ES2197301T3 - Benzotiofenos, formulaciones y procedimientos de uso. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION, PROPORCIONA UNA CLASE DE COMPUESTOS DE BENZO[B]TIOFENOS SUSTITUIDOS, DE ESTRUCTURA: Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN DICHOS COMPUESTOS, BIEN SOLOS, O EN COMBINACION CON ESTROGENO O PROGESTINA, UTILIZADOS EN EL TRATAMIENTO SINTOMATICO DEL SINDROME POSTMENOPAUSICO, ESPECIALMENTE DE LA OSTEOPOROSIS, ALTERACIONES PATOLOGICAS CARDIOVASCULARES RELACIONADAS Y CANCER DEPENDIENTE DE ESTROGENOS.

Description

Benzotiofenos, formulaciones y procedimientos de uso.

``Síndrome postmenopáusico'' es un término usado para describir dolencias que afectan frecuentemente a mujeres que han entrado en la metamorfosis fisiológica conocida como menopausia o que la han completado. Aunque se contemplan numerosas patologías al usar el término, tres efectos principales del síndrome postmenopáusico son la fuente de la mayor preocupación médica a largo plazo: osteoporosis, efectos cardiovasculares tales como hiperlipidemia y cáncer dependiente de estrógenos, en particular cáncer de mama y de útero.

La patente U.S. nº. 5.484.798 se refiere a nuevos compuestos de benzotiofeno que son útiles para el tratamiento de varias indicaciones médicas asociadas con el síndrome postmenopáusico, y enfermedad fibroide uterina, endometriosis y proliferación de células de músculos lisos aórticos.

La patente WO/10513 se refiere a benzotiofenos y compuestos afines que son agonistas de estrógenos para tratar síndromes y dolencias causadas por una deficiencia de estrógenos.

Osteoporosis describe un grupo de enfermedades que arrancan de diversas etiologías, pero que se caracterizan por la pérdida neta de masa ósea por unidad de volumen.

La osteoporosis es una enfermedad común y seria entre mujeres postmenopáusicas.

Se estima en 25 millones sólo en EE.UU. las mujeres afectadas por esta enfermedad. Los resultados de la osteoporosis son personalmente perjudiciales y también son causa de una gran pérdida económica debido a su carácter crónico y el soporte a largo plazo (hospitalización y cuidado de enfermeras en el domicilio) de las secuelas de la enfermedad. Esto es especialmente cierto en pacientes de mayor edad. Además, aunque en general no se cree que la osteoporosis es una dolencia que amenaza la vida, una tasa de mortalidad de 20% a 30% está relacionada con roturas de cadera en mujeres mayores. Un gran porcentaje de esta tasa de mortalidad se puede asociar directamente con la osteoporosis postmenopáusica.

El tejido más vulnerable del hueso a los efectos de la osteoporosis postmenopáusica es el hueso trabecular. Con frecuencia se denomina este tejido hueso esponjoso o de celosía y está particularmente concentrado cerca de los extremos del hueso (cerca de las uniones) y en las vértebras de la columna. El tejido trabecular se caracteriza por pequeñas estructuras osteoides que se conectan entre sí, así como el tejido cortical más sólido y denso que constituye la superficie exterior y el eje central del hueso. Esta red interconectada de trabéculas da soporte lateral a la estructura cortical exterior y es crítica para la resistencia biomecánica de la estructura global. En la osteoporosis postmenopáusica, principalmente es la resorción y pérdida neta de las trabéculas lo que conduce al fallo y a la fractura del hueso. A la vista de la pérdida de trabéculas en mujeres postmenopáusicas, no es sorprendente que las fracturas más comunes sean las asociadas con huesos que dependen en gran medida del soporte trabecular, por ejemplo las vértebras y el cuello de huesos que soportan el peso tales como fémur y antebrazo. Obviamente, la fractura de cadera, las fracturas de cuello y las fracturas de vértebras son señales de osteoporosis postmenopáusica.

Actualmente, el único procedimiento generalmente aceptado para tratar la osteoporosis postmenopáusica es la terapia sustitutiva de estrógenos. Aunque por lo general la terapia tiene éxito, la aceptación por el paciente de la terapia es baja debido principalmente a que frecuentemente el tratamiento con estrógenos produce indeseables efectos secundarios.

A lo largo del período postmenopáusico, la incidencia de enfermedad cardiovascular en mujeres es menor que en hombres de la misma edad. Después de la menopausia, sin embargo, la tasa de enfermedad cardiovascular en mujeres aumenta lentamente para igualarse a la vista en hombres. Esta pérdida de protección se ha relacionado con la pérdida de estrógenos y, en particular, la pérdida de capacidad de los estrógenos para regular los niveles de lípidos en suero. No se conoce bien la naturaleza de la capacidad de los estrógenos para regular los lípidos séricos, pero la evidencia hasta el momento indica que los estrógenos pueden regular por hiperproducción los receptores de lípidos de baja densidad (LDL) en el hígado para eliminar el exceso de colesterol. Además, parece que los estrógenos tienen algún efecto sobre la biosíntesis de colesterol y otros efectos benéficos sobre la salud cardiovascular.

Se ha dado cuenta en la bibliografía de que mujeres postmenopáusicas que tienen una terapia sustitutiva de estrógenos retornan a los niveles de lípidos en suero de los de mujeres en estado premenopáusico. Así, los estrógenos serían un tratamiento razonable para esta terapia. Sin embargo, los efectos secundarios de la terapia sustitutiva de estrógenos no son aceptables para muchas mujeres, lo que limita el uso de esta terapia. Una terapia ideal para esta dolencia sería un agente que regulara el nivel de lípidos en suero como lo hacen los estrógenos, pero que no presentara algunos o todos de los efectos secundarios y riesgos asociados a la terapia de estrógenos.

La tercera patología principal asociada al síndrome postmenopáusico es el cáncer de mama dependiente de estrógenos y, en menor cuantía, cánceres de otros órganos dependientes de estrógenos, en particular, el uterino. Aunque tales neoplasmas no están limitados únicamente a mujeres postmenopáusicas, son mucho más frecuentes en la población de más edad, postmenopáusica. La quimioterapia habitual de estos cánceres ha descansado marcadamente en el uso de compuestos antiestrogénicos tales como, por ejemplo, tamoxifeno. Aunque tales agonistas-antagonistas mixtos tienen efectos beneficiosos en el tratamiento de estos cánceres y los efectos estrogénicos secundarios son tolerables en situaciones agudas de amenaza para la vida, no son ideales. Por ejemplo, estos agentes tienen efectos estimulantes sobre las poblaciones de ciertas células cancerosas en el útero debido a sus propiedades estrogénicas (agonistas) y, por tanto, en algunos casos pueden ser contraproducentes. Una terapia mejor para el tratamiento de estos cánceres sería un agente que fuera un compuesto antiestrógeno que tuviera una despreciable o ninguna propiedad agonista estrógena sobre los tejidos reproductivos.

En respuesta a la evidente necesidad de nuevos agentes farmacéuticos capaces de aliviar los síntomas de, entre otros, síndrome postmenopáusico, la presente invención proporciona nuevos compuestos, formulaciones farmacéuticas de ellos y procedimientos de uso de tales compuestos para el tratamiento del síndrome postmenopáusico y otras dolencias patológicas relacionadas con estrógenas tales como las que se mencionan posteriormente.

La fibrosis uterina (enfermedad fibroide uterina) es un problema clínico viejo y siempre presente que se conoce con una variedad de nombres incluidos los de enfermedad fibroide uterina, hipertrofia uterina, lieomiomata uterina, hipertrofia miométrica, útero con fibrosis y metritis fibrótica. Esencialmente, la fibrosis uterina es una dolencia en la que hay un depósito inapropiado de tejido fibroide sobre la pared del útero.

Esta dolencia es causa de dismenorrea e infertilidad en mujeres. La causa exacta de esta dolencia se conoce mal, pero la evidencia sugiere que es una respuesta inapropiada del tejido fibroide a los estrógenos. Tal dolencia se ha producido en conejos por administración diaria de estrógenos durante 3 meses. En cobayas se ha producido la dolencia administrando diariamente estrógenos durante 4 meses. Además, en ratas, los estrógenos causan una hipertrofia similar.

El tratamiento más común de la fibrosis uterina implica procedimientos quirúrgicos, costosos y a veces fuente de complicaciones tales como la formación de adherencias abdominales e infecciones. En algunos pacientes, la cirugía inicial es sólo un tratamiento temporal y hay recidiva de fibroides. En esos casos se realiza una histeroctomía que acaba efectivamente con la fibrosis, pero también con la vida reproductiva de la paciente. También se pueden administrar antagonistas de hormonas que liberan gonadotropina, pero su uso está frenado por el hecho de que puede conducir a osteoporosis. Así, existe necesidad de nuevos procedimientos para tratar la fibrosis uterina, y los procedimientos de la presente invención satisfacen esa necesidad.

La endometriosis es una dolencia de dismenorrea severa que se acompaña por un dolor severo, hemorragia en las masas endométricas o la cavidad peritoneal y frecuentemente conduce a infertilidad. Las causas de los síntomas de esta dolencia parece que son crecimientos endométricos peritoneales que responden inapropiadamente a un control hormonal normal y se localizan en tejidos inapropiados. A causa de las localizaciones inapropiadas del crecimiento endométrico, parece que el tejido inicia respuestas locales de tipo inflamatorio que causan la infiltración de macrófagos y una cascada de acontecimientos que conducen a la iniciación de la respuesta dolorosa. La etiología exacta de esta enfermedad no es bien conocida y su tratamiento por terapia hormonal es diversa, está malamente definida y está marcada por numerosos efectos secundarios no deseados y acaso peligrosos.

