JPH02223600A - 制癌性物質ｔｆ―３００及びその製造法並びにこれを含有する制癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な制癌性物質、更に詳ｚ前には７ンパクテ
リウム属に属する菌を培養し、この培養液から得られる
制癌作用７有する画分乞蛋白質分解酵素による酵素処理
に付して得られる１０す癌性物質ＴＦ　−５００及びそ
の塩に関する。更にまた、本発明はこの制癌性物質ＴＦ
−ろＯＯ及びその塩を製造する方法並びにこれを含有す
る制癌剤に関する。

近年各種の癌患者の治療法において、宿主の免疫機能ン
九進させ、免疫機能の助はン借りながら制癌効果を発現
させる治療法が盛んとなってきた。

かかる療法に使用される薬剤としては、各種細菌の菌体
、菌体培養物から得られる成分、あるいは担子菌の子実
体又はその培養菌体から得られる多糖体が知られている
。しかし嫌気性菌を培養し、その培養液から優れた制癌
作用乞有する成分の研究は少なく、特にフソバクテリウ
ム属に属する菌を培養し、その培養液から得られる成分
並びにその制癌作用については未だ知られていない。

本発明者は、ヒドロ腔内より分離したフソバクテリウム
属に属する菌乞培養し、その培養液から菌体を除去した
上清液から採取される成分についてその薬理作用を調べ
ていたところ、特定の成分が強い制癌作用を有すること
、宿主介在性あるいは宿主の免疫力を元通させ、免疫力
の助けを借りながら間接的に制癌作用を発現させる作用
をも有するものであることを見いだした。そして得ら汎
た制癌作用７有する有効画分を更に蛋白質分解酵素によ
る酵素処理に付して得られる特定の成分は、制癌作用が
強く、かつ副作用が少ない等制癌剤として好ましい性質
を有することを見いだし、本発明を完成した。

本発明で利用される歯としては、区を培養した上清液か
ら得られる制癌作用を有する画分を蛋白質分解酵素によ
る酵素処理に付せば制癌性物質ＴＦ　−３００を生成す
るフソバクテリウム属に属する菌であればよく、好適な
ものとしてはフソバクテリウム・ヌクレアタムが挙げら
れる。具体的には、例えばフソバクテリウム・ヌクレア
タムＴＦ　−’０３１　（１”ＫＲＭ−５０７７、ＡＴ
ＯＯ−３，１６４７）および微生物学の一般常識として
その性質を有する菌株、すなわち自然変異株あるいは人
工的に改良された菌株等が利用される。

フソバクテリウム・ヌクレアタムＴＩ”　−０３１の菌
学的性状を記載すれば以下のとおりである。

（１）形態 ■　細胞の形：紡錘形（第１図） ■　細胞の多形性の有無：なし ■　運動性の有無：なし ■　胞子の有無：なし ■　ダラム染色ニゲラム陰性 ■　抗酸性：陰性 （２）培地における生育状態 ■　ＴＦ　−ａ寒天平板及び斜面培地 外形二円形 大きさ：約１ｔｘｍ 隆起二手球状 構造：露滴状 表面：平滑 辺縁：平滑 色　：乳黄白色 透明度：°不透明 ■　ＴＦ　−ａ液体培地 発育の程度：旺盛 濁り：凝塊 沈＃：なし 表面の発育：なし、約５　ａｍまでは発育なしがス：な
し く３）　　生理学的性質 ■　硫化水素の生成：＋ ■　硝酸塩の還元： ■　酪酸の生成：＋ ■　インドールの生成： ■　ウレアーゼ： ■　カタラーゼ： ■　デンプンの加水分解： ■　酸素に対する態度：＠気性 ■　アンモニアの生成：＋ ［相］　炭酸ガスの生成：＋ ■　生育の範囲：　ｐＨ５〜８．５ 温度６０〜４５℃ ＠　糖からのガスの生成 Ｌ−アラビノース（−）、Ｄ−キシロース（−）、Ｄグ
ルコース（−）、Ｄ−マンノース（−）、Ｄ−７ラクト
ース］→、Ｄ−ガラクトース（−）、麦芽糖（−１、シ
ヨＦＣ−１、）レバロース（→、ソルビット（−１、マ
ンニトール（−）、イノジット（−）、グリセリン（−
）、デンプン←） 以上の諸性状をバーシーズ・マニュアル・オブ・デイタ
ミネイティブ・バクテリオロジー第８版に照らして検討
すると、本菌株はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆ
ｕＳｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　）に
酷似し、これに属する。

つぎに本発明の制癌性物質ＴＦ　−５００の製造法の一
例乞図式化して説明すｎば、次のとおりである。

（１）　　培養及び培養液から制癌作用を有する画分の
分離 菌の培養 培養液 可溶部←分離 制癌作用を有する画分の採取 酵素処理及び目的物の採取 上記により分割された画分 酵素処理 （不溶部←分離） 可溶部 ＴＦ　−３００の採取 上記の製造法を具体的に示すと次のとおりである。

（１）培養及び培養液から制癌作用を有する画分の分離
工程 （ａ）培養 フソバクテリウム属に属する菌の培養は、通常の嫌気性
菌の培養方法によって行われる。即ち、牛の脳、心臓抽
出物、各種イノトン類等の窒素源；イースト・エクスト
ラクト等のビタミン源；塩化ナトリウム等の無機塩類；
グルコース、ラクトース等の炭素源；Ｌ−シスチン、亜
硫酸ナトリウム、チオグリコレート等の還元剤を含むよ
うな培地を水酸化ナトリウムでｐＨ６〜８．５好ましく
は６．５〜７．５に調整し、菌を植えつけ、嫌気的条件
下、３０〜４２℃好ましくは５２〜３７８Ｃで１〜５日
、好ましくは１〜４日静置あるいは攪拌培養を行う。

あるいは１〜２日、６５〜４２℃好ましくは６６〜５８
℃で培養後２５〜５５℃で更に１〜４日培養してもよい
。特に、下記成分表に記載の培地（以下ＴＦ培地と称す
る）？使用するのが好ましい。しかし、窒素源として、
牛の脳、心１１＃２抽出物のプレイン・ハート・インヒ
ユージョンは必スジも必要ではなく、牛の心臓抽出物で
あるハート・インヒユージョン、牛肉エキス、魚肉エキ
ス、トウモロコシより抽出されたコーンスティゾリヵ等
乞代用してもよく、また各種ペプトンにおいてプロテオ
ース・ぺ゛ケトン、ファイトン・ペプトンは必ずしも必
要ではなく、またトリプトケース・ペゾトン乞ポリペプ
トンで代用することもできる。

同、寒天を使用しないときは攪拌培養７行うのが好まし
い。

以下余白 成分表 （ｂｌ　　培養液から上清液の採取（菌体の除去）上で
得た培養液から自体を除去して一ヒ清液乞得る。菌体の
除去は常法、例えば遠心分離、ハイフロス−パーセル等
の濾過助剤を用いる濾過法を採用できるが、特に遠心分
離法は操作、菌の除去度合、上清液の収量の点で好まし
い。

（Ｃ１制癌作用Ｚ′有する有効画分の分離上で得られた
上清液に親水性有機溶媒を加えて、生ずる沈殿物を採取
する。この際の上清液はｐＨ１，５〜７好ましくはｐＨ
２付近（ｐＨ１，５〜２．５）に調整する。親水性有機
溶媒としては、例えばエタノール、メタノール等のアル
コール類、アセトン等のケトン類が挙げられるが、アル
コール類特にエタノールが最もよい結果を与える。この
親水性有機溶媒はその濃度が５０〜８０％（容量比）、
好ましくは５０〜８０チ（容量比）になるように添加す
るのが好適である。親水性有機溶媒を加えた後、低温、
好ましくは約４〜５℃の温度で数時間〜数日間放置し、
沈殿物の生成を完結させる。

このようにして生じた沈殿物乞デカンテーション、遠心
分離、濾過等の通常の操作で分離する。

次いでこの沈殿物に一般には５〜２０倍量の水を加え、
ｐＨにより分割し有効画分を得る。例えばｐＨ７，５〜
８に調整し、所望により不溶部を除去した後、ｐＨ４付
近（ｐＨ３，５〜４．５）に調整して得られる水不溶部
を遠心分離、濾過等の通常の方法で水不溶部を採取する
。あるいはｐＨ７，５〜８に調整し、所望により不溶部
を除去した後、ｐＨ６付近（ｐＨ５，５〜６．５）に調
整して得られる水不溶部７常法により分離採取してもよ
く、更にはその水可溶部乞ｐＨ４付近（Ｐ）！　３．５
〜４．５）に調整して得られる沈殿物を常法により分離
採取してもよい。上記のようにして得られる画分の水不
溶部あるいは沈殿物２次の酵素処理及び目的物の採取工
程に付す。

（２）酵素処理及び目的物の採取工程 まず、上記の如くして得られた制癌作用を有する画分２
水または緩衝液に溶解又は懸濁し、蛋白質分解酵素２加
え、常法に従って酵素処理ビ行う。

