JPH0361421B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化酵素及びその製造方法に関す
る。 酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも実施されているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を行
なわせている。しかし、このような方法によれば
反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を補給
したり、また、反応後に酵素を失活させることな
く、生成物と酵素を分離することが非常に困難で
あり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、反
応が回分式であるから生産性に劣る。 このような問題を解決するために、既に水不溶
性の担体に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
質を反応させることが提案されている。このよう
な酵素の固定化方法の代表的なものに、水不溶性
の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸
着によつて結合させる担体結合法が知られてい
る。しかし、従来、この方法において用いられて
いる担体は、通常、セルロース、デキストラン、
アガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルア
ミドゲル、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒
子であり、このような粒子に酵素が固定化された
固定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定さ
れて基質溶液と接触されるので、基質が高分子量
の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に長
時間を要すると共に、反応収率が低いという問題
がある。 本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素の製造方法を提供することを目的とする。
特に、本発明は、イオン交換性基又は官能基を高
密度に有する水分散性高分子重合体粒子に酵素を
高負荷量で固定化すると共に、酵素活性が長期に
わたつて高く保持される固定化酵素、及びその製
造方法を提供することを目的とする。 本発明による固定化酵素は、第１のエチレン性
単量体組成物の重合体からなる50〜98重量％の重
合体芯部と、イオン交換性基又は官能基を有する
エチレン性単量体を含む第２の単量体組成物の重
合体からなる２〜50重量％の重合体殻部とより構
成される水分散性高分子重合体粒子に、上記イオ
ン交換性基又は官能基を介して酵素が固定化され
ていることを特徴とし、かかる固定化酵素は、本
発明に従つて、第１のエチレン性単量体組成物を
水媒体中で乳化共重合させて水分散性高分子重合
体粒子からなる重合体芯部を形成した後、水媒体
中でこの重合体芯部の存在下にイオン交換性基又
は官能基を有するエチレン性単量体を含む第２の
単量体組成物を乳化共重合させて、上記重合体芯
部の上に重合体殻部を有する水分散性高分子重合
体粒子を形成させ、次いで、この重合体粒子に上
記イオン交換性基又は官能基を介して酵素を固定
化することにより製造される。 本発明においては、先ず、第１の単量体組成物
を水媒体中で乳化共重合させて水分散性高分子重
合体粒子からなる重合体芯部を形成する。ここに
得られる重合体芯部は、酵素反応が行なわれる温
度、一般的には５〜90℃の温度で溶融軟化しない
ことを要し、従つて、得られる重合体粒子のガラ
ス転移温度が少なくとも０℃であるように単量体
組成が選ばれ、好ましくは５℃以上であるように
選ばれる。従つて、本発明においては、第１の単
量体組成として、スチレン、メチルスチレン、ビ
ニルトルエン、塩化ビニル、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル、特に炭素数１〜４の
アルキルエステル、アクリロニトリル、メタクリ
ロニトリル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、
ブタジエン、イソプレン、アクリルアミド、メタ
クリルアミド等の１種又は２種以上が用いられ
る。 尚、よく知られているように、ガラス転移点が
０℃以下の単独重合体を形成する単量体でも、他
の単量体と共に共重合させることにより、得られ
る共重合体のガラス転移点を０℃以上とすること
ができ、従つて、ガラス転移点が０℃以下の単独
重合体を与えるアクリル酸エチルやアクリル酸ブ
チル等を単量体成分として用いることは何ら差支
