JPS5871895A - １２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０αカルボン酸及び／又はその塩の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はデオキシコール酸及び／又はその塩から微生物
により１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−１）エン
−３−オン−２ｏα−カルボン酸及び／又はその塩を製
造する方法に関し、詳しくはデオキシコール酸及び／又
はその塩を基質として１２α−とドロ中シプレグナー１
．４−ジエン−３−ｔ　７−２０　ｍ−カルボン酸及び
／又はその塩を生産するシュードモナス・アルビラに属
する細菌を、主炭素源としてデオキシコール酸及び／又
はその塩を含む培地に培養して１２α−ヒドロキシプレ
グナ−１，４−ジエン−３−オン−２ｏα−カルボン酸
及び／又はその塩を生成せしめ、これを採取することｔ
＊黴とする１２α−ヒドロキシプレフナ−１，４−／エ
ン−３−オン−２ｏα−カルボン酸及び／又はその塩の
製造方法に関する。

従来、デオキシコール酸に微生物を作用させて１２α〜
ヒドロ中シプレグナー１．４−ジエン−３−オン−２０
α−カルボン酸を得る方法はいくつか知られている。ま
ずパルネス（Ｐ、　Ｊ、　Ｂａｒｎ＠ｓ　）　ラによっ
て、シュードモナス・エスゼーＮＣＩ　Ｂ１０５９０（
Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａａ　Ｉｐ、ＮＣＩＢ　ＩＱ５９Ｑ
　）菌株を用イル方法が報告されている［　Ｊ、Ｃｈ＠
ｍ、　Ｓｏｃ、　Ｃｈｅｗ、Ｃｏｍｍｕｎ。

（１９７４年）、１１５〜１１６頁及びＴｅｔｒａｈ＠
ｄｒｏｎ、　　３２巻、８９〜９３頁（１９７６年）参
照〕０この方法は。

デオキシコール酸を０．１１含む無機塩培地１０／でシ
ュードモナス・エスピーＮｃＩＢｘｏｓ９ｏ１１１ｋｔ
１４時間好気的に培養し、デオキシコール酸１０ｆから
１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
ン−２０α−カルボン酸６５７叩及び１２β−ヒドロキ
シアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン９
６０叩を主生産物として得。

さらに１２α−ヒト四キシアンド四スター１，４−ジエ
ン−３，１７−ジオン％　１２β−ヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオン及び１２ξ。

１７ξ−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３−オン
を微量成分として得るものである。この方法Ｉｆｉ１２
α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−
２０α−カルボン酸の収率が７−未満と低い点、アント
ロスタン系の副生物が多い点、及び基質であるデオキシ
コール酸のｌ）［が０．１％と低い点で実用的ではない
。なお、この方法で使用されているシュードモナス１ｐ
、ＮＣｌＢ１０５９０薗株については、この菌株が動物
糞便から採取されたシュードモナス属に属する細菌であ
ること以外には全く報告されていない。また、テネソン
（Ｍ、　Ｋ、　Ｔ＠ｎｎｅｓｏｎ　）らによる、嫌気性
大腸菌を用イテテオ午シコール酸から１２α−ヒドロキ
シプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２ｏα−カル
ボンＩｌ［ｉ＊β−ヒドロキシアンドロスタ−１゜４−
ジエン−３，１７−ジオンを得る方法（Ｂｌｏｃｈ＠ｍ
。

Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、、　５巻、、１７５８〜１７６
０頁（１９７７年）参照〕；オーエン（Ｒ，Ｗ、　Ｏｗ
ｅｎ　）　ラによる。バクテロイデス・フンギリスＸ　
Ｆ　２３　（Ｂａｃｔ＠ｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ
＋　ＸＦ　２３　）菌株又はバクテロイデス・フラギリ
ス・サブスピーシーズ・セタイオタオミクロ：／　Ｅ　
５９　（Ｂａｃｔ＠ｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　
５ｕｂｓｐ。

ｔｈｅｔａｌｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ　Ｅ　５９　）菌株
を用いてデオキシコール酸から１２α−ヒドロ中シプレ
グナー１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン１
ｌｓｉｚβ−ヒドロ中シアンドロスター１．４−ジエン
−３，１７−ジエン、１２α−ヒドロキシアンドロスタ
−１゜４−ジエン−３，１７−ジオン及び１２β−ヒド
ロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを得る
方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ、、　
５巻、　１７１１〜Ｘ７１３頁（１９７７年）参照〕が
知られているが、これらの方法はいずれも嫌気性菌を用
いており、用いる基質が低濃度となること、培養に長期
間を要すること、目的物の収率が低いことなど工業的に
発酵生産するに尚り種々の問題点を有する。

本発明者らはデオキシコール酸及び／又はその塩を基質
として１２α−ヒドロキシプレグナ−１゜４−ジエン−
３−オン−２０α−カルボン酸及ヒ／又はその塩を生産
する微生物の探索を長期間性なった結果、シュードモナ
ス・アルビラに属する特定の細菌がデオキシコール酸及
び／又はその塩を基質として１２α−ヒト四キシプレグ
ナー１．４−ジエンー３−オン−２０α−カルボン酸及
ヒ／又はその塩を高選択率、高収率で生産することを見
出し１本発明を完成するに至った。

本発明者らが得た上記のシュードモナス・アルビ２に属
する細菌としては、シュードモナス・アルビラＤ−２３
５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｒｖｉｌｌａ　Ｄ−２
３５）菌株（黴工研薗寄第６１４８号）がある。この菌
株はデオキシコール酸及び／又はその塩を含む培地で培
養された場合、培養期間のいずれの時期においても１２
β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１
７−ジオンをほとんど生産しない点で前記のバルネスら
の方法で用いられたシュードモナス・エスピーＮＣＩ　
８１０５９０１株とは区別される。

本発明者らが得たシュードモナス・アルビラロー２３５
藺株の菌学的性質を列挙すると次表のとおりである。

！！１菫亙及 形態　　　　桿菌 大きさ　　　　　　　０．３〜０．７Ｘ１．５〜２．４
μ鞭　毛　　　　　　　　　極鞭毛（２〜４本、束毛）
胞子　　　　なし グラム染色　　　　　　陰性 抗酸性　　　　　　　な　し 培地における培養所見 ニュートリエンド寒天平板　　円形、扁平状、金縁培養
　　　　　　　　　　白色１ｇ１光、平滑ニュートリエ
ンド寒天斜面　　　拡布状、乳白色、平滑培養 ニュー）ＩＪエンド液体靜装　　　厚膜状菌膜及び沈漬
形成培養 ゼラチン穿刺培養　　　　　　液化せずリドマスミルク
　　　　　　　リドマスを脱色せずミルクを凝固、ペプ
トン化せず 硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　　　−脱窒反応　
　　　　　　　　　　　　−ＭＲテスト　　　　　　　
　　　　　　　　−ＶＰテスト　　　　　　　　　　　
　　　　−インドールの生成　　　　　　　　　　　　
−硫化水素の生成　　　　　　　　　　　　　−澱粉の
加水分解　　　　　　　　　　　　−クエン酸の利用　
　　　　　　　　　　　　十コハク酸の利用　　　　　
　　　　　　　　十グルタミン酸の利用　　　　　　　
　　　　十ｐ−ヒドロキシベンゾエートの利用　　　　
　　　　十無機窒素源の利用　　　　　　　　　　　十
ウレアーゼ　　　　　　　　　　　　−オキシダーゼ　
　　　　　　　　　　＋カタラーゼ　　　　　　　　　
　　　＋＃！素に対する態度　　　　　　　　　　好気
的０−Ｆテスト　　　　　　　　　　　　　　０（ｚ）
　　Ｌ−アラビノース　　　　　　＋　　　　　−（匍
　Ｄ−キシロース　　　　　　　十　　　　−（８）Ｄ
−グルコース　　　　　　　　十　　　　　−（４）Ｄ
−マンノース　　　　　　　＋　　　　−（５）Ｄ−７
ラクトース　　　　　　　−　　　　　−（６）Ｄ−ガ
ラクトース　　　　　　十　　　　−（γ）マルトース
　　　　　　　　　　十　　　　　−（８）　　シュー
クロース　　　　　　　＋　　　　−（９）ラクトース
　　　　　　　　　　＋　　　　　−輪　トレハｑ−ス
　　　　　　　　　−　　　　　−（ロ）Ｄ−ソルビッ
ト　　　　　　　−−（ｉｊｌＤ−マンニット　　　　
　　　−−（至）イノジット　　　　　　　　　−　　
　　−ＣＬ４　グリセリン　　　　　　　　−−（ロ）
デンプ゛ン　　　　　　　　　　　−　　　　−（注１
）：培地組成： ポテトエキス４．０　ｆ／Ｉ　、　　グルコース２０．
０　ｔ／１及び寒天１５．０　ｆ／１ （注２）：生理学的性質において、＋、士及び−は次の
と七を意味する。