蛋白質分解酵素としては、プロナーゼ、パノ々イン、ト
リジシンおよびキモトリプシン等が挙げられ、好ましく
はプロナーゼおよびトリプシンが埜げられる。酵素処理
にあたって、あるいは酵素処理中、水溶液をｐＨ７〜８
に調整保持するのが好ましく、そのためには水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、炭酸ソーダ、重炭酸ソーダ等
が用いられる。また、酵素処理中、反応液の腐敗乞防止
するために、クロロホルム、トルエン等の有機溶媒を少
量添加するのが望ましい。そして、酵素の使用量は、通
常は酵素処理に付す粉末（固体）に対して、約１〜２％
（重量比）付近の量が使用される。

上記酵素処理は通常６０〜４０℃にて１〜７２時間、好
ましくは２４〜４８時間行う。また、例えば粉末（固体
）に対して酵素約１％（重量比）を加えて、１〜２４時
間酵素処理７行い、更に約１チ（重量比）の酵素を加え
て酵素処理ン行ってもよい。

上記酵素処理後、所望により遠心分離、濾過等の操作に
より不溶物を除去した水可溶部から制癌性物質ＴＦ　−
３００の画分を採取する。この水可溶部からＴＦ　−３
００の画分を採取するには、例えばｐＨによる分割法、
親水性有機溶媒による沈殿分別法イオン交換体による分
割法および限外濾過等ビ１つ以上組み合わせて処理す牡
ばよい。あるいはこれら１つ以上の操作を２回くり返し
行ってもよい。具体的にその採取方法を例示す扛ば、上
記水可溶部を、好ましくはｐＨ２，５以下に調整しく所
望によりトリクロロ酢酸ン添加してもよい）生ずる沈殿
物を除去し、可溶部に親水性有機溶媒、例えばアルコー
ルを６０〜８０％（容量比）、好ましくは６０〜８０％
（容量比）になるように加え、生ずる目的物の画分の沈
殿物を採取し、所望により、ついでこの沈殿物化、例え
ばりゞウニ°ンクス１−Ｘ（商品名）、アンバーライト
エＲＡ　−４００（商品名）等の強塩基性陰イオン交換
体等で処理して（この操作は数回行ってもよい）その非
吸着画分を採取し、常法によって濃縮、乾燥あるいＧま
親水性有機溶媒による沈殿法等の処理ンすれＱ′］ｌ：
、本発明の制癌性物質ＴＦ−３００が得られる。

上記のようにして得られる制癌性物質ＴＩ”　−５００
の性状は次のとおりである。

（イ）白灰色ないし淡褐色の粉末。

（ロ）　マウスのエールリッヒ腹水型癌エールリッヒ結
節型癌、ザルコーマ１８０癌細胞およびＢ−１６メラノ
ーマ癌細胞の増殖を阻止し、免疫賦活作用を有する。

（ハ）　水に溶解し、メタノール、エタノール、アセト
ン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエ
ーテルに不溶。

に）　明確な融点を示さず、約１８０℃より分解を始め
、１９５℃以上で著しく分解する。

（ホ）　ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
３５００〜３３００．２９２０．２８５０．１６６０〜
１６２０．１５８０〜１５４０．１４６０〜１４００．
１３８０〜１３６０．１１２０．１０８０〜１０２０．
９７０および８２０〜８００　ｃｍ−”の近傍に吸収帯
を有する。

（へ）　ｐＨ７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは１吸
１又末端に強い吸収があり、また２４６〜２８０　ｎｍ
の近傍に吸収を示す。

（ト）　モーリッシュ反応、フェノール硫酸反応、アシ
スロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウリー・フオ
リン反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性。

（ト）　元素分析値 Ｃ：６８％〜４７％　Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％〜４％ （す）　　フェノール硫酸法による糖の含有率は約１６
％〜６０％（グルコース換算）、およびロウリー・フオ
リン法による蛋白質の含有率は、約１０係以下（牛血清
アルゾミン換真）である。

上記のようにして得られた制癌性物質ＴＦ　−３００は
、常法に従って医薬上許容される非毒性塩としてもよい
。具体的には、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のア
ルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアル
カリ土類金属塩等が挙げられる。

次に、本発明の制癌性物質の薬理作用？示せば次のとお
シである。尚、以下の実験においては、上記（１）　−
ｃの上清液に親水性有機溶ＩＡ乞加えて得られた沈殿物
のｐＨによる分割において、その沈殿物’＆ｐＨ４付近
に調整して得られる水不溶部〔実施例１−　（３）　）
、ｐＨ６付近に調整して得られる水不溶部〔実施例２−
　（１）　］、ｐＨ６付近に調整して得られる水可溶部
を更にｐＨ４付近に調整して得られる沈殿物〔実施例２
−　（２）　：）乞そ７’Ｌぞれ使用して蛋白質分解酵
素による酵素処理に付して得ら扛たものをそｎぞれＴＦ
　−３１０、ＴＦ　−３２０及びＴＦ　−３，１５０と
し、また酵素処理して得た上記ＴＦ−５１０Ｌ限外沖過
に付して得られた４ｆｔ製ＴＦ’　−５１０［実施例８
−（４）　）をＴｒ−３１０（精）として示した。

（１）免疫賦活作用 一群６匹のＩＯＲ系マウスを用い、被検物質乞生理食塩
水に溶解させ、その溶液０．２１ｎｌを腹腔内投与した
。投与２４時間後にＰｅｒｉｋａｎ　Ｄｒａｗｉｎｇ工
ｎｋ１７　Ｂｌａｃｋ　（ギュンター・ワグナ−社製）
１ｍｌとゼラチン６％含有生理食塩水２　ｍｌを混合し
て調製したカーボン浮遊液０．２　ｒｎｌｎ正常マウス
尾静脈注入し、注入後１，５．１０および１５分後に眼
窩からヘパリン被覆へマドクリット毛細管を用いて血液
０．０２ｍ１ビ採取し、直ちに０．１％炭酸ナトリウム
水溶ｗ、６ｍｌに希釈溶面させ、これ乞波長６７５ｎＩ
Ｔ］で比色し貧食係数（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｔｉｃｌｎ
ｄｅＸ）：に１直Ｙ　Ｈａｌｐｅｒｎらの数式により求
めた。

また対照群には生理食塩水０．２ｒｎｌ！ビ投与した。

Ｋ−１°ｇ　Ｃｏ　−ｌｏｇ　Ｃ ｔ−ｔ。

（ｃｏ　＝　ｔ、ｏ時の血中炭末量、Ｃ＝を時の血中炭
末量） その結果は表−１のとおりである。

表 明の目的物質投与群は網内系マクロファージが活性化さ
ｎ正常マウスの細胞性免疫が増大した。

（２）　　制癌作用 ＠）　エールリッヒ腹水型腫瘍における抗腫瘍効果ＩＯ
Ｒ系マウス（雌、６週令）にエールリッヒ腹水型癌細胞
をマウス１匹当りｌＸ１０５個腹腔内接種した。°つい
で被検物質ビ生理食塩水に溶解させ、その溶液Ｑ、２ｍ
１ｉを癌細胞接種後１日目から、１日１回、７日間連１
読腹腔内投与した。

また対照群には生理食塩水０．２ｍｌ／１回を同様に投
与した。

その結果は表−２のとおりである。

以下余白 表−１で明らかなように、対照群ｒ比し、本発表−２ を表−６に示す。

表−６ （ロ）　ｆルコーマ１８０癌７Ｈ０胞に対する抗腫瘍効
果ＩｃＲ系マウス（雌、６週令）にずルコーマ１８０癌
細胞をマウス−匹当すＩ　Ｘ　１０７個腋下部皮下に移
殖した。次いで、被検物質を生理食塩水又は５条ブドウ
糖水溶液に溶解させ、その溶液０．２ｍｌ乞癌細胞移殖
後１日目から、１日１回、７日間連続静脈内または筋肉
内投与した。

また対照群には、５チブドウ糖水溶液又は生理食塩水０
．２ｍ１ｌ１回乞同様に投与した。その結果（注）ＴＦ
ｌｌｏに関するデーターは癌細胞接種後７白目の結果を
示し、ＴＦ　−５１０（精）およびＴＦ　−５２０に関
するデーターは癌細胞接種後１４日口の結果を示す。

（ハ）エールリッヒ結節仰腫瘍における抗腫瘍効果ＩＯ
Ｒ系マウス（雌、６週令）＆でエールリッヒ癌細胞ンマ
ウスー匹当り、４　Ｘ　１０’個ｊ液下部皮下に移殖し
た。次いで、被検物質を５％ブドウ糖水溶液に溶解させ
、その溶液０．２ｍｌ’ｅ幅細胞移殖後８日目から、１
日１回、隔日５日間投与した。また対照群には５％ブド
ウ糖水溶液０．２ｒｎｌ１回乞同様に投与した。癌細胞
移植後１５０目に腫瘍重量Ｚ測定した。腫瘍重量は腫瘍
部位の長径ａｍｍと短径ｂ　ｍｍ　ｙｉノギスにて測定
し、次式によって求めた。

