JPH0338838B2 - - Google Patents
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- JPH0338838B2 JPH0338838B2 JP58081235A JP8123583A JPH0338838B2 JP H0338838 B2 JPH0338838 B2 JP H0338838B2 JP 58081235 A JP58081235 A JP 58081235A JP 8123583 A JP8123583 A JP 8123583A JP H0338838 B2 JPH0338838 B2 JP H0338838B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
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Description
本発明は11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン
−３−オン−20−カルプアルデヒド及びその製造
法に関する。 本発明により提供される11β−ヒドロキシプレ
グナ−４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒ
ドは公知文献に未記載の新規化合物であり、優れ
た抗炎症作用を有するハイドロコーチゾン、コル
チコステロン、プレドニゾロン、プレドニゾンに
代表されるコルチコイド系ステロイドの合成原料
となる11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−
３，20−ジオンを製造するための中間体として有
用である〔Shull、G.M.and D.A.Kita、J.Am.
Chem.Soc.、77、763（1955）参照〕。 従来、例えばプレドニゾンの製造法としては、
デオキシコール酸を出発原料として20数段階の工
程を経る方法〔エル・エフ・フイーザー、エム・
フイーザー共著；ステロイド（レインホルド社発
行、1959年）、634〜647頁参照〕が知られている
が、この方法は用いる試薬が高価であるうえに工
程が長く、工業的実施には必ずしも適していな
い。 本発明者らは上記コルチコイド系ステロイドを
製造するためにその有用な中間体について鋭意検
討した結果、11β−ヒドロキシプレグナ−４−エ
ン−３−オン−20−カルプアルデヒドが11β−ヒ
ドロキシリトコール酸及び／又はその塩にアルカ
リゲネス属に属する特定の細菌を作用させること
によつて容易に得られ、かつハイドロコーチゾ
ン、コルチコステロン、プレドニゾロン、プレド
ニゾンなどのコルチコイド系ステロイドの合成原
料となる公知化合物である11β−ヒドロキシプレ
グナ−４−エン−３，20−ジオンに簡単に誘導で
きることを見出し、本発明に至つた。 （上記式中、Ｒは水素原子又はアルカリ金属を表
わし、R1はアルキル基を表わす。） 本発明によれば、11β−ヒドロキシリトコール
酸及び／又はその塩を基質として11β−ヒドロキ
シプレグナ−４−エン−３−オン−20−カルプア
ルデヒドを生産するアルカリゲネス属に属する細
菌を、11β−ヒドロキシリトコール酸及び／又は
その塩を含む培地に培養することにより、11β−
ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−
カルプアルデヒドを高選択率、高収率で得ること
ができる。 上記のアルカリゲネス属に属する細菌として
は、デオキシコール酸及び／又はその塩を基質と
して12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン
−３−オン−20−カルプアルデヒドを生産するア
ルカリゲネス・フエカリスD4020−K15
（Alcaligenes faecalis D4020−K15）菌株（微
工研条寄第204号）がある（特願昭57−30899号明
細書参照）。この菌株は土壌中から取得したアル
カリゲネス・フエカリスD4020（Alcaligenes
faecalis D4020）菌株（微工研条寄第182号）に
突然変異処理を施して得られた変異体である。 アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株及びア
ルカリゲネス・フエカリスD4020−K15菌株の菌
学的性質を列挙すると次表のとおりである。
−３−オン−20−カルプアルデヒド及びその製造
法に関する。 本発明により提供される11β−ヒドロキシプレ
グナ−４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒ
ドは公知文献に未記載の新規化合物であり、優れ
た抗炎症作用を有するハイドロコーチゾン、コル
チコステロン、プレドニゾロン、プレドニゾンに
代表されるコルチコイド系ステロイドの合成原料
となる11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−
３，20−ジオンを製造するための中間体として有
用である〔Shull、G.M.and D.A.Kita、J.Am.