Uno de los tratamientos de esta enfermedad es el uso de dosis bajas de estrógenos para suprimir el crecimiento endométrico por un efecto negativo de retroalimentación sobre la liberación central de gonadotropina y posterior producción de estrógenos en ovario; sin embargo, a veces es necesario usar continuamente estrógenos para controlar los síntomas. Con frecuencia, este uso de estrógenos puede conducir a indeseados efectos secundarios incluso con riesgo de cáncer de endometrio.

Otro tratamiento consiste en la administración continua de progestinas que inducen amenorrea y que, por suprimir la producción de estrógenos en el ovario, pueden causar regresiones de crecimientos del endometrio. El uso crónico de la terapia con progestinas con frecuencia está acompañado por desagradables efectos laterales en el SNC y a menudo conduce a infertilidad debido a la supresión de la función ovárica.

Un tercer tratamiento consiste en la administración de andrógenos débiles que son efectivos para controlar la endometriosis; sin embargo, inducen unos severos efectos de masculinización. También varios de estos tratamientos de le endometriosis se han visto implicados como causantes de una pérdida ósea suave en una terapia continuada. Por tanto, son deseables nuevos procedimientos para tratar la endometriosis.

La proliferación celular de músculos lisos juega un papel importante en enfermedades tales como la ateroesclerosis y la restenosis. Se ha visto restenosis vascular después de angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) a una respuesta del tejido, caracterizada por una fase precoz y demorada. La fase precoz, que se presenta entre horas y días después de la PTCA, es debida a trombosis con algunos vasoespasmos, mientras que la fase demorada parece que está dominada por un excesiva proliferación y migración de células vasculares de músculo liso aórtico. En esta enfermedad, la incrementada motilidad y colonización celular por tales células musculares y macrófagos contribuye significativamente a la patogénesis de la enfermedad. La proliferación y migración excesivas de las células vasculares del músculo liso aórtico pueden ser el mecanismo principal de la reoclusión de las arterias coronarias después de la PCTA, la angioplastia con láser y la cirugía de injerto arterial de bypass. Véase: Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis after Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty, Austin y otros, Journal of trhe American College of Cardiology, 8: 369-375 (agosto de 1985).

La restenosis vascular queda como complicación a largo plazo después de una intervención quirúrgica de arterias bloqueadas por PTCA, aterectomía, angioplastia con láser y cirugía de injerto de bypas arterial. En aproximadamente 35% de los pacientes a los que se ha hecho una PCTA, al cabo de 3 a 6 meses después de efectuado el procedimiento se produce reoclusión. En las estrategias actuales para tratar la restenosis vascular están incluidas la intervención mecánica con dispositivos tales como agentes o terapias farmacológicas, incluida heparina, cumarina, aspirina, aceite de pescado, antagonistas de calcio, esteroides y prostaciclina. Estas estrategias han fracasado para frenar el grado de reoclusión y han sido ineficaces para el tratamiento y la prevención de la restenosis vascular. Véase Prevention of Restenosis after Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search for a ``Magic Bullet'', Hermans y otros, American Heart Journal, 122, 171-187 (julio de 1991).

En la patogénesis de la restenosis se produce una excesiva proliferación y migración de células como resultado de factores de crecimiento producidos por los constituyentes celulares en la sangre y la pared del vaso arterial dañado que median en la proliferación de las células de músculo liso en la restenosis vascular.

Los agentes que inhiben la proliferación y/o la inhibición de las células de músculo liso aórtico son útiles en el tratamiento y la prevención de la restenosis. La presente invención proporciona el uso de compuestos como inhibidores de la proliferación celular del músculo liso aórtico y, por ello, inhibidores de la restenosis.

Sumario de la invención

La invención proporciona nuevos benzotiofenos de la fórmula (I)

1

en la que

R_{1} es -H, -OH, -O(alquilo C_{1-4}), -O-CO(alquilo C_{1-6}), OSO_{2}(alquilo C_{4-6}) o -OCAr, grupo en el que Ar opcionalmente es fenilo sustituido,

R_{2} es -H, -OH, -O(alquilo C_{1-4}), -OCO(alquilo C_{1-6}), OSO_{2}(alquilo C_{4-6}) o -OCAr, grupo en el que Ar opcionalmente es fenilo sustituido, -Cl o -Br

R_{3} es -H, -F, -Cl- alquilo C_{1-4}, CN o -O(alquilo C_{1-3}),

R_{4} es -H, -F, -Cl- alquilo C_{1-4}, CN o -O(alquilo C_{1-3}),

R_{5} es -H, -F, -Cl, -alquilo C_{1-4} o -O(alquilo C_{1-4}),

R_{6} es -H, -F, -Cl, -alquilo C_{1-4} o -O(alquilo C_{1-3}),

con la condición de que R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} no sean todos ellos hidrógeno,

Y es -CO, -CHOH o -CH_{2}-,

R_{7} y R_{8} son, cada uno independientemente, alquilo C_{1-4},

o se combinan para formar, con el nitrógeno al que están unidos, 1-piperidinilo, 1-pirrolidinilo, 1-hexametilenimino

o morfolino,

o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.

Una realización preferente de esta invención es el compuesto en el que cada R_{1} y R_{2} es hidroxi, cada uno de R_{5} y R_{6} es hidrógeno, cada R_{3} y R_{4} es metilo y R_{7} y R_{8} forman un resto de piperidinilo, verbigracia, [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]-tien- 3-il][4-(1-piperidinil)etoxi]-3,5- dimetilfenil]metanona y su sal clorhidrato.

Una realización muy preferente de esta invención es el compuesto en el que R_{1} y R_{2} son, cada uno, hidroxi, R_{4}, R_{5} y R_{6} son, cada uno, hidrógeno, R_{3} es flúor y R_{7} y R_{8} forman un resto piperidinilo, verbigracia, [2-(4-hidroxifenil)-6- hidroxibenzo[b]-tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3- fluorofeni]metanona y su sal clorhidrato.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas aceptables que comprenden un compuesto de fórmula I y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Están incluidos en el ámbito de compuestos de fórmula I isómeros de centros asimétricos e isómeros cis/trans asociados con restos alquenilo.

La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula I, que opcionalmente contienen estrógenos o progestinas, y al uso de tales compuestos, solos o en combinación con estrógenos y progestina, para aliviar los síntomas de síndrome postmenopáusico, en particular osteoporosis, dolencias patológicas cardiovasculares relacionadas y cáncer dependiente de estrógenos. Tal como se usa aquí, el término ``estrógenos'' incluye compuestos esteroides que tiene actividad estrogénica, por ejemplo, 17\beta-estradiol, estrona, estrógenos conjugados (Premarin®), estrógeno de equinos, 17\beta-etinilestradiol y otros similares. Tal como se usa aquí, ``progestinas'' incluye compuestos que tienen actividad progestínica, tales como, por ejemplo, progesterona, noretilnodrel, nongestrel, acetato de megestrol, noretindrona y compuestos similares.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de una nueva serie de benzo[b]tiofenos de la fórmula I. Estos compuestos son útiles para inhibir dolencias asociadas al síndrome postmenopáusico.

El término ``inhibir'' incluye su significado generalmente aceptado, que incluye prohibir, prevenir, restringir y hacer más lento, parar o invertir la progresión, severidad o un síntoma resultante. Por tanto, los procedimientos incluyen la administración médica terapéutica y/o profiláctica, según sea apropiado.

Los términos generales usados en la descripción de los compuestos descritos aquí tienen el significado habitual. Por ejemplo, ``alquilo C_{1-4}'' se refiere a cadenas alifáticas lineales o ramificadas de 1 a 4 átomos de carbono, entre las que están incluidos metilo, etilo, propilo, ispropilo, n-butilo y otros; y ``alquilo C_{1-6}'' abarca los grupos incluidos en la definición de ``alquilo C_{1-4}'' además de grupos tales como pentilo, isopentilo, hexilo, etc. La excepción a esta terminología se produce en el caso de derivados sulfonilo, esto es, ``-O-SO_{2}-(alquilo C_{4-6})-'', que se piensa es el único; n-butilo, n-pentilo o n-hexilo.

El término ``fenilo sustituido'' se refiere a un grupo fenilo que tiene uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo constituido por alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1-3}, hidroxi, nitro, cloro, flúor o tri(cloro o fluoro)metilo. ``Alcoxi C_{1-3}'' se refiere a un grupo alquilo C_{1-3} unido mediante un puente de oxígeno, tal como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi.

Los compuestos de la presente invención, esto es, los compuestos de fórmula I, pueden prepararse esencialmente como se describe en las patentes U.S. n^{os}. 4.133.814, expedida el 9 de enero de 1979; 4.358.593, expedida el 28 de febrero de 1995, y 5.482.949, expedida el 9 de enero de 1996.

En resumen, los compuestos de fórmula II se pueden acilar en la posición 3 del núcleo de benzotiofeno con un resto carboxilo activado de los compuestos de fórmula III en condiciones estándar de Friedel-Crafts. En general, las condiciones de acilación serían el uso de un ácido de Lewis tal como AlCl_{3}, BF_{3} y otros similares, en un disolvente apropiado tal como un hidrocarburo halogenado a temperaturas de 0-100ºC. Los restos carboxilo activado de los compuestos de fórmula III son haluros de acilo, anhídridos mixtos y similares, siendo preferido el cloruro de ácido. Los compuestos de fórmula II se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente U.S. nº. 4.133.814. Los expertos en química orgánica apreciarán que los ligandos R_{1} y R_{2} deben ser compatibles con las condiciones de acilación para formar los compuestos de fórmula I; así, un intermedio preferido sería aquél en el que R_{1} y R_{2} son -OMe. Los carboxilos activados de los compuestos de fórmula III pueden prepararse a partir de ácidos carboxílicos disponibles o por procedimientos conocidos en la técnica con agentes tales como cloruro de tionilo.

