faixa de cerca de 1 um a cerca de 5 um. A formulação das insulinas aciladas é selecionada para render o tamanho de partícula desejado no dispositivo de inalação escolhido.

Vantajosamente para administração como um pó seco uma insu- lina acilada desta invenção é preparada em uma forma particulada com um tamanho de partícula de menos que cerca de 10 um, preferivelmente cerca de 1 a cerca de 5 um. O tamanho de partícula preferido é eficaz para libera- ção aos alvéolos do pulmão do paciente. Preferivelmente, o pó seco é gran- demente composto de partículas produzidas de forma que uma maior parte das partículas tenha um tamanho na faixa desejada. Vantajosamente, pelo menos cerca de 50% do pó seco é feito de partículas que têm um diâmetro menos que cerca de 10 um. Tais formulações podem ser alcançadas por secagem por atomização, moagem, ou condensação de ponto crítico de uma solução que contém a insulina acilada desta invenção e outros ingredientes desejados. Outros métodos também adequados para gerar partículas úteis na invenção atual são conhecidos na técnica.

As partículas são usualmente separadas de uma formulação de : pó seco em um recipiente e depois transportadas para dentro do pulmão de um paciente por meio de uma corrente de ar de veículo. Tipicamente, em Ú inaladores de pó seco atuais, a força para separar o sólido é fornecida so- mente pela inalação do paciente. Em outro tipo de inalador, fluxo de ar gera- do pela inalação do paciente ativa um motor propulsor que desaglomera as partículas.

Formulações de insulinas aciladas desta invenção para adminis- tração de um inalador de pó seco tipicamente incluem um pó seco finamente dividido que contém o derivado, mas o pó pode também incluir um agente de volume, veículo, excipiente, outro aditivo ou similares. Aditivos podem ser incluídos em uma formulação de pó seco de insulina acilada, por exemplo, para diluir o pó como requerido para liberação do inalador de pó particular, para facilitar o processamento da formulação, para fornecer propriedades de “15 pó vantajosas à formulação, para facilitar a dispersão do pó do dispositivo de ' inalação, para estabilizar a formulação (por exemplo, antioxidantes ou tam- pões), para fornecer gosto à formulação ou similares. Vantajosamente, o aditivo não adversamente afeta as vias aéreas do paciente. A insulina acila- da pode ser misturada com um aditivo em um nível molecular ou a formula- ção sólida pode incluir partículas da insulina acilada misturadas ou revesti- das em partículas do aditivo. Aditivos típicos incluem mono, di, e polissacari- deos; alcoóis do açúcar e outros polióis, tais como, por exemplo, lactose, glicose, rafinose, melezitose, lactitol, maltitol, trealose, sucrose, manitol, a- mido ou combinações dos mesmos; tensoativos, tais como sorbitóis, difosfa- tidil colina, ou lecitina; ou similares. Tipicamente um aditivo, tal como um a- gente de volume, está presente em uma quantidade eficaz para um propósi- to descrito acima, frequentemente em cerca de 50% a cerca de 90% em pe- so da formulação. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formula- ção de uma proteína tal como proteína de análogo de insulina podem tam- bém ser incluídos na formulação. Uma pulverização incluindo as insulinas aciladas desta invenção pode ser produzida forçando uma suspensão ou uma solução da insulina acilada através de um bico sob pressão. O tamanho e a configuração do bi- . Co, a pressão aplicada, e a taxa de alimentação líquida podem ser selecio- nadas para alcançar a saída e o tamanho de partícula desejados. Uma ele- : tropulverização pode ser produzida, por exemplo, por um campo elétrico comrelaçãoa uma alimentação capilar ou de bico. Vantajosamente, partícu- las do conjugado de insulina liberadas por um pulverizador têm um tamanho de partícula menos que cerca de 10 um, preferivelmente na faixa de cerca de 1 um a cerca de 5 um.

Formulações de insulinas aciladas desta invenção adequadas paraousocom um pulverizador tipicamente incluirá as insulinas aciladas em uma solução aquosa a uma concentração de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg da insulina acilada por ml! de solução. Dependendo da insulina acilada selecionada e outros fatores conhecidos ao aconselhador médico, o limite superior pode ser inferior, por exemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, “15 120,100 ou 50 mg da insulina acilada por ml! de solução. A formulação pode . incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonici- dade, um conservante, um tensoativo, e, preferivelmente, zinco. A formula- ção pode também incluir um excipiente ou agente para estabilização da insu- lina acilada, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína de volu- me, ou um carboidrato. Proteínas de volume útil em formular conjugados de insulina incluem albumina, protamina ou similares. Carboidratos típicos úteis em formular a insulina acilada incluem sucrose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similares. A formulação de insulinas aciladas pode também incluir um tensoativo que pode reduzir ou impedir agregação induzida por superfi- ciedo conjugado de insulina causada por atomização da solução formando um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tais como ésteres de polioxietileno de ácido graxo e alcoóis , e ésteres de polió- xi-etileno sorbitol de ácido graxo. Quantidades em geral variarão entre cerca de 0,001 e cerca de 4% em peso da formulação. Composições farmacêuticas contendo uma insulina acilada des- ta invenção podem também ser administradas parenteralmente em pacien- tes em necessidade de tal tratamento. Administração parenteral pode ser executada através de injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por . meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa semelhante à caneta. AlI- ternativamente, administração parenteral pode ser executada por meio de ' uma bomba de infusão.

Composições injetáveis das insulinas aciladas desta invenção podem ser preparadas usando as técnicas convencionais da indústria far- macêutica que envolve dissolver e misturar os ingredientes conforme apro- priado para dar o produto final desejado. Desse modo, de acordo com um procedimento, uma insulina acilada é dissolvida em uma quantidade de água queé um pouco menos que o volume final da composição a ser preparada. Zinco, um agente isotônico, um conservante e/ou um tampão é/são adicio- nado(s) como requerido e o valor de pH da solução é ajustado - se necessá- rio - usando um ácido, por exemplo, ácido clorídrico, ou uma base, por e- xemplo, hidróxido de sódio aquoso como necessário. Por fim, o volume da “15 solução é ajustado com água para dar a concentração desejada dos ingredi- : entes.

Em uma outra modalidade desta invenção, o tampão é selecio- nado do grupo que consiste em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogeno fosfato de sódio, hidrogeno fosfato de dissódio, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)amino- metano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumári- co, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas dos mesmos. Cada um des- tes tampões específicos constitui uma modalidade alternativa desta inven- ção.

Em uma outra modalidade desta invenção, a formulação tam- bém compreende um conservante farmaceuticamente aceitável que pode ser selecionado do grupo que consiste em fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, 2-fenoxietanol, p- hidroxibenzoato de butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tio- merosal, bronopol, ácido benzoico, imidureia, cloro-hexidina, deidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clor- fenesina (3-(4-clorofenóxi)-1,2-propanodiol) ou misturas dos mesmos. Em uma outra modalidade desta invenção, o conservante está presente em uma . concentração de cerca de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma outra modalidade desta invenção, o conservante está presente em uma concentração de cerca Ú de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma outra modalidade desta invenção, o con- servante está presente em uma concentração de cerca de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma outra modalidade desta invenção, o conservante está pre- sente em uma concentração de cerca de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um destes conservantes específicos constitui uma modalidade alternativa desta invenção. O uso de um conservante nas composições farmacêuticas é bem conhecido à pessoa versada. Para conveniência, referência é feita a Re- mington: The Science and Practice of Pharmacy, 19º edição, 1995.

Em uma outra modalidade desta invenção, a formulação tam- bém compreende um agente isotônico que pode ser selecionado do grupo que consiste em um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar ou álcool “15 do açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisi- . na, isoleucina, ácido aspártico, triptofano ou treonina), um alditol (por exem- plo glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglico!), 1,3-propanodiol ou 1,3-butanodiol), polietilenoglicol (por exemplo, PEG400) ou misturas dos mesmos. Qualquer açúcar tal como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glu- canos solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sucrose, trealose, dextrana, pululana, dex- trina, ciclodextrina, amido solúvel, hidroxietil amido e carboximetilcelulose-Na podem ser usados. Em uma modalidade, o aditivo de açúcar é sucrose. ÁI- cool do açúcar é definido como um C4-C8 hidrocarboneto que tem pelo me- nosum grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma modalidade, o aditivo de álcool do açúcar é manitol. Os açúcares ou alcoóis do açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há nenhum limite fixo à quantidade usada, contanto que o açúcar ou o álcool do açúcar seja solúvel na preparação líquida e não adversamente realize os efeitos de estabiliza- ção alcançados usando os métodos desta invenção. Em uma modalidade, a concentração de açúcar ou de álcool do açúcar é entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma outra modalidade desta invenção, o agente . isotônico está presente em uma concentração de cerca de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Em uma outra modalidade desta invenção, o agente isotônico está ' presente em uma concentração de cerca de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma outramodalidade desta invenção, o agente isotônico está presente em uma concentração de cerca de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Em uma outra modalidade desta invenção, o agente isotônico está presente em uma concentração de cerca de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um destes agentes isotônicos específi- cos constitui uma modalidade alternativa desta invenção. O uso de um agen- teisotônico nas composições farmacêuticas é bem conhecido à pessoa ver- sada. Para conveniência referência é feita à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19º edição, 1995.

Agentes isotônicos típicos são cloreto de sódio, manitol, dimetil sulfona e glicerol e conservantes típicos são fenol, m-cresol, p- “15 —hidroxibenzoato de metila e álcool benzílico.

: Exemplos de tampões adequados são acetato de sódio, glicilgli- cina, HEPES ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico) e fosfato de sódio.

Uma composição para administração nasal de umas insulinas —aciladas desta invenção pode, por exemplo, ser preparada como descrito na Patente europeia No. 272.097.

Preparações orais contendo uma insulina estabilizada em prote- ase acilada desta invenção podem ser preparadas de uma maneira conheci- da per se. Um modo de fazer preparações contendo uma insulina estabiliza- daemprotease acilada desta invenção que pode convenientemente ser ad- ministrada oralmente é usar um procedimento que é análogo ao processo descrito em WO 2008/145728. Outro modo de preparar preparações orais contendo uma insuli- na estabilizada em protease acilada desta invenção é preparar um líquido livre de água ou composições farmacêuticas semissólidas compreendendo uma insulina estabilizada em protease acilada desta invenção (a), pelo me- nos um solvente orgânico polar (b) para a insulina estabilizada em protease acilada, pelo menos um componente lipofílico (c), e opcionalmente um ten- soativo (d) e/ou pelo menos um componente hidrófilo sólido (e). Isto poderia ser na forma de uma solução oleosa.

Alternativamente, o pelo menos um componente hidrófilo sólido (d) é pelo menos um polímero hidrófilo sólido.

Alternativamente, a composição farmacêutica que compreende pelo menos um componente hidrófilo sólido é livre de tensoativo, em que o dito tensoati- vo tem um valor de HLB que é pelo menos 8, isto é, não há nenhum tensoa- tivo tendo um valor de HLB que seja pelo menos 8, presente na composição.

Por exemplo, uma composição farmacêutica contendo uma insu- lina estabilizada em protease acilada pode ser uma solução oleosa livre de água e/ou uma composição farmacêutica de SEDDS ou SMEDDS.

Alternativamente, a dita composição farmacêutica é um sistema de liberação de fármaco autoemulsificante (aqui designado SEDDS). É acreditado que a solubilidade alta de uma insulina estabilizada “15 em protease acilada no solvente orgânico polar da composição farmacêutica : que resulta na quantidade total relativamente baixa de solvente orgânico po- lar necessário na dita composição farmacêutica possa melhorar a compatibi- lidade da composição farmacêutica com materiais de cápsula.

A composição farmacêutica pode conter um veículo que com- preende um componente lipofílico, um tensoativo e um solvente orgânico polar e opcionalmente um componente hidrófilo sólido (e). Se houver um componente hidrófilo sólido presente, pelo menos um dos componentes se- lecionados do grupo que consiste em um componente lipofílico e um tensoa- tivo é líquido ou semissólido.

Se houver um componente hidrófilo líquido (e) presente, o componente lipofílico e o tensoativo podem ser sólidos.

Por e- xemplo, o tensoativo é líquido ou semissólido.

Em um aspecto, um compo- nente hidrófilo sólido está presente.

Como aqui usado, o termo "veículo" refere-se ao veículo farma- ceuticamente aceitável que transporta o polipeptídeo solúvel em água tera- — peuticamente ativo ao longo da membrana biológica ou dentro de um fluido biológico.

O veículo compreende um componente lipofílico e um solvente orgânico polar, e opcionalmente um componente hidrófilo sólido e/ou um tensoativo. O veículo é capaz de produzir uma emulsão ou estruturas coloi- dais espontaneamente, quando colocado em contato, disperso, ou diluído, com um meio aquoso, por exemplo, água, fluidos contendo água, ou meios in vivo em mamíferos, tais como os sucos gástricos do trato gastrointestinal. As estruturas coloidais podem ser partículas sólidas ou líquidas incluindo domínios, gotículas, micelas, micelas misturadas, vesículas e nanopartícu- las.

Por exemplo, quando a composição farmacêutica for colocada em contato com um meio aquoso, uma emulsão, tal como um microemulsão, espontaneamente se forma. Em particular, uma emulsão ou microemulsão forma no trato digestivo de um mamífero quando o sistema de liberação for ingerido oralmente. Além dos componentes acima mencionados, o pré- concentrado espontaneamente dispersável pode também opcionalmente conter outros excipientes, tais como tampões, ajustadores de pH, estabili- “15 zantese outros adjuvantes reconhecidos por alguém de habilidade usual na BR técnica ser apropriado para um tal uso farmacêutico.

O termo "livre de água" como aqui usado refere-se a uma com- posição à qual nenhuma água é adicionada durante a preparação da com- posição farmacêutica. A insulina estabilizada em protease acilada e/ou um ou mais excipientes na composição farmacêutica podem ter quantidades pequenas de água ligadas aos mesmos antes de preparar uma composição farmacêutica. Por exemplo, uma composição farmacêutica livre de água compreende menos de 10% em p/p de água, por exemplo, menos de 5% em p/p de água, por exemplo, menos de 4% em p/p de água, por exemplo, me- nosde3% em p/p de água, por exemplo, menos de 2% em p/p de água, por exemplo, menos de 1% em p/p de água.

Como aqui usado, o termo "pré-concentrado de microemulsão" significa uma composição que espontaneamente forma um microemulsão, por exemplo, uma microemulsão de óleo-em-água, em um meio aquoso, por exemplo, em água ou nos fluidos gastrointestinais após aplicação oral. A composição autoemulsífica sob diluição em um meio aquoso, por exemplo, em uma diluição de 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 ou mais alta.

Devido à solubilidade alta da insulina estabilizada em protease acilada, a quantidade total de solvente orgânico polar no SEDDS pode ser mantida baixa, que por um lado melhora a compatibilidade da formulação com os materiais de cápsula e por outro lado dá mais espaço de projeto para acomposição.

A composição farmacêutica compreende um componente lipofíli- co, e um componente polar orgânico. Os componentes do sistema de libera- ção de fármaco podem estar presentes em qualquer quantidade relativa. Por exemplo, o sistema de liberação de fármaco pode compreende até 40% em pesode componente orgânico polar da composição do veículo, por exemplo, menos que 30%, 20%, 15% ou 10%. Em outro aspecto, o sistema de libera- ção de fármaco compreende de 5% a 40% em peso de solvente orgânico polar da composição total do veículo. Em ainda um outro aspecto, o sistema de liberação de fármaco compreende de 10% a 30% em peso de solvente “15 orgânico polar da composição total do veículo. . A composição farmacêutica pode ser na forma de uma composi- ção de não pó, isto é, em uma forma semissólida ou líquida.

Como aqui usado, o termo "líquido" significa um componente ou uma composição que está em um estado líquido em temperatura ambiente ("TA"), e tendo um ponto de fusão de, por exemplo, abaixo de 20ºC. Como aqui usado temperatura ambiente (TA) significa cerca de 20-25ºC.

Como aqui usado, o termo "semissólido" diz respeito a um com- ponente ou uma composição que não são líquidos em temperatura ambien- te, por exemplo, tendo um ponto de fusão entre temperatura ambiente e cer- cade40ºC. Um semissólido pode ter as qualidades e/ou os atributos de am- bos os estados sólidos e líquidos de substância. Como usado aqui, o termo "solidificar" é intencionado tornar sólido ou semissólido.

Exemplos de composições semissólidas ou líquidas são compo- sições farmacêuticas na forma de, por exemplo, óleos, soluções, SMEDDS líquido ou semissólido e SEDDS líquido ou semissólido.

"SMEDDS" (sendo uma abreviação para sistemas de liberação de fármaco automicroemulsificantes) é aqui definido como misturas isotrópi-

cas de um componente hidrófilo, um tensoativo, opcionalmente um cotenso- ativo e um fármaco que rapidamente forma um óleo sob microemulsão de água quando exposto a meios aquosos sob condições de agitação suave ou motilidade digestiva que seriam encontradas no trato Gl.

"SEDDS" (sendo uma abreviação para sistemas de liberação de fármaco autoemulsificantes) é aqui definido como misturas de um compo- nente hidrófilo, um tensoativo, opcionalmente um cotensoativo e um fármaco que espontaneamente formam um óleo bom sob emulsão de água quando exposto a meios aquosos sob condições de agitação suave ou motilidade digestiva que seriam encontradas no trato Gl.

Como aqui usado, o termo "microemulsão" refere-se a uma dis- persão coloidal transparente ou translúcida, ligeiramente opaca, opalescen- te, não opaca ou substancialmente não opaca que é formada espontânea ou substancialmente de forma espontânea quando seus componentes são co- “15 locados em contato com um meio aquoso.

. Como aqui usado, o termo "emulsão" refere-se a uma dispersão coloidal ligeiramente opaca, opalescente ou opaca que é formada espontãâ- nea ou substancialmente de forma espontânea quando seus componentes são colocados em contato com um meio aquoso.

Uma microemulsão é termodinamicamente estável e contém partículas ou domínios homogeneamente dispersos, por exemplo, de um estado sólido ou líquido (por exemplo, partículas de lipídio líquidas ou gotícu- las), de um diâmetro médio de menos que cerca de 500 nm, por exemplo, menos que cerca de 400 nm ou menos de 300 nm, menos de 200 nm, me- —nosde100nm,e maior que cerca de 2-4 nm quando medida por técnicas de difração de luz padrão, por exemplo, usando um MALVERN ZETASIZER Nano ZS. O termo "tamanho de domínio" como aqui usado refere-se às uni- dades de difração repetitivas e pode ser medido, por exemplo, por raios X de ângulo pequeno. Em um aspecto, o tamanho do domínio é menor que 400 nm,em outro aspecto, menor que 300 nm e em ainda outro aspecto, menor que 200 nm.

Como aqui usado o termo "espontaneamente dispersável" quan-

do referir-se a um pré-concentrado refere-se a uma composição que é capaz de produzir estruturas coloidais tais como microemulsões, emulsões e outros sistemas coloidais, quando diluídos com um meio aquoso quando são colo- cados os componentes da composição em contato com um meio aquoso, por exemplo, agitação simples à mão durante um período curto de tempo, por exemplo, durante dez segundos.

Em um aspecto, um concentrado es- pontaneamente dispersável de acordo com a invenção é um SEDDS ou SMEDDS.

Como aqui usado, o termo "componente lipofílico" refere-se a uma substância, um material ou um ingrediente que são mais compatíveis com óleo que com água.

Um material com propriedades lipofílicas é insolú- vel ou quase insolúvel em água, mas é facilmente solúvel em óleo ou outros solventes não polares.

O termo "componente lipofílico" pode compreender uma ou mais substâncias lipofílicas.

Componentes lipofílicos múltiplos po- “15 dem constituir na fase lipofílica do pré-concentrado espontaneamente dis- ' persável e forma o aspecto de óleo, por exemplo, em uma emulsão de óleo- em-água ou microemulsão.

À temperatura ambiente, o componente lipofílico e a fase lipofílica do pré-concentrado espontaneamente dispersável podem ser sólido, semissólidos ou líquidos.

Por exemplo, um componente lipofílico sólido pode existir como uma pasta, forma granular, pó ou floco.

Se mais de um excipiente compreender o componente lipofílico, o componente lipofílico pode ser uma mistura de líquidos, sólidos ou ambos.

Em um aspecto, o componente lipofílico está presente na com- posição farmacêutica em uma quantidade de pelo menos 20% em p/p.

Em um outro aspecto, o componente lipofílico está presente em uma quantidade de pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em p/p.

Por exemplo, o componente lipofílico pode estar presente de cerca de 5% a cerca de 90% em peso da composição, por exemplo, de cerca de 15% a cerca de 60%, por exemplo, de cerca de 20% a cerca de 40%. Exem- —plosde componentes lipofílicos sólidos, isto é, componentes lipofílicos que são sólidos ou semissólidos em temperatura ambiente, incluem, mas não são limitados a, os seguintes:

1. misturas de mono, di e triglicerídeos, tais como coco- glicerídeos hidrogenados (ponto de fusão (p.f.) de cerca de 33,5ºC a cerca de 37ºC], comercialmente-disponíveis como WITEPSOL HI5 da Sasol Ale- manha (Witten, Alemanha); exemplos de triglicerídeos de ácido graxo por exemplo, triglicerídeos de C10-C22 ácido graxo incluem óleos naturais e hi- drogenados, tais como óleos vegetais;

2. ésteres, tais como estearato de propileno glicol (PG), comer- cialmente disponíveis como MONOSTEOL (p.f. de cerca de 33ºC a cerca de 36ºC) de Gattefosse Corp. (Paramus, NJ); estearato de palmito de dietileno —glicol, comercialmente disponível como HYDRINE (p.f. de cerca de 44,5ºC a cerca de 48,5ºC) de Gattefosse Corp;

3. glicerídeos saturados poliglicosilados, tais como ésteres de PEG-6 de óleo de semente de palma/palma hidrogenado (p.f. de cerca de 30,5ºC a cerca de 38ºC), comercialmente disponíveis como LABRAFIL “15 M2130CS de Gattefosse Corp. ou Gelucire 33/01; : 4. alcoóis graxos, tais como álcool de miristila (p.f. de cerca de 39ºC), comercialmente disponível como LANETTE 14 de Cognis Corp. (Cin- cinnati, OH); ésteres de ácidos graxos com alcoóis graxos, por exemplo, palmitato de cetila (p.f. de cerca de 50ºC); monolaurato de isosorbida, por exemplo, comercialmente disponível sob o nome comercial ARLAMOL ISML de Unigema (New Castle, Delaware), por exemplo, tendo um ponto de fusão de cerca de 43ºC;

5. Éter de PEG-álcool graxo, incluindo éter de cetila de polioxieti- leno (2), por exemplo comercialmente disponível como BRIJ 52 de Unigema, tendo um ponto de fusão de cerca de 33ºC, ou polioxietileno (2) éter de es- tearila, por exemplo comercialmente disponível como BRIJ 72 de Unigema tendo um ponto de fusão de cerca de 43ºC;

6. ésteres de sorbitano, por exemplo, ésteres de sorbitano de á- cido graxo, por exemplo monopalmitato de sorbitano ou monoestearato de —sorbitano, por exemplo, comercialmente disponíveis como SPAN 40 ou SPAN 60 de Unigema e tendo pontos de fusão de cerca de 43ºC a 48ºC ou cerca de 53ºC a 57ºC e 41ºC a 54ºC, respectivamente; e

7. ésteres de glicerila de ácido mono-C6-C14-graxo. Estes são obtidos esterificando glicerol com óleo vegetal seguido por destilação mole- cular. Monoglicerídeos incluem, mas não são limitados a, monoglicerídeos simétricos (isto é, B-monoglicerídeos) como também assimétricos (a - mono- —glicerídeos). Eles também incluem ambos glicerídeos uniformes (em que o constituinte de ácido graxo é primariamente composto de um ácido graxo simples) como também glicerídeos misturados (isto é, em que o constituinte de ácido graxo é composto de vários ácidos graxos). O constituinte de ácido graxo pode incluir ácidos graxos saturados e insaturados tendo um compri- mento de cadeia de, por exemplo, C8-C14. Particularmente adequado é mo- nolaurato de glicerila, por exemplo, comercialmente disponível como IMWI- TOR 312 de Sasol North America (Houston, TX), (p.f. de cerca de 56ºC - 60ºC); monodicocoato de glicerila, comercialmente disponível como IMWI- TOR 928 de Sasol (p.f. de cerca de 33ºC - 37ºC); citrato de monoglicerila, “15 comercialmente disponível como IMWITOR 370, (p.f. de cerca de 59 a cerca : de 63ºC); ou monoestearato de glicerila, por exemplo, comercialmente dis- ponível como IMWITOR 900 de Sasol (p.f. de cerca de 56ºC -61ºC); ou mo- noestearato autoemulsificante de glicerol, por exemplo, comercialmente dis- ponível como IMWITOR 960 de Sasol (p.f. de cerca de 56ºC -61ºC).

Exemplos de componentes lipofílicos líquidos, isto é, componen- tes lipofílicos que são líquidos em temperatura ambiente incluem, mas não são limitados a, os seguintes:

1. misturas de mono, di e triglicerídeos, tais como mono e digli- cerídeos de cadeia média, caprilato/caprato de glicerila, comercialmente dis- —poníveiscomo CAPMUL MCM de Abitec Corp. (Colombo, OH);

2. éster de glicerila de ácido mono ou digraxo, por exemplo de C6-C18, por exemplo C6-C16 por exemplo C8-C10, por exemplo C8, ácidos graxos, ou derivados acetilados dos mesmos, por exemplo MYVACET 9-45 ou 9-08 de Eastman Chemicals (Kingsport, TN) ou IMWITOR 308 ou 312 de Sasol,

3. éster de propileno glicol de ácido mono ou digraxo, por exem- plo de C8-C20, por exemplo C8-C12, ácidos graxos, por exemplo LAURO-

GLICOL 90, SEFSOL 218, ou CAPRYOL 90 ou CAPMUL PG-8 (mesmo co- mo caprilato de propileno glicol) de Abitec Corp;

4. óleos, tais como óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de amêndoa, óleo de amendoim, óleo de palma, óleo de germe de trigo, óleo de milho, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de semente de algodão, óleo de so- ja, azeite de oliva e óleo mineral;

5. ácidos ou alcoóis graxos, por exemplo C8-C20, saturado ou mono ou di-insaturado, por exemplo ácido oleico, álcool de oleila, ácido lino- leico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido caproico, tetradecanol, dodecanol, decanol;,

6. triglicerídeos de ácido graxo de cadeia média, por exemplo C8-C12, por exemplo MIGLYOL 812, ou triglicerídeos de ácido graxo de ca- deia longa, por exemplo, óleos vegetais;

7. óleos vegetais etoxilados transesterificados, por exemplo, co- “15 mercialmente disponíveis como LABRAFIL M2125 CS de Gattefosse Corp; R 8. compostos estereficados de ácido graxo e álcool primário, por exemplo C8-C20, ácidos graxos e alcoóis C2-C3, por exemplo linoleato de etila, por exemplo comercialmente disponível como NIKKOL VF-E de Nikko Chemicals (Tóquio, Japão), butirato de etila, ácido oleico de caprilato de eti- la,oleatode etila, miristato de isopropila e caprilato de etila;

9. óleos essenciais, ou qualquer um de uma classe de óleos vo- láteis que dão às plantas seus odores característicos, tais como óleo de hor- telã, óleo de cravo-da-índia, óleo limão e óleo de hortelã;

10. frações ou constituintes de óleos essenciais, tais como men- tol, carvacrol e timol;

11. óleos sintéticos, tais como triacetina, tributirina;

12. citrato de trietila, trietil citrato de acetila, citrato de tributila, tributil citrato de acetila;

13. poliglicerol ésteres de ácido graxo , por exemplo, mono- oleato de diglicerila, por exemplo DGMO-C, DGMO-90, DGDO de Nikko Chemicals; e

14. ésteres de sorbitano, por exemplo ésteres de sorbitano de ácido graxo, por exemplo, monolaurato de sorbitano, por exemplo comerci- almente disponível como SPAN 20 de Unigema.

15. Fosfolipídeos, por exemplo, Alquil-O-fosfolipídeos, Ácidos Diacil Fosfatídicos, Diacil Fosfatidil Colinas, Diacil Fosfatidil Etanolaminas, Diacil Fosfatidil Gliceróisó, Ácidos Di-O-Alquil Fosfatídicos, L-alfa- lisofosfatidilcolinas (LPC), L-alfa-lisofosfatidiletanolaminas (LPE), L-alfa- lisofosfatidilglicerol (LPG), L-alfa-lisofosfatidilinositóis (LPI), ácidos L-alfa- fosfatídicos (PA), L-alfa-Fosfatidilcolinas (PC), L-alfa-Fosfatidiletanolaminas (PE), L-alfa-Fosfatidilgliceróis (PG), Cardiolipin (CL), L-alfa-Fosfatidilinositóis (P)), L-alfa-Fosfatidilserinas (PS), Liso-Fosfatidilcolinas, Liso- Fosfatidilgliceróis, sn-Glicerofosforilcolinas comercialmente disponíveis de LARODAN, ou fosfolipídeo de soja (Lipoid S100) comercialmente disponível de Lipoid GmbH.

Por exemplo, o componente lipofílico é um ou mais selecionados “15 dogrupo que consiste em mono, di e triglicerídeos. Em um aspecto, o com- . ponente lipofílico é um ou mais selecionados do grupo que consiste em mo- no e diglicerídeos. Em ainda um outro aspecto, o componente lipofílico é Capmul MCM ou Capmul PG-8. Em um ainda outro aspecto, o componente lipofílico é Capmul PG-8.

O termo "solvente orgânico polar" refere-se em um aspecto aqui a um "solvente orgânico prótico polar" que é um hidrófilo, solvente contendo carbono miscível em água que contém uma ligação O-H ou N-H, ou misturas dos mesmos. A polaridade é refletida na constante dielétrica ou no momento de dippolo de um solvente. A polaridade de um solvente determina que tipo de compostos é capaz de dissolver e com que outros solventes ou compos- tos líquidos é miscível. Tipicamente, solventes orgânicos polares dissolvem melhor compostos polares e solventes não polares dissolivem melhor com- postos não polares: "semelhante dissolve semelhante". Compostos forte- mente polares como de sais inorgânicos (por exemplo, cloreto de sódio) dis- —solvem-se apenas em solventes muito polares.

Solventes orgânicos polares podem ser selecionados de solven- te em que a insulina estabilizada em protease acilada mostra solubilidade melhor nos ditos solventes orgânicos polares que em outros solventes.

Consequentemente, a insulina estabilizada em protease acilada pode ser dissolvida a um grau alto em um solvente orgânico polar livre de água farmaceuticamente aceitável tal como propileno glicol, glicerol e PEGZ200. Por exemplo, pelo menos 20% (p/p) da insulina estabilizada em protease acilada dissolvem-se em um solvente orgânico polar livre de água farmaceuticamente aceitável, isto é, ao adicionar 20% em p/p da insulina estabilizada em protease acilada ao solvente orgânico polar, uma solução clara é obtida. Em outro aspecto, pelo menos 25%, 30%, 40% ou 50% (p/p) da insulina estabilizada em protease acilada dissolvem-se em um solvente orgânico polar livre de água farmaceuticamente aceitável.

O solvente orgânico polar pode desse modo referir-se a um sol- vente contendo carbono miscível em água, hidrófilo, que contém uma liga- ção O-H ou N-H, ou misturas das mesmas. A polaridade é refletida na cons- “15 tante dielétrica ou no momento de dippolo de um solvente. A polaridade de . um solvente determina que tipo de compostos ele é capaz de dissolver e com que outros solventes ou compostos líquidos é miscível. Tipicamente, solventes polares dissolvem melhor compostos polares e solventes não po- lares dissolvem melhor compostos não polares: "semelhante dissolve seme- lhante". Compostos fortemente polares como de sais inorgânicos (por exem- plo, cloreto de sódio) dissolvem-se apenas em solventes muito polares.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é um solvente que tem uma constante dielétrica acima de 20, preferivelmente na faixa de 20-50. Exemplos de solvente orgânico polar diferente são listados na Tabela 1 junto comágua como uma referência.

