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PROCEDE DE PRODUCTION DE SELS DE ZINC DE LA KALLIKREINE.
Il est connu que la Kallikréine contenue dans les solutions impures est précipitée par un nombre de sels de métaux lourds, tels que l'acétate d'uranyle, le phosphate de plomb basique, etc. On sait par les travaux de H.
Kraut, E.K. Frey, E. Bauer et F. Schultz, Zeitschr. physiol. Chem. 205,99, 1937 qu'il s'agit ici d'adsorptions de Kallikréine à des précipités formés par ces métaux lourds, soit avec de la protéine soit avec de l'acide phosphorique ; car dans des préparations plus pures les précipités faisaient défaut dans les conditions opératoires adoptées à cette époque.
Or, la société demanderesse a trouvé que la Kallikréine et le zinc se combinent en formant un composé qui possède des avantages particuliers.Les sels de zinc de la Kallikréine sont relativement facilement solubles dans l'eau dans la gamme de pH comprise entre 5 et 6, mais difficilement solubles dans de l'alcool étendu (par exemple de l'alcool à 30 %) ou des mélanges de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple un mélange d'alcool et d'acétone.
Il est donc possible de précipiter les matières d'accompagnement inactives des solutions plus pures de Kallikréine par addition d'acétate de zinc à une valeur pH de 5 - 6, sans pertes substantielles de Kallikréine.
Après élimination des matières d'accompagnement, la Kallikréine peut être précipitée sous la forme de sel de zinc d'un haut degré de pureté par addition d'alcool ou d'acétone.
Dans les solutions impures de l'addition de sels de zinc donne lieu à la formation de précipités volumineux de protéine ou de phosphate de zinc qui adsorbent la Kallikréine. Il est donc nécessaire d'ajouter aux solutions de Kallikréine des solutions à 30 % d'alcool ou d'acétone avant l'addition de l'acétate de zinc, grâce à quoi les impuretés gênantes sont
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précipitées sans aucune perte substantielle de Kallikréine. Lorsque l'acé- tate de zinc est ajouté dans ce stade, tous les sels de zinc difficilement solubles dans des solutions aqueuses diluées d'alcool sont précipités en- semble avec la Kallikréine.
Le sel de zinc de Kallikréine est extrait à partir de ce précipité au moyen d'une faible quantité d'eau ou d'une solu- tion de sel neutre, par exemple avec une solution physiologique de chlorure de sodium, tandis que les sels de zinc difficilement solubles dans l'eau. restent dans le précipité dont ils peuvent être séparés.
Les sels de zinc de la Kallikréine sont stables dans des solutions aqueuses pendant une période de durée prolongée, mais ils ne peuvent pas être obtenus sous la forme de poudre sèche par les méthodes usuelles, sans que leur activité biologique en soit sérieusement comprise. Cependant, il est possible d'éliminer le zinc des solutions de sel de zinc au moyen d'échangeurs d'ions et de récupérer ensuite la Kallikréine sous forme de poudre sèche biologique- ment active suivant les méthodes usuelles,par exemple par évaporation dans le vide ou par précipitation avec de l'alcool ou de l'acétone. Ces poudres sèches se prêtent aussi à la purification supplémentaire de la Kallikréine.
EXEMPLE
3 litres d'un autolysat pancréatique sont additionnés de 1,5 li- tres d'alcool et le précipité obtenu est éliminé par essorage. La solution limpide est additionnée de 50 g d' acétate de zinc dissous dans 500 cc d'al- cool à 30 %. Le précipité qui ne tarde pas à se former est séparé par esso- rage au bout de 12 heures et mis en suspension dans 1 litre d'une solution physiologique de chlorure de sodium.Le sel de zinc de Kallikréine entre! en solution et est séparé du précipité par filtration. Le rendement en Kalli- ,kréine est de 80 % environ, le degré de pureté est de 40 - 60 par unité de Kallikréine.
La solution de sel de zinc de Kallikréine ainsi obtenue est dialysée pendant 24 heures dans des sacs de cellulose régénérée contre de l'eau courante, la concentration en ions hydrogène étant maintenue entre
5 et 6. Ensuite on y ajoute une nouvelle quantité de 10 g d'acétate de zinc par litre de liquide. La faible quantité du précipité exempt de Kallikréine est séparée par essorage. Ceci fait, la solution est portée à une teneur de 30 % d'alcool ou d'acétone et le précipité qui se sépare graduellement est recueilli dans une centrifuge. Ce précipité se dissout complètement dans l'eau . Le rendement est de 60 - 80 % de la Kallikréine mise en oeuvre.
Le degré de pureté s'élève à 20 - 30 par unité de Kallikréine.
La solution du sel de zinc de Kallikréine est filtrée à travers une colonne d'échangeurs de cations chargée de chlorure de sodium, puis ad- ditionnée à froid de 4 fois son volume d'alcool. Après un repos prolongé à froid, le précipité qui en résulte est séparé par essorage et séché en- suite avec l'acétone et de l'éther. Le rendement en substance active est de 60 %. La poudre sèche est soluble dans l'eau et stable.
REVENDICATIONS
1 Procédé de production de sels de zinc de la Kallikréine, consistant à précipiter la Kallikréine à partir de solutions alcooli- ques étendues, de préférence des solutions à 30 %, ou de solutions aqueu- ses de solvants organiques appropriés miscibles à l'eau, au moyen d'une solution d'acétate de zinc à une valeur pH de 5 - 6, et à extraire du préci- pité le sel de zinc de Kallikréine avec de l'eau ou une solution étendue de sels neutres.
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