MC1602A1

MC1602A1 - Derives de leucine

Info

Publication number: MC1602A1
Application number: MC841710A
Authority: MC
Inventors: Paul Hadvary; Erich Hochuli; Ernst Kupfer; Hans Lengsfeld; Ernst-Karl Weibel
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1983-06-22
Filing date: 1984-06-20
Publication date: 1985-05-09
Also published as: MX9203633A; EP0129748A1; ES533557A0; PH19704A; FI842422L; US4598089A; NL980029I2; AU572851B2; DK160496C; PT78777B; FI842422A0; NO842512L; LV5747A4; DK308584A; ZA844558B; PT78777A; NZ208521A; DE19875045I2; KR920002314B1; IL72122A0

Description

1

La présente invention concerne des composés de formule générale

H Y

HCONx /•

\£&J

H • • H

où A représente le groupe \>f \#/ ^ ^/ ou - ( ) 5-

La formule I ci-dessus comprend la lactone de 11 acide (2S,3S,5S,7Z,10Z)-5-[(S)-2-formamido-4-méthyl-5 valéranyloxy]-2-hexyl-3-hydroxy-7,10-hexadécadiénoïque de formule

• •

H Y

hcon\.>2V

o7 x(j) 9~i/ 7

= = x./ la qui est décrite ci-dessous sous le nom de lipstatine,et la lactone de l'acide (2s,3S,5S)-5-1(S)-2-formamido-4-méthyl-valéranyloxy]-2-hexyl-3-hydroxy-hexadécanoïque 10 de formule

H Y

HCON. •

0

2

qui est décrite ci-dessous sous le nom de tétrahydro-lipstatine.

Ces composés sont nouveaux et possèdent des propriétés pharmacologiques intéressantes. Ils inhibent 5 enparticulier la lipase pancréatique et peuvent être utilisés pour combattre ou prévenir l'obésité et 1'hyperlipémie.

L'invention a pour objet les composés de formule I ci-dessus en tant que tels et comme substances acti-10 ves pharmaceutiques, la préparation de ces composés, les médicaments et les aliments industriellement préparés contenant un composé de formule I, leur préparation, ainsi que l'application de ces composés pour combattre ou prévenir les maladies. 15 La digestion des graisses absorbées avec la nourriture (triglycérides) s'effectue dans l'intestin par la lipase pancréatique. La lipase pancréatique coupe les liaisons ester primaires des triglycérides, et l'on obtient comme produits les acides gras libres 20 et les 2-monoglycérides. Ces produits peuvent alors être résorbés et utilisés. Par l'inhibition de la lipase pancréatique on inhibe en partie le clivage mentionné des graisses alimentaires et ainsi également la résorption et l'utilisation de ces produits; les tri-25 glycérides sont excrétés sans modification.

L'inhibition de la lipase pancréatique par les composés de formule I peut être mise en évidence expérimentalement, en déterminant par titrimétrie l'acide oléique libéré dans le clivage de la trioléine par la 30 lipase pancréatique de porc. Dans une émulsion qui contient 1 mM de taurodésoxychloate, 9 mM de tauro-désoléate, 0,1 mM de cholestérol, 1 mM de lécithine d'oeuf, 15 mg/ml de SAB, 2 mM de Tris-HCl, 100 mM de chlorure de sodium, 1 mM de chlorure de calcium et

3

le substrat trioléine, on ajoute le composé de formule I dissous dans l'éthanol ou le diméthylsulfoxyde (10% du volume de l'émulsion) et on amorce la réaction par addition de 100 pl (175 U) de lipase pancréatique de 5 porc. On maintient le pH à 8 pendant la réaction par addition de lessive de soude. D'après la consommation de lessive de soude déterminée pendant 10 minutes on calcule la ClgQ* La CI50 est "*"a concentrati°n a laquelle l'activité de la lipase est inhibée à la moitié de la 10 valeur maximale. Le Tableau I ci-dessous contient les valeurs de CI^q déterminées pour les composés de formule I et les données sur la toxicité aiguë (DL^

après une administration orale chez des souris).

