JPH08504100A - 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用 - Google Patents

多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用

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JPH08504100A JP6513922A JP51392294A JPH08504100A JP H08504100 A JPH08504100 A JP H08504100A JP 6513922 A JP6513922 A JP 6513922A JP 51392294 A JP51392294 A JP 51392294A JP H08504100 A JPH08504100 A JP H08504100A
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Abstract

(57)【要約】 免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメインからなり、前記ドメインは連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない、ポリペプチドは、連合して、多価であるか、あるいは多重特異性を有することができる抗原結合性マルチマー、例えば、二量体を形成する。ドメインは短いペプチドのリンカーにより連鎖することができるか、あるいは直接一緒に接合することができる。二重特異性二量体はより長いリンカーを有することができる。ポリペプチドおよびそれらのマルチマーおよびレパートリーを生産する方法、および問題のバインダーの容易な選択のためのバクテリオファージの表面上のそれらの表示、ならびに多数の実用性を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用 本発明は、結合タンパク質、前記タンパク質の製造法、およびそれらの使用に 関する。さらに詳しくは、本発明は免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域 からなる合成結合タンパク質に関する。２以上の結合特異性を有することができ るマルチマー、例えば、二量体を形成するポリペプチドが提供される。 この明細書の長さのために、読者が問題の進行を見出ことを助けるために内容 のリストをここに含めることは適当である。請求の範囲に加えて、この明細書は 、順番に、次のものを包含する： 本発明の分野の陳述； 内容； 先行技術の簡単な論考および本発明に対する序説； 本発明の論考； 図面の簡単な説明； ２価および二重特異性の抗体、調製および使用の論考； 「ダイアボディー（diabodies）」の調製、構造および種々の実用性の論考； ダイアボディーのレパートリーの構成およびバクテリオファージ上のそれらの 表示の論考； 実験の実施例のリスト； 実験の実施例および論考； このテキストの中に述べられているすべての文献をここに引用によって加える 。 天然の抗体は多価であり、例えば、IgG抗体は２つの抗原のため の結合部位を有しそしてIgMは５つの結合部位を有する。多価は、抗体が固相抗 原への結合において多数の相互作用を利用することができ、したがって抗原の結 合の結合活性を増加できることを意味する。哺乳動物細胞中の発現により組換え の２価のIgGおよび五量体の10価のIgMを作ることができる。今日まで、多価の種 々の可能性のうちで、２価の抗体は最大の重要性を有してきている。 ２またはそれ以上の異なるエピトープに結合できる抗体、多重特異性を有する ものはさらに重要である。二重特異性抗体は、後述するように、多数の証明され かつ期待される実用性を有する。 構造的には、最も簡単な抗原（IgG）はジスルファイド結合により相互に接続 された４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ ）鎖を有する。軽鎖はカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確な 形態で存在する。各鎖は一定領域（Ｃ）および可変領域（Ｖ）を有する。各鎖は １系列のドメインに有機化されている。軽鎖は、Ｃ領域およびＶ領域に相当する ２つのドメインを有する。重鎖は４つのドメイン、すなわち、Ｖ領域に相当する １つそしてＣ領域中の３つのドメイン（１，２および３）を有する。 この抗体は２つのアームを有し（各アームはFab領域である）、それらの各々 は互いに連合したVLおよびVH領域を有する。１つの抗体が他と異なる（アミノ酸 配列の変動のために）のはＶ領域のこの部分であり、それらは一緒になって抗原 を認識しそして抗原結合部位を提供する責任を負う。なおいっそう詳細には、各 Ｖ領域は４つのフレームワーク領域（FR）により分離された３つの相補的決定領 域（CDR）から構成されている。CDRは可変領域の最も変動性の部分であり、そし てそれらは重要な抗原結合機能を実行する。 結合性抗原の機能は全体の抗体の断片により実行されることがで きることが示された。結合性３断片の例は次の通りである：（ｉ）VL，VH，CLお よびCHlドメインから成るFab断片；（ii）VHおよびCH1ドメインから成るFd断片 ：（iii）抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインから成るFv断片、（iv）VH ドメインから成るdAｂ断片；（ｖ）分離されたCDR領域；および（vi）F（ab′）2 断片、ヒンジ領域におけるジスルファイド架橋により連鎖された２つのFab断片 からなる２価の断片。 断片は大部分完全な抗原の一部分を表す。しかしながら、用語「断片」は、ま た、特異的抗原結合能力を有するように連合された、抗体の重鎖および軽鎖の可 変領域、あるいはこれらのドメインの結合部分からなる。この型である抗体断片 のすぐれた例は「一本鎖Fc」（scFv）断片であり、これは機能的抗原結合部位を 形成するように２つのドメインを連合させることができるペプチドのリンカーに より、抗体の軽鎖の可変領域に連鎖した抗体の重鎖の可変領域から成る（参照、 例えば、米国特許第4,946,778号、Ladnerら、（Genex）；WO88／09344号、Creat ive Biomolecules，Inc／Hustonら）。WO92／01047号、Cambridge Antibody Tec hnologyら／McCaffertyらは、可溶性組換え遺伝的表示のパッケージ、例えば、 バクテリオファージの表面上のscFv断片の表示を記載している。 scFv分子のペプチドのリンカーの長さを変化させた、いくつかの実験の研究は 記載されてきている。リンカーの長さの範囲は一般に12〜18アミノ酸であり、15 アミノ酸は最も通常である、参照、例えば、M C Whitlowら、Protein Engineeri ng 6：989-995，1993。すべての場合において、リンカーは２つのドメイン、す なわち、一方のVL、他方のVHのために十分に長くて、連合して抗原結合部位を形 成し、これはscFvの特性を示す特徴である。例えば、Condraら（The Jurnal of Biological Chemistry，265：2292-2295，1990）は、 細胞レセプターへのヒトライノウイルスの取り付けをブロックすることができる scFv断片のリンカーの長さを変化させた。この論文において著者らがVLドメイン と記載しているものはＣドメインからのアミノ酸を含み（Kabatら、Sequences o f proteins of Immunological Interest，US Goverment Printing Officeを概観 することによって理解することができる）、したがってこれらの分子は可変ドメ インの間に「長い」リンカーを有して、各分子におけるVLおよびVHドメインが連 合して抗原結合部位を形成できるようにする。 本発明は、さらに、連合して多価または多重特異性のマルチマーを形成できる ポリペプチドを提供することにより抗体断片の分野に関する。いっそう詳しく後 述するように、１つの面において、免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域から なる第１ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ ドメインからなり、前記ドメインは連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部 位を形成することができない、ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチ ドは連合してマルチマー、例えば、二量体を形成することができ、１つのポリペ プチドの重鎖の結合領域は他のポリペプチドの軽鎖の結合領域と連合して抗原結 合部位を形成する。二量体化の場合において、２つの抗原結合部位が形成される 。 用語「ダイアボディー（diabody）」は本発明による二量体を記載するために つくられた。この用語はこの分野において既に多少の認識を獲得した。本発明に おいて使用するとき、用語は、特記しない限り、二量体にのみ適用されると一般 的説明において解釈することを意図しない。ポリペプチドの三量体は可能であり 、このとき３つの抗原結合部位が形成される。また、この用語は多価および多重 特異性の両方のマルチマーに関係して使用される。 ポリペプチドの各ドメインは完全な免疫グロブリンの重鎖または 軽鎖（場合に応じて）の可変ドメインであることができるか、あるいは天然に見 出されるドメイン、または、例えば、生体外でWO93／11236号（Medical Researc h Councilら／Griffithsら）に記載されているような技術を使用して構成された 合成ドメインの機能的同等体または突然変異体または誘導体であることができる 。例えば、少なくとも１つのアミノ酸を欠いている抗体の可変ドメインに相当す るドメインを一緒に接合することが可能である。重要な特性を明らかにする特徴 は各ドメインが相補的ドメインと連合して抗原結合部位を形成する能力である。 したがって、用語「免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の可変領域」は、本発明がいか に働くかに実質的な作用をもたない変異型を排除すると解釈すべきでない。 「誘導体」はポリペプチドに関する物質である。誘導体は１または２以上のア ミノ酸の付加、欠失、置換または挿入によるか、あるいは他の分子の連鎖により 異なることができる。変化はヌクレオチドまたはタンパク質のレベルでなすこと ができる。マーカー、例えば、酵素、フルオレセインなどをポリペプチドに連鎖 させることができる。 第１および第２のドメインはアミノ酸残基を介在させないで連鎖することがで きる。２つのこのような分子は合してなおいっそう小さい二量体を形成するであ ろう。さらに、ある場合において、この型の分子の剛性は、マルチマーの１の抗 原結合部位への抗原の結合がマルチマーの他の結合部位のコンフォメーションの 変化、抗原の結合を増強または減少する場合、有用であることがあるコンフォメ ーションの変化を引き起こすか、あるいはその他の結合部位の触媒活性を変化す ることさえあることを意味することがある。 １つの態様において、ポリペプチドのドメインはペプチドのリンカーにより連 鎖されている。このリンカーは「短い」ことができ、 鎖のVLドメインがその鎖のVHドメインと結合できるようにするためには少な過ぎ るアミノ酸から成る。これは10より少ない、最も好ましくは５，４，３，２、ま たは１アミノ酸であることができる。ある場合において、９，８，７または６ア ミノ酸が適当であることがある。ある場合において、それは「−１」であること ができる、すなわち、VHおよびVLドメインは直接一緒に連鎖しているが、それら の一方は１アミノ酸を欠いている。ある場合において、２以上のアミノ酸がドメ インの一方または両方から欠けることができる。 なお他の態様において、リンカーは10またはそれ以上のアミノ酸から成ること ができるので、構造的特徴を制限しないで、各鎖のドメインは互いに連合して抗 原結合部位を形成できるであろう。例えば、リンカーは15アミノ酸またはそれよ り長いことができる。適当な構造的拘束は、システイン残基をリンカー内にもち 、ジスルファイド架橋がそれらの残基を接合してリンカーの有効長さを減少し、 どれだけ遠いかにより、Ｖドメインはリンカーのルーピングにより離れているこ とを包含する。これはさらに後述する。当業者は他の可能性を知っているであろ う。 ポリペプチドの２つの二量体は２価である、すなわち、各抗原結合部位は同一 エピトープに結合することができる。VHおよびVLドメインの結合特異性は、場合 に応じて、それぞれのドメインが相補的VLまたはVHと連合しているとき、決定可 能である。ポリペプチドのVHおよびVLドメインが親の抗体または抗体断片（得ら れる場合）ポリペプチドの２つ（同一であるか、あるいは異なることがある修飾 をもつ）は結合して２価の二量体を形成するであろう。もちろん、連合して２価 の二量体を形成するポリペプチドの結合領域は、同一エピトープに結合する２つ の異なる抗体から誘導することができるか、あるいは合成であるか、あるいは当 業者にとって示唆された任 意の方法を使用して得ることができる。 他の場合において、免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域および免疫グロブ リン軽鎖可変領域の結合領域は、それぞれ、相補的軽鎖または重鎖の結合領域と 連合したとき、互いと異なるエピトープに結合することができる。２つのこのよ うな分子の二量体は二重特異性であろう。 ポリペプチドは追加のアミノ酸残基に融合することができる。このような残基 はペプチドの標識であり、多分単離を促進するか、あるいは合成のとき宿主細胞 からのポリペプチドの分泌のためのシグナル配列であることができる（これにつ いては下を参照のこと）。適当には、分泌のリーダーペプチドを使用し、細胞質 ゾルの中から外へのポリペプチドの動きを指令するポリペプチドのＮ−末端に接 合したアミノ酸である。 追加のアミノ酸残基はポリペプチドのドメイン、例えば、抗体のＣドメインお よび／または生物、例えば、バクテリオファージ、多分繊維状バクテリオファー ジ、例えば、fdまたはM13の表面成分であることができる。好ましくは、表面成 分はバクテリオファージのGIIIまたは他の繊維状バクテリオファージからの同等 体である。 本発明によるポリペプチドは、他のこのようなポリペプチドと連合して二量体 を形成することができ、各ポリペプチドの免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領 域は他のポリペプチドの免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域と連合している 。 他の態様において、３つの鎖の構成体を形成することができ、この構成体は２ つの抗原結合部位を有する。そこで、本発明によるポリペプチドは「遊離の」VH またはVLドメインと連合して２つの抗原結合部位を形成することができる。例え ば、３分子は（VHA−VLB），VHBおよびVLAであって、二重特異性構成体を形成す るか、あるい はそれらは（VH−VL），VHおよびVLであって２価の構成体を形成することができ る。この態様は、VHおよびVLドメインが安定に連合することができる場合、適当 であろう。構成体は標準のダイアボディーに対合よりも柔軟性であるが、なお有 利には大きさが小さい。 二量体は、２価または二重特異性であるかどうかにかかわらず、本発明の範囲 内にはいる。説明するように、二量体における２つのポリペプチドは互いに異な ることができるか、あるいは同一であることができる。それらが異なる場合、第 １および第２のドメイン（「VH」および「VL」）の順序は考えられるように同一 であるか、あるいは異なることができる。しかしながら、最も好ましくは、第１ および第２のドメインのＮ−末端からＣ−末端の順序は各ポリペプチドにおいて 同一である。そのとき二重特異性の二量体はＮ−（VHA−VLB）＝Ｃ／Ｎ−（VHB −VLA）−ＣまたはＮ−（VLA−VHB）−Ｃ／Ｎ−（VLB−VHA）−Ｃとして表すこ とができる内に位置する。 また、ポリペプチドの種々のレパートリーが本発明により提供される。このよ うな種々のレパートリー内に、ポリペプチドの異なる対合（または三量体化など ）は異なる結合特異性をもつ、２価または二重特異性の二量体の形成を生ずるこ とができる。二量体の種々のレパートリーは本発明の範囲内に包含される。 本発明は、また、本発明のポリペプチドをエンコードする配列からなる核酸、 およびこのような核酸の種々のレパートリーを提供する。この核酸は第１ドメイ ンをエンコードする核酸と第２ドメインをエンコードする核酸との間にRNAスプ ライス部位の核酸を含むことができる。 自己スプライシンググループＩのイントロン、例えば、テトラヒメナ（Tetrah ymena）からのもの（T.R.Cech Ann.Rev.Biochem．59 543-568，1990）を挿入す ることができる。イントロンのスプライシ ングアウトはRNAレベルで起こって、イントロンの内部の誘導配列を残し、この 配列はダイアボディーの２つのドメインの間の３アミノ酸をエンコードする。残 留するアミノ酸の数が異なるように、例えば、実施例24において、５および６ア ミノ酸のリンカーが形成されるように、自己スプライシングをデザインすること ができる。 他のグループＩのイントロンまたはグループ11の自己スプライシングのイント ロンを使用することができる。自己スプライシングのイントロンは、例えば、lo xP部位（下を参照）における、組換えと組み合わせて、ダイアボディー分子の構 成において使用することができる。例えば、loxP部位をポリペプチド鎖の２つの 抗体ドメインの間の自己スプライシングイントロンの中に含めることができる。 これは、例えば、他の可変ドメインの遺伝子および自己スプライシングイントロ ンの適当な領域を有する他のレプリコン上のloxP部位を通してDNAレベルで組換 えることができる。転写後のDNAレベルにおける自己スプライシングは次いで、 可変ドメインの新しい組み合わせをもつダイアボディーのポリペプチド鎖に導く であろう。 核酸は、第１ドメインをエンコードする核酸と第２ドメインをエンコードする 核酸との間に、生体内または生体外の組換えのための部位をエンコードする核酸 を含むことができる。 例えば、loxP部位、すなわち、34bpの部位において、組換えはタンパク質Cre により触媒される（Hoessら、PNAS USA 79：3398-3402，1982、およびStemberg ら、J.Mol．Biol．150 ：467-486，1981）。 この系はファージ上で表示される抗体の調製において使用されてきている（P. Waterhouseら、Nuc.Acids Research 21：2265-2266，1993；およびWO93／19172 ）。 本発明は、また、このような核酸からなるベクターを提供する。 このベクターはポリペプチドの発現に必要な核酸からなることができる。ベクタ ーは発現のときのポリペプチドの分泌のための核酸からなることができる。 ベクターは前記ペプチドの２つ、すなわち、第１ポリペプチドおよび第２ポリ ペプチドをエンコードする核酸からなることができる。第１ポリペプチドをエン コードする核酸と第２ポリペプチドをエンコードする核酸との間に、生体内また は生体外の組換えのための部位からなる核酸が存在することができる。 本発明の他の面に従うと、第１ポリペプチドをエンコードする核酸および第２ ポリペプチドをエンコードする核酸、ポリペプチドの各々は免疫グロブリン重鎖 可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域 の結合領域からなる第２ドメインからなり、各ポリペプチドの第１ドメインはそ のポリペプチドの第２ドメインに連鎖されているが、それと連合して抗原結合部 位を形成することができず、第１ポリペプチドをエンコードする核酸は発現のと き宿主細胞から第１ポリペプチドの輸出のためのシグナル配列をエンコードする 核酸に連鎖されており、第２ポリペプチドをエンコードする核酸は発現のとき宿 主細胞から第２ポリペプチドの輸出のためのシグナル配列をエンコードする核酸 に連鎖されている、および発現のときバクテリオファージ粒子の表面上の第２ポ リペプチドの表示のための繊維状バクテリオファージの表面成分をエンコードす る核酸からなり、バクテリオファージ粒子内にパッケージングされることができ るベクターが提供される。 このようなベクターからの発現は、バクテリオファージ粒子の表面上に、２つ の第１および第２のポリペプチドの二量体を生成し、前記ポリペプチドの一方は 表面成分により前記粒子に取り付けられており、他方はそれと連合されている。 これは表示されたダイアボ ディーの選択を可能とし、粒子内にパッケージングされた、エンコーディング核 酸は容易に単離される。この種類の技術はWO92／01047に記載されている。 ダイアボディーのレパートリーの発現および分泌された複製可能な遺伝的表示 パッケージ、例えば、バクテリオファージ上のそれらの表示は、重鎖および軽鎖 の多数の異なる可能な組み合わせ−多数の異なる可能な結合特異性−の中から問 題の抗原のためのバインダーの選択のために価値がある。 他の面において、本発明は、 （ａ）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ポリペプチドのド メイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる免疫グロブリン 軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ポリペプチドのドメインをエンコードする 核酸；および （ｂ）繊維状バクテリオファージの表面成分をエンコードする核酸； 連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない第１ および第２のドメインからなるポリペプチド（「Ａ」）を生産する核酸（ａ）の 発現； 連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない第１ および第２のドメインからなり、バクテリオファージ粒子の表面上のポリペプチ ド（Ｂ）の表示のための繊維状バクテリオファージの表面成分に融合した、ポリ ペプチド（「Ｂ」）を生産する核酸（ｂ）と一緒の核酸（ａ）の発現； 核酸（ｂ）は介在する抑制可能な停止コドンを含む核酸により核酸（ａ）に連 鎖されている； からなるベクターを提供する。 抑制可能な停止コドンは、サプレッサー宿主細胞中の前記コドン の下流のヌクレオチド配列の翻訳を可能とするが、非サプレッサー細胞において 、翻訳は前記コドンにおいて終わることができる。抑制可能な翻訳停止コドンの 例は、アンバー、オーカーまたはオパールのコドンである。事実、ほとんどのサ プレッサー宿主細胞、例えば、SupE細胞において、多少の「すべり」が存在する ので、抑制可能な停止を越える多少の翻訳および停止における多少の翻訳の停止 が存在する。 これは有用である。なぜなら、これにより本発明のこの面に従うベクターを使 用して可溶性ポリペプチドおよびバクテリオファージの１成分、または他の表示 パッケージに融合したポリペプチドの両方を、粒子表面上の二量体の連合のため に、発現することができるからである。好ましくは、ポリペプチドが宿主細胞の 細胞質ゾルから周辺質の中に分泌されるように、ベクターの核酸は分泌リーダー ペプチドまたは他のシグナル配列をエンコードする核酸を含む（Skerraら、Scie nce 240 ：1038：1041，1988；Betterら、Science 240 ，1041-1043，1988；WO9 2／01047）。 本発明は、また、本発明によるベクターでトランスフェクションされた宿主細 胞を包含する。ベクターが前述したような抑制可能な停止コドンを有する場合、 好ましくは宿主細胞は両方のポリペプチドＡおよびＢ（前述したような、すなわ ち、VH−VLであるものおよびバクテリオファージまたは他の生物の表面成分に融 合したVH−VLであるもの）の共発現のための条件を提供することができる。 本発明は、また、ポリペプチドＡおよびＢの同時発現のための条件であること ができる、１または２以上のポリペプチドの発現のための条件下にベクターでト ランスフェクションされた宿主細胞を培養することからなる、本発明によるポリ ペプチド、二量体または他のマルチマーを作る方法を提供する。この方法は、宿 主細胞または 培地からの、宿主細胞の培養物からの１または２以上のポリペプチド、１または ２以上の二量体などの回収を包含する。宿主細胞からの回収は、細胞質からの分 泌後の、周辺質からであるか、あるいは封入体からであることができる。変性状 態からの再生を要求とすることがある。回収は好ましくは問題の抗原との結合に よる選択による。 本発明によるポリペプチドの多数の用途が考えられ、それらのいくつかは後述 されている。とくに興味ある１つの用途は、均質アッセイまたは不均質アッセイ である、抗原についてのアッセイである。 本発明の他の面において、二重特異性二量体が提供され、この二量体は（ｉ） 免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、免疫グロブリン 軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメイン、および第１および第２のドメイ ンを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとの連合を可能とするポリペプチ ドのリンカーを有する第１ポリペプチド；および（ii）免疫グロブリン重鎖可変 領域の結合領域からなる第１ドメイン、免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域 からなる第２ドメイン、および第１および第２のドメインを連鎖しそして抗原結 合部位を形成する互いとのドメインの連合を可能とするポリペプチドのリンカー を有する第２ポリペプチド；を有する。第１ポリペプチドの第１ドメインおよび 第２ポリペプチドの第２ドメインは連合して、第１結合特異性を有する抗原結合 部位を形成するが、第１ポリペプチドの第２ドメインおよび第２ポリペプチドの 第１ドメインは連合して、第２結合特異性を有する抗原結合部位を形成する。 本発明の他の面において、 （ｉ）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメ イン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメインから なる第１ポリペプチド、第１ポリペプチドのドメインは連鎖しているが、互いに 連合して抗原結合部位を形成することができない；および （ii）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、免疫グ ロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメイン、および第１および第２ のドメインを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとの第２ポリペプチドの ドメインの連合を可能とするポリペプチドのリンカーを有する第２ポリペプチド ； 第１ポリペプチドの第１ドメインおよび第２ポリペプチドの第２ドメインは連 合して抗原結合部位を形成している；および 第１ポリペプチドの第２ドメインおよび第２ポリペプチドの第１ドメインは連 合して抗原結合部位を形成している； の二量体が提供される。 このような二量体は２価または二重特異性であることができる。 二量体のポリペプチドに対する種々の修飾を、本発明の他の面について前述し たのと同一の方法において、行うことができる。同様に、本発明は、本発明のこ の面に従う二量体を形成することができる第１および第２のポリペプチドをエン コードする核酸からなるベクター、このようなベクターでトランスフェクション された宿主細胞、および第１および第２のポリペプチドの発現のための条件下に 宿主細胞を培養し、そして二重特異性を有する二量体を回収することからなる方 法を包含する。 下の実験の実施例により開示されるポリペプチド、マルチマー、核酸、ベクタ ー、レパートリーなどは本発明の面として提供される。 例えば、本発明は、また、次のいずれかに結合する抗原結合部位 を有する分子を提供する：細胞表面のタンパク質、Fcレセプター、腫瘍特異的マ ーカー、CEA、ウイルスHIVl、小さい化学的分子、ホルモン、サイトカイン、TNF α、抗体、抗体のイディオタイプ。 二量体の１つの抗原結合部位に対する抗原の結合が二量体の他の結合部位への 抗原の結合に影響を与える二量体が提供される。 リンカーの変更が二量体の抗原結合部位の少なくとも１つの抗原結合アフィニ ティーの改良に導く二量体は本発明に包含される。 診断であることができるアッセイが提供され、そしてこのアッセイは抗原の架 橋または細胞の凝集を包含することができる。それらは表面上の１つの抗原の結 合および溶液中の抗原の結合を包含することができ、そして表面のプラズモンの 共鳴を使用する検出を包含する。本発明の態様により提供される分子は２つの異 なる細胞表面上の抗原に結合することができる。 さらに、本発明は本発明のポリペプチドまたはマルチマーからなる製剤、およ び薬物の調製におけるポリペプチドまたはマルチマーの使用を提供する。本発明 によるポリペプチドまたはマルチマーを使用する処置の方法が包含される。 本発明の多数の他の面は下に記載されている。他の面は当業者にとって明らか であろう。 次に、本発明を図解および例示により、２価および二重特異性の抗体および抗 体断片の分野において現存する技術と比較してさらに説明する。以下は本発明を いかなる方法においても限定するものとして解釈すべきではない。次に図面につ いて述べる（追加の記号解は説明の終わりにある）： 第１図は、bisAbsと表示するハイブリッド−ハイブリドーマおよび２価の抗体 断片を示す。このbisAbsは破線の上にそして２価のAbsは下に記載されている： ハイブリッド−ハイブリドーマ、Ｂ：二 重特異性Fab′2、Ｃ：二重特異性F（ab′−ジッパー）2、Ｄ：二重特異性scFv2 、Ｅ：３鎖の二重特異性断片、Ｆ：二重特異性ダイアボディー、Ｇ：２価の（Fv Cys）2、Ｈ：２価の（Fvジッパー）2、Ｉ：scFvCH32（P.Holliger，G.Winter未 発表の結果）、Ｊ：２価のダイアボディー、Ｋ：２価のF（ab′−ジッパー）2、 Ｌ：２価のFab′2。 第２図は、２つの連鎖するダイアボディー分子の凝集を示す： ダイアボディー１−一方の特異性は血球表面の抗原（部位１）に対して向けら れておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対して向けられ ているので、この結合部位（部位２）は自由である。 ダイアボディー２−一方の特異性は第１ダイアボディー上の部位２に対して向 けられた抗イディオタイプ（部位抗−２）でありそして他方の特異性は血球表面 の抗原（部位１）に対して向けられている。このフォーマットは血球の凝集を可 能とし、スパンされた距離は示すように２つのダイアボディー分子の長さである 。 第３図は、３つの連鎖するダイアボディー分子を使用する凝集を示す： ダイアボディー１−一方の特異性は血球表面の抗原（部位１）に対して向けら れておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対して向けられ ているので、この結合部位（部位２）は自由である。 ダイアボディー２−両方の特異性は第１ダイアボディー上の部位２に対して向 けられた抗イディオタイプである（部位抗−２）。 このフォーマットにおいて、ダイアボディー１の２つの分子が異なる赤血球に 結合するとき、ダイアボディー２は部位２においてこれらのダイアボディー１の 分子の各々に結合することができ、こう して示すように２つの赤血球の間の距離をスパンする３つのダイアボディー分子 の複合体を形成する。 第４図は、連鎖を作る２つのダイアボディー分子および１つの非ダイアボディ ー分子を使用する凝集を示す。 ダイアボディー１−一方の特異性は血球表面の抗原（部位１）に対して向けら れておりそして他方の特異性アッセイに添加すべき他の非ダイアボディー抗原（ 部位２）に対して向けられている。 非ダイアボディー抗原分子−これはダイアボディー１の部位２が向けられる大 きい分子である。このフォーマットにおいて、ダイアボディー１の２つの分子は ２つの異なる細胞に結合する。非ダイアボディー分子は赤血球を架橋する部位２ を通して両方のダイアボディー分子に結合するであろう。 第５図は、架橋反応において全生物を使用する凝集を示す。上の場合において 、凝集のための連鎖する分子はタンパク質分子である。この原理は架橋すべき生 物、例えば、バクテリオファージＭ13または細菌、例えば、大腸菌（E.coli）の 使用に拡張することができる。 上のフォーマット（iii）において、ダイアボディー１の部位１は細胞表面の マーカーに対して向けることができ、そして部位２はバクテリオファージ表面の 分子、例えば、遺伝子８タンパク質に対して向けられることができるであろう。 第６図：２価のダイアボディーのレパートリーの構成。種々のクローニングル ートを使用して２価のダイアボディーのレパートリーを作ることができる。出発 点はVHおよびVL遺伝子の種々のレパートリーあるいはscFvまたはFabとして既に フォーマット化された（および可能ならばバインダーについて濃縮されている） Ｖ遺伝子のレパートリーであることができる。詳細はこのテキストの中で説明さ れている。 第７図：二重特異性ダイアボディーのレパートリーの構成。種々のクローニン グルートを使用して二重特異性ダイアボディーのレパートリーを作ることがでる 。出発点はVHおよびVL遺伝子の種々のレパートリー（ルートＢ）あるいはscFvま たはFabとして既にフォーマット化された（および可能ならばバインダーについ て濃縮されている）Ｖ遺伝子のレパートリー（ルートＣ）であることができる。 両方のルートにおいて、Ｖ遺伝子のレパートリーを段階的制限クローニングまた はPCRアセンブリーにより二重特異性ダイアボディーとしてクローニングするこ とができる。あるいは、ダイアボディーのレパートリーはヘルパーまたはダミー Ｖ遺伝子を使用して作ることができる（ルートＡ）。より詳細はこのテキストの 中で説明されている。 第８図：大きい２価のダイアボディーのレパートリーの構成。テトラヒメナ（ Tetrahymena）からの自己スプライシングイントロン、およびloxP組換え系の両 方を利用することによって、大きい２価のダイアボディーのレパートリーを作る ことができる。VHを含有するレプリコンとCre／loxP仲介組換えを経て組み合わ せる。DNAレベルにおいて起こる組換え後、生ずるダイアボディー遺伝子を転写 し、そしてイントロンおよびVH遺伝子とVL遺伝子との間のloxP部位をスプライス アウトする。いっそう詳細にはテキストを参照のこと。 第９図は実施例１．Ａからのベクター構成体を示す。発現構成体（Ｉ，II，VI ，VII）の構成に使用した構成体（III−Ｖ）を図解する。（それぞれ、VHB−VLA およびVHA−VLBをエンコードする構成体VIIIおよびIXは示されていないが、実施 例１に記載されている）構成体III〜Ｖはfd-tet-DOGl（Ｖ２）（H.R.Hoogenboom ら、前掲）中で、そして他の構成体はpUC19誘導発現ベクター（VI）（L.Riechma nn ら、1992、前掲）中でlacプロモーター（Ｐ）のコントロール下にペプチド標識 （Ｔ）（S.MunroおよびH.R.B.Pelham 1986前掲）を使用してクローニングした。 抗体NQ11（VHA，VLA）およびD1.3（VHB，VLB）のＶ遺伝子は内部のPstI，BstEII ，SacIおよびXhoI制限部位を（R.Orlandiら、Proc．Natl.Acad.Sci．USA 86 383 3-3837 1989；E.S.Wardら、1989 前掲）におけるように有する；さらに、VLAは 内部のPstI部位を有する。同一鎖のVHとVLとの間のポリペプチドのリンカー（Lk ）または非コーディング領域（Ｎ１またはＮ２）がマークされている。LkはGly4 Serのある数の反復（ｎ＝０〜３）から成る。Ｎ１は記載されているように（E.S .Wardら、1989、前掲）リボソーム結合部位（rbsl）を含み、そしてＮ２は記載 されているように（J.McLaughlinら、J.Biol.Chem．256 11283-112881981）コ ンセンサスリボソーム結合部位を含む。細菌の周辺質の中への断片の分泌のため のシグナル配列はpelBシグナル配列（Ｌ１）（E.S.Wardら、1989 前掲）および ファージfd遺伝子３のシグナル配列（Ｌ２）（A.N.Zacherら、Gene 9 127-140 1980）である。PCRプライマー１〜８の位置は構成体III〜Ｖの中に示されている 。また、表１から推定されるタンパク質生産物の概略的描写が与えられている。 第10図は、抗体断片のBIAコアおよびFPLC分析を示す。HELで被覆したBIAコア のセンサーチップを使用しかつ共鳴単位（RU）として結合した質量を検出して、 FabD1.3（パネルＡ）からのリゼイトを構成体VI（パネルＢ）または構成体VII（ パネルＣ）からのリゼイトと比較する。ａ．基線；ｂ−ｄ、断片の注入；ｄ−ｅ ．結合した断片の解離；ｅ−ｈ．phOx-BSAの注入。ｅとｈとの間のDRUは結合し たphOx-BSAの量を反映する。 