JPH01157383A - 組換え体ヒュミコーラリパーゼおよびその調製方法 - Google Patents
組換え体ヒュミコーラリパーゼおよびその調製方法Info
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- JPH01157383A JPH01157383A JP63212641A JP21264188A JPH01157383A JP H01157383 A JPH01157383 A JP H01157383A JP 63212641 A JP63212641 A JP 63212641A JP 21264188 A JP21264188 A JP 21264188A JP H01157383 A JPH01157383 A JP H01157383A
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒュミコーラ（ｌ（ｕｍｉｃｏｌａ）リパー
ゼの組換え体ＤＮＡ生産物の製造方法および組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼに関する。
ゼの組換え体ＤＮＡ生産物の製造方法および組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼに関する。
〔従来技術および発明が解決しようとする課題〕ヒュミ
コーラリパーゼは、好熱性サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍ
ｏｍ ｃｅｓ）種、例えばＨ，ラヌギノザ１ａｎｕ １
ｎａｓａ） （グリフォンアンドマウブランク）ブン
セ、Ｈ，ステラータ（Ｓｔｅｌｌａｔａ）ブンセ、■。
コーラリパーゼは、好熱性サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍ
ｏｍ ｃｅｓ）種、例えばＨ，ラヌギノザ１ａｎｕ １
ｎａｓａ） （グリフォンアンドマウブランク）ブン
セ、Ｈ，ステラータ（Ｓｔｅｌｌａｔａ）ブンセ、■。
ｎｅｎｓｉｓ） 、アピニスアンドエギンス、几、ヒア
ロサーモフィラ（ｈ ａｌｏｔｈｅｒｍｏ ｈｉｌａ）
モウバシア、マゼンアンドアブデルーヘフユッ、Ｈ，グ
リセアｒｉｓｅａ） ｖａｒ、インー゛イカ（ｉｎｄｉ
ｃａ）スブラマンヤン、Ｈ，プレビス（ｂｒｅｖｉｓ）
ｖａｒ、 サーモイデア（ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ
）、スブラマンヤンアンドチルマラカーアンドＨ，プレ
ビスボラスブラマンヤンアンドチルマラ力−を含む好熱
性ヒュミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種の菌株から得る
ことができる。
ロサーモフィラ（ｈ ａｌｏｔｈｅｒｍｏ ｈｉｌａ）
モウバシア、マゼンアンドアブデルーヘフユッ、Ｈ，グ
リセアｒｉｓｅａ） ｖａｒ、インー゛イカ（ｉｎｄｉ
ｃａ）スブラマンヤン、Ｈ，プレビス（ｂｒｅｖｉｓ）
ｖａｒ、 サーモイデア（ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ
）、スブラマンヤンアンドチルマラカーアンドＨ，プレ
ビスボラスブラマンヤンアンドチルマラ力−を含む好熱
性ヒュミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種の菌株から得る
ことができる。
ｎｏｓｕｓ）ライクリンスキー、セベドニヌム５７メノ
ー匹閃）（グリフォンアンドマウブランク）マーソンと
しても記載されてきている。
ー匹閃）（グリフォンアンドマウブランク）マーソンと
しても記載されてきている。
更に種スキタリジウムサーモフィラム（Ｓｃｙｔａｌｉ
−ｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ） （コニーア
ンドエマーソン）アウスウ９インチは、ヘーゲルにより
ヒュミコーラインソレンスＨｕｍｉｌｏｌａ １ｎｓｏ
ｌｅｎｓ に属するものと考えられた（１９７５＋
Ｔｈｅ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ−
１ｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ、 Ｉ
ｎ Ｂｔｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｔｌｌｕｍｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ、 ＲａｐｐＨｒｔ ｄｕ Ｉｅｒ Ｃ
ｏ１１ｏｑｕｅ Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎｅｌ−Ｎａ
ｎｃｙ １９７４（ｅｄ、Ｇ、Ｋｔｌｂｅｒｔｉｕｓ、
０．Ｒｅｉｓｉ−ｎｇｅｒ、 Ａ、Ｍｏｕｒｅｙ
＆ Ｊ、八、Ｃａｎｃｅｌａ Ｄａ Ｆｏｎｓ
ｅｃａ）＋Ｓａｒｒｅｇｕｅｍｉｎｅｓ ： Ｐｉｅｒ
ｒｏｎ Ｅｄｉｔｅｕｒ−５７２０６）。
−ｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ） （コニーア
ンドエマーソン）アウスウ９インチは、ヘーゲルにより
ヒュミコーラインソレンスＨｕｍｉｌｏｌａ １ｎｓｏ
ｌｅｎｓ に属するものと考えられた（１９７５＋
Ｔｈｅ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ−
１ｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｎ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ、 Ｉ
ｎ Ｂｔｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｅｔｌｌｕｍｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ、 ＲａｐｐＨｒｔ ｄｕ Ｉｅｒ Ｃ
ｏ１１ｏｑｕｅ Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎｅｌ−Ｎａ
ｎｃｙ １９７４（ｅｄ、Ｇ、Ｋｔｌｂｅｒｔｉｕｓ、
０．Ｒｅｉｓｉ−ｎｇｅｒ、 Ａ、Ｍｏｕｒｅｙ
＆ Ｊ、八、Ｃａｎｃｅｌａ Ｄａ Ｆｏｎｓ
ｅｃａ）＋Ｓａｒｒｅｇｕｅｍｉｎｅｓ ： Ｐｉｅｒ
ｒｏｎ Ｅｄｉｔｅｕｒ−５７２０６）。
ヒュミコーララヌギノザリパーゼの製造は、日本特許公
開公９８４８−６２９９０並びにヨーロッパ特許出願第
８７３０７６８４．８に記載されている。後者はまた脂
質分解洗剤の添加剤におけるこのリパーゼの使用を開示
している。
開公９８４８−６２９９０並びにヨーロッパ特許出願第
８７３０７６８４．８に記載されている。後者はまた脂
質分解洗剤の添加剤におけるこのリパーゼの使用を開示
している。
洗剤における酵素添加剤の世界的に広範囲の使用並びに
ヒュミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）リパーゼが洗浄力お
よび安定性に関して公知の洗剤リパーゼよりも秀れてい
ることが判明したために、このリパーゼの商業的興味は
高いものがある。
ヒュミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）リパーゼが洗浄力お
よび安定性に関して公知の洗剤リパーゼよりも秀れてい
ることが判明したために、このリパーゼの商業的興味は
高いものがある。
工業的酵素の製造において、収率は製造プロセスの有利
さに関し常に重要である。伝統的な改良方法は、高生産
変異体を得るために野生株を突然変異させることである
。組換え体ＤＮＡ技術を用いての別の可能性は、所望生
産物に対する遺伝子を、野生株よりも高収率又は他の好
ましい特性をもたらしうる宿主微生物に形質転換するこ
とである。
さに関し常に重要である。伝統的な改良方法は、高生産
変異体を得るために野生株を突然変異させることである
。組換え体ＤＮＡ技術を用いての別の可能性は、所望生
産物に対する遺伝子を、野生株よりも高収率又は他の好
ましい特性をもたらしうる宿主微生物に形質転換するこ
とである。
かくして、本発明の目的は組換え体ＤＮＡ技術によりヒ
ュミコーラリパーゼの製造方法を提供することにある。
ュミコーラリパーゼの製造方法を提供することにある。
従来、組換え体ＤＮＡ技術によりポリペプチド又は蛋白
質を製造するため、多数のプロセスが開発されてきた。
質を製造するため、多数のプロセスが開発されてきた。
主な興味は細菌と酵母に集中してば発現および選択系に
関して十分に特徴ある種である。
関して十分に特徴ある種である。
上記の微生物に加えて、繊維状菌、特にアスベ、火りｉ
（迭」区人拝旦りｊ月−リーどＩす搬−（酵素の商業的
製造に対し十分特徴づけられかつ広く使用されている）
は、組換え体ＤＮＡベクターに対し宿主微生物として魅
力的な候補者である。
（迭」区人拝旦りｊ月−リーどＩす搬−（酵素の商業的
製造に対し十分特徴づけられかつ広く使用されている）
は、組換え体ＤＮＡベクターに対し宿主微生物として魅
力的な候補者である。
過去数年において、アスペルギルスニドランスハηｙｔ
旦Ｕ」鳳Ｕ用針の形質転換に対する種々の選択マーカー
が記述されてきており更に真菌細胞の分化をコントロー
ルする遺伝学的および分子的プロセスの研究の目的で繊
維状真菌の統合的形質転換に対しての手順が最近開発さ
れてきている。
旦Ｕ」鳳Ｕ用針の形質転換に対する種々の選択マーカー
が記述されてきており更に真菌細胞の分化をコントロー
ルする遺伝学的および分子的プロセスの研究の目的で繊
維状真菌の統合的形質転換に対しての手順が最近開発さ
れてきている。
Ａ、ニドランスの形質転換が、ニュロスボラクｅ”Ｊ’
（Ｎｅｕｒｏｓ ｏｒａ ｃｒａｓｓａ） ｐｙｒ
−４遺伝子（Ｂａｌｌａ−ｎＣＥｌｌ Ｄ、Ｊ、等、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕ
ｎ、 。
（Ｎｅｕｒｏｓ ｏｒａ ｃｒａｓｓａ） ｐｙｒ
−４遺伝子（Ｂａｌｌａ−ｎＣＥｌｌ Ｄ、Ｊ、等、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕ
ｎ、 。
１１２（１９８３） ２８４−２８９）、Ａ、ニドラン
ス（ｎ ｉ ｄ ｕ １μ）ａｍｄ Ｓ遺伝子（Ｔｉｌ
ｂｕｒｎ、 Ｊ、Ｇ、等、Ｇｅｒｒｅ ３６（１９８３
）２０５−２２１）、Ａ、ニドランスｔｒｐ Ｃ遺伝子
（Ｙｅｌｔｏｎ。
ス（ｎ ｉ ｄ ｕ １μ）ａｍｄ Ｓ遺伝子（Ｔｉｌ
ｂｕｒｎ、 Ｊ、Ｇ、等、Ｇｅｒｒｅ ３６（１９８３
）２０５−２２１）、Ａ、ニドランスｔｒｐ Ｃ遺伝子
（Ｙｅｌｔｏｎ。
Ｍ、Ｍ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、八、、 ８１（１９８４）１４７０−１
４７４）およびＡ、ニドランスａｒｇ Ｂ遺伝子（ジョ
ーン、Ｍ、Ａ、およびＰｅｂｅｒｄｙ Ｊ、、 Ｍｉｃ
ｒｏｂ。
Ｕ、Ｓ、八、、 ８１（１９８４）１４７０−１
４７４）およびＡ、ニドランスａｒｇ Ｂ遺伝子（ジョ
ーン、Ｍ、Ａ、およびＰｅｂｅｒｄｙ Ｊ、、 Ｍｉｃ
ｒｏｂ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、 ６ （１９８４） ３８６ ３８９
）を含むプラスミドを用いて実証されている。形質転換
ＤＮＡは相当に低い緊度（典形的には１０００個未満の
被転換体／ＤＮＡ１μｇ）で宿主ゲノムに組込まれるこ
とが見出された。
）を含むプラスミドを用いて実証されている。形質転換
ＤＮＡは相当に低い緊度（典形的には１０００個未満の
被転換体／ＤＮＡ１μｇ）で宿主ゲノムに組込まれるこ
とが見出された。
Ａ、ニドランスのａｎｄ Ｓ遺伝子を用いたアスペルギ
ルスニガーの形質転換は記載されており（ケリーＪ、Ｍ
、およびハイネス、Ｍ、Ｊ、、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
１４ （１９８５） 、 ４７５−４７９）更にａｎｄ
Ｓは唯一の窒素源としてアセタミド上で強く増殖でき
ないアスペルギルスニガーの形質転換に用いるための強
力な選択マーカーであることを示した。アスペルギルス
ニドランスのａｒｇ Ｂ遺伝子を用いた八ｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｎｉｇｅｒの形質転換は記載されている（［１
ｕｘｔｏｎ、 Ｆ、Ｐ、等、Ｇｅｎｅ ３７（１９８５
）、２０？−２１４）。
ルスニガーの形質転換は記載されており（ケリーＪ、Ｍ
、およびハイネス、Ｍ、Ｊ、、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
１４ （１９８５） 、 ４７５−４７９）更にａｎｄ
Ｓは唯一の窒素源としてアセタミド上で強く増殖でき
ないアスペルギルスニガーの形質転換に用いるための強
力な選択マーカーであることを示した。アスペルギルス
ニドランスのａｒｇ Ｂ遺伝子を用いた八ｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓｎｉｇｅｒの形質転換は記載されている（［１
ｕｘｔｏｎ、 Ｆ、Ｐ、等、Ｇｅｎｅ ３７（１９８５
）、２０？−２１４）。
アスペルギルスニガーの被転換体の製造方法が、ヨーロ
ッパ特許０１８．４３８Ａに記載されており、さらに同
０２１５．５９４、および０２４９．３５０．は繊維状
真菌中の非相同ポリペプチドの発現を記載している。最
後にＷＯ３７１０４４６４はアスペルギルス中の高級真
核遺伝子の発現を記載する。
ッパ特許０１８．４３８Ａに記載されており、さらに同
０２１５．５９４、および０２４９．３５０．は繊維状
真菌中の非相同ポリペプチドの発現を記載している。最
後にＷＯ３７１０４４６４はアスペルギルス中の高級真
核遺伝子の発現を記載する。
本発明によれば、今や以下の内容が見出された。
すなわち、アスペルギルスｓｐ．菌株中ヒュミコーラｓ
ｐ、リパーゼの高レベル発現を得ること、またはヒュミ
コーラ菌株中でのリパーゼの生産を高めることが可能で
ある。
ｐ、リパーゼの高レベル発現を得ること、またはヒュミ
コーラ菌株中でのリパーゼの生産を高めることが可能で
ある。
最も広い面において、本発明は組換え体ヒュミコーラ（
Ｈｕｍｉｃｏｌａ）リパーゼの製造方法を提供するもの
であり、この方法は、次の工程： （ａ）遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配
列およびヒュミコーラリパーゼをコードするＤＮＡ配列
を含んでなる適当な組換え体ＤＮＡクローニングベクタ
ーを得る工程； （ｂ）工程（ａ）で得たクローニングベクターヲ用いて
適当な宿主生物を形質転換する工程；および（ｃ）適当
な培地中で形質転換した宿主を培養し次いで所望により
培地からリパーゼを回収する工程を含んで成る。
Ｈｕｍｉｃｏｌａ）リパーゼの製造方法を提供するもの
であり、この方法は、次の工程： （ａ）遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配
列およびヒュミコーラリパーゼをコードするＤＮＡ配列
を含んでなる適当な組換え体ＤＮＡクローニングベクタ
ーを得る工程； （ｂ）工程（ａ）で得たクローニングベクターヲ用いて
適当な宿主生物を形質転換する工程；および（ｃ）適当
な培地中で形質転換した宿主を培養し次いで所望により
培地からリパーゼを回収する工程を含んで成る。
本発明の次の狭い面において、アスペルギルスにおいて
ヒュミコーラリパーゼの製法が提供され、この方法は次
の工程（ａ）〜（Ｃ）： （ａ）１回のコピー又はそれ以上のコピーで適当なアス
ペルギルスのゲノムに組込むことのでき、更に遺伝子発
現を促進する機能をコードするＤＮＡ配列、被転換体の
適当な選択マーカー、およびヒュミコーラリパーゼをコ
ードするＤＮＡ配列を含んで成るＭ１換え体ＤＮＡクロ
ーニングヘクター系を得る工程； （ｂ）工程（ａ）で得た組換え体ＤＮＡクローニングベ
クター系を用い、選ばれた選択マーカーに対し機能遺伝
子を有しないアスペルギルス宿主を形質転換する工程；
および （ｃ）適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次いで
所望により培地からリパーゼを回収する工程を含んで成
る。
ヒュミコーラリパーゼの製法が提供され、この方法は次
の工程（ａ）〜（Ｃ）： （ａ）１回のコピー又はそれ以上のコピーで適当なアス
ペルギルスのゲノムに組込むことのでき、更に遺伝子発
現を促進する機能をコードするＤＮＡ配列、被転換体の
適当な選択マーカー、およびヒュミコーラリパーゼをコ