えない。例えば、アクリル酸エチルの単独重合体
のガラス転移点は−22℃であるが、単独重合体の
ガラス転移点が105℃であるメタクリル酸メチル
とアクリル酸エチルを共重合することによつて、
通常、ガラス転移点が約30℃である共重合体を得
ることができる。 本発明においては、第１の単量体組成が１〜80
重量％のアクリロニトリル及び／又はメタクリロ
ニトリルを含有するのが好ましい。この単量体を
存在させることにより、乳化剤を用いなくとも、
重合の安定性が確保されると共に、得られる水分
散性高分子重合体粒子の分散性もまた、良好とな
るからである。 特に、本発明において好ましい第１の単量体組
成物は、(a)アクリロニトリル及び／又はメタクリ
ロニトリル１〜80重量％、好ましくは５〜75重量
％、特に好ましくは10〜60重量％、(b)多官能性内
部架橋用単量体０〜10重量％、好ましくは0.1〜
15重量％、特に好ましくは0.5〜10重量％、及び
(c)アクリル酸アルキルエステル、メタクリル酸ア
ルキルエステル及びスチレンから選ばれる少なく
とも１種の単量体20〜99重量％、好ましくは25〜
95重量％、特に好ましくは40〜90重量％からな
る。かかる単量体組成物を用いることにより、乳
化剤の不存在下にも重合は非常に安定に行なわ
れ、望ましくない水溶性重合体等の副生を抑える
ことができるからである。尚、多官能性内部架橋
用単量体は後述するように、重合の安定性を高め
るのに役立ち、その具体例については、後述す
る。 上記の第１の単量体組成物の乳化共重合は水媒
体中で行なわれ、重合開始剤としては、例えば、
２，2′−アゾビスイソブチルアミジウム塩酸塩、
２，2′−アゾビスシアノバレリアン酸、過硫酸塩
等が用いられる。このようにして得られる水分散
性高分子重合体粒子は、本発明において担体とし
て用いる水分散性高分子重合体粒子の芯部を構成
し、通常、平均粒径が0.03〜1.5μの範囲である。
本発明においては、乳化剤を用いないで乳化共重
合体させるのが好ましく、また、上記したように
乳化剤なしで共重合させることができる。得られ
る水分散性高分子重合体粒子に乳化剤が混入して
いると、酵素の固定化の際に酵素が失活すること
があり、また、固定化された酵素が脱離しやすい
等の有害な影響を及ぼす傾向があるからである。
しかし、乳化剤がかかる有害な影響を与えないと
きは、乳化剤の存在下に乳化共重合を行なつても
よいのは勿論である。 次に、本発明においては、水媒体中で上で得た
重合体芯部をなす重合体粒子の存在下に、イオン
交換性基又は官能基を有する単量体を含む第２の
単量体組成を乳化共重合させ、上記第１の単量体
組成物からなる重合体芯部の上に重合体殻部を形
成させる。この場合においても、乳化剤を用いな
いのが好ましいのは前記と同じである。尚、本発
明においては、共重合した後、化学反応によつて
上記官能基に変換し得る側鎖を有する単量体を単
量体組成物の成分として用いる場合も、官能基を
有する単量体を共重合させる場合に含めることと
する。 本発明において、イオン交換性基とは、これに
より酵素をイオン結合により固定化し得る有機基
を意味し、また、官能基とは、これを介して酵素
を共有結合にて固定化し得る有機基を意味し、従
つて、有機基によつてはイオン交換性基であると
同時に官能基であることもある。 ここに、イオン交換性基としては、例えば、ス
ルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等の酸性
基、第３級アミノ基、第４級アミノ基等の塩基性
基等を挙げることができる。このようなイオン交
換性基を有する単量体の具体例としては、スチレ
ンスルホン酸、スルホプロピルメタクリレートの
ようなスルホン酸基を有する単量体、アクリル
酸、メタクリル酸、イタコン酸のようにカルボキ
シル基を有する単量体、アシツドホスホキシエチ
ルメタクリレート、３−クロロ−２−アシツドホ
スホキシエチルメタクリレートのようなリン酸基
を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタクリ
レート、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミ
ドのような第３級アミノ基を有する単量体、メタ
クリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムク
ロライド、メタクリロイルオキシエチルトリメチ
ルアンモニウムクロライドのような第４級アミノ
基を有する単量体を挙げることができる。 また、官能基としては、カルボキシル基、第１
級アミノ基、ヒドラジド基、グリシジル基等を挙
げることができる。かかる官能基を有する単量体
の具体例として、例えば、アクリル酸、メタクリ
ル酸、イタコン酸のようなカルボキシル基を有す
