JPH0438394B2 - - Google Patents
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- JPH0438394B2 JPH0438394B2 JP63212641A JP21264188A JPH0438394B2 JP H0438394 B2 JPH0438394 B2 JP H0438394B2 JP 63212641 A JP63212641 A JP 63212641A JP 21264188 A JP21264188 A JP 21264188A JP H0438394 B2 JPH0438394 B2 JP H0438394B2
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒユミコーラ（Humicola）リパー
ゼの組換え体DNA生産物の製造方法および組換
え体ヒユミコーラリパーゼに関する。 〔従来技術および発明が解決しようとする課題〕 ヒユミコーラリパーゼは、好熱性サーモマイセ
ス（Thermomyces）種、例えばH.ラヌギノザ
（lanuginasa）（グリフオンアンドマウブランク）
ブンセ、H.ステラータ（Stellata）ブンセ、H.グ
リセア var.サーモイデア（grisea var.ther−
moidea）、コニーアンドエマーソン、H.インソ
レンス（insolens）、コニーアンドエマーソン、
サーモマイセスイバダネンシス（Thermomyces
ibada−nensis）、アピニスアンドエギンス、H.
ヒアロサーモフイラ（hyalothermophila）モウ
バシア、マゼンアンドアブデルーヘフユツ、H.
グリセア（grisea）var.インデイカ（indica）ス
ブラマンヤン、H.ブレビス（brevis）var.サーモ
イデア（thermoidea）、スブラマンヤンアンドチ
ルマラカーアンドH.ブレビスポラスブラマンヤ
ンアンドチルマラカーを含む好熱性ヒユミコーラ
（Humicola）種の菌株から得ることができる。 H.ラヌギノザ（lanuginosa）はまた、同義語
サーモマイセスラヌギノザス（Thermomyces
lanuginosus）ツイクリンスキー、セペドニヌム
ラヌギノザム（Sepedonium lanuginosum） グ
リフオンアンドマウブランク、セペドニウムサー
マフイラムシクロスポラム（Sepedonium
thermaphilum cyclosporum）アンドS.サーマフ
イラムオボスポラム（thermaphilum
ovosporum）ベリヒ、アクレモニラ
（Acremoniella） sp.レーベ、アクレモニラサ
ーモフイラ（Acremonilla thermophila）クルジ
アンドモノトスポララヌギノザ（Monotospora
lanuginosa）（グリフオンアンドマウブランク）
マーソンとしても記載されてきている。 更に種スキタリジウムサーモフイラム
（Scytalidium thermophilum）（コニーアンドエ
マーソン）アウスウイツチは、ヘーゲルによりヒ
ユミコーラインソレンス（Humilola insolens）
に属するものと考えられた（1975，The ecology
of thermophilic fungi in Indonesia.In
Biodegradation et Humification.Rapport du
ler Colloque Internationei−Nancy 1974（ed.G.
Kilbertius，O.Reisinger，A.Mourey＆J.A.
Cancela Da Fonseca），Sarreguemines：
Pierron Editeur−57206）。 ヒユミコーララヌギノザリパーゼの製造は、日
本特許公開公報48−62990並びにヨーロツパ特許
出願第87307684.8に記載されている。後者はまた
脂質分解洗剤の添加剤におけるこのリパーゼの使
用を開示している。 洗剤における酵素添加剤の世界的に広範囲の使
用並びにヒユミコーラ（Humicola）リパーゼが
洗浄力および安定性に関して公知の洗剤リパーゼ
よりも秀れていることが判明したために、このリ
パーゼの商業的興味は高いものがある。 工業的酵素の製造において、収率は製造プロセ
スの有利さに関し常に重要である。伝統的な改良
方法は、高生産変異体を得るために野性株を突然
変異させることである。組換え体DNA技術を用
いての別の可能性は、所望生産物に対する遺伝子
を、野性株よりも高収率又は他の好ましい特性を
もたらしうる宿主微生物に形質転換することであ
る。 かくして、本発明の目的は組換え体DNA技術
によりヒユミコーラリパーゼの製造方法を提供す
ることにある。 従来、組換え体DNA技術によりポリペプチド
又は蛋白質を製造するため、多数のプロセスが開
発されてきた。主な興味は細菌と酵母に集中して
おり、例えばE.コリー（coli）。バシラスズブチ
リス（Bacillus subtilis）およびサツカロマイセ
イセレビシエ（Sacharomyces cerevisiae）は例
えば発現および選択係に関して十分に特徴する種
である。 上記の微生物に加えて、繊維状菌、特にアスペ
ルギルス（Aspergillus）種、例えばアスペルギ
ルスニガー（Aspergillus niger）およびアスペ
ルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）（酵素の
商業的製造に対し十分特徴づけられかつ広く使用
されている）は、組換え体DNAベクターに対し
宿主微生物として魅力的な候補者である。 過去数年において、アスペルギルスニドランス
（Aspergillus nidulans）の形質転換に対する
種々の選択マーカーが記述されてきており更に真
菌細胞の分化をコントロールする遺伝学的および
分子的プロセスの研究の目的で繊維状真菌の統合
的形質転換に対しての手順が最近開発されてきて
いる。 A.ニドランスの形質転換が、ニユロスポラク
ラザ（Neurospora crassa） pyr−４遺伝子
（Ballance，D.J.等、Biochem.Biophys.Res.
Commun.，112（1983）284−289）、A.ニドラン
ス（nidulans）amdS遺伝子（Tilburn，J.G.等、
Gene26（1983）205−221）、A.ニドランス trpC
遺伝子（Yelton，M.M.等、Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.，81（1984）1470−1474）およびA.ニド
ランス argB遺伝子（ジヨーン、M.A.および
Peberdy J.，Microb.Technol.6（1984）386−
389）を含むプラスミドを用いて実証されている。
形質転換DNAは相当に低い繁度（典形的には
1000個未満の被転換体／DNA1μg）で宿主ゲノ
ムに組込まれることが見出された。 A.ニドランスのamdS遺伝子を用いたアスペル
ギルスニガーの形質転換は記載されており（ケリ
ーJ.Mおよびハイネス、M.J.，EMBO Journal
４（1985），475−479）更にamdSは唯一の窒素
源としてアセタミド上で強く増殖できないアスペ
ルギルスニガーの形質転換に用いるための強力な
選択マーカーであることを示した。アスペルギル
スニドランスのargB遺伝子を用いた
Aspergillus nigerの形質転換は記載されている
（Buxton.F.P.等、Gene37（1985），207−214）。 アスペルギルスニガーの被転換体の製造方法
が、ヨーロツパ特許018438Aに記載されており、
さらに同0215594、および0249350は繊維状真菌中
の非相同ポリペプチドの発現を記載している。最
後にW087／04464はアスペルギルス中の高級真核
遺伝子の発現を記載する。 〔課題を解決するための手段、および発明の作用
および効果〕 本発明によれば今や以下の内容が見出された。
すなわち、アスペルギルスsp.菌株中ヒユミコー
ラsp.リパーゼの高レベル発現を得ること、また
はヒユミコーラ菌株中でのリパーゼの生産を高め
ることが可能である。 最も広い面において、本発明は組換え体ヒユミ
コーラ（Humicola）リパーゼの製造方法を提供
するものであり、この方法は、次の工程： (a) 遺伝子発現を促進する機能をコードする
DNA配列およびヒユミコーラリパーゼをコー
ドするDNA配列を含んでなる適当な組換え体
DNAクローニングベクターを得る工程： (b) 工程(a)で得たクローニングベクターを用いて
適当な宿主生物を形質転換する工程；および (c) 適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次
いで所望により培地からリパーゼを回収する工
程を含んで成る。 本発明の次の狭い面において、アスペルギルス
においてヒユミコーラリパーゼの製法が提供さ
れ、この方法は次の工程(a)〜(c)： (a) １回のコピー又はそれ以上のコピーで適当な
アスペルギルスのゲノムに組込むことのでき、
更に遺伝子発現を促進する機能をコードする
DNA配列、被転換体の適当な選択マーカー、
およびヒユミコーラリパーゼをコードする
DNA配列を含んで成る組換え体DNAクローニ
ングベクター系を得る工程； (b) 工程(a)で得た組換え体DNAクローニングベ
クター系を用い、選ばれた選択マーカーに対し
機能遺伝子を有しないアスペルギルス宿主を形
質転換する工程；および (c) 適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次
いで所望により培地からリパーゼを回収する工
程を含んで成る。 本発明の第二の面によれば、以下の方法による
アスペルギルスにおけるヒユミコーラリパーゼの
製造方法が提供され、この方法によれば上記の如
く、組換え体DNAクローニングベクター系で形
質転換されたアスペルギルス菌株を適当な培地中
で培養し次いでリパーゼを培地から回収する。 本発明の第三の面によれば、公知の天然ヒユミ
コーラリパーゼとはグリコシル化において差異を
有する新規組換え体ヒユミコーラリパーゼ製品が
提供される。すなわち、本発明の組換え体ヒユミ
コーラリパーゼの性質およびグリコシル化の所望
の程度は、天然ヒユミコーラ菌株から得られるリ
パーゼとは異なる。本発明のヒユミコーラリパー
ゼ製品は、更に、相当する天然のヒユミコーラリ
パーゼに比較して改良された熱安定性にその特徴
を有する。 更に詳しくは、新規組換え体ヒユミコーラリパ
ーゼは、以下の点においてその特徴を有する。す
なわち、炭水化物含量は天然リパーゼと同じレベ
ルであるかまたは天然リパーゼ中の炭水化物含量
よりもより大である。すなわち、新規ヒユミコー
ラリパーゼは、天然リパーゼとは他の炭水化物を
含有する。炭水化物含量は、典型的には約５〜約
30％（ｗ／ｗ）であり、一方天然リパーゼ中の炭
水化物含量は約4.9％（ｗ／ｗ）である。更に特
異的には、炭水化物含量は５〜約15％（ｗ／ｗ）
であり、更にまた特異的には約7.5〜約8.5％
（ｗ／ｗ）の範囲内にある。 本発明の組換え体ヒユミコーラリパーゼ製品
は、例えばヨーロツパ特許出願87307648.8に記載
される如く天然リパーゼと同様の方法で洗剤に使
用する酵素洗剤添加剤として使用できる。 本発明で用いられる語句「組換え体ヒユミコー
ラリパーゼ」は、天然ヒユミコーラリパーゼをコ
ードするcDNAにより形質転換された微生物を培
養して得られるヒユミコーラリパーゼに適用され
る。語句「天然ヒユミコーラリパーゼ」は、本明
細書の導入部において記載した好熱性サーモマイ
セスsp.を含む好熱性ヒユミコーラsp.の天然起源
から得られるヒユミコーラリパーゼに適用され
る。 A.オリゼ由来の組換え体ヒユミコーラリパー
ゼは、ペプチド配列が同じであるにもかゝわらず
天然ヒユミコーラリパーゼとは同一でない。明ら
かに、宿主微生物は、ドナー微生物とは異なつた
程度にかつ異なつた糖部分により発現ポリペプチ
ドをグリコシル化する。A.ニガーにおいては、
グリコシル化の程度は同レベルにあると考えられ
るが、一方糖部分はA.オリゼにおけると同種の
ものと思われる。天然リパーゼと組換え体リパー
ゼの判別および同定は、それらのグリコシル化を
測定することによつて可能である。従つて、天然
ヒユミコーララヌギノザリパーゼとA.オリゼ形
質転換体からのこのリパーゼの組換え体形を典形
例にとると、両方のリパーゼはＮ−グリコシル化
されているが糖残基は異なつている。天然リパー
ゼは、ガラクトースは有しておらず、そして組換
え体リパーゼよりマンノースが少なく、さらにま
た種々の程度にグリコシル化されている。天然リ
パーゼは、その分子量に約1500ダルトンを加える
炭水化物部分（約５％）を有し、組換え体リパー
ゼは約2600ダルトンを加える炭水化物部分（約８
％）を有する。詳しくは、例５参照のこと。 本発明による新規組換え体ヒユミコーラリパー
ゼは、１モルのリパーゼ蛋白質当たり約１〜約12
モルのガラクトースを含み、更に特異的には１モ
ルのリパーゼ蛋白質当たり約１〜約６モルのグラ
クトシースを含む。マンノースの含量は、１モル
のリパーゼ蛋白質当たり約３〜約20モルであり、
更に特異的には約３〜約12モルである。組換え体
ヒユミコーラリパーゼは、１モルのリパーゼ蛋白
質当たり、典形的には約２モルのＮ−アセチルグ
ルコサミン、約３〜約20モルのマンノースおよび
約１〜約12モルのガラクトースを含んでなる。更
に特異的には、組換え体ヒユミコーラリパーゼ
は、１モルのリパーゼ製品当たり、約２モルのＮ
−アセチルグルコサミン、約３〜約12モルのマン
ノースおよび約１〜約６モルのガラクトースを含
む。 更により特異的には、組換え体ヒユミコーラリ
パーゼは、１モルのリパーゼ蛋白質当たり約２モ
ルのＮ−アセチルグルコサミン、約６〜約９モル
のマンノースおよび約２〜約４モルのガラクトー
スを含有する。 グリコシル化における相違は、酵素の特性に対
してある種の効果をもたらす。特に、高精製H.