Tabela 1. Constantes dielétricas (permissividade estática) dos solventes orgânicos polares selecionados e água como uma referência (Handbook of Chemistry and Physics, CMC Press, constantes dielétricas são medidas em campos elétricos estáticos ou em frequências relativamente baixas onde nenhum relaxamento ocorre).

Água (20,1 (293,2)) 80,1 Propanotriol [Glicerol] (20,1 (293,2)) 46,53 Etanodiol [Etileno glico!] (20,1 (293,2)) 41,4 1,3-propanodiol (20,1(293,2)) 35,1 Metano!l (20,1 (293,2)) 33,0 1,4-butanodiol (20,1 (293,2)) 31,9 1,3-butanodio! (20,1 (293,2)) 28,8 1,2-propanodiol — [propileno glicol]l (30,1 (303,2)) 27,5 Etanol (20,1 (293,2)) 25,3 Isopropanol [2-propano]l, álcool isopropílico] : 20,1 (293,2 20,18 No presente contexto, 1,2-propanodiol e propileno glicol são u- sados alternadamente. No presente contexto, propanotriol e glicerol são u- sados alternadamente. No presente contexto, etanodiol e etileno glicol são usados alternadamente.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em polióis. O termo "poliol" como aqui usado refere-se aos compostos químicos contendo grupos hidroxila múltiplos.

Em um aspecto, o solvente orgânico polar é selecionado do gru- po que consiste em dióis e trióis. O termo "diol" como aqui usado refere-se aos compostos químicos contendo dois grupos hidroxila. O termo "triol" co- mo aqui usado refere-se aos compostos químicos contendo três grupos hi- droxila.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em glicerol (propanotriol), etanodiol (etileno glicol), 1,3- propanodiol, metanol, 1,4-butanodiol, 1,3-butanodiol, propileno glicol (1,2- propanodiol), etanol e isopropanol, ou misturas dos mesmos. Em uma alter-

nativa, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em propileno glicol e glicerol.

Glicerol é até mesmo biocompatível em dosagens altas e tem uma capacidade de solvente alta para a insulina estabilizada em protease acilada.

Alternativamente, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em propileno glicol e etileno glicol.

Este solvente or- gânico polar tem uma baixa viscosidade, é biocompatível em doses modera- das, e tem capacidade de solvente orgânica polar muito alta para a insulina estabilizada em protease acilada.

O solvente orgânico polar deve preferivelmente ser de pureza al- tacom um conteúdo baixo de, por exemplo, aldeídos, cetonas e outras impu- rezas reduzindo para minimizar a deterioração química do polipeptídeo solu- bilizado devido à, por exemplo, reação de Maillard.

Moléculas de desconta- minante como glíicil glicina e etileno diamina podem ser acrescentadas às formulações compreendendo solvente(s) orgânico(s) polar(es) tal(is) como “15 polióis para reduzir a deterioração do polipeptídeo enquanto que antioxidan- . tes podem ser adicionados para reduzir a taxa de formação de outras impu- rezas redutoras.

Em um aspecto da invenção, o solvente orgânico polar está pre- sente na composição farmacêutica em uma quantidade de 1-50 % em p/p, porexemplo, 540 % em p/p, por exemplo, 5-30 % em p/p.

Alternativamente, o solvente polar orgânico está presente em uma quantidade de 10-30 % em P/p, por exemplo, 10-25 % em p/p, por exemplo, em uma quantidade de cer- ca de 20 % em p/p ou cerca de 15 % em p/p.

Por exemplo, o solvente polar orgânico polar é propileno glicol e está presente na composição farmacêutica em uma quantidade de 1-50 % em p/p, por exemplo, 5-40 % em p/p, por exemplo, 10-30 % em p/p, por e- xemplo, 10-25 % em p/p, por exemplo, 10-20 % em p/p, por exemplo, cerca de 20 % em p/p ou cerca de 15 % em p/p.

Por exemplo, o solvente orgânico polar é selecionado do grupo que consiste em glicerol, propileno glicol e misturas dos mesmos.

Um componente hidrófilo sólido pode ser acrescentado à com- posição farmacêutica a fim de tornar ou ajudar a tornar a composição farma-

cêutica sólida ou semissólida em temperatura ambiente. O componente hi- drófilo pode compreender mais de um excipiente. Se mais de um excipiente compreender o componente hidrófilo, o componente hidrófilo pode ser uma mistura de líquidos, sólidos ou ambos.

Quando um componente hidrófilo sólido estiver presente, a com- posição farmacêutica pode compreender de cerca de 1% a cerca de 25% em peso de componente hidrófilo sólido, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 20%, por exemplo, de cerca de 3% a cerca de 15%, por exemplo de cer- ca de 4% a cerca de 10%.

Um exemplo de um componente hidrófilo é PEG que é o políme- ro de óxido de etileno que se conforma em geral à fórmula HOCH2CH2),OH em que n correlata com o peso molecular médio do polímero.

Os tipos de PEG úteis na preparação das composições farma- cêuticas podem ser categorizados por seu estado de substância, isto é, se a “15 substância existe em uma forma sólida ou líquida em temperatura ambiente : e pressão. Como aqui usado, "PEG sólido" refere-se a PEG que tem um pe- so molecular de modo que a substância está em um estado sólido em tem- peratura ambiente e pressão. Por exemplo, PEG que tem um peso molecular que varia entre 1.000 e 10.000 é um PEG sólido. Tais PEGs incluem, mas não são limitados a PEGR 1000, PEG 1550, PEG 2000, PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ou PEG 8000. Particularmente PEGs sólidos úteis são a- queles tendo um peso molecular entre 1.450 e 8.000. Especialmente útil co- mo um PEG sólido é PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, deriva- dos dos mesmos e misturas dos mesmos. PEGs de vários pesos molecula- res são comercialmente disponíveis como a série CARBOWAX SENTRY de Dow Chemicals (Danbury, CT). Além disso, PEGs sólidos têm uma estrutura cristalina, ou matriz polimérica, óxido de polietileno ("PEO") que tem uma estrutura idêntica a PEGR, mas para comprimento de cadeia e grupos de extremidade são também adequados. Vários graus de PEO estão comerci- —almente disponíveis como POLYOX de Dow Chemicals. PEO, por exemplo, tem um peso molecular que varia de cerca de 100.000 a 7.000.000. O com- ponente hidrófilo pode compreender PEG, PEO, e qualquer combinação do antecedente.

Os componentes hidrófilos podem opcionalmente incluir um al- canol inferior, por exemplo, etanol. Embora o uso de etanol não seja essen- cial, ele pode melhorar a solubilidade do polipeptídeo no veículo, melhorar ascaracterísticas de armazenamento e/ou reduzir o risco de precipitação de fármaco.

Em um aspecto exemplar alternativo, o componente hidrófilo do veículo consiste em um componente hidrófilo simples, por exemplo, um PEG sólido, por exemplo, PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000 e PEG 8000. Neste aspecto exemplar, a fase hidrófila do componente de microemulsão consiste em uma substância hidrófila simples. Por exemplo, se o veículo compreen- desse PEG 3350, o veículo não conteria nenhuma outra substância hidrófila, por exemplo, alcanóis inferiores (alquila inferior que é C1-C4), tal como eta- nol; ou água.

“5 Em ainda outro aspecto exemplar alternativo, o componente hi- . drófilo do veículo consiste em uma mistura de PEGs sólidos. Por exemplo, o componente hidrófilo compreende PEG 1450, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, derivados dos mesmos e qualquer combinação e misturas dos mes- mos.

Em um aspecto, o veículo compreende um ou mais tensoativos, isto é, opcionalmente uma mistura de tensoativos; ou agentes ativos de su- perfície que reduzem a tensão interfacial. O tensoativo é, por exemplo, não iônico, iônico ou anfotérico. Tensoativos podem ser misturas complexas con- tendo produtos laterais ou produtos de partida não reagidos envolvidos na preparação dos mesmos, por exemplo, tensoativos feitos através de polio- xietilação pode conter outro produto lateral, por exemplo, PEG. O tensoativo ou os tensoativos têm um valor de equilíbrio hidrófilo-lipofílico (HLB) que é pelo menos 8. Por exemplo, o tensoativo pode ter um valor de HLB médio de 8-30, por exemplo, 12-30, 12-20 ou 13-15. Os tensoativos podem ser líqui- dos, semissólidos ou sólidos em natureza.

O termo "tensoativo" como aqui usado refere-se a qualquer substância, em particular um detergente que pode adsorver em superfícies e interfaces, como líquido para ar, líquido para líquido, líquido para recipiente ou líquido para qualquer sólido.

O tensoativo pode ser selecionado de um detergente, tal como óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicosilados, monoglicerídeos acetilados, ésteres de sorbitano de ácido graxo, polissorba- to, tal como polissorbato-20, poloxâmeros, tais como poloxâmero 188 e po- loxâmero 407, ésteres de polioxietileno sorbitano de ácido graxo , derivados de polioxietileno tais como derivados alquilados e alcoxilados (Tweens, por exemplo Tween-20, ou Tween-80), monoglicerídeos ou derivados de etoxila- dos dos mesmos, diglicerídeos ou derivados de polioxietileno dos mesmos, glicerol, ácido cólico ou derivados dos mesmos, lecitinas, alcoóis e fosfolipí- deos, glicerofosfolipídeos (lecitinas, cefalinas, fosfatidil serina), gliceroglicoli- pídeos (galactopiransoide), esfingofosfolipídeos (esfingomielina), e esfingo- glicolipídeos (ceramidas, gangliosidas), DSS (docusato de sódio, registro de CAS no [577-11-7]), docusato de cálcio, registro de CAS no [128-49-44]), do- “15 —cusato de potássio, registro de CAS no [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de . sódio ou lauril sulfato de sódio), ácido dipalmitoil fosfatídico, caprilato de só- dio, ácidos biliares e sais dos mesmos e glicina ou conjugados taurinos, áci- do ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, —glicocoltto de sódio N-hexadecil-N N-dimetil-3-amônio-1- propanossulfonato, tensoativos monovalentes (alquilaril-sulfonatos) aniôni- cos, palmitoil lisofosfatidil-L-serina, lisofosfolipídeos (por exemplo, ésteres de 1-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina ou treonina), alquila, alcoxila (éster de alquila), derivados de alcóxi (éter de alquila) de lisofosfati- dila e fosfatidilcolinas, por exemplo, derivados lauroila e de miristoíla de liso- fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo cabeça polar que são colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, e DODAC positivamente carregado, DOTMA, DCP, BI- SHOP, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina, tensoativos zwiteriônicos (por exemplo N-alquil-N N-dimetilamônio-1-propano-sulfonatos, 3-colamido- 1-propildime-tilamônio-1-propanossulfonato, dodecilfosfocolina, lisofosfatidil- colina de miristoila, lisolecitina de ovo de galinha), tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário) (por exemplo, brometo de cetil-trimetilamônio,

cloreto de cetilpiridínio), tensoativos não iônicos (por exemplo, glicosídeos de alquila como B-D-glucopiranosídeo de dodecila, B-D-maltosídeo de dode- cila, B-D-glucopirano-sídeo de tetradecila, B-D-maltosídeo de decila, B-D- maltosídeo de dodecila, B-D-maltosídeo de tetradecila, B-D-maltosídeo de hexadecila, B-D-maltotriosídeo de decila, B-D-maltotriosídeo de dodecila, B- D-maltotriosídeo de tetradecila, B-D-maltotriosídeo de hexadecila, n-dodecil- sucrose, n-decil-sucrose, etoxilatos de álcool graxo (por exemplo, éteres de polioxietileno de alquila como monotridecil éter de octaetileno glicol, mono- dodecil éter de octaetileno glicol, monotetradecil éter de octaetileno glicol), copolímeros de bloco como copolímeros de bloco de polietileno óxido/polipropileno-óxido (Pluronics/Tetronics, Triton X-100) tensoativos al- canoatos de sorbitano etoxilados (por exemplo, Tween-40, Tween-80, Brij- 35), derivados de ácido fusídico (por exemplo, tauro-di-hidrofusidato de só- dio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e sais dos mesmos C8-C20 (por “15 exemplo, ácido oleico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados - N-acilados de lisina, arginina ou histidina, ou derivados acilados de cadeia lateral de lisina ou arginina, derivados N-acilados de dipeptídeos compreen- dendo qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou acídico, derivados N-acilados de um tripeptídeo compreendendo qualquer combinação de um aminoácido neutro e dois aminoácidos carrega- dos, ou o tensoativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imida- zolina, ou misturas dos mesmos.

Exemplos de tensoativos sólidos incluem, mas não são limitados a.

1. produtos de reação de um óleo de rícino natural ou hidroge- nado e óxido de etileno. O óleo de rícino natural ou hidrogenado pode ser reagido com óxido de etileno em uma razão molar de cerca de 1:35 a cerca de 1:60, com remoção opcional do componente de PEG dos produtos. Vá- rios tais tensoativos estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a série de CREMOPHOR de BASF Corp. (Mt. Olive, NJ), tal como CREMOPHOR RH 40 que é óleo de rícino hidrogenado de PEGA40 que tem um valor de sa- ponificação de cerca de 50 a 60, um valor de ácido de menos que cerca de um, um conteúdo de água, isto é, Fischer, menos que cerca de 2%, um npºº de cerca de 1,453-1,457, e um HLB de cerca de 14-16;

2. ésteres de polioxietileno de ácido graxo que incluem ésteres de polioxietileno de ácido esteárico , tais como a série de MYRJ de Unigema porexemplo, MYRJ 53 que tem um p.f. de cerca de 47ºC.

Compostos particulares na série de MYRJ são, por exemplo, MYRJ 53 que tem um p.f. de cerca de 47ºC e PEG-40-estearato disponível como MYRJ 52;

3. derivados de sorbitano que incluem a série de TWEEN de U- nigema, por exemplo, TWEEN 60;

4. copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno e copolimeros de bloco ou poloxâmeros, por exemplo, Pluronic F127, Pluronic F68 de BASF;

5. alquil éteres de polioxietileno, por exemplo, tal como éteres de “15 polioxietileno glicol de C12-C18 alcoóis, por exemplo, 10- ou 20-cetil éter de . polioxila ou 23-lauril éter de polioxila, ou 20-oleil éter, ou 10-, 20- ou 100- estearil éter de polioxila, tão conhecidos e comercialmente disponíveis quan- to à série de BRIJ de Unigema. Produtos particularmente úteis da série de BRIJ são BRIJ 58; BRIJ 76; BRIJ 78; BRIJ 35, isto é, 23 lauril éter de polioxi- la;eBRIJ 98, isto é, 20 oleil éter de polioxila. Estes produtos têm um p.f. en- tre cerca de 32ºC a cerca de 43ºC;

6. ésteres de tocoferila de PEG de ácido succínico solúveis em água disponíveis de Eastman Chemical Co. com um p.f. de cerca de 36ºC, por exemplo, TPGS, por exemplo, TPGS de vitamina E.

7. esterol éteres de PEG tendo, por exemplo, de 5-35 unidades [CH2-CH,-O], por exemplo, 20-30 unidades, por exemplo, SOLULAN C24 (Choleth-24 e Cetheth-24) de Chemron (Paso Robles, CA); produtos simila- res que podem também ser usados são aqueles que são conhecidos e co- mercialmente disponíveis como NIKKOL BPS-30 (fitosterol 30 polietoxilado) eNIKKOL BPSH-25 (fitoestanol 25 polietoxilado) de Nikko Chemicals;

8. poliglicerol ésteres de ácido graxo , por exemplo, tendo uma faixa de unidades de glicerol de 4-10, ou 4, 6 ou 10 unidades de glicerol. Por exemplo, particularmente adequado é monoestearato de deca-/hexa- Itetraglicerila, por exemplo, DECAGLYN, HEXAGLYN e TETRAGLYN de Nikko Chemicals;

9. alquileno poliol éter ou éster, por exemplo, glicerídeos de lau- roil macrogol-32 e/ou glicerídeos de estearoil macrogol-32 que são respecti- vamente GELUCIRE 44/14 e GELUCIRE 50/13;

10. monoésteres de polioxietileno de C10 a C22 saturado, tal como C18 substituído, por exemplo, ácido hidróxi graxo; por exemplo éster de PEG de ácido 12 hidróxi esteárico, por exemplo de PEG cerca de por e- —xemplo 600-900, por exemplo 660 Dáltons MW, por exemplo, SOLUTOL HS de BASF (Ludwigshafen, 20 Alemanha). De acordo com um folheto técni- co de BASF, MEF 151E (1986), SOLUTOL HS 15 compreende cerca de 70% em peso de 12-hidroxiestearato polietoxilado e cerca de 30% em peso de componente de polietileno glicol não esterificado. Ele tem um valor de “15 hidrogenação de 90 a 110, um valor de saponificação de 53 a 63, um valor ' ácido máximo 1, e um conteúdo de água máximo de 0,5% em peso;

11. éteres de polioxietileno-polioxipropileno-alquila, por exemplo éteres de polioxietileno-polioxipropileno de C12 a C18 alcoóis, por exemplo polioxietilen-20-polioxipropileno-4-cetiléter que está comercialmente disponí- velcomo NIKKOL PBC 34 de Nikko Chemicals;

12. diestearatos polietoxilados, por exemplo, comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais ATLAS G 1821 de Unigema e NIK- KOCDS-6000P de Nikko Chemicals; e

13. lecitinas, por exemplo, fosfolipídeo de feijão de soja, por e- xemplo comercialmente disponível como LIPOID S75 de Lipoid GmbH (Lud- wigshafen, Alemanha) ou fosfolipídeo de ovo, comercialmente disponível como FOSFOLIPON 90 de Nattermann Phospholipid (Cologne, Alemanha).

Exemplos de tensoativos líquidos incluem, mas não são limita- dos a, derivados de sorbitano tais como TWEEN 20, TWEEN 40 e TWEEN 80, SYNPERONIC L4A4, e éter de polioxil de 10-oleíla, todos disponíveis de Unigema, e tensoativos contendo polioxietileno, por exemplo, glicerídeos caprílicos/cápricos de PEG-8 (por exemplo, Labrasol disponível de Gattefos-

se).

A composição da invenção pode compreender de cerca de 0% a cerca de 95% em peso de tensoativo, por exemplo, de cerca de 5% a cerca de 80% em peso, por exemplo, cerca de 10% a cerca de 70% em peso, por exemplo, de cerca de 20% a cerca de 60% em peso, por exemplo, de cerca de 30% a cerca de 50%.

Em um aspecto, o tensoativo são copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno e copolímeros de bloco ou poloxâmeros, por exemplo, Plu- ronic F127, Pluronic F68 de BASF.

Em um aspecto, o tensoativo é um poloxâmero. Em um outro aspecto, o tensoativo é selecionado do grupo que consiste em poloxâmero 188, poloxâmero 407 e misturas de poloxâmero 407 e poloxâmero 188. Em um aspecto, o tensoativo são tensoativos contendo polioxie- tileno, por exemplo, glicerídeos caprílico/cáprico de PEG-8 (por exemplo, “15 —Labrasol disponível de Gattefosse). - Em um aspecto, o tensoativo é umpolioxilglicerídeo de lauroíla (por exemplo, Gelucire 44/14 disponível de Gattefosse). Em um aspecto, o tensoativo é Cremophor RH40 de BASF. Em certos aspectos, a composição farmacêutica pode compre- ender excipientes adicionais comumente encontrados nas composições far- macêuticas, exemplos de tais excipientes incluem, mas não são limitados a, antioxidantes, agentes antimicrobianos, inibidores de enzima, estabilizantes, conservantes, flavorizantes, adoçantes e outros componentes como descri- tos em Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al., Eds., 4º Edição, Pharmaceutical Press (2003), que é por este meio incorporada por referên- cia.

Estes excipientes adicionais podem estar em uma quantidade de cerca de 0,05-5% em peso da composição farmacêutica total. Antioxidantes, agentes antimicrobianos, inibidores de enzima, estabilizantes ou conservan- tes tipicamente fornecem até cerca de 0,05-1% em peso da composição farmacêutica total. Agentes adoçantes ou aromatizantes tipicamente forne- cem até cerca de 2,5% ou 5% em peso da composição farmacêutica total.

Exemplos de antioxidantes incluem, mas não são limitados a, á- cido ascórbico e seus derivados, tocoferol e seus derivados, butil hidroxil anisol e butil hidroxil tolueno.

Em um aspecto, a composição compreende um tampão. O ter- mo'"tampão" como aqui usado refere-se a um composto químico em uma composição farmacêutica que reduz a tendência do pH da composição de se alterar com o passar do tempo como ocorreria do contrário devido às rea- ções químicas. Tampões incluem químicas tais como fosfato de sódio, TRIS, glicina e citrato de sódio.

O termo "conservante" como aqui usado refere-se a um compos- to químico que é acrescentado a uma composição farmacêutica para impedir ou tardar a atividade microbiana (crescimento e metabolismo). Exemplos de conservantes farmaceuticamente aceitáveis são fenol, m-cresol e uma mistu- ra de fenol e m-cresol.

“5 O termo "estabilizante" como aqui usado refere-se às químicas . acrescentadas às composições farmacêuticas contendo peptídeo para esta- bilizar o peptídeo, isto é, aumentar a vida de prateleira e/ou tempo de uso de tais composições. Exemplos de estabilizantes usados em formulações far- macêuticas são L-glicina, L-histidina, arginina, glicilglicina, etilenodiamina, citrato, EDTA, zinco, cloreto de sódio, polietileno glicol, carboximetilcelulose, e tensoativos e antioxidantes como de alfa-tocoferol e ácido |-ascórbico.

Em um outro aspecto, um processo para preparar uma composi- ção farmacêutica contendo insulina estabilizada em protease acilada com- preende as etapas de colocar o fármaco e um veículo que compreende um solvente orgânico polar, um componente lipofílico, e opcionalmente um ten- soativo e/ou um componente hidrófilo em admistão íntima. Por exemplo, a insulina estabilizada em protease acilada e o veículo podem ser liquefeitos, por exemplo, aquecendo para cerca de 20ºC a cerca de 80ºC, e depois soli- dificando por esfriamento para temperatura ambiente.

O veículo pode ser separadamente preparado antes de colocar um veículo que compreende um solvente orgânico polar, um componente lipofílico, e opcionalmente um tensoativo e/ou um componente hidrófilo em admistão íntima com o peptídeo de insulina derivatizado. Alternativamente, um, dois ou mais componentes do veículo podem ser misturados juntos com o polipeptídeo. A insulina estabilizada em protease acilada pode ser dissolvida no solvente orgânico polar, e depois ser misturado com o componente de lipídio e opcionalmente com um tensoativo.

Alternativamente, um processo para preparar uma composição farmacêutica tal como SEDDS ou SMEDDS (que pode ser enchida em uma cápsula, por exemplo, cápsula revestida entérica, cápsula macia, cápsula macia entérica) contendo uma insulina estabilizada em protease acilada compreende as etapas seguintes: (a) dissolver o peptídeo de insulina derivatizado no solvente orgânico polar e (b) misturar com o componente lipofílico, tensoativo e com- “15 ponente opcionalmente hidrófilo.

- Por exemplo, um processo para preparar a composição farma- cêutica é realizado em temperatura baixa (por exemplo, temperatura ambi- ente ou abaixo de temperatura ambiente).

Ao preparar a composição farmacêutica, a insulina estabilizada em protease acilada pode, por exemplo, ser dissolvida no solvente orgânico polar usando o método seguinte: a) fornecer uma solução aquosa da insulina estabilizada em pro- tease acilada, opcionalmente compreendendo excipientes, b) ajustar o valor de pH a um valor de pH alvo que é 1 unidade, alternativamente 2 unidades e alternativamente 2,5 unidades de pH acima ou abaixo do pH da insulina estabilizada em protease acilada, c) remover água (desidratando) da insulina estabilizada em pro- tease acilada através de tecnologias de secagem convencionais tais como secagem por congelamento e por atomização, e d) mistura e dissolução da insulina estabilizada em protease aci- lada no dito solvente não aquoso polar, por exemplo, por agitação, tomba- mento ou outros métodos de mistura,

e) opcionalmente filtração ou centrifugação da solução não a- quosa da insulina estabilizada em protease acilada para remover os sais inorgânicos não dissolvidos, f) opcionalmente removendo quantidades residuais de água, por exemplo, adicionando dessecantes sólidos ou secagem de vácuo.

Por exemplo, a insulina estabilizada em protease acilada é dis- solvida no solvente orgânico polar pelo método seguinte: a) fornecer uma solução aquosa de uma insulina estabilizada em protease acilada, opcionalmente contendo estabilizantes tais como Zinco e glicilglicina, b) ajustar o valor de pH em 1 unidade, alternativamente 2 unida- des e alternativamente 2,5 unidades de pH acima ou abaixo do pH do poli- peptídeo, por exemplo, adicionando uma base não volátil ou um ácido, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio, à solução, 5 c) remover a água (desidratando) da insulina estabilizada em - protease acilada através de tecnologias de secagem convencionais tais co- mo secagem por congelamento e por atomização, d) mistura e dissolução da insulina estabilizada em protease aci- lada no dito solvente não aquoso polar, por exemplo, por agitação, tomba- mento ou outros métodos de mistura, e) opcionalmente filtração ou centrifugação da solução não a- quosa da insulina estabilizada em protease acilada para remover sais inor- gânicos não dissolvidos, f) opcionalmente remover quantidades residuais de água, por exemplo, adicionando dessecantes sólidos ou secagem de vácuo.

Por "base volátil" é significado uma base, que até certo ponto evaporará ao aquecer e/ou em pressão reduzida, por exemplo, bases que têm uma pressão de vapor acima de 65 Pa em temperatura ambiente ou uma mistura azeotrópica aquosa incluindo uma base que tem uma pressão de vapor acima de 65 Pa em temperatura ambiente. Exemplos de bases vo- láteis são hidróxidos de amônio, hidróxidos de tetra-alquilamônio, aminas secundárias, aminas terciárias, aril aminas, aminas alifáticas ou bicarbonato de amônio ou uma combinação. Por exemplo, a base volátil pode ser bicar- bonato, carbonato, amônia, hidrazina ou uma base orgânica tal como aminas alifáticas inferiores, por exemplo, trimetilamina, trietilamina, dietanolaminas, trietanolamina e seus sais. Além disso, a base volátil pode ser hidróxido de amônio, etil amina ou metil amina ou uma combinação das mesmas.

Por "ácido volátil" é significado um ácido que até certo ponto e- vaporará ao aquecer e/ou em pressão reduzida, por exemplo, ácidos que têm uma pressão de vapor acima de 65 Pa em temperatura ambiente ou uma mistura azeotrópica aquosa incluindo um ácido que tem uma pressão de vapor acima de 65 Pa em temperatura ambiente. Exemplos de ácidos voláteis são ácido carbônico, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico.

Uma "base não volátil" como mencionado aqui significa uma ba- se que não evapora ou apenas em parte evapora ao aquecer, por exemplo, basescom uma pressão de vapor abaixo de 65 Pa em temperatura ambien- . te. A base não volátil pode ser selecionada do grupo que consiste em sais de metal alcalino, hidróxidos de metal alcalino, sais de metal alcalinoterroso, hidróxidos de metal alcalinoterroso e aminoácidos ou uma combinação dos mesmos. Exemplos de bases não voláteis são hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, e óxido de cálcio.

Um "ácido não volátil" como mencionado aqui significa um ácido que não evapora ou apenas evapora em parte ao aquecer, por exemplo, ba- ses com uma pressão de vapor abaixo de 65 Pa em temperatura ambiente. Exemplos de ácidos não voláteis são ácido clorídrico, ácido fosfórico e ácido sulfúrico.

A insulina estabilizada em protease acilada pode estar presente em uma quantidade até cerca de 40% tal como até cerca de 20% em peso da composição, ou de cerca de 0,01% tal como de cerca de 0,1%, alternati- vamente, de cerca de 0,01% a cerca de 20%, alternativamente, de cerca de 1% a20% ou de cerca de 1% a 10% em peso da composição. Porém, é in- tencionado que a escolha de um nível particular de polipeptídeo será feita de acordo com fatores bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas, incluindo a solubilidade do polipeptídeo no solvente orgânico polar ou componente hi- drófilo opcional ou tensoativo usado, ou uma mistura dos mesmos, modo de administração e o tamanho e a condição do paciente.

Por exemplo, a formulação farmacêutica compreende uma insu- lina estabilizada em protease acilada em uma concentração de 0,1% em p/p a 30% em p/p.

Cada dosagem de unidade conterá adequadamente de 0,1 mg a 300 mg de polipeptídeo de insulina estabilizada em protease acilada, por exemplo, cerca de 0,1 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, por exemplo, entre 5 mg e 300 mg da insulina estabilizada em protease acilada.

Por exemplo, cada dosagem de unidade contém entre 10 mg e 300 mg, por exemplo, 10 mg e 100 mg ou entre 20 mg e 300 mg, por exemplo, entre 20 mg e 100 mg da insulina estabilizada em protease acilada.

Tais formas de dosagem de unidade são adequadas para “15 administração 1-5 vezes diariamente dependendo do propósito particular da . terapia. - A insulina estabilizada em protease acilada é pH otimizado antes da dissolução no solvente orgânico polar para melhorar a solubilidade no ' solvente orgânico polar.

Quando usar o termo "pH otimizado" é aqui significado que a in- sulina estabilizada em protease acilada foi desidratada para um pH alvo que é pelo menos 1 unidade de pH do pl da insulina estabilizada em protease acilada em solução aquosa.

Desse modo, o pH alvo é mais de 1 unidade de PH acima do ponto isoelétrico da insulina estabilizada em protease acilada.

Alternativamente, o pH alvo é mais de 1 unidade de pH abaixo do ponto i- soelétrico da insulina estabilizada em protease acilada.

Consequentemente, o pH alvo poderia ser mais de 1,5 unidade de pH acima ou abaixo do pl, por exemplo, 2,0 unidades de pH ou mais acima ou abaixo do pl, por exemplo, 2,5 unidades de pH ou mais acima ou abaixo do pl da insulina estabilizada em protease acilada.

O termo "desidratada" como aqui usado com relação a uma in- sulina estabilizada em protease acilada refere-se a uma insulina estabilizada em protease acilada derivatizada que foi secada de uma solução aquosa.

O termo "pH alvo" como aqui usado refere-se ao pH aquoso que estabelecerá quando a insulina estabilizada em protease acilada desidratada for reidrata- da em água pura para uma concentração de cerca de 40 mg/ml ou mais.

O pH alvotipicamente será idêntico ao pH da solução aquosa da insulina esta- bilizada em protease acilada da qual a insulina estabilizada em protease aci- lada foi restabelecida por secagem.

Porém, o pH da solução de insulina es- tabilizada em protease acilada não será idêntico ao pH alvo, se a solução contiver ácidos ou bases voláteis.

Foi descoberto que a história do pH da insulina estabilizada em protease acilada será determinante para a quanti- dade da insulina estabilizada em protease acilada que pode ser solubilizada no solvente orgânico polar.

O termo "o pl do polipeptídeo" como aqui usado refere-se ao ponto isoelétrico de um polipeptídeo.

O termo "ponto isoelétrico" como aqui usado significa o valor de : PH onde a carga líquida geral de uma macromolécula tal como um peptídeo - é zero.

Em peptídeos pode haver vários grupos carregados, e no ponto isoe- létrico a soma de todas estas cargas é zero.

Em um pH acima do ponto isoe- : létrico, a carga líquida geral do peptídeo será negativa, enquanto que nos valores de pH abaixo do ponto isoelétrico a carga líquida geral do peptídeo será positiva.

