JPH0160238B2

JPH0160238B2 -

Info

Publication number: JPH0160238B2
Application number: JP11987783A
Authority: JP
Inventors: Takashi Suzuki; Junya Okada; Hidekazu Sawada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-04-05
Filing date: 1983-06-30
Publication date: 1989-12-21
Also published as: JPS59183695A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ランカシジンC14−低級アルカノイ
ル誘導体の製造法に関する。ランカシジン（Lankacidins）は、微生物によ
り産生される一般式（）または（）の構造を
有する抗生物質ならびに抗生物質ランカシジンＫ
および同Ｌの総称で、抗生物質Ｔ−2636群を構成
する。ランカシジンとして、ランカシジンＡ（；
R¹：＝Ｏ、R²：COCH₃）、ランカシジンＣ（；
R¹：＝Ｏ、R²：Ｈ）、ランカシジノールＡ（；

【式】R²：COCH₃）、ランカシジノール（；

【式】R²：Ｈ）、ランカサイクリノール（；R³：Ｈ）、ランカサイクリノールＡ
（；R³：COCH₃）など、さらに構造未決定の
ランカシジンＫおよび同Ｌなどが知られている。これらの抗生物質の構造や物理化学的、生物学
的性質についても明らかにされている〔ザ・ジヤ
ーナル・オブ・アンチビオチクス、第24巻、１頁
（1971年）；同誌、第26巻、647頁（1973年）；ケミ
カル・フアーマシユチカル・ビユレチン、第22
巻、99頁（1974年）；同誌、第23巻、2201頁
（1975年）参照〕。さらに、ランカシジンＫおよび同Ｌに関する物
理化学的ならびに生物学的性質に関しては、特開
昭58−52285号公報に記載されている。近年、ランカシジンの用途に関する研究が進展
し、抗細菌感染症剤や抗ブタ赤痢予防・治療剤と
してまた抗腫瘍剤として有効であることが明らか
にされた。ことにその毒性がきわめて低いことか
ら、その需要は今後ますます高くなると期待され
る。とりわけその14位が低級（C_1-3）アルカノイ
ルでエステル化されたランカシジンC14−低級ア
ルカノイル（例、ホルミル、アセチル、プロピオ
ニルなど）誘導体は、生体に対する刺激がないこ
とから有用と考えられている。このような事実を背景にして、本発明者らはラ
ンカシジンC14−低級アルカノイル誘導体を大量
かつ安価に供給しうる方法を確立すべく鋭意研究
を重ねた結果、高収量でこれらが得られる方法を
確立し、本発明を完成した。すなわち本発明は、ストレプトミセス
（Streptomyces＝St.）属に属するランカシジン
生産菌をシクロデキストリン含有培地中で培養
し、該培養物またはその液に低級アルキルカル
ボン酸エステルを加えエステル化することを特徴
とするランカシジンC14−低級アルカノイル誘導
体の製造法である。本発明に用いられるストレプトミセス属に属す
るランカシジン生産菌としては、当該抗生物質を
生産するストレプトミセス属に属する菌であれば
いかなるものでもよい。例えば、ストレプトミセス・ロチエイ・バール・ボルビ
リス（St.rochei var.volubilis）IFO−12507
〔ATCC−21250〕ストレプトミセス・グリセオフスクス（St.
griseofuscus）IFO−12870〔ATCC−23916〕ストレプトミセス・ビオラチエオニガー（St.