十・・・・その性質又はその生成６す ±・・・・その性質又はその生成の有無が判定し難い−
・・・・その性質又はその生成なし く注３）：ヒュー・アンド・ンイフソン培地の炭素源を
それぞれ糖類１−１５と代え六培地での菌による糖類か
らの酸の生成及びガスの発生を観察したもので６る。

＋・・・・酸の生成又はガスの発生あり±・・・・酸の
生成又はガスの発生の有無が判定し難い −・・・・酸の生成又はガスの発生なし上記の表に示し
た菌学的性質に基づき、シュードモナス・アルビラＤ−
２３５菌株の同定を行なった。シュードモナス・アルピ
ラＩ）−ａｓｇ株ａ。

桿菌であること、極鞭毛を有していること、グラム染色
が一性であることなどの顕微鏡的所見並びにオキシダー
ゼ反応及びカタラーゼ反応がともに陽性であること、好
気性でおること、０−Ｆテストの結果が酸化的（０ｚｉ
ｄａｔｉｖｅ　）でおることなどの生理学的性質からパ
ージエイズ・マニュアル・オブ・ディター′ミネイティ
プ・バクテリオロジー第７版及び第８版に基づき、シュ
ードモナス属に属する細菌であると同定した。さらにシ
ュードモナス・アルビ９Ｄ−２３５薗株は、菌体の大き
さが０．３〜０．７　Ｘ　１．５〜２．４μである点、
寒天平板上の集落の色が白色でかつその表面が扁平状で
混光を呈する点１色素を生成しない点、ゼラチンを液化
しない点、硝酸塩を還元しない点及びグルコースから酸
を生成する点から、シュードモナス属のフルビク種に属
する細菌であると同定した。

本発明の方法による１２α−ヒドロ中シブレグｔ−１，
４−ジエン−３〜オン−２０α−カルボン酸及び／又は
その塩の生産Ｆｉ、デオキシコール酸及び／又はその塩
を基質として１２α−ヒトＯａ？シプレクナー１．４−
ジエンー３−オン−２０α−ル酸及び／又はその塩を含
む培地に培養することにより行なわれる。デオキシコー
ル酸の塩としては具体的にはデオキシコール酸６ナトリ
ウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシウム
、′マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩である。

デオキシコール酸及び／又はその□塩の濃度は通常約１
〜２００　ｆ／ｌの範囲でよいが、生産される１２α−
ヒドロキシプレグナ−１，゛４−ジエンー３−オンー２
０α−カルボン酸及び／又はその塩の収量、培養条件及
び操作性などの経済的観点から約ｌＯ〜１００　ｆ／ｌ
の範囲が好ましい。培養方法は原則的には一般微生物の
好気培養で採用される方法と同じであるが１通常は液体
培地による振盪培養法又は通気攪拌培養法が用いられる
。培地としては上記のデオキシコール酸及び／又はその
塩を基質として１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−
ジニンー３−オン−２０α−カルボン酸及ヒ／又はその
塩を生産するシヱードモナス・アルピラに属する細菌が
資化利用できる栄養源を含有するものであればよい。炭
素源としてはデオキシコール酸及び／又はその塩を単一
炭素源としてもよく。

