BRPI0615819A2 - método de formulação de fármaco baseado no aumento da afinidade de agentes ativos para superfìcies de micropartìculas cristalinas - Google Patents

Abstract

MéTODO DE FORMULAçãO DE FáRMACO BASEADO NO AUMENTO DA AFINIDADE DE AGENTES ATIVOS PARA SUPERFìCIES DE MICROPARTìCULAS CRISTALINAS. Métodos são fornecidos para promover a adsorção de um agente ativo em miicropartículas pela modificação das propriedades estruturais do agente ativo, com o intuito de facilitar associação favorável à micropartícula.

Description

"MÉTODO DE FORMULAÇÃO DE FÁRMACO BASEADO NOAUMENTO DA AFINIDADE DE AGENTES ATIVOS PARA SUPERFÍCIES DEMICROPARTÍCULAS CRISTALINAS"

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica o beneficio sob 35U.S.C. §119(e) para o pedido provisório norte-americano No.de série 60/717.524, depositado em 14 de setembro de 2005 epedido provisório norte-americano No. de série 60/744.882,depositado em 14 de abril de 2006, o conteúdo completo dosquais está, por meio disso, incorporado pela referência emsua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a formulações de fármacose está, particularmente, relacionada a métodos. Mais especi-ficamente, a ligação e adsorção de agentes ativos na super-fície de micropartículas cristalinas são reveladas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A distribuição de agentes terapêuticos tem sido umgrande problema. A administração oral é uma das mais comunse preferidas rotas de distribuição devido à facilidade deadministração, à complacência do paciente, e ao custo redu-zido. No entanto, as desvantagens dessa rota incluem adsor-ção ineficiente e potência baixa ou variável do terapêutico.Isto se torna particularmente evidente quando o composto aser distribuído é instável sob condições encontradas no tra-to gastrintestinal. Uma variedade de métodos de encapsulaçãoe revestimentos vêm sendo desenvolvidos na técnica, mas ape-nas poucos são eficazes na tentativa de solucionar esse pro-blema. Existem, ainda, compostos terapêuticos que tendem sermenos ativos nas condições do trato gastrintestinal e devemser administrados em dosagens mais elevadas, para serem ad-sorvidos na corrente sangüínea em uma quantidade eficaz.

Uma ampla variedade de sistemas de formulação defármacos vem sendo desenvolvida para tentar solucionar oproblema da distribuição de fármacos ideal e baseiam-se naincorporação do fármaco em uma matriz que funciona como umveículo. Os fatores considerados na formulação de fármacosincluem exigências de que o sistema seja não-tóxico e não-reativo com o fármaco a ser distribuído, econômico na produ-ção, formado com componentes prontamente disponíveis e, con-sistente com relação à composição final e às característicasfísicas, incluindo estabilidade e taxa de liberação. É pre-ferível, também, que o sistema de distribuição de fármacoseja formado com materiais facilmente removíveis do corpopor processos fisiológicos normais.

Os avanços na tecnologia de micropartículas têmajudado no desenvolvimento de formulações de fármacos melho-radas. No entanto, apesar desses avanços, existe, ainda, umacarência na técnica de formulações de fármacos estáveis comeficácia de longo período e adsorção ideal, quando adminis-tradas como um farmacêutico, particularmente, através demeios pulmonares. Uma tentativa para solucionar essa defici-ência é focar nas características/propriedades do agente a-tivo que possam promover sua adsorção na superfície da mi-cropartícula e diminuir sua tendência em permanecer em solu-ção .SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São fornecidos métodos para ligar, revestir ou ad-sorver um agente ativo em uma superfície de micropartículacristalina. Em geral, as micropartículas são revestidas comum agente ativo pela modificação do sistema compreendendo asmicropartículas e o agente ativo dissolvido, de tal formaque o agente ativo tenha uma afinidade maior com a superfí-cie da micropartícula do que em permanecer em solução. Emparticular, a presente invenção procura promover, ainda, aadsorção de um agente ativo na superfície da micropartículapela modificação/utilização das propriedades do agente ativosob um número de condições em solução.

Assim, na presente invenção, é fornecido um métodopara promover a ligação de um agente ativo a uma micropartí-cuia cristalina pré-formada em suspensão, compreendendo asetapas de: i) modificação do potencial químico do agente a-tivo, onde a modificação permite uma interação energetica-mente favorável entre o agente ativo e a micropartícula, in-dependente da remoção do solvente; e ii) adsorção do agenteativo na superfície da micropartícula.

Em modalidades particulares da presente invenção,a modificação do potencial químico compreende modificar aestrutura, a flexibilidade, a rigidez, a solubilidade ou aestabilidade do agente ativo, individualmente ou em combina-ção. A modificação do potencial químico do agente ativo com-preende alterar as condições de solução. A alteração dascondições de solução compreende adicionar um modificador deagente ativo à solução.Em modalidades particulares, o modificador de a-gente ativo é selecionado do grupo consistindo em sais, ten-soativos, ions, osmólitos, álcoois, caotrópicos, cosmotrópi-cos, ácidos, bases e solventes orgânicos. Em uma modalidade,o sal é o cloreto de sódio.

Ainda em outra modalidade da presente invenção, ométodo compreende, ainda, a etapa de dissolução do agenteativo em uma fase fluida de uma suspensão de microparticulase alteração do pH da fase fluida. Em um aspecto, a etapa dedissolução do agente ativo em uma fase fluida refere-se àdissolução de um sólido. Em outro aspecto, a etapa de disso-lução do agente ativo refere-se à adição de uma solução con-centrada do agente ativo.

Em outra modalidade da presente invenção, o modi-ficador de agente ativo melhora a estabilidade estrutural doagente ativo.

Ainda em outra modalidade da presente invenção, oagente ativo é uma proteína, um peptídeo, um polipeptídeo,uma molécula pequena ou uma molécula de ácido nucléico. Emoutra modalidade da presente invenção, o agente ativo é se-lecionado do grupo consistindo em insulina, grelina, hormô-nio do crescimento e hormônio da paratireóide (PTH). O agen-te ativo pode compreender um anticorpo ou fragmento de anti-corpo. Em vários aspectos da invenção, o anticorpo pode re-conhecer um antígeno associado a doenças, incluindo, semrestrições, um antígeno associado a tumor ou um antígeno re-lacionado a patógeno infeccioso.

Ainda em outra modalidade da presente invenção, amolécula pequena é uma molécula ionizável ou uma moléculahidrófoba, tal como, mas não limitada a, ciclosporina A.

Em outra modalidade da presente invenção, a modi-ficação do potencial químico do agente ativo compreende mo-dular uma ou mais interações energeticamente favoráveis taiscomo, mas não limitadas a, interações eletrostáticas, inte-rações hidrófobas, e/ou interações de ligação de hidrogênioentre o agente ativo e a superfície da micropartícula. Emuma modalidade, a micropartícula compreende uma dicetopipe-razina tal como, mas não limitada a, fumaril dicetopiperazi-na.

Ainda em outra modalidade da presente invenção, ométodo compreende, ainda, uma etapa de remoção ou troca dosolvente. Solvente, como referido aqui, refere-se a um meiofluido, no qual o agente ativo e a micropartícula são "ba-nhados". Não deve ser interpretado que sejam necessários to-dos os componentes presentes em solução. Na verdade, em vá-rias circunstâncias, isto pode ser usado como referência pa-ra o meio líquido, no qual as micropartículas estão suspen-sas.

Em outra modalidade da presente invenção, é forne-cido um processo para preparar uma composição de distribui-ção de fármaco, compreendendo um agente ativo e uma micro-partícula cristalina, compreendendo as etapas de: forneci-mento de uma solução de agente ativo compreendendo uma molé-cula do agente ativo; modificação do potencial químico doagente ativo; fornecimento de uma micropartícula em uma sus-pensão ou em pó; e combinação da solução de agente ativo coma suspensão ou pó de micropartícula. 0 pó pode ser, por e-xemplo, filtrado, mas não seco.

Em outra modalidade da presente invenção, o pro-cesso de modificação do potencial químico do agente ativopermite a interação entre o agente ativo e uma micropartícu-la. Em uma modalidade, a modificação do potencial químico doagente ativo compreende adicionar um modificador de agenteativo à solução. Tal modificador de agente ativo pode serselecionado do grupo consistindo em sais, tensoativos, íons,osmólitos, álcoois, caotrópicos, cosmotrópicos, ácido, basee solventes orgânicos. Ainda em outra modalidade, o modifi-cador diminui a solubilidade da molécula do agente ativo,promove associação entre o agente ativo e uma micropartícu-la, tal como uma partícula de dicetopiperazina, e/ou aumentaa estabilidade estrutural da molécula do agente ativo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos a seguir fazem parte do presente rela-tório e estão incluídos para demonstrar adicionalmente de-terminados aspectos dos exemplos descritos aqui. A invençãopode ser mais bem compreendida pela referência a um ou maisdestes desenhos em combinação com a descrição detalhada dasmodalidades específicas presentes aqui.