violaceoniger）NRRL−2834（IFO−14166）ストレプトミセス（St.）sp.6642−GC₁（IFO−
14172）などを挙げることができるが、これらの菌は、リ
スト収載株などいずれも公知の菌である。なお、ストレプトミセス・ロチエイ・バール・
ボルビリスは昭和56年９月11日から通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に受託番
号FERMP−6155として寄託されている。シクロデキストリンとしてはα−シクロデキス
トリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデ
キストリン、δ−シクロデキストリンおよびメチ
ルβ−シクロデキストリン等のシクロデキストリ
ンを化学的に修飾したシクロデキストリン誘導体
などが挙げられる。これらはそれぞれ単独で用い
ることができるが、二以上のシクロデキストリ
ン、例えばβ−シクロデキストリンとγ−シクロ
デキストリンを同時に使用することもできる。培
地に添加されるシクロデキストリンの濃度は、用
いる微生物の発育を抑制しない範囲で適宜選択す
ればよく、通常１〜150ｍＭ、望ましくは２〜100
ｍＭ、さらに好ましくは４〜50ｍＭの添加が効果
的である。培地に添加されるシクロデキストリン
は結晶状、粉末状あるいは液状であつても、また
糖、でんぷん質などの不純物が混入している試料
であつてもよく、それらの添加量は含有されるシ
クロデキストリンの濃度が前述の範囲になるよう
に選択されればよい。またこれらのシクロデキス
トリンを培地に含有させる時期としては、培地に
ストレプトミセス属に属するランカシジン生産菌
を接種または移植する以前に添加するのがもつと
も容易かつ効果的であるが、培養の間に適宜添加
することもできる。本発明の実施にあたり、使用される培地の炭素
源として、たとえばでんぷん、デキストリン、グ
ルコース、マルトース、シユクロース、ソルビト
ールのほか、糖蜜、コーンシラツプ、水飴など糖
類のほか、たとえば酢酸、コハク酸などの有機酸
や油脂、グリセリンなどの多価アルコールなども
用いることができる。窒素源としては、各種のア
ンモニウム塩、硝酸塩や尿素などの無機化合物の
ほか、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、棉実
粕、コーン・ステイープ・リカー、大豆粕などの
有機天然物なども用いることができる。さらに無
機塩類として、たとえば（例、硫酸第１鉄）、マ
グネシウム（例、硫酸マグネシウム）、マンガン
（例、硫酸マンガン）、コバルト（例、硫酸コバル
ト、銅（例、硫酸銅）、ナトリウム（例、食塩）、
カリウム（例、塩化カリウム）、カルシウム（例、
炭酸カルシウム）、亜鉛（例、塩化亜鉛）などの
塩類が適宜必要に応じて用いられる。用いる微生
物がアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などの特定の
栄養物を要求する場合にはそれらを適宜添加する
ことができる。培養は静置培養法、通気撹拌培養法、振盪培養
法などが適用されるが、通常、通気撹拌培養法に
よるのが有利である。培養の温度としては15〜40
℃、望ましくは20〜34℃である。また培地の液性
としては通常PH４〜９の範囲に保たれることが望
ましく、そのためにはたとえば苛性ソーダ、苛性
カリまたはアンモニア水、あるいは硫酸、塩酸な
どの稀釈水溶液をもつて適宜補正しつつ培養した
り、炭酸カルシウム、炭酸ソーダなどのアルカリ
性塩類などを培地に添加してもよい。培養時間
は、ランカシジンが実質的な量まで生産されるよ
うに培養すれば目的を達することができるが、通
常２〜12日間で最大の収量を得ることができる。ランカシジンの14位の選択的エステル化は、上
記培養物または培養液に低級（C_1-3）アルキル
カルボン酸（例、ギ酸、酢酸、プロピオン酸な
ど）のエステル（C_1-4アルコールエステル、グリ
コールエステル、グリセリンエステル）、具体的