Chem.Soc.、77、763（1955）参照〕。 従来、例えばプレドニゾンの製造法としては、
デオキシコール酸を出発原料として20数段階の工
程を経る方法〔エル・エフ・フイーザー、エム・
フイーザー共著；ステロイド（レインホルド社発
行、1959年）、634〜647頁参照〕が知られている
が、この方法は用いる試薬が高価であるうえに工
程が長く、工業的実施には必ずしも適していな
い。 本発明者らは上記コルチコイド系ステロイドを
製造するためにその有用な中間体について鋭意検
討した結果、11β−ヒドロキシプレグナ−４−エ
ン−３−オン−20−カルプアルデヒドが11β−ヒ
ドロキシリトコール酸及び／又はその塩にアルカ
リゲネス属に属する特定の細菌を作用させること
によつて容易に得られ、かつハイドロコーチゾ
ン、コルチコステロン、プレドニゾロン、プレド
ニゾンなどのコルチコイド系ステロイドの合成原
料となる公知化合物である11β−ヒドロキシプレ
グナ−４−エン−３，20−ジオンに簡単に誘導で
きることを見出し、本発明に至つた。 （上記式中、Ｒは水素原子又はアルカリ金属を表
わし、R1はアルキル基を表わす。） 本発明によれば、11β−ヒドロキシリトコール
酸及び／又はその塩を基質として11β−ヒドロキ
シプレグナ−４−エン−３−オン−20−カルプア
ルデヒドを生産するアルカリゲネス属に属する細
菌を、11β−ヒドロキシリトコール酸及び／又は
その塩を含む培地に培養することにより、11β−
ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−
カルプアルデヒドを高選択率、高収率で得ること
ができる。 上記のアルカリゲネス属に属する細菌として
は、デオキシコール酸及び／又はその塩を基質と
して12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン
−３−オン−20−カルプアルデヒドを生産するア
ルカリゲネス・フエカリスD4020−K15
（Alcaligenes faecalis D4020−K15）菌株（微
工研条寄第204号）がある（特願昭57−30899号明
細書参照）。この菌株は土壌中から取得したアル
カリゲネス・フエカリスD4020（Alcaligenes
faecalis D4020）菌株（微工研条寄第182号）に
突然変異処理を施して得られた変異体である。 アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株及びア
ルカリゲネス・フエカリスD4020−K15菌株の菌
学的性質を列挙すると次表のとおりである。
【表】
【表】
【表】
上記の表に示した菌学的性質に基づき、アルカ
リゲネス・フエカリスD4020菌株及びアルカリゲ
ネス・フエカリスD4020−K15菌株の同定を行な
つた。アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株
は、桿菌であること、周鞭毛を有していること、
グラム染色が陰性であることなどの顕微鏡的所見
並びにオキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応がと
もに陽性であること、好気性であること、Ｏ−Ｆ
テストの結果が酸化的（Oxidative）であること
などの生理学的性質からパージエイズ・マニユア
ル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー第７版及び第８版に基づき、アルカリゲネス
属に属する細菌であると同定した。さらにアルカ
リゲネス・フエカリスD4020菌株は、ゼラチンを
液化しない点、ミルクがアルカリ性となる以外に
変化しない点及び脱窒反応がない点から、アルカ
リゲネス属のフエカリス種に属する細菌であると
同定した。また、一般に突然変異株はその親株と
同じ種に属するものと考えられており、アルカリ
ゲネス・フエカリスD4020−K15菌株はアルカリ
ゲネス属のフエカリス種に属する細菌であると判
定した。 本発明による11β−ヒドロキシプレグナ−４−
エン−３−オン−20−カルプアルデヒドの生産
は、11β−ヒドロキシリトコール酸及び／又はそ
の塩を基質として11β−ヒドロキシプレグナ−４
−エン−３−オン−20−カルプアルデヒドを生産
するアルカリゲネス属に属する細菌を、11β−ヒ
ドロキシリトコール酸及び／又はその塩を含む培
地に培養することにより行なわれる。11β−ヒド
ロキシリトコール酸の塩としては具体的には11β
−ヒドロキシリトコール酸のナトリウム、カリウ
ムなどのアルカリ金属の塩が挙げられる。11β−
ヒドロキシリトコール酸及び／又はその塩の濃度
は通常約１〜100ｇ／の範囲でよいが、生産さ
れる11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−
オン−20−カルプアルデヒドの収量、培養条件及
び操作性などの経済的観点から約２〜50ｇ／の
範囲が好ましい。培養方法は原則的には一般微生
物の好気培養で採用される方法と同じであるが、
通常は液体培地による振盪培養法又は通気撹拌培
養法が用いられる。培地は上記の11β−ヒドロキ
シリトコール酸及び／又はその塩を基質として
11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン
−20−カルプアルデヒドを生産するアルカリゲネ
ス属に属する細菌が資化利用できる栄養源を含有
するものであればよい。炭素源としては11β−ヒ
ドロキシリトコール酸及び／又はその塩を単一炭
素源としてもよく、或いは11β−ヒドロキシリト
コール酸及び／又はその塩にグルコース、グリセ
リン、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどを併
用してもよい。また窒素源としては、例えば硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸
カリウムなどの無機窒素源、又はポリペプトン、
ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源が用いられ
る。また、この他に燐酸水素２カリウム、燐酸２
水素カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸マグ
ネシウムなどの塩類が添加される。培養条件に特
徴はないが、通常25〜35℃で10時間〜７日間振盪