Ｘｂ２ 腫瘍重量＝　　　（す） その結果を表−４に示す。

表−４ 果 ＢＤＦｌ系マウス（雄、７週令）にメラノーマ癌細胞乞
マウス−匹当りＩ　Ｘ　１０６個１液下部皮下に移殖し
た。次いで被検物質？生理食塩水又は５％ブドウ糖水溶
液に溶解させ、その溶液Ｑ、２ｍｌを癌細胞移殖後１目
土から、１日１回、７日間連続層腔内投与するか、１５
日０から、１日１回１４日間連続腫瘍内投与するか、ま
たは１３日白心ら、１日１回６日間隔日腫瘍内へと腹腔
へと同時に投与した。また、対照群には生理食塩水また
は５Ｌｉｂブドウ糖水溶液０．２ｍ１１回乞同様に投与
した。その結果７表−５に示す。

表−５ （３）急性毒性 マウス（ＩＯＲ系、♀、６週令：１ｖ投与）に以下余白 （注）ＴＦ−３１０に関するデーターは、癌細胞移動後
、２３日目の結果を示し、 ＴＦ−３１０（精）に関するデーターは、癌細胞移動後
、２３日目の結果を示す。

おける制癌性物質ＴＦ　−５００（ＴＦ　−３１０、Ｔ
Ｆ　−３１０（精）、ＴＦ’　−３２０、ＴＦ　−５２
０１１１）、ＴＦ　−５３０、ＴＦ　−３３０Ｃ年青）
）ＬＤ５ｏイ直はいず牡も１０〜／　ｋｇ以上であった
。

以上の薬理実験から明らかなように本発明方法によって
得ら扛た制癌性物質ＴＦ　−３００は、制癌剤として有
用なものであり、各種の癌挟患に使用され効果が期待さ
れるものである。

本発明の制癌性物質ＴＦ−５００はそのまま、あるいは
非毒性塩として、常法により経口、注射、生薬等の剤形
として利用される。経口剤としては、種々の賦形剤７含
んでいてもよく、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤とす
ることができる。また注射剤としては、皮下、筋肉内、
静脈内注射剤のいず牡でもよく、懸濁液、溶液もしくは
使用時溶解させる粉末等の剤形が用いら扛る。また注射
剤には食塩、ブドウ糖又は局所麻酔剤を含んでいてもよ
い。

本発明の制癌性物質ＴＦ　−３００及びその非毒性塩乞
患者に使用する場合、その投与量は患者の症状に応じて
適宜選択さｎるが、一般に成人では０．００５〜５０ｍ
ｇ／ｋｇ７１日１〜数回に分は投与するのが好ましく、
投与方法としては経口又は皮下、筋肉内、静脈内もしく
は患部への注射によるのが好ましい。

次に本発明の実施例及び製剤例を挙げて説明する。

実施例１ （１）１０／のジャー・ファメンター（丸菱理化研究所
製〕に、１ｇの蒸留水に対し、トリシトケース・ヘプト
ン１フＦ、ハート・インヒユージョン１０ｇ１イースト
・エクストラクト６ｇ、食塩７．５Ｉ、グルコース１２
ｇ、ラクトース１０＆、亜硫酸ナトリウム０．１　、！
？およびチオグリコレート・ナトリウム０．５　、ｌｉ
”＆含有するＴＦｅ培地８ｅ乞加え、１２０℃で６０分
間滅菌する。培養液に、冷却後窒素ガスを１００ｍ１１
分にて１時間通気する。

あらかじめ上述のＴＦ　−ｅ培地にて前培養したフソバ
クテリウム・ヌクレアタムＴＦ−０３１（ＦＥＲＭ　−
５０７７、ＡＴＯＯ−６１６４７）の前培養液１１’に
滅菌条件下で接種する。培養は６７℃で窒素ガスを流入
Ｃ６５ｍ１１分）しながら、攪拌（６０ｒｐｍ　）下６
日間行う。培養終了後、培−ｉ液にセライト１６０．９
およびセルロースパウダー８０Ｆ’＆加え攪拌し、これ
を減圧下で濾過し除菌した培養液上清７．８’６ｖ得た
。

（２）　　（１１で得られた培養液上清７．８ｅに濃塩
酸１７７ｍ１７加え、ｐｌ］２．０に調整した後、エタ
ノール１１、＃’に加え、６０％エタノール溶液とし、
４℃で２４時間放置する。次いでデカンテーションにて
溶液部分乞除き、沈殿物乞採取するために４℃で遠心分
離（６Ｘ　１０”　ｒｐｍ、５分）スル。この沈殿物を
ｐ）１２．０の６０係工タノール水溶液４００ｍＬ　エ
タノール４００１１１、アセトン２００ｍ１およびジエ
チルエーテル２ＣＪＯｍｌで順次洗浄した後減圧乾燥し
て粉末５．９　Ｆ　’ａ？得る。

（３）　　（２）で得らｎた粉末馨水２５ｒｎｌに懸濁
し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えｐＨ７，５〜８
．０となし、室温で６０分間攪拌した後、１Ｎ−塩酸２
加え？Ｈ４，０に調整する。次いで、水冷下２時間攪拌
した後、遠心分離（Ｉ　Ｘ　１０’　ｒｐｍ、１０分）
し、沈殿物と上清液乞分離する。この沈殿物？ｐ）１４
．０に調整した水１０ｍ１で洗浄し、沈殿物と洗浄液乞
遠心分離（Ｉ　Ｘ　１０’　ｒｐｍ、１０分）する。沈
殿物乞エタノール１Ｑｍｌで洗浄した後、減圧乾燥して
制癌性物質ＴＦ〜２１０乞’、５．９得る。

このものは、次のような性状を有する。

（イ）　白灰色ないし淡褐色の粉末 （ロ）　マウスのエールリッヒ腹水型癌、エールリッヒ
結節型幅、ずルコーマー１８０癌細胞およびＢ−１６メ
ラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、免疫賦活作用を有する
。

（ハ）メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼン、
クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテルに不溶。

に）　明確な融点娶示さず、１６０℃〜２５５℃で分解
する。

（羽　ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、５
６００〜ろ２００．２９５０〜２９２０、１３８０〜１
６２０、１５５０〜１５１０．１４４０、１３８０．１
２４０〜１２２０および１１２０〜１０２０ｃｍｎ＋−
１の近傍に吸収帯２有する（第２図）。

（へ）ｐＨ７での水可溶画分の水溶液の紫外線吸収スペ
クトルは吸収末端に強い吸収があり、また２４８〜２６
．５　ｎｍの近傍に吸収を示す（第６図）。

（ト）　　モーリッシュ反応、フェノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウリー・フ
オリン反応は陽性。

例　元素分析値 Ｃ：４０％〜４６％　Ｈ：５％〜７俸 Ｎ：９係〜１０％ （男　ｐＨ７での水可溶画分のフェノール硫酸法による
糖の含有率は約５％〜２５％（グルコース換算）、およ
びロウリー・フオリン法による蛋白質の含有率は約２０
％〜５０％（牛血清アルブミン換算）である。

（４）　　（３）　テ得らｎた制癌性物質ＴＦ’−２１
０の、５９乞水１５１ｎｌＶｃ懸濁し、攪拌下に１Ｎ−
水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ７，８に調整する
。

６７℃に加温し、プロナーゼＥ（科研化学製商品名；、
０００，０００チロシン単位／ｇ　）　１５Ｉｎ９ｙ添
加した後、トルエンを数滴加えて、攪拌下、ｐＨ７，８
〜８．０．３７〜４０　℃”’Ｃ２４ＩＷ間酵素処理を
行う。処理液乞遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）し
、上清液と沈殿物乞分離し、沈殿物にｐＨ８，０に調整
した水６ｍｌを加え、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０
分）し、沈殿物と洗浄液乞分離する。洗浄液に先の上清
液乞合わせてこれに１Ｎ−塩酸を加えてｐＨ２，０に調
整すｎば沈殿が析出する。この溶液を５℃で１２時間放
置した後、遠心分離（ｊ　Ｘ　１０’　ｒｐｒｎ、１０
分）し、上清液と沈殿物に分離し、沈殿物にＰＩ（２，
０に調整した水５　ｒｎｌを加え、遠心分１ζＩｎ（１
ｘ１０’　ｒｐｎｎ、１０分）し、沈殿物と洗浄Ｒｗ分
離する。洗浄液に先の上清液乞合わせてエタノール７加
え８０％エタノール溶液とし、水冷下で２時間攪拌した
後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）し、沈殿物と
上清液を分離する。沈殿物乞８０％エタノール水溶液５
ｍｌおよびエタノール５ｍｌで順次洗浄した後、減圧乾
燥して制癌性物質ＴＦ　−３１０の画分’ｆｘ５２７ｍ
９得る。