第11図は、FPLC（0.2mMのEDTA、0.05％のアジ化ナトリウムを含む PBS中のスーパーデックス（Superdex）S-75 10／30）によりリゼイトを分画した 後に出現するいくつかの断片のBIAコアによるオンライン検出を図解し、HEL被覆 したチップに結合した質量の変化が時間に対してプロットされている（dRu／dt ）。ゼロより上の点はHELとの連合を示し、ゼロより下の点は解離を示す。上部 の列において、キメラFabD1.3（Mr 47.6k）およびFvD1.3（Mr 25.7k）について の図形をプロットし、そして下部の列において二量体の構成体VI（Mr 53.4k）お よびVII（Mr 51.7k）（両方の15残基のリンカー）についての図形をプロットす る。アミノ酸配列からMrを計算する。 第12図はモデリングである。２価のD1.3ダイアボディーのモデルは連鎖したド メインのＮ−およびＣ−末端の付加（連続の円でマークしそして点線により接続 されている）、ドメインのパッキングおよびVLドメインのＣ−末端の近位（開い た円でマークされている）を図解する。同一のポリペプチド鎖上にVHおよびVLド メインのについてのCaの図形（ａまたはｂ）は、それぞれ、太いか、あるいは細 くて、各抗原結合部位が２つの異なる鎖ａおよびｂのVHおよびVLドメインから形 成されることを示す。こうしてVHaはVLbと連合し、そしてVHbはVLaと連合する。 結合した抗原の雌鶏の卵のリゾチーム（HEL）はこの図面の上部および下部に示 されている。 第13図は、二重特異性ダイアボディーNQ11／D1.3（実施例２）のVLドメインの Ｎ−末端またはVHドメインのＣ−末端におけるアミノ酸の欠失により作られた４ つの−１構成体を示す。 第14図は、二重特異性ダイアボディーNQ11／D1.3（実施例２）中のVHおよびVL ドメインの接合部におけるアミノ酸の欠失により作られた−２および−３構成体 を示す。 第15図は、phOx-BSA表面からのNQ11／B1.8二重特異性ダイアボディー（実施例 ４）の解離についての分離速度（off-rate）曲線を示 す。 第16図は、NIPの存在または不存在（対照）下のOx-BSA表面へのNQ11／B1.8の 結合についての補正した平衡結合（平衡における応答単位「Req」）曲線を示す 。上の部分は表面ｓ２についての曲線を示し、そして下の部分は表面ｓ３につい ての曲線を示す（実施例４）。 第17図は、ｓ２のphOx-BSAの表面へのNQ11／B1.80x／NIPダイアボディーの結 合についてのスキャッチャードプロットを示す、上の部分−対照；下の部分−プ ラス１μＭのNIP（実施例４）。 第18図は、ｓ３のphOx-BSAの表面へのNQ11／B1.80x／NIPダイアボディーの結 合についてのスキャッチャードプロットを示す、上の部分−対照；下の部分−プ ラス１μＭのNIP（実施例４）。 第19図は、ベクターpCANTAB5およびその誘導体pCANTAB6のポリリンカー領域を 示す。 第20図は、ベクターpCANTAB6のポリリンカーの領域を示す。 第21図は：MAK195ダイアボディーのELISA。MAK195ダイアボディー（５残基の リンカー）およびscFvをこのテキストに記載するように誘発により調製し（一夜 の成長のために24℃を使用する）そして試料を室温または37℃において実施した ELISAにおいてヒトTNFに対する結合について分析した。対照のscFvは異なる抗原 に対して向け、したがってTNFに結合しない。 第22図：Mab32およびP3A2ダイアボディーのELISA。Mab32ダイアボディー（０ および５残基のリンカー）およびMab32scFv断片をこのテキストに記載されてい るように誘発により調製し、そしてELISAにおいてヒトTNFに対する結合について 分析した。 第23図：Mab32およびP3A2ダイアボディーのウェスタンブロット。Mab32ダイア ボディー（０および５残基のリンカー）およびMab 32scFv断片は、１mMのIPTGおよび一夜の成長のために種々の温度（左に示されて いる）を使用して、適当なプラスミドを有する細菌を誘発することによって調製 した。ダイアボディーはこのテキストに記載されているように培養上澄み液のス ポットの試料（未希釈、純粋；および10倍の希釈）中で検出された。 第24図（ゲルＩ）は、種々の条件下に再生した細胞内で発現させたMab32ダイ アボディーの調製物の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。トラック７は、循環手順お よび添加したレドックス循環剤の不存在下に50mMのTris-HCl、0.5ＭのNaCl中の 一夜インキュベーション後の物質の再生状態を示す。トラック９は、再生−５mM のGSH、0.5mMのGSSGを含む50mMのTris-HCl、0.5MのNaCl−後の一夜インキュベー ションのために実施例Ｘにおいて使用した条件を示す。 第25図（ゲルVII）は、精製の種々の段階からの細胞内で発現させたMab32ダイ アボディーの調製物の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。 １．再生されたタンパク質 ２．50倍に濃縮した再生されたタンパク質 ３．スパロース（Superose）12のクロマトグラフィー後の最終生産物 ４．濃縮工程後の回転したペレット 第26図（ゲルIV）は、因子Xa／ダイアボディーの変化するモル比において１mM のNi2+の存在下に37℃において20時間の間因子Xaで切断した（his6標識を除去す るために）細胞内で発現させたMab32ダイアボディーの調製物の非還元性SDS-PAG Eゲルを示す。因子Xa／ダイアボディーのモル比−トラック１ １：５；トラッ ク２ １：２；トラック３ １：１。 第27図：Mab32ダイアボディーはヒトTNFに特異的に結合する。細菌内で生成し そして再生させて機能的２価の分子を形成したMab 32ダイアボディーのELISAのデータ。ヒトTNFおよびBSAへの結合をこのテキスト に記載されているようにアッセイする。 第28図：Mab32ダイアボディーはMab32全抗体とTNFへの結合について競争する 。細胞内で生成しそして再生させて機能的２価の分子を形成したMab32ダイアボ ディーのELISAのデータ。ヒトTNFおよびBSAへの結合をこのテキストに記載され ているようにアッセイする。 第29図：抗301抗血清はMab32−ダイアボディーの結合と競争する。細胞内で生 成しそして再生させて機能的２価の分子を形成したMab32ダイアボディーのELISA のデータ。ヒトTNFおよびBSAへの結合をこのテキストに記載されているように競 合するエピトープに対して結合する抗血清の存在下にアッセイする。 第30図：Mab32ダイアボディーは２価である。細胞内で生成しそして再生させ て機能的２価の分子を形成したMab32ダイアボディーのELISAのデータ。ヒトTNF およびBSAへの結合をこのテキストに記載されているようにアッセイする。9E10 抗体を使用することによって結合したダイアボディーを検出する代わりに、ビオ チニル化TNFを使用し、ダイアボディーは２価であることが証明される。 第31図は、ヒトPBLにより腫瘍細胞のCBM1ダイアボディー仲介溶解を示す。溶 解％は51Crの解放を使用して決定した。Ｅ：Ｔ比はエフェクター細胞（ヒトPBL 細胞）／標的腫瘍細胞（LS174T）の比を表す。ヒトPBLはドナーＤから得た。CBM -1は1000ng／mlおよび10ng／mlで使用した；ｗ／ｏ抗体は抗体またはダイアボデ ィーの断片なしの対照からのデータである。 第32図は抗CEA抗CD3ダイアボディーCBM1の構成を示す。クローンCEAはネズミ 抗CEA抗体の一本鎖Fvであり、そしてBAR35-L5はモノクローナル抗体3G8の５アミ ノ酸の抗体のバージョンである。ダ イアボディーCBM-1はこの出願に記載されている方法を使用して示した計画に従 い構成された。 第33図：二重特異性ダイアボディーのレパートリーの構成。phOxについて濃縮 されたscFvレパートリーおよびDigバインダーを構成の出発点として使用した。E 1-OXはphOx上で選択したscFvレパートリーからのds-DNAであり、重鎖および軽鎖 の両方の遺伝子のレパートリーを供給する（VH-OXおよびVL-OX；より詳細につい てはテキストを参照のこと）：E2-OXはDig上で選択したscFvレパートリーからの ds-DNAであり、VH-DiGおよびVL-DIGの両方の遺伝子のレパートリーを供給する（ より詳細についてはテキストを参照のこと）。LN11はFab-D1.3を含有するファー ジミドベクターであり、そして２つのVH-VLカセットの間の領域のための供給と して使用する。遺伝子のレパートリーを示すように増幅し（また、テキストを参 照のこと）、そして二重特異性ダイアボディーのフォーマットにおいてPCRアセ ンブリーおよびライゲーション仲介連鎖およびPCRの組み合わせにより一緒に連 鎖した。最終の断片をSfi-NotI制限断片としてファージ表示のためにファージミ ドベクターの中にクローニングした。 第34図：二重特異性ダイアボディーのレパートリーからのクローンのELISAス クリーニング。抗phOx／抗Dig二重特異性レパートリーからの個々のクローンを 選択の前にファージダイアボディーとして分析した（プレート１，４および７） 、そしてphOx-BSA上の選択後ファージダイアボディー（プレート２，５および８ ）または可溶性ダイアボディー断片（プレート３，６および９）として分析した 。すべてのDigおよびphOx結合性ダイアボディーはそれらの抗原に特異的に結合 した；二重特異性クローンは選択前に６／93および選択後に40／96の頻度で同定 された。それ以上の詳細についてはテキ ストを参照のこと。 第35図：二重特異性ダイアボディーの結合。二重特異性ダイアボディーの結合 は、ファージ（上部）として、あるいはELISAにおいて可溶性ダイアボディー（ 下部）として、phOx-BSA上で選択されたレパートリーを形成する。Dig-BSAまた はphOx-BSAに対する相対的結合はクローン毎に変化し、多数の異なるクローンが 得られたことを示す。 第36図は、ゼロ残基のリンカーおよび２残基のリンカーをもつNQ11逆ダイアボ ディーのphOx-BSAへの結合についてのELISAアッセイのシグナルを示す。二重特異性および２価の抗体 ２価および二重特異性の抗体は、免疫診断および治療（Winter G．およびMils tein，C.（1991）Nature 349 ，298-299；P.Holliger & G.Winteｒ，Current Op inion in Biotechnology 4 446-449 1993）における使用を包含する、多数の実 際的応用を有する。２価は抗体をマルチマーの抗原に大きい結合活性で結合させ ることができ、二重特異性は、例えば、漸増する細胞障害性Ｔ細胞において、２ つの抗原の架橋を可能として腫瘍細胞の殺しを仲介することができる（Staerz， U.D.，Kanagawa，O.およびBevan，M.J．（1985）Nature 314，628-631）。 二重特異性抗体の調製はこれまで複雑でありかつ困難であった。二重特異性ダ イアボディーはいっそう伝統的方法により作られた二重特異性抗体と同一の応用 において利用することができる。しかしながら、ダイアボディーはいっそう小さ くそして細菌中で発現されることができるという利点を有する。二重特異性および２価の抗体の調製および応用 二重特異性抗体（bisAbs）は、異なる特異性の２つの抗体からヒ ンジシステインの還元およびレドックス（最初のものとしてポリクローナル抗体 について示された）（Nisonoffら、Nature 194 ：355-358，1962）によるか、あ るいは対応するハイブリドーマの融合（Milsteinら、Nature 305 ：537-540，19 83）により従来作られてきている。不都合なことには、これは、また、重鎖およ び軽鎖を混乱させ、10までの異なる抗体種を生じさせ、そしてbisAbsをこの混合 物から単離しなくてはならない。あるいは、bisAbsはまた従来２つの異なる抗体 の化学的カップリングにより作られてきている。例えば、２つの異なるIgG分子 （Karpovskyら、J.Exp.Med．160 ：1686-1701，1984；Brennanら、229 ：81-83 ，1985）、Fab′断片およびIgG分子（Karpovskyら、J.Exp.Med．160 ：1686-170 1，1984）または２つの異なるタンパク質分解性Fab′またはFab′2断片がヒンジ システインを使用して架橋されてきている。 ２価の抗体は細菌中でFab′2断片として調製された（WO93／06217）。大腸菌 （E.coli）中の全ヘテロ四量体の発現の制限された報告が存在したが、この系の 一般的実用性はまだ示されてきていない（WO93／07896）。この系を使用して発 生された二重特異性抗体は種の複雑な混合物である。操作された二重特異性抗体分子の調製 操作されたbisAbsをFv，Fabおよび一本鎖Fv抗体断片（第１図参照）から生体 外および生体内でアセンブリングした。治療のために、IgGのFc部分はまたFcレ セプターを有する細胞をターゲッティングするので、抗体断片はIgGよりいっそ う特異性であるべきである（Lanzaveccia，A．およびScheidegger，D.，Eur．J. Immunol．1987，17：105-111）。さらに、より小さい抗体断片はIgGまたはFab′2 断片より容易に組織の中に浸透し、そしてまた血清からいっそう急速に除去さ れる（32，33）。これらの特徴は放射性ヌクレオチド または毒素を腫瘍にターゲッティングするために望ましいことがある。逆に、よ り長い血清半減期はエフェクター機能を漸増するために望ましいことがある。ダ イアボディーはこれまで作られた最も小さい二重特異性抗体断片であり、これら は腫瘍のそれらをより長く作ることが必要である場合、CH3ドメインとの融合を 使用してそれらの大きさを増加し、血清半減期を増加することができる。生体外の二重特異性抗体のアセンブリー Carterら（Biotechnology 10：163-167，1992）は、ヒト表皮成長因子レセプ ター２（p185HER2）に対して向けられたおよびCD3に対して向けられたFab断片を ジスルファイド結合により連鎖する二重特異性Fab2を合成した。このbisAbsはp1 85HER2を過度に発現する細胞の殺しを細胞障害性Ｔ細胞により仲介することがで きる。 ジスルファイド結合は、また、Fab断片を一緒にするカルボキシ末端の二量体 化ペプチドを使用して酸化により生体外で推進することができる。Kostelnyら（ J.Immunol．148 ：1547-1553，1992）は、FosおよびJunロイシンジッパーをこの 方法において使用した。レドックス緩衝液中で混合しそして透析することによっ て、ヘテロ二量体のFab断片（抗CD3-Fosおよび抗p55（IL-2R）-Jun）を優先的に アセンブリングすることができ、そして生成したbisAbsは細胞障害性Ｔ細胞を漸 増してIL-2レセプターを有する標的細胞を溶解することができる（Kostelnyら、 J.Immunol．148 ：1547-1553，1992）。 本発明により提供され、そして実施例１に示すように、二重特異性ダイアボデ ィーは生体外で２つの鎖を「クロスオーバー（crossover）」対合の可変ドメイ ンと一緒に混合することによって簡単にアセンブリングすることができる。生体内の２価および二重特異性抗体のアセンブリー いくつかのヒンジシステインをもつFab′断片の哺乳動物細胞（Neubergerら、 Nature 312：604-608，1984））または細菌（Skerraら、Protein Eng.4：971-97 9，1991））からの分泌は、２価のFab′2断片の制限されたアセンブリーに導く ことがある。ジスルファイド結合の形成は二量体化ペプチドを使用して促進する ことができる。例えば、カルボキシ末端の両親媒性らせんおよび単一のシステイ ン残基を使用して操作したscFv断片は、大腸菌（E.coli）からの分泌のときジス ルファイド連鎖した（２価）二量体を形成することが示された（Packら、Bioche mistry 31：1579-1584，1992）。両親媒性らせん単独の使用はモノマーと二量体 との間の平衡を発生する；ジスルファイド結合は二量体を安定化するために要求 される（38）。しかしながら、より安定な二量体化ドメインをジスルファイド結 合を必要としないで使用することもできる。例えば、安定なscFvホモ二量体は抗 体CH3ドメインを通して二量体化し、そして細菌から分泌させることができる（P .Holliger & G.Winter，1993前掲）。 二量体化のペプチドまたはドメインを使用する代わりに、bisAbsは、また、２ つの抗体を直接遺伝子のレベルで融合することによって構成することができる。 例えば、２つの一本鎖Fv断片は直列に柔軟性ポリペプチドにより連鎖して、細菌 から分泌のためのbisAbsを作ることができる（P.Holliger & G.Winter，1993前 掲）。他方において、多分４つの直列のドメインは、また、同一の鎖内で、ある いは事実他の鎖を使用して交互する（および正しくない）対合を形成することが できる。 P11-A ISアミノ酸リンカーを、二重特異性ダイアボディーの発生において、実 施例１に示すように構成体Ｎ−（VHA−VIB）−Ｃ／Ｎ −（VAB−VLA）−Ｃにおいて非共有結合的に連合されるドメインの交差（cross ）対合により使用することができる。しかしながら、このフォーマットにおいて 、二量体化の程度はモノマーおよびキメラscFvの形態の間の平衡に依存するであ ろう。 異なる鎖からの可変VHおよびVLドメインの対合に好適な短いリンカーの使用は 、ダイアボディーのフォーマットで二重特異性ダイアボディーを作ることが簡単 であることを意味する。ダイアボディーの２つの鎖は生体内または生体外で自発 的にアセンブリングする。ホモ二量体は二重特異性であるヘテロ二量体と同様に よく形成されるであろうが、ホモ二量体は機能的抗原結合部位を形成しないであ ろう。例えば、問題の２つの抗原の一方を使用するアフィニティクロマトグラフ ィーを使用して、正しい対合をもつ機能的ヘテロ二量体を不活性のホモ二量体か ら分離することができる。ダイアボディーの構造 ここで、われわれは、ダイアボディー、通常２つの抗原結合部位をもつ小さい 抗体断片のデザインを記載する。 ダイアボディーを構成する考えは、一部分、細菌から分泌されるscFv断片がモ ノマーおよび二量体の両方としてしばしば存在するというわれわれの観察により 剌激された（Griffiths，A.D.，Malquist,M.，Marks，J.D.，Bye，J.M.，Emblet on，M.J.，McCafferty，J.，Baier，M.，Holliger，P.，Gorick，B.，Hughes-Jo nes，N.，Hoogenboom，H.R.およびWinter，G.（1993）EMBO J．12，725-734，G. Winter，oral disclosure at Cardiff，September 1992）；参照、また、…Abst ract from 8th International Congress of Immunology，August 1992。しかし ながら、これらの一本鎖Fv二量体は２価のホモ二量体から成るように思われ、そ してこれらのホモ二量体の構造は明瞭ではない。本発明の１つの態様において、 われわれは２ つの異なるscFv断片に基づくヘテロ二量体を作る方法を提供する。２つの異なる 抗体ＡおよびＢの重鎖および軽鎖のＶ−ドメインを連鎖して２つの異なる「クロ スオーバー」鎖Ｎ−（VHA−VLB）−ＣおよびＮ−（VHB−VLA）−Ｃを形成するこ とによって、われわれは鎖が連合のとき両方の抗原結合部位を再びつくることを 示す。「クロスオーバー」鎖Ｎ−（VHA−VLB）−ＣおよびＮ−（VHB−VLA）−Ｃ をもつ二重特異性ダイアボディーを、また、構成して両方の抗原結合部位を再び つくることができる。われわれはこれを「逆」フォーマットと命名した。抗原結 合部位のアフィニティーが保持され、両方の結合部位が適切に再びつくられるこ とを示すことは、とくに興味あることである。さらに、調製されたヘテロ二量体 の断片は主として二量体であった。 他の態様において、重鎖および軽鎖の可変ドメインは同一鎖上の２つのドメイ ンの間の対合を可能としないリンカーにより接続され、例えば、それは短か過ぎ るためであり（事実ドメインは直接接続することができる）、したがってドメイ ンは他の鎖の相補的ドメインと対合させられ、そして２つの抗原結合部位をつく る。二量体のコンピューターグラフィックモデルにより示されるように、２対の ドメインは抗原結合部位を反対方向に向けて一緒にパックすることができる。２ 価の二量体のダイアボディーは、二重特異性二量体に加えて、短いリンカーを使 用して発生させることができる。VHドメインはVLドメインに対してＮ−末端であ ることができるか、あるいはVLドメインはVHドメインに対してＮ−末端（「逆」 ）であることができる。両方の場合において、VHおよびVLドメインの順序は最も 好ましくは同一であるべきである。ダイアボディー分子およびリンカーの長さのモデリング 短いリンカーは２つの鎖が連合することができる方法に対して主 要な拘束を付与する。したがって、われわれは抗原HELと複合したFabD1.3断片の Ｘ線結晶学的構造を使用して二量体のモデルを構成することを試みた（Fischman n，T.O.，Bentley，G.A.，Bhat，T.N．，Boulot，G.，Mariuzza，R.A.，Philipp s，S.E.V.，Tello，D．およびPoljak，RJ.（1991），J.Biol.Chem．266，12915- 12920）。コンピューターグラフィックスのプログラミングしたFRODO（Jones，T ．A.（1982），Computational Crystallography，Sayre D．編（Clarendon，オ ックスフォード，1982）pp．303-310）を使用して、Fv部分の２分子は一緒にさ れ、こうして各VHドメインのＣ−末端は各VLドメインのＮ−末端に対して密接に 並べられ（約７オングストロームのＣ−Ｎの距離をもつ）、そして５残基のリン カーの拘束を容易に満足した。２つのVHドメインは抗原結合部位から遠位のルー プにおいて一緒にドッキングすることができ、ここで悪い接触は眼により検出さ れずそしてプログラミングされたPROLSQ（Hendrickson W.A.およびKonnert，J.H .，“Structurｅ，conformation and evolution”Vol.1（Strinivarsan，R.編） PP.43-57（Pergamon，オックスフォード，1981））。 抗原結合部位は反対方向に向き、そして２組の対になったドメインは二軸によ り関係づけられる（第12図）。ブルックヘブン（Brookhaven）データベースの他 の抗体の結晶学的構造の検査は、それらがまた同様な方法でパックすることがで きることを示す（示されていない）。二軸（テイル対テイル）を横切る免疫グロ ブリンのドメインのパッキングは、最近の比較について、抗原またはIg上の上科 の構造におけるそれと異なる（参照、Jones，E.Y.，Davis，J.D.，Williams，A. F.，Harlos，K.およびStuart，D.I.（1992）Nature 360，232-239）。 このモデルを検査すると、VHドメインのＣ−末端をVLドメインの Ｎ−末端に直接接合することができ、そしてリンカーのポリペプチドを省略する ことができることが示唆される。これは２つのVHドメインが一緒にパックすると きそれらの間のわずかのつぶれを生ずることが期待されるであろうが、これらの 領域における主鎖の柔軟性によるか、あるいはVLドメインのＮ−末端のβ−鎖を キンクすることによって、歪みを解放することができるとわれわれは考えた。事 実、リンカーをもたない断片は二量体でありかつ二重特異性であることが証明さ れ（実施例１、表２）、提案されたモデルを支持した。phOxについての断片の結 合のアフィニティーおよび解離の反応速度論が変更され、ドメインの強制的パッ キンクは抗原結合部位における構造の変更に導くことができ、そして事実２つの 結合部位の抗原の結合が共同的（または抗共同的）であるダイアボディーを構成 できることを示唆する。NQ11／B1.8ダイアボディーの２つの抗原結合部位の間の 共同性は実施例４において示唆されており、そしてさらに後述する。 この特許に記載されている実施例は、ダイアボディー分子を異なる抗原特異性 をもつ種々の抗体の可変ドメインについて構成できることを証明する。０または ５アミノ酸のリンカー長さをもつ多数のダイアボディーを構成し、そして機能的 であることが示された。これらは次のものを包含する：２−フェニルオキサゾル −５−オン（phOx）（実施例１）；リゾチーム（実施例１）；腫瘍壊死因子（実 施例５および７）；HIVgp120のV3ループ（実施例４）；癌胎児性抗原（CEA）；F cレセプターFcγRIII（CD16）；ヒトFcレセプターFcγRI（実施例17）；BCL-1リ ンパ腫細胞系の表面Ig（実施例19）およびCD3抗原（実施例18）に対して向けら れた２価のダイアボディー。次のものに対して向けられた二重特異性ダイアボデ ィーを構成した：phOxおよびリゾチーム（実施例１）；phOxおよびNIP（４−ヒ ドロキシ−２−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸）（実施例３）；CEAおよびCD1 6；NIPおよびFcRI（実施例17）；BCL−１リンパ腫細胞系の表面IgおよびCD3（実 施例18）；HIVgp120のＶ３ループおよびヒトFcRI（実施例20）およびphOxおよび エストリオール（実施例11）。ある数のこれらは全細胞上のマーカーにCEA；CD1 6およびCD3に対して向けられたものを包含するFACS分析により結合することが示 された（実施例18）。 特定のクローニングした抗体をダイアボディーのフォーマットに変換しようと する場合、どれが最もよく働くかを見るためにリンカーの長さを変化させる（例 えば、０から上方に）ことは簡単なことである。同様に、異なる長さの置換は、 同一の長さであってさえ、有利であることがある。 また、実施例３においてわれわれが示すように、リンカーは抗原結合機能を保 持して−１に短縮することができる。１系列のマイナスリンカー分子（VLドメイ ンのＮ−末端またはVHドメインのＣ−末端からアミノ酸を欠失させることによっ てゼロより短いリンカーをつくって（−１）、（−２）および（−３）構成体を 形成する。−１よりさらにリンカーの長さを減少させると、これらの研究におい て使用するNQ11／D1.3ダイアボディーのみがフォルディングを妨害する。しかし ながら、（−２）リンカーが機能的である場合、異なるVHおよびVLドメインをも つダイアボディーの例が存在する可能性が残る。 実施例１に示すように、15アミノ酸のリンカーにより連鎖されたVH−VLポリペ プチドはダイアボディーのフォーマットにおいてモノマーとしておよび二量体と してそれらのVHおよびVLドメインを対合することができるが、５アミノ酸のリン カーをもつVH−VLポリペプチドはダイアボディーのフォーマットにおいて二量体 を形成するこ とによってそれらのVHおよびVLドメインを対合することができるのみである。VH およびVLドメインがダイアボディーのフォーマットにおいて（そして単一のポリ ペプチド内ではない）対合することができる、リンカーの長さの最大の限界をわ れわれはまだ決定していない。しかしながら、10アミノ酸のリンカーを使用する 実験は、VHおよびVLドメインがモノマーのポリペプチドにおいて対合することが できることを示唆する（実施例16）。 ダイアボディーの構造はコンパクトでありそして短いリンカーは剛性であるべ きである。柔軟性の欠如は２つの可溶性抗原の架橋か、あるいは細胞表面の抗原 および可溶性抗原の架橋を弱めると思われない。われわれは実施例13において、 二重特異性ダイアボディーによる天然のキラー細胞への腫瘍細胞の架橋を達成で きるという証拠を提供する。実施例９および15において、２価および二重特異性 のダイアボディーを使用して、抗原被覆された赤血球を凝集することができるこ とをわれわれは証明する。しかしながら、ある場合において２つの細胞の架橋に ついて、ダイアボディー分子の多少の柔軟性は有利であることがある。長いリン カーはダイアボディーのヘッドのより大きい柔軟性を可能とするが、また、同一 鎖内の対合およびモノマー断片の形成を可能とするであろう。３つの鎖の断片（ 第１図）におけるように、リンカーの一方を完全に破壊すると、高度に柔軟性の ヘッドが形成するであろうが、３つの鎖を緊密に連合して保持することはいっそ う困難であることが証明された。この３つの鎖の断片の構成および性質は実施例 １に記載されている。短いリンカーの距離の拘束をもつ二量体Ｎ−（VH−VL）− Ｃをわれわれはモデリングしたが、また、相互に交換される重鎖および軽鎖の位 置、すなわち、VHドメインに対してＮ−末端のVLドメインを除外して、まさに第 12図におけるように二量体Ｎ−（VL−VH）−Ｃをモデ リングすることができる。ダイアボディーのＮ−（VL−VH）−Ｃフォーマット（ 「逆ダイアボディー」）を構成し、そして効率よく発現されそして抗原に結合す ることが示された（実施例15）。対照的に、短いリンカーの拘束が与えられると 、われわれはヘテロ二量体としてＮ−（VH−VL）−ＣおよびＮ−（VL−VH）−Ｃ またはＮ−（VH−VH）−ＣおよびＮ−（VL−VL）−Ｃをモデリングすることがで きなかった。 ２つの異種鎖から構成されたダイアボディー、例えば、二重特異性ダイアボデ ィーについて、非対称リンカー、例えば、一方の鎖上に＋１、他方の鎖上に−１ をもつダイアボディーを調製できるであろう。事実、ISアミノ酸のリンカーを有 する１つの鎖および０の１つにより例示されるように、異なる長さの組み合わせ をもつ非対称ダイアボディーは可能である（実施例を参照のこと）。二量体にお いてポリペプチドのただ１つが、そのドメインの連合を防止する方法で連鎖され たそのドメインを有することが必要である。ダイアボディー分子のパッキング界面の修飾 前述のダイアボディーのモデルは、Ｎ−（VH−VL）−Ｃフォーマットのダイア ボディー中の２つのFv断片の２つのVHドメイン、あるいはＮ−（VL−VH）−Ｃフ ォーマットのダイアボディー中の２つのFv断片の２つのVLドメインの間にパッキ ング界面を生ずる（これは、一定ドメインが一定ドメインと制限された相互作用 を作るFab断片と対照的である）。例えば、共同的性質を変更することによって 、活性を調節することができるであろう２つのFvドメインの間の界面に残基を導 入することが可能であることがある。共同性 この出願において、２−フェニルオキサゾル−５−オンおよびNIPに対して向 けられたダイアボディーB1.8／NQ11の２つの部位の抗 共同的結合が存在できることをわれわれは証明し、これは共同的変化が一方のド メインから他方のドメインに転移され得ることを示唆する。抗原の結合後にモノ マーのFab断片中の個々のVH／VL対内にコンフォメーションの変化の例が存在す る（R.L.Stanfieldら、Structure 1 83-93，1993；J.N.Herronら、Proteins 11 159-175，1991）が、いずれかの抗体の２つの抗原結合部位の間の共同性が証明 されたのはこれが最初である。特定のアミノ酸残基の導入によりダイアボディー の結合部位の間の共同性の程度を増強（または減少）することが可能であろう。安定性 界面を横切るそれ以上の非共有結合的相互作用、例えば、塩の架橋、芳香族の スタッキング、水素結合、またはファンデルワールス接触またはジスルファイド 残基を通る共有結合的相互作用またはグルタミルリジン架橋を導入する残基の操 作は、ダイアボディーに余分の安定性を付与することができるであろう。この安 定性はダイアボディーの貯蔵半減期、あるいは血清または非水性溶媒中のその半 減期に対して有利であろう。短いリンカーにより強制されるような２つのドメイ ンのパッキングと、ダイアボディーの２つの鎖との相互作用は、また、モデルに より定められるような界面を横切るパッキングの相互作用により多分強制される ことができるであろう。この場合において、一本鎖Fv断片よりむしろダイアボデ ィーのフォーマットにおける鎖の連合に好適であるために短いリンカーを使用す ることは不必要であることがある。共同性および安定性の調節のために修飾すべきVHドメインの界面における残基 われわれは（VH−VL）D1.3ダイアボディーのモデルを検査し、そして修飾のた めにいくつかの残基を選択した。２つのVHドメインの 間の主要な相互作用はVHの２つのループにより形成される。これらのループの一 方はフレームワーク２の中に存在し、２つのVHドメインの残基43（VHD1.3中のリ ジン）は約５Ａ内に近づく。他方はフレームワーク３の中に存在し、このモデル における最も近い接近は残基86〜88においてであり、これらは隣接するVHドメイ ン上で残基86〜88および残基43に密接に近づく。したがって、これらの残基は安 定性および共同性を変調するための修飾の突然変異誘発のための強い候補である 。実施例22は界面が次のことを目的として修飾された例を与える： （i） イオン結合の導入 （ii） ジスルファイド架橋の導入 （iii）水素結合の数の増加 （iv） 疎水性相互作用の数の増加 （v）反発的相互作用の増加 イオン結合および水素結合は強い方向的要素であり、したがって含まれる残基の 向きに依存する。 VHドメインの間の相互作用に関係するループは、全抗体、一本鎖FvおよびFab 断片の中の極性の環境の中に通常存在する。したがって、水を排除することがあ るダイアボディー中のVHドメインの間の界面にこれらの残基が存在することは、 エネルギー的に不適切であろう。したがって、極性残基を疎水性残基と置換する と、ダイアボディーの界面のパッキングをいっそう剛性としかつ安定とすること ができる。 修飾を類似の方法でなすことができる逆ダイアボディーの場合において、一緒 にパックする２つのVLドメインの中の同様な位置に類似の残基が存在する。 導入することができる他の修飾が存在し得る。例えば、界面にお けるか、あるいはリンカー内のヒスチジンの導入は、pHまたは金属イオン濃度を 変化させて、互いに関するドメインの向きを変更させ、これにより結合のアフィ ニティーを調節することができる。 共同性の可能性は、また、例えば、VHおよびVLドメインの間のリンカーの長さ を変更することによって調節できる。これらは、また、リンカーの長さが非対称 であり、例えば、一方の鎖上で＋１、他方の鎖上で−１であるように、変更する ことができる。ダイアボディーの構造におけるジスルファイド架橋の使用 ジスルファイド架橋を使用してダイアボディー内の領域を共有結合的に連鎖す ることができる。 例えば、VL−VHダイアボディーのCLドメインの２つのＣ末端はジスルファイド 架橋により連鎖することができる。（VH−VL）D1.3ダイアボディーのモデルにお いて、VLドメインのＣ−末端は密接な近位にあり、これらの領域がジスルファイ ド結合により連鎖できるであろうことを示唆する。事実、Cys残基がNQ11（５残 基のリンカー）の２価の断片のVLドメインのＣ−末端に挿入されそして断片を記 載するようにphOx−BSAセファローズで精製したとき、非還元性SDS-PAGEおよび 溶離した断片のウェスタンブロッティングにより決定して、共有結合的に連鎖し た二量体が認められた（実施例23）。これが示すように、ジスルファイド連鎖さ れた鎖は抗原の結合において活性であり、われわれの提案したモデルを支持する 。これは細菌から分泌されたFab断片の間の分子間ジスルファイド結合の形成の 推進における成功の欠如と対照をなす（Glockshuber，R．Malia，M.，Pfitzinge r，I．およびPluckthun，A.（1990）Biochemistry 29，1362-1367）。 同様に、逆ダイアボディーのVHドメインのＣ末端におけるジスルファイド結合 の導入のための可能性が存在し得る。 さらに前述したように、（VH−VL）ダイアボディーのVHドメインの間の界面を 横切ってジスルファイド結合を導入することができる。 リンカー分子のいずれかの末端にシステイン残基を組み込むことによって、長 い、例えば、15リンカーのダイアボディーにおけるダイアボディーの形成を促進 することができる。次いで、これらのシステインはジスルファイド結合を形成し 、ペプチドのループアウトをもつ２残基のリンカーの同等体を得ることができる 。上のような（実施例23）およびメタロチオネインを含有するダイアボディー（ 実施例25）におけるVLドメインのＣ−末端におけるジスルファイド架橋の形成は 、このアプローチが実行可能であることを示唆する。対合VH／VLドメインの界面の修飾 抗原が抗体に結合するとき、ある場合においてコンフォメーションのシフトが 存在し得る。ダイアボディーのVH／VLの対の内部およびその間の、このコンフォ メーションの変化の移行の程度は、VHおよびVLドメインの間の相互作用の程度に 依存するであろう。 また、ダイアボディー分子の共同性を増強する、作ることができる修飾が存在 し得る。互いに相互作用しそしてVHおよびVLドメインが互いに関して動く容易さ を調節するように修飾すべき可能性を有する、ある数の残基がVHおよびVLドメイ ンの界面に存在する。これらの残基の修飾は、ダイアボディーの２つの抗原結合 部位の間の共同性の可能性を増強することができる。CH3ドメインをもつ融合体 各ダイアボディーはFab断片とほぼ同一の大きさである。例えば、血清中の保 持を増強するために、大きさを増加することは有利であろう。したがって、ダイ アボディーは他のタンパク質、または他の抗体ドメインに、例えば、抗体のCH3 ドメインを通して遺伝的に 融合して、VH−VL−CH3ホモおよびヘテロ二量体の鎖を形成することができる（ 実施例12に記載するように）。