2

significando R_{1} y R_{2} lo antes indicado.

3

fórmula en la que R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} significan los antes indicado y X es un resto activado tal como Cl, Br, OAc y similares.

Otros compuestos de fórmula I en la que R_{1} y R_{2} son ésteres o sulfonatos pueden hacerse derivar metilando el compuesto dimetoxi con AlCl_{3}, BCl_{3}, etc. y acilando con el resto acilo o sulfonilo apropiado.

Un procedimiento alternativo para preparar los compuestos de fórmula I, especialmente preferido para la preparación de los compuestos preferidos de esta invención, sería acilar la 3ª posición de un compuesto de fórmula II con un compuesto de fórmula IV usando condiciones estándar de Friedel-Crafts para formar los compuestos de fórmula V. El grupo 4-OMe del resto benzoílo puede eliminarse selectivamente usando NaSEt para formar el compuesto de fórmula VI. Los compuestos de fórmula VI se pueden O-alquilar con los compuestos de fórmula VII empleando una base inorgánica tal como K_{2}CO_{3}, Cs_{2}CO_{3} y otras similares para formar los compuestos finales de fórmula I:

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en la que R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} significan lo antes indicado.

5

en la que R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} significan lo antes indicado.

6

en la que R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} significan lo antes indicado.

7

en la que R_{7} y R_{8} significan lo antes indicado.

Se pueden preparar de la siguiente manera otros compuestos de fórmula I en la que Y es un carbinol o metileno.

La reducción del carbonilo a carbinol y luego a metileno se puede realizar por etapas, o se puede convertir el carbinol en metileno en una sola etapa.

Resumidamente, el compuesto carbonilo se puede reducir a carbinol con LiAlH_{4}, NaBH_{4}, etc. en disolventes apropiados tales como clorocarburos, THF, éter, etc. a temperaturas de 0-30ºC. El carbinol se puede reducir a metileno con silanos, por ejemplo, trietilsilano, en disolventes apropiados tales como cloruro de metileno o THF, con un ácido fuerte tal como ácido trifluoroacético, a temperatura ambiente. Alternativamente, el compuesto carbonilo se puede reducir directamente a metileno usando LiAlH_{4} en un disolvente con un punto de ebullición alto, tal como propilbenceno, a temperatura de reflujo.

Seguidamente se presentan preparaciones de muestras a fines ilustrativos, que de ninguna forma son limitativas de la invención.

Preparación 1 Clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil) etoxi]-3-fluorofenil]metanona

Se disolvieron en 30 ml de cloruro de metileno 960 mg (1,85 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][-[4-[2-(1- piperidinil)etoxi]-3-fluorofenil]metanona y se enfrió a 0ºC; se añadieron 2,5 g (18,5 mmol) de AlCl_{3} en porciones a lo largo de 10 min. A la mezcla de reacción sea añadieron 2,75 ml (37 mmol) de EtSH y la mezcla de reacción se agitó durante 15 min. La mezcla de reacción se calentó a reflujo y se mantuvo durante 1,5 h. Se dejó enfriar la mezcla de reacción y se apagó con 100 ml de agua-hielo. Se precipitó el producto en bruto, que se recogió por decantación de los líquidos. El sólido se disolvió en 50 ml de MeOH y se cromatografió sobre gel de sílice en columna eluyendo con un disolvente de MeOH-CHCl_{3} (1:9). Se determinaron por TLC las fracciones apropiadas y se combinaron. Se evaporaron a sequedad en vacío las fracciones combinadas. El residuo se disolvió en 25 ml de MeOH y se precipitó añadiendo una solución de MeOH-HCl hasta que no se formó más precipitado. Se eliminó el líquido por decantación y se redisolvió la sal en una mínima cantidad de MeOH. Se añadió luego éter y se dejó que el producto recristalizara a -20ºC. Se obtuvieron así 470 mg del compuesto del título.

PMR: de acuerdo con la estructura propuesta

MS: m/e= 492 (M-HCl) FD

MS exacta: Calculada para C_{28}H_{27}FNO_{4}S : 492,1645; hallada: 492,1647

Preparación 2 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil)etoxi] -3-fluorofenil]metanona

Se disolvieron en 12 ml de DMF 900 mg (2,20 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][3-fluoro-4-hidroxifenil]metanona y se añadieron 810 mg (4,4 mmol) de clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina. A la mezcla de reacción se añadieron 3,3 g (10 mmol) de Cs_{2}CO_{3} y se calentó a reflujo durante 1 h. Se filtró la mezcla de reacción para eliminar los sólidos. Se eliminaron los disolventes por evaporación y el residuo se cromatografió en columna sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente lineal empezando con CHCl_{3} y finalizando con MeOH-CHCl_{3} (1:19). Se determinaron por TLC las fracciones apropiadas, se combinaron y la mezcla se evaporó a sequedad para obtener un sólido. Esto dio 960 mg del compuesto del título como un sólido amorfo de color canela.

PMR. Conforme con la estructura propuesta.

Preparación 3 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][3-fluoro-4-hidroxifenil]metanona

Se disolvieron en 6 ml de DMF 500 mg (1,2 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][3-fluoro-4-metoxifenil]metanona y se añadieron 200 mg (2,4 mmol) de NaSEt. La mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante 1,5 h bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se filtró rápidamente en columna de gel de sílice con CHCl_{3} para eliminar los sólidos y cambiar el disolvente. Se evaporó el efluyente de la columna obteniéndose un sólido que se redisolvió en EtOAc. La solución en EtOAc se cromatografió en columna de gel de sílice eluyendo con un gradiente lineal comenzando con EtOAc-hexano (3:7) y finalizando con EtOAc-hexano (1:1). Se determinaron por TLC las fracciones apropiadas, se combinaron y la combinación se evaporó a sequedad. Se obtuvieron así 200 mg del compuesto del título como un sólido amorfo de color canela.

PMR: conforme con la estructura propuesta.

Preparación 4 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][3-fluoro-4-metoxifenil]metanona

Se disolvieron en 25 ml de cloruro de tionilo y 3 gotas de DMF 5 g (29,4 mmol) de ácido 3-fluoro-4-metoxibenzoico y se calentó a reflujo durante 1 h. La mezcla de reacción se evaporó para obtener un aceite y se usó sin más purificación. Se añadió el cloruro de ácido a 50 ml de diclorometano y 5,3 g (19,5 mmol) de 2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tiofeno. Se añadieron a lo largo de 30 min 4 porciones de AlCl_{3} (total, 16 g, 120 mmol) y la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante varias horas. Se apagó la reacción vertiendo la mezcla en agua-hielo y se separó la capa orgánica. La capa orgánica se secó con agua y se secó por filtración a través de Na_{2}SO_{4} anhidro y se evaporó a sequedad. El producto en bruto se cromatografió en columna de sílice (HPLC) eluyendo con un gradiente lineal que comenzó con EtOAc:hexano (1:19) y terminó con EtOAc:hexano (1:1). Se determinaron por TLC las fracciones apropiadas, se combinaron y se evaporó para obtener un sólido. Se obtuvo 1 g del compuesto del título.

PMR: de acuerdo con la estructura propuesta.

Preparación 5 Clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-2-(1-piperidinil) etoxi]3,5-dimetilfenil]metanona

Se prepararon 920 mg del compuesto del título a partir de 2,9 g (5,5 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxi-benzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil)etoxi] 3,5-dimetil-fenil]metanona de manera similar a la de la Preparación 1.

PMR: de acuerdo con la estructura propuesta.

MS: m/e=502 (M-HCl) FD

MS exacta: Calculado para C_{30}H_{32}NO_{4}S: 502,2052; hallado: 502,2045

Preparación 6 Clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il] [4-(2-(1-piperidinil)etoxi]-3-t-butil-5-metilfenil]metanona

Se sintetizaron 620 mg del compuesto del título a partir de 1,3 g (2,3 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil) etoxi]-3-t-butil-5-metilfenil]metanona de manera similar a la de la Preparación 1.

PMR: Conforme con la estructura propuesta

MS: m/e= 543 (M-HCl) FD

MS exacta: Calculado para C_{33}H_{38}NO_{4}S: 544,2522; hallado 544,2518

Preparación 7 Clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il] [4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3-clorofenil]metanona

Se prepararon 700 mg del compuesto del título a partir de 1,3 g (2,42 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxi-benzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3-clorofenil] metanona de manera similar a la de la Preparación 1.

PMR: Conforme con la estructura propuesta

MS: m/e=508 (M-HCl) FD

MS exacta: Calculado para C_{28}H_{27}ClNo_{4}S: 508,1349; hallado 508,1360

EA: Calculado para C_{28}H_{26}ClNO_{4}S HCl: C 61,77; H 5,00; N 2,57; hallado: C 61,09; H 5,47; N 2,34

Preparación 8 Clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il] [4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-2-clorofenil]metanona

El compuesto del título se preparó a partir de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidin-il) etoxi]-2-clorofenil]metanona de manera similar a la de la Preparación 1.

PMR: Conforme con la estructura propuesta

MS= m/e=508 (M-HCl) FD

MS exacta para C_{28}H_{27}ClNO_{4}S: 508,1349; hallado: 508,1355

Preparación 9 Clorhidrato de [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il] [4-(2-(1-piperidinil)etoxi]-3-cianofenil]metanona

El compuesto del título se preparó disolviendo 1,6 g (3,04 mmol) de clorhidrato de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3-fenil]metanona en 20 ml de dicloroetano. Se añadieron 2,1 ml de BCl_{3} condensado y se cerró en un recipiente a temperatura ambiente. Se dejó que la reacción transcurriera durante 16 h. La reacción se apagó vertiendo la mezcla de reacción en hielo. Se recogió el producto en bruto en la capa orgánica y se evaporó a un sólido. El producto se purificó más como en la Preparación 1.