As FIGs. 1A-1C apresentam os efeitos de caotrópi-cos e cosmotrópicos em curvas de carga para agentes ativosem micropartículas de fumaril dicetopiperazina (FDKP) comouma função de pH e 100 mM de agente cosmotrópico/caotrópico,de acordo com os ensinamentos da presente invenção. A FIG.IA apresenta a carga de 0,75 mg/mL de insulina em 5 mg/mL demicroparticulas de FDKP na presença de caotrópicos e cosmo-trópicos em pH 3,0-5,0. A FIG. IB apresenta a carga de 0,25mg/mL de peptídeo 1 do tipo glucagon (GLP-I) em 5 mg/mL demicroparticulas de FDKP na presença de caotrópicos e cosmo-trópicos em pH 2,0-4,0. A FIG. IC apresenta a carga de 0,25mg/mL de hormônio da paratireóide (PTH) em 5 mg/mL de micro-particulas de FDKP na presença de caotrópicos fortes, NaSCNe NaClO4, entre pH 4,0-5,0.

As FIGs. 2A-2C apresentam os efeitos de osmólitosnas curvas de carga para agentes ativos em microparticulasde FDKP como uma função de pH e osmólitos (100 mM), de acor-do com os ensinamentos da presente invenção. A FIG. 2A apre-senta a carga de 0,75 mg/mL de insulina em 5 mg/mL de micro-particulas de FDKP na presença de osmólitos em pH 3,0-5,0. AFIG. 2B apresenta a carga de 0,25 mg/mL de GLP-I em 5 mg/mLde microparticulas de FDKP na presença de osmólitos entre pH2,0-4,0. A FIG. 2C apresenta a carga de 0,10 mg/mL de peptí-deo grelina em 5 mg/mL de microparticulas de FDKP na presen-ça de osmólitos fortes em pH 4,0-5,0.

As FIGs. 3A-3D apresentam os efeitos de álcoois emcurvas de carga para agentes ativos em microparticulas deFDKP como uma função de pH e álcoois, de acordo com os ensi-namentos da presente invenção. A FIG. 3A apresenta a cargade 0,10 mg/mL de grelina em 5 mg/mL de microparticulas deFDKP na presença de hexafluorisopropanol (HFIP) a 5%, 10%,15% e 20% v/v entre pH 2,0-4,0. A FIG. 3B apresenta a cargade 0,10 mg/mL de grelina em 5 mg/mL de microparticulas deFDKP na presença de trifluoretanol (TFE) a 5%, 10%, 15% e20% v/v entre ρΗ 2,0-4,0. As FIGs. 3C e 3D apresentam a car-ga de 0,25 mg/mL de GLP-I em 5 mg/mL de micropartículas deFDKP em pH 2,0-5,0 na presença de HFIP e TFE, respectivamen-te.

As FIG. 4A-4D apresentam os efeitos do sal nascurvas de carga para agentes ativos em micropartículas deFDKP como uma função de pH e concentração de NaCl, de acordocom os ensinamentos da presente invenção. A FIG. 4A apresen-ta a carga de 0,75 mg/mL de insulina em 5 mg/mL de micropar-tículas de FDKP na presença de 0-500 mM de NaCl em pH 2,0-5,0. A FIG. 4B apresenta a carga de 0,25 mg/mL de GLP-I em 5mg/mL de micropartículas de FDKP na presença de 0-500 mM deNaCl em pH 2,0-5,0. A FIG. 4C apresenta a carga de 0,25mg/mL de peptídeo PTH em 5 mg/mL de micropartículas de FDKPna presença de 0-1000 mM de NaCl em pH 2,0-5,0. A FIG. 4Dapresenta a análise estrutural secundária de PTH em váriasconcentrações de sal (20°C). A far-UV CD de 4,3 mg/mL de PTHem pH 5,8 demonstra que à medida em que a concentração deNaCl aumenta, a estrutura secundária do peptídeo adota umaconformação mais helicoidal.

As FIGs. 5A-5B apresentam a adsorção de moléculashidrófobas em micropartículas, de acordo com os ensinamentosda presente invenção. A FIG. 5A apresenta a ligação de ci-closporina A a micropartículas de FDKP com anti-solvente (á-gua) em concentrações de 60%, 80% e 90%. A FIG. 5B apresentaa porcentagem de carga máxima teórica alcançada para ciclos-porina A em relações mássicas variáveis de ciclosporinaA/micropartículas de FDKP na presença de 90% de anti-solvente.

A FIG. 6 apresenta a farmacocinética da única in-jeção intravenosa (IV) e insuflação pulmonar (IS) em ratosusando várias relações mássicas de ciclosporinaA/microparticulas de FDKP a 90% de anti-solvente, de acordocom os ensinamentos da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

São descritos aqui métodos úteis para estabilizaragentes ativos farmacêuticos em combinação com microparticu-las cristalinas. As composições resultantes fornecem agentesativos estáveis, revestidos sobre as superfícies das micro-partículas cristalinas.

A substância a ser revestida ou adsorvida sobre amicropartícula cristalina é referida aqui como agente ativo.Exemplos de classes de agentes ativos incluem composiçõesfarmacêuticas, compostos sintéticos e macromoléculas orgâni-cas que tem utilidade terapêutica, profilática, e/ou diag-nostica .

Geralmente, a maioria dos agentes ativos pode serrevestida ou adsorvida sobre a superfície da micropartículacristalina incluindo, mas não limitados a, macromoléculasorgânicas, ácidos nucléicos, compostos orgânicos sintéticos,polipeptídeos, peptídeos, proteínas, polissacarídeos e ou-tros açúcares, e lipídeos. Os peptídeos, proteínas e poli-peptídeos são cadeias de aminoácidos unidas por ligações depeptídeos. Os peptídeos são geralmente considerados comosendo menos do que 30 resíduos aminoácidos, mas podem inclu-ir mais. As proteínas são polímeros que podem conter mais de30 resíduos de aminoácidos. O termo polipeptideo, como co-nhecido na técnica e usado aqui, pode referir-se a um peptí-deo, uma proteína, ou qualquer outra cadeia de aminoácidosde qualquer comprimento contendo múltiplas ligações de pep-tídeos, embora contenham geralmente pelo menos 10 aminoáci-dos. Os agentes ativos usados na formulação de revestimentopodem pertencer a uma variedade de classes de atividade bio-lógica, tais como agentes vasoativos, agentes neuroativos,hormônios, anticoagulantes, agentes imunomoduladores, agen-tes citotóxicos, antibióticos, antivirais, antígenos e anti-corpos .

Exemplos de agentes ativos que podem ser emprega-dos na presente invenção incluem, de uma maneira não Iimi-tante: hormônio do crescimento, anticorpos e fragmentos domesmo, alcinos, ciclosporinas (por exemplo ciclosporina A) ,PPACK (D-fenilalanil-L-prolil-L-arginina clorometil cetona),CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína), Texas Red,clopidogrel, fator estimulante de colônias de granulócitos emacrófagos (GM-CSF) , peptídeo 1 do tipo glucagon (GLP-I),grelina, hormônio da paratireóide (PTH), insulina e análogosde insulina (por exemplo insulina asparte e insulina) e an-ticorpos e fragmentos dos mesmos, incluindo, mas não limita-dos a: anticorpos humanizados ou quiméricos; F(ab), F(ab)2,ou anticorpo de cadeia simples só ou fundido com outros po-lipeptídeos; anticorpos monoclonais diagnósticos ou terapêu-ticos para antígenos de câncer, citocinas, agentes infeccio-sos, mediadores inflamatórios, hormônios, e antígenos de su-perfície celular. Exemplos não limitantes de anticorpos paraantígenos do tumor incluem anti-SSX-241-49 (sarcoma sinovi-al, X breakpoint 2) anti-NY-ESO-1 (antígeno associado ao tu-mor esofágico), anti-PRAME (antígeno preferencialmente ex-presso de melanoma) , anti-PSMA (antígeno de membrana dapróstata específico) , anti-Melan-A (antígeno associado aotumor melanoma), anti-tirosinase (antígeno associado ao tu-mor melanoma) e anti-MOPC-21 (proteína celular plasmática domieloma).