ダイアボディーの二量体 ダイアボディーは、また、ダイアボディー−二量体として、すなわち、４つの VH−VL鎖と化学的架橋により連鎖することができる。これは大きさが（Fab）2断 片に等しい。例えば、VLドメインのＣ−末端にＣ−末端のシステイン残基を導入 する（VL−VH二量体について）と、ジスルファイド結合（P.Carterら、Ｂiotech nology 10 163-167,1992）またはチオエーテル連鎖（M.J.Glennieら、J.Immunol ．139 2367-2375 1987）。これは４結合特異性、または２結合特異性（しかし各 々について２つの結合部位）、または単一の結合特異性（しかし各々の４コピー ）をもつ（Fab）2に似た断片を作る可能性を与える。このようなダイアボディー −二量体は（Fab）2断片と比較して増強された結合活性を有することができる。３以上のポリペプチドのマルチマー 三量体および四量体は、また、精製された２価のダイアボディー調製物（D1.3 、5残基のリンカー）において観察され（Fisch,I.，Holliger，P．およびWinter ,G.，未発表の結果）短いリンカーがマルチマーの形成と適合性であることを示 す。 二重特異性または三重特異性のFabγ３分子はヒンジ不含システインの生体外 カップリングによりFab′断片から構成されたが、われわれの観察によると、生 体内でアセンブリングする小さい三重特異性抗体断片をダイアボディーのデザイ ンに類似する方法で作ることができることが示される。３つの異なる抗体Ａ，Ｂ およびＣの重鎖および軽鎖のＶドメインを連鎖して２つの異なる鎖VHA−VLB，VH B−VLCおよびVHC−VLAを形成することによって、鎖は連合のとき３つの異なる抗 原結合部位を再びつくることができる。 短いリンカー（５残基）を使用してVHおよびVLドメインが連合しそしてダイア ボディーのデザインに類似する安定なFv断片を形成することが知られている抗体 を選択して、同一の鎖上のVHおよびVLドメインが互いに対合するのを防止すべき である。モデリング われわれは、抗原HELと複合化したD1.3抗原のFab断片のＸ線結晶学的構造を使 用して三量体のモデルを構成することを試みた（Fischmannら、前掲）。コンピ ューターグラフィックスのプログラムFRODO（Jonesら、前掲）を使用して、各VH ドメインがVLドメインのＮ−末端に対して密接に並置され、かつ５残基のリンカ ーの拘束を容易に満足するように、Fvタンパク質の３分子を一緒にした。ダイア ボディーのモデル（上を参照）と対照的に、トリアボディー（triabody）中の３ つの抗原結合部位は分子の同一面上に位置し、そして三軸により関係づけられる 。 VLドメインのＣ−末端のすべては分子の対向する面上にかつ互いから距離を置 いて位置する。Ｃ−末端にシステインを導入することによって、２つのトリアボ ディーを架橋させて、IgGとほぼ同一の分子量の６価の分子を形成することがで きる。 Ｃ−末端の間の距離は、ダイアボディーについてと類似する方法で分子内ジス ルファイド架橋を形成する可能性をなくする。 トリアボディーの構造は、ダイアボディーの構造よりもコンパクトではなくそ していっそう柔軟性であると思われる。事実、結合部位は分子の２面の間でフリ ップ−フロップすることができると思われる。トリアボディー分子の可能なコン フォメーションは平らであり、３つの結合部位が平面の中に互いから120゜の角 度で位置する。 分子の中心は孔を含有する。分子の界面または中央の孔における 架橋（例えば、ジスルファイド結合、金属結合部位）を使用して、安定性を増加 しそして断片をいっそう剛性とすることができる。３つのFvドメインの間の堅固 な連鎖は、３つの結合部位の抗原の結合が共同的（または抗共同的）であるトリ アボディーの構成を可能とする。 二重特異性の３鎖のダイアボディーの構成体（VII、上を参照）に類似するよ うに、４鎖のトリアボディーの構成体を想像することができ、ここで、例えば、 ３つの可溶性ドメイン；VHA，VLBおよびVHCは１つのポリペプチド鎖上にエンコ ードされたVLA−VHB−VLCドメインとアセンブリングすることができる（他の組 み合わせは同様に可能である）。しかしながら、このような構成体は希釈のとき 解離するいくつかのFv断片の傾向により制限されることがある。応用 本発明により提供される分子の応用および実用性のここにおける説明において 、「ダイアボディー」に対する一般的言及は、ダイアボディーが２価または二重 特異性であるかどうかにかかわらず、マルチマー、例えば、適当ならばそして適 当な変更を加えて、三量体の「トリアボディー」などを包含する。エフェクター機能の漸増および腫瘍細胞の処置 二重特異性抗体は、細胞障害性Ｔ細胞または天然のキラー（NK）細胞の強力な エフェクター機能を漸増する特定の用途を見出した。こうして、bisAbsはＴ細胞 のコレセプター（CD3）（Staerzら、Nature 314 ：628-631，1985）またはFcRII I（CD16）（DePalazzoら、Ce11 Immunol．142 ：338-347，1992）および標的細 胞の細胞表面の抗原を架橋して、細胞障害性Ｔ細胞はまたNK細胞による標的細胞 の殺しを仲介するために使用されてきている。マウスにおいて、このよ うな抗CD3bisAbsは充実腫瘍の増殖を阻害する（Titusら、J.Immunol．138 ：401 8-4022，1987，Garridoら、Cancer Res. 50：4227-4232，1990）か、あるいはリ ンパ腫を根絶することさえできる（Brissinckら、J.Immunol．147 ：4019-4026 ，1991）；それらは悪性グリオームに対して使用されてきている（Brissinckら 、J.Immunol．147 ：4019-4026，1991）。二重特異性抗体は、また、骨髄から白 血病細胞を半ビボのパージングのために使用されてきている（T.Kanekoら、Bloo d 81 1333-1341，1993）。 生体外で合成された二重特異性抗体は、また、酵素、抗原、毒素、ラジオヌク レオチドおよび細胞障害性薬物を腫瘍細胞に送り出すために使用されてきている （参照、12-14；M.A.Bonardiら、Cancer Res．53 187-199 1992）。腫瘍の像形成 二重特異性抗腫瘍マーカー、抗ハプテン抗体は腫瘍を像形成するために使用さ れてきている（J.M.LeDoussalら、Int.J.Cancer Supplement 7 58-62，1992；P. Peltierら、J.Nucl.Med．34 1267-1273 1993；C.Somasundaramら、Cancer Immun ol．Immnother．36 337-345，1993；A.Bruynckら、Br.J.Cancer 67 436-440，19 93）。第１に、抗体を注射しそして腫瘍マーカーへの結合により腫瘍に対して局 在化する。次いで、放射性標識化ハプテン、例えば、99Ｔまたは111Inとの金属 キレートを注射し、これは二重特異性抗体への結合により、腫瘍に対して優先的 に局在化し、腫瘍の像形成を可能とする。同様に、腫瘍細胞に対して特異性の１ つのアームおよび金属キレートに対して特異性の１つのアームをもつダイアボデ ィーを使用して、放射性金属イオン、例えば、90Ｙのキレートを癌の治療のため に送り出すことができる。他の応用 二重特異性抗体は、腫瘍細胞のターゲッティングを越えて拡張するある数の実 験の目的を達成するために利用されてきている；血栓崩壊は凝血塊に組織プラス ミノゲンアクチベーターをターゲッティングすることによって増強された（15） ：細胞培養におけるヒト免疫不全ウイルス（HIV）−１の増殖はウイルスをFcレ セプター（それらの正常のレセプター、CD4、ではなく）に向けることによって 阻害された（16，17）：非許容性ヒト細胞系は主要な組織適合性複合体（MHC） クラスＩおよびII細胞−表面タンパク質に対するウイルスの連鎖によるマウスレ トロウイルスにより感染された（18）。bisAbsは、抗原を抗原提示細胞に架橋さ せるために使用するとき、アジュバントとして作用することが発見された（14， 19）。 抗FcgRIII抗体デング熱ウイルスbisAbは、感染すべき細胞とウイルスを密接に 接合させることによって、ウイルス感染性を増強するために使用された（B.J.Ma dyら、J.Gen.Virol．74 839-844，1993）。ダイアボディーのいくつかの実用性 二重特異性抗体は癌および他の疾患の治療において大きい可能性を有するよう に思われるが、それらの生産および精製における困難はそれらの応用を制限した 。それらの使用は、二重特異性断片の調製に関係する努力の量が価値がある、困 難な治療上の問題に制限される傾向がある。本発明において記載されるダイアボ ディーは二重特異性抗体の生産方法を簡素化し、そしてこれはそれらを使用でき る応用範囲を大きく拡張する。 二重特異性ダイアボディーは、例えば、ダイアボディーの一方のアームがエフ ェクターの機能を誘発しそして他方のアームが細胞、ウイルスまたは細菌をター ゲッティングする、前述したように、二重特異性抗体が使用されてきている、事 実上任意の応用のために使 用することができる。ターゲッティングのエフェクターの機能について、一方の アームはヒトIgGレセプター（FcγRI，FcγRII、およびFcγRIII）またはIgEレ セプター（FcεRIおよびFcεRIII）に対して向けることができる。高いアフィニ ティーFcγRIレセプターについて、断片はIgGのFc部分によりブロックされない エピトープに対して向けられるべきである。ダイアボディーは、また、ヒトＴ細 胞抗原、例えば、CD3に結合することができるが、Ｔ細胞を活性化して殺しを誘 発することが必要であろう。エフェクターのアームは、また、放射性同位元素、 例えば、キレートと複合化した放射性金属イオン、または放射性ヨウ素化ハプテ ンの結合によるか、あるいはプロドラッグを切断することができる酵素への結合 により提供することができる。 ２価（および二重特異性）のダイアボディーは、また、赤血球の凝集の診断ア ッセイのように、多数の相互作用を作ることによって、細胞、細菌またはウイル スの凝固のために使用できるであろう。また、二重特異性ダイアボディーは、例 えば、特定の細胞の中に遺伝物質を導入する遺伝子のターゲッティングのために 細胞にレトロウイルスをターゲッティングするために、異なる粒子の間の架橋を 形成するために使用できるであろう。ダイアボディーは、また、同一表面、例え ば、ウイルスのコート上の２つのエピトープに同時に結合して、ウイルスに高い 結合活性で結合しそしてウイルスの脱外被をブロックすることができる；あるい はCD3抗原を架橋させることによってＴ細胞を活性化することができる。実施例 ９および15に記載するように２価および二重特異性のダイアボディーによる抗原 被覆赤血球の凝集は、これらのアプローチが実行可能であることを示唆する。こ れは実施例13における腫瘍細胞の細胞溶解により支持される。同一レセプターの ２つの鎖、例えば、IL2−レセプターの αおよびβ鎖に対する特異性をもつダイアボディーを使用することができる。同 一ポリペプチド上の２つの異なるエピトープに対して向けられた二重特異性ダイ アボディーは、その鎖に余分の特異性および結合活性を与えることができる。ま た、ダイアボディーは、マトリックスの１成分に対して向けられた一方の結合部 位および問題の抗原に対して向けられた他方の結合部位を設けることによって、 抗原のアフィニティクロマトグラフィーのためのマトリックスを作るとき使用で きる。この原理は、表面、例えば、表面のプラスミノゲンの共鳴を使用するか、 あるいは消散する波の検出を使用する結合の検出の研究において使用されるチッ プ上の抗体の固定化に拡張することができる。一方の特異性はチップ表面上のマ トリックスに対して向けられることができるが、他方のアームはチップの表面の 外に向けられて抗原を使用する結合の研究を実施可能とする。 抗体断片の表示のためのレトロウイルスの使用（S.J.Russell，R.E.Hawkinsお よびG.Winter，Nucl.Acids Res．21 1081-1085，1985）をダイアボディーの表示 に適応することが可能である。例えば、レトロウイルスは腫瘍細胞の結合のため に結合活性を増加するために２価のダイアボディーを表示することができる。 ダイアボディーは、薬物を送り出す一方の結合部位および腫瘍に結合する他方 を使用するか、あるいはP.A.Trailら（Science 261 212-215，1993）による腫瘍 へのドキソルビシンの送り出しについて記載された系に類似する系を使用して、 腫瘍細胞に細胞障害性薬物を送り出すことができる。これらの著者は、ドキソル ビシンに共有結合的に連鎖した、ルイスＹ抗原に対して向けられた抗体を使用し 、これはリソソームおよびエンドソームの中に内部化されていた。連鎖はこれら の環境において切断されて、薬物をこれらの細胞に送り出すことができる。２価 のダイアボディーは腫瘍細胞のための 抗体の結合活性を増加するために有用である。特異性は２つの異なるマーカーに 対して向けられた二重特異性抗体の使用により増加することができる。いずれか のFHA、細菌百日咳菌（Bordetella pertussis）の付着に対して、あるいは白血 球の付着分子のCR3のための天然のリガンドに対して向けられた一方のアーム（E .I.Tuomanenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 7824-7828，1993）をもつ二重特異 性ダイアボディーを使用して血液脳関門を横切ってダイアボディーを送り出すこ とができ、次いで他方のアームを標的に対して向けて治療的機能を提供すること ができる。 腫瘍の像形成のために、キレート化される金属イオンの導入により標識化する ことができ、そしてここでキレートは一方の結合部位に結合するか、あるいはVH およびVLドメインの間のリンカーの一部分として、あるいは延長部として取り込 まれる追加のペプチドにより標識化することができる。 ２価の抗体は、例えば125Ｉ標識化抗体を使用する腫瘍抗原の結合により腫瘍 を局在化するとき、像形成の目的のためにとくに有用である。抗原のための２つ の結合部位の存在は、バックグラウンドと比較して腫瘍からのシグナルを増加で きる結合活性成分を与えるであろう。腫瘍細胞の表面上の２つのマーカーに対す る二重特異性は、また、バックグラウンドと比較して腫瘍特異性像形成シグナル の増加を助ける。また、一方のアームが腫瘍細胞表面のマーカーに対して向けら れそして他のアームが腫瘍細胞から脱落するが、腫瘍細胞付近に高い濃度で見出 される抗原に対して向けられている、二重特異性抗体を使用することは有利であ る。 抗体が通常の環境下に特異性をもたない部位または抗原に対して抗体を再ター ゲッティングするとき、ダイアボディーを使用できる。ダイアボディーは２つの 特異性を有するであろう：一方は標的部 位に対する特異性、他方は抗体分子の選択した部分に結合することができる。こ の方法において、抗原の標的に対する特異性をもたない抗体をダイアボディーを 介して抗原に近位させる。これの原理は循環の中の抗原を体内の部位、例えば、 腫瘍に再ターゲッティングし、そして自己免疫疾患により例示された不適当な免 疫応答をブロックするために有利であり、そしてエフェクター機能の漸増を可能 とするであろう。 このようにして、ダイアボディーは全抗体鎖への結合によりエフェクター機能 を漸増するために使用できるであろう。１つのアームは治療のための抗原に対し て向けられ、そして第２のアームはエフェクター機能の漸増のために全抗体に対 して向けられるであろう（参照、実施例21）。Ｖ−ドメイン（およびＶ−ドメイ ンを含有する断片）は抗原との相互作用について大きい責任を負うが、Ｃ−ドメ インはエフェクター機能を漸増する。漸増されるエフェクター機能の型はＣ−ド メインのクラス（アイソタイプ）により大きく支配される。例えば、IgGl（γ１ ）アイソタイプのＣ−ドメインは細胞表面における相補的カスケードを誘発する ことによって細胞を殺し、溶解を発生させることができ、そして、また、特殊化 された食細胞およびキラー細胞上のＣ−ドメインのレセプター（Fcレセプター） に結合することができる。対照的に、IgG4（γ４）アイソタイプの抗体はエフェ クター機能を活性的に妨害し、これにより免疫応答をブロックするように思われ る。 ２つの抗原結合部位が密接に一緒に連鎖されているダイアボディーのフォーマ ットは、二重特異性抗体から区別される他の可能性、または細菌において生産さ れる他の二重特異性抗体断片を提供する。２つの結合部位の一緒のパッキングは アフィニティーの増強に導くことができる；そして一方の結合部位における抗原 の結合は他方 における結合の増強または減少に導くことができる。この特徴は、次により例示 されるように、あるシグナルに対する応答における活性のオンまたはオフの切り 替えのための、「条件的」スイッチの構成を可能とするとき望ましいことがある ； （１）分析物および酵素に対するダイアボディーを使用する、均質アッセイ。 こうして、１端における分析物への結合は他端における酵素の解放を誘発するこ とができる。酵素の活性がダイアボディーの結合により阻害された場合、その解 放は酵素の活性の増加を引き起し、これは着色した基質または蛍光性の基質によ り検出できるであろう。あるいは、ダイアボディーの他端はアポ酵素の活性のた めに要求される補欠分子族を解放できるであろう。逆に、ダイアボディーは分析 物の結合により誘発されて酵素に結合し、これによりその活性をオンにする。 （２）前述の均質アッセイに類似する、プロドラッグの活性化。腫瘍細胞のマ ーカーの結合が酵素への結合のための他端の活性化に導くダイアボディーを作る ことができるであろう（これは細胞表面の結合した抗体のみが酵素に結合すると いうことにおいて、簡単な二重特異性ダイアボディーを越えた利点であろう）。 他の特徴、例えば、酵素へのダイアボディーの結合がその触媒活性を誘発すると いう特徴を、また、導入できるであろう。アロステリック抗体の選択 アロステリック抗体を二重特異性レパートリーから選択により単離できるであ ろう。このようなアロステリック抗体は第１抗原への結合により選択し、そして 第２抗原の添加により溶離することができる。これは第１部位における結合のア フィニティーが第２部位の占有により減少するものを選択するであろう。同様に 、選択は第２抗原の添加のときの第１抗原との改良された相互作用によることが できる。ダイアボディーを使用する凝集のためのフォーマット 前述したように、２価および二重特異性のダイアボディーは、細胞、細菌また はウイルスの凝固のために、赤血球の凝集の診断アッセイを使用するときのよう に、多数の相互作用を作ることによって使用できるであろう。細胞表面の上によ く暴露される抗原、例えば、血球グループＢ抗原について、単一のダイアボディ ー分子を使用して細胞を直接凝集することが可能である。しかしながら、よく暴 露されない抗原を使用して凝集するか、あるいは凝集の一般的効率改良するため に、架橋する分子のスパンを増加することが望ましいであろう。次のものを包含 する、ダイアボディーを使用してこれを実施できるある数のフォーマットが存在 する。 （ｉ）２つの連鎖するダイアボディー分子：例えば、使用する２つの抗体は次の ものであることができる： ダイアボディー１−一方の特異性は血球表面の抗原（部位１）に対して向けら れておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対して向けられ ているので、この結合部位（部位２）は自由である。 ダイアボディー２−一方の特異性は第１ダイアボディー上の部位２に対して向 けられた抗イディオタイプ（部位抗−２）でありそして他方の特異性は血球表面 の抗原（部位１）に対して向けられている。 このフォーマットは血球の凝集を可能とし、スパンされた距離は第２図に示す ように２つのダイアボディー分子の長さである。 （ii）３つの連鎖するダイアボディ一分子：例えば、連鎖において使用する分子 は次のものであることができる： ダイアボディー１−一方の特異性は血球表面の抗原（部位１）に 対して向けられておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対 して向けられているので、この結合部位（部位２）は自由である。 ダイアボディー２−両方の特異性は第１ダイアボディー上の部位２に対して向 けられた抗イディオタイプである（部位抗−２）。 このフォーマットにおいて、ダイアボディー１の２つの分子が異なる赤血球に 結合するとき、ダイアボディー２は部位２においてこれらのダイアボディー１の 分子の各々に結合することができ、こうして第３図に示すように２つの赤血球の 間の距離をスパンする３つのダイアボディー分子の複合体を形成する。 （iii）連鎖を作る２つのダイアボディー分子および１つの非ダイアボディー分 子 ：例えば、連鎖において使用する分子は次のものであることができる： ダイアボディー１−一方の特異性は血球表面の抗原（部位１）に対して向けら れておりそして他方の特異性はアッセイに添加すべき他の非ダイアボディー抗原 （部位２）に対して向けられている。 非ダイアボディー抗原分子−これはダイアボディー１の部位２が向けられる大 きい分子である。好ましい分子は多数の同一のエピトープを有し、例えば、マル チマー、例えば、大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼ、200kDの四量体は 抗原であることができるであろう。他の方法は、ハプテンで誘導した大きい分子 の多重性、例えば、２−フェニルオキサゾル−５−オンで誘導したチログロブリ ンを使用することであり、そしてダイアボディー１の部位２について２−フェニ ルオキサゾル−５−オンに対して向けることであろう。非ダイアボディー抗原分 子は血液の中に通常見出されない分子、例えば、ハプテンであることが好ましい であろう。このフォーマットにおいて、ダイアボディー１の２つの分子は２つの 異なる細胞に 結合する。非ダイアボディー分子は赤血球を架橋する部位２を通して両方のダイ アボディー分子に結合するであろう（第４図）。 種々の異なる大きい分子をこの凝集のために使用することができ、例えば、ダ イアボディー１の第２部位は、多分凝集する細胞と異なる種からのものである、 IgMのＣμ領域に対して向けることができるであろう。 この同一のフォーマットを使用することが可能であろうが、ダイアボディー２ は部位１を通して血球表面の抗原と結合するが、その第２部位を通して非ダイア ボディー抗原分子上の異なるエピトープと結合して、同様な形状寸法をもつ架橋 した複合体を発生する。 プロテインＡを２つのダイアボディー分子の間のリンカーとして使用できるで あろう。プロテインＡはヒトVH3族のＶドメインのフレームワーク領域に結合し そしてVH１族のある種のＶドメインに結合し、そしてこれらの族から誘導された ダイアボディーを架橋するであろう。 （iv）架橋反応において完全な生物を使用する 上の場合において、凝集のための連鎖する分子はタンパク質分子である。この 原理は生物、例えば、バクテリオファージＭ13または細菌、例えば、大腸菌（E. coli）を架橋に使用することに拡張できる。 上のフォーマット（iii）において、ダイアボディー１の部位１を細胞表面の マーカーに対して向けそして部位２をバクテリオファージ表面の分子、例えば、 遺伝子８タンパク質に対して向けることができる（第５図）。 このようなダイアボディーは、例えば、細胞表面のマーカーおよび遺伝子８タ ンパク質に対してレイズされた前もって単離した抗体から構成できる。しかしな がら、ファージ表示法を使用してこのよ うな抗体を選択することが可能であろう。ダイアボディーは、細胞表面のマーカ ーおよび遺伝子８タンパク質の両方に対する特異性をもつ、ファージゲノム内の 可溶性断片として発現させることができるであろう。次いで、このダイアボディ ーはファージの表面上に表示されるであろう。別法はペプチド標識配列、例えば 、ｃ−myc標識を遺伝子８タンパク質の中に組み込むことであり、そして標識に 対して向けられたダイアボディーの第２特異性を有してそのファージ表面上の表 示を可能とする。これらのフォーマットにおいて、凝集のために適当な細胞表面 に対する抗体ファージ表示ライブラリーから直接選択することができ、ここで一 方のVH／VL対は可変ドメインのレパートリーから誘導され、そして他方のVH／VL 対は遺伝子８タンパク質または標識への結合を可能とする。遺伝子３タンパク質 は遺伝子８タンパク質に対する代替物として使用できるであろう。 （ｖ）可溶性抗原をアッセイする方法としての凝集 フォーマット、例えば、上の（iii）に記載されているフォーマットは可溶性 抗原を測定する手順において代わりに使用できるであろう。この場合において、 既知の細胞表面のマーカーをもつ細胞は試薬として使用され、そして凝集の程度 は存在する可溶性抗原の量に依存するであろう。 この原理は、結合したハプテンをもつ抗体を認識する部位をもつダイアボディ ーを使用するハプテンのアッセイに拡張できるであろう。このフォーマットにお いて、２つのダイアボディーが存在する： 細胞表面のマーカーを認識する部位１およびハプテンを認識する部位２をもつ ダイアボディー１。 細胞表面のマーカーを認識する部位１および結合したハプテンをもつダイアボ ディー１を認識する第２部位をもつダイアボディー２ 。 可溶性抗原を測定するこれらの方法はダイアボディーがそれに対して向けられ た細胞を使用することに拘束されず、凝集のために適当な任意のフォーマット、 例えば、ラテックスビーズを代わりに使用できるであろう。三量体 ３価または三重特異性のトリアボディーは、ある数の応用においてダイアボデ ィーまたは他の二重特異性抗体を越えた利点を有することができる： より高い柔軟性および１つの面に向いた３つの結合部位は、３価値のトリアボ ディーを反復したエピトープを表示する表面に大きい結合活性をもって結合する ために理想的とすることができる（IgMに類似する）。３倍の対称は、多数のウ イルスのコートタンパク質における普通の３倍の対称によく似るので、ウイルス への結合においてとくに利点をもつことができる。 トリアボディーは同一の可溶性分子（例えば、タンパク質またはタンパク質ア センブリー、生物学的に活性なペプチドなど）上の異なるか、あるいは同一であ るエピトープに結合し、診断および治療の目的に有用な非常に高いアフィニティ ーおよび特異性に導くことができる。（有機化学において、この効果はすぐれた 特異性およびアフィニティーをもつそれらのリガンドに結合するキレート、クリ プタントまたはクラウンエーテルと命名される分子において利用される。） エフェクターの機能（CD3またはCD16による細胞障害性Ｔ細胞、FcRによるマク ロファージおよび顆粒球）は、トリアボディーによりいっそう効果的に漸増する ことができる： （１）抗原剌激を受けていないＴ細胞は、Ｔ細胞上の２つのCD3 分子の架橋（Tutt91）またはCD3とCD28との架橋（Jung91）により活性化するこ とができる。 （２）細胞障害性細胞および活性化サイトカイン（IL−１，IL−２，IFNγ，T FNα，GM-SFなど）を同一細胞にターゲッティングすることによる細胞障害性の 増大。 （３）同一エフェクター（例えば、毒素、ラジオヌクレオチド、プロドラッグ 変換酵素、相補的成分など）の２つのコピーまたは２つの異なるエフェクターの １つのコピーをターゲッティングすることができる。 （４）より高い特異性は、標的細胞表面上の２つの異なるマーカーを認識する か、あるいは２つの同一のマーカーを結合活性的に結合することによって達成す ることができる。標的細胞上の２つのマーカーの架橋は、また、例えば、遺伝子 治療のために毒素またはレトロウイルスをターゲッティングするとき有益である 、エンドサイトーシスを促進するであろう。 （５）２つの異なる組の細胞障害性細胞（キラーＴ細胞、NK細胞、マクロファ ージなど）は同一標的に対して漸増することができる。ダイアボディーのレパートリーの構成およびバクテリオファージ上のそれらの表 示 ファージ上の２価および二重特異性のダイアボディーの表示は、ファージ上の 抗体の抗原を使用する選択力（WO92／01047；J.McCaffertyら、1990、前掲；H.R .Hoogenboomら、Immunol.Rev.130，41-68，1992）を、Ｖ遺伝子のレパートリー からのダイアボディーの直接選択および突然変異誘発または鎖シャフリング（Sh uffling）による改良されたダイアボディーの選択に適用可能とする。２価のダ イアボディーは、例えば、VH−VLまたはVL−VHドメインをファージ遺 伝子３タンパク質に直接融合することによって、ファージ上で表示させることが できる。最後のＶ遺伝子およびファージ遺伝子３の間で、アンバー停止コドンを 挿入してサプレッサー（supE）大腸菌（E.coli）株において不完全の読み過ごし に導くことができる：結局いくつかの可溶性鎖が生成され、これは遺伝子３タン パク質に融合した鎖と対合して２価の抗体を形成できる。あるいは（しかし好ま しさに劣るが）、部分的生体内のタンパク質分解的切断に対して感受性である部 位はVH−VLおよび遺伝子３の接合において操作することができる。Ｖ遺伝子／遺 伝子３接合におけるタンパク質分解はいずれにしても自然に起こる（抗体を表示 するファージのウェスタンブロット分析から明らかである；WO92／01047；J.McC affertyら、1990、前掲）ので、常に多少の可溶性VH−VLまたはVL−VHタンパク 質が存在するであろう。 同様に、二重特異性レパートリーは、１つのVH−VLまたはVL−VHの組み合わせ をファージ遺伝子３タンパク質（例えば）に融合し、そして合致するVH−VLまた はVL−VHの組み合わせを可溶性断片として発現させることによって、作ることが できる。二重特異性リパートリーにおいて、１つの断片を可溶性断片として発現 させることが必要であるので、抗体−遺伝子３接合においてアンバーコドンを存 在させるという絶対的要件は存在しない。 ２価または二重特異性のレパートリーは、また、３分子のアセンブリーとして ファージ上で構成しかつ表示させることができ、１つのVH−VL分子はファージ遺 伝子３に融合されておりそして合致するVHおよびVL遺伝子の両方は可溶性（しか し別の）タンパク質として生成した。最後に（しかし好ましさに劣るが）、２価 または二重特異性のレパートリーは、両方のVH−VLまたはVL−VHの組み合わせを 遺伝子３に融合し、そして操作したアンバーコドンまたは操作した または天然のタンパク質分解に頼って、２価／二重特異性のダイアボディーを形 成するために十分な可溶性Ｖ遺伝子の組み合わせの物質を生成することによって 、構成することができる。 scFvまたはFabレパートリーの構成と同様に、種々のＶ遺伝子のレパートリー はダイアボディーのレパートリーをつくるための出発点として使用することがで きる（H.R.Hoogenboomら、1992、前掲）。ダイアボディーのレパートリーは、免 疫化または「天然の」二量体（Ｖ遺伝子は末梢血液リンパ球からか、あるいは骨 髄または牌臓から単離される）から、ハイブリドーマのプールから、生体内また は生体外の免疫化により抗原バインダーについて多分濃縮されたEBV形質転換さ れた血球からか、あるいはクローニングされた生殖細胞系遺伝子を使用して生体 外（再）構成されたＶ遺伝子からのＶ遺伝子のレパートリー、あるいはこれらの レパートリーの任意の組み合わせから直接作ることができる。 これらのＶ遺伝子のレパートリーを使用して、２価および／または二重特異性 のダイアボディーのレパートリーを種々の方法で構成することができる。われわ れは、ここにおいて、ある数の異なるアプローチを論考するが、詳細にかつ概念 的に異なることがある、多数の他の方法を使用できるであろう。 ２価のダイアボディーを構成するために、Ｖ遺伝子のクローニングは、２つの Ｖ遺伝子ドメインの各々の５′および３′末端に制限部位導入した後、適合性部 位および必要に応じてダイアボディーのフォーマットで遺伝子を一緒に接合する ための短いリンカーをエンコードする配列をもつベクターの中に段階的にクロー ニングすることによって実施することができる（第６図、ルートＩ）。あるいは 、PCR反応およびPCRアセンブリーを使用することによって、VHおよびVL遺伝子の レパートリーを一緒に連鎖しそして直接クローニン グすることができる（第６図、ルートII）。これはＶ遺伝子配列またはダイアボ ディーのリンカー配列と適合性の制限部位をデザインする必要性を回避する。制 限部位、アクセプターファージミドおよびオリゴヌクレオチドのプライマーの正 しいデザインにより、リンカーの配列の任意の長さがＶ遺伝子の間である、VH− VLまたはVL−VHダイアボディーを構成することができる。 クローニングしないおよび未選択のＶ遺伝子のレパートリーから出発する代わ りに、２価のダイアボディーのレパートリーは、また、最初にscFvまたはFab断 片として発現された、VHおよびVL遺伝子を一緒に連鎖することによって得ること ができる。これらはファージ上に表示された（そして可能ならば抗原上で選択し てバインダーについて濃縮された）Ｖ遺伝子のレパートリーから誘導することが できる（第６図、ルートIIIおよびIV）。例えば、VH遺伝子および３′末端およ びVL遺伝子の５′末端における制限部位を適当にデザインすることによって、sc Fv構成体中の標準の15残基のリンカーを簡単な切断およびペーストクローニング により欠失して、ダイアボディーのレパートリーを生成することができる（第６ 図、ルートIIIb）。あるいは、scFvおよびFabフォーマット中のＶ遺伝子のレパ ートリーを再増幅しそして段階的にクローニングするか、あるいは使用するオリ ゴヌクレオチドに依存してPCRアセンブリーにより一緒に連鎖することができる 。 １つの「ヘルパー」の特異性が一定である、二重特異性ダイアボディー、例え ば、抗CD16特異性（天然のキラー細胞上のCD16抗原に結合する）または抗腫瘍細 胞連合抗原を構成するために、キャリヤーベクターをつくって、これらの特異性 （VH−CおよびVL−C）と二重特異性フォーマットにおいてVHおよびVLドメインの レパートリーと急速に組み合わせることができる（第７図、ルートＡの第１工程 ）。このアプローチにおいて、適当な「ヘルパー」Ｖ遺伝子（VH−CおよびVL−C ）およびＶ遺伝子のレパートリーの直接クローニングのための制限部位を有する ２つのプラスミドベクターをつくる。クローニングはVH−レパートリーがVL−C に連鎖され、そしてVL−レパートリーがVH−Cに連鎖されるように実施する。こ の方法は１つの一定の特異性をもつライブラリーの構成を可能としそしてこれと 組み合わせて、新しい特異性の選択を可能とする。例えば、抗Fcレセプター抗体 をレパートリーと組み合わせ、腫瘍細胞上で選択し、そしてFcレセプターを有す る細胞を生体外アッセイにおいて腫瘍細胞に特異的にターゲッティングする特異 性について選択することができる。 ダミーとして「ヘルパー」Ｖ遺伝子を使用することによって、これはアプロー チは、また、ダイアボディーの両端にレパートリーをもっ二重特異性ダィアボデ ィーを構成するために使用することができる（第７図、ルートＡ）。２つのダイ アボディーのレパートリーを作り、１つはレパートリーＡを有しそして１つはヘ ルパーＶ遺伝子の組み合わせから成り、そしてレパートリーＢから成る１つと任 意の他のヘルパーＶ遺伝子の組み合わせから成る。レパートリーはバインダーを 特異性ＡまたはＢについて濃縮するように選択し、そして引き続いて相互にフォ ーマット化されかつ選択されたレパートリーＡの中にクローニング（余分のPCR を必要としないで）することができる。このクローニング手順とscFvアプローチ （第７図、ルートＣ）との差は、選択をダイアボディーのフォーマットにおいて 直接実施することである。他の差は、scFvアプローチにおいて、再クローニング したＶ遺伝子をシャフリングするが、このアプローチにおいては、VHおよびVＬ 遺伝子が対合を常に保持することである（第１クローニング工程により決定され る；VH−AはVL−Aとともに 止まり、VH−BはVL−Bとともに止まる）。このアプローチによると、例えば、特 定の特異性、例えば、前述したように抗CD16特異性をエンコードすることができ 、そして必要に応じて他の「ヘルパー」Ｖ遺伝子と容易に組み合わせることがで きる、ヘルパーＶ遺伝子をもつ多数の異なる二重特異性抗体を作ることができる 。 二重特異性レパートリーは、また、Ｖ遺伝子のレパートリーから、４つのＶ遺 伝子ドメインの各々の５′および３′末端に制限部位を導入し、そして適合性部 位および必要に応じてダイアボディーのフォーマットにおいて遺伝子を一緒に接 合するための短いリンカーをエンコードする配列をもつ適当にファージミドベク ターの中に段階的にクローニングすることによって、構成することができる（第 ７図、ルートＢ、下部）。他のアプローチにおいて、PCR反応およびPCRアセンブ リー（スプライスオーバーラップの延長）を使用することによって、VHおよびVL 遺伝子のレパートリーを一緒に連鎖しそして段階的に、あるいは完全な４−Ｖ遺 伝子のレパートリーのカセットのアセンブリー後にクローニングすることができ る（第７図、ルートＢ、上部）。アセンブリーはＶ遺伝子配列またはダイアボデ ィーのリンカー配列と適合性の制限部位のデザインの必要性を回避する。制限部 位、アクセプターのファージミドおよびオリゴヌクレオチドのプライマーを正し くデザインすることによって、任意のダイアボディーのフォーマットを構成する ことができる。 クローニングしないおよび未選択のＶ遺伝子のレパートリーから出発する代わ りに、二重特異性のダイアボディーのレパートリーは、また、ファージ上で表示 され（そして可能ならば抗原上で選択してバインダーについて濃縮された）Ｖ遺 伝子のレパートリーから誘導されたscFvまたはFab断片からVHおよびVL遺伝子を 一緒に連鎖することによって得ることができる（第７図、ルートＣ；実施例14） 。