ES2559677T3 - Método de formulación de fármacos basado en aumentar la afinidad de los principios activos por superficies de partículas microcristalinas - Google Patents

Abstract

Un método para promover la unión de un principio activo a una partícula microcristalina preformada en suspensión, comprendiendo la micropartícula una dicetopiperazina, comprendiendo el método las etapas de: i) modificar el potencial químico del principio activo con un modificador del principio activo en donde dicha modificación permite una interacción energéticamente favorable entre el principio activo y la micropartícula independiente de la eliminación del disolvente; y ii) adsorber el principio activo sobre la superficie de la micropartícula.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de formulacion de farmacos basado en aumentar la afinidad de los principios activos por superficies de particulas microcristalinas

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a formulaciones de farmacos, y esta especialmente referida a metodos. Mas especificamente, se describe la union o adsorcion de principios activos sobre la superficie de particulas microcristalinas.

Antecedente de la invencion

La administracion de agentes terapeuticos ha sido un problema importante. La administracion oral es una de las vias mas frecuentes y preferidas debido a la facilidad de administracion, cumplimiento terapeutico del paciente, y menor coste. Sin embargo, las desventajas de esta via incluyen una potencia baja o variable y una adsorcion ineficaz del compuesto terapeutico. Esto es especialmente evidente cuando el compuesto a administrar es inestable en las condiciones que se encuentran en el tracto gastrointestinal. Se han desarrollado en la tecnica numerosos metodos de recubrimiento y encapsulacion, pero solamente unos pocos son eficaces para resolver este problema. Sin embargo, existen compuestos terapeuticos que tienden a ser menos activos en las condiciones del tracto gastrointestinal y deben administrarse en dosis mayores para que se puedan adsorber en el torrente sanguineo en una cantidad eficaz.

Se ha desarrollado una amplia gama de sistemas de formulacion de farmacos para resolver el problema de una administracion de farmacos optima y se basa en la incorporacion de farmaco en una matriz que actua como transportador. Los factores considerados en la formulacion de farmacos incluyen los requisitos de que el sistema sea no toxico y no reactivo con el farmaco a administrar, economico de fabricar, formado por componentes facilmente disponibles, y consistente con respecto a la composicion final y las caracteristicas fisicas, incluyendo la estabilidad y la tasa de liberacion. Es tambien preferible que el sistema de administracion del farmaco este formado por materiales que el organismo pueda eliminar facilmente mediante los procesos fisiologicos convencionales.

Los avances en la tecnologia de microparticulas han ayudado en el desarrollo de formulaciones farmacologicas mejoradas. Sin embargo, a pesar de estos avances, existe una necesidad en la tecnica de formulaciones farmacologicas estables que tengan eficacia a largo plazo y una adsorcion optima cuando se administre como sustancia farmaceutica, especialmente por medios pulmonares. Una solucion para resolver esta deficiencia es dirigirse a las caracteristicas/propiedades estructurales del principio activo que estimulen su adsorcion a la superficie de las microparticulas y disminuyan su tendencia a permanecer en solucion.

Sumario de la invencion

Se proporcionan metodos para unir, recubrir o adsorber un principio activo sobre la superficie de una particula microcristalina. En general, las microparticulas se recubren con un principio activo mediante la modificacion del sistema que comprende las microparticulas y el principio activo disuelto de tal forma que el principio activo tenga mayor afinidad por la superficie de la microparticula que por permanecer en disolucion. En particular, la presente invencion busca promover adicionalmente la adsorcion de un principio activo en la superficie de una microparticula que comprende una dicetopiperazina mediante la modificacion/uso de las propiedades del principio activo bajo diferentes condiciones de solucion.

Un primer aspecto de la invencion proporciona un metodo para promover la union de un principio activo a una particula microcristalina preformada en suspension, comprendiendo la microparticula una dicetopiperazina, comprendiendo el metodo las etapas de:

i) modificar el potencial quimico del principio activo con un modificador del principio activo en el que dicha modificacion permite una interaccion energeticamente favorable entre el principio activo y la microparticula independiente de la eliminacion del disolvente; y

ii) adsorber el principio activo sobre la superficie de la microparticula.

En realizaciones concretas de la presente invencion, la modificacion del potencial quimico comprende modificar la estructura, flexibilidad, rigidez, solubilidad o estabilidad del principio activo, individualmente o en combinacion. La modificacion del potencial quimico del principio activo comprende alterar las condiciones de disolucion. Alterar las condiciones de disolucion comprende anadir un modificador del principio activo a la solucion.

En realizaciones particulares, el modificador del principio activo se selecciona entre el grupo que consiste en sales, tensioactivos, iones, osmolitos, alcoholes, caotropos, cosmotropos, acidos, bases, y disolventes organicos. En una realizacion, la sal es cloruro de sodio.

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En otra realizacion mas de la presente invencion, el metodo comprende ademas la etapa de disolver el principio activo en la fase fluida de una suspension de micropartfculas y cambiar el pH de la fase fluida. En otro aspecto, la etapa de disolver el principio activo en una fase fluida se refiere a la disolucion de un solido. En otro aspecto, la etapa de disolver el principio activo se refiere a la adicion de una solucion concentrada del principio activo.

En otra realizacion de la presente invencion, el modificador del principio activo mejora la estabilidad superficial del principio activo.

En otra realizacion mas de la presente invencion, el principio activo es una protefna, peptido, polipeptido, molecula pequena, o molecula de acido nucleico. En otra realizacion de la presente invencion, el principio activo se selecciona entre el grupo que consiste en insulina, grelina, hormona del crecimiento, y hormona paratiroidea (PTH). El principio activo puede comprender un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En varios aspectos de la invencion, el anticuerpo puede reconocer un antfgeno asociado con una enfermedad incluyendo, sin limitacion, un antfgeno asociado con un tumor o un antfgeno relacionado con un patogeno infeccioso.

En otra realizacion mas de la presente invencion, la molecula pequena es una molecula ionizable o una molecula hidrofoba tal como, pero sin limitacion, ciclosporina A.

En otra realizacion de la presente invencion, la modificacion del potencial qufmico del principio activo comprende modular una o mas interacciones energeticamente favorables tales como, pero sin limitacion, interacciones electrostaticas, interacciones hidrofobas, y/o interacciones de enlaces de hidrogeno entre el principio activo y la superficie de la micropartfcula. La micropartfcula comprende una dicetopiperazina tal como, pero sin limitacion, fumaril dicetopiperazina.

En otra realizacion mas de la presente invencion, el metodo comprende ademas la etapa de eliminar o intercambiar el disolvente. Disolvente, tal como se usa en el presente documento, se refiere al medio fluido en el que el principio activo y la micropartfcula estan "banados". No debe interpretarse como la necesidad de que todos los componentes esten en solucion. De hecho, en muchos casos, puede utilizarse para referirse al medio lfquido en el que estan suspendidas la micropartfculas.

Un segundo aspecto de la invencion proporciona un proceso para preparar una composicion de administracion de farmaco que comprende un principio activo y una micropartfcula cristalina que comprende las etapas de:

proporcionar una solucion de principio activo que comprende una molecula de principio activo;

modificar el potencial qufmico del principio activo con un modificador del principio activo en el que dicha modificacion permite una interaccion energeticamente favorable entre el principio activo y la micropartfcula independiente de la eliminacion del disolvente, que promueve la union del principio activo a la micropartfcula;

proporcionar una micropartfcula en suspension o polvo, en el que la micropartfcula comprende una dicetopiperazina;

combinar dicha solucion de principio activo con dicha suspension o polvo de micropartfcula; y adsorber el principio activo sobre la superficie de la micropartfcula. El polvo puede, por ejemplo, estar filtrado pero no seco.

En otra realizacion de la presente invencion, el proceso de modificar el potencial qufmico del principio activo permite la interaccion entre el principio activo y la micropartfcula. En una realizacion, la modificacion del potencial qufmico del principio activo comprende anadir un modificador del principio activo a la solucion. Dicho modificador del principio activo se puede seleccionar entre el grupo que consiste en sales, tensioactivos, iones, osmolitos, alcoholes, caotropos, cosmotropos, acido, base, y disolventes organicos. En otra realizacion adicional, el modificador disminuye la solubilidad de la molecula de principio activo, promueve la asociacion entre el principio activo y la micropartfcula y/o mejora la estabilidad estructural de la molecula de principio activo.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se han incluido para demostrar adicionalmente determinados aspectos de los ejemplos descritos en el presente documento. La invencion se puede entender mejor por referencia a uno o mas de estos dibujos junto con la descripcion detallada de las realizaciones especfficas presentadas en el presente documento.