Micropartícuias

Essencialmente, o termo "micropartículas" refere-se a uma partícula com o diâmetro de cerca de 0,5-1000 ym,independente da exata estrutura interior ou exterior. Dentroda ampla categoria de micropartícuias, as "microesferas" re-ferem-se a micropartículas com forma esférica uniforme. Asmicropartículas cristalinas, como referidas aqui, referem-sea micropartículas que têm a estrutura interna, embora nãonecessariamente a forma externa, de um cristal e têm um ar-ranjo regular de átomos em uma estrutura espacial. As super-fícies cristalinas ionizáveis referem-se a micropartículascristalinas que têm a capacidade adicional de conduzir umacarga elétrica. Em algumas modalidades, a micropartícula po-de ser um único cristal regularmente modelado. Em várias mo-dalidades preferidas, a micropartícula é irregularmente mo-delada, é porosa, tem superfícies internas acessíveis a a-gentes ativos dissolvidos, ou compreendem cristais múlti-plos, em qualquer combinação. Tais características, em ge-ral, aumentarão a área superficial, aumentando, conseqüente-mente, a capacidade de carga. Tais características podemtambém contribuir com propriedades aerodinâmicas vantajosas,importantes se o agente ativo for distribuído pela inalaçãode um pó seco compreendendo as microparticulas.

Preferivelmente, a substância química que compõe amicropartícula cristalina é reversivelmente reativa com oagente ativo a ser distribuído, não-tóxica, bem como não-metabolizada por roedores e humanos. Apesar do dito anteri-ormente, alguns níveis de toxicidade são toleráveis, depen-dendo, por exemplo, da severidade da condição a ser tratadaou da quantidade de substância a qual o paciente está expos-to. Similarmente, não é necessário que a substância sejacompletamente inerte metabolicamente. Ademais, a estruturacristalina de microparticulas preferidas não é substancial-mente rompida no processo de revestimento ou ligação com oagente ativo. A composição da micropartícula cristalina de-termina quais os tipos de interações químicas podem ser ma-nipuladas para levar à adsorção de um agente ativo na super-fície da micropartícula.

Uma variedade de substâncias pode ser usada paraformar microparticulas cristalinas. Microparticulas, comotais, apresentam superfícies, as propriedades das quais po-dem ser manipuladas no processo de revestimento, conformerevelado no pedido de patente co-pendente U.S.

(Attorney Do.cket No. 51300-00025) , depositado no mesmo diado presente pedido, e o pedido provisório norte-americanoNo. 60/717.524 depositado em 14 de setembro de 2005, cadaqual incorporado aqui pela referência em sua totalidade. Osmateriais representativos, a partir dos quais as micropartí-cuias podem ser formadas, incluem, mas não se limitam a, a-minoácidos aromáticos ou compostos com solubilidade limitadaem uma faixa de pH definida, tais como dicetopiperazinas esulfatos de morfolina.

Um exemplo particular de microparticulas, comoconsideradas na presente invenção, são as microparticulas dedicetopiperazinas (DKP). Como discutido aqui, as microparti-culas de DKP são empregadas para facilitar a adsorção do a-gente ativo. As patentes US 5.352.461 e US 5.503.802, cadaqual incorporada aqui pela referência em sua totalidade,descrevem um sistema de distribuição de fármaco baseado naformação de microparticulas de dicetopiperazina (DKP) a par-tir de derivados de dicetopiperazina, tais como 3,6-bis[iV-fumaril-N-(n-butil)amino] (também conhecido como fumaril di-cetopiperazina ou FDKP; também referido como (E)-3,6-bis [4-(N-carbóxi-2-propenil)amidobutil]-2, 5-dicetopiperazina) quesão estáveis em pH baixo e dissolvem-se no pH do sangue oudo intestino delgado. Um sistema baseado em elementos estru-turais de dicetopiperazina ou um de seus derivados de subs-tituição, incluindo, mas não limitados a, dicetomorfolinas edicetodioxanos, forma microparticulas com faixas de pH edistribuições de tamanho desejáveis, bem como com uma boatolerância de carga. Uma ampla série de características re-produzíveis, estáveis pode ser gerada com manipulações apro-priadas dos grupos substituintes. Essas patentes descrevem aprecipitação da DKP na presença do agente ativo para formarmicroparticulas compreendendo o agente ativo. Detalhes adi-cionais com relação à síntese, precipitação e uso das dice-topiperazinas estão descritos nas patentes US 6.071.497;6.331.318; 6.428.771 e publicações das patentes norte-americanas Nos. 20060040953 e 20060041133, cada qual incor-porada aqui por referência em sua totalidade. As composiçõescompreendendo dicetopiperazina estão descritas na patente US6.991.779 e na publicação da patente norte-americana No.20040038865, cada qual incorporada por referência em sua to-talidade .

Outras dicetopiperazinas consideradas na presenteinvenção incluem 3,6-di(4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina;3,6-di(succinil-4-aminobutil)-2, 5-dicetopiperazina (succinildicetopiperazina ou SDKP); 3,6-di(maleil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(citraconil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(glutaril-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3, 6-di(malonil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina; 3,6-di(oxalil-4-aminobutil)-2,5-dicetopiperazina, e derivados dos mesmos. Os sais de diceto-piperazinas também podem ser usados na presente invenção epodem incluir, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitá-20 vel, tal como Na, K, Li, Mg, Ca, amônio, ou mono-, di-, outri-alquilamônio (como derivados de trietilamina, butilami-na, dietanolamina, trietanolamina ou piridinas, e semelhan-tes) . O sal pode ser um sal mono, di ou misto. Sais de ordemmais elevada também são considerados para dicetopiperazinas, nos quais os grupos R contêm mais de um grupo ácido. Em ou-tros aspectos da invenção, uma forma básica do agente podeser misturada com dicetopiperazina para formar uma ligaçãode sal entre o fármaco e a dicetopiperazina, de tal formaque o fármaco seja um contra-cátion da dicetopiperazina. Ossais de DKP para distribuição de fármacos estão descritos deforma mais detalhada na publicação da patente norte-americana No. 20060040953, a qual está incorporada aqui pelareferência em sua totalidade.

As patentes US 6.444.226 e 6.652.885, cada qualincorporada aqui por referência em sua totalidade, descrevema preparação e o fornecimento de microparticulas de DKP emsuspensão aquosa, à qual uma solução de agente ativo é adi-cionada, e, então, a etapa critica de liofilização da sus-pensão para produzir microparticulas com um revestimento deagente ativo. A base para esta formulação é que o revesti-mento de microparticula com agente ativo é levado pela remo-ção do meio liquido através da liofilização (vide também apatente US 6.440.463, a qual está incorporada aqui pela re-ferência em sua totalidade). Em contraste aos ensinamentosdo estado da técnica, a presente invenção fornece um meiopara ajustar a associação do agente ativo à microparticulaantes da remoção do solvente. Assim, a remoção do meio Ii-quido por métodos físicos bulk (por exemplo filtração e se-dimentação) ou métodos evaporativos (por exemplo liofiliza-ção e secagem por pulverização) podem resultar em compará-veis cargas.

Promovendo a Adsorção de Agentes Ativos

O agente ativo que é adsorvido na superfície deuma microparticula cristalina pode envolver a alteração daspropriedades do agente ativo em uma solução ou suspensãofluida sob várias condições de solução, promovendo, assim, aadsorção na superfície da microparticula e reduzindo a quan-tidade de agente ativo remanescente em solução. Alteraçõesou modificações no agente ativo podem ocorrer com o uso demodificadores, tais como, mas não limitados a, caotrópicos ecosmotrópicos, sais e orgânicos, tais como, mas não limita-dos a, álcoois, osmólitos e tensoativos. Esses modificadorespodem agir no agente ativo para alterar seu potencial quími-co e, desta forma, sua estrutura, flexibilidade, rigidez ouestabilidade, sem alterar quimicamente o agente por si pró-prio. 0 termo "potencial químico" é bem conhecido por umtécnico no assunto. Em modalidades da presente invenção,"potencial químico" refere-se à energia livre necessária pa-ra conduzir uma reação química, tal como, por exemplo, a in-teração entre um agente ativo e um solvente ou a adsorção doagente ativo em uma microparticula. 0 termo "energeticamentefavorável", como usado aqui, refere-se à diminuição dos ní-veis de energia livre dos estados absorvidos do agente ativona microparticula em relação ao nível de energia livre demicroparticula não revestida, ou agente ativo não ligadoe/ou às formas insolúveis (incluindo agregação ou precipita-ção) do agente ativo. 0 termo "estrutura", como usado aqui,refere-se à estrutura secundária da molécula do agente ativoe inclui a formação alfa-helicoidal, folhas beta, ou espiralaleatória (desordenada) da molécula do agente ativo, tal co-mo uma proteína. Adicionalmente, o termo estrutura pode in-cluir também estruturas terciárias e quaternárias da molécu-la, mas não está limitada a tais e pode referir-se também àauto-associação, agregação, multimerização, dimerização, esemelhantes, de uma molécula. 0 termo "estabilidade", comousado aqui, refere-se à estabilização ou desestabilização daestrutura do agente ativo na presença do modificador.