PMR: De acuerdo con la estructura propuesta

MS: m/e=499 (M-HCl) FD

MS exacta: Calculada para C_{29}H_{27}N_{2}O_{4}S: 499,1629; hallado: 499,1703

Preparación 10 Clorhidrato de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il] [4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3-cianofenil]metanona

Se prepararon 1,6 g del compuesto del título a partir de 1,45 g (3,49 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][3-ciano-4-hidroxifenil]metanona, 1,3 g (7 mmol) de 1-(2-cloroetil)piperidina y 4,9 g (15 mmol) de Cs_{2}CO_{3} de manera similar a la de la Preparación 2.

PMR: De acuerdo con la estructura propuesta.

Preparación 11 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][3-ciano-4-hidroxifenil]metanona

Se prepararon 1,45 g del compuesto del título a partir de 1,5 g (3,49 mmol) de [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b] tien-3-il][3-ciano-4-metoxifenil]metanona y 590 mg (6,98 mml) de NaSEt de manera similar a la de la Preparación 3.

PMR: Conforme con la estructura propuesta.

Preparación 12 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][3-ciano-4-metoxifenil]metanona

Se prepararon 1,8 g del compuesto del título a partir de 3,9 g (3,9 mmol) del ácido 3-ciano-4-metoxibenzoico (convertido en cloruro de ácido con 30 ml de SOCl_{2} y 3 gotas de DMF), 6 g (22 mmol) de 2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tiofeno y 14,7 g (110 mmol) de AlCl_{3} de manera similar a la de la Preparación 4.

PMR: Conforme con la estructura propuesta

MS: m/e=429 (M) FD

AE: Calculado para C_{25}H_{19}NO_{4}S: C 69,91; H 4,46; N 3,26; hallado: C 69,65; H 4,47; N 3,27

Preparación 13 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil)etoxi] -3-clorofenil]metanona

Se disolvieron 2,6 g (8,12 mmol) de clorhidrato del ácido 4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3-clorobenzoico en 25 ml de diclorometano y 50 ml de SOCl_{2} con 3 gotas de DMF. La mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 16 h bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y luego volvió a disolverse en 50 ml de diclorometano. Se añadieron a la solución 2,2 g (8,12 mmol) de 2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tiofeno y se enfrió a 0ºC. Se añadieron a la mezcla de reacción en 3 porciones 7,6 g (56,8 mmol) de AlCl_{3} y se dejó que transcurriera la reacción durante 1,5 h. Se apagó la reacción vertiendo la mezcla de reacción en hielo. Se separó la capa orgánica y se lavó con Na_{2}CO_{3} y con agua. La capa orgánica se secó por filtración a través de Na_{2}SO_{4} y se evaporó a sequedad. El material en bruto se cromatografió en columna con gel de sílice (HPLC) con un gradiente lineal que comenzaba con CHCl_{3} y terminaba con MeOH-CHCl_{3} (1:9). Por HPLC se determinaron las fracciones deseadas, se combinaron y se evaporaron a sequedad. Esto dió 1,3 g del compuesto del título como una espuma amarilla amorfa.

PMR: Conforme con la estructura propuesta.

Preparación 14 Ácido 4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3-clorobenzoico

Se disolvieron 7,1 g (35,4 mmol) de 3-cloro-4-hidroxietilbenzoato en 250 ml de DMF y se añadieron 13,1 g (71 mmol) de clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina y 52 g (160 mmol) de Cs_{2}CO_{3}. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4 horas. Se dejó que se enfriara la mezcla de reacción y se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en 80 ml de MeOH y se añadieron 40 ml de NaOH 1N. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 h y se enfrió a 0ºC. La mezcla de reacción se acidificó con HCl 5N y se mantuvo a -20ºC durante 16 h. El producto cristalizó y se separó por filtración. Se obtuvieron así 26 g del compuesto del título como un polvo blanco.

PMR: Conforme con la estructura propuesta.

Preparación 15 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-1-piperidinil) etoxi]-2-clorofenil]metanona

Se disolvieron 2,5 g (7,81 mmol) de clorhidrato del ácido 2-cloro-4-[2-(1-piperidinil)etoxi]benzoico en 50 ml de diclorometano y se añadieron 25 ml de SOCl_{2} y 5 gotas de DMF. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 16 horas bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y se trituró 2 veces con CCl_{4}.

Se disolvieron 2 g (7,5 mmol) de 2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tiofeno en 120 ml de diclorometano y se añadió el cloruro de ácido (anterior). La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC y se añadieron en varias porciones, a lo largo de 10 min, 4,2 g (31,24 mmol) de AlCl_{3}. Se dejó que la reacción transcurriera durante varias horas a 0ºC. Se apagó la reacción vertiendo la mezcla de reacción en hielo y se separó la capa orgánica. La capa orgánica se lavó con solución saturada de NaHCO_{3}, agua y se secó con Na_{2}SO_{4}. El producto en bruto se cromatografió en columna de gel de sílice eluyendo con un gradiente lineal que empezaba con CHCl_{3} y finalizaba con CHCl_{3}-MeOH (19:1). Se obtuvieron así 2,91 g del compuesto del título como un aceite amarillo.

PMR: De acuerdo con la estructura propuesta

Preparación 16 Clorhidrato del ácido 2-cloro-4-[2-(1-piperidinil)etoxi] benzoico

Se obtuvieron 6 g del compuesto del título como un polvo cristalino blanco a partir de 5 g (26,8 mmol) de 2-cloro-4-hidroximetilbenzoato, 9,9 g (53,8 mmol) de clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina y 30 g (108 mmol) de Cs_{2}CO_{3} de manera similar a la usada en la Preparación 14.

Preparación 17 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-(2-1-piperidinil)etoxi] -3,5-dimetilfenil]metanona

Se prepararon 2,9 g del compuesto del título a partir de 2 g de 2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tiofeno y ácido 4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3,5-dimetilbenzoico de manera similar a la usada en la Preparación 15.

Preparación 18 Ácido 4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-3,5-dimetilbenzoico

El compuesto del título se preparó a partir de 5 g (25,7 mmol) de 3,5-dimetil-4-hidroxibenzoato de etilo, 18,4 g (100 mmol) de clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina y 49 g (150 mmol) de Cs_{2}CO_{3} de manera similar a la usada en la Preparación 14.

PMR: Conforme con la estructura propuesta.

Preparación 19 [2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tien-3-il][4-[2-(1-piperidinil) etoxi]-3-t-butil-5-metilfenil]metanona

Se prepararon 1,3 g del compuesto del título (como polvo color canela amorfo) a partir de 2 g (5,62 mmol) de ácido 3-metil-4-[2-(1- piperidinil)etoxi-5-t-butilbenzoico, 1,5 g (5,6 mmol) de 2-(4-metoxifenil)-6-metoxibenzo[b]tiofeno y 5,25 g (39,3 mmol) de AlCl_{3} de manera similar a la usada en la Preparación 15.

PMR: De acuerdo con la estructura propuesta.

Preparación 20 Ácido 3-metil-4-[2-(1-piperidinil)etoxi]-5-t-butil]benzoico

Se prepararon 4,25 g del compuesto del título (como un sólido cristalino blanco) a partir de 4 g (16,9 mmol) de 3-metil-4-hidroxi-5-t-butil benzoato de etilo, 9,33 g (50,7 mmol) de clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina y 27,7 g

\hbox{(85 mmol)}

de Cs_{2}CO_{3} de manera similar a la usada en la Preparación 14.

PMR: Conforme con la estructura propuesta.

Los compuestos de esta invención forman sales de adición de ácido y base farmacéuticamente aceptables con una amplia variedad de ácidos y bases orgánicos e inorgánicos e incluyen las sales fisiológicamente aceptables que con frecuencia se usan en química farmacéutica. Tales sales son también parte de la invención. Entre los ácidos inorgánicos típicos usados para formar tales sales están incluidos los ácidos clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, hipofosfórico, etc. También se pueden usar sales derivadas de ácidos orgánicos, tales como sales de ácidos alifáticos monocarboxílicos y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenilsustituidos, ácidos hidroxialcanoicos e hidroxialquilalcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos. Por tanto, el grupo de tales sales farmacéuticamente aceptables incluye acetatos, fenilacetatos, trifluoroacetatos, acrilatos, ascorbatos, benzoatos, clorobenzoatos, dinitrobenzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, metilbenzoatos, o-acetoxibenzoatos, naftaleno-2-benzoatos, bromuros, isobutiratos, fenilbutiratos, \beta-hidroxibutiratos, butino-1,4-dioatos, hexino-1,4-dioatos, capratos, caprilatos, cloruros, cinamatos, citratos, formiatos, fumaratos, glicolatos, heptanoatos, hipuratos, lactatos, malatos, maleatos, hidroximaleatos, malonatos, mandelatos, mesilatos, nicotinatos, isonicotinatos, nitratos, oxalatos, ftalatos, tereftalatos, fosfatos, monohidrogenofosfatos, dihidrogenofosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, propiolatos, propionatos, fenilpropionatos, salicilatos, sebacatos, succinatos, suberatos, sulfatos, bisulfatos, pirosulfatos, sulfitos, bisulfitos, sulfonatos, bencenosulfonatos, p-bromofenilsulfonatos, clorobencenosulfonatos, etanosulfonatos, 2-hidroxietanosulfonatos, metanosulfonatos, naftaleno-1-sulfonatos, naftaleno-2-sulfonatos, p-toluenosulfonatos, xilenosulfonatos, tartratos y otros similares. Una sal preferida es la sal clorhidrato.

Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se forman típicamente haciendo reaccionar un compuesto de fórmula I con una cantidad equimolar o en exceso de ácido. Por lo general, los reactivos se combinan en un disolvente mútuo tal como dietil éter o benceno. Normalmente, la sal precipita de la solución en un tiempo de aproximadamente 1 hora a 10 días y se puede aislar por filtración, o el disolvente se puede eliminar por procedimientos convencionales.