ラヌギノザ組換え体リパーゼの熱安定性は、比較
的精製した天然リパーゼの熱安定性に比較して秀
れている。加えて、40℃および50℃で試験したア
ルカリバシラスプロテアーゼ（エスペラーゼTM）
の存在下での純粋組換え体リパーゼの熱安定性は
比較的純粋な天然リパーゼに比較して秀れてい
る。 特徴的には、酵素製品、本発明に関するリパー
ゼ製品、特に細胞外リパーゼ製品は、他の酵素活
性、顕著には蛋白分解活性並びに培養ブロス成分
由来の非酵素的活性ペプチドおよびアミノ酸を有
する。 ヒユミコーラsp.リパーゼの場合には、組換え
体リパーゼ製品は、比較しうる天然リパーゼ製品
よりも熱的により安定であることが見出された。
本発明者らの知見によれば、熱的安定性の改善の
一部は、異なつたグリコシル化のためであり、更
には他の部分では組換え体リパーゼ製品にヒユミ
コーラ蛋白分解活性が存在していないことによ
る。H.ラヌギノザに対する天然リパーゼの場合
には、米国特許4707291中の簡潔な記載は、次の
内容を報告している。すなわち、商業的に入手可
能なH.ラヌギノザリパーゼ製品（Amano CE）
は実質的レベルの蛋白分解活性を有していた。本
発明者の天然H.ラヌギノザリパーゼ製品は、比
較しうるレベルの蛋白分解活性を有していた。特
に高温において、プロテアーゼは他の酵素を分解
することが期待できる。プロテアーゼの不存在に
帰因する熱的安定性の改善は、異なつたグリコシ
ル化に帰因する累積的改善である（例６参照）。 すでに指摘した如く、本発明は、形質転換アス
ペルギルス菌株を培養することにより高収率のヒ
ユミコーラリパーゼの製法を提供するものであ
り、更に好ましい態様において被転換体A.オリ
ゼ又はA.ニガー宿主細胞を培養することにより
ヒユミコーララヌギノザリパーゼの製造方法を提
供する。 A.オリゼは、数年間、TAKA−アミラーゼ酵
素および蛋白分解酵素の製造用として商業的規模
で用いられている。従つて、この微生物を培養す
る発酵技術は、十分に開発されており、微生物自
身が食品商業において使用することが認められて
いる。本発明は、大量の組換え体ヒユミコーラリ
パーゼの工業的生産のためのA.オリゼの使用の
可能性を提供する。 本発明は、更に熱的安定性が増加し、更にアル
カリバシラスプロテアーゼの存在中での安定性が
増加したために天然のヒユミコーラリパーゼより
も秀れた組換え体ヒユミコーラリパーゼ生産物を
提供する（第６図および第９図参照）。 本発明を更に添付図面を参照して説明する： 第１図は、TAKA−アミラーゼプロモーター
および上流プロモーター領域、プレレージヨンお
よびTAKA−アミラーゼに対する構造遺伝子の
５′部のDNA−配列を示す。 第２図は、プラスミドpTAKA１７のエンドヌ
クレアーゼ制限酵素地図である。 第３図は、プラスミドpHLLの構築を示す。 第４図は、プラスミドｐ９６０の構築を示す。 第５ａ図および第５ｂ図は、三文字の略記号に
よつて与えられる推論されたアミノ酸配列と共に
プレプロヒユミコーララヌギノザリパーゼcDNA
のDNA配列を示す。 第６図は、55℃および60℃でかつ種々のPHで天
然ヒユミコーラリパーゼ生産物の残留活性と比較
した組換え体ヒユミコーラリパーゼの残留活性を
示す。 第７図は、SDS−PAGEグレデエントゲルを示
し、これは図面に代わる写真であり、 第８図は、プロテアーゼ阻害剤（PMSF）を含
有する天然ヒユミコーラリパーゼの残留活性と共
に組換え体ヒユミコーラリパーゼ生産物および天
然ヒユミコーラリパーゼ生産物の55℃での残留活
性を示す。更に 第９図はアルカリバシラスプロテアーゼ製品
（Esperase（商標））の存在下、天然および組換え
体ヒユミコーラリパーゼの40℃および55℃での残
留活性を示す。 アスペルギルス菌株の形質転換に対し用いた形
質転換技術、A.ニドランスの形質転換に対する
方法（バランス等、Biochem.Biophs.Res.
Commnm.，112（1983），284−289；トリブラン
等、Gene 26（1983），205−221、ヤルトン等、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81（1984），1470−
1474）から採用した方法であり更にA.ニガーの
形質転換に対するブクトン等の方法（Gene 37
（1985），207〜214）に類似した方法である。本発
明のプロセスにおいて、アスペルギルス菌株を、
選択マーカーを含むベクター系で形質転換する
が、該マーカーは宿主菌株のゲノムに組込まれる
ことができるが、形質転換前に宿主菌株内には入
らない。次いで形質転換体は選択することがで
き、組込まれた選択マーカーを基礎に非形質転換
体から単離される。 好ましい選択マーカーはargB（A.ニドランス又
はA.ニガー）、trpC（A.ニドランス）、amdS（A.ニ
ドランス）、又はpyr4（ニユロスポラクラザ）遺
伝子、又はDHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ又
はその突然変異体）遺伝子である。更に好ましい
選択マーカーはargB又はamdS遺伝子である。野
性型A.オリゼ菌株は、通常argB+である（すなわ
ち、argB遺伝子はA.オリゼ内で機能的である）。
もしも、argBを選択マーカーとして選ぶ場合、
このマーカーに対し遺伝子内に欠損を有するA.
オリゼのargB突然変異菌株は宿主菌株として使
用されねばならない。A.オリゼargB突然変異体
はF.P.ブクトン等（Gene37（1985），207〜214）
によつて記載される如く調製できる。argB突然
変異体は、オルニチントランスカルバミラーゼ遺
伝子内に欠損を有する突然変異体として定義され
る。一方、amdS遺伝子は野性型A.オリゼの形質
転換に対する選択マーカーとして使用できる。何
故なら野性型菌株はこの遺伝子を有しないからで
ある。 遺伝子発現を促進する機能をコードするDNA
配列は、典形的にはプロモーター、転写ターミネ
ーターおよびポリアデニル化シグナルである。 当業者に周知の如く上流活性化配列およびエン
ハンサー配列に先行されているプロモーターは、
アスペルギルスにおいて強い転写活性を示すこと
ができ更に細胞外および細胞内蛋白質、例えばア
ミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リ
パーゼ、セルラーゼおよびグルコース分解酵素を
コードする遺伝子から誘導されるいかなるDNA
配列でもよい。適当なプロモーターは、A.オリ
ゼTAKAアミラーゼ、リゾムコールマイヘイア
スパラテイクプロテアーゼ、A.ニガーグルコア
ミラーゼ、A.ニガー中性α−アミラーゼ、A.ニ
ガー酸安定性α−アミラーゼ、およびリゾムコー
ルマイヘイリパーゼである。グルコース分解酵素
に対する遺伝子からのプロモーターの例は、
TPI，ADHおよびPGKである。 本発明に係る好ましいプロモーターは、A.オ
リゼTAKA−アミラーゼプロモーターである。
TAKAアミラーゼは周知のα−アミラーゼであ
る（戸田等、Proc.Japan Acad.58 Ser.B（1982）
208−212）。プロモーター域をコードするDNA
は、ヨーロツパ特許出願87103806.3に記載される
ようにTAKA−アミラーゼゲノムクローンから
誘導される。プロモーターの配列およびプロモー
ターの上流領域並びにプレレージヨンおよび
TAKA−アミラーゼに対する構造遺伝子の５′未
満を第１図に示す。 TAKAアミラーゼプロモーターは、ヨーロツ
パ特許出願87103806.3に関連して寄託されたプラ
スミドpTAKA１７から入手可能である。プラス
ミドpTAKA１７のエンドヌクレアーゼ制限地図
を第２図に示す。 pTAKA１７から、プロモーターに対する上流
配列又はその機能的部分を含む全プロモーター配
列は、当業者に明白な手段によつて誘導される。
プロモーター配列は、別のDNA、例えば所望の
蛋白質生産物又は別のプレレージヨン（ジグナル
ペプチド）をコードする遺伝子とプロモーター配
列との連結反応を促進する特異的制限部位を導入
する目的でリンカーを有することができる。 本発明に係る方法において、ヌクレオチド−１
１４４（第１図参照）（Sal Ｉ部位を示す）から
ヌクレオチド−１０までの配列がプロモーター領
域の十分な機能的部分の１例として用いられた。
本発明の他の態様において、ヌクレオチド−１１
７６から−１のヌクレオチド配列の前にpTAKA
１７から未だ配列が決定されていない1.05kbフラ
グメントがあつた。別の断片を用いることができ
るのは当業者に明らかである。 本発明の一態様によれば、プロモーターおよび
上流活性配列は次の配列又は機能的に等価なヌク
レオチド配列を有す： 【表】 （これは第１図におけるヌクレオチド−１１４４
から−１０までの配列を示す） 別の態様によれば、プロモーターおよび上流活
性配列は、次の配列又は官能的に等価なヌクレオ
チド配列を有する： 【表】 本発明の別の面によれば、後者の配列は
pTAKA１７から1.05kbの配列未決定の上流領域
（第２図中位置０から1.05）によつて先行されて
いる。 ターミネーターおよびポリアデニル化配列は、
プロモーターと同じ起源から由来する。エンハン
サー配列もまた構築に導入され得る。 発現した生産物は、生産物を単離するために細
胞の崩壊を要求する細胞内で蓄積される。この別
のプロセス工程を避けるため、更にまた細胞内で
発現された生産物の崩壊量を最少にするため、生
産物は細胞から分泌されるのが好ましい。この目
的のため、所望生産物に対する遺伝子は、細胞の
分泌経路に発現された生産物を有効に向けること
を確保するプレレージヨンを有する。 プレレージヨンは、何らかの起源の生物から分
泌された蛋白質に対する遺伝子から誘導される。 本発明によれば、プレレージヨンはアスペルギ
ルス種由来のグルコアミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼ遺伝子、バシラス種由来のアミラーゼ遺伝
子、リゾムコールマイヘイ由来のリパーゼ又はプ
ロテアーゼ遺伝子、S.セレビゼ又はヒユミコーラ
リパーゼ由来のα−因子に由来する。更に特異的
には、プレレージヨンはヒユミコーララヌギノザ
リパーゼ、A.オリゼTAKAアミラーゼ、A.ニガ
ー中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸安定性α−
アミラーゼ、B.リケニフオルミスα−アミラー
ゼ；バシラスNC1B 11837由来のマルトース分解
アミラーゼ、B.ステロサーモフイラスα−アミ
ラーゼ又はB.リケニフオルミスズブチリシンに
対する遺伝子から誘導される。ヒユミコーララヌ
ギノザシグナルペプチドは次の配列を有する： ATGAGGAGGTCCCTTGTGCTGTTCTTTG
ＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣ MetArgSerSerLeuValLeuPhePheValSerAlaTr
ｐＴｈｒＡｌａ TTGGCC LeuAla TAKA−アミラーゼは、次の配列を有する： ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTC
ＴＧＴＡＣＧＧＣＣＴＴＣＡＧＧＴＣ MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyL
ｅｕＧｌｎＶａｌ GCGGCACCTGCTTTGGCT AlaAlaProAlaLeuAla プロモーターおよびターミネーターに機能的に
結合している所望生産物に対する遺伝子は、選択
マーカーを有するベクター内に挿入されるか、又
は宿主菌株のゲノムに組込まれ得る別個のベクタ
ー又はプラスミド上に組込まれる。本発明で語句
「ベクター系」と言う場合は、単一のベクターも
しくはプラスミド又は２種以上のベクターもしく
はプラスミドが含まれこれらは一緒になつて宿主
ゲノムに組込まれるべき全DNA情報を含有する。
ベクター又はプラスミドは線状又は閉鎖環状分子
である。本発明の好ましい態様によれば、宿主生
物は２個のベクターと同時形質転換されるが、１
個のベクターは選択マーカーを有し更に他のベク
ターは、プロモーターを含んで、宿主菌株に導入
されるべき残りの外来DNA、所望産物に対する
遺伝子又はCDAおよび転写ターミネーターおよ
びポリアデニル化配列を含んで成る。 通常、形質転換体は安定であり、選択圧の非存
在下で培養できる。もしも、形質転換体が不安定
であることが判明すると、選択マーカーは培養中
選択に対し使用できる。次いで形質転換された細
胞を問題のマーカーに相当する選択圧力のもとで
培養する。 以下の実施例中出発物質として用いられるプラ
スミドは次の如くである： p285：（ATCC No.20681） pSa143：バーゼ等、Gene25（1983），109−
117John ＆ Peberdy，Enzyme Microb.