この粉末６２７ｍ９ン水５　ｍｌに溶解させ、１Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液を加えてＰＩ−１７，０に調整し、
あらかじめ１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液にてＯＨ型に
調整したアンバーライトエＲＡ４００（ローム・アンド
・）・アス社製商品名）４５ｍｌ’ｔｔ充填したカラム
にかけ、水２００Ｉｌｌをｆ流した際のカラム通過液馨
全て合わせて、１Ｎ塩酸乞加えてｐＨ７，０に調整する
。これを減圧下に濃縮し孔径０．３μｍのミリポアフィ
ルタ（日本ミリポア・リミテッド製商品名）（（て濾過
、次いで凍結乾燥して制癌性物質ＴＦ−５１０の凍結乾
燥品ビシ１０〜得る。

このものは次のような性状を有する。

（イ）白灰色ないし淡褐色の粉末 （ロ）　マウスのエールリッヒ腹水型癌、エールリツ活
作用を有する。

（ハ）水に溶解し、メタノール、エタノール、アセトン
、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
テルニ不溶。

に）　明確な融点を示さず、約１８０℃より分解を始め
、１９５℃以上で著しく分解する。

（ホ）　ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
３５００〜３３００．２９２０．２８５０．１６６０〜
１６２０．１５８０〜１５４０．１４６０〜１４００．
１３８０〜１３６０．１１２０．１０８０〜１０２０．
９７０および８２０〜８００　ｃｍ−”の近傍に吸収帯
を有する（第４図）。

（へ）　ｐＨ７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸
収末端に強い吸収があり、また２４６〜２５９の近傍に
吸収を示す（第５図ン。

（））　　ＴＳＫ−ＧＥＬ　Ｇ　３　Ｑ　ＯＱ　ＳＷ（
東洋曹達株式会社の商品名、カラム：　７．５　ｍｍ９
６Ｘ　６０　ＱｍｍＸ２）による高速液体クロマトグラ
ム（溶出液：　ｐＨ７の０．１モルリン酸緩衝液、流速
０．８ｍｌ　７分、室温）は２２０　ｎｍの紫外線吸光
度測定においては、溶媒先端部分、２８〜５２分付近、
４６〜６４分付近にかけて吸収２有し、２６０　ｎｍの
紫外線吸光度測定においては溶媒先端部分、４２〜６０
分付近にかけて吸収を有する（第６図〕。

（チ）　モーリツンユ反応、フェノール硫酸反応、アン
スロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウリー・フオ
リン反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性。

凹　元素分析値 Ｃ：　３８．０％〜４２％　Ｉ（：　５．０　％〜７％
Ｎ：１％〜４％ ０）　フェノール硫酸法による糖の含有率は、約２０％
〜６０％（グルコース換算）およびロウリー・フオリン
法による蛋白質の含有率は約１０％以下（牛血清アルブ
ミン換算）である。

（５）上記で得らｎた制癌性物質ＴＦ　−３１０１４０
１％’ン水５０ｍ１ｖｃ溶解し、ウルトラフ・イルター
ＵＫ　−５０（東洋沖紙株式会社製限外濾過膜商品名：
捧徐分画分子量５　Ｘ’　１０４　）にて限外濾過して
１００倍に濃縮する。この濃縮液乞孔径０．２μｍのミ
リポアフィルタ−（日本ミリポアリミテッド製商品名）
にて濾過し、次いで凍結乾燥して制癌性物質ＴＦ′−３
１０の精製凍結乾燥品８８１ｎ９乞得る。このようにし
て得られた制癌性物質ＴＦ　−３１０の精製品は特許請
求の範囲に記載の性状乞有し、糖含率（ケゞルコース換
Ｘ）は約１６〜６０係であった。

実施例２ （１）実施例１−（２＋の方法で得られた粉末３．９　
＆　７水２５１ｎｌに懸濁し、１Ｎ−水酸化ナトリウム
水溶液２加え、ｐＨ−７，５〜８．０となし、室温で６
０分間攪拌した後、１Ｎ−塩酸を加えｐＨ６，０に調整
する。次いで水冷下、２時間攪拌した後、遠心分離（１
ｘ　１０’　ｒｐｍ、１０分）し、沈殿物と上清液乞分
離する。この沈殿物”ｔｐＨ６，０に調整した水５　ｍ
ｌで洗浄し、沈殿物と洗浄液ヲ遠心分離（Ｉ　Ｘ　１０
’　ｒｐｍ、１０分）する。洗浄液は、先に得らｎた上
清液と合わせて実施例６−（］）に記載する処理に付す
。一方、沈殿物をエタノール５　ｍｌで洗浄した後、減
圧乾燥して制癌性物質ＴＦ　−２２０’（＜　、０６１
１得る。

このものは、次のような性状を有する。

（イ）　白灰色ないし淡褐色の粉末 （ロ）　マウスのエールリッヒ腹水型癌、エールリッヒ
結節型癌、デルコーマ−１８０癌５ｆＢ胞およびＢ−１
６メラノーマ癌細胞の増殖を阻止し、免疫賦活作用を有
する。

（）→　メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼン
、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテルに不溶
。

（−１明確な融点７示さず、１６０℃〜２４０℃で分解
する。

（ホ）　ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
６６００〜５２００．２９５０〜２９２０、１３８０〜
１６２０．１５５０〜１５１０．１４４０、１３８０．
１２４．０〜１２２０および１１２０〜１０２０ｃｍ−
１の近傍に吸収帯を有する（第７図）。

ヘ）ｐＨ７での水可溶画分の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは吸収末端に強い吸収があり、また２４８〜２６６
　ｎｍの近傍に吸収を示す（第８図）。

（ト）　　モーリッシュ反応、フェノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウリー・フ
オリン反応は陽性。

（例　元素分析値 Ｃ：４０％〜４２チ　Ｈ：５％〜７％ Ｎニア％〜９％ （ＩＪＩ　　ｐＨ７での水可溶面分のフェノール硫酸法
による糖の含有率は約５襲〜２０チ（グルコース換算）
、およびロウリー・フオリン法による蛋白質の含有率は
約１０％以下（牛血清アルブミン換算）である。

＜２）　　（１）で得られた制癌性物質ＴＦ　−２２０
の１１χ水１０ｍ１に懸濁し、攪拌下に１Ｎ−水酸化す
トリウム水溶液乞加えてｐＨ７，８に調整する。

５７℃に加温し、プロナーゼＥ（利便化学製商品名；　
１，０００．０００チロシン単位／ｇ　）　１５Ｉｎ９
’（＆添加した後、トルエンを数滴加えて、攪拌下、ｐ
Ｈ７，８〜８．０．６７〜４０℃で２４時間酵素処理乞
行う。処理液を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）し
、上清液と沈殿物乞分離し、沈殿物にｐＨ８，０に調整
した水５　ｒｎｌ乞加え、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１０分）し、沈殿物と洗浄液を分離する。洗＃液に先の
上清液乞合わせて、これに１Ｎ−塩酸を加えてｐＨ２，
０に調整すれば沈殿が析出する。この溶液ビ５℃で１２
時間放置した後、遠心分離（Ｉ　Ｘ　１０’　ｒｐｍ、
１０分）し、上清液と沈殿物に分離し、沈殿物にｐＨ２
，０に調整した水５　ｍｌ　Ｙ加え、遠心分離（１×１
０’　ｒｐｍ、１０分）し、沈殿物と洗浄液ン分離する
。洗浄液に先の上清液を合わせてエタノ／Ｌ／Ｙ加え８
０％エタノール溶腋とし、水冷下で２時間攪拌した後、
遠心分離（４０００ｒｐｍ１０分）し、沈殿物と上清′
ｇ！Ｌヲ分離する。沈殿物を８０％エタノール水溶液５
　ｍｌおよびエタノール５ｍｌで順次洗浄した後、減圧
乾燥して制’Ｎｒ’ｉ性物質ＴＦ　−３２０の画分乞１
６６ｍ９得る。

この粉末１５０Ｉｎｇ乞水５　ｍｌに溶解させ、１Ｎ−
水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ７，０に調整し、
あらかじめ１Ｎ−水酸化す）　ＩＪウム水溶液にてＯＨ
型に調整したアンバーライトエＲＡ４００（ローム・ア
ンド・ハアス社製商品名）２５ｍｌ’＆充填したカラム
にかけ、水１００ｍ１ｉ流した際のカラム通過液乞食て
合わせて、１Ｎ−塩酸７加えてｐＨ７，０に調整する。

これを減圧下に濃縮し孔径０．６μｍのミリポアフィル
タ−（日本ミリボア・リミテッド製商品名）にて濾過、
次いで凍結乾燥して制癌性物質ＴＦを２０の凍結乾燥品
ｔ１１０Ｉｎ９得る。