Entre las bases comúnmente usadas para la formación de sales están incluidos hidróxido amónico e hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de metales alcalinos y alcalinotéreos, así como aminas alifáticas y aromáticas, diaminas alifáticas e hidroxialquilaminas. El grupo de bases especialmente útiles en la preparación de sales adicionales incluye hidróxido amónico, carbonato potásico, bicarbonato sódico, hidróxido cálcico, metilamina, dietilamina, etilendiamina, ciclohexilamina y etanolamina.

Por lo general, las sales farmacéuticamente aceptables tienen unas características intensificadas de solubilidad en comparación con el compuesto del que derivan y, por ello, con frecuencia son más susceptibles de formulación como líquidos o emulsiones.

Las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los compuestos pueden formularse con excipientes, diluyentes o vehículos comunes y formar comprimidos, cápsulas, suspensiones, polvos, etc. Entre los ejemplos de excipientes, diluyentes o vehículos que son adecuados para tales formulaciones están incluidos los siguientes: cargas y extensores tales como almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos; agentes aglutinantes tales como carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; agentes humectantes tales como glicerol; agentes desintegrantes tales como agar agar, carbonato cálcico y bicarbonato sódico; agentes para retardar la disolución tales como parafina; aceleradores de resorción tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes de superficie tales como alcohol cetílico, monoestearato de glicerol; vehículos adsorbentes tales como caolín y bentonita; y lubricantes tales como talco, estearato cálcico y magnésico, y polietilglicoles sólidos.

Los compuestos se pueden formular también como elixires o soluciones para una conveniente administración oral, o como soluciones apropiadas para administración parenteral, por ejemplo por vía intramuscular, subcutánea o intravenosa. Además, los compuestos son adecuados para formulación como formas de dosificación de liberación sostenida y similares. Las formulaciones pueden constituirse de manera que liberen el ingrediente activo sólo o preferiblemente en una parte particular del tracto intestinal, posiblemente a lo largo de un período de tiempo. Los revestimientos, envolturas y matrices protectoras pueden hacerse, por ejemplo, de sustancias polímeras o ceras. La invención comprende también un procedimiento para aliviar el síndrome postmenopáusico en mujeres, que comprende el procedimiento antes mencionado usando compuestos de fórmula I y comprende además administrar a una mujer una cantidad efectiva de estrógenos o progestinas. Estos tratamientos son particularmente útiles para tratar la osteoporosis y rebajar el colesterol sérico porque el paciente recibirá los beneficios de cada agente farmacéutico mientras que los compuestos de la presente invención inhibirían los indeseables efectos secundarios de los estrógenos y las progestinas. La actividad de estos tratamientos de combinación en cualquiera de los ensayos postmenopáusicos (más adelante) indica que los tratamientos de combinación son útiles para aliviar los síntomas postmenopáusicos en mujeres.

Hay disponibles comercialmente varias formas de estrógenos y progestinas. Entre los agentes basados en estrógenos están incluidos, por ejemplo, etinilestrógeno (0,01-0,03 mg/día), mestranol (0,05-0,15 mg/día) y hormonas estrogénicas conjugadas tales como Premarin® (Wyeth-Ayerst, 0,3-2,5 mg/díAa. Entre los agentes basados en progestinas están incluidos, por ejemplo, medroxiprogesterona, tal como Provera® (Upjohn, 2,5-10 mg/día), noretilnodrel (1,0-10,0 mg/día) y nonetindrona (0,5-2,0 mg/día). Un compuesto preferido basado en estrógeno es Premarin, y noretilnodrel y noretindrona son agentes preferidos basados en progestinas.

El procedimiento de administración de cada agente basado en estrógenos o progestinas corresponde a los que se conocen en la técnica. Para la mayoría de los procedimientos de la presente invención, los compuestos de fórmula I se administran continuamente, de 1 a 3 veces al día. Sin embargo, la terapia cíclica puede ser especialmente útil en el tratamiento de la endometriosis o puede usarse agudamente durante los ataques dolorosos de la enfermedad. En el caso de restenosis, la terapia puede limitarse a intervalos cortos (1-6 meses) a continuación de procedimientos médicos tales como angioplastia.

Tal como se usa aquí, el término ``cantidad efectiva'' significa una cantidad del compuesto de la presente invención que es capaz de aliviar los síntomas de las varias dolencias patológicas aquí descritas. La dosis específica de un compuesto administrado de acuerdo con esta invención será determinada, obviamente, por las circunstancias particulares que rodean el caso, incluidos, por ejemplo, el compuesto administrado, la vía de administración, el estado del paciente y la dolencia que se está tratando. Una dosis diaria típica contendrá un nivel no tóxico de dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 600 mg/día de un compuesto de la presente invención. Las dosis diarias preferidas generalmente serán de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 80 mg al día.

Seguidamente se presentan formulaciones para los compuestos de fórmula I. Estas formulaciones se dan a fines ilustrativos y de ninguna forma son limitativas del ámbito de esta invención. El término ``ingrediente activo'' significa un compuesto de fórmula I.

Formulación 1

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad   Cantidad
(mg/cápsula) \cr  Ingrediente activo \qquad \+ \qquad
0,5  -  3,0 mg\cr   \beta   -  ciclodextrina
\qquad \+ \qquad 0,1 mg\cr  DMSO \qquad \+ \qquad 1,5 ml\cr  Óxido
bárico \qquad \+ \qquad 0,1 mg\cr  Agua
estéril\+\cr}

Se disuelven un compuesto de fórmula I (0,5-3,0 mg) y 0,1 mg de \beta-ciclodextrina en 1,5 ml de DMSO y se añaden 0,1 mg de óxido bárico. Se calienta la mezcla para inducir la disolución (50ºC) y se deja enfriar a la temperatura ambiente. Se añade agua estéril para tener un volumen de 2 ml.

Formulación 2

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad (mg/cápsula) \cr
 Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 0,5  -  3,0 mg\cr 
Glicerol \qquad \+ \qquad 1 ml\cr  DMSO \qquad \+ \qquad 1 ml\cr 
Triton X \qquad \+ \qquad 0,1 mg\cr  Óxido bárico \qquad \+ \qquad
0,1
mg\cr}

Se disuelve un compuesto de fórmula I (0,5-3,0 mg) en 1 ml de DMSO. Se añaden Triton X (0,1 mg) y óxido bárico (0,1 mg) junto con 1 ml de glicerol. Se mezcla íntimamente.

Formulación 3 Cápsulas de gelatina dura

Se preparan cápsulas de gelatina dura usando los ingredientes siguientes

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad (mg/cápsula) \cr
 Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 0,1  -  1000\cr 
Almidón, NF \qquad \+ \qquad 0  -  650\cr  Polvo de
almidón que puede fluir \qquad \+ \qquad 0  -  650\cr 
Fluido de silicon de 350 centistok \qquad \+ \qquad
0  -  15\cr}

La formulación anterior se puede cambiar teniendo en cuenta las variaciones razonables proporcionadas.

Se prepara una formulación de comprimidos usando los ingredientes siguientes:

Formulación 4 Comprimidos

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad
(mg/comprimido) \cr  Ingrediente activo \qquad \+ \qquad
2,5  -  1000\cr  Celulosa microcristalina \qquad \+
\qquad 200  -  650\cr  Dióxido de silicio de pirólisis
\qquad \+ \qquad 10  -  650\cr  Ácido esteárico \qquad
\+ \qquad
5  -  15\cr}

Se mezclan los ingredientes y se comprimen para formar comprimidos.

Alternativamente, se pueden hacer como sigue comprimidos, cada uno con 2,5-1000 mg de compuesto activo.

Formulación 5 Comprimidos

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad
(mg/comprimido) \cr  Ingrediente activo \qquad \+ \qquad
25  -  1000\cr  Almidón \qquad \+ \qquad 45\cr  Celulosa
microcristalina \qquad \+ \qquad 35\cr  Polivinilpirrolidona \qquad
\+ \qquad 4\cr  (como solución acuosa al 10%)\+\cr 
Carboximetilcelulosa sódica \qquad \+ \qquad 4,5\cr  Estearato
magnésico \qquad \+ \qquad 0,5\cr  Talco \qquad \+ \qquad
1\cr}

Se hacen pasar el ingrediente activo, el almidón y la celulosa por un tamiz de 0,3 mm (malla U.S. nº. 45) y se mezclan íntimamente. Se mezcla la solución de polivinilpirrolidona con los polvos restantes que se hacen pasar luego a través de un tamiz de 1,5 mm (malla U.S. nº. 14). Los gránulos así producidos se secan a 50-60ºC y se hacen pasar a través de un tamiz de 1,0 mm (malla U.S. nº. 18). Se hacen pasar el carboximetilalmidón, el estearato magnésico y el talco por un tamiz de 0,2 mm (malla U.S. nº. 60) y luego se añaden a los gránulos que, después de mezclar, se comprimen en una máquina para obtener comprimidos.

Se preparan como sigue suspensiones que contienen 0,1-1000 mg de medicamento por dosis de 5 ml:

Formulación 6 Suspensiones

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad (mg/5 ml) \cr 
Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 0,1  -  1000 mg\cr 
Carboximetilcelulosa sódica \qquad \+ \qquad 50 mg\cr  Jarabe \qquad
\+ \qquad 1,25 mg\cr  Solución de ácido benzoico \qquad \+ \qquad
0,10 ml\cr  Agente sabor \qquad \+ \qquad s.a.\cr  Colorante \qquad
\+ \qquad s.a.\cr  Agua purificada hasta \qquad \+ \qquad 5
ml\cr}

El medicamento se hace pasar a través de un tamiz de 0,3 mm (malla U.S. nº. 45) y se mezcla con la carboximetilcelulosa sódica y el jarabe para formar una pasta uniforme. Se diluyen con algo de agua la solución de ácido benzoico, el agente saboreador y el colorante y se añaden mientras que se agita. Se añade luego agua suficiente para obtener el volumen requerido.