或いはデオキシコール酸及び／又はその塩にアラビノー
スナトのペントース類；グルコース、″Ｖンノース、フ
ラｉドース、ガククトースなどのヘキソース頽；シュー
クロース、マルトースナトノ二糖ｌ［：澱粉分解物；糖
アルコール類、グリセリンなどの多価アルコール類；又
はポリペプトン、ベフトン、肉エキス、麦芽エキス、コ
ーンステイープリカー、酵母エキス、各種アミノ酸、有
機酸などを併用してもよい。また窒素源としては、例え
ば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム。

硝酸カリウムなどの無機窒素源、又はポリペプトン、ペ
プトン、肉エキスなどの有機窒素源が用いられる。また
、この他に燐酸水素２カリウム、燐酸２水素カリウム、
硫酸マグネシウムなどの無機塩類が溢加される。培養条
件に特徴はないが１通常２５〜３５℃で１０時間〜７日
間振盪培養又は通気攪拌培養を行なう。

このようにして培養液中に蓄積され７’Ｃ１２α−ヒド
ロΦシプレグナー１，４−ジエン−３−オン−２０α−
カルボン酸及び／又はその塩は、既知の方法により分離
採取することができる。例えば。

培養液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分離な
どにより分離除去して得られた培養濾液又は上清に、塩
酸、硫酸などの酸管加えて酸性としたのち、上記カルボ
ン酸を溶解しかつ水と相分離する有機ｓｍ、例えば酢酸
エチル、クロロホルム。

クロロホルムとメタノールの混合液などを用いて抽出す
る。得られた抽出液を集め、これより溶媒を溜去する仁
とによって目的とする１２α−ヒドロキシプレグナ−１
，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸を回収す
ることがで龜る。この有機溶媒による抽出操作は培養濾
液又は上清についてのみでなく、培養液そのものについ
て行なうことができ、１＊これらの培養液、培養濾液又
は上清に予め酸を加えることなしに行なうこともてきる
。上記において培養濾液又は上清を酸性とした場合には
１２α−ヒト四キシプレグナー１．４−ジエン−３−オ
ン−２０α−カルボン酸が沈ｊｌ物、！：して得られる
ため、これをそのまま濾過又は遠心分離などＫより回収
することもできるが、これに続く精製等の処理の操作性
を考慮すれば上記の抽出操作を行なうことが好ましい。

上記の方法で得られた抽出物又は沈澱物中に１１１１２
α−ヒドロキシプレグナ−１，４、−ジエン−３−オン
−２ｏα−カルボン酸の他に残存基質のデオキシコール
及び／又はその塩並びに副生物が含まれており、その抽
出物又は沈澱物を例えばシリカゲルカラムに吸着させ、
クロロホルムとエタノールの混合液で溶出させることに
より１２α−とド四キシプレグナー１．４−ジエン−３
−オン−２ｏα−カルボン酸を取得することができる。

本発明の方法により得られる１２α−ヒドロキシプレグ
ナ−１，４−ジエン−３−オン−２ｏα−カルボン酸は
、その２０位のカルボンａｔ−ａｍさせることくよって
プレドニゾンなどのホルモン系ステロイドの合成原料と
なる１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３
，２０−ジオンに誘導することができる（　ＨｏＲｕａ
ｃｈｔｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｈｅｍ、Ｂａｒ、。

８８巻％８８３頁（１９５５年）参照〕。

以下実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ シュードモナス・アルビラＤ−２３５菌株（微工研菌寄
第６１４８号）を次に示す方法で培養した。