このものはつぎのような性状７有する。

（イ）　白灰色ないし淡褐色の粉末。

（ロ）　マウスのエールリッヒ腹水型癌の増殖を阻止し
免疫賦活作用を有する。

（／１　水に溶解し、メタノール、エタノール、ア七ト
ン、ベンゼン、クロロボルム、酢酸エチル、ジエチルエ
ーテルに不溶。

に）　明確な融点乞示さず、約１８ｏ０ｃより分解を始
め、１９５℃以上で著しく分解する。

（、Ｊ−Ｉ　　ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクト
ルは、３５００〜３５００．２９２０，２８５０．１６
６０〜１６２０．１５８ｏ〜１５４ｏ、１４６０〜１４
００．１３８０〜１５６０．１１２０．１０８０〜１０
２０．９７０および８２０〜８００ＣＩｎ−１の近傍に
吸収帯２有する（第９図）。

（へ）　Ｐｌ−１７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは
、吸収末端に強い吸収があり、また２５０〜２７０　ｎ
ｍの近傍に吸収？示す（第１０図）。

（ト）　　ＴＳＫ−ＧＫＴ、　Ｇ５　Ｑ　ＱＱ　ＳＷ　
（東洋曹達株式会社の商品名、カラム：　７．５ｍｍ０
Ｘ６０　Ｑｍｍ×２）による高速液体クロマトグラム（
溶出液：　ｐＨ７の０．１モルリン酸緩衝液、流速０．
８ｍｌ　７分、室温）は２２　Ｏｎ、ｎの紫外線吸光度
測定においては、溶媒先端部分、２８〜６２分付近、４
５〜６４分付近にかけて吸収２有し、２６０　ｎｍの紫
外線吸光度測定に２いては溶媒先端部分、３５〜５６分
付近にかけて吸収を有する（第１１図）。

（ト）　モーリッシュ反応、フェノール硫酸反応、アン
スロン硫酸反応、インゾール塩酸反応、ロウリー　フォ
リン反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性。

（男　元素分析値 Ｃ：６８％〜４２％　Ｈ：５％〜７チ Ｎ：１％〜４ｑ６ （ヌ）　フェノール硫酸法による糖の含有率は、約２０
％〜６０％（グルコース換算）およびロウリー・フオリ
ン法による蛋白質の含有率は約１０％以下（牛血清アル
ブミン換算）である。

（３）上記で得られた制癌性物質ＴＦ　−５２０，１０
０ｍ９を水５０ｍ１に溶解し、ウルトラフィルターＵＫ
−５０（東洋沖紙株式会社製限外濾過膜商品名：捧徐テ
画分子景５　Ｘ　１０’）にて限外濾過して１００倍に
濃縮する。この濃縮液乞孔径０．２μｍのミリポアフィ
ルタ−（日本ミリボアリミテッド製商品名）にて濾過し
、次いで凍結乾燥して制癌性物質ＴＦ　−６２０の精製
凍結乾燥品７２雫を得る。このようにして得らｎた制癌
性物質ＴＦ　−３２０の精製品は特許請求の範囲に記載
の性状？有し、糖含率（グルコース換算）は約１６〜５
０％であった。

実施例６ （１）実施例２−（１）で得らｎた洗浄液と上清液ン合
わせた溶液［ＩＮ−塩酸７加えてｐＨ４，０に調整した
後、５６Ｃ以下で１２時間放置する。次いで遠心分離（
ｌｘ１０’ｒｐｍ、１０分）し、沈殿物と上清液χ分離
する。この沈殿物’ｔｊｐＨ４，０に調整した水５　ｍ
ｌで洗浄し、沈殿物と洗浄液乞遠心分離（１Ｘ　１Ｑ’
　ｒｐｍ、１０分）する。沈殿物乞エタノール５　ｍｌ
で洗浄した後、減圧乾燥して制癌性物質ＴＦ　−２５０
を０．４８　ｇ得る。

このものは、次のような性状７有する。

（イ）　白灰色ないし淡褐色の粉末。

（ロ）　マウスのエールリッヒ腹水型癌、エールリッヒ
結節型癌、す゛ルコーマー１８０癌細胞およびＢ−１６
メラノーマ癌細胞の増殖ン阻止し、免疫賦活作用乞有す
る。

←→　メタノール、エタノール、アセトン、ベンゼン、
クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテルに不溶。

に）　明確な融点２示さず、１８５６Ｃ〜２２５℃で分
解する。

（ホ）　ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、
６６００〜６２００．２９５０〜２９２０、１３８０〜
１６２０．１５５０〜１５１０．１４４０．１５８０．
１２４０〜１２２０および１１２０〜’ｌ　０２０ｃｍ
−１の近傍に吸収帯を有する（第１２図）。

（へ）　ｐＨ７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは吸収
末端に強い吸収があり、また２４９〜２６４ｎｍの近傍
に吸収χ示す（第１６図）。

（ト）　　モーリッシュ反応、フェノール硫酸反応、ア
ンスロン硫酸反応、イン１−ル塩酸反応、ロウリー・フ
オリン反応は陽性。

（例　元素分析値 Ｃ：　４２　％　〜　４５　％　　　Ｈ二　５　％〜　
７　　ｑｂＮ：１０％〜１１係 明　フェノール硫酸法による砧の含有率は約５％〜２５
％（クルコース換算）およびロウリー・フオリン法によ
る蛋白質の含有率は約６０％〜６０％（牛血清アルブミ
ン換算）である。

ｆ２）　　（１）で得らｎた制癌性物質ＴＦ　−２３０
ｃｖ　Ｏ，４８！ｊ乞水５　ｒｎｌに懸濁し、攪拌下に
１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液７加えてｐＨ７，８に調
整する。

６７℃に加温し、ゾロナーゼＥ（利便化学製商品名；　
１，０００，０００チロシン単位／＆　）　５．ＯＩψ
馨添加した後、トルエンを数滴加えて、攪拌下、Ｐｌ−
１７，８〜８．［）、３７〜４０℃で２４時間酵素処処
理待う。処理液乞遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）
し、上清液と沈殿物を分離し、沈殿物に！３）１８．０
に調整した水５　ｍｌ　Ｙ加え、遠心分２’Ｌ　（４０
００ｒｐｍ、１０分）し、沈殿物ど洗浄液乞分離する。

洗浄液に先の上清Ｗｉ、Ｙ合わせて、とｎに１Ｎ−塩酸
乞加えてｐＨ２，０に調整すれば沈殿が析出する。この
溶液？５℃で１２時間放置した後、遠心分離（Ｉ　Ｘ　
１０’　ｒｐｍ、１゜分）し、上清液と沈殿物に分離し
、沈、穀物にＰ１１２．０に調整さ扛た水５ｒａ１２加
え、遠心分離（１Ｘ　１０’　ｒｐｍ、１０分）し、沈
殿物と洗浄液乞分離する。洗浄液に先の上清液を合わせ
てエタノール７加え８０％エタノール溶液とし、水冷下
で２時間攪拌した後、遠心分、ＶＩ（４［）ＤＯｒｐｍ
、１０分）し、沈殿物と上清液乞分離する。

沈殿物乞８０係エタノール水溶液５　ｍｌおよびエタノ
ール５　ｒｎｌで順次洗浄した後、減圧乾燥して制癌性
物質ＴＦ　−３６０の画分乞ｉ　ｏ　ｏ　ｍｙ得る。

この粉末１００ＦＩＱ乞水５　ｒｎｌに溶解させ、１Ｎ
−水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＦＩ７．０に調整
し、あらかじめ１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液にてＯＨ
型に調整したアンバーライトエＲＡ４００（ローム・ア
ンド・ハアス社製商品名）ｉ５ｍＡ！ｉ充填したカラム
にかけ、水６０　ｒｎｌ　Ｙ流した際のカラム通過液７
全で合せて、１Ｎ−塩酸７加えてｐＨ７，０に調整する
。これを減圧ドに濃縮し、孔径０．６μｍのミリポアフ
ィルタ−（日本ミリボア・リミテッド製商品名）にて濾
過、次いで凍結乾燥して制癌性物質Ｔ；”−５５０の凍
結乾燥品乞７　Ｑ　１！１９得る。

このものは次のような性状７有する。

（イ）　白灰色ないし淡褐色の粉末。

（ロ）　マウスのエールリッヒ腹水型癌の増殖を阻止し
免疫賦活作用χ有する。

（ハ）　水に溶解し、メタノール、エタノール、アセト
ン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエ
ーテルに不溶。

に）　明確な融点χ示さず、約１８０℃より分解を始め
、１９５℃以上で著しく分解する。

（ホ）　１ｃＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
、３５００〜３３００、２９２０．２８５０．１６６０
〜１６２０．１５８０〜１５４０．１４６０〜１４００
、１３８０〜１３６０゜１１２０．１０８０〜１０２０
．９７０および８２０〜８ＤＤｃｍ−１の近傍に吸収帯
７有する（第１４図）。

ヘ）ｐＨ７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸収末
端に強い吸収があり、また２５０〜２６０　ｎｍの近傍
に吸収７示す（第１５図）。