Tableau I

Composé expérimental

CI 50 en ucr/ml

DL5 0 en mq/kq d.o.

Lipstatine

Tetrahydrolipstatine

0 ,07 0, 18

> 4000

L'inhibition de la résorption des graisses absor-20 bées avec la nourriture, qui est provoquée par l'inhibition de la lipase pancréatique, peut être mise en évidence dans une expérience de double marquage chez des souris. A cet effet on administre aux animaux expérimentaux un repas expérimental contenant de la

3 14

25 H-trioléine et de l'acide C-oléique, et un composé

de formule I. En mesurant la radioactivité on détermine alors la quantité de H-trioléine et d'acide "^C-oléique

(en pourcentage de la quantité administrée) excrétée avec les sels. Les résultats donnés au Tableau II ci-dessous

montrent que par comparaison avec les animaux témoins non traités l'excrétion de triglycéride non modifié est fortement accrue et l'excrétion d'acide oléique est largement non modifiée.

Tableau II

Nombre

Excrétion en % de la

Composé

d'animaux

quantité administrée expérimental expérimentaux

Dose

Tr ioléine

Acide oléiaue

Témoin

12

3,5+ 0,3

10,1+ 0,6

Lipstatine

6

4 0 mg/kg *

56,8+ 13

13,8+ 5,6

* Les expériences sont conduites avec une préparation gui contient environ 10% de lipstatine. La dose indiquée est la quantité de lipstatine administrée.

Selon l'invention, on peut préparer les composés de formule I de la façon suivante:

a) pour préparer le composé de formule la on cultive de façon aérobie ûn microorganisme de l'espèce Strep-tomyces • toxytr'icini produisant ce composé dans un milieu de culture aqueux qui contient des sources de carbone et d'azote appropriées et des sels inorganiques et on sépare du bouillon de culture le composé de formule la produit, ou b) pour préparer le composé de formule Ib on hydrogène le composé de formule la.

A partir d'échantillons de sel provenant de différents endroits on peut isoler des souches de Streptomycètes qui produisent la lipstatine, le composé

5

de formule la. Comme exemple on peut mentionner le microorganisme isolé à partir d'un échantillon de sol trouvé à Majorque en Espagne, qui a reçu la désignation de laboratoire Streptomyces sp. 85-13 et qui a été 5 identifié par CBS, Baarn (Pays-Bas) comme Streptomyces toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova (cf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8e édition,

page 811). Il a reçu ensuite la nouvelle désignation Streptomyces toxytricini 85-13. Un échantillon lyophili-10 sé de cette souche a été mis en dépôt le 14 juin 1983 à 1'Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Illinois, sous la désignation NRRL 15443.

On trouvera ci-dessous la description de l'identification de Streptomyces sp 85-13:

15 Milieux

La composition des milieux utilisés est décrite dans Int. J. Syst. Bacteriol. 1966, 16, 3; 313-321.

Diagramme de Nonomura

Nonomura a utilisé les résultats de l'International 20 Streptomyces Project (ISP) pour la classification des espèces de Streptomyces (J. Ferment. Technol. 1974, 52, 2).

Couleurs

Les noms et numéros de code des couleurs du mycélium aérien viennent de Tresner & Backus, "System of color 25 wheels for streptomycete taxonomy". Les couleurs du revers des colonies viennent de la sélection de H.

Prauser du "Farbtonkarte Atlas I" de Baumann.

Modes opératoires

On procède selon les procédés ISP (cf Int. J. Syst. 30 Bacteriol. 1966, 16, 3; 313-340).