培養又は通気撹拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された11β−ヒ
ドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カ
ルプアルデヒドは、基質の11β−ヒドロキシリト
コール酸又はその塩と比較して水に対する溶解度
が著しく小さく、通常は培養液中に析出沈澱して
くる。この11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン
−３−オン−20−カルプアルデヒドを分離採取す
るには、沈澱している11β−ヒドロキシプレグナ
−４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒドを
デカンテーシヨンにより浮遊している菌体を含む
培養液から分離するか、または浮遊している菌体
が沈澱しないような回転数で遠心分離を行ない、
析出している11β−ヒドロキシプレグナ−４−エ
ン−３−オン−20−カルプアルデヒドを沈澱させ
たのち上記のデカンテーシヨンにより11β−ヒド
ロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カル
プアルデヒドを分離する方法が採られる。沈澱し
た11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オ
ン−20−カルプアルデヒドを除去した培養液に含
まれる菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分離
などにより分離除去して得られた培養瀘液又は上
清は、上記のアルデヒドを溶解しかつ水と相分離
する有機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホル
ム、クロロホルムとメタノールの混合液などを用
いて抽出操作を行ない、得られた抽出液を集め、
これより溶媒を留去することによつて、培養液中
に溶解している11β−ヒドロキシプレグナ−４−
エン−３−オン−20−カルプアルデヒドを回収す
ることができる。この有機溶媒による抽出操作は
培養瀘液又は上清についてのみでなく、培養液そ
のものについて行なうことができる。上記の方法
で得られた沈澱物又は抽出物中には11β−ヒドロ
キシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カルプ
アルデヒドの他には残存基質の11β−ヒドロキシ
リトコール酸及び／又はその塩並びに副生物はほ
とんど含まれておらず、必要に応じてメタノール
水溶液からの再結晶により容易に高純度の11β−
ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−
カルプアルデヒドを取得することができる。 本発明で基質として用いる11β−ヒドロキシリ
トコール酸は例えば次の反応式で示される方法に
よりデオキシコール酸から誘導することができ
る。 （上記式中、Meはメチル基を表わし、ｔ−Buは
tert.−ブチル基を表わし、Acはアセチル基を表
わし、HMPAはヘキサメチルホスホルトリアミ
ドを表わす。） 本発明により得られる11β−ヒドロキシプレグ
ナ−４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒド
は、例えば前記の反応式で示される方法により
11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３，20−
ジオンに誘導することができる。すなわち、11β
−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20
−カルプアルデヒドと一般式（） R1COOH ……（） （式中、R1はアルキル基を表わす。）で示される
カルボン酸又はその反応性誘導体、例えば酸ハラ
イド、酸無水物などとを常法により反応させるこ
とにより一般式（）で示される11β−アシルオ
キシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カルプ
アルデヒドが得られる。代表的な反応例として挙
げられる11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−
３−オン−20−カルプアルデヒドと一般式（）
で示されるカルボン酸のクロライドとの反応はト
リエチルアミン、ピリジンなどの第３級アミンの
存在下に行なわれる。この反応は溶媒中で行なう
のが好ましく、溶媒として塩化メチレン、クロロ
ホルム又はこれらとベンゼン、トルエン、酢酸エ
チルなどとの混合溶媒が好ましく用いられる。こ
の反応は通常室温で行なうが、必要に応じて約60
℃までの加温下に行なうこともできる。反応後、
反応混合物を希塩酸水、重曹水、水などで洗滌し
たのち乾燥し、ついでこれにより低沸点物を留去
することにより一般式（）で示される11β−ア
シルオキシプレグナー４−エン−３−オン−20−
カルプアルデヒドの粗生成物を得る。この粗生成
物をそのまま次の反応に用いることができる。一
般式（）で示される11β−アシルオキシプレグ
ナー４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒド
とピペリジン、ピロリジン、モルホリンなどの第
２級アミンとを反応させることにより一般式
（）で示されるエナミンが生成する。第２級ア
ミンは一般式（）で示される11β−アシルオキ
シプレグナー４−エン−３−オン−20−カルプア
ルデヒドに対して等モル〜２倍モル量用いる。反
応中に副生する水を、ベンゼン、トルエンなどの
水と共沸する溶媒を用いて加熱還流下に反応系か
ら除去する。この反応は特に触媒を要しないが、
Ｐ−トルエンスルホン酸などの触媒の存在下に反
応を行なうこともできる。反応後、反応混合物か
ら減圧下に低沸点物を留去することにより、一般
式（）で示されるエナミンの粗生成物が得られ
る。この粗生成物をそのまま次の反応に用いるこ
とができる。一般式（）で示されるエナミンを
オゾン酸化又は無水クロム酸、ピリジウムクロル
クロメート、重クロム酸ナトリウムなどを用いて
酸化することにより、一般式（）で示される
11β−アシルオキシプレグナー４−エン−３，20
−ジオンを得ることができる。なお、無水クロム
酸を用いる酸化反応は通常ピリジン溶媒中で行な