（トＩ　　ＴＥＩＫ　−ＧＥＬ　Ｇ　３　Ｑ　Ｑ　Ｏ８
Ｗ　（東洋曹達株式会社の商品名、カラム：　７．５　
ｍｍ　ｆｌ　Ｘ　６００ｍ＋ｎＸ２）による高速液体ク
ロマトグラム（溶出液：　ｐＨ７の０．１モ／Ｌ／リン
酸緩衝液、流速Ｏ，（３ｍｌＺ分、室温）は２２０　ｎ
ｍの紫外線吸光度測定においては、溶媒先端部分、６６
〜６４分付近にかけて吸収を有し、２６０　ｎｍの紫外
線吸光度測定においては溶媒先端部分、６５〜６２分付
近にかけて吸収を有する（第１６図）。

（チ　モーリッシュ反応、フェノール硫酸反応、アンス
ロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウリーーフオリ
ン反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性。

（男　元素分析値 Ｃ：　６８％〜４２％　　Ｈ：　５％〜７％Ｎ　：　１
　％〜４　％ （ヌ）　フェノール硫酸法による糖の含有率は、約２０
％〜６０％（グルコース換算）およびロウリー・フオリ
ン法による蛋白質の含有率は約１０％以下（牛血清アル
ブミン換算）である。

（３）上記で得られた制癌性物質ＴＦｉ、５０７０η暑
水５０　ｍｌに溶解し、ウルトラフィルターＵＫ　−５
０（東洋沖紙株式会社製限外沖過膜商品名：弁餘分画分
子量５Ｘ１０’）にて限外濾過して１００倍に濃縮する
。この濃縮液χ孔径０．２μｍのミリポアフィルタ−（
日本ミリポアリミテッド製商品名）にて濾過し、次いで
凍結乾燥して制癌性物質ＴＦ〜６６０の精製凍結乾燥品
４９　ｍ９７得る。このようにして得られた制癌性物質
ＴＦ　−３３０の精製品は特許請求の範囲に記載の性状
７有し、一般に糖含鴫率（グルコース換算）は約１６〜
６０％であり、代表的なものの、赤外線吸収スペクトル
および紫外線吸収スペクトルは第１７図および第１８図
のとおりであった。

実施例４ （１）１０ｄのジャー・ファメンタ−（丸菱理化ｊｌｆ
究所製）に１ｇの蒸留水に対し、トリプトケース・ペプ
トン１７ｇ、ハート・インヒユージョン２０Ｉ、イース
ト・エクストラクト６！１１食塩７．５ｇ、グルコース
１２ｇ、ラクトース１０Ｉ、亜硫酸ナトリウム０．、９
およびチオグリコレート・ナトリウム０．５　、Ｆ　暑
含有するＴＦ　−ｄ培地８１乞加え、１２０℃で６０分
間滅画才る。

培養液に冷却後、窒素ガス２１００ｍ１１分にて１時間
通気する。あらかじめ上述のＴＦ　−ｄ培地にて前培養
したフソバクテリウム・ヌクレアタムＴＦ　−０５１（
ＦｉＭ　−５０７７、ＡＴＣＣ−６１６４７）の前培養
Ｗｉ、１ｅ７ａｌｌ−滅菌条件下で接種する。培養は６
７℃１窒素ガスを流入（６５ｍｌ　７分）しながら、攪
拌（３０ｒｐｍ　）下、５日間行う。培養終了後、培養
液にセライト１６０ｇおよびセルロースパウダー８０．
９’ａ−加え攪拌し、こｎを減圧下で濾過し、除菌した
培養液上清７．８６を得た。

（２）　　（１）で得ら扛た培養液上清７．８１　Ｋ濃
塩酸１１７ｍ１χ加え、ｐＨ２，０に調整した後、エタ
ノール１、７ｄ’￥加え、６０％エタノール溶液とし、
４℃で２４時間放置する。次いで、デカンテーションに
て溶液部分乞除き、沈殿物を採取するために４℃で遠心
分ｋｍ　（６Ｘ　１０３ｒｐｎｎ、５分）する。この沈
殿物をｐＨ２，０の６０％エタノール水溶液４００ｍ、
エタノール４００ｍｌ、　アセトン２００ｍ１およびジ
エチルエーテル２０ＣＪｍｌで順次洗浄した後、減圧乾
燥して粉末４．５　、！７　Ｙ得る。

る。

（３１（２）で得られた粉末を、そｎぞれ実施例１−（
３１、実施例２−　（１）および実施例３−（１）と同
様に処理して、制癌性物質ＴＦ　−２１０、ＴＦ’　−
２２０およびＴＦ　−２５０’＆それぞｎ得る。

（４）　　（３）で得られた制癌性物質ＴＦ−２，１０
、ＴＦ　−２２０およびＴＦ　−２５０Ｙそｎぞ扛実施
例１−（４）、実施例２−（２）および実施例３−（２
）と同様に処理して、制癌性物質ＴＦ　−５１０、ＴＦ
６２０およびＴＦ　−３５０の凍結乾燥品を、それぞれ
２２０ダ、１２０Ｉｎ９および７５ｍ９得る。

実施例５ 実施例１−（３）で得らｎた制癌性物質ＴＦ−２１０の
、５．９　’＆、プロナーゼＥの代りにトリプシン（デ
イフコ社製）　１５＃ｌｌ’用いて酵素処理する点、お
よび酵素処理後ｐＨ２に調整した水可溶部から沈殿物を
採取する際に、８０係エタノール溶液の代りに６０％エ
タノール溶液とする魚具外は実施例１−　（４）と同様
に操作し、制癌性物質ＴＦ　−５１０の凍結乾燥品２０
０Ｉｎ９馨得る。

同様にして以下の制癌性物質Ｔｉ”　−３２０およびＴ
Ｆ　−３５０の凍結乾燥品乞それぞれ得る。

実姉例６ 実施例１−　（３１、実施例２−（１１又は実施例３−
（１）でそ扛ぞｎ得られた制癌性物質ＴＦ　−２１０、
ＴＦ−２２０又はＴＦ　−２３０ビ、実施例１−（４）
、実施例２−　（２）又は実施例５−（２）と同様にそ
れぞれ酵素処理した後、ｐＨ２に調整した水可溶部から
沈殿物を採取する際、８０％エタノール溶液とする弐シ
に６０％エタノール溶液に調整し、以後それぞ：／ｌの
実施例と同様の操作７行い制癌性物質ＴＦ６１０、ＴＦ
　−３２０又はＴＦ’　−５００の凍結乾燥品をそ扛ぞ
れ１９０　ｍ９．９８１ｎ９又は６６ダ得る。

実施例７ 実施例１−（３）、実施例２−（１）又は実施例５−（
１）でそ２”Ｌぞ′ｉ″Ｌ得られた制癌性物質ＴＦ　−
２１０、ＴＦ−２２０又はＴＦ　−２，５０を、実施例
１−（４）、実施例２＝（２）又は実施例６−（２）と
同様にそれぞｎ酵素処理した後、ｐＨ２に調整した水可
溶部から沈殿物を採取する代りに、４０％トリクロロ酢
酸水溶液乞加え、トリクロロ酢酸の濃度ＹＩＤ％とした
ときの水可溶部乞８０％エタノール溶液に調整して、沈
殿物乞採取し、以後そｎぞ扛の実施例と同様の操作７行
い、制癌性物質ＴＦ　−３１０、ＴＦ　−６２０又はＴ
Ｅ’−５５０の凍結乾燥品暑１９２ηＶ、１０２＋１１
＆又は６５Ｉｎ９得る。

実施例８ （１）９０１のジャー・ファメンター（丸菱理化研究所
Ｈ：　ＭＳＪ”２　ｍ　）　Ｋ−１７０１（１’）蒸留
水に対し、トリプトケース・ペゾトン１１９０ｇ、ハー
ト・インヒユージョン１０５０ｇ、イースト・エクスト
ラクト２１０ｇ、食ｆＭ５２５ｇ、グルコース８４０ｇ
、ラクトース７００ｇ、亜硫酸ナトリウム７Ｉ、チオグ
リコレート・ナトリウム５５．９および第２す／酸カリ
ウム１７５ｇ乞含有するＴＦ　−ｆ培地を加え、１１８
℃で１５分間滅菌する。培養液に、冷却後窒素ガスｖ２
５０ｍｌ／分にて１時間通気する。

あらかじめ上述のＴＦ　−ｆ培地にて前培養したフソバ
クテリウム・ヌクレアタムＴＦ−０３１（ＦＥＲＭ　”
　５０７７、ＡＴＣ！Ｏ−３１６４７）の前培養液約９
００１ｎｌχ上述した培養液に接種する。