Além disso, a alteração das propriedades do agenteativo em uma solução ou suspensão fluida afeta possivelmenteas interações devido às propriedades hidrófobas, proprieda-des de ligação de hidrogênio e propriedades eletrostáticasdo agente ativo e/ou microparticula.

As interações hidrófobas são associações de gruposnão-polares entre si em soluções aquosas devido à sua inso-lubilidade em água. As interações hidrófobas podem afetarvários processos moleculares incluindo, mas não limitados a,estabilização estrutural (de moléculas simples, complexos deduas ou três moléculas, ou conjuntos maiores) e dinâmica, erealiza contribuições importantes em processos de ligaçãoligante-proteina e proteina-proteina. Essas interações sãotambém conhecidas por desempenharem um papel em eventos pre-coces de dobramento de proteínas, e estão envolvidas em fe-nômenos de montagem de complexos e automontagem (por exem-pio, formação de membranas).

As interações de ligação de hidrogênio são forçasdipolo-dipolo especialmente fortes entre moléculas; um átomode hidrogênio em uma ligação polar (por exemplo, H-F, H-O ouH-N) pode experimentar uma força atrativa com uma moléculaou íon eletronegativo da vizinhança que possui um par de e-létrons não-compartilhado (tipicamente um átomo de F, 0 ou Nem outra molécula). As ligações de hidrogênio são responsá-veis pelas propriedades únicas da água e são muito importan-tes na organização de moléculas biológicas, especialmente nainfluência de estrutura das proteínas e DNA.

As interações eletrostáticas são atrações entrecargas opostas ou repulsões entre cargas semelhantes quecrescem conforme as cargas se aproximam umas das outras. Asinterações eletrostáticas constituem um componente-chave noentendimento das interações entre corpos carregados em solu-ções iônicas. Por exemplo, a estabilidade de partículas co-loidais, dispersas em um solvente, pode ser explicada levan-do em consideração a competição entre interações eletrostá-ticas repulsivas e as interações de van der Waals atrativas.

As interações eletrostáticas também têm importância ao Ie-var-se em conta a interação e a adesão entre partículas.

Sais

Em algumas modalidades da presente invenção, aspropriedades do agente ativo são alteradas usando um sal,tal como, mas não limitado a, cloreto de sódio. Os agentesativos, por exemplo, PTH e GLP-If são submetidos a mudançasestruturais notáveis na presença de sal. Conforme mostradono Exemplo 5 (FIG. 4D), a presença de sal aumenta a estrutu-ra secundária do PTH através da promoção de uma conformaçãomais helicoidal do peptídeo. O sal também mostrou afetar aestrutura do GLP-I, conforme descrito no pedido de patentenorte-americano sob No. de série 60/744,882, depositado em14 de abril de 2006 e incorporado aqui pela referência emsua totalidade. Além disso, sais e outros compostos iônicossão capazes de estabilizar ou desestabilizar proteínas epeptídeos, especialmente quando a diferença entre o pH dasolução e ο pi da proteína ou peptideo aumenta pela ligaçãoa resíduos especificamente carregados (Antosiewiez J, etal., J. Mol. Biol. 238:415-436, 1994).

Caotrópicos

Os caotrópicos, como conhecidos no estado da téc-nica, são íons que apresentam fracas interações com a águae, portanto, desestabilizam moléculas, como proteínas e pep-tídeos. Esses compostos quebram a rede de ligação de hidro-gênio da água e diminuem sua tensão superficial, promovendo,assim, liberdade mais estrutural e a desnaturação de proteí-nas e peptídeos. Exemplos de caotrópicos incluem, mas nãoestão limitados a, NaSCN, (CH3)3N-HCL, Na2NO3, e NaClO4 ecloreto de césio (CsCl).

Os cosmotrópicos ou liotrópicos, por outro lado,são íons que apresentam fortes interações com a água e, ge-ralmente, estabilizam macromoléculas, tais como proteínas epeptídeos. Esse efeito de estabilização é ocasionado peloaumento da ordem da água e pelo aumento de sua tensão super-ficial. Exemplos de cosmotrópicos incluem, mas não estão Ii-mitados a, citrato de sódio (Citrato Na) e sulfato de sódio(Na2S04).

Álcoois

Outra classe de modificador de agente ativo utili-zada na presente invenção trata-se de álcoois. Os álcooissão capazes de romper a estrutura nativa de proteínas e pep-tídeos e também são capazes de estabilizar e induzir confor-mações α-helicoidais em macromoléculas, mais notavelmentedentro de proteínas e polipeptídeos desestruturados. Taisálcoois podem incluir, mas não estão limitados a, metanol(MeOH), etanol (EtOH), trifluoretanol (TFE) e hexafluoriso-propanol (HFIP). Dentre esses, o TFE e o HFIP são os álcooismais potentes para induzir transições helicoidais em peptí-deos e proteínas (Hirota et al., Protein Sci., 6:416-421;1997, incorporado aqui pela referência a todo seu conteúdocom relação a transições helicoidais em peptídeos e proteí-nas). Esses álcoois podem afetar a estrutura das proteínas edos peptídeos pela sua habilidade em romper as propriedadesde ligação de hidrogênio do solvente (vide Eggers e Valenti-ne, Protein Sci., 10:250-261; 2001, incorporado aqui pelareferência a todo seu conteúdo com relação aos efeitos dosálcoois sobre a estrutura das proteínas).

Osmólitos

Outra classe de modificadores que afeta a afinida-de do agente ativo com a micropartícuia trata-se de osmóli-tos. Os osmólitos, como conhecido por um técnico no assunto,são compostos pequenos que são produzidos pelas células dequase todos os organismos sob situações de estresse elevado(tais como flutuações extremas de temperatura, ambientes e-levados de sal, etc.) para estabilizar suas macromoléculas.Eles não interagem diretamente com a macromolécula, mas agemalterando as propriedades do solvente no meio celular e, as-sim, sua presença modifica indiretamente a estabilidade dasproteínas. Esses compostos incluem vários polióis, açúcares,polissacarídeos, solvente orgânicos, e vários aminoácidos eseus derivados. Embora o mecanismo dos osmólitos não estejaainda bem elucidado, especula-se que esses compostos agempossivelmente através do aumento do potencial químico estadodesnaturado relativo ao estado nativo, aumentando, portanto,a (positiva) diferença de energia de Gibbs (AG) entre con-juntos desnaturados e nativos (Arakawa e Timasheff, Bioche-mistry 29:1914-1923; 1990).

Os osmólitos, considerados na presente invenção,incluem, de maneira não limitante, hexileno-glicol (Hex-Gli), trealose, glicina, poli(etileno glicol) (PEG), N-óxidode trimetilamina (TMAO), manitol e prolina.

Descrição Geral do Método

Nos métodos da presente invenção, pelo menos trêscomponentes são combinados em um meio líquido: pelo menos umagente ativo, micropartícuias (pré-formadas) e pelo menos ummodificador de agente ativo, conforme descrito anteriormen-te. Os componentes desse sistema podem ser combinados emqualquer ordem. Em algumas modalidades, o modificador e oagente ativo são combinados entre si, antes da mistura sercombinada com uma suspensão de micropartículas. Em outrasmodalidades, o agente ativo e as micropartículas são primei-ramente combinados e, em seguida, o modificador é adiciona-do. Em algumas modalidades, o agente ativo, ou o modifica-dor, é fornecido e combinado com outro componente, ou compo-nentes, como uma solução. Em outras modalidades, quaisquerdentre os componentes podem ser fornecidos em forma sólida edissolvidos, ou, no caso das micropartículas, suspensos nomeio líquido contendo outro dentre os componentes. Variaçõesadicionais são aparentes para um técnico no assunto.

As micropartículas são formadas antes de seremcombinadas com os outros componentes do sistema, e, comotal, estão presentes como uma suspensão. Apesar disso, omeio liquido, no qual as microparticulas estão suspensas, é,algumas vezes, referido aqui como um solvente. 0 meio liqui-do utilizado no método é quase sempre aquoso. No entanto, emalguns casos, o meio liquido pode compreender mais de umcomposto orgânico, por exemplo, um álcool usado como um mo-dificador, than it does water.