には、ギ酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸エ
チル、モノアセチン、トリアセチン、エチレング
リコールジアセテートなど、を加えることによ
り、上記培養により生成したランカシジン抗生物
質（主生成物はランカシジンＣ）が変換される。
すなわち、培養物中に存在する酵素により、例え
ば酢酸エチルを加えることによりランカシジン
C14−アセチル誘導体（ランカシジンＡ）が得ら
れる。該エステル化は、例えば培養物にその1/50〜２
倍量または培養液にその1/50〜２倍量のエステ
ルを加え通常１分〜１時間撹拌することにより行
う。反応温度は15〜70℃、好ましくは20〜40℃、
PHは通常４〜９である。生成したランカシジンC14−低級アルカノイル
誘導体を採取するには、微生物の培養地から採取
するのに通常使用される分離手段を適宜適用でき
る。たとえばランカシジンの中性かつ脂溶性であ
る性質を利用して、たとえば培養液あるいは培養
液から、ケトン類（例、アセトン、４−メチル
−２−ペンタノン）、エステル類（例、酢酸エチ
ル、プロピオン酸エチル）、炭化水素類（例、ヘ
キサン、ベンゼン）などの非水溶性溶媒を適宜使
用して抽出することができるが、前記エステル化
に使用したものと同じエステル類で抽出すること
が好ましい。さらに必要により該抽出物を酸性水
溶液、塩基性水溶液で洗つたのち濃縮すればラン
カシジンC14−低級アルカノイル誘導体が得られ
る。これらは必要により、前記した各文献記載の
方法など公知の方法に従つてシリカゲル、アルミ
ナなどを用いてカラムクロマトグラフイーを行な
いさらに精製することもできる。かくして得られるランカシジンC14−低級アル
カノイル誘導体は抗細菌性物質、抗腫瘍性物質、
抗豚赤痢菌性抗生物質として用いることができ
る。以下に実施例により本発明をさらに具体的に説
明するが、これらの実施例は本発明の範囲をなん
ら制限するものではない。実施例１グルコース３％、プロフロ（商品名、トレーダ
ー・オイル社製）１％、コーン・ステイープ・リ
カー3.5％、硫酸マグネシウム0.02％、燐酸第二
カリウム0.1％、大豆油0.05％、炭酸カルシウム
1.5％（百分率、重量／容量）からなる培地500ml
を20％苛性ソーダ水溶液でPH7.0に調整したのち、
２容坂口フラスコに分注し、棉栓をしてから滅
菌した。これにストレプトミセス・ロチエイ・バ
ール・ボルビリスIFO−12507の斜面培養物を接
種したのち、28℃で24時間往復振盪培養機上で培
養した。50容発酵槽に上記の坂口フラスコ培養
培地と同じ組成の培地30を調整、滅菌したの
ち、上記坂口フラスコ培養液500mlを接種し、通
気量1VVM（単位容量当りの毎分の通気容量）、
撹拌回転数150rpmで24℃、24時間培養して種培
養とした。200容発酵槽にグリセリン10％、プ
ロフロ（商品名、トレーダー・オイル社製）２
％、コーン・ステイープ・リカー0.5％、ポリペ
プトン１％、硫酸第１鉄0.1％、大豆油0.01％、
β−シクロデキストリン１％（百分率、重量／容
量）からなる培地100を調製し、滅菌したのち、
上記種培養液５を移植し、通気量1VVM、撹
拌回転数165rpm、温度24℃で96時間培養した。かくして得られた培養液60をとり、これに水
20とハイフロスーパーセル（ジヨンズ・マンビ
ル社製）２Kgを加えて過し、70の液を得
た。この液を一部採取し、ランカシジンをメチ
ルイソブチルケトンで抽出し、抽出液をTLCプ
レート（スポツトフイルム；東京化成）で展開し
（展開溶媒；酢酸エチル：エチルエーテル＝１：
３）、ミクロコツカス・ルテウス（Micro−
coccus luteus）PCI−1001を用いてこれに対す
る阻止円の直径を、標品のそれと比較する、生物
活性法によりランカシジンを定量すると、ランカ
シジンＣが3.3ｍＭ、ランカシジンＡが0.2ｍＭ
液中に存在することを認めた。液70を200
容撹拌槽に入れ、これに35の酢酸エチルを加
え、120rpmの撹拌条件で室温中30分撹拌し、一
部採取して上記の方法でランカシジンを定量する
と、ランカシジンＣは消滅し、ランカシジンＡの