JE. Cultures de gélose au, bout de 16 jours à 28"C (double déterminati a) Gélose de farine d'avoine

Croissance: très bonne; colonies: clairsemées, s'étendants; mycélium aérien: velouté, brun rougeâtre (Light Brown 57); revers des colonies: jaunâtre (Pr. Coo-3-m) avec larges bords gris pourpre (Pr. Oc-6-c); pigments solu-bles: incertains.

b) Gélose de sel d'amidon

Croissance: bonne; colonies: clairsemées, s'étendants;

mycélium aérien: velouté, brun rougeâtre (Light Brown 57} avec secteur blanc; revers des colonies: couleur de paille sombre (Pr. Coo (Cr)5a), bords et autres zones rougeâtres (Pr. Oc-5-b) avec quelques points brun-rouge foncé (Pr 0-5-5(r); pigments solubles: indistincts.L'activité de dégradation de l'amidon est très prononcée.

c) Gélose glycérine-asparagine

Croissance: bonne; colonies: clairsemées*. s'étendants;

mycélium aérien: velouté, brun-rouge clair (R4ec:

Grayish Yellowish Pink); revers des colonies: orange (Pr. Oc-3-m/r); pigments solubles: brun rougeâtre pâle.

d) Gélose de malt de levure

Croissance: bonne; colonies: clairsemées, grandes;

mycélium aérien: velouté, brun rougeâtre (4ge: Light Grayish Reddish Brown 45); revers des colonies: jaune (Pr. Coo-4-5) et brun foncé (Pr. Oc-5-r); pigments solubles:

brun jaune très pâle.

II. Cultures de gélose au bout de 62 jours à 28 °C (double déterminati' a) Gélose de farine d'avoine

Croissance: bonne; colonies: clairsemées, s'étendants; mycélium aérien: pulvérulent-velouté, couleur de cannelle (R-4ie: LightBrown (57)-Cork Tan) avec bords larges et plus

clairs (R. 5gc: Light Reddish Brown (4.2)-Peach Tan);

revers des colonies: brun jaunâtre avec bords ocre jaune (Pr. Coo-3-a), légèrement gris vers le centre plus clair (Pr. Oc-4-r); pigments solubles: ocre brun clair.

b) Gélose de sel d'amidon

Comme sur gélose de farine d'avoine, mais avec revers plus fortement gris brun (?r. Oc-6-c) et avec taches et anneaux brun foncé aux extrémités des hachures en croix.

c ) Gélose glycér jne-asparagine

Comme sur gélose de sel d'amidon, mais beige clair plus pâle (5ec: Grayish Yellowish Pink 32-Dusty Peads). Revers:

ocre jaune (Pr. : Coo (=Cr)-4-b), plus clair dans le centre; pas de pigments solubles.

d) Gélose de malt de levure

Croissance: moyenne; colonies: presque comme sur gélose de farine d'avoine, mais avec bord très étroit et gris pâle: revers: jaune foncé (Pr. Coo-4-b), brun foncé près du bord; pigments solubles: indistincts .

III. Pigments mélanoïdes

Gélose peptone-extrait de levure: au bout de 24 h négatif, au bout de 48 h positif;gélose de tyrosine:

au bout de 24 h positif, au bout de 48 h positif.

IV. Morphologie du mycélium aérien sporulant Section: Spira-Retinaculum Apertum. Type à ramification sympodiale. Spirales souvent irrégulières avec jusqu'à 5 enroulements et divers diamètres.

V. Utilisation des sources de carbone

Croissance nulle ou à l'état de traces seulement sur Arabinose, Xylose, Inositol, Mannitol, Fructose,

Rhamnose, Saccharose, Raffinose.

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VI. Spores

Ovals à cylindriques-ovals, quelquefois de gulière, surfaces lisses. Chaînes de spores de 10 spores.

5

VII. Diagramme de Nonomura R ( Gy ) 100 SRA sm ( + )( + )( j- )

Pour les buts de l'invention conviennent toutes les souches de Streptomyces qui produisent l'inhibiteur de lipase lipstatine, en particulier Streptomyces 10 toxytricini 85-13, NRRL 15443, et ses sous-cultures, mutants et variantes.