培養は約６６℃で窒素ガス乞流入Ｃ２Ｃ２５Ｄ／分）し
ながら攪拌（９０ｒ、ｐ、ｍ　）下４日間行う。

培養終了後、培養液にセライ）　１０ｆｔ／ｌおよびセ
ルロースパウダー５ｇ／ｌ’ｉ加え攪拌し、こｎ７減圧
下で濾過し除菌した培養液上清約６５ｄ’ｔグイ４手ノ
こ。

（２１（１）で得ら扛り培養液上清７．５１ＶＣａ塩酸
１１５ｍ１を加え、ｐＨ２，０＋ｃ調整した後、エタノ
ール１、４６を加え、６０％エタノール溶液とし、４℃
で２４時間放置する。次いでデカンテーションにて溶液
部分を除き、沈殿物を採取するために４℃で遠心分離（
４Ｘ　１０”　ｒｐｍ、１０分）する。この沈ｊ設物Ｙ
ｐ８２．０の６０％エタノール水溶１１１　Ｄ　Ｏｍｌ
で２回、エタノール１５０１ｉ／！、メタノール１５０
ｍ１に２回およびアセトン１５０ｍ１で順次洗浄した後
、風乾して粉末６．０Ｉ乞得る。

（３）　　（２）で得らｎた粉末を水５０ｍ１に懸濁し
、４Ｎ−水酸化す）　ＩＪウム水溶液を加えｐＨ７，５
〜８．０となし、室温で１５分間攪拌した後、４Ｎ−塩
酸を加えてｐＨ４，０に調整′１″る。次いで水冷下２
時間静置した後、遠心分離（Ｉ　Ｘ　１０’　ｒｐｍ、
１０分）し、上清液と沈殿物を分離ず乙。この沈殿物に
洗浄のために水６　ｍｌビ加え懸濁液となし、４Ｎ−水
酸化ナトリウム水溶液７加えｐＨ７，５〜８．０に調整
−「る。次いで室温で１５分間攪拌し、その後４Ｎ−塩
酸ン加えてｐｌｉ４．ｏに調整し、水冷下２時間静置す
る。その後遠心分’ｉ”ｊｆＱ　（Ｉ　Ｘ１０４ｒｐｎ
ｌ、１０分）し、沈；殺物乞採取する。

この沈殿物乞ｐＨ４，０に調整した水４　ｍｌにて洗浄
し、遠心分離（Ｉ　Ｘ　１０’　ｒｐｍ、１０分）して
湿重量で６．２Ｊの沈殿物（ＴＦ　−２１０）￥得る。

このようにして得らｎた制４＋’ｔ’ｉ性物質ＴＦ　−
２１０は、実施例１で得らｎたものと同じ性状２有して
いた。

（４１（３）で得ら扛たＴ−Ｆ−２１０６，２，９（醒
重は）を水６ｒｎｌ！ＶＣ懸濁し、攪拌下に飽和炭酸ア
ンモニウム水溶液を加えてｐＨ７，８に調整する。これ
乞６７℃に加温し、プロナーゼＥ（利便化学製商品名；
、０００．０００チロシン単位／ｇ　）　：２１ｌＩｒ
９　’＆添加した後、トルエン乞数滴加えて振盪下、Ｐ
Ｉ−１７，８〜８．０．６７〜４ｏ０ｃで２時間酵素処
理を行う。次いで、処理液に４Ｎ−塩酸を加えｐＨ１，
０とし沈殿乞析出させる。この懸濁＃！χ水冷下２時間
静置した後、遠心分離（Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｑ’　ｒｐｍ、１
０分）し、上清Ｍ　Ｙ分取する。この上清液に工１／−
ル２９ｍ１”ｆ加え、６０チエタノール水溶液となし、
沈殿物乞析出させる。こｆＬ乞水冷下２時間静置した後
遠心分離（６Ｘ　１０３ｒｐｏ＋、１０分）して沈殿物
？採取する。沈殿物を６０％エタノール水溶液５　ｍｌ
、エタノールｉＱｍＪおよびアセトン１０ｒｎｌで順次
洗浄した後、風乾して制癌性物質ＴＦ−６１０３１５Ｉ
ｎ９￥得る。

こｎ７３　Ｑ　ｒｎｌの水に溶解させ、４Ｎ−水酸化ナ
トリウム水溶沿にてＰ）１８．０に調整し、ダウエック
スＩ　Ｘ　４　綽噂（ダウケミカル社製商品名）Ｃ１型
５３　ｍｌ￥充填したカラムにかけ水１００ｍ１Ｙ流し
た際のカラム通過液乞食て合わせてＰＩ−１６，５〜７
．０となる様に調整する。こＡをウルトラフィルターＵ
Ｋ　−５０（東洋Ｐ紙株式会社製限外ν過膜商品名；倖
徐分画分子量５ｘ１０’）＋ｙて限外濾過２行ない１０
０倍までａ縮する。この濃縮液乞孔径０．３μｍのミリ
ポアフィルタ−（日本ミリボアリミテッド製商品名）に
て濾過し、次いで凍結乾燥して制癌性物質ＴＦ−３１０
の精製凍結乾燥品２３０ｍｇ乞得る。７のようにして得
られた制癌性物質ＴＦ−４１０の精製品は特許請求の範
囲に記載の性状を有し、一般にその糖含率（グルコース
換算）は約１６〜６０係であり、代表的なものの赤外線
吸収スペクトル、紫外線吸収スペクトルおよび高速液体
クロマトグラムはそｎぞ２″Ｌ第１９図、第２０図およ
び第２１図のとおシであった。

製剤例１ 制癌性物質Ｔ１７′ｉｌＯの凍結乾燥品トダ７バイアル
瓶に充填した。こｎは使用時滅菌生理食塩水又はリドカ
イン０．５　％含有溶液等に溶解させ注射液として用い
る。

製剤例２ 制癌性物質ＴＦ　−、！＋　２０の凍結乾燥品１■ビバ
イアル瓶に充填した。こｎは使用時滅菌生理食塩水又は
リドカイン０．５％含有溶液等に溶解させ注射液として
用いる。

製剤例６ 制癌性物質ＴＦ　−３５０の凍結乾燥品１η乞バイアル
瓶に充填した。こ扛は開用時滅菌生理食塩水又はリドカ
イン０．５％含有溶液等に溶、゛解さ□せ□注射液とし
て用いる。

製剤例４ 制癌性物質ＴＦ−ｚ＋１０乞詮むｐＨ７，０〜７．５の
水溶Ｍ’＜バイアル瓶に充填し、０．５父は１ダ単位の
制癌性物質ＴＦ　−３１０凍結乾燥品乞得る。こｎは、
使用時滅菌生理食塩水、リドカイン０．５％含有溶液又
は５％ブドウ糖水溶液等に溶解させ注射液として使用す
る。

製剤例５ 制癌性物質ＴＦ　−３１０（端）？含むｐＨ７，０〜７
．５の水溶液ヲパイアル瓶に充填し、０．５又は１〜単
位の制癌性物質ＴＦ　−５１０（椙）凍結乾燥品２得る
。こ扛は使用時、滅菌生理食塩水、リドカイン０．５％
含有溶液又は５％ゾドウ漁水溶詠等に溶解させ注射液と
して使用する。

製剤例６ 制癌性物質ＴＦ　−５２０を含むｐＨ７，０〜７．５の
水溶液乞バイアル瓶に充填し、０．５又は１ｍ９単位め
制癌性物質１、Ｔ２＝　ｇ　２０凍結乾燥品を得る。こ
れ′は使用時、滅菌生理食塩水、リドカイン０．５％・
　　−・　　、　　　・ 含有溶液又は′５％５％ブドウ糖水溶液溶解させ注′射
液として使用する。

製剤例７ 制癌性物質ＴＦ　−５５０を含むＰ）１７．０〜７．５
の水溶液乞バイアル瓶に充填し、０．５又は１ｍｇ単位
の制癌性物質ＴＦ　−５５０凍結乾燥品乞得る。こ扛は
使用時、滅菌生理食塩水、リドカイン０．５％含有溶液
又は５％ブドウ糖水溶液等に溶解して注射液として使用
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いるフソバクテリウム・ヌクレアタ
ムＴＦ　−０５１の形態７示す顕微鏡写真、第２図は制
癌性物質ＴＦ−２１０の赤外線吸収スベクトル、第６図
は同物質の紫外線吸収スペクトル、第４図は本発明の制
癌性物質ＴＦ　−３１０の赤外線吸収スペクトル、第５
図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第６図は同物質の
高速液体クロマトグラム、第７図は制癌性物質ＴＦ　−
２２０の赤外線吸収スペクトル、第８図は同物質の紫外
線吸収スペクトル、第９図は本発明の制癌性物質ＴＦ６
２０の赤外線吸収スペクトル、第１０図は同物質の紫外
線吸収スペクトル、第１１図は同物質の高速液体クロマ
トグラム、第１２因は制癌性物質ＴＦ　−２３０の赤外
線吸収スペクトル、第１５図は同物質の紫外線吸収スペ
クトル、第１４図は本発明の制癌性物質ＴＦ　−’３ろ
Ｏの赤外線吸収スペクトル、第１５図は同物質の紫外線
吸収スペクトル、第１６（２）は同物質の高速液体クロ
マトグラム、第１７図は本発明の制癌性物質ＴＦ　−３
３０（精）の赤外線吸収スペクトル、第１８図は同物質
の紫外線吸収スペクトル、第１９図は本発明の制癌性物
質ＴＦ　−３１０（精）の赤外線吸収スペクトル、第２
０図は同物質の紫外線吸収スペクトル、第２１図は同物
質の調速液体クロマトグラム７示す。 第３ 図 第５ 図 第１０図 第１３図 第１５図 第１８図 Ｏρ 臼 巳