例えば、２つの抗原に対する特異性をもつ別のscFvレパートリーを構成しそし て選択し、Ｖ遺伝子のレパートリーを段階的にクローニングまたはPCRアセンブ リーによりシャフリングして、二重特異性ダイアボディーとして再フォーマット 化することができる。このアプローチは実施例14に記載されている。 大きいライブラリーを作るために、組み合わせ感染および引き続く生体内の組 換えを、特許出願PCT WO92／20791および特許出願WO93／19172に記載されている ように、利用することが可能であろう。例えば、プラスミド（２価のダイアボデ ィーの107クローンをエンコードする）上のランダムアセンブリングされた鎖の ライブラリーを収容する細菌をVH−B−VL−Aライブラリーを収容するファージで 感染させる。次いで、感染した細菌は、ファージ上に表示された二重特異性ダイ アボディーのレパートリーを生産するであろう。ファージ上に表示されたダイア ボディー配列の多様性は、２つのライブラリーの多様性の生産物であろう。 同一の方法で、組み合わせの感染を使用してVHおよびVL遺伝子の高度に多様な ２価のライブラリーをアセンブリングして、各ダイアボディー鎖をエンコードす ることができる。しかしながら、これは組換えのための部位、例えばloxP部位を VHおよびVL遺伝子の間に導入することを必要とする。ダイアボディーの構造はこ れらの残基を収容するが、最も好ましくは配列は除去される。例えば、loxPは、 タンパク質が発現されるときスプライスアウトされるべきイントロン内にエンコ ードされることができる。実施例24はこれを例示し、テトラヒメナ（Tetrahymen a）からの自己スプライシングイントロンをVHおよびVLドの間に挿入できること 、およびスプライシング（これはRNAの中への翻訳後にのみ起こる）後、機能的 ダイアボディーを形成できることを示す。タンパク質レベルで、イントロンの内 部 の誘導配列（IGS）の３アミノ酸は唯一の残留物として残る。これはダイアボデ ィーのフォーマットと適合性である。 大きいレパートリーを作るために、テトラヒメナ（（Tetrahymena）からの自 己スプライシングイントロンは自己スプライシング活性と適合性の部位に挿入さ れた組換え部位を含有することができる。第８図は２価の抗体のレパートリーを 使用する原理を証明する。それはVHおよびVL遺伝子のレパートリーの直接クロー ニングにより発生したレプリコン、および組換え後に生ずるレプリコンを示す。 loxP部位におけるCre仲介組換えは生体内で実施する（P1ファージをもつ両方の レプリコンを有する細菌の重感染によるか、あるいは温度依存性P1ファージを使 用することによって）か、あるいはCreレコンビナーゼを使用して生体外で実施 することができる。DNAレベルで起こる組換え後、生ずるダイアボディー遺伝子 が転写され、そしてイントロンおよびVHおよびVL遺伝子の間のloxP部位をスプラ イスアウトする。自己スプライシング系を同様な方式で二重特異性レパートリー に適用することができる。実施例のリスト 実施例１ ２価および二重特異性のダイアボディー断片の構成、発現および特 性決定 主要な面は次のものを包含する： （ａ）NQ11／D1.3phOx−D1.3二重特異性ダイアボディーの構成、発現および特 性決定 （ｂ）２価および二重特異性のダイアボディーの構成、発現および特性決定 （ｃ）３鎖の構成体の構成、発現および特性決定 実施例２ −１および−２リンカーの長さをもつNQ11／D1.3ダイアボディーの 構成および発現 実施例３ NQ11／B1.80x／NIPダイアボディーの構成および発現 実施例４ BIAコア分析によるNQ11／B1.8ダイアボディーの共同的（アロステ リック）性質の特性決定 実施例５ 腫瘍壊死因子に対して向けられたMAKI95ダイアボディーの構成およ び発現 実施例６ ヒト免疫不全ウイルスのgp120のＶ３ループの構成および発現 実施例７ 腫瘍壊死因子に対して向けられたMab32ダイアボディーの構成およ び発現 実施例８ Mab32ダイアボディーの細胞内発現 実施例９ ２価および二重特異性のダイアボディーを使用するrbxの凝集 実施例10 リゾチームおよび２−フェニル−５−オキサゾロンに対して向けら れた二重特異性ゼロリンカーのD1.3／NQ11ダイアボディーのファージの表示 実施例11 ２−フェニルオキサゾル−５−オンに対して向けられた１つのアー ムおよびエストリオールに対して向けられた１つのアームをもつ二重特異性ダイ アボディーの構成 実施例12 ダイアボディーおよびCH3ドメインの間の融合体の構成 実施例13 二重特異性抗CEA、抗ｄ16抗体の細胞溶解活性：ヒトPBLによるヒト 腫瘍細胞のダイアボディー仲介溶解 実施例14 ファージ上に表示された二重特異性ダイアボディーのレパートリー の構成 実施例15 VHドメインに対してＮ−末端のVLドメインをもつ逆ダイアボディー ：２−フェニルオキサゾル−５−オンに対して向けられた２価のダイアボディー の構成および発現 実施例16 VHおよびVLドメインの間の10アミノ酸のリンカーは二量体の形成よ りむしろモノマーを好む証拠 実施例17 二重特異性抗NIP、抗ヒトFcR1ダイアボディーの調製 実施例18 二重特異性抗イディオタイプ（bc11）−抗CD3の調製および生体外 の細胞障害性へのその適用 実施例19 ２価の抗イディオタイプ（bc11）ダイアボディーの調製および特性 決定 実施例20 二重特異性抗HIVgp120HIV V3ループ−抗ヒトFcR1ダイアボディーの 調製および特性決定 実施例21 二重特異性２−フェニルオキサゾル−５−オン、抗マウスラムダ軽 鎖のダイアボディーの調製および特性決定 実施例22 NQ11／B1.80x／NIPダイアボディーの２つのVHドメインの間の界面 における残基の突然変異誘発 実施例23 ジスルファイド架橋を導入する軽鎖のＣ末端にシステインをもつダ イアボディーの構成および特性決定 実施例24 ダイアボディー分子の構成における自己スプライシングイントロン の使用 実施例25 メタロチオネインとの融合体を含有するダイアボディー分子の構成 および特性決定実施例１ ２価および二重特異性ダイアボディーの分子の構成、発現および特性 決定 この実施例は、可変ドメインの間にある範囲のリンカーの長さをもつ、種々の 型のダイアボディー分子の構成、発現および特性決定を記載する： （ａ）モノクローナル抗体NQ11（C．Berekら、Nature 316 412-418，1985）お よびD1.3（A.G．Amit Science 233 747-753，1986 ）から誘導された可変ドメインを使用して２−フェニルオキサゾル−５−オン（ phOx）または雌鶏卵リゾチーム（HEL）に対して向けられた２価のダイアボディ ー。 （ｂ）２−フェニルオキサゾル−５−オンに対して向けられた１つのアームお よび雌鶏卵リゾチームに対して向けられた１つのアームをもつ二重特異性ダイア ボディー。 （ｃ）phOxおよびHELに対して向けられた二重特異性の３鎖の断片。 ダイアボディーは普通の中間体を通して構成され、したがって一緒に記載する 。方法 ベクターの構成。大腸菌（E.coli）TG1（T.J．Gibson，1984博士論文、ケンブ リッジ大学）を、プラスミドの調製および抗体断片の発現のために使用した。ほ とんどの構成体の概略については第９図を参照のこと（構成体VIIIおよびIXを除 外する）。HELに対して向けられたモノクローナル抗体D1.3（A．Amitら、1986 前掲）のscFv（J．McCaffertyらNature 348 552-554 1990）およびFv（E.S．Wa rdら、Nature 341 544-546 1989）断片をエンコードする構成体II，IVおよびＶ はT．Simonにより提供された。ハプテンのフェニルオキサゾロンに対して向けら れたマウスハイブリドーマNQ11.7.22のFv断片（C．Berekら、1985 前掲）をエ ンコードする構成体IIIは、L．Riechmannにより提供された。構成体III、および それから誘導されたもの（構成体I，VI，VII，VIIIおよびIX）はVHドメイン中の 突然変異を含む（L．Riechmannら、J．Mol．Biol．224 913-918，1992）。 それ以上の構成体（第９図）は制限断片（ここでベクター断片と命名しそして ベクターの主鎖およびＶ遺伝子またはＶ遺伝子の部分 からなる）の再結合によるか、あるいは制限断片（ここでPCR断片と命名しそし てＶ遺伝子、リンカーまたは非コーディング配列からなる）との結合により標準 の方法（J．Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spri ng Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク州プレインビュー、1990）を使 用して誘導した。ベクター断片は構成体IIIをBstEII／SacIで消化し、そして構 成体VIをBstEIIまたはXhoIまたはPstIで消化することによって得た。 15残基のリンカーのためのPCR断片は構成体IVをもつプライマー１および２を 使用して発生させた。AsclおよびSaclを使用する消化は遺伝子３リーダー、VHセ グメントおよびリンカーからなるPCR断片ａ−15を生じた。BstEIIおよびAscIを 使用する消化はリンカーおよびVLセグメントからなるPCR断片ｂ−15を生じた。 より短い連鎖のためのPCR断片は次のものを使用して発生させた：プライマー３ または４または５をもつプライマー１（それぞれ、０，５または10残基のリンカ ーをエンコードする）およびプライマー６または７または８をもつプライマー２ （また、それぞれ、０，５または10残基のリンカーをエンコードする）そして上 のように消化してPCR断片ａ−０，ａ−10，ｂ−０，ｂ−５およびｂ−10をつく った。構成体Ｖの中に非コーディング配列（Ｎ１）を提供するためのPCR断片を 構成体Ｖをもつプライマー１および２を使用して発生させ、そしてBstEIIおよび AscIで消化した。 構成体VIを作るために、構成体IVからのPCR断片（ａ−０，ａ−５，ａ−10お よびａ−15）を対応するPCR断片ｂおよびベクター断片III-BstEII／SacIと結合 した。構成体VIIを作るために、構成体IVからのPCR断片（ａ−５およびａ−10） を同様に断片ｃと結合した。構成体VIIIおよびIXを構成体VIから、それぞれ、Ps tIまたは XhoIで部分的に消化し、そしてベクター断片を再結合させることによって誘導し た。５，10および15残基のリンカーをもつ構成体Ｉを同様に対応する構成体VIの BstEII消化により発生させた。PstIおよびSacIで切断した断片ａ−５と断片II− PstI／SacIを結合することによって、５残基のリンカーをもつ構成体IIを発生さ せた。 結合混合物および形質転換は記載されている通りであった（J.D.Marksら、Bio ／Technology 10 779-783，1992）。リンカーまたは非コーディング領域をジデ オキシ法（F．Sangerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74 5463-5467，1977）に よりVENT（exo-）ポリメラーゼ（New England Biolabs）を使用して配列決定し た。構成体の各々のヌクレオチド配列は要求に応じて著者らから入手可能である 。 オリゴヌクレオチド。使用したプライマーの配列は表１に記載されている。プ ライマー１はAscIを導入しそして３′VLにおいてプライミングする；プライマー ２はAscIおよび合成リボソーム結合部位を導入しそして５′fd遺伝子３シグナル においてプライミングする；プライマー３，４および５はVHおよびVLの間に０， ５，10残基のリンカーのリンカーを導入し、BstEII部位を含み、そして５′VLに おいてプライミングする；プライマー６，７および８はVHおよびVLの間に０，５ ，10残基のリンカーのリンカーを導入し、SacI部位を含み、そして３′VHにおい てプライミングする。 二重特異性断片の発現。断片は周辺質リゼイト（A．SkerraおよびA．Pluckthu n，Science 240 1038-1041，1988）または細菌の上澄み液（M．Betterら、Scien ce 240 1041-1043，1988）から調製した。HELまたはphOx−BSAに結合する断片の 検出のために、ELISAを記載されているように実施した（H.R．Hoogenboomら、Nu cl．Acids Res．19 4133-4137，1991）。サンドイッチ−ELISAのために、プ レートをHELで被覆し、そして周辺質リゼイトまたは培養上澄み液を前述したよ うに添加した。結合は100μｌの１μg／mlのphOx−BSAで、次いで100μｌの100n g／mlのphOxに対して向けられたマウス抗体NQ22．18.7（C.Berekら、1985 前掲 ）およびペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（１：1000）（Sigm a）で検出された。すべてのインキュベーションは２％ｗ／ｖのスキムミルク粉 末を含有するPBS中で実施した。ウェスタンブロットは記載されている通りであ った（20）。断片を細菌の上澄み液からHEL−セファローズ（Sepharose）（S．M unroおよびH.R.B．Pelham，Cell 46 291-300，1986）および／または記載されて いるようにphOx−BSA（M．Dreher博士論文 ケンブリッジ大学、1992）のアフィ ニティクロマトグラフィーにより精製した。 結合アフィニティー。記載されているように（A.D．Griffithesら、EMBO J．1 2 725-734，1993）BIAコア（Pharmacia BiosensorAB）を使用して、プラズモン 表面共鳴によりHELおよびphOxに対する抗体断片の解離の反応速度を測定した。H ELおよびphOx−BSAの両方に対して結合活性をもつ断片の検出のために、10μｌ の周辺質リゼイトまたはアフィニティー精製した断片をHEL被覆センサー（上を 参照）上に５μｌ／分の一定速度で注射し、次いで直ちに10μｌの１mg／mlのph Ox−BSAのパルスを与えた。蛍光クエンチ滴定（H.N．Eisen，Methods Med．Res ．10 115-151，1994）によりハプテン４−γ−アミノブチリル−２−フェニルオ キサゾル−５−オン（phOx−BSA）記載されているように（J．FooteおよびC．Mi lstein Nature 352 530-532，1991）を使用して、phOxについての断片の結合の アフィニティーを測定した。 結果 scFv断片におけるように、VHおよびVLドメインの間に15残基のリ ンカーをもつ２つの異なる抗体の二重特異性および２価の断片の発現のための構 成を、われわれは作った。15残基はVHドメインのＣ−末端から同一鎖のVLドメイ ンのＮ−末端にストレッチするために十分である（構成体の概略については第９ 図を参照のこと）。しかしながら、共発現された鎖（VHA−VLB，VHB−VLA）をも つ「二重特異性」抗体の構成体は両方のHELおよびphOx−BSAに結合した断片を生 じたので、鎖はまた互いに対合することができることをわれわれは発見した。（ 表２）。ELISAにより、結合は特異性であった：シチメンチョウの卵リゾチーム （TEL）またはウシ血清アルブミン（BSA）に対する結合を検出することができず 、そしてphOx−BSAへの結合は可溶性ハプテンにより阻害することができた。対 照的に、クロスオーバー鎖を別々に発現させた（構成体VIIIおよびIX）とき、期 待されるように、それらはELISAにおいてHEL，TEL，BSAまたはphOx−BSAに結合 しなかった；しかしながら、生体外で一緒に混合したとき、２つの鎖はHELおよ びphOx−BSAへの結合により検出されるように連合せず、そして２つの鎖が共発 現されるとき得られるシグナルのELISAシグナルの約10％を生成した。 われわれは、また、５〜10残基のより短いリンカーの長さを使用した：５残基 のリンカーは同一鎖のVHおよびVLドメインの間でストレッチすることができず、 それは二重特異性断片の形成を事実可能とする（表２）。事実、二量体のコンピ ューターグラフィックモデルにより促進されて（論考を参照のこと）、われわれ はVHドメインのＣ−末端をVLドメインのＮ−末端に直接接合した。再び、断片は 両方の抗原に（表１）、また、ファージミドベクターpHEN1を使用してファージ の表面上に表示されたとき、結合した（実施例10）。 鎖（VHA−VLB）上にゼロアミノ酸のリンカーおよび他の鎖（VHB−VLA）上に15 アミノ酸のリンカーをもつ構成体VIのそれ以上のバージョ ンを調製した。15アミノ酸はリンカーにおいてポリペプチドの２つのドメインが 互いに連合して抗原結合部位を形成することができるようにする。この抗原はEL ISAで両方の抗原に結合し、この型の「非対称の」二量体は機能的であることを 示す。 両方の抗原結合部位が同一の二重特異性断片上に位置することを証明するため に、われわれはサンドイッチ−ELISA（表２）およびまたBIAコアを使用して、HE Lに結合した二重特異性断片がまたphOx−BSA結合することを示した。例えば、第 10図（Ｂ）において、断片を注入しそしてHELで被覆したバイオセンサーのチッ プ（セグメントbc）に結合した。屈折率の変化（セグメントcd）および多少の解 離（セグメントde）が存在した後、断片は注入したphOx−BSAに結合することが 見えた（ｅおよびｈの間の共鳴単位（RU）の差は結合したphOx−BSAの量を反映 する）。対照として、FabD1.3はHELに結合することが示されたが、結合した断片 は引き続いてphOx−BSAに結合しなかった（第10図（Ａ））。 HELまたはハプテンに結合する断片の大きさはFPLCゲル濾過により二量体に相 当することが示された（第II図）。われわれは抗体断片を含有するリゼイトをFP LCカラム上に負荷し、そして抗原またはハプテンを被覆したBIAコアセンサーチ ップの上に流出液を通過させた。チップの表面における質量の増加により、断片 の結合を検出した（実時間で）（A.D．Griffiths 1993前掲）。二重特異性断片 は大きさがキメラD1.3Fab断片に類似することが発見され、そしてphOx−BSA被覆 したチップならびにHEL被覆したチップに結合した（表２）。これはこれらの二 重特異性断片が、２つの鎖の連合により形成された、二量体であるに違いないこ とを示す。 また、バイオチップ上に固定化されたモノクローナル抗体9E10に断片のＣ−末 端のmyc tagの結合により、断片の大きさを検査した 。このフォーマットは断片が抗原結合活性を有するかどうかに無関係に断片を検 出し、そして単一のクロスオーバー鎖（構成体VIIIおよびIX）（抗原に結合しな い）が長いリンカーをもつモノマーを除いて、短いリンカーをもつ二量体である ことを示すために使用可能とする。再び、二重特異性断片は、リンカーの長さに 無関係に、二量体に相当する主要なピークの中に出現する。 われわれは、５および15残基のリンカーをもつ、およびまたリンカーをもたな い、二重特異性断片を、HELのアフィニティクロマトグラフィー、次いでphOx−B SA−セファローズのカラムにより精製した。c−myc標識に対する抗体を使用する ウェスタンブロットによるか、結合ELISAにより検出したときの断片の収率は、 細胞を誘発後より低い温度（20℃）に移したとき改良された（H．Takagiら、Bio ／Technology 6 948-950，1988）。一夜の発酵後、タンパク質の大部分は培養 上澄み液の中に位置し、そしてアフィニティー精製後、0.3mg／ｌ〜１mg／ｌの 断片を生じた。収量はscFvまたはFab断片について報告されたものに匹敵するよ うに思われる（R．Glockshuberら、Biochemistry 29 1362-1367，1990；A．Sker raおよびA．Pluckthun，Protein Eng．4 971-979，1991）。 われわれは、HEL上で精製した二重特異性断片の可溶性phOx−GABAについての 結合のアフィニティーを蛍光クエンチ滴定により測定した。結果（表３）が示す ように、５および15残基のリンカーをもつ二重特異性断片の結合のアフィニティ ーは親のFvに類似する。しかしながら、リンカーをもたない断片は10倍の改良さ れたアフィニティーを有した。われわれは、また、phOx−BSAおよびHELからの断 片の解離反応速度をBIAコアにより測定した。phOx−BSAからのリンカーをもたな い断片の解離は少なくとも10倍遅かった。（表２） われわれは、また一本鎖VHB−VLAが２つの相補的ドメインVHAおよびVLBととも に分泌される、３鎖の断片（第９図、構成体VII）を構成した。断片は両方のHEL およびphOxに結合し（表２）そして二重特異性であることが示されたが、FPLC上 で、断片はモノマーと二量体との間の大きさで出現したので、鎖は速い平衡にあ るように思われた、論考および参考文献については（D.H．Jonesら、Biochemist ry 24 5852-5857 1985）を参照のこと。 論考 ここで、VHおよびVLドメインの分子間対合を利用する二重特異性抗体のアフィ ニティーのデザインを説明する。これは化学的架橋または二量体化ポリペプチド への融合と対照的である。１つの抗原のVHドメインを同一のポリペプチド鎖上の 他のVLドメインに連鎖させて、２つの鎖VHA−VLBおよびVHB−VLAをつくり、これ らは同一細胞中で共発現されそして連合して同一分子上に２つの抗原結合部位を もつ二量体を形成する。同一細菌から両方の鎖が分泌されるとき、ヘテロ二量体 、ホモ二量体およびモノマーが形成することをわれわれは期待したが、ヘテロ二 量体のみが抗原に結合しそして単一のラウンドのアフィニティクロマトグラフィ ーにより単離することができる。 VHおよびVLドメインが連合しそして安定なFab断片を形成することが知られて いる（E.S．Wardら、1989 前掲；L．Riechmannら、1992 前掲）２つの抗体、D 1.3およびNQ11を選択した。15残基のリンカーをもつ二重特異性断片のFPLC分析 から、二量体がリゼイトの中で優勢であるように思われる（表２）。多分、２つ の異なる鎖上の相補的ドメインの間の好適な相互作用は二量体の形成の推進を助 ける。しかしながら、VHおよびVLドメインがいっそう弱く連合される抗体につい て二量体化を促進するために（A．SkerraおよびA．Pluck thun，1988 前掲）、例えば、クロスオーバー鎖（構成体VIIIおよびIX）におい て、同一鎖上のVHおよびVLドメインが互いに対合するのを防止するために短いリ ンカー（０または５アミノ酸）を使用した（表２）。 ０または５アミノ酸のリンカーの長さをもつ多数のダイアボディーを構成し、 そして機能的であることが示された。これらは次のものに対して向けられた２価 のダイアボディーを包含する：２−フェニルオキサゾル−５−オン（phOx）（実 施例１）；リゾチーム（実施例１）；腫瘍壊死因子（実施例５および７）；HIVg p120のＶ３ループ（実施例４）；癌胎児性抗原（CEA）；FcレセプターFcγRIII （CD16）；ヒトFcレセプターFcγRI（実施例17）；BCL−１リンパ腫細胞系の表 面Ig（実施例19）およびCD3抗原（実施例18）。次のものに対して向けられた二 重特異性ダイアボディーを構成した：phOxおよびリゾチーム（実施例１）；phOx およびNIP（４−ヒドロキシ−２−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸）（実施例 ３）；CEAおよびCD16；NIPおよびFcR1（実施例17）；BCL−１リンパ腫細胞系の 表面IgおよびCD3（実施例18）；HIVgp120のＶ３ループおよびヒトFcR1（実施例2 0）およびphOxおよびエストリオール（実施例11）。CEA；CD16およびCD3（実施 例18）を包含するこれらのある数は、FACS分析により全細胞上のマーカーに結合 することが示された。実施例２ −１および−２リンカーの長さをもつNQ11／D1.3ダイアボディーの構 成および発現 この実施例は、実施例１において作られたNQ11／D1.3ダイアボディーに基づい た１系列の二重特異性NQ11／D1.3ダイアボディーの構成を記載する。 目的は二重特異性ダイアボディー上で働く構成的拘束を研究することであった 。scFv分子において使用した15アミノ酸からのリンカ ーの長さの減少は、同一のポリペプチド鎖からのVHおよびVLドメインの連合を妨 害し、そしてダイアボディーの形成を促進する。実施例１は０，５および10アミ ノ酸のリンカーを記載する。この実施例において、活性ダイアボディーの形成を 可能とする最小のリンカーの長さを決定する。１系列のマイナスリンカー分子（ 重鎖３′コドンまたは軽鎖５′コドンを除去することによって、ゼロより短いリ ンカーを作る）を構成した。VLドメインのＮ−末端またはVHドメインのＣ−末端 からアミノ酸を欠失させることによって、VHVLリンカーの長さをゼロから減少し て（−１），（−２）および（−３）構成体を形成した。−１以上のリンカーの 長さの減少はNQ11／D1.3ダイアボディーのフォルディングを妨害する。マイナスリンカーのダイアボディーの構成 ダイアボディーNQ11／D1.3の構成は０，５および10アミノ酸のリンカーについ て実施例１に記載した。 実施例１におけるのと同一の方法を使用して、マイナスリンカーの長さの変異 型を作った。BstEII部位を含有するプライマー３およびSacI部位を含有するプラ イマー６を再デザインすることによって、重鎖および軽鎖の間のリンカーの長さ を変更させた。これらのプライマーの各々はダイアボディーの２つのVH／VL接合 の１つをスパンする。したがって、１または２以上のコドンが最終のダイアボデ ィーのVH／VL接合をスパンする配列から外に残るように、これらのプライマーを 変更することができる。 （−１）変異型を作るとき、VH／VL接合における重鎖配列の３′末端および軽 鎖配列の５′末端からコドンを欠失させることができる。この方法において表４ に示し、その配列が表１に記載されているオリゴヌクレオチドのプライマーを使 用して作った、４つの可能な変異型が第13図に示されている。構成体NQ11／D1.3 （−１）１−３ は、１つのポリペプチド鎖上のNQ11から誘導されたVHドメインのＣ−末端から欠 失したアミノ酸および他の鎖上のD1.3から誘導されたVHドメインのＣ−末端から 欠失した１つのアミノ酸を有する。構成体NQ11／D1.3（−１）１−４は、１つの ポリペプチド鎖上のD1.3から誘導されたVLドメインのＮ−末端から欠失したアミ ノ酸および他の鎖上のD1.3から誘導されたVHドメインのＣ−末端から欠失した１ つのアミノ酸を有する。構成体NQ11／D1.3（−１）２−３は、１つのポリペプチ ド鎖上のNQ11から誘導されたVHドメインのＣ−末端から欠失したアミノ酸および 他の鎖上のNQ11から誘導されたVLドメインのＮ−末端から欠失した１つのアミノ 酸を有する。構成体NQ11／D1.3（−１）２−４は、１つのポリペプチド鎖上のD1 .3から誘導されたVLドメインのＮ−末端から欠失したアミノ酸および他の鎖上の NQ11から誘導されたVLドメインのＮ−末端から欠失した１つのアミノ酸を有する 。断片をpUC19の中にクローニングし、そして実施例１に記載するように発現さ せた。ELISAを実施例１におけるように実施した。これらの変異型のすべての４ つ、１−３，１−４，２−３および２−４は発現し、そして活性であり、ELISA 上で２−フェニルオキサゾル−５−オンおよび雌鶏卵リゾチームの両方に結合し たが、BSAに結合しなかった（すなわち、それらはそれらの抗原に特異的に結合 する）。 第14図は作った２つの他の構成体を示す。コドンの欠失によりプライマー３お よび６から誘導した表４に示すプライマーを使用して、NQ11 VHおよびD1.3 VL接 合の５′軽鎖配列から２コドンが欠失しそしてD1.3VHおよびNQ11 VL接合のVH配 列から２コドンが欠失した、構成体NQ11／D1.3（−２）変異型（AE）を作った。 各接合から３コドンが除去された、構成体NQ11／D1.3（−３）（CF）を作った 。一方のポリペプチド鎖について、構成において表４に 示すオリゴヌクレオチドを使用することによって、NQ11から誘導されたVHドメイ ンのＣ−末端から１つのアミノ酸を欠失させそしてD1.3から誘導されたVLドメイ ンのＮ−末端から２つのアミノ酸を欠失させた。他方のポリペプチド鎖について 、構成において表４に示すオリゴヌクレオチドを使用することによって、D1.3か ら誘導されたVHドメインから２つのアミノ酸を欠失させそしてNQ11から誘導され たVLドメインのＮ−末端から１つのアミノ酸を欠失させた。上のように発現させ そしてELISAによりアッセイしたとき、（−２）および（−３）変異型のいずれ もシグナルを与えなかった。 H．R．Hoogenboomら、Nucleic Acids Res．19 4133-4137，1991に記載されて いるように、抗体構成体の各々のＣ−末端におけるmyc標識に結合するモノクロ ーナル抗体9E10を使用する検出により、ウェスタンブロットを実施した。これら のブロット上で分析した試料は、D1.3scFv（J．McCaffertyら、Nature 348 552 -554，1990），NQ11／D1.3（−３）変異型１−３および２−３およびNQ11／D1.3 （−２）構成体（AE）を包含した。シグナルが示すように、（−１）構成体はダ イアボディー生産物のscFvの比率のそれに近い発現収率を有するが、ホモ二量体 のミスフォルデッド（misfolded）物質または不活性な均質鎖、すなわち、それ 自体と対合したNQ11VH／D1.3VLおよびそれ自体と対合したD1.3VH／NQ11VLであろ う）。（−２）生成物は非常に低い濃度でのみ存在しそして試料を10倍に濃縮し たときにのみブロット上で検出することができた。 誘発しそしてダイアボディーの変異型１−４および２−４を作るとき、首尾一 貫した問題が経験された。これらの２つの（−１）構成体は機能的にフォルディ ングすることができるへりにちょうど存在するように思われる。 これらの特定のダイアボディー構成体におけるVHおよびVLドメイ ンの間のリンカーの長さについての下限はそれゆえ（−１）であった。（−２） が機能的である異なるVHおよびVLドメインをもつダイアボディーの例が存在する 可能性がある。実施例３ NQ11／B1.8ダイアボディーの構成および発現 この実施例は、抗体NQ11（これはハプテンphOxに結合する）および抗体B1.8（ Rothら、Eur．J．Immunology 8 3019 1978）（これはハプテンNIPに結合する） に基づく二重特異性ダイアボディーを記載する。ダイアボディーNQ11／B1.8の構成 このダイアボディーのために出発点は存在するNQ11／D1.3であった。この構成 の中央のD1.3VK／D1.3VH部分は制限酵素BstEIIおよびSacIで切除した。次いで、 B1.8VH配列をこの構成体の中にBstEIIおよびSacI部位を使用してクローニングし た。 存在するB1.8scFvクローンからプライマーVLB18baLinkOBstEおよびVLB18foAsc を使用するPCR増幅により、ダイアボディーのためのB1.8VLインサートを作った 。プライマーVLB18baLinkOBstEは、切断したベクター構成体のNQ11VHの３′末端 におけるBstEII部位と適合性のBstEII部位を含有する。プライマーVLB18foAscは B1.8VHインサートの５′末端におけるAscI部位と適合性のAscI部位を含有する。 B1.8VLインサートをベクター構成体の中へのクローニングのためにBstEIIおよび AscIで切断した。 存在するB1.8scFvクローンからプライマー２および６を使用するPCR増幅によ り、ダイアボディーのためのB1.8VHインサートを作った。プライマー６は切断し たベクター構成体のNQ11VLの５′末端におけるSacI部位と適合性のSacI部位を含 有する。プライマー２はB1.8VLインサートの３′末端におけるAscI部位と適合性 のAscI部位を含有する。B1.8VHインサートをベクター構成体の中へのクローニン グのためにSacIおよびAscIで切断した。 次いで、BstEII／AscI切断B1.8VL断片およびSacI／AscI切断B1.8断片をBstEII ／SacI切断NQ11ベクター構成体と混合し、そして一緒に結合してNQ11VH／B1.8VL ／／B1.8VH／NQ11VLダイアボディーを発生させた。ダイアボディーNQ11／B1.8の発現 可溶性ダイアボディーNQ11／B1.8を37℃において2YT／0.1％グルコース／100m g／ml中で0.9〜1.0のOD550nmに成長させることによって発現させ、そしてIPTGを 1mMに添加することによって誘発した。次いで、培養物をより低い温度（22また は26℃）においてさらに24時間成長させた。 培養上澄み液から可溶性抗体は、NIP−BSAまたはphOx−BSAを被覆したELISAプ レートを使用するELISAにおいてNIPおよびphOxの両方に結合することが示された 。（ELISAプレートのコーティングはPBS中の10μｇ／mlのNIP−BSAまたは10μｇ ／mlのphOx−BSAを使用する一夜の100μｌ／ウェルであった）。1.0より大きいE LISAシグナルが50μｌの上澄み液で各抗原を使用して得られた。実施例４ BIAコア分析によるNQ11／B1.8二重特異性ダイアボディーのアロス テリック性質の特性決定 ダイアボディーにおけるポリペプチド鎖の緊密なパッキングは、一方の抗原結 合部位から他方の抗原結合部位へのコンフォメーションの変化の伝搬の可能性を 開く。一方の部位における抗体の結合が他方の部位における結合のアフィニティ ーの増加または減少に導くアロステリック二重特異性ダイアボディーは、均質ア ッセイおよびプロドラッグ活性化に対する応用の可能性を有する。 この実施例において、phOxに対する二重特異性NQ11／B1.8Ox／NIPダイアボデ ィーのアフィニティーへのNIP（４−ヒドロキシ−２ −ヨード−５−ニトロフェニル酢酸）の結合の効果を研究した。実施例３におい て構成されたNQ11／B1.8ダイアボディーを発現させ、そしてphOx−BSA−セファ ローズカラムのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。こうして発現 されたダイアボディーは２つのポリペプチド鎖NQ11VH−B1.8VLおよびB1.8VH−NQ 11−VLの二量体である。VHおよびVLドメインは互いに対して直接融合された（ゼ ロアミノ酸のリンカー）。 ファーマシア（Pharmacia）BIAコアを使用する表面プラズモン共鳴（SPR）に より、phOx−BSAおよびNIP−BSAへのダイアボディーの結合を研究した。SPRセン サーチップ表面をphOx−BSAで誘導して、２−フェニルオキサゾル−５−オンへ のNQ11結合部位の結合を分析した。通常、誘導したチップ表面からの抗体の解離 についての反応速度（ｋOff）を測定するとき、チップ表面を非常に低いレベル の抗原で被覆する。これは、より遅い見掛けの分離速度（off-rate）に導く再結 合を防止する。しかしながら、NQ11についての分離速度は普通のBIAコア分析の ためにはかなり高過ぎるので、チップ表面をphOx-BSAで高いレベルに被覆して再 結合を利用した。観測された分離速度曲線はここで表面からの抗体の解離につい ての速度定数（ｋoff）および表面への抗体の結合についての速度定数（ｋoff） の両方の関数である。したがって、観測された分離速度曲線は表面における抗原 についての抗体の解離定数（ｋd）に関係する。 第15図は、ph0x−BSAからのNQ11／B1.8二重特異性ダイアボディーの解離につ いての分離速度曲線である。ダイアボディーを「前インキュベーション」工程に おいて表面に結合させ、そして結合した抗体は「溶離」工程において解離させた 。各場合において、曲線は表面に結合したままであるダイアボディーの3000共鳴 単位から開始することが示されており、そして分離速度はこの点において計算す る。曲線１について、前インキュベーションのための緩衝液はPBSであり、そし て溶離はPBSを使用して実施し、そして0.0045ｓ-1の見掛けのｋoffが得られる。 曲線２について、前インキュベーションは１μＭのNIP／PBSを使用して実施し、 そして溶離はPBSを使用して実施し、そして0.0047ｓ-1の見掛けのｋoffが得られ る。曲線２について、曲線３について、前インキュベーションはPBSを使用して 実施し、そして溶離は１μＭのNIP／PBSを使用して実施し、そして0.0069ｓ-1の 見掛けのｋoffが得られる。曲線４について、前インキュベーションは１μＭのN IP／PBSを使用して実施し、そして溶離は１μＭのNIP／PBSを使用して実施し、 そして0.0071ｓ-1の見掛けのｋoffが得られる。こうして、１μＭのNIPが溶離結 合の中に存在する曲線３および４は、溶離緩衝液の中にNIPが存在しない曲線１ および２と比較して50％より高い見掛けのｋoffを示す。このNIPは見掛けのｋof f を増加し、そしてphOxについてのNQ11／B1.8ダイアボディーの見掛けの結合の アフィニティーを減少する。相互作用は複雑であるので、分離速度曲線はｋoff およびｋonの複雑な関数である。真の解離定数への効果は定量することができな いが、NIPの結合がphOxの結合に影響を与えることは明らかである。 NIPとの前インキュベーションは観測された分離速度に影響を与えないが、NIP との前インキュベーションが、phOx被覆表面からのダイアボディーの解離へのNI Pの観測された効果と一致して、チップに結合するダイアボディーの合計量を減 少する。 