ードするＤＮＡ配列を含んで成るＭ１換え体ＤＮＡクロ
ーニングヘクター系を得る工程； （ｂ）工程（ａ）で得た組換え体ＤＮＡクローニングベ
クター系を用い、選ばれた選択マーカーに対し機能遺伝
子を有しないアスペルギルス宿主を形質転換する工程；
および （ｃ）適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次いで
所望により培地からリパーゼを回収する工程を含んで成
る。
本発明の第二の面によれば、以下の方法によるアスペル
ギルスにおけるヒュミコーラリパーゼの製造方法が提供
され、この方法によれば上記の如＜、組換え体ＤＮＡク
ローニングベクター系で形質転換されたアスペルギルス
菌株を適当な培地中で培養し次いでリパーゼを培地から
回収する。
ギルスにおけるヒュミコーラリパーゼの製造方法が提供
され、この方法によれば上記の如＜、組換え体ＤＮＡク
ローニングベクター系で形質転換されたアスペルギルス
菌株を適当な培地中で培養し次いでリパーゼを培地から
回収する。
本発明の第三の面によれば、公知の天然ヒュミコーラリ
パーゼとはグリコシル化において差異を有する新規組換
え体ヒュミコーラリパーゼ製品が提供される。すなわち
、本発明の組換え体ヒュミコーラリパーゼの性質および
グリコシル化の所望の程度は、天然のヒュミコーラ菌株
から得られるリパーゼとは異なる。本発明のヒュミコー
ラリパーゼ製品は、更に、相当する天然のヒュミコーラ
リパーゼに比較して改良された熱安定性にその特徴を有
する。
パーゼとはグリコシル化において差異を有する新規組換
え体ヒュミコーラリパーゼ製品が提供される。すなわち
、本発明の組換え体ヒュミコーラリパーゼの性質および
グリコシル化の所望の程度は、天然のヒュミコーラ菌株
から得られるリパーゼとは異なる。本発明のヒュミコー
ラリパーゼ製品は、更に、相当する天然のヒュミコーラ
リパーゼに比較して改良された熱安定性にその特徴を有
する。
更に詳しくは、新規組換え体ヒュミコーラリパーゼは、
以下の点においてその特徴を有する。すなわち、炭水化
物含量は天然リパーゼと同じレヘルであるかまたは天然
リパーゼ中の炭水化物含量よりもより大である。すなわ
ち、新規牛ヒュミコーラリパーゼは、天然リパーゼとは
他の炭水化物を含有する。炭水化物含量は、典型的には
約５〜約３０％（ｗ／ｗ）であり、一方天然リパーゼ中
の炭水化物含量は約４．９％（ｗ／ｗ）である。更に特
異的には、炭水化物含量は約５〜約１５％（ｗ／ｗ）で
あり、更にまた特異的には約７．５〜約８．５％（１へ
）の範囲内にある。
以下の点においてその特徴を有する。すなわち、炭水化
物含量は天然リパーゼと同じレヘルであるかまたは天然
リパーゼ中の炭水化物含量よりもより大である。すなわ
ち、新規牛ヒュミコーラリパーゼは、天然リパーゼとは
他の炭水化物を含有する。炭水化物含量は、典型的には
約５〜約３０％（ｗ／ｗ）であり、一方天然リパーゼ中
の炭水化物含量は約４．９％（ｗ／ｗ）である。更に特
異的には、炭水化物含量は約５〜約１５％（ｗ／ｗ）で
あり、更にまた特異的には約７．５〜約８．５％（１へ
）の範囲内にある。
本発明の組換え体ヒュミコーラリパーゼ製品は、例えば
ヨーロッパ特許出願８７３０７６４８．８に記載される
如く天然リパーゼと同様の方法で洗剤に使用する酵素洗
剤添加剤として使用できる。
ヨーロッパ特許出願８７３０７６４８．８に記載される
如く天然リパーゼと同様の方法で洗剤に使用する酵素洗
剤添加剤として使用できる。
本発明で用いられる語句「組換え体ヒュミコーラリパー
ゼ」は、天然ヒュミコーラリパーゼをコードするｃＤＮ
Ａにより形質転換された微生物を培養して得られるヒュ
ミコーラリパーゼに適用される。
ゼ」は、天然ヒュミコーラリパーゼをコードするｃＤＮ
Ａにより形質転換された微生物を培養して得られるヒュ
ミコーラリパーゼに適用される。
語句「天然ヒュミコーラリパーゼ」は、本明細書の導入
部において記載した好熱性サーモマイセスｓｐ、を含む
好熱性ヒュミコーラｓｐ、の天然起源から得られるヒュ
ミコーラリパーゼに適用される。
部において記載した好熱性サーモマイセスｓｐ、を含む
好熱性ヒュミコーラｓｐ、の天然起源から得られるヒュ
ミコーラリパーゼに適用される。
Ａ、オリゼ由来の組換え体ヒュミコーラリパーゼは、ペ
プチド配列が同じであるにもか＼わらず天然ヒュミコー
ラリパーゼとは同一でない。明らかに、宿主微生物は、
ドナー微生物とは異なった程度にかつ異なった糖部分に
より発現ポリペプチドをグリコシル化する。Ａ、ニガー
においては、グリコシル化の程度は同レベルにあると考
えられるが、一方糖部分はＡ、オリゼにおけると同種の
ものと思われる。天然リパーゼと組換え体リパーゼの判
別および同定は、それらのグリコシル化を測定すること
によって可能である。従って、天然ヒュミコーララヌギ
ノザリパーゼとＡ、オリゼ形質転換体からのこのリパー
ゼの組換え体形を典形例にとると、両方のリパーゼはＮ
−グリコシル化されているが糖残基は異なっている。天
然リパーゼは、ガラクトースは有しておらず、そして組
換え体リパーゼよりもマンノースが少なく、さらにまた
種々の程度にグリコシル化されている。天然リパーゼは
、その分子量に約１５００ダルトンを加える炭水化物部
分（約５％）を有し、組換え体リパーゼは約２６００ダ
ルトンを加える炭水化物部分（約８％）を有する。詳し
くは、例５参照のこと。
プチド配列が同じであるにもか＼わらず天然ヒュミコー
ラリパーゼとは同一でない。明らかに、宿主微生物は、
ドナー微生物とは異なった程度にかつ異なった糖部分に
より発現ポリペプチドをグリコシル化する。Ａ、ニガー
においては、グリコシル化の程度は同レベルにあると考
えられるが、一方糖部分はＡ、オリゼにおけると同種の
ものと思われる。天然リパーゼと組換え体リパーゼの判
別および同定は、それらのグリコシル化を測定すること
によって可能である。従って、天然ヒュミコーララヌギ
ノザリパーゼとＡ、オリゼ形質転換体からのこのリパー
ゼの組換え体形を典形例にとると、両方のリパーゼはＮ
−グリコシル化されているが糖残基は異なっている。天
然リパーゼは、ガラクトースは有しておらず、そして組
換え体リパーゼよりもマンノースが少なく、さらにまた
種々の程度にグリコシル化されている。天然リパーゼは
、その分子量に約１５００ダルトンを加える炭水化物部
分（約５％）を有し、組換え体リパーゼは約２６００ダ
ルトンを加える炭水化物部分（約８％）を有する。詳し
くは、例５参照のこと。
本発明による新規組換え体ヒュミコーラリパーゼは、１
モルのリパーゼ蛋白質光たり約１〜約１２モルのガラク
トースを含み、更に特異的には１モルのリパーゼ蛋白質
光たり約１〜約６モルのグラフトシースを含む。マンノ
ースの含量は、１モルのリパーゼ蛋白質光たり約３〜約
２０モルであり、更に特異的には約３〜約１２モルであ
る。
モルのリパーゼ蛋白質光たり約１〜約１２モルのガラク
トースを含み、更に特異的には１モルのリパーゼ蛋白質
光たり約１〜約６モルのグラフトシースを含む。マンノ
ースの含量は、１モルのリパーゼ蛋白質光たり約３〜約
２０モルであり、更に特異的には約３〜約１２モルであ
る。
組換え体ヒュミコーラリパーゼは、１モルのリパーゼ蛋
白質光たり、典形的には約２モルのＮ−アセデルグルコ
サミン、約３〜約２０モルのマンノースおよび約１〜約
１２モルのガラクトースを含んでなる。更に特異的には
、組換え体ヒュミコーラリパーゼは、１モルのリパーゼ
製品光たり、約２モルのＮ−アセチルグルコサミン、約
３〜約１２モルのマンノースおよび約１〜約６モルのガ
ラクトースを含む。
白質光たり、典形的には約２モルのＮ−アセデルグルコ
サミン、約３〜約２０モルのマンノースおよび約１〜約
１２モルのガラクトースを含んでなる。更に特異的には
、組換え体ヒュミコーラリパーゼは、１モルのリパーゼ
製品光たり、約２モルのＮ−アセチルグルコサミン、約
３〜約１２モルのマンノースおよび約１〜約６モルのガ
ラクトースを含む。
更により特異的には、組換え体ヒュミコーラリパーゼは
、１モルのリパーゼ蛋白質光たり約２モルのＮ−アセチ
ルグルコサミン、約６〜約９モルのマンノースおよび約
２〜約４モルのガラクトースを含有する。
、１モルのリパーゼ蛋白質光たり約２モルのＮ−アセチ
ルグルコサミン、約６〜約９モルのマンノースおよび約
２〜約４モルのガラクトースを含有する。
グリコシル化における相違は、酵素の特性に対しである
種の効果をもたらす。特に、高精製Ｈ。
種の効果をもたらす。特に、高精製Ｈ。
ラヌギノザ組換え体リパーゼの熱安定性は、比較的精製
した天然リパーゼの熱安定性に比較して秀れている。加
えて、４０℃および５０℃で試験したアルカリバシラス
ブロテアーゼ（エスペラーゼＴＭ）の存在下での純粋組
換え体リパーゼの熱安定性は比較的純粋な天然リパーゼ
に比較して秀れている。
した天然リパーゼの熱安定性に比較して秀れている。加
えて、４０℃および５０℃で試験したアルカリバシラス
ブロテアーゼ（エスペラーゼＴＭ）の存在下での純粋組
換え体リパーゼの熱安定性は比較的純粋な天然リパーゼ
に比較して秀れている。
特徴的には、酵素製品、本発明に関するリパーゼ製品、
特に細胞外リパーゼ製品は、他の酵素活性、顕著には蛋
白分解活性並びに培養ブロス成分由来の非酵素的活性ペ
プチドおよびアミノ酸を有する。
特に細胞外リパーゼ製品は、他の酵素活性、顕著には蛋
白分解活性並びに培養ブロス成分由来の非酵素的活性ペ
プチドおよびアミノ酸を有する。
ヒュミコーラｓｐ．リパーゼの場合には、組換え体リパ
ーゼ製品は、比較しうる天然リパーゼ製品よりも熱的に
より安定であることが見出された。
ーゼ製品は、比較しうる天然リパーゼ製品よりも熱的に
より安定であることが見出された。
本発明者らの知見によれば、熱的安定性の改善の一部は
、異なったグリコシル化のためであり、更に他の部分で
は組換え体リパーゼ製品にヒュミコーラ蛋白分解活性が
存在していないことによる。
、異なったグリコシル化のためであり、更に他の部分で
は組換え体リパーゼ製品にヒュミコーラ蛋白分解活性が
存在していないことによる。
Ｈ，ラヌギノザに対する天然リパーゼの場合には、米国
特許４，７０７，２９１中の簡潔な記載は、次の内容を
報告している。すなわち、商業的に人手可能なＨ，ラヌ
ギノザリパーゼ製品（Ａｍａｎｏ ＣＥ）は実質的レベ
ルの蛋白分解活性を有していた。本発明者の天然Ｈ，ラ
ヌギノザリパーゼ製品は、比較しうるレベルの蛋白分解
活性を有していた。特に高温において、プロテアーゼは
他の酵素を分解することが期待できる。プロテアーゼの
不存在に帰因する熱的安定性の改善は、異なったグリコ
シル化に帰因する累積的改善である（例６参照）。
特許４，７０７，２９１中の簡潔な記載は、次の内容を
報告している。すなわち、商業的に人手可能なＨ，ラヌ
ギノザリパーゼ製品（Ａｍａｎｏ ＣＥ）は実質的レベ
ルの蛋白分解活性を有していた。本発明者の天然Ｈ，ラ
ヌギノザリパーゼ製品は、比較しうるレベルの蛋白分解
活性を有していた。特に高温において、プロテアーゼは
他の酵素を分解することが期待できる。プロテアーゼの
不存在に帰因する熱的安定性の改善は、異なったグリコ
シル化に帰因する累積的改善である（例６参照）。
すでに指摘した如く、本発明は、形質転換アスペルギル
ス菌株を培養することにより高収率のヒュミコーラリパ
ーゼの製法を提供するものであり、更に好ましい態様に
おいて被転換体Ａ、オリゼ又はＡ、ニガー宿主細胞を培
養することによりヒュミコーララヌギノザリパーゼの製
造方法を提供する。
ス菌株を培養することにより高収率のヒュミコーラリパ
ーゼの製法を提供するものであり、更に好ましい態様に
おいて被転換体Ａ、オリゼ又はＡ、ニガー宿主細胞を培
養することによりヒュミコーララヌギノザリパーゼの製
造方法を提供する。
Ａ、オリゼは、数年間、ＴＡＫＡ−アミラーゼ酵素およ
び蛋白分解酵素の製造用として商業的規模で用いられて
いる。従って、この微生物を培養する発酵技術は、十分
に開発されており、微生物自身が食品商業において使用
することが認められている。本発明は、大量の組換え体
ヒュミコーラリパーゼの工業的生産のためのＡ、オリゼ
の使用の可能性を提供する。
び蛋白分解酵素の製造用として商業的規模で用いられて
いる。従って、この微生物を培養する発酵技術は、十分
に開発されており、微生物自身が食品商業において使用
することが認められている。本発明は、大量の組換え体
ヒュミコーラリパーゼの工業的生産のためのＡ、オリゼ
の使用の可能性を提供する。
本発明は、更に熱的安定性が増加し、更にアルカリバシ
ラスブロテアーゼの存在中での安定性が増加したために
天然のヒュミコーラリパーゼよりも秀れた組換え体ヒエ
ミコーラリバーゼ生産物を提供する（第６図および第９
図参照）。
ラスブロテアーゼの存在中での安定性が増加したために
天然のヒュミコーラリパーゼよりも秀れた組換え体ヒエ
ミコーラリバーゼ生産物を提供する（第６図および第９
図参照）。
本発明を更に添付図面を参照して説明する：第１図は、
ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターおよび上流プロモー
ター領域、プレレージョンおよびＴＡＫＡ−アミラーゼ
に対する構造遺伝子の５′部のＤＮＡ−配列を示す。
ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターおよび上流プロモー
ター領域、プレレージョンおよびＴＡＫＡ−アミラーゼ
に対する構造遺伝子の５′部のＤＮＡ−配列を示す。
第２図は、プラスミドｐＴＡＫＡ １７のエンドヌクレ
アーゼ制限酵素地図である。
アーゼ制限酵素地図である。
第３図は、プラスミドｐＨＬＬの構築を示す。
第４図は、プラスミド１９６０の構築を示す。
第５ａ図および第５ｂ図は、三文字の略記号によって与
えられる推論されたアミノ酸配列と共にブレブロヒュミ
コーララヌギノザリパーゼｃＤＮへのＤＮＡ配列を示す
。
えられる推論されたアミノ酸配列と共にブレブロヒュミ
コーララヌギノザリパーゼｃＤＮへのＤＮＡ配列を示す
。
第６図は、５５℃および６０℃でかつ種々のｐ＋（で天
然ヒュミコーラリパーゼ生産物の残留活性と比較した組
換え体ヒュミコーラリパーゼの残留活性を示す。
然ヒュミコーラリパーゼ生産物の残留活性と比較した組
換え体ヒュミコーラリパーゼの残留活性を示す。
第７図は、ＳＯ５−ＰＡＧＥグレデエントゲルを示し、
これは図面に代わる写真であり、 第８図は、プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）を含有する
天然ヒュミコーラリパーゼの残留活性と共に組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼ生産物および天然ヒュミコーラリパ
ーゼ生産物の５５℃での残留活性を示す。更に 第９図はアルカリバシラスプロテアーゼ裂品（Ｅｓｐｅ
ｒａｓｅ （商標）〕の存在下、天然および組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼの４０℃および５５℃での残留活性
を示す。
これは図面に代わる写真であり、 第８図は、プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）を含有する
天然ヒュミコーラリパーゼの残留活性と共に組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼ生産物および天然ヒュミコーラリパ
ーゼ生産物の５５℃での残留活性を示す。更に 第９図はアルカリバシラスプロテアーゼ裂品（Ｅｓｐｅ
ｒａｓｅ （商標）〕の存在下、天然および組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼの４０℃および５５℃での残留活性
を示す。
アスペルギルス菌株の形質転換に対し用いた形質転換技
術は、Ａ、ニドランスの形質転換に対する方法（バラン
ス等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｓ、Ｒｅｓ。
術は、Ａ、ニドランスの形質転換に対する方法（バラン
ス等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｓ、Ｒｅｓ。
Ｃｏｍｍｕｍ、 、月、２（１９８３）、２８４−２８
９ ； Ｉ−リブラン等、Ｇｅｎｅ ２６（１９８３
）、 ２０５−２２１ 、ヤルトン等、Ｐｒｏｃ。
９ ； Ｉ−リブラン等、Ｇｅｎｅ ２６（１９８３
）、 ２０５−２２１ 、ヤルトン等、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ８１（１９８
４）、１４７０−１４７４）から採用した方法であり更
にＡ、ニガーの形質転換に対するブクトン等の方法（Ｇ
ｅｎｅ ３７ （１９８５）、 ２０７〜２１４）に類