Las Figs. 1A-1C representa graficamente los efectos de caotropos y cosmotropos en las curvas de carga de los principios activos en micropartfculas de fumaril dicetopiperazina (FDCP) en funcion del pH y agente caotropico/cosmotropico 100 mM de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion. La Fig. 1A representa graficamente la carga de 0,75 mg/ml de insulina sobre 5 mg/ml de micropartfculas de FDCP en presencia de caotropos y cosmotropos a pH 3,0-5,0. La Fig. 1B representa graficamente la carga de 0,25 mg/ml de peptido 1 analogo a glucagon (GlP1) sobre 5 mg/ml de micropartfculas de FDCP en presencia de caotropos y cosmotropos a

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pH 2,0-4,0. La Fig. 1C representa graficamente la carga de 0,25 mg/ml de hormona paratiroidea (PTH) mg/ml sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de caotropos fuertes, NaSCN y NaClO4, entre pH 4,0-5,0.

Las Figs. 2A-2C representan graficamente los efectos de los osmolitos sobre las curvas de carga de los principios activos sobre las microparticulas de FDCP en funcion del pH y de los osmolitos (100 mM) de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion. La Fig. 2A representa graficamente la carga de 0,75 mg/ml de insulina sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de osmolitos a pH 3,0-5,0. La Fig. 2B representa graficamente la carga de 0,25 mg/ml de GlP1 sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de osmolitos entre pH 2,04,0. La Fig. 2A representa graficamente la carga de 0,10 mg/ml del peptido grelina sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de osmolitos fuertes a pH 4,0-5,0.

Las Figs. 3A-3D representan graficamente los efectos de alcoholes sobre las curvas de carga de los principios activos sobre las microparticulas de FDCP en funcion del pH y de los alcoholes de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion. La Fig. 3A representa graficamente la carga de 0,10 mg/ml de grelina sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de hexafluoroisopropanol (HFIP) al 5 %. 10 %, 15 %, y 20 % v/v entre pH 2,04,0. La Fig. 3B representa graficamente la carga de 0,10 mg/ml de grelina sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de trifluoroetanol (TFE) al 5 %. 10 %, 15 %, y 20 % v/v entre pH 2,0-4,0. La Fig. 3C y 3D representan graficamente la carga de 0,25 mg/ml de GIP1 sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP a pH 2,0-5,0 en presencia de HFIP y TFE, respectivamente.

Las Figs. 4A-4D representan graficamente los efectos de la sal sobre las curvas de carga de los principios activos sobre las microparticulas de FDCP en funcion del pH y de la concentracion de NaCl de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion. La Fig. 4A representa graficamente la carga de 0,75 mg/ml de insulina sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de 0-500 mM de NaCl a pH 2,0-5,0. La Fig. 4B representa graficamente la carga de 0,25 mg/ml de GlP1 sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de 0-500 mM de NaCl a pH 2,0-5,0. La Fig. 4B representa graficamente la carga de 0,25 mg/ml del peptido PTH sobre 5 mg/ml de microparticulas de FDCP en presencia de 0-1000 mM de NaCl a pH 2,0-5,0. La Fig. 4D representa graficamente el analisis de la estructura secundaria de la PTH para varias concentraciones de sal (20°C). La CD del UV lejano de 4,3 mg/ml de PTH a pH 5,8 ilustra que, a medida que la concentracion de NaCl aumenta, la estructura secundaria del peptido adopta una conformacion mas helicoidal.

Las Figs. 5A-5B representan graficamente la adsorcion de moleculas hidrofobas sobre las microparticulas de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion. La Fig. 5A representa graficamente la union de la ciclosporina A a las microparticulas de FDCP con el aumento de antidisolvente (agua) a una concentracion del 60 %, 80 % y 90 %. La Fig. 5B representa graficamente el porcentaje de carga teorica maxima conseguida para la ciclosporina A con relaciones masicas variables de ciclosporina A/microparticulas de FDCP en presencia de un 90 % de antidisolvente.

La Fig. 6 representa graficamente la farmacocinetica de una unica inyeccion intravenosa (IV) e insuflacion pulmonar (IS) en ratas usando varias relaciones masicas de ciclosporina A/microparticulas de FDCP con un 90 % de antidisolvente de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion.

Descripcion detallada de la invencion

Se describen en el presente documento metodos utiles para estabilizar principios activos farmaceuticos junto con microparticulas cristalinas que comprenden una dicetopiperazina. Las composiciones resultantes proporcionan principios activos estables revestidos sobre las superficies de la microparticula cristalina.

La sustancia a revestir o adsorber sobre la microparticula cristalina se denomina en el presente documento principio activo. Los ejemplos de clases de principio activo incluyen composiciones farmaceuticas, compuestos sinteticos, y macromoleculas organicas que tienen utilidad terapeutica, profilactica y/o diagnostica.

En general, la mayoria de principios activos que se pueden revestir o adsorber sobre la superficie de las microparticulas cristalinas incluyen, pero sin limitacion, macromoleculas organicas, acidos nucleicos, compuestos organicos sinteticos, polipeptidos, peptidos, proteinas, polisacaridos y otros azucares, y lipidos. Los peptidos, proteinas, y polipeptidos son todos ellos cadenas de aminoacidos unidos por enlaces peptidicos. Por lo general, se considera que los peptidos tienen menos de 30 restos de aminoacidos, pero pueden incluir mas. Las proteinas son polimeros que contienen mas de 30 restos de aminoacidos. El termino polipeptido, tal como se conoce en la tecnica y se utiliza en el presente documento, se puede referir a un peptido, una proteina, o cualquier otra cadena de aminoacidos de cualquier longitud que contenga multiples enlaces peptidicos, aunque generalmente contienen un minimo de 10 aminoacidos. Los principios activos utilizados en la formulacion de revestimiento pueden clasificarse en varias clases de actividad biologica, tales como agentes vasoactivos, agentes neuroactivos, hormonas, anticoagulantes, agentes inmunomoduladores, agentes citotoxicos, antibioticos, antiviricos, antigenos, y anticuerpos.

Los ejemplos de principios activos que se pueden emplear en la presente invencion incluyen, de una forma no limitante: hormona del crecimiento, anticuerpos y fragmentos de los mismos, alquinos, ciclosporinas (por ejemplo

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ciclosporina A), PPACK (D-fenilalanil-1 -prolil-l-arginina clorometilcetona, CMFDA (diacetato de 5- clorometilfluoresceina), Texas Red, clopidogrel, factor estimulador de las colonias de macrofagos y granulocitos (GM-CSF), peptido 1 analogo a glucagon (GlP-1), grelina, hormona paratiroidea (PTH), insulina y analogos de insulina (por ejemplo, aspartoinsulina e insulina) y anticuerpos y fragmentos de los mismos, incluyendo, pero sin limitacion: anticuerpos humanizados o quimericos; F(ab), F(ab’)2, o anticuerpos monocatenarios solos o fusionados con otros polipeptidos; anticuerpos monoclonales terapeuticos o diagnosticos dirigidos contra antigenos del cancer, citoquinas, agentes infecciosos, mediadores inflamatorios, hormonas, y antigenos de la superficie celular. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos dirigidos contra antigenos tumorales incluyen anti-SSX-241-49 (sarcoma sinovial, X breakpoint 2), anti-NY-ESQ-1 (antigeno asociado al tumor esofagico), anti-PRAME (antigeno de melanoma expresado preferentemente), anti-PSMA (antigeno de membrana especifico de la prostata), anti-Melan-A (antigeno asociado al tumor melanoma), anti-tirosinasa (antigeno asociado al tumor melanoma), y anti-MQPC-21 (proteina plasmatica de la celula de mieloma).