る単量体、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒド
ロキシエチルメタクリレートのような水酸基を有
する単量体、グリシジルメタクリレートのような
グリシジル基を有する単量体を挙げることができ
る。 また、重合体芯部をなす重合体粒子の存在下に
水媒体中で、アクリルアミドのようなアミド基を
有する単量体、及びアクリル酸メチル、メタクリ
ル酸メチルのようなメチルエステル基を有する単
量体をれぞれ含有する第２の単量体組成物を乳化
共重合し、上記重合体芯部の上にこれらを単量体
組成として有する共重合体を重合体殻部として生
成させ、次いで、この共重合体中の上記アミド基
をホフマン分解し、また、メチルエステル基にヒ
ドラジンを作用させることによつて、官能基とし
てアミド基やヒドラジド基を有する共重合体から
なる重合体殻部を形成させることができる。ま
た、第２の単量体組成物にアクリル酸エステルの
ようなエステル基を有する単量体を含有させ、こ
れを重合体芯部の存在下に共重合させ、次いで、
このエステル基を加水分解することにより、官能
基としてカルボキシル基を有する共重合体からな
る重合体殻部を形成させることもできる。 第２の単量体組成において、イオン交換性基又
は官能基を有する単量体は水溶性であることが多
く、従つて、これを単独で乳化重合させると、望
ましくない水溶性重合体が生じることがある。従
つて、本発明においては、第２の単量体組成物と
して、上記イオン交換性基又は官能基を有する単
量体１〜70重量％と共に、アクリロニトリル及
び／又はメタクリロニトリル１〜80重量％と、多
官能性内部架橋用単量体０〜20重量％と、これら
と共重合性を有する単量体20〜98重量％を含有す
る単量体組成物を乳化共重合させるのがよい。ま
た、ここにおいても、形成される重合体殻部が酵
素反応の行なわれる温度で溶融軟化しないことを
要し、従つて、形成される重合体殻部のガラス転
移温度が少なくとも０℃、好ましくは５℃以上で
あるように選ばれる。 上記共重合性単量体としては、前記したスチレ
ン、メチルスチレン、ビニルトルエン、塩化ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステ
ル、特に炭素数１〜４のアルキルエステル、アク
リロニトリル、メタクリロニトリル、酢酸ビニ
ル、プロピオン酸ビニル、ブタジエン、イソプレ
ン、アクリルアミド、メタクリルアミド等の１種
又は２種以上が好ましく用いられるが、特に、ア
クリル酸及びメタクリル酸の炭素数１〜４のアル
キルエステル及びスチレンが好ましく用いられ
る。 従つて、特に本発明においては好ましい第２の
単量体組成物は、(a)イオン交換性基又は官能基を
有する単量体１〜70重量％、好ましくは５〜65重
量％、特に好ましくは10〜60重量％、(b)アクリロ
ニトリル及び／又はメタクリロニトリル１〜80重
量％、好ましくは５〜75重量％、特に好ましくは
10〜60重量％、(c)多官能性内部架橋用単量体０〜
20重量％、好ましくは0.1〜15重量％、特に好ま
しくは0.5〜10重量％、及び(d)アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル及びスチレンから選ば
れる少なくとも１種の単量体20〜98重量％、好ま
しくは25〜95重量％、特に好ましくは40〜80重量
％とからなる。 このような単量体組成物を乳化共重合させるこ
とにより、イオン交換性基又は官能基を有する単
量体からなる単独重合体の生成が抑制されて、特
に重合が安定に行なわれると共に、得られる水分
散性高分子重合体粒子もまた、分散安定性にすぐ
れ、更に、これに酵素を固定化したとき、酵素の
脱離も抑えられるからである。 上記の内部架橋用多官能性単量体としては、多
価アルコールのポリ（メタ）アクリレートが好ま
しく、具体的には、エチレングリコールジメタク
リレート、ジエチレングリコールジメタクリレー
ト、トリエチレングリコールジメタクリレート、
ジプロピレングリコールジメタクリレート、１，
３−ブチレングリコールジメタクリレート、トリ
エチレングリコールジアクリレート、トリメチロ
ールプロパントリメタクリレート、トリメチロー
ルプロパントリアクリレート、テトラメチロール
メタンテトラアクリレート等が用いられる。ジビ
ニルベンゼンも好ましく用いられる。 一般に、イオン交換性基や官能基を有する単量
体は親水性であるため、これを単独で乳化重合す
ると、重合が不安定になると共に、望ましくない
水溶性重合体等の副性が多く、分散性の良好な重
合体粒子を得ることが困難である。 特に、水溶性重合体が生成すると、その一部は
水不溶性高分子重合体粒子上に吸着されて残り、
これを担体として酵素を固定化すると、この水溶
性重合体にも酵素が固定化される。このような水
溶性重合体を含む担体に酵素が固定化された固定
化酵素によれば、酵素反応の際に酵素が水溶性重