う。この場合、一般式（）で示されるエナミン
を溶媒させたピリジン溶液に無水クロム酸とピリ
ジンの混合液を徐々に加えるか、又は無水クロム
酸とピリジンの混合液に一般式（）で示される
エナミンを溶解させたピリジン溶液を徐々に加え
ることにより反応を行なう。この酸化反応は氷冷
下ないしは室温下に行なわれる。反応後、反応混
合物をベンゼン、トルエンなどで希釈し、これに
より固形物を瀘過により除去したのち、瀘過に希
塩酸水を加え、ついでベンゼン、トルエンなどで
抽出し、抽出液から低沸点物を留去することによ
り、一般式（）で示される11β−アシルオキシ
プレグナー４−エン−３，20−ジオンの粗生成物
が得られる。この粗生成物を必要に応じてシリカ
ゲルカラムクロマトグラフイーに付することによ
り高純度の一般式（）で示される11β−アシル
オキシプレグナー４−エン−３，20−ジオンを得
ることができる。一般式（）で示される11β−
アシルオキシプレグナー４−エン−３，20−ジオ
ンを通常の加水分解反応に付することにより11β
−ヒドロキシプレグナー４−エン−３，20−ジオ
ンが得られる。例えば、この加水分解反応はメタ
ノール、エタノールなどの溶媒中で水酸化カリウ
ム、水酸化ナトリウムなどの存在下、室温ないし
溶媒の還流温度で行なわれる。反応後、反応混合
物を減圧下に濃縮し、ついでベンゼン、トルエン
などで希釈し、水、希塩酸水などで洗滌し、乾燥
したのち、これより低沸点物を留去することによ
り11β−ヒドロキシプレグナー４−エン−３，20
−ジオンの粗生成物が得られる。この粗生成物は
必要に応じてシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ーに付することにより精製することができる。 以下、実施例及び参考例によつて本発明をさら
に詳細に説明する。 参考例 アルカリゲネス・フエカリスD4020−K15菌株
の取得方法 培地１（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化
ナトリウム0.05％、ペプト0.5％、酵母エキス0.5
％、塩化ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のスラ
ントに生育させたアルカリゲネス・フエカリス
D4020菌株の一白金耳を、予め試験管内に準備し
た培地２（組成：デオキシコール酸２％、水酸化
ナトリウム0.2％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸
２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6
％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母
エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で８〜10時
間振盪培養した。この培養液の0.3mlを予め試験
管に準備した培地３（組成：デオキシコール酸0.5
％、水酸化ナトリウム0.05％、グルコース0.1％、
硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.02％）の10
mlに加え、30℃で10〜15時間培養した。ついでこ
の対数増殖期にある菌体を0.45μのメンブレンフ
イルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩緩
衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25ml
に懸濁させた。これに終濃度が20μｇ／mlになる
ようにＮ−メチル−N′−ニトロソグアニジンを
添加し、30℃で10〜15分間振盪することにより突
然変異処理を行なつた。突然変異処理を施した菌
体を0.45μのメンブレンフイルターで濾過集菌し、
0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同
じ緩衝液20mlに懸濁した。得られた菌懸濁液を滅
菌生理食塩水で希釈し、それを培地４（組成：デ
オキシコール酸0.5％、水酸化ナトリウム0.05％、
硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％、酵母エキス0.02％及び寒天
1.5％）の寒天平板上に500〜1000個のコロニーを
出現させるように塗布したのち、30℃で３〜４日
間培養した。出現したコロニー中の極小コロニー
を培地１のスラントに単離したのち、その一白金
耳を予め試験管に準備した培地５（組成：デオキ
シコール酸0.2％、水酸化ナトリウム0.02％、グ
ルコース0.1％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２
水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、
硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキ
ス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で24時間振盪培
養した。得られたそれぞれの培養液中の生産物を
薄層クロマトグラフイーにより検定し、上記の培
養条件下で12α−ヒドロキシプレグナー１，４−
ジエン−３−オン−20−カルプアルデヒドを選択
的に蓄積している−菌株を見い出し、これをアル
カリゲネス・フエカリスD4020−K15と命名し
た。 実施例 アルカリゲネス・フエカリスD4020−K15菌株
（微工研条寄第204号）を次に示す方法で培養し
た。11β−ヒドロキシリトコール酸0.5ｇ、グリセ
ロール0.5ｇ、硝酸アンモニウム0.1ｇ、燐酸２水
素カリウム0.1ｇ、燐酸水素２カリウム0.6ｇ、ク
エン酸マグネシウム0.02ｇ、酵母エキス0.02ｇ及
び水酸化ナトリウム0.1ｇに水道水を加えて容量
を100ml（PH：8.0）に調整し、これを培他とし
た。この培地を500ml容坂口フラスコに入れ、120
℃で15分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培
地と同じ培地で試験管振盪機にて１日間増殖させ
た種菌の10mlを上記の500ml容坂口フラスコに添
加し、30℃で２日間振盪培養した。培養後、この
培養液を集め、遠心分離機で培養中に生じた沈澱