Microparticulas

Esencialmente, el termino "micropartfcula" se refiere a una particula que tiene un diametro de aproximadamente 0,51000 pm, independientemente de la estructura exterior o interior precisa. En la amplia categoria de las microparticulas, las "microesferas" se refieren a microparticulas que tienen una forma esferica uniforme. Las microparticulas cristalinas que se usan en el presente documento se refieren a microparticulas que tienen la estructura interna, aunque no necesariamente la forma externa, de un cristal y tienen una ordenacion regular de los atomos en una red cristalina espacial. Las superficies cristalinas ionizables se refieren a microparticulas cristalinas que tienen la capacidad adicional de llevar una carga electrica. En algunas realizaciones, la micropartfcula puede ser un monocristal de forma regular. En varias realizaciones preferidas, la micropartfcula tiene forma irregular, es porosa, tiene superficies interiores accesibles al principio activo, o comprende multiples cristales, en cualquier combinacion. Dichas caracteristicas aumentaran por lo general el area superficial y, por tanto, la capacidad de carga. Dichas caracteristicas tambien pueden contribuir a propiedades aerodinamicas ventajosas, algo importante si el principio activo va a administrarse mediante la inhalacion de un polvo seco que comprende las microparticulas.

Preferentemente, la sustancia quimica que compone la micropartfcula cristalina es reactiva reversiblemente con el principio activo a administrar, no toxica, asi como no metabolizable por roedores y seres humanos. Entendiendo lo anterior, se puede tolerar cierto nivel de toxicidad, dependiendo, por ejemplo, de la gravedad de la dolencia a tratar o de la cantidad de la sustancia a la que esta expuesto el paciente. De manera similar, no se requiere que la sustancia sea totalmente metabolicamente inerte. Ademas, la estructura cristalina de las microparticulas preferidas no se ve sustancialmente perturbada durante el proceso de recubrimiento o union con el principio activo. La composicion de la micropartfcula cristalina determina que tipo de interacciones quimicas se pueden manipular para impulsar la adsorcion de un principio activo en la superficie de una micropartfcula.

Numerosas sustancias se pueden usar para formar las microparticulas cristalinas. Las microparticulas de ese tipo tienen superficies, cuyas propiedades se pueden manipular durante el proceso de recubrimiento tal como se describe en el documento US 2007/0059373. Los materiales representativos a partir de los que se pueden formar las microparticulas cristalinas incluyen, pero sin limitacion, aminoacidos aromaticos, o compuestos con solubilidad limitada en un intervalo de pH definido tales como dicetopiperazinas y sulfatos de morfolina. Las microparticulas para utilizar en la presente invencion comprenden una dicetopiperazina (DCP).

Como se discute en el presente documento, Las microparticulas de DCP se utilizan para facilitar la adsorcion del principio activo. Las patentes estadounidenses N.° 5.352.461 y 5.503.852 describen un sistema de administracion de farmaco basado en la formacion de microparticulas de dicetopiperazina (DCP) a partir de derivados de dicetopiperazina tales como 3,6-bis[W-fumaril-W-(n-butil)amino] (tambien denominado fumaril dicetopiperazina o FDCP; tambien denominada (E)-3,6-bis[4-(W-carboxi-2-propenil)amidobutil]-2,5-dicetopiperazina) que son estables a pH bajo y se disuelven en el pH sanguineo o del intestino delgado. Un sistema basado en elementos estructurales de la dicetopiperazina forma microparticulas con distribuciones de tamano e intervalos de pH deseables, asi como buena tolerancia a la carga util. Se puede generar una amplia gama de caracteristicas estables y reproducibles con las manipulaciones adecuadas de los grupos sustituyentes. Dichas patentes describen la precipitacion de la DCP en la presencia del principio activo para formar microparticulas que comprenden el principio activo. Otros detalles sobre la sintesis, preparacion, y uso de las dicetopiperazinas y las microparticulas de dicetopiperazina se describen en las patentes de Estados Unidos 6.071.497; 6.331.318; 6.428.771 y en las publicaciones de patente de Estados Unidos N.° 20060040953 y 20060041133. Las composiciones que comprenden particulas de dicetopiperazina se describen en la patente de Estados Unidos N.° 6.991.779 y en la publicacion de patente de Estados Unidos N.° 20040038865.

Otras dicetopiperazinas incluidas en la presente invencion incluyen 3,6-di(4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6- di(succinil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina (succinil dicetopiperazina o SDCP); 3,6-di(maleil-4-aminobutil)-2,5- dicetopiperazina; 3,6-di(citraconil-4-aminobutil)-2-5-dicetopiperazina; 3,6-di(glutaril-4-aminobutil)-2,5-

dicetopiperazina; 3,6-di(malonil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(oxalil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina y derivados de las mismas. Las sales de dicetopiperazina tambien se pueden utilizar en la presente invencion, y pueden incluir, por ejemplo, una sal farmaceuticamente aceptable tal como la de Na, K, Li, Mg, Ca, amonio, o mono, di o trialquilamonio (derivadas de trietilamina, butilamina, dietanolamina, trietanolamina, o piridinas, y similares). La

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sal puede ser una monosal, disal o sal mixta. Las sales de orden superior tambien se contemplan para aquellas dicetopiperazinas cuyos grupos R contienen mas de un grupo acido. En otros aspectos de la invencion, una forma basica del agente se puede mezclar con la dicetopiperazina para formar un enlace salino entre el farmaco y la dicetopiperazina, de forma que el farmaco es el contracation de la dicetopiperazina. Las sales de DCP para administracion de farmacos se describen mas detalladamente en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.2 20060040953.

La patente de Estados Unidos n.° 6.444.226, y 6.652.885, describen la preparacion y la provision de microparticulas de DCP en suspension acuosa, a la que se anade una solucion de principio activo, y a continuacion, la etapa critica de liofilizar la suspension para obtener microparticulas que tienen un revestimiento de principio activo. La base de esta formulacion es que el recubrimiento de la microparticula con el principio activo esta impulsado por la eliminacion del medio liquido mediante liofilizacion. (Vease tambien la patente de Estados Unidos n.° 6.440.463). A diferencia de las ensenanzas de la tecnica anterior, la presente invencion proporciona medios para ajustar la asociacion entre el principio activo y la microparticula antes de la eliminacion del disolvente. De esta manera, la eliminacion del medio liquido por metodos fisicos no especificos (por ejemplo, filtracion o sedimentacion) o metodos evaporativos (por ejemplo, liofilizacion o secado por pulverizacion) pueden dar como resultado cargas comparables.

Promover la adsorcion de los principios activos

La adsorcion del principio activo en la superficie de una microparticula cristalina puede implicar alterar las propiedades del principio activo en una solucion o suspension de fluido en varias condiciones de disolucion, promoviendo de esta forma la adsorcion sobre la superficie de la microparticula y reduciendo la cantidad de principio activo que permanece en solucion. La alteracion o las modificaciones del principio activo pueden dan lugar al uso de modificadores tales como, pero sin limitacion, caotropos y cosmotropos, sales, sustancias organicas tales como, pero sin limitacion, alcoholes, osmolitos, y tensioactivos. Estos modificadores pueden actuar sobre el principio activo para alterar su potencial quimico y, por tanto, su estructura, flexibilidad, rigidez o estabilidad, sin alterar quimicamente el propio agente. El termino "potencial quimico" es bien conocido por un experto en la materia. En realizaciones de la presente invencion, "potencial quimico" se refiere a la energia libre necesaria para impulsar una reaccion quimica como, por ejemplo, la interaccion entre un principio activo y un disolvente o la adsorcion de un principio activo sobre una microparticula. La expresion "energeticamente favorable" tal como se usa en el presente documento se refiere a la disminucion en los niveles de energia libre de los estados absorbidos del principio activo sobre la microparticula comparado con el nivel de energia libre de la microparticula sin revestimiento, o principio activo no unido y/o las formas insolubles (incluyendo la agregacion o la precipitacion) del principio activo. El termino "estructura" tal como se usa en el presente documento se refiere a la estructura secundaria de la molecula del principio activo e incluye la formacion de alfa-helices, beta laminas, o helice aleatoria (sin ordenar) de la molecula de principio activo, tal como una proteina. Adicionalmente, el termino estructura tambien puede incluir las estructuras ternaria y cuaternaria de la molecula, pero no se limita a las mismas y tambien puede referirse a la autoasociacion, agregacion, multimerizacion, dimerizacion, y similares, de una molecula. El termino "estabilidad" tal como se usa en el presente documento se refiere a la estabilizacion o desestabilizacion de la estructura del principio activo en la presencia del modificador.

Ademas, la alteracion de las propiedades del principio activo en una solucion o suspension de fluido es probable que afecte las interacciones debidas a las propiedades hidrofobas, propiedades de union a hidrogeno, y propiedades electrostaticas del principio activo y/o microparticula.