Se prepara una solución aerosol que contiene los ingredientes siguientes:

Formulación 7 Aerosol

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad (% en peso) \cr 
Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 0,25\cr  Etanol \qquad \+ \qquad
25,75\cr  Propulsor 22 (clorodifluorometano) \qquad \+ \qquad
70,00\cr}

El ingrediente activo se mezcla con etanol y la mezcla se añade a una porción del propulsor 22, se enfría a 30ºC y se pasa a un dispositivo de llenado. Se pasa luego la cantidad requerida a un recipiente de acero inoxidable y se diluye con el resto de propulsor. Se ajustan luego las unidades de válvula al recipiente.

Se preparan supositorios como sigue:

Formulación 8 Supositorios

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad
(mg/supositorio) \cr  Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 250\cr 
Glicéridos de ácidos grasos\+\cr   saturados \qquad \+ \qquad
2.000\cr}

Se hace pasar el ingrediente activo a través de un tamiz de 0,2 mm (malla U.S. nº. 60) y se pone en suspensión en los glicéridos de ácidos grasos saturados previamente fundidos usando el mínimo calor necesario. La mezcla se vierte luego en un molde de supositorios de 2 g de capacidad y se deja enfriar.

Se prepara como sigue una formulación intravenosa:

Formulación 9 Solución intravenosa

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad \cr  Ingrediente
activo \qquad \+ \qquad  50 mg\cr  Solución salina isotónica \qquad
\+ \qquad 1.000
ml\cr}

La solución de los ingredientes anteriores se administra al paciente por vía intravenosa a un caudal de aproximadamente 1 ml/min

Formulación 10 Comprimido de combinación I

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad (mg/cápsula \cr 
Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 50\cr  Premarin \qquad \+ \qquad
1\cr  Avicel pH 101 \qquad \+ \qquad 50\cr  Almidón 1500 \qquad \+
\qquad 117,50\cr  Aceite de silicona \qquad \+ \qquad 2\cr  Tween 80
\qquad \+ \qquad 0,50\cr  Cab  -  O  -  Sil
\qquad \+ \qquad
0,25\cr}

\newpage

Formulación 11 Cápsula de combinación II

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad (mg/cápsula \cr 
Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 50\cr  Noretilnodrel \qquad \+
\qquad 5\cr  Avicel pH 101 \qquad \+ \qquad 82,50\cr  Almidón 1500
\qquad \+ \qquad 90\cr  Aceite de silicona \qquad \+ \qquad 2\cr 
Tween 80 \qquad \+ \qquad
0,50\cr}

Formulación 12 Comprimido de combinación

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Ingrediente  \qquad \+ \qquad  Cantidad (mg/cápsula \cr 
Ingrediente activo \qquad \+ \qquad 50\cr  Premarin \qquad \+ \qquad
1\cr  Almidón de maíz NF \qquad \+ \qquad 50\cr  Povidone
K29  -  32 \qquad \+ \qquad 6\cr  Avicel pH 101 \qquad
\+ \qquad 41,50\cr  Avicel pH 102 \qquad \+ \qquad 136,50\cr 
Crospovidone XL10 \qquad \+ \qquad 2,50\cr  Estearato magnésico
\qquad \+ \qquad 0,50\cr  Cab  -  O  -  Sil
\qquad \+ \qquad
0,50\cr}

Más en general, la totalidad de los ingredientes activos en tales formulaciones comprende de 0,1% a 99,9% en peso de la composición. Por ``farmacéuticamente aceptable'' se entiende que el vehículo, el diluyente, los excipientes y la sal deben ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para quien los recibe.

En los ejemplos que ilustran los procedimientos se usa un modelo postmenopáusico en el que se determinan los efectos de diferentes tratamientos sobre los lípidos circulantes.

Se obtuvieron de Charles River Laboratories (Portage, MI) ratas Sprague Dawley hembra de 75 días de edad. Los animales se ovarioectomizan (OVX) bilateralmente o se exponen a un procedimiento quirúrgico en Charles River Laboratories y luego se envían después de una semana. Al llegar, se encerraron en jaulas colgantes en grupos de 3 o 4 por jaula y tenían acceso ad libitum a alimento (contenido de calcio de aproximadamente 0,5%) y agua durante 1 semana. La temperatura ambiente se mantuvo a 22,2º \pm 1,7ºC con una humedad relativa de 40%. El fotoperíodo en la habitación es de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

Recogida de tejido en régimen de dosificación

Después de una semana de aclimatación (por tanto, dos semanas después de la OVX) se inicia la dosificación diariamente con el compuesto a ensayar. Se administran oralmente, a no ser que se indique lo contrario, 17\alpha-etinilestradiol o el compuesto a ensayar como suspensión en carboximetilcelulosa al 1% o disueltos en ciclodextrina al 20%. Los animales se dosifican diariamente durante 4 días. Después del régimen de dosificación, se pesan los animales y se anestesian con una mezcla de cetamina/xilazina (2:1 v/v) y se toma una muestra de sangre por punción cardíaca. Los animales se sacrifican luego por asfixia con CO_{2}, se extrae el útero mediante incisión en la línea media y se determina el peso de útero húmedo.

Análisis de colesterol

Se deja que coagulen las muestras de sangre a temperatura ambiente durante 2 horas y se obtiene suero centrifugando durante 20 min a 3000 rpm. El colesterol sérico se determina usando un ensayo de alta prestación de colesterol de Boehringer Mannheim Diagnostics. En resumen, el colesterol se oxida a colest-4-en-3-ona y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno se hace reaccionar luego con fenol y 4-aminofenazona en presencia de peroxidasa para producir un colorante p-quinonaimina, que se lee espectrofotométricamente a 500 nm. La concentración de colesterol se calcula luego frente a una curva patrón. El ensayo se automatiza en su totalidad usando un dispositivo automatizado Biomek.

Los datos presentados en la Tabla 1 presentan resultados comparativos entre ratas ovarioectomizadas, ratas tratadas con 17\alpha-etinilestradiol (EE_{2}) y ratas tratadas con ciertos compuestos de esta invención. Aunque el EE_{2} causó una disminución del colesterol sérico cuando se administró a 0,1 mg/kg/día, también ejerció un efecto estimulante sobre el útero de manera que el peso uterino de los animales tratados con EE_{2} era sustancialmente mayor que el peso uterino de los animales ovarioectomizados. Esta respuesta uterina a un estrógeno es bien conocida en la técnica.

Los compuestos de la presente invención no sólo redujeron el colesterol sérico en comparación con los animales ovarioectomizados, sino que el peso uterino sólo aumentó mínimamente. En comparación con compuestos estrogénicos conocidos en la técnica, el beneficio de la reducción de colesterol sérico sin afectar perjudicialmente al peso uterino es inusual y deseable.

Como lo expresan los datos que se presentan seguidamente, la capacidad estrogénica se estimó también evaluando la respuesta de la infiltración de eosinófilos en el útero. Los compuestos de esta invención no causaron un gran aumento de eosinófilos observado en la capa estromal de los úteros de ratas ovarioectomizadas. El EE_{2} causó un aumento sustancial y esperado de la infiltración de eosinófilos.

Los datos presentados en la Tabla 1 reflejan la respuesta de 5 ó 6 ratas por grupo de tratamiento.

TABLA 1

\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline
 Compuesto nº.  \+ Dosis, mg/kg  \+ Peso uterino  \+ Eosinófilos  \+
Colesterol \\   \+  \+ % de aumento ^{b}   \+ uterinos, V _{max} 
 ^{c}   \+ sérico, % de \\   \+  \+  \+  \+ disminución  ^{d} 
\\\hline  EE _{2}   \+ 0,1  \+ 207,5*  \+ 205,8*  \+ 87,3* \\  1  \+
0,1  \+ 18,4  \+ 5,4  \+ 45,1* \\   \+ 1,0  \+ 14,9  \+ 4,5  \+
59,5* \\   \+ 10,0  \+ 12,5  \+ 2,7  \+ 64,1* \\  5  \+ 0,1  \+
-24,4  \+ 4,0  \+ 33,8* \\   \+ 1,0  \+ -16,4  \+ 7,2  \+ 55,5* \\  
\+ 10,0  \+ 27,4  \+ 25,9*  \+ 74,9* \\  6  \+ 1,0  \+ -35,7  \+ 2,8
 \+ 55,2* \\  7  \+ 10,0  \+ 46,1*  \+ 30,9  \+ 62,2* \\  8  \+ 10,0
 \+ 37,5*  \+ 12,0  \+ 42,0* \\  9  \+ 10,0  \+ 16,8  \+ 7,8  \+
38,8
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

b. Aumento porcentual del peso uterino frente a los controles ovarioectomizados

c. V_{máx}. de perosidasa de eosinófilos

d. Disminución del colesterol sérico frente a controles ovarioectomizados

* p < 0,5.

Una demostración adicional del procedimiento para tratar la hieperlipidemia debida a la privación de estrógenos sería la siguiente:

Se seleccionarían cien pacientes, que son mujeres postmenoáusicas sanas, de edades de 45-60 años y que normalmente se considerarían candidatas para la terapia sustitutiva de estrógenos. El grupo incluye mujeres con el útero intacto que han tenido el último período menstrual hace más de seis meses pero menos de seis años. Las pacientes excluidas del ensayo serían las que han tomado estrógenos, progestinas o corticoesteroides.