物を2000r.p.mで１分間処理し、ついでデカンテ
ーシヨンすることにより培養液上清及び菌体と分
離した。この沈澱物を水洗後乾燥することによ
り、11β−ヒドロキシプレグナー４−エン−３−
オン−20−カルプアルデヒドを0.29ｇ得た。 得られた11β−ヒドロキシプレグナー４−エン
−３−オン−20−カルプアルデヒドの一部を取
り、これにメタノールを加えて２％溶液とし、こ
の溶液25μをミクロボンダバツクＣ−18カラム
を備えた高速液体クロマトグラフイー（米国ウオ
ーターズ社製、HLC−GPC−244型）に注入し
た。移動相としてPH4.0に調整した水／メタノー
ルの25／75容量比の混合液を流速１ml／分で流
し、検出を屈折率方式で行なつた。得られた液体
クロマトグラフにおける各ピークの面積比を積分
計（島津製作所製、島津クロマトパツクＣ−
R1A）で求め、この面積比から上記の11β−ヒド
ロキシプレグナー４−エン−３−オン−20−カル
プアルデヒドの純度を求めたところ90％であつ
た。 また上記で得られた11β−ヒドロキシプレグナ
ー４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒドの
一部を水を10％含むメタノールに溶解し、不溶物
を濾過により除去したのち、水／メタノールから
再結晶することにより、HPLC純度95％の精製物
を得た。 11β−ヒドロキシプレグナー４−エン−３−オ
ン−20−カルプアルデヒドの確認を下記の方法で
行なつた。 融点：147〜149℃ FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）：〔Ｍ〕+344 NMRスペクトル（90MHz）δCDCl3 HMS： 0.97（3H、ｓ）；1.08（3H、ｄ）；1.42（3H、
ｓ）；4.38〜4.23（1H、ｍ）；5.63（1H、ｓ）；
9.55（1H、ｄ） IRスペクトル（KBr、cm-1）： 1610、1650、1720、3400
リゲネス・フエカリスD4020菌株及びアルカリゲ
ネス・フエカリスD4020−K15菌株の同定を行な
つた。アルカリゲネス・フエカリスD4020菌株
は、桿菌であること、周鞭毛を有していること、
グラム染色が陰性であることなどの顕微鏡的所見
並びにオキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応がと
もに陽性であること、好気性であること、Ｏ−Ｆ
テストの結果が酸化的（Oxidative）であること
などの生理学的性質からパージエイズ・マニユア
ル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー第７版及び第８版に基づき、アルカリゲネス
属に属する細菌であると同定した。さらにアルカ
リゲネス・フエカリスD4020菌株は、ゼラチンを
液化しない点、ミルクがアルカリ性となる以外に
変化しない点及び脱窒反応がない点から、アルカ
リゲネス属のフエカリス種に属する細菌であると
同定した。また、一般に突然変異株はその親株と
同じ種に属するものと考えられており、アルカリ
ゲネス・フエカリスD4020−K15菌株はアルカリ
ゲネス属のフエカリス種に属する細菌であると判
定した。 本発明による11β−ヒドロキシプレグナ−４−
エン−３−オン−20−カルプアルデヒドの生産
は、11β−ヒドロキシリトコール酸及び／又はそ
の塩を基質として11β−ヒドロキシプレグナ−４
−エン−３−オン−20−カルプアルデヒドを生産
するアルカリゲネス属に属する細菌を、11β−ヒ
ドロキシリトコール酸及び／又はその塩を含む培
地に培養することにより行なわれる。11β−ヒド
ロキシリトコール酸の塩としては具体的には11β
−ヒドロキシリトコール酸のナトリウム、カリウ
ムなどのアルカリ金属の塩が挙げられる。11β−
ヒドロキシリトコール酸及び／又はその塩の濃度
は通常約１〜100ｇ／の範囲でよいが、生産さ
れる11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−
オン−20−カルプアルデヒドの収量、培養条件及
び操作性などの経済的観点から約２〜50ｇ／の
範囲が好ましい。培養方法は原則的には一般微生
物の好気培養で採用される方法と同じであるが、
通常は液体培地による振盪培養法又は通気撹拌培
養法が用いられる。培地は上記の11β−ヒドロキ
シリトコール酸及び／又はその塩を基質として
11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン
−20−カルプアルデヒドを生産するアルカリゲネ
ス属に属する細菌が資化利用できる栄養源を含有
するものであればよい。炭素源としては11β−ヒ
ドロキシリトコール酸及び／又はその塩を単一炭
素源としてもよく、或いは11β−ヒドロキシリト
コール酸及び／又はその塩にグルコース、グリセ
リン、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどを併
用してもよい。また窒素源としては、例えば硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸
カリウムなどの無機窒素源、又はポリペプトン、
ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源が用いられ
る。また、この他に燐酸水素２カリウム、燐酸２
水素カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸マグ
ネシウムなどの塩類が添加される。培養条件に特
徴はないが、通常25〜35℃で10時間〜７日間振盪
培養又は通気撹拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された11β−ヒ
ドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カ
ルプアルデヒドは、基質の11β−ヒドロキシリト
コール酸又はその塩と比較して水に対する溶解度
が著しく小さく、通常は培養液中に析出沈澱して
くる。この11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン
−３−オン−20−カルプアルデヒドを分離採取す
るには、沈澱している11β−ヒドロキシプレグナ
−４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒドを
デカンテーシヨンにより浮遊している菌体を含む
培養液から分離するか、または浮遊している菌体
が沈澱しないような回転数で遠心分離を行ない、
析出している11β−ヒドロキシプレグナ−４−エ
ン−３−オン−20−カルプアルデヒドを沈澱させ
たのち上記のデカンテーシヨンにより11β−ヒド
ロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カル
プアルデヒドを分離する方法が採られる。沈澱し
た11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オ
ン−20−カルプアルデヒドを除去した培養液に含
まれる菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分離
などにより分離除去して得られた培養瀘液又は上
清は、上記のアルデヒドを溶解しかつ水と相分離
する有機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホル
ム、クロロホルムとメタノールの混合液などを用
いて抽出操作を行ない、得られた抽出液を集め、
これより溶媒を留去することによつて、培養液中
に溶解している11β−ヒドロキシプレグナ−４−
エン−３−オン−20−カルプアルデヒドを回収す
ることができる。この有機溶媒による抽出操作は
培養瀘液又は上清についてのみでなく、培養液そ
のものについて行なうことができる。上記の方法
で得られた沈澱物又は抽出物中には11β−ヒドロ
キシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カルプ
アルデヒドの他には残存基質の11β−ヒドロキシ
リトコール酸及び／又はその塩並びに副生物はほ
とんど含まれておらず、必要に応じてメタノール
水溶液からの再結晶により容易に高純度の11β−
ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20−
カルプアルデヒドを取得することができる。 本発明で基質として用いる11β−ヒドロキシリ
トコール酸は例えば次の反応式で示される方法に
よりデオキシコール酸から誘導することができ
る。 （上記式中、Meはメチル基を表わし、ｔ−Buは
tert.−ブチル基を表わし、Acはアセチル基を表
わし、HMPAはヘキサメチルホスホルトリアミ
ドを表わす。） 本発明により得られる11β−ヒドロキシプレグ
ナ−４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒド
は、例えば前記の反応式で示される方法により
11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３，20−
ジオンに誘導することができる。すなわち、11β
−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−20
−カルプアルデヒドと一般式（） R1COOH ……（） （式中、R1はアルキル基を表わす。）で示される
カルボン酸又はその反応性誘導体、例えば酸ハラ
イド、酸無水物などとを常法により反応させるこ
とにより一般式（）で示される11β−アシルオ
キシプレグナ−４−エン−３−オン−20−カルプ
アルデヒドが得られる。代表的な反応例として挙
げられる11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−
３−オン−20−カルプアルデヒドと一般式（）
で示されるカルボン酸のクロライドとの反応はト
リエチルアミン、ピリジンなどの第３級アミンの
存在下に行なわれる。この反応は溶媒中で行なう
のが好ましく、溶媒として塩化メチレン、クロロ
ホルム又はこれらとベンゼン、トルエン、酢酸エ
チルなどとの混合溶媒が好ましく用いられる。こ
の反応は通常室温で行なうが、必要に応じて約60
℃までの加温下に行なうこともできる。反応後、
反応混合物を希塩酸水、重曹水、水などで洗滌し
たのち乾燥し、ついでこれにより低沸点物を留去
することにより一般式（）で示される11β−ア
シルオキシプレグナー４−エン−３−オン−20−
カルプアルデヒドの粗生成物を得る。この粗生成
物をそのまま次の反応に用いることができる。一
般式（）で示される11β−アシルオキシプレグ
ナー４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒド
とピペリジン、ピロリジン、モルホリンなどの第
２級アミンとを反応させることにより一般式
（）で示されるエナミンが生成する。第２級ア
ミンは一般式（）で示される11β−アシルオキ
シプレグナー４−エン−３−オン−20−カルプア
ルデヒドに対して等モル〜２倍モル量用いる。反
応中に副生する水を、ベンゼン、トルエンなどの
水と共沸する溶媒を用いて加熱還流下に反応系か
ら除去する。この反応は特に触媒を要しないが、
Ｐ−トルエンスルホン酸などの触媒の存在下に反
応を行なうこともできる。反応後、反応混合物か
ら減圧下に低沸点物を留去することにより、一般
式（）で示されるエナミンの粗生成物が得られ
る。この粗生成物をそのまま次の反応に用いるこ
とができる。一般式（）で示されるエナミンを
オゾン酸化又は無水クロム酸、ピリジウムクロル
クロメート、重クロム酸ナトリウムなどを用いて
酸化することにより、一般式（）で示される
11β−アシルオキシプレグナー４−エン−３，20
−ジオンを得ることができる。なお、無水クロム
酸を用いる酸化反応は通常ピリジン溶媒中で行な
う。この場合、一般式（）で示されるエナミン
を溶媒させたピリジン溶液に無水クロム酸とピリ
ジンの混合液を徐々に加えるか、又は無水クロム
酸とピリジンの混合液に一般式（）で示される
エナミンを溶解させたピリジン溶液を徐々に加え
ることにより反応を行なう。この酸化反応は氷冷
下ないしは室温下に行なわれる。反応後、反応混
合物をベンゼン、トルエンなどで希釈し、これに
より固形物を瀘過により除去したのち、瀘過に希
塩酸水を加え、ついでベンゼン、トルエンなどで
抽出し、抽出液から低沸点物を留去することによ
り、一般式（）で示される11β−アシルオキシ
プレグナー４−エン−３，20−ジオンの粗生成物
が得られる。この粗生成物を必要に応じてシリカ
ゲルカラムクロマトグラフイーに付することによ
り高純度の一般式（）で示される11β−アシル
オキシプレグナー４−エン−３，20−ジオンを得