Las interacciones hidrofobas son asociaciones de los grupos no polares entre si en soluciones acuosas debido a su insolubilidad en agua. Las interacciones hidrofobas pueden afectar a numerosos procesos moleculares que incluyen, pero sin limitacion, estabilizacion de la estructura (de moleculas simples, complejas de dos o tres moleculas, o conjuntos mas grandes) y dinamica de la misma, y realizan importantes contribuciones a los procesos de union protefna-protefna y proteina-ligando. Se sabe que estas interacciones tienen un papel en eventos tempranos del plegamiento de las proteinas, y estan implicados en complejos conjuntos y fenomenos de autoensamblaje (por ejemplo, formacion de membranas).

Las interacciones de enlace de hidrogeno son fuerzas dipolo-dipolo especialmente intensas entre moleculas; un atomo de hidrogeno en un enlace polar (por ejemplo, H-F, H-O o H-N) puede experimentar una fuerza de atraccion con una molecula o ion electronegativo vecino, que tiene un par de electrones no compartidos (de forma tipica un atomo de F, O, o de N sobre otra molecula). Los enlaces de hidrogeno son responsables de las propiedades unicas del agua y son muy importantes en la organizacion de moleculas biologicas, especialmente en lo que afecta a la estructura de las proteinas y el ADN.

Las interacciones electrostaticas son atracciones entre cargas opuestas o repulsiones entre cargas similares que se vuelven mas intensas a medida que las cargas se acercan entre si. Las interacciones electrostaticas constituyen un componente clave en la comprension de las interacciones entre los cuerpos cargados en soluciones ionicas. Por ejemplo, la estabilidad de las particulas coloidales dispersas en un disolvente se puede explicar teniendo en cuenta la competicion entre las interacciones electrostaticas de repulsion y las interacciones de van der Waals de atraccion. Las interacciones electrostaticas son tambien de importancia cuando se tiene en cuenta la interaccion y la adhesion

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entre las partfculas.

Sales

En algunas realizaciones de la presente invencion, las propiedades del principio activo se alteran usando sales tales como, pero sin limitacion, cloruro sodico. Los principios activos, por ejemplo, PTH y GLP-1, experimentan cambios estructurales notales en la presencia de sal. Como se muestra en el Ejemplo 5 (Fig. 4D), la presencia de sal aumenta la estructura secundaria de PTH promoviendo una conformacion mas helicoidal del peptido. Tambien se ha mostrado que la sal afecta a la estructura del GLP-1. Adicionalmente, las sales y otros compuestos ionicos pueden tanto estabilizar como desestabilizar proteinas y peptidos, especialmente cuando la diferencia entre el pH de la solucion y el pi de la proteina o el peptido se vuelve mayor por la union a restos especificamente cargados (Antosiewiez J, et al., J. Mol. Biol. 238:415-436, 1994).

Caotropos

Los caotropos, que son bien conocidos en la materia, son iones que muestran interacciones debiles con el agua y por tanto desestabilizan moleculas tales como proteinas o peptidos. Estos compuestos descomponen la red de agua unida por hidrogeno y disminuyen su tension superficial, promoviendo de esta forma mayor libertad estructural y la desnaturalizacion de las proteinas y los peptidos. Los ejemplos de caotropos incluyen, pero sin limitacion, NaSCN, (CH3)3N-HCl, Na2NC>3, y NaClCU y cloruro de cesio (CsCl).

Los cosmotropos o liotropos, por otra parte, son iones que muestran interacciones fuertes con el agua y por lo general estabilizan macromoleculas tales como proteinas y peptidos. este efecto de estabilizacion se lleva a cabo con el aumento del orden del agua y el aumento de su tension superficial. Los ejemplos de cosmotropos incluyen, pero sin limitacion, citrato de tamoxifeno (citrato Na), y sulfato de sodio (Na2SO4).

Alcoholes

Otra clase de modificador del principio activo utilizado en la presente invencion son los alcoholes. Los alcoholes pueden perturbar la estructura nativa de las proteinas y los peptidos y tambien pueden estabilizar e inducir conformaciones a-helicoidales en macromoleculas, muy especialmente en el interior de proteinas y polipeptidos no estructurados. Dichos alcoholes pueden incluir, pero sin limitacion, metanol (MeOH), etanol (EtoH), trifluoroetanol (TFE), y hexafluoroisopropanol (HFIP). De estos, TFE y HFIP son dos de los alcoholes mas potentes para inducir transiciones helicoidales en peptidos y proteinas (Hirota et al., Protein Sci., 6:416-421; 1997, incorporado en este documento por referencia para todo su contenido que se refiere a las transiciones helicoidales en peptidos y proteinas). Estos alcoholes pueden afectar a la estructura de proteinas y peptidos debido a su capacidad para perturbar las propiedades de union al hidrogeno del disolvente (vease Eggers y Valentine, Protein Sci., 10:250-261; 2001, incorporado en este documento por referencia para todo su contenido que se refiere al efecto de los alcoholes sobre la estructura de las proteinas).

Osmolitos

Otra clase de modificadores que afectan a la afinidad del principio activo por la microparticula son los osmolitos. Los osmolitos, como es bien conocido del experto en la materia, son compuestos pequenos que producen las celulas de la mayoria de los organismos en situaciones de elevado estres (tales como extremas fluctuaciones de temperatura, entornos muy salinos, etc.) para estabilizar sus macromoleculas. No interactuan directamente con la macromolecula, pero actuan mediante la alteracion de las propiedades del disolvente en el entorno celular y, por tanto, su presencia indirectamente modifica la estabilidad de las proteinas. Estos compuestos incluyen varios polioles, azucares, polisacaridos, disolventes organicos, y varios aminoacidos y sus derivados. Aunque el mecanismo de los osmolitos debe elucidarse aun, se especula que es probable que estos compuestos actuan aumentando el potencial quimico del estado desnaturalizado con respecto a su estado natural, aumentando de esta forma la diferencia de energia de Gibbs (positiva) (AG) entre los conjunto natural y desnaturalizado (Arakawa y Timasheff, Biochemistry 29:19141923,1990).

Los osmolitos que se contemplan en la presente invencion, incluyen de forma no limitante, hexilenglicol (Hex-Gli), trehalosa, glicina, polietilenglicol (PEG), N-oxido de trimetilamina (TMAO), manitol, y prolina.

Descripcion general del metodo

En los metodos de la presente invencion, se combinan al menos tres componentes en un medio liquido: al menos un principio activo, microparticulas (preformadas) que comprenden una dicetopiperazina, y al menos un modificador del principio activo como se ha descrito anteriormente. Los componentes de este sistema se pueden combinar en cualquier orden. En algunas realizaciones, el modificador y el principio activo se combinan entre si antes de que dicha mezcla se combine con una suspension de las microparticulas. En otras realizaciones, el agente y las microparticulas se combinan en primer lugar y luego se anade el modificador. En algunas realizaciones, el principio activo o el modificador se proporcionan y se combinan con otro componente, o componentes, en forma de una

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solucion. En otras realizaciones, cualquiera de los componentes se puede proporcionar en forma solida y disuelta o, en el caso de las micropartfculas, suspendidas, en el medio lfquido que contiene otro de los componentes. Otras variaciones seran evidentes para el experto en la materia.

Las micropartfculas se forman antes de combinarse con el resto de componentes del sistema y, como tal, se presentan en forma de una suspension. No obstante, el medio lfquido en el que se han suspendido las micropartfculas se denomina en el presente documento, algunas veces, como disolvente. El medio lfquido utilizado en el metodo suele ser acuoso. Sin embargo, en algunos casos, el medio lfquido puede comprender mas de un compuesto organico, por ejemplo, un alcohol utilizado como modificador, en lugar de aguar.

Tras la union de todos los componentes del sistema, el principio activo quedara adsorbido sobre la superficie de la micropartfcula. En realizaciones crecientemente preferidas de la presente invencion, al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 %, o sustancialmente todo, el principio activo del sistema quedara adsorbido sobre las micropartfculas, hasta el 100 %. En algunas realizaciones de la presente invencion, el area superficial accesible de las micropartfculas sera suficiente para que todo el principio activo adsorbido este en contacto directo con la suficiente de la micropartfcula, es decir, el recubrimiento es una monocapa. Sin embargo, debe entenderse que pueden estar presentes interacciones adicionales. En algunos casos, por ejemplo, la autoasociacion del principio activo tambien se ve energeticamente favorecida de forma que multiples capas de principio activo recubren la partfcula. No se requiere que ninguna de dichas capas este completa, o que el espesor del recubrimiento sea uniforme. Se pueden reconocer dos formas de autoasociacion: multimerizacion y agregacion. La multimerizacion se caracteriza por interacciones intermoleculares especfficas y una estequiometrfa fija. La agregacion se caracteriza por interacciones intermoleculares inespecfficas y una estequiometrfa indefinida. Debera entenderse que los principios activos multimericos se pueden adsorben en el estado multimerico, o disociarse en monomeros, o multfmeros de orden inferior, y adsorberse sobre la superficie en dicho estado. Cualquiera que sea el caso, la agregacion puede mediar en la disposicion en capas del principio activo sobre la micropartfcula.