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）フソバクテリウム属に属する菌を培養し、その培
   養液から得られる制癌作用を有する画分を、蛋白質分解
   酵素による酵素処理に付して得られる次の性状を有する
   制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩。 （イ）白灰色ないし淡褐色の粉末。 （ロ）マウスのエールリツヒ腹水型癌エールリツヒ結節
   型癌、ザルコーマ１８０癌細胞およびＢ−１６メラノー
   マ癌細胞の増殖を阻止し免疫賦活作用を有する。 （ハ）水に溶解し、メタノール、エタノール、アセトン
   、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
   テルに不溶。 （ニ）明確な融点を示さず、約１８０℃より分解を始め
   、１９５℃以上で著しく分解する。 （ホ）ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、３
   ５００〜３３００、２９２０、２８５０、１６６０〜１
   ６２０、１５８０〜１５４０、１４６０〜１４００、１
   ３８０〜１３６０、１１２０、１０８０〜１０２０、９
   ７０および８２０〜８００ｃｍ＾−＾１の近傍に吸収帯
   を有する。 （ヘ）ｐＨ７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸収
   末端に強い吸収があり、また２４６〜 ２８０ｎｍの近傍に吸収を示す。 （ト）モーリツシユ反応、フェノール硫酸反応、アンス
   ロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウリー・フオリ
   ン反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性。 （チ）元素分析値 Ｃ：３８％〜４７％Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％〜４％ （リ）フェノール硫酸法による糖の含有率は、約１６％
   〜６０％（グルコース換算）およびロウリー・フオリン
   法による蛋白質の含有率は約１０％以下（牛血清アルブ
   ミン換算）である。
2. （２）フソバクテリウム属に属する菌を培養して得た上
   清液に親水性有機溶媒を加えて生ずる沈殿物の制癌作用
   を有する画分を、蛋白質分解酵素による酵素処理に付し
   て得られたものである特許請求の範囲第１項記載の制癌
   性物質ＴＦ−３００及びその塩。
3. （３）フソバクテリウム属に属する菌を培養して得た上
   清液に親水性有機溶媒を加えて生ずる沈殿物をｐＨによ
   り分割して得られる制癌作用を有する画分を蛋白質分解
   酵素による酵素処理に付しついで制癌性物質ＴＦ−３０
   ０の画分を採取して得られたものである特許請求の範囲
   第１項又は第２項記載の制癌性物質ＴＦ−３００及びそ
   の塩。
4. （４）蛋白質分解酵素による酵素処理が、プロナーゼ又
   はトリプシン処理である特許請求の範囲第１〜３項いず
   れかの項記載の制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩。
5. （５）フソバクテリウム属に属する菌が、フソバクテリ
   ウム・ヌクレアタムである特許請求の範囲第１〜４項い
   ずれかの項記載の制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩。
6. （６）フソバクテリウム属に属する菌を培養して得た上
   清液に親水性有機溶媒を加えて生ずる沈殿物の制癌作用
   を有する画分を蛋白質分解酵素による酵素処理に付すこ
   とを特徴とする制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩の製
   造法。
7. （７）フソバクテリウム属に属する菌を培養して得た上
   清液に親水性有機溶媒を加えて生ずる沈殿物をｐＨによ
   り分割して得られる制癌作用を有する画分を蛋白質分解
   酵素による酵素処理に付し、ついで制癌性物質ＴＦ−３
   ００の画分を採取することを特徴とする特許請求の範囲
   第６項記載の制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩の製造
   法。
8. （８）酵素処理後制癌性物質ＴＦ−３００の画分を採取
   する操作が少なくともｐＨによる分割法、親水性有機溶
   媒による沈殿分別法、イオン交換体又は限外ろ過による
   分割法の１種以上を組み合わせて処理し、制癌性物質Ｔ
   Ｆ−３００の画分を採取する操作である特許請求の範囲
   第７項記載の制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩の製造
   法。
9. （９）酵素処理後制癌性物質ＴＦ−３００の画分を採取
   する操作が蛋白質分解酵素による酵素処理後の水可溶部
   をｐＨにより分割し、ｐＨ２．５以下に調整して得られ
   る水可溶部の有効画分に親水性有機溶媒を加え、得られ
   る沈殿物をイオン交換体で処理し、その非吸着画分を限
   外ろ過して採取する操作である特許請求の範囲第７項又
   は第８項記載の制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩の製
   造法。
10. （１０）上清液に親水性有機溶媒を加える操作が上清液
    をｐＨ２付近に調整したのち親水性有機溶媒を加える操
    作である特許請求の範囲第６〜９項いずれかの項記載の
    制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩の製造法。
11. （１１）上清液に加える親水性有機溶媒がアルコールで
    ある特許請求の範囲第６〜１０項いずれかの項記載の制
    癌性物質ＴＦ−３００及びその塩の製造法。
12. （１２）親水性有機溶媒をその濃度が３０％〜８０％（
    容量比）になるように上清液に加えることを特徴とする
    特許請求の範囲第６〜１１項いずれかの項記載の制癌性
    物質ＴＦ−３００及びその塩の製造法。
13. （１３）上清液に親水性有機溶媒を加えて得られる沈殿
    物をｐＨにより分割する操作が沈殿物に水を加え、ｐＨ
    ４付近に調整して得られる水不溶部を採取する操作であ
    る特許請求の範囲第７〜１２項いずれかの項記載の制癌
    性物質ＴＦ−３００及びその塩の製造法。
14. （１４）上清液に親水性有機溶媒を加えて得られる沈殿
    物をｐＨにより分割する操作が、沈殿物に水を加え、ｐ
    Ｈ６付近に調整して得られる水不溶部を採取する操作で
    ある特許請求の範囲第７〜１３項いずれかの項記載の制
    癌性物質ＴＦ−３００及びその塩の製造法。
15. （１５）上清液に親水性有機溶媒を加えて得られる沈殿
    物をｐＨにより分割する操作が、沈殿物に水を加え、ｐ
    Ｈ６付近に調整して得られる水可溶部を更にｐＨ４付近
    に調整し、得られる沈殿物を採取する操作である特許請
    求の範囲第７〜１４項いずれかの項記載の制癌性物質Ｔ
    Ｆ−３００及びその塩の製造法。
16. （１６）蛋白質分解酵素による酵素処理が、プロナーゼ
    又はトリプシン処理である特許請求の範囲第６〜１５項
    いずれかの項記載の制癌性物質ＴＦ−３００及びその塩
    の製造法。
17. （１７）フソバクテリウム属に属する菌を培養し、その
    培養液から得られる制癌作用を有する画分を、蛋白質分
    解酵素による酵素処理に付して得られる次の性状を有す
    る制癌性物質ＴＦ−３００又はその塩を含有することを
    特徴とする制癌剤。 （イ）白灰色ないし淡褐色の粉末。 （ロ）マウスのエールリツヒ腹水型癌エールリツヒ結節
    型癌、ザルコーマ１８０癌細胞およびＢ−１６メラノー
    マ癌細胞の増殖を阻止し免疫賦活作用を有する。 （ハ）水に溶解し、メタノール、エタノール、アセトン
    、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエー
    テルに不溶。 （ニ）明確な融点を示さず、約１８０℃より分解を始め
    、１９５℃以上で著しく分解する。 （ホ）ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは、３
    ５００〜３３００、２９２０、２８５０、１６６０〜１
    ６２０、１５８０〜１５４０、１４６０〜１４００、１
    ６８０〜１３６０、１１２０、１０８０〜１０２０、９
    ７０および８２０〜８００ｃｍ＾−＾１の近傍に吸収帯
    を有する。 （ヘ）ｐＨ７の水溶液の紫外線吸収スペクトルは、吸収
    末端に強い吸収があり、また２４６〜 ２８０ｎｍの近傍に吸収を示す。 （ト）モーリツシユ反応、フェノール硫酸反応、アンス
    ロン硫酸反応、インドール塩酸反応、ロウリー・フオリ
    ン反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性。 （チ）元素分析値 Ｃ：３８％〜４７％Ｈ：５％〜７％ Ｎ：１％〜４％ （リ）フェノール硫酸法による糖の含有率は、約１６％
    〜６０％（グルコース換算）およびロウリー・フオリン
    法による蛋白質の含有率は約１０％以下（牛血清アルブ
    ミン換算）である。