La culture de ces microorganismes aux fins de préparation de la lipstatine peut s'effectuer selon différents procédés de fermentation. On peut par 15 exemple la conduire dans des ballons agités ou dans des fermenteurs de 10 litres, de 200 litres ou de 1000 litres. On introduit une certaine quantité de matière de spores ou de mycélium d'une souche produisant la lipstatine dans un milieu liquide qui contient 20 des sources de carbone et d'azote appropriées et les sels nécessaires pour la croissance, et on fait incuber de façon aérobie à une température de 20-37°C pendant 1 à 6 jours. Comme sources de carbone on peut utiliser par exemple la dextrine, le glucose, l'amidon, 25 la ribose et la glycérine. Les sources d'azote appropriées sont par exemple l'extrait de levure, la peptone ou la farine de soja. Comme sels il faut mentionner de préférence les sels d'ammonium, de magnésium et de calcium. La fermentation est conduite à pH 6-8. 30 L'isolement de la lipstatine s'effectue selon des procédés connus et courants pour tous les spécialistes et peut être conduit par exemple comme suit:

taille irré-

avec plus

9

On centrifuge après la fin de la fermentation le bouillon de fermentation, après quoi on trouve 60-90% de l'activité dans la masse cellulaire et le reste dans le produit de centrifugation. On peut alors traiter 5 la masse cellulaire avec un alcool inférieur, comme le méthanol et l'éthanol, et l'extraire avec le même solvant. On peut extraire le produit de centrifugation avec un solvant organique approprié, p. ex. avec le chlorure de méthylène ou l'acétate d'éthyle. La matière 10 obtenue à partir des extraits contient la lipstatine désirée et peut être enrichie et purifiée par des procédés chromatographiques. Les procédés appropriés sont par exemple l'extraction par multiplication avec le système hexane/méthanol/eau (50:40:9), la chromatogra-15 phie par filtration sur gel de silice avec élution au chloroforme, la chromatographie sur colonne sur gel de silice avec élution à l'hexane, l'acétate d'éthyle et leurs mélanges, la chromatographie sur supports non polaires avex élution avec des solvants polaires, comme 20 le méthanol (chromatographie à phases inversées) et la chromatographie en phase liquide à haute pression.

Les exemples qui suivent contiennent des données détaillées concernant la culture de Streptomyces toxytricini 85-13 et l'isolement de la lipstatine. 25 On peut préparer la tétrahydrolipstatine, le composé de formule Ib, en hydrogénant la lipstatine en présence d'un catalyseur approprié. Comme catalyseurs on peut mentionner par exemple le palladium/charbon, l'oxyde de platine, le palladium, etc. Les solvants 30 appropriés sont par exemple les alcools inférieurs, comme le méthanol et l'éthanol. On travaille de préférence à basses pressions d'hydrogène et à la température ambiante.

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Les composés de formule I peuvent être utilisés comme médicaments, p. ex. sous forme de préparations pharmaceutiques. Les préparations pharmaceutiques peu-5 vent être administrées par voie orale, p. ex. sous forme de comprimés, de comprimés enrobés, de dragées, de capsules de gélatine dure et molle, de solutions, d'émulsions ou de suspensions.

Pour préparer les préparations pharmaceutiques, 10 on peut administrer les produits selon l'invention avec des supports inorganiques ou organiques pharmaceuti-quement inertes. Comme supports de ce genre on peut utiliser pour les comprimés, les comprimés enrobés, les dragées et les capsules de gélatine dure par exemple 15 le lactose, l'amidon de maïs ou ses dérivés, le talc, l'acide stéarique ou ses sels, etc. Pour les capsules de gélatine molle on peut utiliser comme supports par exemples les huiles végétales, les cires, les graisses, les polyols semi-solides et liquides, etc; cependant 20 selon la nature de la substance active il peut n'être aucunement nécessaire d'employer un support dans les capsules de gélatine molle. Pour préparer des solutions et des sirops on peut utiliser comme supports par exemple l'eau, les polyols, le saccharose, le sucre 25 inverti, le glucose, etc.

Les préparations pharmaceutiques peuvent en outre contenir encore des agents de conservation, des tiers solvants, des agents de stabilisation, des agents mouillants, des émulsifiants, des adoucissants, des colorants, 30 des agents aromatisants, des sels pour modifier la pression osmotique, des tampons, des revêtements ou des anti-oxydants. Elles peuvent également contenir d'autres corps thérapeutiquement intéressants.