Las micropartfculas cargadas constituyen una composicion de administracion de farmaco que se puede utilizar en varias formas. Las partfculas se pueden utilizar en forma de polvo, en formas farmaceuticas solidas tales como comprimidos o incluidas en capsulas, o suspendidas en un transportador lfquido. En general, esto requerira el intercambio y/o la eliminacion del medio lfquido en el que tiene lugar la carga. Esto se puede llevar a cabo por cualquiera de varios medios, incluyendo medios ffsicos tales como, pero sin limitacion, sedimentacion o filtracion, y metodos evaporativos tales como, pero sin limitacion, liofilizacion o secado mediante pulverizacion. Dichas tecnicas son conocidas de los expertos en la tecnica. En una realizacion de la invencion, el disolvente se elimina mediante secado por pulverizacion. Los metodos para secar las micropartfculas de dicetopiperazina mediante secado por pulverizacion se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 60/776.605 presentada el 22 de febrero de 2006.

Si la carga no esta sustancialmente completa, las realizaciones de la invencion que emplean metodos ffsicos para eliminar el disolvente perderan normalmente el principio activo no adsorbido, pero por ejemplo pueden ser utiles para garantizar que el recubrimiento no va mas alla de una monocapa. Por el contrario, las realizaciones que utilizan el secado por evaporacion para la eliminacion del disolvente pueden, en algunos casos, depositar principio activo adicional sobre la partfcula y de esta forma evitar su perdida, pero las interacciones adsortivas implicadas pueden ser diferentes de las ya establecidas por las moleculas unidas en las primeras etapas del metodo. En otras realizaciones, la eliminacion del disolvente mediante evaporacion no da como resultado una deposicion significativa adicional del principio activo, incluyendo el caso en que practicamente todo el principio activo ya se ha adsorbido sobre la partfcula.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se han incluido para demostrar las realizaciones preferidas de la presente invencion. Las personas expertas en la materia deberan apreciar que las tecnicas descritas en los ejemplos siguientes representan tecnicas y composiciones descubiertas por los inventores que funcionan bien en la practica de la invencion, y, por tanto, se puede considerar que constituyen los modos preferidos para su practica. Aunque la discusion puede centrarse en un mecanismo concreto, debera entenderse que algunos modificadores pueden tener multiples efectos sobre el agente, o incluso tambien sobre la superficie de la partfcula, cada uno de los cuales puede contribuir a promover la adsorcion del agente en la partfcula. Sin embargo, los expertos en la materia, a la luz de la presente divulgacion, apreciaran que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones especfficas que se describen y obtener ademas un resultado igual o similar.

EJEMPLO 1

Procedimiento experimental: Estudios de adsorcion de principio activo/microparticula FDCP

Los principios activos insulina, PTH, grelina y GLP-1 bien se adquirieron de American Peptide (Sunnyvale, CA) o AnaSpec (San Jose, CA), o se prepararon en el laboratorio (MannKind Corporation, Valencia, CA). Se analizaron muestras acuosas a pH variable y a 20°C (salvo que se indique otra cosa). Generalmente, las muestras se

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prepararon frescas y se mezclaron con el aditivo concreto (por ejemplo, sal, tampon de pH, etc., de utilizarse alguno), antes de anadir las microparticulas de FDCP.

La asociacion del principio activo con las particulas de dicetopiperazina (DCP) en suspension se evaluo mediante la realizacion de estudios de adsorcion. Los parametros investigados en los estudios de adsorcion investigaron los efectos de las interacciones electrostaticas, puentes de hidrogeno, estructura del agua, flexibilidad de la proteina, e interacciones especificas de pares salinos sobre la interaccion del principio activo y la microparticula de fumarildicetopiperazina (FDCP). Ademas, se sometieron a ensayo varios estabilizantes de proteinas habituales para determinar su interferencia con la adsorcion del principio activo sobre las superficies de la microparticula de FDCP.

Se estudiaron diferentes condiciones que promueven la adsorcion del principio activo sobre las superficies de las particulas de FDCP preformadas. Una solucion de microparticulas de FDCP 15 mg/ml se combino con tampon de pH 3X y una solucion 3X de aditivo o excipiente. La solucion final contenia una concentracion de microparticulas de FDCP de 5 mg/ml y una concentracion de GLP-1 de 0,25 mg/ml (5 % p/p), o una concentracion de PTH de 0,25 mg/ml (5 % p/p), o una concentracion de insulina de 0,75 mg/ml (15 % p/p) o una concentracion de grelina de 0,10 mg/ml (2 % p/p). El principio activo no unido del sobrenadante se elimino por filtracion de la suspension. Las particulas de FDCP con el principio activo asociado se disolvieron (reconstituyeron) en 100 mM de bicarbonato de amonio y se filtraron para separar cualesquiera moleculas de principio activo agregadas. La cantidad de principio activo tanto en el sobrenadante como en las fracciones reconstituidas se cuantifico por HPLC. Se llevaron a cabo una serie de experimentos, cuyas condiciones incluyeron el uso de aditivos tales como sales, osmolitos, caotropos y cosmotropos, y alcoholes. Los resultados de estos estudios se describen a continuacion.

EJEMPLO 2

Efecto de los caotropos y cosmotropos sobre la adsorcion de principio activo sobre particulas de FDCP

Se estudiaron las especies ionicas que afectan a la estructura del agua y de las proteinas (caotropos y cosmotropos) para investigar la adsorcion del principio activo sobre la superficie de una microparticula de FDCP mediante un mecanismo hidrofobo (a bajo pH). La carga del principio activo sobre las particulas de FDCP se realizo a 5 mg/ml de microparticulas y una concentracion de GLP-1 de 0,25 mg/ml (5 % p/p), o una concentracion de PTH de 0,25 mg/ml (5 % p/p), o una concentracion de insulina de 0,75 mg/ml (15 % p/p). La concentracion del caotropo o del cosmotropo en las muestras se mantuvo constante a 100 mM y el pH vario de 2,0 a 5,0. Los caotropos o cosmotropos se seleccionaron entre los siguientes: NaSCN, CsCl, Na2SO4, (CH3)3N-HCl, Na2NO3, Citrato Na, y NaClO4. El control indico que no se anadieron caotropos o cosmotropos.

Las Figs. 1A-1C representan graficamente las curvas de carga para la insulina, GLP-1 y PTH, respectivamente, sobre la superficie de la microparticula de FDCP en funcion del pH en presencia de varios caotropos o cosmotropos. A pH bajo (3,0) todos los caotropos y cosmotropos analizados mejoraron la afinidad de la insulina por la superficie de la microparticula y mostraron una carga significativa en comparacion con el control. A pH 4, no se observo este efecto (FIG. 1A). A pH mas alto (5,0), los caotropos y cosmotropos interfirieron con la adsorcion de insulina en la superficie de la microparticula, en comparacion con el control, mediante la precipitacion de la proteina insulina. De esta forma, estos agentes promueven la union de la insulina a las particulas de FDCP al pH mas bajo, pero tuvieron poco efecto, o incluso un efecto perjudicial, en condiciones de pH mas altos.

GLP-1, en la presencia de caotropos y cosmotropos, mostro una afinidad mejorada por las microparticulas de FDCP a pH 2,0-4,0 con un mayor efecto a pH mas bajo (FIG. 18). Se describen observaciones similares en la solicitud provisional de Estados Unidos con numero de serie 60/744.882. Se observo que aproximadamente 0,02-0,04 mg/ml del peptido GLP-1 (que corresponde a relaciones masicas de 0,004 a 0,008) se detectaban en las muestras de control exentas de microparticulas en la presencia de NaSCN, NaClO4, Na2SO4, Na2NO3 y Na citrato, lo que indica que una pequena proporcion del GLP-1 precipito en lugar de adsorberse en la particula.