Cincuenta mujeres (grupo de ensayo) recibirían de 60 a 100 mg por día de un compuesto de fórmula I, por ejemplo, la Formulación 1 dada antes. Las otras cincuenta mujeres (grupo de control) recibirían diariamente un placebo.

El estudio es un diseño doblemente ciego. Ni los investigadores ni los pacientes conocerían a qué grupo está asignado cada paciente.

El examen de la línea base de cada paciente incluye la determinación de los niveles de colesterol y triglicéridos en suero. Al final del período de estudio (seis meses) se habría tomado a cada paciente el nivel de lípidos en suero. El análisis de los datos confirmaría una bajada de los lípidos en suero, esto es, de colesterol y/o triglicéridos, en el grupo de ensayo respecto al de control.

Ensayo de peroxidasa uterina de eosinófilos (EPO)

Se mantienen los úteros a 4ºC hasta el momento del análisis enzimático. Los úteros se homogeneizan luego en 50 volúmenes de tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contiene 0,005% de Triton X-100. Después de añadir 0,01% de peróxido de hidrógeno y O-fenilendiamina 10 mM (concentración final) en tampón Tris, se controla el aumento de la absorbancia durante 1 minuto a 450 nm. La presencia de eosinófilos en el útero es una indicación de la actividad estrogénica de un compuesto. Se determina la velocidad máxima de un intervalo de 15 segundos sobre la porción inicial, lineal de la curva de reacción.

Origen del compuesto

El 17\alpha-etinilestradiol se obtiene de Sigma Chemical Co., St Louis, MO.

Procedimiento para el ensayo de la osteoporosis

Siguiendo el procedimiento general de preparación (véase más adelante), las ratas se tratan diariamente durante 35 días (6 ratas por cada grupo de tratamiento) y se sacrifican por asfixia con dióxido de carbono el día 36º. El período de tiempo de 35 días es suficiente para lograr una reducción máxima de la densidad ósea, medida como se describe aquí. En el momento del sacrificio, se extraen los úteros, se liberan de tejido extraño y se expelen los fluidos contenidos antes de determinar el peso en húmedo con el fin de confirmar la deficiencia de estrógenos asociada con la ovarioectomía completa. El peso del útero se reduce rutinariamente en aproximadamente 75% en respuesta a la ovarioectomía. Los úteros son ponen luego en formalina neutra al 10% tamponada para poder hacer seguidamente el análisis histológico.

Se cortan los fémures de la parte derecha y se generan rayos X digitalizados y se analizan mediante un programa de análisis de imagen (imagen NIH) en la metáfisis distal. También se analizan por barrido mediante tomografía cuantitativa computorizada el aspecto proximal de las tibias de estos animales.

De acuerdo con los procedimientos anteriores, los compuestos de la presente invención y el etinilestradiol (EE_{2}) en 20% de hidroxipropil \beta-ciclodextrina se administran oralmente a los animales de ensayo.

Ensayo de proliferación de MCF-7

Células MCF-7 de adenocarcinoma de mama (ATCC HTB 22) se mantienen en MEM (medio esencial mínimo exento de rojo de fenol, Sigma, St. Louis, MO) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (v/v), L-glutamina (2 mM), piruvato sódico (1 mN), HEPES {N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-ácido etanosulfónico] 10 nM}, aminoácidos no esenciales e insulina bovina (1 ug/ml) (medio de mantenimiento). Diez días antes del ensayo, se cambian las células al medio de mantenimiento suplementado con 10% de suero fetal bovino apurado con carbón vegetal revestido con dextrano (DCC-FBS) (medio de ensayo) en vez de FBS al 10% para vaciar las reservas internas de esteroides. Se extraen las células MCF-7 de los matraces de mantenimiento usando un medio de disociación de células (Ca^{++}/Mg^{++} HBSS libre (exento de rojo de fenol) suplementado con HEPES 10 mM y EDTA 2 mM). Las células se lavan 2 veces con medio de ensayo y se ajustan a 80.000 células/ml. A los pocillos de microcultivo de fondo plano (Costar 3596) se añaden aproximadamente 100 \mul (8.000 células) y se incuban a 37ºC durante 48 horas en una incubadora con 5% de CO_{2} humidificada para que las células se adhieran y equilibren después de la transferencia. Se preparan diluciones seriales de fármacos o DMSO como control diluyente en medio de ensayo y se transfieren 50 \mul a microcultivos triplicados y seguidamente 50 \mul de medio de ensayo para un volumen final de 200 \mul. Después de 48 h más a 37ºC en una incubadora con 5% de CO_{2}, humidificada, se pulsan los microcultivos con timidina tritiada (1 uCi/pocillo) durante 4 h. Se terminan los cultivos por congelación a -70ºC durante 24 h a lo que sigue la descongelación y cosecha de los microcultivos usando una cosechadora Skatron Semiautomatic Cell Harvester. Las muestras se recuentan por centelleo de líquidos usando un contador de \beta Wallac BetaPlace.

Por ejemplo, el compuesto de la Preparación 5, un compuesto preferido, inhibe la proliferación de estas células con una IC_{50} de 40 nM. Se determina una concentración inhibidora del 50% de las drogas de ensayo (IC_{50}) frente al control (DMSO).

Inhibición de tumores de mama inducidos por DMBA

Se producen tumores mamarios dependientes de estrógenos en ratas Sprague-Dawley hembra que se compran de Harlan Industries, Indianopolis, Indiana. A la edad de aproximadamente 55 días, las ratas reciben un único suministro oral de 20 mg de 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA). Aproximadamente 6 semanas después de la administración del DMBA, se palpan las glándulas mamarias a intervalos de una semana en búsqueda de la aparición de tumores. Cuando aparecen uno o varios tumores, se miden con un calibre métrico los diámetros más largo y más corto de cada tumor, se registran las medidas y se selecciona ese animal para la experimentación. Se intenta distribuir uniformemente los varios tamaños de tumores en los grupos de tratamiento y de control de manera que los tumores de un tamaño promediado estén distribuidos equivalentemente entre los grupos de ensayo. Los grupos de control y los grupos de ensayo para cada experimento contienen de 5 a 9 animales.

Se administran compuestos de fórmula I por vía intraperitoneal en goma arábiga al 2% o por vía oral. Los compuestos administrados por vía oral se disuelven o se ponen en suspensión en 0,2 ml de aceite de maíz. Cada tratamiento, incluidos los tratamientos de control con goma arábiga y aceite de maíz, se administra una vez al día a cada animal de ensayo. Después de la medida inicial de los tumores y la selección de los animales de ensayo, los tumores se miden cada semana por el procedimiento mencionado. El tratamiento y las medidas de los animales continúan durante 3 a 5 semanas y al cabo de este tiempo se determinan las superficies finales de los tumores. Para cada compuesto y tratamiento de control, se determina el cambio de la superficie media del tumor.

Procedimientos de ensayo de la fibrosis uterina Ensayo 1

Se administra un compuesto de la presente invención a entre 3 y 20 mujeres que tienen fibrosis uterina. La cantidad administrada del compuesto es de 0,1 a 1000 mg/día y el período de administración es de 3 meses.

Se observan los efectos sobre la fibrosis uterina en las mujeres durante el período de administración y hasta 3 meses después de interrumpir la administración.

Ensayo 2

Se usa el mismo procedimiento del Ensayo 1, excepto que el período de administración es de 6 meses.

Ensayo 3

Se usa el mismo procedimiento del Ensayo 1, excepto que el período de administración es de 1 año.

Ensayo 4 A. Inducción de tumores fibroides en cobaya

Se usa una estimulación prolongada por estrógenos para inducir leiomiomata en cobayas hembra maduras. A los animales se administra estradiol de 3 a 5 veces a la semana por inyección durante 2-4 meses o hasta que aparecen tumores. Los tratamientos consisten en la administración de un compuesto de la invención o vehículo durante 3-16 semanas y luego se sacrifican los animales, se recogen los úteros y se analizan en cuanto a la regresión de los tumores.

B. Implantación de tejido fibroide uterino en ratones nude

Se implanta tejido de leiomiomas humano en la cavidad peritoneal y/o el miometrio uterino de ratones nude hembra maduros, castrados. Se suministra estrógeno exógeno para inducir el crecimiento del tejido explantado. En algunos casos se cultivan in vitro, antes del implante, células tumorales cosechadas. Los tratamientos consisten en el suministro de un compuesto de la invención o un vehículo por lavado gástrico sobre base diaria durante 3-16 semanas y los implantes se extraen y miden en cuanto a su crecimiento o regresión. En el momento del sacrificio, se recoge el útero para estimar el estado del órgano.

Ensayo 5

A. Se cosecha tejido fibroide uterino humano y se mantiene in vitro como cultivo primario no transformado. Se hacen pasar a través de un tamiz o malla estéril muestras quirúrgicas o, alternativamente, se cardan del tejido que las rodea para producir un suspensión de células. Las células se mantienen en un medio que contiene 10% de suero y antibiótico. Se determina la velocidad de crecimiento en presencia y ausencia de estrógeno. Se ensayan las células en cuanto a su capacidad para producir el componente de complemento C3 y su respuesta a factores de crecimiento y hormona de crecimiento. La estimación de los cultivos in vitro se realiza por su respuesta proliferativa al tratamiento con progestinas, GnRH, un compuesto de la presente invención y un vehículo. Los niveles de receptores de hormonas esteroides se evalúan semanalmente para determinar si se mantienen in vitro características celulares importantes. Se utilizan tejidos de 5-25 pacientes.

La actividad en al menos uno de los ensayos anteriores indica que los compuestos de la presente invención tienen potencial para el tratamiento de la fibrosis uterina.

Procedimiento de ensayo de la endometriosis

En los Ensayos 1 y 2 se pueden examinar los efectos el día 14º y el 21º de administración de los compuestos de la presente invención sobre el crecimiento del tejido endometrial explantado.