O pl de uma proteína pode ser determinado experimentalmente através de técnicas de eletroforese tais como eletrofocalização: Um gradiente de pH é estabelecido em um meio anticonvectivo, tal como um gel de poliacrilamida.

Quando uma proteína é introduzida ao sistema, ela migrará sob influência de um campo elétrico aplicado ao longo do gel.

Proteínas carregadas positivas migrarão para o cátodo.

Eventual- mente, a proteina migrando alcança um ponto no gradiente de pH onde sua carga elétrica líquida é zero e é dito ser focalizada.

Este é o pH isoelétrico (pl) da proteína.

A proteína é depois fixada no gel e tingida.

O pl da proteína pode ser depois determinado por comparação da posição da proteína no gel com relação para moléculas marcadoras com valores de pl conhecidos.

A carga líquida de uma proteína em um valor de pH dado pode ser estimada teoricamente por uma pessoa versada na técnica através de métodos convencionais. Em essência, a carga líquida da proteína é o equi- valente à soma das cargas fracionárias dos aminoácidos carregados na pro- teína: aspartato (grupo B-carboxila), glutamato (grupo 3-carboxila), cisteína (grupo tiol), tirosina (grupo fenol), histidina (cadeias laterais de imidazol), lisina (grupo e-amônio) e arginina (grupo guanidínio). Adicionalmente, deve- se também levar em conta a carga dos grupos terminais de proteína (a-NH? e a-COOH). A carga fracionária dos grupos ionizáveis pode ser calculada dos valores de pKa intrínsecos.

A secagem, isto é, desidratação da insulina estabilizada em pro- tease acilada pode ser executada por qualquer método de secagem conven- cional tal, por exemplo, através de secagem por atomização, congelamento, a vácuo, aberta e de contato. Por exemplo, a solução de insulina estabiliza- “15 daemprotease acilada é secada por atomização para se obter um conteúdo . de água abaixo de cerca de 10%, por exemplo, abaixo de cerca de 8%, a- - baixo de cerca de 6%, abaixo de cerca de 5%, abaixo de cerca de 4%, abai- xo de cerca de 3%, abaixo de cerca de 2% ou abaixo de cerca de 1% calcu- Ú lado/medido através de perda no teste de secagem (gravimétrico) como de- claradona parte experimental.

Por exemplo, a insulina estabilizada em protease acilada é se- cada por atomização ou por congelamento.

Composições contendo insulina estabilizada em protease acila- da desta invenção podem ser usadas no tratamento de estados que são sensíveis à insulina. Desse modo, elas podem ser usadas no tratamento de diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 e hiperglicemia, por exemplo, como às vezes visto nas pessoas seriamente feridas e pessoas que sofreram cirurgia princi- pal. O ótimo nível de dose para qualquer paciente dependerá de uma varie- dade de fatores incluindo a eficácia do derivado de insulina específico em- pregado, da idade, do peso do corpo, da atividade física, e da dieta do paci- ente, em uma possível combinação com outros fármacos, e da severidade do estado a ser tratado. É recomendado que a dosagem diária da insulina acilada desta invenção seja determinada para cada paciente individual por aqueles versados na técnica de um modo similar como para composições de insulina conhecidas.

CARACTERÍSTICAS PREFERIDAS DESTA INVENÇÃO As características desta invenção são como segue:

1. Uma insulina estabilizada em protease acilada em que a insulina estabilizada em protease, formalmente, consiste em uma insulina estabili- zada em não protease (insulina parental), em que pelo menos um aminoáci- do hidrofóbico foi substituído com aminoácidos hidrófilos, e em que a dita substituição é dentro ou em proximidade íntima a um ou mais sítios de cliva- gem de protease da insulina não estabilizada em protease (insulina parental) e em que tal insulina estabilizada em protease opcionalmente também com- preende uma ou mais mutações adicionais com a condição que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a metade de acila “15 seja ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na insulina es- . tabilizada em protease.

" 2. "Uma insulina estabilizada em protease acilada, em que a insulina estabilizada em protease, formalmente, consiste em uma insulina estabili- ' zada em não protease (insulina parental), em que pelo menos dois aminoá- cidos hidrofóbicos foram substituídos com aminoácidos hidrófilos, e em que as ditas substituições estão dentro ou em proximidade íntima a dois ou mais sítios de clivagem de protease da não insulina estabilizada em protease (in- sulina parental) e em que tal insulina estabilizada em protease opcionalmen- te também compreende uma ou mais mutações adicionais com a condição que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a metade de acila seja ligada ao resíduo de lisina na insulina estabilizada em protease.

3. “Uma insulina estabilizada em protease acilada, em que a insulina estabilizada em protease, formalmente, consiste em uma insulina estabili- zadaem não protease (insulina parental), em que pelo menos dois aminoá- cidos hidrofóbicos foram substituídos com aminoácidos hidrófilos, e em que as ditas substituições estão dentro ou em proximidade íntima a dois ou mais sítios de clivagem de protease da insulina estabilizada em não protease (in- sulina parental) e em que tal insulina estabilizada em protease opcionalmen- te também compreende uma ou mais mutações adicionais com a condição que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a porção de acila seja ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na insulina estabilizada em protease.

4. "Uma insulina acilada de acordo com quaisquer cláusulas prece- dentes em que a insulina estabilizada em protease tem solubilidade aumen- tada com relação à insulina parental acilada.

5. “Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que a cadeia B da insulina compre- ende pelo menos uma mutação com relação à insulina parental.

6. “Uma insulina acilada de acordo com a cláusula precedente na medida do possível, em que a cadeia B da insulina compreende uma, duas outrêsmas não mais mutações com relação à insulina parental. . 7. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas - precedentes na medida do possível, em que a cadeia A da insulina estabili- zada em protease é idêntica à cadeia A da insulina humana. ' 8. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível em que a cadeia A da insulina compre- ende pelo menos uma mutação e a cadeia B da insulina compreende pelo menos uma mutação com relação à insulina parental.

9. “Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que a cadeia A da insulina compre- ende pelomenos duas mutações e a cadeia B da insulina compreende pelo menos uma mutação com relação à insulina parental.

10. Uma insulina acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que a insulina também compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em um sítio de protease de uma primeira insulina estabilizada em protease modificada, em que a dita pelo menos uma substituição de aminoácido é de modo que pelo menos um aminoácido hidrofóbico foi substituído com pelo menos um aminoácido hidró-

filo.

11. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível em que o aminoáci- do na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly ou Arg; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu ou Asp; e que opcionalmente também com- preende uma ou mais mutações adicionais.

12. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que o aminoá- cido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, “15 Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, ' Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e/ou .. o aminoácido na posição B16 é Tyr, His ou Glu; e/ou o aminoácido na posi- ção B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o ami- Ú noácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posi- ção B27é His, Glu, Asp, Gly, Lys, Arg ou deletado; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu, Asp, ou ausente (deletado); e/ou o aminoácido na posição B29 é Lys, Arg, ou ausente (deletado); e que opcionalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais e, preferivelmente, insulina estabilizada em protease acilada em que o aminoácido na posição A12é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly ou Arg; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu, ou Asp; e que opcionalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais.

13. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que o aminoá- cido na posição A14 é Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B25 é His ou Asn e que opcionalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais.

14. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer das cláusulas precedentes na medida do possível, em que o ami- noácido na posição A14 é Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B25 é His ou Asn e o aminoácido na posição B30 é deletado.

15. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que o aminoá- cido na posição A14 é Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B16 é His ou Glu, o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 é deletado.

"5 16. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com . quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que o aminoá- . cido na posição A14 é Glu, Asp ou His e o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 é deletado.

: 17. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que o aminoá- cido na posição A14 é Glu ou Asp e o aminoácido na posição B28 é Glu ou Asp, e, opcionalmente, não há nenhum resíduo de aminoácido na posição B30.

18. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas de um grupo que consiste em: A8His, A18GIn, A21GIn, A21GIy, B1Glu, B1GIn, B3GIn, B10Pro, B14Thr, B16Glu, B17Ser, B26Asp, B27Glu, B27Asp, B28Asp, B28Glu, e desB30.

19. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que a mutação adicional é desB30.

20. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que A14 é Glu.

21. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que B25 é Asn.

22. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que B25 é His.

23. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que B25 é Asn e B27 é Glu ou Asp.

24. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que B25 é Asn e B27 é Glu.

25. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível ,que mostra estabi- lidade aumentada para uma ou mais enzimas de protease com relação à “15 proteína parental. . 26. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com - quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, que mostra estabi- lidade aumentada para duas ou mais enzimas de protease com relação à i proteína parental.

27. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que a insulina parental é selecionada de um grupo que consiste em a) insulina humana; b) um análogo de insulina de insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B28 é Pro, Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro e opcionalmente o resíduo de aminoácido na posição B30 é deletado; c) Insulina humana de des(B26-B30), Insulina hu- mana de des(B27-B30), Insulina humana de des(B28-B30), Insulina humana de des(B29-B30), Insulina humana de des(B27) ou Insulina humana de des(B30); d) um análogo de insulina de insulina humana, em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Glu ou Asp; e) um análogo de insulina de insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição A21 é Gly e em que o análogo de insulina é também estendido no C-terminal com dois resíduos de Arg; f) um derivado de insulina, em que o resíduo de aminoácido na posição B30 é substituído com um metil éster de treonina; e g) um derivado de insulina em que à posi- ção Ne da lisina na posição B29 de Insulina humana de des(B30) uma ca- deiadetetradecanoíila está ligada.

28. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas para intensificar a estabilidade química da insulina.

29. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a cláusula precedente na medida do possível, em que a uma ou mais muta- ções adicionais são selecionadas de um grupo que consiste em A18GIn, A21GIh, A21GIy e B3GIn.

30. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com “15 quaisquer das cláusulas precedentes na medida do possível compreenden- . do uma sequência de aminoácido de cadeia A da fórmula 1, isto é: Xaaaç2 - Xaaa1)-Xaano-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Xaansg-Ser-lle-Cys-Xaan12- Xaani3-Xaan4-Xaaais-Leu-Glu-Xaan8-Tyr-Cys-Xaans;: (SEQ ID No: 1), e uma sequência de aminoácido de cadeia B da fórmula 2, isto é: Xaag.2-Xaagçy- XaagoXaag;-XaagrXaagz-Xaaga-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaagio-Leu-Val-Glu- Ala-Leu-Xaag15-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaag21-Xaagao5s-Xaaga6-Xaago7- Xaagae-Xaag29-Xaagzo-Xaaga1-Xaags2 (SEQ ID No: 2), em que Xaan2) está ausente ou Gly; Xaa,.,, está ausente ou Pro; Xaaa, está ausente ou Pro; Xaans é independentemente selecionado de Thr e His; Xaa-2 é independen- temente selecionado de Ser, Asp e Glu; Xaa-.;3 é independentemente sele- cionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaaais é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaais é independentemente selecionado de Gln, Asp e Glu; Xaans é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gln; Xaan; é —independentemente selecionado de Asn e Gln; Xaag,.2 está ausente ou Gly; Xaag,,, está ausente ou Pro; Xaago está ausente ou Pro; Xaag;, está ausente ou independentemente selecionado de Phe e Glu; Xaag? está ausente ou

Val; Xaag; está ausente ou independentemente selecionado de Asn e Gin; Xaag, é independentemente selecionado de Gln e Glu; Xaagio é independen- temente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; Xaagis é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gln, His, Arg, e Glu; Xaag2s é independentemente selecionado de Phe e His; Xaagas é independentemente selecionado de Phe, Asn e His; Xaagas está ausente ou independentemente selecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; Xaago; está ausente ou independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaagag está ausente ou independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; Xaagax, está ausente ou independentemente selecionado de Lys e Glh; Xaagzo está ausente ou Thr; Xaagaz; está ausente ou Leu; Xaag3z7> está ausente ou Glu; o C-terminal pode ser opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácido da cadeia A e a sequência de aminoácido da cadeia B são conectadas por ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteínas na posi- “15 ção7 da cadeia Ae a cisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteina . na posição 20 da cadeia A e a cisteína na posição 19 da cadeia B e em que - as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A são conectadas por uma ligação em ponte de dissulfeto; em que opcionalmente a sequência de aminoácido da cadeia A N-terminal é conectada à sequência de aminoácido da cadeia B C-terminal por uma sequência de aminoácido compreendendo 3-7 aminoáci- dos para formar uma molécula de insulina de cadeia simples, em que opcio- nalmente o N-terminal da cadeia B é estendido com 1-10 aminoácidos; em que se Xaans for Thr e Xaan2 for Ser e Xaan3 for Leu e Xaan for Tyr então Xaans é Glu ou Asp; e em que se Xaago, for Phe e Xaagas for Phe e Xaagos forTyreXaags, for Thr e Xaagag for Pro então Xaaga, é Gin.

31. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível compreendendo uma sequência de aminoácido de cadeia A da fórmula 3, isto é: Gly-lle-Val- Glu-Gln-Cys-Cys-Xaans-Ser-lle-Cys-Xaan2-Xaan3-Xaani4-Xaaais-Leu-Glu- Xaans-Tyr-Cys-Xaan: (SEQ ID No: 3), e uma sequência de aminoácido de cadeia B da fórmula 4, isto é: Xaag;-Val-Xaags-Xaaga-seu-Leu-Cys-Gly-Ser- Xaagio-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaag16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaago4-

seu-Xaagas-Xaag2o7-Xaag28-Xaagro-Xaagzo (SEQ ID No: 4), em que Xaa,s é independentemente selecionado de Thr e His; Xaa-2 é independentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; Xaan;3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaan., é inde- pendentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaa-5 é independentemente selecionado de Gln, Asp e Glu; Xaan é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gln; Xaan: é inde- pendentemente selecionado de Asn, e Gln; Xaag, é independentemente se- lecionado de Phe e Glu; Xaag; é independentemente selecionado de Asn e Glnh;Xaag, é independentemente selecionado de Glh e Glu; Xaagi1o é inde- pendentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; Xaag1s é independen- temente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; Xaaga, é independen- temente selecionado de Phe e His; Xaagas é independentemente seleciona- do de Phe, Asn e His; Xaagax; está ausente ou independentemente selecio- nadode Tyr, His, Thr, Gly e Asp; Xaagz; está ausente ou independentemen- . te selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaagos . está ausente ou independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; Xaagas está ausente ou independentemente selecionado de Lys e Gln; Xa- i agzo está ausente ou Thr; o terminal C pode ser opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácido de cadeia A e a se- quência de aminoácido de cadeia B estão conectadas através de ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteínas na posição 7 da cadeia A e a ciste- na na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteína na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11dacadeiaA estão conectadas por uma ligação em ponte de dissulfeto.

32. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a cláusula precedente na medida do possível, em que Xaa,; é independente- mente selecionado de Thr e His; Xaan> é independentemente selecionado de Ser e Glu; Xaaa; é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaan é independentemente selecionado de Tyr, Asp, His, e Glu; Xaa1s é independentemente seleciona- do de Glh e Glu; Xaa1is é independentemente selecionado de Asn, Lys e

Gln; Xaan, é independentemente selecionado de Asn, e Gln; Xaag;, é inde- pendentemente selecionado de Phe e Glu; Xaag; é independentemente se- lecionado de Asn e Glnh; Xaag, é independentemente selecionado de GIn e Glu; Xaag1o é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; Xa- agiséindependentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; Xa- Ap24 É independentemente selecionado de Phe e His; Xaagos é independen- temente selecionado de Phe, Asn e His; Xaagas é independentemente sele- cionado de Tyr, Thr, Gly e Asp; Xaag2; é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, e Glu; Xaagaxs é independentemente selecionado do Pro, Gly e Asp; Xaag2x, é independentemente selecionado de Lys e Gln; Xaagazo está ausente ou Thr; o terminal C pode ser opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácido de ca- deia A e a sequência de aminoácido de cadeia B estão conectadas através de ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteínas na posição 7 da cadeia Aeacisteina na posição 7 da cadeia B, e entre a cisteína na posição 20 da - cadeia A e a cisteína na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na - posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ligação em ponte de dissulfeto.

33. Uma insulina estabilizada em protease acilada, em que, na insuli- naestabilizada em protease, o aminoácido na posição A14 é Glu ou His (isto é, E ou H, de acordo com o código de uma letra), o aminoácido na posição B25 é His e que opcionalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais, e em que a porção de acila é ligada ao grupo € amino no resíduo de lisina na posição B29.

34. Uma insulina estabilizada em protease acilada em que, na insuli- na estabilizada em protease, o aminoácido na posição B25 é His ou Asn, o aminoácido na posição B27 é Glu ou Asp, e que opcionalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais seguintes: A8H, A14E/D, B1E/D, B28E/D, e desB30 e em que a porção de acila é ligada ao grupo e amino no resíduo de lisina na posição B29.

35. Uma insulina estabilizada em protease acilada em que, na insuli- na estabilizada em protease, o aminoácido na posição A14 é Tyr, Glu ou His

(isto é, Y, E ou H, de acordo com o código de uma letra), o aminoácido na posição B25 é Asn, o aminoácido na posição B27 é Glu ou Asp e que opcio- nalmente também compreende uma ou mais mutações adicionais, e em que a porção de acila é ligada ao grupo e amino no resíduo de lisina na posição B29.

36. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível em que a insulina estabilizada em protease compreende a mutação de A14E.

37. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que, na insulina estabilizada em protease, além da mutação na posição B25, há a- penas a mutação na posição A14 mencionada na cláusula precedente.

38. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que a “15 insulina estabilizada em protease compreende a mutação de A14H. . 39. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com - qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que o análogo da insulina estabilizada em protease compreende a mutação de desB30.

40. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com quaisquer cláusulas precedentes na medida do possível, em que a uma ou mais mutações adicionais dentro da insulina estabilizada em protease é se- lecionada de um grupo que consiste em: ArP, A(O0)P, A8H, A21G, B(-1)P, B(O0)P, B1E, B1Q, B16E, B26D, B27E, B28D, desB30, B31L e B32E.

41. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a cláusula precedente na medida do possível, em que a insulina estabilizada em protease, além das mutações nas posições A14 e B25, tem apenas uma das mutações mencionadas nas cláusulas anteriores.

42. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes fora a última (isto é, exceto a cláu- sula 41) na medida do possível, em que a insulina estabilizada em protease, além das mutações nas posições A14 e B25, tem exatamente duas das mu-

tações mencionadas na cláusula precedente fora duas (isto é, mencionadas na cláusula 40).

43. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes fora as duas últimas (isto é, exceto ascláusulas41e42)na medida do possível, em que a insulina estabilizada em protease, além das mutações nas posições A14 e B25, tem exatamente três das mutações mencionados na cláusula precedente fora duas (isto é, mencionadas na cláusula 40).

44. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes fora as duas últimas (isto é, exceto as cláusulas 41 e 42) na medida do possível em que, além das mutações nas posições A14 e B25, a única mutação adicional é desB30.

45. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que o “15 resíduo C do aminoácido terminal na cadeia A da insulina estabilizada em BR protease é o resíduo de aminoácido A21. - 46. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que a insulina estabilizada em protease é selecionada do grupo que consiste em Insulina humana de A8H, B25N, B27E, desB30; Insulina humana de A14E, A18L, B25H, desB30; Insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30; Insu- lina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, desB30; Insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, desB30; Insulina humana de A14E, B1E, B28E, desB30; Insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, B27E, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, desB27, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, B29R, desB30, Insulina humana de A14E, B28D, desB30, Insulina humana de A14E, B28E, desB30, Insulina humana de Insulina humana de ; Insulina humana de B25N, B27E, desB30; Insulina humana de B25H, desB30; Insuli- na humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, B29R, desB30; Insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; Insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB30; Insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, B16H, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, — desB30; Insulina humana de A14E, B25H, desB27, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30; Insulina humana de A14E, B25H, desB30; Insulina humana de A14E, desB30 e Insulina humana de A21G, B25H, desB30.

47. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que a porção de acila ligada à insulina estabilizada em protease tem a fórmula ge- ral Acy-AA1,-AA2,-AA3,- (1), em que Acy, AA1, AAZ, AA3, n, m e p são co- mo definidos acima.

48. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a “15 cláusula precedente na medida do possível, em que Acy é um ácido graxo, - preferivelmente ácido mirístico ou ácido estérico, mais preferido ácido mirís- . tico.

49. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes exceto a última, em que Acy é um diácido graxo, preferivelmente um diácido graxo (a,ww), mais preferido ácido heptadecanodioico, ácido hexadecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido nonadecanodioico, ácido docosanodioico, ácido eicosanodioico.

50. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes exceto a última, em que Acy é um ácido ww-(tetrazol-S-il)-graxo, preferivelmente ácido 15-(1H-tetrazol-5- iNpentadecanoico, ácido 16-(1H-tetrazol-5-il)hexadecanoico, ácido 17-(1H- tetrazol-S5-il)heptadecanoico, ácido 18-(1H-tetrazol-5-il)octadecanoico, ou ácido 19-(1H-tetrazol-5-il)nonadecanoico.

51. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que AA1 é ácido tranexâmico ou glicina.

52. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que AA1 é ácido tranexâmico.

53. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que n é Oou1.

54. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que n é o.

55. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que n é

1.

56. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que AA2 é yGlu, aGlu, BAsp, aAsp, y-D-Glu, a-D-Glu, B-D-Asp, a-D-AsP. ou um =—

Õ OH PP OH ' HN OH HN OH “15 amincácido da fórmula seguinte: Ss = e , H nn : o No o NU ou HAN. e ou CG o C HO “TO ; HO To Ho ““o 2,0 o o 7 E H,N h “L o > no o ,e —— oH , em que as setas indicam o ponto de ligação ao grupo amino de AA1, AA2Z, AA3 ou ao grupo e-amino do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N-terminal da insulina estabilizada em prote- ase

57. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que

AA?2 é yGlu, BAsp, y-D-Glu, B-D-ASP. ou um aminoácido da fórmula seguinte: or “o.

HN OH O = e HO "Oo , em que a seta indica o ponto de ligação ao grupo amino de AA1, AAZ2, AA3 ou ao grupo e-amino do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N-terminal da insulina estabilizada em protease

58. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que o AA?2 é yGlu, y-D-Glu, ou um aminoácido da fórmula seguinte: Pon HN oH "" = em que a seta indica o ponto de ligação ao grupo amino de AA1, AAZ, AA3 ou ao grupo £e-amino do resíduo de lisina B29 ou a uma posi- ção N-terminal da insulina estabilizada em protease ' 59. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com ' qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que m ' é 0,1,2,3,4,5, ou 6.

60. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que m é 0,1,2,3, ou 4.

61. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que m és.

62. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que m é3.

63. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que m é2.

64. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que m él.

65. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que m é o.

66. Uma insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que AA3 é selecionado de qualquer um dos seguintes: o oH Ao Do o

IN O AÇO

H o + o o BN OA NÃO ou

H o o ENTAO A O o - 6 H o o - EN Ag Oo ron

100. H ' H IN O O Ng OH - o o H o INT O Ng o Ns ron o e o o Ioga o A od,

H em que r é 1,2, 3,5,7,11,23 ou 27.

67. Uma insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a cláusula precedente, em que r é 1, 3, 5, ou 7.

68. Uma insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a cláusula precedente, em que r é 1.

69. Uma insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a cláusula precedente fora uma, em que ré 3.

70. Uma insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a cláusula precedente fora duas, em que ré 5.

71. Uma insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a cláusula precedente fora três, em que r é 7.

72. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes na medida do possível, em que p é 0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,0u10.

73. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que p é 0, 1,2, 3 ou 4.

74. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que p é 0, 1 ou 2.

75. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que p é 0 ou 2.

76. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes, em que pé 0.

77. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com “15 qualquer uma das cláusulas precedentes, em que p é 1. ' 78. Uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com ” qualquer uma das cláusulas precedentes, em que p é 2.

79. Um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de pro- duto precedentes, que é qualquer um dos compostos especificamente men- cionados neste relatório descritivo tal como nos exemplos específicos, espe- cialmente qualquer um dos exemplos 1 et seg. abaixo.

80. Um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de pro- duto precedentes, que é qualquer um dos exemplos específicos das porções de acila especificamente mencionadas neste relatório descritivo presa a qualquer uma das insulinas estabilizadas em protease especificamente mencionadas neste relatório descritivo.

81. O uso de um composto de acordo com qualquer uma das cláusu- las de produto precedentes para a preparação de uma composição farma- cêutica para o tratamento de diabetes.

82. O uso de um composto de acordo com qualquer uma das cláusu- las de produto precedentes para a preparação de uma composição farma- cêutica que pode ser administrada pulmonarmente para o tratamento de dia-

betes.

83. O uso de um composto de acordo com qualquer uma das cláusu- las de produto precedentes para a preparação de uma composição farma- cêutica que pode ser administrada pulmonarmente para o tratamento de dia- betese que dá um «efeito de ação longa.

84. O uso de um composto de acordo com qualquer uma das cláusu- las de produto precedentes para a preparação de uma composição farma- cêutica em pó que pode ser administrada pulmonarmente para o tratamento de diabetes.

85. O uso de um composto de acordo com qualquer uma das cláusu- las de produto precedentes para a preparação de uma composição farma- cêutica líquida que pode ser administrada pulmonarmente para o tratamento de diabetes.

86. O uso de um composto de acordo com qualquer uma das cláusu- “15 las de produto precedentes para a preparação de uma composição farma- R cêutica que pode ser administrada oralmente para o tratamento de diabetes.

« 87. Um método de tratamento de diabetes, o método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas de produto precedentes.

88. Uma composição que contém insulina humana como também uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes.

89. Uma composição que contém insulina asparto como também uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes.

90. Uma composição que contém insulina Lispro como também uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes.

91. Uma composição que contém insulina Glulisina como também uma insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das cláusulas precedentes.

92. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada em protease de acordo com qualquer uma das cláusulas acima relativo aos análogos de insulina e um veículo farmaceuticamente aceitável.

93. Um método para o tratamento, a prevenção ou o alívio de hiper- glicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dislipidemia em um sujeito compreendendo admi- nistrar a um sujeito uma insulina estabilizada em protease, de acordo com qualquer uma das cláusulas acima, relativo aos análogos de insulina ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas acima.

94. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma insulina estabilizada em protease, de acordo com qualquer uma das cláusulas acima, relativo aos análogos de insulina para a preparação de uma formulação far- macêutica para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, “15 tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou : dislipidemia.

« 95. Um método de tratamento de diabetes, o método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade tera- ' peuticamente eficaz de uma insulina acilada de acordo com qualquer uma dascláusulasde produto precedentes.

Combinando uma ou mais cláusulas descritas aqui, opcional- mente também com uma ou mais reivindicações abaixo, resulta em outras cláusulas e a presente invenção diz respeito a todas as possíveis combina- ções das ditas cláusulas e reivindicações.

Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente, e patentes, citadas aqui são por este meio incorporadas por referência em sua totalidade e na mesma proporção como se cada referência fosse indivi- dual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e fosse exposta em sua totalidade aqui (na proporção máxima permitida por lei).

Todos os títulos e subtítulos são aqui usados para conveniência apenas e de forma alguma não deveriam ser interpretados como limitando a invenção.

: 112 O uso de qualquer um e de todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") fornecidos aqui, é intencionado mera- i mente para melhor esclarecer a invenção e não propõem uma limitação no escopo da invenção a menos que do contrário reivindicado. Nenhuma lin- guagem no relatório descritivo deveria ser interpretada como indicando qual- quer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

A citação e a incorporação de documentos de patente aqui são feitas para conveniência apenas e não refletem qualquer vista da validez, patentabilidade, e/ou exequibilidade de tais documentos de patente. A men- ção aquidas referências está fora de admissão que elas constituam técnica anterior.

Aqui, a palavra "compreendem" é para ser amplamente interpre- tada significando "incluem", "contêm" ou "compreendem" (diretrizes de EPO C4.13).

Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto citado nas reivindicações anexadas a este conforme permitido por lei aplicável.

EXEMPLOS Os exemplos seguintes são oferecidos por via de ilustração, não porlimitação.

As abreviações aqui usadas são as seguintes: BAla é beta- alanila, Aoc é ácido 8-amino-octanoicoo, tBu é terc-butila, DCM é diclorome- tano, DIC é diisopropilcarbodi-imida, DIPEA = DIEA é NN disopropiletilamina, DMF é N ,N-dmetifformamida, DMSO é sulfóxido de di- metila, EIOAc é acetato de etila, Fmoc é 9-fluorenilmetiloxicarbonila, yGlu é gama L-glutamila, HCI é ácido clorídrico, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, NMP é —N-metilpirrolidona MeCN é acetonitrla OEG é [2(2 aminoetóxi)etóxilmetilcarbonila, Su é succinimidil-1-ila = 2,5-dioxo-pirrolidin- 1-ila, OSu é succinimidil-1-ilóxi = 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilóxi, RPC é cromato- grafiade fase reversa, TA é temperatura ambiente, TFA é ácido trifluoroacé- tico, THF é tetraidrofurano, TNBS é ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico, TRIS é tris(hidroximetil))aminometano e TSTU é tetrafluoroborato de O-(N-

succinimidil)-1,1,3,3-tetrametilurônio.

Os seguintes exemplos e procedimentos gerais referem-se aos compostos intermediários e produtos finais identificados no relatório descriti- Vo e nos esquemas de síntese.

A preparação dos compostos da presente invenção é descrita em detalhes usando os exemplos seguintes, mas as re- ações químicas descritas em termos de sua aplicabilidade geral são descri- tas para a preparação dos compostos da invenção.

Ocasionalmente, a rea- ção pode não ser aplicável como descrito em cada composto incluso dentro do escopo descrito da invenção.

Os compostos para os quais isto ocorre serão facilmente reconhecidos por aqueles versados na técnica.

Nestes ca- sos, as reações podem ser de forma bem sucedidas executadas por modifi- cações convencionais conhecidas àqueles versados na técnica, ou seja, por proteção apropriada de grupos interferentes, alterando a outros reagentes convencionais, ou por modificação rotineira das condições de reação.

Alter- “15 nativamente, outras reações descritas aqui ou do contrário convencionais BR serão aplicáveis à preparação dos compostos correspondentes da invenção. ' Em todos os métodos preparativos, todos os materiais de partida são conhe- cidos ou podem ser facilmente preparados de materiais de partida conheci- : dos.

Todas as temperaturas são expostas em graus Centígrado e a menos que do contrário indicado, todas as partes e porcentagens são em peso quando referem-se a rendimentos e todas as partes são em volume quando referem-se a solventes e eluentes.

Os compostos da invenção podem ser purificados empregando um ou mais procedimentos seguintes que são típicos dentro da técnica.

Es- tes procedimentos podem - se necessário - ser modificados com respeito aos gradientes, pH, sais, concentrações, fluxo, colunas e assim sucessiva- mente.

Dependendo dos fatores tais como perfil de impureza, solubilidade das insulinas em questão et cetera, estas modificações podem ser facilmen- te reconhecidas e feitas por uma pessoa versada na técnica.

Após HPLC acídica ou dessalgação, os compostos são isolados por liofilização das frações puras.

Após HPLC neutro ou cromatografia de permuta de ânion, os compostos são dessalgados, precipitados em pH isoelétrico, ou são purifica- dos por HPLC acídica.

PROCEDIMENTOS DE PURIFICAÇÃO TÍPICOS: O sistema de HPLC é um sistema de Gilson que consiste no se- guinte: manipulador Líquido Modelo 215, Bomba Modelo 322-H2 e um De- tector de UV Modelo 155. Detecção é tipicamente a 210 nm e 280 nm.