似した方法である。本発明のプロセスにおいて、アスペ
ルギルス菌株を、選択マーカーを含むベクター系で形質
転換するが、該マーカーは宿主菌株のゲノムに組込まれ
ることができるが、形質転換前に宿主菌株内には入らな
い。次いで形質転換体は選択することができ、組込まれ
た選択マーカーを基礎に非形質転換体から単離される。
４）、１４７０−１４７４）から採用した方法であり更
にＡ、ニガーの形質転換に対するブクトン等の方法（Ｇ
ｅｎｅ ３７ （１９８５）、 ２０７〜２１４）に類
似した方法である。本発明のプロセスにおいて、アスペ
ルギルス菌株を、選択マーカーを含むベクター系で形質
転換するが、該マーカーは宿主菌株のゲノムに組込まれ
ることができるが、形質転換前に宿主菌株内には入らな
い。次いで形質転換体は選択することができ、組込まれ
た選択マーカーを基礎に非形質転換体から単離される。
好ましい選択マーカーはａｒｇ Ｂ （Ａ 、ニドラン
ス又はＡ、ニガー）、ｔｒｐ Ｃ（Ａ 、ニドランス）
、ａｍｄ Ｓ （Ａ 、ニドランス）、又はｐｙｒ４
Ｃニュロスポラクラザ）遺伝子、又はＤＨＰＲ（ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ又はその突然変異体）遺伝子である
。
ス又はＡ、ニガー）、ｔｒｐ Ｃ（Ａ 、ニドランス）
、ａｍｄ Ｓ （Ａ 、ニドランス）、又はｐｙｒ４
Ｃニュロスポラクラザ）遺伝子、又はＤＨＰＲ（ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ又はその突然変異体）遺伝子である
。
更に好ましい選択マーカーはａｒｇ Ｂ又はａｍｄ Ｓ
遺伝子である。野生型Ａ、オリゼ菌株は、通常ａｒｇＢ
”である（すなわち、ａｒｇ Ｂ遺伝子はＡ。
遺伝子である。野生型Ａ、オリゼ菌株は、通常ａｒｇＢ
”である（すなわち、ａｒｇ Ｂ遺伝子はＡ。
オリゼ内で機能的である）。もしも、ａｒｇ Ｂを選択
マーカーとして選ぶ場合、このマーカーに対し遺伝子内
に欠損を有するＡ、オリゼのａｒｇ Ｂ突然変異菌株は
宿主菌株として使用されねばならない。
マーカーとして選ぶ場合、このマーカーに対し遺伝子内
に欠損を有するＡ、オリゼのａｒｇ Ｂ突然変異菌株は
宿主菌株として使用されねばならない。
Ａ、オリゼａｒｇ Ｂ突然変異体はＦ、Ｐ、ブクトン等
（Ｇｅｎｅ ３７（１９８５）、２０７〜２１４）によ
って記載される如く調製できる。ａｒｇ Ｂ突然変異体
は、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子内に欠ｔ
Ｍを有する突然変異体として定義される。一方、ａｍｄ
Ｓ遺伝子は野生型Ａ、オリゼの形質転換に対する選択
マーカーとして使用できる。何故なら野生型菌株はこの
遺伝子を有しないからである。
（Ｇｅｎｅ ３７（１９８５）、２０７〜２１４）によ
って記載される如く調製できる。ａｒｇ Ｂ突然変異体
は、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子内に欠ｔ
Ｍを有する突然変異体として定義される。一方、ａｍｄ
Ｓ遺伝子は野生型Ａ、オリゼの形質転換に対する選択
マーカーとして使用できる。何故なら野生型菌株はこの
遺伝子を有しないからである。
遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配列は、
典形的にはプロモーター、転写ターミネータ−およびポ
リアデニル化シグナルである。
典形的にはプロモーター、転写ターミネータ−およびポ
リアデニル化シグナルである。
当業者に周知の如く上流活性化配列およびエンハンサ−
配列に先行されているプロモーターは、アスペルギルス
において強い転写活性を示すことができ更に細胞外およ
び細胞内蛋白質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ
、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびグルコー
ス分解酵素をコードする遺伝子から誘導されるいかなる
ＤＮＡ配列でもよい。適当なプロモーターは、Ａ、オリ
ゼＴＡＫＡアミラーゼ、リソ゛ムコールマイヘイアスパ
ラティクプロテアーゼ、Ａ、ニガーグルコアミラーゼ、
Ａ、ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ、ニガー酸−安定性
α−アミラーゼ、およびリゾムコールマイヘイリパーゼ
である。グルコース分解酵素に対する遺伝子からのプロ
モーターの例は、ＴＰＩ 。
配列に先行されているプロモーターは、アスペルギルス
において強い転写活性を示すことができ更に細胞外およ
び細胞内蛋白質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ
、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびグルコー
ス分解酵素をコードする遺伝子から誘導されるいかなる
ＤＮＡ配列でもよい。適当なプロモーターは、Ａ、オリ
ゼＴＡＫＡアミラーゼ、リソ゛ムコールマイヘイアスパ
ラティクプロテアーゼ、Ａ、ニガーグルコアミラーゼ、
Ａ、ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ、ニガー酸−安定性
α−アミラーゼ、およびリゾムコールマイヘイリパーゼ
である。グルコース分解酵素に対する遺伝子からのプロ
モーターの例は、ＴＰＩ 。
ＡＤＨおよびＰＧにである。
本発明に係る好ましいプロモーターは、Ａ、オリゼＴＡ
ＫＡ−アミラーゼプロモーターである。ＴＡＫＡアミラ
ーゼは周知のα−アミラーゼである（戸田等、Ｐｒｏｃ
、Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ、 ５８ Ｓｅｒ、 Ｂ（１９
８２） ２０８−２１２）。プロモーター域をコードす
るＤＮＡは、ヨーロッパ特許出願８７１０３８０６．３
に記載されるようにＴＡＫＡ−アミラーゼゲノムクロー
ンから誘導される。
ＫＡ−アミラーゼプロモーターである。ＴＡＫＡアミラ
ーゼは周知のα−アミラーゼである（戸田等、Ｐｒｏｃ
、Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ、 ５８ Ｓｅｒ、 Ｂ（１９
８２） ２０８−２１２）。プロモーター域をコードす
るＤＮＡは、ヨーロッパ特許出願８７１０３８０６．３
に記載されるようにＴＡＫＡ−アミラーゼゲノムクロー
ンから誘導される。
プロモーターの配列およびプロモーターの上流領域並び
にプレレージョンおよびＴＡＫＡ−アミラーゼに対する
構造遺伝子の５′末端を第１図に示す。
にプレレージョンおよびＴＡＫＡ−アミラーゼに対する
構造遺伝子の５′末端を第１図に示す。
ＴＡＫＡアミラーゼプロモーターは、ヨーロッパ特許出
願８７１０３８０６．３に関連して寄託されたプラスミ
ドｐＴＡＫＡ １７から入手可能である。プラスミドｐ
ＴＡＫＡ １７のエンドヌクレアーゼ制限地図を第２図
に示す。
願８７１０３８０６．３に関連して寄託されたプラスミ
ドｐＴＡＫＡ １７から入手可能である。プラスミドｐ
ＴＡＫＡ １７のエンドヌクレアーゼ制限地図を第２図
に示す。
ｐＴＡＫＡ １７から、プロモーターに対する上流配列
又はその機能的部分を含む全プロモーター配列は、当業
者に明白な手段によって誘導される。プロモーター配列
は、別のＤＮＡ、例えば所望の蛋白質生産物又は別のプ
レレージョン（シグナルペプチド）をコードする遺伝子
とプロモーター配列との連結反応を促進する特異的制限
部位を４人する目的でリンカ−を有することができる。
又はその機能的部分を含む全プロモーター配列は、当業
者に明白な手段によって誘導される。プロモーター配列
は、別のＤＮＡ、例えば所望の蛋白質生産物又は別のプ
レレージョン（シグナルペプチド）をコードする遺伝子
とプロモーター配列との連結反応を促進する特異的制限
部位を４人する目的でリンカ−を有することができる。
本発明に係る方法において、ヌクレオチド−１１４４（
第１図参照）（Ｓａ１１部位を示す）からヌクレオチド
−１０までの配列がプロモーター領域の十分な機能的部
分の１例として用いられた。本発明の他の態様において
、ヌクレオチド−１１７６から−１のヌクレオチド配列
の前にｐＴＡＫＡ １７から朱だ ゛配列が
決定されていない１゜０５ｋｂフラグメントがあった。
第１図参照）（Ｓａ１１部位を示す）からヌクレオチド
−１０までの配列がプロモーター領域の十分な機能的部
分の１例として用いられた。本発明の他の態様において
、ヌクレオチド−１１７６から−１のヌクレオチド配列
の前にｐＴＡＫＡ １７から朱だ ゛配列が
決定されていない１゜０５ｋｂフラグメントがあった。
別の断片を用いることができるのは当業者に明らかであ
る。
る。
本発明の一態様によれば、プロモーターおよび上流活性
配列は次の配列又は機能的に等価なヌクレオチド配列を
有す： ＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＴＡ ＣＧ＋１Ｇ
ＧＣＣＴＧＡ ＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡ ＣＡＴＡＣ
ＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＡＧＴＡＧ ＡＣＣＧＡＧＣＡ
ＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴ ＣＡＧＣＧＣＣＴＡＡ
ＡＡＣＧＣＣＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＴＴ
ＡＡＡＧＡＡ ＧＴＴＡＧＡＡＴＣＴ ＡＣＧＣＴ
ＴＡＡＡＡ ＡＧＣＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＧＡＴ
ＣＴ ＣＧＣＡＧＴＣＣ（：Ｇ ＡＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＴ （：ＡＡＡＡＣＣＡＧＴ ＴＴＡＡＡＴＣＡ
ＡＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧ ＴＧＣＣＧＡＡＣＧＡ
ＧＣＴＩＩＴ八八ＡＴＧへへＡＴＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＡＴＴＡ八八ＧへへＴＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＡＡＴＡ
ＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣＧＡＡ ＡＧＧＣＡＡ（
：ＴＴＡ ＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＣＴＣＴＡＣ
Ｔ ＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡ ＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡ Ａ
ＧＧＣＡＣＡＴＣＡ ＧＴＡＴＴＴＡＡＡＧＣＣＣＧＡ
ＡＴＣＣＴ ＴＡＴＴＡＡＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡ
ＧＧ ＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＧＧＣ＾Ｇ
ＡＴＡＧＡＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡＴＴＡＡ ＡＴＣＧ
ＧＣＴＴＣＴ ＡＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＡ
ＡＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴ ＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧ
ＧＧＣＡＴＡＡＡＡＴ ＴＡＣＧＣＡＣＴＡＣＣ
ＣＧＡＡＴＣＧへＴへＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＴＴ
ＡＴＡＴ ＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡ ＡＴＴＣＡＴＡ
ＧＴＧ ＴＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴ
ＴＡＴＡＴＧＧＣＧＧ ＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡ
ＡＣＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣ［；Ｃ
ＴＴＡＣＣＧＡ ＴＴＡＣＧＴ丁八ＧＧ へＣＴＧ
ＡＴＡＴＴＴ ＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴ ＣＧＴＣＡ
ＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡ ＡＡＧＴＡＧＴＡ
ＡＡ ＡＣＣＣＣＧＧＡＡＧ ＴＣＡＡＣＡＧＣＡ
Ｔ ＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡ（：Ｇ
ＧＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＴＣＣＡＣＡ ＴＣ
ＡＣＧＡＧＣＧＡ ＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＧＧ
ＣＡＴＣＧ ＧＡＣＧＣＡＣＣＡＴ ＣＣＡＡＴＴ
ＡＧＡＡ ＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣ
ＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧ ＴＣＧＧＣＣＣＧＴＣＧＧ
ＣＣＴＴＴＴＣＴ ＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡ ＴＣＡ
ＣＧＧＧＣＡＧＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴ
ＣＣＡＧ八へＴＧＡＣＴＡ ＧＧＧＧＣＧＧＡＡＡ
ＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＴＣＣＡ ＣＴ
Ｃ八八へへＣＡＣＡ ＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＣＣ
ＣＣＧＧＴＡ ＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＣＡ
ＡＴＴ ＴＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧＣ
ＴＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＧＴＡＧ
ＡＧＣＴＴ ＡＡＡＧＴＡＴＧＴＣＣＣＴＴＧＴＣＧ
ＡＴ Ｇ（：ＧＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＡ
ＡＡＴＡＣＴＡＧＣＡ ＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡ Ｔ
ＧＣＴＴＧＧＡＧＧ ＡＴＡＧＣＡＡＣＣＧ ＡＣ
ＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴ ＣＣＣＴＴ
ＣＴＣＴＧ へへＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＣＡＣＡＧ（
これは第１図におけるヌクレオチド−１１４４から＝１
０までの配列を示す） 別の態様によれば、プロモーターおよび上流活性化配列
は、次の配列又は官能的に等価なヌクレオチド配列を有
する： ＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＣＴ ＣＣＴ
ＡＧＴＣＴＧＡ ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧ
ＡＡＴＡＣＧＡＧＧ（：ＣＴＧＡ ＴＴＡＡＴＧＡＴ
ＴＡ ＣＡＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＡＧＴＡＧ
ＡＣＣＧＡＧＣＡＧ（：ＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴ Ｃ
ＡＧＣＧＣＣＴＡＡ ＡＡＣＧＣＣＴＴＡＴ ＡＣ
ＡＡＴＴＡＡＧＣＩＩＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧＴＴＡＧＡ
ＡＴＣＴ ＡＣＧＣＴＴＡＡＡＡ ＡＧＣＴＡＣＴ
ＴＡＡ ＡＡＡＴＣＧＡＴＣＴ ＣＧＣＡＧＴＣＣ
ＣＧＡＴＴＣＧＣＣＴＡＴ ＣＡＡＡＡＣＣＡＧＴ
ＴＴＡ＾八ＴＣへＡ（： ＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧ
ＴＧＣＣＧＡＡＣＧ八ＧＣＴＡＴＡＡＡＴＧ ＡＴ
ＡＴ八八ＣへへＴ ＋ＣＧＣＧＣＡＣＧＡＡ ＡＧ
ＧＣＡＡＣＴＴＡ ＋ＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡ ＡＧ
ＧＣＡＣＡＴＣ八 （ＣＧ八へへＴＣＡＧＧ ＣＡＧ
ＡＴ八＾ＡＧへ ｆＡＴＣＧＧＣＴＴＣＴ ＡＧＧ
ＣＧＣＧＣＴＣ（ＧＧＣＡＴ＾＾ＡＡＴ ＴＡＣＧＣ
ＡＣＴＡＣ（八ＧＡＡＧＴＣＡＧＡ ＡＴＴＣＡＴＡ
ＧＴＧ ］ＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡ ＡＣＴＣＧＣＴ
ＴＧＣ［ＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴ ＡＣＧＴＧＡＡ＾＾
Ｔ （ＡＣＣＣＣＧＧＡＡＧ ＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴ
（ＡＧＣＧＴＣＣＡＣＡ ＴＣＡＣＧＡＧＣＧＡ
ｆＣＣＡＡＴＴＡＧＡＡ ＧＣＡＧＣＡ八八ＧＣ
へへＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴ ＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡ
ＩＡＧＡＧＴＧＡＣＴＡ ＧＧＧＧＣＧＧＡＡＡ
ＩＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＧＴＡ Ｉ
ＴＧＣＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＧＡＴＴＣＣＣ（ＣＣＴＴ
ＧＴＣＧＡＴ ＧＣＧＡＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＴＧ
ＧＡＧＧ ＡＴＡＧＣＡＡＣＣＧ ハＡＡＣＡＡＴ
ＡＡＡＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧ Ｇ中のヌクレオチド
−１１，７６２ λＴＴＡＡＡＧＣＡＴ ＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＡＡＴ
ＡＴＣＡＧＧＣ＄ＡＡＡＧＣＧＡＡＡ ＧＣＧＣＴＣ
ＴＡＣＴ ＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡ；ＴＡＴＴＴＡＡＡ
Ｇ ＣＣＣＧＡＡＴＣＣＴ ＴＡＴＴＡＡＧＣＧＣ
：ＡＴＡＣＡＧＧＣＡ ＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣＴＡＣ
ＣＴＡＴＴＡＡ：ＡＴＣＴＡ八八ＴＧへへＴＴＣＴＧＧ
ＣＴＧＴ ＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧ：ＣＧＡＡＴＣＧＡ
Ｔ ＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴｒＴ
ＴＴＧＡＴｃＡＴ ＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴ ＴＡＴ
ＡＴＧＧＣＧＧ；ＣＧＧＧＣＡＡＣＴ ＣＧＣＴＴＡ
ＣＣＧＡ ＴＴＡＣＧＴＴＡＧＧ：ＧＴＣＡＡＧＧＧ
Ａ ＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡ ＡＡＧＴＡＧＴ八八八
：ＣＡへへへＣＣＡＡ ＧＴＣＣＴＴＣＡＣＧ Ｇ
ＡＧＡＡＡＣＣＣＣＩＧＧＡＣＣＡＣＣＴ ＣＴＡＧ
ＧＣＡＴＣＧ ＧＡＣＧＣＡＣＣＡＴ：八ＡＡＣＡＧ
ＣＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧ ＴＣＧＧＣＣＣＧＴＣ
’ＣＡＣＧＧＧＣＡＧ ＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣ＾へＣ
ＡＣＣＣＴＣＣ’ＴＴへへへＧＧＧＡ ＴＴ八へへＴ
ＴＣＣＡ ＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡ’ＴＧＴＣＣＴＧＣ
Ａ ＧＡＡＴＧＣ＾八ＴＴ ＴへＡＡＣＴＣＴＴＣ
：ＧＣＣＣＣＴＡＧＴ ＣＧＴＡＧＡＧＣＴＴ へ
へへＧＴＡＴＧＴＣ１Ｃ八八ＣＡＴＡＴ八 へＡＴＡＣ
ＴＡＧＣへ ΔＧＧＧＡＴＧＣＣ八、ＣＡＡＣＡＴＣＡ
ＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴ ＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧｉｃ
ＡＴＴＴ （これは、第１図 ＴＪ）ら−１の配列を示す） 本発明の別の面によれば、後者の配列はｐＴＡＫＡ１７
から１．０５ｋｂの配列未決定の上流領域（第２図中位
置Ｏから１．０５）によって先行されている。
配列は次の配列又は機能的に等価なヌクレオチド配列を
有す： ＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＴＡ ＣＧ＋１Ｇ
ＧＣＣＴＧＡ ＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡ ＣＡＴＡＣ
ＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＡＧＴＡＧ ＡＣＣＧＡＧＣＡ
ＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴ ＣＡＧＣＧＣＣＴＡＡ
ＡＡＣＧＣＣＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＴＴ
ＡＡＡＧＡＡ ＧＴＴＡＧＡＡＴＣＴ ＡＣＧＣＴ
ＴＡＡＡＡ ＡＧＣＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＧＡＴ
ＣＴ ＣＧＣＡＧＴＣＣ（：Ｇ ＡＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＴ （：ＡＡＡＡＣＣＡＧＴ ＴＴＡＡＡＴＣＡ
ＡＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧ ＴＧＣＣＧＡＡＣＧＡ
ＧＣＴＩＩＴ八八ＡＴＧへへＡＴＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＡＴＴＡ八八ＧへへＴＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＡＡＴＡ
ＴＣＡＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣＧＡＡ ＡＧＧＣＡＡ（
：ＴＴＡ ＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＣＴＣＴＡＣ
Ｔ ＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡ ＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡ Ａ
ＧＧＣＡＣＡＴＣＡ ＧＴＡＴＴＴＡＡＡＧＣＣＣＧＡ
ＡＴＣＣＴ ＴＡＴＴＡＡＧＣＧＣＣＧＡＡＡＴＣＡ
ＧＧ ＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＧＧＣ＾Ｇ
ＡＴＡＧＡＣＣＴＣＴＡＣＣＴＡＴＴＡＡ ＡＴＣＧ
ＧＣＴＴＣＴ ＡＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＡ
ＡＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴ ＧＧＴＧＴＡＣＡＧＧ
ＧＧＣＡＴＡＡＡＡＴ ＴＡＣＧＣＡＣＴＡＣＣ
ＣＧＡＡＴＣＧへＴへＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＴＴ
ＡＴＡＴ ＡＧＡＡＧＴＣＡＧＡ ＡＴＴＣＡＴＡ
ＧＴＧ ＴＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴ
ＴＡＴＡＴＧＧＣＧＧ ＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡ
ＡＣＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣＧＧＧＣＡＡＣＴＣ［；Ｃ
ＴＴＡＣＣＧＡ ＴＴＡＣＧＴ丁八ＧＧ へＣＴＧ
ＡＴＡＴＴＴ ＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴ ＣＧＴＣＡ
ＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡ ＡＡＧＴＡＧＴＡ
ＡＡ ＡＣＣＣＣＧＧＡＡＧ ＴＣＡＡＣＡＧＣＡ
Ｔ ＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡ（：Ｇ
ＧＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＧＴＣＣＡＣＡ ＴＣ
ＡＣＧＡＧＣＧＡ ＡＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＴＡＧＧ
ＣＡＴＣＧ ＧＡＣＧＣＡＣＣＡＴ ＣＣＡＡＴＴ
ＡＧＡＡ ＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣ
ＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧ ＴＣＧＧＣＣＣＧＴＣＧＧ
ＣＣＴＴＴＴＣＴ ＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡ ＴＣＡ
ＣＧＧＧＣＡＧＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴ
ＣＣＡＧ八へＴＧＡＣＴＡ ＧＧＧＧＣＧＧＡＡＡ
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Ｃ八八へへＣＡＣＡ ＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＣＣ
ＣＣＧＧＴＡ ＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＣＡ
ＡＴＴ ＴＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧＣ
ＴＴＧＧＡＴＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＧＴＡＧ
ＡＧＣＴＴ ＡＡＡＧＴＡＴＧＴＣＣＣＴＴＧＴＣＧ
ＡＴ Ｇ（：ＧＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＡ
ＡＡＴＡＣＴＡＧＣＡ ＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡ Ｔ
ＧＣＴＴＧＧＡＧＧ ＡＴＡＧＣＡＡＣＣＧ ＡＣ
ＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴ ＣＣＣＴＴ
ＣＴＣＴＧ へへＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＣＡＣＡＧ（
これは第１図におけるヌクレオチド−１１４４から＝１
０までの配列を示す） 別の態様によれば、プロモーターおよび上流活性化配列
は、次の配列又は官能的に等価なヌクレオチド配列を有
する： ＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＣＴ ＣＣＴ
ＡＧＴＣＴＧＡ ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧ
ＡＡＴＡＣＧＡＧＧ（：ＣＴＧＡ ＴＴＡＡＴＧＡＴ
ＴＡ ＣＡＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＡＧＴＡＧ
ＡＣＣＧＡＧＣＡＧ（：ＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴ Ｃ
ＡＧＣＧＣＣＴＡＡ ＡＡＣＧＣＣＴＴＡＴ ＡＣ
ＡＡＴＴＡＡＧＣＩＩＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧＴＴＡＧＡ
ＡＴＣＴ ＡＣＧＣＴＴＡＡＡＡ ＡＧＣＴＡＣＴ
ＴＡＡ ＡＡＡＴＣＧＡＴＣＴ ＣＧＣＡＧＴＣＣ
ＣＧＡＴＴＣＧＣＣＴＡＴ ＣＡＡＡＡＣＣＡＧＴ
ＴＴＡ＾八ＴＣへＡ（： ＴＧＡＴＴＡＡＡＧＧ
ＴＧＣＣＧＡＡＣＧ八ＧＣＴＡＴＡＡＡＴＧ ＡＴ
ＡＴ八八ＣへへＴ ＋ＣＧＣＧＣＡＣＧＡＡ ＡＧ
ＧＣＡＡＣＴＴＡ ＋ＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡ ＡＧ
ＧＣＡＣＡＴＣ八 （ＣＧ八へへＴＣＡＧＧ ＣＡＧ
ＡＴ八＾ＡＧへ ｆＡＴＣＧＧＣＴＴＣＴ ＡＧＧ
ＣＧＣＧＣＴＣ（ＧＧＣＡＴ＾＾ＡＡＴ ＴＡＣＧＣ
ＡＣＴＡＣ（八ＧＡＡＧＴＣＡＧＡ ＡＴＴＣＡＴＡ
ＧＴＧ ］ＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡ ＡＣＴＣＧＣＴ
ＴＧＣ［ＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴ ＡＣＧＴＧＡＡ＾＾
Ｔ （ＡＣＣＣＣＧＧＡＡＧ ＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴ
（ＡＧＣＧＴＣＣＡＣＡ ＴＣＡＣＧＡＧＣＧＡ
ｆＣＣＡＡＴＴＡＧＡＡ ＧＣＡＧＣＡ八八ＧＣ
へへＧＧＣＣＴＴＴＴＣＴ ＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡ
ＩＡＧＡＧＴＧＡＣＴＡ ＧＧＧＧＣＧＧＡＡＡ
ＩＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＧＴＡ Ｉ
ＴＧＣＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＧＡＴＴＣＣＣ（ＣＣＴＴ
ＧＴＣＧＡＴ ＧＣＧＡＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＴＧ
ＧＡＧＧ ＡＴＡＧＣＡＡＣＣＧ ハＡＡＣＡＡＴ
ＡＡＡＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧ Ｇ中のヌクレオチド
−１１，７６２ λＴＴＡＡＡＧＣＡＴ ＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＡＡＴ
ＡＴＣＡＧＧＣ＄ＡＡＡＧＣＧＡＡＡ ＧＣＧＣＴＣ
ＴＡＣＴ ＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡ；ＴＡＴＴＴＡＡＡ
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ＡＴＧＧＣＧＧ；ＣＧＧＧＣＡＡＣＴ ＣＧＣＴＴＡ
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ＡＧＡＡＡＣＣＣＣＩＧＧＡＣＣＡＣＣＴ ＣＴＡＧ
ＧＣＡＴＣＧ ＧＡＣＧＣＡＣＣＡＴ：八ＡＡＣＡＧ
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’ＣＡＣＧＧＧＣＡＧ ＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣ＾へＣ
ＡＣＣＣＴＣＣ’ＴＴへへへＧＧＧＡ ＴＴ八へへＴ
ＴＣＣＡ ＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡ’ＴＧＴＣＣＴＧＣ
Ａ ＧＡＡＴＧＣ＾八ＴＴ ＴへＡＡＣＴＣＴＴＣ
：ＧＣＣＣＣＴＡＧＴ ＣＧＴＡＧＡＧＣＴＴ へ
へへＧＴＡＴＧＴＣ１Ｃ八八ＣＡＴＡＴ八 へＡＴＡＣ
ＴＡＧＣへ ΔＧＧＧＡＴＧＣＣ八、ＣＡＡＣＡＴＣＡ
ＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴ ＣＣＣＴＴＣＴＣＴＧｉｃ
ＡＴＴＴ （これは、第１図 ＴＪ）ら−１の配列を示す） 本発明の別の面によれば、後者の配列はｐＴＡＫＡ１７