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Comme on l'a mentionné plus haut, les médicaments qui contiennent un composé de formule I font également l'objet de l'invention, ainsi qu'un procédé de préparation de tels médicaments caractérisé en ce qu'on met 5 sous une forme d'administration galénique un composé de formule I et éventuellement un ou plusieurs autres corps thérapeutiquement utiles. Comme on l'a mentionné ci-dessus, on peut utiliser les composés de formule I pour combattre ou prévenir les maladies, et cela en 10 particulier pour combattre ou prévenir l'obésité et les hyperlipémies. La posologie peut varier dans de larges limites et doit naturellement être adaptée dans chaque cas particulier aux circonstances individuelles. En général il faut compter en cas d'administrais tion orale une dose quotidienne d'environ 0,1 mg à 100 mg de poids corporel.

Les composés de formule I peuvent également être ajoutés à des aliments industriellement préparés, et il faut mentionner en particulier les graisses, les huiles, 20 le beurre, la margarine, le chocolat et d'autres confiseries. Ces aliments industriellement préparés et leurs préparations font également l'objet de l'invention.

Les exemples suivants doivent préciser l'invention, sans cependant en limiter en aucune manière la portée. 25 Toutes les températures sont données en degrés Celsius.

Exemple 1

a) Fermentation

On inocule à un ballon agité avec le milieu de pré-culture 391 des spores de Streptomyces toxytricini 85-13 (ou du mycélium végétatif de cet organisme) et on fait incuber pendant 72 h à 28°C sous forme de culture agitée. On utilise environ 2-5% en volume de cette culture pour inoculer une précultuure de fermentation de 10 litres avec le milieu de préculture 391. On fait incuber pendant 3 jours à 28°, et on aère avec 1 vvm et on agite à 400 tpm. On utilise cette préculture de 10 litres pour l'inoculer à un fermenteur de production de 200 litres avec le milieu de production N 7. On fait fermenter pendant 124 heures à 28°, et on aère avec 1,0 vvm et on agite à 150 tpm. Des analyses régulières montrent au bout de 124 h une activité extracellulaire d'inhibition de la lipase de 53 CI50/ml.

Le milieu de préculture 391 (pH 7,0) a la composition suivante: 3% d'amidon de maïs, 4% de dextrine, 3% de farine de soja, 0,2% de (NH4)2S04 , 0,6% de CaCO^ et 0,8% d'huile de soja. On amène le pH à 7. Le milieu de production N 7 (pH 7,0) a la composition suivante: 1% d'amidon de pomme de terre, 0,5% de glucose, 1% de ribose, 0,5% de glycérine, 0,2% de peptone, 2% de farine de soja et 0,2% de (NH^^SO^.

b) Traitement

On centrifuge le bouillon de fermentation au moyen d'une centrifugeuse à tubes, et l'on obtient 175 litres de filtrat de culture et 12 kg de mycélium. On jette le mycélium, et on chauffe le filtrat de culture pendant 10 minutes à 80°, on refroidit, on centrifuge encore une fois et on concentre à 50 litres à 30° sous vide. On extrait ce concentré avec 50 litres d'hexane au moyen d'un extracteur travaillant en continu,

on mélange l'émulsion obtenue avec 50 1 d'hexane/acétate d'éthyle (1:1) et on sépare la phase organique. On sèche celle-ci sur sulfate de sodium et on concentre; on obtient 199 g d'extrait brut I. On dilue la phase aqueuse à 100 ml avec de l'eau et on extrait avec 100 1 d'acétate d'éthyle. On obtient après concentration de la solution d'acétate d'éthyle 49 g d'extrait brut II. On extrait ensuite la phase aqueuse encore une fois avec 100 litres d'acétate d'éthyle, et après concentration on obtient 78 g d'extrait brut III.