O sistema de FPLC de Purificador Âkta de (Amersham Bioscien- ces) consiste no seguinte: Bomba Modelo P-900, detector de UV Modelo UV-900, pH Modelo pH/C-900 e detector de condutividade, coletor Modelo —Frac-950 Frction. Detecção de UV é tipicamente a 214 nm, 254 nm e 276 nm. HPLC ACÍDICA: COLUNA: Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4 FLUXO: 8 ml/min TAMPÃO A: 0,1% de TFA em acetonitrila TAMPÃO B: 0,1% de TFA em água. : GRADIENTE: 0,0 — 5,0 min: 10% de À - 5,00-30,0 min: 10% de A a 90% A 30,0-35,0 min: 90% de A 35,0-40,0 min: 100% de À HPLC NEUTRA: COLUNA: Phenomenex, Jupiter, C4 5 um 250 x 10,00 mm, 300 À FLUXO: 6 mi/min TAMPÃO A: 5 mM de TRIS, 7,5 mM de (NH;)2SO,, pH = 7,3, 20% de CH;CN. TAMPÃO B: 60% de CH;CN, 40% de água, GRADIENTE: 0-5minh'"=—10%deB 5-35 min: 10 -60% de B - 39 min: 60% de B 39 - 40 min: 70% de B 40-43,5 min: 70% de B

CROMATOGRAFIA DE PERMUTA DE ÂNION: COLUNA: RessourceQ, 1 ml! FLUXO: 6 ml/min TAMPÃO A: 0,09% de NHHCO;, 0,25% de NH,OAc, 42,5% de etanol, pH 8,4 TAMPÃO B: 0,09% de NH.HCO;, 2,5% de NH,OAc, 42,5% de etanol, pH 8,4 GRADIENTE: 100% de A a 100% de B durante 30 volumes de coluna DESSALGAÇÃO: COLUNA: HiPrep 26/10 FLUXO: 10 ml/min, 6 volumes de coluna TAMPÃO: 10 mM de NH.HCO;3

PROCEDIMENTO GERAL PARA A SÍNTESE DE FASE SÓLIDA 115 DOS REAGENTES DE ACILAÇÃO DA FÓRMULA GERAL (II): e (11): ACy-AA1,-AA2,,-AA3,-Act, - em que Acy, AA1, AAZ, AA3, n, m, e p são como definidos acima : e Act é o grupo de partida de um éster ativo, tal como N-hidroxissuccinimida i (OSu), ou 1-hidroxibenzotriazol, e em que os ácidos carboxílicos são protegidos dentro das por- ções de Acy e de AA2 da porção de acila como ésteres de terc-butila. Compostos da fórmula geral (Il) de acordo com a invenção po- dem ser sintetizados em suporte sólido usando procedimentos bem conheci- dos às pessoas versadas na técnica de síntese de peptídeo de fase sólida. Este procedimento compreende ligação de um aminoácido protegido por Fmoc a uma resina de 2-clorotritilcloreto de poliestireno. A ligação pode, por exemplo, ser realizada usando o aminoácido N-protegido livre na presença de uma amina terciária, como trietil amina ou N,N-di-isopropiletilamina (vide referências abaixo). A extremidade C-terminal (que é ligada à resina) deste aminoácido está na extremidade da sequência sintética que é acoplada às insulinas parentais da invenção. Após ligação do aminoácido Fmoc à resina, o grupo de Fmoc foi desprotegido usando, por exemplo, aminas secundá-

rias, como piperidina ou dietil amina, seguido por acoplamento de outro (ou o mesmo) aminoácido protegido por Fmoc e desproteção. A sequência sintéti- ca é feita mediante acoplamento de diácidos graxos protegidos por mono- terc-butila (a, w), como ésteres de mono-fterc-butila de ácido hexadecanodi- oico, heptadecanodioico, octadecanodioico ou eicosanodioico. Clivagem dos compostos da resina é realizada usando ácido como 0,5-5% de TFA/DCM (ácido trifluoroacético em diclorometano), ácido acético (por exemplo, 10% em DCM, ou HOAc/triflouroetanol/DCM 1:1:8), ou hecafluoroisopropanol em DCM (Vide, por exemplo, "Organic Synthesis on Solid Phase", F. Z. Dôrwald, Wiley VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, "Peptides: Chemistry and Biology", N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3 ou "The Combinatorial Chemistry Catalog" 1999, Novabiochem AG, e referências citadas dentro do mesmo). Isto assegura que os ésteres de ferc-butila pre- sentes nos compostos como grupos de proteção de ácido carboxílico não 115 são desprotegidos. Por fim, o grupo carbóxi C-terminal (liberado da resina) é . ativado, por exemplo, como o éster de N-hidroxissuccinimida (OSu) e usado - ou diretamente ou após a purificação como reagente de acoplamento ligado - às insulinas parentais da invenção. Este procedimento é ilustrado no exem- plo 9.

Alternativamente, os reagentes de acilação da fórmula geral (II) acima podem ser preparados através da síntese de fase de solução como descrito abaixo.

Diácidos graxos protegidos por mono-terc-butila, tais como éste- res de mono-ferc-butila de ácido hexadecanodioico, heptadecanodioico, oc- tadecanodioico ou eicosanodioico são ativados, por exemplo, como OSu- ésteres como descritos abaixo ou como qualquer outro éster ativado conhe- cido àqueles versados na técnica, tal como ésteres de HOBt ou HOAt. Este éster ativo é acoplado com um dos aminoácidos AA1, AA2 protegidos com mono-terc-butila, ou AA3 em um solvente adequado tal como THF, DMF, —NMP (ou uma mistura de solventes) na presença de uma base adequada, tal como DIPEA ou trietilamina. O intermediário é isolado, por exemplo, através de procedimentos extrativos ou através de procedimentos cromatográficos.

O intermediário resultante é submetido novamente à ativação (como descrito acima) e ao acoplamento com um dos aminoácidos AA1, AA2Z protegido com mono-terc-butila, ou AA3 como descrito acima. Este procedimento é repetido até o intermediário protegido por Acy-AA1,-AA2n-AA3,-OH desejado ser ob- tido. Este é por sua vez ativado para fornecer os reagentes de acilação da fórmula geral (Il) Acy-AA1,-AA2n-AA3,-Act. Este procedimento é ilustrado no exemplo 21.

Os reagentes de acilação preparados por qualquer um dos mé- todos acima podem ser desprotegidos por (terc-butila) após ativação como ésteres de OSu. Isto pode ser feito por tratamento de TFA do reagente de acilação protegido por terc-butila ativado por OSu. Após acilação de qual- quer insulina estabilizada em protease, a insulina estabilizada em protease acilada desprotegida resultante da invenção é obtida. Este é ilustrado, por exemplo, no exemplo 16 abaixo.

Se os reagentes preparados por qualquer um dos métodos aci- .. ma não forem desprotegidos por (ferc-butila) após ativação como ésteres de . OSu, acilação de qualquer insulina estabilizada em protease fornece a insu- ' lina estabilizada em protease acilada protegida por terc-butila corresponden- te da invenção. Para se obter a insulina estabilizada em protease acilada protegida da invenção, a insulina protegida será desprotegida. Isto pode ser feito através de tratamento de TFA para fornecer a insulina estabilizada em protease acilada protegida da invenção. Isto é ilustrado, por exemplo, nos exemplos 1 e 2 abaixo.

Se acilação de um resíduo de lisina (na posição épsilo) de uma insulina for desejada, a acilação é executada em pH alcalino (por exemplo, em pH 10, 10,5, ou 11). Isto é, por exemplo, ilustrado nos exemplos 1 e 2 abaixo.

Se acilação da posição N-terminal da cadeia A (A1) de uma in- sulina for desejada, acilação é executada em pH neutro (por exemplo, em pH7,7,5,8,ou8,5). Isto é, por exemplo, ilustrado nos exemplos 38, e 44 abaixo. PROCEDIMENTO GERAL (A) PARA PREPARAÇÃO DE INSULINAS ES-

TABILIZADAS EM PROTEASE ACILADAS DESTA INVENÇÃO O procedimento geral (A) é ilustrado no primeiro exemplo. EXEMPLO 1. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N-hexadecandioíla), desB30

O AAA NH

O i boo 4Gl vVEQCÇGTS ICSLEQL ENYCN"

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFÁYTPN OH Oo Insulina humana de A14E, B25H, desB30 (500 mg) foi dissolvida em 100 MM de NazxCO; aquoso (5 ml), e pH ajustado em 10,5 com 1 N de NaOH. .e Éster de N-hidroxissuccinimida de éster de ferc-butila de ácido hexadecano- ' dioico foi dissolvido em acetonitrila (10 em P/V%) e adicionado à solução de : insulina e aquecido suavemente sob água de torneira morna, para evitar precipitação e deixada em temperatura ambiente durante 30 minutos. A mis- tura foi liofilizada. O sólido foi dissolvido em 95% de ácido trifluoroacético esfriado em gelo (contendo 5% de água) e mantido em gelo durante 30 mi- nutos. A mistura foi concentrada a vácuo e re-evaporada de diclorometano. O resíduo foi dissolvido em água, e pH foi ajustado para neutro (6-7) e a mis- tura foi liofilizada.

A insulina resultante foi purificada através de cromatografia de permuta de íon em uma coluna de Fonte 15Q de 21 ml, várias passadas, eluindo com um gradiente de 15 a 300 mM de acetato de amônio em 15 mM de Tris, 50 % em v/v de etanol, pH 7,5 (ácido acético). Dessalgação final das frações puras foi executada em uma coluna de RPC de 3 ml eluindo isocrati- camente com 0,1% em v/v de TFA, 50 % em v/v de etanol. A insulina pura resultante foi liofilizada. LC-MS (eletropulverização): m/z = 1483,2 (M+4)/4. Calc.: 1483,5

EXEMPLO 2. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecandioil-yGlu), desB30 o H o Ho mou

A i i . O "NH 4GI VEGOOTS ICS LEQLENYON= | | : OH mFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHAYTP-N Ho Insulina humana de A14E, B25H, desB30 (2 g) foi dissolvida em 100 mM de NazCO; aquoso (10 ml), e DMSO (4 ml) foi adicionado. pH foi ajustado para 10,5 com 1 Nde NaOH. Octadecanodioil-L-Glu(OSu)-OtBu de ' terc-butila (preparado como descrito em WO 2005/012347). Mais 100 mM de . Na>zCO; aquoso (20 ml) foram adicionados seguidos por THF (20 ml). Após : 1,5 h, algumas gotas de metilamina foram adicionadas e a mistura foi sub- - sequentemente acidificada com ácido acético. A mistura foi purificada por “10 HPLC preparativa e liofilizada para fornecer a insulina do título como éster de di-ferc-butila. Este foi dissolvido em diclorometano e ácido trifluoroacético 1:1 (SO ml). A mistura foi deixada por 2 horas e concentrada a vácuo. Após adição de uma pouco de água e acetonitrila, a mistura foi purificada por H- PLC preparativa. Frações puras foram liofilizadas. Isto forneceu 313 mg da insulina do título. MALDI-TOF MS: m/z = 6089 (M+1). Calc.: 6089. EXEMPLO 3. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfeicosanodioil-yGlu), desB30 o H o Ho or Aa j j O NH “Gl VEQGCÇTS ICSLEQ LENYCNo: Ss Ss | 7 Ss Ss | | * OH H“FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N no Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a partir de áci- do eicosanodioico por meio de éster de mono-terc-butila de ácido eicosano- dioico e icosanodioil-L-Glu(OSu)-OtBu de terc-butila.

MALDI-TOF MS: m/z = 6120 (M+1). Calc.: 6117. EXEMPLO 4. PROCEDIMENTO GERAL (A): ' Insuliha humana de A14E, B25H, B29K(Nº3-CARBÓXI-5-octadecan- r. odioilaminobenzoíla), desB30 o o ' H - N o IN OH Oo 1 Í o NH 4 G |. vEGSSTS l CSFtFOLENYONT Í / s Ss | | : oH EVNONBLOGSHLVEALYLVEOCEROPRNY]P—N o Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a partir de és- ter de mono-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de ácido 5-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)isoftálico — (preparado — como descrito em WO 2006/082204). LC-MS: 1531 (M+4), Mw 6124 (desconvoluto). Calc.: 1531

(M+4), 6122. EXEMPLO 5. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insuliha humana de A14E, B25H, B29K(Nf-N-octadecandioil-N-(2- carboxietil)glicila), desB30 o o a

AAA AAA AAA o Neo

PA NH "“GIVEQCCTSICSLEQLENYCN-+ í Í 1 / Ss Ss ! ! y OH HWFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N Ho Ss Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a ' partir de octadecandioil-N-(2-(terc-butoxicarbonil)etil)-Gly-OSu de terc-butila Lc (preparado como descrito em WO 2005/012347). - LC-MS (eletropulverização): m/z: 1522,52 (M+4). Calc.: 1523. : EXEMPLO 6. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N (n-octadecandioil-n-carboximetil)- beta-alanila), desB30 o o Pon Io o o Po NH "“GIVEQCCTSICSL ÉQL ENYCN- or ; ; i / Ss Ss | | + OH mFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N Ho Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a partir de octadecandioil-N-(terc-butoxicarbonilmetil)-BAla-OSu de terc-butila (preparado como descrito em WO 2005/012347).

MALDI-TOF MS: m/z = 6088 (M+1). Calc.: 6089. EXEMPLO 7. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nf4-([4-((19-carboxinonadeca- noilamino) metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu), desB3o PEIDDDIDIDDIIIO a. o à (Son

A ja om *&G | VEGCCTS | CSLEQLENYON=" <& 1 P Í À . OH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N no Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a o partir de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de áci- ' do í 2-((4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo- hexanocarbonilYamino)pentanodioico LC-MS (eletropulverização): m/z: 6260. Calc:6255.

Preparação de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1- terc-butila de ácido 2-(f4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino) me- til|ciclo-hexanocarbonil;)amino)pentanodioico:

1. ATIVAÇÃO DE OSU DE ÁCIDO EICOSANODIOICO DE TERC-BUTILA Ácido icosanodioico de ferc-butila (5,0 g) foi dissolvido em THF (50 ml) e DMF (30 ml). TSTU (4,53 g) e DIPEA (2,65 ml) foram adicionados.

A mistura foi agitada durante 3 dias e depois concentrada a vácuo. O resí- duo sólido foi recristalizado de acetonitrla para dar éster de N- hidroxissuccinimida de éster de terc-butila de ácido icosanodioico como um composto cristalino branco (5,52 g, 89%).

LC-MS (eletropulverização): m/z: 440 [M-56 (= terc-Bu)]

2. ACOPLAMENTO DO ÁCIDO TRANEXÂMICO

A uma solução de éster de N-hidroxissuccinimida de éster de terc-butila de ácido icosanodioico (5,52 gq) em THF (100 ml) foi adicionado ácido tranexâmico (1,75 g). Um precipitado foi obtido. Tentativas para adqui- rir uma solução adicionando DMF (75 ml), água (25 ml) e DMSO (50 ml) e algumas gotas de DIPEA não tiveram êxito. A suspensão foi agitada durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo. Ao resíduo sólido foi adicionado THF e o precipitado foi filtrado. O filtrado foi concentrado e o resíduo sólido foi recristaizado em acetonitila para dar ácido 4[((19-terc- butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil|ciclo-hexanocarboxílico “como um composto cristalino branco (5,569, 93%) LC-MS (eletropulverização): m/z: 538 (M+1).

3. ATIVAÇÃO DE OSU DE ÁCIDO 4-[(19-TERC-BUTOXICARBONILNO- NADECANOILAMINO)METILJCICLO-HEXANOCARBOXÍLICO A uma solução de ácido 4-[(19-terc-butoxicarbonilnonade- canoilamino)metillciclo-hexanocarboxílico (5,56 gq) em THF (100 ml) foi adi- - cionada uma solução de TSTU (3,42 g) em acetonitrila (25 ml). A mistura foi - concentrada a vácuo após agitação durante a noite. O resíduo sólido foi re- - cristalizado de acetonitrila para dar éster de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila de ácido 4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil|ciclo-hexanocarboxílico (5,769,88%). LC-MS (eletropulverização): m/z: 635 (M+1).

4. ACOPLAMENTO DE H-Glu-OTBU E ATIVAÇÃO DE OSU. A uma solução de éster de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila de ácido 4- [(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil|ciclo-hexanocarboxílico em THF (150 ml) foi adicionada uma solução de H-Glu-OtBu (1,84 g) em água (25 ml) e algumas gotas de DIPEA. A mistura foi agitada durante noite e de- pois concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em THF quente (60ºC) e filtrado. Ao filtrado frio, THF foi adicionado até 150 ml e TSTU (2,98 g) dis- solvido em acetonitrila (25 ml) foi adicionado. A mistura foi concentrada após agitação por 20 min. O resíduo foi recristalizado de acetonitrila para dar um sólido branco, éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de ácido 2-((4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil]ciclo-

hexanocarbonilYamino)pentanodioico (6,8 g, 92%). LC-MS (eletropulverização): m/z: 820 (M+1). EXEMPLO 8. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“hepadecanodioil-yGlu), desB30

H FO ou Oo Oo 3 PA . O "NH Gl! vEGCGTO ICSLEQL ENYGN | | + OH HWFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N Ho Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a - partir de ácido heptadecanodioico por meio de éster de mono-terc-butila de ácido heptadecanodioico e heptdecanodioil-L-Glu(OSu)-OtBu de ferc-butila C (preparado como descrito em WO 2006/082204). : LC-MS (eletropulverização): m/z: 1519 (M+4). Calc.: 1519. - 10 EXEMPLO 9. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o H Oo HO PÔ on Cao o Oo Io NA on —) º "Gl VEQCETS ICSLÉQL ENYON “FVNQHLCGSHLVEALY LVCGERGFÂYTP-N Y OH O efeito oral deste composto em ratos Wistar machos de jejum à noite é dado na figura 2a e figura 2b abaixo.

Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a partir de éster de terc-butila de ácido 17-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-(2-[2-((2- [2-(2, 5-dioxopirrolidin-1- iloxicarbonilmetó- xi)etóxiletilcarbamoil)metóxi)etóxiletilcarbamoil)propilcarbamoil)heptadecanoi co (nome alternativo: octadecandioil-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBU de terc- butila) LC-MS (eletropulverização): m/z: 1596 (M+4). Calc.: 1596.

O bloco de construção para preparação desta insulina foi prepa- rado como descrito no seguinte: Resinade = u o " o or 2-Cl-trítila Fmoe NO, —=— moer No. Resina de 2-Cltritila H o Jc — ego mon ro nono Resina de 2-Cl-tritila : ne CcH0O À — em o o governo nro oo Resina de 2-Cl-tritila H o HCSHQ 4 O CH o emo No À TE: o o õ povo nono oo Resina de 2-Cl-tritila H o HCO un O CH

APR SRSARASNAAL mn— o n o o ooo nro no on H o HCSHO9 un O CH o PA SRRARRANAAL o n o 5 A mamona os

Resina de partida: Resina de 2-clorotritila, 1,80 mmol/g. 1,0 g da resina foi intumescido por 30 min em DCM (10 ml!).

1. Acilação com ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico: 0,39 g (0,63 eq, 1,0 mmol) de ácido Fmoc-8-amino-3,6- dioxaoctanoico (Fmoc-OEG-OH) foi dissolvido em DCM (15ml) e acrescen- tadoãàresina. N N-Di-isopropiletilamina (DIEA) (0,44 ml, 2,5 mmols) foi adi- cionada ema gotas. A mistura da reação foi submetida a vórtice durante 30 min e depois metanol (2 ml) foi adicionado e a mistura foi submetida a vórti- ce por um adicional de 15 min. A resina foi filtrada e lavada com NMP (2x8 ml) e DCM (8x8 ml). 20% de piperidina/NMP (8 ml) foram adicionados, repousados por 10 min repetidos uma vez. Filtrados e lavados com NMP (2x8 m!), DCM (3x8 ml), e NMP (5x8 ml). Um teste de TNBS positivo forneceu resinas ver- melhas. : 2. Acilação com ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico: 25 0,78 g (2 eq, 20 mmols) de ácido Fmoc-8-amino-3,6- . dioxaoctanoico foi dissolvido em NMP/DCM 1:1 (10 ml). 0,28 g (2,2 eq, 2,4 ' mmols) de HOSu foi adicionado seguido por adição de 0,37 ml (2,2 eq, 2,4 mmolis) de DIC. A mistura de reação foi deixada repousar 1 hora e depois adicionada à resina e por fim 0,407 ml (2,2 eq) de DIEA foi adicionado. À mistura foi submetida a vórtice por 16 horas, filtrada e lavada com NMP (2x8 ml), DCM (3x8 ml), e NMP (5x8 ml). Um teste de TNBS positivo forneceu resinas incolores. 20% de piperidina/NMP (10 ml) foram adicionados, repousados por 10 min repetidos uma vez. Filtrados e lavados com NMP (2x8 ml), DCM (3x8ml) e NMP (5x8 ml). Um teste de TNBS positivo forneceu resinas ver- melhas. Acilação com Fmoc-Glu-OtBu: 0,86 g (2 eq, 2,0 mmols) de Fmoc-Glu-OtBu foi dissolvido em NMP/DCM 1:1 (10 ml). 0,329 (2,2 eq, 2,4 mmols) de HOBT foi adicionado — seguido por adição de 0,37 ml (2,2 eq, 2,4 mmols) de DIC. A mistura de rea- ção foi deixada repousar 20 min e depois transferida para a resina e por fim

0,407 ml (2,2 eq) de DIEA foi adicionado. A mistura foi submetida a vórtice por 16 horas, filtrada e lavada com NMP (2x8 m!), DCM (3x8 ml), e NMP (5x8 ml). Um teste de TNBS positivo forneceu resinas incolores.

20% de piperidina/NMP (10 ml) foram adicionados, repousados por10 min repetidos uma vez. Filtrados e lavados com NMP (2x8 m!), DOM (3x8 ml), e NMP (5x8 ml). Um teste de TNBS positivo forneceu resinas ver- melhas.

Acilação com éster de mono terc-butila de ácido octadecanodioi- co: 0,75 g (2 eq, 2,0 mmolis) de éster de mono terc-butila de ácido octadecanodioico foi dissolvido em NMP/DCM 1:1 (10 ml). 0,32 g (2,2eq, 2,Ammols) de HOBT foi adicionado seguido por adição de 0,37 ml (2,2 eq, 2,4 mmols) de DIC. A mistura de reação foi deixada repousar 20 min e de- pois transferida para a resina e por fim 0,41 ml (2,2 eq) de DIEA foi adicio- nado. A mistura foi submetida a vórtice por 16 horas, filtrada e lavada com * NMP (2x8 m!), DCM (3x8 ml), e NMP (5x8 ml). - Clivagem com TFA: ' 8 ml de 5% de TFA/DCM foram acrescentados à resina e a mis- tura de reação foi submetida a vórtice por 2 horas, filtrada e o filtrado foi co- lhido. Mais 5% de TFA/DCM (8 ml) foram acrescentados à resina, e a mistu- ra foi submetida a vórtice por 10 min, filtrada e a resina foi lavada com DCM (2x10 ml). Os filtrados combinados e lavagens foram ajustados no pH para básico usando cerca de 800 ul de DIEA. A mistura foi evaporada a vácuo rendendo um óleo (3,5 g). Dietiléter (30 ml) foi adicionado e o óleo dissolvido foiseparado através de decantação e evaporado a vácuo. Isto forneceu 1,1 g de éster de terc-butila de ácido 17-((S)-1-terc-butoxicarbonil-3-[2-(2-(1[2-(2- carboximeto- xietó- xi)etilcarbamoil|metóxiletóxi)etilcarbamoil]propilcarbamoil)heptadecanoico (nome alternativo: octadecandioil-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU de terc-butila) como um óleo.

LC-MS (Sciex100 API): m/z = 846,6 (M+1)+.

Ativação de OSu: O octadecandioil-Glu(OEG-OEG-OH)-OtBU de terc-butila acima (0,63 g) foi dissolvido em THF (35 ml). DIEA (0,255 ml, 2 eq.) foi adicionado seguido por TSTU (0,45 g, 2 eq.), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas. A mistura foi dividida entre acetato de etila (250 ml) e NaHSO, aquoso (3 x 100 ml). A fase orgânica foi secada (MgSOy) e concen- trada a vácuo para fornecer 0,65 g de éster de terc-butila de ácido 17-((S)-1- terc-butoxicarbonil-3-(2-[2-((2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1- iloxicarbonilmetó- xi)detóxileticarbamoilimetóxi)etóxiletilcarbamoil)propilcarbamoil)heptadecanoi co (nome alternativo: octadecandioil-Glu(OEG-OEG-OSu)-OtBu de terc- butila) como um óleo.

LC-MS: m/z = 943,4 (M+1). EXEMPLO 10. PROCEDIMENTO GERAL (A): “15 Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfmiristila), desB30 : O : — HEAD NH - "6 VEGCÇTS TOSLEGLENTYON=" j Fi i ! . Es mwFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N Ho Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a partir de 1-tetradecanoil-pirrolidina-2,5-diona acima. MALDI-TOF MS: m/z = 5873,6. Calc.: 5872,9. EXEMPLO 11. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Neicosanodioil-yGlu-yGlu), desB30

Oo H O Ho AS on o à dg 2 o NA OH — A NH “GIVEQCCTSICS LEQLENYCNe: | | . OH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N Ho Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a - partir de éster de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 5-terc-butila de áci- do (S)-2-[4-terc-butoxicarbonil-4-(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino) " butirilamino]pentanodioico.

: 5 MALDI-TOF MS: m/z = 6242,5. Calc.: 6245,2.

' Preparação de éster de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 5- terc-butila de ácido (S)-2-[4-terc-butoxicarbonil-4-(19-terc-butoxicarbonil- nona-decanoilamino)butirilamino]pentanodioico.

1. Éster de terc-butila de ácido (S)-2-[4-terc-Butoxicarbonil-4-(19- terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)butirilamino]pentanodioico A uma solução de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de ácido (S)-2-(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino) pentanodioico (preparado similarmente como descrito em WO 2005/012347) (4,1 g) em THF (100 ml) foi adicionada uma solução de H-Glu-OtBu (1,47 9) em água (20ml). O pH foi ajustado para 8 com DIPEA. A mistura foi concen- trada após agitação por 1,5 h. O resíduo foi recristalizado de DCM para dar o composto do título como um sólido branco (2,81 g, 61%). LC-MS: m/z = 769 (M+1). Éster de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 5-terc-butila de ácido (S)-2-[4-terc-Butoxicarbonil-4-(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoila-

mino) butirilamino]pentanodioico A uma solução de éster de 1-terc-butila de ácido (S)-2-[4-terc- butoxicarbonil-4-(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)butirilamino] pen- tanodioico (2,81 g) em acetonitrila (80 ml) foi adicionada uma solução de TSTU(1,32g)em acetonitrila (20 m!). O pH foi ajustado para 8 com DIPEA. Após agitar por 1,5 h, a mistura foi concentrada. O resíduo foi recristalizado de acetonitrila para dar o composto do título (1,7 g, 54%). LC-MS: m/z = 866,4 (M+1). EXEMPLO 12. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“4-([4-((19-carboxinonadecanoila- minoimelipiranseilo-haxanasadoni-VOlu-veSia), desB30 PEIDDDDDDDÁÂAO a. º mp os

SN o do, | e dy 1 "GI VEGCOTS | CSLEGLENYVON Ss Ss ; fo E rFVNQHLCGSHLVEALY LVOGERGFAYTP-N 5 Esta insulina foi similarmente preparada como descrito acima a partir de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de áci- do 2-[4-terc-butoxicarbonil-4-(f4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino) metillciclo-hexanocarbonilYamino)butirilamino]pentanodioico LC-MS (eletropulverização): m/z: 6386 (M+1). Calc.: 6384. Preparação de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1- terc-butila de ácido 2-[4-terc-butoxicarbonil-4-((4-[(19-terc-butoxicarbonil- nona-decanoilamino)metil|ciclo-hexanocarbonil)amino)butirilamino] pentano- dioico.

1. Éster de 1-terc-butila de ácido 2-[4-terc-Butoxicarbonil-4-((4- [(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil|ciclo-hexanocarbonil)| ami-

no)butirilamino]pentanodioico A uma solução de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de ácido 2-((4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino) metil|ciclo-hexanocarbonilYamino)pentanodioico (5,0 g) em THF (100 ml) foi adicionada uma solução de H-Glu-OtBu (1,36 g) em água (25 ml). Após agi- tar durante a noite, a mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi precipi- tado de água e filtrado e secado a vácuo para dar o composto do título (4,63 9g, 84%).

LC-MS: m/z = 740 (M-3x56, perda de 3xt-Bu).

Éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de ácido — 2-[4-terc-Butoxicarbonil-4-(f4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoila- mino) metil|ciclo-hexanocarbonil)amino)butirilamino]pentanodioico A uma solução de éster de 1-terc-butila de ácido 2-[4-terc- butoxicarbonil-4-((4-[(19-terc-butoxicarbonilnonadecanoilamino)metil|ciclo- hexanocarboniljamino)butirilamino]pentanodioico (4,6 gq) em THF (150 ml) foi *. adicionado TSTU (1,68 g). DIPEA (0,97 ml) foi adicionado. Após agitar du- - rante a noite, a mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi cristalizado de ' acetonitrila para fornecer o composto do título como um sólido (4,4 g, 87%) LC-MS: m/z = 837 (M-3x56, perda de 3xt-Bu).

EXEMPLO 13. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil-yGlu-yGlu), desB30 o H o Ho or o à du q Oo Nou e Aus HGIVEQCCTSICSLEQLENYCNo Í i | / Ss Ss | | * OH wFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYT PN

O O efeito oral deste composto em ratos Wistar machos de jejum à noite é dado na figura 7 abaixo. LC-MS: m/z = 1555 (M+4)/4. . EXEMPLO 14. PROCEDIMENTO GERAL (A): . 5 Insulina humana de A14E, B28D, B29K(N octadecandioil-yGlu), desB30 : o H o , Ho ou

A PA O “NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o : Í 1 / Ss Ss h | * oH

HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGF FYTDN o MALDI-TOF MS: m/z = 6118 EXEMPLO 15. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nº octadecandioil-yGlu-PEG?7), desB30 o q" o Ho No o o EA NI IA OA OA On

H i oo GI. vFQCEÇTS 1 CSFFQLENYCON | | - OH

PPFUMNODLCOGSHLVEALYVLVOGERGFNYVTPAN Oo MALDI-TOF MS: m/z = 6510 EXEMPLO 16. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfeicosanodioil-y/Glu-OEG-OEG), desB30 o H o Ho CADA ou - o o o NÚ oh * ÊNIO OO ADA NH

H . o

À À : HGIVEQCCTS|CSLEQLENYCN-o i Í 1 /

Í À “FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFRYTP-N OH

O O efeito oral deste composto em ratos Wistar machos de jejum à noite é dado na figura 3 abaixo. MALDI-TOF MS: m/z = 6407 O reagente de acilação intermediário para este exemplo foi pre- parado como descrito no seguinte: Etapa 1: éster de ferc-butila de ácido 19-f(S)-1-terc-Butoxicar- bonil-3-[2-(2-1[2-(2-carboximetóxi-etóxi)-etilcarbamoil]-metóxi)-etóxi)- etilcarbamoil]-propilcarbamoil)-nonadecanoico cH, O O CH Neo Wo A KER o º " o o rs + IO ONO MA o Õ º cH, O O CH neo AAA NO A o “ o o ONDA No on H fe) A uma solução de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de ácido 2-(19-ferc-Butoxicarbonilnonadecanoilamino) pen- tanodioico (2,50 g, (preparado similarmente como descrito em WO CO 2005/012347) e ácido [2-(2-(2-[2-(2-aminoetóxi)etóxilacetilamino) etóxi) etó- “5 xilacético (147 g, nome alternativo: dímero de ácido 8-amino-3,6- . dioxaoctanoico, IRIS Biotech GmbH, Cat.

No.

PEG1221) em etanol (40 ml) foi adicionado DIPEA (1,26 ml). A mistura foi agitada em temperatura ambi- ente durante a noite e depois concentrada a vácuo.