から１．０５ｋｂの配列未決定の上流領域（第２図中位
置Ｏから１．０５）によって先行されている。
ターミネータ−およびポリアデニル化配列は、プロモー
ターと同じ起源から由来する。エンハンサ−配列もまた
構築に導入され得る。
ターと同じ起源から由来する。エンハンサ−配列もまた
構築に導入され得る。
発現した生産物は、生産物を単離するために細胞の崩壊
を要求する細胞内で蓄積される。この別のプロセス工程
を避けるため、更にまた細胞内で発現された生産物の崩
壊量を最少にするため、生産物は細胞から分泌されるの
が好ましい。この目的のため、所望生産物に対する遺伝
子は、細胞の分泌経路に発現された生産物を有効に向け
ることを確保するプレレージョンを有する。
を要求する細胞内で蓄積される。この別のプロセス工程
を避けるため、更にまた細胞内で発現された生産物の崩
壊量を最少にするため、生産物は細胞から分泌されるの
が好ましい。この目的のため、所望生産物に対する遺伝
子は、細胞の分泌経路に発現された生産物を有効に向け
ることを確保するプレレージョンを有する。
プレレージョンは、何らかの起源の生物から分泌された
蛋白質に対する遺伝子から誘Ｒされる。
蛋白質に対する遺伝子から誘Ｒされる。
本発明によれば、プレレージョンはアスペルギルス種由
来のグルコアミラーゼ又はグルコアミラーゼ遺伝子、バ
シラス種由来のアミラーゼ遺伝子、リゾムコールマイヘ
イ由来のリパーゼ又はプロテアーゼ遺伝子、Ｓ、セレビ
ゼ又はヒュミコーラリパーゼ由来のα−因子に由来する
。更に特異的には、プレレージョンはヒュミコーララヌ
ギノザリパーゼ、Ａ、オリゼＴＡに＾アミラーゼ、Ａ、
ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ、ニガー酸安定性α−ア
ミラーゼ、Ｂ、リケニフォルミスα−アミラーゼ；バシ
ラスＮＣ１Ｂ １１８３７由来のマルトース分解アミラ
ーゼ、Ｂ、ステロサーモフィラスα−アミラーゼ又はＢ
、リケニフォルミスズブチリジンに対する遺伝子から誘
導される。ヒュミコーララヌギノザシグナルペブチドは
次の配列を有する：ＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＴＧ
ＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧ Ｇ
ＡＣＧＧＣＣＭｅ ｔＡ ｒｇＳｅｒＳｅｒＬｅｕＶａ
ＩＬｅｕＰｈｅＰｈｅＶａ ｌ５ｅｒＡ ｌａ Ｔｒ
ｐＴｈｒＡ ｌａＴＧＧＣＣ ｅｕＡｌａ ＴＡＫＡ−アミラーゼは、次の配列を有する：へＴＧＡ
ＴＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＴＣＴＡＴＴＴＣＴ
ＧＴＡＣＧＧＣＣＴＴＣＡＧＧＴＣＭｅ ｔＭｅ ｔＶ
ａ ｌ Ａ ｌ ａＴｒｐＴｒｐＳｅｒＬｅｕＰｈｅＬ
ｅｕＴｙｒＧ １ｙＬｅｕＧ Ｉ ｎＶａ ＩＧＣＧＧ
ＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧＣＴＡ ｌａＡ １ａＰｒｏ
＾１ａＬｅｕＡｌａプロモーターおよびターミネータ−
に機能的に結合している所望生産物に対する遺伝子は、
選択マーカーを有するベクター内に挿入されるか、又は
宿主菌株のゲノムに組込まれ得る別個のベクター又はプ
ラスミド上に組込まれる。本発明で語句「ベクター系」
と言う場合は、単一のベクターもしくはプラスミド又は
２種以上のベクターもしくはプラスミドが含まれこれら
は一緒になって宿主ゲノムに組込まれるべき全ＤＮＡ情
報を含有する。
来のグルコアミラーゼ又はグルコアミラーゼ遺伝子、バ
シラス種由来のアミラーゼ遺伝子、リゾムコールマイヘ
イ由来のリパーゼ又はプロテアーゼ遺伝子、Ｓ、セレビ
ゼ又はヒュミコーラリパーゼ由来のα−因子に由来する
。更に特異的には、プレレージョンはヒュミコーララヌ
ギノザリパーゼ、Ａ、オリゼＴＡに＾アミラーゼ、Ａ、
ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ、ニガー酸安定性α−ア
ミラーゼ、Ｂ、リケニフォルミスα−アミラーゼ；バシ
ラスＮＣ１Ｂ １１８３７由来のマルトース分解アミラ
ーゼ、Ｂ、ステロサーモフィラスα−アミラーゼ又はＢ
、リケニフォルミスズブチリジンに対する遺伝子から誘
導される。ヒュミコーララヌギノザシグナルペブチドは
次の配列を有する：ＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＴＧ
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ＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧＣＴＡ ｌａＡ １ａＰｒｏ
＾１ａＬｅｕＡｌａプロモーターおよびターミネータ−
に機能的に結合している所望生産物に対する遺伝子は、
選択マーカーを有するベクター内に挿入されるか、又は
宿主菌株のゲノムに組込まれ得る別個のベクター又はプ
ラスミド上に組込まれる。本発明で語句「ベクター系」
と言う場合は、単一のベクターもしくはプラスミド又は
２種以上のベクターもしくはプラスミドが含まれこれら
は一緒になって宿主ゲノムに組込まれるべき全ＤＮＡ情
報を含有する。
ベクター又はプラスミドは線状又は閉鎖環状分子である
。本発明の好ましい態様によれば、宿主生物は２個のベ
クターと同時形質転換されるが、１個のベクターは選択
マーカーを有し更に他のベクターは、プロモーターを含
んで、宿主菌株に導入されるべき残りの外来ＤＮＡ、所
望産物に対する遺伝子又はＯＤＡおよび転写ターミネー
タ−およびポリアデニル化配列を含んで成る。
。本発明の好ましい態様によれば、宿主生物は２個のベ
クターと同時形質転換されるが、１個のベクターは選択
マーカーを有し更に他のベクターは、プロモーターを含
んで、宿主菌株に導入されるべき残りの外来ＤＮＡ、所
望産物に対する遺伝子又はＯＤＡおよび転写ターミネー
タ−およびポリアデニル化配列を含んで成る。
通常、形質転換体は安定であり、選択圧の非存在下で培
養できる。もしも、形質転換体が不安定であることが判
明すると、選択マーカーは培養中選択に対し使用できる
。次いで形質転換された細胞を問題のマーカーに相当す
る選択圧力のもとで培養する。
養できる。もしも、形質転換体が不安定であることが判
明すると、選択マーカーは培養中選択に対し使用できる
。次いで形質転換された細胞を問題のマーカーに相当す
る選択圧力のもとで培養する。
以下の実施例中出発物質として用いられるプラスミドは
次の如くである： ｐ２８５ ： （ＡＴＣＣＮａ２０６８１）ｐｓ
ａ１４３ ： バーセ等、Ｇｅｎｅ ２５（１９８
３）、１０９ １１７Ｊｏｈｎ ＆ Ｐｅｂｅｒｄｙ、
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ。
次の如くである： ｐ２８５ ： （ＡＴＣＣＮａ２０６８１）ｐｓ
ａ１４３ ： バーセ等、Ｇｅｎｅ ２５（１９８
３）、１０９ １１７Ｊｏｈｎ ＆ Ｐｅｂｅｒｄｙ、
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ。
６（１９８４）、 ３８６−３８９゜
ｐ３ＳＲ２： Ｊ、Ｍ、ケリーおよび門、Ｊ、ハイ
ネス、ＥＭＩＩＯＪｏｕｒｎａｌ ４ （１９８５）
、 ４７５−４７９゜ｐ３Ｐ６２− Ｋ２および ｐｃＤＶＩ −ＰＬ ： ツマ等、Ｎａｔｕｒｅ、
３１９．（１９８６）、 ６４０−ｐ７７５ ：
ヨーロッパ特許出願患８７１０３８０６．３゜ｐＵｃ
１９ ： ビエリラ等、Ｇｅｎｅ 旦（１９８
２）、 ２５９−２６８ ａｎｄ Ｍｅｓｓｔｎｇ、
Ｍｅｔｈ、ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏｌ（１９８
３）、 ２０−２７゜ 用いた菌株は次の如くである： Ａ、 ｏｒ１殺ｅ”： ＡＴＣＣ２０４２３，ＩＦＯ４
１７７、ＡＴＣＣＬＯＬＬＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ
１４４８８−１１４９Ｌ 八ＴＣＣ１１６０１ａｎｄ
ＡＴＣＣ１２８９２゜旦、す旦： ＭＣ１００
Ｏ（Ｃａｓａｂａｄａｎ、 Ｍ、Ｊ、ａｎｄ Ｃｏｈ
ｅｎ。
ネス、ＥＭＩＩＯＪｏｕｒｎａｌ ４ （１９８５）
、 ４７５−４７９゜ｐ３Ｐ６２− Ｋ２および ｐｃＤＶＩ −ＰＬ ： ツマ等、Ｎａｔｕｒｅ、
３１９．（１９８６）、 ６４０−ｐ７７５ ：
ヨーロッパ特許出願患８７１０３８０６．３゜ｐＵｃ
１９ ： ビエリラ等、Ｇｅｎｅ 旦（１９８
２）、 ２５９−２６８ ａｎｄ Ｍｅｓｓｔｎｇ、
Ｍｅｔｈ、ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏｌ（１９８
３）、 ２０−２７゜ 用いた菌株は次の如くである： Ａ、 ｏｒ１殺ｅ”： ＡＴＣＣ２０４２３，ＩＦＯ４
１７７、ＡＴＣＣＬＯＬＬＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ
１４４８８−１１４９Ｌ 八ＴＣＣ１１６０１ａｎｄ
ＡＴＣＣ１２８９２゜旦、す旦： ＭＣ１００
Ｏ（Ｃａｓａｂａｄａｎ、 Ｍ、Ｊ、ａｎｄ Ｃｏｈ
ｅｎ。
Ｓ、Ｎ、、 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １３８．
１７９ ２０７）（ＮＣ１Ｂ １１９５６） ■、すμ４Ｉ旦担： ＤＳＭ ４１０９八、 旦↓且旦
工２ ： 八ＴＣＣ１０１５，ＡＴＣＣ１０５８２゜※
これらの菌株のＡｒｇＢ突然変異体は、Ｆ、Ｐ、ブクト
ン等（Ｇｅｎｅ ３７（１９８７） ２０７−２１４）
によって記載される如く調製できる。ａｒｇＢ突然変異
体はオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子内に欠損
を有する突然変異体として定義される。
１７９ ２０７）（ＮＣ１Ｂ １１９５６） ■、すμ４Ｉ旦担： ＤＳＭ ４１０９八、 旦↓且旦
工２ ： 八ＴＣＣ１０１５，ＡＴＣＣ１０５８２゜※
これらの菌株のＡｒｇＢ突然変異体は、Ｆ、Ｐ、ブクト
ン等（Ｇｅｎｅ ３７（１９８７） ２０７−２１４）
によって記載される如く調製できる。ａｒｇＢ突然変異
体はオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子内に欠損
を有する突然変異体として定義される。
特異的オリゴヌクレオチドプローブの構築をなさしめる
情報を得るため、部分配列の決定を精製ヒュミコーララ
ヌギノザリパーゼについて行った。
情報を得るため、部分配列の決定を精製ヒュミコーララ
ヌギノザリパーゼについて行った。
菌糸体および低分子量物質がすでに除去された、ヒュミ
コーララヌギノザの培養ブロスからの上澄みを、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース（アニオン交換クロマトグラフィー）
、フェニルセファロース（疎水性相互作用クロマトグラ
フィー）を用いて行うカラムクロマトグラフィーに委ね
、次いでＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷによるゲル濾過に委ね
る。配列決定は、チム等（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 ２１
２．３０７−３１２（１９８７））によって記載される
如く気相シーケンサ−（アプライドバイオシステムモデ
ル４７０＾）を用いて行った。
コーララヌギノザの培養ブロスからの上澄みを、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース（アニオン交換クロマトグラフィー）
、フェニルセファロース（疎水性相互作用クロマトグラ
フィー）を用いて行うカラムクロマトグラフィーに委ね
、次いでＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷによるゲル濾過に委ね
る。配列決定は、チム等（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 ２１
２．３０７−３１２（１９８７））によって記載される
如く気相シーケンサ−（アプライドバイオシステムモデ
ル４７０＾）を用いて行った。
次のＮ−末端配列が見出された：
Ｇ ｌｕ−Ｖａ ｌ−５ｅｒ−Ｇ ｌｎ−Ａｓｐ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇ ｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− この配列は、アミノ酸残基隘７〜Ｎｎ １１ （Ｐｈ
ｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−八ｓｎ）およびアミノ酸
残基Ｎａ１３〜ＮＩＬ１６ （Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｉｎ
−Ｔｙｒ）をそれぞれ含んでなる２種の特異的混合オリ
ゴヌクレオチドプローブの構築を認める。上記配列に相
当するＨＬＬ−特異的オリゴヌクレオチド混合物を用い
たヒュミコーララヌギノザｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングを例１に示す。
ｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇ ｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− この配列は、アミノ酸残基隘７〜Ｎｎ １１ （Ｐｈ
ｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−八ｓｎ）およびアミノ酸
残基Ｎａ１３〜ＮＩＬ１６ （Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｉｎ
−Ｔｙｒ）をそれぞれ含んでなる２種の特異的混合オリ
ゴヌクレオチドプローブの構築を認める。上記配列に相
当するＨＬＬ−特異的オリゴヌクレオチド混合物を用い
たヒュミコーララヌギノザｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニングを例１に示す。
例 １
ヘール等（ＥＭＢＯＪ、、 ３ ： １０９７〜１１
０２．１９８４）およびチルギウィン等（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ（Ｗａｓｈ、）、 ｔｓ。
０２．１９８４）およびチルギウィン等（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ（Ｗａｓｈ、）、 ｔｓ。
５２９４〜５２９９．１９７９）によって記載される方
法により、全ＲＮＡを均質化したＨ、ラヌギノザマイセ
リウムから抽出した。ポリ （Ａ）−含有ＲＮＡを、ア
ビブおよび１ノーダー（ＰＮＡＳ、 ＵＳＡ、国、 １
４０８〜１４１２、１９７２）によって記載される如く
オリゴ（ｄ Ｔ）−セルロースについての２サイクルで
のアフィニティクロマトグラフィーにより得た。岡山お
よびベルブ（Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、 ２
： １６１−１７０゜１９８２）によって記載される
方法を用い、更にツマ等（Ｎａｔｕｒｅ、 ３１９ ：
６４０〜６４６．１９８６）によって記載されるへ
’）ター ｐＳＰ６２−に２およびｐｃｏｖ Ｉ −Ｐ
Ｌを用いてｅＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮ八を
、Ｅ、コリーＭＣ１００ＯのｈｓｄＲ−、Ｍ＋誘導体（
カサダバンおよびコーヘン、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、
１３８．１７９〜２０７゜１９８０）に形質転換し組
換え体クローンを得た。
法により、全ＲＮＡを均質化したＨ、ラヌギノザマイセ
リウムから抽出した。ポリ （Ａ）−含有ＲＮＡを、ア
ビブおよび１ノーダー（ＰＮＡＳ、 ＵＳＡ、国、 １
４０８〜１４１２、１９７２）によって記載される如く
オリゴ（ｄ Ｔ）−セルロースについての２サイクルで
のアフィニティクロマトグラフィーにより得た。岡山お
よびベルブ（Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、 ２
： １６１−１７０゜１９８２）によって記載される
方法を用い、更にツマ等（Ｎａｔｕｒｅ、 ３１９ ：
６４０〜６４６．１９８６）によって記載されるへ
’）ター ｐＳＰ６２−に２およびｐｃｏｖ Ｉ −Ｐ