合体と共に基質溶液中に溶出して、酵素活性の経
時低下が著しいうえに、溶出した酵素が基質や反
応生成物と混在することとなるので、反応後にそ
の分離を要する等の種々の不都合を生じる。 しかしながら、本発明に従つて、予め調製され
た重合体芯部の存在下に、イオン交換性基又は官
能基を有する単量体と、アクリロニトリル及び／
又はメタクリロニトリルと、好ましくは多官能性
内部架橋用単量体と乳化共重合させることによ
り、乳化剤の不存在下においても、重合の安定性
が確保されると共に、望ましくない水溶性重合体
の生成が抑えられて、これらの単量体組成物を重
合体芯部の上に安定に共重合させることができ、
かくして、表面にイオン性基又は官能基を高密度
に有する水分散性高分子重合体粒子を得ることが
できるのである。 このような結果が得られる理由は必ずしも明ら
かではないが、第２の単量体組成物の乳化共重合
に際しては、既に重合の場として第１の単量体組
成物からなる重合体芯部が与えられており、且
つ、重合初期に生じるイオン性基又は官能基を有
する単量体を主成分とする水溶性の低分子量の重
合体にアクリロニトリル及び／又はメタクリロニ
トリルと多官能性内部架橋用単量体とが有効に共
重合して水不溶化すると共に、芯部重合体粒子と
の親和性がよくなつて、その表面に円滑にグラフ
ト化され、かくして、重合が安定化するのであろ
う。従つて、本発明においては、第２の単量体組
成物は、前記したように、アクリロニトリル及
び／又はメタクリロニトリル、及び多官能性内部
架橋用単量体を含有するのが望ましいのである。 また、重合体芯部の上に上記のような第２の単
量体組成物を乳化共重合させて、重合体殻部を形
成することにより、酵素の固定化に役立つイオン
交換性基又は官能基を水分散性高分子重合体粒子
の表面に高密度で形成させることができ、かくし
て、本発明によれば、酵素を高負荷量で固定化す
ることができるのである。 更に、本発明においては、以上のようにして得
られる水分散性高分子重合体粒子において、重合
体芯部が50〜98重量％であり、重合体殻部が２〜
50重量％となるように第１及び第２の単量体組成
物を逐次的に乳化共重合させる必要がある。殻部
が重合体粒子において２重量％よりも少ないとき
は、重合体殻部として重合体粒子がその表面に有
する共重合体のイオン交換性基又は官能基の量が
少なくなり、固定化し得る酵素の量が限られるこ
ととなつて、高い酵素活性を有する固定化酵素を
得難くなるからである。一方、50重量％を越える
ときは、イオン交換性基及び官能基が親水性であ
るために、重合体芯部をなす水分散性高分子重合
体粒子の存在下に第２の単量体組成物を共重合を
行なつても、殻部を形成する以外に、第２の単量
体組成物のみによる水溶性重合体を生成し、前記
したような不都合を生じ、更に、重合の安定性や
重合体粒子の分散性も損なわれることがあるから
である。 本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、その平均粒径が0.05μ〜2μ、好ましくは
0.1μ〜1μである。粒径が小さすぎると、これを担
体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素反応
を行なわせた後の回収が困難となり、一方、粒径
が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積が小
さくなり、酵素の固定化量が少なくなると共に、
水中に分散させるのが困難となるので好ましくな
い。 上記のような水分散性高分子重合体粒子の有す
るイオン交換性基に酵素をイオン結合にて固定化
し、又は官能基にこれを介して酵素を固定化する
方法は特に制限されず、従来より知られている方
法が適宜に採用される。 例えば、イオン交換性基を有する水分散性高分
子重合体粒子に酵素をイオン結合にて固定化する
には、酵素の失活の起こらない温度、PH等適宜の
条件で重合体粒子の分散液と酵素溶液とを混合す
ればよい。例えば、反応時のPHは酵素の等電点、
イオン交換性基の種類等に応じて適宜に選ばれる
が、一般的には５〜８が好ましい。この後、必要
に応じて、遠心分離、膜分離等き適宜の手段にて
未固定の酵素を除去すれば、本発明による固定化
酵素を得ることができる。 また、官能基を有する水分散性高分子重合体粒
子に酵素を固定化する方法も特に制限されず、従
来より一般に知られている方法が適宜に採用され
る。かかる方法として、官能基の種類に応じて、
例えば、ジアゾ法、カルボジイミド法、臭化シア
ン法、アジド法等が挙げられるが、これらに限定
されるものではない。例えば、水酸基をもつ水分
散性高分子重合体粒子に酵素を共有結合にて固定
化するには、水酸基をエピクロロヒドリンにより
エポキシ化した後、このエポキシ基に酵素のアミ
ノ基を反応させ、アミド基を形成させることによ
り、酵素を重合体粒子に結合させることができ