Ao resíduo foram adicio- nados 0,1 N de HCI aquoso (150 ml) e acetato de etila (200 ml). As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (100 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água e salmou- ra, secadas (sulfato de magnésio) e concentradas a vácuo para dar um óleo, que cristalizou-se sob repouso.

Rendimento 96% (3,1 g). LC-MS (eletropul- verização): m/z = 874,49. Etapa 2: éster de ferc-butila de ácido 19-((S)-1-terc-Butoxicar- bonil-3-(2-[2-((2-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonilmetóxi)-etóxiJetilcar- bamoil) metóxi)etóxiletilcarbamoil)propilcarbamoil)nonadecanoico:

me Q H Q er, HCO po CH, o o

H o. o WOOD O OO Au

H o CH; o o CH, He H EH, Ke o Ro Ao cm o o”

H o o o A H o o A uma solução de éster de ferc-butila de ácido 194(S)-1-terc- ' Butoxicarbonil-3-[2-(2-([2-(2-carboximetoxietóxi) etilcarbamoillmetóxi) etó- xi)etilcarbamoil] propilcarbamoilInonadecanoico (3,1 g) em acetonitrila (50 - ml) foram adicionados TSTU (1,39 g) e DIPEA (0,91 ml). A mistura foi agita- : 5 daem temperatura ambiente durante a noite e depois concentrada a vácuo. - Ao resíduo foram adicionados 0,1 N de HCI aquoso (100 ml) e acetato de etila (200 ml). As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lava- das com água e salmoura, secadas (sulfato de magnésio) e concentradas a vácuo para dar um óleo. Rendimento 99% (3,4 g). LC-MS (eletropulveriza- ção): m/z: 971,8. Etapa 3: ácido 19-((S)-1-Carbóxi-3-(2-[2-((2-[2-(2,5-dioxopirro- lidin-1-iloxicarbonilmetóxi) etóxiletilcarbamoilmetóxi)etóxiletilcarbamoil) pro- pilcar-bamoil) nonadecanoico:

cH, O , O CH

PIC o 5º o e AE? o NO OA NO o b ” o à, o Ho Wo ou

PE o NOTONDOOA oh?

H F O Éster de ferc-butila de ácido 19-((S)-1-terc-Butoxicarbonil-3-(2- [2-(12-[2-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonilmetóxi)etóxiletilcarbamoil) |— metó- + xi)etóxiletilcarbamoil) propilcarbamoil)nonadecanoico (3,4 g) foi agitado em TFA (75 ml) por 45 min e depois concentrado a vácuo. O resíduo foi concen- " 5 trado com tolueno 3 vezes para dar um sólido. O resíduo foi cristalizado em : 2-propanol e filtrado para dar um composto cristalino branco. Rendimento ' 80% (2,4 g). LC-MS (eletropulverização): m/z: 859,44. O reagente de acilação similar com o fragmento de ácido octa- decanodioico (por exemplo, usado no exemplo 26 e outros exemplos) pode sersimilarmente preparado. EXEMPLO 17. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Neicosanodioil-yGlu-(3-(2-(2-[2-(2- aminoetóxi)etóxiletóxiletóxi)propionil-yGlu), desB30 o H O Ho PAI ou A ?

AVI ÇAD IN À oo o o Nou e Au mGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o+ Í : : “S | | + OH sWFVNQHLCGSH LVEALVEVCORRSFANVT PA Oo ES-MS: m/z = 1626 (M+4) EXEMPLO 18. PROCEDIMENTO GERAL (A): - Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nºhexadecanodioil-y/Glu-OEG-OEG), : desB30 : Oo w o | HO PAODAAADNA on - O ny o o N oh o NO OO O QONE NH H o o HGIVEQCCTS|CSLEQLENYCN-o1 Í i Ss sÓ | | + OH HWFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N Ho MALDI-TOF MS: m/z = 6348 EXEMPLO 19. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(n“hexadecanodioil-yGlu), desB30

O H O OI Sou | A Oo NH h DI HG IWVEQGERTS ! CSLEQGLENYONON S 8 À oerer

HFVNQHLCGSHLVEA LYLVOGERGFHYTPN OH

O MALDI-TOF MS: m/z = 6062 EXEMPLO 20. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nºhepadecanodioil-yGlu- OEG-OEG), desB30

P H " Ho RPEODIO DIDO O o o O

H ” o Ea a 4 o Í | MeIVEQEGTSICSLEGLENTENM i a | Í MEVNONCLCOSGSHEVEALYLIVOGERGENVTPYH a o ES-MS: m/z = 1592 (M+4) EXEMPLO 21. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil-yGlu - yGlu -yGlu -yGlu), desB30 e A, | À Ad Ad, [— A. menrveReeqprs est toeieNtTfOT i / | | os "FVNOQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHNYTPN o os ES-MS: m/z = 1620 (M+4) - O reagente de acilação intermediário octadecanodioil-yGlu -yGlu Vs -yGlu -yGlu-OSu (com ésteres de terc-butila como grupos de proteção em ácidos carboxílicos restantes) foi preparado como descrito abaixo: ÉSTER DE 2,5-DIOXOPIRROLIDIN-I-ILA DE ÉSTER DE TERC-BUTILA DE ÁCIDO OCTADECANODIOICO

JP No Ha Far o CH; Éster de mono-terc-butila de ácido octadecanodioico (4,2 g, 0,011 mol) foi dissolvido em THF (20 mL), TSTU (4 g, 0,013 mol) em aceto- nitrila (20 ml) foi adicionado e pH da solução foi ajustado para 8 com a adi- çãoem gotas de DIPEA. A mistura foi agitada em TA por 4 h, depois acidifi- cada com HCI (2M) para pH 3 e evaporada a vácuo. O óleo residual foi sub- sequentemente dividido entre acetato de etila e HCI (0,1 M). A camada or- gânica foi secada (MgSO;), filtrada e evaporada à secura a vácuo. Isto for-

neceu 5,2 g de éster de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila de éster de ferc-butila de ácido octadecanodioico como um óleo que poderia ser usado na próxima etapa sem outra purificação. LC-MS (eletropulverização): m/z = 468 (M+1) e 412 (M+1-'Bu). ÉSTER DE 1-TERC-BUTILA DE ÁCIDO (S)-2-(17-TERC- BUTOXARBONIL-HEPTADECANOILAMINO)-PENTANODIOICO. CH, O H O CHocn RPA oa, A. Ho “o Éster de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila de éster de terc-butila de ácido octadecanodioico (7 g, 0,015 mol) foi dissolvido em THF (80 ml) e adiciona- do a uma solução de H-Glu-O'Bu (3,7 g, 0,0165 mol) em NazCO; (0,1 M, 40 ml) A mistura foi agitada em TA durante a noite, depois acidificada com HC! (2M) para pH 3 e evaporada a vácuo. O resíduo foi dividido entre acetato de oo etila e HCI (0,1 M). A camada orgânica foi secada (MgSO;), filtrada e evapo- ' rada à secura a vácuo. Adição de acetonitrila (30 ml) causou a formação de ' - um precipitado branco que foi isolado através de filtração e secado para for- necer 3,75 g de éster de 1-terc-butila de ácido (S)-2-(17-terc-butoxarbonil- heptadecanoilamino)pentanodioico. LC-MS (eletropulverização): m/z = 556 (M+1).

Sob evaporação do filtrado de acetonitrila mais 2,6 g de produto foram isolados.

ÉSTER DE 5-(2,5-DIOXOPIRROLIDIN-1-ILA) DE ÉSTER DE 1- TERC-BUTILA) DE ÁCIDO (S)-2-(17-TERC-BUTOXICARBONIL- HEPTADECANOILAMINO)PENTANODIOICO CH, ? H QD cn eo ot on, CH, o CH, na

Éster — de 1-terc-butila de ácido (S)-2-(17-terc-Butoxarbonil- heptadecanoilamino)pentanodioico (3g, 0,005 mol) foi dissolvido em THF (100 ml) e adicionado a uma solução de TSTU (1,78 g, 0,006 mol) em ace- tonitrila (30 ml). O pH foi ajustado para 8 pela adição a gotas de DIPEA. A mistura foiagitadaem TA por 1h, depois acidificada com HCI (2M) para pH 3 e evaporada a vácuo. O óleo residual foi subsequentemente dividido entre acetato de etila e HCI (0,1 M). A camada orgânica foi secada (MgSO;,), filtra- da e evaporada a vácuo à secura. Isto forneceu um sólido branco (2,75 g) de éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de ácido (S)-2- (1I7-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino)-pentanodioico. LCMS (eletro- pulverização): m/z = 653 (M+1).

ÉSTER DE 1-TERC-BUTILA DE ÁCIDO (S)-2-[(S)4-TERC- BUTOXICARBONIL-4-(17-TERC-BUTOXICARBONIL- HEPTADECANOILAMINO)BUTIRILAMINO]-PENTANODIOICO mn o & o H . o HÇ P ni: elo I CH, Éster de 5-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc-butila de ácido (S)-2-(17-terc-Butoxicarbonil-heptadecanoilamino)pentanodioico (0,5 9, 0,766 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (20 ml). Esta solução foi acrescen- tada a uma solução de H-Glu-OtBu (0,17 1g, 0,84 mmol) em água (30 ml), pH foi ajustado para 10 com DIPEA. A mistura foi agitada em TA por 15 min, depois acidificada em pH 7 com HCI (2M) e evaporada a vácuo. O resíduo foi dividido entre acetato de etila e HCI (0,1 M). A camada orgânica foi seca- da (MgSO;), filtrado, e evaporada a vácuo à secura. Isto rendeu éster de 1- terc-butila de ácido (S)-2-[(S)-4-ferc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)butirilamino]pentanodioico como um óleo. LC-MS (ele-

tropulverização): m/z = 741 (M+1). ÉSTER DE 1-(2,5-DIOXOPIRROLIDIN-1-ILA) DE ÉSTER DE 5- TERC-BUTILA DE ÁCIDO (S)-2-[(S) 4-TERC-BUTOXICARBONIL-4-(17- TERC-BUTOXICARBONIL-HEPTADECANOILAMINO)BUTIRILAMINO]- — PENTANODIOICO &

H A CH;

A A CH; o o Éster de 1-terc-butila de ácido (S)-2-[(S)-4-terc-Butoxicarbonil-4- .. (17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino)butirilamino]-pentanodioico (89, " 10,79 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (40 ml) e uma solução de TSTU Ú - (3,89 g, 12,95 mmol) em acetonitrila (40 ml) foi adicionada. O pH foi ajustado para8 pela adição em gotas de DIPEA. A mistura foi agitada em TA por 1 h, depois acidificada com HCI (2M) para pH 3 e evaporada a vácuo. Isto forne- ceu um óleo que foi subsequentemente dividido entre acetato de etila e HC! (0,1 M). A camada orgânica foi secada (MgSO;), filtrada e evaporada à se- cura a vácuo. Isto forneceu 8,2 g de éster de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 5-terc-butila de ácido (S)-2-[(S)4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc- butoxicarbonil-heptadecanoilamino)-butirilamino]pentanodioico como um só- lido. ÉSTER DE 1-TERC-BUTILA DE ÁCIDO (S)-24(S)-4-TERC- BUTOXICARBONIL-A4-[(S)-4-TERC-BUTOXICARBONIL-4-(17-TERC- —BUTOXICARBONIL-HEPTADECANOI/LAMINO) BUTIRILAMINO] BUTIRI- LAMINO) PENTANODIOICO o AAA CH, o cH, HN CH;

A

E HC H CHEH, RARA AA AA e Éster de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 5-terc-butila de ácido (S)-2-[([S)-4-terc-Butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil-heptade- canoila-mino)butirilamino]-pentanodioico (49, 4,77 mmols) foi dissolvido em acetonitrila (30 ml) e adicionado a uma solução de H-Glu-OtBu (1,07 g, 5,25 mmols)em NaCO; (0,1M, 20 ml). A mistura foi agitada em TA por 1 h, de- Co pois neutralizada com HCI (2M) para pH 7 e evaporada a vácuo. O óleo resi- . dual foi subsequentemente dividido entre acetato de etila e HCI (0,1 M. À . camada orgânica foi secada (MgSO;,), filtrada e evaporada à secura a vácuo. O resíduo (4 g) foi dissolvido em acetonitrila e tratado com carbono ativo.

Após filtração e evaporação para secura seguida por secagem durante a noite a vácuo, 2,8 g de éster de 1-terc-butila de ácido (S)-24(S)-4-terc- Butoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)butirilamino]butirilamino)pentanodioico que foi obtido como um sólido cristalino. LC-MS (eletropulverização): m/z = 927 (M+1).

ÉSTER DE 1-TERC-BUTILA DE ÁCIDO (S)-2-((S)-4-TERC- BUTOXICARBONIL-4-((S)-4-TERC-BUTOXICARBONIL-4-[(S)-4-TERC- BUTOXICARBONIL-4-(17-TERC-BUTOXICARBONIL-HEPTADECANO- ILAMINO)BUTIRILAMINO]BUTIRILAMINO)BUTIRILAMINO)-PENTANO-

DIOICO

H FE 3 3 o o H o N CH, och, HN CH, o N o

H CH. ne E, H,C 4 o eHGn, he CH, CH, o Éster de 1-terc-butila de ácido (S)-24(S)-4-terc-Butoxicarbonil-4- [(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino) buti- rilamino] butirilamino)pentanodioico (2,8 g, 3,02 mmols) foi ativado com TS- r.” TU (1,0 g, 3,325 mmols) usando o mesmo método como descrito acima, en- - 5 quanto fornecendo éster de 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-ila) de éster de 1-terc- butila de ácido (S)-2-((S)-4-terc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-ferc-butoxicarbonil4- (17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoilamino)-butirilamino]butirilamino)- pentanodioico bruto. LC-MS (eletropulverização): m/z = 1024 (M+1). 1,3 g deste composto foi dissolvido em acetonitrila (40 ml) e adi- cionadoa uma solução de H-Glu-O'Bu (0,28 g, 1,39 mmol) em água (30 ml), pH foi ajustado para 9,3 com DIPEA. A mistura foi agitada em TA por 2 h, depois neutralizada em pH 7 com HCI (2M) e depois evaporada a vácuo à quase secura. O resíduo foi tratado com água que dá um precipitado branco que foi filtrado. Após secar a vácuo durante a noite, 1,1 g de éster de 1-terc- butila de ácido (S)-2-((S)-4-terc-butoxicarbonil-4-f((S)-4-terc-butoxicarbonil-4- [(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicarbonil- heptadecanoilamino)butirilamino]butirilamino)butirilamino)pentanodioico — foi isolado, contendo quantidades secundárias de material de partida. LC-MS (eletropulverização): m/z = 1111,9 (M+1). ÉSTER DE 1-TERC-BUTILÉSTER-5-(2,5-DIOXOPIRROLIDIN-1-

IA) DE ÁCIDO (S)-2-((S)4-TERC-BUTOXICARBONIL-4-f(S)-4-TERC- BUTOXICARBONIL-4-[(S)-4-TERC-BUTOXICARBONIL-4-(17-TERC- BUTOXICARBONIL-HEPTADECANOILA-MINO)BUTIRILAMINO]BUTIRILA- MINO) BUTIRILAMINO)-PENTANODIOICO H. ne Fen, o Oo: o " o o ARA CH; oc, d- YE o X o O: N o t L ne SE Ha! n o eHEH, eo ÇÃ CH, o CH; o Éster de 1-terc-butila de ácido (S)-2-((S)-4-ferc-Butoxicarbonil-4- oo 1(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-[(S)-4-terc-butoxicarbonil-4-(17-terc-butoxicar- . bonil-heptadecanoilamino)butirilamino]butirilamino) butirilamino)pentanodioi- ] : co (0,1g, 0,09 mmol) foi ativado com TSTU (29,8 mg, 0,099 mmol) em solu- ção de acetonitrila em TA por 1h usando o mesmo método para ativação e processamento como descrito acima.

Isto forneceu 100 mg de produto ativa- do bruto que poderia ser usado como tal para acilação de insulina sem outra purificação.

LC-MS (eletropulverização): m/z = 1208 (M+1). EXEMPLO 22. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Neicosanodioil-yGlu- yGlu-yGlu), desB30

IA wo 7 ou o x 9 es ">. oH PA À, "GI IVEQCCTSICSLEQLENYCNO [ Í í á | | = -oH "FVNOULEGSULILVEALYLILVCOCGERGFRNYTPAA o MALDI-TOF MS: m/z = 6373 EXEMPLO 23. PROCEDIMENTO GERAL (A): - Insulina humana de A14E, B25H, B27E, B29K(Noctadeca- ' nodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 - Oo " o

HO N | OH o H Oo o AFI QODS NO PAU-NND NS N o o NH .. N HG VvEQCCTS | CSLEQLENYENH 3 SP : ; HFFVNOWHLOGSHLVEALYLVCGERGFHYEPN oH Oo MALDI-TOF MS: m/z = 6407 EXEMPLO 24. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nfoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30

9 o

N 7 WA do o " o o ODIN o Am

H o N, ne! veRÓGTS ICS LÉGLENTENTA 7 Fa

Í Í WFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHGGÊN oH o O efeito oral deste composto em ratos Wistar machos de jejum à noite é dado na figura 6 abaixo. MALDI-TOF MS: m/z = 6188 EXEMPLO 25. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Noctadecano- . dioil-y/Glu-OEG-OEG), desB30 - No À ú -. Ho oH o | " ADA DRA, Ps, Ah o x o o NH

A meiveetprs ds ieetentçEo : / ervNoNCdasHevEeRLHLViGERGHEHNNTmA oH o O efeito oral deste composto em ratos Wistar machos de jejum à noite é dado na figura 4 abaixo. MALDI-TOF MS: m/z = 6352 EXEMPLO 26. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihna humana de A14E, B16E, B25H, B29K(Noctadeca- nodioil-y/Glu-OEG-OEG), desB30

Roo À

HO oH o ú AJ õ O AODIOA MI AO um o mervealireidsicarentçs i / rvnant basuivesinevicenararrma | o MALDI-TOF MS: m/z = 6345 EXEMPLO 27. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Nºhexade- canodioil-yGlu), desB30 n -. Ho oH : o

CÚ N À ' o OI WI O ne o mervealoreidsicarentçs i / ervnoNClasuivescaiviceenaravrmm Bs o O efeito oral deste composto em ratos Wistar machos de jejum à noite é dado na figura 5 abaixo. MALDI-TOF MS: m/z = 6041 EXEMPLO 28. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Neicosanodioil-yGlu- OEG-yGlu), desB30

EO

Í Í í O | Í or eVNONWNLCGSHIVEALYLIVOGERGFANYVTPA ES-MS: m/z = 1598 (M+4) EXEMPLO 29. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16E, B25H, B29K(Nºhexadecandioil- yGlu), desB30

A N. no Y oH o ê | i i Me VEQOÇTSIOSLIFQLENTENT Í 7 Í |

HEVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHAYT PHN OH o MALDI-TOF MS: m/z = 6028 EXEMPLO 30. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Noctade- canodioil-yGlu -yGlu -yGlu), desB30

A À, HO : oH

SI

GC ND H Y oH

AA H S oH o d MerveasprsItsttarentTENMT L Fá | au, , o ""FVNQOHLCGSHLVEALHLVCGERGFÁYT PH o ES-MS: m/z = 1581 (M+4) EXEMPLO 31. PROCEDIMENTO GERAL (A): GV Insulihva humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B286G, .o B29K(Nºhexadecandioil-yGlu), desB30 A À,

N HO Y oH o H

PA "elveaGegpts ' cstiQLENVYENM Ss Ss 1 / | Í WFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHGGAN oH o ES-MS: m/z = 1484 (M+4) EXEMPLO 32. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Noctadeca-

nodioil-yGlu -yGlu), desB30 AA À, Ho e oH p e H Y oH E o MervEGApTS CsrEA;ENTANT Í a | | ou WE VNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYT — o ES-MS: m/z = 1548 (M+4) EXEMPLO 33. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(N(EPS) eicosa- “6 nodioilyGlu-OEG-OEG), desB30 o i Fr. alta latas lit.

Rn ' A . ! 7 o ES-MS: m/z = 1596 (M+4) EXEMPLO 34. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil-OEG -yGlu -yGlu), desB30

REA ss RÃ o Cs Om mm TeilVvEMOÇTSICSLfoL ENYÇNT i Fá mEVNQNLCGSNLVENALYLVEGERGFAVTPAAA o ES-MS: m/z = 1592 (M+4) EXEMPLO 35. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, A18L, B25H, B29K(Neicosanodioil- YGIlu-OEG-OEG), desB30 ú no E o E POD Oo es, : ' x 1 O o MALDI-TOF MS: m/z = 6405 EXEMPLO 36. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, A18L, B25H, B29K(Nfoctadeca- nodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 wo Ho, o ODE Rx, A > o o ! v cereal terei fes i / o MALDI-TOF MS: m/z = 6377 EXEMPLO 37. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B27E, B29K(Neicosanodioil- YGlu-OEG-OEG), desB30 no Foo À, . o ' õ Poa

7. o | mervesiprs lee qe Í Fá erva osunivenivivicenarhverm ow o MALDI-TOF MS: m/z = 6433 EXEMPLO 38. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A1G(Nºoctadecandioil-YGlu-OEG-OEG), A14E, B25H, B29R, desB30

CA

DR A or om i Po rvmoWLbasuLvEeALYLVEGERGFÂNVTPACOO Insulina de A14E, B25H, B29R, desB30 (500 mg, 88 (umols) foi dissolvida em 0,1 M de NaHCO;, pH 8 (5 ml). w-carbóxi-heptadecanoil-y-L- glutamil-OEG-OEG-OSu (65 mg, 88 umols) foi dissolvido em THF/MeCN 1:1 (5 ml) e adicionado à solução de insulina. Após 30 minutos, a reação foi ex- tinguida por adição de 2 M de metilamina aquosa (0,5 ml). O solvente foi e- vaporado a vácuo e o sólido foi redissolvido na quantidade mínima de á- gua/MeCN. O pico do produto principal foi isolado por uso de RP-HPLC em coluna de C18, tampão A: 0,1% de TFA em água, tampão B: 0,1% de TFA " em MeCN, gradiente 30-55% de tampão B 45 min. As frações de produto -. 10 foram parcialmente evaporadas a vácuo e secadas por congelamento para ' fornecer 59 mg de produto (10%). Análise de LC-MS: M4+ = 1602,7, calcu- lada 1602,6. Duas etapas de análise da sequência de aminoácido padrão mostraram F-V, confirmando a acilação A1. EXEMPLO 39. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, B1F(Nºoctadecandioil-yGlu-OEG- OEG), B25H, B29R, desB30 ou ecc trauma rara a sa aa Catas : AT Í f Í / o Este composto foi isolado acima como um subproduto do exem- plo (exemplo 38). Análise de LCMS: M4+ = 1602,5, calculada 1602,6. Duas etapas de análise de sequência de aminoácido padrão mostraram G-l, con-

firmando a acilação a B1. EXEMPLO 40. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A1G(Nºhexadecandioil-yGlu), A14E, B25H, B29R, desB30 H o

NO

N o oH o | 4 o GIvEQGOpTSICSLÊGLENVENT! s s L 1 | |

HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHAYTPRO ES-MS: m/z = 1523 (M+4) Este composto foi similarmente preparado à A1-acilação descrita acima (exemplo 38), usando w-carboxipentadecanoil-y-L-glutamil(OSu) co- -s mo reagente de acilação. O produto mostrou LCMS: M4+ = 1523,2, calcula- . do 1523,0. Duas etapas de análise de sequência de aminoácido padrão - 10 mostraram F-V, confirmando a acilação A1. EXEMPLO 41. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(NFoctadecanodioil-yGlu- ABU-ABU-ABU-ABU), desB30

H N. to Po, o eh AO N. õ Jr OA " AX " o o — ! s Í SLEQLENYÇN "GIVEO T 1 LE L o

Í Í | / | | 4EVNOHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPH oH o

ES-MS: m/z = 1286 (M+5) O reagente de acilação para este exemplo foi preparado em analogia com o reagente preparado no exemplo 9, partindo de ligação de ácido 4-aminobutírico protegido por Fmoc à resina de 2-clorotritila, seguido por3 mais unidades de desproteção e ligação sequencial de ácido 4- aminobutírico protegido por 3 Fmoc, e como descrito no exemplo 9, Fmoc- Glu-OtBu e éster de mono-terc-butila de ácido octadecanodioico.

EXEMPLO 42. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, B25H, B29K(Nºeicosanodioil), desB30 o

OR "a "GIVEQC TSICSLEQLENY Neo Ú mevaenilesnivestrivicenaravros or o MALDI-TOF-MS: m/z = 5987 EXEMPLO 43. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nº4-[16-(1H-tetrazol-5- IL)hexadecanoilsulfamoil]butanoil), desB30

A Z s Ss | Í X "GivEGCÇTSICSLtaQLENYÇNO | ! É | | ' os "FvNoNWLCGSHLIVEALYLVCaERGFhVvT PA o

ES-MS: m/z = 1530 (M+4) Preparação do reagente de acilação intermediário: 600 un Ácido — 4-[16-(1H-Tetrazol-5-il)hexadecanoilsulfamoil]butanoico (500 mg, preparado como descrito em WO 2006/005667) foi dissolvido em etanol (2Oml),eTSTU (381 mg), e DIPEA (542 (ul) foi adicionado e a mistu- ra resultante foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas.

A mistura foi concentrada a vácuo, e o resíduo foi agitado com 0,25 M de HCl.

O sólido foi isolado através de filtração, lavado com água e secado a vácuo para forne- cer 580 mg (91%) do reagente de acilação.

Reação de acilação: A14E, B25H, desB30 (500 mg) foi dissolvido em 0,1M de carbo- o nato de sódio aquoso (10 ml) e etanol (A4mL). O pH foi ajustado para 10,8 - com 1IN de NaOH.

O acima reagente de acilação (101 mg) dissolvido em CV THF (2mL) e etanol (2 ml) foi adicionado em duas porções com 10 minutos | 15 deintervalo.

A mistura resultante foi agitada lentamente para 1 hora e diluída com água (50 ml). A insulina resultante foi precipitada por adição de IN de HCl em pH 5,5, O precipitado foi isolado através de centrifugação e purifica- do por HPLC.

Foram agrupadas e liofilizadas frações puras.

EXEMPLO 44. PROCEDIMENTO GERAL (A): A1G(Nºoctadecandioil-yGlu-OEG-OEG), A14E, A21G, B25H, desB30 RAIO À y |O = EXITO OOOOO SE MALDI-TOF-MS: m/z = 6321 EXEMPLO 45. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfeicosanodioil-OEG), desB30

Ai À o CarveAAqra Pest eAtENTEMOO i / o MALDI-TOF-MS: m/z = 6130 EXEMPLO 46. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B27K(Noctadecanodioil-yGlu- OEG-OEG), desB28, desB29, desB30 Foo N.

HO oH É | - H N ed -. õ OO AOS SA N o i | ""GIVEQC TSICSLEQLENY Nor f f 1 / s s | | : or HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFH Y-HN o MALDI-TOF-MS: m/z = 6181 EXEMPLO 47. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insuliha humana de A14E, B25H, B29K(N(ácido 5- eicosanodioilaminoisoftálico)), desB30

H

O o A Or melvEeEACpTSICSLEaLENTANT t 7 s $ | | : ou IPUNONLGSSHLIVERI VIVOSERGrHTT PA o MALDI-TOF-MS: m/z = 6150 EXEMPLO 48. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioíla), desB30 po À

NH s———=- o -. verveetpre tsrierent es ' Í / o s $ | | ' OH TFVNGQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP—N o MALDI-TOF-MS: m/z = 5959 EXEMPLO 49. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B29K(Noctadecanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30

FA vp mMecetprec ester qo Í Pá

E ES-MS: m/z = 1598 (M+4) EXEMPLO 50. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nfeicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 "* o H o j N .o 7 DDD Dou o n o o NO Mo a on

H o Pod HG! veGóETS IESLEQGLENYENOA WFVNQNLCGSHLVEALYLVEGERGFHGGON oH o MALDI-TOF-MS: m/z = 6216 EXEMPLO 51. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(NOctadecanodioil-yGlu- OEG), desB30

AA, o &

SOOOO mervesipra istiecençes i / | | : ou mAVNQWLCGSHLVEALYIVOGERGFNyTPN o ES-MS: m/z = 1559 (M+4) EXEMPLO 52. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(NEicosanodioil-OEG- OEG), desB30 o DDD Asa A ' | Los o j' L |

L ÚÓ , | | : ou EL MALDI-TOF-MS: m/z = 6278 EXEMPLO 53. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(NEicosanodioil-Aoc), desB30

IA À o = 8 | | º Y MenveAsprs tt tarENnTAMT ! 1 | | ow "FVvNoOHLCGSHLVEALYLVCGERGFhNYTPN o MALDI-TOF-MS: m/z = 6126 EXEMPLO 54. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NEicosanodioil-yGlu -yGlu), desB30 o Ho

PÔ DO Y Nº -

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NH —— EREEISSENS EESTAS EANES

Í Ó ervnant lesivo vlarçor had im Y” o ES-MS: m/z = 6055 (desconvoluto) EXEMPLO 55. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihva humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B286G, .-. B29K(NfEicosanodioil-yGlu -yGlu), desB30 - o HD o o. AAA ADO N/A

H o bo Hm

OA Oo HN ervealo a lara | / ervacnelasueverckherlacaarkrr om OH o ES-MS: m/z = 6220 (desconvoluto) EXEMPLO 56. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“Octadecanodioil- OEG), desB30 o o ALA AA, mervealire baianos” : / | | . ou PF vNQWLICGSNLILVEALYLIVCGERGFAYT PN o MALDI-TOF-MS: m/z = 6101 EXEMPLO 57. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(NFOctadecanodioil-/Glu-OEG-OEG), desB30 o Wu Oo a sa as HO oH 7 | Á

H o Aa o Re], ". weivealersilsriarenvewno: S : A?

Í Í HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHY PN oH

H o MALDI-TOF-MS: m/z = 6277 EXEMPLO 58. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A1A4E, B25H, B16H, B29K(N“Octadecanodioil-yGlu), desB30 o no à Pod

HWGIVEQCCTSICSLEQLENYCNOK : ? Í o | ; HFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPHN oH o ES-MS: m/z = 1516 (M+4) EXEMPLO 59. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A1G(NºOctadecanodioil), A14E, B25H, B29R, desB30 Ro À, í i : enveseçts 1esteorentfNT ' i Ú a 2 *EVNONLCGSHLVEALYLVCGERGEHYTPÃO To ES-MS: m/z = 1498 (M+4) EXEMPLO 60. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(NEicosanodioil- yGlu), desB30 o no da, o ã Pod eoivendeTe óSsLEGLENT ÇA t /

Í Í WevNaHLCGsHLVEALHLVEGERGFÁVTPAHN oH o ES-MS: m/z = 1523 (M+4) EXEMPLO 61. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B27K(NEicosanodioil-yGlu),

desB28, desB29, desB30

PARRRRARANDO no os o õ Paiao A o envelopes qe i / ervusanelasui ves riviceneravra oH o MALDI-TOF MS: m/z = 6208 EXEMPLO 62. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(NOctadecanodioil-yGlu -yGlu-yGlu), desB30 8 Ro A — A Í á | | JH or ES-MS: m/z = 1587 (M+4) As insulinas aciladas da invenção nos exemplos seguintes po- dem ser similarmente preparadas: EXEMPLO 63. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B286G, B29K(NfOctadecandioil-yGlu), desB30 o H o 6 IA ou o NH

É HG VEQGOÇTS 1 CSLÉQLENYCNeOH 3 : ;

HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHGGÊN OH Oo EXEMPLO 64. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NEicosanodioil-yGlu), desB30 o nº , o io .. o NH .—

HGIVEQCCTS ICSLÉQLENYCNEH : É HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHGGÊN oH o EXEMPLO 65.PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulihna humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NfOctadecandioil), desB30

O HO. ODOOADADADAm o tore É

HG VEGSOCETS ICSL ÉQLENYCNOH S 8 ;

HF VNQH LCGSHLVEALYLVCGERGFHGGÊN OH Oo

EXEMPLO 66. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insuliha humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NEicosanodioil), desB30 o

PÔ NH º É

HG IVEQCCTSICSLÉQLENYCNOH $ S P : .

HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHGGÊN OH o EXEMPLO 67. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“docosanodioil-yGlu), desB30 o o

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A , | | O NH GV “GI VEQCCTSICSLEQLENYCN-o+ =. | | -. 1 / Ss Ss | | » OH

HWFVNQHLCGSHLVEALY LVOGERGFHY TPM

O EXEMPLO 68. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nºdocosanodioil-yGlu-yGlu), desB30 o o

H Ho IS or o É du q o Nou — o "GIVEQCCTSICSLEQLENYCN-+

Í Í l / Ss Ss | | . OH

HWFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYT PN Oo

EXEMPLO 69. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nicosanodioil-yGlu-OEG-OEG- yGlu), desB30 o W o HO ODDS OOo Oo o N ou 7 coa NV o NA ou e A qe HG IVEQCCTSICSLEQLENYCN-eo ; : i / s Ss | | . OH

WFVNQHLCGSHLVEALY LVOGERGFNTTPA o Oo - EXEMPLO 70. PROCEDIMENTO GERAL (A): CÚ Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG- vyGlu), desB30 o H o Ho JOAO OO OO

O o N o lu 7 Aa Dt DADAS o X o NA oH pH A "GIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o i Í | / Ss Ss | | " OH H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYT PAN

O EXEMPLO 71. PROCEDIMENTO GERAL (A):

Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nº (N-icosanodioil--carboximetil)- BAla), desB30

O o fon Ho IN N

O O Pp NH HGIVEQCCTSICS LÊÉQ LENYCN-+o" i Í l " Ss Ss | | . OH "FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N no EXEMPLO 72. PROCEDIMENTO GERAL (A): . Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nº3-[2-(2-(2-[2-(17-carbóxi- -. 5 heptadecanoilamino)etóxiletóxiletóxi)etóxilpropionil-yGlu), desB30 - 9 H o o : toda o a o A ou o o à Ao no "Gl VEQOÇTS ICS LEGLENYON oH FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFÂYTP-N oH Oo EXEMPLO 73. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“3-[2-(2-(2-[2-(19- carboxinonadecanoilamino)etóxiletóxiletóxi)etóxilpropionil-yGlu), desB30 o H "ss Io a o O son o o à 1 À no "Gl! VEQCÇTS l CSLEGLENTON oH i Ú *FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFAYTP-N or

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EXEMPLO 74. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfoctadecandioil-yGlu-(3-(2-(2-[2-(2- aminoetóxi)etóxiletóxiletóxi)propionila), desB30 O o

N HO CAIA ou º [9) o NO Ia NON i Í 4GIVEQCCTS|ICSLEÉQLENYCN-o"

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À À "FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N OH

O o : EXEMPLO 75. PROCEDIMENTO GERAL (A): . 5 Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecandioil-yGlu-(3-(242-[2-(2- CÚ aminoetóxi)etóxiletóxi)etóxi)propionil-yGlu), desB30 O o

N Ho PAD AAAAA Ao Oo o o

H o WO mamona Ai lo, PA Ave "GI IVEQCCTSICSLEQLENYCN-+o+ i i | / Ss Ss | | - OH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N Ho EXEMPLO 76. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nicosanodioil-yGlu-(3-(2-(2-[2-(2-

aminoetóxi)etóxiletóxiletóxi)propionila), desB30 o H o Ho No on Õ Oo o WO Io NaN n Po “GI VEQCCTS|CSLEÉQLENYCN-o+ i Í 1 Pá Ss Ss | | . OH r-FVNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFHYTP-N

O EXEMPLO 77. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(N4-([4-(117- carboxinonadecanoilamino)metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu), desB30

O -. PIDDDDDDIAÂAIIO H O o O mp or Po O NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o | | | / Ss Ss | | é OH mwFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP-N no EXEMPLO 78. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de Al4E B25H, —B29K(Nf4-([4-((17-carbóxi- heptadecanoilamino)metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu-yGlu), desB30 o PEIDDIDDDDAO no º mp or o à a q o NA Oh e Lu HGIVEQCCTS|CSLEQLENYCN-o+ i Í 1 / Ss Ss | | . OH HFVNQH LOGSHALVEALYLVOGERGFÁYTP-N Oo EXEMPLO 79. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28D, B29K(Nº hexadecandioil-yGlu), desB30 o H o o Ho NS Sor : A j 1 O NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN- o ; À i / Ss Ss | | * oH H-FVNQH LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDXN o EXEMPLO 80. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28D, B29K(N eicosanodioil-yGlu), desB30 o H O Ho ou Oo 3 j 7 1 . O NH 4 GI! VEQCCTS ICSLEQLENYCN- o" Í ; ' 7

À À * H HWFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTD—XN o fo) EXEMPLO 81. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28D, B29K(Nº octadecandioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o H O Ho PAO ou Oo u o o N oh - LÊ NOSSA OW ASA NH Te H Po o o HwGIVEQCCTSICSLEQLENYCN- o i i 1 / À i WFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTD—N or o EXEMPLO 82. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28D, B29K(N eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o HW o HO PAI ou O nu o o N od o NOS OO DQO NH

H O

À À HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-or : i LÁ 7

À À WFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTD—N on o EXEMPLO 83. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28E, B29K(Nº hexadecandioil-yGlu), desB30 O H o Ho A ou

A ; [E O ÓTNH -. "SIVEGOGTS | OSLEGLENYVONTI Ss Ss 1 / Ss Ss | | + OH H-FVNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFFYTE—N o EXEMPLO 84. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28E, B29K(N” octadecandioil-yGlu), desB30 o H o Ho or 1 Í . O NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN- os ; ; l / i Ã * oH H-FVNQH LCGSHLVEALYLVCGERGFFYTE—N o EXEMPLO 85. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28E, B29K(Nf eicosanodioil-yGlu), desB30 o H o o ou

A CG ; [A O NH o HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o" i à ! / Ss Ss | | * OH H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGF FYTEXN o EXEMPLO 86. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28E, B29K(Nº octadecandioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o HW o Ho POA ou [) Hu D o N oh

DÊ NO OO NODQOM NH

H Po º nG| vEQCÇETS ICSLEQLENYCN- or Í i 1 / Ss s | | * oH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGF FYTE—N o EXEMPLO 87. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28E, B29K(N eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o H o . HO AAA ou o o o o o . CÊ NO DOHA AO NH os H Oo i À HG IVEQCCTSICSLEQLENYCN- o i Í i j WFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTE—N or o EXEMPLO 88. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulha humana de A14E, B1IE, B28E, B29K(Nº hexadecandioil-yGlu), desB30

O H O Ho om

O DI Pp . O "NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN- o"

N Y 1 / Ss Ss , | ! . OH Hs-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTE—N no EXEMPLO 89. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(Nº octadecandioil-yGlu), desB30 o H o Ho ou ! “A - | O "NH UÚ "O IVEGOQRTSIÓSLEGLENVON Ss Y 1 / Ss Ss * | | + OH s-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTE-N no EXEMPLO 90. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(Nº eicosanodioil-yGlu), desB30 o H O Ho or 1 i O “NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN- o t Y l / Ss Ss + | | . OH H-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGF-FYTE—N no EXEMPLO 91. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(Nº hexadecandioil-yGlu-OEG- OEG), desB30 o H o Ho PA ou * o Oo o o N ok - oÊNOE OoOW NO QONE NH - ot 5 nGIVEQCCTSICSLEQLENYGCN-o

Y Y 1 / Ss Ss * | | + OH s-E VÍNQHLCGSHLVEALYLVCGERGF-FYTE—N no EXEMPLO 92. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(N octadecandioil-yGlu-OEG- OEG), desB30 o H o Ho AAA on o u o o N oh

LÊ NO OW OQ NH ot ó HGIVEQCCTSICS LEQLENYCN-or

X Y 7 / Ss Ss * | | x OH

HE VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFEFY TEN Oo EXEMPLO 93. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(N eicosanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30 o o

H

N Ho CADA on - Oo o CG o NÚ oh : Êo NO OW ADOOS NH à —— 8 HGIVEQCCTSI CSLEQLENYCN-o

X X 1 Fá Ss Ss + | | OH 4H-E VNQHLCGSH LEVEALYVLIVOGERGFFY TEM

O EXEMPLO 94. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nº hexadecandioil-yGlu), desB30 o H o to ou O 3 | O NH HWwGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o X y 1 / Ss Ss > | | . ou H-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYEE—N nn & EXEMPLO 95. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(N octadecandioil-yGlu), desB30 o n O Ho ou Oo 3

NS A O NH . HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN- o" ao Í Í | / Ss Ss + | | a. OH H-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYEE—N no EXEMPLO 96. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nº eicosanodioil-yGlu), desB30

Oo H o Ho or

AA Í 1 O “NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o

Y Y | / Ss Ss + | | .. OH s-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYEE—N "&, EXEMPLO 97. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nº hexadecandioil-yGlu- OEG-OEG), desB30 Oo Oo

N Ho PANDA or " : O o i o N oh . DÊ NO OWN OSQON NH : od, 0 nGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-os

N Y l / E) Ss * | | =. OH s-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYEE—N no EXEMPLO 98. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nº octadecandioil-yGlu- OEG-OEG), desB30 o H o Ho PAODDAINAN Ao 9 o o N o DÊ NOME OW AoA NH pot . 4GIVEQCCTSICSLEQLENYGCN-or

Y Y 1 / Ss s + | | +. OH Hn-E VÍNQHLCGSHLVEALYLVCGERGF FYEE-N o EXEMPLO 99. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(N eicosanodioil-yGlu- OEG-OEG), desB30 o o

N O u o o N oh - o NO DOOR ADO NH ss. SS O | | + - HG IVEQCCTSICSLEQLENYCN-o 7” Y Y $ sÓ > Í | *. oH HE VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYEE—N Oo EXEMPLO 100. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nº hexadecandioil- yGlu), desB30 o H o Ho on — a Í j O NH HG|IVEQCCTSICSLEQLENYCN-o y Y 1 / Ss Ss * | | * * OH nH-E VNQHLCGSH LVEALVYLIVOGERSFHYTEN Oo

EXEMPLO 101. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nº octadecandioil-yGlu), desB30 o H o to ou

A

PA O NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o

N V i / Ss Ss . | | . . OH HE VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTE—N no EXEMPLO 102. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(N eicosanodioil-yGlu), desB30 ". O yu o .. Ho or o A 1 i . O NH HG! VEQCGTS ICSLEQLENYCN-o" Ss Y | / Ss Ss . | | AU OH s-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTE—N no EXEMPLO 103. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nº hexadecandioil-yGlu- OEG-OEG), desB30 o W o Ho eo ou o Oo o N oh o NOME OWA ADA NH ot 0 HGIVEQCCTSICS LEQLENYGCN-or Y y 1 / Ss Ss * | | * + OH HE VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTE—N n& EXEMPLO 104. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(N octadecandioil-yGlu- OEG-OEG), desB30 Oo H o

N Ho PIADA AAA o Oo yu o o N o

CÊ NO OOWA OO NH ot o HGIVEQCCTSICS LEQLENYCN-o

X X 1 / Ss Ss + | | * * OH HE VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTE—N no EXEMPLO 105. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nº eicosanodioil-yGlu- OEG-OEG), desB30

. 185 o NH o Ho AAA on Oo yu o o N ok o NO DOOR OO NH S—— . O | | . HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-or

Y Y $ Ss + | | + ; oH 4-E VNQHLCGSHLVEA LYLVCGERGFHYTEXN Oo EXEMPLO 106. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nº hexadecandio- il-yGlu), desB30 o H o to ou

A ' PA O "NH HGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o"

Y Y í / Ss Ss * | | * x. OH n-E VNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFHYEE—N

O EXEMPLO 107. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(N octadecandio- il-yGlu), desB30 o H o Ho or

AA | O NH WGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-o

X Y i / Ss Ss * | | * x OH s-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYEE—N no EXEMPLO 108. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(N eicosanodioil- yGlu), desB30 o H o Ho Sou

A ' A O NH HWGIVEQCCTSICSLEQLENYCN-os

Y Y l / Ss Ss x | | to A OH HE VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYEE—N no EXEMPLO 109. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nº hexadecandio- i-yGlu-OEG-OEG), desB30 o HW o Ho A ou Oo Hu o o N ok ANO OoOW OO NH — “ 4 G | VFOCGTS ICS LEQLENYCN-or Ss Y 1 / Ss Ss + | | * +. OH n-E VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYEE—N no EXEMPLO 110. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(N octadecandio- i-yGlu-OEG-OEG), desB30 o O

2. EXEMPLO 111. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(N eicosanodioil- yGlu-OEG-OEG), desB30 o o

N Ho CAOAOAIAAD on º o o N o o NO OOW Ao NH A o HGIVEQCCTSICS LEQLENYCN-o

X X $ SÓ x Í Í * as OH

HE VÍNQHLCGSHLVEALY LVOCGERG FHYVEEN o

" 188 EXEMPLO 112. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B28D, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o HW Oo o Oo o N ok

EÂANOE OW OQ OA NH H o

À À “GI IVEQCCTSICS LEQLENYGCN-o i i ! / Ss Ss | | * OH mFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERG FFYTDAN

O EXEMPLO 114. PROCEDIMENTO GERAL (A): B25N, B27E, B29K(Neicosanodioil-/Glu-OEG-OEG), desB30 o NH o Ho PIADA Ao Oo nu o o N o A NON O Do NH

H o 1 À HGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-o Í i l / Ss Ss | | o. OH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP—-N nr EXEMPLO 115. PROCEDIMENTO GERAL (A): B25N, B27E, B29K(Noctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o o

N Ho PAI ou O nu o o N od o NOS OO OQ O NH 7 H o o À i ' o HWGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-or

Í Í - i / Ss Ss | | o. OH H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP-N

H O EXEMPLO 116. PROCEDIMENTO GERAL (A): B25N, B27E, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 o NH o Ho OPDOMOOOOoa o Oo o N ok

CÊ NO OOWR OQO NH H Oo Í i HGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-o Í ! 1 / Ss Ss | | .. OH H-FVNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFNYEP—N o EXEMPLO 117. PROCEDIMENTO GERAL (A): B25N, B27E, B29K(Neicosanodioil-yGlu), desB30 o H o Ho on O x GC A HNSo ] To HGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-o i Í 7 1 / Ss Ss | | o. OH H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP—-N no EXEMPLO 118. PROCEDIMENTO GERAL (A): B25N, B27E, B29K(Noctadecanodioil-yGlu), desB30 o n Oo Ho SE So

A Í Í HN “O 4H GI VEQCCETS ICSLYQLENYCN-or ; 1 / Ss Ss | | * OH H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP-N no EXEMPLO 119. PROCEDIMENTO GERAL (A): B25N, B27E, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu), desB30 o n o Ho A ou O x e HNTo . nO | VvEGORTS IS LYSLENYONTA ” ; Í 1 / Ss Ss - | | ... oH Ns H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP-N - Rh O EXEMPLO 120. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A8H, B25N, B27E, B29K(Neicosanodioil-yGlu-OEG- OEG),desB30 o H o Ho DADA ou Oo Hu o o N ok

ANO OW AQE NH A o

À À HGIVEQCCHSICSLYQLENYCN-o

Í Í 1 ) Ss Ss | / o. OH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP—-N Rn O EXEMPLO 121. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A8H, B25N, B27E, B29K(Noctadecanodioil-yGlu-OEG-

OEG), desB30 o H o HO PAIRA ANA o O yu o o N o oÔNOE VOO ODQOE NH

H Oo Pos GI! VEQCCEHS ICSLYQLENYCN-or Í i 1 1 Ss Ss | / o. OH H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP—N no EXEMPLO 122. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de ASH, B25N, B27E, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30 o N o o Ho OODODODODDOA on -., o H O o NO IN Na ON " H Oo Pos HGI VEQCGCHS ICSLYQLENYCN- or $ i | 1 Ss Ss | / o. OH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP—N n Oo EXEMPLO 123. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A8H, B25N, B27E, B29K(Neicosanodioil-yGlu), desB30 o H o Ho SE Sou

A Í . Í HN TO 4GIVEQCCHSICSLYQLENYCN-o" ; ; 1 ) Ss Ss | ( . OH HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP—-N no EXEMPLO 124. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A8H, B25N, B27E, B29K(Noctadecanodioil-yGlu), desB30 o " o

A - = Í HNTOo q". HGIVEQCCHSICSLYQLENYCN-o" o. b ; = ] / S Ss Ss À / Sã OH - E MVNQULEOSHEMEADICVCSER CENTER SN

O EXEMPLO 125. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulha humana de A8H, B25N, B27E, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu), desB30 o H o to sou

A i HNTO HGIVEQCCHSICSLYQLENYCN-o

Í Í 1 1 Ss Ss | / o. OH sFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFNYEP—N no EXEMPLO 126. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nº (Nicosanodioil-N-carboximetil)-

BAIa-OEG-OEG), desB30 o ro o

SETE o. o n Q nono NH à o Po "GI VEQCCTS|ICSLEQLENYCN-o" Í : i j "FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFÁYTP-N oH o EXEMPLO 127. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insuliha humana de A14E, B25H, B29K(Nº (N-octadecanodioil-N- carboximetil)-BAla-OEG-OEG), desB30 o NS Ho o -. SETOR CÚ o. o [o

H - [oo o Na A º HG | VEQCCTSI CSLEQLENYCNo+ Í : 1 / À 1 "FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFAYTP-N oH

O EXEMPLO 128. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nº (N-hexadecanodioil-N- carboximetil)-BAIla-OEG-OEG), desB30 o Ho o

SEO Oo o o

H o NOVO Do No Ás 3 o i À 4Gl VEGOÇTS ICS LEQLENTON: Ss Ss 1 / i À * OH H-FVNQHLCGSHLVEALY LVCGERGFHYTPN Oo EXEMPLO 129. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil -yGlu-2-[(3-(2-[2- (3-aminopropóxi)etóxiletóxilpropilcarbamoil)metóxilacetila), desB30 o H o " Io Son CG 9 : o o -. Aee À, -. H H —s : mervealira lecicicentçra t O Ácido [(3-(2-[2-(3-aminopropóxi)etóxiletóxilpropilcarbamoil) me- tóxil acético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e reagido com w-(terc-butil-carbóxi-heptadecanoil-y-L- glutamil(OSu)-OtBu. O produto pode ser ativado usando TSTU e acoplado à insulina humana A14E, B25H, desB30 em 0,1 M de NazCO;3 em pH 10,5 pa- ra fornecer o produto. EXEMPLO 130. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfeicosanodioil-yGlu-2-[(3-(2-[2-(3- aminopropóxi)etóxiletóxi)propilcarbamoil)metóxilacetila), desB30 no as. Pa a PREOOCOO0OS SO

H H mervealersilsciocervero i É : É Ácido [(3-(2-[2-(3-aminopropóxi)etóxiletóxi) propilcarbamoil) me- tóxi] acético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e reagido com uw-(terc-butil-carbóxi-nonadecanoil-y-L-glutamil(OSu)- OtBu. O produto pode ser ativado usando TSTU e acoplado a A14E, B25H, desB30em0O,1M de Na;CO; em pH 10,5 para fornecer o produto. EXEMPLO 131. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Noctadecanodioil -yGlu-2- [(312-[2-(3-aminopropóxi)etóxiletóxilpropilcarbamoil) metóxiJacetila), desB30 - o H o -. to Sou - 9 x o o o 5 IO IN um

H . s— | lo W6eIVEMCCTSICSLÉMLENVCNON Í 5 3 Ó | | . HEVNOHWLCGSHLVEALHLVCGERGFÁYT PH ou Ácido [(3-[2-[2-(3-aminopropóxi)etóxi]etóxi) propilcarbamoil) me- tóxil acético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e reagido com w-(terc-buti-carbóxi-heptadecanoil-y-L- glutamil((OSu)-OtBu. O produto pode ser ativado usando TSTU e acoplado à insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30 em 0,1 M de Na;CO; em pH 10,5 para fornecer o produto. EXEMPLO 132. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Neicosanodioil -yGlu-2-[(3- (2-[2-(3-aminopropóxi)etóxi]etóxi)propilcarbamoil)metóxilacetila), desB30

Ho o ADA o

VT o o Aee Ae, b N —s es IVESdOrsatscênicatçem | : é Ácido [(3-(2-[2-(3-aminopropóxi)etóxiletóxi) propilcarbamoil) me- tóxi] cético pode ser preparado como descrito (Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114) e reagido com w-(terc-butil-carbóxi-nonadecanoil-y-L-glutamil(OSu)- OtBu. O produto pode ser ativado usando TSTU e acoplado a insulina hu- manade AT14E,B16H,B25H, desB30 em 0,1 M de Na;CO;3 em pH 10,5 para fornecer o produto. EXEMPLO 133. PROCEDIMENTO GERAL (A): ' Insulina humana de B25H, B29K(N Octadecanodioil-yGlu-OEG- .- OEG), desB30 o o ... K e. N Ho eo hor | = i À

H o O Ô na Aa se—— º weiveadlersilsivarenvenon : Í L / Ss Ss esvuaurtosaLonaLtTUNiGonerârTARAs ow o EXEMPLO 134. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de B25H, B29K(NfEicosanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30 o "

N no PA, o x o õ OI WD DA NH — : MeovrGS|TCSICStYyareNyfmNo Í f HWFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHNYTPN om o EXEMPLO 135. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de B25H, B29K(NfOctadecanodioil-yGlu), desB30 o

H id a, o A 7 : H o os Í Í

CU HGIVENCGETS CSLL YALENY ENO - Ss Ss 1 Fá

Í Í HFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPN oH o EXEMPLO 136. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de B25H, B29K(NEicosanodioil-yGlu), desB30 o AAA, o & bs SS s HG veQêgTs ósivaLeNTAOS T 7 Ss Ss weevuaunLbosHLvVEALYLVEGERSFÁVTPAN oH o EXEMPLO 137. PROCEDIMENTO GERAL (A): Insulina humana de B25H, B29K(NOctadecanodioil), desB30

AA

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HN Í i º o || TRAeqri IP RrFArFENTÇNO! s . fe] ç P 7 Ss Ss SERA. Í H-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHGGGROH EXEMPLO 178. Afinidade de receptor de insulina dos derivados de insulina selecionados da invenção: A afinidade dos análogos de insulina acilada desta invenção pa- ra o receptor de insulina humana é determinada por um ensaio de SPA (En- saio de Proximidade de Cintilação) ensaio de captura de anticorpo de placa de microtitulação. Contas de ligação de SPA-anticorpo de PVT, reagente anticamundongo (Amersham Biosciences, Cat No. PRNQO0017) são mistura- das com 25 ml de tampão de ligação (100 mM de HEPES pH 7,8; 100 mM de cloreto de sódio, 10 mM de MgSO,., 0,025% de Tween-20). Mistura de reagente para uma Packard Optiplate simples (Packard No. 6005190) é composta de 2,4 ul de um receptor 1:5000 de insulina humana recombinante purificado diluído (ou com ou sem éxon 11), uma quantidade de uma solução de matéria-prima de insulina de A14Tyr["*PI)-humano correspondendo a 5000 cpm por 100 ul da mistura de reagente, 12 ul de uma diluição de 1:1000 de

7 anticorpo de F12, 3 ml de SPA-contas e tampão de ligação para um total de ' 12 ml. Um total de 100 ul da mistura de reagente é depois adicionado a cada bem na Packard Optiplate e uma série de diluição do derivado de insulina é feita no Optiplate de amostras apropriadas. As amostras são depois incuba- daspor16 horas enquanto suavemente agitadas. As fases são depois sepa- radas através de centrifugação por 1 min e as placas contadas em um Top- counter. Os dados de ligação foram ajustados usando o algoritmo de regres- são não linear no GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA) e afinidades relativas são expressadas (em porcentagem (%)) para a afinidade de insulina humana. Um ensaio relacionado é também usado em que o tampão de li- gação também contém 4,5% de HSA para imitar condições fisiológicas. Afinidades de receptor de insulina das insulinas selecionadas da invenção: - 15 | oo (O& 0% HSA) (%) (& 40,5% HSA) (%) — EE e e a por poa es Los pas o Çj| a a |

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(O 0% HSA) (%) (OQ 40,5% HSA) (%)

EE e e povo aro em | La TE a EE e o E E o o EBD os — EE Ia LB Ts seas Çj EXEMPLO 179. Hidrofobicidade dos derivados de insulina da invenção: A hidrofobicidade de um derivado de insulina é encontrada por HPLC de fase reversa executada sob condições isocráticas.

O tempo de elu- ição do derivado de insulina é comparado ao da insulina humana (aqui de- signada HI) ou outro derivado com uma hidrofibicidade conhecida sob as mesmas condições.

A hidrofobicidade, k'rel, é calculada como: kK'rel = ((tgeriv- to)/(trerto))*K'rel.

Usando HI como referência: k'rel = k'rel = 1. O tempo nulo do sistema de HPLC, to, é determinado injetando 5 ul de 0,1 mM de NaNO;. Condições de Operação: Coluna: Lichrosorb RP-C18, 5um, 4 x 250 mm

7 Tampão A: 0,1 M de fosfato de nátrio pH 7,3, 10 vol% de CH;CN Tampão B: 50 % em vol de CH;CN Volume de injeção: 5 ul Tempo de execução: max 60 minutos Após passar um gradiente inicial, o nível isocrático para passar o derivado e referência (por exemplo, HI) é escolhido, e os tempos de eluição do derivado e referência sob condições isocráticas são usados na equação acima para calcular K'relgeriv.

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EXEMPLO 180. Liberação pulmonar de derivados de insulina para ratos: Protocolo: A substância de teste será dosada pulmonarmente pelo método de instilação a gotas.

Em suma, ratos Wistar machos (aproximadamente 250 g)são anestesiados em apl. 60 ml de fentanila/deidrodenzperido!l/-lormicum dados como uma dose de reforço de 6,6 ml/kg sc e seguidos por 3 doses de manutenção de 3,3 ml/kg sc com um intervalo de 30 min.

Dez minutos após

' a indução de anestesia, amostras basais da veia de cauda são obtidas (t = - : 20 min) seguido imediatamente por uma amostra basal antes do doseamen- to da substância de teste (t=0). Em t=0, a substância de teste é de modo intratraqueal dosada em um pulmão. Uma cânula especial com terminação arredondada é montada em uma seringa contendo os 200 ul de ar e subs- tância de teste (1 ml/kg). Por meio do orifício, a cânula é introduzida na tra- queia e é mandada para um dos brônquios principais - apenas passando a bifurcatura. Durante a inserção, o pescoço é apalpado do exterior para as- segurar posicionamento intratraqueal. O conteúdo da seringa é injetado se- guidopor2s de pausa. Depois disso, a cânula é lentamente tirada de volta. Os ratos são mantidos anestesiados durante o teste (as amostras de sangue por até 4 ou 8 h) e foram eutanizados após o experimento.

As figuras 8 e 9 mostram os efeitos redutores da glicose do san- gue e concentrações de insulina no plasma, respectivamente, da instilação ' 15 em gotas intraqueal de uma insulina da invenção (exemplo 9), comparada ' com uma insulina similar, mas não resistente à protease da técnica anterior NS (exemplo 183). . EXEMPLO 181. Liberação pulmonar de derivados de insulina para minipor- cos: Protocolo: Os porcos foram instrumentados com cateteres venosos centrais para injeções intravenosas e amostragem de sangue. Os porcos estavam em jejum antes do experimento pulmonar, isto é, o dia antes do doseamento, as sobras da alimentação da tarde são removidas cerca de uma hora após a alimentação e no dia do doseamento, os porcos não são alimentados. A permeabilidade dos cateteres é verificada antes do experimento com solu- ção salina adicionada a 10 IU/ml de heparina.

Após doseamento pulmonar, uma solução de glicose deveria es- tar pronta para injeção i.v. para impedir hipoglicemia, isto é, 4-5 seringas (20ml)são enchidas com 20% de glicose estéril, prontas para o uso. Diag- nose de hipoglicemia é com base em sintomas clínicos e medições de glico- se no sangue em um glucômetro (Glucocard X-metro). Tratamento consiste

7 em injeção i.v. lenta de 50-100 ml de 20% de glicose (10-20 g de glicose). A ' glicose é dada em frações por 5-10 minutos até efeito.

Os porcos são jejuados durante a primeira parte do experimento (até 24 h), mas com acesso livre à água.

Após 16 h, os cateteres da amostra de sangue são fechados com 5000 IU/ml de heparina, colocados nos bolsos e os porcos são liberados.

Após 24 h da amostra de sangue, os porcos são alimentados com ração dupla e maçãs.

Os porcos não ficam em jejum de 24 ha48h.

Composto e doseamento pulmonar Pó paradoseamento pulmonar Os pós de insulina são pesados em 8 câmaras de pó separadas do dispositivo de pó seco (Modelo PennCentury& DP+, dispositivo porcino sob medida) no dia antes do experimento.

Todas as câmaras são mantidas protegidas de luz e umidade as mantendo ao redor em um material de des- ' 15 secagem em um recipiente com folha de alumínio em um laboratório com ' temperatura e umidade controladas até o doseamento. o Com base no peso do animal individual mais recente, o disposi- ' tivo de liberação foi pré-carregado com 25 nmol/kg visto que alguma reten- ção de pó foi esperada.

Carga da dose = (Peso do pó + (peso do dispositivo e do pó — peso do dispositivo))/2. Anestesia Por uma injeção i.v. de Domitor& Vet inj. (medetomideína 1 mg/ml), 0,145 mli/10 kg = 0,4 ml/porco, o porco é sedado.

Imediatamente após, Rapinovet Vet. inj. (propofol 10 mg/ml) é in- jetado i.v. lentamente até profundidade suficiente da anestesia ser obtida.

Em geral, 2-3 kg de ml/10 é suficiente, mas pode ser necessário suplemen- tar com 1-2 ml de uma vez até que a intubação seja possível.

Atropina (1 mg/ml) é injetada i.m. a 0,5 ml/porco e deixada trabalhar min. de 5 min antes daintubação.

Para intubação, o porco é colocado na posição ventral com a frente ligeiramente elevada, anestésico local Xylocaine& kutanspray (lidoca-

' ina 10 mg/dose) é pulverizado sobre a epiglote, e os porcos são intubados : usando um laringoscópio e um tubo descartável de tamanho 8,0 mm (ID). As duas partes do tubo são pressionadas firmemente.

Posição do dispositivo durante o doseamento pulmonar A posição do dispositivo de PennCentury& durante doseamento apenas deveria ser externa à extremidade do tubo endotraqueal e deveria ser medida no dispositivo antes da intubação (lembra-se do pedaço em L conectado ao medir). Durante o doseamento, a ponta do dispositivo de PennCentury& apenas deve ser posicionada na traqueia abaixo dos brôn- —quios que vai para o dextro cranialis lobus que é confirmado com o broncos- cópio durante o doseamento.

Respiração artificial A frequência da respiração é ajustada a 10/min e a profundidade da respiração a 250 ml/respiração.

O respirador é montado com saco "be- . 15 bê" para otimizar a regulação do doseamento.

O aparelho de anestesia é : conectado a um filtro que é conectado ao tubo endotraqueal por meio de um oO pedaço em L.

O dispositivo de PennCentury& é introduzido através do peda- . ço em L que permitirá o controle na profundidade da respiração e frequência durante o doseamento.

Técnicade doseamento O dispositivo de PennCentury& deveria ser colocado como des- crito acima.

Os porcos são dosados (um de cada vez) com o dispositivo de PennCentury& por administração manual durante a inalação usando a bom- ba de ar ajustável PennCentury (AP-1 Modelo). A cada porco são dadas 8 pulverizações de ar (bomba de ar ajustada em 4 ml) durante 8 inalações forçadas com respirador sucessivas para assegurar que a dose inteira seja dada.