Ｌを用いてｅＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮ八を
、Ｅ、コリーＭＣ１００ＯのｈｓｄＲ−、Ｍ＋誘導体（
カサダバンおよびコーヘン、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、
１３８．１７９〜２０７゜１９８０）に形質転換し組
換え体クローンを得た。
３２個のペンタデカマーオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド： （この内の一つは、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−
Ａｓｎに対しコードする領域内でＨＬＬ ｍＲＮＡに対
して相補的である）の混合物を、アプライドバイオシス
テム社のＤＮＡ合成機で合成し、次いでポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。ヒュミコーララヌ
ギノザｃＤＮＡライブラリーからの約１０．０００個の
Ｅ、コリー組換え体を、ワトマン５４０口紙に移した。
ド： （この内の一つは、Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−
Ａｓｎに対しコードする領域内でＨＬＬ ｍＲＮＡに対
して相補的である）の混合物を、アプライドバイオシス
テム社のＤＮＡ合成機で合成し、次いでポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。ヒュミコーララヌ
ギノザｃＤＮＡライブラリーからの約１０．０００個の
Ｅ、コリー組換え体を、ワトマン５４０口紙に移した。
クローンを洗浄し、ゲルデン等（Ｎｕｃ ｌｅ １ｃＡ
ｃ １ｄｓＲｅｓ、 ７ 、２１１５〜２１３５．１９
７９）に記載される如く固定化した。フィルターを、ベ
ール等（ＥＭＢＯＪ、 ３ 。
ｃ １ｄｓＲｅｓ、 ７ 、２１１５〜２１３５．１９
７９）に記載される如く固定化した。フィルターを、ベ
ール等（ＥＭＢＯＪ、 ３ 。
１０９７〜１１０２．１９８４）によって記載される如
く、３２ｐ−ラヘル化ＨＬＬ特異性ペンタデカマー混合
物でバイブリド化した。バイブリド形成およびフィルタ
ーの洗浄は、それぞれ３７℃および４３℃で行い、次い
でインテンスファイヤースクリーンで２４時間オートラ
ジオグラフィーにより追跡した。ミニプレブブラスミド
ＤＮＡを、標準方法（ピルボイムおよびドリー、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
く、３２ｐ−ラヘル化ＨＬＬ特異性ペンタデカマー混合
物でバイブリド化した。バイブリド形成およびフィルタ
ーの洗浄は、それぞれ３７℃および４３℃で行い、次い
でインテンスファイヤースクリーンで２４時間オートラ
ジオグラフィーにより追跡した。ミニプレブブラスミド
ＤＮＡを、標準方法（ピルボイムおよびドリー、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
ユ、 １５１３〜１５２３．１９７９）を用い、２種の
バイブリド化コロニー、ｐＨＬ１７０２．３から単離し
、次いでｃＤＮＡ挿入のＤＮＡ配列をマキサムおよびギ
ルベル）（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ６５，
４９９−５６０．１９８０）の手順により確立した。
バイブリド化コロニー、ｐＨＬ１７０２．３から単離し
、次いでｃＤＮＡ挿入のＤＮＡ配列をマキサムおよびギ
ルベル）（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ６５，
４９９−５６０．１９８０）の手順により確立した。
ＨＬＬ ｃＤＮＡを用いた構築作業を更に促進するため
、独得の制限サイトを含有するＤＮＡ配列を次の如＜
ｃＤＮＡの５′および３′末端に加えた。３′未翻訳領
域内でＨＬＬ ｃＤＮＡを消化する５ａｕ９６１を用い
てｐ！ＩＬＬ７０２．３を消化し、次いで得られた末端
をＥ。
、独得の制限サイトを含有するＤＮＡ配列を次の如＜
ｃＤＮＡの５′および３′末端に加えた。３′未翻訳領
域内でＨＬＬ ｃＤＮＡを消化する５ａｕ９６１を用い
てｐ！ＩＬＬ７０２．３を消化し、次いで得られた末端
をＥ。
コリーＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）および４種
のｄＮＴＰでフィルインした。このＤＮＡを、開始メチ
オニンコドンに対し丁度３′で１回＋１ＬＬｃＤＮＡを
切断するＳａｃ Ｉで連続的に消化した。得られた０、
９ ｋｂ ＩＩＬＬ ｃＤＮＡ断片を、アガロースゲ
ル電気泳動法により精製し、電気溶出し次いで連結反応
用に調製した。５′アダプターとして、２個のオリゴヌ
クレオチド、９２７および９２８を合成した。
のｄＮＴＰでフィルインした。このＤＮＡを、開始メチ
オニンコドンに対し丁度３′で１回＋１ＬＬｃＤＮＡを
切断するＳａｃ Ｉで連続的に消化した。得られた０、
９ ｋｂ ＩＩＬＬ ｃＤＮＡ断片を、アガロースゲ
ル電気泳動法により精製し、電気溶出し次いで連結反応
用に調製した。５′アダプターとして、２個のオリゴヌ
クレオチド、９２７および９２８を合成した。
アダプターの配列を第３１図に示す。このアダプターを
、ＨＬＬ ｃＤＮＡの開始Ｍｅｔコドンに対し丁度５′
で旧ｎｄｌｌｌおよびＢａｍ１ｌ Ｉサイトを加えるよ
うに設計した。２種のオリゴを、ＡＴＰおよびＴ、ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてキナーゼ処理し、互いに
アニールし次いで、すでに旧ｎｄＩＩ［およびｆｌｉｎ
ｃｎで消化（ついで０．７％アガロースゲルで精製され
たｐＵｃ１９ベクター内で精製０．９ ｋｂ ＩＩＬＬ
ｃＤＮ八配列配列結した。得られたプラスミドｐＨＬ
Ｌは、移送可能な０．９ｋｂ Ｂａｍ１ｌ Ｉ断片とし
てＨＬＬ ｃＤＮＡを有していた。ｐＨ１凡の構築を第
３図に示す。
、ＨＬＬ ｃＤＮＡの開始Ｍｅｔコドンに対し丁度５′
で旧ｎｄｌｌｌおよびＢａｍ１ｌ Ｉサイトを加えるよ
うに設計した。２種のオリゴを、ＡＴＰおよびＴ、ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてキナーゼ処理し、互いに
アニールし次いで、すでに旧ｎｄＩＩ［およびｆｌｉｎ
ｃｎで消化（ついで０．７％アガロースゲルで精製され
たｐＵｃ１９ベクター内で精製０．９ ｋｂ ＩＩＬＬ
ｃＤＮ八配列配列結した。得られたプラスミドｐＨＬ
Ｌは、移送可能な０．９ｋｂ Ｂａｍ１ｌ Ｉ断片とし
てＨＬＬ ｃＤＮＡを有していた。ｐＨ１凡の構築を第
３図に示す。
Ｂａｍ１ｌ １消化およびアガロースゲル上での０．９
ｋｂＨＬＬ ｃＤＮＡ断片の精製後、それをＢａｍ１ｌ
Ｉ消化しかつホスファターゼ処理したｐ７７５に連結
しｐ９６０を得、ここにおいてＩＩＬＬ ｃＤＮＡはア
スペルギルスニガー由来のＴＡＫＡプロモーターおよび
アスペルギルスニガー由来のＡＭＣターミネータ−の転
写活性の制御のもとにある。ｐ９６０の構築を第４図に
示す。ｐ７７５の構築は、ヨーロッパ特許出願８７１０
３８０６．３に記載されている。
ｋｂＨＬＬ ｃＤＮＡ断片の精製後、それをＢａｍ１ｌ
Ｉ消化しかつホスファターゼ処理したｐ７７５に連結
しｐ９６０を得、ここにおいてＩＩＬＬ ｃＤＮＡはア
スペルギルスニガー由来のＴＡＫＡプロモーターおよび
アスペルギルスニガー由来のＡＭＣターミネータ−の転
写活性の制御のもとにある。ｐ９６０の構築を第４図に
示す。ｐ７７５の構築は、ヨーロッパ特許出願８７１０
３８０６．３に記載されている。
ｐ７７５は、ＴＩＫＡプロモーターとＡＭＣターミネー
タ−を含み更にクローニングサイトとして独得のＢａｍ
１ｌＴサイトを有している。
タ−を含み更にクローニングサイトとして独得のＢａｍ
１ｌＴサイトを有している。
第５ａ図および第５ｂ図は、その導かれたアミノ酸配列
と共にプレプロＩ！ＬＬ ｃＤＮＡの配列を示す。
と共にプレプロＩ！ＬＬ ｃＤＮＡの配列を示す。
ヌクレオチドは、クローン化ｃＤＮＡ中の第一塩基から
番号をつけられている。このｃＤＮ＾配列から、以下の
内容が結論づけられる。すなわち、ＨＬ Ｌが、１７個
の残基のシグナルペプチドおよび５個の残基の短いプロ
ペプチドを有した２９１個のアミノ酸残基の長い前駆体
として合成されている。Ｈｉ定上のシグナルペプチダー
ゼプロセシングサイト（フォノへイネ、 Ｅｕｒ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ、 １３３．１７〜２Ｌ １９８３）
は、Ａｌａと３ｅｒとの間のペプチド結合を示す矢印で
示される。アミノ末端アミノ酸配列により同定される如
き成熟酵素のアミノ末端が示される。
番号をつけられている。このｃＤＮ＾配列から、以下の
内容が結論づけられる。すなわち、ＨＬ Ｌが、１７個
の残基のシグナルペプチドおよび５個の残基の短いプロ
ペプチドを有した２９１個のアミノ酸残基の長い前駆体
として合成されている。Ｈｉ定上のシグナルペプチダー
ゼプロセシングサイト（フォノへイネ、 Ｅｕｒ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ、 １３３．１７〜２Ｌ １９８３）
は、Ａｌａと３ｅｒとの間のペプチド結合を示す矢印で
示される。アミノ末端アミノ酸配列により同定される如
き成熟酵素のアミノ末端が示される。
ヒ１ミコーララヌギノｆ工焦に見し叫ヱｌム畝６モルの
ｌｌｉ又は４モルのメタンスルホン酸のシールしたアン
プル中、１１０℃で２４時間、４８時間および９６時間
予め加水分解したサンプル（４Ｏａｇ）について、ベッ
クマンアミノ酸分析機（型几Ｉ ＭＢ）を用いアミノ酸
分析を行った。半シスチンを、トリブチルホスフィンに
より還元し次いで４−ビニルピリジンとカップリングし
た２＆ Ｓ−β−（４−ピリジルエチル）−システィン
として測定した。全ての試剤は、最高純度のものであっ
たＯ 結果を次表に示すが、ｃＤＮＡ配列により決定したアミ
ノ酸組成と比較する。
ｌｌｉ又は４モルのメタンスルホン酸のシールしたアン
プル中、１１０℃で２４時間、４８時間および９６時間
予め加水分解したサンプル（４Ｏａｇ）について、ベッ
クマンアミノ酸分析機（型几Ｉ ＭＢ）を用いアミノ酸
分析を行った。半シスチンを、トリブチルホスフィンに
より還元し次いで４−ビニルピリジンとカップリングし
た２＆ Ｓ−β−（４−ピリジルエチル）−システィン
として測定した。全ての試剤は、最高純度のものであっ
たＯ 結果を次表に示すが、ｃＤＮＡ配列により決定したアミ
ノ酸組成と比較する。
コニ慮−４１交−−−−−−二木Ｓ１ム宍：ＪΔ！−−
一−ノ１も斤い￥！−” ｃＤＮ八Ａへａ
２０．８５ ２１ ２１Ａｒｇ １
４．４２ １４ １４Ａｓｎ ３６
．９１ ３７ １９アミノ−″・順：」しＬ
［鷺整裁−−小へＡｓｐ
１９Ｃｙｓｅ５．５４ ６
６Ｇｉｎ １８．２０
１８ ６Ｇｌｕ
１２ｃｒｙ
２７．５１ ２８ ２８１１ｉｓ
５．９４ ６
６１１ｅｂ １４．９９ １５
１６１、ｅｕ ２０．０６
２０ ２０Ｌｙｓ ７
．０５ ７ ７Ｍｅｔ
０ ０ ０Ｐｈｅ
１４．８０ １５
１５Ｐｒｏ １１．９０ １
２ １２Ｓｅｒａ １６．７６
１７ １？Ｔｈｒ” １８
．４６ １８ １９Ｔｒｐ
３．５８ ４ ４Ｔｙｒ
９．８４ １０ １０
νａｌ’ １８．２４ １８
１８ａ）加水分解時間ゼロに外挿した値 ｂ）加水分解開始時間に外挿した値 ｃ）Ｓ−β−（４−ピリジルエチル）−システィンとし
て測定 例２ １００−のＹＰＤ （ゼーマン等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ １９
８１）を、Ａ、オリゼ、Ａ、ニガー又はそれらのａｒｇ
Ｂ突然変異体の胞子を用いて接種し次いで３７℃で約
２時間振とうしながらインキュベートした。菌糸体をミ
ラクロスを用いてろ過して集め、次いで０．６モルのＭ
ｇ５Ｏａ ２００−で洗浄した。菌糸体を１５ｍＺの１
．２モルのＭｇＳＯ４，１０ミリモルのＮａ１ｌ□ＰＯ
４ｐｔ１５．８に懸濁せしめた。懸濁液を氷上で冷却し
次いで１２０■のＮｏｖｏｚｙｍ＠ ２３４を含有する
緩衝液（バッチ１６８７） １ｍ／を添加した。５分
後、１２ ｗ／ｍｌ ＢＳＡ （シグマタイプＨ２５）
１−を添加し、次いで多数のプロトプラストが顕微
鏡下で観察したサンプル中に可視できるまで穏やかに撹
拌しながら３７℃で１．５〜２．５時間インキュベーシ
ヨンした。
一−ノ１も斤い￥！−” ｃＤＮ八Ａへａ
２０．８５ ２１ ２１Ａｒｇ １
４．４２ １４ １４Ａｓｎ ３６
．９１ ３７ １９アミノ−″・順：」しＬ
［鷺整裁−−小へＡｓｐ
１９Ｃｙｓｅ５．５４ ６
６Ｇｉｎ １８．２０
１８ ６Ｇｌｕ
１２ｃｒｙ
２７．５１ ２８ ２８１１ｉｓ
５．９４ ６
６１１ｅｂ １４．９９ １５
１６１、ｅｕ ２０．０６
２０ ２０Ｌｙｓ ７
．０５ ７ ７Ｍｅｔ
０ ０ ０Ｐｈｅ
１４．８０ １５
１５Ｐｒｏ １１．９０ １
２ １２Ｓｅｒａ １６．７６
１７ １？Ｔｈｒ” １８
．４６ １８ １９Ｔｒｐ
３．５８ ４ ４Ｔｙｒ
９．８４ １０ １０
νａｌ’ １８．２４ １８
１８ａ）加水分解時間ゼロに外挿した値 ｂ）加水分解開始時間に外挿した値 ｃ）Ｓ−β−（４−ピリジルエチル）−システィンとし
て測定 例２ １００−のＹＰＤ （ゼーマン等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ １９
８１）を、Ａ、オリゼ、Ａ、ニガー又はそれらのａｒｇ
Ｂ突然変異体の胞子を用いて接種し次いで３７℃で約
２時間振とうしながらインキュベートした。菌糸体をミ
ラクロスを用いてろ過して集め、次いで０．６モルのＭ
ｇ５Ｏａ ２００−で洗浄した。菌糸体を１５ｍＺの１
．２モルのＭｇＳＯ４，１０ミリモルのＮａ１ｌ□ＰＯ
４ｐｔ１５．８に懸濁せしめた。懸濁液を氷上で冷却し
次いで１２０■のＮｏｖｏｚｙｍ＠ ２３４を含有する
緩衝液（バッチ１６８７） １ｍ／を添加した。５分
後、１２ ｗ／ｍｌ ＢＳＡ （シグマタイプＨ２５）
１−を添加し、次いで多数のプロトプラストが顕微
鏡下で観察したサンプル中に可視できるまで穏やかに撹
拌しながら３７℃で１．５〜２．５時間インキュベーシ
ヨンした。
懸濁液をミラクロスで口過し、０液を殺菌チューブに移
し、次いで５ｎｔ／の０．６モルソルビトール、１００
ミリモルのトリス−１１Ｃ７！ 、ｐＨ７，０でおおっ
た。
し、次いで５ｎｔ／の０．６モルソルビトール、１００
ミリモルのトリス−１１Ｃ７！ 、ｐＨ７，０でおおっ
た。
遠心分離を、１０００ ｇで１５分間行い、次いでプロ
トプラストをＭｇＳＯ４クツションの頂部から採取した
。２容量の５ＴＣ（１，２モルのソルビトール、１０ミ
リモルのＴｒｉｃ−ＨＣ１、ｐｔ（７，５，１０ミリモ
ルのＣａＣ１２）を、プロトプラスト）に濁液に添加し
、次いで混合物を５分間１０００ ｇで遠心分離した。
トプラストをＭｇＳＯ４クツションの頂部から採取した
。２容量の５ＴＣ（１，２モルのソルビトール、１０ミ
リモルのＴｒｉｃ−ＨＣ１、ｐｔ（７，５，１０ミリモ
ルのＣａＣ１２）を、プロトプラスト）に濁液に添加し
、次いで混合物を５分間１０００ ｇで遠心分離した。
プロトプラストベレットを３ｍｌのＳＴＣ中で再懸濁さ
せ次いで再ペレット化した。これをくりかえした。Ｅｔ
ｉ＆にプロトプラストを０．２〜１−のＳＴＣに再゛
脈ン■させた。
せ次いで再ペレット化した。これをくりかえした。Ｅｔ
ｉ＆にプロトプラストを０．２〜１−のＳＴＣに再゛
脈ン■させた。
１００μｌのプロトプラスト
ＳＴＣ中、適当なりＮＡ ５〜２５！！ｇと混合した。
ａｒｇＢ菌株由来のプロトプラストを、ｐｓａ１４３
ＤＮＡ（Ａ．ニドランスａｒｇＢ遺伝子担持プラスミド
）と混合し次いでａｒｇＢ“菌株由来のプロトプラスト
をｐ３ＳＲ２ （ Ａ 、ニドランスａｍｄ Ｓ遺伝子
担持プラスミド）と混合した。混合物を室温で２５分間
放置した。０．２−の６０％ＰＥＧ４００ （ＢＤ）１
２９５７６）、１０１のＣａＣＩｌｔおよび１０ｍＭの
トリス−１１ｃ ｌ 、 ｐＨ７、５を添加し次いで注
意深く混合しく２回）、最後に０．８５−の同溶液を加
え、注意深く混合した。
ＤＮＡ（Ａ．ニドランスａｒｇＢ遺伝子担持プラスミド
）と混合し次いでａｒｇＢ“菌株由来のプロトプラスト
をｐ３ＳＲ２ （ Ａ 、ニドランスａｍｄ Ｓ遺伝子
担持プラスミド）と混合した。混合物を室温で２５分間
放置した。０．２−の６０％ＰＥＧ４００ （ＢＤ）１
２９５７６）、１０１のＣａＣＩｌｔおよび１０ｍＭの
トリス−１１ｃ ｌ 、 ｐＨ７、５を添加し次いで注
意深く混合しく２回）、最後に０．８５−の同溶液を加
え、注意深く混合した。
混合物を室温で２５分間放置し、２５００ ｇで１５分
間回転させ、更にペレットを２ｍｌの１．２モルソルビ