Technol.6（1984），384−389. p3SR2：J.M.ケリーおよびM.J.ハイネス、
EMBO Journal ４（1985），475−479. p3P62−K2および pCDVI−PL：ノマ等、Nature，319，（1986），
640−646） p775：ヨーロツパ特許出願No.87103806.3， pUC19：ビエリラ等、Gene19（1982），259−268
and Messing，Meth.in Enzymology 101
（1983），20−27. 用いた菌株は次の如くである： A.oryzae*：ATCC 20423，IFO 4177，ATCC
1011，ATCC 9576，ATCC 14488−11491，
ATCC 11601 and ATCC 12892. E.coli：MC1000（Casabadan，M.J.and Cohen，
S.N.，J.Mol.Biol.138，179−207）（NCIB
11956） H.lanuginosa：DSM 4109 A.niger*：ATCC 10105，ATCC 10582. ※これらの菌株のArgB突然変異体は、F.P.ブ
クトン等（Gene37（1987）207−214）によつて
記載される如く調製できる。argB突然変異体は
オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子内に欠
損を有する突然変異体として定義される。 ヒユミコーララヌギノザリパーゼ（HLL）ア
ミノ酸配列の同定 特異的オリゴヌクレオチドプローブの構築をな
さしめる情報を得るため、部分配列の決定を精製
ヒユミコーララヌギノザリパーゼについて行つ
た。菌糸体および低分子量物質がすでに除去され
た、ヒユミコーララヌギノザの培養ブロスからの
上澄みを、DEAE−セフアロース（アニオン交換
クロマトグラフイー）、フエニルセフアロース
（疎水性相互作用クロマトグラフイー）を用いて
行うカラムクロマトグラフイーに委ね、次いで
TSK G3000SWによるゲル濾過に委ねる。破裂
決定は、チム等（FEBS Lett.212，307−312
（1987））によつて記載される如く気相シーケンサ
ー（アプライドバイオシステムモデル470A）を
用いて行つた。 次のＮ−末端配列が見出された： Glu−Val−Ser−Gln−Asｐ５−Leu−Phe−Asn
−Gln−Ｐｈｅ１０−Asn−Leu−Phe−Ala−Ｇｌｎ１５
−Tyr−Ser−Ala−Ａｌａ２０−Tyr−Ｘ−Gly−
Lys−Asn−２５ この配列は、アミノ酸残基No.７〜No.11（Phe−
Asn−Gln−Phe−Asn）およびアミノ酸残基No.
13〜No.16（Phe−Ala−Gln−Tyr）をそれぞれ含
んでなる２種の特異的混合オリゴヌクレオチドプ
ローブの構築を認める。上記配列に相当する
HLL−特異的オリゴヌクレオチド混合物を用い
たヒユミコーララヌギノザcDNAライブラリーの
スクリーニングを例１に示す。 〔実施例〕 例 １ E.コリー中でのヒユミコーララヌギノザcDNA
ライブラリーの構築 ベール等（EMBO J.，３：1097〜1102，1984）
およびチルギウイン等（Biochemistry（Wash.），
18，5294〜5299，1979）によつて記載される方法
により、全RNAを均質化したH.ラヌギノザマイ
セリウムから抽出した。ポリ(A)−含有RNAを、
アビブおよびリーダー（PNAS，USA，69，
1408〜1412，1972）によつて記載される如くオリ
ゴ（dT）−セルロースについての２サイクルでの
アフイニテイクロマトグラフイーにより得た。岡
山およびベルグ（Molec.Cell.Biol.，２：161−
170，1982）によつて記載される方法を用い、更
にノマ等（Nature，319：640〜646，1986）によ
つて記載されるベクターpSP62−K2および
pCDVI−PLを用いてcDNAを合成した。合成さ
れたcDNAを、E.コリーMC1000のhsdR-，M+誘
導体（カサダバンおよびコーヘン、J.Mol.Biol.，
138，179〜207，1980）に形質変換し組換え体ク
ローンを得た。 ヒユミコーララヌギノザリパーゼ（HLL）特
異性cDNA組換え体の同定 32個のペンタデカマーオリゴデオキシリボヌク
レオチド： d(ATTAAAATGATTAAA), G G G G G （この内の一つは、Phe−Asn−Gln−Phe−
Asnに対しコードする領域内でHLL mRNAに対
して相補的である）の混合物を、アプライドバイ
オシステム社のDNA合成機で合成し、次いでポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によつて精製し
た。ヒユミコーララヌギノザcDNAライブラリー
からの約10000個のE.コリー組換え体を、ワトマ
ン540紙に移した。クローンを洗浄し、ゲルデン
等（NucleicACiDSRes.７，2115〜2135，1979）
に記載される如く固定化した。フイルターを、ベ
ール等（EMBOJ.３，1097〜1102，1984）によつ
て記載される如く、32Ｐ−ラベル化HLL特異性ペ
ンタデカマー混合物でハイブリド化した。ハイブ
リド形成およびフイルターの洗浄は、それぞれ37
℃および43℃で行い、次いでインテンスフアイヤ
ースクリーンで24時間オートラジオグラフイーに
より追跡した。ミニプレププラスミドDNAを、
標準方法（ビルボイムおよびドリー、Nucleic
Acids Res.，７，1513〜1523，1979）を用い、
２種のハイブリド化コロニー、pHLL702，３か
ら単離し、次いでcDNA挿入のDNA配列をマキ
サムおよびギルベルト（Methods Enzymol.65，
499−560，1980）の手順により確立した。 HLL cDNAを用いた構築作業を更に促進する
ため、独特の制限サイトを含有するDNA配列を
次の如くcDNAの５′および３′末端に加えた。
３′未翻訳領域内でHLL cDNAを消化する
Sau961を用いてpHLL702.3を消化し、次いで得
られた末端をE.コリーDNAポリメラーゼ（クレ
ノー断片）および４種のdNTPでフイルインし
た。このDNAを、開始メチオニンコドンに対し
丁度３′で１回HLL cDNAを切断するSacIで連
続的に消化した。得られた0.9kb HLL cDNA断
片を、アガロースゲル電気泳動法により精製し、
電気溶出し次いで連結反応用に調製した。５′ア
ダプターとして、２個のオリゴヌクレオチド、
927および928を合成した。アダプターの配列を第
３１図に示す。このアダプターを、HLL cDNA
の開始Metコドンに対し丁度５′でHindおよび
BamHIサイトを加えるように設計した。２種の
オリゴを、ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてキナーゼ処理し、互いにアニールし
次いで、すでにHindおよびHincで消化（つ
いで0.7％アガロースゲルで精製されたpUC19ベ
クター内で精製0.9kb HLL cDNA配列に連結し
た。得られたプラスミドpHLLは、移送可能な
0.9kb BamHI断片としてHLL cDNAを有して
いた。pHLLの構築を第３図に示す。 BamHI消化およびアガロースゲル上での0.9kb
HLL cDNA断片の精製後、それをBamHI消化
しかつホスフアターゼ処理したp775に連結し
p960を得、ここにおいてHLL cDNAはアスペル
ギルスオリゼ由来のTAKAプロモーターおよび
アスペルギルスニガー由来のAMGターミネータ
ーの転写活性の制御のもとにある。p960の構築
を第４図に示す。p775の構築は、ヨーロツパ特
許出願87103806.3に記載されている。 p775は、TAKAプロモーターとAMGターミネ
ーターを含み更にクローニングサイトとして独得
のBamHIサイトを有している。 第５ａ図および第５ｂ図は、その導かれたアミ
ノ酸配列と共にブレプロHLL cDNAの配列を示
す。ヌクレオチドは、クローン化cDNA中の第一
塩基から番号をつけられている。このcDNA配列
から、以下の内容が結論づけられる。すなわち、
HLLが、17個の残基のシグナルペプチドおよび
５個の残基の短いプロペプチドを有した291個の
アミノ酸残基の長い前駆体として合成されてい
る。推定上のシグナルペプチダーゼプロセシング
サイト（フオンヘイネ，Eur.J.Biochem.133，17
〜21，1983）は、AlaとSerとの間のペプチド結
合を示す矢印で示される。アミノ末端アミノ酸配
列により同定される如き成熟酵素のアミノ末端が
示される。 ヒユミコーララヌギノザ（HLL）のアミノ酸
組成 ６モルのHC又は４モルのメタンスルホン酸
のシールしたアンプル中、110℃で24時間、48時
間および96時間予め加水分解したサンプル
（40μg）について、ベツクマンアミノ酸分析機
（型JL1 MB）を用いアミノ酸分析を行つた。半
シスチンを、トリブチルホスフインにより還元し
次いで４−ビニルピリジンとカツプリングした後
Ｓ−β−（４−ピリジルエチル）−システインとし
て測定した。全ての試剤は、最高純度のものであ
つた。 結果を次表に示すが、cDNA配列により決定し
たアミノ酸組成と比較する。 【表】 【表】 例 ２ アスペルギルスオリゼ又はアスペルギルスニガ
ーの形質転換（全体手順） 100mlのYPD（ゼーマン等、Methods in Yeast
Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，
1981）を、A.オリゼ、A.ニガー又はそれらの
argB突然変異体の胞子を用いて接種し次いで37
℃で約２時間振とうしながらインキユベートし
た。菌糸体をミラクロスを用いてろ過して集め、
次いで0.6モルのMgSO4200mlで洗浄した。菌糸
体を15mlの1.2モルのMgSO4、10ミリモルの
NaH2PO4 PH5.8に懸濁せしめた。懸濁液を氷上
で冷却し次いで120mgのNovozym 234を含有す
る緩衝液（バツチ1687）１mlを添加した。５分
後、12mg／mlBSA（シグマタイプH25）１mlを添
加し、次いで多数のプロトプラストが顕微鏡下で
観察したサンプル中に可視できるまで穏やかに攪
拌しながら37℃で1.5〜2.5時間インキユベーシヨ
ンした。 懸濁液をミラクロスでロ過し、ロ液を殺菌チユ
ーブに移し、次いで５mlの0.6モルソルビトール、
100ミリモルのトリス−HC、PH7.0でおおつた。
遠心分離を、1000gで15分間行い、次いでプロプ
ラストをMgSO4クツシヨンの頂部から採取した。
２容量のSTC（1.2モルのソルビトール、10ミリモ
ルのTric−HC、PH7.5、10ミリモルのCAC2）
を、プロトプラスト懸濁液に添加し、次いで混合
物を５分間1000gで遠心分離した。プロトプラス
トペレツトを３mlのSTC中で再懸濁させ次いで
再ペレツト化した。これをくりかえした。最後に
プロトプラストを0.2〜１mlのSTCに再懸濁させ
た。 100μのプロトプラスト懸濁液を、15μの
STC中、適当なDNA5〜25μgと混合した。argB
菌株由来のプロトプラストを、pSa143 DNA（A.