デオキシコール酸５．Ｏｆ　、硝酸アンモニウム０．２
Ｖ、燐酸２水素カリウム０．１？、燐酸水素２カリウム
０．２５　ｆ　、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２
ｆ、酵母エキス０．０１ｆ及び水酸化ナトリウム０．５
ｆに水道水を加えて容量を１００１！Ｌｌ（Ｆｔｌニア
、２）に調整し、と九を培地とした。この培地ｔ−５０
〇−容坂ロフラスコに入れ、１２０℃で１５分間。

蒸気殺菌を行なった。予め上記の培地と同じ培地で試験
管振盪機にて２日間増殖させた種菌ＩＱｍを上記の５０
０ｄ容坂ロフ２スコに添加し、３０℃で５日間振盪培養
した。培養後、この培養液を液上清に塩酸を加えること
により、この培養液上清の田ｔ−２とした。この培養液
上清をクロロホルム／メタノールの２／ｌ容量比の混合
液３００ａｃ／で抽出し、ロータリー・エバポレーター
でクロロホルム／メタノール混合液を溜去することによ
り。

２．９ｔのデオキシコール酸の酸化生成物及び未変換の
デオキシコール酸の混合物を得た。

上記の混合物の極く一部を取り、これにメタノールを加
えてｌ−溶液とし、この溶液２０μｌをミクロボンダバ
ックｃ−１８カラムを備えた高速液体クロマトグラフィ
ー（米国ウォーターズ社製。

ＨＬＣ−ＧＰＣ−２４４型）に注入した。移動相として
田４．０ＫＩＩ！ｌた水／メタノールの２５７７５容量
比の混合液を流速ｌボッ分で流し、検出を屈折率方式で
行なったところ第１図のクロマドグ２ムが得られた。こ
のクロマドグ２ムにおけるピークＡ％　ビークＢ、ビー
クＣ，ピークＤ％　ビークＥ及びビークＦは標準品のピ
ークと照合することにより各々１２α−ピドｐキシプレ
グナー１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸
、１２α−ヒドロキシ−３−ケト−４−コレン酸、１２
α−ヒドロキシ−３−ケト−５β−コラン酸、１２α−
ヒドロキシ−３−ケト−コラ−１，４−ジエン散。

１２α−ヒドロキシ−３−ケト−５β−プレグナン−２
０α−カルボン酸及びデオキシコール酸のものと一致し
た。

上記の混合物２，８ｖを少量のクロロホルム／エタノー
ルの９９／１容量比の混合液に溶解させ。

５０Ｆのシリカゲルカラムに吸着させた。このカラムを
クロロホルム／エタノールの９９７１容量比の混合液５
００−で洗滌彼、クロ四ホルム／エタノールの９７／３
容量比の混合液１１をカラムに流し、得られた溶出液か
らロータリー・エバポレーターで溶媒を溜去することに
よりデオキシコール酸の酸化生成物の混合物を３１０！
得た。次に、上記のカラムにクロロホルム／エタノール
の９５１５容量比の混合液５００ｍを流し、溶出液’４
ｘｏａｇ宛フ２クションチューブに分取し、薄層クロマ
トグラフィーにより単一スポットを与える画分を集め、
ロータリー・エバポレーターで溶媒を溜去することによ
り乾固物６’５０■を得九。これを酢酸エチルで再結晶
することにより１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−
ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸を４５０叩得た
。さらに上記のカラムにクロロホルム／エタノールの９
０／１０容量比の混合液２００ｍ１を流し、この溶出液
から未変換のデオキシコール酸を１．２？回収した。