NIPはphOx／BSA被覆表面へのscFvNQ11の結合に有意な効果をもたなかった。 NIP−BSA被覆センサーチップ表面からのNQ11／B1.8ダイアボディーの分離速度 曲線へのアロステリック効果は、phOxの存在で見ら れなかった。 これをさらに研究するために、１μＭのNIPの不存在（対照）および存在（試 験）下にダイアボディーの別の調製物を使用して平衡結合試験を実施した。各希 釈を2000RUのBSA−Ox4.6（「ｓ２」）で修飾した表面；7900RUのBSA−Ox1.8（「 ｓ３」）で修飾した表面；および未修飾表面の上で実施して、各試科の全体の屈 折率を測定した。第16図（上の部分）はNIPの存在および不存在下にｓ２への結 合についての曲線を示し、そして第17図（下の部分）はｓ３への結合のそれを示 す。両方の場合において、NIPはBSA−Ox表面へのダイアボディーの結合を減少す る。また、飽和は到達されなかったが、対照についてさえの最大の結合は、BSA 上のハプテン分子のすべてが抗原として等しく活性であった場合に期待されるも のより非常に少なかったことが明らかである。 データをスキャッチャード分析により処理してアフィニティーの推定を得た。 しかしながら、アフィニティーを計算するためにいくつかの仮定を行うことが必 要であった。ダイアボディーは100％純粋でありかつ100％活性であると仮定した 。最低の濃度の抗体（ことにNIPを含有する試料）についてのデータは適合線よ り有意に離れており、これは多分平衡が達成されなかったことから生ずるので、 これらの結果は分析から省略した。第17図及び第18図は、それぞれｓ２およびｓ ３へのダイアボディーの結合を示す。ダイアボディーについてのKdはｓ２につい て275nMであることが発見され、計算した最大の結合（Rmax）は510RUであった； ｓ２についてのそれぞれの値は275nMおよび355nMであった。しかしながら、NIP の存在下に、Oxについての見掛けのKdはｓ２について425nMそしてｓ３について4 18nMであった。Rmax値（それぞれ、461および348RU）は対照についてのそれらと 合理的によく合致する。明らかなように、効 果の量は精密にわれわれの仮定に依存する。われわれのデータは多分効果の下限 を与える。なぜなら、ダイアボディーのすべての分子が100％の活性を有したと いう仮定は多分誤りであるからである。同様な調製物の蛍光クエンチの測定は約 30％の各ハプテンについての活性を与えた。不活性のNIP（NQ11）部位以外に活 性のOx結合（B1.8）部位をもつダイアボディー分子が存在する場合、これらはNI Pの存在により影響を受けないBSA−Ox表面に結合し、そしてこれはBSA−Oxへの 合計の結合へのNIPの見掛けの効果を減少するであろう。さらに、ハプテン分子 はBSA上にいくつかのエピトープを提供し、そしてこれはいくつかのクラスの結 合部位を生ずる可能性が存在する。 それにもかかわらず、データが示すように、ダイアボディーへの第１ハプテン （NIP）の添加は、多分第１ハプテンの結合のときの分子におけるコンフォメー ションの変化の伝搬により、第２ハプテン（phOx）のための結合部位の少なくと も１つのクラスに対するダイアボディーの見掛けのアフィニティーを変更するこ とが明らかである。 こうして、このダイアボディーによるphOx−BSAの結合へのNIPのアロステリッ ク効果が存在する。これは抗体についてのこのようなアロステリック効果の最初 の観察である。実施例５ ヒト腫瘍壊死因子アルファに対して向けられたMAK195抗体の構成およ び発現 MAK195はヒトTNFαに特異的に結合するネズミモノクローナル抗 Schollmeier，Monoclonal Antibodies to human tumor necrosis factor alpha ：in vtro an ivivo applications，Cytokine 2，162-169，1990）。それはファ ージミドベクターpCANTAB5mycにおいて 向きVH−VLに５残基のリンカーGGGGSを使用してダイアボディーフォーマットで クローニングされた（第19図、WO92／01047）。リンカー配列をVKの５′末端の 増幅に使用したプライマー（AJR21）の中に組み込んだ。BstEIIのために制限部 位をプライマーAJR21のリンカー配列の５′末端およびまたVH1FOR−２の３′末 端に組み込み（E．S．Ward，D．Gussow，A．D．Griffiths，P．T．JonesおよびG ．Winter，Nature 341 544−546，1989）、VHおよびリンカー−VL断片を３方法 結合反応における発現ベクターpCANTAB5mycの中にクローニングすることを可能 にした。 RNAをMAK195ハイブリドーマ細胞から抽出しそしてcDNAの調製に使用した。MAK 195のVHおよびVLドメインのDNAを、cDNAからのPCRにより、プライマー対MAKVHBA CKNCOおよびVH1FOR−2、およびAJR21およびVK4FORNOT1（T．Clackson，H．R．Ho ogenboomら、A．D．GriffithsおよびG．Winter，Nature 352，624−628，1991） を使用して、それぞれ、標準条件下に増幅した。（注：MAK195V遺伝子は前にク ローニングしかつ配列決定されたので、われわれは「標準の」VH1BACKプライマ ーを使用するよりむしろMAK195−VH特異的プライマーをデザインした（R．Orlan di，D．H．Gussow，P．T．JonesおよびG．Winter，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86，3833−3837，1989））。VH PCR反応の生成物を制限酵素NcoIおよびBstEII で消化し、そしてVH PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消化した。 VHおよびVLドメインDNAをNcoI／NotI消化したpCANTAB5mycの中にモル比３：３： １（VH：VL：pCANTAB5myc）で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を大腸菌 （E．coli）TG1胞の形質転換に使用した。組換えクローンのいくつかの配列は標 準のベクターに基づくプライマーを使用して確証された。われわれはこれらを構 成体MAK15−５と呼んだ。 可溶性ダイアボディーを24℃における成長により発現させた。５mlの２YT／１ ％グルコース／100μｇ／mlのアンピシリン中で対数期成長の細胞を５mlの２YT ／１mMIPTG／100mg／mlのアンピシリンの中に再懸濁させ、そして24℃で３時間 成長させた。細胞を遠心（1000ｇ，10分）しそして細胞ペレットを250μｌの氷 冷したPBS／１mMのEDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に15分間放置した。細胞 懸濁液を遠心（1000ｇ，10分）しそしてダイアボディーを含有する上澄み液をEL ISAにおいて使用した。 50μｌの周辺質上澄み液＋50μｌの３％マーベル（marvel）／PBSを組換えヒ トTNFα（0.1ＭのNH4HCO3PH9.6中の10μｇ／ml）で被覆したELISAウェルに添加 し、３％マーべル／PBSでブロックした。モノクローナル抗体9E10、およびセイ ヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGでmyc標識を検出する、標準のELIS Aプロトコールに従った（H．R．Hoogenboomら、Nucl．Acids Res．19，4133−41 37 1991）。90分後のELISAの読みを第21図に示す。クローンの発現を30℃におい て誘発したとき、TNFへの結合は検出できなかった（示されていない）。しかし ながら、クローンの発現を24℃において誘発し、そしてELISAを37℃および室温 の両方において実施したとき、匹敵する陽性のシグナルが得られた。これが示す ように、このダイアボディーは37℃において安定であるが、効率よい発現のため にはより低い温度を必要とする。実施例６ HIVgp120のＶ３ループを認識する５リンカーのダイアボディーの構成 Mab447−52−ＤはHIVgp120のV3ループを認識するモノクローナル抗体である（ Gorny，M．K.，J．−U．Xu.，V．Gianakakos，S．Karawowska，C．Williams，H. W．Sheppard，C.V．Hanson、およびS．Zolla−Pazner，1991。HIV−Iエンベロー プ糖タンパク質の第３ 可変ドメインに対する部位選択中和性ヒトモノクローナル抗体の生産。Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 88：3238−3242）。scFvとしてクローニングしたとき、抗 体はその抗原特異性を保持し、gp120およびＶ３ループ配列を表す合成ペプチド に結合する。447：P4B1は447−scFvのより高いアフィニティーの変異型である： ４アミノ酸の置換は一緒にペチプド抗原からの解離速度を減少させる。重鎖おび 軽鎖の可変領域を接合するリンカー配列の長さを15から５残基に減少することに よって、２価の447ダイアボディーを操作した。 ファージミドベクターpCANTAB5myc中でクローニングした鋳型447：P4B1scFvの PCR増幅により、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をエンコードするDNA断片を別 々に調製した（第19図）。ベクター特異的プライマーPUC19rev（表１）およびプ ライマーHuJH6ForLINK（表１）（これは抗体のJH領域（肉太）およびscFvリンカ ーの最初の５残基（下線）に対して特異性である）を使用して、重鎖断片を発生 させた。同様に、ベクター特異的プライマー、FDTSEQ1およびプライマーLINKUHu llBack（表１）（HuJH6ForLINKのリンカー領域（下線）に対して相補的でありそ して抗体軽鎖（肉太）に対して特異的である）を使用して、軽鎖断片を調製した 。一次PCR生成物のPCRアセンブリー（T．P．Clacksonら、1991前掲）は、プライ マーHuJH6ForLINKとLINKUHullBackとの間のリンカー配列の相補性によって構成 された。次いで、アセンブリングした生成物をプライマーPUC19revおよびFDTSEQ 1を使用して再増幅し、NcoIおよびNotIで標準のプロトコールに従い消化し、そ してpCANTAB5mycの中にクローニングした。 ダイアボディー447：P4B1（５）を、Ｖ３ループ配列を表す合成ペプチドの認 識の可溶性捕捉アッセイにおいて試験した。まず、適当な構成体で形質転換した TG1の一夜の培養物から、scFvおよびダ イアボディーの周辺質の抽出物を調製した。可溶性抽出物を３％マーベル（Marv el）／PBS中で30℃において30分間ブロックした。次いで100nMのビオチニル化ペ プチド抗原を100μｌの各周辺質抽出物に添加し、そしてこの混合物を30℃にお いて１時間平衡させた。インキュベーション後、試料を前ブロックしたストレプ トアビジンのダイナビーズ（dynabeads）と短時間混合し、次いでビーズを磁石 で回収しそしてPBSでよく洗浄した。scFvまたはダイアボディー断片のＣ−末端 におけるmyc標識を認識するマウスモノクローナル抗体を使用して、ビオチニル 化抗原に結合したABを検出した。9E10を引き続いてアルカリ性ホスファターゼ接 合ヤギ抗マウスIgGを使用して検出し、反応をPNPPで発生させ、そして405nmにお いてマイクロタイタープレートのリーダーで吸収を測定した。scFvクローン447 P4B1（15）は1.0の吸収を与えたが、ダイアボディーのクローンP4B1（５）は1.3 7の吸収を与えた。それゆえ、HIVgp120のＶ３ループに対して向けられた抗体は 機能的である。実施例７ ヒト腫瘍壊死因子アルファに対して向けられた、ネズミMab32抗体お よびヒト化誘導体P3A2からのダイアボディーの構成および発現Mab32ダイアボディー ネズミMab32抗体をクローニングしそして、標準のプライマーを使用してcDNA からクローニングした後、標準の15残基のリンカー（配列（GGGGS）3）を使用し て一本鎖Fv（scFv）として発現させた（Clacksonら、1991、前掲；WO93／06213 ）。この構成体をダイアボディー構成のための出発点として使用した。scFv鋳型 からのPCRプライマーとしてFL−VLまたはZL−VL、およびfd-tet-seq24を使用し てMab32 VLを再増幅し、そしてVH遺伝子を含有するプラスミドDNAの中にBstEII- Not I切断断片としてクローニングした（pHEN1-VH-Ma b32，BstEII-NcoI切断）。この発生したVHドメインをもつクローンは５または０ アミノ酸のリンカーでVLドメインに融合した（それぞれ、FL−V1およびZL−VLプ ライマー）。pHEN1およびオリゴヌクレオチドMab32-VL-REVに基づく標準のプラ イマーを使用する配列決定により、ベクターダイアボディー配列は確証された。 実施例５（第22図）に記載されているように、被覆した抗原（ヒトTNF−アル ファ）を使用するELISAにおいて、ダイアボディーの活性は確証された。前述し たように、37℃に比較して室温（ほぼ20〜24℃）においてダイアボディーを誘発 しかつ成長させたとき、より活性の物質が得られる。結果はMab32−０（ゼロ− リンカーのダイアボディー）；Mab32−５（５残基のリンカー、GGGGSリンカー） ；Mab32−15（scFvリンカー）。 Mab32ダイアボディーおよび一本鎖Fvクローンの培養上澄み液中の生成したタ ンパク質の相対量を推定するために、スロットブロットアッセイを実施した。培 養上澄み液（10ｐｌ＝純粋；および２×YT中のこれの10倍の希釈物）をハイボン ド（Hybond）−Ｃ上にブロットし、膜を乾燥し、そして３％マーベルでブロック した。フィルターに結合したMab32分子を、それらのＣ−末端に存在するmyc標識 に対して向けられた９Ｅ10抗体で検出した。９Ｅ10（ほぼ１μｇ／ml）とインキ ュベーションした後、PBS−ツイーン20（0.1％）で洗浄し、そしてペルオキシダ ーゼ標識化ヤギ抗マウスIgとインキュベーションした後、結合した抗体を化学発 光（Amersham）の増強により検出した。スロットブロット（第23図）により、EL ISAシグナルはその温度において生産される物質の量と相関関係を有することが 確証される。Mab32−０およびMab32-5ダイアボディーについてのELISAシグナル はMab32-scFvについてよりわずかに高いが、また、生産されている（30℃および 室温において）より多い物質が存在する 。 ヒト抗体P3A2（WO93／06213に記載されている）を標準のプライマー（Clackso nら、1991、前掲）を使用してscFv断片として以前にクローニングされた。このs cFvのDNAをPCRにおいて鋳型として使用してVHを増幅（プライマーpUC-逆およびV H1FOR−1Xhoを使用する）しそしてVL遺伝子を増幅（プライマーFL−VL−A2およ びZL−VL−A2、およびfd-tet-seq24を使用する）して、５残基およびゼロ残基の リンカーのダイアボディーを作った。NcoIおよびXhoI（VH）およびNcoI（VL）で 制限した後、２つの断片をファージミドベクターpHEN1（NcoI−NotI切断した） 中で一緒に結合し、そして組換え体のVH−VL結合をVLA2−REVを使用して配列決 定した。 30℃において誘発および成長した後、ダイアボディーの最小結合が得られた； ダイアボディーを室温において生産したとき、よりすぐれたシグナルが得られた 。9E10抗体を使用するスロットブロット（第23図）により、再び、ELISAシグナ ルはその温度において生産される物質の量と相関関係を有することが確証される 。実施例８ 大腸菌（E．coli）中で細胞内で発現されたダイアボディー：腫瘍壊 死因子に対して向けられたMab32ダイアボディーの生産、フォルディングおよび 特性決定 この実施例は、マウスモノクローナル抗体Mab32から誘導された、腫瘍壊死因 子に対して向けられたダイアボディーの大腸菌（E．coli）中の生産を記載する 。このタンパク質を細胞内で発現させ、次いで正しくフォルディングされる二量 体の量を最大とするように注意して最適化された、レドックス変性−復元手順を 使用して再生させる。このレドックス変性−復元手順の原理は、発明の名称「ポ リペプチドの処理」のデンマーク国特許出願、DK0130−93およびDK0139−93（H ．C．Thogersen，T．L．HoltetおよびM．E．tzerodt）に 記載されている。 ５アミノ酸のリンカーをもつダイアボディーのフォーマット（実施例７に記載 されている）でエンコードされたMab32を含有するファージミドクローンをポリ メラーゼ連鎖反応において鋳型として使用して、Mab32ダイアボディーに相当す るcDNA断片を生成した。 ウシ制限プロテアーゼ、因子Xaのための切断部位を構成するアミノ酸配列GSIE GRをエンコードするDNA配列を５′末端に取り込むように、PCRのためのプライマ ーをデザインした（K．NagaiおよびH．C．Thogersen，Mcthods in Enzymology 1 52 461-481，1987）。増幅されたDNA断片を大腸菌（E．coli）発現ベクターpT7H6 の中にサブクローニングして（Christensenら、FEBS Letters 295 181-184，19 91）プラスミドpT7H6FX-DBを発生させた。このプラスミドを大腸菌（E．Coli）B L21細胞の中に形質転換した。 ダイアボディー断片を調製するために、プラスミドpT7H6FX-DBを、Studierお よびMoffat（J．Mol．Biol．189 113-130，1986）が記載しているように、100μ ｇ／mlおよび５mMのMgSO4を含有する４リットルの２×TY培地中で37℃において Ａ600＝0.8まで成長させた。次いで、指数的に成長する培養物にバクテリオファ ージλCE６をほぼ５の感染の多重度で感染させた。感染後40分において、リファ ンピシンを添加し（２mlのメタノール／ｌの培地中の0.2ｇ）そして４時間後に 細胞を収穫した。細胞を150mlの0.5MのNaCl、10mMのTris-HCl，pH８，1mMのEDTA の中に再懸濁させた。フェノールpH８（100ml）を添加し、そしてこの混合物を 超音波処理して全体のタンパク質を抽出した。2.5体積のエタノールを添加しそ して遠心することによって、タンパク質をフェノール相から沈殿させた。 タンパク質のペレットを６Ｍの塩化グアニジニウム、50mMのTris-HCl，pH８お よび0.1Ｍのジチオエリスリトールを含有する緩衝液 中に溶解した。セファデックス（Sephadex）G25（Pharmacia、スイス国ウップサ ラ）のゲル濾過により、８Ｍの尿素、１ＭのNaCl，50mM Tris-HCl，pH8および10 mMの２−メルカプトエタノールの中に入れた後、精製の精製タンパク質をＮｉ2+ 活性化NTA−アガロースカラム（75ml，８Ｍの尿素、１ＭのNaCl，50mM Tris-HCl ，pH８および10mMの２−メルカプトエタノールで洗浄した）を精製のために適用 した（Hochuli，Bannwarth，Dobeli，GentzおよびStuber，Bio／Technology 6 1 321-1325，1988）。カラムを200mlの８Ｍの尿素、１ＭのNaCl，50mM Tris-HCl， pH８および10mMの２−メルカプトエタノール（緩衝液Ｉ）および100mlの６Ｍの 塩化グアニジニウム、50mMのTris−HCl，pH８，10mMの２−メルカプトエタノー ル（緩衝液II）で洗浄した。MGSHHHHHHSIEGR融合タンパク質を10mMのEDTAを含有 する緩衝液IIで溶離し、そして溶出液をセファデックスG25でゲル濾過し、溶離 液として緩衝液Ｉを使用した。 次いで溶離したタンパク質を再生させた。タンパク質を100mlのNi-NTAセファ ローズと混合した。結合したタンパク質を含有する樹脂を直径５cmのカラムの中 に詰め、そして緩衝液Ｉで洗浄した。ここで再生を表５に示すサイクリングプロ グラムを使用して11℃〜12℃において次の緩衝液を使用して実施した： 緩衝液Ａ：50mMのTris-HCl，pH８；0.5MのNaCl；２mMの還元したグルタチオン （GSH）；0.2mMの酸化したグルタチオン（GSSG） 緩衝液Ｂ：50mMのTris-HCl，pH８；１ＭのNaCl；3mMのGSH；８Ｍの尿素 タンパク質をこのカラムから50mMのTris-HCl；0.5MのNaCl；25mMのEDTAで溶離 し、次いで５mMのGSH，0.5mMのGSSGに加え、そして20℃において12〜15時間イン キュベーションして正しい分子の形態に再生した。次いで、タンパク質をYM10膜 を使用する限外濾過によ り50倍に濃縮した。第24図において、非還元性SDS-ポリアクリルアミドゲルでタ ンパク質をエレクトロポレイションすることによって再生状態を分析し、そして この実施例において使用した条件（トラック９）が再生された生成物の最高の収 量を与えたことが示された。 ダイアボディーの二量体をセファローズ12カラムを使用するゲル濾過により精 製し、溶離液としてPBSを使用した。 この手順により正しくフォルディングされた物質Mab32ダイアボディーの全体 の収量はほぼ４mg／ｌであった。これは全体の再生収量の20％を表す。 精製の種々の段階からのタンパク質の非還元性のSDS-PAGEによる分析を第25図 に示す。 因子Xa（モル比１：５の因子Xa：ダイアボディー）で37℃において20時間処理 することによって、ダイアボディー生成物のＮ−末端からhis６標識を切断する ことができた。これは第26図において未切断の物質のちょうど下の低分子量のバ ンドの出現として示されている。精製した細胞内で発現されたMab32ダイアボデ ィーの性質 １．Mab32ダイアボディーはヒトTNF-アルファに特異的に結合する。 TNF-アルファおよびBSAを0.1Ｍの炭酸ナトリウムの緩衝液中で４℃において一 夜10μｇ／mlに被覆した。２％マーベルで１時間ブロックし、そしてPBS-ツイー ン20（0.1％）およびPBSで洗浄した後、ダイアボディーを２％マーベルの中に添 加し、そして引き続いて９抗myc標識E10抗体およびペルオキシダーゼ標識化ヤギ 抗マウスIgで検出した。第27図に示すように、Mab32ダイアボディーはTNF-アル ファに特異的に結合し、BSAとの小さい交差反応性がダイアボディーの最高濃度 においてはじめて可視である。 ２．Mab32ダイアボディーはTNFへの結合についてMab32全抗体と競争する。 TNF-アルファおよびBSAを0.1Ｍの炭酸ナトリウムの緩衝液中で４℃において一 夜10μｇ／mlに被覆した。２％マーベルで１時間ブロックし、そしてPBS-ツイー ン20（0.1％）およびPBSで洗浄した後、Mab32全抗体を２％マーベルの中に添加 し、そして引き続いてペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスIgで検出した。同一 ELISAを反復し、ここで競合ダイアボディーをウェルに添加し（10μｌの調製物 、0.21mg／mlに等しい）。第28図はダイアボディーがTNF被覆表面から離れて（ ２価の）Mab32抗体と極めて効果的に競争する方法を示す。３．Mab32ダイアボディーはヒツジ抗301抗血清と競争する。 ヒトTNF-アルファの最初の18アミノ酸残基をエンコードするペプチドでヒツジ を免疫化することによって抗301抗血清をレイズし、そしてこれはネズミMab32抗 体により認識されるエピトープの少なくとも一部分からなっていた。この血清を 分析するために、Mab32抗体を使用する対照ELISAを実施した。（２）におけるの と同一のELISAを反復し、ここで競合ヒツジ抗301抗血清（10μｌの未希釈血清） をウェルにMab32全抗体（前のように３倍の希釈）と一緒に添加した（第29図の 上）。また、（１）におけるのと同一のELISAを反復し、ここで競合ヒツジ抗301 抗血清（10μｌの未希釈血清）をウェルにダイアボディー（前のように３倍の希 釈）と一緒に添加した（第29図の下）。図面に示すように、親の抗体Mab32に似 て、ダイアボディーは抗301抗血清の添加によりTNF表面から離れて競合し、ダイ アボディーがTNF上の親の抗体と同一のエピトープを認識する。４．Mab32ダイアボディーは２価である。 TNF-アルファを４℃において0.1Ｍの炭酸ナトリウムの緩衝液中で一夜10μｇ ／mlに被覆した。２％マーベルで１時間ブロックし、そしてPBS-ツイーン20（0. 1％）およびPBSで洗浄した後、Mab32ダイアボディーを２％マーベルの中に添加 しそして１時間放置した。洗浄後、ウェルを30分間２％マーベル中のビオチニル 化TNFを含有する試料とインキュベーションし、そして30分間ペルオキシダーゼ 標識化エキストラビジン（Sigma、コードＥ−2886）とインキュベーションした 。第30図はダイアボディーをこのELISAの構成において検出できる方法を示し、 調製物の少なくとも一部分が２価の分子であることを証明する。実施例９ ２価および二重特異性のダイアボディーを使用する抗原で被覆した赤 血球の凝集 抗原で被覆した赤血球の凝集は、二量体のダイアボディー中の２つの抗原結合 部位存在の明確な試験としておよび診断試験のための凝集アッセイにおけるダイ アボディーの使用のためのモデルとして働く。 この実施例において、３つのダイアボディーおよび一本鎖Fv断片を抗原被覆赤 血球を凝集するそれらの能力について試験した：phOxおよび雌鶏卵リゾチームに 対して向けられた、ゼロアミノ酸のリンカーをもつNQ11／D1.3ダイアボディー（ NQ11／D1.3／０：実施例１）；雌鶏卵リゾチームに対して向けられた、５アミノ 酸のリンカーをもつD1.3ダイアボディー（D1.3／５；実施例１）；ゼロアミノ酸 のリンカーをもつD1.3ダイアボディー（D1.3／０；D1.3／５のようであるが、VL D1.3に直接融合されたVHD1.3）およびscFvD1.3（J．McCaffertyら、1990）前掲 ）。抗原被覆赤血球の調製 ヒト赤血球（RBC）をこの技術に使用した。赤血球からバッフィー コート除去しそして廃棄した後、それらを洗浄し、回転し、そしてPBSで４回再 懸濁させ、各回上澄み液を廃棄した。この洗浄工程の前に、異なる血液のグルー プの細胞を混合することが重要であった。最後の洗浄および回転後、RBC、被覆 タンパク質溶液（PBS中の20mg／mlまたはそれより少ないリゾチームまたはphOx- BSA）および１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カーボジイミド（E DAC；PBS中の100mg／ml）を混合することによって、充填したRBCをタンパク質で 被覆した。この混合物を回転プラットホームで４℃において1.5時間転倒させ、 次いで赤血球を回転しそして上澄み液を除去しそして廃棄した。引き続いて、細 胞をほぼ10mlのPBS中で５回洗浄し（それ以上の溶血が存在しなくなるまで）次 いで使用するために10mlの最終体積の中に再懸濁させた。アッセイ手順 抗体断片のためのクローンを、細菌の周辺質中で室温（ほぼ24℃）において、 実施例１に記載するように１mMのIPTGを使用して誘発しながら発現させた。無菌 の丸底マイクロタイタープレート中のウェルの第１列を除去した各々に、50μｌ のPBSを添加した。ウェルの第１列に、62μｌの周辺質調製物を添加した（複製 物において）。12μｌをウェルからウェルに移す（最後のウェルから12μｌを廃 棄する）ことによって、プレートを横切って最初のウェルの内容物の５倍の希釈 を行った。各対の第１行に、50μｌの抗原被覆RBCを添加し、そして各々の複製 物に、被覆抗原の不存在下にPBS中のEDACで処理したRBCを添加した。ウェルの内 容物をおだやかに震盪することによって混合し、そしてプレートを混乱させない で室温において60〜90分間放置した。結果 ウェルの下部の全体を被覆する細胞の平坦なマットの発生は、表 ６中で「＋」により示されている、赤血球凝集の発生を示す。赤血球凝集が起こ らない場合、細胞はウェルの中央に緊密なボタンを形成する。 D1.3／5およびD1.3／0の２価のダイアボディーは、純粋な周辺質上澄み液およ びリゾチーム被覆赤血球を含むが、phOx-BSA被覆赤血球または未被覆赤血球を含 まない１：５希釈物の両方で凝集を示し、２価の断片の存在を示す。対照的に、 実施例１に示すscFvD1.3は、モノマーと二量体との間の平衡として存在し、血球 を凝集しない。NQ11／D1.3／0二重特異性ダイアボディーは、リゾチームで被覆 した赤血球およびphOx-BSAで被覆した赤血球の混合物で凝集を示すが、phOx-BSA またはリゾチームのみで被覆した赤血球では凝集を示さない。これは周辺質調製 物中の二重特異性ダイアボディーの存在を示す。実施例10 リゾチームおよび２−フェニル−５−オキサゾロンに対して向けられ た二重特異性ゼロリンカーのD1.3／NQ11ダイアボディーのファージの表示 この実施例は、リゾチームおよび２−フェニル−５−オキサゾロンに対して向 けられた二重特異性ゼロリンカーのD1.3／NQ11ダイアボディーを繊維状バクテリ オファージの遺伝子IIIに融合し、そして両方の抗原への結合を保持してバクテ リオファージ上に表示できることを示す。 実施例１からの構成体VI（リンカーなし）を、ファージの表示のためにファー ジミドpHEN1（H．R．Hoogenboomら、Nucleic AcidsRes．19 4133-4137，1991） の中に再クローニングさせた。両方のポリペプチド鎖をエンコードする断片を、 HindIIIを使用する消化およびXhoIによる部分的消化により切除した。部分的消 化から発生したより大きい断片を、J．D．Marks（J．Mol．Biol．222 581 −597，1991）に記載されてる方法を使用するゲル電気泳動により精製した。こ の断片をPstI／XhoI切断pHEN1の中に結合しそしてTG1の中にエレクトロポレイシ ョンした。 ファージミドをM13K07でレスキューし、そしてファージを含有する上澄み液を 直接アッセイした。ファージの上澄み液（50μｌ）を実施例１におけるようにph Ox-BSAおよび雌鶏卵リゾチームを被覆したプレートを使用するELISAにおいて使 用したが、ただしＭ13に対して向けられたヒツジ抗体を使用してJ．McCafferty ら（Nature 348 552−554，1990）におけるようにファージ抗体の結合を検出し た。NQ11／D1.3／0二重特異性ダイアボディーは、ファージの表面上の表示され るとき、両方の抗原に結合した。0.1のバックグラウンドの値に比較して、雌鶏 卵リゾチームで2.8そしてphOx-BSAで2.7の吸収シグナルが得られた。実施例11 二重特異性ダイアボディーNQ11／OE13の構成 実施例１に記載する２−フェニルオキサゾル−５−オンに対して向けられた一 本鎖Fv断片をエンコードするDNAから、そして実施例１に本質的に記載するよう に方法を使用してエストリオールに対して向けられたハイブリドーマOE13（Amer ican Diagnositics Ltd）から誘導されたDNAから、５アミノ酸のリンカーをもつ ２−フェニルオキサゾル−５−オンおよびホルモンのエストリオールに対して向 けられた二重特異性ダイアボディーをエンコードするクローンを調製した。 OE13のVHおよびＶκドメインをハイブリドーマＶ遺伝子から誘導された一本鎖 FvのDNAから増幅し、そしてApaLI-NotI断片として、Clacksonら（1991、前掲） が記載するようなプライマーおよび方法を使用して、fd-tet-DOG1の中にクロー ニングした。scFv断片をエンコードするDNAをfd-tet-DOG1からPstI-NoTI断片と して切 除し、そしてpHEN−１の中に再クローニングした。 このクローンからのDNAを、実施例１におけるように、プライマーVH1BACK，VH 1FOR-2，Vk2BACKおよびVk4FORを使用するPCRにおいてＶ遺伝子を増幅するために 使用した。遺伝子IIIのリーダー配列を含む遺伝子間領域を、プライマーNterVHf oおよびCterVkbaを使用するPCRにより増幅した。３断片をオーバーラップ延長に よるスプラインシング（Clacksonら、1991）によりアセンブリングし、そしてア センブリー生成物をゲル精製し、そしてプライマーVkbLink5-SacBstEおよびVH1f oBsetELink5Sacで再増幅した。これはOE13Vk−遺伝子間領域−OE13VHインサート を与える。 プライマーVkbLink5-SacBstEおよびVH1foBstELink5Sacの各々は、最終のダイ アボディー構成体の重鎖と軽鎖との間に、５アミノ酸のリンカー、GGGGSをつく るための正しい配列を含有する。プライマーVkbLink5-SacBstEはリンカー配列に 対して５′のBstEIIのための制限部位を含有し、そしてVH1foBstELink5Sacはリ ンカー配列に対して５′のSacI部位を含有する。したがって、これらのプライマ ーで増幅したOE13インサートはBstEIIおよびSacIで消化し、そしてBstEII／SacI 切断ベクターの中に挿入することができる。 OE13インサートをpUC19中のFvNQ11構成体（実施例１参照、構成体III）の中に クローニングした。これはNQ11／pUC19をBstEIIおよびSacIで切断することによ って調製した。OE13インサートをこの中に３：１のモル比（VLN2VH：pUC19-NQ11 ）で結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E．Coli）TG1細胞を形質転 換した。プライマーLMB2およびLMB3を使用する組換えコロニーからのインサート のPCR増幅により、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニン グした。 Ox-BSA（ほぼ10〜12モルのphOx／モルのBSA）で10μｇ／mlに被覆 するか、あるいはエストリオール−BSA（ほぼ30モルのエストリオール／モルのB SA）で10μｇ／mlで被覆したプレートを使用するELISAにより、これらのクロー ンをそれらの抗原について結合する能力についてアッセイし、そしてphOx-BSAま たはエストリオール-BSAで被覆したELISAウェルに50μｌの４％マーベル／PBSを 添加した。モノクローナル抗体９Ｅ10によるmyc標識の検出を使用する、標準のE LISAのプロトコールに従った。陽性のELISAシグナル（＞1.0）が得られた。実施例12 ダイアボディーとCH3ドメインとの間の融合体の構成 ダイアボディーは遺伝的に他のタンパク質、または他の抗体ドメインに融合す ることができる。この実施例は、ダイアボディーを発生させ、この分子の両端に おいて抗原に結合する能力を保持して、ヒトIgGγ４のCH3ドメインに融合させる ことができ、ただし十分な大きさのリンカーを接合部に挿入することを条件とす ることを証明する。 IgGγ４（T．Simonからの提供）のヒトCH3ドメインを、実施例１に記載するNQ 11／D1.3二重特異性ダイアボディーのＣ−末端に融合した。それを直接に、ある いはＣ−末端とCH3ドメインとの間の15アミノ酸の柔軟なスペーサーと融合した 。 pUC19-NQ11／D1.3／0をHindIIIで消去しそしてXhoIで部分的に消化することに よって、NQ11／D1.3を切り出した（実施例１）。 CH3ドメインの５′末端を増幅するために使用したプライマーHuCH3baXhoおよ びHuCH3baLinkXhoの中に、XhoI制限部位を導入した。CH3の３′末端を増幅する ために使用したプライマーHuCH3foEcoの中に、EcoRI制限部位を導入した。これ はダイアボディーおよびCII3断片を３方法結合反応において発現ベクターpUC119 SfiNotmycの中にクローニングできるようにする。ダイアボディ−NQ11／D1.3／CH3の構成 ヒトCH3鎖に直接連鎖したダイアボディーを構成するために、IgGγ４のヒトCH 3ドメインをプライマーHuCH3foEcoおよびHuCH3baXhoで標準の条件下にPCR増幅し た。PCR生成物（CH3およびLinkCH3）をXhoIおよびEcoRIで切断した。ダイアボデ ィー断片HindIII／XhoIおよびCH3ドメインDNAをHindIII／EcoRI消化したpUC119S fiNotmycの中にモル比２：３：１：（NQ11／D1.3／0：CH3：pUC119SfiNotmyc） で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E．coli）TG1細胞 を形質転換した。プライマーHuCH3foEcoおよびLMB3を使用する組換えコロニーの PCR増幅により、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニング した。ダイアボディーNQ11／D1.3／リンカー／CH3の構成 CH3ドメインに対して15アミノ酸のリンカーをもつダイアボディーを構成する ために、同様なプロトコールに従った。IgGγ４のヒトCH3ドメインをプライマー HuCH3baEcoおよびHuCH3baLinkXhoで標準の条件下にPCR増幅した。PCR生成物（CH 3およびLinkCH3）をXhoIおよびEcoRIで切断した。