ニドランス argB遺伝子担持プラスミド）と混
合し次いでargB+菌株由来のプロトプラスト
p3SR2（A.ニドランス amdS遺伝子担持プラス
ミド）と混合した。混合物を室温で25分間放置し
た。0.2mlの60％PEG400（BDH29576）、10mMの
CAC2および10mMのトリス−HC、PH7.5を
添加し次いで注意深く混合し（２回）、最後に
0.85mlの同溶液を加え、注意深く混合した。混合
物を室温で25分間放置し、2500gで15分間回転さ
せ、更にペレツトを２mlの1.2モルソルビトール
に懸濁させた。もう一度沈降させた後、プロトプ
ラストを適当なプレート上に散布した。pSa143
で形質転換したargB菌株由来のプロトプラスト
を、炭素および窒素源としてそれぞれグルコース
および尿組を用い、更に浸透安定化用の1.2モル
ソルビトールを有するミニマルプレート（Cove，
Biochem.Biophys.Acta113（1966）51−56）上
に散布した。p3SR2で形質転換したargB+菌株由
来のプロトプラストを、1.0モルのスクロース、
窒素源としての10ミリモルのアセトアミドおよび
バツクグラウンド増殖を阻止するための20ミリモ
ルCsCを含有するミニマルプレート（Cove，
Biochem.Biophys.Acta113（1966）51〜56）上
に散布した。37℃で４〜７日間インキユベーシヨ
ンした後、胞子を選び、殺菌水に懸濁させ次いで
単一コロニーに散布した。この手順をくりかえ
し、第２回の再単離後単一コロニーの胞子を規制
した形質転換体として保存した。 例 ３ A.オリゼ菌株内での組換え体リパーゼ（RHL）
の発現 p960を、例２で記載した如くA.ニドランス由
来のamdS遺伝子含有p3SR2で同時形質転換する
ことによりA.オリゼIF04177に形質転換する。上
述の如く調製したプロトプラストを、p960およ
びp3SR2の同量の混合物（各々ほゞ5μg）を用い
てインキユベートした。唯一の窒素源としてアセ
トアミドを用いることのできる形質転換体を２回
再単離する。YPD（ゼーマン等、1981）上で３回
増殖後、培養上澄みをSDS−PAGEで分析する。
ゲルをコマシーブリリアントブルーＲで染色す
る。最もより形質転換体を更に研究するため選別
し、次いで４％の大豆ミル上の２キラー発酵槽
中で増殖させ、増殖中グルコースを与えた。培養
物を発酵中強く攪拌する。組換え体ヒユミコーラ
リパーゼ生産物（RHL）を、遠心分離による細
胞の除去により培養ブロスより単離し、上澄みを
限外ろ過し次いで凍結乾燥する。 例 ４ A.ニガー菌株中でのヒユミコーラリパーゼの
発現 例２で記載する如く、A.ニドランスargB遺伝
子含有pSa143で同時形質転換することによつて
A.ニガー argBに形質転換した。プロトプラス
トを各々のプラスドの同等（約5μg）と共にイン
キユベートした。形質転換体をミニマルプレート
（Cove，Biochem.Biophys.Acta 113（1966），
51〜56）上でアルゲニン要求に基づき選別した。 分子胞子を２回再単離後、形質転換体をYPD
（ジーマン等、1981）中30℃で数日間培養した。
培養上澄みをSDS−PAGEで分析した。大部分の
形質転換体は、その上澄み中にヒユミコーラリパ
ーゼを産生した。 炭水化物含量を例５で記載した如くエンドＨ処
理により分析した。以下の内容が見出された。す
なわち、炭水化物含量は天然のヒユミコーラリパ
ーゼに対するとほぼ同程度であつた。エンドＨ感
受性は、A.オリゼ由来の組換え体ヒユミコーラ
リパーゼに対してのものと同じであつた。従つ
て、グルコシル化の性質はA.オリゼおよびA.ニ
ガーにおけると同じであると推定された。 例 ５ RHL（例３で得られる組換え体リパーゼ生産物
およびHLL（DSM4109の培養によつて得られる
天然リパーゼ生産物）中の炭水化物含量の測定 炭水化物側鎖を分解しうる酵素（エンドＨおよ
びグリコペプチターゼＦ）を用いる処理。 RHLおよびHLLを、グリコペプチダーゼＦ
（ベーリンガーNo.91378、500μの水に溶解した
100単位のバイアル）およびエンドＨ（シグマNo.
E6878、シトレート緩衝液PH5.5に溶解）で処理し
た。 HLLおよびRHLを各々10mMのトリスPH7.5
（１mg／ml）に溶解した。100μのHLLおよび
RHLの各々に、2μのグリコペプチダーゼＦを
加え、サンプルを37℃で20時間インキユベートし
た。 更にHLLとRHLを10mMトリスPH7.5（１mg／
ml）に溶解し、25μのEndo Ｈおよび50μの
0.1モル酢酸ナトリウムPH5.0を、HLLとRHLの
25μの各々に加えた。サンプルを37℃で20時間
インキユベートした。 サンプルを、未処理HLLおよびRHLと共に7.5
〜20％のSDS−PAGE勾配ゲルで操作した。SDS
−PAGE勾配ゲルを第７図に示す。第７図のサン
プルは次の如くである。 １標準：92K，67K，43K，30K，20.1K，14.4K 2HLL，10mMトリス（PH7.5）中１mg／ml 3HLL＋Endo Ｈ 4RHL＋Endo Ｈ 5RHL＋グリコペプチダーゼＦ 6HLL＋グリコペプチダーゼＦ 7RHL＋Endo Ｈ 8RHL＋グリコペプチダーゼＦ 9RHL，10mMトリス（PH7.5）中１mg／ml 第７図から以下の内容が明らかである。すなわ
ち、グリコペプチダーゼＦはHLLとRHLの双方
の炭水化物部分を分解することができ更に残りの
蛋白質が同じ大きさである。一方Endo Ｈは
RHLの炭水化物のみ分解することができ、一方
HLLのEndo Ｈ処理は何らの効果ももたらさな
い。 従つて、HLLとRHLの双方はＮ−グリコシル
化される。しかし、グリコシル化は異なつた性質
である。 Biochemistryにおいて提案されたチム等、チ
ヤプリン、M.F.（1982），AnaI.Biochem.123，
336〜341およびヤントフ、N.（1985），Anal.
biochem.148，424−433に記載された方法を用い
て炭水化物の分析を行つた。 リパーゼ含有サンプルをメタノリシスに委ね、
次いでアミノ糖の再−Ｎ−アセチル化を行い更に
第２回の温和なメタノリシス工程によりＯ−アセ
チル基を脱離せしめた。逆相高圧液体クロマトグ
ラフイーによる分析に対し適当な誘導体がメチル
グリコシドのパーベンゾイル化によつて得られ
た。 分析結果を次表に示す。 【表】 サミン
マンノース 5.7 8.6
ガラクトース 0 3.3
天然ヒユミコーラリパーゼHLLの炭水化物残
基は、ハイマンノースタイプのＮ−グリコシル化
において見出された２種の単糖類から構成されて
いる（モントレニル、J.等、1986，
「Carbohydrate analysis：ａ practical
approach」、チヤプリン、M.F.およびケンデイ
ー、J.F.IRLプレス，オクスフオード，p143）。 Ｎ−アセチルグルコサミン（＜２モル／モル）
に対する結果は、主配列のみが単一のＮ−グリコ
シル化を有していることを示している。このこと
は、更にcDNA配列（第５ａ図および第５ｂ図）
から推論される。加えて、マンノースはセリン又
はトレオニン残基にＯ−グリコシド結合しえた。 Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノースの
外に、組換え体ヒユミコーラリパーゼ、RHLは
相当量のガラクトースを含む。天然リパーゼに関
し、Ｎ−アセチルグルコサミンの含量は、単一Ｎ
−グリコシル化の存在を示す。しかし、これはも
しガラクトースがこの一部である場合は複合体は
ハイブリドタイプである。しかし、セリンもしく
はトレオニン残基でのＯ−グリコシル化は、もし
も組換え体RHLリパーゼのＮ−グリコシル化が
天然HLLリパーゼに対する場合と同様にハイマ
ンノースタイプである場合、ガラクトースの存在
の原因である。 炭水化物部分は、天然ヒユミコーラリパーゼ
HLLおよび組換え体ヒユミコーラリパーゼRHL
の分子量に各々約1500Dおよび2600Dを平均で加
えている。これは炭水化物含量を各々約4.9％お
よび8.1％に相当する。 例 ６ RHLおよびHLLの安定性に対するPHおよび温
度の作用 RHL（1.4×106LU／ｇ）およびHLL（0.2×106
LU／ｇ）の各々を、種々のPHの緩衝液に溶解し
次いで55°および60℃の温度で２時間インキユベ
ートした。緩衝溶液を、47.5mMの酢酸ナトリウ
ム、MOPS（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンス
ルホン酸）およびホウ酸から調製し、0.1N HC
又は1N NaOHを用いてPH４，５，６，７，
８，９および10に調節した。加えて、1.5×106
LU／ｇに精製したHLLのサンプルの別個のテス
トに用いた緩衝液を、PMSF（フエニルメタンス
ルホニルフルオリド）に添加しこの天然リパーゼ
生産物中でのプロテアーゼ含量を抑制した。 溶液中のリパーゼ含量は、約10〜15LU／mlに
等しかつた。 インキユベーシヨン後直ちに、リパーゼ溶液を
氷水浴内で冷却し次いで同日分析するそこに保つ
た（LU−法、AF95）。 結果を第６図および第８図に示す。 第６図から明らかなようにRHLの熱安定性は
55℃および60℃の各々で、PH５〜10でHLLのそ
れよりもより大である。 第８図から明らかなように、RHLのより大き
い熱安定性は、部分的にはH.ラヌギノザプロテ
アーゼ活性が存在しないためである。 例 ７ 典形的アルカリバシラスsp.プロテアーゼ（こ
こでは、商業的に入手可能な洗剤酵素Esperase
（商標）の存在下、比較できる単位活性レベル４
×106LU／ｇのRHLおよびHLLの安定性 インキユベーシヨン条件は、3600LU／およ
び0.057AU／（AU／LU＝0.016×10-3）の濃
度を用い、0.1Mホウ酸、PH9.5でかつ40℃又は50
℃であつた。残留活性を対照インキユベーシヨン
を基礎に計算した。 結果を第９図に示す。 第９図から明らかなように、、アルカリ性バシ
ラスプロテアーゼの存在下、RHLの熱安定性は
HLLのそれよりも秀れており、これによりプロ
テアーゼによる攻撃に対するそれらの感受性にお
ける相違がわかる。 比較例 (a) 本発明方法による組換え体ヒユミコーラリパ
ーゼの調製 実施例２および実施例３において記載した如
く調製された形質転換体を、YPG寒天基質
（YPG寒天：0.4％の酵母エキス、1.5％のグル
コース、0.1％のK2HPO4，0.05％のMgSO4・
7H2Ｏ，２％の寒天）から以下の組成を有する
中性培地130mlを有する500mlフラスコに接種し
た： 大豆粉 ３％ アルトデキストリン 1.5％ （Glucidex6、ロ・ケツテ フレレス社から
入手可能） バクトペプトン（デイフコ） 0.5％ プルロニツク61L 0.02％ フラスコを30℃でかつ275rpmで４日間振と
うした。測定の結果収率は2990LU／ｇであつ
た。 (b) ヒユミコーララヌギノザ（Humicola
lanuginosa）を培養することによる生来ヒユミ
コーラリパーゼの調製 ヒユミコーララヌギノザ（Humicola
lanuginosa）を、以下の組成を有するGTS基
質内で、45℃で３日間培養した： 10g／の酵母エキス 5g／のスパン80 5g／のツイーン80 2g／のMgSO4・7H2Ｏ 0.1g／のCaC2・2H2Ｏ 2g／のナルコ10 オートクレープ処理前のPH：6.0 発酵後、２個のフラスコ内のリパーゼ活性は
それぞれ541LU／mlおよび440LU／mlであつ
た。
ゼの組換え体DNA生産物の製造方法および組換
え体ヒユミコーラリパーゼに関する。 〔従来技術および発明が解決しようとする課題〕 ヒユミコーラリパーゼは、好熱性サーモマイセ
ス（Thermomyces）種、例えばH.ラヌギノザ
（lanuginasa）（グリフオンアンドマウブランク）
ブンセ、H.ステラータ（Stellata）ブンセ、H.グ
リセア var.サーモイデア（grisea var.ther−
moidea）、コニーアンドエマーソン、H.インソ
レンス（insolens）、コニーアンドエマーソン、
サーモマイセスイバダネンシス（Thermomyces
ibada−nensis）、アピニスアンドエギンス、H.
ヒアロサーモフイラ（hyalothermophila）モウ
バシア、マゼンアンドアブデルーヘフユツ、H.
グリセア（grisea）var.インデイカ（indica）ス
ブラマンヤン、H.ブレビス（brevis）var.サーモ
イデア（thermoidea）、スブラマンヤンアンドチ
ルマラカーアンドH.ブレビスポラスブラマンヤ
ンアンドチルマラカーを含む好熱性ヒユミコーラ
（Humicola）種の菌株から得ることができる。 H.ラヌギノザ（lanuginosa）はまた、同義語
サーモマイセスラヌギノザス（Thermomyces
lanuginosus）ツイクリンスキー、セペドニヌム
ラヌギノザム（Sepedonium lanuginosum） グ
リフオンアンドマウブランク、セペドニウムサー
マフイラムシクロスポラム（Sepedonium
thermaphilum cyclosporum）アンドS.サーマフ
イラムオボスポラム（thermaphilum
ovosporum）ベリヒ、アクレモニラ
（Acremoniella） sp.レーベ、アクレモニラサ
ーモフイラ（Acremonilla thermophila）クルジ
アンドモノトスポララヌギノザ（Monotospora
lanuginosa）（グリフオンアンドマウブランク）
マーソンとしても記載されてきている。 更に種スキタリジウムサーモフイラム
（Scytalidium thermophilum）（コニーアンドエ
マーソン）アウスウイツチは、ヘーゲルによりヒ
ユミコーラインソレンス（Humilola insolens）
に属するものと考えられた（1975，The ecology
of thermophilic fungi in Indonesia.In
Biodegradation et Humification.Rapport du
ler Colloque Internationei−Nancy 1974（ed.G.
Kilbertius，O.Reisinger，A.Mourey＆J.A.