先に得うれたクロロホルム／エタノールノ９７／３容量
比°の混合液による溶出画分からのデオキシコール酸の
酸化生成物の混合物３１６呼を少量のクロロホルム／エ
タノールの９９／ｌ容量比の混合液に溶解させ、２０ｆ
のシリカゲルカラムに吸着させた。この力ジムにクロロ
ホルム／エタノールの容量比が９８／２及び９７／３の
各々の混合液３００１Ｌｌをこの順序で流し、溶出液を
１０ｉｌ宛フ２クシヨンチユーブに分取し、薄層クロマ
トグラフィーにより単一スポットを与える画分をそれぞ
れ合わせ、ロータリー・エバポレーターで溶媒を溜去し
六。その結果、クロロホルム／工Ｉ’／−ルの９８／２
容量比の混合液による前半の溶出画分から１２α−ヒド
ロ中シー３−ケトー５β−フラン酸を８０即得、その後
半の溶出画分から１２α−ヒドロキシ−３−ケト−４−
コレン酸ヲｌＯＨｇ得た。クロロホルム／エタノールの
９７／３容量比の混合液による前半の溶出画分から１２
α−ヒドロキシ−３−ケト−５β−プレグナン−２０α
−カルボン酸を５９得、その後半の溶出画分から１２α
−ヒドロキシ−３−ケト−コラ−１゜４−ジエン酸を１
０譜得た。

得られた各々の化合物を下記の方法で同定した。

マススヘクトｈ　ｍ／　ｚ　：　３５８　［Ｍ］”３４
０ＣＭ−Ｈ２０）” ３２２（Ｍ−２Ｈ＊Ｏ］“。

またｍ／Ｚ＝１２２より３−ケト−１，４−ジエンの存
在が確認され、ｍ／ｚ＝７４より−ＣＨ−Ｃ０ＯＨの存
在が確認されＮＭＲスペクトル（９Ｑ　ＭＨｚ　）δＤ
ＭＳＯ−ｄ６゜ＨＭＳ ０．６５（３Ｈ，＠）１８−ＣＨｓ ｌ、０５（３Ｈ，ｄ　）　２１−ＣＭ５１．１３　（３
Ｈ，ｌ　）　１９−ＣＨＩ３．７４（ＩＨ，ｔ、Ｊ−３
Ｈｚ）１２β−Ｈ４，３ｊ（ＩＨ，ｄ）１２α−ＯＨ ＆９３（ＩＨ，ｓ＋）４−Ｈ ６，０６（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）２−Ｈ７，０８（
１ｇ、ｄ、Ｊ＝ｉ０Ｈｚ）１−Ｈ１２ｇ−ヒドロキシプ
レグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン
酸メチルエステルの融点：２３６℃ｔＺａ−ヒドロキシ
ー３−ケト−４−コレン酸ｖｘｘベク）４ｍ／ｉ　ｔ　
　３８８ＣＭ）＋４３７Ｇ［Ｍ−ＨｓＯ］＋□ ３５５　ＣＭ　−ＨｚＯ−ＣＨｓ　］”１九１ｌｓ＝ｘ
ｚ４より３−ケト−４−エンの存在が確認されｍ／　ｓ
　＝　６　Ｑより−ＣＨ！−ＣＯＯＨｃＤ存在が確認さ
れた。

ＤＭＳＯ−ｄ５　。

ＮＭＲスペクトル（９９ＭＨｚ　）δ）ＩＭｓ　　・０
．６０（３Ｈ，５）１８−ＣＨｓ ｏ、８６（３Ｈ，ｄ）２１−ＣＨｓ ｌ、０７（３Ｈ，５）１９−ＣＨＩ ’　３．７５（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ）１２β−Ｈａ５
６（ＩＪ　５）４−Ｈ １２α−ヒドロキシ−３−ケト−５β−コラン酸マ、Ｘ
　ｘペクトＡ’　ｍ／ｚ　：　３９０　（Ｍ　）”３７
２［Ｍ−ＨｇＯ］” ３５４（Ｍ−２ＨｚＯ）” ３３９ＣＭ−２Ｈ２０−ＣＨＩ）” またｍ／ｌ：５Ｑより−ＣＨ５−ＣＯ０ＨｒＤ存在がｉ
ｉｍされた。