A câmara é batida suavemente entre as pulverizações para evitar ade- rência do pó ao dispositivo.

Um tubo de liberação novo é usado para cada porco.

A regulação em relação à inalação é muito importante, e as pulveriza- ções de ar deveriam ser dadas bem no início da inalação (meta para início em 50 ml de inalação). Para contrariar o efeito de Domitor, Antisedan& Vet inj. (atipa-

' mezol 5 mg/ml) será injetado como uma injeção intramuscular (0,4 : mL/porco) imediatamente após doseamento, e os porcos serão levados de volta a seus cercados e serão deixados acordar da anestesia.

Análise de retenção A dose emitida deveria ser o conteúdo inteiro da câmara e após doseamento o dispositivo é pesado novamente com qualquer pó residual, e o pó retido é extraído com 9 mL de 0,01 N de HCI med 0,05% (p/v) de tam- pão de extração Tween 80 e enviado para análise.

Amostragem de sangue Após o doseamento, as amostras de sangue serão extraídas de um cateter venoso central nos pontos de tempo seguintes: -10, O, 10, 20, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 240 (4 h), 300 (5 h), 360 (6 h), 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 24h, 32 he 48h.

As amostras são tiradas com uma válvula reguladora de 3 mo- . 15 dos; sangue residual é injetado de volta no animal.

O tamanho da amostra Ú é: 0,8 ml de sangue colhido em um tubo revestido com EDTA.

Após cada os amostra de sangue, o cateter é fluxado com 5 ml de 0,9% de NaCl estéril . com 10 IU/ml de heparina.

O tubo é inclinado um mínimo de 8 vezes suave- mente para assegurar mistura suficiente de sangue e anticoagulante (EDTA) eapósum minuto é colocado em gelo molhado.

Os tubos são girados por 10 min a 3000 rpm e 4ºC dentro de 1 hora após amostragem.

As amostras são armazenadas em gelo molhado até pipetação.

Fechamento dos cateteres após o experimento Um tratamento intravenoso simples com Ampicilina (10 mg/kg = 0,1ml/kgdeuma solução em 100 mg/ml) dissolvida em solução salina estéril (1 g de Ampicilina em 10 ml = 100 mg/ml) é dado por meio do cateter que foi usado para amostragem de sangue.

Ambos os cateteres são fluxados com 4-5 ml de 0,9% de NaCl estéril adicionados à heparina com a uma concen- tração a 10 IU/ml.

Os cateteres são fechados com uma nova trava do tipo —luerlockcom membrana de injeção de látex. 4-5 ml de 0,9% de NaCl estéril são injetados através da membrana.

Por fim 0,8 ml de heparina, 5000 IU/ml, é injetado através do cateter como uma trava.

Técnica asséptica é exigida

" para evitar crescimento bacteriano no cateter com risco aumentado de coa- : gulação. Análise das amostras de sangue 10 ul de plasma são pipetados em 500 ul de solução de tampão deEBIO paramedições de concentração de glicose em plasma no autoana- lisador de Biosen.

Amostras de plasma são também ensaiadas para insulina exó- gena através de imunoensaios para calcular os parâmetros de PK. Doseamento pulmonar da insulina do exemplo 9 para miniporcos de acordo como protocolo acima: As figuras 10 e 11 mostram o perfil farmacocinético da insulina do exemplo 9 comparado à mesma insulina, mas sem as mutações de esta- bilização de protease A14E e B25H (insulina da técnica anterior). Os dados são do mesmo experimento, figura 10 é mostrada com os dados dos primei- . 15 ros 250 minutos, e figura 11 é mostrada com o curso de tempo total de 24 : horas (1440 minutos).

CO Dados farmacocinéticos para a insulina do exemplo 9 compara- . da à mesma insulina, mas sem as mutações de estabilização de protease A14E e B25H (insulina da técnica anterior). Os dados são do mesmo expe- rimento, meia-vida (T%) e biodisponibilidade (F;) com relação à administra- ção intravenosa: vide ex. 183 Lo go Bo EXEMPLO 182. Degradação dos análogos de insulina usando enzimas do lúmen duodenal: A degradação dos análogos de insulina usando enzimas do lú- —men duodenal (preparado por filtração do conteúdo do lúmen duodenal) de ratos de SPD. O ensaio é executado por um robô em uma placa de 96 poços (2 ml!) com 16 poços disponíveis para análogos de insulina e padrões. Aná-

: logos de insulina são incubados -15 uM com enzimas do duodeno em 100 : MM de Hepes, pH=7,4 a 37ºC, cujas amostras são extraídas a 1, 15, 30, 60, 120 e 240 min e reação extinta por adição de TFA.

Análogos de insulina in- tactos em cada ponto são determinados por RP-HPLC.

Meio tempo de de- gradação é determinado ajustando o exponencial dos dados e normalizado para meio tempo determinado para as insulinas de referência, A14E, B25H, desB30 ou insulina humana em cada ensaio.

A quantidade de enzimas adi- cionada para a degradação é de modo que o meio tempo para degradação da insulina de referência seja entre 60 min e 180 min.

O resultado é dado comoo meio tempo de degradação para o análogo de insulina em duodeno de rato dividido pelo meio tempo de degradação da insulina de referência do mesmo experimento (taxa de degradação relativa). Degradação do duodeno.

EN Farmacocinética do rato: PK de Rato intravenosa: Ratos anestesiados são intravenosamente dosados (i.v.) com análogos de insulina em várias doses e concentrações de plasma dos com- postos empregados são medidas usando imunoensaios ou espectrometria

' de massa em intervalos especificados por 4 horas ou mais pós-dose. Parâ- : metros farmacocinéticos são subsequentemente calculados usando Win- NonLin Pro (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA). Ratos Wistar machos não jejuados (Taconic) pesando cerca de 200gramas são usados.

Peso do corpo é medido e os ratos são subsequentemente a- nestesiados com Hypnorm/Dormicum (cada composto é diluído 1:1 separa- damente em água estéril e depois misturados; preparados recentemente no dia experimental). Anestesia é iniciada por 2 mi/kg de mistura de Hyp- —norm/Doricum sc seguido por duas doses de manutenção de 1 ml/kg sc em intervalos de 30 min e duas doses de manutenção de 1 ml/kg sc com inter- valos de 45 min. Se preciso for para manter os ratos ligeiramente anestesia- dos por todo tempo uma(s) outra(s) dose(s) 1-2 mi/kg sc é/são provida(s). Pesagem e anestesia inicial são executadas no quarto de contensão dos ' 15 ratos para evitar estressar os animais movendo-os de um quarto para outro. ' PK de Rato Peroral: OU Gavagem: . Ratos conscientes são dosados p.o. com análogos de insulina. Concentrações no plasma dos compostos empregados como também alte- rações em glicose do sangue são medidas em intervalos especificados por 4-6 horas pós-doseamento. Parâmetros farmacocinéticos são subsequente- mente calculados usando WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA).

Ratos Sprague-Dawley machos (Taconic), pesando 250-300 g — sãojejuados por -18 h e dosados p.o. com composto de teste ou veículo.

A composição da formulação usada para o doseamento de gavagem oral é a seguinte (% em peso): 45% Propileno glicol (Merck) 33% Capmul MCM C10 (Abitec) 11% Poloxâmero 407 (BASF) 11% Polietilenoglicol 3350 Ultra (Fluka) A quantidade de insulina adicionada é subtraída igualmente de

' Capmul MCM C10, Poloxâmero 407 e PEG 3350 e não de propileno glicol a : fim de manter a quantidade de propileno glicol independente da carga de fármaco constante em 45%. Insulina neutra (secada por congelamento de pH 7,4) é dissolvida em propi- lenoglicol em TA sob agitação suave. Dependendo da insulina e da quanti- dade de insulina em si, pode levar algumas horas para dissolver-se em pro- pileno glicol. A solução resultante deveria ser clara. Os outros aditivos, Capmul, poloxâmero e PEG3350 são misturados e fundidos a 58º C e deve também resultar em uma solução clara, ligeiramente amarelada.Depois a solução de propileno glicol de insulina é aquecida até 35ºC e os aditivos fun- didos são adicionados em partes sob agitação magnética. A mistura resul- tante deveria ser clara e homogeneamente a 35ºC e resultar em um semis- sólido após armazenamento no congelador. Após preparação, a composição de SEDDS é esfriada até 5ºC para solidificar-se. ' 15 As amostras de sangue são colhidas para a determinação das , concentrações de glicose de sangue total em tubos capilares heparinizados "oO de 10 ul por furo dos vasos capilares na ponta da cauda. Concentrações de . glicose no sangue foram medidas após diluição em 500 ul de tampão de a- nálise pelo método de glicose oxidase usando um autoanalisador de Biosen (EKF Diagnostic Gmbh, Alemanha). Cursos médios da concentração de gli- cose no sangue (+ SEM médio) são feitos para cada composto.

As amostras são colhidas para determinação da concentração de insulina no plasma. 100 ul de amostras de sangue são tirados em tubos esfriados contendo EDTA. As amostras são mantidas em gelo até centrifu- gadas (7000 rpm, 4ºC, 5 min), o plasma é pipetado em tubos Micrônicos e depois congelado a 20ºC até o ensaio. Concentrações no plasma dos análo- gos de insulina são medidas no departamento de Ensaio e Tecnologia usan- do um imunoensaio que é considerado apropriado ou validado para o análo- go individual.

Amostras de sangue são tiradas em t=-10 (para glicose de san- gue apenas), em t=-1 (logo antes do doseamento) e em intervalos especifi- cados por 4-6 horas pós-doseamento.

" Injeção Intraintestinal: BR Ratos anestesiados são intraintestinalmente dosados (no jejuno) com análogos de insulina. Concentrações no plasma dos compostos empre- gados como também alterações na glicose sanguínea são medidas em in- tervalos especificados por 4 horas ou mais pós-doseamento. Parâmetros farmacocinéticos são subsequentemente calculados usando WinNonLin Pro- fessional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, EUA).

Ratos Sprague-Dawley machos (Taconic), pesando 250-300 9, jejuados por -18 h são anestesiados usando Hypnorm-Dormicum s.c. (0,079 mg/mlde citrato de fentanila, 2,5 mg/ml de fluanisona e 1,25 mg/ml de mida- zolam) 2 ml/kg como uma dose preparatória (para ponto de tempo de -60 min antes do doseamento da substância de teste), 1 ml/kg após 20 min se- guido por 1 mi/kg a cada 40 min. As insulinas a serem testadas no modelo de injeção intraintesti- . 15 nalsão formuladas como formuladas acima para o modelo de gavagem. O rato anestesiado é colocado em uma manta homotérmica es- o tabilizada a 37ºC. Um cateter de 20 cm de polietileno montado em uma se- - ringa de 1 ml é enchido com formulação de insulina ou veículo. Uma incisão de linha intermediária de 4-5 cm é feita na parede abdominal. O cateter é inserido suavemente no jejuno médio — 50 cm do ceco por penetração da parede intestinal. Se o conteúdo intestinal estiver presente, o sítio de aplica- ção é movido + 10 cm. A ponta do cateter é colocada aproximadamente 2 em dentro do lúmen do segmento intestinal e fixado sem o uso de ligaduras. Os intestinos são substituídos cuidadosamente na cavidade abdominal e a parede abdominal e pele são fechadas com autogrampos em cada camada. No tempo 0, os ratos são dosados por meio do cateter, 0,4 ml/kg de compos- to de teste ou veículo.

As amostras de sangue são colhidas para a determinação das concentrações de glicose de sangue total em tubos capilares heparinizados de10ulpor furo dos vasos capilares na ponta da cauda. Concentrações de glicose no sangue são medidas após diluição em 500 ul de tampão de análi- se pelo método de glicose oxidase usando um autoanalisador de Biosen

Ú (EKF Diagnostic Gmbh, Alemanha). Cursos médios de concentração de gli- BR cose no sangue ( + SEM médio) são feitos para cada composto. Amostras são colhidas para determinação da concentração de insulina no plasma. 100 ul de amostras de sangue são tirados em tubos es- friados contendo EDTA. As amostras são mantidas em gelo até centrifuga- das (7000 rpm, 4ºC, 5 min), o plasma é pipetado em tubos Micrônicos e de- pois congelado a 20ºC até o ensaio. Concentrações no plasma dos análogos de insulina são medidas em um imunoensaio que é considerado apropriado ou validado para o análogo individual.

Amostras de sangue são tiradas em t=-10 (para glicose de san- gue apenas), em t=-1 (logo antes do doseamento) e em intervalos especifi- cados por 4 horas ou mais pós-doseamento.

[ereto | ESESSSTI oanóimeo ni ig: Exemplo Nº | retenção médio, gava- | Gavagem (%) | Injeção de Intraintesti- - gem) nal (%) To anterior) — DR OB Se O * DO Gsimo [ooo [ET [a | se or [O [8 [| os26 Tons [O a aa Farmacodinâmica dos ratos: Perfis de glicose sanguínea versus tempo seguindo administra- ção oral (como descrito acima) de insulinas aciladas selecionadas da inven- ção são mostrados abaixo: Exemplo 183 O efeito oral de ratos Wistar machos de jejum à noite em uma

' insulina da técnica anterior, isto é: no oH o o OVOS OS o merveelgre teirereançes é Í / | | on

EVNONLOSGSHNHLIVEALTYLVCOCGERGFPYTP A o B29K(NFOctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30 é dado na fi- gura 1 abaixo. EXEMPLO 184 Potência dos análogos de insulina acilada desta invenção com relação à in- . sulina humana Ratos Sprague Dawley machos pesando 238-383 g no dia expe- os rimental são usados para o experimento de grampo. Os ratos têm acesso 1 livre à alimentação sob condições de ambiente controlado e são jejuados durante a noite (de 3 pm) antes do experimento de grampo. Protocolo experimental: Os ratos são aclimatados nas instalações animais por pelo me- nos | semana antes do procedimento cirúrgico. Cerca de 1 semana antes do experimento de grampo, cateteres Tygon são inseridos sob anestesia de halotano na veia jugular (para infusão) e a artéria carótida (para amostragem de sangue) e exteriorizados e fixados na parte de trás do pescoço. Aos ratos é dado Streptocilin vet. (Boehringer Ingelheim; 0,15 ml/rato, im.) pós- surgicamente e colocados em uma unidade de cuidado animal (25ºC) duran- te o período de restabelecimento. Para obter analgesia, Anorphin (0,06 mg/rato,s.c.)é administrada durante a anestesia e Rimadyl (1,5 mg/kg, s.c.) é administrado após restabelecimento total da anestesia (2-3 h) e novamen- te uma vez diariamente durante 2 dias.

Às 7 horas da manhã no dia experimental, ratos jejuados duran-

: te a noite (de 3 pm do dia anterior) são pesados e conectados às seringas . de amostragem e ao sistema de infusão (bombas Harvard 22 Basic, Har- vard, e seringa de vidro Hipodérmica Perfectum, Aldrich) e depois colocados em gaiolas de grampo individuais onde eles descansam para cerca de 45 minantesdo começo do experimento. Os ratos são capazes de moverem-se livremente em sua cama usual durante o experimento inteiro e ter acesso livre à água potável. Após um período basal de 30 min durante os quais os níveis de glicose no plasma foram medidos em intervalos de 10 min, o deri- vado de insulina a ser testado e insulina humana (um nível de dose por rato, n=6-7 por nível de dose) é infuso (i.v.) a uma taxa constante por 300 min. Opcionalmente uma infusão de bolo preparatório do derivado de insulina a ser testado é administrada para alcançar níveis de estado fixo imediatos no plasma. A dose da infusão de bolo preparatório pode ser calculada com ba- se nos dados de liberação obtidos de farmacocinética i.v. de bolo por um - 15 farmacocineticista versado na técnica. Níveis de glicose no plasma são me- didos em intervalos de 10 min ao longo e infusão de 20% de glicose aquosa os é ajustada consequentemente para manter a euglicemia. As amostras de 1 eritrócitos ressuspensos são agrupadas de cada rato e retornadas para cer- ca de volumes de % ml por meio do cateter da carótida.

Em cada dia experimental, as amostras das soluções dos deri- vados de insulina individuais a serem testados e a solução de insulina hu- mana são tiradas antes e ao terminal dos experimentos de grampo e as con- centrações dos peptídeos são confirmadas por HPLC. Concentrações no plasma de insulina e C-peptídeo de rato como também do derivado de insu- lina ser testado e insulina humana são medidas em pontos de tempo rele- vantes antes e ao terminal dos estudos. Os ratos são mortos ao terminal de experimento usando uma overdose de pentobarbital.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID Nos. 5-11 são as sequências para as cadeias A presen- tes nos compostos desta invenção mostrados nos exemplos específicos a- cima e SEQ ID Nos. 12-29 são as sequências para as cadeias B presentes nos compostos desta invenção mostrados nos exemplos específicos acima.

As insulinas a ser testada no modelo de injeção intraintestinal são formuladas como formuladas acima para o modelo de gavagem.

O rato anestesiado é colocado em uma manta homotérmica es- tabilizada a 37ºC. Um cateter de 20 cm de polietileno montado em uma se- ringade1mlé enchido com formulação de insulina ou veículo. Uma incisão de linha intermediária de 4-5 cm é feita na parede abdominal. O cateter é in- serido suavemente no jejuno médio — 50 em do ceco por penetração da pa- rede intestinal. Se o conteúdo intestinal estiver presente, o sítio de aplicação é movido + 10 cm. A ponta do cateter é colocada aprox. 2 cm dentro do lú- e 10 men do segmento intestinal e fixado sem o uso de ligaduras. Os intestinos são substituídos cuidadosamente na cavidade abdominal e a parede abdo- : minal e pele são fechadas com autogrampos em cada camada. No tempo 0, . os ratos são dosados por meio do cateter, 0,4 mi/kg de composto de teste ou ' veículo.

As amostras de sangue são colhidas para a determinação das ' concentrações de glicose de sangue total em tubos capilares heparinizados de 10 ul por furo dos vasos capilares na ponta da cauda. Concentrações de glicose no sangue são medidas após diluição em 500 ul de tampão de análi- se pelo método de glicose oxidase usando um autoanalizador de Biosen (EKF Diagnostic Gmbh, Alemanha). Cursos médios de concentração de gli- oe cose no sangue ( + SEM médio) são feitos para cada composto.

Amostras são colhidas para determinação da concentração de insulina no plasma. 100 ul de amostras de sangue são tirados em tubos es- friados contendo EDTA. As amostras são mantidas em gelo até centrifuga- das(70001pm,4ºC,5 min), o plasma é pipetado em tubos Micrônicos e de- pois congelado a 20ºC até o ensaio. Concentrações no plasma dos análogos de insulina são medidas em um imunocensaio que é considerado apropriado ou validado para o análogo individual.

Exemplo No. MRT (min) (Tem- Fpo. Fpo. - po de retenção Gavagem(%) Injeção de Intraintes- médio, gavagem) tinal (%) 183 (técnica an- 97 +15 0,005 +0,009 0,28+0,14 terior) 2 401 +82 0,05 + 0,02 9 345 + 111 0,10 + 0,09 1,9£1,0 13 251447 0,12 + 0,08 16 416 +37 0,06 + 0,04 1,8+1,9 oe 18 149 +29 0,13 0,07 24 194 +54 0,06 + 0,05 14411 ' 25 481 + 108 0,20 + 0,05 3,3+1,2 . 26 7 33 Farmacodinâmica dos ratos: Perfis de glicose sanguínea vs. tempo seguindo administração oral (como descrito acima) de insulinas aciladas selecionadas da invenção são mostrados abaixo: Exemplo 183 oe O efeito oral de ratos Wistar machos de jejum à noite em uma insuli- na da técnica anterior, isto é:

SOS o ou o

Y

A E OIOOEwY AOS ! á o B28K(NºOctadecanodioil-Glu-OEG-OEG), desB30 é dado na figura 1 abai-

xo. - EXEMPLO 184

POTÊNCIA DOS ANÁLOGOS DE INSULINA ACILADA DESTA ' INVENÇÃO COM RELAÇÃO À INSULINA HUMANA Ratos Sprague Dawley machos pesando 238-383 g no dia expe- rimental são usados para o experimento de grampo. Os ratos têm acesso livre à alimentação sob condições de ambiente controlado e são jejuados du- rante a noite (de 3 pm) antes do experimento de grampo. PROTOCOLO EXPERIMENTAL: oe 10 Os ratos são aclimados nas instalações animais por pelo menos 1 semana antes do procedimento cirúrgico. Cerca de 1 semana antes do ex- , perimento de grampo, cateteres Tygon são inseridos sob anestesia de halo- . tano na veia jugular (para infusão) e a artéria carótida (para amostragem de - sangue) e exteriorizados e fixados na parte de trás do pescoço. Aos ratos é : 15 dado Streptocilin vet. (Boehringer Ingelheim; 0,15 míifrato, im.) pós- ' surgicamente e colocados em uma unidade de cuidado animal (25ºC) duran- te o período de restabelecimento. Para obter analgesia, Anorphin (0,06 mgirato, s.c.) é administrada durante a anestesia e Rimady! (1,5 mg/kg, s.c.) é administrado após restabelecimento total da anestesia (2-3 h) e novamen- teuma vez diariamente durante 2 dias. oe Às 7 horas da manhã no dia experimental ratos jejuados durante a noite (de 3 pm do dia anterior) são pesados e conectados às seringas de amostragem e ao sistema de infusão (pombas Harvard 22 Basic, Harvard, e seringa de vidro Hipodérmica Perfectum, Aldrich) e depois colocados em —gaiolasde grampo individuais onde eles descansam para ca. 45 min antes do começo do experimento. Os ratos são capazes de moverem-se livremen- te em sua cama usual durante o experimento inteiro e ter acesso livre à água potável. Após um período basal de 30 min durante os quais os níveis de gli- cose no plasma foram medidos em intervalos de 10 min, o derivado de insu- linaa ser testado e insulina humana (um nível de dose por rato, n = 6-7 por nível de dose) é infuso (i.v.) a uma taxa constante por 300 min. Opcional- mente uma infusão de bolo preparatório do derivado de insulina a ser testa-

do é administrada para alcançar níveis de estado fixo imediatos no plasma. 7 A dose da infusão de bolo preparatório pode ser calculada com base nos dados de liberação obtidos de farmacocinética i.v. de bolo por um farmaco- ' cineticista versado na técnica.

Níveis de glicose no plasma são medidos em intervalos de 10 min ao longo e infusão de 20% de glicose aquosa é ajusta- da consequentemente para manter a euglicemia.

As amostras de eritrócitos ressuspensos são agrupadas de cada rato e retornadas para cerca de volu- mes de % mi por meio do cateter da carótida.

Em cada dia experimental, as amostras das soluções dos deri- ( 10 vados de insulina individuais a ser testados e a solução de insulina humana são tiradas antes e ao término dos experimentos de grampo e as concentra- ' ções dos peptídeos são confirmadas por HPLC.

Concentrações no plasma . de insulina e C-peptideo de rato como também do derivado de insulina ser . testado e insulina humana são medidas em pontos de tempo relevantes an- tese aotérmino dos estudos.

Os ratos são mortos ao término de experimen- ' to usando uma overdose de pentobarbital. o

LISTAS DE SEQUÊNCIA ' SEOQ [ID Nos. 5-11 são as sequências para as cadeias A presentes nos com- postos desta invenção mostrados nos exemplos específicos acima e SEQ ID ] Nos. 12-29 são as sequências para as cadeias B presentes nos compostos destainvenção mostrados nos exemplos específicos acima. o o

Claims

REIVINDICAÇÕES ' 1. Insulina estabilizada em protease acilada, caracterizada pelo ' fato de que, formalmente, consiste em uma não insulina estabilizada em pro- tease (insulina parental), em que pelo menos um aminoácido hidrofóbico foi — substituído com aminoácidos hidrófilos, e em que a dita substituição é dentro ou em proximidade íntima a um ou mais sítios de clivagem de protease da insulina não estabilizada em protease (insulina parental) e em que tal insuli- na estabilizada em protease opcionalmente compreende ainda uma ou mais mutações adicionais com a condição que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a porção de acila seja ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na insulina estabilizada em protease.
2. Insulina estabilizada em protease acilada, caracterizada pelo fato de que, formalmente, consiste em uma não insulina estabilizada em pro- tease (insulina parental), em que pelo menos dois aminoácidos hidrofóbicos foram substituídos com aminoácidos hidrófilos, e em que as ditas substitui- ções são dentro ou em proximidade íntima a dois ou mais sítios de clivagem de protease da não insulina estabilizada em protease (insulina parental) e em que tal insulina estabilizada em protease opcionalmente compreende ainda uma ou mais mutações adicionais com a condição que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a porção de acila se- ja ligada ao resíduo de lisina na insulina estabilizada em protease.
3. Insulina estabilizada em protease acilada, caracterizada pelo fato de que, formalmente, consiste em uma não insulina estabilizada em pro- tease (insulina parental), em que pelo menos dois aminoácidos hidrofóbicos foram substituídos com aminoácidos hidrófilos, e em que as ditas substitui- ções são dentro ou em proximidade íntima a dois ou mais sítios de clivagem de protease da não insulina estabilizada em protease (insulina parental) e em que tal insulina estabilizada em protease opcionalmente compreende ainda uma ou mais mutações adicionais com a condição que haja apenas um resíduo de lisina na insulina estabilizada, e em que a porção de acila se- ja ligada ao resíduo de lisina ou a uma posição N-terminal na insulina estabi- lizada em protease.

- 2
4. Insulina acilada de acordo com qualquer uma das reivindica- á ções | a 3, caracterizada pelo fato de que possui solubilidade aumentada com relação à insulina parental acilada.
5. Insulina acilada de acordo com qualquer uma das reivindica- ções1ald, caracterizada pelo fato de que a cadeia B da insulina compreen- de pelo menos uma mutação com relação à insulina parental.
6. Insulina acilada de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a cadeia B da insulina compreen- de uma, duas ou três, mas não mais mutações com relação à insulina paren- tal
7. Insulina acilada de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a cadeia A da insulina estabilizada em protease é idêntica à cadeia A da insulina humana.
8. Insulina acilada de acordo com qualquer uma das reivindica- ções1a7,caracterizada pelo fato de que a cadeia A da insulina compreen- de pelo menos uma mutação e a cadeia B da insulina compreende pelo me- nos uma mutação com relação à insulina parental.
9. Insulina acilada de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a cadeia A da insulina compreen- de pelomenos duas mutações e a cadeia B da insulina compreende pelo menos uma mutação com relação à insulina parental.
10. Insulina acilada de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a insulina compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácido em um sítio de protease de uma primeira insulina estabilizada em protease modificada, em que a dita pelo menos uma substituição de aminoácido é de modo que pelo menos um ami- noácido hidrofóbico foi substituído com pelo menos um aminoácido hidrófilo.
11. Insulina estabilizada em protease acilada acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o amino- ácido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e

- 3 o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ' ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o ' aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly ou Arg; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu ou Asp; e que opcionalmente compreende aindauma ou mais mutações adicionais.
12. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gin, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição B16 é Tyr, His ou Glu; e/ou o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly, Lys, Arg ou deletado; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu, Asp, ou ausente (deletado); e/ou o aminoá- cido na posição B29 é Lys, Arg, ou ausente (deletado); e que opcionalmente compreende ainda uma ou mais mutações adicionais e, preferivelmente, in- sulina estabilizada em protease acilada em que o aminoácido na posição A12 é Glu ou Asp; e/ou o aminoácido na posição A13 é His, Asn, Glu ou Asp; e/ouo aminoácido na posição A14 é Tyr, Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly ou His; e/ou o aminoácido na posição A15 é Glu ou Asp; e o aminoácido na posição B24 é His; e/ou o aminoácido na posição B25 é His ou Asn; e/ou o aminoácido na posição B26 é His, Gly, Asp ou Thr; e/ou o aminoácido na posição B27 é His, Glu, Asp, Gly ou Arg; e/ou o aminoácido na posição B28 é His, Gly, Glu, ou Asp; e que opcionalmente compreende ainda uma ou mais mutações adicionais.
13. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o aminoácido na posição A14 é Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B25 é HisouAsn,e que opcionalmente compreende ainda uma ou mais muta- ções adicionais.
14. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com

- 4 qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o ã aminoácido na posição A14 é Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B25 D é His ou Asn, e o aminoácido na posição B30 é deletado.
15. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com — qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que o aminoácido na posição A14 é Glu, Asp ou His, o aminoácido na posição B16 é His ou Glu, o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 é deletado.
16. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o aminoácido na posição A14 é Glu, Asp ou His e o aminoácido na posição B25 é His e o aminoácido na posição B30 é deletado.
17. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que o aminoácido na posição A14 é Glu ou Asp e o aminoácido na posição B28 é Glu ou Asp, e, opcionalmente, não há qualquer resíduo de aminoácido na posição B30.
18. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que uma ou mais mutações adicionais são selecionadas de um grupo que consiste em: A8His, A18GIn, A21GIn, A21GlIy, B1Glu, B1GIn, B3GIn, B10Pro, B14Thr, B16Glu, B17Ser, B26Asp, B27Glu, B27Asp, B28Asp, B28Glu, e desB30.
19. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a —mutação adicional é desB30.
20. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que A14 é Glu.
21. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com — qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que B25 é Asn.
22. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com

- 5 qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que B25 í é His.
23. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com : qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que B25 éAsneB27éGluouAsp.
24. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que B25 é Asn e B27 é Glu.
25. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que a- presenta estabilidade aumentada para uma ou mais enzimas de protease com relação à proteína parental.
26. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que a- presenta estabilidade aumentada para duas ou mais enzimas de protease com relação à proteína parental.
27. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a in- sulina parental é selecionada de um grupo que consiste em: a) insulina humana; b) um análogo de insulina de insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B28 é Pro, Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e o resíduo de aminoácido na posição B29 é Lys ou Pro e opcionalmente o resíduo de aminoácido na posição B30 é deletado; c) des(B26-B30) insulina humana, des(B27-B30) insulina huma- na, insulina humana de des(B28-B30), des(B29-B30) insulina humana, insu- lina humana de des(B27) ou insulina humana de des(B30); d) um análogo de insulina de insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição B3 é Lys e o resíduo de aminoácido na posição B29éGluouAsp; e) um análogo de insulina de insulina humana em que o resíduo de aminoácido na posição A21 é Gly e em que o análogo de insulina é tam-

- 6 bém estendido no C-terminal com dois resíduos de Arg; ' f) um derivado de insulina em que o resíduo de aminoácido na : posição B30 é substituído com um éster de metila de treonina; e g) um derivado de insulina em que à posição Ne da lisina na po- sição B29 de insulina humana de des(B30) uma cadeia de tetradecanoila está ligada.
28. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que uma ou mais mutações adicionais são selecionadas para intensificar a estabilida- de química da insulina.
29. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que uma ou mais mutações adicionais são selecionadas de um grupo que consiste em A18Gln, A21GIn, A21GIly e B3GIn.
30. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido de cadeia A da fórmula 1, isto é: Xaaaç2)-Xaan1)-Xaano-Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Xaansg-Ser-lle-Cys- Xaan2-Xaan3-Xaani1-Xaanis-Leu-Glu-Xaanig-Tyr-Cys-Xaan: (SEQ ID No: 1) e uma sequência de aminoácido de cadeia B da fórmula 2, isto é: Xaag,. 2-Xaag(1)-Xaago-Xaag;-Xaap2-Xaagz-Xaaga-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaag,o-Leu- Val-Glu-Ala-Leu-Xaagi6-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaag24-Xaagas-Xaagos- Xaagsr7-Xaag2re-Xaag2o-Xaagao-Xaags1-Xaagz2 (SEQ ID No: 2), em que Xaanço) está ausente ou Gly; Xaaa1, está ausente ou Pro; Xaano está ausente ou Pro; Xaa,;s é independentemente selecionado de Thr e His; Xaan2 é inde- pendentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; Xaan é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaan, é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaans é independentemente selecionado de Gln,Aspe Glu; Xaa é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; Xaan, é independentemente selecionado de Asn e Glh; Xaag,.2, está ausen- te ou Gly; Xaag,1, está ausente ou Pro; Xaago está ausente ou Pro; Xaag,