Após a montagem de todos os componentes do siste-ma, o agente ativo será adsorvido na superfície da micropar-ticula. Em modalidades reforçadamente preferidas da presenteinvenção, pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95%, ou substanci-almente todo o agente ativo no sistema será adsorvido nasmicroparticulas, até 100%. Em algumas modalidades da presen-te invenção, a área superficial acessível das microparticu-las será suficiente para todo o agente ativo adsorvido estarem contato direto com a superfície da micropartícula, istoé, o revestimento é uma monocamada. No entanto, deve ser en-tendido que interações adicionais podem estar presentes. Emalguns casos, por exemplo, a auto-associação do agente ativopode ser também energeticamente favorecida, de forma quemúltiplas camadas do agente ativo revistam a partícula. Nãoé necessário que quaisquer dessas camadas estejam completasou que a espessura do revestimento seja uniforme. Duas for-mas de auto-associação podem ser reconhecidas: multimeriza-ção e agregação. A multimerização é caracterizada por inte-rações intermoleculares específicas e estequiometria fixa. Aagregação é caracterizada por interações intermolecularesnão-especificas e estequiometria indefinida. Deve ser enten-dido que agentes ativos multiméricos podem ser adsorvidos noestado multimérico, ou dissociados em monômeros, ou multíme-ros de ordem mais baixa, e adsorvidos na superfície nesseestado. Em qualquer caso, a agregação pode mediar a formaçãode camadas do agente ativo na microparticula.

As micropartículas carregadas constituem uma com-posição de distribuição de fármaco que pode ser utilizada emuma variedade de formas. As partículas podem ser usadas comopós, em formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos oucontidas em cápsulas, ou suspensas em um veículo líquido.Geralmente, isso irá requerer troca e/ou remoção do meio lí-quido, no qual a carga está presente. Isso pode ser realiza-do por qualquer dentre uma variedade de meios incluindo mé-todos físicos, tais como, mas não limitados a, sedimentaçãoe filtração, e métodos evaporativos, tais como, mas não li-mitados a, liofilização ou secagem por pulverização. Essastécnicas são conhecidas por técnicos no assunto. Em uma mo-dalidade da presente invenção, o solvente é removido atravésda secagem por pulverização. Métodos de secagem por pulveri-zação de micropartículas de dicetopiperazina estão descri-tos, por exemplo, no pedido de patente provisório norte-americano No. 60/776.605, depositado em 22 de fevereiro de2006, incorporado aqui por referência para todo seu conteúdorelacionado à secagem por pulverização de micropartículas dedicetopiperazina.

Se a carga não estiver substancialmente completa,modalidades da invenção, ao usar-se métodos físicos para re-moção de solvente irá ocorrer, tipicamente, uma perda do a-gente ativo não-adsorvido, mas pode, por exemplo, ser útilpara assegurar que o revestimento não irá progredir além deuma monocamanda. Contrariamente, modalidades usando secagemevaporativa para remoção de solvente pode, em alguns casos,depositar mais agente ativo na partícula, evitando, assim,sua perda, mas as interações de adsorção envolvidas podemdiferir daquelas estabelecidas pelas ligações de moléculasnas etapas precedentes do método. Em outras modalidades, aremoção evaporativa do solvente não resulta em deposiçõesadicionais significativas de agente ativo, incluindo o casoem que substancialmente todo o agente ativo já tenha sidoadsorvido na partícula.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir estão incluídos para demons-trar modalidades preferidas da presente invenção. Deve serapreciado por técnicos no assunto que as técnicas, descritasnos exemplos que seguem, representam técnicas descobertaspelo inventor para funcionarem bem na prática da invenção,e, assim, podem ser consideradas por constituírem modos pre-feridos para sua prática. Enquanto a discussão foca em ummecanismo particular, deve ser entendido que alguns modifi-cadores podem apresentar efeitos múltiplos sobre o agenteativo, ou, de fato, na superfície da partícula, cada qualpodendo contribuir para promover a adsorção do agente ativona partícula. No entanto, técnicos no assunto, levando emconta a presente invenção, irão apreciar que várias modifi-cações podem ser feitas nas modalidades específicas que es-tão descritas e, ainda assim, um resultado similar ou pare-cido será obtido sem fugir ao principio e escopo da inven-ção .

EXEMPLO 1

Procedimento Experimental: Estudos de Adsorção deAgente Ativo/Micropartícula de FDKP

Os agente ativos insulina, PTH, grelina e GLP-Iforam comprados da American Peptide (Sunnyvale, CA) ou AnaS-pec (San Jose, CA) , ou foram preparados em casa (MannKindCorporation, Valencia, CA). Amostras aquosas em pH variáveise a 20°C (a menos que observado de outra maneira) foram ana-lisadas. As amostras foram, em geral, preparadas na hora eforam misturadas com o aditivo particular (por exemplo sal,tampão de pH, etc., se qualquer) antes da adição das micro-partículas de FDKP.

A associação do agente ativo a partículas de dice-topiperazina (DKP) em suspensão foi avaliada pela conduçãode estudos de adsorção. Os parâmetros investigados nos estu-dos de adsorção exploraram os efeitos das interações ele-trostáticas, ligação de hidrogênio, estrutura da água, fle-xibilidade da proteína e interações de pareamento de saisespecíficas na interação agente ativo/micropartícula de fu-maril dicetopiperazina (FDKP) . Além disso, uma série de es-tabilizadores de proteínas comuns foi testada pela interfe-rência na adsorção do agente ativo em superfícies de micro-partículas de FDKP.

Várias condições de promoção da adsorção do agenteativo nas superfícies de partículas de FDKP pré-formadas fo-ram estudadas. Uma suspensão de micropartículas de FDKP de15 mg/mL foi combinada com 3X de tampão de pH e 3X de solu-ção de um aditivo ou excipiente. A solução final continhauma concentração de micropartículas de FDKP de 5 mg/mL e umaconcentração de GLP-I de 0,25 mg/mL (5% p/p), ou uma concen-tração de PTH de 0,25 mg/mL (5% p/p), ou uma concentração deinsulina de 0,75 mg/mL (15% p/p) ou uma concentração de gre-lina de 0,10 mg/mL (2% p/p). O agente ativo não-ligado nosobrenadante foi removido da suspensão por filtração. Aspartículas de FDKP com o agente ativo associado foram dis-solvidos (reconstituídos) em 100 mM de bicarbonato de amô-nio, e filtrado para separar (dividir) quaisquer moléculasde agente ativo agregadas.

EXEMPLO 2

Efeito de Caotrópicos e Cosmotrópicos na Adsorçãode Agente Ativo em Partículas de FDKP

As espécies iônicas que afetam a estrutura da águae proteínas (caotrópicos e cosmotrópicos) foram estudadaspara investigar a adsorção de agente ativo em uma superfíciede micropartícula de FDKP por um mecanismo hidrófobo (em pHbaixo) . A carga de agente ativo em partículas de FDKP foirealizada em 5 mg/mL de micropartículas e uma concentraçãode GLP-I de 0,25 mg/mL (5% p/p), ou uma concentração de 0,25mg/mL de PTH (5% p/p) , ou uma concentração de insulina de0,75 mg/mL (15% p/p). A concentração do caotrópico ou cosmo-trópico nas amostras foi mantida constante a 100 mM e o pHfoi variado de 2,0 a 5,0. Os caotrópicos ou cosmotrópicosforam selecionados dentre os seguintes: NaSCN, CsCl, Na2SO4,(CH3) 3N-HC1, Na2NO3, Citrato Na e NaClO4. 0 controle indicaque nenhum caotrópico ou cosmotrópico foi adicionado.

As FIGs. 1A-1C apresentam, respectivamente, ascurvas de carga para insulina, GLP-I e PTH na superfície damicropartícula de FDKP como uma função de pH na presença devários caotrópicos ou cosmotrópicos. Em pH baixo (3,0), to-dos os caotrópicos e cosmotrópicos analisados melhoraram aafinidade da insulina com a superfície da micropartícula emostraram uma carga significativa comparada com o controle.Em pH 4, esse efeito não foi observado (FIG. IA). Em pH maiselevado (5,0), os caotrópicos e cosmotrópicos interferiramna adsorção de insulina na superfície da micropartícula,comparada com o controle, pela precipitação da proteína in-sulina. Desta forma, esses agentes promoveram a ligação dainsulina às partículas de FDKP em pH mais baixo, mas possuemum efeito mínimo ou detrimental em condições de pH mais ele-vado .