Ensayo 1

Se usan como animales de ensayo de 12 a 30 ratas hembra adultas de la cepa CD. Se dividen en 3 grupos de igual número de individuos. Se controla el ciclo del estro de todos los animales. El día previo al estro se realiza cirugía en cada hembra. Se extrae la trompa izquierda del útero de cada hembra, se corta en pequeños cuadrados y los cuadrados se suturan flojamente en varios sitios adyacentes al flujo sanguíneo mesentérico. Además, a las hembras del grupo 2 se extrae el ovario.

Al día siguiente de la cirugía, los animales de los Grupos 1 y 2 reciben inyecciones peritoneales de agua durante 14 días, mientras que los animales del Grupo 3 reciben inyecciones intraperitoneales de 1,0 mg de un compuesto de la presente invención por kg de peso corporal durante el mismo tiempo. A continuación de los 14 días de tratamiento, se sacrifica cada hembra y se extraen los explantes endometriales, adrenales, útero remanente y ovarios, cuando es aplicable, y se preparan para examen histológico. Se pesan los ovarios y los adrenales.

Ensayo 2

Se usan como animales de ensayo de 12 a 30 ratas hembra adultas de cepa CD. Se dividen en dos grupos iguales. Se controla el ciclo del estro de todos los animales. El día previo al estro se realiza cirugía en cada hembra. Se extrae la trompa izquierda del útero de cada hembra, se corta en pequeños cuadrados y los cuadrados se suturan flojamente en varios sitios adyacentes al flujo sanguíneo mesentérico.

Aproximadamente 50 días después de la cirugía, los animales del Grupo 1 y 2 reciben inyecciones peritoneales de agua durante 21 días, mientras que los animales del Grupo 2 reciben inyecciones intraperitoneales de 1,0 mg de un compuesto de la presente invención por kg de peso corporal durante el mismo tiempo. A continuación de los 21 días de tratamiento, se sacrifica cada hembra y se extraen los explantes endometriales y los adrenales. Se miden los explantes como indicación del crecimiento. Se controlan los ciclos del estro.

Ensayo 3 A. Inducción quirúrgica de la endometriosis

Se usan autógrafos de tejidos endometriales para inducir endometriosis en ratas y/o conejos. Se someten a ooforectomía bilateral animales hembra reproductivamente maduras y se suministra exógenamente estrógeno proporcionando así un nivel específico y constante de hormona. Se implanta tejido endometrial autólogo en el peritoneo de 5-150 animales y se suministra estrógeno para inducir el crecimiento del tejido explantado. El tratamiento consiste en el suministro diario de un compuesto de la presente invención por lavado gástrico durante 3-16 semanas, se extraen los implantes y se mide su crecimiento o regresión. Al sacrificar el animal se recoge la trompa intacta del útero para estimar el estado del endometrio.

B. Implante de tejido endometrial humano en ratones nude

Se implanta tejido de lesiones endometriales en el peritoneo de ratones nude hembra maduros, castrados. Se suministra estrógeno exógeno para inducir el crecimiento del tejido explantado. En algunos casos se cultivan in vitro, antes del implante, células endometriales cosechadas. El tratamiento consiste en la administración de un compuesto de la invención por lavado gástrico sobre base diaria durante 3-16 semanas, los implantes se extraen y se evalúa su crecimiento o regresión. En el momento del sacrificio, se recoge el útero para estimar el estado del endometrio intacto.

Ensayo 4

A. Se cosecha tejido de lesiones endometriales humanas y se mantiene in vitro como cultivo primario no transformado. Se hacen pasar a través de un tamiz o malla estéril muestras quirúrgicas o, alternativamente, se cardan del tejido que las rodea para producir un suspensión de células. Las células se mantienen en un medio que contiene 10% de suero y antibiótico. Se determina la velocidad de crecimiento en presencia y ausencia de estrógeno. Se ensayan las células en cuanto a su capacidad para producir el componente de complemento C3 y su respuesta a factores de crecimiento y hormona de crecimiento. La estimación de los cultivos in vitro se realiza por su respuesta proliferativa al tratamiento con progestinas, GnRH, un compuesto de la presente invención y un vehículo. Los niveles de receptores de hormonas esteroides se evalúan semanalmente para determinar si se mantienen in vitro características celulares importantes. Se utilizan tejidos de 5-25 pacientes.

La actividad en al menos uno de los ensayos anteriores indica que los compuestos de la presente invención tienen potencial para el tratamiento de la fibrosis uterina.

Procedimiento de ensayo de la inhibición de la proliferación de células lisas de aorta/restenosis

Los compuestos de la presente invención tienen capacidad de inhibir la proliferación de células lisas aórticas. Esto puede demostrarse usando células lisas cultivadas de aorta de conejo, determinándose la proliferación por medida de la síntesis de DNA. Las células se obtienen por el procedimiento de explante descrito por Ross, J. of Cell. Bio. 50:172 (1971). Las células se cultivan en placas de microtitulación de 96 pocillos durante 5 días. Los cultivos se hacen confluentes y se detiene el crecimiento. Las células se pasan luego a Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 0,5-2% de plaquetas en plasma, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 1 mC/ml de ^{3}H-timidina, 20 ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas y concentraciones variables de los presentes compuestos. La solución madre de los compuestos se prepara en dimetilsulfóxido y luego se diluye a la concentración apropiada (0,01-30 mM) en el medio de ensayo anterior. Las células se incuban luego a 37ºC durante 24 h en 5% de CO_{2}/95% de aire. Al cabo de 24 h, las células se fijan en metanol. La incorporación de ^{3}H-timidina se determina luego por recuento de centelleo como lo describen Bonin y otros en Exp. Cell. Res. 181:457-482 (1989).

La inhibición de la proliferación de células de músculo liso de aorta se demuestra además determinando sus efectos sobre células con crecimiento exponencial. Se siembran células de músculo liso de aortas de conejo en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos en DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Después de 24 h, se fijan las células y se reemplaza el medio con DMEM que contiene 10% de suero, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y las concentraciones que se deseen de los compuestos. Se deja que las células crezcan durante 4 días. Las células se tratan con tripsina y se determina el número de células en cada cultivo mediante recuento usando un contador ZM-Coulter.

La actividad en los ensayos anteriores indica que los compuestos de la presente invención tienen potencial para el tratamiento de la restenosis.

Claims (15)

1. Un compuesto de fórmula I:

8

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables,

en la que

R^{1} se selecciona entre el grupo constituido por

hidrógeno, -OH,

-O(alquilo C_{1-4}),

-OC(O)(alquilo C_{1-6}),

-OSO_{2}(alquilo C_{4-6}), en el que ``alquilo C_{4-6}'' es n-butilo, n-pentilo o n-hexilo, y

-OC(O)Ar, en el que Ar es fenilo no sustituido o es fenilo sustituido con uno o más sustituyentes del grupo constituido por

alquilo C_{1-4},

alcoxi C_{1-3},

hidroxi,

nitro,

triclorometilo y

trifluorometilo;

R^{2} se selecciona entre el grupo constituido por

hidrógeno,

cloro,

bromo,

hidroxi,

-O(alquilo C_{1-4}),

-OC(O)(alquilo C_{1-6}),.

-OSO_{2}(alquilo C_{4-6}), en el que ``alquilo C_{4-6}'' es n-butilo, n-pentilo o n-hexilo, y

-OC(O)Ar, en el que Ar es fenilo no sustituido o es fenilo sustituido con uno o más sustituyentes del grupo constituido por

alquilo C_{1-4},

alcoxi C_{1-3},

hidroxi,

nitro,

triclorometilo y

trifluorometilo;

R^{3} y R^{4} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por

hidrógeno,

flúor,

cloro,

ciano,

alquilo C_{1-4} y

-O(alquilo C_{1-3});

R^{5} y R^{6} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por

hidrógeno,

flúor,

cloro,

alquilo C_{1-4} y

-O(alquilo C_{1-3});

R^{7} y R^{8} se seleccionan independientemente entre alquilo C_{1-4} o se combinan para formar, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, 1-piperidinilo, 1-pirrolidinilo, 1- hexametilenimino o morfolino; y

Y se selecciona entre el grupo constituido por

-C(O)-,

-CH(OH)- y

-CH_{2}-;

con la condición de que R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} pueden no ser todos hidrógeno.

2. Un compuesto según se ha definido en la reivindicación 1, en el que Y es -C(O)-.

3. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que Y es -CH(OH)-.

4. Un compuesto según se ha definido en la reivindicación 1, en el que Y es -CH_{2}-.

5. Un compuesto según la reivindicación 2, seleccionado entre en el grupo constituido por

[2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-(2-(1-piperidinil)etoxi) -3,5-dimetilfenil]metanona y

[2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-(2-(1- piperidinil)etoxi)-3-fluorofenil]metanona,

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

6. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un compuesto según la reivindicación 1 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables en combinación con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6, que además comprende una cantidad efectiva de estrógeno.

8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6, que además comprende una cantidad efectiva de progestina.

9. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para uso en el alivio de los síntomas de osteoporosis en una mujer postmenopáusica que necesita tal tratamiento.

10. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para uso en el tratamiento de la hiperlipidemia en una mujer postmenopáusica que necesita tal tratamiento.

11. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para uso en el tratamiento de la enfermedad de fibroide uterino en una mujer postmenopáusica que necesita tal tratamiento.

12. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para uso para inhibir la endometriosis en una mujer postmenopáusica que necesita tal tratamiento.

13. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para uso para inhibir la proliferación de células de músculo liso aórtico en una mujer postmenopáusica que necesita tal tratamiento.

14. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para uso para inhibir la restenosis en una mujer postmenopáusica que necesita tal tratamiento.

15. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para uso para inhibir un cáncer dependiente de estrógenos en una mujer postmenopáusica que necesita tal tratamiento.