ＤＭＳＯ−ｄ６　。

ＮＭＲスペクトル（９０ＭＨｚ）δＨＭＳ　　　”０．
５７　（３Ｈｔ　ａ　）　１８　　ＣＨｓｏ、８３（３
Ｈ，ｄ）２１−ＣＨｓ ｏ、８９（３Ｈ，５）１９−ＣＨｓ ３．７６（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ）１２β−Ｈ１２α−
ヒドロキシ−３−ケト−コラ−１４−ジエンマススヘク
トルｍ／　ｚ　：　３８６　（Ｍ）”３６８（Ｍ−Ｈｉ
ｄ）” ３５３　（Ｍ　−ＨｚＯ−ＣＭ５　）”またｍ／ｚ＝ｘ
ｚｚより３−ケト−１，４−ジエンの存在が確認されｈ
　ｍ／ｚ　＝６０より−ＣＨ２−Ｃ０ＯＨの存在が確認
された。

ＤＭＳＯ−ｄ６　。

ＮＭＲｘ　ベクトル（９０ＭＨｚ）δＨＭＳ　　　”０
−６３　（３Ｌ　’　）　１８−　ＣＨａｏ、８５（３
Ｈ，ｄ）２１−ＣＨｓ ｌ、１１（３Ｈ，畠）　１９−ＣＨＩ ３．７８（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ）１２β−Ｈ＆９１’
（ＩＨｔ　ｌ　）　４−” ６．０５（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝ｌＯＨｚ）２−Ｈ７，０８（
ＬＨ，ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）１−Ｈ１２α−ヒドロキシ−
３−ケト−５β−プレグナン−２０α−カルボン酸 マススペクトルｍ／ｚ：３６２〔Ｍ）＋′３４４ＣＭ−
Ｈ２０）” ３２６ＣＭ−２Ｈ２０］” またｍ／ｚ　＝　７４より一〇Ｈ−ＣＯＯＨの存在が確
認され六〇晶３ ＮＭＲｘ−＜り）ｌ’（９０ＭＨｚ）δＤＭＳＯ−ｄ６
　。

ＨＭＳ　　　　” ０．６３（３Ｈ，５）１８−ＣＨｓ ｌ、０７（６Ｈ，ｍ）１９−Ｃｎａ及び２ｌ−ＣＨｓ３
．７５（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ）１２β−Ｈ４．２８（
ＩＨ，ｄ）１２α−ＯＨ 第１図のクロマトグラムにおける各ピークの面積比を積
分針（島津製作所製、島津クロマトパックＣ−ＲＩＡ）
で求め、この面積比から得られたデオキシコール酸の酸
化生成物の収量及び未変換のデオキシコール酸の残存量
を算出すると次表のとおりである。

実施例２ 実施例ＩにおいてデオキシコールＨ５，Ｏｆ及ｒＪ水酸
化ナトリウム０．５Ｆの代りにデオキシコール＠２．Ｏ
ｆ及び水酸化ナトリウム０．２ｆｔ−含有する培地を用
いる以外は実施例１に示した条件と同様にしてシュード
モナス・アルビラＤ−２３５菌株（徴工研曹寄第６１４
８号）を培養し、処理することによりデオキシコール酸
の酸化生成物及び未変換のデオキシコール酸の混合物を
４２０■得た。

上記の混合物の極く一部を取り、これにメタノールを加
えてｌ−溶液とし、この溶液２０μｌ’にミクロボンダ
パックＣ−１８カラムを備えた高速液体クロマトグラフ
ィー（米国ウォーターズ社製。

ＨＬＣ−ＧＰＣ−２４４型）に注入した。移動相として
ＰＨ４，ＯＫ調整した水／メタノールの２５／７５容量
比の混合液を流速１ｌＥ７！／分で流し、検出を行なっ
た。以下、実施例１と同様の方法により得られたデオキ
シコール酸の酸化生成物の収量及び未変換のデオキシコ
ール酸の残存量を求めた０その結果を次表に示す。