ダイアボディー断片HindIII／ XhoIおよびCH3ドメインDNAをHindIII／EcoRI消化したpUC119SfiNotmycの中にモ ル比２：３：１（NQ11／D1.3／0：CH3：pUC119SfiNotmyc）で同時に結合し、そ して生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E．coli）TG1細胞を形質転換した。プ ライマーHuCH3foEcoおよびLMB3を使用する組換えコロニーのPCR増幅により、組 換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT／0.1 ％グルコース／100mg／mlのアンピシリン中で対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの 最終濃度にIPTGを添加することによ って誘発し、そして22℃において３時間成長させた。細胞を遠心（1000ｇ、10分 ）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBS／１mMのEDTAの中に再懸濁させ 、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心（1000ｇ、10分）し、そして ダイアボディーを含有する上澄み液をELISAにおいて使用した。実施例１に記載 されているようにphOxおよびリゾチームへの結合についてELISA（セロテク（Ser otech）からの抗ヒトCH3γ４を使用する結合した抗体の検出を使用する）および 実施例１に記載するようにBIAコアにより分析すると、15アミノ酸のスペーサー をもつ抗体のみが２−フェニルオキサゾル−５−オンおよびリゾチームに対する 特異性を保持した。 スーパーデックス（Superdex）75を使用するFPLCゲル濾過により分析およびBI Aコアを使用する結合の検出（実施例１に記載するように）は、物質の約30％が 二量体であることを示した。こうして、より大きい断片がこの方法において事実 作ることができる。このCH3融合体中の30％の二量体は親NQ11／D1.3リンカーの ダイアボディーをもつ100％の二量体と対照をなし、CH3ドメインの存在がこのダ イアボディーの二量体化の平衡を混乱させる。実施例13 ヒトPBLによるヒト腫瘍細胞のダイアボディー仲介溶解 腫瘍特異的マーカーを介して腫瘍細胞に結合しそしてレセプター、例えば、CD 16を介してヒトエフェクター細胞に結合する二重特異性抗体は、ヒトエフェクタ ー細胞による腫瘍細胞の溶解を仲介することができる（参照、例えば、Garcia d e Palazzo l．ら、CA19−9抗原およびCD16をターゲッティングする二重特異性抗 体の抗腫瘍作用、Cancer Research 52，pp5713−5719）。 腫瘍特異性抗原癌胎児性抗原（CEA）に結合するネズミ抗-CEA抗体およびヒト 細胞表面タンパク質CD16に結合するモノクローナル抗体３Ｇ８（Flcit，H．B.， Wright，S．D．およびUnkeless，J．C．（198 2）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79，p3275-3279）から誘導された可変領域を使 用して、二重特異性ダイアボディー（CBM−１）を構成した。CBM−１はこの特許 に記載されている技術により第32図に概説されているスキームを使用して構成し 、可変ドメインの間に５アミノ酸のリンカーを有しそしてCEAおよびCD16の両方 に結合する。CBM−１は精製したCEAおよびCD16にELISAにより結合する。 クロム51解放アッセイによりアッセイした溶解百分率（溶解％）により細胞の 殺しを決定した（Brunner，K．T.，Engers，H．D．およびCerottini，J．C．（1 976）、生体外の細胞仲介細胞溶解の定量的測定に使用した51Cr解放アッセイ；B loom，B．およびDavid，J．R．（編）、細胞仲介および腫瘍免疫性における生体 外の方法、p423。Academic press、ニューヨーク）。 エフェクター細胞（末梢血リンパ球（PBL））はヒトドナーから入手しそして 、フィコール−イソパーク（Ficoll−Isopaque）（Ficoll−Paque，Pharmacia， スイス国ウップサラ）密度遠心を使用してBoyum，A（1968）Scan．J．Clin．Lab ．Invest．21（suppl．97），p7のプロトコールに従い全血から単離した。 CEAを収容する2×106のLS174T標的細胞をトリプシン処理後に収穫し、そして1 0％胎児仔ウシ血清を含有するRPMIで洗浄した。細胞の遠心後、ペレットを51Cr （200μCi）で37℃において１時間標識化する。RPM1中で２回洗浄後、標的細胞 をマイクロプレート（5000細胞／ウェル）にエフェクター細胞と一緒に添加して 、種々のエフェクター：標的比を得る。ダイアボディー（１mg／mlまで）を200 μｌで添加した後、37℃において４時間インキュベーションする。細胞を回転し 、そして上澄み液の半分（100μｌ）を集め、そしてクロムの解放をガンマカウ ンターで決定する。各の試料点を三重反復実験において実施し、そして比溶解を 次のようにして計算する： 100×（平均の試料の解放−自発的解放）／（最大の解放−自発的解放） 自発的解放はアッセイ培地単独中の標的細胞から測定し、そして最大の解放は １ＭのHCl中の標的細胞の同等の数の溶解後に測定する。 第31図は、PBLエフェクター細胞／LS174T腫瘍細胞の標的の種々の比における ドナーＤからのPBLを使用する実験からのデータを示す。データは、1000ng／ml のダイアボディーを使用するが、10ng／mlのダイアボディーを使用しないときの 、エフェクター細胞を増加するCBM-1仲介細胞溶解を示す。こうしてCBM-1は腫瘍 標的細胞の殺しを仲介し、そして細胞の殺しは使用するCBM-1ダイアボディーの 投与量に依存する。 この実験が証明するように、二重特異性ダイアボディーは１つの細胞（腫瘍細 胞）の他の細胞（ヒトPBLの中に含有されるCD16陽性細胞）により殺しを仲介す ることができる。実施例14 ファージ上に表示される二重特異性ダイアボディーのレパートリーの 構成 われわれは、ここで、２工程の構成、およびダイアボディーのレパートリーの バクテリオファージ上の表示および２つのハプテン、一方のアーム上の２−フェ ニルオキサゾル−５−オン（phOx）、および他方のアーム上のジゴキシン（Dig ）に対する特異性をもつ二重特異性ダイアボディーの選択を記載する。 最初に、免疫化マウスの脾臓から得られたＶ遺伝子を使用して、２つのscFvレ パートリーをアセンブリングした。これらのレパートリーをファージ上に表示さ せ、そして抗原上で選択してバインダーについて濃縮した。第２クローニング工 程において、Ｖ遺伝子を再シャフリングして二重特異性ダイアボディーのレパー トリーを形成 し、レパートリーはファージ上に表示されそして順次に２つの抗原（phOx−ウシ 血清アルブミン（BSA）およびジゴキシゲニン−BSA）上で選択した。 この節に記載する増幅反応のすべては、特記しない限り、基本的サイクリング のプロトコールを使用する：94℃１分間、55℃１分間、および72℃２分間、25サ イクル、セツス（Cetus）またはベーリンガー・マンヘイム（Boehringer Mannhe im）から購入したTaqポリメラーゼ、および供給業者が記載する緩衝液組成物を 使用する。２つの構成ブロック：抗ジゴキシンおよび抗phOx活性の種々のscFvレパートリー の構成 免疫化マウスの脾細胞からの抗体の高度に多様なレパートリーを、本質的にCl acksonら、Nature 352，624-628（1991）に記載されているようにして作った。 ２つのハプテン、ジゴキシンおよびphOxを選択した。３匹のマウスのグループを 抗原（Dig−ニワトリ血清アルブミン（CSA）またはphOx−CSA）で免疫化した。 抗原に対する免疫応答を被覆抗原（phOx-BSAまたはDig-BSA）を使用する標準のE LISAによりモニターした。すぐれたphOx応答をBalb／Ｃマウスにおいて誘発する ことができた（10-5の抗体力価が、満足すべき抗ジゴキシン力価（105またはこ れよりすぐれる）を達成するためにＡ／Ｊマウス使用することが必要であった。 また、一次応答および二次応答の間に生成する抗体の潜在的変動を探索するため に、phOx-CSAで免疫化した３匹のマウスを同一抗原で免疫化した残りの３匹のマ ウスより４週早く脾摘出した。いったん適当な応答が達成されたとき、二次免疫 化を抗原のみ（phOxおよびDig）で実施し、３日後に脾臓を取り出した。 単細胞の懸濁液を各超免疫化脾臓から調製しそしてプールし、次いでRNAzolの Ｂ系（Biogenesisリミテッド、英国ボウネマウス）を 使用してRNA調製した。この方法において単離されたRNAをそれ以上修飾しないで 使用して第１鎖cDNAを調製し、そして、これから、一次VHおよびVLバンドを調製 した（Clacksonら、1991、前掲、におけるように）。増幅されたVHおよびVLのDN AをPCR誘導法において、クローニングのための制限部位で標識化したプライマー を使用してscFv遺伝子としてアセンブリングした。PCRアセンブリーを使用して 標準のscFvフォーマットにおいて15アミノ酸のリンカーをエンコードする断片を 介してVHおよびVL遺伝子を接合した（（Glｙ4Ser）3配列を使用する）。SfiIお よびNotIで制限後、アセンブリングした断片を適当に切断したファージミドベク ターpCANTAB5mycの中に結合し、そしてレパートリーを大腸菌（E．coli）の中に エレクトロポレイションした。Dig-レパートリーを同様な方法においてわずかに 異なるプライマーを使用して作ってそれ以上の研究のための追加のクローニング 部位を含めた（そしてリンカー配列を（Gly4Ser）2Gly2Scr2に変化させた）。（ 注：唯一の差はリンカー配列をLINK-FOR-XHOおよび標準のLINK-BACKプライマー を使用して作ったということである；LINK-FOR-XHO配列は後のクローニングのた めにXhoI部位を導入する）。 われわれは１×106および７×106の独立のクローンのライブラリーの大きさを 一次および二次のphOxの応答のために、そして３×106のライブラリー大きさを ジゴキシゲニンのために生成することができた。多様性はscFvDNAのBstNI消化に より確証され、多数の異なるパターンを示した（示されていない）。２つのphOx ライブラリーをプールすると、phOxおよびDigバインダーについての濃縮は、そ れぞれ、高度に誘導されたphOx-BSA（14：１のモル比）およびDig-BSA（25：１ のモル比）上の数ラウンドのパニング（panning）により達成された。すべての 可能なバインダーを保持するために、パ ニング選択において使用した免疫管上のコーティングのために非常に高い抗原濃 度を使用した（１mg／ml）。１および２ラウンドのパニング後、phOxライブラリ ーからのすべてのクローンの66％および94％がそれぞれphOx-BSAに結合し、そし てBSAに結合しない（示されていない）。同様に、ジゴキシゲニンのバインダー は２ラウンドの選択後豊富である（90％）。広範な種類のELISAシグナルが１ラ ウンドの選択後に見られ、それ以上のラウンドにわたっていっそう均質にかつよ り高くなる。二重特異性ダイアボディーのレパートリーのための構成ブロックと して、ラウンド１の抗phOxレパートリーからのDNA（E1−OX ds−DNA；66％の陽 性）およびラウンド２の抗Digレパートリー（E2−DIG ds−DNA；90％の陽性）を 選択した。二重特異性レパートリーの構成 クローニングのスキームの外観は第３３図に記載されている。第１Ｖ−VLの組 み合わせをスプライスオーバーラップ延長PCR反応により作った。選択したVL-DI Gレパートリーおよび選択したVH−OXレパートリーを、次のようにして２つの停 止コドン、リボソーム結合部位およびシグナル配列をエンコードするDNA断片と 一緒にスプライスした。VH-DIGレパートリーをＥ２−DIG ds−DNAからプライマ ーpUC逆およびVH1FOR−２を使用して増幅した。VH−OXレパートリーをE1−OX d s−DNAからプライマーMVKBBSTおよびVK4FORを使用して増幅した（Clacksonら、1 990）前掲）。MVKBBSTはVH1FOR−２に対して相補的な５′配列、それゆえ、VH遺 伝子３′配列を含有するようにデザインした。RBS断片と呼ぶ第３断片をファー ジミドpCANTAB5-FabD1.3（クローンLN11）からのde-DNAから増幅して、２つのVH −VLカッセトの間のための配列を供給した。増幅された鋳型の配列は次の通りで ある：５′−TAA TAA CCC TGC AGG TCG ACA AGG AGA CAG TCA GTG AAA AAA CTC CTC TTT GCC ATA CCA CTC GTG GTG CCA TTT TAC TCC GCG GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCC-３′。逆プライマー混合物（LBRBS−１ ，２，３，４，５）（VL遺伝子３′配列に対して相補的な配列領域を含有するよ うにデザインされた）および前方プライマー、LFRBS-２（これはVL-OXの３′以 外のどこかに位置するリンカーと望ましくないアセンブリー生成物の形成を回避 するためにVH遺伝子と相補的な配列を含有しないように適合された）を使用して 、鋳型を増幅した。３つの断片、VH−DIG，VL−OXおよびLN11誘導断片を、PCRお よびオリゴヌクレオチドpUC逆およびLFRBS−２を使用してスプライスオーバーラ ップ延長によりアセンブリングした。VH−DIG／VL−OX−RBS断片をゲル精製しそ して次の工程において使用した。 第２工程において、VL−OXレパートリーをE1−OX ds−DNAからプライマーVH1 BACKSfiKspおよびVH1FOR−2Xhoを使用して増幅した。第１プライマーは標準のVH 1BACKプライマーの回りにデザインした（Clacksonら、1990、前記）が、KspI部 位を含有する長い５′標識を含有する。前方プライマー（VH1FOR−2Xho）は再び 標準のVH1FOR−２に基づく（Clacksonら、1991、前掲）が、ここでXhoIクローニ ング部位を含有する。増幅された生成物をゲル精製し、そしてゲル精製したプラ イマーVH-TagおよびXho-Tag、およびVH−OX断片を使用して再増幅した。 アセンブリングされたVH-DIG／VL-OX-RBS生成物およびVL-OXを引き続いてKspI で切断し（VH−OXの５′標識の中およびRBS断片の３′末端におけるリーダー配 列内に存在する）、そして結合キット（Amersham）によりＴ４DNAリガーゼを使 用して一緒に結合した。結合混合物の試料を、プライマーpUC逆およびXhoTagを 使用するPCRにおいて直接使用して、結合された生成物をプルースルー（pull -through）した。この断片、VH-DIG／VL-OX-RBS-VH-OX、をゲル精製し、XhoIで 切断し、そして再びゲル精製して、最後の工程、すなわちVL-DIGレパートリーの 添加のためにそれを準備した。 最後のＶ遺伝子のレパートリー、VL-DIGは、プライマーLINKBACK（Clacksonら 、1991、前掲）およびfd-tet-seq24を使用するPCRによりＥ２−DIG ds−DNAか らPCRにより得た。断片をゲル精製し、XhoIで切断しそしてゲル精製した。VL-DI G DNAをVH-DIG／VL-OX-RBS-VH-OX DNAに結合し、そして結合混合物の試料をプラ イマーBioGene3Leadおよびfd-tet-seq24を使用するPCRにおいて直接使用して結 合した生成物をプルースルーした。この断片は、ここで２つのアセンブリングさ れたVH−VL遺伝子のカッセトを含有し、ゲル精製し、SfiIおよびNcoIで切断し、 ゲル精製し、ファージミドベクターpCANTAB5mycの中に結合し（第19図）（同一 酵素で制限した）、そしてエレクトロポレイションにより大腸菌（E．coli）TG1 の中に導入した。 第１クローニングは50000クローンのレパートリーを生じ、クローンの95％は 完全な二重特異性のダイアボディーのインサートを有し、そしてBstNIフィンガ ープリンティングにより判定して多様性を保持した（示されていない）。 ファージ粒子をレパートリーから、基本的にMarksら、J．Mol．Biol．222，58 1-697，1991に記載されているように調製した。レスキュー手順における唯一の 差は、ヘルパーファージの感染後の培養の成長温度であった。30℃の代わりに、 より低い温度を使用した（22℃）。一夜（20時間）のインキュベーション後、２ 回のPEG沈澱により培養上澄み液からファージを調製した。力価はファージ上に 表示されたscFvレパートリーから得られた力価に類似した（ほぼ1012コロニー形 成単位／ml培養上澄み液）。ファージをphOx-BSA上 の選択のために使用し（前述したように、パニングにより）、そして結合するフ ァージをTG1の中に再感染させた。この選択の前後の個々のクローンをELISAによ りphO-BSA，Dig-BSAおよびBSAへの結合について分析した。ダイアボディーをフ ァージ−ダイアボディー（ダイアボディーはヘルパーファージで個々のクローン のレスキュー後にファージ上に表示された）としておよび可溶性ダイアボディー （１mMのIPTGで誘発しそして22℃において20時間成長させた培養物の上澄み液を 使用する）として分析した。第34図は簡索化のために灰色の目盛りでELISAの結 果示す；＜0.2のELISAのODを結合の証拠のためのカット−オフとして取った；し たがって、灰色のシグナルをもつすべてのウェルは陽性であると考慮した。プレ ート１，４および７は、ファージ上に表示されたダイアボディーとして未選択の レパートリーの96クローンのELISA分析（それぞれ、Dig−BSA，phOx−BSAおよび BSA上の）に相当する（同一のクローンからのファージを含有する上澄み液を３ つのELISAの各々において分析した）。phOx-BSA上で選択したレパートリーをフ ァージ上に表示されたダイアボディー（プレート２，５および８）としておよび 可溶性ダイアボディー（プレート３，６および９）として分析した。最初に、フ ァージのELISAを論考する。第34図が示すように、選択の前に、レパートリーはD IGのみ（ウェルＡ７，Ｃ７など）、phOxのみ（ウェルＧ２，Ｈ４，Ｆ11）に対す るバインダーを含有するが、また、両方（ウェルＡ３，Ａ６，Ｂ９，Ｃ５，Ｄ12 ，Ｈ12）に対するバインダーを含有する。この二重特異性のレパートリーのため の出発レパートリーは66％のphOxバインダーおよび90％のDigバインダーを有し た。再クローニング後、９／96（9.3％）phOxバインダーおよび14／96（14.5％ ）Digバインダーが得られる。それゆえ、すべてのＶ遺伝子のレパートリーは再 クローニングの間にシャフリ ングされており、そしてＶ遺伝子のレパートリーのいくつかはほぼ100サイクル のPCRに付されたが、われわれの二重特異性レパートリーにおいて比較的高いレ ベルのバインダーが得られる。また、これが示すように、scFvフォーマットにお いて抗原に結合する大部分の抗体は、また、二重特異性ダイアボディーのフォー マットにおいて機能することができるに違いない。6／96クローンは両方の抗原 に結合するので、50000クローンのもとのレパートリーは3000より多い二重特異 性抗体を有するであろう。 phOx-BSA上で濃縮すると、ほぼ40／96二重特異性抗体が得られ、17クローンは phOxのみに結合し、そして９クローンはDigのみに結合する。明らかなように、p hOxの選択はphOxバインダーの頻度を増加し（9／96から57／96）に、そして期待 されるように、Digのみのバインダーの数は減少する（14／96から9／96）。この 選択は、ダイアボディーをレパートリーから標準のファージのフォーマットを使 用して選択することができることを証明する。 第35図は、可溶性断片（下部）のファージのダイアボディー（上部）として、 選択された二重特異性クローンのいくつかについてのDigおよびphOxへの結合に ついてのELISAシグナルの試料を示す。いくつかのクローンは両方のDigおよびph Oxについて同様なELISAシグナルを有するが、他のものはそれらの結合の挙動が 完全に異なる。これらの結果から明らかなように、われわれは、異なる二重特異 性ダイアボディーの全系列を選択し、そして、BstNIフィンガープリントの分析 により確証することができるのは、ちょうど１クローンだけではない（結果は示 されていない）。 可溶性ダイアボディー断片のELISAは、ファージのダイアボディーのELISAと同 一の傾向を示す。プレート３，６および９は、ファージのダイアボディーを分析 した同一のクローンから得られた可溶 性ダイアボディーを使用するELISAである（プレート２，５および８；第34図） 。陽性の頻度は明らかなようにより低い、これは多分ELISAの感度が低いか、あ るいは生産されるダイアボディーの量の変動のためである。しかしながら、可溶 性ダイアボディーのELISAの結果はファージのELISAの結果と完全に一致する。例 えば、プレート３および６のウェルＢ８におけるクローンは可溶性ダイアボディ ーとして二重特異性であるが、また、ファージ上に表示されるとき二重特異性で ある（プレート２および３上のウェルＢ８）。同様に、ウェルＢ２におけるクロ ーンは可能性およびファージの両方のダイアボディーとしてDig特異性である。 これらのクローンが二重特異性であることをさらに証明するために、４クロー ン（ウェルＧ９，Ｆ12，Ｈ４およびＦ２から）を凝集アッセイにおいて可溶性断 片およびファージのダイアボディーとして分析した。基本的に実施例９に記載さ れているように、赤血球をDig-BSAまたはphOx-BSAで被覆し、細胞を混合しそし て周辺質抽出物または培養上澄み液（可溶性ダイアボディーについて）または培 養上澄み液（ファージのダイアボディー）とインキュベーションした。凝集はす べての４クローンについてすべての期待した場合において透明である（そして培 養上澄み液についてより周辺質抽出物についていっそう強い）（結果は示されて いない）。 これらの結果が示すように、二重特異性（したがって、最もありそうなことに は２価の）ダイアボディーのレパートリーを発生させ、ファージ上に表示させ、 そして抗原で選択することができる。実施例15 VHドメインに対してＮ−末端のVLドメインをもつダイアボディー：２ −フェニルオキサゾル−５−オンに対して向けられた２価のダイアボディーの構 成および発現 通常のダイアボディーのフォーマットにおいて、重鎖の可変ドメ インは軽鎖の可変ドメインに対してＮ−末端である（Ｎ−（VH−VL）−Ｃ）。こ の実施例は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの向きが逆転されている（VL−VH） ダイアボディーの構成を記載する（「逆」ダイアボディー）。これは、２つのＶ IIドメインよりむしろ、２つのVHドメインの並置を生ずる。２価のNQ11逆ダイアボディーの構成 ベクターfd-CAT1中のNQ11scFvクローン（J．McCaffertyら、1990、前掲）を、 VLおよびVHドメインの増幅のための基質として使用した。増幅生成物を制限酵素 XhoIで消化しそして結合してSfiIおよびNcoIの消化およびファージミドベクター pCANTAB5-mycの中へのクローニングのための逆ダイアボディー構成体をエンコー ドするDNAを提供することができるように、プライマーをデザインした。プライ マーSfiVLBack（表１）およびfdtseq1を使用してVLドメインを増幅し、そしてプ ライマーVL／VHBackXhoIまたはVL／LHBackXholＡをVHドメインの増幅のためにVH ForNotとともに使用した。 SfiVLBackは、NQ11VLの５′末端に対して相補的である配列および引き続いてS fi1制限部位を含有する33塩基のオーバーハングから成る。Fdtseq1はVL配列に対 して３′に横たわる遺伝子IIIコーディング配列内の領域に結合する。増幅したV Lドメインは、３′末端の10bp内に前もって存在するXhoI部位および５′末端に プライマー誘発SfiI部位を含有する。 VHForNotは、NQ11VHの３′末端に対して相補的である配列および引き続いてNc oI制限部位を含有する24塩基のオーバーハングから成る。VL／VHBackXholはNQ11 VHのDNAの５′末端に対して相補的である配列および、XhoI制限部位を含むNQ11V LのDNAの３′末端に対して相補的である配列から成る。VL／VHBackXholAはVL／V HBackXholに類似するが、VHおよびVL配列の間の接合部に２つの余分のグ リシンコドンを含有する。 増幅生成物をXhoIで消化しそしてゲル精製した。断片を結合しそして結合生成 物をフランキングプライマーSfiVLBackおよびFdtseqlを使用するプルスルー（pu llthrough）増幅のための鋳型として使用した。VL／VHBackXholを一次PCRにおい て使用した場合、プルスルー生成物はリンカー残基をもたない逆ダイアボディー を発生した。VL／VHBackXholＡを使用した場合、プルスルー生成物は２つのグリ シン残基のリンカーをもつ逆ダイアボディーを発生した。 プルスルー生成物をSfiIおよびNcoIで消化し、そしてSfiI／NotI消化ベクター 、pCANTAB5-mycに結合した。精製した構成体を電気成分の大腸菌（E．coli）TG1 細胞の中にエレクトロポレイションしそして２％グルコース、100μｇ／mlアン ピシリンを含有する2TY／寒天プレート上にプレートした。 生ずるコロニーを2TY，0.1％グルコース、100μｇ／mlアンピシリン中で30℃ において対数期に成長させることによって、可溶性ダイアボディーを発現させた 。IPTGを１mMに添加し、そして細胞を22℃において24時間インキュベーションし た。細胞を遠心（1000ｇ，10分）そして上澄み液をELISAにおいて使用した。 80μｌの上澄み液を２−フェニルオキサゾル−５−オン／BSA接合体（PBS中の 100μｇ／ml）で被覆したELISAウェル中の20mlの５×PBS，10％マーベルに添加 し、そして２％マーベル／PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従 い（H．R．Hoogenboomら、1991、Nucl．Acids Res．19，4133−4137）モノクロ ーナル抗体９Ｅ10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGを 使用するmyc標識の検出を使用した。０リンカーおよび２残基のリンカーのNQ11 逆ダイアボディーの両方により結合が検出された（第36図）。 逆ダイアボディーが２価であることを確証するために、誘発後４時間に調製さ れた周辺質抽出液について赤血球凝集アッセイを実施した。細胞を５mlの培養物 中で成長させ、上のように誘発し、そして22℃において４時間成長させた。細胞 を遠心し、そしてペレットを250μｌのPBS，１mMのEDTAの中に再懸濁させた。氷 上で15分間インキュベーションした後、細胞を遠心しそして周辺質上澄み液を凝 集アッセイにおいて使用した。50μｌの周辺質上澄み液を２−フェニルオキサゾ ル−５−オン／BSA接合体で誘導した50μｌのヒツジ赤血球とインキュベーショ ンした（誘導はPBS中の20mg／mlの２−フェニルオキサゾル−５−オン／BSAおよ びPBS中の100mg／mlのエチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カーバミド と赤血球を４℃において1.5時間インキュベーションすることによって達成した ）。 ０リンカーおよび２残基のリンカーの逆ダイアボディーからの純粋な周辺質上 澄み液は誘導された赤血球を凝集させ、そして非誘導の細胞を凝集させなかった 。これにより示されるように、Ｖドメインの向きが逆転されたダイアボディーは フォルディングして安定な活性の２価の結合性タンパク質を形成することができ る。 ２価のphOx特異性逆ダイアボディーをエンコードするDNAは、一方のアームがp hOxに対して向けられそして他方のアームがNIPに対して向けられた逆のフォーマ ットで二重特異性ダイアボディーの構成において使用できる。これはVH NIP−遺 伝子間領域をエンコードするDNAを２価のNQ11クローンの中に挿入し、こうして ２つのポリペプチド鎖を生成し、こうしてVL Ox／VH NIPおよびVL NIP/VH Oxを 生成することによって達成される。遺伝子間領域はリボソーム結合部位および第 ２ペプチドのためのリンカー配列を含有する（VLNIP／VH Ox）。実施例16 VHおよびVLドメインの間の10アミノ酸のリンカーはモノマーの形成を 可能とするという証拠 実施例１において構成体の発生について記載したよに、一本鎖FvNQ11の10アミ ノ酸のリンカーのバージョンを調製した。実施例１において、このダイアボディ ーの５および15アミノ酸のバージョンを作った。この実施例において、ダイアボ ディーの構成はプライマーを使用して10アミノ酸のリンカーを発生させてリンカ ーを導入することによって完結する。 クローンをTG1中で発現させそして断片を実施例１におけるようにphOx−BSA− セファローズのクロマトグラフィーにより精製した。 精製したタンパク質をセファデックスのカラムを使用するFPLCゲル濾過により 分析し、そしてファーマシアBIAコアによりphOx-BSAへの結合を分析した。10ア ミノ酸のリンカーのNQ11ダイアボディーの見掛けの分子量はFvNQ11および15アミ ノ酸のリンカーのscFvNQ11のそれと同一であったが、ダイアボディーを形成する ５アミノ酸のリンカーのNQ11分子のそれより小さかった。こうして、10残基のリ ンカーは同一鎖からVHおよびVLドメインの間の対合を可能とするために十分であ るように思われる。しかしながら、モノマーの形成を可能とするリンカーの正確 な大きさは、また、リンカーの配列に依存するようである。例えば、リンカーの 中に崇高の鎖の配列（例えば、Tyr）が存在した場合、このような短いリンカー でモノマーを形成することはいっそう困難であったであろうことが予測される。実施例17 二重特異性抗NIP、抗ヒトFcR1ダイアボディーの調製 NIP（４−ヒドロキシ−２−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸）および０アミ ノ酸のリンカーをもつヒトFcγRIレセプターに対して向けられた二重特異性ダイ アボディーを、中間体として調製した２価 の抗FcγRIダイアボディーを使用して調製した。２価の抗FcγRIダイアボディーの構成 022はヒトFcγRIに特異的に結合するネズミモノクローナル抗体である。それ はファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLで５残基のリンカ ーを使用してダイアボディーのフォーマットでクローニングされた。リンカーの 配列はVKの５′末端の増幅に使用されたプライマー（Vk022SacbaLink5BstEII） の中に取り込まれ、そしてこのプライマーは、また、SacI制限部位をVkの開始に 導入する。BstEIIのための制限部位はプライマーVk022SacbaLink5BstEIIのリン カー配列の５′およびまたVH1FOR−２の３′末端に組み込まれた（E．S．Wardら 、1989、前掲）。SfiI制限部位をVHの５′末端の増幅に使用されたプライマーVH 022Sfibaの中に導入する。NcoI制限部位をVKの３′末端の増幅に使用されたプラ イマーVk022foNotの中に導入する。これはVHおよびリンカー−VL断片を３方法の 結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングできるよう にするであろう。 VH022遺伝子をプライマーVH022SfibaおよびVH1fo-2を使用するPCRにより増幅 した。Vk022遺伝子をプライマーVk022SacbaLink5BestEIIおよびVk022foNotで増 幅した。鋳型として022VHおよびVL遺伝子（Sctogenにより供給される）をエンコ ードするＭ13ファージとともに、標準の条件使用した。VH PCR反応の生成物を制 限酵素SfiIおよびBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素NotIお よびBstEIIで消化した。VHおよびVLドメインのDNAをSfiI／NotI消化pUC119SfiNo tmycおよびpCantab6の中にモル比３：３：１（VH：VL：pUC119SfiNotmyc）で結 合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E．coli）TG1細胞を形質転換 した。組換え体を022特異的プライマーVH022baSfiおよびVk022foNotを使用して 正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。VHおよびVLドメインの DNAを、また、同一の方法でSfiI／NcoI消化pCANTAB6ベクターの中に結合し、そ して大腸菌（E．coli）HB2151細胞を形質転換するために使用した。 可溶性ダイアボディーをpUC119SfiNotmycクローンからTG1中で37℃における成 長により発現させた。２mlの２YT／0.1％グルコース／100mg／mlアンピシリン中 で対数期の成長の細胞を、IPTGを１mMのIPTGの最終濃度に添加することによって 誘発し、そして22℃において３時間成長させた。細胞を遠心（1000ｇ、10分）し 、そして細胞ペレットを100μｌの氷冷PBS／１mM EDTAの中に再懸濁させ、そし て氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心（1000ｇ、10分）し、そしてダイア ボディー含有上澄み液をELISAにおいて使用した。 ELISAについて、アッセイのプレートを炭酸塩緩衝液中のヤギ抗ヒトIgM（Sera Lab）の１：500希釈物で37℃において４時間被覆した。ウェルをPBS／１％BSAで ブロックしそして100γｌのヒトFcガンマRI−IgM融合体を含有するCos上澄み液 を添加し（１％BSA／PBS中で１：４に希釈した）そして37℃において１時間イン キュベーションした。上のようにして調製したダイアボディーの上澄み液をその ２×希釈で200μｌに添加した。さらに、各ウェルは10μｇ（10γｌ）のヒトIgG l，λ（Sigma）を含有した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ヒト カッパ抗体（Sera−Lab）を使用して37℃において１時間、結合を検出し、そし てOPD基質で展開した。濃縮した上澄み液の試料を使用して492nmにおいて、1.0 より大きいELISAシグナルが得られた。二重特異性抗NIP、抗FcγRIダイアボディー022／B18／0の構成 このダイアボディーは実施例３におけるダイアボディーNQ11／B1 .8について使用した方法に類似する方法で構成した。ダイアボディー022／５（ 上を参照）をBstEIIおよびSacIで切断して、VH022およびVL022アームをもつベク ター構成体を生成した。次いで、抗体B1.8のVHおよびVL配列をこの中にクローニ ングして、二重特異性ダイアボディー022／B1.8／０を生成した。 ２つの抗体の特異性022（抗ヒトFcγRI）およびB1.8（抗NIP）を二重特異性ダ イアボディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVLを直接０リンカーと向 きVH−VLでファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で融合した。リンカー配列 をV1の５′末端の増幅に使用したプライマー（V1B1.8baLinkOBstE）の中に組み 込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVIBのリンカー配列の５′に取り込まれ た。AscI制限部位をVKの３′末端の増幅を使用するプライマーV1B1.8foAscの中 に導入する。これにより、VH−リンカーおよびリンカー−VL断片を３方結合反応 において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングすることができるで あろう。 VHB1.8をプライマー２および６（実施例１）で増幅し、V1B1.8をプライマーV1 B1.8baLinkOBstEおよびV1B1.8foAscで増幅し、プライマーV1B1.8baLinkOBstEお よびV1B1.8foAscはfdDOG-1の中にクローニングされたscFvB1.8からのものであっ た（R.Hawkinsにより供給された）。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびS acIで消化し、そしてVI PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBstEIIで消化し た。ダイアボディー022／５（上を参照）のベクター断片をBstEII／SfiIで切断 し、そしてVHおよびVLドメインのDNAをそれとモル比３：３：１（VH：VL：pUC11 9−022／５）で同時に結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli） TG1細胞を形質転換した。組換え体をプライマーLMB2およびLMB3を使用して正し い大きさのインサートについてスクリーニングし、組換え体からのインサー トをPCR増幅した。 