る。このエポキシ化は従来知られている通常の条
件の下に行なわれ、例えば、水分散性高分子重合
体粒子の有する水酸基の１〜10倍当量のエピクロ
ロヒドリンを用い、アルカリ水溶液中、室温で反
応させる。このエポキシ基への酵素の固定化も従
来の普通の条件下に行なわれる。 また、カルボキシル基に酵素を固定化する一つ
の方法として、水溶性カルボジイミドを用いて、
酵素のアミノ基と水分散性高分子重合体粒子表面
のカルボキシル基とを直接アミド結合を形成させ
ることにより結合させることができる。水溶性カ
ルボジイミドとしては、例えば、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モル
ホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トル
エンスルホネート等を挙げることができる。この
ような水溶性カルボジイミドを用いる酵素固定化
は従来知らている通常の条件の下で行なわれ、例
えば、水分散性高分子重合体粒子の有するカルボ
キシル基の３〜50倍当量のカルボジイミドの水溶
液に酵素を混合し、温度を５℃程度、PHを4.5〜
6.0に保持して、一夜反応させればよい。 また、本発明においては、酵素を重合体粒子の
官能基を介して共有結合にて固定化するに際し
て、必要に応じて、重合体粒子にヘキサメチレン
ジアミン、ドデカメチレンジアミン、グリシルグ
リシルグリシン等のスペーサ基を介して酵素を結
合させ、固定化された酵素の重合体粒子上での自
由度を拡大することができる。 以上のようにして、酵素を重合体粒子に固定化
させた後、用いた反応試薬や固定化されていない
酵素を遠心分離、膜分離等の適宜の手段によつて
除去すれば、本発明の固定化酵素を得る。 本発明による固定化酵素は水分散液として用い
られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量
は、固定化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要と
する反応速度、基質濃度等により適宜に決定され
る。 本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でもよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て、単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵
素を同時に固定化してもよい。 本発明において酵素は特に制限されず、種々の
酵素が用いられる。具体例として、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、
アスパラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシ
ンアミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−オ
キザロ酢酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミ
ン酸−ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、ク
レアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトラ
ンスフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクト
キナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチル
トランスフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼのような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミ
ラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナ
ーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリ
プシン、トロンビン、オリンギナーゼ、ヌクレオ
チダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラス
ミン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリアミダーゼ、ホス
ホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リパ
ーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加水