La afinidad de la FDCP por la microparticula de FDCP fue mayor a un pH de 4,0 a aproximadamente 4,9 en la presencia de caotropos fuertes tales como NaSCN y NaClO4 (FIG. 1C).

Los datos respaldan que los agentes caotropicos y cosmotropicos tienen un papel en promover la adsorcion del principio activo en las superficies de la microparticula de FDCP, muy notablemente a pH bajo. Puesto que estos modificadores tienen mayor efecto a pH bajo, cuando la superficie de la microparticula es menos ionica, es probable que la adsorcion proceda de un mecanismo hidrofobo. La disminucion en la adsorcion observada a pH mas alto puede ser resultado de la superficie mas cargada de la particula junto con los efectos que tienen los agentes caotropicos y cosmotropicos para aumentar la hidrofobia de los principios activos. Adicionalmente, como especies ionicas, estos agentes pueden competir con el principio activo para su union a la microparticula, o perturbar las interacciones electrostaticas entre el principio activo y la microparticula. Finalmente, tambien se indica que el apantallamiento de Debye puede contribuir a la disminucion de la adsorcion en la superficie mas cargada.

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EJEMPLO 3

Efecto de los osmolitos sobre la adsorcion del principio activo en particulas de FDCP

Para evaluar la importancia de la estabilidad del principio activo en la adsorcion, se examino el efecto de los osmolitos sobre la union del principio activo a particulas de FDCP. Las Figs. 2A-2C muestran las curvas de carga para la insulina (FIG. 2A), GLP-1 (Fig. 28) y grelina (FIG. 2C) sobre particulas de FDCP en funcion del pH en presencia de estabilizantes habituales (osmolitos). La carga del principio activo sobre las microparticulas de FDCP se realizo a 5 mg/ml de microparticulas y una concentracion de insulina de 0,75 mg/ml (15 % p/p), o a una concentracion de GLP-1 de 0,25 mg/ml (5 % p/p) o una concentracion de grelina de 0,10 mg/ml (2 % p/p). La concentracion del osmolito (estabilizador) en las muestras se mantuvo constante a 100 mM y el pH vario de aproximadamente de 2,0 a aproximadamente 5,0. Los osmolitos se seleccionaron entre hexilenglicol (Hex-Gly), trehalosa, glicina, PEG, TMAO, manitol y prolina; el control no indica osmolito.

De los principios activos estudiados, la insulina mostro una afinidad significativamente mejorada para la superficie de la particula de FDCP en presencia de los osmolitos (PEG, glicina, trehalosa, manitol y Hex-Gly) para un intervalo de pH de 3,0 a 5,0 (FIG. 2A). De los osmolitos estudiados, PEG y prolina mejoraron la afinidad para la adsorcion del GLP-1 sobre la superficie de la particula de FDCP para un intervalo de pH de 2,0 a 4,0. El osmolito TMAO fue mas eficaz que el PEG o la prolina para la union de GLP-1 sobre la superficie de la microparticula de FDCP a pH bajo (2,0), pero fue ligeramente perjudicial a pH 3,0 y superior (FIG. 28). Sin embargo, la grelina mostro una mayor afinidad por la superficie de la microparticula en presencia de 100 mM de manitol, PEG, glicina, Hex-Gly, y trehalosa cuando se comparo con el control para un intervalo de pH de aproximadamente 4,0 a 5,0 (Fig. 2C).

Estas curvas de carga sugieren que los osmolitos pueden mejorar la adsorcion del principio activo sobre la superficie de la microparticula de FDCP. Es probable que este efecto sea el resultado de la capacidad de los modificadores para estabilizar el principio activo, que permite que la adsorcion sea mas energeticamente favorable.

EJEMPLO 4

Efecto de los alcoholes sobre la afinidad del principio activo en particulas de FDCP

Para evaluar el efecto de los modificadores sobre el principio activo que permite la adsorcion en la superficie de la microparticula mediante un mecanismo hidrofobo, se examino el efecto de los alcoholes. Los alcoholes conocidos por inducir la conformacion helicoidal en peptidos y proteinas no estructurados mediante el aumento de la fuerza de los enlaces de hidrogeno fueron evaluados para determinar el papel que tiene la conformacion helicoidal sobre la adsorcion del principio activo sobre la superficie de particulas de FDCP. Se analizaron principios activos tales como GLP-1 y grelina. La carga del principio activo sobre las particulas de FDCP se realizo a 5 mg/ml de microparticulas y una concentracion de GLP-1 de 0,25 mg/ml (5 % p/p) o una concentracion de grelina de 0,10 mg/ml (2 % p/p). El efecto de cada alcohol se observo para un intervalo de pH de 2,0 a 5,0. Los alcoholes utilizados fueron trifluoroetanol (TFE) y hexafluoroisopropanol (HFIP). Cada alcohol se evaluo a concentraciones variables que incluyen 5 %, 10 %, 15 %, o 20 % v/v.

Las Figs. 3A-3D muestran las curvas de carga del principio activo sobre microparticulas de FDCP en funcion del pH de cada alcohol y de cada principio activo. A pH 2,0-4,0, la grelina mostro una afinidad muy aumentada por la superficie de la microparticula en presencia de HFIP y TFE a todas las concentraciones sometidas a ensayo (5 %, 10 %, 15 % y 20 %), tal como se demuestra mediante la relacion masica entre la grelina y las particulas de FDCP (FIG. 3A-3B).

A pH 2,0-5,0, GLP-1 mostro una afinidad mejorada por la superficie de la microparticula en presencia de HFIP y TFE a las concentraciones mostradas (5 % y 10 %) (FIG. 3C-3D). El efecto del TFE fue menos marcado, y a los pH mas bajos sometidos a ensayo fue perjudicial. Se destaca que se detecto una cantidad sustancial del peptido GLP-1 (0,13-0,19 mg/ml, que corresponde a relaciones masicas de 0,026 a 0,038), en las muestras de control exentas de microparticulas reconstituidas en presencia de HFIP al 10 % y TFE al 4,0, lo que indica que parte del GLP-1 habia precipitado. Sin embargo, a un pH mas bajo (2,0-3,0), la cantidad de peptido GLP-1 detectado en el control exento de microparticulas reconstituido en presencia de un 10 % de HFIP o tFe disminuyo significativamente. A pH 3,0, fue detectado el peptido GLP-1 de 0 a 0,02 mg/ml, (que corresponde a una relacion masica de 0 a 0,004), aunque no se detecto GLP-1 en las muestras de control a pH 2,0. Las relaciones masicas de las Figs. 3C-D reflejan el principio activo tanto adsorbido como precipitado, aunque la precipitacion es un componente menos importante a medida que el pH disminuye hacia 3,0.

Los datos indican que los alcoholes pueden mejorar la adsorcion del principio activo sobre las microparticulas de FDCP. Este aumento en la adsorcion probablemente dio como resultado una mejora en las interacciones hidrofobas entre el principio activo y la superficie de la microparticula en presencia de alcoholes.

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EJEMPLO 5

Efecto de la sal sobre la adsorcion del principio activo en particulas de FDCP

Para resolver adicionalmente el mecanismo hidrofobo de union, se observaron los efectos de la sal sobre la adsorcion del principio activo en microparticulas de FDCP mediante analisis por HPLC.

La carga del principio activo sobre las microparticulas de FDCP se realizo a 5 mg/ml de microparticulas y una concentracion de insulina de 0,75 mg/ml (15 % p/p), o una concentracion de GLP-1 de 0,25 mg/ml (5 % p/p) o una concentracion de PTH de 0,25 mg/ml (5 % p/p) en presencia de 0, 25, 50, 100, 250, y 500 mM de NaCl (FIG. 4A- 4C). La carga de la PTH en las particulas de FDCP tambien se evaluaron a NaCl 1000 nM. Se evaluo la cantidad del principio activo detectado en las muestras de control exentas de microparticulas reconstituidas en funcion del pH y la concentracion de NaCl. El pH se controlo con una mezcla de fosfato de potasio 20 mM /acetato de potasio 20 mM).

Tal como se observo en la FIG. 4A, la mayor union (adsorcion) de la insulina sobre las particulas de FDCP fue evidente a elevadas concentraciones de sal de 100-500 mM a un pH entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3,5. A un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0, para todas las concentraciones de sal sometidas a ensayo, se observo una reduccion en la adsorcion de la insulina a la particula de FDCP.