- 7 está ausente ou independentemente selecionado de Phe e Glu; Xaag; está Ú ausente ou Val; Xaagz; está ausente ou independentemente selecionado de ' Asn e Gln; Xaag, é independentemente selecionado de Gln e Glu; Xaag1o é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; Xaagis é indepen- dentemente selecionado de Tyr, Asp, Gln, His, Arg, e Glu; Xaago, é indepen- dentemente selecionado de Phe e His; Xaagos é independentemente sele- cionado de Phe, Asn e His; Xaagxs está ausente ou independentemente se- lecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; Xaago; está ausente ou independen- temente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gln, His, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaagsxs está ausente ou independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; Xaaga,s está ausente ou independentemente selecionado de Lys e Gin; Xaagzo está ausente ou Thr; Xaag3z, está ausente ou Leu; Xaagz2> está ausen- te ou Glu; o C-terminal pode ser opcionalmente derivatizado como uma ami- da; em que a sequência de aminoácido da cadeia A e a sequência de ami- —noácido da cadeia B são conectadas por ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a cisteína na posição 7 da ca- deia B, e entre a cisteína na posição 20 da cadeia A e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteínas na posição 6 e 11 da cadeia A são conectadas por uma ligação em ponte de dissulfeto; em que opcionalmente asequência de aminoácido da cadeia A N-terminal é conectada à sequência de aminoácido da cadeia B C-terminal por uma sequência de aminoácido compreendendo 3-7 aminoácidos para formar uma molécula de insulina de cadeia simples, em que opcionalmente o N-terminal da cadeia B é estendido com 1-10 aminoácidos; em que se Xaans for Thr e Xaan for Ser e Xaans forleue Xaan, for Tyr então Xaa,s é Glu ou Asp; e em que se Xaago, for Phe e Xaagas for Phe e Xaagas for Tyr e Xaago7; for Thr e Xaagag for Pro então Xaaga é Gln.
31. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada pelo fato de que — compreende uma sequência de aminoácido de cadeia A da fórmula 3, isto é: Gly-Ille-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Xaang-Ser-lle-Cys-Xaani2-Xaan3-Xaani4- Xaaais-Leu-Glu-Xaanis-Tyr-Cys-Xaan, (SEQ ID No: 3), e uma sequência de

- 8 aminoácido de cadeia B da fórmula 4, isto é: Xaag;-Val-Xaaga-Xaaga-seu- i Leu-Cys-Gly-Ser-Xaag10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaag16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu- Arg-Gly-Xaag21-seu-Xaagas-Xaag27-Xaap28-Xaagao-Xaagão (SEQ ID No: 4), em que Xaan; é independentemente selecionado de Thr e His; Xaan é inde- — pendentemente selecionado de Ser, Asp e Glu; Xaan; é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaana, é independentemente selecionado de Tyr, Thr, Asn, Asp, Giln, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaais é independentemente selecionado de Gln, Asp e Glu; Xaani; é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gin; Xaans é independentemente selecionado de Asn, e Gin; Xaag, é indepen- dentemente selecionado de Phe e Glu; Xaag;3 é independentemente selecio- nado de Asn e Gin; Xaag, é independentemente selecionado de GIn e Glu; Xaagio é independentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; Xaag1s é independentemente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; Xaaga é independentemente selecionado de Phe e His; Xaagos é independentemente selecionado de Phe, Asn e His; Xaagaxs está ausente ou independentemente selecionado de Tyr, His, Thr, Gly e Asp; Xaag>; está ausente ou independen- temente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaagas está ausente ou independentemente selecionado de Pro, His, Gly e Asp; Xaagx, está ausente ou independentemente selecionado de Lys e Gin; Xaagzo está ausente ou Thr; o término C pode ser opcionalmente derivatiza- do como uma amida; em que a sequência de aminoácido de cadeia Ae a sequência de aminoácido de cadeia B estão conectadas através de ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteinas na posição 7 da cadeia A e a ciste- ínana posição 7 da cadeia B, e entre a cisteína na posição 20 da cadeia À e a cisteina na posição 19 da cadeia B e em que as cisteíinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ligação em ponte de dissulfeto.
32. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo a reivin- dicação 31, caracterizada pelo fato de que Xaaxs é independentemente se- lecionado de Thr e His; Xaa-> é independentemente selecionado de Ser e Glu; Xaan;3 é independentemente selecionado de Leu, Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, Pro, Ser e Glu; Xaan, é independentemente selecionado

- 9 de Tyr, Asp, His, e Glu; Xaas é independentemente selecionado de Glh e Í Glu; Xaan: é independentemente selecionado de Asn, Lys e Gln; Xaav: é i independentemente selecionado de Asn, e Glh; Xaag, é independentemente selecionado de Phe e Glu; Xaag3 é independentemente selecionado de Asn eGlh;Xaag, é independentemente selecionado de Gin e Glu; Xaagio é inde- pendentemente selecionado de His, Asp, Pro e Glu; Xaagi1s é independen- temente selecionado de Tyr, Asp, Gin, His, Arg, e Glu; Xaaga, é independen- temente selecionado de Phe e His; Xaagas é independentemente seleciona- do de Phe, Asn e His; Xaagas é independentemente selecionado de Tyr, Thr, GlyeAsp; Xaagz;, é independentemente selecionado de Thr, Asn, Asp, Gin, His, Lys, Gly, Arg, e Glu; Xaagoxs é independentemente selecionado do Pro, Gly e Asp; Xaagsxs é independentemente selecionado de Lys e Gln; Xaagszo está ausente ou Thr; o término C pode ser opcionalmente derivatizado como uma amida; em que a sequência de aminoácido de cadeia A e a sequência de aminoácido de cadeia B estão conectadas através de ligações em ponte de dissulfeto entre as cisteíinas na posição 7 da cadeia A e a cisteina na po- sição 7 da cadeia B, e entre a cisteína na posição 20 da cadeia A e a cisteí- na na posição 19 da cadeia B e em que as cisteinas na posição 6 e 11 da cadeia A estão conectadas por uma ligação em ponte de dissulfeto.
33. Insulina estabilizada em protease acilada, caracterizada pelo fato de que, na insulina estabilizada em protease, o aminoácido na posição A14 é Glu ou His (isto é, E ou H, de acordo com o código de uma letra), o aminoácido na posição B25 é His e que opcionalmente compreende ainda uma ou mais mutações adicionais, e em que a porção de acila é ligada ao grupoe amino no resíduo de lisina na posição B29.
34. Insulina estabilizada em protease acilada, caracterizada pelo fato de que, na insulina estabilizada em protease, o aminoácido na posição B25 é His ou Asn, o aminoácido na posição B27 é Glu ou Asp, e que opcio- nalmente compreende ainda uma ou mais das mutações adicionais seguin- tes: ASH, A14E/D, B1E/D, B28E/D, e desB30 e em que a porção de acila é ligada ao grupo € amino no resíduo de lisina na posição B29.
35. Insulina estabilizada em protease acilada, caracterizada pelo

- 10 fato de que, na insulina estabilizada em protease, o aminoácido na posição i A1A4 é Tyr, Glu ou His (isto é, Y, E ou H, de acordo com o código de uma W letra), o aminoácido na posição B25 é Asn, o aminoácido na posição B27 é Glu ou Asp e que opcionalmente compreende ainda uma ou mais mutações adicionais, e em que a porção de acila é ligada ao grupo e amino no resíduo de lisina na posição B29.
36. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizada pelo fato de que a insulina estabilizada em protease compreende a mutação de A14E.
37. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada pelo fato de que, na insulina estabilizada em protease, além da mutação na posição B25, há a- penas a mutação na posição A14 mencionada na cláusula precedente.
38. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a insulina estabilizada em protease compreende a mutação de A14H.
39. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizada pelo fato de que o análogo da insulina estabilizada em protease compreende a mutação de desB30.
40. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais mutações adicionais dentro da insulina estabilizada em protea- se é selecionada de um grupo que consiste em: A(-1)P, A(O)P, A8H, A21G, B(1)P,B(0)P, B1E, B1Q, B16E, B26D, B27E, B28D, desB30, B31L e B32E.
41. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que, além das mutações nas posições A14 e B25, apresenta apenas uma das mutações como definida na reivindicação 40.
42. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo fato de que, a- lém das mutações nas posições A14 e B25, apresenta exatamente duas das
- 1 mutações mencionadas como definidas na reivindicação 40. ' 43. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com : qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo fato de que, a- lém das mutações nas posições A14 e B25, apresenta exatamente três das — mutações como definidas na reivindicação 40.
44. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40 e 43, caracterizada pelo fato de que, além das mutações nas posições A14 e B25, a única mutação adicional é desB30.
45. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizada pelo fato de que o resíduo C do aminoácido terminal na cadeia A da insulina estabilizada em protease é o resíduo de aminoácido A21.
46. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada pelo fato de que a insulina estabilizada em protease é selecionada do grupo que consiste em insulina humana de ASH, B25N, B27E, desB30; insulina humana de A14E, A18L, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30; insuli- —nahumana de A14E, B1E, B25H, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana de A1I4E, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana de A14E, B28D, desB30; insulina humana de A14E, B28E, desB30; B25N, B27E, desB30; B25H, desB30; A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B16H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de

- 12 A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27K, desB28, desB29, desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB30; insulina . humana de A14E, desB30 e A21G, B25H, desB30.
47. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 46, caracterizada pelo fato de que a porção de acila ligada à insulina estabilizada em protease apresenta a fór- mula geral Acy-AA1,-AA2,,-AA3,p- (1), em que Acy, AA1, AA2, AA3, nn, mep são como definidos acima.
48. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo fato de que Acy é um ácido graxo, preferivelmente ácido mirístico ou ácido estérico, mais preferido ácido mirístico.
49. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizada pelo fato de que Acy é um diácido graxo, preferivelmente um diácido graxo (a,w), mais preferido ácido heptadecanodioico, ácido hexadecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido nonadecanodioico, ácido docosanodioico, ácido eicosanodioico.
50. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizada pelo fato de que Acy é um ácido w-(tetrazol-S-il)-graxo, preferivelmente ácido 15-(1H-tetrazol-5- i)pentadecanoico, ácido 16-(1H-tetrazol-5-il)hexadecanoico, ácido 17-(1H- tetrazol|-5-il)heptadecanoico, ácido 18-(1H-tetrazol-5-il)octadecanoico, ou ácido 19-(1H-tetrazol-5-il)nonadecanoico.
51. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com — qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizada pelo fato de que AA1 é ácido tranexâmico ou glicina.
52. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizada pelo fato de que AA1 é ácido tranexâmico.
53. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizada pelo fato de que né O ou 1.

- 13
54. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com : qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que n é . o.
55. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 54, caracterizada pelo fato de que n é

1.
56. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizada pelo fato de que AA2 é yGlu, aGlu, BAsp, aAsp, y-D-Glu, a-D-Glu, B-D-Asp, a-D-Asp, ou um ami- —noácido da fórmula seguinte: Y

N OH 7 Pe H,N x oH o! Ao o ss

HN OH HN OH E SÉ oo HoOto HS o o Nou No CG HNÓ N as

O Ho “o — ——> Ho o QT or e em que as setas indicam o ponto de ligação ao grupo amino de AA1, AA2Z2, AA3 ou ao grupo £-amino do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N-terminal da insulina estabilizada em protease.
57. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 56, caracterizada pelo fato de que AA2 é yGlu, BAsp, y-D-Glu, B-D-Asp, ou um aminoácido da fórmula seguinte: o Pon “o

HN OH % e HO“O | e em que a seta indica o ponto de ligação ao grupo amino de AA1, AAZ, AA3 ou ao grupo e-amino do resíduo de lisina B29 ou a uma posi- ção N-terminal da insulina estabilizada em protease.

- 14
58. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com Ã qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizada pelo fato de que AA2 , é yGlu, y-D-Glu, ou um aminsándo da fórmula seguinte:

Õ OH

HN OH Da SS em que a seta indica o ponto de ligação ao grupo amino de AA1, AA2Z,AA3 ou ao grupo e-amino do resíduo de lisina B29 ou a uma posição N- terminal da insulina estabilizada em protease.
59. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizada pelo fato de que m é 0,1,2,3,4,5, ou6.
60. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizada pelo fato de que m é 0,1,2,3,ou4.
61. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo fato de que m é 4
62. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 61, caracterizada pelo fato de que m é

3.
63. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, caracterizada pelo fato de que m é

2.
64. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizada pelo fato de que m é

1.
65. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizada pelo fato de que m é o.
66. Insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizada pelo fato de que AA3

: 15 é selecionado de qualquer um dos seguintes: " fo) oH AA Ao o . o HENTAI ANA AN oH h o EA fo o IN Og Ao ron

H Leto H,N [NDA o oH L Toe N | Lo H,N. o QN o OH A AO "

H

BN O O A OH o o ; Re HENTAI Ag AN oH 9 D e o o IN ouço,

H em que r é 1, 2,3, 5, 7, 11, 23 ou 27.
67. Insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo fato de que r é 1, 3, 5, ou 7.
68. Insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que ré 1.
69. Insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que ré 3.
70. Insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que ré 5.
71. Insulina estabilizada em protease acilada, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que ré 7.
72. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que p é 0, 1, 2,3,4,5,6,7,8,9, ouío.
73. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a
- 16 reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que p é 0, 1,2, 3 ou 4. i 74. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a . reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que p é 0, 1 ou 2.
75. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que p é 0 ou 2.
76. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que pé O.
77. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que p é 1.
78. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que p é 2.
79. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78, caracterizada pelo fato de que pelo menos dois aminoácidos hidrofóbicos na não insulina estabilizada em prote- aseforam substituídos com aminoácidos hidrófilos.
80. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 79, caracterizada pelo fato de que a porção de acila é ligada ao resíduo de lisina na insulina estabilizada em pro- tease.
81. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, caracterizada pelo fato de que a porção de acila é ligada ao grupo amino da cadeia A do resíduo N-terminal na insulina estabilizada em protease.
82. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 81, caracterizada pelo fato de que a insulina estabilizada em protease é selecionada do grupo que consiste em insulina humana de A8H, B25N, B27E, desB30; insulina humana de A14E, A18L, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, desB30; insuli- —na humana de A14E, B1E, B25H, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B1E, B28E, desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14E,

- 17 B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, , desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27E, desB30; insulina humana . de A14E, B25H, desB27, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana de A14E, B28D, desB30; insulina humana de A14E, B28E, desB30; B25N, B27E, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B16H, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; B25H, desB30; insulina humana de A21G, B25H, desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB30 e A14E, A21G, B25H, desB27, desB30.
83. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 82, caracterizada pelo fato de que a porção de acila ligada à insulina estabilizada em protease apresenta a fór- mula geral Acy-AA1,-AA2,-AA3,- (1), em que n é O ou um número inteiro na faixa de 1 a 3; m é O ou um número inteiro na faixa de 1 a 10; pé 0 ou um número inteiro na faixa de 1 a 10; insulina humana de Acy é um ácido graxo ou um diácido graxo que compreende de cerca de 8 a cerca de 24 átomos de carbono; insulina humana de AA1 é um resíduo de aminoácido linear ou cíclico neutro; insulina humana de AA é um resíduo de aminoácido acídico; insulina humana de AA3 é um resíduo de aminoácido contendo alquilenogli- col, neutro; a ordem pela qual AA1, AA2 e AA3 aparecem na fórmula pode ser trocada independentemente; insulina humana de AA2 pode ocorrer vá- rias vezes ao longo da fórmula (por exemplo, Acy-AA2-AA3>-AA2-); insulina humana de AA2 pode ocorrer independentemente (= sendo diferente) várias vezes ao longo da fórmula (por exemplo, Acy-AA2-AA37-AA2-); as conexões entre Acy, AA1, AA2 e/ou AA3 são ligações de amida (peptídeo) que, for- malmente, podem ser obtidas por remoção de um átomo de hidrogênio ou um grupo hidroxila (água) de cada um dentre Acy, AA1, AA2 e AA3; e liga- ção à insulina estabilizada em protease pode ser da extremidade C-terminal de um resíduo de AA1, AAZ, ou AA3 na porção de acila da fórmula (1) ou de uma das cadeias laterais de um resíduo de AA? presente na porção da fór- mula (1).
84. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com

- 18 qualquer uma das reivindicações 1 a 83, caracterizada pelo fato de que é ' qualquer um dos compostos especificamente mencionados no relatório des- ' critivo acima.
85. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 84, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“-hexadecandioil),) desB30; insuliha humana de A14E, B25H, B29K(N“octadecandioil-yGlu), désB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“3-carbóxi-5-octadecanodioilaminobenzoil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“-N-octadecandioil-N-(2-carboxieti)glicil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“ (N-octadecandioil-N-carboximetil)- beta-alanila), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“4-([4-(119- carboxinonadecanoilamino)metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“heptadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N*miristil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“4-([4-((19-carboxinonadeca- —noilaminotmetil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu-yGlu), desB30; insulina hu- mana de A14E, B25H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B28D, B29K(N“octadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“octadecandioil-yGlu-PEG?7), desB30; insu- lina humana de A14E, B25H, B29K(N“eicosanodioil-/Glu-OEG-OEG), —desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-(3-(2- (2-[2-(2-aminoetóxi)etóxiletóxitetóxi)propionil-yGlu), desB30; insulina huma- na de A14E, B25H, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; in- sulina humana de A14E, B25H, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu), desB30; in- sulina humana de A14E, B25H, B29K(Nºheptadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insuliha humana de A14E, B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu - yGlu -yGlu -yGlu), desB30; insulha humana de A14E, B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-yGlu-yGlu), desB30; insulina humana de A14E,

- 19 B25H, B27E, B29K(Nºoctadecanodioil-y/GlIu-OEG-OEG), desB30; insulina '" humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(N“octadecanodioil-yGlu- H OEG-OEG), desB30; insuliha humana de A14E, B1IGH, B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulha humana de A1T4E, B1I6GE, B25H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; in- sulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(N“hexadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-OEG - yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B16E, B25H, B29K(N“hexadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu -yGlu -yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(N“hexadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(N“octadecanodicil-yGlu - yGlu), desB30; insuliha humana de A1I4E, B16GH, B25H, B29K(N(eps)eicosanodioil-y/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de —A14E, B25H, B29K(N“octadecanodioil-OEG -yGlu -yGlu), desB30; insulina humana de A14E, A18L, B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, A18L, B25H, B29K(N“octadecanodioil- yGIlu-OEG-OEG), desB30; insuliha humana de A14E, B25H, B27E, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de —A1G(Nºoctadecandioil-yGlu-OEG-OEG), A14E, B25H, B29R, desB30; insuli- na humana de A14E, B1F(Nºoctadecandioil-y/Glu-OEG-OEG), B25H, B29R, desB30; insulina humana de A1G(Nºhexadecandioil-yGlu), A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“octadecanodioil-yo Glu-Abu-Abu-Abu-Abu), desB30; insulihva humana de A14E, B25H, —B29K(Nºeicosanodioil) desB30; insulha humana de A14E, B25H, B29K(Nº4-[16-(1H-tetrazol-5-il)hexadecanoilsulfamoil]butanoil), desB30; in- sulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(N“octadecandioil- yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A1T4E, B25H, B26G,B27G, B28G, B29K(N“octadecandioil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(N“eicosanodioil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-

: 20 OEG-OEG), desB30; insulina humana de A1I4E, B25H, ] B29K(N“docosanedioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, . B29K(Nºdocosanedioil-yGlu-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“icosanodioil-yGlu-OEG-OEG-yGlu), desB30; insulina humana de AIT4E, B25H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N* (N-icosanodioil-N-carboximetil)- BAla), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“3-[2-(2-(2-[2-(17- carbóxi-heptadecanoilamino)etóxiletóxitetóxi)etóxilpropionil-yGlu), — desB30; insulina humana de A1I4E, B25H, B29K(N“3-[2-(2-f2-[2-(19- —carboxinonadecanoilamino)etóxiletóxiletóxi)etóxilpropionil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“ºoctadecandioil-yGlu-(3-(242-[2-(2- aminoetóxi)etóxiletóxiletóxi)propionil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(N“octadecandioil-yGlu-(3-(2-(2-[2-(2-aminoetóxi)etóxiletóxi) etó- xi)propionil-yGlu), — desB30; insulha humana de A1I4E B25H, — B29K(Ncosanodioil-yGlu-(3-(2-(2-[2-(2-aminoetóxi)etóxiletóxiletóxi) propio- nil), desB30; insuliha humana de A14E, B25H, B29K(N“4-([4-(f17- carboxinonadecanoilamino)metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu), desB30; insulha humana de A14E, B25H, B29K(N“4-([4-(f17-carboxieptade- canoilamino)metil)trans-ciclo-hexanocarbonil]-yGlu-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B28D, hexadecandioil-yGlu de B29K(N”º), desB30; insulina humana de A14E, B28D, eicosanodioil-yGlu de B29K(Nº), desB30; insulina humana de A14E, B28D, octadecandioil-yGIt-OEG-OEG de B29K(N), desB30; insulina humana de A14E, B28D, eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG de B29K(N”º), desB30; insulina humana de A14E, B28E, hexadecandioil-yGlu de —B29K(Nº), desB30; insulina humana de A14E, B28E, octadecandioil-yGlu de B29K(Nº), desB30; insulina humana de A14E, B28E, eicosanodioil-yGlu de B29K(Nº), desB30; insulina humana de A14E, B28E, octadecandioil-yGlu- OEG-OEG de B29K(N”º), desB30; insulina humana de A14E, B28E, eicosa- nodioil-yGlu-OEG-OEG de B29K(N”º), desB30; insulina humana de A14E, BIE, B28E, B29K(Nºhexadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(N“octadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(Neicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana

- 21 de A14E, B1E, B28E, B29K(N“hexadecandioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; f insulina humana de A14E, B1E, B28E, B29K(N“octadecandioil-yGlu-OEG- B OEG), desB30; insulihta humana de AI4E B1IE, B28E, B29K(N“eicosanodioil-/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, BI1E,B27E,B28E, B29K(Nºhexadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(N“octadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(Nºhexadecandioil-yGlu- OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B1IE, B27E, B28E, B29K(Nºoctadecandioil-Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B27E, B28E, B29K(N“eicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nºhexadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(N“octadecandioil-yGlu), desB30; insulha humana de AI4E, B1IE, B25H, B28E, — B29K(Neicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(Nºhexadecandioil-/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, BIE, B25H, B28E, B29K(N“octadecandioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B28E, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, BI1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nºhexadecandioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(N“octadecandioil-yGlu), desB30; insuliha humana de A14E, B1IE, B25H, B27E, B28E, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Nºhexadecandioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B1IE, B25H, B27E, B28E, B29K(N“octadecandioil-yGlu- OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B1E, B25H, B27E, B28E, B29K(Neicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B28D, B29K(Nºhexadecanodioil-y/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B28E, B29K(Nºhexadecanodioil-y/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25N, B27E, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25N, B27E, B29K(Nºoctadecanodioil-/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25N, B27E, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu-

, 22

OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25N, B27E,

f B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de B25N, B27E, : B29K(N“octadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de B25N, B27E, B29K(N“hexadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A8H, B25N,

B27E, B29K(Neicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de ASH, B25N, B27E, B29K(Nºoctadecanodioil-/Glu-OEG-OEG), desB30; insu-

lina humana de A8H, B25N, B27E, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30; insulina humana de ASH, B25N, B27E, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A8H, B25N, B27E,

B29K(N“octadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de ASH, B25N, B27E, B29K(Nºhexadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nº (N-icosanodioil-N-carboximetil)-BAIla-OEG-OEG), desB30; insulihva humana de A14E, B25H, B29K(N“ (N-octadecanodioil-N- carboximetil)-BAla-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H,

—B29K(Nº (N-hexadecanodioil-N-carboximetil)-BAla-OEG-OEG), desB30; insu- lina humana de A14E, B25H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu-2-[(3-[2-[2-(3- aminopropóxi)etóxiletóxilpropilcarbamoil)]metóxilacetil), desB30; insulina humana de A1I14E B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-2-[(3-(2-[2-(3- aminopropóxi)etóxiletóxilpropilcarbamoil)metóxilacetil), “desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu-2-[(3-(2-[2-(3- aminopropóxi)etóxiletóxilpropilcarbamoil)]metóxilacetil), desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Nºeicosanodioil-yGlu-2-[(3-(2-[2-(3- aminopropóxi)etóxiletóxilpropilcarbamoil)metóxilacetil), desB30; insulina humana de B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insu-

linahumana de B25H, B29K(Nºeicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insu- lina humana de B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu), desB30; insulina hu- mana de B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de B25H, B29K(N“octadecanodioil), desB30; insulihva humana de B25H, B29K(N“eicosanodioil), desB30; insulina humana de B25H,

—B29K(Nºoctadecanodioil-yGlut-OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25H, B29K(Nºeicosanodioil-YGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de B25H,

B29K(N“eicosanodioil-Y/Glu), desB30; insulha humana de B25H, ' B29K(N“octadecanodioil),) — desB30; insulha humana de B25H, B29K(N“eicosanodioil), desB30; insulina humana de B25H, B29K(N“octadecanodioil-/Glut-OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25H, B29K(N“eicosanodioil-/Glut-OEG-OEG), desB30; insulina humana de B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(N“octadecanodioil), desB30; insulha humana de A14E, B25H, desB27, B29K(N“eicosanodioil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(Nºoctadecanodioil-/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30; insuliha humana de A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(N“octadecanodioil), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(N“eicosanodioil), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(N“eicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(N“octadecanodioil-y/Glu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(N“eicosanodioil- yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A1G(Nºoctadecandioil-yGlu- OEG-OEG), A14E, A21G, B25H, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Neicosanodioil-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B27K(NFoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB28, desB29, desB30; insuli- na humana de A14E, B25H, ácido B29K(Nf(5-eicosanodioilaminoisoftálico)), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil), desB30; insulina humana de A14E, B29K(Nfoctadecanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Neicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil-/Glu-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Neicosanodioil-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfeicosanodioil-Aoc), desB30; insulina humana de

- 24 A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nfeicosanodioil-yGlu -yGlu), ' desB30; insulha humana de A1I4E, B25H, B26G, B27G, B28G, , B29K(Neicosanodioil-yGlu -yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nfoctadecanodioil-OEG), desB30; insulina humana de A14E, B25H, desB27, B29K(Noctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina huma- na de A14E, B25H, B16H, B29K(Nfoctadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A1G(Nºoctadecanodioil), A14E, B25H, B29R, desB30; insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(Nfeicosanodioil-yGlu), desB30; insuli- na humana de A14E, B25H, B27K(Neicosanodioil-yGlu), desB28, desB29, desB30; insulina humana de A14E, B25H, B29K(Noctadecanodioil-yGlu - yGlu -yGlu), desB30; insulina humana de A21IG, B25H, B29K(Nfoctadecanodioil), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Neicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B29K(Nfoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B29K(Neicosanodioil-yGlu-OEG- OEG), desB30; insuliha humana de AI4E A21IG, B25H, B29K(ANfFeicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B29K(Nfeicosanodioil), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B29K(Noctadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, A21G, B25H, B29K(Nfoctadecanodioil), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(NFoctadecanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Nfoctadecanodioil), desB30; insulha humana de A1I4E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Afeicosanodioil-yGlu), desB30; insulina humana de A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Neicosanodioil), desB30; insulina humana de A1G(Nºoctadecandioil-yGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; in- sulina humana de A1G(Nºeicosanodioil-yGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de A1G(Nºoctadecandioil-yGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulha humana de —A1IG(Nºeicosanodioil-yGlu), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30; insulina humana de A1G(Nºoctadecandioil), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insulina humana de A1G(Nºeicosanodioil), A14E,

. 25 B25H, B26G, B27G, B28G, desB30; insuliha humana de ' A1G(Nºoctadecandioil), A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 e . insulina humana de A1G(Nºeicosanodioil), AT4E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30.
86. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que é insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(N“octadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30.
87. Uso do composto como definido na reivindicação 86, carac- terizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica paraotratamento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tole- rância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou disli- pidemia.
88. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que de ser para uso no trata- mento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dislipidemia.
89. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada em protease, como definida na reivindicação 86, e um veículo farmaceuti- camente aceitável. |
90. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que é insulina humana de A14E, B25H, desB27H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30.
91. Uso do composto como definido na reivindicação 90, carac- terizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tole- rância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou disli- pidemia.
92. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 90, caracterizada pelo fato de que de ser para uso no trata- mento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dislipidemia.

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93. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que i compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada y em protease, como definida na reivindicação 90, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
94. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que é insulina humana de A14E, B16H, B25H, B29K(N“eicosanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30.
95. Uso do composto como definido na reivindicação 94, carac- terizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica paraotratamento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tole- rância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou disli- pidemia.
96. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 94, caracterizada pelo fato de que de ser para uso no trata- mento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dislipidemia.
97. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada em protease, como definida na reivindicação 94, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
98. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que é insulina humana de A14E, B25H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu-OEG-OEG), desB30.
99. Uso do composto como definido na reivindicação 98, carac- terizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tole- rância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou disli- pidemia.
100. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 98, caracterizada pelo fato de que de ser para uso no trata- mento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, sindrome X ou dislipidemia.
101. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que ' compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada ' em protease, como definida na reivindicação 98, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
102. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que é insulina humana de A14E, B25H, desB27H, B29K(Nºoctadecanodioil-yGlu), desB30.
103. Uso do composto como definido na reivindicação 102, ca- racterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica paraotratamento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tole- rância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou disli- pidemia.
104. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com a reivindicação 102, caracterizada pelo fato de que de ser para uso no trata- mento, prevenção ou alívio de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dislipidemia.
105. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada em protease, como definida na reivindicação 102, e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
106. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser usa- da como medicamento.
107. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com as reivindicações 86, 90, 94, 98 ou 102, caracterizada pelo fato de ser usada como medicamento.
108. Insulina estabilizada em protease acilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser para o uso no tratamento ou na prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tole- —rância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou disli- pidemia.
109. O uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser para a preparação Ã de uma composição farmacêutica para o tratamento de diabetes. V
110. O uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser para a preparação S deuma composição farmacêutica que pode ser administrada pulmonarmen- te para o tratamento de diabetes.
111. O uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica que pode ser administrada pulmonarmen- teparaotratamento de diabetes e que dá um efeito de ação longa.
112. O uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica em pó que pode ser administrada pulmo- narmente para o tratamento de diabetes.
113. O uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica líquida que pode ser administrada pulmo- narmente para o tratamento de diabetes.
114. O uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 85, caracterizada pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica que pode ser administrada oralmente para o tratamento de diabetes.
115. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma in- sulina estabilizada em protease, como definido em qualquer uma das reivin- —dicações 1 a85, caracterizada pelo fato de ser para preparação de uma for- mulação farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabetes tipo 1, obesidade, síndrome X ou dislipidemia.
116. Composição, caracterizada pelo fato de que contém insuli- na humana como também uma insulina estabilizada em protease acilada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 85.
117. Composição, caracterizada pelo fato de que contém insuli-
: 29 na aspart como também uma insulina estabilizada em protease acilada como ' definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 85. ' 118. Composição, caracterizada pelo fato de que contém insuli- na Lispro como também uma insulina estabilizada em protease acilada, co- —modefinidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 85.
119. Composição, caracterizada pelo fato de que contém insuli- na Glulisina como também uma insulina estabilizada em protease acilada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 85.
120. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade biologicamente ativa da insulina estabilizada em protease, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 85, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
121. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretiza- ções ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.