Cancela Da Fonseca），Sarreguemines：
Pierron Editeur−57206）。 ヒユミコーララヌギノザリパーゼの製造は、日
本特許公開公報48−62990並びにヨーロツパ特許
出願第87307684.8に記載されている。後者はまた
脂質分解洗剤の添加剤におけるこのリパーゼの使
用を開示している。 洗剤における酵素添加剤の世界的に広範囲の使
用並びにヒユミコーラ（Humicola）リパーゼが
洗浄力および安定性に関して公知の洗剤リパーゼ
よりも秀れていることが判明したために、このリ
パーゼの商業的興味は高いものがある。 工業的酵素の製造において、収率は製造プロセ
スの有利さに関し常に重要である。伝統的な改良
方法は、高生産変異体を得るために野性株を突然
変異させることである。組換え体DNA技術を用
いての別の可能性は、所望生産物に対する遺伝子
を、野性株よりも高収率又は他の好ましい特性を
もたらしうる宿主微生物に形質転換することであ
る。 かくして、本発明の目的は組換え体DNA技術
によりヒユミコーラリパーゼの製造方法を提供す
ることにある。 従来、組換え体DNA技術によりポリペプチド
又は蛋白質を製造するため、多数のプロセスが開
発されてきた。主な興味は細菌と酵母に集中して
おり、例えばE.コリー（coli）。バシラスズブチ
リス（Bacillus subtilis）およびサツカロマイセ
イセレビシエ（Sacharomyces cerevisiae）は例
えば発現および選択係に関して十分に特徴する種
である。 上記の微生物に加えて、繊維状菌、特にアスペ
ルギルス（Aspergillus）種、例えばアスペルギ
ルスニガー（Aspergillus niger）およびアスペ
ルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）（酵素の
商業的製造に対し十分特徴づけられかつ広く使用
されている）は、組換え体DNAベクターに対し
宿主微生物として魅力的な候補者である。 過去数年において、アスペルギルスニドランス
（Aspergillus nidulans）の形質転換に対する
種々の選択マーカーが記述されてきており更に真
菌細胞の分化をコントロールする遺伝学的および
分子的プロセスの研究の目的で繊維状真菌の統合
的形質転換に対しての手順が最近開発されてきて
いる。 A.ニドランスの形質転換が、ニユロスポラク
ラザ（Neurospora crassa） pyr−４遺伝子
（Ballance，D.J.等、Biochem.Biophys.Res.
Commun.，112（1983）284−289）、A.ニドラン
ス（nidulans）amdS遺伝子（Tilburn，J.G.等、
Gene26（1983）205−221）、A.ニドランス trpC
遺伝子（Yelton，M.M.等、Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.，81（1984）1470−1474）およびA.ニド
ランス argB遺伝子（ジヨーン、M.A.および
Peberdy J.，Microb.Technol.6（1984）386−
389）を含むプラスミドを用いて実証されている。
形質転換DNAは相当に低い繁度（典形的には
1000個未満の被転換体／DNA1μg）で宿主ゲノ
ムに組込まれることが見出された。 A.ニドランスのamdS遺伝子を用いたアスペル
ギルスニガーの形質転換は記載されており（ケリ
ーJ.Mおよびハイネス、M.J.，EMBO Journal
４（1985），475−479）更にamdSは唯一の窒素
源としてアセタミド上で強く増殖できないアスペ
ルギルスニガーの形質転換に用いるための強力な
選択マーカーであることを示した。アスペルギル
スニドランスのargB遺伝子を用いた
Aspergillus nigerの形質転換は記載されている
（Buxton.F.P.等、Gene37（1985），207−214）。 アスペルギルスニガーの被転換体の製造方法
が、ヨーロツパ特許018438Aに記載されており、
さらに同0215594、および0249350は繊維状真菌中
の非相同ポリペプチドの発現を記載している。最
後にW087／04464はアスペルギルス中の高級真核
遺伝子の発現を記載する。 〔課題を解決するための手段、および発明の作用
および効果〕 本発明によれば今や以下の内容が見出された。
すなわち、アスペルギルスsp.菌株中ヒユミコー
ラsp.リパーゼの高レベル発現を得ること、また
はヒユミコーラ菌株中でのリパーゼの生産を高め
ることが可能である。 最も広い面において、本発明は組換え体ヒユミ
コーラ（Humicola）リパーゼの製造方法を提供
するものであり、この方法は、次の工程： (a) 遺伝子発現を促進する機能をコードする
DNA配列およびヒユミコーラリパーゼをコー
ドするDNA配列を含んでなる適当な組換え体
DNAクローニングベクターを得る工程： (b) 工程(a)で得たクローニングベクターを用いて
適当な宿主生物を形質転換する工程；および (c) 適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次
いで所望により培地からリパーゼを回収する工
程を含んで成る。 本発明の次の狭い面において、アスペルギルス
においてヒユミコーラリパーゼの製法が提供さ
れ、この方法は次の工程(a)〜(c)： (a) １回のコピー又はそれ以上のコピーで適当な
アスペルギルスのゲノムに組込むことのでき、
更に遺伝子発現を促進する機能をコードする
DNA配列、被転換体の適当な選択マーカー、
およびヒユミコーラリパーゼをコードする
DNA配列を含んで成る組換え体DNAクローニ
ングベクター系を得る工程； (b) 工程(a)で得た組換え体DNAクローニングベ
クター系を用い、選ばれた選択マーカーに対し
機能遺伝子を有しないアスペルギルス宿主を形
質転換する工程；および (c) 適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次
いで所望により培地からリパーゼを回収する工
程を含んで成る。 本発明の第二の面によれば、以下の方法による
アスペルギルスにおけるヒユミコーラリパーゼの
製造方法が提供され、この方法によれば上記の如
く、組換え体DNAクローニングベクター系で形
質転換されたアスペルギルス菌株を適当な培地中
で培養し次いでリパーゼを培地から回収する。 本発明の第三の面によれば、公知の天然ヒユミ
コーラリパーゼとはグリコシル化において差異を
有する新規組換え体ヒユミコーラリパーゼ製品が
提供される。すなわち、本発明の組換え体ヒユミ
コーラリパーゼの性質およびグリコシル化の所望
の程度は、天然ヒユミコーラ菌株から得られるリ
パーゼとは異なる。本発明のヒユミコーラリパー
ゼ製品は、更に、相当する天然のヒユミコーラリ
パーゼに比較して改良された熱安定性にその特徴
を有する。 更に詳しくは、新規組換え体ヒユミコーラリパ
ーゼは、以下の点においてその特徴を有する。す
なわち、炭水化物含量は天然リパーゼと同じレベ
ルであるかまたは天然リパーゼ中の炭水化物含量
よりもより大である。すなわち、新規ヒユミコー
ラリパーゼは、天然リパーゼとは他の炭水化物を
含有する。炭水化物含量は、典型的には約５〜約
30％（ｗ／ｗ）であり、一方天然リパーゼ中の炭
水化物含量は約4.9％（ｗ／ｗ）である。更に特
異的には、炭水化物含量は５〜約15％（ｗ／ｗ）
であり、更にまた特異的には約7.5〜約8.5％
（ｗ／ｗ）の範囲内にある。 本発明の組換え体ヒユミコーラリパーゼ製品
は、例えばヨーロツパ特許出願87307648.8に記載
される如く天然リパーゼと同様の方法で洗剤に使
用する酵素洗剤添加剤として使用できる。 本発明で用いられる語句「組換え体ヒユミコー
ラリパーゼ」は、天然ヒユミコーラリパーゼをコ
ードするcDNAにより形質転換された微生物を培
養して得られるヒユミコーラリパーゼに適用され
る。語句「天然ヒユミコーラリパーゼ」は、本明
細書の導入部において記載した好熱性サーモマイ
セスsp.を含む好熱性ヒユミコーラsp.の天然起源
から得られるヒユミコーラリパーゼに適用され
る。 A.オリゼ由来の組換え体ヒユミコーラリパー
ゼは、ペプチド配列が同じであるにもかゝわらず
天然ヒユミコーラリパーゼとは同一でない。明ら
かに、宿主微生物は、ドナー微生物とは異なつた
程度にかつ異なつた糖部分により発現ポリペプチ
ドをグリコシル化する。A.ニガーにおいては、
グリコシル化の程度は同レベルにあると考えられ
るが、一方糖部分はA.オリゼにおけると同種の
ものと思われる。天然リパーゼと組換え体リパー
ゼの判別および同定は、それらのグリコシル化を
測定することによつて可能である。従つて、天然
ヒユミコーララヌギノザリパーゼとA.オリゼ形
質転換体からのこのリパーゼの組換え体形を典形
例にとると、両方のリパーゼはＮ−グリコシル化
されているが糖残基は異なつている。天然リパー
ゼは、ガラクトースは有しておらず、そして組換
え体リパーゼよりマンノースが少なく、さらにま
た種々の程度にグリコシル化されている。天然リ
パーゼは、その分子量に約1500ダルトンを加える
炭水化物部分（約５％）を有し、組換え体リパー
ゼは約2600ダルトンを加える炭水化物部分（約８
％）を有する。詳しくは、例５参照のこと。 本発明による新規組換え体ヒユミコーラリパー
ゼは、１モルのリパーゼ蛋白質当たり約１〜約12
モルのガラクトースを含み、更に特異的には１モ
ルのリパーゼ蛋白質当たり約１〜約６モルのグラ
クトシースを含む。マンノースの含量は、１モル
のリパーゼ蛋白質当たり約３〜約20モルであり、
更に特異的には約３〜約12モルである。組換え体
ヒユミコーラリパーゼは、１モルのリパーゼ蛋白
質当たり、典形的には約２モルのＮ−アセチルグ
ルコサミン、約３〜約20モルのマンノースおよび
約１〜約12モルのガラクトースを含んでなる。更
に特異的には、組換え体ヒユミコーラリパーゼ
は、１モルのリパーゼ製品当たり、約２モルのＮ
−アセチルグルコサミン、約３〜約12モルのマン
ノースおよび約１〜約６モルのガラクトースを含
む。 更により特異的には、組換え体ヒユミコーラリ
パーゼは、１モルのリパーゼ蛋白質当たり約２モ
ルのＮ−アセチルグルコサミン、約６〜約９モル
のマンノースおよび約２〜約４モルのガラクトー
スを含有する。 グリコシル化における相違は、酵素の特性に対
してある種の効果をもたらす。特に、高精製H.
ラヌギノザ組換え体リパーゼの熱安定性は、比較
的精製した天然リパーゼの熱安定性に比較して秀
れている。加えて、40℃および50℃で試験したア
ルカリバシラスプロテアーゼ（エスペラーゼTM）
の存在下での純粋組換え体リパーゼの熱安定性は
比較的純粋な天然リパーゼに比較して秀れてい
る。 特徴的には、酵素製品、本発明に関するリパー
ゼ製品、特に細胞外リパーゼ製品は、他の酵素活
性、顕著には蛋白分解活性並びに培養ブロス成分
由来の非酵素的活性ペプチドおよびアミノ酸を有
する。 ヒユミコーラsp.リパーゼの場合には、組換え
体リパーゼ製品は、比較しうる天然リパーゼ製品
よりも熱的により安定であることが見出された。
本発明者らの知見によれば、熱的安定性の改善の
一部は、異なつたグリコシル化のためであり、更
には他の部分では組換え体リパーゼ製品にヒユミ
コーラ蛋白分解活性が存在していないことによ
る。H.ラヌギノザに対する天然リパーゼの場合
には、米国特許4707291中の簡潔な記載は、次の
内容を報告している。すなわち、商業的に入手可
能なH.ラヌギノザリパーゼ製品（Amano CE）
は実質的レベルの蛋白分解活性を有していた。本
発明者の天然H.ラヌギノザリパーゼ製品は、比
較しうるレベルの蛋白分解活性を有していた。特
に高温において、プロテアーゼは他の酵素を分解
することが期待できる。プロテアーゼの不存在に
帰因する熱的安定性の改善は、異なつたグリコシ
ル化に帰因する累積的改善である（例６参照）。 すでに指摘した如く、本発明は、形質転換アス
ペルギルス菌株を培養することにより高収率のヒ
ユミコーラリパーゼの製法を提供するものであ
り、更に好ましい態様において被転換体A.オリ
ゼ又はA.ニガー宿主細胞を培養することにより
ヒユミコーララヌギノザリパーゼの製造方法を提
供する。 A.オリゼは、数年間、TAKA−アミラーゼ酵
素および蛋白分解酵素の製造用として商業的規模
で用いられている。従つて、この微生物を培養す
る発酵技術は、十分に開発されており、微生物自
身が食品商業において使用することが認められて
いる。本発明は、大量の組換え体ヒユミコーラリ
パーゼの工業的生産のためのA.オリゼの使用の
可能性を提供する。 本発明は、更に熱的安定性が増加し、更にアル
カリバシラスプロテアーゼの存在中での安定性が
増加したために天然のヒユミコーラリパーゼより
も秀れた組換え体ヒユミコーラリパーゼ生産物を
提供する（第６図および第９図参照）。 本発明を更に添付図面を参照して説明する： 第１図は、TAKA−アミラーゼプロモーター
および上流プロモーター領域、プレレージヨンお
よびTAKA−アミラーゼに対する構造遺伝子の
５′部のDNA−配列を示す。 第２図は、プラスミドpTAKA１７のエンドヌ
クレアーゼ制限酵素地図である。 第３図は、プラスミドpHLLの構築を示す。 第４図は、プラスミドｐ９６０の構築を示す。 第５ａ図および第５ｂ図は、三文字の略記号に
よつて与えられる推論されたアミノ酸配列と共に
プレプロヒユミコーララヌギノザリパーゼcDNA
のDNA配列を示す。 第６図は、55℃および60℃でかつ種々のPHで天
然ヒユミコーラリパーゼ生産物の残留活性と比較
した組換え体ヒユミコーラリパーゼの残留活性を
示す。 第７図は、SDS−PAGEグレデエントゲルを示
し、これは図面に代わる写真であり、 第８図は、プロテアーゼ阻害剤（PMSF）を含
有する天然ヒユミコーラリパーゼの残留活性と共
に組換え体ヒユミコーラリパーゼ生産物および天
然ヒユミコーラリパーゼ生産物の55℃での残留活
性を示す。更に 第９図はアルカリバシラスプロテアーゼ製品
（Esperase（商標））の存在下、天然および組換え
体ヒユミコーラリパーゼの40℃および55℃での残
留活性を示す。 アスペルギルス菌株の形質転換に対し用いた形
質転換技術、A.ニドランスの形質転換に対する
方法（バランス等、Biochem.Biophs.Res.