゛　実施例３ シュードモナス・アルビラＤ−２３５菌株（微工研菌寄
第６１４８号）を次に示す方法で培養した。

デオキシコール酸０．５Ｆ、グルコース０．０５ｆＴｈ
硝酸アンモニウム０．０２ｆ、燐酸２水嵩カリウム０、
（ｌｔｆ、燐酸水素２カリウム０．０３Ｆ、硫酸マグネ
シウム・７水和物０．００２Ｆ、酵母エキス０．００２
ｆを水道水に加えて容量ｔｌＯｍに調整し、これを培地
とした０この培地を試験管（内径２１■×長さ２００■
）に注入し、１２０℃で１５分間、蒸気殺菌を行なった
０予め、デオキシコール酸１９１％ペプトン０．５　％
　Ｉ肉エキス０．５６塩化ナトリウムｏ、　５　＊　、
寒天１．５チ及び水酸化ナトリウム０．１−を含有する
水溶液から作成し九スラント上で１日間増殖させた種菌
の１白金耳を上記の試験管中の培地に植菌し、３０℃で
６日間振盪培養した。培養後、培養液からクロロホルム
２００ｄを用いてデオキシコール酸の酸化生成物及び未
変換のデオキシコール酸を抽出した。分液後、抽出液か
らロータリー・エバポレーターでクロロホルムを溜去す
ることにより、デオキシコール酸の酸化生成物と未変換
のデオキシコール酸との混合物を３９０９得た。

上記の混合物の極く一部を取り、これにメタノールを加
えて２−溶液とし、この溶ｆｉ２０μｌを考クロポンダ
パックＣ−１８カラムを備えた高速液体クロマトグラフ
ィー（米国ウオーターズ社製。

ＨＬＧ−ＧＰＣ−２４４盤）Ｋ注入した。移動相として
ｐＨ４，０に調整した水／メタノールの２５／７５容蓋
比の混合液を流速１ｍ／／分で流し、検出を行なった。

以下、実施例１と同様の方法により得られたデオキシコ
ール酸の酸化生成物の収量及び未変換のデオキシコール
酸の残存量を求めたところ。

１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
ン−２０４−カルボン酸が６（ｌハその他のデオキシコ
ール酸の酸化生成物が２０１ｇ、デオキシコール酸が３
１０　Ｑでらった。

【図面の簡単な説明】

第１図＃′ｉ夾施例１で得られたデオキシコール酸の酸
化生成物及び未変換のデオキシコール酸の液体クロマト
グラムを表わす。 特許出願人株式会社り　ラ　し 代理人弁理士本多　騒 ０　３　６　　　’？　　１２　１５　１３２１係蒋痺
聞（２） 手続補正書（自発） 昭和５７年　１月１１日 特許庁長官島田春樹殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１６８２７６号 ２、発明の名称 １２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
ン−２０α−カルボン酸及び／又はその塩の製造方法倉
敷市酒津１６２１番地 （１０８）株式会社り　ラ　し 代表取締役　　岡　　オ木　　次　　男４、代理　人 ６、補正の内容 （１）　　明細書第１頁＠７〜１７行の記載（特許請求
の範囲）を別紙のとおシ訂正する◇ （２）明細書ｊｌＥ２頁第７行第７行る「主炭素源とし
て」を削除する。 以上 （別紙） ［デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として１２
α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−
２０α−カルボン酸及び／又はその塩を生産するシュー
ドモナス・アルビラに楓する細菌を、デオキシコール酸
及び／又はその塩を含む培地に培養して１２ｍ−ヒドロ
キシプレグナ−１゜４−ジエン−３−オン−２０α−カ
ルボン酸及ヒ／又はその塩を生成せしめ、これを採取す
ることを特徴とする１２α−ヒドロキシプレグナ−１，
４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸及び／又は
その塩の製造方法。 持開昭５８−７１と＋　２５　（９） ４７９−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. デオキシコール酸及び／又はその塩を基質として１２ｇ
   −ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２
   ０α−カルボン酸及び／又はその塩を生産するシュード
   モナス・アルビラに属する細菌を、主炭素源としてデオ
   キシコール酸及び／又はその塩を含む培地に培養して１
   ２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン
   −２０α−カルボン酸及び／又はその塩を生成せしめ、
   これを採取することを特徴とする１２α−ヒトｑキシプ
   レグナー１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン
   酸及び／又はその塩の製造方法。