みが存在することを認めた。この液と酢酸エチ
ルの混合液を１時間混合撹拌したのち、酢酸エチ
ル層を分離しロータリーエバポレーター（内温30
℃）により５に濃縮した。かくして得られた濃
縮液につき、トルエンを加えて溜去することによ
り溶媒を可及的にトルエンに置換したのち、トル
エンで平衡したシリカゲル（0.05mm〜0.2mm、メ
ルク社製）10Kgで吸着クロマトグラフイーを行な
つた。トルエン30を流したのち、トルエン酢酸
エチル混合液（トルエン：酢酸エチル、８：２）
120を流し、１ずつ画分して活性部分を集め
た。活性部分をロータリーエバポレーター（内温
30℃）により濃縮するとランカシジンＡの結晶が
晶出した。これを過し乾燥すると、ランカシジ
ンＡの結晶が80.0ｇ得られた。実施例２グルコース３％、プロフロ（商品名、トレーダ
ー・オイル社製）１％、コーン・ステイープ・リ
カー3.5％、硫酸マグネシウム0.02％、燐酸第２
カリウム0.1％、炭酸カルシウム1.5％（重量／容
量）からなる培地に20％苛性ソーダ水溶液を滴下
することによりPHを6.5に調整した。この培地25
mlを200ml容三角フラスコに分注し、棉栓をして
滅菌し、これらにストレプトミセス・ロチエイ・
バール・ボルビリスIFO−12507の斜面培養物１
白金耳を接種し、200rpmの回転振盪機上で28℃、
24時間培養して、これを種培養液とした。グリセリン10％、プロフロ（商品名、トレーダ
ー・オイル社製）２％、ポリペプトン１％、コー
ン・ステイープ・リカー0.5％、食塩0.5％、硫酸
第１鉄0.1％、硫酸銅0.0025％、β−シクロデキ
ストリン1.6％（重量／容量）からなる培地に20
％苛性ソーダ水溶液を滴下することによりPH6.0
に調製した。この培地25mlを200ml容三角フラス
コに分注し、120℃、20分の条件で滅菌して醗酵
培地とした。この醗酵培地４本に、前述の種培養
液１mlずつを移植して、200rpmの回転振盪機上
で24℃、144時間培養した。培養終了後、培養液
を集めこれら約100mlを500ml容ヒダ付三角フラス
コに入れ、これに酢酸エチル100mlを加えて30分
間、回転振盪機上28℃200rpmの条件下で振盪を
した。これを遠心分離（2000×ｇ、10分）により
酢酸エチル部分を採取した。水溶部分にはさらに
酢酸エチルを100ml加えて500ml容分液ロートに入
れてよく撹拌振盪し、ふたたび遠心分離（2000×
ｇ10分）により、酢酸エチル部分を得、前述の酢
酸エチル抽出液に合わせた。酢酸エチル抽出液を
定容すると170mlとなり、これに酢酸エチルを滴
下し、200mlとした。これに重炭酸ソーダ２％水
溶液50mlを加え、500ml容分液ロートに入れよく
撹拌し静置したのち分液して水溶部分を除いた。
このような操作をもう一度くり返えしたのち、
200ml容の蒸溜水を用いて２回洗浄をした。この
酢酸エチル抽出液をロータリーエバポレーターを
用いて減圧濃縮乾固し、残溜物にクロロホルム60
mlを加えて、溶解させた。クロロホルムで平衡し
たシリカゲルカラム（長さ37cm、直径2.5cm）を
調製し、これに前述のクロロホルム溶液を通液
し、ランカシジンＡをカラムに吸着せしめた。ク
ロロホルム120mlをさらに通液させたのちに、ク
ロロホルム、酢酸エチル（７：３）混合溶媒で溶
出し10mlずつを分画した。各画分より10μ採取
し、シリカゲル薄層クロマトグラフイーに供し、
クロロホルム、酢酸エチル（93：７）混合溶媒を
展開剤としてランカシジンＡの存在を調べた。画
分No.９〜13の範囲にランカシジンＡの存在をUV
吸収スポツトとして認めたので、この画分を集め
てロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮乾
固した。残溜物に酢酸エチル30mlを加えて溶解さ
れ、これを１mlまでロータリーエバポレーターを
用いて減圧濃縮し、５℃に24時間静置するとラン
カシジンＡの結晶が晶出した。結晶をガラスフイ
ルターで採取し、ｎ−ヘキサンを用いて洗浄し、
真空乾燥すると85mgのランカシジンＡが得られ