Commnm.，112（1983），284−289；トリブラン
等、Gene 26（1983），205−221、ヤルトン等、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81（1984），1470−
1474）から採用した方法であり更にA.ニガーの
形質転換に対するブクトン等の方法（Gene 37
（1985），207〜214）に類似した方法である。本発
明のプロセスにおいて、アスペルギルス菌株を、
選択マーカーを含むベクター系で形質転換する
が、該マーカーは宿主菌株のゲノムに組込まれる
ことができるが、形質転換前に宿主菌株内には入
らない。次いで形質転換体は選択することがで
き、組込まれた選択マーカーを基礎に非形質転換
体から単離される。 好ましい選択マーカーはargB（A.ニドランス又
はA.ニガー）、trpC（A.ニドランス）、amdS（A.ニ
ドランス）、又はpyr4（ニユロスポラクラザ）遺
伝子、又はDHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ又
はその突然変異体）遺伝子である。更に好ましい
選択マーカーはargB又はamdS遺伝子である。野
性型A.オリゼ菌株は、通常argB+である（すなわ
ち、argB遺伝子はA.オリゼ内で機能的である）。
もしも、argBを選択マーカーとして選ぶ場合、
このマーカーに対し遺伝子内に欠損を有するA.
オリゼのargB突然変異菌株は宿主菌株として使
用されねばならない。A.オリゼargB突然変異体
はF.P.ブクトン等（Gene37（1985），207〜214）
によつて記載される如く調製できる。argB突然
変異体は、オルニチントランスカルバミラーゼ遺
伝子内に欠損を有する突然変異体として定義され
る。一方、amdS遺伝子は野性型A.オリゼの形質
転換に対する選択マーカーとして使用できる。何
故なら野性型菌株はこの遺伝子を有しないからで
ある。 遺伝子発現を促進する機能をコードするDNA
配列は、典形的にはプロモーター、転写ターミネ
ーターおよびポリアデニル化シグナルである。 当業者に周知の如く上流活性化配列およびエン
ハンサー配列に先行されているプロモーターは、
アスペルギルスにおいて強い転写活性を示すこと
ができ更に細胞外および細胞内蛋白質、例えばア
ミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リ
パーゼ、セルラーゼおよびグルコース分解酵素を
コードする遺伝子から誘導されるいかなるDNA
配列でもよい。適当なプロモーターは、A.オリ
ゼTAKAアミラーゼ、リゾムコールマイヘイア
スパラテイクプロテアーゼ、A.ニガーグルコア
ミラーゼ、A.ニガー中性α−アミラーゼ、A.ニ
ガー酸安定性α−アミラーゼ、およびリゾムコー
ルマイヘイリパーゼである。グルコース分解酵素
に対する遺伝子からのプロモーターの例は、
TPI，ADHおよびPGKである。 本発明に係る好ましいプロモーターは、A.オ
リゼTAKA−アミラーゼプロモーターである。
TAKAアミラーゼは周知のα−アミラーゼであ
る（戸田等、Proc.Japan Acad.58 Ser.B（1982）
208−212）。プロモーター域をコードするDNA
は、ヨーロツパ特許出願87103806.3に記載される
ようにTAKA−アミラーゼゲノムクローンから
誘導される。プロモーターの配列およびプロモー
ターの上流領域並びにプレレージヨンおよび
TAKA−アミラーゼに対する構造遺伝子の５′未
満を第１図に示す。 TAKAアミラーゼプロモーターは、ヨーロツ
パ特許出願87103806.3に関連して寄託されたプラ
スミドpTAKA１７から入手可能である。プラス
ミドpTAKA１７のエンドヌクレアーゼ制限地図
を第２図に示す。 pTAKA１７から、プロモーターに対する上流
配列又はその機能的部分を含む全プロモーター配
列は、当業者に明白な手段によつて誘導される。
プロモーター配列は、別のDNA、例えば所望の
蛋白質生産物又は別のプレレージヨン（ジグナル
ペプチド）をコードする遺伝子とプロモーター配
列との連結反応を促進する特異的制限部位を導入
する目的でリンカーを有することができる。 本発明に係る方法において、ヌクレオチド−１
１４４（第１図参照）（Sal Ｉ部位を示す）から
ヌクレオチド−１０までの配列がプロモーター領
域の十分な機能的部分の１例として用いられた。
本発明の他の態様において、ヌクレオチド−１１
７６から−１のヌクレオチド配列の前にpTAKA
１７から未だ配列が決定されていない1.05kbフラ
グメントがあつた。別の断片を用いることができ
るのは当業者に明らかである。 本発明の一態様によれば、プロモーターおよび
上流活性配列は次の配列又は機能的に等価なヌク
レオチド配列を有す： 【表】 （これは第１図におけるヌクレオチド−１１４４
から−１０までの配列を示す） 別の態様によれば、プロモーターおよび上流活
性配列は、次の配列又は官能的に等価なヌクレオ
チド配列を有する： 【表】 本発明の別の面によれば、後者の配列は
pTAKA１７から1.05kbの配列未決定の上流領域
（第２図中位置０から1.05）によつて先行されて
いる。 ターミネーターおよびポリアデニル化配列は、
プロモーターと同じ起源から由来する。エンハン
サー配列もまた構築に導入され得る。 発現した生産物は、生産物を単離するために細
胞の崩壊を要求する細胞内で蓄積される。この別
のプロセス工程を避けるため、更にまた細胞内で
発現された生産物の崩壊量を最少にするため、生
産物は細胞から分泌されるのが好ましい。この目
的のため、所望生産物に対する遺伝子は、細胞の
分泌経路に発現された生産物を有効に向けること
を確保するプレレージヨンを有する。 プレレージヨンは、何らかの起源の生物から分
泌された蛋白質に対する遺伝子から誘導される。 本発明によれば、プレレージヨンはアスペルギ
ルス種由来のグルコアミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼ遺伝子、バシラス種由来のアミラーゼ遺伝
子、リゾムコールマイヘイ由来のリパーゼ又はプ
ロテアーゼ遺伝子、S.セレビゼ又はヒユミコーラ
リパーゼ由来のα−因子に由来する。更に特異的
には、プレレージヨンはヒユミコーララヌギノザ
リパーゼ、A.オリゼTAKAアミラーゼ、A.ニガ
ー中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸安定性α−
アミラーゼ、B.リケニフオルミスα−アミラー
ゼ；バシラスNC1B 11837由来のマルトース分解
アミラーゼ、B.ステロサーモフイラスα−アミ
ラーゼ又はB.リケニフオルミスズブチリシンに
対する遺伝子から誘導される。ヒユミコーララヌ
ギノザシグナルペプチドは次の配列を有する： ATGAGGAGGTCCCTTGTGCTGTTCTTTG
ＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＣ MetArgSerSerLeuValLeuPhePheValSerAlaTr
ｐＴｈｒＡｌａ TTGGCC LeuAla TAKA−アミラーゼは、次の配列を有する： ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTC
ＴＧＴＡＣＧＧＣＣＴＴＣＡＧＧＴＣ MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyL
ｅｕＧｌｎＶａｌ GCGGCACCTGCTTTGGCT AlaAlaProAlaLeuAla プロモーターおよびターミネーターに機能的に
結合している所望生産物に対する遺伝子は、選択
マーカーを有するベクター内に挿入されるか、又
は宿主菌株のゲノムに組込まれ得る別個のベクタ
ー又はプラスミド上に組込まれる。本発明で語句
「ベクター系」と言う場合は、単一のベクターも
しくはプラスミド又は２種以上のベクターもしく
はプラスミドが含まれこれらは一緒になつて宿主
ゲノムに組込まれるべき全DNA情報を含有する。
ベクター又はプラスミドは線状又は閉鎖環状分子
である。本発明の好ましい態様によれば、宿主生
物は２個のベクターと同時形質転換されるが、１
個のベクターは選択マーカーを有し更に他のベク
ターは、プロモーターを含んで、宿主菌株に導入
されるべき残りの外来DNA、所望産物に対する
遺伝子又はCDAおよび転写ターミネーターおよ
びポリアデニル化配列を含んで成る。 通常、形質転換体は安定であり、選択圧の非存
在下で培養できる。もしも、形質転換体が不安定
であることが判明すると、選択マーカーは培養中
選択に対し使用できる。次いで形質転換された細
胞を問題のマーカーに相当する選択圧力のもとで
培養する。 以下の実施例中出発物質として用いられるプラ
スミドは次の如くである： p285：（ATCC No.20681） pSa143：バーゼ等、Gene25（1983），109−
117John ＆ Peberdy，Enzyme Microb.
Technol.6（1984），384−389. p3SR2：J.M.ケリーおよびM.J.ハイネス、
EMBO Journal ４（1985），475−479. p3P62−K2および pCDVI−PL：ノマ等、Nature，319，（1986），
640−646） p775：ヨーロツパ特許出願No.87103806.3， pUC19：ビエリラ等、Gene19（1982），259−268
and Messing，Meth.in Enzymology 101
（1983），20−27. 用いた菌株は次の如くである： A.oryzae*：ATCC 20423，IFO 4177，ATCC
1011，ATCC 9576，ATCC 14488−11491，
ATCC 11601 and ATCC 12892. E.coli：MC1000（Casabadan，M.J.and Cohen，
S.N.，J.Mol.Biol.138，179−207）（NCIB
11956） H.lanuginosa：DSM 4109 A.niger*：ATCC 10105，ATCC 10582. ※これらの菌株のArgB突然変異体は、F.P.ブ
クトン等（Gene37（1987）207−214）によつて
記載される如く調製できる。argB突然変異体は
オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子内に欠
損を有する突然変異体として定義される。 ヒユミコーララヌギノザリパーゼ（HLL）ア
ミノ酸配列の同定 特異的オリゴヌクレオチドプローブの構築をな
さしめる情報を得るため、部分配列の決定を精製
ヒユミコーララヌギノザリパーゼについて行つ
た。菌糸体および低分子量物質がすでに除去され
た、ヒユミコーララヌギノザの培養ブロスからの
上澄みを、DEAE−セフアロース（アニオン交換
クロマトグラフイー）、フエニルセフアロース
（疎水性相互作用クロマトグラフイー）を用いて
行うカラムクロマトグラフイーに委ね、次いで
TSK G3000SWによるゲル濾過に委ねる。破裂
決定は、チム等（FEBS Lett.212，307−312
（1987））によつて記載される如く気相シーケンサ
ー（アプライドバイオシステムモデル470A）を
用いて行つた。 次のＮ−末端配列が見出された： Glu−Val−Ser−Gln−Asｐ５−Leu−Phe−Asn
−Gln−Ｐｈｅ１０−Asn−Leu−Phe−Ala−Ｇｌｎ１５
−Tyr−Ser−Ala−Ａｌａ２０−Tyr−Ｘ−Gly−
Lys−Asn−２５ この配列は、アミノ酸残基No.７〜No.11（Phe−
Asn−Gln−Phe−Asn）およびアミノ酸残基No.