0 GLP-1, na presença de caotrópicos e cosmotrópi-cos, apresentou uma afinidade melhorada com micropartículasde FDKP em pH 2,0-4,0 com um efeito maior em pH mais baixo(FIG. 1B) . Observações similares foram reveladas no pedidoprovisório norte-americano No. de série 60/744.882. Neste,observou-se que aproximadamente 0,02-0,04 mg/mL do peptídeoGLP-I (que corresponde a relações mássicas de 0,004 a 0,008)foi detectado nas amostras de controle livre de micropartí-culas reconstituídas na presença de NaSCN, NaClO4, Na2SO4,Na2NO3 e Citrato Na, indicando que uma pequena proporção doGLP-I precipitou de modo preferível a ser adsorvida na par-ticula.

A afinidade de PTH com a superfície da micropartí-cula de FDKP foi maior em pH de 4,0 a cerca de 4,5 na pre-sença dos caotrópicos fortes NaSCN e NaClO4 (FIG. 1C) .

Os dados sustentam que os agentes caotrópicos ecosmotrópicos desempenham um papel importante na promoção daadsorção do agente ativo em superfícies de micropartícuiasde FDKP, mais notavelmente em pH baixo. Uma vez que essesmodificadores possuem um efeito maior em pH baixo, onde asuperfície da micropartícula é menos iônica, é mais provávelque a adsorção resulte de um mecanismo hidrófobo. A diminui-ção da adsorção observada em pH mais elevado pode resultarda superfície mais carregada da partícula em combinação comos efeitos que os agentes caotrópicos e cosmotrópicos possu-em de aumentar a hidrofobicidade dos agentes ativos. Ade-mais, como espécies iônicas, esses agentes podem competircom o agente ativo na ligação com a micropartícula, ou rom-per as interações eletrostáticas entre o agente ativo e amicropartícula. Finalmente, observa-se também que a blinda-gem de Debye pode contribuir para a diminuição da adsorçãoem superfícies mais carregadas.

EXEMPLO 3

Efeito de Osmólitos na Adsorção de Agente Ativo emPartículas de FDKP

Para avaliar a importância da estabilidade do a-gente ativo na adsorção, o efeito de osmólitos nas ligaçõesdo agente ativo a partículas de FDKP foi examinado por aná-lise HPLC. As FIG. 2A-2C mostram as curvas de carga para in-sulina (FIG. 2A) , GLP-I (FIG. 2B) e grelina (FIG. 2C) empartículas de FDKP como uma função de pH na presença de es-tabilizadores comuns (osmólitos). A carga do agente ativo emmicropartículas de FDKP foi realizada a 5 mg/mL de micropar-tículas e uma concentração de insulina de 0,75 mg/mL (15%p/p), ou uma concentração de GLP-I de 0,25 mg/mL (5% p/p) ouuma concentração de grelina de 0,10 mg/mL (2% p/p) . A con-centração do osmólito (estabilizador) nas amostras foi man-tida constante em 100 mM e o pH variou de cerca de 2,0 acerca de 5,0. Os osmólitos foram selecionados a partir dehexileno-glicol (Hex-Gli), trealose, glicina, PEG, TMAO, ma-nitol e prolina; o controle indica nenhum osmólito.

Dentre os agentes ativos estudados, a insulinamostrou uma afinidade significativamente melhorada com a su-perfície da partícula de FDKP na presença de osmólitos (PEG,glicina, trealose, manitol e Hex-Gli) em uma faixa de pH de3,0 a 5,0 (FIG. 2A). Dentre os osmólitos estudados, PEG e aprolina melhoraram a afinidade para a adsorção de GLP-I nasuperfície da partícula de FDKP numa faixa de pH de 2,0 a4,0. 0 osmólito TMAO foi mais eficaz que o PEG ou a prolinana ligação de GLP-I à superfície da micropartícula de FDKPem pH baixo (2,0), porém foi modestamente mais detrimentalem pH 3,0 e acima (FiG. 2B). A grelina, no entanto, mostrouuma maior afinidade com a superfície da micropartícula napresença de 100 mM de manitol, PEG, glicina, Hex-Gli e trea-lose, quando comparada com o controle numa faixa de pH decerca de 4,0 a 5,0 (FIG. 2C).

Essas curvas de carga sugeriram que os osmólitossão capazes de aumentar a adsorção do agente ativo na super-fície da microparticula de FDKP. É provável que esse efeitoresulte da habilidade dos modificadores em estabilizar o a-gente ativo, o que possibilitou uma adsorção mais energeti-camente favorável.

EXEMPLO 4

Efeito de Álcoois na Afinidade do Agente Ativo comPartículas de FDKP

Ao avaliar o efeito de modificadores sobre o agen-te ativo que permite a adsorção na superfície da microparti-cula por um mecanismo hidrófobo, o efeito dos álcoois foiexaminado. Os álcoois, conhecidos por induzirem uma confor-mação helicoidal em peptídeos e proteínas desestruturadospelo aumento da força de ligação de hidrogênio, foram avali-ados para determinar o papel que a conformação helicoidaldesempenha na adsorção do agente ativo na superfície da par-tícula de FDKP. Os agentes ativos, tais como, GLP-I e greli-na, foram analisados. A carga do agente ativo em partículasde FDKP foi realizada a 5 mg/mL de micropartí cuias e umaconcentração de GLP-I de 0,25 mg/mL (5% p/p) ou uma concen-tração de grelina de 0,10 mg/mL (2% p/p) . 0 efeito de cadaálcool foi observado numa faixa de pH de 2,0 a 5,0. Os álco-ois usados foram trifluoretanol (TFE) e hexafluorisopropanol(HFIP). Cada álcool foi avaliado em concentrações variáveisque incluem 5%, 10%, 15% ou 20% v/v.

As FIG. 3A-3D mostram as curvas de carga para oagente ativo em micropartículas de FDKP como uma função depH para cada álcool e cada agente ativo. Em pH 2,0-4,0, agrelina apresentou uma afinidade extremamente melhorada coma superfície da microparticula na presença de HFIP e TFE emtodas as concentrações testadas (5%, 10%, 15% e 20%) , comodemonstrado pela razão mássica de grelina para partículas deFDKP (FIGs. 3A-3B).

Em pH 2,0-5,0, o GLP-I apresentou uma afinidademelhorada com a superfície da microparticula na presença deHFIP e TFE nas concentrações mostradas (5% e 10%) (FIG. 3C-3D) . O efeito do TFE foi menos acentuado, e, em pHs maisbaixos testados, foi detrimental. Foi observado que umaquantidade substancial do peptídeo GLP-I (0,13-0,19 mg/mL,que corresponde a relações mássicas de 0,026 a 0,038) foidetectada nas amostras de controle livres de micropartículasreconstituídas na presença de 10% de HFIP e TFE em pH 4,0,indicando que parte do GLP-I havia precipitado. No entanto,em pH baixo (2,0-3,0), a quantidade de peptídeo GLP-I detec-tado no controle livre de micropartículas reconstituídas napresença de 10% de HFIP e TFE foi significativamente diminu-ída. Em pH 3,0, o peptídeo GLP-I a 0-0,02 mg/mL (que corres-ponde a uma razão mássica de 0 a 0, 004) foi detectado, aopasso que nenhum GLP-I foi detectado nas amostras de contro-le em pH 2,0. As relações mássicas nas FIGs. 3C-3D refletemambos agente ativo precipitado e adsorvido, embora a preci-pitação se torne um componente reforçadamente muito menor àmedida que o pH diminui para 3,0.

Os dados indicam que os álcoois são capazes de me-lhorar a adsorção do agente ativo em micropartículas deFDKP. 0 aumento na adsorção resultou, provavelmente, de in-terações hidrófobas intensificadas entre o agente ativo e asuperfície da microparticula na presença de álcoois.

EXEMPLO 5

Efeito do Sal na Adsorção do Agente Ativo em Par-tículas de FDKP

Para tentar entender o mecanismo hidrófobo de li-gação, os efeitos do sal na adsorção do agente ativo em mi-cropartículas de FDKP foram observados através da análiseHPLC.