トールに懸濁させた。もう−度沈降させた後、プロトプ
ラスト ｐｓａ１４３で形質転換したａｒｇ Ｂ菌株由来のプロ
トプラストを、炭素および窒素源としてそれぞれグルコ
ースおよび尿素を用い、更に浸透安定化用の１、２モル
ソルビトールを有するミニマルプレート（Ｃｏｖｅ，
Ｂｉｏｃｈｅｍ．旧ｏｐｈｙｓ．へｃｔａ １１３
（１９６６） ５１ −５６）上に散布した。ｐ
３ＳＲ２で形質転換したａｒｇＢ”菌株由来のプロトプ
ラストを、１．０モルのスクロース、窒素源としての１
０ミリモルのアセトアミドおよびバックグラウンド増殖
を阻止するための２０ミリモルＣｓＣ ｌを含有するミ
ニマルプレート（Ｃｏｖｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．へｃｔａ １１３ （１９６６）
５１〜５６）上に散布した。３７℃で４〜７日間インキ
ュベーションした後、胞子を選び、殺菌水に懸濁させ次
いで単一コロニーに散布した。この手順をくりかえし、
第２回の再単離後単一コロニーの胞子を規制した形質転
換体として保存した。
間回転させ、更にペレットを２ｍｌの１．２モルソルビ
トールに懸濁させた。もう−度沈降させた後、プロトプ
ラスト ｐｓａ１４３で形質転換したａｒｇ Ｂ菌株由来のプロ
トプラストを、炭素および窒素源としてそれぞれグルコ
ースおよび尿素を用い、更に浸透安定化用の１、２モル
ソルビトールを有するミニマルプレート（Ｃｏｖｅ，
Ｂｉｏｃｈｅｍ．旧ｏｐｈｙｓ．へｃｔａ １１３
（１９６６） ５１ −５６）上に散布した。ｐ
３ＳＲ２で形質転換したａｒｇＢ”菌株由来のプロトプ
ラストを、１．０モルのスクロース、窒素源としての１
０ミリモルのアセトアミドおよびバックグラウンド増殖
を阻止するための２０ミリモルＣｓＣ ｌを含有するミ
ニマルプレート（Ｃｏｖｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．へｃｔａ １１３ （１９６６）
５１〜５６）上に散布した。３７℃で４〜７日間インキ
ュベーションした後、胞子を選び、殺菌水に懸濁させ次
いで単一コロニーに散布した。この手順をくりかえし、
第２回の再単離後単一コロニーの胞子を規制した形質転
換体として保存した。
例 ３
ｐ９６０を、例２で記載した如＜Ａ．ニドランス由来の
ａｍｄ Ｓ遺伝子含有ｐ３ＳＲ２で同時形質転換するこ
とによりＡ．オリゼＩＦＯ４１７７に形質転換する。
ａｍｄ Ｓ遺伝子含有ｐ３ＳＲ２で同時形質転換するこ
とによりＡ．オリゼＩＦＯ４１７７に形質転換する。
上述の如く調製したプロトプラストを、ｐ９６０および
ｐ３ＳＲ２の同品の混合物（各々は＼５ｐｇ）を用いて
インキュベートした。唯一の窒素源としてアセトアミド
を用いることのできる形質転換体を２凹再卯離する。Ｙ
ＰＤ （ゼーマン等、１９８１）上で３回増殖後、培養
」二澄みをＳＤＳ − ＰＡＧＥで分析する。
ｐ３ＳＲ２の同品の混合物（各々は＼５ｐｇ）を用いて
インキュベートした。唯一の窒素源としてアセトアミド
を用いることのできる形質転換体を２凹再卯離する。Ｙ
ＰＤ （ゼーマン等、１９８１）上で３回増殖後、培養
」二澄みをＳＤＳ − ＰＡＧＥで分析する。
ゲルをコマジ−ブリリアントブルーＲで染色する。
最もよい形質転換体を更に研究するため選別し、次いで
４％の大豆ミル上の２１キラ一発酵槽中で増殖させ、増
殖中グルコースを与えた。培養物を発酵中強く攪拌する
。組換え体ヒュミコーラリパーゼ生産物（ＲＨＬ）を、
遠心分離による細胞の除去により培養ブロスより単離し
、上澄みを限外ろ過し次いで凍結乾燥する。
４％の大豆ミル上の２１キラ一発酵槽中で増殖させ、増
殖中グルコースを与えた。培養物を発酵中強く攪拌する
。組換え体ヒュミコーラリパーゼ生産物（ＲＨＬ）を、
遠心分離による細胞の除去により培養ブロスより単離し
、上澄みを限外ろ過し次いで凍結乾燥する。
例４
Ａ．ニガー − でのヒュミコーラリパーゼの発」−
例２で記載する如く、Ａ．ニドランスａｒｇ Ｂ遺伝子
含有ｐＳａ １４３で同時形質転換することによってＡ
．ニガーａｒｇ Ｂに形質転換した。プロ１−プラスト
を各々のプラストの同等（約５Ｉ１ｇ）と共にインキュ
ベートした。形質転換体をミニマルプレート（Ｃｏｖｅ
， Ｂｉｏｃｈｃｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１
３ （１９６６）＋ ５１〜５６）上でアルゲニン要求
に基づき選別した。
含有ｐＳａ １４３で同時形質転換することによってＡ
．ニガーａｒｇ Ｂに形質転換した。プロ１−プラスト
を各々のプラストの同等（約５Ｉ１ｇ）と共にインキュ
ベートした。形質転換体をミニマルプレート（Ｃｏｖｅ
， Ｂｉｏｃｈｃｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１
３ （１９６６）＋ ５１〜５６）上でアルゲニン要求
に基づき選別した。
分子胞子を２四回単離後、形質転換体をＹＰＤ（ジーマ
ン等、１９８１）中３０℃で数日間培養した。
ン等、１９８１）中３０℃で数日間培養した。
培養上澄みをＳＤＳ − ＰＡＧＥで分析した。大部分
の形質転換体は、その上澄み中にヒュミコーラリパーゼ
を産生じた。
の形質転換体は、その上澄み中にヒュミコーラリパーゼ
を産生じた。
炭水化物含量を例５で記載した如くエンドＨ処理により
分析した。以下の内容が見出された。すなわち、炭水化
物含量は天然のヒュミコーラリパーゼに対するとほぼ同
程度であった。エンドＨ感受性は、Ａ、オリゼ由来の組
換え体ヒュミコーラリパーゼに対してのものと同じであ
った。従って、グリコシル化の性質はＡ、オリゼおよび
Ａ、ニガーにおけると同じであると推定された。
分析した。以下の内容が見出された。すなわち、炭水化
物含量は天然のヒュミコーラリパーゼに対するとほぼ同
程度であった。エンドＨ感受性は、Ａ、オリゼ由来の組
換え体ヒュミコーラリパーゼに対してのものと同じであ
った。従って、グリコシル化の性質はＡ、オリゼおよび
Ａ、ニガーにおけると同じであると推定された。
例５
炭水化物側鎖を分解しうる酵素（エンドＨおよびグリコ
ペプチダーゼＦ）を用いる処理。
ペプチダーゼＦ）を用いる処理。
ＲＨＬおよびＨＬＬを、グリコペプチダーゼＦ（ベーリ
ンガー隘９１３７８．５００μ）の水に溶解した１００
単位のｌバイアル）およびエンドＨ（シグマＮ１１Ｅ６
８７８ 、シトレート緩衝液ｐｌ＋５．５に溶解）で処
理した。
ンガー隘９１３７８．５００μ）の水に溶解した１００
単位のｌバイアル）およびエンドＨ（シグマＮ１１Ｅ６
８７８ 、シトレート緩衝液ｐｌ＋５．５に溶解）で処
理した。
ＨＬＬおよびＲＨＬを各々１０ｍＭのトリスｐＨ７，５
（１■／−）に溶解した。１００μ！のＨＬＬおよびＲ
ＨＬの各々に、２μｌのグリコペプチダーゼＦを加え、
サンプルを３７℃で２０時間インキュベートした。
（１■／−）に溶解した。１００μ！のＨＬＬおよびＲ
ＨＬの各々に、２μｌのグリコペプチダーゼＦを加え、
サンプルを３７℃で２０時間インキュベートした。
更にＨＬＬとＲＨＬを１０ｍＭ）リスｐＨ７，５（１■
／−）に？８解し、２５μ／のＥｎｄｏ １１および５
０μＺの０．１モル酢酸ナトリウムｐＩ（５，０を、Ｈ
Ｌ ＬとＲＨ’ Ｌの２５ｍの各々に加えた。サンプル
を３７℃で２０時間インキュベートした。
／−）に？８解し、２５μ／のＥｎｄｏ １１および５
０μＺの０．１モル酢酸ナトリウムｐＩ（５，０を、Ｈ
Ｌ ＬとＲＨ’ Ｌの２５ｍの各々に加えた。サンプル
を３７℃で２０時間インキュベートした。
サンプルを、未処理ＨＬ ＬおよびＲ）（Ｌと共に７．
５〜２０％のＳＯＳ −ＰＡＧＥ勾配ゲルで操作した。
５〜２０％のＳＯＳ −ＰＡＧＥ勾配ゲルで操作した。
５ＯＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲルを第７図に示す。第７図のサ
ンプルは次の如くである。
ンプルは次の如くである。
１）標準：９２に、 ６７に、 ４３に、 ３０に、
２０．１に、 １４．４に２） ＨＬ Ｌ、 １０
ｍＭ ）リス （ｐｉ（７，５）中１■／−３） ）（
Ｌ Ｌ ＋Ｅｎｄｏ Ｈ ４） ＲＨＬ ＋Ｅｎｄｏ Ｈ ５）ＲＨＬ＋グリコペプチダーゼＦ ６）ＨＬＬ＋グリコペプチダーゼＦ ７） ＲＨＬ ＋Ｅｎｄｏ ｌｌ ８）ＲＨＬ＋グリコペプチダーゼＦ ９）ＲＨＬ、１０ｍＭトリス （ｐＨ７，５）中１■／
−第７図から以下の内容が明らかである。すなわち、グ
リコペプチダーゼＦはＨＬ ＬとＲＨＬの双方の炭水化
物部分を分解することができ更に残りの蛋白質が同じ大
きさである。一方Ｅｎｄｏ ｆｌはＲＨＬの炭水化物の
み分解することができ、一方ＨＬＬのＥｎｄｏ Ｉｔ処
理は何らの効果ももたらさない。
２０．１に、 １４．４に２） ＨＬ Ｌ、 １０
ｍＭ ）リス （ｐｉ（７，５）中１■／−３） ）（
Ｌ Ｌ ＋Ｅｎｄｏ Ｈ ４） ＲＨＬ ＋Ｅｎｄｏ Ｈ ５）ＲＨＬ＋グリコペプチダーゼＦ ６）ＨＬＬ＋グリコペプチダーゼＦ ７） ＲＨＬ ＋Ｅｎｄｏ ｌｌ ８）ＲＨＬ＋グリコペプチダーゼＦ ９）ＲＨＬ、１０ｍＭトリス （ｐＨ７，５）中１■／
−第７図から以下の内容が明らかである。すなわち、グ
リコペプチダーゼＦはＨＬ ＬとＲＨＬの双方の炭水化
物部分を分解することができ更に残りの蛋白質が同じ大
きさである。一方Ｅｎｄｏ ｆｌはＲＨＬの炭水化物の
み分解することができ、一方ＨＬＬのＥｎｄｏ Ｉｔ処
理は何らの効果ももたらさない。
従って、ＨＬ ＬとＲＨＬの双方はＮ−グリコシル化さ
れる。しかし、グリコシル化は異なった性質である。
れる。しかし、グリコシル化は異なった性質である。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて提案されたチム等、
チャプリン、Ｍ、Ｆ、 （１９８２） 、 八ｎａ１
．Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ］二２３． ３３６〜３４１お
よびヤントフ、Ｎ、 （１９８５） 、八ｎａ１．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。
チャプリン、Ｍ、Ｆ、 （１９８２） 、 八ｎａ１
．Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ］二２３． ３３６〜３４１お
よびヤントフ、Ｎ、 （１９８５） 、八ｎａ１．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。
１４８、４２４−４３３に記載された方法を用いて炭水
化物の分析を行った。
化物の分析を行った。
リパーゼ含有サンプルをメタツリシスに委ね、次いでア
ミノ糖の再−Ｎ−アセチル化を行い更に第２回の温和な
メタノリシス工程により○−アセチル基を脱離せしめた
。逆相高圧液体クロマトグラフィーによる分析に対し適
当な誘導体がメチルグリコシドのバーベンゾイル化によ
って得られた。
ミノ糖の再−Ｎ−アセチル化を行い更に第２回の温和な
メタノリシス工程により○−アセチル基を脱離せしめた
。逆相高圧液体クロマトグラフィーによる分析に対し適
当な誘導体がメチルグリコシドのバーベンゾイル化によ
って得られた。
分析結果を次表に示す。
マンノース ５．７ ８．６ガ
ラクトース ０３．３ 天然ヒュミコーラリパーゼＨＬＬの炭水化物残基は、ハ
イマンノースタイプのＮ−グリコシル化において見出さ
れた２種の単糖類から構成されている（モントレニル、
Ｊ９等、１９８６＋ 、ｒＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅａ
ｎａｌｙｓｉｓ ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐ
ｒｏａｃｈＪ 、チャプリン、Ｍ、Ｆ、およびケンデイ
−１Ｊ、Ｆ、 ＩＲＬプレス、オフスフオード、 ｐ１
４３）。
ラクトース ０３．３ 天然ヒュミコーラリパーゼＨＬＬの炭水化物残基は、ハ
イマンノースタイプのＮ−グリコシル化において見出さ
れた２種の単糖類から構成されている（モントレニル、
Ｊ９等、１９８６＋ 、ｒＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅａ
ｎａｌｙｓｉｓ ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐ
ｒｏａｃｈＪ 、チャプリン、Ｍ、Ｆ、およびケンデイ
−１Ｊ、Ｆ、 ＩＲＬプレス、オフスフオード、 ｐ１
４３）。
Ｎ−アセチルグルコサミン（〈２モル１モル）に対する
結果は、主配列のみが単一のＮ−グリコシル化を有して
いることを示している。このことは、更にｃＤＮ＾配列
（第５ａ図および第５ｂ図）から推論される。加えて、
マンノースはセリン又はトレオニン残基にＯ−グリコシ
ド結合しえた。
結果は、主配列のみが単一のＮ−グリコシル化を有して
いることを示している。このことは、更にｃＤＮ＾配列
（第５ａ図および第５ｂ図）から推論される。加えて、
マンノースはセリン又はトレオニン残基にＯ−グリコシ
ド結合しえた。
Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノースの外に、組
換え体ヒュミコーラリパーゼ、ＲＴ−（Ｌは相当量のガ
ラクトースを含む。天然リパーゼに関し、Ｎ−了セチル
グルコサミンの含量は、単一Ｎ−グリコシル化の存在を
示す。しかし、これはもしガラクトースがこの一部であ
る場合は複合体はバイブリドタイプである。しかし、セ
リンもしくはトレオニン残基でのＯ−グリコシル化は、
もしも組換え体ＲＨＬリパーゼのＮ−グリコシル化が天
然ＨＬ Ｌリパーゼに対する場合と同様にハイマンノー
スタイプである場合、ガラクトースの存在の原因である
。
換え体ヒュミコーラリパーゼ、ＲＴ−（Ｌは相当量のガ
ラクトースを含む。天然リパーゼに関し、Ｎ−了セチル
グルコサミンの含量は、単一Ｎ−グリコシル化の存在を
示す。しかし、これはもしガラクトースがこの一部であ
る場合は複合体はバイブリドタイプである。しかし、セ
リンもしくはトレオニン残基でのＯ−グリコシル化は、
もしも組換え体ＲＨＬリパーゼのＮ−グリコシル化が天
然ＨＬ Ｌリパーゼに対する場合と同様にハイマンノー
スタイプである場合、ガラクトースの存在の原因である
。
炭水化物部分は、天然ヒュミコーラリパーゼＨＬ Ｌお
よび組換え体ヒュミコーラリパーゼＲＨＬの分子量に各
々約１５００Ｄおよび２６００ Ｄを平均で加えている
。これは炭水化物含量を各々約４．９％および８．１％
に相当する。
よび組換え体ヒュミコーラリパーゼＲＨＬの分子量に各
々約１５００Ｄおよび２６００ Ｄを平均で加えている
。これは炭水化物含量を各々約４．９％および８．１％
に相当する。
例６
ＲＨＬ （１，４Ｘ １０６ＬＵ／ｇ ）およびＨＬ
Ｌ （０，２Ｘ１０’ＬＣ／ｇ）の各々を、種々のｐＨ
の緩衝液に溶解し次いで５５°および６０℃の温度で２
時間インキュベートした。緩衝溶液を、４７ 、５ｍＭ
の酢酸ナトリウム、ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−モルホリノ
）−プロパンスルホン酸）およびホウ酸から調製し、０
．ｌＮＨＣｌ又はＩ Ｎ Ｎａ０１ｌを用いてｐＨ４，
５，６，７゜８．９および１０に調節した。加えて、１
．５ Ｘ １０”しＬｌ／ｇに精製したＨ Ｌ Ｌのサ
ンプルの別個のテストに用いた緩衝液を、ＰＭＳＦ （
フェニルメタンスルホニルフルオリド）に添加しこの天
然リパーゼ生産物中でのプロテアーゼ含量を抑制した。
Ｌ （０，２Ｘ１０’ＬＣ／ｇ）の各々を、種々のｐＨ
の緩衝液に溶解し次いで５５°および６０℃の温度で２
時間インキュベートした。緩衝溶液を、４７ 、５ｍＭ
の酢酸ナトリウム、ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−モルホリノ
）−プロパンスルホン酸）およびホウ酸から調製し、０
．ｌＮＨＣｌ又はＩ Ｎ Ｎａ０１ｌを用いてｐＨ４，
５，６，７゜８．９および１０に調節した。加えて、１
．５ Ｘ １０”しＬｌ／ｇに精製したＨ Ｌ Ｌのサ
ンプルの別個のテストに用いた緩衝液を、ＰＭＳＦ （
フェニルメタンスルホニルフルオリド）に添加しこの天
然リパーゼ生産物中でのプロテアーゼ含量を抑制した。
溶液中のリパーゼ含量は、約１０〜１５ＬＵ／ｌａ／に
等しかった。
等しかった。
インキュベーション後直ちに、リパーゼ溶液を氷水浴内
で冷却し次いで同日分析するそこに保った（ＬＵ−法、
八Ｆ９５）。
で冷却し次いで同日分析するそこに保った（ＬＵ−法、
八Ｆ９５）。
結果を第６図および第８図に示す。
第６図から明らかなようにＲＨＬＯ熱安定性は５５℃お
よび６０℃の各々で、ρ１１５〜１０でＨＬＬのそれよ
りもより大である。