c) Purification

On filtre les extraits bruts II et III en trois fractions sur à chaque fois 1 kg de gel de silice 60 (granulométrie 0,040-0,063 mm), et on élue avec du chloroforme (colonne: 10 x 100 cm). On obtient de cette manière 18,3 g de matière enrichie. On filtre à nouveau 178 g de cette substance en éluant avec du chloroforme sur 1 kg de gel de silice. On obtient alors 5,29 g de matière active. On purifie 802 mg de cette substance au moyen d'une chromatographie à phases inversées sur une colonne instantanée de Lobar que l'on trouve dans le commerce (Lichoprep RP-8, taille C) en éluant avec du méthanol. On obtient 158 mg de lactone de l'acide (2S,3S,5S,7Z,10Z)-5-[(S)-2-formamido-4-méthyl-valéranyloxy]-2-hexyl-3-hydroxy-7,10-hexadécadiénoïque (lipstatine) qui est une huile jaunâtre à la température ambiante. A basse température, elle est cireuse-cristalline.

Microanalyse (20 h sous un vide poussé, séché à 50°): Calculé pour c29H49Ni°5 (491,713):

C 70,84; H 10,04; N 2,85 Trouvé: C 70,85; H 9,97; N 2,59

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20

Pouvoir rotatoire optique: C<*]D = - 19,0° (c = 1,

dans le chloroforme).

Spectre de masse (ionisation chimique avec NH^ comme qaz réactif): pics entre autres à m/z 509 (M+NH*) et 5 492 (M+H+).

Spectre IR (pellicule): bandes entre autres à 3318, 3012, 2928, 2558, 2745, 1823, 1740, 1673, 1521, 1382, 1370, 1250, 1191 cm"1.

Par la dégradation chimique de la lipstatine et la 10 comparaison des fragments obtenus avec des substances connues, on peut établir la configuration absolue.

Exemple 2

a) Fermentation

Avec une pré-culture de Streptomyces toxytricini 15 85-13 (ballon agité puis fermentation de 10 1) préparée selon l'exemple 1 on inocule une fermentation de 200 1 avec le milieu de production N 16. Le milieu de production N 16 correspond au milieu de production N 7 utilisé dans l'exemple 1, mais contient en outre 0,1% de saindoux 20 On conduit la fermentation pendant 120 h comme dans l'exemple 1. Au bout de 120 h, l'activité d'inhibition de la lipase intracellulaire s'élève à 71 CI50/ml , 1'extracellulaire à 4 CIgQ/ml de bouillie de fermentation b) Traitement

25 Après la fin de la fermentation on chauffe la bouillie de fermentation pendant 10 minutes à 80°, puis on refroidit et on sépare la masse cellulaire au moyen d'une centrifugeuse à tubes. En centrifugeant 2 fois on obtient 11,4 kg de mycélium; on jette le filtrat de

15

culture. On délaye le mycélium pendant 30 minutes dans 70 1 de méthanol, puis on filtre la suspension obtenue avec un entonnoir filtrant. On délaie encore le tourteau de filtration avec 50 1 de méthanol et on filtre.

5 On concentre les extraits méthanoliques réunis à 1,8 1. On extrait 3 fois ce concentré avec à chaque fois 2 1 d'acétate de butyle. A partir des phases organiques réunies on obtient après concentration 160 g d'extrait brut.

10 c) Purification

On purifie cet extrait brut par extractions multiples avec le système hexane/méthanol/eau (5:4:0,9) On transfère tout d'abord la substance active de la phase inférieure (uP) à la phase supérieure (oP). On 15 dissout 160 g d'extrait brut dans 4 1 d'uP et on agite dans un récipient d'agitation avec 4 1 d'oP. Après séparation de l'oP on extrait l'uP une deuxième fois avec 4 1 d'oP frais. Il se forme une émulsion stable, à laquelle on ajoute encore 4 1 d'uP et 4 1 d'oP, et 20 l'on obtient une bonne séparation de phases. Après séparation de l'oP on extrait encore 2 fois l'uP avec 8 1 d'oP frais. Les oP réunis donnent après concentration 90,3 g d'extrait. On jette les uP extraits. On transfère alors la substance active de 1'oP à l'uP. 25 On dissout 90,3 g de l'extrait ci-dessus dans 4 1 d'oP et on extrait avec 4 1 d'uP. Après la séparation de phases on extrait encore 3 fois l'oP avec de l'uP frais On jette ensuite l'oP. On concentre les uP réunis à 0,7 1 de phase aqueuse, et on extrait celle-ci 8 fois 30 avec au total 0,2 1 d'acétate d'éthyle. Après concentration, on obtient 25,8 g de produit. On jette la phase aqueuse extraite. La purification ultérieure de