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。２mlの2YT／0.1 ％グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を１mMのIPTG の最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において３時間成長させた 。細胞を遠心（1000ｇ、10分）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBS／ １mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心 （1000ｇ、10分）し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液をELISAにおい て使用して前述したようにヒトFcγRIレセプターに結合しそして次のようにして NIP-BSAに結合した。 50mlの周辺質上澄み液＋50mlの４％マーベル／PBSをNIPで被覆したELISAウェ ル（BSAを10〜12分子のNIPで誘導した）（PBS中の10μｇ／ml）に添加し、２％ マーベル／PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い（H.R.Hoogen boomら、Nucl.Acids Res．19，4133-4137，1991）、モノクローナル抗体9E10、 およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGを使用するmyc標識の検 出を使用した。10分後、両方の抗原についてのELISAの読みは1.0より大きかった 。 NP−セファローズのアフィニティーカラム（T.Simon、博士論文、コルン大学 、1990）による精製のために、発現を前述したように実施したが、ただし誘発後 、細胞を22℃において26時間成長させた。細胞を8000rpm／10分／４℃におい沈 澱させ、そして上澄み液を0.16μのFILTRONミニセッテ（Minisette）を使用して 濾過して残留する細胞を除去し、次いでFILTRONミニセッテを使用して濃縮した 。濃縮物をNP−セファローズカラム上に２回通した。カラムを20カラム体積のPB Sで洗浄し、そして10カラム体積のPBS／0.5Ｍ NClで洗浄した。結合したタンパ ク質を0.2ＭのグリシンpH2.3で４℃ において溶離し、そして１ＭのTrispH7.3で直ちに中和し、次いでPBS／0.2mM ED TA pH7.4の中に透析し、そしてアリコートで凍結させた。 精製したタンパク質はELISAアッセイにより決定したときNIPおよびHuFcγRIレ セプターに強くかつ特異的に結合し、タンパク質生成物の二重特異性の本質を示 した。実施例18 二重特異性抗イディオタイプ（bc11）−抗CD3ダイアボディーの調製 ５アミノ酸のリンカーをもつ二重特異性ダイアボディーをエンコードするクロ ーンを調製し、一方のアームはBCL-1リンパ腫細胞系の表面Igに対して向けられ た抗イディオタイプ抗体B1を発現し、そして他方のアームは、ハムスターハイブ リドーマ細胞系から誘導された、マウスＴ細胞レセプターのクラスター分化抗原 CD3に対して向けられていた。中間の工程として、２価のダイアボディー2C11を 調製した。両方の２価のダイアボディーおよび二重特異性ダイアボディーは、EL −４マウスＴ細胞系上のFACS走査により、CD3に結合することが示された。 ５アミノ酸のリンカーをもつ２価のダイアボディーB1構成は実施例19に記載さ れている。 2C11はマウスCD3T細胞コレセプターに結合するハムスターモノクローナル抗体 である。それはダイアボディーのフォーマットで５残基のリンカーを使用してフ ァージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLでクローニングされた 。リンカー配列をVKの５′末端の増幅に使用したプライマー（VkCbaLink5BstEII ）の中に組み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVkCbaLink5BstEIIの５′お よびまたVH1FOR-2の３′末端に取り込まれた。SfiI制限部位をVHの５′末端の増 幅に使用したプライマーVH2C11Sfibaの中に導入し た。NcoI制限部位をVKの３′末端の増幅に使用したプライマー混合物Vk4FORNot （Clackson，1991、前掲）の中に導入した。これにより、VHおよびリンカー−VL 断片を３方結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニング することができた。 RNAを2C11ハイブリドーマ細胞（Kris Thielemans教授により供給された）から 抽出し、そしてcDNAの調製に使用した。2C11のVHおよびVLドメインのDNAを、PCR によりcDNAから、それぞれ、プライマーの対VH2cbaSfiおよびVH1FOR-2、およびV kCbaおよびVK4FOR（T.Clackson，H.R.Hoogenboom，A.D.GriffithsおよびG.Winte r，Nature 352，624-628，1991）を使用して標準の条件下に増幅した。（注：2 C11V遺伝子は前もってクローニングおよび配列決定されていたので、われわれは 「標準の」VH1BACKプライマー（R.Orlandi，D.H.Gussow，P.T.JonesおよびG.Win ter，Proc.Natl，Acad.Sci.USA86，3833-3837，1989）を使用するよりむしろ2C1 1-VII特異的プライマーをデザインした）。 VH2C11をプライマーVII211baSfi，VH1FOR2で増幅し、Vk2C11をプライマーVk2C 11baLink5BstEII，Vk4FORNotで増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素SfiIお よびBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで 消化した。VHおよびVLドメインのDNAをSfiI／NotI消化pUC119SfiNotmycの中にモ ル比３：３：１（VH：VL：pUC119SfiNotmyc）で同時に結合し、そして生ずる結 合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1細胞を形質転換した。同様に、VHおよ びVLドメインのDNAをSfiI／NotI消化pCANTAB6の中に結合し、そして同一の方法 で大腸菌（E.coli）HB2151細胞の中に形質転換した。それぞれ、pUC119SfiNotmy cまたはpCANTAB6中の組換え体のために2C11特異的プライマーVH2C11baSfiおよび LMB3またはVH2C11baSfiおよびfdSeqを使用して、組換え体を正しい大きさに ついてスクリーングした。 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。２mlの2YT／0.1 ％グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を１mMのIPTG の最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において３時間成長させた 。細胞を遠心（1000ｇ，10分）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBS／ １mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心 （1000ｇ，10分）し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液をマウスＴ細胞 系EL-4およびMD90（これはCD3抗原を発現する）を使用するFACSScanにおいて使 用した。ダイアボディーはこれらの細胞系について親のダイアボディーと同一の 特異性を示した。 FACS走査は次のようにして実施した：細胞系EL-4およびMD90（G.Grossら、Pro c.Natl.Acad.Sci.USA 86 10024-10028，1989）を、標準の組織培養条件下に成長 させた。約107細胞を収獲し、そしてPBS／１％BSA／0.05％NaN3で２回洗浄し、 次いで少なくとも105細胞のアリコートで細胞ウェルプレートのウェルの中に分 布させた。2C11／52価の抗CD3ダイアボディーを添加して100μｌの最終体積とし 、そして４℃において30分〜１時間結合させた。次いで細胞を1600rpmで２分間 遠心し、そして上澄み液を吸引により除去した。次いで細胞を100μｌのPBS／１ ％BSA／0.05％NaN3中のMab9E10（１：100に希釈した）の中に再懸濁させ、そし て４℃において30分間結合させた。次いで細胞を1600rpmで２分間遠心すること によって沈澱させ、そして上澄み液を吸引により除去した。次いで細胞を100μ ｌのPBS／１％BSA／0.05％NaN3中の標識化Fab′２抗マウスFITCO（１：128に希 釈した、Sigmaから）の中に再懸濁させ、そして暗所で４℃において30分間結合 させた。次いで細胞を1600rpmで２分間遠心することによって沈澱させ、そして 上澄み液を吸 引により除去した。次いで細胞を１mlのPBS／１％BSA／0.05％NaN3で２回洗浄し 、そして５mlのファルコン（Falcon）管に１mlの最終体積で移し、そして直ちに 分析した。蛍光活性化細胞の選別をベクトン−ディキンソン（Becton-Dickinson ）-FACSScanで実施した。５アミノ酸のリンカーをもつ2C11抗CD3ダイアボディー のEL-4およびMD-90への結合は、細胞を9E10およびFab′２抗マウスFITC標識化試 薬とインキュベーションするが、ダイアボディーとインキュべーションしない対 照に比較して、より高い蛍光の読みへの細胞集団におけるシフトにより検出され た。2C11ダイアボディーを使用するシフトと、商用FITC標識化抗マウスCD3IgG（ Serotech）を使用して得られたシフトとを比較することによって、走査を目盛り 定めした。２つの抗CD3試薬は匹敵するシフトを与えた。こうして、2C11／５ダ イアボディーはEL-4およびMD-90細胞に効率よく結合する。５アミノ酸のリンカーをもつ二重特異性抗イディオタイプ／抗CD3 ダイアボディ ーB1／2C11／5の構成 ２つの抗体特異性B1（抗−Id BCL-1）および2C11（抗マウスCD3）をダイアボ ディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVLを５残基のリンカーとファー ジミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLで融合した。リンカー配列 をVKの５′末端の増幅に使用したプライマー（Vk2C11baLink5BstEII）の中に組 み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVk2C11baLinkOBstEIIの５′に取り込 まれた。AscI制限部位を、pc1BリーダーおよびlacZリボソーム結合部位を含むVH 2C11の増幅に使用したプライマーLinkAscの中に導入した。これにより、VH−リ ンカーおよびリンカー−VL断片を３方結合反応において発現ベクターpUC119SfiN otmycの中にクローニングすることができた。 VH2C11をプライマーLinkAscおよびプライマー（実施例１に記載 するような）で増幅し、Vk2C11をプライマーVk2C11baLink5BstEII、プライマー １（実施例１に記載するような）で増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素As cIおよびBacIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBstEII で消化した。ダイアボディーB1／５（実施例19参照）をBstEII／SacIで切断し、 そしてVHおよびVLドメインのDNAをそれとモル比３：３：１（VH：VL：pUC119-B1 ／５）で同時に結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1細 胞を形質転換した。プライマーLMB2およびLMB3使用して、組換え体を正しい大き さについてスクリーニングした。 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。２mlの2YT／0.1 ％グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を１mMのIPTG の最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において３時間成長させた 。細胞を遠心（1000ｇ，10分）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBS／ １mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心 （1000ｇ，10分）し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を前述したよう にFACSScanにおいて使用し、そしてEL−４細胞に結合することが発見された。 Mab9E10-セファローズのカラム（myc標識を介するアフィニティー精製）によ る精製のために、発現を前述したように実施したが、ただし誘発後、細胞を22℃ において26時間成長させた。引き続いて、細胞を8000rpm／10分／４℃において 沈澱させ、そして上澄み液をFILTRONミニセッテ（実施例17参照）を使用して濾 過および濃縮した。9E10セファローズのカラムから溶離されたアフィニティー精 製された細胞は、IgBCL-1（実施例19に記載する方法を使用するELISAにより、そ してBCL細胞上のFACSScanにより決定して）およびマウスＴ細胞（マウスＴ細胞 系EL−４およびMD90上のFACSScanによ り決定して）に強くかつ特異的に結合した。 それゆえ、５アミノ酸のリンカーをもつ機能的二重特異性抗イディオタイプ（ bc11）−抗CD3ダイアボディーが調製された。 生体外のBCL−１リンパ腫の溶解の剌激（細胞の架橋による）のためのモデル 系においてMD90細胞系を使用して、このダイアボディーの活性を試験した。BCL −１リンパ腫細胞（Kris Thielemansにより供給された）を標的細胞として使用 した；エフェクター細胞として、Ｔ細胞ハイブリドーマMD90を選択した（Zelig Esharにより供給された）。 ６×106の標的細胞に150mCiの51Cr（Amersham）を37℃において１時間負荷さ せ、そしてPBSで５回洗浄して取り込まれなかった標識を除去した。次いで細胞 をエフェクター細胞と比20／１，10／１および５／１で混合し、そして37℃にお いて精製したダイアボディーの存在（30μｇ／ml）または不存在下に８時間イン キュベーションした。培養上澄み液中のガンマ線をカウントすることによって、 解放された51Crを決定した。 ５：１のエフェクター：標的の比について、MD90細胞によるBCL−１リンパ腫 細胞の20％の特異的殺し（上澄み液の中に解放された51Crにより測定して）がダ イアボディーの存在下に得られ（ダイアボディーの不存在下に特異的殺しなし） 、エフェクター細胞と一緒のダイアボディーの添加が標的細胞の殺しに導くこと が示唆されてる。殺しの効率はエフェクター／標的の比が20：１におけるわずか の殺しから５：１における20％の殺しに増加し、これはMD90細胞系について典型 的であることが知られているパターンである。実施例19 ２価の抗イディオタイプ（抗bc11）ダイアボディーの調製および特性 決定 B1はリンパ腫BCL−１の表面１ｇに対して抗イディオタイプであ るネズミモノクローナル抗体である（J.Brissinckら、J.Immunol.147 4019-402 6，1991）。それはダイアボディーのフォーマットで５残基のリンカーを使用し てファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLでクローニングさ れた（Clackson，Nature）。リンカー配列をVKの５′末端の増幅に使用したプラ イマー（V1B1baLink5BstEII）の中に組み込み、そしてこのプライマーはまたVK の開始においてSacI制限部位を導入する。BstEIIの制限部位はプライマーV1B1ba Link5BstEIIの５′およびまたVH1FOR-2の３′末端に取り込まれた。SfiI制限部 位をVHの５′末端の増幅に使用したプライマーVHB1Sfibaの中に導入した。NotI 制限部位をVKの３′末端の増幅に使用したプライマー混合物Vk4foNotI（Clackso n，Nature）の中に導入した。これにより、VIIおよびリンカー−VL断片を３方結 合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングすることがで きた。 VHB1をプライマーVIIB1baSfi，VH1B1fo-2で増幅し、VLB1をプライマーV1B1baL ink5BstEII，Vk4foNotI（これらの両方はKris Thielemans教授（Vrije Universi teit Brussel）により供給されるscFvクローンからのものであった）で増幅した 。VH PCR反応の生成物を制限酵素SfiIおよびBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応 の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消化した。VHおよびVLドメインのDNAをS fiI／NotI消化pUC119SfiNotmycの中にモル比３：３：１（VH：VL：pUC119SfiNot myc）で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1 細胞を形質転換した。また、VHおよびVLドメインのDNAをpCANTAB6第20図の中に 結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）HB2151細胞を形質 転換した。それぞれ、pUC119SfiNotmycおよびpCANTAB6クローンのためにB1特異 的VHB1baSfiおよびLMB2またはVHB1baSfiおよびfdScqを使用し て、組換え体を正しい大きさについてスクリーニングした。 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。２mlの2YT／0.1 ％グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を１mMのIPTG の最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において３時間成長させた 。細胞を遠心（1000ｇ，10分）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBS／ １mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心 （1000ｇ，10分）し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を下に概説する プロトコールを使用するELISAにおいて使用した。 50μｌの周辺質上澄み液＋50μｌの３％BSA／PBSをBCL−１Ig（PBS中の10μｇ ／ml；Kris Thielemans博士）で被覆したELISAウェルに添加し、そして３％BSA ／PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い（H.R.Hoogenboomら、 Nucl.Acids Res.19，4133-4137，1991）、モノクローナル抗体9E10、およびセイ ヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGを使用するmyc標識の検出を使用し た。10分後、両方の抗原についてのELISAの読みは1.0より大きかった。 B1／５ダイアボディーをpCANTAB6クローンから発現された周辺質調製物からの 固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）により製造業者のプロトコ ール（Daigen）を使用して精製した。得られた物質はELISA上のBCL−１抗原に結 合した。 両方の周辺質画分およびIMAC精製したB1／５ダイアボディーは、実施例18に記 載する、FACS走査によりBCL−１リンパ腫細胞に結合することが発見された。リ ンパ腫へのB1／５ダイアボディーの結合は、より高い蛍光の読みへの細胞集団に おけるシフトにより検出された。 このような２価の抗イディオタイプダイアボディーは、細胞表面の抗原を架橋 し、レセプターを誘発しそして、また、アポプトーシスを誘発するために有用で あることを証明できる。同一細胞の表面上の抗原を架橋する二重特異性ダイアボ ディーを、同様に、使用することができる。小さい大きさのダイアボディーは同 一細胞上の抗原を架橋するためにとくに有利であることがある。実施例20 二重特異性抗HIVgp120のV3ループ−抗ヒトFcR1ダイアボディーの調製 および特性決定 F58はHIV3Bgp120のV3ループに結合するマウスモノクローナル抗体である。（P CT／GB92／01755参照）。それはファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中でscFv 断片としてクローニングされた。二重特異性ダイアボディー022／F58／0の構成 ２つの抗体の特異性022（抗ヒトFcR1）およびF58（抗IIIV3Bgp120のV3ループ ）を二重特異性ダイアボディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVLを直 接０リンカーと向きVH−VLでファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で融合し た。リンカー配列をVKの５′末端の増幅に使用したプライマーVkba-SacLinkOBst EIIの中に組み込み、そしてVHの３′末端の増幅に使用したVH1fo-BstEIILinkOSa cの中に組み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVkba-SacLink5BstEIIのリン カー配列の５′に取り込まれ、そしてSacI制限部位はプライマーVH1fo-BstEIILi nk5Sacの５′に組み込まれた。これにより、アセンブリングされたVH−リンカー およびリンカー−VL断片は３方結合反応において発現ベクターpUC119022／5BstE II／SacIの中にクローニングすることができた。 VHF58をプライマーVH1fo-2およびVH1baで増幅し、VkF58 DNAをプライマーVk4f oおよびVk2baで増幅した。gIIIリーダーを含む遺伝子間領域N2（実施例１）をプ ライマーNterVHfoおよびCterVkba で増幅した。３断片をゲル精製し、次いで標準の条件下にPCRアセンブリングし 、そしてアセンブリー生成物をゲル精製しそしてプライマーVkba-SacLink5BstEI IおよびVH1fo-BstEIILink5Sacで増幅した。 PCR反応の最終生成物を制限酵素SacIおよびBstEIIで消化した。pCantab6の組 換えダイアボディー022／５（実施例17参照）をBstEII／SacIで消化して022／５ ベクター構成体を生成し、そしてVHF58をアセンブリングし、そしてVHF58 DNA断 片をそれとモル比３：１（VLN2VH：pCantab6-022／５）で結合した。生ずる結合 混合物を使用して大腸菌（E.coli）HB2151細胞を形質転換した。プライマーLMB3 およびfdSeqを使用する組換え体コロニーのPCR増幅により、組換え体を正しい大 きさインサートについてスクリーニングした。発現およびアッセイ ELISAによる分析のために、可溶性ダイアボディーの周辺質調製物を作った。 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。２mlの2YT／0.1％ グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を１mMのIPTGの 最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において３時間成長させた。 細胞を遠心（1000ｇ，10分）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBSの中 に再懸濁させ、そして10分間あるいは細胞懸濁液は半透明となるまで、超音波処 理した。超音波処理した細胞懸濁液遠心（1000ｇ，10分）し、そしてダイアボデ ィーを含有する上澄み液をELISAにおいて使用した。 二重特異性ダイアボディーのアッセイのために、ELISAを実施例17に記載する ようにFcγRIレセプターについて実施し、そしてHIVgp120のV3ループの抗体につ いて、次のプロトコールを使用した。50μｌの周辺質上澄み液＋50μｌの３％BS A／PBSをgp120（PBS中の 50ng／ml）で被覆したELISAウェルに添加し、そして３％BSA／PBSでブロックし た。標準のELISAのプロトコールに従い（H.R.Hoogenboomら、Nucl.Acids Res．1 9 ，4133-4137，1991）、モノクローナル抗体9E10、およびセイヨウワサビペルオ キシダーゼ接合抗マウスIgGを使用するmyc標識の検出を使用した。両方の抗原に ついての陽性のELISAが得られた（10分後、1.0より大きい）。022／F58／0ダイアボディーの精製 精製したダイアボディーを作るために、可溶性ダイアボディーを、実施例３に 記載するように、IPTG誘発細胞中の成長により発現させ、そしてダイアボディー を培養上澄み液から精製した。製造業者のインストラクションに従い「キアゲン （Qiagen）」ニッケルNTAアガロース（カタログNo．30210）を使用する固定化金 属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）により、精製を実施した。 精製したタンパク質は両方のHIV3Bgp120およびHuFcR1に強くかつ特異的に結合 した（ELISAにより決定して）。実施例21 二重特異性抗２−フェニルオキサゾル−５−オン、抗マウスラムダ軽 鎖ダイアボディーの調製および特性決定 ハイブリドーマNQ11（抗マウス（実施例１参照）から誘導された２−フェニル オキサゾル−５−オンに対して向けられた抗体をエンコードするDNAから、およ びマウスラムダ軽鎖に対して向けられたハイブリドーマLS136から誘導されたDNA から、本質的に実施例１に記載されている方法に従い、２−フェニルオキサゾル −５−オンおよびゼロアミノ酸のリンカーをもつマウスλ軽鎖に対して向けられ た二重特異性ダイアボディーをエンコードするクローンを調製した。マウスラム ダ軽鎖に対して向けられた２価の抗体を中間工程として調製した。 LS136はマウス抗体λ軽鎖に対して向けられたネズミハイブリド ーマである。それはダイアボディーのフォーマットで５残基のリンカーを使用し て向きVH-GGGGS-VLでファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中でクローニングさ れた。リンカー配列をVKの５′末端の増幅に使用したプライマー（VkCbaLink5Bs tEIIおよびプライマー４（表１））の中に組み込んだ。プライマー４は、また、 VKの５′末端にSacI制限部位を導入する。BstEIIの制限部位はプライマーVkCbaL ink5BstEIIおよびプライマー４のリンカー配列の５′および、また、VH1FOR-2の ３′末端に取り込まれた（E.S.Ward，D.Gussow，A.D.Griffiths，P.T.Jonesおよ びG.Winter，Nature 341，544-546，1989）。これにより、VHおよびリンカー− VL断片を３方結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニン グすることができた。 RNAをLS136ハイブリドーマから抽出し、そしてcDNAの調製に使用した。LS136 のVHおよびVLドメインのDNAを、PCRによりcDNAから、それぞれ、プライマーの対 VH3AbaおよびVH1FOR-2、およびVkCbaおよびＶK4FOR（T.Clackson，H.R.Hoogenbo om，A.D.GriffithsおよびG.Winter，Nature 352，624-628，1991）を使用して 標準の条件下に増幅し、そしてVH3AbaSfiおよびVH1fo-2（VHについて）およびプ ライマー４（PNAS論文に記載されているように）およびVk4foNotI（Vkについて ）を使用することによって再増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素SfiIおよ びBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消 化した。VHおよびVLドメインのDNAをSfiI／NotI消化pUC119SfiNotmycの中にモル 比３：３：１（VH：VL：pUC119SfiNotmycまたはpCantab6）で同時に結合し、そ して生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1細胞を形質転換した。ま た、VHおよびVLドメインのDNAをSfiI／NotI消化pCANTAB6ベクター（第20図）の 中に同一の方法で結合し、そして大腸 菌（E.coli）HB2151細胞の中に形質転換した。ベクターpUC119SfiNotmyc中の組 換え体についてプライマーLMB2およびLMB3を使用するか、あるいはpCANTAB6中の 組換え体のためにLMB3およびfdSeqを使用して、組換え体を正しい大きさについ てスクリーニングした。LS136ダイアボディーの発現 可溶性ダイアボディーを37℃におけるpUC119SfiNotmycクローンの成長により 発現させた。２mlの2YT／0.1％グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数 期の成長の細胞を１mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22 ℃において３時間成長させた。細胞を遠心（1000ｇ，10分）し、そして細胞のペ レットを100μｌの氷冷PBS／１mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間 放置した。細胞懸濁液を遠心（1000ｇ，10分）し、そしてダイアボディーを含有 する上澄み液を下のようにELISAにおいて使用した。 50μｌの周辺質上澄み液および50μｌの３％BSA／PBSをマウスIgM1またはマウ スIgG2a1（両方共Sigmaから）（PBS中の10μｇ／ml）で被覆したELISAウェルに 添加し、３％BSA／PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い（H.R .Hoogenboomら、Nucl.Acids Res．19，4133-4137，1991）、モノクローナル抗体 9E10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgG（IgMλについて ）、および抗マウスｋ鎖およびペルオキシダーゼ−ビオチン−ストレプトアビジ ン複合体（両方共Amersham）（IgG2aλについて）を使用するmyc標識の検出を使 用した。ELISAの読みは1.0より大きかった。二重特異性ダイアボディーLS136／NQ11／5および二重特異性ダイアボディーLS13 6／NQ11／0の構成 ２つの抗体の特異性LS136（抗マウス１抗体軽鎖）およびNQ11（抗 phOx）を二重特異性ダイアボディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVL を５アミノ酸のリンカーVH-GGGGS-VLと、あるいは直接０リンカーと向きVH--VL でファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で融合した。リンカー配列をVKの５ ′末端の増幅に使用したプライマー４および５（表１）の中に、およびVHの３′ 末端の増幅に使用したプライマー７および８（表１）の中に組み込んだ。BstEII の制限部位はプライマー５のリンカー配列の５′に取り込まれ、そしてSacI制限 部位はプライマー８のリンカー配列の５′に取り込まれた。これにより、アセン ブリングされたVH−リンカーおよびリンカー−VL断片は３方結合反応において発 現ベクターpUC119LS136／5BstEII／SacIの中にクローニングすることができた。二重特異性ダイアボディーLS136／NQ11／5（５アミノ酸のリンカー）の構成 VHNQ11をプライマー２および６（表１）で増幅し、VkNQ11をプライマー１およ び４で鋳型としてfdDOG-1の中にクローニングされたscFvNQ11を使用して増幅し た。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびSacIで消化し、そしてVL PCR反応 の生成物を制限酵素AscIおよびBstEIIで消化した。ダイアボディーLS136／５の ベクター断片（上を参照）をBstEII／SacIで切断し、そしてVHおよびVLドメイン のDNAをそれとモル比（３：３：１）（VH：VL：pUC119-LS136／５）で同時に結 合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1細胞を形質転換した 。組換え体コロニーのPCR増幅のためにプライマーLMB2およびLMB3を使用して、 組換え体を正しい大きさインサートについてスクリーニングした。二重特異性ダイアボディーLS136／NQ11／0（０アミノ酸のリンカー）の構成 VHNQ11をプライマー２および８（表１）で増幅し、VkNQ11をプラ イマー１および５で鋳型としてfdDOG-1の中にクローニングされたscFvNQ11を使 用して増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびSacIで消化し、そし てVL PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBstEIIで消化した。ダイアボディー LS136／５のベクター断片（上を参照）をBstEII／SacIで切断し、そしてVHおよ びVLドメインのDNAをそれとモル比（３：３：１）（VH：VL：pUC119-LS136／５) で同時に結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1細胞を形 質転換した。組換え体コロニーのPCR増幅のためにプライマーLMB2およびLMB3を 使用して、組換え体を正しい大きさインサートについてスクリーニングした。二重特異性ダイアボディーLS136／NQ11／5および二重特異性ダイアボディーLS13 6／NQ11／0の発現 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。２mlの2YT／0.1 ％グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を１mMのIPTG の最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において３時間成長させた 。細胞を遠心（1000ｇ，10分）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBS／ １mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心 （1000ｇ，10分）し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を下のようにEL ISAにおいて上のようにλ軽鎖について、あるいは実施例１におけるようにphOx について使用した。10分後のELISAの読みは1.0より大きかった。これはダイアボ ディー調製物が両方の結合部位を含有することを示す。 抗体におよびまた他の抗原、例えば、腫瘍細胞のマーカーに結合するこのよう なダイアボディーは、腫瘍部位に対する抗体のエフェクター機能を漸増するため に有用であろう。実施例22 NQ11／B1.8 Ox／NIPダイアボディーの２つのVHドメイ ンの間の界面における残基の突然変異誘発 前述したように、われわれは（VH-VL）D1.3ダイアボディーのモデルを検査し そして、その構成および共同的性質を実施例３および４に記載した、NQ11／B1.8 ダイアボディーにおける共同性および安定性の調節のために修飾すべきVHドメイ ンの間の界面における残基を選択した。 界面は種々の目的で修飾された： （ｉ）イオン結合の導入： 突然変異B1.8 T86Kにおいて、B1.8 VHドメインの残基86はスレオニンからリジ ンに変換されて、NQ11 VHドメインのAsp88とイオン結合を形成する可能性を与え られた。 