A un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,5 fue evidente una mejora en la union (adsorcion) de GLP-1 a las particulas de FDCP para todas las concentraciones de sal sometidas a ensayo (FIG. 48). A pH 4,0 y superior, tambien se observo una reduccion en la union.

Estudios similares realizados con PTH como principio activo mostraron una union potenciada de la PTH a las particulas de FDCP a elevadas concentraciones de sal de 250 a 1000 mM a un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,5 (FIG. 4C). A un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 5,0, la union de la PTH a la microparticula disminuyo en presencia de sal.

A pH bajo, donde la adsorcion no es favorable, la adicion de sal pudo modificar el potencial quimico del principio activo de forma que aumentara su afinidad por la superficie de la microparticula. Dicha mejora de la union probablemente fue resultado de un mecanismo hidrofobo. Adicionalmente, los datos indicaron que a medida que el pH aumentaba, disminuia la adsorcion con una mayor concentracion de sal. A medida que la superficie de la microparticula queda mas cargada con un pH creciente, se puede esperar que el mecanismo hidrofobo teorico sea menos eficaz para promover la adsorcion del principio activo. Esta reduccion puede ser tambien resultado de la competencia de la sal por los sitios de union sobre la superficie de la microparticula. Debe indicarse que el apantallamiento de Debye tambien puede contribuir a la disminucion de la adsorcion observada.

Los datos tambien muestran que la sal puede alterar la estructura de los principios activos. Por ejemplo, las mediciones de dicroismo circular con la PTH mostraron que, a medida que la concentracion de sal aumenta, la estructura secundaria del peptido adopta una conformacion mas helicoidal (FIG. 4D). Esto sugiere que el cambio en la estructura de la PTH puede promover su union a la superficie de la microparticula a pH bajo.

En solucion acuosa, tambien se mostro que la presencia de sal reparte el colorante Texas Red sobre la superficie de la microparticula.

EJEMPLO 6

Efectos de la adsorcion de ciclosporina A sobre particulas de FDCP

Los efectos sobre la adsorcion de las moleculas hidrofobas pequenas sobre las particulas de FDCP se investigo tanto in vitro como in vivo usando ciclosporina A como principio activo. La adsorcion se promovio alterando la solubilidad del principio activo.

La ciclosporina A, un polipeptido ciclico lipofilo, se estudio para mostrar como se puede fabricar una molecula hidrofoba para adsorberse en microparticulas. Ademas, el tamano de la ciclosporina A (PM 1202,61) se utilizo para demostrar las capacidades de carga de las de las microparticulas de compuestos mas pequenos.

Para realizar la carga, se utilizo un metodo de disolvente/antidisolvente. El principio basico de esta metodologia es disolver el compuesto en un disolvente (metanol) y despues usar un antidisolvente (agua) para sacar el compuesto de la solucion en direccion a la superficie de las microparticulas. El uso de esta solucion de disolvente/antidisolvente, la ciclosporina A se cargo satisfactoriamente sobre la superficie de las microparticulas.

En un experimento preliminar para determinar un perfil de solubilidad, se disolvio la ciclosporina A hasta 10 mg/ml en metanol y se analizo mediante HPLC su solubilidad a 1 mg/ml con concentraciones variables de antidisolvente (1090 % H2O en incrementos del 10 %). El area del pico de la ciclosporina A se comparo contra la muestra que contenia solamente metanol, para determinar la perdida porcentual debida a la precipitacion. Se observo que la

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solubilidad se retuvo en gran medida por debajo del 60 % de H2O. A un 70 % de H2O, una mayoria significativa del principio resulto ser insoluble y a un 80-90 % H2O permanecia menos del 5 % de solubilidad.

Para evaluar la carga de la particula, las microparticulas de FDCP se suspendieron en soluciones metanolicas de ciclosporina A. A continuacion se anadio agua de forma progresiva hasta una concentracion final de 60, 80, y 90 %. La mitad de la muestra se aglomero y la otra mitad se liofilizo. Despues, cada mitad se redisolvio de forma que los porcentajes finales fueron un 20 % de microparticulas de FDCP/ciclosporina A, 20 % de bromuro de amonio 0,5 M (AmBicarb), y 60 % de metanol (las concentraciones necesarias para la disolucion tanto de la microparticula como de la ciclosporina A). El contenido de ciclosporina A de cada una se analizo mediante HPLC y se comparo para determinar la proporcion que habia quedado adsorbida en la particula. Los resultados se presentan a un 60 % de H2O donde se observo que aproximadamente un 20 % de la ciclosporina A se habia unido a la particula. A 80 % y 90 % de H2O, las cargas fueron aproximadamente 90 % y 95 %, respectivamente, lo que indica la fuerte union de la ciclosporina A a las microparticulas de FDCP.

La capacidad de carga de las microparticulas para la ciclosporina A se analizo a un nivel de 90 % de antidisolvente variando la entrada de ciclosporina A de forma que el contenido final de los solidos recubiertos seria de 2 % a 20 %, suponiendo que toda la ciclosporina A quedase adsorbida. Se observo que, a media que la entrada aumentaba sobre este intervalo, el porcentaje de ciclosporina A disponible unida a la microparticula aumento de 50 % a 95 % de la entrada (FIG. 58). Debe resaltarse que, teniendo en cuenta que la solubilidad de la ciclosporina A es de 0,05 mg/ml a 90 % de H2O, estos resultados indican que practicamente toda la ciclosporina A insoluble quedo adsorbida en las particulas, en lugar de separarse por precipitacion.

EJEMPLO 7

Insuflacion pulmonar de particulas de ciclosporina A/DCP

Para examinar la farmacocinetica de la ciclosporina A/microparticulas de FDCP, se evaluaron las concentraciones plasmaticas de ciclosporina A en ratas Sprague Dawley hembra que recibieron varias formulaciones de ciclosporina A/microparticulas de FDCP mediante insuflacion pulmonar o inyeccion intravenosa. Estos estudios se realizaron usando ciclosporina A/microparticulas de FDCP fabricadas con un 90 % de antidisolvente y una relacion maxima teorica de 0,05, 0,10 o 0,20 como se ha descrito en el ejemplo anterior. Se denominan como cargas del 5 %, 10 % y 20 %.

Una unica dosis de 2,5 mg de ciclosporina A/microparticulas de FDCP se suministro a ocho grupos de ratas mediante insuflacion pulmonar o inyeccion intravenosa. Se extrajeron muestras de sangre el dia de la dosificacion de cada grupo con la predosis (tiempo 0), y a 5, 20, 40, 60, 240, 480 minutos y a 24 h despues de la dosis. En cada punto temporal, aproximadamente 100 pl de sangre completa se recogieron de la vena lateral de la cola en un criovial, invertido y almacenado sobre hielo. Las muestras de sangre se centrifugaron a 4000 rpm y aproximadamente 40 pl de plasma se pipetearon en placas de 96 pocillos que se almacenan a -80°C hasta su analisis.

Tal como se muestra en la Fig. 6, la administracion de 2,5 mg de microparticulas de FDCP/ciclosporina A mediante insuflacion pulmonar dio como resultado niveles maximos de ciclosporina en suero 24 horas despues de la dosis en ratas Sprague Dawley hembra. La carga del 10 % consiguio una Cmax. de 32,4 ng/ml en dicho punto temporal. Los animales que recibieron una administracion de 2,5 mg microparticulas de FDCP/ciclosporina A en 0,1 ml mediante inyeccion intravenosa mostraron niveles minimos de ciclosporina 24 horas despues de la dosis. Se observo que los niveles de microparticulas de FDCP alcanzaron un maximo 20 minutos despues de la dosis y volvio a los niveles iniciales en 4 horas para los grupos tanto de inyeccion intravenosa como de insuflacion pulmonar.

En su conjunto, los datos muestran la biodisponibilidad de la ciclosporina A/microparticula de FDCP. Se resalta que el unico pico a 240 minutos es una anomalia. Para todos los animales tratados, la patologia determinada a simple vista y mediante observacion microscopica fue normal.