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cette matière s'effectue'par filtration sur 1 kg de gel de silice 60 (granulométrie 0,040-0,063 mm; colonne de 10 x 100 cm) en éluant avec du chloroforme. On obtient 649 mg de produit que l'on chromatographie sur une colonne instantanée de Lobar (Lichoprep RP-8, taille C) en éluant avec du méthanol (chromatographie à phases inversées). On obtient 204 mg de lipstatine, qui est pure selon le chromatogramme en couche mince.

Exemple 3

On dissout 138 mg de lipstatine dans 10 ml d'éthanol, on mélange avec 60 mg de palladium à 5%/char-bon et on agite à la température ambiante pendant 3 h dans une atmosphère d'hydrogène (ballon). On sépare ensuite le catalyseur par centrifugation. On chromatographie le produit d'hydrogénation sur une courte colonne de gel de silice (1x5 cm) avec du chloroforme. On obtient 112 mg de lactone de l'acide (2S,3S,5S)-5-[(S)-2-formamido-4-méthyl-valéranyloxy]-2-hexyl-3-hydroxy-hexadécanoïque (tétrahydrolipstatine) sous la forme d'un corps solide cireux légèrement jaune.

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Pouvoir rotatoire optique: [<*]D = -32,0° (c = 1, dans le chloroforme).

Spectre de masse (ionisation chimique avec NH^ comme gaz réactif): pics entre autres à m/z 513 (M+NH^); 496 (M+H+) et 452 (M+H+-C02).

Spectre IR (pellicule): bandes entre autres à 3332, 2956, 2921, 2853, 1838, 1731, 1709, 1680, 1665, 1524, 1383, 1249 et 1200 cm-1.

Spectre 1H RMN (270 MHz, CDC13): 0,89 (6H); 0,97 (6H); 1,15-1,5 (27H) ; 1,5-1,85 (6H); 1,9-2,25 (2H); 3,24 (1H); 4, (1H); 4,68 (1H); 5,03 (1H); 6,43 (1H); 8,07 et 8,21 (1H) ppm.

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Exemple 4

a) Fermentation

On inocule un ballon de culture agité de 2 litres avec le milieu 391 avec des spores d'une culture sur 5 gélose en biseau de Streptomyces toxytricini 85-13

et on fait incuber de façon aérobie pendant 72 h à 28°C On transfère ensuite la préculture de 2 litres dans un fermenteur de 50 litres avec le milieu de production N 16 et on fait incuber à 28°C pendant 70 h en aérant 10 avec 0,5 vvm. On utilise cette préculture de 50 litres pour inoculer le milieu N 16 à un fermenteur de 1000 li très. Cette fermentation de production est conduite à 28°C et 0,5 vvm d'aération pendant 91 heures, et l'on obtient un titre de lipstatine de 73 CI^Q/ml intracel-15 lulaire et 16 Cl^/ml extracellulaire. On refroidit à 20°C l'ensemble de la bouillie de fermentation et on centrifuge, et il apparaît 41 kg de biomasse humide, que l'on congèle à -20°C.

b) Traitement

20 On décongèle à 4°C 37 kg de mycélium et on homo généise dans un mélangeur avec environ 40 litres d'eau. On mélange la suspension fluide obtenue avec 140 litres de méthanol et on agite pendant 20 minutes. On filtre ensuite avec un entonnoir filtrant sur un tissu 25 filtre, et on extrait encore le tourteau de filtration avec 140 litres de méthanol. On concentre les extraits de méthanol à 30°C à environ 22 litres. On dilue le concentré obtenu avec de l'eau à 50 litres et on extrait 3 fois dans un récipient d'agitation avec à 30 chaque fois 50 litres d'hexane/acétate d'éthyle (1:1). Dans la deuxième et la troisième extraction on obtient des émulsions que l'on peut détruire par addition d'environ 1,4 kg ou selon les cas 0,5 kg de sel de cuisine.