ることができる。一般式（）で示される11β−
アシルオキシプレグナー４−エン−３，20−ジオ
ンを通常の加水分解反応に付することにより11β
−ヒドロキシプレグナー４−エン−３，20−ジオ
ンが得られる。例えば、この加水分解反応はメタ
ノール、エタノールなどの溶媒中で水酸化カリウ
ム、水酸化ナトリウムなどの存在下、室温ないし
溶媒の還流温度で行なわれる。反応後、反応混合
物を減圧下に濃縮し、ついでベンゼン、トルエン
などで希釈し、水、希塩酸水などで洗滌し、乾燥
したのち、これより低沸点物を留去することによ
り11β−ヒドロキシプレグナー４−エン−３，20
−ジオンの粗生成物が得られる。この粗生成物は
必要に応じてシリカゲルカラムクロマトグラフイ
ーに付することにより精製することができる。 以下、実施例及び参考例によつて本発明をさら
に詳細に説明する。 参考例 アルカリゲネス・フエカリスD4020−K15菌株
の取得方法 培地１（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化
ナトリウム0.05％、ペプト0.5％、酵母エキス0.5
％、塩化ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のスラ
ントに生育させたアルカリゲネス・フエカリス
D4020菌株の一白金耳を、予め試験管内に準備し
た培地２（組成：デオキシコール酸２％、水酸化
ナトリウム0.2％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸
２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6
％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母
エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で８〜10時
間振盪培養した。この培養液の0.3mlを予め試験
管に準備した培地３（組成：デオキシコール酸0.5
％、水酸化ナトリウム0.05％、グルコース0.1％、
硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.02％）の10
mlに加え、30℃で10〜15時間培養した。ついでこ
の対数増殖期にある菌体を0.45μのメンブレンフ
イルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩緩
衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25ml
に懸濁させた。これに終濃度が20μｇ／mlになる
ようにＮ−メチル−N′−ニトロソグアニジンを
添加し、30℃で10〜15分間振盪することにより突
然変異処理を行なつた。突然変異処理を施した菌
体を0.45μのメンブレンフイルターで濾過集菌し、
0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同
じ緩衝液20mlに懸濁した。得られた菌懸濁液を滅
菌生理食塩水で希釈し、それを培地４（組成：デ
オキシコール酸0.5％、水酸化ナトリウム0.05％、
硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％、酵母エキス0.02％及び寒天
1.5％）の寒天平板上に500〜1000個のコロニーを
出現させるように塗布したのち、30℃で３〜４日
間培養した。出現したコロニー中の極小コロニー
を培地１のスラントに単離したのち、その一白金
耳を予め試験管に準備した培地５（組成：デオキ
シコール酸0.2％、水酸化ナトリウム0.02％、グ
ルコース0.1％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２
水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、
硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキ
ス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で24時間振盪培
養した。得られたそれぞれの培養液中の生産物を
薄層クロマトグラフイーにより検定し、上記の培
養条件下で12α−ヒドロキシプレグナー１，４−
ジエン−３−オン−20−カルプアルデヒドを選択
的に蓄積している−菌株を見い出し、これをアル
カリゲネス・フエカリスD4020−K15と命名し
た。 実施例 アルカリゲネス・フエカリスD4020−K15菌株
（微工研条寄第204号）を次に示す方法で培養し
た。11β−ヒドロキシリトコール酸0.5ｇ、グリセ
ロール0.5ｇ、硝酸アンモニウム0.1ｇ、燐酸２水
素カリウム0.1ｇ、燐酸水素２カリウム0.6ｇ、ク
エン酸マグネシウム0.02ｇ、酵母エキス0.02ｇ及
び水酸化ナトリウム0.1ｇに水道水を加えて容量
を100ml（PH：8.0）に調整し、これを培他とし
た。この培地を500ml容坂口フラスコに入れ、120
℃で15分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培
地と同じ培地で試験管振盪機にて１日間増殖させ
た種菌の10mlを上記の500ml容坂口フラスコに添
加し、30℃で２日間振盪培養した。培養後、この
培養液を集め、遠心分離機で培養中に生じた沈澱
物を2000r.p.mで１分間処理し、ついでデカンテ
ーシヨンすることにより培養液上清及び菌体と分
離した。この沈澱物を水洗後乾燥することによ
り、11β−ヒドロキシプレグナー４−エン−３−
オン−20−カルプアルデヒドを0.29ｇ得た。 得られた11β−ヒドロキシプレグナー４−エン
−３−オン−20−カルプアルデヒドの一部を取
り、これにメタノールを加えて２％溶液とし、こ
の溶液25μをミクロボンダバツクＣ−18カラム
を備えた高速液体クロマトグラフイー（米国ウオ
ーターズ社製、HLC−GPC−244型）に注入し
た。移動相としてPH4.0に調整した水／メタノー
ルの25／75容量比の混合液を流速１ml／分で流
し、検出を屈折率方式で行なつた。得られた液体
クロマトグラフにおける各ピークの面積比を積分
計（島津製作所製、島津クロマトパツクＣ−
R1A）で求め、この面積比から上記の11β−ヒド
ロキシプレグナー４−エン−３−オン−20−カル