A carga do agente ativo em microparticulas de FDKPfoi realizada a 5 mg/mL de micropartículas e uma concentra-ção de insulina de 0,75 mg/mL (15% p/p), ou uma concentraçãode GLP-I de 0,25 mg/mL (5% p/p) ou uma concentração de PTHde 0,25 mg/mL (5% p/p) na presença de 0, 25, 50, 100, 250 e500 mM de NaCl (FIGs. 4A-4C) . A carga de PTH em partículasde FDKP também foi avaliada em 1000 mM de NaCl. A quantidadede agente ativo detectado nas amostras de controle livres demicropartículas reconstituídas, como uma função de pH e con-centração de NaCl, foi avaliada. O pH foi controlado com umamistura de 20 mM de fosfato de potássio/20 mM de acetato depotássio.

Conforme observado na FIG. 4A, a ligação (adsor-ção) aumentada da insulina a partículas de FDKP estava evi-dente em altas concentrações de sal de 100-500 mM em pH decerca de 2,5 a cerca de 3,5. Em um pH entre cerca de 4,0 ecerca de 5,0, para todas as concentrações de sal testadas,uma redução na adsorção de insulina na partícula de FDKP foiobservada.Em um pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,5, a ligação(adsorção) aumentada de GLP-I a partículas de FDKP estavaevidente para todas as concentrações de sal testadas (FIG.4B) . Em pH 4,0 e acima, a redução da ligação também foi ob-servada .

Estudos similares usando PTH como agente ativomostraram uma ligação aumentada de PTH a partículas de FDKPem concentrações elevadas de sal de 250 a 1000 mM em pH decerca de 2,0 a cerca de 3,5 (FIG. 4C). Em pH de cerca de 3,5a cerca de 5,0, a ligação de PTH à micropartícuia diminuiuna presença do sal.

Em pH baixo, onde a adsorção não é favorável, aadição de sal foi capaz de modificar o potencial químico doagente ativo, de modo a aumentar sua afinidade com a super-fície da micropartícula. Tal melhora de ligação resultou,provavelmente, do mecanismo hidrófobo. Além disso, os dadosindicam que, à medida que o pH foi aumentando, a adsorçãodiminuiu com a concentração de sal aumentada. À medida que asuperfície da micropartícula tornou-se mais carregada aumen-tando o pH, o mecanismo hidrófobo hipotético pode ser espe-rado como sendo menos eficaz na promoção da adsorção do a-gente ativo. Essa redução pode ter resultado também da com-petição do sal pelos sítios de ligação na superfície da mi-cropartícula. Foi observado que a blindagem de Debye podeter contribuído também para a adsorção reduzida observada.

Os dados mostraram também que o sal é capaz de al-terar a estrutura dos agentes ativos. Por exemplo, medidasde dicroísmo circular com PTH mostraram que, à medida que aconcentração de sal aumentou, a estrutura secundária do pep-tídeo adotou uma conformação mais helicoidal (FIG. 4D). Issosugere que uma mudança na estrutura do PTH pode promover sualigação à superfície da micropartícuia em pH baixo.

Em uma solução aquosa, a presença do sal tambémfoi mostrada para dividir o corante Texas Red na superfícieda micropartícula.

EXEMPLO 6

Efeitos na Adsorção de Ciclosporina A em Partícu-las de FDKP

Os efeitos na adsorção de moléculas pequenas hi-drófobas em partículas de FDKP foram investigados tanto invitro, quanto in vivo, usando ciclosporina A como o agenteativo. A adsorção foi promovida pela alteração da solubili-dade do agente ativo.

A ciclosporina A, um polipeptídeo cíclico lipofí-lico, foi estudada com o intuito de mostrar como uma molécu-la pode ser adsorvida em micropartículas. Ademais, o tamanhoda ciclosporina A (1202,61 MW) foi utilizado para demonstraras capacidades de carga das micropartículas para compostosmenores.

Para realizar a carga, um método solvente/anti-solvente foi utilizado. 0 princípio básico dessa metodologiaé dissolver o composto em um solvente (metanol) e, em segui-da, usar um anti-solvente (água) para conduzir o compostopara fora da solução e para a superfície das micropartícu-las. Utilizando esse método solvente/anti-solvente, a ci-closporina A foi carregada com êxito na superfície das mi-cropartículas.

Em um experimento preliminar para determinar umperfil de solubilidade, a ciclosporina A foi dissolvida a 10mg/mL em metanol e sua solubilidade a 1 mg/mL com concentra-ções variáveis de anti-solvente (10-90% de H2O em 10% de in-crementos) foi analisada por HPLC. As áreas de pico da ci-closporina A foram comparadas com a amostra contendo apenasmetanol para determinar a porcentagem de perda para precipi-tação. Foi observado que a solubilidade foi, em alto grau,retida abaixo de 60% de H2O. Em 70% de H2O, uma significati-va maior parte de agente estava insolúvel e em 80-90% de H2Omenos de 5% de solubilidade remanescente.

Para avaliar a carga da particula, naicropartículasde FDKP foram suspensas em soluções de metanol de ciclospo-rina A. Água foi, então, adicionada em uma etapa particularpara concentrações finais de 60, 80 e 90%. Metade da amostrafoi pelotizada e a outra metade foi liofilizada. Cada metadefoi, então, redissolvida, de tal forma que as porcentagensfinais foram de 20% de microparticulas de FDKP/ciclosporinaA, 20% de 0,5 M de bicarbonato de amônio (AmBicard) e 60% demetanol (as concentrações necessárias para a dissolução deambas microparticula e ciclosporina A) . O teor de ciclospo-rina A de cada foi analisada por HPLC e comparada para de-terminar a proporção que foi adsorvida na particula. Os re-sultados estão presentes na FIG. 5A. Em 60% de H2O foi ob-servado que 20% da ciclosporina A havia se ligado a particu-la. Em 80% e 90% de H2O, as cargas eram de cerca de 90% e95%, respectivamente, indicando a forte ligação da ciclospo-rina A às micropartícuias de FDKP.

A capacidade de carga das micropartículas para ci-closporina A foi analisada no nivel de 90% de anti-solventepela variação da carga de entrada da ciclosporina A, de modoque o teor final dos sólidos recuperados fosse de 2% a 20%,assumindo que toda a ciclosporina A tivesse sido adsorvida.Foi observado que, à medida que a carga de entrada aumentousobre essa faixa, a porcentagem de ciclosporina A disponí-vel, ligada à micropartícula aumentou de 50% a 95% da cargade entrada (FIG. 5B) . Deve ser notado, levando-se em contaque a solubilidade da ciclosporina A é de 0,05 mg/mL em 90%de água, que esses resultados indicaram que substancialmentetoda a ciclosporina A insolúvel foi adsorvida nas partículasde modo preferível a precipitação.

EXEMPLO 7

Insuflação Pulmonar de Ciclosporina A/Partículasde FDKP

Para examinar a farmacocinética de ciclosporinaA/micropartículas de FDKP, concentrações plasmáticas de ci-closporina A foram avaliadas em fêmeas de ratos Sprague Da-wley administrando várias formulações de ciclosporinaA/micropartículas de FDKP via insuflação pulmonar ou injeçãointravenosa. Esses estudos foram conduzidos usando ciclospo-rina A/micropartículas de FDKP preparadas em 90% de anti-solvente e uma razão mássica máxima teórica de 0,05; 0,10 ou0,20; conforme descrito no exemplo acima. Essas são referi-das como as cargas de 5%, 10% e 20%.

Uma dose única de 2,5 mg de ciclosporinaA/micropartícuias de FDKP foi distribuída para oito gruposde ratos via insuflação pulmonar ou injeção intravenosa. A-mostras de sangue foram tiradas no dia da dosagem para cadagrupo na pré-dosagem (0 mg) , e 5, 20, 40, 60, 240, 480 minu-tos e 24 horas pós-dosagem. A cada instante de tempo, apro-ximadamente 100 μΐί de sangue total foram coletados da veialateral da cauda em um criovial, invertido e congelado. Asamostras de sangue foram centrifugadas a 4000 rpm e aproxi-madamente 40 pL foram pipetados em 96 placas com cavidades,as quais foram armazenadas a -80°C até que fossem analisadas.

Conforme mostrado na FIG. 6, a administração de2,5 mg de micropartícuias de FDKP/ciclosporina A via insu-flação pulmonar resultou em níveis máximos de ciclosporinano soro, 24 horas pós-dosagem, nas fêmeas de ratos SpragueDawley. A carga de 10% alcançou uma Cmax de 32,4 ng/mL na-quele instante de tempo. Animais administrados com 2,5 mg demicropartículas de FDKP/ciclosporina A em 0,1 mL via injeçãointravenosa mostrou níveis mínimos de ciclosporina fora 24horas pós-dosagem. Foi observado que os níveis de micropar-tículas de FDKP atingiram um pico em 20 minutos pós-dosagem,e retornaram aos níveis da linha de base em 4 horas para am-bos os grupos insuflação pulmonar e injeção intravenosa.