分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、
アルパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン
酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニアリ
アーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアーゼ、
フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リンゴ酸
シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラセマ
ーゼ、グリコースイソメラーゼ、グリコースホス
フエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマー
ゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼのよ
うな異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グル
タチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼのよ
うなリガーゼ等を挙げることができる。 本発明による固定化酵素は以上のように、水不
溶性の担体としての水分散性高分子重合体粒子
が、重合体芯部の上に高密度にイオン交換性基又
は官能基をする重合体殻部が形成されている。従
つて、従来のセルロース誘導体粒子等を担体とす
る場合と異なり、酵素が高負荷量にて固定化され
ると共に、固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に
反応系内を自由に移動できるため、基質の拡散が
反応に殆ど影響を与えず、従つて、高分子量の基
質の場合にも遊離の酵素と同様の高い反応速度で
酵素反応を行なわせることができる。 しかも、本発明による固定化酵素は水不溶性の
担体に固定化されているため、酵素反応後には遠
心分離、塩析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性
膜による膜分離等によつて容易に回収でき、かく
して、長期間にわたつて高い酵素活性を保持させ
つつ、繰返して使用することができる。 また、本発明の固定化酵素をその製造面からみ
れば、一般にイオン交換性基又は官能基を有する
単量体を含む単量体組成物を乳化共重合させて、
表面に高密度にこれらイオン交換性基や官能基を
有する水分散性高分子重合体粒子を生成させるこ
とは困難であるが、本発明によれば、予め重合体
芯部を形成しておき、この上にイオン交換性基又
は官能基を有する単量体を含む単量体組成物を乳
化共重合させるので、安定な共重合によつて重合
体粒子を得ることができ、且つ、得られる水分散
性高分子重合体粒子は第２の単量体組成物のみを
乳化共重合させる場合と異なつて、表面に高密度
でこれらイオン交換性基又は官能基を有すること
となり、この結果、本発明の方法により得られる
水分散性高分子重合体粒子には高負荷量にて酵素
を固定化することができるのである。 以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこ
れらの実施例により限定されるものではない。 実施例 １ メタクリル酸メチル80ｇ及びアクリロニトリル
15ｇを蒸留水421ｇに加え、２，2′−アゾビス−
２−アミジノプロパン二塩酸塩0.3ｇを水10ｇに
溶解した重合開始剤水溶液を60℃の温度で窒素気
流下に加え、120rpmで撹拌しつつ４時間重合さ
せて、重合体芯部としての水分散性高分子重合体
粒子を得た。次いで、これに上記と同じ重合開始
剤0.03ｇを水10mlを溶解した重合開始剤水溶液を
加え、更に、メタクリル酸メチル5.5ｇ、アクリ
ロニトリル５ｇ、メタクリル酸３ｇ及びトルエチ
レングリコールジメタクリレート0.5ｇの混合物
を１時間要して添加し、３時間反応させて、上記
芯部の上に官能基としてカルボキシル基を有する
重合体殻部を形成させた。このようにして得た重
合体粒子の水分散液は、固形分20％、重合体粒子
の平均粒径は0.45μであつた。平均粒径0.45μの重
合体粒子の水分散液を得た。重合は非常に安定に
行なわれて、凝集物は0.08％であつた。 この分散液を遠心分離し、上澄中のカルボキシ
ル基について定量したところ、仕込み量の0.9％
のカルボキシル基しか定量されず、水溶性重合の
生成は僅かであつた。 次に、上記重合体粒子を固形物20重量％になる
ように蒸留水に分散させて分散液50mlを得、１−
シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）
カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネー
ト2.5ｇを水30mlに溶解した水溶液を上記分散液
に加え、PHを塩酸で6.5に調整した。この後、α
−アミラーゼ500mgを水10mlに溶解させた酵素水
溶液を加え、５℃でPHを6.5に調整しつつ、24時
間放置して反応させ、α−アミラーゼを共有結合
にて重合体粒子に固定化した。次いで、遠心分離
し、沈降した重合体粒子を塩化ナトリウム、酢酸
ナトリウム及び酢酸カルシウムをそれぞれ0.1M、
0.02M及び0.001Mとなるように溶解したPH7.0と
緩衝液中に再分散させ、かくして、本発明による
固定化α−アミラーゼを得た。 この固定化酵素において、α−アミラーゼの固
定化量は重合体粒子１ｇ当り40mgであり、また、
活性収率は45％であつた。 尚、活性収率とは、固定化された酵素の活性の
理論量に対する実際の活性の割合として定義され
る。ここでは、１％のデンプン水溶液を基質とし
て固定化酵素を35℃で10分間反応させ、ヨウ素デ
ンプン反応からデンプンの分解量を求めることに
より、固定化酵素の活性、即ち、デンプン分解速
度（mg／分）を得、これと等しい活性を有する遊
離の酵素量を酵素固定化量で除して求めた。 参考例 本参考例は、実施例１と同様にして単量体組成
物を段階的に共重合させた場合において、第１及
び第２の単量体組成を種々に変化させて共重合し
たときの凝集物及び重合後の分散液の上澄中のカ
ルボキシル基量を示す。結果を表に示す。 また、実験番号４の単量体組成を一括して共重
合させたとき、凝集物は7.3％、カルボキシル基
量は６％であつて、分散液中の重合体粒子はその
１ｇ当りカルボキシル基を0.08ミリモル有してい
た。しかし、段階的に共重合した場合の重合体粒
子はその１ｇ当りのカルボキシル基を0.35ミリモ
ル有していた。 実施例 ２ 実施例１で得たカルボキシル基を有する重合体
粒子をPH7.0のリン酸塩緩衝液50ml中に固形分20
重量％となるように分散させ、α−キモトリプシ
ン50mgを上と同じ緩衝液に溶解させた酵素水溶液
を上記重合体粒子分散液に加え、５℃で24時間放
置した後、遠心分離した。沈降した重合体粒子を
緩衝液にて洗滌して未固定のα−キモトリプシン
を除去し、再び緩衝液に分散させて、本発明によ
る共有結合固定化α−キモトリプシンを得た。 この固定化酵素のα−キモトリプシンの固定化

【表】

【表】 ールジメタクリレートを表わす。
量は、重合体粒子１ｇ当り4.0mgであり、活性収
率は90％であつた。ここに、活性収率は、0.05ｍ
ＭのＮ−アセチル−Ｌ−チロシンエチルエステル
を基質として30℃で固定化酵素を反応させ、アル
カリ滴定によりカルボキシル基の生成速度（μモ
ル／分）から求めた。 実施例 ３ 実施例１と同じ重合体芯を実施例１と同様にし
て形成した後、これを含む水分散液に第２の単量
体組成として、ジメチルアミノエチルメタクリレ
ート４ｇ、アクリロニトリル４ｇ、アクリル酸エ
チル5.5ｇ及びトリエチレングリコールジメタク
リレート0.5ｇを添加した以外は、実施例１と全
く同様にして重合体殻部を形成させ、固形分20
％、平均粒径0.3μの重合体粒子の水分散液を得
た。 遠心分離により沈降した重合体粒子を0.1Mリ
ン酸塩緩衝液（PH7.0）100mlに固形分10重量％と
なるように分散させ、これにウレアーゼ500mgを
加え、５℃で24時間撹拌して、ウレアーゼをイオ
ン結合にて重合体粒子に固定化した。この後、遠
心分離し、沈降した重合体粒子を上と同じ緩衝液
で洗滌して、未固定のウレアーゼを除去し、再び
同じ緩衝液に分散させて、本発明による固定化ウ
レアーゼを得た。 この固定化酵素におけるウレアーゼの固定化量
は、重合体粒子１ｇ当り45mgであり、活性収率は
95％であつた。活性収率は、0.03Mの尿素水溶液
を基質とし、35℃で10分間固定化酵素を反応さ
せ、生成したアンモニア量（μモル／分）を塩酸
滴定で求めて活性を測定し、これと等しい活性を
有する遊離の酵素量を酵素固定化量で除して求め
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 第１のエチレン性単量体組成物の重合体から
   なる50〜98重量％の重合体芯部と、イオン交換性
   基又は官能基を有するエチレン性単量体を含む第
   ２の単量体組成物の重合体からなる２〜50重量％
   の重合体殻部とより構成される水分散性高分子重
   合体粒子に、上記イオン交換性基又は官能基を介
   して酵素が固定化されていることを特徴とする固
   定化酵素。 ２ 第１の単量体組成物が(a)アクリロニトリル及
   び／又はメタクリロニトリル１〜80重量％、(b)多
   官能性内部架橋用単量体０〜20重量％、及び(c)ア
   クリル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキ
   ルエステル及びスチレンから選ばれる少なくとも
   １種の単量体20〜99重量％とからなることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 ３ 第２の単量体組成物が(a)イオン交換性基又は
   官能基を有する単量体１〜70重量％、(b)アクリロ
   ニトリル及び／又はメタクリロニトリル１〜80重
   量％、(c)多官能性内部架橋用単量体０〜20重量
   ％、及び(d)アクリル酸アルキルエステル、メタク
   リル酸アルキルエステル及びスチレンから選ばれ
   る少なくとも１種の単量体20〜98重量％とからな
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   固定化酵素。 ４ 第２のエチレン性単量体組成物における官能
   基が第１級アミノ基、水酸基、グリシジル基及び
   カルボキシル基から選ばれる少なくとも１種であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   固定化酵素。 ５ 第２のエチレン性単量体組成物におけるイオ
   ン交換性基がカルボキシル基、スルホン酸基及び
   リン酸から選ばれる少なくとも１種の酸性基であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   固定化酵素。 ６ 第２のエチレン性単量体組成物におけるイオ
   ン性基が第３級アミノ基及び第４級アミノ基、リ
   ン酸から選ばれる少なくとも１種の塩基性基であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   固定化酵素。 ７ 水分散性高分子重合体粒子が0.05〜2μの平均
   粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の固定化酵素。 ８ 第１のエチレン性単量体組成物を水媒体中で
   乳化共重合させて水分散性高分子重合体粒子から
   なる重合体芯部を形成した後、水媒体中でこの重
   合体芯部の存在下にイオン交換性基又は官能基を
   有するエチレン性単量体を含む第２の単量体組成
   物を乳化共重合させて、上記重合体芯部の上に重
   合体殻部を有する水分散性高分子重合体粒子を形
   成させ、次いで、この重合体粒子に上記イオン交
   換性基又は官能基を介して酵素を固定化すること
   を特徴とする固定化酵素の製造方法。 ９ 第１の単量体組成物が(a)アクリロニトリル及
   び／又はメタクリロニトリル１〜80重量％、(b)多
   官能性内部架橋用単量体０〜20重量％、及び(c)ア
   クリル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキ
   ルエステル及びスチレンから選ばれる少なくとも
   １種の単量体20〜99重量％とからなることを特徴
   とする特許請求の範囲第８項記載の固定化酵素の
   製造方法。 １０ 第２の単量体組成物が(a)イオン交換性基又
   は官能基を有する単量体１〜70重量％、(b)アクリ
   ロニトリル及び／又はメタクリロニトリル１〜80
   重量％、(c)多官能性内部架橋用単量体０〜20重量
   ％、及び(d)アクリル酸アルキルエステル、メタク
   リル酸アルキルエステル及びスチレンから選ばれ
   る少なくとも１種の単量体20〜98重量％とからな
   ることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の
   固定化酵素の製造方法。 １１ 第２のエチレン性単量体組成物における官
   能基が第１級アミノ基、水酸基、グリシジル基及
   びカルボキシル基から選ばれる少なくとも１種で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載
   の固定化酵素の製造方法。 １２ 第２のエチレン性単量体組成物におけるイ
   オン交換性基がカルボキシル基、スルホン酸基及
   びリン酸から選ばれる少なくとも１種の酸性基で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載
   の固定化酵素の製造方法。 １３ 第２のエチレン性単量体組成物におけるイ
   オン性基が第３級アミノ基及び第４級アミノ基、
   リン酸から選ばれる少なくとも１種の塩基性基で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載
   の固定化酵素の製造方法。 １４ 水分散性高分子重合体粒子が0.05〜2μの平
   均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第８項記載の固定化酵素の製造方法。