13〜No.16（Phe−Ala−Gln−Tyr）をそれぞれ含
んでなる２種の特異的混合オリゴヌクレオチドプ
ローブの構築を認める。上記配列に相当する
HLL−特異的オリゴヌクレオチド混合物を用い
たヒユミコーララヌギノザcDNAライブラリーの
スクリーニングを例１に示す。 〔実施例〕 例 １ E.コリー中でのヒユミコーララヌギノザcDNA
ライブラリーの構築 ベール等（EMBO J.，３：1097〜1102，1984）
およびチルギウイン等（Biochemistry（Wash.），
18，5294〜5299，1979）によつて記載される方法
により、全RNAを均質化したH.ラヌギノザマイ
セリウムから抽出した。ポリ(A)−含有RNAを、
アビブおよびリーダー（PNAS，USA，69，
1408〜1412，1972）によつて記載される如くオリ
ゴ（dT）−セルロースについての２サイクルでの
アフイニテイクロマトグラフイーにより得た。岡
山およびベルグ（Molec.Cell.Biol.，２：161−
170，1982）によつて記載される方法を用い、更
にノマ等（Nature，319：640〜646，1986）によ
つて記載されるベクターpSP62−K2および
pCDVI−PLを用いてcDNAを合成した。合成さ
れたcDNAを、E.コリーMC1000のhsdR-，M+誘
導体（カサダバンおよびコーヘン、J.Mol.Biol.，
138，179〜207，1980）に形質変換し組換え体ク
ローンを得た。 ヒユミコーララヌギノザリパーゼ（HLL）特
異性cDNA組換え体の同定 32個のペンタデカマーオリゴデオキシリボヌク
レオチド： d(ATTAAAATGATTAAA), G G G G G （この内の一つは、Phe−Asn−Gln−Phe−
Asnに対しコードする領域内でHLL mRNAに対
して相補的である）の混合物を、アプライドバイ
オシステム社のDNA合成機で合成し、次いでポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によつて精製し
た。ヒユミコーララヌギノザcDNAライブラリー
からの約10000個のE.コリー組換え体を、ワトマ
ン540紙に移した。クローンを洗浄し、ゲルデン
等（NucleicACiDSRes.７，2115〜2135，1979）
に記載される如く固定化した。フイルターを、ベ
ール等（EMBOJ.３，1097〜1102，1984）によつ
て記載される如く、32Ｐ−ラベル化HLL特異性ペ
ンタデカマー混合物でハイブリド化した。ハイブ
リド形成およびフイルターの洗浄は、それぞれ37
℃および43℃で行い、次いでインテンスフアイヤ
ースクリーンで24時間オートラジオグラフイーに
より追跡した。ミニプレププラスミドDNAを、
標準方法（ビルボイムおよびドリー、Nucleic
Acids Res.，７，1513〜1523，1979）を用い、
２種のハイブリド化コロニー、pHLL702，３か
ら単離し、次いでcDNA挿入のDNA配列をマキ
サムおよびギルベルト（Methods Enzymol.65，
499−560，1980）の手順により確立した。 HLL cDNAを用いた構築作業を更に促進する
ため、独特の制限サイトを含有するDNA配列を
次の如くcDNAの５′および３′末端に加えた。
３′未翻訳領域内でHLL cDNAを消化する
Sau961を用いてpHLL702.3を消化し、次いで得
られた末端をE.コリーDNAポリメラーゼ（クレ
ノー断片）および４種のdNTPでフイルインし
た。このDNAを、開始メチオニンコドンに対し
丁度３′で１回HLL cDNAを切断するSacIで連
続的に消化した。得られた0.9kb HLL cDNA断
片を、アガロースゲル電気泳動法により精製し、
電気溶出し次いで連結反応用に調製した。５′ア
ダプターとして、２個のオリゴヌクレオチド、
927および928を合成した。アダプターの配列を第
３１図に示す。このアダプターを、HLL cDNA
の開始Metコドンに対し丁度５′でHindおよび
BamHIサイトを加えるように設計した。２種の
オリゴを、ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてキナーゼ処理し、互いにアニールし
次いで、すでにHindおよびHincで消化（つ
いで0.7％アガロースゲルで精製されたpUC19ベ
クター内で精製0.9kb HLL cDNA配列に連結し
た。得られたプラスミドpHLLは、移送可能な
0.9kb BamHI断片としてHLL cDNAを有して
いた。pHLLの構築を第３図に示す。 BamHI消化およびアガロースゲル上での0.9kb
HLL cDNA断片の精製後、それをBamHI消化
しかつホスフアターゼ処理したp775に連結し
p960を得、ここにおいてHLL cDNAはアスペル
ギルスオリゼ由来のTAKAプロモーターおよび
アスペルギルスニガー由来のAMGターミネータ
ーの転写活性の制御のもとにある。p960の構築
を第４図に示す。p775の構築は、ヨーロツパ特
許出願87103806.3に記載されている。 p775は、TAKAプロモーターとAMGターミネ
ーターを含み更にクローニングサイトとして独得
のBamHIサイトを有している。 第５ａ図および第５ｂ図は、その導かれたアミ
ノ酸配列と共にブレプロHLL cDNAの配列を示
す。ヌクレオチドは、クローン化cDNA中の第一
塩基から番号をつけられている。このcDNA配列
から、以下の内容が結論づけられる。すなわち、
HLLが、17個の残基のシグナルペプチドおよび
５個の残基の短いプロペプチドを有した291個の
アミノ酸残基の長い前駆体として合成されてい
る。推定上のシグナルペプチダーゼプロセシング
サイト（フオンヘイネ，Eur.J.Biochem.133，17
〜21，1983）は、AlaとSerとの間のペプチド結
合を示す矢印で示される。アミノ末端アミノ酸配
列により同定される如き成熟酵素のアミノ末端が
示される。 ヒユミコーララヌギノザ（HLL）のアミノ酸
組成 ６モルのHC又は４モルのメタンスルホン酸
のシールしたアンプル中、110℃で24時間、48時
間および96時間予め加水分解したサンプル
（40μg）について、ベツクマンアミノ酸分析機
（型JL1 MB）を用いアミノ酸分析を行つた。半
シスチンを、トリブチルホスフインにより還元し
次いで４−ビニルピリジンとカツプリングした後
Ｓ−β−（４−ピリジルエチル）−システインとし
て測定した。全ての試剤は、最高純度のものであ
つた。 結果を次表に示すが、cDNA配列により決定し
たアミノ酸組成と比較する。 【表】 【表】 例 ２ アスペルギルスオリゼ又はアスペルギルスニガ
ーの形質転換（全体手順） 100mlのYPD（ゼーマン等、Methods in Yeast
Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，
1981）を、A.オリゼ、A.ニガー又はそれらの
argB突然変異体の胞子を用いて接種し次いで37
℃で約２時間振とうしながらインキユベートし
た。菌糸体をミラクロスを用いてろ過して集め、
次いで0.6モルのMgSO4200mlで洗浄した。菌糸
体を15mlの1.2モルのMgSO4、10ミリモルの
NaH2PO4 PH5.8に懸濁せしめた。懸濁液を氷上
で冷却し次いで120mgのNovozym 234を含有す
る緩衝液（バツチ1687）１mlを添加した。５分
後、12mg／mlBSA（シグマタイプH25）１mlを添
加し、次いで多数のプロトプラストが顕微鏡下で
観察したサンプル中に可視できるまで穏やかに攪
拌しながら37℃で1.5〜2.5時間インキユベーシヨ
ンした。 懸濁液をミラクロスでロ過し、ロ液を殺菌チユ
ーブに移し、次いで５mlの0.6モルソルビトール、
100ミリモルのトリス−HC、PH7.0でおおつた。
遠心分離を、1000gで15分間行い、次いでプロプ
ラストをMgSO4クツシヨンの頂部から採取した。
２容量のSTC（1.2モルのソルビトール、10ミリモ
ルのTric−HC、PH7.5、10ミリモルのCAC2）
を、プロトプラスト懸濁液に添加し、次いで混合
物を５分間1000gで遠心分離した。プロトプラス
トペレツトを３mlのSTC中で再懸濁させ次いで
再ペレツト化した。これをくりかえした。最後に
プロトプラストを0.2〜１mlのSTCに再懸濁させ
た。 100μのプロトプラスト懸濁液を、15μの
STC中、適当なDNA5〜25μgと混合した。argB
菌株由来のプロトプラストを、pSa143 DNA（A.
ニドランス argB遺伝子担持プラスミド）と混
合し次いでargB+菌株由来のプロトプラスト
p3SR2（A.ニドランス amdS遺伝子担持プラス
ミド）と混合した。混合物を室温で25分間放置し
た。0.2mlの60％PEG400（BDH29576）、10mMの
CAC2および10mMのトリス−HC、PH7.5を
添加し次いで注意深く混合し（２回）、最後に
0.85mlの同溶液を加え、注意深く混合した。混合
物を室温で25分間放置し、2500gで15分間回転さ
せ、更にペレツトを２mlの1.2モルソルビトール
に懸濁させた。もう一度沈降させた後、プロトプ
ラストを適当なプレート上に散布した。pSa143
で形質転換したargB菌株由来のプロトプラスト
を、炭素および窒素源としてそれぞれグルコース
および尿組を用い、更に浸透安定化用の1.2モル
ソルビトールを有するミニマルプレート（Cove，
Biochem.Biophys.Acta113（1966）51−56）上
に散布した。p3SR2で形質転換したargB+菌株由
来のプロトプラストを、1.0モルのスクロース、
窒素源としての10ミリモルのアセトアミドおよび
バツクグラウンド増殖を阻止するための20ミリモ
ルCsCを含有するミニマルプレート（Cove，
Biochem.Biophys.Acta113（1966）51〜56）上
に散布した。37℃で４〜７日間インキユベーシヨ
ンした後、胞子を選び、殺菌水に懸濁させ次いで
単一コロニーに散布した。この手順をくりかえ
し、第２回の再単離後単一コロニーの胞子を規制
した形質転換体として保存した。 例 ３ A.オリゼ菌株内での組換え体リパーゼ（RHL）
の発現 p960を、例２で記載した如くA.ニドランス由
来のamdS遺伝子含有p3SR2で同時形質転換する
ことによりA.オリゼIF04177に形質転換する。上
述の如く調製したプロトプラストを、p960およ
びp3SR2の同量の混合物（各々ほゞ5μg）を用い
てインキユベートした。唯一の窒素源としてアセ
トアミドを用いることのできる形質転換体を２回
再単離する。YPD（ゼーマン等、1981）上で３回
増殖後、培養上澄みをSDS−PAGEで分析する。
ゲルをコマシーブリリアントブルーＲで染色す
る。最もより形質転換体を更に研究するため選別
し、次いで４％の大豆ミル上の２キラー発酵槽
中で増殖させ、増殖中グルコースを与えた。培養
物を発酵中強く攪拌する。組換え体ヒユミコーラ
リパーゼ生産物（RHL）を、遠心分離による細
胞の除去により培養ブロスより単離し、上澄みを
限外ろ過し次いで凍結乾燥する。 例 ４ A.ニガー菌株中でのヒユミコーラリパーゼの
発現 例２で記載する如く、A.ニドランスargB遺伝
子含有pSa143で同時形質転換することによつて
A.ニガー argBに形質転換した。プロトプラス
トを各々のプラスドの同等（約5μg）と共にイン
キユベートした。形質転換体をミニマルプレート
（Cove，Biochem.Biophys.Acta 113（1966），
51〜56）上でアルゲニン要求に基づき選別した。 分子胞子を２回再単離後、形質転換体をYPD
（ジーマン等、1981）中30℃で数日間培養した。
培養上澄みをSDS−PAGEで分析した。大部分の
形質転換体は、その上澄み中にヒユミコーラリパ
ーゼを産生した。 炭水化物含量を例５で記載した如くエンドＨ処
理により分析した。以下の内容が見出された。す
なわち、炭水化物含量は天然のヒユミコーラリパ
ーゼに対するとほぼ同程度であつた。エンドＨ感
受性は、A.オリゼ由来の組換え体ヒユミコーラ
リパーゼに対してのものと同じであつた。従つ
て、グルコシル化の性質はA.オリゼおよびA.ニ
ガーにおけると同じであると推定された。 例 ５ RHL（例３で得られる組換え体リパーゼ生産物
およびHLL（DSM4109の培養によつて得られる
天然リパーゼ生産物）中の炭水化物含量の測定 炭水化物側鎖を分解しうる酵素（エンドＨおよ
びグリコペプチターゼＦ）を用いる処理。 RHLおよびHLLを、グリコペプチダーゼＦ
（ベーリンガーNo.91378、500μの水に溶解した
100単位のバイアル）およびエンドＨ（シグマNo.