よび６０℃の各々で、ρ１１５〜１０でＨＬＬのそれよ
りもより大である。
第８図から明らかなように、ＲＨＬのより大きい熱安定
性は、部分的にはＨ，ラヌギノザブロテアーゼ活性が存
在しないためである。
性は、部分的にはＨ，ラヌギノザブロテアーゼ活性が存
在しないためである。
例 フ
インキュベーション条件は、３６００ＬＵ／ ＃および
０．０５７Ａｌｌ／ ｌ （Ａυ／Ｌｔｌ＝ ０．０
１６Ｘ１０−３）の温度を用い、０．１ Ｍホウ酸、ｐ
Ｈ９，５でかつ４０℃又は５０℃であった。残留活性を
対照インキュベーションを基礎に計算した。
０．０５７Ａｌｌ／ ｌ （Ａυ／Ｌｔｌ＝ ０．０
１６Ｘ１０−３）の温度を用い、０．１ Ｍホウ酸、ｐ
Ｈ９，５でかつ４０℃又は５０℃であった。残留活性を
対照インキュベーションを基礎に計算した。
結果を第９図に示す。
第９図から明らかなように、アルカリ性バシラスプロテ
アーゼの存在下、ＲＨＬの熱安定性はＨＬＬのそれより
も秀れており、これによりプロテアーゼによる攻撃に対
するそれらの感受性における相違がわかる。
アーゼの存在下、ＲＨＬの熱安定性はＨＬＬのそれより
も秀れており、これによりプロテアーゼによる攻撃に対
するそれらの感受性における相違がわかる。
第１図は、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターおよび上
流プロモーター領域、プレレージョンおよびＴＡＫＡ−
アミラーゼに対する構造遺伝子の５′部のＤＮＡ−配列
を示し、 第２図は、プラスミドｐＴＡＫＡ １７のエンドヌクレ
アーゼ制限酵素地図であり、 第３図は、プラスミドｐＨＬＬの構築を示し、第４図は
、プラスミドｐ９６０の構築を示し、第５ａ図および第
５ｂ図は、三文字の略記号によって与えられる推論され
たアミノ酸配列と共にプレブロヒュミコーララヌギノザ
リパーゼｃＤＮＡのＤＮＡ配列を示し、 第６図は、５５℃および６０℃でかつ種々のｐＨで天然
ヒュミコーラリパーゼ生産物の残留活性と比較した組換
え体ヒュミコーラリパーゼの残留活性を示すグラフであ
り、 第７図は、ＳＯ５−ＰＡＧＥダレデエントゲルを示し、
これは図面に代わる写真であり、 第８図は、プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）を含有する
天然ヒュミコーラリパーゼの残留活性と共に組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼ生産物および天然ヒュミコーラリパ
ーゼ生産物の５５℃での残留活性を示すグラフであり 第９図はアルカリバシラスプロテアーゼ製品の存在下、
天然およびｍｌＡえ体ヒュミコーラリパーゼの４０℃お
よび５５℃での残留活性を示すグラフである。
流プロモーター領域、プレレージョンおよびＴＡＫＡ−
アミラーゼに対する構造遺伝子の５′部のＤＮＡ−配列
を示し、 第２図は、プラスミドｐＴＡＫＡ １７のエンドヌクレ
アーゼ制限酵素地図であり、 第３図は、プラスミドｐＨＬＬの構築を示し、第４図は
、プラスミドｐ９６０の構築を示し、第５ａ図および第
５ｂ図は、三文字の略記号によって与えられる推論され
たアミノ酸配列と共にプレブロヒュミコーララヌギノザ
リパーゼｃＤＮＡのＤＮＡ配列を示し、 第６図は、５５℃および６０℃でかつ種々のｐＨで天然
ヒュミコーラリパーゼ生産物の残留活性と比較した組換
え体ヒュミコーラリパーゼの残留活性を示すグラフであ
り、 第７図は、ＳＯ５−ＰＡＧＥダレデエントゲルを示し、
これは図面に代わる写真であり、 第８図は、プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）を含有する
天然ヒュミコーラリパーゼの残留活性と共に組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼ生産物および天然ヒュミコーラリパ
ーゼ生産物の５５℃での残留活性を示すグラフであり 第９図はアルカリバシラスプロテアーゼ製品の存在下、
天然およびｍｌＡえ体ヒュミコーラリパーゼの４０℃お
よび５５℃での残留活性を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、組換え体ヒュミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）リパー
ゼの製造方法であって、次の工程： （ａ）遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配
列およびヒュミコーラリパーゼをコードするＤＮＡ配列
を含んでなる適当な組換え体ＤＮＡクローニングベクタ
ーを得る工程； （ｂ）工程（ａ）で得たクローニングベクターを用いて
適当な宿主生物を形質転換する工程；および （ｃ）適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次いで
所望により培地からリパーゼを回収する工程を含んで成
る、前記組換え体ヒュミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）リ
パーゼの製造方法。 ２、前記宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）菌株であり更に次の工程： （ａ）１回のコピー又はそれ以上のコピーで適当なアス
ペルギルス宿主のゲノムに組込むことのでき、更に遺伝
子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配列、被転換
体の適当な選択マーカー、およびヒュミコーラリパーゼ
をコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換え体ＤＮＡク
ローニングベクター系を得る工程； （ｂ）工程（ａ）で得た組換え体ＤＮＡクローニングベ
クター系を用い、選ばれた選択マーカーに対し機能遺伝
子を有しないアスペルギルス宿主を形質転換する工程；
および （ｃ）適当な培地中で形質転換した宿主を培養し次いで
所望により培地からリパーゼを回収する工程を含んで成
る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３、遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配列
が、プロモーター、転写開始部位、および転写ターミネ
ーターおよびポリアデニル化機能を含んでなる特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ４、前記プロモーターが上記活性化配列により先行され
ている、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記選択マーカーが、Ａ．ニドランスもしくはＡ．
ニガーａｒｇＢ、Ａ．ニドランスｔｒｐＣ、Ａ．ニドラ
ンスａｍｄＳ、ニューロスポラクラセＰｙｒ４もしくは
ＤＨＦＲに対する遺伝子から誘導される、特許請求の範
囲第２項記載の方法。 ６、選択マーカーがＡ．ニドランスもしくはＡ．ニガー
から誘導されるＡｒｇＢ遺伝子又はＡ．ニドランスから
誘導されるａｍｄＳ遺伝子である、特許請求の範囲第５
項記載の方法。 ７、プロモーターおよび上流活性化配列がアミラーゼ、
グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラー
ゼ又はグルコース分解酵素の如き細胞外もしくは細胞内
蛋白質をコードする遺伝子から誘導される、特許請求の
範囲第４項記載の方法。 ８、プロモーターおよび上流活性化配列が、Ａ．オリゼ
ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコールマイヘイアスペパラ
ギン酸プロテアーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、
Ａ．ニガー酸性安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーグル
コアミラーゼ又はリゾムコールマイヘイリパーゼに対す
る遺伝子から誘導される、特許請求の範囲第７項記載の
方法。 ９、アスペルギルス宿主が、アスペルギルスオリゼ菌株
である、特許請求の範囲第２項記載の方法。 １０、プロモーターが、Ａ．オリゼＴＡＫＡアミラーゼ
プロモーター又はその機能部分である、特許請求の範囲
第９項記載の方法。 １１、プロモーターおよび上流活性化配列が次の配列： 【遺伝子配列があります】 又は官能的に等価のヌクレオチド配列を有する、特許請
求の範囲第１０項記載の方法。 １２、プロモーターおよび上流活性化配列が次の配列： 【遺伝子配列があります】 又は機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許請
求の範囲第１０項記載の方法。 １３、特許請求の範囲第１１項記載の配列が、プラスミ
ドｐＴＡＫＡ１７における０位から１．０５位までの１
．０５ｋｂの未配列決定の上流領域によって先行されて
いる、特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、ベクター系が、培地に発現産物の分泌を与えるプ
レレージョンを更に含む、特許請求の範囲第２項記載の
方法。 １５、前記プレレージョンが、アスペルギルス種からの
グルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バシラス
種からのアミラーゼ遺伝子、リゾムコールマイヘイから
のリパーゼもしくはプロテアーゼ遺伝子、Ｓ．セレビゼ
もしくはヒュミコーラリパーゼ遺伝子からα−因子に対
する遺伝子から誘導される、特許請求の範囲第１４項記
載の方法。 １６、前記プレレージョンが、ヒュミコーララヌギノザ
リパーゼに対する遺伝子、Ａ．オリゼＴＡＫＡアミラー
ゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定
性α−アミラーゼ、Ｂ．リケニフォルミスα−アミラー
ゼ、バシラスＮＣ１Ｂ１１８３７由来のマルトース産生
アミラーゼ、Ｂ．ステロサーモフィラスα−アミラーゼ
又はＢ．リケニフォルミスズブチリシンアミラーゼに対
する遺伝子から誘導される、特許請求の範囲第１５項記
載の方法。 １７、前記ベクター系が二種のベクターを含んでなり、
１種のベクターが選択マーカーを含有し、更に他のベク
ターが遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配
列および所望蛋白質産物をコードするＤＮＡ配列を含有
する、特許請求の範囲第２項記載の方法。 １８、組換え体ヒュミコーラリパーゼの製造方法であっ
て、次の工程： （ａ）遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配
列およびヒュミコーラｓｐ．リパーゼをコードするＤＮ
Ａ配列を含んでなる組換え体ＤＮＡクローニングベクタ
ー系を用いて形質転換されたアスペルギルスｓｐ．宿主
を培養する工程、および （ｂ）該組換え体リパーゼを回収する工程を含んで成る
、前記方法。 １９、遺伝子発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配
列が、プロモーター、転写開始サイト、および転写ター
ミネーターおよびポリアデニル化機能を含んで成る、特
許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、前記プロモーターがＡ．オリゼＴＡＫＡアミラー
ゼプロモーター又はその機能的部分である、特許請求の
範囲第１２項記載の方法。 ２１、前記ヒュミコーラｓｐ．リパーゼを培地から更に
回収することを含んで成り、該組換え体ＤＮＡクローニ
ングベクター系が更に該ヒュミコーラｓｐ．リパーゼを
コードするＤＮＡ配列に作用的に結合した分泌を与える
プレレージョンを更に含んで成る、特許請求の範囲第１
８項記載の方法。 ２２、ＤＮＡ配列がヒュミコーララヌギノザリパーゼで
ある、特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２３、アスペルギルスｓｐ．宿主がアスペルギルスオリ
ゼ菌株である、特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２４、特許請求の範囲第２３項記載の方法によって製造
される組換え体ヒュミコーララヌギノザリパーゼ製品で
あって、該組換え体リパーゼ製品が天然ヒュミコーララ
ヌギノザ製品よりも熱安定がより大きくかつ天然ヒュミ
コーララヌギノザリパーゼのグリコシル化とは異なるグ
リコシル化を有することを特徴とする、前記リパーゼ製
品。 ２５、天然ヒュミコーラｓｐ．リパーゼのグリコシル化
とは異なるグリコシル化を有することを特徴とする、組
換え体ヒュミコーラｓｐ．リパーゼ。 ２６、炭水化物含量が約５〜約３０％（ｗ／ｗ）である
、特許請求の範囲第２５項記載の組換え体ヒュミコーラ
ｓｐ．リパーゼ。 ２７、炭水化物含量が約５〜約１５％（ｗ／ｗ）である
、特許請求の範囲第２６項記載の組換え体ヒュミコーラ
リパーゼ。 ２８、炭水化物含量が約６〜約１０％（ｗ／ｗ）である
、特許請求の範囲第２５項記載の組換え体ヒュミコーラ
リパーゼ。 ２９、炭水化物含量が約７．５〜約８．５％（ｗ／ｗ）
である、特許請求の範囲第２９項記載の組換え体ヒュミ
コーラリパーゼ。 ３０、ガラクトースを含むことを特徴とする、特許請求
の範囲第２５項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３１、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースおよびガ
ラクトースを含むことを特徴とする、特許請求の範囲第
２５項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３２、１モルのリパーゼ蛋白質当たり、約１〜約１２モ
ルガラクトースを含むことを特徴とする、組換え体ヒュ
ミコーラリパーゼ。 ３３、１モルのリパーゼ蛋白質当たり、約１〜約６モル
のガラクトースを含むことを特徴とする、特許請求の範
囲第３０項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３４、１モルのリパーゼ蛋白質当たり、約３〜約２０モ
ルのマンノースを含むことを特徴とする、特許請求の範
囲第２５項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３５、１モルのリパーゼ蛋白質当たり、約３〜約１２モ
ルのマンノースを含むことを特徴とする、特許請求の範
囲第２５項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３６、１モルのリパーゼ蛋白質当たり、約２モルのＮ−
アセチルグルコサミン、約３〜約２０モルのマンノース
および約１〜約１２モルのガラクトースを含む、特許請
求の範囲３１項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３７、１モルのリパーゼ蛋白質当たり、約２モルのＮ−
アセチルグルコサミン、約３〜約１２モルのマンノース
および約１〜約６モルのガラクトースを含む、特許請求
の範囲３２項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３８、１モルのリパーゼ蛋白質当たり、約２モルのＮ−
アセチルグルコサミン、約６〜約９モルのマンノースお
よび約２〜約４モルのガラクトースを含む、特許請求の
範囲３２項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ３９、ｐＨ約６〜約９で、６０℃での２時間後の残留活
性が少なくとも９０％である、特許請求の範囲第２５項
記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ４０、ｐＨ約６〜約９．２で、６０℃での２時間後の残
留活性が少なくとも８０％である、特許請求の範囲第２
５項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ４１、ｐＨ約６〜約９．５で、５５℃での２時間後の残
留活性が少なくとも９５％である、特許請求の範囲第２
５項記載の組換え体ヒュミコーラリパーゼ。 ４２、ｐＨ約９で、５５℃での残留活性が約９９％であ
る、特許請求の範囲第２５項記載の組換え体ヒュミコー
ラリパーゼ。 ４３、ｐＨ１０で、５５℃での残留活性が少なくとも８
５％である、特許請求の範囲第２５項記載の組換え体ヒ
ュミコーラリパーゼ。
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