Salvo que se indique de otra forma, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como el peso molecular, condiciones de reaccion, y otros que se usan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones estan previstos para modificarse en todos los casos por el termino "aproximadamente". De acuerdo con ello, a no ser que se indique lo contrario, los parametros numericos definidos en la siguiente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se desean obtener mediante la presente invencion. Como minimo, y no como intento de limitar la aplicacion de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico deberia considerarse al menos teniendo en cuenta el numero de cifras significativas notificadas y aplicando las tecnicas de redondeo usuales. Sin perjuicio de que los intervalos y parametros numericos que muestran el amplio alcance de la invencion sean aproximaciones, los valores numericos definidos en los ejemplos especificos se han notificado de forma tan precisa como ha sido posible. Cualquier valor numerico, sin embargo, contiene de forma inherente algunos errores que son necesariamente el resultado de la desviacion estandar que se encuentra en sus respectivas medidas de ensayo.

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Los terminos "un" y "uno" y "el" y los referentes similares utilizados en el contexto de la descripcion de la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben tomarse para incluir el singular y el plural, a no ser que se indique otra cosa en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Se pretende que la enumeracion de los intervalos de valores en el presente documento sirva como metodo abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra comprendido en el intervalo. Salvo que se indique de otra forma en el presente documento, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Todos los metodos descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado a no ser que se indique de otra manera en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Se pretende que el uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo "tal como") proporcionado en el presente documento sea meramente para discernir mejor la invencion y no plantee una limitacion en el alcance de la invencion por otra parte reivindicada. Ninguna redaccion de la memoria descriptiva debe tomarse como una indicacion de cualquier elemento no reivindicado esencial para la practica de la invencion.

El uso del termino "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a no ser que se indique de manera explicita para referirse solo a alternativas o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la divulgacion apoye una definicion que se refiera a unicamente a alternativas e “y/o.”

Las agrupaciones de elementos o realizaciones alternativas de la invencion descritas en el presente documento no deben tomarse como limitaciones. Cada miembro del grupo se puede denominar y reivindicar individualmente o en cualquier combinacion con otros miembros del grupo u otros elementos que se encuentran en el presente documento. Se anticipa que uno o mas miembros de un grupo pueden incluirse, o eliminarse de, un grupo por motivos de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produce cualquiera de dichas inclusiones o eliminaciones, se considera que la memoria descriptiva del presente documento contiene el grupo tal como se ha modificado cumpliendo de esta manera la descripcion escrita de todos los grupos de Markush utilizados en las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se describen realizaciones preferidas de la presente invencion, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores de llevar a cabo la invencion. Por supuesto, seran evidentes para las personas normalmente expertas en la tecnica variaciones de dichas realizaciones preferidas tras la lectura de la descripcion anterior. El inventor espera que los tecnicos expertos empleen dichas variaciones cuando sea adecuado, y los inventores pretenden que la invencion se lleve a la practica de formas diferentes a las descritas en el presente documento. De acuerdo con ello, la presente invencion incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia sujeto enumeradas en las reivindicaciones adjuntas a esta segun permita la legislacion aplicable. Ademas, cualquier combinacion de los elementos anteriormente descritos en todas sus posibles variaciones queda abarcada por la invencion a no ser que se indique de otra forma en el presente documento o se contradiga claramente de otra manera por el contexto.

Adicionalmente, se han realizado numerosas referencias a patentes y publicaciones impresas en la totalidad de esta memoria descriptiva. Cada una de las referencias citadas y publicaciones impresas se incorporan individualmente en el presente documento por referencia en su totalidad.

Ademas, debe entenderse que las realizaciones de la invencion descritas en el presente documento son ilustrativas de los principios de la presente invencion.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para promover la union de un principio activo a una particula microcristalina preformada en suspension, comprendiendo la microparticula una dicetopiperazina, comprendiendo el metodo las etapas de:

   i) modificar el potencial quimico del principio activo con un modificador del principio activo en donde dicha modificacion permite una interaccion energeticamente favorable entre el principio activo y la microparticula independiente de la eliminacion del disolvente; y

   ii) adsorber el principio activo sobre la superficie de la microparticula.
2. 2. El metodo de reivindicacion 1, en el que la modificacion del potencial quimico comprende modificar la estructura, la flexibilidad, la rigidez, la solubilidad o la estabilidad del principio activo.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la modificacion del potencial quimico del principio activo comprende alterar las condiciones de disolucion.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que alterar las condiciones de disolucion comprende anadir un modificador del principio activo a la solucion.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el modificador del principio activo se selecciona entre el grupo que consiste en sales, tensioactivos, iones, osmolitos, alcoholes, caotropos, cosmotropos, acido, base y disolventes organicos.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que dicha sal es cloruro sodico.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1 que comprende ademas una etapa de disolver el principio activo en una fase fluida de la suspension de microparticulas y cambiar el pH de la fase fluida.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el pH se cambia antes de anadir el principio activo.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el pH se cambia despues de anadir el principio activo.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el modificador del principio activo mejora la estabilidad estructural o la farmacodinamica del principio activo.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el principio activo es una proteina, un peptido, un polipeptido, una molecula pequena o una molecula de acido nucleico.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que el principio activo se selecciona entre el grupo que consiste en insulina, grelina, hormona del crecimiento y hormona paratiroidea (PTH).
13. 13. El metodo de la reivindicacion 11, en el que el principio activo comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 11, en el que la molecula pequena es una molecula hidrofoba.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 14 en el que la molecula pequena es ciclosporina A.
16. 16. El metodo de la reivindicacion 11, en el que la molecula pequena es una molecula ionizable.
17. 17. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la modificacion del potencial quimico del principio activo comprende modular una o mas interacciones energeticamente favorables con la superficie de la microparticula.
18. 18. El metodo de la reivindicacion 17, en el que la una o mas interacciones energeticamente favorables entre el principio activo y la microparticula comprenden una interaccion electrostatica.
19. 19. El metodo de la reivindicacion 17, en el que la una o mas interacciones energeticamente favorables entre el principio activo y la microparticula comprenden una interaccion hidrofoba.
20. 20. El metodo de la reivindicacion 17 en el que la una o mas interacciones energeticamente favorables entre el principio activo y la microparticula comprenden una interaccion de enlace de hidrogeno.
21. 21. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que la dicetopiperazina es fumaril dicetopiperazina.
22. 22. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, que comprende ademas una etapa para eliminar el disolvente.

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23. 23. Un proceso para preparar una composicion de administracion de farmaco que comprende un principio activo y una microparticula cristalina, que comprende las etapas de:

    proporcionar una solucion de principio activo que comprende una molecula de principio activo;

    modificar el potencial quimico del principio activo con un modificador del principio activo en donde dicha

    modificacion permite una interaccion energeticamente favorable entre el principio activo y la microparticula

    independiente de la eliminacion del disolvente, que promueve la union del principio activo a la microparticula;

    proporcionar una microparticula en suspension o polvo, en donde la microparticula comprende una

    dicetopiperazina;

    combinar dicha solucion de principio activo con dichos suspension o polvo de microparticula; y adsorber el principio activo sobre la superficie de la microparticula.
24. 24. El proceso de la reivindicacion 23, en el que la modificacion del potencial quimico del principio activo comprende anadir un modificador del principio activo a la solucion.
25. 25. El proceso de la reivindicacion 24, en el que el modificador del principio activo se selecciona entre el grupo que consiste en sales, tensioactivos, iones, osmolitos, alcoholes, caotropos, cosmotropos, acido, base y disolventes organicos.
26. 26. El proceso de la reivindicacion 25, en el que el modificador del principio activo disminuye la solubilidad de la molecula de principio activo.
27. 27. El proceso de la reivindicacion 25, en el que el modificador del principio activo mejora la estabilidad estructural de la molecula de principio activo.
28. 28. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que la dicetopiperazina es fumaril dicetopiperazina.
29. 29. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en el que el principio activo o la molecula de principio activo son insulina o un analogo de insulina.
30. 30. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el principio activo es insulina o un analogo de insulina y en donde el metodo comprende las etapas de:

    (i) obtener una microparticula cristalina de dicetopiperazina en donde la microparticula cristalina de dicetopiperazina comprende fumaril dicetopiperazina;

    (ii) formar una suspension que comprende la microparticula cristalina de dicetopiperazina y un disolvente acuoso;

    (iii) disolver la insulina o el analogo de insulina en la fase fluida de la suspension;

    (iv) aumentar el pH de la fase fluida a entre 4,0 y 5,0;

    (v) adsorber la insulina o el analogo de insulina sobre una superficie de la microparticula de dicetopiperazina para proporcionar un recubrimiento de la insulina o del analogo de insulina sobre la microparticula cristalina de dicetopiperazina; y

    (vi) eliminar o intercambiar el disolvente tras la etapa (v).