E6878、シトレート緩衝液PH5.5に溶解）で処理し
た。 HLLおよびRHLを各々10mMのトリスPH7.5
（１mg／ml）に溶解した。100μのHLLおよび
RHLの各々に、2μのグリコペプチダーゼＦを
加え、サンプルを37℃で20時間インキユベートし
た。 更にHLLとRHLを10mMトリスPH7.5（１mg／
ml）に溶解し、25μのEndo Ｈおよび50μの
0.1モル酢酸ナトリウムPH5.0を、HLLとRHLの
25μの各々に加えた。サンプルを37℃で20時間
インキユベートした。 サンプルを、未処理HLLおよびRHLと共に7.5
〜20％のSDS−PAGE勾配ゲルで操作した。SDS
−PAGE勾配ゲルを第７図に示す。第７図のサン
プルは次の如くである。 １標準：92K，67K，43K，30K，20.1K，14.4K 2HLL，10mMトリス（PH7.5）中１mg／ml 3HLL＋Endo Ｈ 4RHL＋Endo Ｈ 5RHL＋グリコペプチダーゼＦ 6HLL＋グリコペプチダーゼＦ 7RHL＋Endo Ｈ 8RHL＋グリコペプチダーゼＦ 9RHL，10mMトリス（PH7.5）中１mg／ml 第７図から以下の内容が明らかである。すなわ
ち、グリコペプチダーゼＦはHLLとRHLの双方
の炭水化物部分を分解することができ更に残りの
蛋白質が同じ大きさである。一方Endo Ｈは
RHLの炭水化物のみ分解することができ、一方
HLLのEndo Ｈ処理は何らの効果ももたらさな
い。 従つて、HLLとRHLの双方はＮ−グリコシル
化される。しかし、グリコシル化は異なつた性質
である。 Biochemistryにおいて提案されたチム等、チ
ヤプリン、M.F.（1982），AnaI.Biochem.123，
336〜341およびヤントフ、N.（1985），Anal.
biochem.148，424−433に記載された方法を用い
て炭水化物の分析を行つた。 リパーゼ含有サンプルをメタノリシスに委ね、
次いでアミノ糖の再−Ｎ−アセチル化を行い更に
第２回の温和なメタノリシス工程によりＯ−アセ
チル基を脱離せしめた。逆相高圧液体クロマトグ
ラフイーによる分析に対し適当な誘導体がメチル
グリコシドのパーベンゾイル化によつて得られ
た。 分析結果を次表に示す。 【表】 サミン
マンノース 5.7 8.6
ガラクトース 0 3.3
天然ヒユミコーラリパーゼHLLの炭水化物残
基は、ハイマンノースタイプのＮ−グリコシル化
において見出された２種の単糖類から構成されて
いる（モントレニル、J.等、1986，
「Carbohydrate analysis：ａ practical
approach」、チヤプリン、M.F.およびケンデイ
ー、J.F.IRLプレス，オクスフオード，p143）。 Ｎ−アセチルグルコサミン（＜２モル／モル）
に対する結果は、主配列のみが単一のＮ−グリコ
シル化を有していることを示している。このこと
は、更にcDNA配列（第５ａ図および第５ｂ図）
から推論される。加えて、マンノースはセリン又
はトレオニン残基にＯ−グリコシド結合しえた。 Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノースの
外に、組換え体ヒユミコーラリパーゼ、RHLは
相当量のガラクトースを含む。天然リパーゼに関
し、Ｎ−アセチルグルコサミンの含量は、単一Ｎ
−グリコシル化の存在を示す。しかし、これはも
しガラクトースがこの一部である場合は複合体は
ハイブリドタイプである。しかし、セリンもしく
はトレオニン残基でのＯ−グリコシル化は、もし
も組換え体RHLリパーゼのＮ−グリコシル化が
天然HLLリパーゼに対する場合と同様にハイマ
ンノースタイプである場合、ガラクトースの存在
の原因である。 炭水化物部分は、天然ヒユミコーラリパーゼ
HLLおよび組換え体ヒユミコーラリパーゼRHL
の分子量に各々約1500Dおよび2600Dを平均で加
えている。これは炭水化物含量を各々約4.9％お
よび8.1％に相当する。 例 ６ RHLおよびHLLの安定性に対するPHおよび温
度の作用 RHL（1.4×106LU／ｇ）およびHLL（0.2×106
LU／ｇ）の各々を、種々のPHの緩衝液に溶解し
次いで55°および60℃の温度で２時間インキユベ
ートした。緩衝溶液を、47.5mMの酢酸ナトリウ
ム、MOPS（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンス
ルホン酸）およびホウ酸から調製し、0.1N HC
又は1N NaOHを用いてPH４，５，６，７，
８，９および10に調節した。加えて、1.5×106
LU／ｇに精製したHLLのサンプルの別個のテス
トに用いた緩衝液を、PMSF（フエニルメタンス
ルホニルフルオリド）に添加しこの天然リパーゼ
生産物中でのプロテアーゼ含量を抑制した。 溶液中のリパーゼ含量は、約10〜15LU／mlに
等しかつた。 インキユベーシヨン後直ちに、リパーゼ溶液を
氷水浴内で冷却し次いで同日分析するそこに保つ
た（LU−法、AF95）。 結果を第６図および第８図に示す。 第６図から明らかなようにRHLの熱安定性は
55℃および60℃の各々で、PH５〜10でHLLのそ
れよりもより大である。 第８図から明らかなように、RHLのより大き
い熱安定性は、部分的にはH.ラヌギノザプロテ
アーゼ活性が存在しないためである。 例 ７ 典形的アルカリバシラスsp.プロテアーゼ（こ
こでは、商業的に入手可能な洗剤酵素Esperase
（商標）の存在下、比較できる単位活性レベル４
×106LU／ｇのRHLおよびHLLの安定性 インキユベーシヨン条件は、3600LU／およ
び0.057AU／（AU／LU＝0.016×10-3）の濃
度を用い、0.1Mホウ酸、PH9.5でかつ40℃又は50
℃であつた。残留活性を対照インキユベーシヨン
を基礎に計算した。 結果を第９図に示す。 第９図から明らかなように、、アルカリ性バシ
ラスプロテアーゼの存在下、RHLの熱安定性は
HLLのそれよりも秀れており、これによりプロ
テアーゼによる攻撃に対するそれらの感受性にお
ける相違がわかる。 比較例 (a) 本発明方法による組換え体ヒユミコーラリパ
ーゼの調製 実施例２および実施例３において記載した如
く調製された形質転換体を、YPG寒天基質
（YPG寒天：0.4％の酵母エキス、1.5％のグル
コース、0.1％のK2HPO4，0.05％のMgSO4・
7H2Ｏ，２％の寒天）から以下の組成を有する
中性培地130mlを有する500mlフラスコに接種し
た： 大豆粉 ３％ アルトデキストリン 1.5％ （Glucidex6、ロ・ケツテ フレレス社から
入手可能） バクトペプトン（デイフコ） 0.5％ プルロニツク61L 0.02％ フラスコを30℃でかつ275rpmで４日間振と
うした。測定の結果収率は2990LU／ｇであつ
た。 (b) ヒユミコーララヌギノザ（Humicola
lanuginosa）を培養することによる生来ヒユミ
コーラリパーゼの調製 ヒユミコーララヌギノザ（Humicola
lanuginosa）を、以下の組成を有するGTS基
質内で、45℃で３日間培養した： 10g／の酵母エキス 5g／のスパン80 5g／のツイーン80 2g／のMgSO4・7H2Ｏ 0.1g／のCaC2・2H2Ｏ 2g／のナルコ10 オートクレープ処理前のPH：6.0 発酵後、２個のフラスコ内のリパーゼ活性は
それぞれ541LU／mlおよび440LU／mlであつ
た。
第１図は、TAKA−アミラーゼプロモーター
および上流プロモーター領域、プレレージヨンお
よびTAKA−アミラーゼに対する構造遺伝子の
５′部のDNA−配列を示し、第２図は、プラスミ
ドpTAKA17のエンドヌクレアーゼ制限酵素地図
であり、第３図は、プラスミドpHLLの構築を示
し、第４図はプラスミドp960の構築を示し、第
５ａ図および第５ｂ図は、三文字の略記号によつ
て与えられる推論されたアミノ酸配列と共にプレ
プロヒユミコーララヌギノザリバーゼcDNAの
DNA配列を示し、第６図は、55℃および60℃で
かつ種々のPHで天然ヒユミコーラリパーゼ生産物
の残留活性と比較した組換え体ヒユミコーラリパ
ーゼの残留活性を示すグラフであり、第７図は、
SDS−PAGEグレデエントゲルを示し、これは図
面に代わる写真であり、第８図は、プロテアーゼ
阻害剤（PMSF）を含有する天然ヒユミコーラリ
パーゼの残留活性と共に組換え体ヒユミコーラリ
パーゼ生産物および天然ヒユミコーラリパーゼ生
産物の55℃での残留活性を示すグラフであり、第
９図はアルカリバシラスプロテアーゼ製品の存在
下、天然および組換え体ヒユミコーラリパーゼの
40℃および55℃での残留活性を示すグラフであ
る。
および上流プロモーター領域、プレレージヨンお
よびTAKA−アミラーゼに対する構造遺伝子の
５′部のDNA−配列を示し、第２図は、プラスミ
ドpTAKA17のエンドヌクレアーゼ制限酵素地図
であり、第３図は、プラスミドpHLLの構築を示
し、第４図はプラスミドp960の構築を示し、第
５ａ図および第５ｂ図は、三文字の略記号によつ
て与えられる推論されたアミノ酸配列と共にプレ
プロヒユミコーララヌギノザリバーゼcDNAの
DNA配列を示し、第６図は、55℃および60℃で
かつ種々のPHで天然ヒユミコーラリパーゼ生産物
の残留活性と比較した組換え体ヒユミコーラリパ
ーゼの残留活性を示すグラフであり、第７図は、
SDS−PAGEグレデエントゲルを示し、これは図
面に代わる写真であり、第８図は、プロテアーゼ
阻害剤（PMSF）を含有する天然ヒユミコーラリ
パーゼの残留活性と共に組換え体ヒユミコーラリ
パーゼ生産物および天然ヒユミコーラリパーゼ生
産物の55℃での残留活性を示すグラフであり、第
９図はアルカリバシラスプロテアーゼ製品の存在
下、天然および組換え体ヒユミコーラリパーゼの
40℃および55℃での残留活性を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アスペルギルス（Aspergillus）宿主内にお
ける組換え体ヒユミコーラ（Humicola）リパー
ゼの製造方法であつて、次の工程： (a) １回のコピー又はそれ以上のコピーで適当な
アスペルギルス宿主のゲノムに組込むことので
き；更にDNA配列が、プロモーター、転写開
始部位、および転写ターミネーターおよびポリ
アデニル化機能のような遺伝子発現を促進する
機能をコードするDNA配列、それによつて上
流活性化配列により先行されているプロモータ
ー、およびヒユミコーラ属由来のリパーゼをコ
ードするDNA配列を含んで成る組換え体DNA
クローニングベクター系を得る工程； (b) 工程(a)で得た組換え体DNAクローニングベ
クター系を用い、選ばれた選択マーカーに対し
機能遺伝子を有しないアスペルギルス宿主を形
質転換する工程；および (c) 適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次
いで所望により培地からリパーゼを回収する工
程を含んで成る前記方法。 ２ アスペルギルス宿主が、アスペルギルスオリ
ゼ菌株である、特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ３ プロモーターが、A.オリゼTAKAアミラー
ゼプロモーター又はその機能部分である、特許請
求の範囲第２項記載の方法。 ４ プロモーターおよび上流活性化配列が次の配
列： 【表】 又は官能的に等価のヌクレオチド配列を有す
る、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ プロモーターおよび上流活性化配列が次の配
列： 【表】 又は機能的に等価のヌクレオチド配列を有す
る、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 特許請求の範囲第４項記載の配列が、プラス
ミドpTAKA１７における０位から1.05位までの
1.05kbの未配列決定の上流領域によつて先行され
ている、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７ 前記ベクター系が二種のベクターを含んでな
り、１種のベクターが選択マーカーを含有し、更
に他のベクターが遺伝子発現を促進する機能をコ
ードするDNA配列および所望蛋白質産物をコー
ドするDNA配列を含有する、特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ８ ヒユミコーラ属由来のリパーゼと同じアミノ
酸配列を有する組換え体ヒユミコーララヌギノザ
リパーゼであつて、該組換え体リパーゼが天然ヒ
ユミコーララヌギノザ製品よりも熱安定がより大
きくかつ天然ヒユミコーララヌギノザリパーゼの
グリコシル化とは異なるグリコシル化を有し、約
５〜約30％（Ｗ／Ｗ）の炭水化物を含有し、PH約
６〜約９で、60℃での２時間後の残留活性が少な
くとも90％であるか、又はPH約5.5〜約9.2で、60
℃で２時間後の残留活性が少なくとも80％である
か、又はPH約６〜約9.5で、55℃での２時間後の
残留活性が少なくとも95％であるか、又はPH約９
で、55℃での残留活性が約99％であるか又はPH10
で、55℃での残留活性が少なくとも85％である、
前記リパーゼ。 ９ ガラクトースを含むことを特徴とする、特許
請求の範囲第８項記載の組換え体ヒユミコーラリ
パーゼ。 １０ １モルのリパーゼ蛋白質当たり、約１〜約
12モルガラクトースを含むことを特徴とする、特
許請求の範囲第９項記載の組換え体ヒユミコーラ
リパーゼ。 １１ １モルのリパーゼ蛋白質当たり、約２モル
のＮ−アセチルグルコサミン、約３〜約12モルの
マンノースおよび約１〜約６モルのガラクトース
を含む、特許請求の範囲第１０項記載の組換え体
ヒユミコーラリパーゼ。 １２ ヒユミコーララヌギノザリパーゼである、
特許請求の範囲第８〜１１項のいずれか１項に記
載の組換え体ヒユミコーラリパーゼ。
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