た。実施例３ 200容発酵槽を用いて、実施例１に示した方
法で得られた培養液より30を採取し、100容
撹拌槽に入れ、これに酢酸エチル15を加えた。
25℃で40分間、120rpmの条件で撹拌し、一部酢
酸エチル部分を採取して実施例１に記載された方
法でランカシジンＣの消滅とランカシジンＡの生
成を確認した。これを遠心分離によつて酢酸エチ
ル層を分離した。さらに抽出残液に酢酸エチル15
を加え25℃、40分間、120rpmの条件で前記の
100容撹拌槽内で撹拌し同様な方法で酢酸エチ
ル部分を分離し、最初に得た酢酸エチル部分と合
わせた。この酢酸エチル抽出液をロータリーエバ
ポレーター（内温30℃）により５に濃縮した。
これに重炭酸ソーダ２％水溶液２を加え、20
容分液ロートに入れよく撹拌し静置したのち分液
して水溶部分を除いた。このような操作をもう一
度くり返えしたのち、５の蒸溜水を用いて２回
洗浄した。この酢酸エチルの抽出液をさらに減圧
濃縮乾固し、残溜物を20のクロロホルムに溶解
させ、クロロホルムで平衡したシリカゲル10Kgで
吸着クロマトグラフイーを行なつた。クロロホル
ム20を流し、さらにクロロホルム酢酸エチル
（７：３）混合溶媒で溶出し、0.5ずつ分画し
た。活性部分を集め、ロータリーエバポレーター
を用いて滅圧縮乾固した。残溜物に酢酸エチル10
を加えてこれを溶解し、さらにロータリーエバ
ポレーターによりこのものを0.5まで濃縮し、
５℃24時間静置すると、ランカシジンＡの結晶が
晶出した。これを紙液で採取し、ｎ−ヘキサ
ンを用いて洗浄後、真空乾燥すると、30ｇのラン
カシジンＡの結晶が得られた。実施例４グルコース３％、プロフロ（商品名、トレーダ
ー・オイル社製）１％、コーン・ステイープ・リ
カー3.5％、硫酸マグネシウム0.02％、燐酸第２
カリウム0.1％、炭酸カルシウム1.5％（百分率表
示は重量／容量）からなる培地に20％苛性ソーダ
水溶液を滴下することによりPHを6.5に調整した。
この培地25mlを200ml容三角フラスコに分注し、
棉栓をして滅菌し、これらにストレプトミセス・
ビオラチエオニガーIFO−14166の斜面培養物１
白金耳を接種し、200rpmの回転振盪機上で28℃、
24時間培養して、これを種培養液とした。グリセ
リン10％、プロフロ２％、コーン・ステイープ・
リカー0.5％、ポリペプトン１％、硫酸第１鉄0.1
％、硫酸銅0.0025％、食塩0.5％（百分率表示、
重量／容量）からなる培地にβ−シクロデキスト
リンを９ｍＭになるように加えたのち、20％苛性
ソーダ水溶液を滴下することにより、PHを6.0に
調整した。つぎにこの培地25mlを200ml容三角フ
ラスコに分注し、120℃、20分の条件で滅菌し、
前述の種培養液１mlを移植して、200rpmの回転
振盪機上で24℃、96時間培養した。培養液を10ml
採取し、これを常温で2000rpm（回転数／分）の
条件で遠心分離した。遠心分離液の上清液を、
100ml容の密栓付き三角フラスコに６ml採取し、
これに酢酸エチル６mlを加えて、18℃、30分、
200rpm（回転数／分）の条件で振盪し、アセチル
化反応に供した。50ml容の分液ロートを用いて酢
酸エチル部分を分離採取し、実施例１と同様な方
法に従つてランカシジン群抗生物質を定量して、
第１表に示した。

【表】実施例５実施例４と同様な方法で、ストレプトミセス・
ビオラチエオニガーIFO−14166の代りにストレ
プトミセスsp.6642−GC₁（IFO−14172）を用いて
培養した。なお培地のβ−シクロデキストリン
は、4.5ｍＭとした。培養液を10ml採取し、実施
例４と同様な条件でアセチル化反応に供し、第２
表に示す結果が得られた。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ストレプトミセス属に属するランカシジン生
産菌をシクロデキストリン含有培地中で培養し、
該培養物またはその液に低級アルキルカルボン
酸エステルを加えエステル化することを特徴とす
るランカシジンC14−低級アルカノイル誘導体の
製造法。