突然変異NQ11 K43Eにおいて、NQ11 VHドメインの残基86はグルタミン酸に変換 されて、B1.8 VHドメインのリジン43とイオン結合を形成する可能性を与えられ た。 （ii）ジスルファイド架橋の導入： 突然変異NQ11 K43C B1.8 R43Cにおいて、NQ11 VHドメインの残基43はシステイ ンに変換されて、２つのドメインの残基43の間でジスルファイド架橋を形成する 可能性を与えられた。 （iii）水素結合の数の増加： 突然変異NQ11 R86Qにおいて、NQ11 VHドメインの残基86はアルギニンからグル タミンに変換されて、それ以上の水素結合のための可能性を与えられた。 （iv）疎水性相互作用の数の増加： 突然変異NQ11 K43L B1.8 R43Iにおいて、NQ11 VHドメインのリジン43はロイシ ンに変換され、そしてB1.8 VHドメインのアルギニン43はイソロイシンに変換さ れて、２つのVHドメインの間の界面における疎水性パッキングのための可能性を 与えられた。 （ｖ）反発相互作用の数の増加： 突然変異B1.8 T86Eにおいて、B1.8VHドメインのスレオニン86はグルタミンに 変換されて、NQ11 VHドメインのアスパルテート88との反発相互作用のための可 能性を与えられた。突然変異誘発反応 実施例３に記載したNQ11／B1.8 Ox／NIPダイアボディーをHindIIIおよびEcoR Iで消化し、そしてHindIIIおよびEcoRIで切断したファージミドベクターpBluesc ript II KS-（Stratagene）の中にサブクローニングした。M13K07でレスキュー 後に一本鎖DNAを調製し、そして生体外の突然変異誘発を実施した（Amersham） 。次の突然変異原性オリゴヌクレオチドを使用した： 突然変異B1.8 T86Kについて、オリゴヌクレオチドT86K（表１）； 突然変異NQ11 K43Eについて、オリゴヌクレオチドK43E； 突然変異NQ11 K43C B1.8 R43Cについて、２つのオリゴヌクレオチドを使用した ； K43CおよびR43C； 突然変異NQ11 R86Qについて、およびR86Q； 突然変異NQ11 K43L B1.8 R43Iについて、２つのオリゴヌクレオチドを使用した ； K43LおよびR43I； 突然変異B1.8 T86Eについて、オリゴヌクレオチドT86E。 PCRにより調製した鋳型上でTaqDNAポリメラーゼ（Boehringer）を使用するサ イクル配列決定により、突然変異誘発手順により発生したコロニーを突然変異の 存在について分析した。突然変異のコロニーを同定した。次いで発現を異なる温 度において測定し、そして両方の抗原への結合を種々の条件下にELISAおよびBIA コア分析により研究することができる。ダイアボディーの安定性およびアロス テリック結合性質（実施例４参照）への突然変異の効果は決定されるであろう。実施例23 鎖を架橋するジスルファイド架橋を導入するための軽鎖のＣ−末端に システインをもつ２−フェニルオキサゾル−５−オンに対して向けられたNQ11ダ イアボディーの構成および特性決定 この実施例において、５アミノ酸のリンカーをもつVLドメインに対してＮ−末 端のVHドメインをもつフォーマットで、２−フェニルオキサゾル−５−オン（ph Ox）に対して向けられた２価のNQ11ダイアボディーの中にジスルファイド架橋を 導入する。VLドメインのＣ−末端に取り込まれたシステイン残基の間に、ジスル ファイド架橋を形成する。このＣ−末端領域はダイアボディーのモデルにおいて 比較的拘束されない。２つのＣ−末端はダイアボディーのモデルにおいて密接し ているように思われる。この実験の目的は、ジスルファイド架橋をこれらのＣ− 末端の間に形成できることと確立することであった。 この実施例において作った構成体は、Ｃ−末端のLys-Arg配列の直ぐ後のVL鎖 のＣ−末端にシステイン残基を組み込んだ。構成体Ｉ（５残基のリンカー）の鋳 型上にPCRプライマー10（これはダイアボディー分子をエンコードするDNAに対し て５′をプライミングする）および11（これは３′末端においてプライミングし そしてシステインのコドンを組み込む）を使用するPCRを実施することによって 、システイン残基をVLドメインのＣ−末端に挿入した。PCR断片を制限酵素PstI およびNotIで消化し、そしてファージミド発現ベクター（pUC119SfiNotpolymyc ）の中にクローニングした。こうして発生したダイアボディーは、phOx-BSA被覆 プレート上のELISAにおける陽性のシグナルにより示されるようにphOx-BSAに結 合した（実施例１におけるように実施した）。 phOx-BSA-セファローズ上のアフィニティクロマトグラフィー（T.Clacksonら 、Nature 352 624-628，1991）を使用して２価のダイアボディーを精製し、そし て還元性または非還元性条件下のSDS-ポリアクリルアミドの電気泳動により精製 したタンパク質を分析することによって、ジスルファイド架橋の存在が確立され た。Ｃ末端のシステインをもたない親のNQ11ダイアボディーは、両方の還元性お よび非還元性条件下に25000ダルトンの分子量で移動する。還元性条件下に、Ｃ 末端のシステインをもつNQ11ダイアボディーは25000ダルトンの分子量で移動す るが、非還元性条件下ではタンパク質の約30〜50％が50000ダルトンの分子量で 移動し、タンパク質のこの比率が鎖の間の共有結合のジスルファイド架橋を形成 したことを示す。アフィニティクロマトグラフィーで非連鎖ダイアボディーと共 精製されたジスルファイド連鎖されたダイアボディーは、ジスルファイド連鎖さ れたダイアボディーがphOx-BSAに結合できるに違いないことを示す。実施例24 ダイアボディー分子の構成における自己スプライシングイントロンの 使用 この実施例において記載する研究において、それぞれ、２−フェニルオキサゾ ル−５−オンおよび雌鶏卵リゾチームに対して向けられたダイアボディーのフォ ーマット、NQ11およびD1.3においてクローニングされた２つの抗体のVHおよびVL ドメインの間に、自己スプライシングイントロンを導入した。この自己スプライ シングイントロンは、機能的２価のダイアボディーの発現により決定して、発現 後にスプライスアウトされることが示された。切除して２価のダイアボディーのVHおよびVLドメインの間に５アミノ酸のリンカ ーを残す、自己スプライシングイントロンを含有するNQ11およびD1.3クローンの 構成 テトラヒメナ（Tetrahymena）からの自己スプライシングイントロン（T.R.Cec h,Ann.Rev.Biochem．59 543-568,1990）は、大腸菌（E.coli）細胞質中でスプラ イスすることができることが示された。スプライシングアウトのときリンカーVH -GLSSG-VLをもつダイアボディーをエンコードするオープンリーディングフレー ムをつくるような方法において、抗体D1.3およびNQ11のVHおよびVLドメインをエ ンコードする遺伝子の間に、クローンICE10（Ian Eperon、レイセスター大学） からのこのような自己スプライシングイントロンを挿入した。スプライシングし ないと、自己スプライシングイントロンは３リーディングフレームの中にいくつ かの停止コドンを含有するので、機能的ダイアボディーを生成することができな い。 EstEIIのための制限部位をプライマーT1baBstEIIの５′末端に組み込み、そし てSacI制限部位をプライマーT1foSacの中に導入した。これにより、自己スプラ イシングイントロン断片は２方結合反応において発現ベクターpUC119D1.3（D1.3 抗リゾチーム抗体のＶドメインをエンコードする）またはpUC19NQ11（抗phOx抗 体NQ11のＶドメインをエンコードする）（各々はBstEIIおよびSacIで切断された ）の中にクローニングすることができた。 T1baBstEIIは自己スプライシングイントロンの５′末端においてプライミング し、そしてスプライシング活性のために要求される内部誘導配列（IGS）を保存 しそして余分のグリシン残基をVHドメインの３′末端に挿入する。T1foSacは自 己スプライシングイントロンの３′末端においてプライミングしそして、イント ロンの一部分ではないが、テトラヒメナ（Tetrahymena）DNAの中に存在する自己 スプライシングイントロンのちょうど３′にチミジン塩基を保存する。T1foSac は余分のGlyおよびSer残基をVLの５′末端に挿入して５アミノ酸のリンカーをつ くる。 自己スプライシングイントロンをプライマーT1baBstEIIおよびT1foSacで標準 の条件下に増幅した（実施例14におけるように）。PCR反応の生成物を制限酵素S acIおよびBstEIIで消化し、そしてBstEII／SacI消化pUC119D1.3またはpUC19NQ11 の中にモル比４：１（SS1：pUC119D1.3またはpUC19NQ11）で結合し、そして生ず る結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1細胞を形質転換した。自己スプラ イシングイントロンに対して特異性のプライマー、T1foSacおよびT1baBstEIIを 使用して、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。 可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。２mlの2YT／0.1 ％グルコース／100μｇ／mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を１mMのIPTG の最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において３時間成長させた 。細胞を遠心（1000ｇ，10分）し、そして細胞のペレットを100μｌの氷冷PBS／ １mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心 （1000ｇ，10分）し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を実施例１に記 載するようにリゾチームおよびphOx上のELISAにおいて使用した。 ELISAシグナルはスプライシングした５アミノ酸のリンカーのD1.3ダイアボデ ィーについて、５アミノ酸のリンカーのD1.3ダイアボディーで得られたものに同 等であった（10分後1.0より大きい）。しかしながら、スプライシングした５ア ミノ酸のリンカーのNQ11ダイアボディーについて、実施例１において構成した５ アミノ酸のリンカーのダイアボディーと比較したとき、このシグナルは非常に低 かった（20分後の2.0に比較して0.2）。これについて２つの可能な説明が存在す る；−NQ11ダイアボディーはGLSSGリンカー配列で機能的ではないが、これはあ りそうに思われない；−イントロンの３ ′（VLドメインの５′における）のDNA配列は自己スプライシングのために適当 ではないので、自己スプライシングはダイアボディーNQ11の場合において適切に 働かない。VLドメイン遺伝子の５′末端におけるD1.3配列は自己スプライシング を可能とするとき効率よいが、この領域におけるNQ11配列は劣る。切除して２価のダイアボディーのVHおよびVLドメインの間に６アミノ酸のリンカ ーを残す、loxP部位を含む自己スプライシングイントロンを含有するNQ11および D1.3クローンの構成 RNAレベルで効率よい自己スプライシングを可能とする自己スプライシングの ３′にNQ11構成体の配列を導入するように、プライマーT1ba2BstEIIおよびT1fo2 Sacをデザインした。 自己スプライシングイントロンをPCRによりT1ba2BstEIIおよびT1fo2Sacで増幅 した。このイントロンは抗体NQ11のVHおよびVLドメインの遺伝子の間に挿入され そして、スプライスアウトのとき、リンカーVH-GSLKVG-VLをもつダイアボディー をエンコードするオープンリーディングフレームをつくる。スプライシングしな いと、自己スプライシングイントロンは３リーディングフレームの中にいくつか の停止コドンを含有するので、機能的ダイアボディーを生成することができない 。 BstEIIのための制限部位をプライマーT1ba2BstEIIの５′末端に組み込み、そ してSacI制限部位をプライマーT1fo2Sacの中に導入した。これにより、自己スプ ライシングイントロン断片は２方結合反応においてBstEIIおよびSacIで切断され た発現ベクターpUC19NQ11の中にクローニングすることができた。T1baBstEIIは 自己スプライシングイントロンの５′末端においてプライミングし、そしてスプ ライシング活性のために要求される内部誘導配列（IGS）を保存しそして余分の グリシン残基をVHドメインの３′末端に挿入する。T1fo Sacは自己スプライシングイントロンの３′末端においてプライミングしそして 、イントロンの一部分ではないが、テトラヒメナ（Tetrahymena）DNAの中に存在 する自己スプライシングイントロンのちょうど３′にチミジン塩基を保存し、そ して余分のGlyおよびSer残基をVLドメインのＮ−末端に挿入する。 この場合において使用した自己スプライシングイントロンはbp236と237との間 にloxP部位を含有した。それをプライマーT1ba2BstEIIおよびT1fo2Sacで標準の 条件下に増幅した。PCR反応の生成物を制限酵素SacIおよびBstEIIで消化し、そ してBstEII／SacI消化pUC19NQ11の中にモル比４：１（SS1：pUC19NQ11）で結合 し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌（E.coli）TG1細胞を形質転換し た。自己スプライシングイントロンに対して特異性のプライマー、T1foSacおよ びT1baBstEIIを使用して、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリ ーニングした。 可溶性ダイアボディーを上のように発現させ、そしてELISAによりアッセイし た。この場合において、同等のシグナル（10分後に1.0より大きい）が、実施例 １において構成した５アミノ酸のリンカーのダイアボディーについてのように、 自己スプライシングにより形成された６アミノ酸のリンカーのNQ11ダイアボディ ーについて得られた。こうして、この戦略はNQ11構成体におけるいっそう効率よ い自己スプライシングを可能とする。実施例25 メタロチオネインとの融合体を含有するダイアボディー分子の構成お よび特性決定 腫瘍を像形成するために、メタロチオネインペプチドをVHおよびVLドメインの 間のリンカーの一部分として、あるいはVLドメインのＣ末端における延長として 組み込むことができる。次いで、これはメタロチオネインペプチドによりキレー トされた放射性金属イオン を導入することによって標識化することができる。 メタロチオネインペプチドをダイアボディーのVHおよびVLドメインの間のリン カーの一部分として組み込む場合、scFvよりむしろダイアボディーの形成はなお 可能であろう。（より長いリンカーは通常scFvの形成に好適であろう。）リンカ ー配列の中にシステインを組み込んでリンカー内にジスルファイド架橋を与える ことは、同一鎖からのVHおよびVLドメインの対合を促進してダイアボディーの形 成に好適とすることができる。 これを研究するために、メタロチオネイン配列をダイアボディーのフォーマッ トにおいて抗体のＶドメインの間のリンカーとして使用した。メタロチオネイン 配列を２つのペプチドＡ：GGGDPNCSCAAGDSCTCAGGSおよびｂ：GGGGSCKCKECKCTSCK GGSGにスプリットし、下線の配列をスペーサーとして導入した（有効リンカー長 さ21アミノ酸）。二重特異性ダイアボディーをフォーマット鎖１：VHNQ11-A-VkD 1.3、鎖２：VHD1.3-B-VkNQ11、後者の鎖は、また、Ｃ−末端のc-myc標識を有す る。メタロチオネインペプチドの各々の１つを各鎖のＣ−末端にもつNQ11／D1.3 ゼロリンカーのダイアボディーを使用して、第２二重特異性ダイアボディーを構 成した。両方の構成体は発現され、そしてHEL-セファローズで精製後２−フェニ ル−５−オキサゾロンで誘導したリゾチームおよびBSAの両方に結合することが 証明され（実施例１）、リンカーの中にシステイン残基をもつ構成体は二重特異 性ダイアボディーとしてフォルディングすることができることを示す。 抗原＊または9E10抗体†への結合によるリゼイトのFPLCおよびBIAコアにより示 す。Ｍ＝主としてモノマー、Ｄ＝主として二量体、Ｍ＆Ｄ＝両方のモノマーおよ び二量体が明瞭に検出可能、Ｘ＝Ｍより速く走行する種（構成体VIIで見られた ）多分３鎖の間の平衡のためである。‡サンドイッチELISAおよびまたBIAコアに よる、HELへ、次いでphOx-BSAへの結合。 phOxについてのアフィニティー定数（ｋd）は蛍光クエンチにより決定し、そし てHELおよびphOxについての解離反応速度（ｋoff）はBIAコアにより決定した。 ｋon値は表わされていない（活性画分は異なる調製物の間で変化することがある （Griffiths,A.D.ら（1993）EMBO J．12,725-734））。HEL上のFv，FabおよびIg G D1.3についてのｋoff値は、どこかで論考した理由で、Borrebaeck,C.A.K.ら（ 1992）Bio/Technology 10,697-698、に表わされているBIAコアのデータと一致し ない。 ＊（21）から。 ｋoffは速過ぎてBIAコアにより測定できず、与えた値は最も遅 い可能な推定値である。−Foote,J．ら（1990）Nature（London）352 ,530-532 から停止−流れにより測定したｋoffの値。§ 停止−流れ（ｋon）および蛍光 クエンチ（ｋd）により測定したFoote,J.ら（1992）J.Mol.Biol．224 ,487-499 からのｋofｆ＝ｋon×ｋdの値。 図面に対する追加の記号解 第６図： 垂直の矢印は制限部位を示す。 ｘ−scFvリンカー ｙ−10残基のリンカー ｚ−５残基のリンカー Ａ−PCRアセンブリーを経るクローニング Ｂ−制限部位を経るクローニング 第10図： 垂直の矢印は制限部位を示す。 ｘ−scFvリンカー ｙ−ダイアボディーのリンカー接合（0〜10残基） １−PCR ２−PCRアセンブリーおよび制限消化後のクローニング ３−制限部位を経るクローニング ルートＡ−ダイアボディー断片としてバインダーを選択する、最初のレパート リーは１つの一定の特異性（Ｃ）を有する。 ルートＢ−二重特異性ダイアボディーのレパートリーを直接構成する。 ルートＣ−scFv断片としてバインダーを選択する。 第８図： １−標準のクローニング ２−loxP制限部位を経るCre仲介生体内組換え ３−RNAの自己スプライシング ｘ−loxP認識部位 ｙ−認識部位のスプライス（いくつかの部分はダイアボディーのリンカー配列 を形成するであろう） ｚ−自己スプライシングイントロン（クラスＩ） Ａ−VH遺伝子のレパートリー Ｂ−VL遺伝子のレパートリー Ｃ−VHおよびVL遺伝子の大きいレパートリー Ｄ−ダイアボディーのレパートリー（RNA） 第９図： ＩおよびII−scFv断片および２価の断片 III，IVおよびＶ−構成体のためのベクター VI−二重特異性断片 VII−３鎖の断片 第10図： グラフは時間（秒）に対する相対的応答（RU）である。 第11図： グラフは分離１ｎ（R1／Rt）／時間である。分離速度曲線は表面上の3000ruか ら開始する。見掛けのｋoff（0〜21秒）； ｓ１：0.0045，ｓ２：0.0047，ｓ３：0.0069，ｓ４：0.0071 前インキュベーション 溶離緩衝液 １ PBS PBS ２ NIP／PBS PBS ３ PBS NIP／PBS ４ NIP／PBS NIP／PBS 第16図： １μＭのNIPの存在および不存在におけるBSA-Ox表面に対するB1.8／NQ11ダイ アボディーのBIAコア分析。グラフはμＭ抗体に対するReqを示す。 ｘ−対照 ｙ＋１μＭのNIP 第17図： 表面２への結合のスキャッチャード分析。グラフはReq／μＭに対するReqであ る。 Ａ−対照。ｙ＝-0.275ｘ＋510.444ｒ2＝0.977 Kd＝275nM Rmax＝510RU Ｂ−＋１μＭのNIP ｙ＝-0.425ｘ＋461.316ｒ2＝0.992 kd＝425nM Rmaｘ＝461 RU 第18図： 表面３への結合のスキャッチャード分析。グラフはReq／μＭに対するReqであ る。 Ａ−対照。ｙ＝-0.275ｘ＋355.052ｒ2＝0.951 Kd＝275nM Rmax＝355RU Ｂ−＋１μＭのNIP ｙ＝-0.418ｘ＋348.166ｒ2＝0.968 kd＝418nM Rmax＝348R U 第31図： ｘ−CBM-1 １μＭ／ml ｙ−CBM-1 10ng／ml ｚ−ｗ／ｏ CBM-1 第33図： 二重特異性レパートリーのクローニング（実施例14） １−pUC逆およびLFRBS-2を使用するPCRアセンブリー ２−KspIによる切断、結合 ３−pUC逆およびXhoTagを使用するPCR ４−XhoIによる切断、結合 ５−BioGene3Leadおよびfd-tet-seq24を使用するPCR ６−pCANTAB5mycファージミドベクターの中にSfiI-NotI断片としてクローニン グして二重特異性ダイアボディーのレパートリーを 生成する。 第34図： レパートリー： プレート１，４および７−未選択クローンからのファージ プレート２，５および８−phOx-BSA上で選択したクローンからのファージ プレート３，６および９−phOx-BSA上で選択した可溶性ダイアボディー ELISA： プレート１，２および３−Dig-BSA プレート４，５および６−phOx-BSA プレート７，８および９−BSA
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ９３３０３６１４．７ (32)優先日 1993年５月10日 (33)優先権主張国 欧州特許機構（ＥＰ） (31)優先権主張番号 ９３１９９６９．３ (32)優先日 1993年９月22日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フーゲンブーム，ヘンドリクス レネルス ジェイコブス マシューズ イギリス国，ケンブリッジ シービー２ ５エイチジェイ，リトル シェルフォー ド，ホークストン ロード ３ (72)発明者 マルムクビスト，マグヌス スウェーデン国，エス―751 82 ウップ サラ，ファルマシア エルコーベー（番地 なし) (72)発明者 マークス，ジェームス デビッド アメリカ合衆国，カリフォルニア，サンフ ランシスコ，ポトレロ アベニュ 1001, デパートメント オブ アナエスゼシア (72)発明者 マクギネス，ブライアン ティモシー イギリス国，ケンブリッジ シービー２ ５エイチピー，ホークストン，ザ レーン 22 (72)発明者 ポープ，アンソニー リチャード イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ２エルダブリュ，グウィダー ストリート 178 (72)発明者 プロスペロー，テレンス デレク イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ３ディーティー，ビネリー ロード 100 (72)発明者 ウィンター，グレゴリー ポール イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ４ユーティー，カベンディッシュ アベニ ュ 64

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、および免 疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメインからなり、前記ドメ インは連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない 、ポリペプチド。 ２．第１および第２のドメインがアミノ酸残基を介在させないで連鎖している 請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ３．第１および第２のドメインがペプチドリンカーにより連鎖されている請求 の範囲第１項記載のポリペプチド。 ４．免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域および免疫グロブリン軽鎖可変領 域の結合領域が、それぞれ、相補的軽鎖または重鎖の結合領域と連合したとき、 互いと同一のエピトープに結合することができる請求の範囲第１〜３のいずれか １項記載のポリペプチド。 ５．免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域および免疫グロブリン軽鎖可変領 域の結合領域が、それぞれ、相補的軽鎖または重鎖の結合領域と連合したとき、 互いと異なるエピトープに結合することができる請求の範囲第１〜４のいずれか １項記載のポリペプチド。 ６．追加のアミノ酸残基に融合した請求の範囲第１〜５のいずれか１項記載の ポリペプチド。 ７．追加のアミノ酸残基がペプチドの標識である請求の範囲第６項記載のポリ ペプチド。 ８．追加のアミノ酸残基がシグナル配列である請求の範囲第６項記載のポリペ プチド。 ９．追加のアミノ酸残基がポリペプチドのドメインである請求の範囲第６項記 載のポリペプチド。 10．ポリペプチドのドメインが繊維状バクテリオファージの表面 成分である請求の範囲第９項記載のポリペプチド。 11．表面成分がGIIIである請求の範囲第10項記載のポリペプチド。 12．その免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域が免疫グロブリン軽鎖可変領 域の結合領域と連合しており、そしてその免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領 域が免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域と連合しており、各連合が抗原結合 部位を形成している請求の範囲第１〜11のいずれか１項記載のポリペプチド。 13．それらの各々が請求の範囲第１〜12のいずれか１項記載の、ポリペプチド の種々のレパートリー。 14．請求の範囲第12項記載の２ポリペプチドの二量体。 15．各ポリペプチドが異なる請求の範囲第14項記載の二量体。 16．第１および第２のドメインのＮ−末端からＣ−末端の順序が各ポリペプチ ドにおいて同一である請求の範囲第15項記載の二量体。 17．各ポリペプチドが同一である請求の範囲第14項記載の二量体。 18．請求の範囲第14〜17のいずれか１項記載の二量体の種々のレパートリー。 19．請求の範囲第１〜11のいずれか１項記載のポリペプチドをエンコードする 配列からなる核酸。 20．第１ドメインをエンコードする核酸と第２ドメインをエンコードする核酸 との間にRNAスプライス部位をエンコードする核酸を含む請求の範囲第19項記載 の核酸。 21．第１ドメインをエンコードする核酸と第２ドメインをエンコードする核酸 との間に、生体内または生体外の組換えのための部位をエンコードする核酸を含 む請求の範囲第19または20項記載の核酸 。 22．請求の範囲第19〜21のいずれか１項記載の核酸からなるベクター。 23．ポリペプチドの発現に必要な核酸からなる請求の範囲第22項記載のベクタ ー。 24．発現のときのポリペプチドの分泌のための核酸からなる請求の範囲第23項 記載のベクター。 25．２つの前記ポリペプチド、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドをエ ンコードする核酸からなる請求の範囲第22〜24のいずれか１項記載のベクター。 26．第１ポリペプチドをエンコードする核酸と第２ポリペプチドをエンコード する核酸との間に、生体内または生体外の組換えのための部位からなる核酸を含 む請求の範囲第25項記載のベクター。 27．第１ポリペプチドをエンコードする核酸および第２ポリペプチドをエンコ ードする核酸、ポリペプチドの各々は免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域か らなる第１ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第 ２ドメインからなり、各ポリペプチドの第１ドメインはそのポリペプチドの第２ ドメインに連鎖されているが、それと連合して抗原結合部位を形成することがで きず、第１ポリペプチドをエンコードする核酸は発現のとき宿主細胞から第１ポ リペプチドの輸出のためのシグナル配列をエンコードする核酸に連鎖されており 、第２ポリペプチドをエンコードする核酸は発現のとき宿主細胞から第２ポリペ プチドの輸出のためのシグナル配列をエンコードする核酸に連鎖されている、お よび発現のときバクテリオファージ粒子の表面上の第２ポリペプチドの表示のた めの繊維状バクテリオファージの表面成分をエンコードする核酸からなり、バク テリオファージ粒子内にパッケージングされることが できるベクター。 28．請求の範囲第23〜27のいずれか１項記載のベクターでトランスフェクショ ンされた宿主細胞。 29．宿主細胞からのポリペプチドの発現のための条件下に請求の範囲第28項記 載の宿主細胞を培養することからなる請求の範囲第１〜11のいずれか１項記載の ポリペプチドを作る方法。 30．ポリペプチドを宿主細胞の培地から回収する請求の範囲第29項記載の方法 。 31．ポリペプチドを宿主細胞から回収する請求の範囲第29項記載の方法。 32．ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの２つの二量体を変性状態から再生 させる請求の範囲第31項記載の方法。 33．ポリペプチドを宿主細胞の周辺質から回収する請求の範囲第31項記載の方 法。 34．前記ポリペプチドの２つの二量体を抗原との結合により選択する請求の範 囲第30〜33のいずれか１項記載の方法。 35．（ａ）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ポリペプチド のドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる免疫グロブ リン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ポリペプチドのドメインをエンコード する核酸；および （ｂ）繊維状バクテリオファージの表面成分をエンコードする核酸； 連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない第１ および第２のドメインからなるポリペプチド（「Ａ」）を生産する核酸（ａ）の 発現； 連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない第１ および第２のドメインからなり、バクテリオファージ 粒子の表面上のポリペプチド（Ｂ）の表示のための繊維状バクテリオファージの 表面成分に融合した、ポリペプチド（「Ｂ」）を生産する核酸（ｂ）と一緒の核 酸（ａ）の発現； 核酸（ｂ）は介在する抑制可能な停止コドンを含む核酸により核酸（ａ）に連 鎖されている； からなるベクター。 36．請求の範囲第35項記載のベクターでトランスフェクションされておりそし てポリペプチドＡおよびＢの共発現のための条件を提供することができる宿主細 胞。 37．請求の範囲第31項記載の宿主細胞を宿主細胞からのポリペプチドＡおよび Ｂの共発現のための条件下に培養することからなる、各ペプチドが免疫グロブリ ン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可 変領域の結合領域からなる第２ドメインからなり、前記ドメインは連鎖している が、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない、２つのポリペプチ ドの二量体を作る方法。 38．抗原についての均質または不均質のアッセイにおける請求の範囲第12項記 載のポリペプチドの使用。 39．（ｉ）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、お よび免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメインからなる第１ ポリペプチド、第１ポリペプチドのドメインは連鎖しているが、互いに連合して 抗原結合部位を形成することができない；および （ii）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、免疫グ ロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメイン、および第１および第２ のドメインを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとの第２ポリペプチドの ドメインの連合を可能とす るポリペプチドのリンカーを有する第２ポリペプチド； 第１ポリペプチドの第１ドメインおよび第２ポリペプチドの第２ドメインは連 合して抗原結合部位を形成している；および 第１ポリペプチドの第２ドメインおよび第２ポリペプチドの第１ドメインは連 合して抗原結合部位を形成している； の二量体。 40．（ｉ）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、免 疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメイン、および第１および 第２のドメインを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとの連合を可能とす るポリペプチドのリンカーを有する第１ポリペプチド；および （ii）免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第１ドメイン、免疫グ ロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第２ドメイン、および第１および第２ のドメインを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとのドメインの連合を可 能とするポリペプチドのリンカーを有する第２ポリペプチド； 第１ポリペプチドの第１ドメインおよび第２ポリペプチドの第２ドメインは連 合して、第１結合特異性を有する抗原結合部位を形成している；および 第１ポリペプチドの第２ドメインおよび第２ポリペプチドの第１ドメインは連 合して、第２結合特異性を有する抗原結合部位を形成している； の二量体。 41．ポリペプチドの一方が追加のアミノ酸残基に融合されている請求の範囲第 39または40項記載の二量体。 42．追加のアミノ酸残基がペプチドの標識である請求の範囲第41項記載の二量 体。 43．追加のアミノ酸残基がポリペプチドのドメインである請求の範囲第41項記 載の二量体。 44．ポリペプチドのドメインが繊維状バクテリオファージの表面成分である請 求の範囲第43項記載の二量体。 45．表面成分がGIIIである請求の範囲第44項記載の二量体。 46．請求の範囲第39〜45のいずれか１項記載の二量体を形成することができる 第１および第２のポリペプチドをエンコードする核酸からなるベクター。 47．ポリペプチドの発現に必要な核酸からなる請求の範囲第46項記載のベクタ ー。 48．請求の範囲第47項記載のベクターでトランスフェクションされた宿主細胞 。 49．請求の範囲第48項記載の宿主細胞を前記第１および第２のポリペプチドの 発現のための条件下に培養し、そして 抗原の二重特異性を有する二量体を回収する、 ことからなる方法。 50．二量体を抗原との結合により選択する請求の範囲第49項記載の方法。 51．次の： 細胞表面のタンパク質； Fcレセプター； 腫瘍特異的マーカー； CEA； ウイルス； HIV 1； 小さい化学的分子； ホルモン； サイトカイン； TNFα； 抗体； 抗体のイディオタイプ； のいずれかに結合する抗原結合部位を有する請求の範囲第12項記載のポリペプチ ドあるいは請求の範囲第14〜17，39，40〜45のいずれか１項記載の二量体。 52．二量体の１つの抗原結合部位に対する抗原の結合が二量体の他の結合部位 への抗原の結合に影響を与える請求の範囲第14〜17，39，40〜45のいずれか１項 記載の二量体。 53．リンカーの変更が二量体の抗原結合部位の少なくとも１つの抗原結合アフ ィニティーの改良に導く請求の範囲第14〜17のいずれか１項記載の二量体。 54．請求の範囲第12項記載のポリペプチドあるいは請求の範囲第14〜17，39， 40〜45のいずれか１項記載の二量体を使用する抗原についてのアッセイ。 55．診断である請求の範囲第54項記載のアッセイ。 56．２つの抗原の架橋を包含する請求の範囲第54項記載のアッセイ。 57．２つの細胞の凝集を包含する請求の範囲第56項記載のアッセイ。 58．１つの抗原が表面上に存在し、そして他の抗原が溶液の中に存在する請求 の範囲第56項記載のアッセイ。 59．表面のプラズモンの共鳴を使用する検出を包含する請求の範囲第57項記載 のアッセイ。 60．２つの異なる細胞表面上の抗原に結合する請求の範囲第12項記載のポリペ プチドあるいは請求の範囲第14〜17，39，40〜45のい ずれか１項記載の二量体。 61．請求の範囲第１〜12いずれか１項記載のポリペプチドあるいは請求の範囲 第14〜17，39，40〜45のいずれか１項記載の二量体からなる製剤。
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