プアルデヒドの純度を求めたところ90％であつ
た。 また上記で得られた11β−ヒドロキシプレグナ
ー４−エン−３−オン−20−カルプアルデヒドの
一部を水を10％含むメタノールに溶解し、不溶物
を濾過により除去したのち、水／メタノールから
再結晶することにより、HPLC純度95％の精製物
を得た。 11β−ヒドロキシプレグナー４−エン−３−オ
ン−20−カルプアルデヒドの確認を下記の方法で
行なつた。 融点：147〜149℃ FD−Massスペクトル（ｍ／ｚ）：〔Ｍ〕+344 NMRスペクトル（90MHz）δCDCl3 HMS： 0.97（3H、ｓ）；1.08（3H、ｄ）；1.42（3H、
ｓ）；4.38〜4.23（1H、ｍ）；5.63（1H、ｓ）；
9.55（1H、ｄ） IRスペクトル（KBr、cm-1）： 1610、1650、1720、3400
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 11β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−
オン−20−カルプアルデヒド。 ２ 11β−ヒドロキシリトコール酸及び／又はそ
の塩を基質として11β−ヒドロキシプレグナ−４
−エン−３−オン−20−カルプアルデヒドを生産
するアルカリゲネス属に属する細菌を、11β−ヒ
ドロキシリトコール酸及び／又はその塩を含む培
地に培養することを特徴とする11β−ヒドロキシ
プレグナ−４−エン−３−オン−20−カルプアル
デヒドの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58081235A JPS59205396A (ja) | 1983-05-09 | 1983-05-09 | １１β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルブアルデヒド及びその製造法 |
| US06/607,458 US4592868A (en) | 1983-05-09 | 1984-05-07 | 11-hydroxypregn-4-en-3-one-20-carbaldehyde and a method for its production |
| DE8484105166T DE3462611D1 (en) | 1983-05-09 | 1984-05-08 | 11-hydroxypregn-4-en-3-one-20-carbaldehyde and a method for its production |
| EP84105166A EP0124903B1 (en) | 1983-05-09 | 1984-05-08 | 11-hydroxypregn-4-en-3-one-20-carbaldehyde and a method for its production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58081235A JPS59205396A (ja) | 1983-05-09 | 1983-05-09 | １１β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルブアルデヒド及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59205396A JPS59205396A (ja) | 1984-11-20 |
| JPH0338838B2 true JPH0338838B2 (ja) | 1991-06-11 |
Family
ID=13740776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58081235A Granted JPS59205396A (ja) | 1983-05-09 | 1983-05-09 | １１β−ヒドロキシプレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルブアルデヒド及びその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0124903B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59205396A (ja) |
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| DE3112981A1 (de) * | 1981-04-01 | 1982-10-21 | Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf | Verfahren zum gezielten mikrobiologischen abbau von gallensaeuren |
| US4405525A (en) * | 1981-07-24 | 1983-09-20 | The Upjohn Company | Composition of matter and process |
| EP0077544B1 (en) * | 1981-10-20 | 1986-09-10 | Kuraray Co., Ltd. | Microbial process for producing 12-alpha-hydroxypregna-1,4-dien-3-one-20-alpha-carboxylic acid |
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1983
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1984
- 1984-05-07 US US06/607,458 patent/US4592868A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-05-08 DE DE8484105166T patent/DE3462611D1/de not_active Expired
- 1984-05-08 EP EP84105166A patent/EP0124903B1/en not_active Expired
Also Published As
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