18

On concentre les extraits organiques réunis, on sèche sur sulfate de sodium et on concentre jusqu'à ce qu'on ait un résidu huileux. On obtient 428 g d'extrait brut.

c) Purification

On filtre cet extrait brut en 4 fractions sur à chaque fois 1 kg de gel de silice (60 (granulométrie 0,040-0,063 mm), et l'on élue avec du chloroforme (colonne: 10 x 100 cm). On obtient 70 g de préparation enrichie, que l'on filtre en 2 fractions sur à chaque fois 1 kg de gel de silice 60 en éluant avec de 1'hexane/ acétate d'éthyle (gradient de 9:1 à 4:1). On obtient 4,2 g de matière active que l'on purifie en quatre fractions au moyen d'une chromatographie à phases inversées sur une colonne instantanée de Lobar (Lichoprep RP-8, taille C) en éluant avec du méthanol. On obtient 1,77 g de lipstatine.

Exemple A

Préparation de capsules de gélatine molle de composition suivante:

Quantité par capsule Lipstatine 50 mg

NEOBEE M-5 450 pl

On répartit la solution de la substance active dans NEOBEE M-5 dans des capsules de gélatine molle de taille appropriée.

19

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un composé de formule générale

• •

h Y

HCON^ i ÎA7

H *x /H

où A représente le groupe ou -(CH^)^-

caractérisé en ce gue a) pour préparer la lactone de l'acide (2S,3S,5S,7Z,10Z) 5-[(S)-2-formamido-4-méthyl-valéranyloxy]-2-hexyl-3-hydroxy-7,10-hexadécadiénoïque de formule

H Y

HCON .•

V/V

o i = i • = <

? ?"i

on cultive de façon aérobie un microorganisme de l'espèce Streptomyces toxytricini produisant le composé de formule la dans un milieu de culture aqueux qui contient des sources de carbone et d'azote appropriées et des sels inorganiques, et on sépare du bouillon de culture le composé de formule la produit, ou

20

b) pour préparer la lactone de l'acide (2S,3S,5S)-5-[(s)-2-formamido-4-méthyl-valéranyloxy]-2-hexyl-3-

hydroxy-hexadécanoaique de formule

• •

H Y

HCON. /•

;7

<f'^. T-ù. ■ ■ ™

./'s./'xy'xy \./ x-7 x,/

on hydrogène le composé de formule la.

5

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce gu'on utilise comme microorganisme Streptomyces toxytricini NRRL 15443 ou ses sous-cultures, variantes ou mutants produisant le composé de formule la.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce 10 qu'on prépare la lactone de l'acide (2S,3S,5S,7Z,10Z ) -

5-[(S)-2-formamido-4-méthyl-valéranyloxy]-2-hexyl-3-hydroxy-?, 10-hexadécadiénoïque.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prépare la lactone de l'acide (2S,3S,5S)-5-[(S) — 2—

15 formamido-4-méthyl-valéranyloxy J-2-hexyl-3-hydroxy-hexadécanoïque.

5. Procédé de préparation de médicaments en particulier aux fins d'application pour combattre ou prévenir l'obésité et les hyperlipémies, caractérisé en ce qu'on met

20 sous une forme d'administration galénique un composé

de formule générale I selon la revendication 1 et si on le désire un ou plusieurs autres corps thérapeutiquement intéressants.

21

6. Application d'un composé de formule générale I selon la revendication 1 à la préparation d'aliments préparés industriellement.

***

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fopiiété Industrielle

Boul. Princesse Charlotte MONTE-CARLO

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