Como um todo, os dados mostram a biodisponibilida-de de ciclosporina A/micropartícula de FDKP. Foi observadoque o único pico em 240 minutos trata-se de uma anomalia.Para todos os animais testados, a patologia, conforme deter-minada por observação geral e microscópica, estava normal.

A menos que indicado de outra forma, todos os nú-meros indicando quantidades de ingredientes, propriedadescomo peso molecular, condições de reação, e etc. usados norelatório descritivo e nas reivindicações devem ser inter-pretados como sendo modificados a todo instante pelo termo"cerca de". Conseqüentemente, a menos que indicado de outramaneira, os parâmetros numéricos estabelecidos no relatórioe nas reivindicações em anexo são aproximações que podem va-riar, dependendo das propriedades desejadas visadas de modoa serem obtidas pela presente invenção. Não menos que e pro-vavelmente muito mais, e não como uma tentativa de limitar opedido da doutrina de equivalentes do escopo das reivindica-ções, cada parâmetro numérico deve ser ao menos interpretadoconsiderando o número de dígitos significativos reportados epela aplicação de técnicas de arredondamento usuais. Apesardas faixas e parâmetros numéricos que estabelecem o amploescopo da invenção serem aproximações, os valores numéricosestabelecidos nos exemplos específicos estão tão precisamen-te reportados, quanto possível. Qualquer valor numérico, noentanto, contém inerentemente determinados erros, resultandoessencialmente de desvios padrões encontrados em suas res-pectivas medições de teste.

Os termos "um" e "uma" e "o/a" e referências simi-lares usadas no contexto da descrição da invenção (especial-mente no contexto das reivindicações que seguem) são paraserem entendidas abrangendo ambos singular e plural, a menosque indicado aqui de outra forma ou claramente contraditopelo contexto. A citação, aqui, de faixas de valores é pre-tendida meramente como um método simples e rápido de refe-rir-se a cada valor em separado dentro da faixa. A menos queindicado aqui de outra maneira, cada valor individual estáincorporado no relatório descritivo como se ele estivesseindividualmente citado aqui. Todos os métodos descritos po-dem ser realizados em qualquer ordem desejada, a menos queindicado aqui de outra forma ou claramente contradito pelocontexto. 0 uso de quaisquer ou todos os exemplos, ou lin-guagens exemplares (por exemplo "tal como"), fornecidos aquié pretendido meramente para tornar mais clara a invenção enão causar uma limitação no escopo da invenção, a menos queindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve serinterpretada como indicativo de qualquer elemento essencialnão-reivindicado pela prática da invenção.

O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado co-mo significado para "e/ou", a menos que claramente indicadopara referir-se a alternativas apenas ou as alternativas se-rem mutuamente exclusivas; embora a descrição suporte umadefinição que se refere a apenas alternativas e "e/ou".

Os grupamentos de elementos alternativos ou moda-lidades da invenção, descritos aqui, não devem ser entendi-dos como limitações. Cada membro do grupo deve referir-se ae reivindicado individualmente ou em qualquer combinação comoutros membros do grupo ou outros elementos encontrados a-qui. Antecipa-se que um ou mais membros de um grupo podemestar incluídos em, ou retirados de, um grupo por razões deconveniência e/ou de patenteabilidade. Quando qualquer in-clusão ou retirada ocorre, o relatório é aqui consideradocontendo o grupo conforme modificado, fornecendo, assim, adescrição por escrito de todos os grupos da fórmula Markushusados nas reivindicações em anexo.

Modalidades preferidas dessa invenção são descri-tas aqui, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventorespara realizar a invenção. Certamente, variações nessas moda-lidades preferidas se tornarão evidentes para técnicos noassunto, ao lerem a descrição acima. O inventor conta comtécnicos no assunto para empregar tais variações como apro-priadas, e os inventores pretendem que a invenção seja postaem prática de outra maneira que especificamente descrita a-qui. Conseqüentemente, a invenção inclui todas as modifica-ções e equivalentes da matéria descrita nas reivindicaçõesem anexo, como permitido pela lei aplicável. Ademais, qual-quer combinação dos elementos supramencionados em todas aspossíveis variações dos mesmos está contida na presente in-venção, a menos que indicado aqui de outra maneira ou clara-mente contradito pelo contexto.

Além disso, inúmeras referências foram feitas apatentes e publicações impressas ao longo desse relatóriodescritivo. Cada uma das referências e publicações impres-sas, citadas acima, estão individualmente incorporadas aquipela referência em sua totalidade.

Ademais, deve ser entendido que as modalidades dainvenção descritas aqui são ilustrativos dos princípios dapresente invenção. Outras modificações que possam ser empre-gadas fazem parte do escopo da invenção. Assim, como meioexemplificativo, porém não limitante, configurações alterna-tivas da presente invenção podem ser utilizadas em conformi-dade com os ensinamentos desta. Conseqüentemente, a presenteinvenção não está precisamente limitada ao que está apresen-tado e descrito.

Claims (32)

1. Método para promover a ligação de um agente a-tivo a uma microparticula cristalina pré-formada em suspen-são, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:i) modificação do potencial químico do agenteativo, onde a referida modificação permite uma interação e-nergeticamente favorável entre o agente ativo e a micropar-ticula, independente da remoção do solvente; eii) adsorção do agente ativo na superfície damicroparticula.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,·CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação do potencialquímico compreende modificar a estrutura, flexibilidade, ri-gidez, solubilidade ou estabilidade do agente ativo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação do potencialquímico do agente ativo compreende alterar as condições desolução.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a alteração das condições desolução compreende adicionar um modificador de agente ativoà solução.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o modificador de agente ativoé selecionado do grupo consistindo em sais, tensoativos, í-ons, osmólitos, álcoois, caotrópicos, cosmotrópicos, ácido,base e solventes orgânicos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sal é cloreto desódio.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa dedissolução do agente ativo em uma fase fluida da suspensãode microparticulas e alteração do pH da fase fluida.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o pH é alterado antes da adi-ção do agente ativo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o pH é alterado logo após aadição do agente ativo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que o modificador de agente ativomelhora a estabilidade estrutural ou a farmacodinâmica doagente ativo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ativo é uma proteí-na, um peptídeo, um polipeptideo, uma molécula pequena ouuma molécula de ácido nucléico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ativo é selecionadodo grupo consistindo em insulina, grelina, hormônio do cres-cimento e hormônio da paratireóide (PTH).

13. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente ativo compreende umanticorpo ou fragmento de anticorpo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula pequena é uma mo-lécula hidrófoba.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula pequena é ciclos-porina A.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula pequena é uma mo-lécula ionizável.

17. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação do potencialquímico do agente ativo compreende modular uma ou mais inte-rações energeticamente favoráveis com a superfície da micro-partícula.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais interações e-nergeticamente favoráveis entre o agente ativo e a micropar-tícula compreende uma interação eletrostática.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais interações e-nergeticamente favoráveis entre o agente ativo e a micropar-tícula compreende uma interação hidrófoba.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais interações e-nergeticamente favoráveis entre o agente ativo e a micropar-tícula compreende uma interação de ligação de hidrogênio.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a micropartícula compreendeuma dicetopiperazina.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que a dicetopiperazina é fumarildicetopiperazina.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma etapa deremoção do solvente.

24. Processo para preparar uma composição de dis-tribuição de fármaco, compreendendo um agente ativo e umamicroparticula cristalina, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende as etapas de:fornecimento de uma solução de agente ativocompreendendo uma molécula do agente ativo;modificação do potencial químico do agenteativo;fornecimento de uma microparticula em umasuspensão ou em pó; ecombinação da referida solução de agente ati-vo com a referida suspensão ou pó de microparticula.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação do potencialquímico do agente ativo permite a interação entre o agenteativo e a microparticula.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação do potencialquímico do agente ativo compreende adicionar um modificadorde agente ativo à solução.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26,CARACTERIZADO pelo fato de que o modificador de agente ativoé selecionado do grupo consistindo em sais, tensoativos, í-ons, osmólitos, álcoois, caotrópicos, cosmotrópicos, ácido,base e solventes orgânicos.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o modificador de agente ativodiminui a solubilidade da molécula do agente ativo.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o modificador de agente ativopromove a associação entre o agente ativo e uma micropartí-cuia.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o modificador de agente ativomelhora a estabilidade estrutural da molécula do agente ati-vo .

31. Processo, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que a microparticula compreendeuma dicetopiperazina.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que a dicetopiperazina é fumarildicetopiperazina.